CN110945008A - 层析 - Google Patents
层析 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110945008A CN110945008A CN201880046930.7A CN201880046930A CN110945008A CN 110945008 A CN110945008 A CN 110945008A CN 201880046930 A CN201880046930 A CN 201880046930A CN 110945008 A CN110945008 A CN 110945008A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fraction
- chromatography matrix
- chromatography
- fractions
- interest
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 255
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 153
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 149
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims description 336
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 123
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 71
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 62
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 56
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 55
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 54
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 40
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims description 28
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 5
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000003821 enantio-separation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007872 degassing Methods 0.000 claims description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 163
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 42
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 abstract description 14
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 abstract description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 141
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 70
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 65
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 50
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000000306 component Substances 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 14
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 13
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 2
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150050927 Fcgrt gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 108700006385 OmpF Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001576 beta-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- HUSUHZRVLBSGBO-UHFFFAOYSA-L calcium;dihydrogen phosphate;hydroxide Chemical compound O.[Ca+2].OP([O-])([O-])=O HUSUHZRVLBSGBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012534 cell culture medium component Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940090568 combinations of vitamin Drugs 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000375 direct analysis in real time Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical class CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150036274 kil gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Substances [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002908 protein secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003667 tyrosine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
- B01D15/1814—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns recycling of the fraction to be distributed
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/24—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the treatment of the fractions to be distributed
- B01D15/245—Adding materials to the effluents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/24—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the treatment of the fractions to be distributed
- B01D15/247—Fraction collectors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Immunology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
本发明属于纯化特别是蛋白质纯化领域。本发明提供了用于蛋白质和其他生物分子的工业规模纯化的改进技术。更具体地，本发明涉及一种用于纯化目的化合物例如蛋白质，优选抗体或抗体片段的方法，其使用层析步骤，优选半连续层析步骤。
Description
发明领域
本发明属于纯化特别是蛋白质纯化领域。本发明提供了用于蛋白质和其他生物分子的工业规模纯化的改进技术。更具体地，本发明涉及一种用于纯化目的化合物例如蛋白质(优选抗体或抗体片段)的方法，其使用层析步骤,优选半连续层析步骤。
发明背景
蛋白质和核酸分子的大规模经济性的纯化对于生物技术产业而言日益成为重要的问题。通常，蛋白质是通过细胞培养产生的，其使用经工程化改造以产生目的蛋白质(通过插入含有该蛋白质基因的重组质粒)的哺乳动物或细菌细胞系。由于使用的细胞系是活生物体，因此必须向它们补给含有糖、氨基酸和生长因子的复合生长培养基。必须从补给到细胞的化合物的混合物和细胞本身的副产物(进料流)中分离出目的蛋白质，达到足以用作人用治疗剂的纯度。对于意图用于人给药的蛋白质，卫生当局关于进料流中的杂质制定的标准非常高。
工业蛋白质纯化通常在非常大的规模进行。用于产生治疗性蛋白质例如抗体的商业生物反应器通常包含数百、数千甚至数万升的培养基。细胞通常生长至所需水平，该水平可以通过例如在适当的波长(例如约600nm)测量生长培养基的光密度来确定，其中光密度的增加对应于生长培养基中细胞浓度的增加。
一旦达到了期望的水平，通常就制备粗蛋白提取物。粗提取物可以通过常规技术如裂解、过滤和/或初始浓缩等来制备以产生粗提取物。来自商业生物反应器的要处理的大量培养基相应产生大量的粗提物。例如，2000升的细胞培养物通常可产生数百升体积的粗蛋白提取物，经常含有数千克的期望蛋白。
工业蛋白质合成技术中产生的大量粗蛋白提取物需要专用的纯化技术。用于纯化很少体积(通常为数十至数百毫升)的粗蛋白提取物(原料)的实验室规模技术通常很难扩大到工业水平，原因是难以防止污染、需要高效处理、对自动化的要求等。因此，已经开发了工业规模的纯化技术用于大规模纯化生物分子例如蛋白质。
经常使用层析技术来实现蛋白质纯化，例如亲和层析(其基于目的蛋白质与偶联至层析基质的特异性配体之间的可逆相互作用来分离蛋白质)；离子交换层析(其基于蛋白质的带电基团与附接到层析基质的带相反电荷的分子的非特异性静电相互作用来分离蛋白质)；置换层析(其基于蛋白质对层析基质的动态亲和力分离蛋白质)；和大小排阻层析(其基于蛋白质的大小分离蛋白质)。这些和其他用于分离生物分子的层析技术的一个共同特点是存在合适的分离基质，通常称为树脂。层析基质通常较昂贵，并且由于不可逆的污染、基质材料的降解、基质上官能团的不期望的反应等原因，使用期限有限。需要在工业蛋白质纯化中处理的大体积的粗蛋白提取物相应地需要大量层析基质。这种基质的高成本是使纯化技术的效率尽可能最大化的驱动力。
设计蛋白质纯化技术时必须考虑的另一个方面是需要从目的蛋白质中去除的杂质的性质。通常，粗蛋白提取物中所含的杂质与目的蛋白相比，具有在结合层析基质方面明显不同的特征。这种杂质通常很容易去除。其他杂质通常与目的蛋白质具有相似的结合特征。通常，这些杂质可以至少部分地与期望蛋白质从基质上共洗脱，从而观察到一定程度的重叠。因此，包含目的蛋白质和杂质的原料通常可以被认为包含三种成分：目的产物(即产物生物分子)；与层析基质的结合比目的产物弱的杂质；以及与层析基质的结合比目的产物强的杂质。
分离此类组分的传统技术依赖于分批柱层析。将原料加载到柱上，并以小级分收集柱流出液。与层析柱最弱结合的原料组分首先洗脱。因此，除了仅含有目的产物的级分外，前导级分既包含目的产物还包含与层析基质的结合不如目的产物强的杂质；而尾部级分既包含目的产物还包含与层析基质的结合比目的产物更强的杂质。由于对要用于治疗应用的蛋白质的严格纯度要求，传统上将这些“重叠级分”(即前导级分和尾部级分)丢弃，从而降低了整个纯化方法的效率。
传统层析技术的另一方面是过载的概念。层析基质具有有限的结合载量。一旦达到此载量，过量的目的产物就不能结合基质，且通常会作为“过载”损失掉。另外，基质的选择性通常随着接近结合载量而降低。在传统技术中，过载的蛋白质样品可能会丢失或必须进一步处理，从而增加了污染的风险。
一种使用的标准工业技术是多柱逆流溶剂梯度纯化(MCSGP)。MCGSP是一种依赖于多个层析柱以将粗蛋白提取物纯化至期望水平的层析技术。在MCGSP中，与粗蛋白提取物流动方向相反切换多个层析柱的位置。总之，将粗蛋白提取物加载到第一柱上，以使目的蛋白与层析基质(树脂)结合。一旦已从基质洗掉弱吸收性杂质，就开始目的蛋白的洗脱。保留期望蛋白质的纯级分，同时将前导和尾部重叠级分导向第二柱，并与另外的进料(粗蛋白溶液)合并。然后在第二柱上重复该过程，并将重叠级分导向下一个柱。从理论上讲，可以将重叠级分重导向回第一柱，不过在实践中通常使用一系列的柱以容许在重新使用之前将各个柱清洁、重新平衡等的时间。以这种方式，由于不纯的重叠级分经过重复的纯化循环，可以高纯度地获得期望的蛋白质。
尽管MCSGP旨在在工业中大规模使用，但它与明显的缺点关联。从以上概述中可以明显看出，MSCGP最少需要两个匹配的层析柱，且在实践中经常使用超过两个柱以尽可能最大化方法的效率。层析中使用的基质(树脂)的高成本意味着要求多个柱显著增加了蛋白质生产的成本。MSCGP技术的另一个问题是，除了需要多个匹配的柱以外，所需设备的性质高度复杂，还需要复杂的流动控制装置和控制软件以及另外的层析硬件(包括在线混合器、泵、阀门、检测器和每个额外柱的容纳空间)，所有这些都增加了成本，增加了零件故障的可能性，增加了验证过程的复杂性并使对错误的诊断复杂化。MSCGP技术的另一个问题是要求方法连续运行。当不能按照标准的工作实践确定纯化进行(例如纯化来自大体积培养物的粗蛋白提取物)所需的时间时，可能会出现问题；例如要求操作者全天候超时工作。再一个问题是，为了实现充分的分离，需要缓慢的流动速率和/或大的基质体积。
出于这类考虑，本发明人已经认识到需要改进的技术以用于大规模蛋白质纯化。因此，本发明提供了一种用于在工业规模上纯化蛋白质和其他生物分子的改进方法，并且旨在解决上述问题中的一些或全部。
发明概述
虽然MCSGP已用于大规模工业蛋白质纯化中，但发明人已经认识到，在单个层析基质(例如单个柱)上分离目的产物(即产物生物分子)以及将重叠和任选地过载级分再循环，带来显著的益处。与使用多个柱的现有技术相比，单个基质的使用与明显的优势关联。由于只需要一个柱而不是多个柱，可以显著降低所需基质(树脂)的成本。操作柱所需的设备(例如)流动控制装置和控制软件的复杂性也显著降低，并且对层析硬件(例如在线混合器、泵、阀门、检测器等)的需要也减少了。重要的是，该过程可以不连续地(异步)进行，这允许纯化在工作日进行，甚至可以长时间中断。与先前已知的技术相比，使用相对较高的流动速率和/或较低的基质体积也能实现充分的分离。
先前，发明人在WO 2017/140881中报道了一种用于从混合物中纯化蛋白质的层析方法。WO 2017/140881中报道的方法涉及加载层析基质使得超过基质的结合载量，从而使含有未结合蛋白的流通液通过基质，然后将流通液在进一步的操作性层析循环中重新加载到基质中。发明人现在已经开发了一种新的层析技术，该技术涉及将来自原料的进料加载到层析基质上，洗脱产物，并将包含产物生物分子和至少一种杂质的洗脱液的级分重新加载到基质上。这样的方法不同于WO 2017/140881中报道的方法，并且与显著的有益效果(包括改进的纯化产率)有关。本发明的方法特别适合于初始部分纯化来自粗提取物的原料之后的“精制(polishing)”步骤。
由此，本发明提供了一种用于纯化产物生物分子(目的化合物，特别是目的蛋白质)的方法，该方法涉及更高效和更成本有效地使用层析基质，同时保持或改善纯化的化合物的产率和纯度。
因此，本发明提供了一种用于从包含产物生物分子和至少一种杂质的原料中纯化产物生物分子的工业规模的方法，该方法包括以下步骤：
a)将来自原料的进料加载到层析基质上，使得产物生物分子结合层析基质；
b)将产物生物分子在洗脱液中从层析基质洗脱，其通过将洗脱溶液施加到层析基质；
其中所述洗脱液包括：
-包含纯化的产物生物分子的第一级分；和
-包含产物生物分子和至少一种杂质的第二级分，所述第二级分包含一个或多个前导和/或尾部级分；
并且其中所述第一级分与第二级分是分开收集的；
c)将第二级分存放在一个或多个容器中；
d)将来自所述容器的第二级分和来自原料的另外的进料加载至层析基质，使得第二级分中的产物生物分子与层析基质结合；其中所述另外的进料与第二级分同时或序贯地加载；和
e)通过将洗脱溶液施加到层析基质上以将产物生物分子在洗脱液中从层析基质洗脱，其中所述洗脱液包含纯化的产物生物分子；
其中步骤(a)、步骤(b)、步骤(d)和步骤(e)中的层析基质为同一层析基质。
优选地，在本发明中，所述产物生物分子是蛋白质、抗体、抗体片段、多核苷酸或多肽。
还提供了根据本发明的方法，其进一步包括将纯化的产物生物分子与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或佐剂一起配制。本发明还提供了能通过本发明的方法获得的纯化的产物生物分子。
附图说明
图1示出了用于本发明方法的设置的示意图。将多种液体缓冲液组分存放在槽中，并经由阀门序贯地泵送通过多孔层析基质。从层析基质中排出后，洗脱液的级分通过检测器，该检测器分析洗脱液的离散体积，在本文中也称为洗脱液的级分。收集包含纯化的产物生物分子的“第一级分”(即，洗脱液的那些显示目的化合物的期望特征例如所述化合物的浓度或所述化合物的纯度的一个或多个级分)。从剩余的级分中收集既包含产物生物分子又包含至少一种杂质的“第二级分”(即未显示出期望特征但仍含有目的化合物并且原则上适合进一步处理的那些级分)以用于重新加载到同一层析基质。在图1的设置中，有两种级分，分别收集在容器“回收1”和“回收2”中。
图2至图7示出了根据本发明的方法的图。典型的层析分离可能牵涉结合阶段，其中产物生物分子(目的蛋白/目标化合物)结合固定化的基质，以及洗脱阶段，其中从基质中化学去除产物生物分子(目标化合物)。在它们之间通常存在洗涤和条件化步骤以去除其他杂质并保持基质的质量，在此期间这些材料通常导向至废液。在图2至图7所示的方法中，根据本发明，将包含产物生物分子(目的化合物)和至少一种杂质的混合物加载到层析基质中，洗涤所述加载的层析基质，并从层析基质洗脱产物生物分子(目的化合物)。收集包含纯化的产物生物分子的洗脱液的一个或多个“第一级分”(即显示出目的化合物期望特征例如所述化合物的浓度或所述化合物的纯度的那些级分)，并从方法中移出作为产物。在图2至图7中描绘的方法中，将在所述一个或多个第一级分之前的至少一个洗脱液级分和/或在所述一个或多个第一级分之后的至少一个洗脱液级分重新加载到同一层析基质。该程序可以重复数次，并且该过程通常持续进行直到包含产物生物分子的混合物体积(即原料的总体积)竭尽为止。
图2描述了本发明方法的一个例子。在将原料加载到层析基质之后，洗脱包含纯化的产物生物分子的第一级分。第二级分包括前导和/或尾部级分(本文定义)，其在重新加载到层析基质上之前任选地经过处理(例如通过稀释)。该循环重复多次。尽管图2描绘了尾部级分和前导级分都被重新加载，但本领域技术人员将理解，本发明的方法不需要将两种级分都如此重新加载，例如，可以仅将尾部(在后)和/或前导(在前)级分之一重新加载到基质上。
图3显示了本发明方法的另一个实例。在图3所示的方法中，将至少一个在前(前导)级分和/或至少一个在后(尾部)级分进行处理，然后在随后的操作性层析循环中将它们分别重新加载到同一层析基质。
在图4所示的方法中，将至少一个在前(前导)级分和至少一个在后(尾部)级分组合并加工成合并的级分，然后在随后的操作性层析循环中重新加载到同一层析基质。
图5示出了与图4所示的方法非常相似的方法，只不过洗脱液的合并级分的体积显著增加。合并级分的合并体积可以例如通过稀释增加。稀释是在将合并的级分重新加载到基质上之前对其进行处理的一个例子。
在图6所示的方法中，将至少一个在前(前导)级分和至少一个在后(尾部)级分与来自原料的另外的进料组合(即将混合物的另外体积或体积的另外一部分在操作性层析循环中加载到层析基质)，并施加到层析基质。同样，此程序可以重复几次。尽管图6描绘了尾部级分和前导级分都被重新加载，但是本领域技术人员将理解，本发明的方法不需要将两种级分都如此重新加载，例如可以仅将尾部和/或前导级分之一重新加载到基质上。
在图7所示的方法中，将至少一个在前(前导)级分和至少一个在后(尾部)级分与流通液(flow-through)(在图7中称为“再循环”)组合。当将包含产物生物分子(目的化合物)的负载施加到层析基质上直到其泄漏通过时，获得这种流通液。因此，该图描绘了过量加载的示例，如本文更详细描述的。尽管图7描绘了尾部级分和前导级分都被重新加载，但是本领域技术人员将理解，本发明的方法不需要将两种级分都如此重新加载，例如可以仅将尾部和/或前导级分之一重新加载到基质上。
图8至图14示出了在根据本发明的方法的多个循环期间记录的层析谱。图8至图14提供了包括7个操作性循环的本发明方法的实例(即，参照权利要求1的方法，步骤(b)、(c)和(d)重复了5次)。图8至图14显示了多个循环的可再现性，并证明了使用本发明的方法可以高产率地可再现地获得目的化合物(例如产物生物分子)。图8显示了层析基质平衡的初始阶段，随后是加载阶段(本发明方法的步骤(a))。加载完成后，可以洗涤基质，然后从基质中洗脱目的化合物(产物生物分子)，例如以梯度洗脱(该方法的步骤(b))。在260nm、280nm和305nm处记录的峰指示从基质洗脱蛋白质。图9至图14示出了本发明方法的后续循环。在图9至14中，加载阶段对应于本发明方法的步骤(d)。因此，图8示出了实施例的循环1的层析谱。图9示出了实施例的循环2的层析谱。图10示出了实施例的循环3的层析谱。图11显示了实施例的循环4的层析谱。图12示出了实施例的循环5的层析谱。图13示出了实施例的循环6的层析谱。图14显示了实施例的循环7的层析谱。
图15显示了循环1至7的层析谱的覆盖图。图15例示了来自根据本发明方法的目标生物分子的高产率。
图16是例示通过蛋白G HPLC测定的CEX梯度洗脱中汇合的杂质和Fab峰的图。图17是汇总了保留池(pool)中Fab的测定量的表(保留池中的测定量(主要含有非Fab的第9-20个级分和主要含有目的Fab的第23-31个级分)。图18是汇总了后期阳离子交换峰保留池中的％产率增加的表。图19是汇总了后期阳离子交换峰保留池中％纯度增加的表。(注意对于图17-19，循环7具有不同范围的纳入级分–对于早期峰为1-8，对于后期峰为24-31)。图20是显示后期阳离子交换峰中随着循环的产率和纯度增加的图，带有基线。(注意，由于每个级分体积恒定，因此总产率的增加也等同于总浓度的增加)。在实施例中描述了产生该数据和图17至20中汇总的数据的实验。
发明详述
本领域已知的许多蛋白质纯化方法含有需要应用例如低或高pH、高盐浓度或其他可能会不可逆转地危害待纯化蛋白质的生物学活性且因此不适用的极端条件的步骤。因此，将期望蛋白质以足够的纯度分离是巨大的挑战。历史上的蛋白质纯化方案基于待纯化蛋白质与不希望的蛋白质污染物之间的大小、电荷和溶解度的分子性质的差异。基于这些参数的方案包括大小排阻层析、离子交换层析、差异沉淀等。
抗体和抗体片段在一系列治疗领域中越来越重要。产生抗体和抗体片段的最重要方法之一是通过重组技术。此类技术使用宿主细胞表达期望的抗体，然后将其与生产培养基分离并纯化。
抗体需要糖基化，因此通常在使用真核细胞，特别是哺乳动物细胞如CHO、PER.C6、NS0、BHK或Sp2/0细胞的真核表达系统中表达。在真核表达系统中，通常将表达的目的蛋白(例如抗体)分泌到细胞培养基中。随后可以容易地将培养基与分泌蛋白质的细胞分离，例如通过离心或过滤。目的蛋白通常需要进一步纯化，例如通过层析。
用于各种层析技术，特别是用于大型工业规模纯化方法的层析基质非常昂贵。它们通常在清洁后重复使用。由于所用清洁剂的苛刻性质，层析基质效率会随时间降低。典型地，层析基质在本领域中不是非常有效地使用，例如因为没有充分利用其完全的最大蛋白质结合载量。在本领域中，使用层析基质的方式为使得其加载的目的蛋白低于其完全载量以改进产率。当蛋白质基质中加载的目的蛋白达到其完全载量时，许多目的蛋白质在流通液中流失。由于层析基质的高成本和有限的使用期，在本领域中需要最佳使用层析基质的方法。
来自大规模细胞培养过程的粗蛋白制备物通常不能在单个纯化循环中纯化。由于要纯化的蛋白质的量，需要相同纯化过程的几个循环来纯化细胞培养物的输出。因此，要纯化的蛋白质混合物经常在多个纯化循环(也涉及多个层析循环)中逐批纯化。在生物制药的大规模制备方法中也已实施了连续过程。在连续层析中，根据方法要求，几个相同的柱以允许串联和/或并联操作柱的布置方式连接。与单柱或分批层析(其中单个层析循环基于几个连续步骤，例如加载、洗涤、洗脱和再生)相比，在基于多个相同柱的连续层析中，所有这些步骤同时发生，但各自在不同的柱上发生。连续层析操作可更好地利用层析树脂，减少处理时间并减少缓冲液要求，所有这些都有利于过程经济性。操作连续层析的一种特定方式称为模拟移动床(SMB)层析。在模拟移动床层析中，构成系统的所有层析柱都朝与样品流动相反的方向周期性地同时移动。柱的移动是通过将进入柱的入口流和离开柱的出口流适当地改向而实现的，这需要复杂的设置。因此，诸如SMB方法之类的连续层析方法与显著的复杂性关联。
在本领域中已经描述了一种半连续层析方法，其中不使用单个大层析柱，而是连续地(in row)使用多个较小的柱并加载至更高的结合载量。每个柱的流通液直接加载到下一个柱上。或者，将第一个柱的流通液直接引回到具有目的蛋白质混合物的第一容器，然后重新加载到第一个柱上(Mahajan，George等，2012)。使用的柱具有非常小的实验室规模，且作者得出的结论是使用多个柱的连续模式层析提供了减少处理时间的优势。
连续地使用几个层析柱需要复杂的流动控制装置和控制软件，以及另外的层析硬件，包括泵、阀门、检测器和每个额外柱的容纳空间，这增加了成本，增加了部件故障的可能性，增加了验证过程的复杂性并使对错误的诊断复杂化。此外，为了将来自一个柱的流通液与相邻的接收柱的顺序在正确的时段对齐，必须引入延迟时段以使它们匹配，这会降低操作速度。由于必须以交错的顺序启动和停止每个另外的接收柱，从而产生这些时段内处于非活动状态的柱，因此每次关闭或重启动操作时都产生额外的生产率损失。
因此，需要用于纯化蛋白质(例如抗体)的简单、有效和成本有效的涉及使用层析基质的方法。本发明的方法旨在解决该需求。
本发明的方法
通过本文提供的方法解决了本发明的根本性的问题。
本发明提供了一种用于从包含产物生物分子和至少一种杂质的原料中纯化产物生物分子的工业规模的方法，该方法包括以下步骤：
a)将来自原料的进料加载到层析基质上，使得产物生物分子结合层析基质；
b)通过将洗脱溶液施加到层析基质上，将产物生物分子在洗脱液中从层析基质洗脱；
其中所述洗脱液包含：
-包含纯化的产物生物分子的第一级分；和
-包含产物生物分子和至少一种杂质的第二级分，所述第二级分包含一个或多个前导和/或尾部级分；
并且其中所述第一级分与第二级分是分开收集的；
c)将第二级分存放在一个或多个容器中；
d)将来自所述容器的第二级分和来自原料的另外的进料加载至层析基质，使得第二级分中的产物生物分子与层析基质结合；其中所述另外的进料与第二级分同时或序贯地加载；和
e)通过将洗脱溶液施加到层析基质上，将产物生物分子在洗脱液中从层析基质洗脱，其中所述洗脱液包含纯化的产物生物分子；
其中步骤(a)、步骤(b)、步骤(d)和步骤(e)中的层析基质为同一层析基质。
如下文更详细解释的，步骤(d)包括将来自原料的另外的进料与第二级分同时或序贯地加载到层析基质中。
优选地，在本发明的方法中，重复步骤(b)、(c)和(d)。优选地，步骤(b)、(c)和(d)进行至少2次，更优选至少3次，例如至少4次，例如至少5次，例如至少10次或更多。本领域技术人员将能够容易地根据原料的体积、原料中产物生物分子的纯度、原料中存在的杂质的特征等等来选择合适的次数来重复这些步骤。
显然，当步骤(b)、(c)和(d)重复一次时，该方法包括三个加载/洗脱循环(即步骤(a)中的第一加载循环；步骤(b)中的第一洗脱循环；步骤(d)中的第二加载循环；第二次步骤(b)中的第二洗脱循环；第二次步骤(d)中的第三加载循环和步骤(e)中的第三洗脱循环)。当步骤(b)、(c)和(d)重复2次时，本发明的方法包括四个加载/洗脱循环(即步骤(a)中的第一加载循环；步骤(b)中的第一洗脱循环；步骤(d)中的第二加载循环；第二次步骤(b)中的第二洗脱循环；第二次步骤(d)中的第三加载循环；第三次步骤(b)中的第三洗脱循环；第三次步骤(d)中的第四加载循环和步骤(e)中的第四洗脱循环)。换句话说，当步骤(b)、(c)和(d)重复n次(其中n为正整数)时，该方法包括(n+2)个加载/洗脱循环。
优选地，将步骤(a)和(b)重复多次。因此，可将来自原料的进料以多个体积施加到层析基质上，并且在每次进料加载后从层析基质洗脱第一和第二级分。收集的第二级分可优选合并在一起。步骤(c)优选地涉及将合并的第二级分存放在一个或多个容器中。备选地，在步骤(a)和(b)的每次重复之后获得的第二级分可以分别存放在一个或多个容器中。然后可以将第二级分以单个体积或多个体积重新加载到层析基质上，以使第二级分中的产物生物分子结合层析基质。因此，优选地，将步骤(a)和(b)重复多次；将每次步骤(b)中收集的第二级分合并在一起；步骤(c)包括将合并的第二级分存放在容器中；且步骤(d)包括将合并的第二级分从所述容器中加载到层析基质中，使得合并的第二级分中的产物生物分子与层析基质结合。
在第二方面，提供了一种用于从包含目的化合物的混合物中纯化该目的化合物的方法，其中该方法包括以下步骤：
a)在第一操作性层析循环中，将包含目的化合物的混合物从第一容器加载到层析基质中，操作为使得该化合物与层析基质结合；
b)从层析基质洗脱目的化合物，并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液的级分；
c)将一个或多个洗脱液级分重新加载到同一层析基质，操作为使得目的化合物结合层析基质。
在第二方面，优选地，步骤c)的重新加载是在进一步的操作性层析循环中将洗脱液的一个或多个级分重新加载到同一层析基质中，操作为使得目的化合物与层析基质结合。据此，第二方面的方法因此可以包括以下步骤：
a)在第一操作性层析循环中，将包含目的化合物的混合物从第一容器加载到层析基质中，操作为使得该化合物与层析基质结合；
b)从层析基质洗脱目的化合物，并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液的级分；
c)在进一步的层析循环中，将一个或多个洗脱液级分重新加载到同一层析基质中，操作为使得目的化合物与层析基质结合。
优选地，在第二方面，所述进一步的操作性层析循环是紧接其后的层析循环。
备选地，在第二方面的另一个实施方案中，步骤c)的重新加载是在同一个操作性层析循环中将一个或多个洗脱液级分重新加载到同一层析基质上，操作为使得该目的化合物结合层析基质。据此，该方法因此可以包括以下步骤：
a)在第一操作性层析循环中，将包含目的化合物的混合物从第一容器加载到层析基质中，操作为使得该化合物与层析基质结合；
b)从层析基质洗脱目的化合物，并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液的级分；
c)在同一个层析循环中将一个或多个洗脱液级分重新加载到同一层析基质中(即第一操作性层析循环)，操作为使得目的化合物与层析基质结合。
优选地，目的化合物是如本文定义的产物生物分子。
从上面的论述中明显的是，本发明的方法牵涉将原料(即，包含目的化合物即产物生物分子的混合物)加载到基质中；从基质洗脱产物生物分子(目的化合物)；收集包含纯化的产物生物分子的“第一级分”(即具有期望特征的级分)和包含产物生物分子和至少一种杂质的“第二级分”(即不具有期望特征的级分)；并将一种或多种这类第二级分重新加载到同一层析基质中。下面详细描述本发明的这些和其他方面。
保留级分
如上所述，本发明的方法涉及将来自原料的进料加载到层析基质上，并从基质洗脱目的化合物，即产物生物分子。由此，洗脱液包含一个或多个“第一级分”，其包含纯化的产物生物分子。所述洗脱液还包含一个或多个“第二级分”，其包含产物生物分子和至少一种杂质。
第一级分在本文中也称为“具有期望特征的级分”或“不重新加载至同一层析基质的洗脱液级分”。第二级分在本文中也被称为“具有不期望特征的级分”，或“重新加载至同一层析基质的洗脱液级分”。
本领域技术人员将能够容易地识别出要在本发明方法的步骤(d)中(重新)加载到层析基质的洗脱液的级分，并将这类级分与包含纯化的产物生物分子的级分区分开。可以使用任何合适的手段来确定要在本发明方法的步骤(d)中(重新)加载至层析基质的洗脱液的级分。例如，可以通过确定获得的洗脱液的体积或方法的运行时间(即，基于对原料性质的预先了解的知识以及第一和第二级分的特征)来识别要(重新)加载的级分。备选地，可以基于在方法过程期间进行的测量来识别要(重新)加载的级分。例如，第一级分优选具有最小浓度的产物生物分子(目的化合物)和/或最大浓度的除产物生物分子以外的化合物，即杂质。优选地，第一级分具有最小浓度的产物生物分子(目的化合物)。
以类似的方式，要在本发明方法的步骤(d)中(重新)加载到层析基质中的第二级分优选具有最大浓度的目的化合物或产物生物分子和/或最小浓度的除目的化合物以外的化合物，即杂质。优选地，第二级分具有最小浓度的除目的化合物以外的化合物(杂质)。
可以在本发明的方法中测量一个或多个洗脱液级分和/或流通液(参见下文)中的蛋白质或任何其他目的分子的浓度，其通过本领域已知的任何技术，例如但不限于测量光学吸光度或荧光。
可以在本发明的方法中测定样品中(例如在第一级分、第二级分和/或流通液中)的目的化合物，特别是目的蛋白质，其通过观察时间过程中超出了背景紫外吸光度或荧光信号的稳定态水平(由样品中其他蛋白质杂质引起)的紫外吸光度或荧光信号的增加或减少。
可以在本发明的方法中测量样品中(例如在第一级分、第二级分和/或流通液中)目的化合物(特别是目的蛋白质)的浓度，其通过在如本领域已知的任何合适波长(例如在280nm)处的紫外吸光度或荧光，优选使用次优的激发和/或发射波长，例如290nm、300nm或310nm，以允许在存在来自样品中蛋白质杂质的过量信号时检测样品中的目的蛋白质。
样品中目的化合物的浓度可以在线(on-line)、近线(at-line)或离线(offline)测定。在线测定浓度是指在本发明的方法中例如使用连接到层析基质的出口或者位于其中实时收集所述样品的一个或多个容器处或容器中的检测器来测定浓度。近线测定浓度是指从样本测定浓度，该样本取自层析基质的出口或其中收集所述样品的一个或多个容器。离线测定浓度是指从样本测定浓度，该样本取自层析基质的出口或其中收集所述样品的一个或多个容器，并在远处放置(即在与基质分开的室)的检测器上延迟后测量。优选在线或近线，更优选在线测定样品的浓度。
本领域技术人员将认识到，可以以与用于测量样品中产物生物分子的浓度相同的方式测量样品中的杂质浓度。
因此，本领域技术人员将理解，在本发明中，第一级分与第二级分不同。第一级分与第二级分分开收集。通常不将第一级分(重新)加载到层析基质中，而将第二级分(重新)加载到层析基质中进行进一步纯化。第一级分包含纯化的产物生物分子，而第二级分包含产物生物分子和至少一种杂质；即第二级分不包含纯化的产物生物分子。
如本文所用，术语“纯化的”产物生物分子不一定要求产物生物分子是100％纯的。纯化的产物生物分子可以含有不超过可接受水平的杂质，只要这类水平低于原料中的杂质水平。纯化的产物生物分子可以基本上没有杂质(例如，至少50％的纯度，例如至少70％的纯度，更优选至少90％的纯度，例如至少95％的纯度，至少97％的纯度，优选至少98或99％的纯度，例如相对于级分中的所有生物分子测定的，例如按重量％计)。杂质可包含除产物生物分子以外的生物分子，或可包含经修饰或降解的产物生物分子。第二级分中存在的杂质通常不同于第一级分中可能存在或保留的任何杂质。
以类似的方式，特别是参考上面论述的第二方面地，重新加载到同一层析基质中的一个或多个洗脱液级分与具有期望特征的一个或多个洗脱液级分不同。具有期望特征的一个或多个洗脱液级分不重新加载到同一层析基质中。如以下进一步描述的，本发明涵盖这种不重新加载的级分或者通过不同于层析处理的方法进一步处理，或者已准备好使用。本领域技术人员将根据层析处理的潜在的目的来确定不重新加载的级分数。例如，如果在洗脱液的一个或几个级分中达到目的化合物的某个含量或浓度，则这样的一个或几个级分将不会重新加载到同一层析基质中。用于确定是否将洗脱液的一个或多个级分中的一个或几个级分重新加载到同一层析基质中的另一个标准是不存在不想要的化合物例如杂质或其浓度降低。
前导和尾部级分
如上所述，生物分子的粗提取物通常含有杂质，其具有与产物生物分子(目的化合物)相似的对层析基质的结合特征。这种杂质的洗脱曲线通常至少部分与产物生物分子重叠。因此，“前导级分”既包含产物生物分子(目的化合物)，也包含对层析基质的结合没有产物生物分子强的杂质。“尾部级分”既包含产物生物分子(目的化合物)，也包含比产物生物分子更强地结合层析基质的杂质。在产物生物分子(目的化合物)之前，前导级分从层析基质中洗脱；而在产物生物分子(目的化合物)之后，尾部级分从层析基质中洗脱。前导级分也称为“在前级分”。尾部级分也称为“在后级分”。
在本发明的方法中，第二级分包含如本文所定义的一个或多个前导级分和/或一个或多个尾部级分。
优选地，第二级分包含一个或多个前导级分或由其组成。换句话说，特别是参考第二方面地，重新加载至同一层析基质的一个或多个洗脱液级分优选是在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前，从层析基质洗脱的至少一个洗脱液级分。本领域技术人员能够确定在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前，从层析基质洗脱的这类一个或多个洗脱液级分的数目，如在本文中更详细描述的。换句话说，本领域技术人员将能够容易地鉴定并入第二级分中的合适的前导级分以用于本发明的方法。可以用来鉴定适合并入第二级分中的前导级分的参数包括，目的化合物或产物生物分子的最小浓度和/或目的化合物以外的化合物即杂质的最大浓度；其可以如上所述测定。
优选地，第二级分优选包含紧接在第一级分之前的前导级分或由其组成。换句话说，与具有期望特征的一个或多个洗脱液级分不同的一个或多个洗脱液级分优选地包含紧接在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前从层析基质洗脱的级分。由此，第二级分优选包含紧邻第一级分并紧接在第一级分之前从层析基质洗脱的级分或由其组成。通过包括洗脱液的这种级分，尤其提高了目的化合物的纯化和/或富集。例如，紧接在第一级分之前的前导级分通常比在第一级分更前的前导级分含有更高浓度的目的化合物/产物生物分子。通过保留这类前导级分，增加了方法的总纯化产率。
优选地，第二级分包含尾部级分或由其组成。换句话说，特别是参考第二方面地，重新加载至同一层析基质的一个或多个洗脱液级分优选是在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后，从层析基质洗脱的至少一个洗脱液级分。与第二级分包含前导级分或由其组成时的情况(上文描述)相同的，本领域技术人员将能够容易地鉴定并入第二级分中的合适的尾部级分以用于本发明的方法。可以用来鉴定适合并入第二级分的尾部级分的参数包括，目的化合物或产物生物分子的最小浓度和/或目的化合物以外的化合物即杂质的最大浓度；其可以如上所述测定。
优选地，第二级分包含紧随第一级分之后的尾部级分或由其组成。换句话说，与具有期望特征的一个或多个级分不同的一个或多个洗脱液级分优选包含在具有期望特征的一个或多个洗脱液的级分之后，立即从层析基质洗脱的级分。由此，第二级分优选包含紧邻第一级分并紧接在第一级分之后从层析基质洗脱的级分或由其组成。与重新加载紧接在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前洗脱的洗脱液级分时的情况相同，包括这种洗脱液的级分特定地提高了目的化合物的纯化和/或富集。例如，紧接在第一级分之后的尾部级分通常含有比第一级分更后面的尾部级分更高浓度的目的化合物/产物生物分子。通过保留这类尾部级分，增加了该方法的总纯化产率。
优选地，第二级分包含紧接在第一级分之前的前导级分和紧接在第一级分之后的尾部级分两者或由其组成。换句话说，特别是参考第二方面地，不同于具有期望特征的一个或多个级分的一个或多个洗脱液级分且因此要重新加载到同一层析基质的一个或多个级分包含，在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前立即从层析基质中洗脱的级分，以及在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后立即从层析基质中洗脱的级分。由此，第二级分优选包含紧邻第一级分并紧接在第一级分之前从层析基质洗脱的级分以及紧邻第一级分并紧接在第一级分之后从层析基质洗脱的级分，或由其组成。
包括前导级分和尾部级分两者增加了方法的总纯化产率，并且还可以简化本发明方法中使用的设备。例如，可以减少用于存放第二级分的储存容器的数量，从而减少进料管线和所需的必要阀门位置的数量。另一个优点是前导级分和尾部级分可以匀质地加载到层析基质上，这是有益的，因为例如它允许容易地预测处理参数，诸如洗脱时间等。
因此，优选地，在本发明的方法中，第二级分包含紧接在第一级分之前的前导级分和/或紧接在第一级分之后的尾部级分，或由其组成。优选地，将前导级分和尾部级分分开地重新加载或者合并并重新加载到同一层析基质中。
以类似的方式，特别是参考上文论述的第二方面地，优选地：
i)重新加载到同一层析基质中的一个或多个洗脱液级分与具有期望特征的一个或多个洗脱液级分不同；
ii)重新加载到层析基质中的一个或多个洗脱液级分在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前从层析基质洗脱；和/或
重新加载到层析基质的一个或多个洗脱液级分在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后从层析基质中洗脱；
以及任选地
iii)重新加载到层析基质的一个或多个洗脱液级分(其在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前从层析基质中洗脱)；和重新加载到层析基质的一个或多个洗脱液级分(其在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后从层析基质中洗脱)被：
i)分开地重新加载到同一层析基质中；或
ii)合并并重新加载到同一层析基质中。
多个级分
如上所述，本发明的方法涉及将进料加载到层析基质上并从基质洗脱目标生物分子(目的化合物)。除了包含纯化的产物生物分子(并因此具有如本文所定义的期望特征)的第一级分之外，洗脱液还包含第二级分，该第二级分包含至少一种杂质(并由此具有如本文所定义的不期望的特征)。本发明的方法可以产生一个或多个这样的第二级分。如以下更详细描述地，多个第二级分可以以多种方式产生，包括通过从本发明方法的单个循环收集多个第二级分，或通过实施本发明方法的多个循环并在每个循环中收集单个或多个第二级分。
优选地，在本发明的方法中，可以收集多于一个的第二级分。在这种情况下，可以将收集的多个第二级分分别地(重新)加载到层析基质中；或可以组合(“合并在一起”)并作为合并级分重新加载到层析基质中。换句话说，如果一个或多个洗脱液级分是两个或更多个洗脱液级分，则将该两个或更多个洗脱液级分分别地重新加载到同一层析基质中。或者，可以组合两个或更多个洗脱液级分，并作为合并级分重新加载到同一层析基质中。
本发明的方法可以以多种方式产生多个第二级分。例如，可以将包含产物生物分子的原料(即，包含目的化合物的混合物)以多个部分加载到层析基质中，每个部分产生第一级分和第二级分。在这种情况下，可以将收集的第二级分分别地(重新)加载到层析基质中。或者，可以将第二级分合并在一起；并将合并的第二级分加载到层析基质上，使得第二级分中的产物生物分子与层析基质结合。
另一个例子是当将包含前导级分的第二级分与包含尾部级分的第二级分分开收集时。由此，可以将包含前导部分的第二级分和包含尾部级分的第二级分分别地(重新)加载到层析基质中。或者，可以将第二级分合并在一起；并将合并的第二级分加载到层析基质中，使得合并的第二级分中的产物生物分子与层析基质结合。
存放阶段
在本发明的方法中，一旦将来自原料的进料加载到层析柱上并且洗脱了第一和第二级分，则将第二级分在重新加载到层析基质之前存放在一个或多个容器中。该存放阶段对应于所要求保护的方法中的步骤(c)。
可以根据所论述的方法来控制存放时间。优选地，存放时间为至少5分钟，更优选为至少30分钟，例如至少1小时，例如至少2小时。更长的存放时间也是合适的，例如至少5小时、10小时、24小时、1天、2天、7天、14天、1个月、2个月、6个月或一年的存放时间。
因此，在本发明中，步骤(c)优选包括将第二级分存放至少5分钟。步骤(c)可优选包括将第二级分存放过夜。
本发明方法中的存放步骤的优点在于，如果需要，可以对层析设备或级分进行修改。例如，如下文进一步描述地，从层析基质中洗脱的级分可以在重新加载到柱之前进行进一步处理。或者，可以在存放时间期间更换、清洁或更新层析基质。就改善操作者的便利性而言，延长存放时间也可能是有利的。例如，可以将存放时间安排为过夜或跨周末运行，由此可以避免操作者加班的需要。存放步骤的另一个优点是，从层析基质中洗脱的级分(特别是第二级分)可以如本文所述在存放步骤期间进行测试。
处理
在本发明的方法中，可以处理重新加载到层析基质中的第二级分，以促进层析基质对生物分子的结合。优选在重新加载到层析基质之前或期间处理第二级分，以促进层析基质对生物分子的结合。不过，可以在将其从层析基质洗脱期间处理第二级分。因此，在所要求保护的本发明的方法中，优选在方法的步骤(b)和/或步骤(c)和/或步骤(d)期间，优选在步骤(c)和/或步骤(d)期间；最优选在方法的步骤(c)期间进行处理。
在本发明的方法中，处理第二级分优选包括改变所述第二级分(即，参考上述方法的第二方面，在重新加载之前或期间处理的一个或多个洗脱液级分)的pH、离子强度、浓度、温度和/或溶剂。处理还可包括混合和/或脱气。处理还可包括搅拌或搅动。如本文所述的用于处理样品的合适技术是本领域已知的。例如，改变样品的pH可以包括添加酸或碱。改变离子强度可以通过添加或扣留离子性物质例如盐，或通过稀释(例如在水或缓冲液中)来实现。改变浓度可以通过浓缩样品(例如使用真空过滤组件)或通过稀释(例如在水或缓冲液中)来实现。改变温度可以通过使用常规设备加热或冷却来实现。改变样品的溶剂可以通过缓冲液或溶剂交换如通过渗滤来实现。
本发明的方法可以有利地涉及测试第二级分。优选地，这样的测试是非破坏性测试，优选地是如本文所述的在线测试。如下文更详细描述的，测试第二级分优选包括测定第二级分中产物生物分子的一个或多个浓度；杂质的浓度；杂质的身份；pH；离子强度；温度；溶剂；和/或气体浓度。
为了有效地处理洗脱液的级分(即第二级分)，通常需要首先确定这类级分的影响目的化合物与层析基质结合的特征。例如，在改变样品的pH之前，通常需要确定样品的pH。类似地，在改变样品的离子强度、浓度和/或温度之前，通常分别需要确定样品的离子强度、浓度和/或温度。确定所述特征的方法是本领域技术人员已知的。
确定所述特征和处理级分的步骤可以彼此紧接地连接，即确定特征并且在确定一个或多个所述特征后紧接着改变一个或多个所述特征，使得经处理的级分中含有的目的化合物在施加后可以结合层析基质。或者，确定所述特征和处理的步骤可以彼此分开。这种分开可以是时间上的分开，即在确定所述特征与处理洗脱液的一个或多个级分之间存在时间间隔，即确定所述特征且仅在经过一定时间段后才改变一个或多个所述特征，以使经处理的级分中含有的目的化合物可以在施加时结合层析基质。通常，这种时间间隔为至少30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、1天、2天、7天、14天、1个月、2个月、6个月或1年。短时间间隔，例如不超过2天，更优选不超过24小时，例如不超过10小时，例如不超过5小时，例如不超过2小时，更优选不超过1小时，例如不超过30分钟的时间间隔可能是有益的，因为可以最小化目的化合物(即产物生物分子)降解和/或污染的可能性。如果需要纯化多批蛋白质，则更长的时间间隔，例如超过2天的时间间隔，例如至少7天，例如至少14天、1个月、2个月、6个月或1年或更长的时间间隔可能是有益的；通常在这种情况下，将洗脱液的级分(即第二级分)在延迟时间内冷冻以使降解和/或污染的可能性最小化。
一个或多个洗脱液级分(即第二级分)的特征可以在线、近线或离线确定。在线确定所述特征优选地是指在根据本发明的方法中确定所述特征，例如使用连接到层析基质的出口或者位于其中实时收集所述一个或多个洗脱液级分的一个或多个容器处或容器中的检测器。近线确定所述特征优选地是指用样品确定所述特征，该样品取自层析基质的出口或其中收集所述一个或多个洗脱液级分的一个或多个容器。离线确定所述特征优选地是指用样品确定所述特征，该样品取自层析基质的出口或其中收集所述一个或多个洗脱液级分的一个或多个容器，并在远处放置的检测器(即在与基质分开的室)上延迟后测量。优选在线或近线，更优选在线地确定所述级分的特征。
另外的原料
在本发明中，将第二级分与来自原料的另外的进料一起(即与包含目的化合物的另外的混合物一起)重新加载至层析基质中。将另外的进料与第二级分同时或序贯地加载。可以将另外的进料添加到存放在一个或多个容器中的第二级分中，然后将所得混合物加载到层析基质。或者，可以在从一个或多个容器加载第二级分之前、期间或之后，将另外的进料加载到层析基质中。
因此，步骤(d)包括将来自原料的另外的进料与第二级分同时或序贯地加载至层析基质。换句话说，特别是参考上面论述的第二方面地，将一个或多个洗脱液级分与包含目的化合物的混合物一起或至少与所述混合物的部分一起重新加载到同一层析基质中。包含目的化合物的混合物(其与洗脱液的级分一起加载到层析基质)优选未经历本发明方法的任何操作性层析循环。然而，在本发明中涵盖了这类混合物已经经历了任何形式的下游处理。
在本发明中，步骤(d)包括将来自原料的另外的进料与第二级分同时或序贯地加载到层析基质中。第二级分优选在与进料一起重新加载之前或期间进行处理。换句话说，特别是参考上面论述的第二方面地，在本发明中，将洗脱液的级分与包含目的化合物的全部或部分混合物一起重新加载到层析基质中，且优选地，与包含目的化合物的混合物合并的一个或多个洗脱液级分在重新加载之前或期间经过处理，以使与包含目的化合物的混合物合并的一个或多个洗脱液级分中含有的目的化合物在重新加载时结合层析基质。
第二级分与来自原料的另外的进料的组合(即一个或多个洗脱液级分与包含目的化合物的混合物的组合)在本文中也称为合并的负载(combined load)。关于合并的负载的这类处理，同样适用本文中关于一个或多个洗脱液级分的处理(上文描述)所列出的内容。
加载进料
从本发明的以上描述中将明显的是，本发明的方法涉及将来自原料(即包含产物生物分子即目的化合物的混合物)的进料加载到层析基质中，使得产物生物分子结合层析基质。
本发明不需要将全部原料以一体积加载到层析基质中，尽管这并不排除在外。由此，本发明可以涉及将全部原料以一体积加载到层析基质中。然而，更优选地，将原料的总体积的一部分(即，来自原料的进料)加载到层析基质中，并执行本发明的方法。然后可以如本文所述根据本发明将另外的进料加载到层析基质上。例如，如上文解释的，方法的步骤(d)涉及将来自原料的另外的进料与第二级分同时或序贯地加载到层析基质中。
换句话说，特别是参考上文论述的第二方面地，优选在第一操作性层析循环中将第一体积的包含目的化合物的混合物从第一容器加载到层析基质中，操作为使得目的化合物结合层析基质。因此，在这样的实施方案中，并非包含目的化合物的全部混合物(要对其进行本发明方法)都处于加载到层析基质中的第一操作性层析循环中。
优选地，在本发明中，将原料加载到层析基质上，直到达到期望的负载。例如，优选地可以将原料加载到层析基质上，直到达到层析基质的静态结合载量的40％至100％，例如50％或60％至90％，例如70％至80％。换句话说，当将包含目的化合物的混合物从第一容器加载至层析基质，操作为使得目的化合物结合层析基质时，该负载通常使得目的化合物与层析基质结合直到达到层析基质的静态结合载量的40至100％、50至100％、60至100％、70至100％、80至100％、90至100％、70至90％或70至80％、60至90％、60至80％。将原料加载到层析基质上至负载低于基质静态结合载量的100％有时可能是有利的，例如在期望增加目标生物分子和杂质分离的应用中。
流通液
如本领域技术人员将理解的，当将包含产物生物分子的原料加载到层析基质上时，进料中产物生物分子总量的全部或仅一部分可以结合层析基质。不与层析基质结合的过量产物生物分子(目的化合物)保持不被基质捕获，且可以从层析基质中作为流通液收集。当将过量的进料加载至层析基质从而超出了基质的静态结合载量时，可能会发生这种情况。
流通液(如果存在)在某些情况下可能包含高水平的产物生物分子(目的化合物)，且因此可以有价值地回收以进行纯化。如果将来自原料的过量进料添加到层析基质中从而超过了基质的静态结合载量，例如如果超过了基质的静态结合载量至少10％，例如至少20％，例如至少50％，例如可以超过基质的静态结合载量至少100％或更多，可能产生流通液。可以有意地在本发明的方法中施加过量的负载，例如以使纯化速度最大化。由此，要求保护的方法的步骤(a)可以包括将来自原料的进料加载到层析基质上使得超过层析基质的动态结合载量，并收集含有未结合的产物生物分子的流通液。如此收集的流通液可以重新加载到层析基质上，例如，在该方法的再一个循环中，或在该方法的步骤(d)中与第二洗脱液级分和/或来自原料的另外的进料一起。
流通液的高潜在价值意味着期望对其进行回收和纯化以获得目的化合物(产物生物分子)。
因此，本发明要求保护的方法的步骤(a)优选进一步包括收集含有未结合层析基质的未结合产物生物分子的流通液；和步骤(d)优选进一步包括将流通液与第二级分和/或另外的进料同时或序贯地加载到层析基质中。步骤(d)可以包括加载全部或仅部分流通液。当在步骤(d)中仅加载一部分流通液时，优选保留剩余的流通液，并随后将其加载到层析基质上，例如与来自原料的另外的进料一起。优选将流通液存放在一个或多个容器中达存放时间，如下文论述地。所述一个或多个容器可以是用于存放第二级分的同一容器。或者，用于存放流通液的一个或多个容器可以与用于存放第二级分的一个或多个容器是分开的。优选可以处理流通液以促进产物生物分子与层析基质的结合。可以使用任何合适的处理步骤，例如上文针对第二级分所述的任何处理步骤。
尽管可以将流通液与第二级分同时或序贯地加载到层析基质中，但是备选地可以将流通液与第二级分分别地重新加载到层析基质中。例如，可以将流通液与来自原料的另外的进料同时或序贯地加载到层析基质中(即在该方法的步骤(a)中)。
当将流通液重新加载到层析基质中时，无论是在该方法的步骤(d)还是步骤(a)中，层析基质都优选加载为直至达到该层析基质的静态结合载量的40％至100％，例如50％或60％至90％，例如70％至80％。这降低了产物生物分子反复流过层析基质而不被基质结合的可能性。
因此，特别是参考上文论述的第二方面的方法地，这类方法优选涉及，在从层析基质洗脱目的化合物并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液级分之前，有以下步骤：
ab)在第二容器中收集含有未结合的目的化合物的流通液，以及
ac)在进一步的操作性层析循环中，将来自第二容器的流通液重新加载到同一层析基质中，操作为使得目的化合物与层析基质结合。
优选地，这类方法还可以包括，在从层析基质洗脱目的化合物并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液级分之前，有以下步骤：
ab)在第二容器中收集含有未结合的目的化合物的流通液，以及
ac)在进一步的操作性层析循环中将来自第二容器的流通液重新加载到同一层析基质中并另外加载新鲜的加载混合物，操作为使得目的蛋白质结合到层析基质。
所述新鲜的加载混合物可以是来自原料的第二体积的进料。因此，该方法优选地包括以下步骤：在进一步的操作性层析循环中将来自第二容器的流通液重新加载和将来自第一容器的目的化合物的第二体积加载至同一层析基质，操作为使得目的蛋白质与层析基质结合。本发明涵盖目的化合物的这类第二体积是包含目的化合物的混合物的第二体积。
优选地，在重新加载来自第二容器的流通液的步骤中，层析基质操作为直到达到层析基质静态结合载量的40至100％、50至100％、60至100％、70至100％、80至100％、90至100％、70至90％或70至80％、60至90％、60至80％。优选地，可以达到层析基质的静态结合载量的40％至100％，例如50％或60％至90％，例如70％至80％。
优选地，特别是参考上面论述的第二方面的方法地，在操作性层析循环中分别重新加载在第二容器中收集的流通液和一个或多个洗脱液级分。本发明涵盖将流通液的仅一部分，即流通液体积的一部分和/或一个或多个洗脱液级分的仅一部分，即一个或多个洗脱液级分的体积的仅一部分，在一个操作性层析循环中分别地重新加载。优选地，收集在第二容器中的流通液和一个或多个级分分别地在同一个操作性层析循环中重新加载，优选在紧接在第一操作性层析循环之后的层析循环中重新加载。
备选地，第二容器中收集的流通液和一个或多个级分优选地可以在不同的操作性层析循环中分别地重新加载。本发明涵盖将一个或多个洗脱液级分在第二容器中收集的流通液之前重新加载到同一层析基质中。然而，本发明也涵盖将第二个容器中收集的流通液在一个或多个洗脱液级分之前重新加载到同一层析基质中。
在一个备选的实施方案中，可以将流通液和一个或多个洗脱液级分组合，并作为组合重新加载到同一层析基质上，操作为使得目的化合物与层析基质结合。本发明涵盖如本文关于处理一个或多个洗脱液级分所公开的那样来处理所述组合。
因此，在本发明的第二方面，优选可在第一操作性层析循环中将包含目的化合物的混合物的第一体积从第一容器加载至层析基质，操作为使得超过该层析基质的动态结合载量，且该方法包括，在从层析基质洗脱目的化合物并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液级分之前，有以下步骤：
ab)在第二容器中收集含有未结合的目的化合物的流通液；和
ac)在进一步的操作性层析循环中将来自第二个容器的流通液重新加载并将目的化合物的第二体积从第一容器中加载到同一层析基质中，操作为使得超过层析基质的动态结合载量。本发明涵盖目的化合物的这类第二体积是包含目的化合物的混合物的第二体积。
优选地，在将包含目的化合物的混合物的第一体积在第一操作性层析循环中从第一容器加载到层析基质，操作为使得超过了层析基质的动态结合载量的步骤中，当达到最大静态结合载量的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％时，停止目的蛋白的加载。
优选地，在本发明的方法中，在流通液中产物生物分子(目的蛋白质)的预定的第一浓度时开始收集流通液，并在流通液中产物生物分子(目的蛋白质)的预定的第二浓度时停止收集。优选在流通液中目的蛋白质的浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml或0.2mg/ml时开始收集流通液中的产物生物分子(目的蛋白质)和/或在流通液中目的蛋白质的浓度为0.6mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml时停止收集。优选地，在第二容器中收集预定的流通液级分，如例如流通液的50％、40％、30％、20％、10％或5％。
优选地，在一个实施方案中，所收集的流通液(例如在第二容器中)在重新加载到层析基质上(例如在再一个操作性层析循环中)之前或之时未经过处理。优选地，在层析循环完成之后，将收集的流通液(例如在第二容器中)直接在下一个操作性层析循环中重新加载到层析基质上。优选地，在另一个实施方案中，所收集的流通液(例如在第二容器中)在重新加载到层析基质上(例如在再一个操作性层析循环中)之前或之时经过处理。处理可以是例如搅拌或搅动，稀释(例如在水或缓冲液中)，浓度调节(例如使用真空过滤组件)，pH调节，电导率调节，缓冲液或溶剂交换，冷却或加热或其任意组合。处理可以如上文针对第二级分所描述的那样。
优选地，合并收集的(例如在第二容器中)来自多个分别的操作性层析循环(即，本发明方法的几个循环)的流通液，并在另一个循环中重新加载到同一层析基质上。可以收集来自2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或超过10个操作性层析循环的流通液(例如，在单个第二容器中或在第二、第三、第四或更多容器中)并重新加载到层析基质上，例如在进一步的操作性层析循环中。
优选地，在本发明方法的一个实施方案中，在随后的操作性层析循环中将收集的流通液重新加载(例如从第二容器中)到层析基质上，然后将含有目的蛋白质的来自第一容器的新批次混合物加载到所述层析基质上。在含有目的化合物(优选目的蛋白质)的来自第一容器的混合物之前在随后的操作性层析循环中重新加载流通液允许通过空柱完全结合再循环的目的化合物(优选目的蛋白质)，这样确保仅在两个循环内将其捕获。备选地，在另一个实施方案中，优选在含有目的化合物(优选目的蛋白质)的来自第一容器的新批次混合物加载到层析基质之后或与其一起在随后的操作性层析循环中将收集的流通液从第二容器中重新加载到所述层析基质上。换句话说，可以将流通液与来自原料的另外进料分开地或与来自原料的另外进料一起加载到层析基质中。
优选地，将收集在第二容器中的流通液存储至少30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、24小时、1天、2天、7天、14天、1个月、2个月、6个月或1年。较短的存储时段(存放时间)，例如存放时间不超过2天，更优选地不超过24小时，例如不超过10小时，例如不超过5小时，例如不超过2小时，更优选不超过1小时，例如不超过30分钟可能是有益的，因为可以将流通液中产物生物分子(即目的化合物)的降解和/或污染的可能性最小化。如果必须纯化多个批次的流通液，则更长的存放时间，例如超过2天，例如至少7天，例如至少14天、1个月、2个月、6个月或1年或更长的存放时间可能是有益的；通常在这种情况下，将流通液在存放时间内冷冻以最小化降解和/或污染的可能性。
原料
如本文所述，包含产物生物分子(即目的化合物)的混合物也称为原料。在本发明的方法中，将来自原料的进料加载到层析基质上。
优选地，在一个实施方案中，原料(混合物)包含产物生物分子(即目的化合物，优选目的蛋白质)；和原核生物(例如细菌)宿主细胞污染物，例如宿主细胞蛋白质、核酸或脂质。优选地，在另一个实施方案中，原料(混合物)包含产物生物分子(目的化合物，优选目的蛋白质)和真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞污染物，例如宿主细胞蛋白、核酸或脂质。
优选地，在本发明中，原料(即，包含目的化合物的混合物)具有的体积为至少20升，例如至少50升，例如至少60升，例如至少80升，更优选至少100升，例如至少500升，例如至少1000L或更大，例如至少5000L，例如至少10000L，例如多达至少50,000L、100,000L或更大。由此，混合物/原料具有的体积优选地可以大于1,000L，例如1000L至50,000L或100,000L，优选5,000L至20,000L，例如约10,000L。也可以使用2L至100L的较小体积，例如20L至50L。
优选地，产物生物分子(即目的化合物)选自包含以下的组：蛋白质、抗体、抗体片段、核酸分子(即多核苷酸)、多肽和小分子，例如目的化合物(即产物生物分子)优选选自包含以下的组：蛋白质、抗体、抗体片段、多核苷酸和多肽。优选地，产物生物分子(即目的化合物)选自包含以下的组：蛋白质、抗体、抗体片段、核酸分子和小分子。优选地，产物生物分子(即目的化合物)是蛋白质。优选地，产物生物分子(即目的化合物)是抗体或抗体片段。
层析基质
许多层析技术是本领域已知的，并且与本发明的方法相容。
几乎所有当前的工业抗体纯化平台都使用蛋白A。蛋白A是在细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的一种细胞表面蛋白，该蛋白与哺乳动物免疫球蛋白的Fc部分结合。蛋白A对人IgG1和IgG2具有高亲和力，对人IgM、IgA和IgE抗体具有中等亲和力。因此，蛋白A纯化不太适用于缺少Fc部分的抗体片段。但是，蛋白A层析非常适合一些抗体(尤其是具有Fc部分的抗体)，并且与本发明的方法相容。亲和层析是基于目的蛋白(或蛋白的组)与偶联至层析基质的特异性配体之间的可逆相互作用来分离蛋白的。目的蛋白与偶联至层析基质的配体之间的相互作用可能是静电或疏水相互作用、范德华力和/或氢键键合的结果。为了从亲和介质中洗脱目标分子，可以特异性地使用竞争性配体或非特异性地通过改变pH、离子强度或极性来逆转相互作用。亲和纯化需要可与层析基质共价附接的配体。偶联的配体必须保持其对目标分子的特异性结合亲和力，并且在洗去未结合的材料之后，该配体和目标分子之间的结合必须是可逆的，以允许目标分子以活性形式移出。尽管普遍使用亲和层析，但它的价格昂贵，特别是在纯化治疗性蛋白质所需的工业规模上。本发明的方法与亲和层析相容，并且由于它们旨在最大化处理效率，因此它们至少部分解决了所涉及的高成本。
离子交换层析可用于纯化可电离分子。离子化分子是基于其带电基团与附接在固相支持基质上的带相反电荷的分子的非特异性静电相互作用，从而阻碍了那些与固相相互作用更强的离子化分子而分离的。每种类型的离子化分子的净电荷及其对基质的亲和力，根据带电基团的数量、每个基团的电荷以及竞争与带电固相基质相互作用的分子的性质而变化。这些差异导致通过离子交换层析解析各种分子类型。通常通过增加缓冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现与固相结合的分子的洗脱。改变pH，从而改变溶质的电荷是实现溶质洗脱的另一种方式。电导率或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(逐步洗脱)。已知两种一般的相互作用类型：由带负电荷的氨基酸侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)与带正电荷的表面相互作用介导的阴离子交换层析，以及由带正电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸和精氨酸)与带负电的表面相互作用介导的阳离子交换层析。阴离子交换剂可分类为弱或强。弱阴离子交换剂上的电荷基团是弱碱，它会去质子化，因此在高pH会失去电荷。二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素是弱阴离子交换剂的一个例子，其中氨基基团在低于pH～9可带正电，而在更高pH值逐渐失去其电荷。例如，DEAE或二乙基-(2-羟基-丙基)氨基乙基(QAE)具有氯离子作为反荷离子。
通过增加洗脱缓冲液的离子强度来洗脱(洗脱层析)的替代方式是使用对固定相的动态亲和力高于结合蛋白的分子进行洗脱。这种实施离子交换层析的模式称为置换层析。置换层析从根本上不同于任何其他模式的层析，因为溶质不在流动相改性剂中解吸附，而通过迁移速率的差异分离。在置换中，通过置换剂分子的前进冲击波迫使分子在层析柱上向下移动，该置换剂分子对固定相的亲和力高于进料流中的任何组分。与其他操作模式相比，正是这种强制迁移导致了更高的产物浓度和纯度。高保留，然后将置换剂溶液持续注入柱中。
本领域已知的这些和其他层析技术与本发明的方法相容。从上面的论述中可以明显看出，本发明的方法需要将产物生物分子(目的蛋白)加载到层析基质上，使得产物生物分子结合层析基质。这种层析模式称为结合和洗脱模式。该层析不同于例如在WO 2014/158231中描述的流通模式(flow-through mode)。
优选地，所述方法包括超过一种层析步骤，并且可以操作两种、三种、四种或所有层析步骤使得收集含有未结合的目的蛋白的流通液(例如，在除了从其加载到层析基质的容器以外的容器中)，并且在以后的操作性层析循环中将流通液重新加载(例如，从此类容器中)到同一层析基质。优选地，所述方法包括一种、两种、三种、四种或超过四种的层析步骤。优选地，在层析柱上进行一种、两种、三种、四种或全部层析步骤。优选地，所述方法包括三种层析步骤，其中三种层析步骤是蛋白A层析，然后是阳离子交换层析，接着是阴离子交换层析。在本发明方法的一个实施方案中，对蛋白A层析的洗脱液进行以结合和洗脱模式操作的阳离子交换层析，从中回收含有目的蛋白的洗脱液，并将这种洗脱液进行阴离子交换层析以产生含有目的蛋白的流通液。本领域技术人员理解，根据本发明的方法可以在三种层析步骤的每种之间包括其他步骤，如例如渗滤。
优选地，层析选自亲和层析例如蛋白A层析、阴离子或阳离子交换层析、疏水相互作用层析、混合模式层析例如羟基磷灰石层析、手性层析或介电层析(dielectricchromatography)。因此，优选地，层析基质选自：
-离子交换层析基质；
-疏水相互作用层析基质；
-亲和层析基质；
-混合模式层析基质；
-手性层析基质；和
-介电层析基质。
优选地，用于一种、两种、三种、四种或所有层析步骤的一种或多种层析基质是一种或多种层析柱。换句话说，在本发明的方法中，优选层析基质在层析柱中。
优选地，层析基质具有的床体积为至少1升，例如，至少4升，例如至少5升，更优选至少10L，例如至少20L，例如至少30L，优选地大于50L，典型地大于75L，更优选地至少100L或至少200L，例如优选地20L至200L，例如30L至100L，例如50L至100L。换言之，优选地，层析基质中的至少一个是具有的床体积大于1L、大于20L、大于30L、大于50L、大于75L、大于100L或大于200L，优选20L至200L、30L至100L或50L至100L的层析柱。
优选地，在本发明的方法中，在步骤(b)中洗脱液的体积至少等于层析基质的床体积。更优选地，洗脱液的体积是层析基质的床体积的至少2倍，例如层析基质的床体积的至少5倍，例如层析基质的床体积的至少10倍，例如层析基质床体积的至少15倍，例如层析基质床体积的至少20倍或更多。优选地，洗脱液的体积为层析基质床体积的2倍至20倍。
在其他实施方案中，优选层析基质是层析膜或整体式吸附器(monolithadsorber)。
优选地，在膜或整体式吸附器上操作一种、两种、三种、四种或所有层析步骤。
优选地，在单个层析柱、膜吸附器或整体式吸附器上操作一种、两种、三种、四种或所有层析步骤。
在本发明中，可以使用比常规层析技术中通常使用的流速更高的流速。在某种程度上这是可以实现的，因为目标生物分子(目的化合物)与原料(包含目的化合物的混合物)中杂质之间任何减少的分离可以通过将第二级分重新加载到层析基质上以进一步纯化来补偿。因此，本发明的方法优选可以涉及将产物生物分子(目的化合物)从层析基质以每分钟至少0.05至0.5个层析基质体积，例如以每分钟至少约0.1至约0.4个层析基质体积，例如以每分钟至少约0.2至约0.3个层析基质体积的流速洗脱。
本发明的方法可优选涉及将产物生物分子(目的化合物)以约60至约900cm/h的流速(其中cm符号是指层析基质的床高；通常为约20cm至约30cm，优选为约20cm；并且其中h＝小时)从层析基质洗脱，例如约120至约720cm/h，例如约240至约540cm/h，例如约300至约450cm/小时。
从上文论述中将明显看出，本发明方法的优点在于，过程长度(process length)不受限于层析基质的体积。换句话说，在第二级分重新加载之前收集第二级分允许根据本发明的方法处理超过层析基质的体积的原料体积。因此，在本发明的方法中，过程长度优选大于层析基质的体积。这通过使用容器来存储第二级分(即，重新加载到层析基质中的那些洗脱液级分)来有益地实现。
可以使用任何合适的容器，例如来存储第二级分和/或流通液。本领域技术人员将认识到，第二容器可以与层析设备一致，或者可以是外部容器。适当的阀门等将允许根据需要将级分引导至容器。
另外的方法步骤
优选地，可以将来自本发明方法的多个循环的第一级分合并或汇集在一起。因此，本发明的方法优选包括合并每个第一级分。
本发明的方法可优选包括渗滤和/或浓缩第一级分(包含目标生物分子，即目的化合物的洗脱液的级分)。优选地，在任选的渗滤之后将第一级分浓缩至适合于治疗用途的最终期望浓度。
本发明的方法可优选包括对纯化的产物生物分子进行纳米过滤。可以使用任何合适的装置进行纳米过滤。通常，使用孔径为约1nm至约10nm的聚合物(例如聚对苯二甲酸乙二酯)或金属(例如铝)膜进行纳米过滤。
本发明的方法可以优选进一步包括对纯化的产物生物分子进行进一步的层析纯化。可以使用任何合适的层析纯化，例如本文论述的任何层析方法。
本发明的方法可以优选地包括化学修饰纯化的产物生物分子。可以进行任何合适的化学修饰。例如，可以通过还原和/或聚乙二醇化来修饰产物生物分子。可以通过将产物生物分子附接到选自以下的一种或多种实体来对其进行修饰：放射性核素、药物、毒素、聚合物(例如PEG)、金属螯合物、荧光团、半抗原等。可以通过任何合适的方式，例如EDC/NHS偶联或通过蛋白质的反应性硫醇基之间的二硫化键形成来实现附接。可以使用化学还原剂来实现还原。
本发明的方法可优选进一步包括将目标生物分子/目的化合物与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或佐剂一起配制。
因此，本发明还提供了一种制备目的蛋白质的方法，所述方法包括本发明的方法，包括其任何实施方案，其中目的化合物或目标生物分子是蛋白质。本发明还提供了可通过这种方法获得的蛋白质，例如抗体或抗体片段。
本发明还提供了能通过如本文公开的本发明的方法获得的目的化合物或目标生物分子。
定义
如本文所用的术语“阴离子交换层析”是指其中固相带正电(例如具有与其附接的一个或多个带正电荷的配体，例如季铵基基团)的层析。市售的阴离子交换基质包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEXTM、FAST Q SEPHAROSETM Capto Q和Capto Q Impres(GE Healthcare)、Unosphere和NuviaQ(BioRad)、GigaCapQ(Tosoh)、Mustang Q XT(Pall)、Fractogel Q和Eshmuno Q(Merck Millipore)和阴离子交换膜吸附器如SartoBind Q(Sartorius)、以及整体式吸附器，例如QA整体式(Bia Separations)。
如本文所用，术语“抗体”是指包含两条重链和两条轻链的单克隆或多克隆四聚体全长抗体。两条重链和两条轻链可以相同或不同，例如在双特异性抗体如
或
中。术语免疫球蛋白与“抗体”同义使用。如本文所用的术语“抗体”包括但不限于通过本领域已知的重组技术产生的重组抗体。“抗体”可以具有任何来源，包括来自哺乳动物物种，例如人类、非人灵长类(例如人类，例如黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴)、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、山羊、牛或马物种。本文的抗体针对目的“抗原”。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物施用抗体可以在该哺乳动物中产生治疗益处。然而，也涵盖了针对非多肽抗原的抗体。当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体，例如生长因子或细胞因子。本发明涵盖的抗体的优选分子靶标包括CD多肽，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD38、CD40和CD40-L；和FcRN；OX40；HER受体家族的成员，例如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，例如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整联蛋白包括其α或β亚基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；趋化因子和细胞因子或其受体，例如IL-1α和β、IL-2、IL-6、IL-6受体、IL-12、IL-13、IL-17A和/或IL-17F、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα和TNFβ；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C；PD1、PD-L1、PCSK9；硬骨素；等等。
如本文所用的术语“抗体片段”是指抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括缺少或没有Fc部分的任何抗体。抗体片段的实例还包括诸如Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv和scFv片段；以及双抗体，包括例如
(双特异性T细胞衔接物)和DARTsTM(双亲和力重靶向技术)等形式，三抗体，四抗体，小微抗体(minibody)，域抗体(dAb)，例如sdAb、VHH和VNAR片段，单链抗体，由抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv、Fab-scFv、Fab(Fv)2或Fab-(scFv)2构建体。如上定义的抗体片段和衍生物是本领域已知的(Kontermann 2012)。为了清楚起见，Fab-Fv应理解为是指含有以任何次序连接的一个Fv区和一个Fab区的构建体，即Fab-Fv或Fv-Fab，其中一个区中的最后氨基酸之后是下一区域的最前氨基酸，反之亦然。类似地，应当将Fab-scFv理解为是指含有以任何次序连接的一个scFv区和一个Fab区的构建体(且在Fab的情况下连接至任一多肽链)，即Fab-scFv或scFv-Fab，其中一个区域中的最后一个氨基酸之后是下一个区域中的第一个氨基酸，反之亦然。以相同的方式，Fab-(Fv)2应该被理解为是指含有以任何次序连接的两个Fv区域和一个Fab区域的构建体，即Fab-Fv-Fv、Fv-Fab-Fv或Fv-Fv-Fab，其中一个区域中的最后氨基酸之后是下一区域中的最前氨基酸，反之亦然。类似地，应当将Fab-(scFv)2理解为是指含有以任何次序连接的两个scFv区域和一个Fab区域的构建体(且在Fab的情况下与任一多肽链连接)，导致20种可能的排列。通常，这些构建体在第一区域(例如Fab)和第二区域(例如Fv)之间包括肽接头。这样的接头在本领域中是众所周知的，并且可以是一个或多个氨基酸，通常由技术人员优化其长度和组成。或者，所述区域可以直接连接，即没有肽接头。用于将可变结构域连接至Fab或Fab'的合适的接头区域的实例在WO 2013/068571中描述，其通过引用并入本文，且包括但不限于柔性接头序列和刚性接头序列。抗体片段可以是无糖基化的或糖基化的。术语“抗体片段”也指抗体衍生物，其包含与另一抗体结构域、不同蛋白质或非蛋白质分子共价连接的至少一个抗原结合的抗体结构域或fc受体结合的抗体结构域。
如本文所用，术语“核酸分子”是指单链或双链核酸。核酸分子可以选自包含质粒、mRNA、引物和探针的组。在一个实施方案中，核酸分子包含D-核苷酸或由其组成。在一个备选的实施方案中，核酸分子包含L-核苷酸或由L-核苷酸组成。术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以互换使用。
如本文所用，术语“多肽”是指通过肽键连接在一起的多个氨基酸。多肽通常包含2至100个氨基酸，例如10至50个氨基酸。多肽可以仅包含天然氨基酸，或者可以包含一种或多种非天然氨基酸，例如β-氨基酸(β3和β2)；高氨基酸；脯氨酸和丙酮酸衍生物；3-取代的丙氨酸衍生物；甘氨酸衍生物；环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物；线性核心氨基酸和N-甲基氨基酸。
如本文所用，术语“阳离子交换层析”是指其中固相带负电荷(例如具有一个或多个带负电荷的配体，如例如羧酸根或磺酸根基团)的层析。可商购的阳离子交换基质包括羧甲基纤维素，固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)和固定在琼脂糖上的磺酰基，例如Capto S、Capto Adhere和Capto S Impres(GE Healthcare)、Unosphere S和Nuvia S(BioRad)、GigaCap S(Tosoh)、Fractogel S和Eshmuno S(Merck Millipore)或阳离子交换膜吸附器例如SartoBindS(Sartorius)和整体式吸附器例如SO3整体式(Bia Separations)。
如本文所用的关于层析的术语“层析柱”或“柱”指的是一种容器，通常是填充有层析基质的圆柱体或中空柱的形式。层析基质是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。
如本文所用，术语“层析循环”或“操作性层析循环”是指在给定的层析基质分配上的处理步骤顺序中单个循环的操作，其可以包括但不限于，以下步骤的一些至一个或多个的序贯组合：平衡步骤、重新加载步骤、加载步骤、过载步骤、加载后洗涤步骤、二次洗涤步骤、洗脱步骤、再生步骤、清洁步骤、存储步骤以及任何暂停或存放时间段。因此，进一步/另外的循环可以包括相同顺序的处理步骤的重复。
术语“结合”，关于目的化合物/目标生物分子与层析基质的相互作用时，是指基质对化合物或生物分子的捕获。本领域技术人员将理解，目的化合物/目标生物分子与层析基质相互作用的手段取决于所论述基质的性质。术语“结合/结合至/与…结合”不一定暗指共价键合。对于离子交换层析，“结合”是目的化合物/目标生物分子与基质之间的离子相互作用。对于亲和层析，“结合”是目的化合物/目标生物分子与基质之间的亲和力相互作用。对于疏水相互作用层析，“结合”是目的化合物/目标生物分子与基质之间的疏水相互作用。适用于其他类型层析的相关结合模式对于本领域技术人员将是显而易见的。
如本文所用，与层析相关的术语“动态结合载量”，是指在恒定流动下能够与层析基质结合而在流通液中没有显著量的目的蛋白或其他目标化合物的目的蛋白或其他目标化合物的量。层析基质的动态结合载量是通过加载含有已知浓度目的蛋白的样品确定的。监测柱上蛋白质样品的负载，它将与基质结合至某个转折点然后未结合的蛋白质将流过基质。从损失例如10％蛋白质的穿透曲线中，发现动态结合载量，并停止实验。动态结合载量经常定义为在恒定流动下能结合基质且目的蛋白(优选是在同一时间点加载的目的蛋白质浓度)的不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％或20％损失在流通液中的目的蛋白的量。
如本文所用，术语“流通液”是指通过使混合物通过或越过(pass through orover)层析基质获得的液体组合物。
如本文所用，术语“疏水相互作用层析”是指其中固相是疏水的(例如具有一个或多个疏水性配体，如例如苯基或丁基基团)层析。可商购的疏水相互作用基质包括固定在琼脂糖上的苯基或丁基，例如Capto Phenyl或Capto Butyl(GE Healthcare)、ToyoPearl HIC(Tosoh)和Fractogel EMD Phenyl(Merck Millipore)，或固定在膜吸附器上例如SartoBind HIC(Sartorius)。
如本文所用，关于层析的术语“膜吸附器”或“膜层析”是指以下层析形式，其中半渗透膜被容纳在容器中，通过该半渗透膜供应进料流，并且其表面附加有树脂或配体，该树脂或配体是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。
如本文所用，关于层析的术语“整体式(monolith)层析”或“整体式吸附器”是指以下层析形式，其中将连续体积的多孔聚合物容纳在容器中，通过该多孔聚合物供给进料流，并且其表面附加有树脂或配体，该树脂或配体是提供用于纯化的物理和/或化学性质的材料。
如本文所用，术语“混合模式”层析是指其中固相可具有不同带电或不带电配体的混合物(如例如羟基磷灰石)的层析。可商购的混合模式基质包括Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)或Capto Adhere(GE Healthcare)和HA Ultrogel Hydroxyapatite(Pall)。
如本文所用，术语“混合物”是指包含至少一种目的蛋白质的至少部分为液体的组合物，所述目的蛋白质是试图将其从也可能存在的其他物质例如宿主细胞蛋白质、DNA或其他宿主细胞组分中纯化的。混合物可以是例如悬浮液、水溶液、有机溶剂体系、或水/有机溶剂混合物或溶液。混合物经常是复杂的混合物或溶液，包含许多生物分子(例如蛋白质、抗体、激素、多核苷酸和病毒)、小分子(例如盐、糖、脂质等)和甚至颗粒物。虽然典型的生物来源混合物可以从水溶液或悬浮液开始，但是它也可以含有在较早的分离步骤例如溶剂沉淀、萃取等中使用的有机溶剂。如本文所用，术语“混合物”可以以术语“原料”识别。混合物/原料的一体积可以被称为“来自原料的进料”。
如本文所用，关于层析的术语“静态结合载量”，是指在静态条件下能结合层析基质而在流通液中没有显著量的目的蛋白质或其他目标化合物的目的蛋白质或其他目标化合物的最大量。静态结合载量通常在烧杯中以分批模式进行测量，且通常指在给定的溶剂和蛋白质浓度条件下结合到层析介质上的蛋白质的最大量。
术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂或佐剂”是指除产物生物分子以外的治疗性制剂的组分。稀释剂包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；赋形剂包括润滑剂，例如硅土(silica)、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；结合剂；例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、藻酸、藻酸盐或乙醇酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，例如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂基硫酸盐；以及通常用于药物制剂的无毒且无药理活性的物质。佐剂包括止痛剂、无机化合物例如明矾、氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙氢氧化物；矿物油，例如石蜡油；洗涤剂；皂苷、细胞因子和食用油。本领域技术人员能够根据产物生物分子的应用选择合适的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或佐剂。
更多细节
可以产生可根据本发明的方法纯化的目的蛋白质例如抗体或抗体片段，其通过培养用一种或多种编码重组抗体或抗体片段的表达载体转化的宿主细胞。
根据本发明的实施方案的宿主细胞是例如原核生物，酵母(例如但不限于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和其他克鲁维酵母属菌种、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica))，粘菌(Myxomycete)(例如但不限于盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum))，丝状真菌(例如但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)和其他木霉属菌种、黑曲霉(Aspergillus niger)和其他曲霉属菌种)，藓类(moss)(例如但不限于小立碗藓(Physcomitrella patens)、仙鹤藓(Atrichum undulatum))，昆虫或哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞是，例如但不限于NSO、SP2.0、3T3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、VERO细胞、CHO细胞、rCHO-tPA细胞、rCHO-Hep B表面抗原细胞、CHO-S细胞、HEK 293细胞、rHEK 293细胞、C127细胞、rC127-Hep B表面抗原细胞、人成纤维细胞、基质细胞、肝细胞或PER.C6细胞。
宿主细胞优选是真核宿主细胞，优选是哺乳动物宿主细胞，更优选是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如DG44品系的。
对于真核宿主细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，取决于宿主的性质，可以采用不同的转录和翻译调节序列。它们可以源自病毒源，例如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿病毒等，其中调节信号与具有高表达水平的特定基因相关。例子是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择允许阻遏和活化的转录起始调节信号，从而可以调控基因的表达。可以还通过引入一种或多种标志物来选择已经被引入的DNA稳定转化的细胞，所述标志物允许选择含有表达载体的宿主细胞。标志物还可以提供对营养缺陷性宿主的光营养，杀生物剂(biocide)抗性，例如但不限于抗生素，或重金属如铜等。可选择的标志基因可以直接与要表达的DNA基因序列连接，也可以通过共转染导入同一细胞。为了本发明蛋白质的最佳合成，可能还需要其他元件。
用一种或多种编码目的蛋白的表达载体转染真核宿主细胞，然后在将支持其生长和目的蛋白表达的任何培养基中培养。培养基是化学上限定的培养基，其不含动物衍生的产物例如动物血清和蛋白胨。本领域技术人员可获得不同的细胞培养基，其包含维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲液、核苷、葡萄糖或等同能量源的不同组合，并以合适的浓度存在以实现细胞生长和蛋白质生产。可以在细胞培养周期中的不同时间以合适的浓度将另外的细胞培养基组分包含在细胞培养基中，这将是本领域技术人员已知的。
哺乳动物细胞培养可以在任何合适的容器中进行，例如摇瓶或生物反应器，依赖于所需的生产规模，其可以或可以不以补料分批模式操作。这些生物反应器可以是搅拌釜反应器或气升反应器。可以使用多种大规模生物反应器，具有大于1,000L至50,000L或100,000L，优选5,000L至20,000L或至10,000L的容量。或者，可以使用较小规模的生物反应器，例如2L至100L也可用于根据本发明的方法制备抗体。
通常在细胞培养物的上清液中找到根据本发明的方法和方法在真核宿主细胞例如CHO细胞中产生的目的蛋白质，例如抗体或抗原结合片段。在本发明的一个实施方案中，所述上清液是在本发明的方法中纯化的混合物。
因此，在本发明的一个特定实施方案中，本发明的方法和方法包括离心上清液并在离心后回收液相的步骤，以获得含有目的蛋白的混合物用于根据本发明的方法进一步纯化。
或者，可以使用技术人员已知的澄清技术如例如深度过滤来回收所述上清液。因此，在本发明的特定实施方案中，所述方法包括深度过滤的步骤，以获得含有目的蛋白的混合物用于根据本发明的方法进一步纯化。
或者，宿主细胞是原核细胞，优选革兰氏阴性细菌，优选大肠杆菌细胞。原核细胞。用于蛋白表达的原核宿主细胞是本领域众所周知的。宿主细胞是已被基因工程改造以产生目的蛋白质例如抗体片段的重组细胞。重组的大肠杆菌宿主细胞可以衍生自任何合适的大肠杆菌菌株，包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个例子是大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)，它是重组蛋白发酵的常用宿主菌株。抗体片段也可以通过培养经修饰的大肠杆菌菌株，例如代谢突变体或蛋白酶缺陷性大肠杆菌菌株来产生。
依赖于蛋白质的性质、生产规模和使用的大肠杆菌菌株，通常可以在大肠杆菌宿主细胞的周质或宿主细胞培养上清液中找到可以根据本发明方法纯化的抗体片段。将蛋白质靶向这些区室的方法是本领域众所周知的。将蛋白质引导至大肠杆菌周质的合适信号序列的实例包括大肠杆菌PhoA、OmpA、OmpT、LamB和OmpF信号序列。可以通过依赖自然分泌途径或通过诱导外膜有限渗漏来导致蛋白质分泌，将蛋白质靶向上清液，其例子是使用pelB前导、蛋白A前导、共表达细菌素释放蛋白(丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白)以及向培养基中添加甘氨酸和共表达用于膜渗透的kil基因。最优选地，在本发明的方法中，在宿主大肠杆菌的周质中表达重组蛋白。
重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中的表达也可以在诱导型系统的控制下，由此重组抗体在大肠杆菌中的表达在诱导型启动子的控制下。适用于大肠杆菌的许多诱导型启动子是本领域众所周知的，并且根据启动子，可以通过多种因素例如温度或生长培养基中特定物质的浓度来诱导重组蛋白的表达。诱导型启动子的实例包括大肠杆菌lac、tac和trc启动子(其可由乳糖或不可水解的乳糖类似物异丙基-b-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导)和phoA、trp和araBAD启动子(其分别由磷酸、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导)。表达可以通过例如添加诱导剂或温度变化(其中诱导是温度依赖性的)来诱导。在通过向培养物中添加诱导剂来实现重组蛋白表达的诱导的情况下，可以根据发酵系统和诱导剂通过任何合适的方法添加诱导剂，例如通过单次或多次注射添加(shot addition)或通过经由进料逐渐添加诱导剂。应当理解，在诱导物的添加和蛋白表达的实际诱导之间可能存在延迟，例如在诱导剂是乳糖的情况下，在发生蛋白表达诱导之前可能存在延迟，同时先于乳糖利用任何预先存在的碳源。
大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)可以在任何将支持大肠杆菌生长和重组蛋白表达的培养基中进行培养。培养基可以是任何化学上限定的培养基，例如描述于。
大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器中进行，例如摇瓶或发酵罐，这取决于所需的生产规模。可以获得多种大规模发酵罐，具有超过1,000L多达100,000L的容量。优选使用1,000L至50,000L的发酵罐，更优选使用1,000L至10,000L或12,000L的发酵罐。也可使用容量在0.5L至1,000L的较小规模的发酵罐。
宿主细胞例如CHO或大肠杆菌的发酵可以在任何合适的系统中进行，例如连续、分批或补料分批模式，这取决于所需的蛋白质和产率。使用分批模式可以在需要时使用营养物或诱导剂的注射添加。备选地，可以使用补料分批培养，并且在分批模式中诱导前以使用发酵罐中最初存在的营养物能维持的最大比生长速率生长培养物，并使用一种或多种营养物进料方案来控制生长速率，直至发酵完成。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括在加载到第一层析基质上(捕获步骤)之前，离心细胞培养物收获的步骤，然后通过添加提取缓冲液来悬浮宿主细胞。
对于其中在宿主细胞的周质空间中发现目的蛋白质如抗体片段的大肠杆菌发酵过程，需要从宿主细胞中释放蛋白质。该释放可以通过任何合适的方法实现，例如通过机械或压力处理、冻融处理、渗透压冲击、提取剂或热处理进行的细胞裂解。用于蛋白质释放的这类提取方法是本领域众所周知的。
在本发明方法的特定实施方案中，根据任何实施方案的本发明方法中的混合物是通过洗脱与蛋白质A结合的抗体或抗体片段而产生的，例如用具有适于破坏抗体或抗体片段结合的pH的洗脱缓冲液洗脱。所述pH取决于特定分子，并且通常由技术人员凭经验确定并调整以实现期望的终点。
技术人员可获得许多含有所述天然重组蛋白A的层析材料，如例如
(GE Healthcare)、
(Novasep)、Captiv
(Repligen)或
(JSR)。
适用作蛋白A层析中的洗涤和洗脱缓冲液/剂的缓冲液/剂在本领域内很容易获得，并且可以通过非限制性举例从以下选择：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris、组氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液或MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸咪唑)、BES(N,N-(双-2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)或HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液。
以下实施例例示了本发明。但是，它不以任何方式限制本发明。在这方面，重要的是要理解实施例中描述的具体方法，而且用于证明纯度和产率的方法仅设计为用于提供对本发明过程的指示。有许多方法可用于测定生物分子的产率和纯度，因此在任何一种特定测定中的阴性结果不是决定性的。
实施例
将冷冻澄清的细胞培养液用去离子水稀释至浓度为0.5g/l，pH为约4.5，且电导率为约3.76mS/cm，该冷冻澄清的细胞培养液是经离心并从含有浓度为2.18g/L的裸Fab和约14mS/cm电导率的大肠杆菌培养物中热提取的。进行了结合和洗脱层析方法，其中将等同于3个柱体积(CV)的洗涤缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.5，电导率4.0mS/cm)以150cm/h泵送到基于柱的层析基质上以平衡柱，然后将含有目的蛋白质的负载以17.5g/L树脂体积的加载挑战以225cm/小时泵送施加，随后以150cm/h再加5个CV的相同洗涤缓冲液，然后是以150cm/小时通过10个CV的从低电导率的洗涤缓冲液增加到高电导率的洗脱缓冲液(50mM乙酸钠、225mM氯化钠缓冲液，pH 4.5，电导率26.4mS/cm)的线性洗脱缓冲液梯度，随后是以300cm/小时施加的2个CV的高电导率再生缓冲液(50mM乙酸钠、1M氯化钠，pH 4.5，电导率85mS/cm)，然后以300cm/小时施加2个CV的高pH清洁缓冲液，并在此点保持15分钟，接着再用另外2个CV的洗涤缓冲液冲洗。所使用的层析基质是GE 4.66ml 10cm Capto S HiScreen阳离子交换柱，该工作在GE Akta Avant机器上进行。在整个层析中，对柱输出的电导率、pH、280nm吸光度、260nm吸光度和305nm吸光度进行在线测量，并实时监测和记录，并捕获10CV洗脱过程期间的输出液体并将其以1.55ml的级分保存在6摄氏度的96孔深孔微量滴定板中。观察10CV梯度洗脱过程中的波幅测量，出现了两个主要的部分分离的峰，有较强的重叠；在第17个级分附近具有明显顶点的一个小峰，刚好在一个大得多的不对称峰之前，该不对称峰在约第22个级分出现顶点。对每个级分取样30ul，并在亲和蛋白G分析性HPLC步骤上运行以确定级分的组成，且对通过蛋白G HPLC运行的每个样品上不同的流通液峰和洗脱液峰的A280吸光度积分允许明显的测定非抗体成分的量(HPLC上的流通液，在本文中称为非Fab)和抗体成分的量(HPLC上的洗脱液，在本文中称为Fab)，非抗体成分的量与Capto S梯度洗脱的早期小峰相对应，抗体成分的量与CaptoS梯度洗脱中后期的大峰相对应，给出了两者的真实概况(profile)。
将来自该第一循环上CEX梯度洗脱中两个峰之间重叠区域的两个特定级分(总共32个中的第21个和第22个)的剩余保留体积(代表每个级分的绝大部分—每个级分的不到5％被用于蛋白G HPLC测定)合并，并添加到容器中与先前层析操作上相同体积的新鲜负载中，并使用去离子水再次稀释到相同的3.76mS/cm的电导率，以在下一个循环的Capto S层析上再次加载。选择这些级分的原因是它们具有较高的目的Fab含量和显著的非Fab含量，并且可以通过计算机模型辅助有效的选择。(见下文)。同时，将在这两个选定级分之后且主要含有Fab的级分(第23至31个，在下文中称为保留池(retained pool))的剩余保留体积的大部分合并，并计算该池中的所得Fab和残留杂质。在每种情况下，将每个池的纯度计算为Fab的量除以非Fab的量，将产率计算为保留池中Fab的量除以涵盖两个洗脱峰的所有级分(级分9至31)中的总Fab。
在由所有相同操作构成的随后的第二层析循环中，将合并的负载/再循环级分重新施加到柱，并再次收集相同的级分，并对每个级分的相同小部分取样以通过蛋白G HPLC进行测定，并且再次地，保存同样的两个级分并与另外的新鲜负载合并以施加到第三循环上，并且再次合并第23级分至第31级分，以计算该部分中Fab和非Fab的量和产率。以相同的方式在第三和第四循环中重复该过程。这导致在接收来自先前循环的再循环级分的第二、第三和第四循环中保留池中Fab的产率显著增加，与仅接受原始新鲜进料且因此作为传统的分批操作和创造性的再循环操作的对照进行操作的初始循环相比，分别增加了22％、23％和25％。同时，相对纯度(以保留池中测得的非Fab与每单位Fab的比率计算)保持接近初始循环中所观察到的纯度比率，为-4％、-4％和+1％，并且在几个循环后已平衡达到与初始循环相同的水平。因此，在第一循环的保留池代表传统的层析结合和洗脱分离(在给定区域的保留池中产生特定的产率和纯度)的情况下，根据本发明包括了来自前一个循环的再循环级分的在后层析循环能够提高相同区域的保留池的产率，同时保持该纯度。通过将要再循环的级分存储在容器中，这可以在单个层析基质上实现本发明的产率提高，并允许在层析的分开的循环之间有灵活的时间间隔，而基本上不影响方法的平衡能力，相应地这还允许有时间使用离线测定法来测试循环之间的级分的性能，并且通过用新鲜负载稀释，这还排除了对这些级分使用另外的稀释缓冲液的需求。最后，与传统运行1相比，在循环2、3和4中洗脱液中保留的Fab的浓度也提高了。
从第4个循环中再次保存选择用于再循环的两个同样的级分，以在第5个循环中重新施加，且在第5个循环中，以与第1循环相同的方式将新鲜负载自行用去离子水稀释至目标电导率3.76mS/cm，然后混合入再循环的第21和22个级分，这一次在从这两个级分中含有的洗脱缓冲液中流入额外的盐后，不再添加去离子水以再次将电导率降低至3.76mS/cm。由于要施加到下一个循环的新鲜负载的电导率远低于确保结合所需的电导率，并且其体积比两个再循环级分的合并体积大得多，因此将它们混合将起到将高电导率盐在级分中充分稀释的效果，从而在下一个循环的加载期间它不会阻止正常的可结合组分的结合。在第5个循环的保留池中，与初始(对照)循环相比，产率有变小但仍然可观的增长(为13％)，纯度略有降低但仍具有可比性(损失了6％)，纯度*产率平衡总体增加为106％，这证明即使不对合并的进料进行另外稀释，也可以实现额外的总体性能的提高。
再次收集相同的两个级分，并从第5个循环到第6个循环进行再循环，这次与之前一样将合并的进料稀释至3.76mS/cm，在此循环中，同时在保留池中实现了产率和纯度两者的显著增加。进行了最后的第7个循环，其中将第6个循环中的第20、21、22和23个级分与新鲜负载合并，并在加载到第7个循环之前用去离子水稀释至3.76mS/cm。在可能的后续循环会持续将这种新的扩展范围的级分再循环的情况下，保留池中包含的级分必然会缩短一个，从第24个级分延伸至第31个级分。与初始循环的最初保留池范围相比，在这种情况下保留池保持大约相同的产率(97％)和增加了8％的纯度，证明了在保持产率的同时增加纯度的能力，并且与包括相同级分的初始循环的保留池相比产生了增加32％的产率和增加11％的纯度。在第7个之后循环不再继续的情况下，与来自初始循环的相同再循环池相比，包括来自第7个循环的第23至第31个级分的保留池的产率增加了34％，纯度增加了12％，证明两者都可以显著增加。
整体纯度增加(Purity gain throughout)计算为给定的循环中保留池的纯度除以初始循环中保留池的纯度，且整体产率增加(Yield gain throughout)计算为给定的循环中保留池的产率除以初始循环中保留池的产率。
因此，已经证明，将来自一个循环的部分分离峰的重叠中取得的选定级分再循环到下一循环的负载中，可以导向为提高剩余不再循环的保留材料中的产率或纯度或两者的组合，从而增强目标产物的有效纯化。可以通过计算机建模帮助合理选择要再循环的级分—在初始循环的各样品中测定Fab和非Fab的量后，创建了峰分布的计算机模型，该模型计算了对可能的再循环给定的选定级分中Fab和非Fab的量，并模拟了如果要将其再循环在下一个保留池中峰组成和量的变化，并且通过迭代能够预测多个循环内纯度和产率的所得变化。然后，改变在此模拟中对再循环所选的级分，以迭代地找到可能将会如期望的提高纯度或产率或两者的条件。可以朝任一方向推动此过程，以有利于再循环级分的一侧(后期级分)的保留池中的Fab，或者有利于再循环级分的另一侧(早期级分)的非Fab。相应地，目标产物的浓度也可以以相同的定向方式提高。该过程指导了在前6个循环中选择再循环第21和22个级分，并使用第6个循环的测定数据重新校准模拟，其然后指示在第7个循环中将第20至第23个级分再循环。
这种再循环办法将自然地扩展到与所述实施例类似的具有以重叠洗脱的峰的任何组分的任何层析，而不论其部分分离是否由梯度洗脱驱动，只要就穿透时间和峰形而言的峰的分离保持相同，对于其中导致不同的穿透时间和峰形的流动组分之间的差异分离取决于它们与固定化配体之间的差异性的化学和/或静电相互作用的任何给定的层析来说，都应是如此。此外，这种再循环办法将自然地扩展到具有含多个成对重叠的多个峰的任何系统，例如具有两个重叠的3个连续峰或具有3个重叠的4个峰或4个峰分成两对每对具有一个重叠，等等。在每种情况下，可以优化要再循环到后续循环中的每个重叠的区域，从而差异性地偏向目标峰的保留池中占主导的期望组分相对于在重叠的伙伴峰中占主导的不想要组分的产率(和浓度)和/或纯度，或者例如在期望的组分峰被其前后的两个重叠的不期望的组分峰包围的情况下，两个重叠区域的部分都可以再循环以相对于其两个相邻峰更偏向目标中间峰。
上面的实施例显示，通过根据本发明的方法可以实现各种优点，包括纯度的富集、产率的提高、浓度的增加、免于稀释、可中断操作、单柱操作、任意的重新加载次序。
在说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以分开地和以其任意组合地，作为用于以其各种形式实现本发明的材料。
参考文献
Kontermann,R.E.(2012)."Dual targeting strategies with bispecificantibodies."MAbs 4(2):182-197.
Mahajan,E.,A.George和B.Wolk(2012)."Improving affinity chromatographyresin efficiency using semi-continuous chromatography."J Chromatogr A 1227:154-162.
现在已经完全描述了本发明，本领域技术人员将理解，可以在相当大范围的等同参数、浓度和条件下进行本发明，而不背离本发明的精神和范围，并且无需过多的实验。尽管已经结合本发明的特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明能够进行进一步的修改。本申请旨在涵盖总体上遵循本发明原理的本发明的任何变型、使用或改编，并且包括如属于本发明所属领域内的已知或惯用实践的范围以及如可以应用于上文所述的基本特征(其在下文所附权利要求书的范围内阐述)的对本公开的这类背离。
如本文所用，“一个/种”可以指一个/种或多个/种。术语“或”的使用在本文中是指“和/或”，除非明确指出仅指备选或备选是互斥的，尽管本公开支持仅指备选和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个/种”可以指至少第二个/种或更多。
如本文所用，“在X和Y之间/X至Y”可以表示包括X和Y的范围。
本文引用的所有参考内容均通过引用完全并入本文，包括期刊文章或摘要，已公开或未公开的美国或外国专利申请，已公布的美国或外国专利或任何其他参考内容，包括所引用参考内容中呈现的所有数据、表格、图形和文本。另外，本文引用的参考内容中引用的参考内容的全部内容也通过引用整体并入。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的提述绝不是以任何方式承认在相关领域中公开、教导或提示了本发明的任何方面、描述或实施方案。
以下是本发明的方面：
1.一种用于从包含目的化合物的混合物中纯化该目的化合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)在第一操作性层析循环中，将包含该目的化合物的混合物从第一容器加载到层析基质中，操作为使得该化合物结合层析基质；
b)从层析基质洗脱该目的化合物，并收集含有该目的化合物的洗脱液作为洗脱液级分；和
c)将一个或多个该洗脱液级分重新加载到同一层析基质，操作为使得该目的化合物结合层析基质。
2.根据方面1的方法，其中步骤c)的重新加载是在进一步的操作性层析循环中将一个或多个洗脱液级分重新加载到同一层析基质，操作为使得该目的化合物结合层析基质。
3.根据方面2的方法，其中所述进一步的操作性层析循环是紧接在后的层析循环。
4.根据方面1-3中任一项的方法，其中重新加载到同一层析基质的一个或多个洗脱液级分与具有期望特征的一个或多个洗脱液级分不同。
5.根据方面4的方法，其中重新加载到同一层析基质的一个或多个洗脱液级分是在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前从层析基质洗脱的一个或多个洗脱液级分中的至少一个，以及在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后从层析基质洗脱的一个或多个洗脱液级分中的至少一个。
6.根据方面5的方法，其中将在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前从层析基质洗脱的一个或多个洗脱液级分中的至少一个以及在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后从层析基质洗脱的一个或多个洗脱液级分中的至少一个分开地重新加载到同一层析基质。
7.根据方面5的方法，其中将在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之前从层析基质洗脱的一个或多个洗脱液级分中的至少一个以及在具有期望特征的一个或多个洗脱液级分之后从层析基质洗脱的一个或多个洗脱液级分中的至少一个合并，并将这种合并级分重新加载到同一层析基质中。
8.根据方面1至7中任一项的方法，其中所述一个或多个洗脱液级分在重新加载之前或期间经过处理，其中经处理的一个或多个洗脱液级分允许重新加载时该目的化合物与层析基质结合。
9.根据方面1至8中任一项的方法，其中所述方法包括，在从层析基质洗脱目的化合物并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液级分之前，有以下步骤：
ab)在第二容器中收集含有未结合的目的化合物的流通液，和
ac)在进一步的操作性层析循环中将来自第二容器的流通液重新加载到同一层析基质，操作为使得该目的化合物与层析基质结合。
10.根据方面1至8中任一项的方法，其中所述方法包括，在从层析基质洗脱目的化合物并收集含有目的化合物的洗脱液作为洗脱液级分之前，有以下步骤：
ab)在第二容器中收集含有未结合的目的化合物的流通液，和
ac)在进一步的操作性层析循环中将来自第二容器的流通液重新加载到同一层析基质中并另外加载新鲜的加载混合物，操作为使得目的蛋白质结合层析基质。
11.根据方面9至10中任一项的方法，其中在操作性层析循环中将收集到第二容器中的流通液和一个或多个洗脱液级分分开地重新加载。
12.根据方面9至10中任一项的方法，其中将流通液和一个或多个洗脱液级分合并并作为合并物重新加载到同一层析基质中，操作为使得该目的化合物结合层析基质。
13.根据方面1至12中任一项的方法，其中所述目的化合物选自包含蛋白质、抗体、抗体片段、核酸分子和小分子的组。
14.一种制备目的蛋白质的方法，其包括如方面1至13中任一项定义的用于纯化的方法，其中在所述用于纯化的方法中，所述目的化合物是蛋白质。
15.一种蛋白质，例如抗体或抗体片段，其通过如方面14中定义的制备目的蛋白质的方法获得。
Claims (29)
1.一种用于从包含产物生物分子和至少一种杂质的原料纯化该产物生物分子的工业规模的方法，该方法包括以下步骤：
a)将来自原料的进料加载到层析基质上，使得该产物生物分子结合层析基质；
b)通过将洗脱溶液施加到层析基质，将该产物生物分子在洗脱液中从层析基质洗脱；
其中所述洗脱液包含：
-包含纯化的产物生物分子的第一级分；和
-包含该产物生物分子和至少一种杂质的第二级分，所述第二级分包含一个或多个前导和/或尾部级分；
并且其中所述第一级分与第二级分分开收集；
c)将所述第二级分存放在一个或多个容器中；
d)将来自所述容器的第二级分和来自原料的另外的进料加载至层析基质，使得第二级分中的产物生物分子与层析基质结合；其中所述另外的进料与第二级分同时或序贯地加载；和
e)通过将洗脱溶液施加到层析基质来将该产物生物分子在洗脱液中从层析基质洗脱，其中所述洗脱液包含纯化的产物生物分子；
其中步骤(a)、步骤(b)、步骤(d)和步骤(e)中的层析基质为同一层析基质。
2.根据权利要求1的方法，其中重复步骤(b)、(c)和(d)。
3.根据权利要求1的方法，其中将步骤(b)、(c)和(d)至少实施两次。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二级分包含：(i)紧接在第一级分之前的前导级分；和/或(ii)紧接在第一级分之后的尾部级分。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中：
-将步骤(a)和(b)重复多次；
-将每个步骤(b)中收集的第二级分汇集在一起；
-步骤(c)包括将汇集的第二级分存放在所述容器中；
和
-步骤(d)包括将汇集的第二级分从所述容器加载至所述层析基质，使得汇集的第二级分中的产物生物分子结合所述层析基质。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(a)还包括收集含有未结合层析基质的未结合产物生物分子的流通液；且步骤(d)还包括将所述流通液与第二级分和/或另外的进料同时或序贯地加载到层析基质中。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括处理第二级分以促进所述生物分子与层析基质的结合。
8.根据权利要求7的方法，其中所述处理在步骤(c)和/或步骤(d)期间进行。
9.根据权利要求7或权利要求8的方法，其中所述处理包括改变所述第二级分的pH、离子强度、浓度、温度和/或溶剂和/或将所述第二级分混合和/或脱气。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括测试所述第二级分。
11.根据权利要求10的方法，其中所述测试第二级分包括测定第二级分中所述产物生物分子的一个或多个浓度；杂质的浓度；杂质的身份；pH；离子强度；温度；溶剂；和/或气体浓度。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(c)包括将所述第二级分存放至少5分钟。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述步骤(c)包括将所述第二级分存放过夜。
14.根据权利要求12或权利要求13的方法，其中在存放时间期间将所述层析基质交换、清洁或更新。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述产物生物分子是蛋白质、抗体、抗体片段、多核苷酸或多肽。
16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述原料具有至少20升，任选地至少100升的体积。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述层析基质具有至少4升的床体积。
18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(b)中，洗脱液的体积为层析基质的床体积的至少2倍，任选地其中所述洗脱液的体积为层析基质的床体积的2倍至20倍。
19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述层析基质选自：
-离子交换层析基质；
-疏水相互作用层析基质；
-亲和层析基质；
-混合模式层析基质；
-手性层析基质；和
-介电层析基质。
20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述层析基质在层析柱中。
21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中所述层析基质是层析膜或整体式吸附器。
22.根据前述权利要求中任一项的方法，其中从所述层析基质洗脱产物生物分子是以每分钟至少约0.2个层析基质体积的流速进行的。
23.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括合并所述第一级分的每一个。
24.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括渗滤和/或浓缩纯化的产物生物分子。
25.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括对纯化的产物生物分子进行纳米过滤。
26.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括对纯化的产物生物分子进行进一步的层析纯化。
27.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括化学修饰纯化的产物生物分子。
28.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括将纯化的产物生物分子与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或佐剂一起配制。
29.能通过前述权利要求中任一项的方法获得的纯化的产物生物分子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1711481.0 | 2017-07-17 | ||
| GBGB1711481.0A GB201711481D0 (en) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | Protein purification |
| PCT/EP2018/069298 WO2019016154A1 (en) | 2017-07-17 | 2018-07-16 | Chromatography |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110945008A true CN110945008A (zh) | 2020-03-31 |
Family
ID=59713705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880046930.7A Pending CN110945008A (zh) | 2017-07-17 | 2018-07-16 | 层析 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11498941B2 (zh) |
| EP (1) | EP3655420A1 (zh) |
| JP (1) | JP7145196B2 (zh) |
| KR (1) | KR102542274B1 (zh) |
| CN (1) | CN110945008A (zh) |
| AU (1) | AU2018304867A1 (zh) |
| BR (1) | BR112019027760A2 (zh) |
| CA (1) | CA3067496A1 (zh) |
| CL (1) | CL2020000087A1 (zh) |
| CO (1) | CO2020000090A2 (zh) |
| EA (1) | EA202090262A1 (zh) |
| GB (1) | GB201711481D0 (zh) |
| IL (1) | IL271790B1 (zh) |
| MX (1) | MX2020000288A (zh) |
| SG (1) | SG11201911880UA (zh) |
| WO (1) | WO2019016154A1 (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201916961D0 (en) * | 2019-11-21 | 2020-01-08 | Puridify Ltd | Method in bioprocess purification system |
| JP2023513347A (ja) | 2020-02-13 | 2023-03-30 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 標的化合物の精製のための方法／デバイス |
| EP4083053A1 (en) * | 2021-04-30 | 2022-11-02 | Fresenius Kabi iPSUM S.r.l. | Method for icatibant preparation |
| AU2022325485A1 (en) * | 2021-08-13 | 2024-03-21 | Bluetech Aps | Industrial method for isolating an analyte from a liquid mixture |
| TW202337900A (zh) * | 2022-01-12 | 2023-10-01 | 美商再生元醫藥公司 | 改良使用親和層析的異二聚蛋白質自雜質之解析的方法 |
| WO2023178329A1 (en) * | 2022-03-18 | 2023-09-21 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of isolating polypeptides |
| WO2024056626A1 (en) * | 2022-09-13 | 2024-03-21 | Sanofi Aventis Deutschland Gmbh | Continuous gradient elution chromatographic fractionation |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101252979A (zh) * | 2005-06-09 | 2008-08-27 | 拜尔技术服务有限责任公司 | 用于分离二元和多元物质混合物的半连续色谱法和相应设备 |
| WO2014158231A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| WO2016009221A1 (en) * | 2014-07-17 | 2016-01-21 | University Of Newcastle Upon Tyne | Biomolecule separation using apatite |
| CN105358572A (zh) * | 2013-05-06 | 2016-02-24 | 赛诺菲 | 用于纯化抗体的连续多步骤方法 |
| WO2017140881A1 (en) * | 2016-02-19 | 2017-08-24 | Ucb Biopharma Sprl | Protein purification |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5940161A (ja) | 1982-08-30 | 1984-03-05 | Asahi Chem Ind Co Ltd | カラムクロマトグラフイ−による分取方法 |
| JPS61270658A (ja) | 1985-05-25 | 1986-11-29 | Hitachi Plant Eng & Constr Co Ltd | 分離精製装置 |
| US8569464B2 (en) * | 2006-12-21 | 2013-10-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| KR102048382B1 (ko) | 2011-11-11 | 2019-11-25 | 유씨비 바이오파마 에스피알엘 | 알부민 결합 항체 및 이의 결합 단편 |
| EP2794635B8 (en) | 2011-12-22 | 2018-11-14 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Ion exchange membrane chromatography |
-
2017
- 2017-07-17 GB GBGB1711481.0A patent/GB201711481D0/en not_active Ceased
-
2018
- 2018-07-16 IL IL271790A patent/IL271790B1/en unknown
- 2018-07-16 CA CA3067496A patent/CA3067496A1/en active Pending
- 2018-07-16 MX MX2020000288A patent/MX2020000288A/es unknown
- 2018-07-16 CN CN201880046930.7A patent/CN110945008A/zh active Pending
- 2018-07-16 EA EA202090262A patent/EA202090262A1/ru unknown
- 2018-07-16 JP JP2020500853A patent/JP7145196B2/ja active Active
- 2018-07-16 SG SG11201911880UA patent/SG11201911880UA/en unknown
- 2018-07-16 KR KR1020207003892A patent/KR102542274B1/ko active IP Right Grant
- 2018-07-16 BR BR112019027760-9A patent/BR112019027760A2/pt unknown
- 2018-07-16 US US16/629,609 patent/US11498941B2/en active Active
- 2018-07-16 AU AU2018304867A patent/AU2018304867A1/en active Pending
- 2018-07-16 WO PCT/EP2018/069298 patent/WO2019016154A1/en unknown
- 2018-07-16 EP EP18746627.1A patent/EP3655420A1/en active Pending
-
2020
- 2020-01-07 CO CONC2020/0000090A patent/CO2020000090A2/es unknown
- 2020-01-10 CL CL2020000087A patent/CL2020000087A1/es unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101252979A (zh) * | 2005-06-09 | 2008-08-27 | 拜尔技术服务有限责任公司 | 用于分离二元和多元物质混合物的半连续色谱法和相应设备 |
| WO2014158231A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| CN105358572A (zh) * | 2013-05-06 | 2016-02-24 | 赛诺菲 | 用于纯化抗体的连续多步骤方法 |
| WO2016009221A1 (en) * | 2014-07-17 | 2016-01-21 | University Of Newcastle Upon Tyne | Biomolecule separation using apatite |
| WO2017140881A1 (en) * | 2016-02-19 | 2017-08-24 | Ucb Biopharma Sprl | Protein purification |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FABIAN STEINEBACH等: "Experimental design of a twin-column countercurrent gradient purifification process", pages 20 - 21 * |
| WEN-HUI K. KUO等: "A new strategy for the on-column exopeptidase cleavage of poly-histidine tagged proteins", vol. 879, pages 7 - 2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CL2020000087A1 (es) | 2020-07-24 |
| WO2019016154A1 (en) | 2019-01-24 |
| IL271790A (en) | 2020-02-27 |
| CA3067496A1 (en) | 2019-01-24 |
| US11498941B2 (en) | 2022-11-15 |
| MX2020000288A (es) | 2020-07-22 |
| KR102542274B1 (ko) | 2023-06-12 |
| EP3655420A1 (en) | 2020-05-27 |
| KR20200027552A (ko) | 2020-03-12 |
| GB201711481D0 (en) | 2017-08-30 |
| JP7145196B2 (ja) | 2022-09-30 |
| CO2020000090A2 (es) | 2020-04-24 |
| IL271790B1 (en) | 2024-05-01 |
| JP2020527553A (ja) | 2020-09-10 |
| BR112019027760A2 (pt) | 2020-07-07 |
| EA202090262A1 (ru) | 2020-05-12 |
| US20200331960A1 (en) | 2020-10-22 |
| AU2018304867A1 (en) | 2020-01-02 |
| SG11201911880UA (en) | 2020-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11498941B2 (en) | Chromatography | |
| US11905310B2 (en) | Protein purification | |
| US11339214B2 (en) | Protein purification | |
| Laible et al. | Towards higher-throughput membrane protein production for structural genomics initiatives | |
| CN108883345B (zh) | 用于蛋白纯化的方法 | |
| EA043448B1 (ru) | Очистка белка | |
| Ransdell et al. | Creation of a versatile automated two-step purification system with increased throughput capacity for preclinical mAb material generation | |
| JP2022543187A (ja) | 抗体を精製するための方法 | |
| CN112805298A (zh) | 制备GLY-Tβ4的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |