KR20200027552A - 크로마토그래피 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 정제 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 정제 분야에 관한 것이다. 본 발명은 단백질 및 기타 생체분자를 공업적인 규모로 정제하기 위한 개선된 기법을 제공한다. 특히, 본 발명은 단백질과 같은 대상 화합물, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편을 크로마토그래피 단계, 바람직하게는 반-연속적인 크로마토그래피 단계를 이용해 정제하는 공정에 관한 것이다.
Description
본 발명은 정제 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 정제 분야에 관한 것이다. 본 발명은 단백질 및 기타 생체분자를 공업적인 규모로 정제하기 위한 개선된 기법을 제공한다. 특히, 본 발명은 단백질과 같은 대상 화합물, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편을 크로마토그래피 단계, 바람직하게는 반-연속적인 크로마토그래피 단계를 이용해 정제하는 공정에 관한 것이다.
단백질 및 핵산 분자를 대규모로 경제적으로 정제하는 것은 생물공학 산업에서 점점 중요한 문제가 되고 있다. 일반적으로, 단백질은 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 삽입하여 대상 단백질을 생산하도록 조작된 포유류 또는 박테리아 세포주를 이용한, 세포 배양에 의해 생산한다. 이용되는 세포주는 살아있는 유기체이기 때문에, 당, 아미노산 및 성장인자가 함유된 복합 배양 배지를 공급하여야 한다. 대상 단백질은, 세포에 공급되는 화합물들의 혼합물로부터 그리고 (공급 스트림) 세포 자체 부산물로부터, 인간 치료제로서 사용하기에 충분한 순도로 분리되어야 한다. 공급 스트림으로부터 유래되는 불순물과 관련하여, 인간 투여용으로 의도된 단백질에 대해 보건 당국에 의해 설정된 기준은 매우 엄격하다.
공업적인 단백질 정제는 전형적으로 매우 대규모 수준으로 이루어진다. 항체와 같은 치료학적 단백질을 생산하기 위한 상업용 생물반응조는 전형적으로 배양 배지를 수백, 수천 또는 심지어 수만 L로 수용한다. 세포는 전형적으로, 예를 들어, 약 600 nm와 같은 적절한 파장에서 배양 배지의 광학 밀도를 측정함으로써 결정할 수 있는 원하는 수준까지 배양하는데, 광학 밀도 증가는 배양 배지 내 세포의 농도 증가와 일치한다.
원하는 수준에 도달하면, 전형적으로 단백질 조 추출물을 준비한다. 조 추출물은 조 추출물을 제조하기 위한 세포용해, 여과 및/또는 초기 농축 등과 같은 일반적인 기법으로 준비한다. 상업용 생물반응조로부터 나오는 처리할 상당히 많은 양의 배양 배지는 그에 따라 상당량의 조 추출물을 생성한다. 예를 들어, 세포 배양물 2000 L의 경우, 전형적으로 단백질 조 추출물의 부피는 수백 L이며, 대개 원하는 단백질이 수 kg 함유되어 있다.
공업적인 단백질 합성 기법으로 수득되는 상당량의 단백질 조 추출물에는 전용 정제 기술이 요구된다. 매우 소량 (전형적으로 수십 내지 수백 mL)의 단백질 조 추출물 (공급원료)을 정제하기 위한 목적의 실험실 규모의 기술은 전형적으로 오염 방지 어려움, 효율적인 가공 처리 요건, 자동화 요건 등으로 인해, 공업적인 수준까지 확대하기에는 부족하다. 이에, 단백질과 같은 생체분자를 대량 정제하기 위한 공업적인 규모의 정제 기법들이 개발되었다.
단백질 정제는 보통 친화성 크로마토그래피 (대상 단백질과 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 특이적인 리간드 간의 가역적인 상호작용에 기반하여 단백질을 분리함); 이온 교환 크로마토그래피 (하전된 기와 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대로 하전된 분자의 비-특이적인 정전기적 상호작용에 기반하여 단백질을 분리함); 치환 크로마토그래피 (크로마토그래피 매트릭스에 대한 단백질의 동적 친화성에 기반하여 단백질을 분리함); 및 크기 배제 크로마토그래피 (단백질 크기에 기반하여 단백질을 분리함)과 같은 크로마토그래피 기법을 이용해 달성된다. 생체분자를 분리하기 위해 사용되는 이들 및 기타 크로마토그래피 기법들의 공통적인 특징은 흔히 수지로 지칭되는 적절한 분리 매트릭스가 있다는 것이다. 크로마토그래피 매트릭스는 전형적으로 비싸고, 비-가역적인 오염, 매트릭스 물질의 분해, 매트릭스의 관능기에서의 부적절한 반응 등으로 인해 사용 수명이 제한적이다. 공업적인 단백질 정제시 처리하여야 하는 상당량의 단백질 조 추출물로 인해 크로마토그래피 매트릭스도 그에 따라 대량으로 필요하다. 이러한 매트릭스의 높은 가격은 정제 기술의 효율을 가능한 극대화하고자 하는 요인이다.
단백질 정제 기법을 설계하는데 고려되어야 하는 다른 측면은 대상 단백질로부터 제거하여야 하는 불순물의 특성이다. 전형적으로, 단백질 조 추출물에는 대상 단백질과 비교해 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 매우 다른 특징들을 가진 불순물들이 함유되어 있다. 이러한 불순물들은 전형적으로 쉽게 제거된다. 그외 불순물들은 전형적으로 대상 단백질과 비슷한 결합 특징을 가지고 있다. 전형적으로, 이러한 불순물들은 매트릭스로부터 원하는 단백질과 함께 적어도 일부 공동-용출될 수 있어, 어느 정도의 중첩이 관찰된다. 따라서, 대상 단백질과 불순물을 포함하는 공급원료는 전형적으로 3가지 타입의 성분을 함유한 것으로 볼 수 있다: 대상 생성물 (즉, 생성물 생체분자); 대상 생성물에 비해 크로마토그래피 매트릭스에 약하게 결합하는 불순물; 및 대상 생성물에 비해 크로마토그래피 매트릭스에 강하게 결합하는 불순물.
이러한 성분들을 분리하기 위한 전통적인 기법은 배치 컬럼 크로마토그래피를 이용한다. 공급원료를 컬럼에 주입하고, 컬럼 유출물을 소량의 분획들로서 수집한다. 컬럼에 가장 약하게 결합하는 공급원료의 성분이 먼저 용출된다. 그에 따라, 대상 생성물만 함유한 분획 외에도, 선행 분획 (leading fraction)들은 대상 생성물 및 크로마토그래피 매트릭스에 대상 생성물보다 약하게 결합하는 불순물을 포함하며; 후행 분획 (trailing fraction)들은 대상 생성물 및 크로마토그래피 매트릭스에 대상 생성물보다 강하게 결합하는 불순물을 포함한다. 치료학적 용도로 사용될 단백질에 대한 엄격한 순도 요건으로 인해, 이러한 "중첩 분획" (즉, 선행 분획과 후행 분획)은 전통적으로 폐기되므로, 전체 정제 공정의 효율을 감소시킨다.
전통적인 크로마토그래피 기법들의 또 다른 측면은 오버로드 (overload) 개념이다. 크로마토그래피 매트릭스는 제한된 결합 용량을 가지고 있다. 결합 용량에 도달하면, 과잉의 대상 생성물은 매트릭스에 결합할 수 없으며, 전형적으로 "오버로드"로 소실된다. 또한, 매트릭스의 선택성은 전형적으로 결합 용량에 도달함에 따라 감소한다. 전통적인 기법에서, 오버로드 단백질 샘플은 소실되거나 또는 추가적인 공정을 거쳐야 하는데, 이는 오염 위험성을 가중시킨다.
사용되는 한가지 표준 산업 기법은 MCSGP (multicolumn countercurrent solvent gradient purification)이다. MCGSP는 단백질 조 추출물을 원하는 수준으로 정제하기 위해 복수의 크로마토그래피 컬럼을 이용하는 크로마토그래피 기법이다. MCGSP에서, 복수의 크로마토그래피 컬럼들은 단백질 조 추출물이 흐르는 방향과 반대 포지션으로 스위칭된다. 요컨대, 대상 단백질이 크로마토그래피 매트릭스 (수지)에 결합하도록 단백질 조 추출물을 제1 컬럼에 로딩한다. 약하게 흡착된 불순물을 매트릭스에서 세척 제거한 후, 대상 단백질의 용출을 개시한다. 원하는 단백질의 순수 분획들은 체류시키고, 선행 및 후행 중첩 분획들은 제2 컬럼으로 인가하여, 추가적인 공급물 (단백질 조 용액)과 합친다. 그런 후, 제2 컬럼에서 이 과정을 반복하게 되며, 중첩 분획들은 추가의 컬럼으로 인가한다. 이론적으로, 오버로드 분획은 제1 컬럼에 다시 적용할 수 있지만, 실제 컬럼 시리즈는 전형적으로 재사용하기 전에 각각의 컬럼을 세척, 재-평형화 등을 위한 시간을 허용하기 위해 이용된다. 이러한 방식으로, 불순물 중첩 분획들은 반복적인 정제 사이클을 거치게 되므로, 원하는 단백질을 고 순도로 수득할 수 있다.
MCSGP는 산업에서 대량 스케일 용도로 의도되지만, 중대한 문제점을 가지고 있다. 전술한 설명에서 자명한 바와 같이, MCSGP에는 매칭되는 크로마토그래피 컬럼이 최소 2개 필요하고, 실제 공정의 효율을 가능한 극대화하기 위해 대개는 2개 보다 더 많은 수의 컬럼이 사용된다. 크로마토그래피 수단에 사용되는 매트릭스 (수지)의 높은 단가는, 복수의 컬럼의 필요성이 단백질 생산 비용을 현저하게 가중시키는 것을 의미한다. MSCGP 기법과 관련된 또 다른 문제는, 매칭되는 복수의 컬럼, 정교한 흐름 조절 장치 및 제어 소프트웨어뿐 아니라, 인라인 믹서, 펌프, 밸브, 검출기 및 하우징 등의 추가적인 크로마토그래피 하드웨어가 각각의 추가적인 컬럼에 필요한데, 이들 모두 비용을 가중시키고, 부품 고장 가능성을 높이고, 검증 프로세스의 복잡성을 높이고, 오류 진단을 복잡하게 만들므로, 매우 복잡한 필수 장치 특성이 있다는 것이다. MSCGP 기법과 관련된 또 다른 문제는 공정을 계속 가동하여야 한다는 것이다. 이는, (예, 다량의 배양물로부터 단백질 조 추출물을) 정제하는데 소요되는 시간을 표준 작동 실무에 따라 정할 수 없을 때 문제가 되며, 예를 들어 작업자가 24시간 내내 연장된 시간 동안 작업해야 할 경우 문제가 된다. 또 다른 문제는 적절한 분리를 달성하기 위해서는 느린 유속 및/또는 대량의 매트릭스가 필요하다는 것이다.
이러한 상황에 비추어, 본 발명자들은 단백질을 대량 정제를 위한 개선된 기법이 필요하다는 것을 인지하게 되었다. 이에, 본 발명은 단백질 및 기타 생체분자를 공업적인 규모로 정제하기 위한 개선된 방법을 제공하며, 전술한 문제들 중 일부 또는 전부를 해결하고자 한다.
Kontermann, R. E. (2012). "Dual targeting strategies with bispecific antibodies." MAbs 4(2): 182-197.
Mahajan, E., A. George and B. Wolk (2012). "Improving affinity chromatography resin efficiency using semi-continuous chromatography." J Chromatogr A 1227: 154-162.
본 발명자들은, MCSGP가 대규모 공업적인 단백질 정제에 이용되고 있지만, 대상 생성물 (즉, 생성물 생체분자)의 분리, 중첩 및 선택적으로 중첩 분획의 싱글 크로마토그래피 매트릭스 (single chromatography matrix), 예를 들어 싱글 컬럼에서의 재순환으로부터 상당한 이점이 발생한다는 것을 인지하게 되었다. 싱글 매트릭스의 사용은 복수의 컬럼을 사용하는 종래 기술과 비교해 현저한 장점이 있다. 여러개의 컬럼이 아닌 단 하나의 컬럼을 사용하므로, 필요한 매트릭스(수지) 비용을 현저하게 줄일 수 있다. 컬럼을 작동시키기 위해 필요한 장치 (예를 들어) 흐름 제어 장치 및 제어 소프트웨어의 복잡성 역시 현저하게 감소하며, 인라인 믹서, 펌프, 밸브, 검출기 등과 같은 크로마토그래피 하드웨어의 필요성도 줄어든다. 중요한 점은, 공정을 불연속적으로 (비동기적) 운영할 수 있다는 것으로, 이는 정제를 작업일 동안 운영할 수 있으며, 심지어 장기간 중단시킬 수도 있다. 또한, 기존에 공지된 기법과 비교해 비교적 빠른 유속 및/또는 적은 매트릭스 부피로 적절한 분리를 달성할 수 있다.
이전에, 본 발명자들은 WO 2017/140881에서 혼합물로부터 단백질을 정제하기 위한 크로마토그래피 공정을 발표하였다. WO 2017/140881에서 발표된 공정은, 매트릭스의 결합 용량을 초과하도록 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하여, 비-결합 단백질을 함유한 통과 분획을 매트릭스를 통과시킨 다음, 통과 분획을 추가의 작동 크로마토그래피 사이클에서 매트릭스에 재-로딩하는 것을 포함한다. 본 발명자들은, 이제 공급원료로부터 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하고, 생성물을 용출시킨 다음, 생성물 생체분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 용출물 분획을 매트릭스에 재-로딩하는 새로운 크로마토그래피 기법을 개발하게 되었다. 이러한 방법은 WO 2017/140881에서 발표된 방법과는 구별되는 방법으로, 정제 수율 개선을 비롯해 현저하게 유익한 효과를 가진다. 본 발명의 방법은 조 추출물로부터 공급원료를 일차 부분 정제한 다음의 "폴리싱" 단계에 특히 적합하다.
이에, 본 발명은, 정제된 화합물의 순도 및 수율을 유지 또는 개선하면서도 보다 효율적이고 비용 효과적인 크로마토그래피 매트릭스의 사용을 수반하는, 생성물 생체분자 (대상 화합물, 특히 대상 단백질)의 정제 공정을 제공한다.
즉, 본 발명은,
a)
생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 공급원료로부터 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩 (loading)하는 단계;
b)
용출 용액을 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여, 크로마토그래피 매트릭스로부터 생성물 생체분자를 용출물로서 용출시키는 단계로서,
상기 용출물이,
- 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 제1 분획; 및
- 생성물 생체분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 제2 분획을 포함하고,
상기 제2 분획이 하나 이상의 선행 분획 및/또는 후행 분획을 포함하고;
상기 제1 분획이 제2 분획과 별도로 수집되는, 단계;
c)
제2 분획을 하나 이상의 용기에서 홀딩 (holding)하는 단계;
d)
제2 분획 내 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 용기로부터 제2 분획 및 공급원료로부터 추가적인 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계로서, 상기 추가적인 공급물이 제2 분획과 동시에 또는 순차적으로 로딩되는, 단계; 및
e)
용출 용액을 상기 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여, 크로마토그래피 매트릭스로부터 생성물 생체분자를 용출물로서 용출시키는 단계로서, 용출물이 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 단계를 포함하며,
상기 단계 (a), 단계 (b), 단계 (d) 및 단계 (e)에서 크로마토그래피 매트릭스가 동일한 크로마토그래피 매트릭스인, 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 공급원료로부터 생성물 생체분자를 정제하기 위한 공업적인 규모의 공정을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에서, 생성물 생체분자는 단백질, 항체, 항체 단편, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드이다.
또한, 본 발명은 정제된 생성물 생체분자를 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 보강제와 함께 제형화하는 것을 더 포함하는 공정을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 공정에 의해 수득가능한 정제된 생성물 생체분자를 제공한다.
도 1은 본 발명의 공정에 사용하기 위한 셋업을 도시한 개략도이다. 다양한 액체 완충제 성분은 탱크에 수용되며, 밸브를 경유해 다공성 크로마토그래피 매트릭스로 순차적으로 펌핑된다. 용출물 분획은, 매트릭스에서 나온 다음 본원에서 용출물 분획으로 지칭되는 개별 부피의 용출물을 분석하는 검출기를 통과하게 된다. 정제된 생성물 생체분자 "제1 분획"(즉, 화합물의 농도 또는 화합물의 순도와 같이 대상 화합물의 바람직한 특징을 나타내는 용출물의 하나 이상의 분획)을 수집한다. 나머지 분획들의 경우, 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 "제2 분획" (즉, 원하는 특징을 나타내진 않지만, 대상 화합물이 여전히 함유되어 있으며 기본적으로 추가적인 가공 처리에 적합한 분획)은 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하기 위해 수집한다. 도 1의 셋업에서, "재순환 1" 및 "재순환 2" 용기에 각각 수집되는 2개의 분획이 존재한다.
도 2 내지 7은 본 발명에 따른 공정도를 도시한 것이다. 전형적인 크로마토그래피 분리는, 생성물 생체분자 (대상 단백질/타겟 화합물)를 고정된 매트릭스에 결합시키는 결합 단계, 및 생성물 생체분자 (타겟 화합물)를 매트릭스로부터 화학적으로 제거하는 용출 단계를 포함할 수 있다. 그 사이에, 전형적으로 불순물을 추가로 제거하고 매트릭스의 품질을 유지하기 위해 세척 및 컨디셔닝 단계가 존재하며, 이때 이들 물질은 전형적으로 폐기한다. 도 2-7에 도시된 공정에서, 본 발명에 따르면, 생성물 생체분자 (대상 화합물) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 혼합물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하고, 로딩된 크로마토그래피 매트릭스를 세척한 다음 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시킨다. 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 용출물의 "제1 분획(들)" (즉, 대상 화합물의 농도 또는 화합물의 순도와 같은 대상 화합물에서 원하는 특징을 나타내는 분획들) 하나 이상을 수집하고, 생성물로서 공정으로부터 회수한다. 도 2-7에 도시된 공정에서, 하나 이상의 제1 분획(들)에 앞서 나오는 하나 이상의 용출물 분획 및/또는 하나 이상의 제1 분획(들) 다음에 나오는 하나 이상의 용출물 분획은 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩한다. 이 공정을 수차례 반복할 수 있으며, 이 공정은 생성물 생체분자를 포함하는 혼합물의 부피 (즉, 공급원료의 총 부피)가 모두 소비될 때까지 계속 진행한다.
도 2는 본 발명에 따른 공정의 일 예이다. 공급원료를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한 후, 정제된 생성물 생체분자를 함유한 제1 분획을 용출시킨다. 제2 분획은 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하기 전 선택적으로 (예, 희석에 의해) 가공 처리되는, (본원에 정의된) 선행 및/또는 후행 분획을 포함한다. 사이클은 수회 반복된다. 도 2는 후행 및 선행 분획 둘다 재-로딩하는 것으로 도시되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 방법이 2가지 분획들 둘다를 재-로딩하여야 하는 것은 아님을 이해할 것이다 - 예를 들어, 후행 (이후) 및/또는 선행 (이전) 분획 중 한가지만 매트릭스에 재-로딩할 수도 있다.
도 3은 본 발명의 공정에 대한 다른 예를 도시한다. 도 3의 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및/또는 하나 이상의 이후 (후행) 분획은, 후속적인 크로마토그래피 작동 사이클 (operational chromatography cycle)에서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 각각 재-로딩하기 전에 가공 처리된다.
도 4에 도시된 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및 하나 이상의 이후 (후행) 분획을 합치고, 후속적인 크로마토그래피 작동 사이클에서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하기 전 조합된 분획으로서 가공 처리한다.
도 5는, 조합된 용출물 분획의 부피가 현저하게 증가되는 것을 제외하고는 도 4에 도시된 공정과 매우 유사한 공정을 도시한다. 조합된 분획의 총 부피는 예를 들어 희석에 의해 증가할 수 있다. 희석은 매트릭스에 재-로딩하기 전, 조합된 분획을 가공 처리하는 방법의 일 예이다.
도 6에 도시된 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및 하나 이상의 이후 (후행) 분획은, 공급원료로부터 나오는 추가의 공급물 (즉, 추가의 부피, 또는 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스에 로딩되는 혼합물의 추가적인 일부)과 합쳐져, 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 재차, 이 공정은 수차례 반복할 수 있다. 도 6에서 후행 분획과 선행 분획이 재-로딩되는 것으로 도시되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 방법이 2가지 분획들 둘다를 재-로딩하여야 하는 것은 아님을 이해할 것이다 - 예를 들어, 후행 및/또는 선행 분획 중 한가지만 매트릭스에 재-로딩할 수도 있다.
도 7에 도시된 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및 하나 이상의 이후 (후행) 분획을 통과 분획 (도 7에서 "재순환"으로 언급됨)과 합친다. 통과 분획은 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 함유한 로딩을 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여 유출될 때까지 수득한다. 즉, 도 7은 본원에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이 과량 로딩의 일 예를 나타낸 것이다. 도 7에는 후행 분획과 선행 분획이 재-로딩되는 것으로 도시되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 방법이 2가지 분획들 둘다를 재-로딩하여야 하는 것은 아님을 이해할 것이다 - 예를 들어, 후행 및/또는 선행 분획 중 한가지만 매트릭스에 재-로딩할 수도 있다.
도 8 내지 도 14는 본 발명에 따른 공정의 복수의 사이클 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 8-14는 작동 사이클을 7회 포함하는 본 발명에 따른 공정의 일 예 (즉, 청구항 1의 공정 참조, 단계 (b), (c) 및 (d)가 5회 반복됨)를 나타낸 것이다. 도 8-14는 복수의 사이클의 재현성을 보여주며, 대상 화합물 (예, 생성물 생체분자)을 본 발명의 방법으로 고 수율로 재현가능하게 수득할 수 있음을 입증해준다. 도 8은 첫 단계 크로마토그래피 매트릭스 평형화와 이후의 로딩 단계 (본 발명의 공정에서 단계 (a))를 나타낸 것이다. 로딩이 완료되면, 매트릭스를 세척할 수 있으며, 그런 후 대상 화합물 (생성물 생체분자)을, 예를 들어, 농도 구배 용출에 의해 매트릭스로부터 용출시킬 수 있다 (공정의 단계 (b)). 260 nm, 280 nm 및 305 nm에서 기록한 피크는 매트릭스로부터 단백질의 용출을 의미한다. 도 9-14는 본 발명의 공정의 후속 사이클을 도시한다. 도 9-14에서, 로딩 단계는 본 발명의 공정에서 단계 (d)이다. 즉, 도 8은 실시예의 제1 사이클의 크로마토그램을 도시한 것이다 도 9는 실시예의 제2 사이클의 크로마토그램이다. 도 10은 실시예의 제3 사이클의 크로마토그램이다. 도 11은 실시예의 제4 사이클의 크로마토그램이다. 도 12는 실시예의 제5 사이클의 크로마토그램이다. 도 13은 실시예의 제6 사이클의 크로마토그램이다. 도 14는 실시예의 제7 사이클의 크로마토그램이다.
도 15는 제1 내지 제7 사이클의 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 도 15는 본 발명에 따른 공정에 따른 타겟 생체분자의 고 수율을 보여준다.
도 16은 Protein G HPLC에 의해 측정한 CEX 농도 구배 용출에서 합체된 (conflated) 불순물 및 Fab 피크들을 나타낸 도이다. 도 17은 체류 풀 (retained pool)의 Fab 양을 분석한 결과를 요약한 표이다 (체류 풀 내 함량 분석, 9-20번 분획은 주로 non-Fab를, 23-31번 분획은 주로 대상 Fab를 함유하고 있음). 도 18은 후기 양이온 교환 피크 체류 풀에서 획득한 수율 %를 요약한 표이다. 도 19는 후기 양이온 교환 피크 체류 풀에서 획득한 순도 %를 요약 개시한 표이다. (도 17-19에서, 제7 사이클은 포함된 분획의 범위가 다름에 유념함 - 초기 피크는 1-8번 분획을, 후기 피크는 24-31번 분획임). 도 20은 사이클에 따른 후기 양이온 교환 피크의 수율 및 순도를 베이스라인과 함께 나타낸 도이다. (각 분획들의 부피는 일정하기 때문에, 총 수율 증가는 전체 농도 증가와 동일함). 도 17-20에 요약 개시된 데이터 및 상기한 데이터 획득 실험들은 실시예에서 설명된다.
도 2 내지 7은 본 발명에 따른 공정도를 도시한 것이다. 전형적인 크로마토그래피 분리는, 생성물 생체분자 (대상 단백질/타겟 화합물)를 고정된 매트릭스에 결합시키는 결합 단계, 및 생성물 생체분자 (타겟 화합물)를 매트릭스로부터 화학적으로 제거하는 용출 단계를 포함할 수 있다. 그 사이에, 전형적으로 불순물을 추가로 제거하고 매트릭스의 품질을 유지하기 위해 세척 및 컨디셔닝 단계가 존재하며, 이때 이들 물질은 전형적으로 폐기한다. 도 2-7에 도시된 공정에서, 본 발명에 따르면, 생성물 생체분자 (대상 화합물) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 혼합물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하고, 로딩된 크로마토그래피 매트릭스를 세척한 다음 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시킨다. 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 용출물의 "제1 분획(들)" (즉, 대상 화합물의 농도 또는 화합물의 순도와 같은 대상 화합물에서 원하는 특징을 나타내는 분획들) 하나 이상을 수집하고, 생성물로서 공정으로부터 회수한다. 도 2-7에 도시된 공정에서, 하나 이상의 제1 분획(들)에 앞서 나오는 하나 이상의 용출물 분획 및/또는 하나 이상의 제1 분획(들) 다음에 나오는 하나 이상의 용출물 분획은 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩한다. 이 공정을 수차례 반복할 수 있으며, 이 공정은 생성물 생체분자를 포함하는 혼합물의 부피 (즉, 공급원료의 총 부피)가 모두 소비될 때까지 계속 진행한다.
도 2는 본 발명에 따른 공정의 일 예이다. 공급원료를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한 후, 정제된 생성물 생체분자를 함유한 제1 분획을 용출시킨다. 제2 분획은 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하기 전 선택적으로 (예, 희석에 의해) 가공 처리되는, (본원에 정의된) 선행 및/또는 후행 분획을 포함한다. 사이클은 수회 반복된다. 도 2는 후행 및 선행 분획 둘다 재-로딩하는 것으로 도시되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 방법이 2가지 분획들 둘다를 재-로딩하여야 하는 것은 아님을 이해할 것이다 - 예를 들어, 후행 (이후) 및/또는 선행 (이전) 분획 중 한가지만 매트릭스에 재-로딩할 수도 있다.
도 3은 본 발명의 공정에 대한 다른 예를 도시한다. 도 3의 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및/또는 하나 이상의 이후 (후행) 분획은, 후속적인 크로마토그래피 작동 사이클 (operational chromatography cycle)에서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 각각 재-로딩하기 전에 가공 처리된다.
도 4에 도시된 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및 하나 이상의 이후 (후행) 분획을 합치고, 후속적인 크로마토그래피 작동 사이클에서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하기 전 조합된 분획으로서 가공 처리한다.
도 5는, 조합된 용출물 분획의 부피가 현저하게 증가되는 것을 제외하고는 도 4에 도시된 공정과 매우 유사한 공정을 도시한다. 조합된 분획의 총 부피는 예를 들어 희석에 의해 증가할 수 있다. 희석은 매트릭스에 재-로딩하기 전, 조합된 분획을 가공 처리하는 방법의 일 예이다.
도 6에 도시된 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및 하나 이상의 이후 (후행) 분획은, 공급원료로부터 나오는 추가의 공급물 (즉, 추가의 부피, 또는 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스에 로딩되는 혼합물의 추가적인 일부)과 합쳐져, 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 재차, 이 공정은 수차례 반복할 수 있다. 도 6에서 후행 분획과 선행 분획이 재-로딩되는 것으로 도시되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 방법이 2가지 분획들 둘다를 재-로딩하여야 하는 것은 아님을 이해할 것이다 - 예를 들어, 후행 및/또는 선행 분획 중 한가지만 매트릭스에 재-로딩할 수도 있다.
도 7에 도시된 공정에서, 하나 이상의 이전 (선행) 분획 및 하나 이상의 이후 (후행) 분획을 통과 분획 (도 7에서 "재순환"으로 언급됨)과 합친다. 통과 분획은 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 함유한 로딩을 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여 유출될 때까지 수득한다. 즉, 도 7은 본원에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이 과량 로딩의 일 예를 나타낸 것이다. 도 7에는 후행 분획과 선행 분획이 재-로딩되는 것으로 도시되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 방법이 2가지 분획들 둘다를 재-로딩하여야 하는 것은 아님을 이해할 것이다 - 예를 들어, 후행 및/또는 선행 분획 중 한가지만 매트릭스에 재-로딩할 수도 있다.
도 8 내지 도 14는 본 발명에 따른 공정의 복수의 사이클 동안 기록된 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 8-14는 작동 사이클을 7회 포함하는 본 발명에 따른 공정의 일 예 (즉, 청구항 1의 공정 참조, 단계 (b), (c) 및 (d)가 5회 반복됨)를 나타낸 것이다. 도 8-14는 복수의 사이클의 재현성을 보여주며, 대상 화합물 (예, 생성물 생체분자)을 본 발명의 방법으로 고 수율로 재현가능하게 수득할 수 있음을 입증해준다. 도 8은 첫 단계 크로마토그래피 매트릭스 평형화와 이후의 로딩 단계 (본 발명의 공정에서 단계 (a))를 나타낸 것이다. 로딩이 완료되면, 매트릭스를 세척할 수 있으며, 그런 후 대상 화합물 (생성물 생체분자)을, 예를 들어, 농도 구배 용출에 의해 매트릭스로부터 용출시킬 수 있다 (공정의 단계 (b)). 260 nm, 280 nm 및 305 nm에서 기록한 피크는 매트릭스로부터 단백질의 용출을 의미한다. 도 9-14는 본 발명의 공정의 후속 사이클을 도시한다. 도 9-14에서, 로딩 단계는 본 발명의 공정에서 단계 (d)이다. 즉, 도 8은 실시예의 제1 사이클의 크로마토그램을 도시한 것이다 도 9는 실시예의 제2 사이클의 크로마토그램이다. 도 10은 실시예의 제3 사이클의 크로마토그램이다. 도 11은 실시예의 제4 사이클의 크로마토그램이다. 도 12는 실시예의 제5 사이클의 크로마토그램이다. 도 13은 실시예의 제6 사이클의 크로마토그램이다. 도 14는 실시예의 제7 사이클의 크로마토그램이다.
도 15는 제1 내지 제7 사이클의 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 도 15는 본 발명에 따른 공정에 따른 타겟 생체분자의 고 수율을 보여준다.
도 16은 Protein G HPLC에 의해 측정한 CEX 농도 구배 용출에서 합체된 (conflated) 불순물 및 Fab 피크들을 나타낸 도이다. 도 17은 체류 풀 (retained pool)의 Fab 양을 분석한 결과를 요약한 표이다 (체류 풀 내 함량 분석, 9-20번 분획은 주로 non-Fab를, 23-31번 분획은 주로 대상 Fab를 함유하고 있음). 도 18은 후기 양이온 교환 피크 체류 풀에서 획득한 수율 %를 요약한 표이다. 도 19는 후기 양이온 교환 피크 체류 풀에서 획득한 순도 %를 요약 개시한 표이다. (도 17-19에서, 제7 사이클은 포함된 분획의 범위가 다름에 유념함 - 초기 피크는 1-8번 분획을, 후기 피크는 24-31번 분획임). 도 20은 사이클에 따른 후기 양이온 교환 피크의 수율 및 순도를 베이스라인과 함께 나타낸 도이다. (각 분획들의 부피는 일정하기 때문에, 총 수율 증가는 전체 농도 증가와 동일함). 도 17-20에 요약 개시된 데이터 및 상기한 데이터 획득 실험들은 실시예에서 설명된다.
당해 기술 분야에 공지된 다수의 단백질 정제 방법들은, 예를 들어, 높거나 또는 낮은 pH, 높은 염 농도 또는 정제할 단백질의 생물학적 활성을 비가역적으로 위협할 수 있어 부적절한 기타 극한의 조건 적용이 요구되는 단계를 포함한다. 따라서, 원하는 단백질을 충분한 순도로 정제하는 것은 상당한 도전 과제이다. 역사적으로, 단백질 정제 계획은 정제할 단백질과 부적절한 단백질 오염물 간의 크기, 전하 및 용해성과 같은 분자 특징 차이를 기반으로 예상한다. 이러한 파라미터에 기반한 프로토콜로는 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 차별적인 석출 (differential precipitation) 등이 있다.
항체 및 항체 단편은 다양한 치료학적 분야에서 중요성이 커지고 있다. 항체 및 항체 단편을 생산하는 가장 중요한 방법 중 하나는 재조합 기법에 의한 것이다. 이 기법은 숙주 세포를 이용해 원하는 항체를 발현시킨 다음 생산 배지에서 분리하여 정제한다.
항체에는 당화가 필요하므로, 일반적으로 진핵생물 세포, 특히 CHO, PER.C6, NS0, BHK 또는 Sp2/0 세포와 같은 포유류 세포를 이용한 진핵생물 발현 시스템에서 발현시킨다. 진핵생물 발현 시스템에서, 항체와 같이 발현되는 대상 단백질은 일반적으로 세포 배양 배지로 분비된다. 이후, 배지를 단백질 분비 세포로부터, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 대상 단백질은 전형적으로 예를 들어 크로마토그래피에 의해 추가적으로 정제하여야 한다.
다양한 크로마토그래피 기법, 특히 공업적인 대량 정제 공정에 사용되는 크로마토그래피 매트릭스들은 매우 비싸다. 이러한 매트릭스는 일반적으로 세척 공정을 거친 후 재사용된다. 사용되는 세척제의 가혹한 특성으로 인해, 크로마토그래피 매트릭스의 효율은 시간에 따라 감소한다. 전형적으로, 크로마토그래피 매트릭스는, 예를 들어, 이의 최대 단백질 결합 용량으로 이용되지 않으므로, 당해 기술 분야에서 그다지 효율적으로 사용되진 않는다. 당해 기술 분야에서, 크로마토그래피 매트릭스는 수율 개선을 위해 매트릭스의 총 용량 보다 낮은 수준으로 대상 단백질을 로딩하는 방식으로 사용된다. 대상 단백질이 단백질 매트릭스에 총 용량으로 로딩되면, 대상 단백질은 통과 분획 (flow-through)으로 다량 소실된다. 크로마토그래피 매트릭스의 높은 단가와 제한된 수명으로 인해, 크로마토그래피 매트릭스를 최적화된 사용 방법이 당해 기술 분야에 요구되고 있다.
대규모 세포 배양 공정으로부터 수득되는 단백질 조산물 (crude preparation)은 전형적으로 한번의 정제 사이클로는 정제할 수 없다. 정제할 단백질의 양으로 인해, 세포 배양의 결과물을 정제하기 위해서는 동일한 정제 사이클을 여러번 수행하여야 한다. 따라서, 정제할 단백질 혼합물은 역시 크로마토그래피 사이클을 수회 포함하는 다중 정제 사이클로, 흔히 배치 방식 (batch by batch)으로 정제한다. 또한, 대규모 생의약품 제조 공정에서도 연속 공정을 수행한다. 연속 크로마토그래피의 경우, 해당 방법의 요건에 따라, 컬럼을 일렬로 및/또는 병렬로 작동시킬 수 있는 배치로 동일한 컬럼들이 여러 개 연결된다. 하나의 크로마토그래피 사이클이 로딩, 세척, 용출 및 재생과 같은 연속적인 여러 단계들로 이루어지는, 싱글 컬럼 또는 배치 크로마토그래피와 비교해, 동일한 컬럼을 여러 개 사용하는 연속적인 크로마토그래피에서는, 이러한 단계들이 모두 동시에, 그러나 서로 다른 컬럼들에서 각각 이루어진다. 연속적인 크로마토그래피 작동 방식은 크로마토그래피 수지를 보다 효율적으로 활용하고, 처리 시간을 단축하고, 필수 완충제를 줄일 수 있으며, 이러한 효과들은 모두 공정 경제성에 유익하다. 연속적인 크로마토그래피의 특별한 운용 방식을 모의 유동층 (simulated moving bed, SMB) 크로마토그래피라 한다. 모의 유동층 크로마토그래피에서, 시스템을 구성하는 모든 크로마토그래피 컬럼들은 샘플의 흐름과 반대 방향으로 주기적으로 동시에 이동한다. 컬럼의 이동은 정교한 설정이 필요한 컬럼으로의 유입/컬럼으로부터의 배출 스트림의 적절한 방향 전환에 의해 구현된다. 이에, SMB 공정과 같은 연속적인 크로마토그래피 공정은 상당한 복잡성과 연관되어 있다.
하나의 큰 크로마토그래피 컬럼이 아니라 작은 컬럼을 여러 개 일렬로 사용하고 보다 높은 결합 용량까지 로딩하는, 반-연속적인 크로마토그래피 공정이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 각 컬럼의 통과 분획은 다음 컬럼에 바로 로딩된다. 다른 구현예로, 제1 컬럼의 통과 분획은 대상 단백질과의 혼합물이 수용된 제1 용기로 다시 인가된 다음 제1 컬럼에 재-로딩된다 (Mahajan, George et al. 2012). 사용 컬럼은 매우 작은 실험실 규모이며, 저자는 복수의 컬럼을 이용한 연속 방식의 크로마토그래피가 처리 시간 단축과 같은 이점을 제공한다는 결론 내렸다.
여러 개의 크로마토그래피 컬럼을 일렬로 사용하기 위해서는 정교한 흐름 제어 장치 및 제어 소프트웨어뿐 아니라 각각의 추가의 컬럼에 대한 펌프, 밸브, 검출기 및 하우징 등의 부가적인 컬럼 하드웨어가 필요하며, 이는 비용 증가, 부품 고장 가능성 증가, 검증 공정의 복잡성 증가 및 에러 진단의 복잡성을 야기한다. 아울러, 하나의 컬럼에서 나온 통과 분획을 인접한 수용 컬럼 (receiving column)에 순서대로 정확한 기간에 배치하기 위해서는, 이들을 매칭시키기 위한 지연 기간이 도입되어야 하는데, 이는 작업의 속도를 떨어뜨린다. 각각의 추가적인 수용 컬럼들을 교대로 개시 및 정지시켜야 하며, 그 결과 그 기간 동안 컬럼은 비-사용 상태이기 때문에, 작동을 정지 또는 재개할 때마다 추가적인 생산성 패널티가 발생한다.
따라서, 크로마토그래피 매트릭스의 사용을 포함하는, 단순하고, 효율적이며, 비용 효과적인, 단백질, 예를 들어 항체 정제 공정이 필요하다. 본 발명의 방법은 이러한 요구를 해결하고자 한다.
본 발명의 공정
본 발명의 토대가 되는 문제들은 본원에 제공된 방법에 의해 해결된다.
본 발명은 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 공급원료로부터 생성물 생체분자를 정제하기 위한 공업적인 규모의 공정을 제공하며, 공정은
a)
생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 공급물을 공급원료로부터 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계;
b)
용출 용액을 상기 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여, 생성물 생체분자를 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출물로서 용출시키는 단계로서,
상기 용출물이,
- 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 제1 분획; 및
- 생성물 생체분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 제2 분획을 포함하고,
상기 제2 분획이 하나 이상의 선행 분획 및/또는 후행 분획을 포함하고;
상기 제1 분획이 제2 분획과 별도로 수집되는, 단계;
c)
제2 분획을 하나 이상의 용기(들)에서 홀딩하는 단계;
d)
제2 분획 내 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 상기 용기(들)로부터 제2 분획과 상기 공급원료로부터 추가적인 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계로서, 상기 추가적인 공급물이 상기 제2 분획과 동시에 또는 순차적으로 로딩되는, 단계; 및
e)
용출 용액을 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여, 생성물 생체분자를 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출물로서 용출시키는 단계로서, 상기 용출물이 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 단계를 포함하며,
상기 단계 (a), 단계 (b), 단계 (d) 및 단계 (e)에서 크로마토그래피 매트릭스는 동일한 크로마토그래피 매트릭스이다.
아래에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 단계 (d)는 추가적인 공급물을 공급원료로부터 크로마토그래피 매트릭스에 제2 분획과 함께 또는 순차적으로 로딩하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 공정에서, 단계 (b), (c) 및 (d)는 반복 수행된다. 바람직하게는, 단계 (b), (c) 및 (d)는 2회 이상, 더 바람직하게 3회 이상, 예를 들어 4회 이상, 예로 5회 이상, 예로, 10회 이상으로 수행된다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 공급원료의 부피, 공급원료 내 생성물 생체분자의 순도, 공급원료에 존재하는 불순물의 특징 등에 따라, 이들 단계의 적절한 반복 횟수를 쉽게 정할 수 있을 것이다.
단계 (b), (c) 및 (d)가 1회 반복되는 경우, 공정은 3번의 로딩/용출 사이클 (즉, 단계 (a)에서 제1 로딩 사이클; 단계 (b)에서 제1 용출 사이클; 단계 (d)에서 제2 로딩 사이클; 단계 (b)에서 제2 용출 사이클; 단계 (d)에서 제3 로딩 사이클 및 단계 (e)에서 제3 용출 사이클)을 포함함이 자명할 것이다. 단계 (b), (c) 및 (d)를 2번 반복할 경우, 본 발명의 공정은 4번의 로딩/용출 사이클 (즉, 단계 (a)에서 제1 로딩 사이클; 단계 (b)에서 제1 용출 사이클; 단계 (d)에서 제2 로딩 사이클; 단계 (b)에서 제2 용출 사이클; 단계 (d)에서 제3 로딩 사이클; 단계 (b)에서 제3 용출 사이클; 단계 (d)에서 제4 로딩 사이클; 및 단계 (e)에서 제4 용출 사이클)을 포함한다. 다시 말해, 단계 (b), (c) 및 (d)를 n회 (n = 양의 정수)로 반복할 경우, 공정은 (n + 2)번의 로딩/용출 사이클을 포함한다.
바람직하게는, 단계 (a) 및 (b)는 여러번 반복된다. 즉, 공급물은 공급원료로부터 크로마토그래피 매트릭스로, 여러번으로 나누어 적용될 수 있으며, 공급물을 각각 로딩한 후 크로마토그래피 매트릭스로부터 제1 분획 및 제2 분획이 용출된다. 수집되는 제2 분획들은 바람직하게는 제2 분획 풀 (pool)로서 합칠 수 있다. 단계 (c)는, 바람직하게는, 하나 이상의 용기 (들)에 제2 분획 풀을 홀딩하는 것을 포함한다. 다른 예로, 단계 (a) 및 (b)를 반복할 때마다 수득되는 제2 분획들은 하나 이상의 용기(들)에 분리하여 홀딩할 수 있다. 그런 후, 제2 분획을 하나의 부피로 또는 복수의 부피로 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하여, 제2 분획 내 생성물 생체분자를 크로마토그래피 매트릭스에 결합시킬 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 단계 (a) 및 (b)는 수차례 반복되며; 각각의 단계 (b)에서 수집된 제2 분획들을 풀로 모우고; 단계 (c)는 합친 제2 분획 풀을 용기(들)에서 홀딩하는 것을 포함하며; 단계 (d)는 제2 분획 풀을 용기(들)로부터 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하여, 제2 분획 풀 내 생성물 생체분자를 크로마토그래피 매트릭스에 결합시키는 것을 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 대상 화합물을 포함하는 혼합물로부터 대상 화합물을 정제하는 공정을 제공한다:
a)
제1 크로마토그래피 작동 사이클 (operational chromatography cycle)에서, 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스에 대상 화합물을 포함하는 혼합물을 제1 용기로부터 로딩하는 단계;
b)
대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키고, 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계;
c)
대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩하는 단계.
제2 측면에서, 바람직하게는, 단계 c)의 재-로딩은, 추가적인 크로마토그래피 작동 사이클에서, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 제2 측면의 공정은 따라서 하기 단계를 포함할 수 있다:
a)
제1 크로마토그래피 작동 사이클에서, 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스에 대상 화합물을 포함하는 혼합물을 제1 용기로부터 로딩하는 단계;
b)
대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키고, 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계;
c)
추가의 크로마토그래피 사이클에서, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩하는 단계.
바람직하게는, 제2 측면에서, 추가적인 크로마토그래피 작동 사이클은 즉각적으로 후행되는 크로마토그래피 사이클이다.
다른 예로, 제2 측면에 대한 다른 구현예에서, 단계 (c)의 재-로딩은 동일한 크로마토그래피 작동 사이클에서 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩하는 것이다. 이와 관련하여, 공정은 따라서 하기 단계들을 포함할 수 있다:
a)
제1 크로마토그래피 작동 사이클에서 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스에 대상 화합물을 포함하는 혼합물을 제1 용기로부터 로딩하는 단계;
b)
대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키고, 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계;
c)
동일한 크로마토그래피 사이클에서 하나 이상의 용출물 분획을 동일한 크로마토그래피 매트릭스에, 즉, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 제1 크로마토그래피 작동 사이클에서 재-로딩하는 단계.
바람직하게는, 대상 화합물은 본원에 정의된 바와 같은 생성물 생체분자이다.
전술한 내용으로부터, 본 발명의 방법이 공급원료 (즉, 대상 화합물, 즉, 생성물 생체분자를 포함하는 혼합물)를 매트릭스에 로딩하는 단계; 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 매트릭스로부터 용출시키는 단계; 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 "제1 분획" (즉, 원하는 특징을 가진 분획) 및 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 "제2 분획" (즉, 원하는 특징이 없는 분획)을 수집하는 단계; 및 이러한 제2 분획들 중 하나 이상을 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하는 단계를 포함하는 것은 자명할 것이다. 본 발명의 이러한 및 기타 측면들은 아래에서 상세히 설명된다.
체류 분획 (retained fraction)
전술한 바와 같이, 본 발명의 공정은 공급원료로부터 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계, 및 대상 화합물, 즉, 생성물 생체분자를 매트릭스로부터 용출시키는 단계를 포함한다. 따라서, 용출물은 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 하나 이상의 "제1 분획을 포함한다. 또한, 용출물은 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 하나 이상의 "제2 분획"을 포함한다.
제1 분획(들)은 본원에서 또한 "원하는 특징을 가진 분획" 또는 "동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되지 않는 용출물 분획"으로 지칭된다. 제2 분획은 또한 본원에서 "부적절한 특징을 가진 분획" 또는 "동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 용출물 분획"으로 지칭된다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 용이하게도, 본 발명의 공정의 단계 (d)에서 크로마토그래피 매트릭스에 (재) 로딩할 용출물 분획을 식별할 수 있으며, 이러한 분획을 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 분획과 구분할 수 있다. 본 발명의 공정의 단계 (d)에서, 크로마토그래피 매트릭스에 (재) 로딩할 용출물 분획을 식별하기 위해 임의의 적합한 수단을 이용할 수 있다. 예를 들어, (재) 로딩할 분획은, 수득되는 용출물의 부피 또는 방법의 운영 시간을 측정함으로써, (즉, 제1 및 제2 분획의 특징 및 공급원료의 특성에 대해 미리 학습된 지식에 기반하여) 식별할 수 있다. 다른 예로, (재) 로딩할 분획은 방법의 코스 동안에 취해진 측정 결과를 기초로 식별할 수 있다. 예를 들어, 제1 분획은, 바람직하게는, 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 최소 농도로 및/또는 생성물 생체분자 이외의 다른 화합물, 즉, 불순물을 최고 농도로 포함한다. 바람직하게는, 제1 분획은 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 최소 농도로 포함한다.
유사 방식으로, 본 발명의 공정의 단계 (d)에서 크로마토그래피 매트릭스에 (재) 로딩할 제2 분획은, 바람직하게는, 대상 화합물 또는 생성물 생체분자를 최고 농도로, 및/또는 대상 화합물 이외의 다른 화합물, 즉, 불순물을 최소 농도로 포함한다. 바람직하게는, 제2 분획은 대상 화합물 이외의 화합물 (불순물)을 최소 농도로 포함한다.
하나 이상의 용출물 분획 내 및/또는 (하기 참조) 통과 분획 내 대상 단백질 또는 임의의 다른 화합물의 농도는, 비-제한적인 예로, 광학 흡광도 또는 형광성을 측정하는 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기법에 의해 본 발명의 공정에서 측정할 수 있다.
대상 화합물, 특히 대상 단백질은, 샘플 내 다른 단백질 불순물에 의해 유발되는 형광 신호 또는 백그라운드 자외선 흡광도의 정상 상태 수준을 넘어서는 자외선 흡광 또는 형광 신호의 경시적인 증가 또는 감소를 관찰함으로써, 본 발명의 공정에서 샘플 (예, 제1 분획, 제2 분획 및/또는 통과 분획)에서 측정할 수 있다.
대상 화합물, 특히 대상 단백질의 샘플 (예, 제1 분획, 제2 분획 및/또는 통과 분획) 내 농도는, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 파장, 예를 들어 280 nm에서, 바람직하게는, 샘플 내 단백질 불순물로부터 나오는 과도한 신호가 존재할 경우 샘플 내 대상 단백질을 검출할 수 있도록, 290 nm, 300 nm 또는 310 nm와 같은 준-최적 여기 및/또는 방출 파장을 이용해, 자외선 흡광도 또는 형광성에 의해 본 발명의 방법에서 측정할 수 있다.
샘플 내 대상 화합물의 농도는 온라인 (on-line)으로, 라인 상 (at-line)에서 또는 오프라인 (offline)으로 검출할 수 있다. 온라인 농도 측정은, 예를 들어, 샘플이 실시간으로 수집되는 용기(들)에 또는 안에 배치된 또는 크로마토그래피 매트릭스의 유출구와 연결된 검출기를 사용해, 본 발명의 공정에서 농도를 측정하는 것을 의미한다. 라인 상에서 농도 측정은, 샘플이 수집되는 용기(들) 또는 크로마토그래피 매트릭스의 유출구로부터 취해진 시료로부터 농도를 측정하는 것을 의미한다. 오프라인 농도 측정은, 크로마토그래피 매트릭스의 유출구 또는 샘플이 수집되는 용기(들)로부터 시료를 취한 다음, 멀리 배치된, 즉, 매트릭스로부터 분리되어 배치된 검출기에서 지연 후 농도를 측정하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 샘플의 농도는 온라인 측정하거나 또는 라인 상에서 측정하며, 더 바람직하게는 온라인으로 측정한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 샘플 내 불순물의 농도를 샘플 내 생성물 생체분자의 농도를 측정하기 위해 사용되는 방식과 동일한 방식으로 측정할 수 있음을 알 것이다.
따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명에서, 제1 분획(들)이 제2 분획(들)과 다르다는 것을 알 것이다. 제1 분획은 제2 분획과 분리하여 수집된다. 제1 분획은 전형적으로 크로마토그래피 매트릭스에 (재) 로딩되지 않는 반면, 제2 분획은 추가적인 정제를 위해 크로마토그래피 매트릭스에 (재) 로딩된다. 제1 분획은 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 반면, 제2 분획(들)은 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하며; 즉, 제2 분획(들)은 정제된 생성물 생체분자를 포함하지 않는다.
본원에서, 용어 "정제된" 생성물 생체분자는, 반드시 생성물 생체분자가 100% 순도이어야 하는 것은 아니다. 정제된 생성물 생체분자는, 불순물의 수준이 공급원료 내 불순물의 수준 보다 낮은 한, 불순물을 허용가능한 수준 이하로 함유할 수 있다. 정제된 생성물 생체분자에는 불순물이 실질적으로 없을 수 있다 (예, 분획 내 모든 생체분자에 대해 측정하였을 경우, 순도 50% 이상, 예를 들어, 순도 70% 이상, 더 바람직하게 순도 90% 이상, 예를 들어, 순도 95% 이상, 순도 97% 이상, 바람직하게는 순도 98% 또는 99% 이상, 예를 들어 중량%). 불순물은 생성물 생체분자 이외의 생체분자를 포함할 수 있거나, 또는 변형된 또는 분해된 생성물 생체분자를 포함할 수 있다. 제2 분획에 존재하는 불순물은 전형적으로 제1 분획에 존재 또는 체류할 수 있는 임의의 물질과 다르다.
유사한 방식으로, 전술한 제2 측면을 구체적으로 참조하여, 동일 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획과 상이하다. 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획은 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되지 않는다. 본 발명에서, 후술한 바와 같이, 이러한 재-로딩되지 않는 분획은, 크로마토그래피 처리와는 다른 방법에 의해 추가적으로 처리되거나, 또는 사용할 수 있도록 준비된다 (ready for use). 재-로딩되지 않는 분획의 개수는 크로마토그래피 처리의 기본 목적에 따라 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 하나 또는 수개의 용출물 분획에서 대상 화합물이 특정 함량 또는 농도에 도달한다면, 이러한 하나 또는 수개의 분획은 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되지 않을 것이다. 하나 이상의 용출물 분획 중 하나 또는 수개가 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되어야하는지를 결정하기 위한 또 다른 기준은, 예를 들어, 불순물과 같은 부적절한 화합물의 부재 또는 농도 감소이다.
선행 분획 및 후행 분획
전술한 바와 같이, 생체분자의 조 추출물은 전형적으로 크로마토그래피 매트릭스에 대해 대상 생성물 생체분자 화합물과 비슷한 결합 특징을 가진 불순물을 함유한다. 이러한 불순물의 용출 프로파일은 전형적으로 생성물 생체분자와 적어도 일부 중첩된다. 즉, "선행 분획"은 생성물 생체분자 (대상 화합물) 및 생성물 생체분자 보다 약하게 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 불순물을 둘다 포함한다. "후행 분획"은 생성물 생체분자 (대상 화합물) 및 생성물 생체분자 보다 강하게 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 불순물을 둘다 포함한다. 선행 분획은 생성물 생체분자 (대상 화합물)에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되고; 후행 분획은 생성물 생체분자 (대상 화합물) 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출된다. 선행 분획은 또한 "이전 분획"으로도 지칭된다. 후행 분획은 "이후 분획"으로도 지칭된다.
본 발명의 방법에서, 제2 분획은 본원에서 정의되는 하나 이상의 선행 분획(들) 및/또는 하나 이상의 후행 분획(들)을 포함한다.
바람직하게는, 제2 분획은 하나 이상의 선행 분획(들)을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 다시 말해, 제2 측면을 구체적으로 참조하면, 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은, 바람직하게는, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서, 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획이다. 본원에 보다 상세히 기술된 바와 같이 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서, 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획의 개수를 결정하는 것은, 당해 기술 분야의 당업자의 능력에 속한다. 다시 말해, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 공정에서 이용하기 위해 제2 분획에 투입할 적합한 선행 분획들을 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 제2 분획에 투입할 적합한 선행 분획들을 식별하기 위해 사용할 수 있는 파라미터로는 대상 화합물 또는 생성물 생체분자의 최소 농도 및/또는 대상 화합물 이외의 화합물, 즉, 불순물의 최고 농도이며, 이들은 전술한 바와 같이 측정할 수 있다.
바람직하게는, 제2 분획은 바람직하게는 제1 분획 바로 직전에 나오는 선행 분획을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 다시 말해, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획과 상이한 하나 이상의 용출물 분획은, 바람직하게는, 원하는 특징으로 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 직전에 용출되는 분획을 포함한다. 따라서, 제2 분획은, 바람직하게는, 제1 분획 직전에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되고 제1 분획에 바로 인접한 분획을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 이러한 용출물 분획을 포함함으로써, 대상 화합물의 정제 및/또는 농화는 개선된다. 예를 들어, 제1 분획 직전의 선행 분획은 전형적으로 제1 분획 더 앞에 나오는 선행 분획 보다 대상 화합물/생성물 생체분자를 더 높은 농도를 함유한다. 이러한 선행 분획을 체류시킴으로써, 공정의 전체 정제 수율이 증가한다.
바람직하게는, 제2 분획은 후행 분획을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 다시 말해, 제2 측면을 구체적으로 참조하면, 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은, 바람직하게는, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물이다. 제2 분획이 (전술한) 선행 분획을 포함하거나 또는 이로 구성되는 경우에서와 같이, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 공정에 사용하기 위해 제2 분획에 투입하기에 적합한 후행 분획들을 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 제2 분획에 투입하기에 적합한 후행 분획들을 식별하기 위해 사용할 수 있는 파라미터로는 대상 화합물 또는 생성물 생체분자의 최소 농도 및/또는 대상 화합물 이외의 화합물, 즉, 불순물의 최고 농도이며, 이들은 전술한 바와 같이 측정할 수 있다.
바람직하게는, 제2 분획은 제1 분획 직후에 나오는 후행 분획을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 다시 말해, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 분획과는 상이한 하나 이상의 용출물 분획은, 바람직하게는, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 직후 용출되는 분획을 포함한다. 따라서, 제2 분획은, 바람직하게는, 제1 분획에 바로 인접하며 제1 분획 직후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 분획을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 직전에 용출되는 용출물 분획을 재-로딩하는 경우에서와 같이, 이러한 용출물 분획의 포함은 특히 대상 화합물의 정제 및/또는 농화를 높인다. 예를 들어, 제1 분획 직후에 나오는 후행 분획은 전형적으로 제1 분획으로부터 더 뒤에 나오는 후행 분획 보다 대상 화합물/생성물 생체분자를 더 높은 농도로 함유한다. 이러한 후행 분획을 체류시킴으로써, 공정의 전체 정제 수율이 증가된다.
바람직하게는, 제2 분획은 제1 분획 직전의 선행 분획과 제1 분획 직후의 후행 분획을 둘다 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 다시 말해, 제2 측면을 구체적으로 참조하면, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 분획과 상이한 하나 이상의 용출물 분획, 즉, 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩할 하나 이상의 분획은, 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 직전에 용출되는 분획, 및 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 직후에 용출되는 분획을 포함한다. 따라서, 제2 분획은, 바람직하게는, 제1 분획과 바로 인접하고 제1 분획 직전에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 분획, 및 제1 분획과 바로 인접하고 제1 분획 직후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 분획을 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
선행 분획 및 후행 분획 둘다를 포함함으로써, 공정의 전체 정제 수율을 높이고, 또한 본 발명의 공정에 사용되는 장치를 단순화할 수 있다. 예를 들어, 제2 분획을 홀딩하기 위해 사용되는 보관 용기의 개수를 줄일 수 있으며, 따라서 필요한 공급선 및 필수 밸브 위치들의 수를 줄일 수 있다. 추가적인 이점은, 선행 분획 및 후행 분획을 매트릭스에 균일하게 로딩할 수 있다는 것으로, 이는 예를 들어 이는 용출 시간 등과 같은 처리 파라미터를 쉽게 예측하는 바와 같이 유익하다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명의 공정에서, 제2 분획은 제1 분획 직전의 선행 분획 및/또는 제1 분획 직후의 후행 분획을 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 바람직하게는, 선행 분획 및 후행 분획은 크로마토그래피 매트릭스에 각각 분리하여 재-로딩하거나, 또는 이들을 합친 후 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩한다.
유사한 방식으로, 전술한 제2 측면을 구체적으로 참조하여, 바람직하게는:
i)
동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획과 상이하고;
ii)
크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되거나; 및/또는
크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되며; 및
선택적으로,
iii)
원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는, 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획; 및 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는, 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획은:
i) 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 각각 분리하여 재-로딩되거나; 또는
ii) 이들을 합친 다음 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩된다.
복수의 분획들
전술한 바와 같이, 본 발명의 공정은 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하고 매트릭스로부터 타겟 생체분자 (대상 화합물)을 용출시키는 것을 포함한다. 정제된 생성물 생체분자 (즉, 본원에 정의된 원하는 특징을 가진 것)를 포함하는 제1 분획 외에도, 용출물은 또한 하나 이상의 불순물 (즉, 본원에 정의된 부적절한 특징을 가진 것)을 포함하는 제2 분획을 포함한다. 본 발명의 공정에서 이러한 제2 분획이 하나 또는 여러개 생길 수 있다. 아래에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 복수의 제2 분획들은, 본 발명의 공정의 하나의 사이클로부터 나오는 복수의 제2 분획들을 수집함으로써, 또는 본 발명의 공정의 복수의 사이클을 수행하고 각각의 사이클에서 하나 또는 복수의 제2 분획을 수집하는 등의, 다양한 방식으로 생길 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 공정에서, 2 이상의 제2 분획을 수집할 수 있다. 이 경우, 수집되는 복수의 제2 분획은 크로마토그래피 매트릭스에 각각 (재)-로딩하거나; 또는 합쳐 ("풀로 합침") 조합 분획으로서 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩할 수 있다. 다시 말해, 하나 이상의 용출물 분획이 2 이상의 용출물 분획일 경우, 2 이상의 용출물 분획은 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 각각 재-로딩한다. 다른 예로, 2 이상의 용출물 분획을 합친 다음 조합 분획으로서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩할 수 있다.
본 발명의 공정은 다양한 방식으로 복수의 제2 분획을 생성할 수 있다. 예를 들어, 생성물 생체분자를 포함하는 공급원료 (즉, 대상 화합물을 포함하는 혼합물)를 크로마토그래피 매트릭스에 여러개의 분액으로 나누어 로딩할 수 있으며, 각각의 분액에서 제1 분획 및 제2 분획이 생성된다. 이러한 경우, 수집한 제2 분획은 크로마토그래피 매트릭스에 각각 (재) 로딩할 수 있다. 다른 예로, 제2 분획들을 풀로 합치고; 제2 분획 풀 내 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 제2 분획 풀을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한다.
다른 예는 선행 분획을 포함하는 제2 분획을 후행 분획을 포함하는 제2 분획과 분리하여 수집하는 경우이다. 선행 분획을 포함하는 제2 분획 및 후행 분획을 포함하는 제2 분획은 따라서 각각 크로마토그래피 매트릭스에 (재) 로딩할 수 있다. 다른 예로, 상기한 제2 분획들을 풀로 합치고; 제2 분획 풀 내 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 제2 분획 풀을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한다.
홀딩 단계
본 발명의 공정에서, 공급물을 공급원료로부터 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고, 제1 분획과 제2 분획이 용출되면, 제2 분획(들)은 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하기 전에 하나 이상의 용기(들)에서 홀딩한다. 이러한 홀딩 단계는 청구된 공정에서 단계 (c)에 해당한다.
홀드 시간 (hold time)은 대상 공정에 따라 조절할 수 있다. 바람직하게는, 홀드 시간은 5분 이상, 더 바람직하게는 30분 이상, 예를 들어 1시간 이상, 예를 들어 2시간 이상이다. 적어도 5시간, 10시간, 24시간, 1일, 2일, 7일, 14일, 1달, 2달, 6달 또는 1년과 같이 더 긴 홀드 시간도 적합하다.
이에, 본 발명에서, 단계 (c)는 바람직하게는 제2 분획(들)을 5분 이상 홀딩하는 것을 포함한다. 단계 (c)는 바람직하게는 제2 분획(들)을 밤새 홀딩하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 공정에서 홀딩 단계의 이점은, 필요에 따라 크로마토그래피 장치 또는 분획에 변형을 가할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 후술한 바와 같이, 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출된 분획은, 컬럼에 재-로딩하기 전에 추가로 가공 처리할 수 있다. 다른 예로, 크로마토그래피 매트릭스는 홀드 시간 동안에 교환, 세척 또는 재생 처리할 수 있다. 또한, 조작자의 편의성을 개선하는 측면에서 더 긴 홀드 시간도 유익할 수 있다. 예를 들어, 홀드 시간은 밤새 또는 주말동안 진행하도록 계획될 수 있으며, 따라서 작업자는 반사회적인 작업 시간을 회피할 수 있다. 홀딩 단계의 다른 이점은 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출된 분획(들) (특히 제2 분획(들))을 홀딩 단계 중에 본원에 기술된 바와 같이 검사할 수 있다는 것이다.
가공 처리
본 발명의 공정에서, 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 제2 분획(들)은 크로마토그래피 매트릭스에 의한 생체분자의 결합을 촉진하도록 가공 처리될 수 있다. 제2 분획(들)은 바람직하게는 크로마토그래피 매트릭스에 의한 생체분자의 결합을 촉진하기 위해 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩 전 또는 재-로딩 중에 가공 처리된다. 그러나, 제2 분획(들)은 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 중에 가공 처리될 수 있다. 이에, 본 발명의 청구된 공정에서, 가공 처리는 바람직하게는 공정의 단계 (b) 및/또는 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 중에 이루어지며, 바람직하게는 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 중에; 가장 바람직하게는 공정의 단계 (c) 중에 이루어진다.
본 발명의 공정에서, 제2 분획(들)의 가공 처리는 바람직하게는 제2 분획(들)의 pH, 이온 세기, 농도, 온도 및/또는 용매에 변화를 주는 것을 포함한다 (즉, 상기 공정의 제2 측면을 참조하여, 재-로딩 전 또는 재-로딩 중에 가공 처리되는 하나 이상의 용출물 분획). 가공 처리는 또한 혼합 (mixing) 및/또는 탈기 (degassing)를 포함할 수 있다. 가공 처리는 또한 스터링 (stirring) 또는 교반 (agitation)을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 샘플을 가공 처리하는데 적합한 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 샘플의 pH 변형은 산 또는 염기의 첨가를 포함할 수 있다. 이온 세기 변형은 염과 같은 이온 물질의 첨가 또는 격리 (sequestration)에 의해, 또는 (예, 수중 또는 완충제 내) 희석에 의해 달성할 수 있다. 농도 변형은 (예, 진공 필터 어셈블리를 이용해) 샘플 농축에 의해 또는 (예, 수중 또는 완충제 내) 희석에 의해 달성할 수 있다. 온도 변형은 일반적인 장치를 이용한 가열 또는 냉각에 의해 달성할 수 있다. 샘플의 용매 변형은 예를 들어 정용여과에 의한 완충제 또는 용매 교환에 의해 달성할 수 있다.
본 발명의 공정은 유익하게는 제2 분획(들)을 검사하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 검사는 비-파괴적 검사, 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이 인라인 검사이다. 아래에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 제2 분획(들)의 검사는 바람직하게는 생성물 생체분자의 농도; 불순물의 농도; 불순물의 실체; pH; 이온 세기; 온도; 용매; 및/또는 제2 분획(들)의 기체 농도 중 하나 이상의 측정을 포함한다.
용출물 분획 (즉, 제2 분획(들))을 효율적으로 가공 처리하기 위해, 전형적으로, 크로마토그래피 매트릭스에 대한 대상 화합물의 결합에 영향을 미치는 상기한 분획의 특징을 일차로 측정하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 샘플의 pH에 변화를 주기 전에, 전형적으로 샘플의 pH를 측정하는 것이 필수적이다. 마찬가지로, 샘플의 이온 세기, 농도 및/또는 온도를 변형하기 전에, 전형적으로, 이의 이온 세기, 농도 및/또는 온도를 각각 측정하는 것이 필수적이다. 이러한 특징을 측정하는 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.
특징 측정 단계 및 분획 가공 처리 단계는 서로 인접하게 연결될 수 있으며, 즉, 특징을 측정하고, 측정 직후에 가공 처리할 분획에 함유된 대상 화합물이 적용되었을 때 크로마토그래피 매트릭스에 결합할 수 있도록 상기한 하나 이상의 특징을 변화시킨다. 다른 구현예에서, 상기한 특징을 측정하는 단계 및 가공 처리 단계는 서로 각각 분리될 수 있다. 이러한 분리는 시간적 분리일 수 있으며, 즉, 상기한 특징을 측정하는 단계와 하나 이상의 용출물 분획을 가공 처리하는 단계 사이에 갭 시간이 존재하며, 즉, 특징을 측정하고, 특정 시간이 경과한 이후에, 가공 처리된 분획에 함유된 대상 화합물이 적용시 크로마토그래피 매트릭스에 결합할 수 있도록 상기한 하나 이상의 특징을 변화시킨다. 전형적으로, 이러한 시간 갭은 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 5시간 이상, 10시간 이상, 24시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 7일 이상, 14일 이상, 1달 이상, 2달 이상, 6달 이상 또는 1년 이상이다. 대상 화합물 (즉, 생성물 생체분자)의 분해 및/또는 오염 가능성을 최소화할 수 있어, 2일을 초과하지 않는, 더 바람직하게는 24시간을 초과하지 않는, 예를 들어 10시간을 초과하지 않는, 예를 들어 5시간을 초과하지 않는, 예를 들어 2시간을 초과하지 않는, 더 바람직하게는 1시간을 초과하지 않는, 예를 들어 30분을 초과하지 않는 시간 갭과 같은, 짧은 시간 갭이 유익할 수 있다. 복수의 단백질 배치를 정제하여야 할 경우, 2일을 초과하는 시간 갭, 7일 이상, 14일 이상, 1달, 2달, 6달 또는 1년 이상의 시간 갭과 같이, 더 긴 시간 갭이 유익할 수 있으며; 전형적으로 이 경우, 용출물 분획 (즉, 제2 분획)은 분해 및/또는 오염 가능성을 최소화하기 위해 지연 기간 동안에 냉동한다.
하나 이상의 용출물 분획 (즉, 제2 분획)의 특징은 온라인, 라인 상에서 또는 오프라인에서 측정할 수 있다. 이러한 온라인 특징 측정은, 바람직하게는, 상기한 특징을 본 발명에 따른 공정에서, 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스의 유출구에 연결되거나 또는 하나 이상의 용출물 분획을 실시간으로 수집하는 용기 (들)에 또는 내에 배치된 검출기를 사용해 측정하는 것을 의미한다. 라인 상에서 특징을 측정하는 것은, 바람직하게는, 하나 이상의 용출물 분획이 수집되는 용기(들) 또는 크로마토그래피 매트릭스의 유출구로부터 취해진 샘플을 사용해 특징을 측정하는 것을 의미한다. 오프라인 특징 측정은, 바람직하게는, 하나 이상의 용출물 분획이 수집되는 용기(들) 또는 크로마토그래피 매트릭스의 유출구로부터 취해진 샘플을 사용해, 원거리로 배치된, 즉, 매트릭스와 별개의 룸 (room)에 배치된 검출기에서 지연 후 특징을 측정하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 분획의 특징은 온라인으로 또는 라인 상에서 측정하며, 더 바람직하게는 온라인으로 측정한다.
추가적인 공급원료
본 발명에서, 제2 분획은 공급원료로부터 추가적인 공급물 (즉, 대상 화합물을 포함하는 부가적인 혼합물)과 함께 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩된다. 추가적인 공급물은 제2 분획과 동시에 또는 이와 순차적으로 로딩된다. 추가적인 공급물은, 제조된 혼합물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하기 전에, 용기(들)에 수용된 제2 분획(들)에 로딩될 수 있다. 다른 예로, 추가적인 공급물은 용기로부터 제2 분획(들)을 로딩하기 전, 중 또는 후에 크로마토그래피 매트릭스에 로딩할 수 있다.
이에, 단계 (d)는 공급원료로부터 추가적인 공급물을 제2 분획과 동시에 또는 이와 순차적으로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것을 포함한다. 다시 말해, 전술한 제2 측면을 구체적으로 참조하여, 하나 이상의 용출물 분획은, 대상 화합물을 포함하는 혼합물과 함께 또는 적어도 이러한 혼합물의 일부와 함께 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩된다. 용출물 분획과 함께 크로마토그래피 매트릭스에 로딩되는 대상 화합물을 포함하는 혼합물은, 바람직하게는, 본 발명의 공정의 임의의 크로마토그래피 작동 사이클을 거치지 않은 것이다. 그러나, 이러한 혼합물이 임의의 다운-스트림 가공 처리 형태를 앞서 거치는 방식 역시 본 발명에 속한다.
본 발명에서, 단계 (d)는 공급원료로부터 추가적인 공급물을 제2 분획과 동시에 또는 이와 순차적으로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것을 포함한다. 제2 분획은, 바람직하게는, 공급물의 재-로딩 전 또는 재-로딩 중에 가공 처리된다. 다시 말해, 전술한 제2 측면을 구체적으로 참조하여, 본 발명에서, 용출물 분획은 대상 화합물을 포함하는 혼합물 전부 또는 일부와 함께 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되며, 바람직하게는, 대상 화합물을 포함하는 혼합물과 하나 이상의 용출물 분획의 조합물은, 대상 화합물을 포함하는 혼합물과 하나 이상의 용출물 분획으로 된 조합물에 함유된 대상 화합물이 재-로딩시 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록, 재-로딩 전 또는 재-로딩 중에 가공 처리된다.
공급원료로부터 추가적인 공급물과 제2 분획(들)의 조합물 (즉, 하나 이상의 용출물 분획과 대상 화합물을 포함하는 혼합물의 조합물)은 본원에서, 조합된 로드 (combined load)로서 언급된다. 조합된 로드의 가공 처리에 관해서는, 전술한 하나 이상의 용출물 분획의 가공 처리와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 동일하게 적용된다.
공급물
로딩
본 발명의 전술한 설명으로부터 자명한 바와 같이, 본 발명의 공정은 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 공급원료 (즉, 생성물 생체분자, 즉, 대상 화합물을 포함하는 혼합물)를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것을 포함한다.
본 발명에서, 전체 공급원료를 크로마토그래피 매트릭스에 하나의 부피로 로딩하는 것은, 배제되는 것은 아니지만, 필수적인 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 공급원료 전체를 하나의 부피로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 방식을 포함할 수 있다. 그러나, 더 바람직하게는, 공급원료 전체 부피 중 일부 (즉, 공급원료로부터 공급물)를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하여, 본 발명의 공정을 수행한다. 그런 후, 추가적인 공급물을 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 따라 크로마토그래피 매트릭스에 로딩할 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, 공정의 단계 (d)는 공급원료로부터 추가적인 공급물을 제2 분획과 동시에 또는 이와 순차적으로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것을 포함한다.
다시 말해, 전술한 제2 측면을 구체적으로 참조하면, 대상 화합물을 포함하는 혼합물의 제1 부피는, 바람직하게는, 제1 용기로부터, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스로, 제1 크로마토그래피 작동 사이클에서, 로딩된다. 이에, 이러한 구현예에서, 본 발명의 공정을 통과시킬, 대상 화합물을 포함하는 혼합물을 전부 제1 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에서, 공급원료는 원하는 로딩에 도달할 때까지 크로마토그래피 매트릭스에 로딩된다. 예를 들어, 공급원료는 바람직하게는 크로마토그래피 매트릭스의 정적 결합 용량 (static binding capacity)의 40 내지 100%, 50 또는 60% 내지 90%, 예를 들어 70 내지 80%에 도달할 때까지, 크로마토그래피 매트릭스에 로딩할 수 있다. 다시 말해, 대상 화합물을 포함하는 혼합물을 제1 용기로부터 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합되도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 경우, 전형적으로 크로마토그래피 매트릭스의 정적 결합 용량의 40 내지 100%, 50 내지 100%, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 80 내지 100%, 90 내지 100%, 70 내지 90% 또는 70 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 80%에 도달할 때까지, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 로딩한다. 공급원료를, 매트릭스의 정적 결합 용량의 100% 미만의 로딩으로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것이, 때때로, 예를 들어, 타겟 생체분자와 불순물의 분리를 강화하는 것이 바람직한 경우에, 유리할 수 있다.
통과 분획
당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 생성물 생체분자를 포함하는 공급원료를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 경우, 공급물 내 생성물 생체분자의 총량 또는 그 일부를 크로마토그래피 매트릭스에 결합시킬 수 있다. 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않는 과잉의 생성물 생체분자 (대상 화합물)는 매트릭스에 포획되지 않은 채 남아있으며, 통과 분획으로서 크로마토그래피 매트릭스로부터 수집할 수 있다. 이는, 매트릭스의 정적 결합 용량을 초과하는 과잉의 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩할 경우에, 발생할 수 있다.
통과 분획은, 존재한다면, 일부 경우에, 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 고 농도로 포함할 수 있으며, 따라서 정제하기 위해 유용하게 회수할 수 있다. 공급원료로부터 과잉의 공급물을 매트릭스의 정적 결합 용량을 초과하도록 크로마토그래피 매트릭스에 첨가하는 경우, 예를 들어, 매트릭스의 정적 결합 용량이 10% 이상, 예를 들어 20% 이상, 예를 들어 50% 이상 초과하는 경우, 예를 들어, 매트릭스의 정적 결합 용량이 적어도 100% 또는 그 이상을 초과할 수 있는 경우에, 통과 분획이 생길 수 있다. 과잉의 로드는 본 발명의 방법에서 의도적으로, 예를 들어, 정제 속도를 최대화하기 위해 이용할 수 있다. 따라서, 청구된 공정의 단계 (a)는, 크로마토그래피 매트릭스의 동적 결합 용량 (dynamic binding capacity)을 초과하도록, 공급원료로부터 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하고, 비-결합된 생성물 생체분자를 함유한 통과 분획을 수집하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 수집한 통과 분획은, 예를 들어, 용출물 제2 분획 및/또는 공정의 단계 (d)에서 공급원료부터의 추가적인 공급물과 함께, 또는 공정의 추가적인 사이클에서, 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩할 수 있다.
통과 분획의 높은 잠재적인 가치는, 대상 화합물 (생성물 생체분자)을 수집하기 위한 회수 및 정제가 바람직하다는 것을 의미한다.
이에, 본 발명의 청구된 공정의 단계 (a)는, 바람직하게는, 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않는 비-결합 생성물 생체분자를 함유한 통과 분획을 수집하는 것을 더 포함하며; 단계 (d)는, 바람직하게는, 통과 분획을 제2 분획(들) 및/또는 추가적인 공급물과 동시에 또는 이와 순차적으로 로딩하는 것을 더 포함한다. 단계 (d)는 통과 분획 전부 또는 일부만 로딩하는 것을 포함할 수 있다. 통과 분획 중 일부만 단계 (d)에서 로딩하는 경우, 나머지 통과 분획은 바람직하게는 보유한 다음, 예를 들어 공급원료로부터 추가적인 공급물과 함께 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한다. 통과 분획은 바람직하게는 후술한 홀드 시간 동안 하나 이상의 용기(들)에 수용된다. 용기(들)는 제2 분획(들)을 수용하기 위해 사용되는 용기(들)와 동일할 수 있다. 다른 예로, 통과 분획을 수용하기 위해 사용되는 용기(들)는 제2 분획(들)을 수용하기 위해 사용되는 용기(들)와 별개일 수 있다. 통과 분획은, 바람직하게는, 크로마토그래피 매트릭스에 생성물 생체분자의 결합을 촉진하도록 가공 처리될 수 있다. 제2 분획(들)에 대해 전술한 임의의 가공 처리 단계 등의 임의의 적절한 가공 처리 단계를 이용할 수 있다.
통과 분획은 제2 분획(들)과 동시에 또는 이와 순차적으로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩될 수 있지만, 다른 예로, 통과 분획은 제2 분획(들)과 별개로 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩할 수 있다. 예를 들어, 통과 분획은 (즉, 공정의 단계 (a)에서) 공급원료로부터 추가적인 공급물과 동시에 또는 이와 순차적으로 크로마토그래피 매트릭스에 로딩할 수 있다.
통과 분획을, 공정의 단계 (d) 또는 단계 (a)에서 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하는 경우, 바람직하게는 크로마토그래피 매트릭스의 정적 결합 용량의 40 내지 100%, 예를 들어 50% 또는 60% 내지 90%, 예를 들어 70% 내지 80%에 도달할 때까지, 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한다. 이는, 생성물 생체분자가 매트릭스에 결합되지 않은 채 반복적으로 크로마토그래피 매트릭스를 통과하여 흐를 가능성을 낮춘다.
이에, 전술한 제2 측면을 구체적으로 참조하여, 이러한 공정은, 바람직하게는, 대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키는 단계 및 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계에 앞서,
ab)
비-결합된 대상 화합물을 함유한 통과 분획을 제2 용기에 수집하는 단계, 및
ac)
추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에, 통과 분획을 제2 용기로부터 재-로딩하는 단계를 수반한다.
이러한 공정은, 또한, 바람직하게는, 대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키는 단계 및 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계에 앞서,
ab)
비-결합된 대상 화합물을 함유한 통과 분획을 제2 용기에 수집하는 단계, 및
ac)
통과 분획을 제2 용기로부터 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하고, 부가적으로 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서, 프레쉬 로드 혼합물 (fresh load mixture)을 로딩하는 단계를 포함할 수 있다.
프레쉬 로드 혼합물은 공급원료로부터 나온 제2 부피의 공급물일 수 있다. 이에, 본 방법은, 바람직하게는, 통과 분획을 제2 용기로부터 재-로딩하는 단계 및 대상 단백질이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서 제2 부피의 대상 화합물을 제1 용기로부터 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계를 포함한다. 본 발명에서, 제2 부피의 대상 화합물은 대상 화합물을 포함하는 제2 부피의 혼합물이다.
바람직하게는, 통과 분획을 제2 용기로부터 재-로딩하는 단계에서, 크로마토그래피 매트릭스의 정적 결합 용량의 40 내지 100%, 50 내지 100%, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 80 내지 100%, 90 내지 100%, 70 내지 90% 또는 70 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 80%에 도달할 때까지, 크로마토그래피 매트릭스를 작동시킨다. 바람직하게는, 크로마토그래피 매트릭스의 정적 결합 용량의 40 내지 100%, 예를 들어 50% 또는 60% 내지 90%, 예를 들어 70% 내지 80%에 도달할 수 있다.
바람직하게는, 전술한 제2 측면의 공정을 구체적으로 참조하여, 제2 용기에 수집되는 통과 분획 및 하나 이상의 용출물 분획은 크로마토그래피 작동 사이클에서 각각 분리하여 재-로딩한다. 본 발명에서, 통과 분획의 일부만, 즉, 통과 분획 전체 부피 중 일부 및/또는 하나 이상의 용출물 분획 중 일부만, 즉, 하나 이상의 용출물 분획의 전체 부피 중 일부만, 크로마토그래피 작동 사이클에서, 각각 분리하여 재-로딩한다. 바람직하게는, 제2 용기에서 수집되는 통과 분획 및 하나 이상의 분획은, 동일한 크로마토그래피 작동 사이클에서, 바람직하게는 제1 크로마토그래피 작동 사이클 직후의 크로마토그래피 사이클에서 각각 분리하여 재-로딩한다.
다른 구현예에서, 제2 용기에 수집된 통과 분획과 하나 이상의 분획은, 바람직하게는, 서로 다른 크로마토그래피 작동 사이클에서, 분리하여 재-로딩된다. 본 발명에서, 하나 이상의 용출물 분획을 제2 용기에 수집된 통과 분획에 앞서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩한다. 그러나, 본 발명은, 제2 용기에 수집된 통과 분획을 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하는 것도 포함한다.
다른 구현예에서, 통과 분획 및 하나 이상의 용출물 분획을 합친 다음, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 조합물로서 재-로딩할 수 있다. 본 발명에서, 이러한 조합물은 하나 이상의 용출물 분획의 가공 처리와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 가공 처리된다.
이에, 본 발명의 제2 측면에서, 대상 화합물을 포함하는 제1 부피의 혼합물은, 바람직하게는 제1 크로마토그래피 작동 사이클에서, 제1 용기로부터, 크로마토그래피 매트릭스의 동적 결합 용량을 초과하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스로 로딩될 수 있으며, 공정은, 대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키는 단계 및 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계에 앞서,
ab)
비-결합된 대상 화합물을 함유한 통과 분획을 제2 용기에 수집하는 단계; 및
ac)
추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서, 제2 용기로부터 통과 분획을 재-로딩하고, 제2 부피의 대상 화합물을 제1 용기로부터 크로마토그래피 매트릭스의 동적 결합 용량을 초과하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스로 로딩하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 제1 크로마토그래피 작동 사이클에서, 대상 화합물을 포함하는 제1 부피의 혼합물을, 제1 용기로부터, 크로마토그래피 매트릭스의 동적 결합 용량을 초과하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스로 로딩하는 단계에서, 대상 단백질의 로딩은, 최대 정적 결합 용량의 적어도 40% 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에 도달하면, 중단된다.
바람직하게는, 본 발명의 공정에서, 통과 분획의 수집은 통과 분획 내 생성물 생체분자 (대상 단백질)의 지정된 제1 농도에서 개시하고, 통과 분획 내 생성물 생체분자 (대상 단백질)의 지정된 제2 농도에서 중단한다. 통과 분획 내 생성물 생체분자 (대상 단백질)의 수집은, 바람직하게는, 통과 분획 내 대상 단백질 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml 또는 0.2 mg/ml의 농도에서 개시하고, 통과 분획내 대상 단백질 0.6 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml 또는 5 mg/ml의 농도에서 중단한다. 바람직하게는, 통과 분획의 지정된 비율 (predetermined fraction), 예를 들어 통과 분획의 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5%를 제2 용기에서 수집한다.
바람직하게는, 일 구현예에서, (예, 제2 용기에서) 수집되는 통과 분획은, 크로마토그래피 매트릭스에, 예를 들어, 추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서, 재-로딩되기 전 또는 재-로딩되는 중에, 가공 처리되지 않는다. 바람직하게는, (예, 제2 용기에서) 수집되는 통과 분획은, 크로마토그래피 사이클 완료 후, 다음번 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스에 바로 재-로딩된다. 바람직하게는, 다른 구현예에서, (예, 제2 용기에서) 수집되는 통과 분획은, 예를 들어 추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되기 전 또는 재-로딩되는 동안에 가공 처리된다. 가공 처리는, 예를 들어, 스터링 또는 교반, 희석 (예, 물 또는 완충제 내), 농도 조정 (예, 진공 여과 어셈블리 사용), pH 조정, 전도성 조정, 완충제 또는 용매 교환, 냉각 또는 가열, 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 가공 처리는 제2 분획에서 전술한 바와 같을 수 있다.
바람직하게는, (예, 제2 용기에서) 수집되는, 복수의 별개의 크로마토그래피 작동 사이클 (즉, 본 발명의 공정의 수개의 사이클)로부터 나온 통과 분획들은, 풀로서 합쳐지며, 다른 사이클에서 동일한 크로마토그래피 매트릭스로 재-로딩된다. 크로마토그래피 작동 사이클 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 10회 이상에서 유래되는 통과 분획들 (예, 하나의 제2 용기에서, 또는 제2, 제3, 제4 또는 추가의 용기에서)을 수집하고, 예를 들어, 추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스로 재-로딩할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 공정의 일 구현예에서, 수집된 통과 분획은, 제1 용기로부터 대상 단백질을 함유한 혼합물의 새로운 배치를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하기 전에, 후속적인 크로마토그래피 작동 사이클에서 (예, 제2 용기로부터) 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩된다. 제1 용기로부터 유래된 대상 화합물, 바람직하게는 대상 단백질을 함유한 혼합물에 앞서, 후속적인 크로마토그래피 사이클에서의 통과 분획의 재-로딩은, 단 2번의 사이클에서 포획되게 하는 빈 컬럼에 의해, 재순환된 대상 화합물, 바람직하게는 대상 단백질의 완전한 결합을 허용한다. 다른 예로, 다른 구현예에서, 수집된 통과 분획은, 바람직하게는, 대상 화합물, 바람직하게는 대상 단백질을 함유한 혼합물의 새로운 배치를 제1 용기로부터 크로마토그래피 매트릭스에 로딩한 후 또는 이의 로딩과 함께, 후속적으로 크로마토그래피 작동 사이클에서 크로마토그래피 매트릭스로 재-로딩한다. 다시 말해, 통과 분획은 공급원료로부터의 추가적인 공급물과 분리하여 또는 공급원료로부터의 추가적인 공급물과 함께 크로마토그래피 매트릭스에 로딩할 수 있다.
바람직하게는, 제2 용기에 수집된 통과 분획은 적어도 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 1일, 2일, 7일, 14일, 1달 2달, 6달 또는 1년 동안 보관된다. 짧은 보관 기간 (홀드 시간), 예를 들어 2일을 초과하지 않는, 더 바람직하게는 24시간을 초과하지 않는, 예를 들어 10시간을 초과하지 않는, 예를 들어 5시간을 초과하지 않는, 예를 들어 2시간을 초과하지 않는, 더 바람직하게는 1시간을 초과하지 않는, 예를 들어 30분을 초과하지 않는 홀드 시간이, 통과 분획 내 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물)의 분해 및/또는 오염 가능성을 최소화하는데 유익할 수 있다. 만일, 통과 분획의 복수의 배치를 정제하여야 한다면, 더 긴 홀드 시간, 예를 들어, 2일을 초과하는 홀드 시간, 7일 이상, 14일 이상, 1달, 2달, 6달 또는 1년 이상의 홀드 시간이 유익할 수 있으며; 전형적으로 이 경우, 통과 분획은 분해 및/또는 오염 가능성을 최소화하기 위해 홀드 시간 동안 냉동한다.
공급원료
본원에 기술된 바와 같이, 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물)를 포함하는 혼합물은 또한 공급원료라고도 한다. 본 발명의 공정에서 공급물은 공급원료로부터 크로마토그래피 매트릭스로 로딩된다.
바람직하게는, 일 구현예에서, 공급원료 (혼합물)는 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물, 바람직하게는 대상 단백질); 및 원핵생물, 예를 들어 박테리아, 숙주 세포 오염물, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 핵산 또는 지질을 포함한다. 바람직하게는, 다른 구현예에서, 공급원료 (혼합물)는 생성물 생체분자 (대상 화합물, 바람직하게는 대상 단백질), 및 진핵생물, 예를 들어, 포유류, 숙주 세포 오염물, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 핵산 또는 지질을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에서, 공급원료 (즉, 대상 화합물을 포함하는 혼합물)는 적어도 20 L, 예컨대 적어도 50 L, 예로 적어도 60 L, 예컨대 적어도 80 L, 더 바람직하게는 적어도 100 L, 예를 들어 적어도 500 L, 예컨대 적어도 1000 L 또는 그 이상, 예컨대 적어도 5000L, 예로 적어도 10000 L, 예컨대 최대 적어도 50,000L, 100,000L 또는 그 이상의 부피를 가진다. 혼합물/공급원료는, 따라서, 바람직하게는, 1,000 L 보다 큰 부피, 예컨대 1000 L 내지 50,000 L 또는 100,000 L, 바람직하게는 5,000 L 내지 20,000 L, 예컨대 약 10,000 L를 가질 수 있다. 2 L 내지 100 L, 예컨대 20 L 내지 50 L와 같은 더 작은 부피도 사용할 수 있다.
바람직하게는, 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물)는 단백질, 항체, 항체 단편, 핵산 분자 (즉, 폴리뉴클레오티드), 폴리펩타이드 및 소형 분자를 포함하는 군으로부터 선택되며, 예를 들어, 대상 화합물 (즉, 생성물 생체분자)은 바람직하게는 단백질, 항체, 항체 단편, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물)는 단백질, 항체, 항체 단편, 핵산 분자 및 소형 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물)는 단백질이다. 바람직하게는, 생성물 생체분자 (즉, 대상 화합물)는 항체 또는 항체 단편이다.
크로마토그래피 매트릭스
수많은 크로마토그래피 기법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 적합하다.
현재 공업적인 항체 정제 플랫폼 거의 대부분이 단백질 A를 이용한다. 단백질 A는 포유류 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 박테리아 스타필로코커스 아우레우스 (staphylococcus aureus)의 세포벽에서 발견한 세포 표면 단백질이다. 단백질 A는 인간 IgG1 및 IgG2에 대해 고 친화성을 가지며, 인간 IgM, IgA 및 IgE 항체에 대해 보통 수준의 친화성을 가지고 있다. 따라서, 단백질 A 정제는 Fc 영역이 없는 항체 단편에는 그다지 적합하지 않다. 그러나, 단백질 A 크로마토그래피는 일부 항체 (특히 Fc 영역을 가진 항체)에 매우 적합하며, 본 발명의 방법에 이용가능하다. 친화성 크로마토그래피는 대상 단백질 (또는 단백질 군)과 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 특이적인 리간드 간의 가역적인 상호작용에 기반하여 단백질을 분리한다. 대상 단백질과 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된 리간드 간의 상호작용은 정전기적 또는 소수성 상호작용, 반데르 발스 힘 및/또는 수소 결합의 결과일 수 있다. 친화성 매질로부터 타겟 분자를 용출시키기 위해, 경쟁적인 리간드를 사용해 특이적으로 또는 pH, 이온 세기 또는 극성을 변화시켜 비-특이적으로 상호작용을 역전시킬 수 있다. 친화성 정제에는 크로마토그래피 매트릭스에 공유적으로 부착될 수 있는 리간드가 필요하다. 커플링된 리간드는 타겟 분자에 대한 특이적인 결합 친화성을 가져야 하며, 비-결합된 물질을 세척 제거한 후, 타겟 분자를 활성 형태에서 제거할 수 있도록 리간드와 타겟 분자간의 결합은 가역적이어야 한다. 일반적인 사용에도 불구하고, 친화성 크로마토그래피는 특히 치료학적 단백질을 정제하는데 필요한 공업적인 규모로는 비용이 많이 든다. 본 발명의 방법은 친화성 크로마토그래피와 혼용가능하며, 이는 공정의 효율을 최대화하기 위해, 고 비용을 수반하는 적어도 일부의 문제를 해결한다.
이온 교환 크로마토그래피를 사용해 이온화가능한 분자를 정제할 수 있다. 이온화된 분자는 하전된 기와 고상 지지체 매트릭스에 부착된 반대로 하전된 분자의 비-특이적인 정전기적 상호작용을 이용하여, 고상과 더 강하게 상호작용하는 이온화된 분자를 지연시킴으로써, 분리한다. 각 타입의 이온화된 분자의 순 전하, 및 이의 매트릭스에 대한 친화성은 하전된 기의 개수, 각각의 기의 전하 및 하전된 고상 매트릭스와의 상호작용을 경쟁하는 분자의 특성에 따라 달라진다. 이러한 차이가 다양한 분자 타입들을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리한다. 고상에 결합된 분자들의 용출은 일반적으로 이온 교환 매트릭스의 하전된 부분과 용질과 경쟁하도록 완충제의 이온 세기 (즉, 전도성)를 높임으로써 달성된다. pH 변형, 따라서 용질의 전하 변형은 용질의 용출을 달성하기 위한 다른 방식이다. 전도성 또는 pH 변형은 점진적 (농도 구배 용출) 또는 단계적 (단계 용출)일 수 있다. 일반적인 2가지 타입의 상호작용들이 공지되어 있다: 음으로 하전된 아미노산 측쇄 (예, 아스파르트산 및 글루탐산)에 의해 매개되며 양으로 하전된 표면과 상호작용하는 음이온 교환 크로마토그래피, 및 양으로 하전된 아미노산 잔기 (예, 라이신 및 아르기닌)에 의해 매개되며 음으로 하전된 표면과 상호작용하는 양이온 교환 크로마토그래피. 음이온 교환은 약 또는 강으로 분류할 수 있다. 약한 음이온 교환제의 하전된 기 (charge group)는 약 염기로서, 이는 탈-프로톤화되므로, 높은 pH에서 전하를 상실한다. 다이에틸아미노에틸 (DEAE)-셀룰로스가 약한 음이온 교환제의 일 예로서, 아미노기는 pH~9 미만에서 양으로 하전되고, 더 높은 pH에서는 점차적으로 전하를 상실한다. DEAE 또는 다이에틸-(2-하이드록시-프로필)아미노에틸 (QAE)는 예를 들어 반대 이온으로서 클로라이드를 포함한다.
용출 완충제의 이온 세기 증가에 의한 용출 (용출 크로마토그래피)에 대한 다른 예는, 결합된 단백질과 비교해 정지상 (stationary phase)에 대한 동적 친화성이 더 높은 분자를 이용한 용출이다. 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 이러한 방식을 치환 크로마토그래피라고 한다. 치환 크로마토그래피는, 기본적으로, 용질이 이동상 변형제에 흡착되지 않고 이동 속도 차이에 의해 분리한다는 점에서, 임의의 다른 방식의 크로마토그래피와 차별된다. 치환시, 분자는 공급 스트림으로부터 유래된 임의의 구성성분에 비해 정지상에 대해 친화성이 더 높은 치환제 분자의 전진성 쇼크 파 (advancing shock wave)에 의해 크로마토그래피 컬럼으로부터 아래로 이동하도록 강제된다. 이러한 강제된 이동은, 컬럼에 치환제 용질의 일정한 주입 후, 높은 체류성으로 인해, 다른 작동 방식과 비교해 산물의 농도 및 순도를 더 강화한다.
당해 기술 분야에 공지된 이들 및 기타 크로마토그래피 기법들은 본 발명의 방법에서 적용가능하다. 전술한 내용에서 자명한 바와 같이, 본 발명의 공정은 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 생성물 생체분자 (대상 단백질)를 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계가 필요하다. 이러한 유형의 크로마토그래피 방식은 결합 및 용출 방식으로 알려져 있다. 이러한 크로마토그래피는 WO 2014/158231에 기술된 방법과 같은 통과 방식 (flow-through mode)과는 다르다.
바람직하게는, 본 공정은 크로마토그래피 단계를 2 이상 포함하며, 크로마토그래피 단계 2개, 3개, 4개 또는 모두, 비-결합된 대상 단백질을 (예, 크로마토그래피 매트릭스로 로딩되는 용기 이외의 용기에서) 수집하고, 통과 분획을 후기 크로마토그래피 작동 사이클에서 (예, 상기한 용기로부터) 동일한 크로마토그래피에 재-로딩하도록, 작동될 수 있다. 바람직하게는, 공정은 크로마토그래피 단계를 하나, 2, 3, 4 또는 그 이상으로 포함하며, 바람직하게는 크로마토그래피 단계 1, 2, 3, 4 또는 전체가 크로마토그래피 컬럼 상에서 수행된다. 바람직하게는, 공정은, 3가지 크로마토그래피 단계가 순차적인 단백질 A 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피인, 3개의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 본 발명의 공정의 일 구현예에서, 단백질 A의 용출물은, 결합 및 용출 방식으로 작동되는 양이온 교환 크로마토그래피를 거치고, 이때 대상 단백질을 함유한 용출물이 회수되며, 용출물은 음이온 교환 크로마토그래피를 거쳐 대상 단백질을 함유한 통과 분획을 수득한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 따른 공정이, 예를 들어 정용여과와 같은 다른 단계를 3개의 크로마토그래피 단계들 사이에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록시아파티트 크로마토그래피와 같은 혼성 방식의 크로마토그래피, 키랄 크로마토그래피 또는 유전성 크로마토그래피 (dielectric chromatography matrix)로부터 선택된다:
- 이온 교환 크로마토그래피 매트릭스;
- 소수성 상호작용 크로마토그래피 매트릭스;
- 친화성 크로마토그래피 매트릭스;
- 혼성-방식의 크로마토그래피 매트릭스;
- 키랄 크로마토그래피 매트릭스; 및
- 유전성 크로마토그래피 매트릭스.
바람직하게는, 크로마토그래피 1 단계, 2 단계, 3단계, 4단계, 또는 전체 단계에서 크로마토그래피 매트릭스/매트릭스들은 크로마토그래피 컬럼(들)이다. 다시 말해, 바람직하게는, 본 발명의 공정에서, 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 컬럼 내에 위치한다.
바람직하게는, 크로마토그래피 매트릭스는 1 L 이상, 예를 들어, 4 L 이상, 예로 5 L 이상, 더 바람직하게는 10 L 이상, 예로, 20 L 이상, 예를 들어, 30 L 이상, 바람직하게는 50 L 초과, 전형적으로 75 L 초과, 더 바람직하게는 100 L 이상 또는 200 L 이상, 예를 들어, 바람직하게는 20 L 내지 200 L, 예를 들어, 30 L 내지 100 L, 예를 들어 50 L - 100 L의 베드 부피 (bed volume)를 가진다. 다시 말해, 바람직하게는, 하나 이상의 크로마토그래피 매트릭스는 1 L 초과, 20 L 초과, 30 L 초과, 50 L 초과, 75 L 초과, 100 L 초과, 200 L 초과, 바람직하게는 20 L - 200 L, 30 L - 100 L 또는 50 L - 100 L의 베드 부피를 가진 크로마토그래피 컬럼이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 단계 (b)에서, 용출물의 부피는 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피와 적어도 동일하다. 더 바람직하게는, 용출물의 부피는 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 2배 이상, 예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 5배 이상, 예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 10배 이상, 예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 15배 이상, 예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 20배 이상이다. 바람직하게는, 용출물의 부피는 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 2배 내지 20배이다.
다른 구현예들에서, 바람직하게는, 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 멤브레인 또는 모노리스 흡착제 (monolith adsorber)이다.
바람직하게는, 크로마토그래피 1단계, 2단계, 3단계, 4단계 또는 전체 단계가 멤브레인 또는 모노리스 흡착제 상에서 수행된다.
바람직하게는, 크로마토그래피 1단계, 2단계, 3단계, 4단계 또는 전체 단계는 하나의 크로마토그래피 컬럼, 멤브레인 흡착제 또는 모노리스 흡착제 상에서 수행된다.
본 발명에서, 전형적으로 통상적인 크로마토그래피 기법에서 사용되는 유속 보다 더 빠른 유속을 적용할 수 있다. 부분적으로, 타겟 생성물 생체분자 (대상 화합물)와 불순물 간의 분리 감소는, 추가적인 정제를 위해 제2 분획을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩함으로써 보완되므로, 가능할 수 있다. 이에, 본 발명의 공정은, 바람직하게는, 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 크로마토그래피 매트릭스로부터 적어도 0.05 내지 0.5 크로마토그래피 매트릭스 부피/분의 유속으로, 예를 들어, 적어도 약 0.1 내지 약 0.4 크로마토그래피 매트릭스 부피/분, 예를 들어, 적어도 약 0.2 내지 약 0.3 크로마토그래피 매트릭스 부피/분의 유속으로 용출시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 공정은, 바람직하게는, 생성물 생체분자 (대상 화합물)를 크로마토그래피 매트릭스로부터 약 60 내지 약 900 cm/h (cm은 크로마토그래피 매트릭스의 베드 높이이며, 전형적으로 약 20 cm 내지 약 30 cm, 바람직하게는 약 20 cm임; h = 시간), 예를 들어, 약 120 내지 약 720 cm/h, 예컨대 약 240 내지 약 540 cm/h, 예컨대 약 300 내지 약 450 cm/h의 유속으로 용출시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 내용으로부터 자명한 바와 같이, 본 발명의 공정의 이점은, 공정의 길이가 크로마토그래피 매트릭스의 부피로 한정되지 않는다는 것이다. 다시 말해, 제2 분획을 재-로딩하기 전에 수집하여, 크로마토그래피 매트릭스의 부피를 초과하는 부피의 공급원료를 본 발명의 방법에 따라 가공 처리할 수 있다. 이에, 본 발명의 공정에서, 공정의 길이는, 바람직하게는 크로마토그래피 매트릭스의 부피 보다 더 길다. 이는, 제2 분획 (들) (즉, 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 용출물 분획)을 보관하기 위해 용기를 사용함으로써 유리하게 달성된다.
임의의 적합한 용기를, 예를 들어, 제2 분획(들) 및/또는 통과 분획을 보관하기 위해 사용할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 제2 용기가 크로마토그래피 장치와 연결될 수 있거나 (in line with) 또는 외장 용기일 수 있다. 적절한 밸브 등이 필요에 따라 분획을 용기로 인가시킬 것이다.
추가적인 공정 단계들
바람직하게는, 본 발명의 공정의 복수의 사이클로부터 수득되는 제1 분획들은 조합 또는 풀로서 합칠 수 있다. 이에, 본 발명의 공정은 바람직하게는 각각의 제1 분획을 합치는 것을 포함한다.
본 발명의 공정은, 바람직하게는, 제1 분획 (타겟 생체분자, 즉 대상 화합물을 포함하는 용출물 분획)의 정용여과 및/또는 농축을 포함할 수 있다. 제1 분획은, 바람직하게는, 선택적인 정용여과 후, 치료학적 목적으로 적합한 바람직한 최종 농도로 농축한다.
본 발명의 공정은, 바람직하게는 정제된 생성물 생체분자의 나노여과를 포함할 수 있다. 나노여과는 임의의 적절한 장치를 사용해 수행할 수 있다. 전형적으로, 나노여과는 포어 크기가 약 1 nm 내지 약 10 nm인 폴리머 (예, 폴리에틸렌 테레프탈레이트) 또는 금속 (예, 알루미늄) 멤브레인을 사용해 수행한다.
본 발명의 공정은, 바람직하게는, 정제된 생성물 생체분자를 추가적인 크로마토그래피 정제에 투입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본원에 기술된 임의의 크로마토그래피 공정과 같은 임의의 적합한 크로마토그래피 정제를 사용할 수 있다.
본 발명의 공정은, 바람직하게는, 정제된 생성물 생체분자를 화학적으로 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 임의의 적절한 화학적 변형을 가할 수 있다. 예를 들어, 환원 및/또는 페길화에 의해 생성물 생체분자를 변형시킬 수 있다. 생성물 생체분자는 방사핵종, 약물, 독소, 폴리머 (예, PEG), 금속 킬레이트, 형광단, 팝텐 등으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 이를 부착시켜 변형시킬 수 있다. 부착은, EDC/NHS 커플링과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 또는 단백질의 반응성 티올 기들 간의 다이설파이드 형성을 통해 달성할 수 있다. 환원은 화학적 환원제를 사용해 달성할 수 있다.
본 발명의 공정은, 바람직하게는, 타겟 생체분자 / 대상 화합물을 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 보강제와 함께 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이에, 본 발명은, 또한, 본 발명의 임의 구현예를 비롯한 본 발명의 공정을 포함하는, 대상 화합물 타겟 생체분자가 단백질인, 대상 단백질의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에 의해 수득가능한 항체 또는 항체 단편과 같은 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 공정에 의해 수득가능한 타겟 생체분자 또는 대상 화합물을 제공한다.
정의
본원에서, 용어 "음이온 교환 크로마토그래피"는, 고상이 양으로 하전된, 예를 들어, 4급 아미노기가 부착된 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 가진, 크로마토그래피를 의미한다. 상업적으로 이용가능한 음이온 교환 매트릭스로는 DEAE 셀룰로스, QAE SEPHADEXTM, FAST Q SEPHAROSETM Capto Q 및 Capto Q Impres (GE Healthcare), Unosphere 및 Nuvia Q (BioRad), GigaCap Q (Tosoh), Mustang Q XT (Pall), Fractogel Q 및 Eshmuno Q (Merck Millipore) 및 음이온 교환 멤브레인 흡착제, 예를 들어 SartoBind Q (Sartorius), 및 모노리스 흡착제, 예를 들어 QA monoliths (Bia Separations) 등이 있다.
본원에서, 용어 "항체" 또는 "항체들"은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 단일클론 또는 다클론 테트라머 전장 항체를 지칭한다. 2개의 중쇄와 2개의 경쇄는 동일하거나, 또는 예를 들어, Biclonics® 또는 DuoBody®와 같은 이중 특이성 항체와 같이 상이할 수 있다. 용어 면역글로불린 또는 면역글로불린들은 "항체" 또는 "항체들"과 각각 동의어로 사용된다. 본원에서, 용어 "항체" 또는 "항체들"로는 당해 기술 분야에 공지된 재조합 기법에 의해 제조되는 재조합 항체 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. "항체" 또는 "항체들"은 인간, 인간을 제외한 영장류 (예, 침팬지, 개코원숭이, 레수스 또는 시노몰구스 원숭이와 같은 인간), 설치류 (예, 마우스, 랫, 토끼 또는 기니아피그), 염소, 소 또는 말 종과 같은 포유류 등의 임의 기원일 수 있다. 본원에서 항체는 대상 "항원"에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩타이드이며, 질환 또는 장애를 앓고 있는 포유류에 항체를 투여하면 그 포유류에서 치료학적인 이점을 발휘할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩타이드 항원에 대한 항체 역시 고려된다. 항원이 폴리펩타이드일 경우, 이는 막관통 분자 (예, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어, 성장 인자 또는 사이토카인일 수 있다. 본 발명에 포함되는 항체에 대한 바람직한 분자 타겟으로는 CD 폴리펩타이드, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD38, CD40 및 CD40-L; FcRN; OX40; EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체와 같은 HER 수용체 패밀리의 구성원; 세포 유착 분자, 예를 들어, LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 av/b3 인테그린, 예로 이의 α 또는 β 서브유닛 (예, anti-CD11a, anti-CD18 또는 anti-CD11b 항체); 케모카인 및 사이토카인 또는 이의 수용체, 예를 들어, IL-1 α 및 β, IL-2, IL-6, IL-6 수용체, IL-12, IL-13, IL-17A 및/또는 IL-17F, IL-18, IL-21, IL-23, TNFα 및 TNFβ; 성장인자, 예를 들어, VEGF; IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 폴리펩타이드 C; PD1, PD-L1, PCSK9; 스클레로스틴 (sclerostin) 등이 있다.
본원에서, 용어 "항체 단편" 또는 "항체 단편들"은 항원의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합부 또는 가변부를 의미한다. 항체 단편의 예로는 Fc 영역이 결핍 또는 없는 모든 항체를 포함한다. 항체 단편의 예로는, 또한, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 및 scFv 단편; 뿐만 아니라 BiTEs® (이중 특이성의 T 세포 결합제 (Engagers)) 및 DARTs™ (듀얼 친화성 재-타겟팅 기술)과 같은 포맷을 비롯한 다이아바디, 트라이바디, 테트라바디, 미니바디, 도메인 항체 (dAb), 예로, sdAb, VHH 및 VNAR 단편, 단쇄 항체, 항체 단편들 또는 항체로부터 제조된 이중 특이성, 3중 특이성, 4중 특이성 또는 다중 특이성의 항체, 비-제한적인 예로, Fab-Fv, Fab-scFv, Fab(Fv)2 또는 Fab-(scFv)2 구조체 등이 있다. 전술한 항체 단편 및 유도체는 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (Kontermann 2012). 명확하게 하기 위해, Fab-Fv는 Fv 영역 하나와 Fab 영역 하나가 임의 순서로 연결된, 즉 한 영역의 마지막 아미노산이 다음 영역의 제1 아미노산 다음에 오거나 또는 그 반대인, Fab-Fv 또는 Fv-Fab로 연결된 구조체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, Fab-scFv는 하나의 scFv 영역과 하나의 Fab 영역이 임의 순서로 연결된 것을 포함하는 구조체, Fab의 경우, 한 영역의 마지막 아미노산이 다음 영역의 제1 아미노산 다음에 오거나 또는 그 반대인, 폴리펩타이드 체인, 즉 Fab-scFv 또는 scFv-Fab 구조체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 동일한 방식으로, Fab-(Fv)2는 2개의 Fv 영역과 하나의 Fab 영역이 임의 순서로 연결된 구조체, 즉, 한 영역의 마지막 아미노산이 다음 영역의 제1 아미노산 다음에 오거나 또는 그 반대인 Fab-Fv-Fv, Fv-Fab-Fv 또는 Fv-Fv-Fab를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, Fab-(scFv)2는 2개의 scFv 영역과 하나의 Fab 영역이 임의 순서로 연결된 것을 포함하는 구조에, Fab의 경우, 20종의 가능한 순열을 만드는 폴리펩타이드 체인을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 전형적으로, 이들 구조체는 제1 영역 (예, Fab)과 제2 영역 (예, Fv) 사이에 펩타이드 링커를 포함한다. 이러한 링커는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 전형적으로 길이 및 조성 최적화된 하나 이상의 아미노산 서열일 수 있다. 다른 예로, 이러한 영역들은 직접, 즉 펩타이드 링커없이 연결될 수 있다. 가변성 도메인을 Fab 또는 Fab'와 연결하는데 적절한 링커 영역의 예들은 본원에 원용에 의해 포함되는 WO 2013/068571에 기술되어 있으며, 비-배타적으로, 유연한 링커 서열과 뻣뻣한 링커 서열을 포함한다. 항체 단편은 비-당화되거나 또는 당화될 수 있다. 용어 "항체 단편" 또는 "항체 단편들"은 또한 다른 항체 도메인, 다른 단백질 또는 비-단백질 분자와 공유 결합된 하나 이상의 항원 결합성 또는 fc 수용체 결합성 항체 도메인을 포함하는, 항체 유도체를 지칭한다.
본원에서, 용어 "핵산 분자"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산을 지칭한다. 핵산 분자는 플라스미드, mRNA, 프라이머 및 프로브를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 D-뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 L-뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 복수의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 연결된 것을 지칭한다. 폴리펩타이드는 전형적으로 아미노산 2-100개, 예를 들어 아미노산 10-50개를 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 아미노산만 포함할 수 있거나, 또는 β-아미노산 (β3 및 β2); 호모-아미노산; 프롤린 및 피루브산 유도체; 3-치환된 알라닌 유도체; 글리신 유도체; 고리-치환된 페닐알라닌 및 티로신 유도체; 선형 코어 아미노산 및 N-메틸 아미노산과 같은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "양이온 교환 크로마토그래피"는, 고상이 음으로 하전된, 예를 들어, 카르복실레이트 또는 설포네이트 기와 같은 하나 이상의 음으로 하전된 리간드를 가진, 크로마토그래피를 의미한다. 상업적으로 이용가능한 양이온 교환 매트릭스로는 카르복시-메틸-셀룰로스, 아가로스 상에 고정된 설포프로필 (SP) 및 아가로스 상에 고정된 설포닐, 예를 들어 Capto S, Capto Adhere 및 Capto S Impres (GE Healthcare), Unosphere S 및 Nuvia S (BioRad), GigaCap S (Tosoh), Fractogel S 및 Eshmuno S (Merck Millipore) 또는 양이온 교환 멤브레인 흡착제, 예를 들어 SartoBind S (Sartorius) 및 모노리스 흡착제, 예를 들어 SO3 monoliths (Bia Separations) 등이 있다.
본원에서, 크로마토그래피와 관련하여, 용어 "크로마토그래피 컬럼" 또는 "컬럼"은 용기, 종종 실린더 형태의 용기 또는 크로마토그래피 매트릭스로 충전된 중공 기둥 (hollow pillar) 형태를 지칭한다. 크로마토그래피 매트릭스는 정제에 사용되는 물리적 특성 및/또는 화학적 특성을 제공하는 물질이다.
본원에서, 용어 "크로마토그래피 사이클" 또는 "크로마토그래피 작동 사이클"은, 비-제한적으로, 다음과 같은 단계들 일부 내지 하나 이상의 순차적인 조합을 포함할 수 있는, 주어진 크로마토그래피 매트릭스 할당 (allotment) 상에서 일련의 처리 단계들로 구성된 하나의 사이클을 운영하는 것을 의미한다: 평형 단계, 재-로딩 단계, 로딩 단계, 오버로딩 단계, 로딩 후 세척 단계, 2차 세척 단계, 용출 단계, 재생 단계, 클리닝 단계, 보관 단계 및 임의의 잠시 휴지 또는 중지 기간 (hold period). 따라서, 추가의 사이클은 처리 단계들의 동일한 순서의 반복을 포함할 수 있다.
대상 화합물/타겟 생체분자와 크로마토그래피 매트릭스와의 상호작용과 관련하여, 용어 "결합한다" 및 "결합하는"은 매트릭스에 의한 화합물 또는 생체분자의 포획을 의미한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 대상 화합물/타겟 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스와 상호작용하는 수단이 대상 매트릭스의 특성에 따라 좌우됨을 알 것이다. 용어 "에 결합한다"가 반드시 공유 결합을 내포하는 것은 아니다. 이온 교환 크로마토그래피에서, "결합은 대상 화합물/타겟 생체분자 및 매트릭스 간의 이온성 상호작용이다. 친화성 크로마토그래피의 경우, "결합"은 대상 화합물/타겟 생체분자 및 매트릭스 간의 친화성 상호작용이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 경우, "결합"은 대상 화합물/타겟 생체분자 및 매트릭스 간의 소수성 상호작용이다. 다른 크로마토그래피 타입에 적용가능한 적절한 결합 방식은 당해 기술 분야의 당업들에게 자명할 것이다.
본원에서, 크로마토그래피와 관련하여 용어 "동적 결합 용량"은, 일정한 속도 하에 크로마토그래피 매트릭스에 결합할 수 있으면서 통과 분획 내에 대상 단백질 또는 기타 타겟 화합물이 충분한 양으로 존재하지 않는, 대상 단백질 또는 기타 타겟 화합물의 양을 의미한다. 크로마토그래피 매트릭스의 동적 결합 용량은 대상 단백질을 기지 농도로 포함하는 샘플을 로딩함으로써 측정한다. 컬럼 상의 단백질 샘플의 로딩을 모니터링하고, 비-결합된 단백질이 매트릭스를 통과하여 흐르기 전까지 특정 브레이크 포인트 (break point)까지 매트릭스에 결합시킨다. 예를 들어, 단백질 10%가 유실되는 시점에서의 파과 곡선 (breakthrough curve)으로부터 동적 결합 용량을 구하고, 실험을 중단한다. 대개 동적 결합 용량은, 통과 분획으로 유실되는 대상 단백질, 바람직하게는, 동일한 시점에 로딩되는 대상 단백질의 농도의 소실이 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 17% 또는 20% 이하이면서, 일정한 유속 하에 매트릭스에 결합할 수 있는 대상 단백질의 양을 정의한다.
본원에서, 용어 "통과 분획"은 혼합물이 크로마토그래피 매트릭스를 관통 또는 통과함으로써 수득되는 액체 조성물을 의미한다.
본원에서, 용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피"는, 고상이 소수성인, 예를 들어 페닐 또는 부틸 기와 같이 하나 이상의 소수성 리간드를 가진, 크로마토그래피를 지칭한다. 상업적으로 이용가능한 소수성 상호작용 매트릭스로는 Capto 페닐 또는 Capto 부틸 (GE Healthcare), ToyoPearl HIC (Tosoh) 및 Fractogel EMD 페닐 (Merck Millipore)과 같이 아가로스 상에 고정된, 또는 SartoBind HIC (Sartorius)와 같이 멤브레인 흡착제 상에 고정된, 페닐 또는 부틸 등이 있다.
본원에서, 크로마토그래피와 관련하여, 용어 "멤브레인 흡착제" 또는 "멤브레인 크로마토그래피"는, 반-투과성 멤브레인이 공급 스트림이 공급되는 용기 안에 하우징되고, 그 표면에 정제에 사용되는 물성 및/또는 화학적 특성을 제공하는 물질인 수지 또는 리간드가 고정된, 크로마토그래피 포맷을 지칭한다.
본원에서, 크로마토그래피와 관련하여, 용어 "모노리스 크로마토그래피" 또는 "모노리스 흡착제"는, 다공성 폴리머가 연속적인 체적으로 공급 스트림이 공급되는 용기 내에 하우징되고, 그 표면에 정제에 사용되는 물성 및/또는 화학적 특성을 제공하는 물질인 수지 또는 리간드가 고정된, 크로마토그래피 포맷을 지칭한다.
본원에서, 용어 "혼성-방식의" 크로마토그래피는, 고상이, 예를 들어, 하이드록시아파티트와 같은 여러가지 비-하전된 리간드 또는 하전된 리간드의 혼합을 가질 수 있는, 크로마토그래피를 지칭한다. 상업적으로 이용가능한 혼성의 매트릭스로는 세라믹 하이드록시아파티트 (BioRad) 또는 Capto Adhere (GE Healthcare) 및 HA Ultrogel 하이드록시아파티트 (Pall) 등이 있다.
본원에서, 용어 "혼합물"은, 존재할 수도 있는 숙주 세포 단백질, DNA 또는 기타 숙주 세포 성분 등의 다른 물질로부터 정제하고자 하는 하나 이상의 대상 단백질을 포함하는 적어도 부분적으로 액체 조성물을 지칭한다. 혼합물은, 예를 들어, 현탁액, 수성 용액, 유기 용매 시스템, 또는 수성/유기 용매 혼합물 또는 용액일 수 있다. 혼합물은 흔히 복수의 생물 분자 (예, 단백질, 항체, 호르몬, 폴리뉴클레오티드 및 바이러스), 소분자 (예, 염, 당, 지질 등) 및 심지어 미립자 물질을 포함하는, 복합 혼합물 또는 용액이다. 생물 기원의 전형적인 혼합물은 수용액 또는 수성 현탁액으로 시작할 수 있지만, 또한 용매 석출, 추출 등과 같은 이전의 분리 단계들에 사용되는 유기 용매도 포함할 수 있다. 본원에서, 용어 "혼합물"은 용어 "공급원료"와 동일할 수 있다. 일정 부피의 혼합물/공급원료는 "공급원료로부터의 공급물"로서 언급될 수 있다.
본원에서, 크로마토그래피와 관련하여 용어 "정적 결합 용량"은 통과 분획 내에 대상 단백질 또는 다른 타겟 화합물이 상당량으로 존재하지 않는, 정적 조건 하에 크로마토그래피 매트릭스에 결합할 수 대상 단백질 또는 기타 타겟 화합물의 최대량을 지칭한다. 정적 결합 용량은 정상적으로는 비이커 안에서 배치 방식으로 측정되며, 주어진 용매 및 단백질 농도 조건에서 크로마토그래피 매질에 결합되는 단백질의 최대량으로 통상 지칭된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 보강제"는 생성물 생체분자를 제외한 치료학적 제형의 성분을 지칭한다. 희석제로는, 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 사카로스, 셀룰로스, 옥수수 전분 또는 감자 전분 등이 있으며; 부형제로는 윤활제, 예를 들어, 실리카, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜; 결합제, 예를 들어 전분, 아라비아검, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 피롤리돈; 붕해제, 예를 들어 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 소듐 전분 글리콜레이트; 발포성 혼합물 (effervescing mixture); 색소 (dyestuff); 감미제; 습윤제, 예를 들어, 레시틴, 폴리소르베이트, 라우릴설페이트; 및, 일반적으로, 약학적 제형에 사용되는 무독성의 약제학적으로 비활성 물질 등이 있다. 보강제로는 진통제, 무기 화합물, 예를 들어 알럼 (alum), 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트 하이드록사이드; 미네랄 오일, 예를 들어 파라핀 오일; 디터전트 (detergent); 사포닌 (saponin), 사이토카인 및 식품 기재 오일 (food based oil) 등이 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 생성물 생체분자의 용도에 따라 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 보강제를 선택할 수 있다.
추가적인 상세 설명
본 발명에 따라 정제할 수 있는 항체 또는 항체 단편과 같은 대상 단백질은 재조합 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 배양함으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따른 숙주 세포는, 예를 들어, 원핵생물, 효모 (예, 비-제한적으로, 칸디다 보이디니이 (Candida boidinii), 한세뉼라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha), 피키아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 및 기타 클루이베로마이세스 spp. (Kluyveromyces spp.), 야로이와 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 믹소마이세테 (Myxomycete) (비-제한적인 예로, 딕티로스텔리움 디스코이데움 (Dictyostelium discoideum)), 곰팡이 (filamentous fungi) (비-제한적인 예, 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei) 및 그외 트리코데마 ssp. (Trichoderma spp), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger) 및 그외 아스퍼질러스 spp.), 이끼류 (비-제한적인 예, 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens)), 아트리쿰 운둘라툼 (Atrichum undulatum)), 곤충 또는 포유류 세포이다. 포유류 숙주 세포는, 비-제한적인 예로, NSO, SP2.0, 3T3 세포, COS 세포, 인간 골육종 세포, MRC-5 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, VERO 세포, CHO 세포, rCHO-tPA 세포, rCHO-Hep B 표면 항원 세포, CHO-S 세포, HEK 293 세포, rHEK 293 세포, C127 세포, rC127-Hep B 표면 항원 세포, 인간 섬유모세포 세포, 기질 세포, 간세포 세포 또는 PER.C6 세포이다.
숙주 세포는, 바람직하게는 진핵생물 숙주 세포이고, 바람직하게는 포유류 숙주 세포, 더 바람직하게는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DG44 균주이다.
진핵생물 숙주 세포 (예, 효모, 곤충 또는 포유류 세포)의 경우, 여러가지 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열이, 숙주의 특성에 따라 사용될 수 있다. 숙주 세포는, 조절 신호가 발현 수준이 높은 특정 유전자와 관련있는, 아데노바이러스, 보바인 파필로마 바이러스, 유인원 바이러스 등과 같이 바이러스 소스로부터 유래될 수 있다. 그 예로는 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV40 초기 프로모터, 효모 gal4 유전자 프로모터 등이 있다. 유전자의 발현을 조절할 수 있도록 억제 및 활성화를 허용하는 전사 개시 조절 신호가 선택될 수 있다. 도입된 DNA에 의해 안정적으로 형질전환된 세포는, 또한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선별할 수 있는 하나 이상의 마커를 도입함으로써, 선별할 수 있다. 마커는 또한 영양요구성 숙주 (auxotropic host)에 대한 광영양 (phototrophy), 살생물제 내성 (biocide resistance), 비-제한적인 예로, 항생제, 또는 구리와 같은 중금속 등을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현시키거나 또는 공동-형질감염에 의해 동일 세포내 도입시킬 DNA 유전자 서열에 직접 연결될 수 있다. 또한, 추가적인 인자가 본 발명의 단백질의 합성을 최적화하는데 필요할 수 있다.
대상 단백질을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터로 진핵생물 숙주 세포를 형질감염시킨 다음 이의 증식 및 대상 단백질의 발현을 뒷받침하는 임의의 배지에서 배양한다. 배지는 동물 혈청 및 펩톤 등의 동물 유래의 산물을 포함하지 않는 화학적으로 정의되는 배지이다. 세포 증식 및 단백질 생산을 달성하기에 적절한 농도로 존재하는 비타민, 아미노산, 호르몬, 성장인자, 이온, 완충제, 뉴클레오시드, 글루코스 또는 등가의 에너지원을 여러 조합으로 포함하는, 당해 기술 분야의 당업자가 이용가능한 여러가지 세포 배양 배지들이 존재한다. 세포 배양 사이클 중에 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 여러 시점에 적절한 농도로 추가적인 배양 배지 성분들이 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
포유류 세포 배양은 교반 플라스크 또는 생물반응조와 같은 임의의 적절한 용기에서 이루어질 수 있으며, 필요한 생산 규모에 따라 피드-배치 방식 (fed-batch mode)으로 운영되거나 또는 운영되지 않을 수 있다. 이들 생물반응조는 교반형-탱크 또는 공기-리프트식 반응조일 수 있다. 1,000 L 이상 - 50,000 L 또는 100,000 L, 바람직하게는 5,000 L - 20,000 L 또는 10,000 L의 용량을 가진 다양한 대규모 생물반응조가 사용될 수 있다. 다른 구현예로, 2 L 내지 100 L와 같은 더 작은 규모의 생물반응조를 사용해 본 발명에 따른 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 공정 및 방법에 따라 CHO 세포와 같은 진핵생물 숙주 세포에서 생산되는 항체 또는 항원 결합 단편 등의 대상 단백질은, 전형적으로, 세포 배양물의 상층액에서 확인된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상층액은 본 발명의 공정에 따라 정제되는 혼합물이다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 공정 및 방법은, 본 발명의 공정에 따라 추가적으로 정제하기 위해, 상층액을 원심분리하고, 원심분리한 후 액상을 회수하여 대상 단백질을 포함하는 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 예로, 상층액은, 예를 들어, 딥 여과 (depth filtration)와 같이 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 청징 기법 (clarification technique)을 이용해 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명에 대한 특정 구현예에서, 본 방법은 본 발명의 공정에 따라 추가로 정제하기 위해, 딥 여과하여 대상 단백질을 포함하는 혼합물을 수득하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이며, 바람직하게는 그람 음성 박테리아, 바람직하게는, E. coli 세포. 원핵생물 세포이다. 단백질을 발현시키기 위한 원핵생물 숙주 세포들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 숙주 세포는 항체 단편과 같은 대상 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 재조합 세포이다. 재조합 E. coli 숙주 세포는 MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue 및 JM109 등의 임의의 적절한 E. coli 균주로부터 유래될 수 있다. 일 예는 재조합 단백질 발효를 위해 통상적으로 사용되는 숙주 균주인 E. coli 균주 W3110 (ATCC 27,325)이다. 또한, 항체 단편은 변형된 E. coli 균주, 예를 들어, 대사 돌연변이 또는 프로테아제 결핍된 E. coli 균주를 배양함으로써 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 정제할 수 있는 항체 단편은 전형적으로 단백질의 특성, 생산 규모 및 사용되는 E. coli 균주에 따라 E. coli 숙주 세포의 페리플라즘 (periplasm)에서 또는 숙주 세포 배양물 상층액에서 확인된다. 단백질을 이들 구역으로 타겟팅하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 단백질을 E. coli의 페리플라즘으로 향하게 하는 적절한 신호 서열의 예로는 E. coli PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 신호 서열 등이 있다. 단백질은 천연적인 방출 경로에 따라, 또는 예를 들어 pelB 리더, 단백질 A 리더, 박테리오신 방출 단백질의 공동-발현, 미토마이신-유발성 박테리오신 방출 단백질과 글리신의 배양 배지에 첨가 및 막 투과화를 위한 kil 유전자의 공동-발현을 사용하는, 단백질 방출을 유발하기 위한 외막의 제한된 누출 유도에 의해, 상층액으로 타겟팅될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 재조합 단백질은 E. coli 숙주의 페리플라즘에서 발현된다.
E. coli 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현은 또한 E. coli에서 재조합 항체의 발현을 유도성 프로모터의 제어 하에 둠으로써 유도성 시스템의 제어 하에 이루어질 수 있다. E. coli에서 사용하기 적합한 다수의 유도성 프로모터들이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 프로모터에 따라, 재조합 단백질의 발현은 증식 배지 내 특정 물질의 농도 또는 온도 등의 인자를 달리함으로써 유도할 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 락토스 또는 비-가수분해성 락토스 유사체, 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)로 유도가능한 E. coli lac, tac 및 trc 프로모터, 및 포스페이트, 트립토판 및 L-아라비노스에 의해 유도되는 phoA, trp 및 araBAD 프로모터 등이 있다. 발현은, 예를 들어, 유도제의 첨가, 또는 유도가 온도 의존적일 경우 온도 변화에 의해 유도할 수 있다. 재조합 단백질의 발현 유도가 배양물에 유도제를 첨가함으로써 달성되는 경우, 유도제는 발효 시스템 및 유도제에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 첨가될 수 있으며, 예를 들어 1회 또는 다회 샷 첨가 또는 피드를 통한 유도제의 점진적인 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 유도제의 첨가와 실제 단백질 발현의 유도 사이에는 지연이 있을 수 있으며, 예를 들어 유도제가 락토스인 경우, 단백질의 발현 유도 전 임의의 기존 탄소원이 락토스를 이용하기 전에 이용되는 기간 동안 지연이 발생할 수 있다.
E. coli 숙주 세포의 배양물 (발효물)은 E. coli의 증식과 재조합 단백질의 발현을 지지하는 임의 배지에서 배양할 수 있다. 배지는, 예를 들어, 개시된 임의의 화학적으로 규정된 배지일 수 있다.
E. coli 숙주 세포의 배양은 필요한 생산 규모에 따라 교반 플라스크 또는 발효기 등의 임의의 적절한 용기에서 이루어질 수 있다. 1,000 L 이상 - 최대 100,000 L 용량의 다양한 대규모 발효기가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 1,000 L - 50,000 L의 발효기가 사용되며, 더 바람직하게는 1,000 L - 10,000 L 또는 12,000 L의 발효기가 사용된다. 0.5 L - 1,000 L 용량의 더 작은 용량의 발효기 역시 사용될 수 있다.
CHO 또는 E. coli와 같은 숙주 세포의 발효는 단백질 및 필요한 수율에 따라 임의의 적절한 시스템, 예를 들어, 연속, 배치 또는 피드-배치 방식으로 수행할 수 있다. 필요에 따라 영양물질 또는 유도제가 샷 첨가되는 배치 방식을 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 발효기에 처음에 존재하는 영양물질을 이용해 지속될 수 있는 최대 특정 증식 속도로 배양물을 배치 방식으로 유도 전 배양하고; 발효가 끝날 때까지 증식 속도를 제어하기 위해 하나 이상의 영양물질 공급 용법을 사용하는, 피드-배치 배양을 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 로딩하는 포획하는 단계 전에, 세포 배양 회수물을 원심분리한 다음 추출 완충제를 첨가하여 숙주 세포를 현탁하는 단계를 포함한다.
항체 단편과 같은 대상 단백질이 숙주 세포의 페리플라즘 공간에서 발현되는 E. coli 발현 방법의 경우, 숙주 세포로부터 단백질을 분리하여야 한다. 분리는 기계적 또는 압력 처리, 동결-해동 처리, 삼투압 충격, 추출제 또는 열 처리에 의한 세포용해와 같은 임의의 적절한 방법으로 달성될 수 있다. 단백질을 분리하기 위한 이러한 추출 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 방법에 대한 특정 구현예에서, 임의 구현예에 따른 본 발명의 방법에서 혼합물은, 단백질 A에 결합된 항체 또는 항체 단편을, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편의 결합을 파괴하는데 적합한 pH를 가진 용출 완충제를 사용해 용출시킴으로써, 수득한다. 상기한 pH는 특정 분자에 의존하며, 일반적으로 당해 기술 분야의 당업자에 의해 경험적으로 결정되며, 바람직한 엔드포인트를 달성하도록 적정된다.
예를 들어, MabSelect® (GE Healthcare), Absolute® (Novasep), Captiv A® (Repligen) 또는 Amsphere® (JSR)와 같이, 네이티브 재조합 단백질 A를 비롯하여, 당해 기술 분야의 당업자가 이용가능한 크로마토그래피 물질들이 다수 존재한다.
단백질 A 크로마토그래피에서 세척 완충제 및 용출 완충제로서 사용하기 적합한 완충제들은 당해 기술 분야에서 쉽게 입수가능하며, 비-제한적인 예로, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS), Tris, 히스티딘, 아세테이트, 사이트레이트 완충제, MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 이미다졸), BES (N,N-(비스-2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산) 또는 HEPES (N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산) 완충제 중에서 선택할 수 있다.
아래 실시예는 본 발명을 예시한다. 그러나, 실시예가 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다. 이와 관련하여, 실시예에 기술된 특정 공정 및 순도 및 수율을 입증하기 위해 사용되는 방법들은 본 발명의 공정을 기술하기 위한 목적으로만 설계된다. 생체분자의 수율 및 순도를 측정하기 위해 이용가능한 방법들이 다수 존재하며, 임의의 일 특정 분석에서 부정적인 결과가 결정적인 것은 아니다.
실시예
네이키드 Fab를 2.18 g/L 농도로 함유하며 전도도가 대략 14 mS/cm인, E. coli 배양물로부터 원심분리 및 열 추출된, 청징 처리된 냉동 세포 배양물을, 탈이온수로 pH 대략 4.5 및 전도도 대략 3.76mS/cm에서 농도 0.5g/l로 희석하였다. 세척 완충제 (50mM 소듐 아세테이트 pH 4.5, 전도도 4.0mS/cm) 3 컬럼 부피 (CV)를 컬럼 크로마토그래피 매트릭스에 150cm/h로 펌핑하여 컬럼을 평형화한 다음; 대상 단백질이 함유된 로드를 225cm/hour 속도로 펌핑되는 수지 부피에 대해 17.5g/L의 로드 챌린지 (load challenge)로 적용하고; 동일 세척 완충제를 다시 5 CV로 150cm/h 속도로 적용하고; 낮은 전도성 세척 완충제로부터 고 전도성 세척 완충제 (50mM 소듐 아세테이트, 225mM 소듐 클로라이드 완충제, pH 4.5, 전도도 26.4mS/cm)로 이어지는 선형적인 용출 완충제 농도 구배를 150cm/hour 속도로 10 CV로 적용하고; 고 전도성 재생 완충제 (50mM 소듐 아세테이트, 1M 소듐 클로라이드, pH 4.5, 전도도 85mS/cm) 2CV를 300cm/hour 속도로, 높은 pH의 클리닝 완충제 2CV를 300cm/hour 속도로 적용한 다음; 세척 완충제 2CV로 세척 제거하기 전에 15분간 유지하는, 결합 및 용출 크로마토그래피 공정을 수행하였다. 사용된 크로마토그래피 매트릭스는 GE 4.66ml 10cm Capto S HiScreen 양이온 교환 컬럼이며, GE Akta Avant 장치에서 수행하였다. 크로마토그래피 내내, 컬럼으로부터 나오는 아웃풋의 전도도, pH, 280nm 흡광도, 260nm 흡광도 및 305nm 흡광도를 인라인으로 측정하여, 실시간으로 모니터링 및 기록하였으며, 10CV 용출 중에 수득되는 아웃풋 액체를 수집하여, 96웰 딥 웰 마이크로타이터 플레이트에서 1.55 ml씩 분획으로서 6℃에서 보관하였다. 10CV 농도 구배 용출에서 진폭 값을 관찰한 바, 일부 분리된 2개의 주 피크가 상당히 중첩되어 나타났으며; 대략 22번째 분획에서 정점을 나타낸 훨씬 큰 비대칭적인 피크 바로 앞에 17번째 분획 부근에서 구별되는 정점을 나타낸 소형 피크가 관찰되었다. 각 분획에서 30 ㎕을 샘플로 취하고, 분획물의 조성을 확인하기 위해 친화성 단백질 G 분석용 HPLC 단계에 투입하였으며, 단백질 G HPLC를 통과시킨 각 샘플에서 구분되는 통과 피크 및 용출 피크를 A280 흡광도 적분하여, Capto S 농도 구배 용출에서의 초기 소형 피크에 해당되는 비-항체 성분 (HPLC에서 통과 분획, non-Fab로 언급됨)의 양과 Capto S 농도 구배 용출에서 후기 큰 피크에 해당되는 항체 성분 ((HPLC에서 용출물, Fab로 언급됨)의 양을 각각 측정할 수 있었으며, 둘다 트루 프로파일 (true profile)을 수득하였다.
제1 사이클에서, CEX 농도 구배 용출에서 2개의 피크 간의 중첩 영역으로부터 2개의 특정 분획 (총 32개 중 21번째와 22번째)의 나머지 남아있는 부피 (각 분획의 거의 대부분임, 각각에서 5% 미만을 단백질 G HPLC 분석에 사용함)를 합치고, 이를 이전의 크로마토그래피 작동에서의 프레쉬 로드와 동일 부피로 용기에 넣고, 다음번 Capto S 크로마토그래피에 다시 로딩하기 위해 탈이온수를 사용해 동일한 전도도 3.76mS/cm로 다시 희석하였다. 이들 분획은 대상 Fab를 다량으로, non-Fab를 유의한 함량으로 포함하므로, 이를 선택하였으며, 효과적인 선택은 컴퓨터 모델을 사용해 도움을 받았다. (하기 참조). 2개 선택 후 분획들의 남아있는 나머지 부피 (23번부터 31번까지, 체류 풀로서 언급됨)와 주로 Fab를 함유한 부피를 풀로서 합치고, 풀에서 Fab 수율과 남아있는 불순물을 계산하였다. 각 경우에, 각 풀의 순도는 Fab의 양을 non-Fab의 양으로 나누어 계산하였으며, 수율은 체류 풀 내 Fab의 양을 양쪽 용출 피크를 커버하는 모든 분획들 (9번 분획에서부터 31번 분획까지)에서의 총 Fab로 나누어 계산하였다.
조합한 로드/재순환 분획을, 조작이 모두 동일한 후속적인 2차 크로마토그래피 사이클의 컬럼에 다시 적용하고, 다시 동일한 분획들을 수집하였으며, 각각 동일하게 소량을 단백질 G HPLC에 의해 분석하기 위해 샘플로 취하였으며, 다시 동일한 2개의 분획을 취하고, 제3 사이클에 적용할 부가적인 프레쉬 로드와 합치고, 23번 - 31번 분획을 모아, 다시 Fab 및 non-Fab의 양 및 수율을 계산하였다. 3차 및 4차 사이클에서 동일한 방식으로 이를 반복하였다. 이로써, 이전 사이클로부터 재순환된 분획을 투입한 제2, 제3 및 제4 사이클의 체류 풀에서는, 로우 프레쉬 공급물 (raw fresh feed)만 투입되므로 즉 전통적인 배치 작동으로 운영되고 본 발명의 재순환 조작의 대조군인 첫 사이클과 비교해, Fab 수율이 각각 22%, 23% 및 25%로 현저하게 증가하였다. 동시에, 체류 풀에서 측정된 Fab 단위 당 non-Fab의 비율로서 계산된 상대적인 순도는, 첫 사이클에서 관찰된 순도 비율에 -4%, -4% 및 +1%로 근접하였으며, 수회의 사이클 수행 후, 첫 사이클과 동일한 수준으로 평형화되었다. 따라서, 제1 사이클의 체류 풀이 주어진 체류 풀 영역에서 특정 수율 및 순도를 제시하는 전통적인 크로마토그래피 결합 및 용출 분리를 나타내는 경우, 본 발명에 따라 이전 사이클로부터 나온 재순환된 분획을 투입한 후속적인 크로마토그래피 사이클은, 순도는 유지하면서 체류 풀의 동일한 영역의 수율을 증가시킬 수 있었다. 재순환시킬 분획을 용기에 보관함으로써, 본 발명의 수율 증가를 단일 크로마토그래피 매트릭스에서 달성할 수 있으며, 공정의 평형화 능력에 실질직인 영향없이 분리 크로마토그래피 사이클 사이에 유연한 시간 갭을 허용할 수 있었으며, 또한 이는 사이클 사이에 분획들의 성능을 검사하기 위한 오프라인 분석을 이용할 수 있는 시간이 허용되었으며, 프레쉬 로드로 희석함으로써, 이들 분획에 대한 별도의 희석 완충제의 필요성을 없앨 수 있었다. 마지막으로, 용출물 내 체류 Fab의 농도는, 전통적인 run 1과 비교해 제2, 제3 및 제4 사이클에서 증가하였다.
재순환용으로 선택된 동일한 2개의 분획을 다시 제4 사이클에서 취하여 제5 사이클에 다시 적용하였으며, 재순환된 21번 분획과 22번 분획을 혼합하기 전에, 제1 사이클과 동일한 방식으로 제5 사이클에서 프레쉬 로드는 탈이온수를 사용해 타겟 전도도 3.76mS/cm으로 자체 희석하였으며, 2개의 분획에 함유된 용출 완충제로부터의 부가적인 염의 유입 후 전도도를 3.76mS/cm으로 낮추기 위한 추가의 탈이온수는 첨가하지 않았다. 다음 사이클에 적용될 프레쉬 로드의 전도도가 결합을 위해 필요한 수준 보다 훨씬 낮고 그 부피는 2개의 재순환 분획을 합친 부피 보다 훨씬 많기 때문에, 이들 분획의 혼합은, 다음 사이클을 로딩하는 동안에 정상적인 결합가능한 성분들의 결합을 방해하지 않을 정도로 충분히 고 전도성 염을 희석하는 효과를 분획에서 발휘하게 될 것이다. 제5 사이클의 체류 풀에서, 첫 (대조군) 사이클과 비교해, 13%로 소폭이지만 여전히 실질적인 수율 증가와, 약간 낮지만 여전히 비슷한 수준의 순도, 6% 감소, 그리고 순도*수율 밸런스의 전체적인 증가 106%가 달성되었으며, 이는, 조합된 공급물을 추가적으로 희석하지 않을 경우에도 부가적인 전체 성능 증가를 달성할 수 있다는 것을 의미한다.
동일한 2개의 분획을 다시 수집하고, 이를 제5 및 제6 사이클에서 재순환하였으며, 이때 조합한 공급물을 그 전에 3.76mS/cm로 희석하였는 바, 사이클에서 수율 및 순도 측면에서 상당한 증가가 체류 풀에서 동시에 달성되었다. 마지막 제7 사이클을, 제6 사이클의 20번, 21번, 22번 및 23번 분획을 프레쉬 로드와 합치고 이를 제7 사이클에 로딩하기 전에 탈이온수를 사용해 3.76mS/cm로 희석하여, 수행하였다. 잠재적인 이후 사이클을 재순환되는 확장된 범위의 새로운 분획을 사용해 계속 진행할 경우, 체류 풀에 함유된 분획들은 반드시 더 짧게 될 것이며, 24번부터 31번 분획까지 연장된다. 이 경우 체류 풀은 첫 사이클의 오리지날 체류 풀 범위와 비교해 거의 동일한 수율 (97%) 및 8% 순도 증가를 나타내며, 이는 수율은 유지하면서 순도를 높일 수 있음을 입증해주었으며, 또한 첫 사이클에서 동일한 분획들을 포함한 체류 풀과 비교해, 32% 수율 증가 및 11% 순도 증가가 관찰되었다. 제7 사이클 이후에는 사이클을 계속 진행하지 않을 경우, 제7 사이클의 23번-31번 분획들을 합친 체류 풀은, 첫 사이클에서 수득한 동일한 재순환 풀과 비교해, 34% 수율 증가 및 12% 순도 증가가 달성되었으며, 이는 순도 및 수율 둘다 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을, 입증해준다.
실험 동안의 순도 증가는 주어진 사이클의 체류 풀의 순도를 첫 사이클의 체류 풀의 순도로 나누어 계산하였으며, 수율 증가는 주어진 사이클의 체류 풀의 수율을 첫 사이클의 체류 풀의 수율로 나누어 계산하였다.
따라서, 하나의 사이클에서 일부 분리된 피크들의 중첩된 영역으로부터 취한 선택 분획을 다음 사이클에서 로드로 재순환함으로써, 나머지 비-재순환 체류 물질에서의 수율 또는 순도 또는 이들의 조합 증가를 달성하여, 타겟 산물의 정제 효율을 높일 수 있다는 것이 입증되었다. 재순환할 분획에 대한 합리적인 선택은 컴퓨터 모델링을 통해 도움을 받을 수 있으며 - 첫 사이클에서 샘플들에서 Fab 및 non-Fab를 정량한 후, 잠재적으로 재순환시킬 소정의 분획 선택에서 Fab 및 non-Fab의 양을 계산하고 재순환시켜야 하는 다음 체류 풀에서 피크 조성과 양의 변화를 시뮬레이션하는 피크 분포에 대한 컴퓨터 모델을 구축하였으며, 반복을 통해 수회 사이클 동안의 달성되는 순도 및 수율 변화를 예측할 수 있었다. 그런 다음, 원하는 대로 순도 또는 수율 또는 이 둘다를 증가시킬 가능성이 있는 조건을 반복적으로 찾기 위해, 시뮬레이션에서 재순환용으로 선택되는 분획들을 변경하였다. 이러한 과정은 재순환 분획의 한 측면 (후기 분획)에서 체류 풀 내 Fab, 또는 재순환 분획의 다른 측면 (초기 분획)에서 Non-Fab에 유리하도록 어느 방향으로도 구동할 수 있었다. 이에 상응하여, 타겟 산물의 농도를 동일한 방식으로 높일 수 있다. 본 공정에서는 처음 6번의 사이클에서는 21번 및 22번 분획을 재순환시키도록 선택하였으며, 제6 사이클의 분석 데이터를 사용해 시뮬레이션을 다시 보정하여, 제7 사이클에서는 20번-23번 분획을 재순환시켰다.
이러한 재순환 방식은, 차별적인 파과 시간 및 피크 형태를 나타내는 이동상 성분들 간의 차별적인 분리가, 이들과 고정된 리간드 간의 차별적인 화학적 및/또는 정전기적 상호작용에 의존하는 임의의 소정의 크로마토그래피에 대한 경우에서와 같이, 부분 분리가 농도 구배 용출에 의해 구동되는 지의 유무와 상관없이, 파과 시간 측면에서 피크의 분리 및 피크 형태가 동일하게 유지되는 한, 실시예에 기술된 바와 비슷한 중첩성으로 용출되는 피크를 가진 임의의 성분의 크로마토그래피로까지 물론 확대될 것이다. 아울러, 이러한 재순환 방식은 물론 2번 중첩된 3개의 연속 피크 또는 3번 중첩된 4개의 피크 또는 각각 1번 중첩된 2개의 쌍으로 분할된 4개의 피크 등과 같이, 복수의 페어링된 중첩성을 가진 (multiple paired overlap) 복수의 피크를 나타내는 임의의 시스템으로까지 확장될 것이다. 각각의 경우에, 후속 사이클에서 재순환시킬 각각의 중첩 영역의 최적화는, 중첩성 파트너 피크에 지배적인 부적절한 성분과 비교해 타겟 피크의 체류 풀에서 지배적인 원하는 성분의 수율 (및 농도) 및/또는 순도에 차별적으로 유리하도록, 적용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 원하는 성분 피크가 앞뒤로 겹치는 부적절한 구성성분 피크 2개로 둘러싸인 경우에는, 이들의 중첩 영역의 섹션은 양쪽 이웃에 걸친 타겟 중간 피크에 유리하게 재순환시킬 수 있다.
전술한 실시예는, 본 발명에 따른 공정으로 순도 향상, 수율 개선, 농도 증가, 희석 프리 (dilution for free), 중단가능한 운영, 싱글 컬럼의 사용, 임의의 재로딩 순서 등의 다양한 이점들을 달성할 수 있다는 것을, 보여준다.
본 명세서, 청구항 및/또는 도면에 기술된 본 발명의 특징들은 개별적으로, 그리고 이의 임의 조합으로 본 발명을 다양한 형태로 실현하기 위한 재료일 수 있다.
본 발명이 충분히 설명된 바, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 사상 및 범위에서 이탈되지 않으면서 과도한 실험없이도 광범위한 등가의 파라미터, 농도 및 조건 하에 수행될 수 있음을 알 것이다. 본 발명이 구체적인 구현예를 들어 기술되었지만, 추가적인 변형도 가능한 것으로 이해될 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 또는 통례적인 실무 범위 내이며, 첨부된 청구항의 범위에 기술된 전술한 본질적인 특징들에 적용될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 내용으로부터 기원하는 것을 포함하여, 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 개조를 망라하는 것으로 의도된다.
본원에서, 부정관사 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서, 용어 "또는"의 사용은, 본원의 내용이 단독 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 뒷받침하더라도, 구체적으로 단독 대안을 명시하거나 또는 대안들이 상호 배타적임을 명시적으로 나타내지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 본원에서, "다른"은 적어도 2번째 이상을 의미할 수 있다.
본원에서, "X 내지 Y"는 X 및 Y를 포함하는 범위를 의미할 수 있다.
저널 기사 또는 초록, 공개된 또는 비-공개된 미국 또는 외국 출원, 등록된 미국 또는 외국 특허 또는 임의의 기타 참조문헌 등의, 본원에 언급된 모든 참조문헌들은, 인용된 참조문헌에 제시된 모든 데이터, 표, 도면 및 글자를 비롯하여, 그 전체가 본원에 원용에 의해 포함된다. 또한, 본원에 인용된 참조문헌에 언급된 참조문헌들의 전체 내용 역시 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
공지된 방법 단계들, 통상적인 방법 단계들, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 언급이 어떠한 방식으로도 본 발명의 임의의 측면, 설명 또는 구현예가 해당 분야에 개시, 교시 또는 시사되었음을 인정하는 것은 아니다.
본 발명의 측면들은 다음과 같다:
1.
하기 단계를 포함하는, 대상 화합물을 대상 화합물을 포함하는 혼합물로부터 정제하기 위한 공정:
a)
제1 크로마토그래피 작동 사이클에서 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 크로마토그래피 매트릭스에 대상 화합물을 포함하는 혼합물을 제1 용기로부터 로딩하는 단계;
b)
대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키고, 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계; 및
c)
대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩하는 단계.
2.
단계 c)의 재-로딩 단계는, 추가적인 크로마토그래피 작동 사이클에서, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합되도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩하는 것인, 측면 1에 따른 공정.
3.
상기 추가의 크로마토그래피 작동 사이클이 즉시 뒷따르는 크로마토그래피 사이클인, 측면 2에 따른 공정.
4.
동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획이 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획과 상이한, 측면 1 내지 측면 3 중 어느 하나에 따른 공정.
5.
동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩되는 하나 이상의 용출물 분획이 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획, 및 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획인, 측면 4에 따른 공정.
6.
원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획, 및 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획이 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 분리하여 재-로딩되는, 측면 5에 따른 공정.
7.
원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획에 앞서 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획, 및 원하는 특징을 가진 하나 이상의 용출물 분획 이후에 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출되는 하나 이상의 용출물 분획을 합치고, 조합된 분획을 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하는, 측면 5에 따른 공정.
8.
하나 이상의 용출물 분획을 재-로딩 전 또는 재-로딩 중에 가공 처리되고, 가공 처리된 하나 이상의 용출물 분획은 재-로딩시 대상 화합물의 크로마토그래피 매트릭스에의 결합을 허용하는, 측면 1 내지 측면 7 중 어느 하나에 따른 공정.
9.
상기 공정이, 대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키는 단계 및 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계에 앞서,
ab)
비-결합된 대상 화합물을 함유한 통과 분획을 제2 용기에 수집하는 단계, 및
ac)
추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서, 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에, 통과 분획을 제2 용기로부터 재-로딩하는 단계를 포함하는, 측면 1 내지 측면 8 중 어느 하나에 따른 공정.
10.
상기 공정이, 대상 화합물을 크로마토그래피 매트릭스로부터 용출시키는 단계 및 대상 화합물을 함유한 용출물을 용출물 분획으로서 수집하는 단계에 앞서,
ab)
비-결합된 대상 화합물을 함유한 통과 분획을 제2 용기에 수집하는 단계, 및
ac)
통과 분획을 제2 용기에서 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하고, 부가적으로 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 추가의 크로마토그래피 작동 사이클에서, 프레쉬 로드 혼합물 (fresh load mixture)을 로딩하는 단계를 포함하는, 측면 1 내지 측면 8 중 어느 하나에 따른 공정.
11.
제2 용기에서 수집된 통과 분획과 하나 이상의 용출물 분획을 크로마토그래피 작동 사이클에서 각각 분리하여 재-로딩하는, 측면 9 내지 측면 10 중 어느 하나에 따른 공정.
12.
통과 분획 및 하나 이상의 용출물 분획을 합치고, 이를 조합물로서 대상 화합물이 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 작동되는 동일한 크로마토그래피 매트릭스에 재-로딩하는, 측면 9 내지 측면 10 중 어느 하나에 따른 공정.
13.
상기 대상 화합물이 단백질, 항체, 항체 단편, 핵산 분자 및 소형 분자를 포함하는 군으로부터 선택되는, 측면 1 내지 측면 12 중 어느 하나에 따른 공정.
14.
측면 1 내지 측면 13 중 어느 하나에 따라 정의되는 정제 공정을 포함하며, 정제 공정에서 대상 화합물이 단백질인, 대상 단백질의 제조 방법.
15.
측면 14에 따라 정의되는 대상 단백질의 제조 방법에 의해 수득된, 항체 또는 항체 단편과 같은 단백질.
Claims (29)
- 생성물 생체분자 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 공급원료로부터 생성물 생체분자를 정제하기 위한 공업적인 규모의 공정 (industrial-scale process)으로서,
상기 공정이,
a) 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 공급물을 공급원료로부터 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계;
b) 용출 용액을 상기 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여, 크로마토그래피 매트릭스로부터 생성물 생체분자를 용출물로서 용출시키는 단계로서,
상기 용출물이,
- 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 제1 분획; 및
- 생성물 생체분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 제2 분획
을 포함하고,
상기 제2 분획이 하나 이상의 선행 분획 및/또는 후행 분획을 포함하며;
상기 제1 분획이 제2 분획과 별도로 수집되는, 단계;
c) 제2 분획을 하나 이상의 용기에서 홀딩하는 단계;
d) 제2 분획 내 생성물 생체분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합하도록 상기 용기로부터 제2 분획 및 상기 공급원료로부터 추가적인 공급물을 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 단계로서, 상기 추가적인 공급물이 상기 제2 분획과 동시에 또는 순차적으로 로딩되는, 단계; 및
e) 용출 용액을 상기 크로마토그래피 매트릭스에 적용하여, 크로마토그래피 매트릭스로부터 생성물 생체분자를 용출물로서 용출시키는 단계로서, 상기 용출물이 정제된 생성물 생체분자를 포함하는 단계
를 포함하고,
상기 단계 (a), 단계 (b), 단계 (d) 및 단계 (e)에서 크로마토그래피 매트릭스가 동일한 크로마토그래피 매트릭스인, 공정. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (b), (c) 및 (d)가 반복되는, 공정. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (b), (c) 및 (d)가 2회 이상 수행되는, 공정. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 분획이 (i) 제1 분획 직전에 유출되는 선행 분획; 및/또는 (ii) 제1 분획 직후에 유출되는 후행 분획을 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a) 및 (b)가 여러번 반복되고;
상기 단계 (b) 각각에서 수집되는 제2 분획을 풀 (pool)로 합치고;
상기 단계 (c)가 제2 분획의 풀을 용기(들)에 홀딩하는 것을 포함하고; 및
상기 단계 (d)가 제2 분획의 풀을 용기로부터 크로마토그래피 매트릭스로 로딩하여, 제2 분획의 풀 내 생성물 생체분자를 크로마토그래피 매트릭스에 결합시키는 것을 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a)가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않은 비-결합된 생성물 생체분자를 함유한 통과 분획 (flow-through)을 수집하는 단계를 더 포함하고;
상기 단계 (d)가 상기 통과 분획을 상기 제2 분획 및/또는 추가의 공급물과 동시에 또는 순차적으로 상기 크로마토그래피 매트릭스에 로딩하는 것을 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생체분자가 상기 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 것을 촉진하도록 상기 제2 분획(들)을 가공 처리하는 것을 더 포함하는, 공정. - 제7항에 있어서,
상기 가공 처리가 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 중에 이루어지는, 공정. - 제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 가공 처리가 상기 제2 분획(들)의 pH, 이온 세기, 농도, 온도 및/또는 용매의 변형, 및/또는 상기 제2 분획(들)의 혼합 (mixing) 및/또는 탈기 (degassing)를 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 분획(들)을 검사하는 단계를 더 포함하는, 공정. - 제10항에 있어서,
상기 제2 분획(들)의 검사가 상기 생성물 생체분자의 농도; 불순물의 농도; 불순물의 실체; pH; 이온 세기; 온도; 용매; 및/또는 제2 분획(들)의 기체 농도 중 하나 이상을 확인하는 것을 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)가 상기 제2 분획을 5분 이상 홀딩하는 것을 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)가 상기 제2 분획을 하룻밤 동안 홀딩하는 것을 포함하는, 공정. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스를 홀드 시간 (hold time) 동안 교환, 세척 또는 재생하는, 공정. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생성물 생체분자가 단백질, 항체, 항체 단편, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드인, 공정. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공급원료가 적어도 20 L, 선택적으로 적어도 100 L 부피인, 공정. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스가 4 L 이상의 베드 부피 (bed volume)를 가지는, 공정. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 상기 용출물의 부피가 상기 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 2배 이상이고, 선택적으로는 상기 용출물의 부피가 상기 크로마토그래피 매트릭스의 베드 부피의 2배 내지 20배인, 공정. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스가
- 이온 교환 크로마토그래피 매트릭스;
- 소수성 상호작용 크로마토그래피 매트릭스;
- 친화성 크로마토그래피 매트릭스;
- 혼성-방식의 크로마토그래피 매트릭스;
- 키랄 크로마토그래피 매트릭스; 및
- 유전 크로마토그래피 매트릭스 (dielectric chromatography matrix)로부터 선택되는, 공정. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스가 크로마토그래피 컬럼 내에 존재하는, 공정. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스가 크로마토그래피 멤브레인 또는 모노리스 흡착제 (monolith adsorber)인, 공정. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 상기 생성물 생체분자의 용출이 분당 크로마토그래피 매트릭스 부피의 약 0.2 이상의 유속으로 이루어지는, 공정. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 제1 분획을 합치는 것을 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정제된 생성물 생체분자를 정용여과 (diafiltering) 및/또는 농축하는 것을 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정제된 생성물 생체분자를 나노여과하는 것을 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정제된 생성물 생체분자에 대해 추가적인 크로마토그래피 정제를 수행하는 것을 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정제된 생성물 생체분자를 화학적으로 변형하는 단계를 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정제된 생성물 생체분자를 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 보강제와 함께 제형화 (formulating)하는 것을 더 포함하는, 공정. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득가능한 정제된 생성물 생체분자.
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