CN112899235B - 一种细胞培养液的收获方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞培养液的收获方法。所述方法包括以下步骤：1)提供宿主细胞，对宿主细胞进行种子复苏、摇瓶扩增培养和流加培养，得到细胞密度不小于1.0×106个/mL的细胞培养物；2)向步骤1)中所述细胞培养物中添加酸性溶液，调节细胞培养物的pH为4.0～5.6；3)对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤和/或添加碱性溶液，得到细胞培养液；4)收获步骤3)所述的细胞培养液。利用本发明提供的细胞培养液的收获方法能够显著提高细胞培养液的收获效率，同时还能显著提高深层过滤膜的包载量、降低细胞培养液的终点浊度，并提高生产的可操作性、降低生产设备和设施的成本投入。

Description

一种细胞培养液的收获方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种细胞培养液的收获方法。
背景技术
经过几十年发展，细胞培养技术已经成为生产很多重要蛋白的成熟技术。目前在细胞培养领域常用的细胞培养液收获方法包括：絮凝、沉淀、离心和深层过滤。其中离心和深层过滤对于某些特定培养基成分的细胞收获液不能有效分离，并且通过离心或深层过滤获得的细胞收获液的浊度高。另外，深层过滤方法中使用的深层过滤膜的包载量低，也会影响细胞培养液的收获以及目标产物的收率。通过絮凝或沉淀收获细胞培养液，主要作用为去除宿主细胞蛋白(HCP)、DNA、细胞碎片、培养基组分。
现有技术中，提高深层过滤膜包载量的能力有限，而且需要配合特定的膜包，且膜包的使用数量显著大于同类产品，从而增加了生产设备和设施的操作负荷，存在生产失败的风险。另外，使用深层过滤膜收获细胞培养液还会不可避免的造成产品的生产成本增加，降低了产品的市场竞争力。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种针对使用特定培养基培养宿主细胞、收获包含目标产物的细胞培养液的方法。
用于解决问题的方案
本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，通过对细胞培养液收获工艺进行优化，从而完成了本发明。即本发明如下所述：
一种细胞培养液的收获方法，所述方法包括以下步骤：
1)提供宿主细胞，对宿主细胞进行种子复苏、摇瓶扩增培养和流加培养，得到细胞密度不小于1.0×106个/mL的细胞培养物；
2)向步骤1)中所述细胞培养物中添加酸性溶液，调节细胞培养物的pH为4.0～5.6，其中所述酸性溶液含有枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸及其盐中的一种及一种以上；
3)对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤和/或添加碱性溶液，得到细胞培养液，其中所述碱性溶液含有Tris、Tris-bis、组氨酸中的一种及一种以上；
4)收获步骤3)所述的细胞培养液。
在一些实施方式中，在上述细胞培养液的收获方法中，其特征在于，在步骤3)中首先对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤，得到细胞收集液，然后再向所述细胞收集液中添加碱性溶液、将所述细胞收集液的pH调节为5.0～8.0，从而得到相应的细胞培养液；优选的，在所述步骤2)之前或者在所述步骤2)之后额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。
在一些实施方式中，在上述细胞培养液的收获方法中，其特征在于，在步骤3)中首先向步骤2)所述的细胞培养物中添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0，然后再将所述细胞培养物进行深层过滤，从而得到相应的细胞培养液；优选的，在添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0之后或者在所述步骤2)之前额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。
根据上文所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤1)中使用基础培养基M对所述宿主细胞进行种子复苏和摇瓶扩增，使用流加试剂A和流加试剂B对所述宿主细胞进行流加培养；其中，所述基础培养基M溶解后pH为7.3～7.5，浊度为0.5～1NTU，渗透压为300～350mOsm/kg，葡萄糖含量为5～6g/L，其中谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸的含量均小于40μmol/L；所述流加试剂A溶解后pH为6.5～6.8，浊度为1.5～2.5NTU，渗透压为1500～1800mOsm/kg，葡萄糖含量>75.02g/L，其中天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸的含量均大于10000μmol/L；所述流加试剂B溶解后pH为11～11.5，浊度为1～1.5NTU，渗透压为1200～1500mOsm/kg，其中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10000μmol/L；优选的，在所述流加培养中，当溶液中葡萄糖的浓度低于4.0g/L时，补加葡萄糖使溶液中葡萄糖的浓度提高到5.0g/L，并根据实际泡沫量加入总量不超过100ppm的消泡剂。
在一些实施方式中，上文所述基础培养基M中天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述基础培养基M中不包含谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸；上文所述流加试剂A中谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述流加试剂A中不含组氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、正缬氨酸、羟脯氨酸和肌氨酸；上文所述流加试剂B中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述流加试剂B中不含天门冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、羟脯氨酸和肌氨酸；优选的，所述流加试剂B中酪氨酸的含量为45～55％(w/w)。
在一些实施方式中，所述基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B中的氨基酸组成如表1所示。
根据上文所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，所述深层过滤中使用的膜包选自Millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS、40MS系列中的任意一种或任意两种的组合；优选的，所述膜包的过滤载量大于等于60升每平方米。
在一些实施方式中，上文所述细胞培养液的收获方法中的宿主细胞为哺乳动物细胞；优选的，所述哺乳动物细胞选自由CHO、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系组成的组；更优选的，所述哺乳动物细胞为CHO-S或CHO-K1细胞。
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包含编码外源蛋白的核苷酸序列；优选的，所述外源蛋白为抗体；更优选的，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体。
具体的，在本发明的一个方面提供一种细胞培养液的收获方法A，所述方法包括以下步骤：
a)细胞培养：采用生物反应器培养，接种密度不小于1.0×106个/mL，细胞培养的基础培养基为基础培养基M，流加培养基为流加试剂A和流加试剂B(培养基特点详见表1～2)，培养温度33.0℃～36.5℃，葡萄糖低于4.0g/L时，补加葡萄糖使细胞液中葡萄糖浓度提高到5.0g/L，根据实际泡沫量加入消泡剂，总量不超过100ppm；
b)保持微生物细胞培养条件，向培养物添加酸性溶液，例如枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸等及其盐溶液，至pH4.0～5.6；其中，所述酸性溶液的使用浓度没有特殊限制，只要能将培养物的pH调整为4.0～5.6即可；
c)深层过滤，膜包包括但不限于millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS系列，过滤载量大于等于60L/m2；
d)向收集液添加碱性溶液，例如Tris、Tris-bis、组氨酸等，至pH5.0～8.0。其中，所述碱性溶液的使用浓度没有特殊限制，只要能将收集液的pH调整为5.0～8.0即可。
在本发明的另一个方面提供一种细胞培养液的收获方法B，所述方法在上述收获方法A的基础上，将所述步骤c)和所述步骤d)的顺序进行互换。
在本发明的另一个方面提供一种细胞培养液的收获方法C，所述方法包括以下步骤：
a)细胞培养：采用生物反应器培养，接种密度不小于1.0×106个/mL，细胞培养的基础培养基为基础培养基M，流加培养基为流加试剂A和流加试剂B(培养基特点详见表1～2)，培养温度33.0℃～36.5℃，葡萄糖低于4.0g/L时，补加葡萄糖使细胞液中葡萄糖浓度提高到5.0g/L，根据实际泡沫量加入消泡剂，总量不超过100ppm；
b)保持微生物细胞培养条件，向培养物添加酸性溶液，例如枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸等及其盐溶液，至pH4.0～5.6；其中，所述酸性溶液的使用浓度没有特殊限制，只要能将培养物的pH调整为4.0～5.6即可；
c)连续流离心机离心；
d)深层过滤，膜包包括但不限于millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS系列，过滤载量大于等于60L/m2；
e)向收集液添加碱性溶液，例如Tris、Tris-bis、组氨酸等，至pH5.0～8.0。其中，所述碱性溶液的使用浓度没有特殊限制，只要能将收集液的pH调整为5.0～8.0即可。
在本发明的另一个方面提供一种细胞培养液的收获方法D，所述方法在上述收获方法C的基础上，将所述步骤e)调整到所述步骤c)之前。
在本发明的另一个方面提供一种细胞培养液的收获方法E，所述方法包括以下步骤：
a)细胞培养：采用生物反应器培养，接种密度不小于1.0×106个/mL，细胞培养的基础培养基为基础培养基M，流加培养基为流加试剂A和流加试剂B(所述基础培养基M和流加试剂A、流加试剂B的特点详见表1～2)，培养温度33.0℃～36.5℃，葡萄糖低于4.0g/L时，补加葡萄糖使细胞液中葡萄糖浓度提高到5.0g/L，根据实际泡沫量加入消泡剂，总量不超过100ppm；
b)连续流离心机离心；
c)向收集液添加酸性溶液，例如枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸等及其盐溶液，至pH4.0～5.6；其中，所述酸性溶液的使用浓度没有特殊限制，只要能将培养物的pH调整为4.0～5.6即可；
d)深层过滤，膜包包括但不限于millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS系列，过滤载量大于等于60L/m2；
e)向培养物中添加碱性溶液，例如Tris、Tris-bis、组氨酸等，至pH5.0～8.0；其中，所述碱性溶液的使用浓度没有特殊限制，只要能将收集液的pH调整为5.0～8.0即可。
在本发明的另一个方面提供一种细胞培养液的收获方法F，所述方法在上述收获方法E的基础上，将所述步骤e)和所述步骤d)的顺序进行互换。
发明的效果
由本发明的试验结果可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
1，显著提高了使用特定培养基培养宿主细胞获得的细胞培养液中的目标产物的产量、收率。
2，显著提高了深层过滤膜的包载量、降低细胞培养液的终点浊度，降低了生产成本，降低了下游处理的难度。
3，提高了生产的可操作性性、降低了生产设备和设施的成本投入。
为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：
附图说明
图1为细胞培养过程中活细胞密度(VCD)随时间变化的曲线图；
图2为细胞培养过程中细胞活率(VIB)随时间变化的曲线图；
图3为细胞培养过程中蛋白表达量随时间变化的曲线图。
具体实施方式
本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
描述本发明会定义多个术语，使用这些术语并不限制本发明的范围。
1)如本文所用，术语“细胞培养液”包括细胞、细胞碎片和胶体颗粒，以及所关注的生物分子(即宿主细胞表达的目标产物蛋白)、宿主细胞蛋白(HCP)及DNA、培养基组分及其代谢产物。
2)如本文所用，术语“澄清过滤”一般是指在纯化生物分子中最初使用的一个或者多个步骤，特别地，在本文“澄清过滤”和“深层过滤”具有相同概念。
3)如本文所用，术语“CV”一般是指层析柱或膜腔体积，特别地在本文指深层滤器膜腔体积，和10L/m2具有相同的体积概念。
4)如本文所用，术语“百万分数”或“ppm”在本文中可交换使用。
5)如本文所用，术语“通量”与“流速”同义，指单位时间滤过一定膜面积的深层滤器的液体体积，特别地，在本文用单位LMH表示。
6)如本文所用，术语“浊度”一般指含水的溶液中的悬浮物对光线透过时所发生的阻碍程度，特别地在本文悬浮物指细胞、细胞碎片等，用单位NTU表示。
7)如本文所用，术语“压降”、“压力”或“压力终点”是指当溶液通过滤器时，由于受到阻碍所产生的膜两侧的压力差，用单位“psi”或“bar”或“MPa”表示。
8)如本文所用，术语“载量”是指每平方米深层滤膜所能加载或通过的水、溶液或细胞发酵液等液体的体积，单位用L/m2表示。
9)如本文所用，术语“膜孔径”是指多孔固体表面或内部通道的大小或形状，特别地，在本文指深层滤器膜内部通道的大小分布范围，一般用“μm”表示。
10)如本文所用，术语“细胞密度”一般是指在单位体积(mL)或单位面积(cm2)内计数得到的细胞总数，用单位：“cell/mL”或“cell/cm2”表示，二者具有相同含义。
11)如本文所用，术语“细胞活率”一般是指在单位体积(mL)或单位面积(cm2)内计数得到的活细胞数量与细胞总数的比值，用单位％表示。
12)除非另外说明，否则本文中所用术语“抗体”包括提及任何同种型或子类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区，包括人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、单克隆抗体、多克隆抗体以及其低聚物或抗原结合片段。还包括具有抗原结合片段或抗原结合区的蛋白质，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、双功能抗体、Fd、dAb、单链抗体分子、互补决定区(CDR)片段、scFv、多功能抗体以及含有免疫球蛋白中足以赋予目标多肽以特异性抗原结合作用的至少一部分的多肽。本文中所用术语“双特异性抗体”是指对两个不同抗原表位具有结合特异性的抗体。
13)除非另外说明，否则本文中所用“工作细胞”是采用分子生物学等的常规技术获得的重组CHO宿主细胞，这些技术在现有技术的参考文献中有充分解释，参考文献例如：Bispecific human IgG by design(Carter P，J Immunol Methods.2001Feb)；MolecularCloning：A Laboratory Manual,(J.Sambrook et al.,Cold SpringHarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；Current Protocols inMolecularBiology(F.Ausubel et al.,eds.,1987updated)；Essential MolecularBiology(T.Brown ed.,IRL Press 1991)；Gene Expression Technology(Goeddel ed.,Academic Press 1991)；Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes(A.Bothwell et al.,eds.,Bartlett Publ.1990)；Gene Transfer and Expression(M.Kriegler,Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology II(R.Wu et al.,eds.,Academic Press 1995)；PCR：A Practical Approach(M.McPherson et al.,IRLPress at Oxford University Press 1991)；Oligonucleotide Synthesis(M.Gaited.,1984)；Cell Culture for Biochemists(R.Adams ed.,Elsevier SciencePublishers1990)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.Miller&M.Calos eds.,1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler ed.,1991)；AnimalCell Culture(J.Pollardet al.,eds.,Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells,2ndEd.(R.Freshney etal.,eds.,Alan R.Liss 1987)；Flow Cytometry and Sorting(M.Melamed et al.,eds.,Wiley-Liss 1990)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；WirthM.and Hauser H.(1993)；Immunochemistry inPractice,3rd edition,A.Johnstone&R.Thorpe,Blackwell Science,Cambridge,MA,1996；Techniques inImmunocytochemistry,(G.Bullock&P.Petrusz eds.,Academic Press1982,1983,1985,1989)；Handbook of Experimental Immunology,(D.Weir&C.Blackwell,eds.)；CurrentProtocols in Immunology(J.Coligan et al.,eds.1991)；Immunoassay(E.P.Diamandis&T.K.Christopoulos,eds.,Academic Press,Inc.,1996)；Goding(1986)MonoclonalAntibodies：Principles and Practice(2d ed)Academic Press,New York；EdHarlow and David Lane,Antibodies A laboratory Manual,Cold SpringHarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York,1988；Antibody Engineering,2ndEdition(C.Borrebaeck,ed.,Oxford University Press,1995)；and theseriesAnnual Review of Immunology；the seriesAdvances in Immunology。
14)如本文所用，术语“混合浊度”是指收集从开始到结束所有液体充分混匀后取样检测得到的浊度，单位为NTU。本文所用术语“瞬时浊度”是指收集时某时间点瞬间取样检测得到的浊度，单位为NTU。
本发明实施例在细胞培养过程中使用的仪器设备可从市场上购买获得，其具体信息如下：
仪器设备信息表：
仪器名称 产地及品牌 仪器型号
细胞培养生物反应器 德国Sartrious BIOSTATR A 2L
细胞培养生物反应器 德国Sartrious BIOSTATR B Twin 2L
洁净工作台 苏州AIRTECH SW-CJ-2FD
FE20pH计 瑞士METTLER FE20
二氧化碳摇床 瑞士INFORS Multitron Pro
二氧化碳摇床 瑞士Kuhner Climo-Shaker ISF1-XC
细胞计数仪 美国BECKMAN Vi-CELL XR
生化分析仪 瑞士Roche CEDEX BIO HT
全自动生化分析仪 美国NOVA Bioprofile 100-plus
湘仪离心机 湖南湘仪 TDZ5-WS
微量离心机 美国Thermo Microcl 17
接管机 日本TERUMO SCDIIB
接管机 德国Sartrious Bio Welder TC
高效液相色谱仪 美国Agilent Agilent 1260
本发明在具体实施例的细胞培养过程中使用的基础培养基M、流加培养基(包括流加试剂A和流加试剂B)的特征分别在于：
基础培养基M特征在于：溶解后pH为7.3～7.5、浊度0.5～1NTU、渗透压300～350mOsm/kg、葡萄糖含量5～6g/L、谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸含量均小于40μmol/L；
流加试剂A特征在于：溶解后pH为6.5～6.8、浊度1.5～2.5NTU、渗透压1500～1800mOsm/kg、葡萄糖含量>75.02g/l，其中天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸的含量均大于10000μmol/L；
流加试剂B特征在于：溶解后pH为11～11.5、浊度1～1.5NTU、渗透压1200～1500mOsm/kg，其中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10000μmol/L。
在本发明具体的实施例中，在细胞培养过程中使用的基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B的氨基酸组成，如下表1所示：
表1本发明所述基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B的氨基酸组成
氨基酸种类 缩写 基础培养基M(μmol/L) 流加试剂A(μmol/L) 流加试剂B(μmol/L)
天门冬氨酸 ASP 1877 28522 681
谷氨酸 GLU 2958 69790 2666
天门冬酰胺 ASN 7030 27269 0
丝氨酸 SER 6743 67615 289
谷氨酰胺 GLN 0 0 190
组氨酸 HIS 1224 0 52542
甘氨酸 GLY 1338 427 544
苏氨酸 THR 5330 27743 0
精氨酸 ARG 1654 24737 818
丙氨酸 ALA 0 15836 2140
酪氨酸 TYR 957 134 181291
胱氨酸 CY2 250 515 60141
缬氨酸 VAL 4320 39443 0
蛋氨酸 MET 1486 9194 0
正缬氨酸 NVA 46 0 0
色氨酸 TRP 1037 0 66897
苯丙氨酸 PHE 1694 23712 0
异亮氨酸 ILE 3621 24995 0
亮氨酸 LEU 5714 54470 0
赖氨酸 LYS 3102 41555 220
羟脯氨酸 HYP 0 0 0
肌氨酸 SAR 0 0 0
脯氨酸 PRO 0 37559 8305
上述基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B的特征如表2所示：
表2本发明所述基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B的特征
培养基名称 溶解后pH 终密度(g/cm3) 浊度(NTU) 渗透压(mOsm/kg) 葡萄糖(g/L)
基础培养基M 7.4 1.007 0.8 313 5.87
流加试剂A 6.7 1.08 1.77 1586 >75.02
流加试剂B 11.5 1.05 1.14 1313 N/A
实施例1：细胞培养基本工艺
本实施例介绍了本发明所适用的细胞培养过程，在本实施例中，细胞收获液中的目标蛋白为重组全人源抗程序性死亡受体1(PD-1)的双特异性抗体。
细胞培养过程基本工艺包括：
1)种子复苏：从工作细胞库中取出一株表达抗PD-1的双特异性抗体的工作细胞，在水浴锅中37℃±0.5℃解冻，将细胞悬液转移到离心管中，加入10mL基础培养基M，1000r/min离心5分钟，去上清，用基础培养基M重悬细胞并转移到125mL平底摇瓶中，补充体积至30mL，混匀后取样进行细胞计数。将摇瓶置于二氧化碳摇床，并在36.5℃±0.5℃，6％±1％CO2，130±10r/min的条件下，培养3±1天。
2)摇瓶扩增：用基础培养基M将上述步骤1)中复苏后的细胞按(0.5±0.2)×106个/mL的密度稀释至新的摇瓶中，置于二氧化碳摇床中，并在36.5℃±0.5℃，6％±1％CO2，130±10r/min的条件下，培养3±1天，逐级扩增至细胞数量满足流加培养接种要求时进行接种。摇瓶扩增阶段细胞活率应≥90％，细胞密度达到(1.0～7.0)×106个/mL时接种至下一级。
3)流加培养：培养周期14天，接种密度为(0.7～1.3)×106个/mL，培养至第3、5、7、9、11天分别流加5％(w/w)初始培养重量的流加试剂A和0.5％(w/w)的流加试剂B，溶氧设置为20～80％，初始培养温度设置为36～37℃，第五天降温至32～34℃，葡萄糖低于4.0g/L时，补加200g/kg的葡萄糖浓缩液使细胞培养液中葡萄糖浓度提高到5.0g/L，根据实际泡沫量手动加入消泡剂，总量不超过100ppm。
图1、图2和图3分别出示了细胞培养过程中活细胞密度(VCD)随时间变化的曲线图、细胞活率(VIB)随时间变化的曲线图、蛋白表达量随时间变化的曲线图。
实施例2：包含抗PD-1受体的双特异性抗体的细胞培养液在传统两级深层过滤膜包串联的情况下在深层过滤工艺阶段的表现
A)深层过滤膜的组装：膜包D0HC(Millipore公司产品，货号MDOHC23CL3，膜包死体积23mL)，膜包X0HC(Millipore公司产品，货号：MXOHC23CL3，膜包死体积23mL)，使用硅胶管(NALGENE公司产品，货号：8600-0030)，先后串联蠕动泵(Intertek公司产品，型号：120s)-压力表(Millipore公司产品，货号：SLTEST000)-D0HC膜包-X0HC膜包，由蠕动泵泵入缓冲液或样品，最后从X0HC膜包流出。
B)用超纯水冲洗深层过滤膜包，将膜包内空气全部赶出，充分润湿。为了达到超纯水冲洗深层过滤膜的最佳通量以及冲洗体积，减少资源的浪费；在500～600LMH的通量条件下用100～200L/m2的超纯水分别冲洗D0HC膜包和X0HC膜包，实际冲洗量约0.5L。
C)在细胞培养液通过深层过滤膜包前，需用一种合适的缓冲液将膜包内的注射用水置换出来，保证当料液进入深层过滤膜包时保持相对稳定的渗透压以及pH等条件，保持抗体蛋白性质的稳定。所述缓冲液为包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2的平衡缓冲液。
所述平衡缓冲液的成分和含量如下表所示：
试剂名称 级别 浓度
Tris 药用级 0.26g/L
Tris盐酸盐 高纯级 2.82g/L
氯化钠 药用级 8.77g/L
保持与上述超纯水冲洗深层过滤膜的通量500～600LMH不变，用20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH 7.2的缓冲溶液平衡深层过滤膜包，平衡体积2～3CV，实际润洗体积0.15L。
D)平衡结束后，将实施例1培养得到的细胞密度23.4×106cell/mL，细胞活率为95.2％，浊度为2955NTU，titer为6.16g/L的抗PD-1双特异性抗体细胞培养液通过蠕动泵泵入深层过滤膜包，细胞培养液通量100LMH，前1/2CV的过滤液作为废液排放，实际排放约30mL的平衡液。
E)为了能够得到真实抗PD-1双特异性抗体细胞培养液深层过滤澄清的过程，每隔一定时间记录深层过滤膜两侧的压力差P(psi)、过滤出口端测得的瞬时浊度(NTU)，深层过滤过程中若终点压力接近14.5psi，终点浊度接近15NTU则判定为膜包堵塞，载量达到终止点。压力、瞬时浊度和混合浊度在不同时间点的测试结果如下表所示：
时间(min) 压力(psi) 瞬时浊度(NTU) 混合浊度(NTU)
0 0 0 0
20 14.5 N/A 8.4
F)当细胞培养液深层过滤结束后，需要用步骤c)中所述的平衡缓冲液将滤膜内残留的细胞培养液赶出回收，简称冲膜回收。冲洗膜包回收细胞澄清液时，用20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH 7.2的平衡缓冲溶液冲洗滤膜，通量保持与步骤D)中细胞培养液澄清过滤时一致，即100LMH，冲洗体积为2～3CV，实际冲洗体积约115mL。
G)合并顶洗收集液和样品，根据公式分别计算得一级膜包载量：(77.28/0.0023)/1000＝33.6L/m2，二级膜包载量：(77.28/0.0023)/1000＝33.6L/m2，收率：【(157.28*2.48)/(77.28*6.16)】＝82％。
其中，所述一级膜包载量、二级膜包载量和收率的计算公式如下：
一级膜包载量：过滤细胞培养液体积/一级膜包膜面积；
二级膜包载量：过滤细胞培养液体积/二级膜包膜面积；
收率：【(收集液总体积*收集液蛋白含量)/(过滤细胞培养液体积*过滤细胞培养液蛋白含量)】*100％。
实施例3：包含抗PD-1受体的双特异性抗体的细胞培养液在模拟连续流离心机离心的情况下在深层过滤工艺阶段的表现
A)深层过滤膜的组装：膜包D0HC(millipore公司产品，货号MDOHC23CL3，膜包死体积23mL)，膜包X0HC(millipore公司产品，货号：MXOHC23CL3，膜包死体积23mL)，使用硅胶管(NALGENE公司产品，货号：8600-0030)先后串联蠕动泵(Intertek公司产品，型号：120s)-压力表(Millipore公司产品，货号：SLTEST000)-D0HC膜包-X0HC膜包，由蠕动泵泵入缓冲液或样品，最后从X0HC膜包流出。
B)离心：离心力参数设定为2000G离心力、离心3min；将实施例1培养得到的细胞密度23.4×106cell/mL，细胞活率为95.2％，浊度为2955NTU、titer为6.16g/L的抗PD-1双特异性抗体细胞培养液以2000G离心力离心3min，检测浊度：122NTU，Titer：6.35g/L；
C)超纯水冲洗深层过滤膜包，将膜包内空气全部赶出，充分润湿。
D)细胞培养液通过深层过滤膜包前，需用一种合适的缓冲液将膜包内的注射用水置换出来，保证当料液进入深层过滤膜包时保持相对稳定的渗透压以及pH等条件，保持抗体蛋白性质的稳定。所述缓冲液中包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH 7.2。保持与上述超纯水冲洗深层过滤膜的通量500～600LMH不变，用20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH 7.2的缓冲溶液平衡深层过滤膜包，平衡体积2～3CV，实际润洗体积约0.15L。
E)平衡结束后，将离心后的细胞培养液通过蠕动泵泵入深层过滤膜包，细胞培养液通量100LMH，前1/2CV的过滤液作为废液排放，实际排放约30mL的平衡液。
F)为了能够得到真实的包含抗PD-1双特异性抗体的细胞培养液深层过滤澄清的过程，每隔一定时间记录深层过滤膜两侧的压力差P(psi)、过滤出口端测得的瞬时浊度(NTU)，深层过滤过程中深层过滤过程中若终点压力接近14.5psi，终点浊度接近15NTU则判定为膜包堵塞，载量达到终止点。压力、瞬时浊度和混合浊度在不同时间点的测试结果如下表所示：
时间(min) 压力(psi) 瞬时浊度(NTU) 混合浊度(NTU)
0 0 0 0
10 0 1.59 N/A
20 0 8.17 N/A
30 0 31.9 12.1
G)当细胞培养液深层过滤结束后，需要用平衡缓冲液将滤膜内残留的细胞培养液赶出回收，简称冲膜回收。冲洗膜包回收细胞澄清液时，用20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2的平衡缓冲溶液冲洗滤膜，通量保持与细胞培养液澄清过滤时一致，即100LMH，冲洗体积为2～3CV，实际冲洗体积0mL。
H)合并顶洗收集液和样品，称重(顶洗收集液+样品)141.7g，Titer：4.39g/L；浊度12.1NTU；
一级膜包载量：(170.95/0.0023)/1000＝61.6L/m2
二级膜包载量:(170.95/0.0023)/1000＝61.6L/m2
收率：【(141.7*4.39)/(170.95*6.35)】*100％＝57.3％
其中，所述一级膜包载量、二级膜包载量和收率的计算公式和实施例2中相同。
实施例4：包含抗PD-1受体的双特异性抗体的细胞培养液在酸沉淀的情况下在深层过滤工艺阶段的表现
A)将实施例1培养得到的细胞密度23.4×106cell/mL，细胞活率为95.2％，浊度为2955NTU，titer为6.16g/L的抗PD-1双特异性抗体细胞培养液加入2mol/L冰醋酸(台山新宁公司产品，货号：H44020291，配制批号：pu20190705-11)调节pH至4.8±0.2，后使用磁力搅拌器搅拌30min，检测浊度10260NTU；
B)深层过滤膜的组装：膜包20MS(货号:CS20MS01L3)使用硅胶管(NALGENE公司产品，货号：8600-0030)先后串联蠕动泵(Intertek公司产品，型号：120s)-压力表(MILLIPORE公司产品，货号：SLTEST000)-20MS膜包，由蠕动泵泵入缓冲液或样品，最后从20MS膜包流出。
C)用超纯水冲洗深层过滤膜包，将膜包内空气全部赶出，充分润湿。为了达到超纯水冲洗深层过滤膜的最佳通量以及冲洗体积，减少资源的浪费；本发明在500～600LMH的通量条件下用100～200L/m2的超纯水冲洗20MS膜包，实际冲洗量约0.25L；
D)在细胞培养液通过深层过滤膜包前，需用一种合适的缓冲液将膜包内的注射用水置换出来，保证当料液进入深层过滤膜包时保持相对稳定的渗透压以及pH等条件，保持抗体蛋白性质的稳定。所述缓冲液中包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2；保持与上述超纯水冲洗深层过滤膜的通量500～600LMH不变，用包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2的平衡缓冲溶液平衡深层过滤膜包，平衡体积2～3CV，实际润洗体积约60mL。
E)平衡结束后，将酸沉淀后浊度为10260NTU的抗PD-1双特异性抗体细胞培养液通过蠕动泵泵入深层过滤膜包，细胞培养液通量100LMH，前1/2CV的过滤液作为废液排放，实际排放约15mL的平衡液。
F)为了能够得到真实的包含抗PD-1双特异性抗体的细胞培养液深层过滤澄清的过程，每隔一定时间记录深层过滤膜两侧的压力差P(psi)、过滤出口端测得的瞬时浊度(NTU)，深层过滤过程中若终点压力接近14.5psi，终点浊度接近15NTU则判定为膜包堵塞，载量达到终止点。压力、瞬时浊度和混合浊度在不同时间点的测试结果如下表所示：
时间(min) 压力(psi) 瞬时浊度(NTU) 混合浊度(NTU)
0 2 N/A N/A
8 2 7.55 N/A
10 2 6.02 N/A
15 4 6.95 N/A
20 5 6.94 N/A
30 10 3.94 N/A
40 11 4.46 N/A
100 12 4.38 6.14
G)当细胞培养液深层过滤结束后，需要用平衡缓冲液将滤膜内残留的细胞培养液赶出回收，简称冲膜回收。冲洗膜包回收细胞澄清液时，用包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2的平衡缓冲溶液冲洗滤膜，通量保持与细胞培养液澄清过滤时一致，即100LMH，冲洗体积为2～3CV，实际冲洗体积约140mL。
H)使用2mol/L的Tris(Angus公司产品，货号：288733，批号：D609H69031，配制批号：pu20190610-11)16.5mL调节pH至7.0。
I)合并顶洗收集液和样品，称重(顶洗液+样品)540g，Titer：4.0g/L；浊度6.14NTU。
一级膜包载量：(438/0.0023)/1000＝190.4L/m2
收率：【(540*4.0)/(438*6.16)】*100％＝80％。
其中，所述一级膜包载量、二级膜包载量和收率的计算公式和实施例2中相同。
实施例5：包含抗PD-1受体的双特异性抗体的细胞培养液在模拟连续流离心机离心后加酸沉淀的情况下在深层过滤工艺阶段的表现
A)将实施例1培养得到的细胞密度23.4×106cell/mL，细胞活率为95.2％，浊度为2955NTU、titer为6.16g/l的抗PD-1双特异性抗体细胞培养液加入2mol/L冰醋酸(台山新宁公司产品，货号：H44020291，配制批号：pu20190705-11)56mL，调节pH至4.8，后使用磁力搅拌器搅拌30min；
B)离心：离心力参数设定为2000G离心力、离心3min；检测浊度：142NTU，Titer：6g/L
C)深层过滤膜的组装：膜包D0HC(millipore公司产品，货号：MDOHC23CL3，膜包死体积23mL)，膜包X0HC(millipore公司产品，货号：MXOHC23CL3，膜包死体积23mL)，使用硅胶管(NALGENE公司产品，货号：8600-0030)先后串联蠕动泵(Intertek公司产品，型号：120s)-压力表(millipore公司产品，货号：SLTEST000)-D0HC膜包-X0HC膜包，由蠕动泵泵入缓冲液或样品，最后从X0HC膜包流出；
D)用超纯水冲洗深层过滤膜包，将膜包内空气全部赶出，充分润湿。为了达到超纯水冲洗深层过滤膜的最佳通量以及冲洗体积，减少资源的浪费；在500～600LMH的通量条件下用100～200L/m2的超纯水分别冲洗D0HC膜包和X0HC膜包，实际冲洗量约0.5L；
E)在细胞培养液通过深层过滤膜包前，需用一种合适的缓冲液将膜包内的注射用水置换出来，保证当料液进入深层过滤膜包时保持相对稳定的渗透压以及pH等条件，保持抗体蛋白性质的稳定。所述缓冲液中包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2；保持与上述超纯水冲洗深层过滤膜的通量500～600LMH不变，用包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2的平衡缓冲溶液平衡深层过滤膜包，平衡体积2～3CV，实际润洗体积约0.15L。
F)平衡结束后，将经过酸沉加离心后的细胞培养液通过蠕动泵泵入深层过滤膜包，细胞培养液通量100LMH，前1/2CV的过滤液作为废液排放，实际排放约30mL的平衡液。
G)为了能够得到真实的包含抗PD-1双特异性抗体的细胞培养液深层过滤澄清的过程，每隔一定时间记录深层过滤膜两侧的压力差P(psi)、过滤出口端测得的瞬时浊度(NTU)，深层过滤过程中若终点压力接近14.5psi，终点浊度接近15NTU则判定为膜包堵塞，载量达到终止点。压力、瞬时浊度和混合浊度在不同时间点的测试结果如下表所示：
时间(min) 压力(psi) 瞬时浊度(NTU) 混合浊度(NTU)
0 1 142 N/A
10 1 0.92 N/A
20 1 3.42 N/A
25 2 3.13 N/A
30 2 2.87 N/A
40 2 3.30 N/A
50 2 2.81 N/A
60 2 3.22 N/A
70 3 3.28 N/A
80 3 3.32 N/A
90 4 3.38 N/A
100 4 3.37 N/A
110 5 3.41 N/A
130 8 3.42 N/A
150 11 3.50 N/A
160 13.5 3.45 N/A
170 14.5 3.70 2.98
H)当细胞培养液深层过滤结束后，需要用平衡缓冲液将滤膜内残留的细胞培养液赶出回收，简称冲膜回收。冲洗膜包回收细胞澄清液时，用包含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L氯化钠，pH为7.2的平衡缓冲溶液冲洗滤膜，通量保持与细胞培养液澄清过滤时一致，即100LMH，冲洗体积为2～3CV，实际冲洗体积约115mL。
I)用2mol/L Tris(Angus公司产品，货号：288733，批号：D609H69031,配制批号：pu20190610-11)16.5mL调节pH至7.01。
J)合并顶洗收集液和样品，称重(顶洗液+样品)989.7g，Titer：4.99g/L；浊度2.98NTU；
一级膜包载量：(863.4/0.0023)/1000＝375.4L/m2
二级膜包载量：(863.4/0.0023)/1000＝375.4L/m2
收率：【(989.7*4.99)/(863.4*6.05)】*100％＝95％。
其中，所述一级膜包载量、二级膜包载量和收率的计算公式和实施例2中相同。
【试验结果分析】
根据实施例2-5所示的以下试验数据：
分类 实施例 终点压力(psi) 终点浊度(NTU) 膜包载量(L/m2) 收率(％)
传统方法 2 14.5 8.4 33.6 82
加强传统方法 3 0 12.1 61.6 57.3
创新方法1 4 12 6.14 190.4 80
创新方法2 5 14.5 2.98 375.4 95
上述表格中所述“终点压力”和“终点浊度”分别为对应实施例在测试终点时间的压力和混合浊度。
可以看出：采用本发明提供的细胞液收获方法相对于(加强)传统方法能够(1)显著提高膜包载量、降低浊度；(2)同时还能够有效提高细胞培养液的收率。

Claims (16)

1.一种细胞培养液的收获方法，所述方法包括以下步骤：
1)提供宿主细胞，对宿主细胞进行种子复苏、摇瓶扩增培养和流加培养，得到细胞密度不小于1.0×106个/mL的细胞培养物；
2)向步骤1)中所述细胞培养物中添加酸性溶液，调节细胞培养物的pH为4.0～5.6，其中所述酸性溶液含有枸橼酸、醋酸、磷酸、正辛酸及其盐中的一种及一种以上；
3)对步骤2)所述的细胞培养物先进行深层过滤然后添加碱性溶液，得到细胞培养液，其中所述碱性溶液含有Tris、Tris-bis、组氨酸中的一种及一种以上；
4)收获步骤3)所述的细胞培养液；
在步骤1)中使用基础培养基M对所述宿主细胞进行种子复苏和摇瓶扩增，使用流加试剂A和流加试剂B对所述宿主细胞进行流加培养；
所述基础培养基M、流加试剂A和流加试剂B中的氨基酸组成分别为：
基础培养基M由1877μmol/L的天门冬氨酸、2958μmol/L的谷氨酸、7030μmol/L的天门冬酰胺、6743μmol/L的丝氨酸、1224μmol/L的组氨酸、1338μmol/L的甘氨酸、5330μmol/L的苏氨酸、1654μmol/L的精氨酸、957μmol/L的酪氨酸、250μmol/L的胱氨酸、4320μmol/L的缬氨酸、1486μmol/L的蛋氨酸、46μmol/L的正缬氨酸、1037μmol/L的色氨酸、1694μmol/L的苯丙氨酸、3621μmol/L的异亮氨酸、5714μmol/L的亮氨酸和3102μmol/L的赖氨酸组成；
流加试剂A由28522μmol/L的天门冬氨酸、69790μmol/L的谷氨酸、27269μmol/L的天门冬酰胺、67615μmol/L的丝氨酸、427μmol/L的甘氨酸、27743μmol/L的苏氨酸、24737μmol/L的精氨酸、15836μmol/L的丙氨酸、134μmol/L的酪氨酸、515μmol/L的胱氨酸、39443μmol/L的缬氨酸、9194μmol/L的蛋氨酸、23712μmol/L的苯丙氨酸、24995μmol/L的异亮氨酸、54470μmol/L的亮氨酸、41555μmol/L的赖氨酸和37559μmol/L的脯氨酸组成；
流加试剂B由681μmol/L的天门冬氨酸、2666μmol/L的谷氨酸、289μmol/L的丝氨酸、190μmol/L的谷氨酰胺、52542μmol/L的组氨酸、544μmol/L的甘氨酸、818μmol/L的精氨酸、2140μmol/L的丙氨酸、181291μmol/L的酪氨酸、60141μmol/L的胱氨酸、66897μmol/L的色氨酸、220μmol/L的赖氨酸和8305μmol/L的脯氨酸组成；
其中，所述基础培养基M溶解后pH为7.3～7.5，浊度为0.5～1NTU，渗透压为300～350mOsm/kg，葡萄糖含量为5～6g/L，其中谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸的含量均小于40μmol/L；
所述流加试剂A溶解后pH为6.5～6.8，浊度为1.5～2.5NTU，渗透压为1500～1800mOsm/kg，葡萄糖含量>75.02g/L，其中天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸的含量均大于10000μmol/L；
所述流加试剂B溶解后pH为11～11.5，浊度为1～1.5NTU，渗透压为1200～1500mOsm/kg，其中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10000μmol/L。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤3)中首先对步骤2)所述的细胞培养物进行深层过滤，得到细胞收集液，然后再向所述细胞收集液中添加碱性溶液、将所述细胞收集液的pH调节为5.0～8.0，从而得到相应的细胞培养液。
3.根据权利要求2所述的细胞培养液的收获方法，其中，在所述步骤2)之前或者在所述步骤2)之后额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。
4.根据权利要求1所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在步骤3)中首先向步骤2)所述的细胞培养物中添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0，然后再将所述细胞培养物进行深层过滤，从而得到相应的细胞培养液。
5.根据权利要求4所述的细胞培养液的收获方法，其中，在添加碱性溶液、将所述细胞培养物的pH调节为5.0～8.0之后或者在所述步骤2)之前额外增加对所述细胞培养物进行连续流离心机离心的操作。
6.根据权利要求1～5任一项中所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，在所述流加培养中，当溶液中葡萄糖的浓度低于4.0g/L时，补加葡萄糖使溶液中葡萄糖的浓度提高到5.0g/L，并根据实际泡沫量加入总量不超过100ppm的消泡剂。
7.根据权利要求6所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于：
所述基础培养基M中天门冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸的含量以质量百分比计均大于10％，且所述基础培养基M中不包含谷氨酰胺、羟脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸；
所述流加试剂A中谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸的含量以质量百分比计均大于10％，且所述流加试剂A中不含组氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、正缬氨酸、羟脯氨酸和肌氨酸；
所述流加试剂B中组氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量以质量百分比计均大于10％，且所述流加试剂B中不含天门冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、羟脯氨酸和肌氨酸。
8.根据权利要求7所述的细胞培养液的收获方法，其中，所述流加试剂B中酪氨酸的含量以质量百分比计为45～55％。
9.根据权利要求1～5、7～8任一项中所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，所述深层过滤中使用的膜包选自Millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS、40MS系列中的任意一种或任意两种的组合。
10.根据权利要求9所述的细胞培养液的收获方法，其中，所述膜包的过滤载量大于等于60升每平方米。
11.根据权利要求1～5、7～8和10任一项中所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
12.根据权利要求11所述的细胞培养液的收获方法，其中，所述哺乳动物细胞选自由CHO、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系组成的组。
13.根据权利要求12所述的细胞培养液的收获方法，其中，所述哺乳动物细胞为CHO-S或CHO-K1细胞。
14.根据权利要求11所述的细胞培养液的收获方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞包含编码外源蛋白的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的细胞培养液的收获方法，其中，所述外源蛋白为抗体。
16.根据权利要求15所述的细胞培养液的收获方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或双特异性抗体。
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