CN112805298A

CN112805298A - 制备GLY-Tβ4的方法

Info

Publication number: CN112805298A
Application number: CN201980065912.8A
Authority: CN
Inventors: 金渶睦; 张道水; 姜锡瓒; 金完燮; 严基安
Original assignee: Huons Co Ltd
Current assignee: Huons Co Ltd
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2021-05-14
Also published as: WO2020032444A1; KR20200016597A; US20220081476A1; EP3835313A4; KR102140531B1; EP3835313A1; JP2021532811A

Abstract

本发明涉及甘氨酸‑胸腺素β4（Gly‑Tβ4）的制备方法。本发明具有优异的效果，因为根据本发明，可以通过色谱法、酶处理和过滤包含GST融合胸腺素β4（GST）的样品，以高生产率获得大量高纯度Gly‑Tβ4。

Description

制备GLY-Tβ4的方法

技术领域

本发明涉及一种制备甘氨酸-胸腺素β4(Gly-Tβ4)的方法，更具体地说，涉及一种制备Gly-Tβ4的方法，其包括表达作为Gly-Tβ4的前体的GST融合重组人胸腺素β4(以下称为“GST-Tβ4”)的表达工艺和Gly-Tβ4纯化工艺。

背景技术

大规模蛋白质纯化是在生物技术工业中变得越来越重要的问题。通常，通过使用哺乳动物或细菌细胞系通过细胞培养来生产蛋白质，哺乳动物或细菌细胞系经工程改造以通过插入含有靶蛋白基因的重组质粒来生产靶蛋白。由于本文使用的细胞系是活生物体，包含糖类，氨基酸和生长因子的复合培养基将提供给细胞，所述复合培养基通常由动物血清制剂提供。从提供给细胞的化合物和由细胞产生的副产物的混合物中分离出足够纯度的所需蛋白质以用于人类治疗是非常困难的。

但是，对于如蛋白质之类的生物制剂用作药物的情况，杂质的去除以及产品的产量非常重要。与工艺有关的杂质和与产品有关的杂质可能会有所不同。与工艺有关的杂质包含宿主细胞成分，例如蛋白质和核酸，并且源自细胞培养物(例如，培养基组分)或后处理工艺(例如，盐或分离的色谱配体)。与产品有关的杂质是具有不同性质的产物的分子变体。例如，此类分子变体包括通过脱氨基、不正确的糖基化或错配的二硫键以及缩短的形式例如前体和水解降解产物产生的修饰形式。与产品有关的变体还包括聚合物和聚集体。术语“污染物”用于表示具有化学、生物化学或微生物学特征的任何材料，这些材料不直接参与制备工艺。污染物包括可能不希望出现在细胞培养物中的病毒。

在生物制剂的情况下，杂质和污染物会引起安全问题。在生物制剂的情况下，这种情况经常发生，例如，如果通过注射或输液将治疗性蛋白质直接施用到血液中，可能会很严重。因此，宿主细胞组分可引起变态反应或免疫病理作用。此外，杂质可能导致所施用蛋白质的不希望的免疫原性，这会触发患者对治疗的不希望的免疫反应，例如导致致命的过敏性休克。因此，需要一种合适的纯化方法，该方法可以将所有不希望的物质去除到微不足道的水平。

同时，在生物制剂的情况下，经济方面不可忽视。因此，所使用的生产和纯化方法不应威胁所生产的生物制剂的经济可行性。此外，能够建立新的纯化方法所用的时间的测量也起着重要的作用。也就是说，除了成本效应外，工艺开发还需要与药物的临床前和临床开发相协调。因此，例如，只有在有足够纯度的的生物制剂以足够数量可用时才能启动某些临床前试验和所有临床试验。

从细胞碎片中纯化蛋白质的方法最初取决于蛋白质的表达位点。一种蛋白质可以直接从细胞分泌到周围的增殖培养基中，另一种蛋白质可以在细胞内产生。对于后一种蛋白质，纯化方法的第一步包括细胞裂解步骤，可以通过各种方法进行，包括机械剪切，渗透压冲击或酶处理。由于这种细胞裂解，整个细胞内含物被释放到细胞悬液中，并且产生由于其小尺寸而难以去除的细胞内片段。这些细胞内片段通常通过分级离心或过滤除去。在自然细胞死亡和蛋白质产生过程中，由于宿主细胞蛋白质在细胞中的释放而直接分泌的蛋白质中也出现了这个问题，程度比上述情况要小。

当获得含有靶蛋白的纯化溶液时，将靶蛋白与细胞产生的另一种蛋白质的分离通常通过不同的色谱技术的组合来进行。这种色谱技术的关键在于，由于蛋白质可以不同的速度沿色谱柱向下移动，因此蛋白质可能会越来越多地被物理分离，或者选择性地粘附到分离介质上，从而被不同的溶剂差异洗脱。在某些情况下，当杂质特异性附着在色谱柱上，而靶蛋白未附着在色谱柱上时(即存在于流通液中)，靶蛋白就会从杂质中分离出来，或者当靶蛋白特异性附着在色谱柱上，附着的靶蛋白可以通过洗脱与杂质分离。已知可用于该步骤的多种柱色谱方法和材料。但是，随着替代方法数量的增加，就纯化效果、产量、生物活性、时间和成本而言，需要进行大量的初步试验来确定最佳的材料和方法。

此外，在纯化方法的建立和优化中，很明显，必须根据要纯化的特定分子(靶分子或靶蛋白)和生物起始材料的生物化学和生物物理特性分别对方法进行调整。从其分离靶材料的生物起始材料通常由非常复杂的材料的混合物形成。为了分离和浓缩靶分子，使用了特定的特征，例如形状、大小、溶解度、表面电荷、表面疏水性和对结合伴侣的生物特异性亲和力。对于新的目标分子，即，即使对于仅在先前步骤之一中发生了变化的相同目标分子(例如，发酵培养基的组成的变化)，也必须重新调整纯化工艺，因为在新条件下从上述方面可能无法实现最佳结果。

同时，理论上可以估计的替代工艺的数量取决于上面列出的参数的数量。在柱色谱中，例如，在整个工艺中，一系列色谱步骤、柱材料、pH、盐含量和所使用的各种洗脱缓冲液的性质，装入柱中时的蛋白质浓度以及其他方面需要优化。这使得不可能在工业规模上在适当的成本和时间范围内开发最佳的柱色谱工艺。同时，经济上的可行性和与设备相关的限制(例如，使用尽可能少种类的缓冲液，最小量或最小体积的缓冲液和色谱材料的必要性，保持包含产物的级分(fraction)体积尽可能小的必要性以及最短处理时间和最少废水体积的必要性)在每个工艺步骤中都需要优化。

因此，可以快速且低成本地建立和优化生物分子的柱色谱纯化方法，并且仍然迫切需要在大规模生产和纯化条件下获得令人满意的结果的工艺。

然而，甘氨酸-胸腺素β4(Gly-Tβ4)是由44个氨基酸的序列表示的肽，并且具有添加到常规胸腺素β4(Tβ4)的N末端的甘氨酸(Gly)。Gly-Tβ4是通过对Tβ4的已知四级结构分析和蛋白质N末端的基因工程修饰而发现的，其具有与原始Tβ4不同的活性。Tβ4的结构和功能是相对定义的，并且Tβ4是已知的主要胸腺因子之一。已知Tβ4是从牛乳腺中提取的胸腺素级分5(TF5)中第一个分离的多肽，它具有43个氨基酸，分子量为4963KD，无二硫键和糖基化(The Journal of Biological Chemistry，第257卷，第2期，第1000-1006页，1982，Chemical Characterization of Thymosin beta)。

通过在经操纵以表达常规Gly-Tβ4的细菌细胞中发酵来表达和纯化Gly-Tβ4，获得了Gly-Tβ4。然而，已经指出，纯化中损失了大量蛋白质，并且通过上述工艺获得的Gly-Tβ4最终具有较低的生产率。此外，当根据由中国北京的诺思兰德生物技术股份有限公司(Northland Biotech)制造(以下称为“NR培养方法”)的常规的30L培养批次记录发酵GST-Tβ4时，也指出存在诸如形成培养基沉淀物和乙酸盐积累以及生产力低下的缺点。此外，根据诺思兰德生物技术股份有限公司的纯化方法进行纯化时，由于低增殖率，高单位成本和最终产物的低纯度，用作药物存在许多问题。

发明内容

技术问题

本发明旨在提供一种稳定地大规模获得高纯度Gly-Tβ4的方法。更具体地，本发明提供了制备甘氨酸-胸腺素β4(Gly-Tβ4)的方法，其包括以下步骤：(S1)将包含GST融合胸腺素β4(GST-Tβ4)的样品加载到用平衡缓冲液平衡的一级阴离子交换色谱柱中，并用洗脱缓冲液洗脱附着在色谱柱上的级分；(S2)对洗脱液进行亲和色谱；(S3)通过凝血酶处理酶促裂解洗脱液；(S4)将裂解产物装载在用平衡缓冲液平衡的二级阴离子交换色谱柱中，并用洗脱缓冲液以1.8mg/mL或更低的动态结合载量(DBC)洗脱附着于该柱的级分；(S5)将洗脱液加载到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤该柱，并用洗脱缓冲液以5mg/mL或更低的DBC洗脱附着在该柱上的级分；和(S6)过滤洗脱液。

然而，本发明中要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员将从以下描述中充分理解本文中未描述的其他问题。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备甘氨酸-胸腺素β4(Gly-Tβ4)的方法。

更具体地说，根据本发明的制备Gly-Tβ4的方法包括以下步骤：

(S1)将样品加载到用平衡缓冲液平衡的一级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤该柱，并用洗脱缓冲液洗脱附着在该柱上的级分；

(S2)对洗脱物进行亲和色谱；

(S3)通过凝血酶处理酶促裂解洗脱物；

(S4)将裂解产物加载到用平衡缓冲液平衡的二级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤该柱，并用洗脱缓冲液以3mg/mL或更小的动态结合能力(DBC)洗脱附着于该柱的级分；

(S5)将洗脱液加载到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱上，用洗涤缓冲液洗涤该柱，并用洗脱缓冲液以3至8mg/mL的DBC洗脱附着于该柱的级分；和

(S6)过滤洗脱物。

在步骤(S4)中，可以将裂解产物以pH 8至9和4mS/cm或更小的电导率加载到柱中。

用pH 7至9的缓冲液洗脱附着到步骤(S4)中阴离子交换色谱的柱上的级分，该缓冲液包含10至30mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和30至130mM NaCl，流速为100至300cm/小时

在步骤(S5)中的阳离子交换色谱中，将裂解产物在pH 4至7和4mS/cm或更小的电导率的条件下加载到柱中。

在步骤(S5)中的阳离子交换色谱中，用pH 4至5的缓冲液洗脱附着在柱上的级分，该缓冲液包含10至30mM的乙酸盐和150至210mM的NaCl，流速为100至300cm/小时

在步骤(S3)中，靶蛋白与凝血酶的比例可以为5至0.5：1(单位：mg)。

步骤(S3)中的反应温度可以为13至27℃。

根据该方法的最终纯化的提取物的纯度可以为97％或更高。

在步骤(S1)中，可以通过以下步骤获得样品：

培养表达靶蛋白的宿主细胞；裂解宿主细胞；并洗涤和过滤裂解物。

在诱导开始时，宿主细胞的主要培养物可以在OD₆₀₀为40至65且诱导温度为25至35℃的情况下补料分批(fed-batch)培养。

根据该方法的细胞生产率可以是180g小球/L(g pellet/L)或更高，并且靶蛋白的生产率可以是54mg/g小球(mg/g pellet)或更高。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明涉及一种甘氨酸-胸腺素β4(Gly-Tβ4)的制备方法，其包括以下步骤：

(S2)对洗脱液进行亲和色谱；

(S3)通过凝血酶处理酶促裂解洗脱液；

(S4)将裂解产物加载到用平衡缓冲液平衡的二级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤柱，并用洗脱缓冲液以1.8mg/mL或更小的动态结合载量(DBC)洗脱附着于柱的级分；

(S5)将洗脱液加载到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换色谱中，用洗涤缓冲液洗涤色谱柱，并使用洗脱缓冲液以5mg/mL或更小的动态结合载量(DBC)洗脱附着于柱的级分；和

(S6)过滤洗脱液。

在此使用的术语“甘氨酸胸腺素β4(Gly-Tβ4)”优选为哺乳动物，最优选为人Gly-Tβ4蛋白质或其多肽。人Gly-Tβ4蛋白质的氨基酸序列在GenBank号NP_066932.1中公开，人Gly-Tβ4蛋白质的遗传序列在GenBank号NM_021109中公开。

本文使用的术语“样品”是指靶蛋白和一种或多种类型的污染物的混合物，并且“靶蛋白”包括Gly-Tβ4，其多肽或其前体，优选地，Gly-Tβ4的前体是指GST融合胸腺素β4(GST-Tβ4)。根据本发明的一个实施方式，样品包含GST融合胸腺素β4(GST-Tβ4)。

在本发明中，进行至少4个色谱循环。优选地，进行4个色谱循环。最优选地，进行2个阴离子色谱循环，1个亲和色谱循环和1个阳离子色谱循环。此外，在步骤S1)之前或之后，步骤S2)之前或之后，步骤S3)之前或之后，步骤S4)之前或之后，步骤S5)之前或之后，或步骤S6)之前或之后，可以进一步进行任何一个或多个选自由亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式色谱组成的组中的色谱技术。

在本发明中，所有类型的色谱优选地根据结合/洗脱(B/E)模式进行。术语“B/E模式”是指色谱的工作方法，其中通过将包含要纯化的靶蛋白(例如样品)的溶液施加到色谱材料上，靶蛋白与色谱材料结合。因此，靶蛋白被保留在色谱材料上，而不对应于靶蛋白的材料与流通液或上清液一起被去除。然后通过洗脱缓冲液从色谱材料中回收靶蛋白。在本发明中，根据B/E模式，可以高效地获得高纯度的靶蛋白。

术语“应用(application)”是指纯化方法的部分步骤，其中含有靶蛋白的溶液与色谱材料接触。这意味着(a)将溶液添加至包含色谱材料的色谱设备中，或(b)将色谱材料添加至溶液中。在(a)中，溶液通过设备使色谱材料与溶液中所含材料相互作用。例如，根据如pH，电导率，盐浓度，温度和/或流速等条件，溶液中的一些材料可以结合到色谱材料上，并且其他材料可以从色谱材料中回收。残留在溶液中或从色谱材料中回收的材料可能会在流通液中找到。术语“流通液”是指在通过设备后获得的溶液，其可以是应用于洗涤柱子或引起与色谱材料结合的材料洗脱的缓冲液(或溶液)。该设备是色谱柱或盒子。在(b)中，色谱材料是例如固体，并且通过添加到包含要纯化的材料的溶液中来允许色谱材料与溶液中的材料之间的相互作用。相互作用后，可以通过过滤除去色谱材料，并且还从溶液中除去与色谱材料结合的材料，而与色谱材料不结合的材料残留在溶液中。

在本发明的色谱步骤中，包括平衡、加载、洗涤和洗脱过程，并且在每个过程中，可以使用缓冲液。

本文所用的术语“缓冲液”是通过酸碱复合物成分的作用而抵抗pH变化的溶液。例如，在文献[Buffers.A Guide for the Preparation and Use of Buffers inBiological System,Gueffroy,D.,Ed.Calbiochem Corporation(1975)]中公开了可以根据缓冲液的期望pH使用的各种缓冲液。通常，使用药学上可接受的缓冲液。一方面，缓冲液选自由磷酸和/或其盐组成的磷酸盐缓冲液，由乙酸和其盐组成的乙酸盐缓冲液，由柠檬酸和/或其盐组成的柠檬酸盐缓冲液，吗啉缓冲液，2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，组氨酸缓冲液，甘氨酸缓冲液和三(羟甲基)氨基甲烷(tris)缓冲液。在另一方面，所述缓冲液选自Tris缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液。缓冲液可包含例如无机盐，诸如氯化钠、硫酸钠、氯化钙、硫酸钙、氯化铵或硫酸铵。

在本发明中，术语“平衡缓冲液”在加载到柱子之前使用，并且平衡缓冲液可以是例如选自由柠檬酸钠、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钙、硫酸钾、磷酸钾、Tris、Tris-盐酸(HCl)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)组成的组中的任意一种，但本发明不限于此。

本文所用的术语“洗涤缓冲液”是指用于在洗脱靶蛋白之前洗涤或重新平衡离子交换树脂的缓冲液。离子交换树脂的“洗涤”是指将合适的(洗涤)缓冲液渗透进离子交换树脂中或通过离子交换树脂。例如，洗涤缓冲液可以是选自由柠檬酸钠、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、Tris、Tris-盐酸(HCl)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-[(3-苯甲酰氨基丙基)-二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)组成的组中的任意一种，但本发明不限于此。

本文使用的术语“洗脱”是用于从离子交换树脂(或色谱柱)洗脱分子(例如，靶蛋白质或污染物)，以及通过改变离子交换树脂(或色谱柱)周围的缓冲液的离子浓度，以使缓冲液与分子竞争离子交换树脂的带电部分，从离子交换树脂(或色谱柱)去除分子。用足够量的缓冲液进行洗脱以引起靶蛋白的有效洗脱，从而回收包含靶蛋白的洗脱缓冲液。“有效洗脱”是指从树脂中洗脱含有树脂中负载的靶蛋白的溶液的75％或更多，或80％或更多，例如85％或更多。在本发明中，术语“洗脱缓冲液”用于从离子交换树脂(或柱)洗脱靶蛋白。洗脱缓冲液可以是例如选自由柠檬酸钠、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、Tris、Tris-盐酸(HCl)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-[(3-苯甲酰氨基丙基)-二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)组成的组中的任意一种，但本发明不限于此。洗脱缓冲液的电导率和/或pH是从树脂(柱)洗脱靶蛋白的电导率和/或pH。在本发明中，电导率和/或pH是实际上使用树脂洗脱的所有污染物和靶蛋白的程度。

本文使用的术语“电导率”是指水溶液允许电流在两个电极之间流动的能力。在溶液中，电流通过离子传输流动。因此，当水溶液中存在的离子量增加时，溶液可以具有更高的电导率。电导率的测量单位是mmhos(mS/cm)，并且可以使用市售电导率仪例如Orion来测量电导率。溶液的电导率可以通过改变溶液的离子浓度来改变。例如，为了获得所需的电导率，溶液和/或盐(柠檬酸钠、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、Tris、Tris-盐酸(HCl)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和3-[(3-苯甲酰氨基丙基)-二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS))中缓冲材料的浓度可能会更改。优选地，可以通过改变各种类型的缓冲液的盐浓度来获得所需的电导率。

本文使用的术语“动态结合能力(DBC)”是指在色谱条件下目标分子与一定量的树脂结合的载量(Q)。由于材料之间的结合能力会根据温度、pH或流速引起平衡和解离常数(K)的变化，因此应该知道目标分子在树脂中的结合能力，以计算所需的树脂量或每柱标本的负载量。DBC可用作确定要分离或纯化多少材料的参考数据。DBC测量所有目标分子结合到色谱柱后洗脱开始的时间点，通常将达到负载目标分子的10％的浓度的时间点设置为起始点(Q_B，10％：在10％穿透点时的结合载量)。根据目标分子的特性，鉴别测试和测量的方法可以是例如ELISA、SEC或UV吸光度之类的分析方法，在设定了10％的穿透点后，计算从装载时起到相应起点的总体积比以计算目标材料的总量和负载量(V_10％*C₀)，然后除以树脂体积(Vc)：Q_B，10％＝V_10％*C₀/Vc。

如果需要，可以将根据本发明的方法获得的靶蛋白样品进行额外的纯化步骤。

本文中使用的“纯化”是指通过从其中靶蛋白与一种或多种类型的污染物混合的样品中完全或部分去除一种或多种类型的污染物来提高靶蛋白的纯度。

根据本发明，最终纯化的提取物的纯度为97％或更高。

在下文中，将逐步描述本发明。然而，为了避免过多的重复，在每个步骤中的重复描述仅在第一次提到部分中提供了一次，并且被省略。

该方法包括(S1)将包含GST融合胸腺素β4(GST-Tβ4)的样品加载到用平衡缓冲液平衡的一级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤该柱，并用洗脱缓冲液洗脱附着在柱上的级分。

在本发明中，在阴离子交换色谱步骤中的阴离子交换树脂可以是一个或多个附着到固相的带正电荷的配体，其被例如二乙氨基乙基(DEAE)或季铵基团取代，但本发明不限于此。优选地，可以选择和使用具有强碱性季铵基团和弱碱性DEAE基团的阴离子交换树脂中的任何一种。例如，作为强碱性阴离子交换树脂，可以使用Q Sepharose Fast Flow，QSepharose High Performance，Resource Q，Source 15Q，Source 30Q，Mono Q，Mini Q，Capto Q，Capto Q ImpRes，Q HyperCel，Q Cermic HyperD F，Nuvia Q，UNOsphere Q，Macro-PrepHighQ，Macro-Prep 25Q，Fractogel EMD TMAE(S)，Fractogel EMD TMAE Hicap(M)，Fractogel EMD TMAE(M)，Eshmono Q，Toyopearl QAE-550C，Toyopearl SuperQ-650C，Toyopearl GigaCap Q-650M，Toyopearl Q-600C AR，Toyopearl SuperQ-650M，ToyopearlSuperQ-650S，TSKgel SuperQ-5PW(30)，TSKgel SuperQ-5PW(20)或TSKgel SuperQ-5PW，但本发明不限于此，可以使用本领域已知的阴离子交换树脂。在本发明中，使用FractogelEMD TMAE(M)作为一级阴离子交换树脂，但本发明不限于此。

阴离子交换色谱步骤中使用的树脂的合适体积通过柱尺寸即柱的直径和树脂的高度来反映，并且例如根据所施加的溶液中靶蛋白的量和所用树脂的结合性能而变化。在阴离子交换色谱之前，优选用缓冲液平衡阴离子交换树脂，以使树脂与其反荷离子结合。

根据本发明的一个实施方式，在步骤(S1)中的阴离子交换色谱中，可以将样品以pH 8至9和4mS/cm或更小的电导率加载到柱中。更优选地，可以将样品以pH 8和2mS/cm或更小的电导率加载到柱中。

在本发明中，步骤(S1)中的阴离子交换色谱法使用pH为8至9的缓冲液进行。

根据本发明的一个实施方式，本发明的步骤(S1)中用于阴离子交换色谱的柱可以用10至30mM，优选20mM Tris-HCl平衡至pH 7至9，并且优选，pH 8。

此外，根据本发明的一个实施方式，本发明的步骤(S1)中的阴离子交换色谱的离子交换树脂用pH 7至9，优选pH 8的缓冲液洗涤，该缓冲液包含10至30mM的Tris-HCl，优选20mM的Tris-HCl。

根据本发明的一个实施方式，用pH 7至9，优选pH 8的缓冲液洗脱附着到本发明的步骤(S1)中阴离子交换色谱中柱的级分，其中所述缓冲液包含为10至30mM，优选20mMTris-HCl和200至400mM，优选300mM NaCl，流速为100至300cm/小时，优选200cm/小时。

根据本发明的一个实施方式，在步骤(S1)的阴离子交换色谱中，DBC为5至9，并且优选为7.5mg GST-Tβ4/mL树脂。

该方法包括(S2)在洗脱液上进行亲和色谱。

本文中使用的术语“亲和色谱”是指蛋白质分离技术，其中靶蛋白特异性地结合对其特异的配体。该配体通常被称为生物特异性配体，并且与靶蛋白特异性地相互作用(例如，酶-底物，酶-抑制剂或抗原-抗体)。在一些实施方式中，生物特异性配体通过共价键连接至色谱树脂，并且当溶液接触色谱树脂时，配体可接近溶液中的靶蛋白。靶蛋白通常在色谱过程中具有对生物特异性配体的特异性结合亲和力，但是混合物中的其他溶质和/或蛋白质不能清楚地或特异性地与配体结合。靶蛋白与固定的配体的结合允许污染物蛋白质或蛋白质杂质通过色谱树脂，但是保持靶蛋白与固相材料上的固定的配体特异性结合。然后在合适的条件下(例如，低pH，高pH，高盐或竞争性配体)从固定的配体中以活性形式除去特异性结合的靶蛋白，并使其通过带有洗脱缓冲液的色谱柱而不含先前允许通过色谱柱的污染物蛋白质或蛋白质杂质。

亲和色谱步骤中的亲和树脂可以是连接到固相的一种或多种类型的配体，例如，Blue Trisacryl M，Protein A Ceramic HyperD，MEP HyperCel，Lysine HyperD，HeparinHyperD M，HA Ultrogel或Glutathione Sepharose 4Fast Flow，但本发明不限于此，并且也可以是本领域中已知的亲和树脂。在本发明中，作为亲和树脂，使用了GlutathioneSepharose 4Fast Flow，但本发明不限于此。

根据本发明的一个实施方式，本发明的步骤(S2)中用于亲和色谱的柱用10至30mM，优选20mM的Tris-HCl和100至200mM，优选150mM的NaCl平衡以具有pH为7至9并且优选pH 8，步骤(S2)中的亲和色谱的树脂用含有20mM Tris-HCl和100至200mM且优选为150mMNaCl且pH为7至9并且优选pH 8的缓冲液洗涤。亲和色谱中附着在色谱柱上的级分用含有40至60mM，优选50mM Tris-HCl和5至15mM，优选10mM谷胱甘肽，pH为7至9并且优选pH为8的缓冲液，以流速为53至73cm/小时，优选63cm/小时洗脱。作为酸性缓冲液，可以使用含有90至110mM，优选为100mM的乙酸钠，400至600mM且优选为500mM的NaCl，pH为4至6且优选为pH4.5的缓冲液，作为碱性缓冲液，可以使用可以使用含有50至150mM，优选为100mM的Tris-HCl和400至600mM，优选为500mM的NaCl，pH为7至9并且优选为pH 8的缓冲液，但本发明不限于此。

根据本发明的一个实施方式，在步骤(S2)的亲和色谱中，相对于GST-Tβ4的Glutathione Sepharose 4Fast Flow的DBC为9.3至9.5mg GST-Tβ4/mL树脂。

该方法包括(S3)通过凝血酶处理酶促裂解洗脱液。

在该步骤中，将通过步骤(S2)中的亲和色谱获得的洗脱液用酶(特别是凝血酶)处理。通过该步骤，在步骤(S2)中通过亲和色谱获得的洗脱液中所含的Gly-Tβ4的前体即GST融合胸腺素β4(GST-Tβ4)通过酶促裂解变为Gly-Tβ4。因此，在步骤(S3)之前的色谱中要纯化的靶蛋白优选为GST-Tβ4，并且在步骤(S3)之后的色谱中要纯化的靶蛋白优选为Gly-Tβ4。

与酶(例如凝血酶)相比，靶蛋白(例如GST-Tβ4)的体积比为但不限于优选0.5至5：1(单位：mg)，更优选3至1：1(单位：mg)，最优选2：1(单位：mg)。在0.5至5∶1(单位：mg)的范围内，酶反应速率特别高。酶(特别是凝血酶)的处理时间为但不限于，优选16至20(小时)。酶(特别是凝血酶)处理的温度为但不限于，优选13至27℃，更优选20至24℃。本领域普通技术人员可以根据条件适当地改变上述酶的体积、酶处理时间和温度，但是在优选的范围内，它们显示出最优异的效果。

该方法包括(S4)将裂解产物加载到用平衡缓冲液平衡的二级阴离子交换色谱柱中，并用洗脱缓冲液以3mg/mL或更小的动态结合载量(DBC)洗脱附着于该柱的级分。

根据本发明的一个实施方式，使用Fractogel EMD TMAE(M)作为二级阴离子交换树脂，但本发明不限于此。

在本发明中，步骤(S4)中的阴离子交换色谱是用pH为8至9的缓冲液进行的。

根据本发明的一个实施方式，在步骤(S4)中的阴离子交换色谱中，该步骤中的裂解产物可以以pH 8至9和4mS/cm或更小的电导率加载到柱中。更优选地，将裂解产物在pH 8和2mS/cm或更小的电导率下加载到柱中。

根据本发明的一个实施方式，用于本发明的步骤(S4)中阴离子交换色谱的柱使用含有10至30mM，优选20mM Tris-HCl的平衡缓冲液进行平衡，以具有pH 7至9，优选pH 8。

另外，根据本发明的一个实施方式，本发明的步骤(S4)中的阴离子交换色谱中的离子交换树脂用含有10至30mM，优选20mM Tris-HCl，具有pH 7至9，优选pH 8的缓冲液洗涤。

根据本发明的一个实施方式，用包含10至30mM，优选20mM Tris-HCl和30至130mM，优选80mM NaCl，具有pH 7至9，优选pH 8，流速为100至300cm/小时，优选为200cm/小时的溶液洗脱附着至本发明的步骤(S4)中阴离子交换色谱中柱的级分。

根据本发明的一个实施方式，步骤(S4)中的阴离子交换色谱中的DBC为3mg GST-Tβ4/mL树脂或更低，优选为1.8mg GST-Tβ4/mL树脂。此处，当本发明的柱的量乘以DBC时，可以获得最大负载量，例如，当柱体积(树脂体积)为24mL且DBC为1.8mgGly-Tβ4/mL树脂时，Gly-Tβ4的最大负载量为45.2mg。

该方法包括(S5)将洗脱液加载到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤色谱柱，并用洗脱缓冲液以3至8mg/mL或更小的DBC洗脱附着在色谱柱上的级分。

本文所用的术语“阳离子交换色谱”取决于靶蛋白与树脂之间的电荷-电荷相互作用。在阳离子交换色谱中，要结合的分子带正电，而固定的配体带负电。常规使用的阳离子交换树脂是S树脂(磺酸盐)，SP树脂(磺丙基)，SE树脂(磺乙基)和CM树脂(羧甲基)。然而，通常，阳离子交换色谱步骤可以用任何可商购的阳离子交换树脂进行。典型的市售产品包括，例如，Macro-Prep High S，Macro-Prep CM，Unosphere Rapid S，Unosphere Rapid S40，Nuvia S和Nuvia HR-S(美国加利福尼亚州Bio-Rad)，Toyopearl CM，Toyopearl SP和Toyopearl GigaCap S(德国Tosoh Bioscience)，Millipore ProRes S，Fractogel EMDCOO-，Fractogel EMD SO3-(德国默克公司)，Biosepra CM ceramic HyperD，Biosepra Sceramic HyperD，S HyperCel(颇尔公司，美国纽约州)，Poros HS，Poros XS(德国AppliedBiosystems)，YMC BioPro 30S，YMC BioPro 70S(欧洲YMC)CM-Sepharose FF，SP-Sepharose FF，S-Sepharose FF，SP-Sepharose HP，SP-Sepharose XL，SP-Sepharose BigBeads，CM-Sephadex，Capto S，Capto SP ImpRes和Source S(均为通用电气医疗集团，德国)，但本发明不限于此。“阳离子交换树脂”包括具有离子交换功能和疏水相互作用功能的混合功能的色谱树脂(例如，Capto adhere，Capto MMC，MEP HyperCell和Eshmuno HCX)和具有阴离子交换功能和阳离子交换功能的混合功能的色谱树脂(例如，羟基磷灰石和陶瓷羟基磷灰石)。本发明优选的阳离子交换树脂是使用磺酸盐或磺丙基配体的强阳离子交换基团。最优选地，优选的阳离子交换树脂是结合到刚性基质上的磺酸盐或磺丙基配体，例如，高度交联的琼脂糖，例如Nuvia HR-S，或聚(苯乙烯-乙烯基苯)，例如Poros 50HS。根据本发明的示例性实施方式，使用基于高度交联的琼脂糖基质的磺酸盐基团和Nuvia HR-S(如强阳离子交换基团)作为阳离子交换树脂，但本发明不限于此。

在本发明中，使用pH为4至7的缓冲液进行步骤(S5)中的阳离子交换色谱。

根据本发明的一个实施方式，在步骤(S5)的阳离子交换色谱中，可将裂解产物以pH 4至7和4mS/cm或更小的电导率加载到柱中。优选地，裂解产物以pH 4.5和2mS/cm或更小的电导率加载到柱中。

根据本发明的一个实施方式，用于本发明的步骤(S5)的阳离子交换色谱的柱用10至30mM，优选20mM的乙酸盐平衡以具有4至5的pH，且优选地pH 4.5。

此外，根据本发明的一个实施方式，本发明的步骤(S5)的阳离子交换色谱中的离子交换树脂用含有10至30mM，优选20mM乙酸盐和50至150mM，优选100mM NaCl，具有pH为4至5，优选pH 4.5的缓冲液洗涤。

根据本发明的一个实施方式，用包含10至30mM，优选20mM乙酸盐和150至210mM，优选180mM NaCl，具有pH为4到5，优选pH为4.5的缓冲液，以流速100到300cm/小时，优选200cm/小时洗脱附着至本发明的步骤(S5)的阳离子交换色谱中柱的级分。

在本发明中，步骤(S5)的阳离子交换色谱法中的DBC为8mg或更少Gly-Tβ4/mL树脂，3至8mgGly-Tβ4/mL树脂，优选为5mgGly-Tβ4/mL树脂。此处，当本发明的柱的量乘以DBC时，可以获得最大负载量，例如，当柱体积(树脂体积)为12.6mL并且DBC为5mgGly-Tβ4/mL树脂时，Gly-Tβ4的最大负载量为63mg。

该方法包括(S6)过滤洗脱液。

在本发明中，步骤(S6)中的过滤可以根据本领域已知的各种方法进行。优选地，过滤可以使用纳米过滤或超滤/渗滤(UF/DF)系统，最优选地，超滤/渗滤(UF/DF)。超滤/渗滤(UF/DF)是从含有溶剂和两种或更多种具有不同分子大小的溶质的液体中仅除去一些溶质的方法，并且对聚合物材料的纯化是有效的，并且与普通透析相比，具有减少时间和成本的优点。超滤/渗滤(UF/DF)在330mOsmol/kg或更低的渗透压下进行，然后通过将pH值调整为8。

在这一步骤中，可以对洗脱液进行透析和浓缩。

此外，在本发明中，可以通过以下步骤获得样品：

靶蛋白包含Gly-Tβ4，其多肽及其前体，并且Gly-Tβ4的前体包括GST融合胸腺素β4。

本文中使用的宿主细胞可以衍生自本领域已知的各种物种，并且根据本发明的实施方式，可以使用大肠杆菌(E.coli)，并且本发明不限于此。

本文使用的术语“培养物”包括用于宿主细胞的存活或增殖的种子培养物和用于发酵以在宿主细胞中表达靶蛋白的主要培养物。

本发明中使用的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基，例如Ham's F10(Sigma)，LB(溶源性肉汤)培养基，基本必需培养基(MEM；Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM，Sigma)适合用于宿主细胞的培养物。此外，在Ham等[Meth.Enz.58:44(1979)]，Barns等[Anal.Biochem.102:255(1980)]美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469，国际专利申请公开号90/03430或87/00195或美国专利号30,985文献中公开的任何培养基，可用作用于宿主细胞的培养物培养基。根据需要，可以在培养基中补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白或上皮生长因子)，盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如庆大霉素^TM药物)，微量元素(通常定义为在最终浓度下存在于微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。可以以本领域普通技术人员已知的合适浓度将任何其他必要的补充剂包括在培养基中。选择用于表达的宿主细胞的培养条件，例如温度和pH与常规使用的条件相同，并且对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

用于本发明的种子培养和主要培养的培养基可以由本领域普通技术人员从上述培养基和必要的补充物中适当地选择。优选地，可以在LB培养基中在35至40℃，优选在37℃下进行种子培养3至4小时，并且当OD₆₀₀达到2至6时，可以终止培养。此外，主要培养可以用补充葡萄糖和MgSO₄·7H₂O的进料A和补充胰蛋白和酵母提取物的进料B进行。此外，主要培养在pH 7至8下在35至40℃，优选在37±0.5℃下进行17小时。主要培养优选地用进料A开始，并且当诱导在OD₆₀₀为40至65，优选49至59时开始进行，进料B与IPTG添加和温度变化(25到35℃，优选30℃)一起施用，并且当诱导终止时，可能会中断进料B培养基的供应。这可以使细胞生长和靶蛋白的生产率最大化。

在本发明中，在本发明的培养之后可以进行补料分批发酵过程。补料分批是指一种培养方法，其中直到培养结束才从发酵罐中提取培养液，同时在培养进行的同时将营养培养基缓慢地添加到发酵罐中。在本发明中，根据补料分批发酵方法，显示出高生产率，并且对于解决形成培养基沉淀物和乙酸盐的缺点具有优异的效果。根据本发明的培养方法，细胞生产率可以为180g小球/L或更多，并且优选为185g小球/L或更多，并且靶蛋白(GST-T4)的生产率可以为54mg/g小球或更多，优选56mg/g小球或更多。

当优选地使用重组技术表达靶蛋白时，可以用表达或克隆载体转化宿主细胞，并在经修饰以适合于诱导启动子、选择转化子并扩基因增编码所需的序列的上述常规培养基中培养。

在本发明中，当使用重组技术在宿主细胞中表达靶蛋白时，靶蛋白可以在细胞内、膜间空间中产生或直接分泌到培养基中。当在细胞中产生靶蛋白时，包括裂解宿主细胞以及洗涤和过滤裂解物的步骤，作为第一步，例如，通过离心或超滤(UF)去除宿主或裂解细胞的裂解微粒(例如，通过均质化产生的)。当靶蛋白被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤(UF)设备，浓缩表达系统的上清液。根据本发明的一个实施方式，优选包括裂解宿主细胞的步骤以及洗涤和过滤裂解物的步骤。

有益效果

根据本发明，可以稳定地大规模制备高纯度的Gly-Tβ4，因此可以经济高效地获得优异的工业实用价值的Gly-Tβ4。

附图说明

图1示出了5L验证运行的进料策略。

图2示出了50L验证运行的进料策略。

图3示出了细胞生长以及葡萄糖和乙酸盐的浓度(验证运行5L培养)。

图4示出了SDS-PAGE测定的结果(5L验证运行)。

图5示出了细胞生长以及葡萄糖和乙酸盐的浓度(验证运行50L培养)。

图6示出了SDS-PAGE的结果(验证运行50L培养)。

图7示出了玻瓶培养细胞的生长(烧瓶1：w/YE，烧瓶2：w/o YE)。

图8示出了细胞生长以及葡萄糖和乙酸盐浓度(5L分批补料生长测试)。

图9(图9a至9m)示出了培养液中的细胞生长(DoE 13运行)以及葡萄糖和乙酸盐的残留量。

图10示出了SDS-PAGE和蛋白质定量(运行数据：DoE 12、7、8、5、10、2、13)。

图11示出了SDS-PAGE和蛋白质定量(运行数据：DoE 11、3、9、1、6、4)。

图12示出了用于DoE方差分析的拟合优度的结果(残差图)。

图13示出了Minitab响应条件的优化。

图14示出了响应(GST-Tβ4和细胞生产率)的等高线图。

图15示出了细胞生长以及葡萄糖和乙酸盐的浓度(确认DoE最佳条件可重复性)。

图16示出了SDS-PAGE和蛋白质定量分析1(最佳条件可重复性批次)。

图17示出了SDS-PAGE和蛋白质定量分析2(最佳条件可重复性批次)。

图18示出了细胞生长以及葡萄糖和乙酸盐的浓度(50L最佳条件放大工艺)。

图19示出了50L验证运行下游工艺流程图。

图20示出了通过细胞裂解缓冲液条件对细胞裂解物的SDS-PAGE分析。

图21示出了在细胞裂解物中对硫酸铵研究的SDS-PAGE分析。

图22示出了使用亲和柱的GST-Tβ4的回归曲线。

图23示出了线性流速(61cm/小时)的AEXI工艺色谱图。

图24示出了线性流速(200cm/小时)的AEXI工艺色谱图。

图25(图25a至图25b)示出了用于线性流速研究(a：61cm/小时，b：200cm/小时)的SDS-PAGE分析。

图26示出了500mM NaCl洗脱条件的AEXI工艺色谱图。

图27示出了200mM NaCl洗脱条件的AEXI工艺色谱图。

图28(图28a和28b)示出了用于洗脱缓冲液研究(a：500mM NaCl，b：200mM NaCl)的SDS-PAGE分析。

图29示出了加载样品条件(对照)的AEXI工艺色谱图。

图30示出了加载样品条件(50mM NaCl)的AEXI工艺色谱图。

图31示出了加载样品条件(80mM NaCl)的AEXI工艺色谱图。

图32(图32a和32b)示出了用于加载样品和EQ缓冲液研究(a：80mM NaCl，b：50mMNaCl)的SDS-PAGE分析。

图33(图33a，33b和33c)示出了用于AEX DBC测试的SDS-PAGE分析(a：10mg GST-Tβ4/mL树脂，b：8mg GST-Tβ4/mL树脂，c：75mg GST-Tβ4/mL树脂)。

图34(图34a和图34b)示出了在两种不同条件(a：储存温度：2至8℃，b：储存温度：18至22℃)下使用AEXI洗脱池的保持时间研究。

图35示出了线性流速(90cm/小时)的亲和色谱。

图36示出了线性流速(180cm/小时)的亲和色谱。

图37(图37a和37b)分别示出了从XK16(a)到XK50(b)的按比例放大测试的AEXI色谱图。

图38(图38a和38b)分别示出了在LRC10规模(a)和XK50规模(b)下用于可行性测试的亲和色谱图。

图39(图39a和39b)示出了在两种不同条件(A：储存温度：2至8℃，B：储存温度：18至22℃)下用亲和洗脱池研究的保持时间。

图40示出了在三个不同温度下消化后反应混合物的SEC-HPLC色谱图。

图41示出了在pH 4.5条件下的CEX工艺色谱图。

图42示出了在pH 4.5条件下用于CEX工艺的RPC-HPLC色谱图。

图43(图43a和43b)示出了丁基(a)和苯基(b)的一组HIC色谱图。

图44示出了Capto MMC工艺色谱图。

图45示出了MMC工艺洗脱级分的RP-HPLC分析。

图46示出了洗涤后逐步洗脱的MMC色谱图。

图47示出了用于100mM NaCl洗涤步骤的MMC色谱图。

图48示出了用于120mM NaCl洗涤步骤的MMC色谱图。

图49示出了用于140mM NaCl洗涤步骤的MMC色谱图。

图50示出了DSP流程图。

图51示出了对AEXII DBC洗脱样品的SEC-HPLC分析。

图52示出了加载量(1mgGly-Tβ4每mL树脂)的AEXII工艺色谱图。

图53示出了加载量(15mgGly-Tβ4每mL树脂)的AEXII工艺色谱图。

图54示出了对AEXII工艺洗脱样品的RP-HPLC分析。

图55示出了AEXII工艺色谱图，其中加载样品的电导率增加。

图56示出了用于AEXII保持时间研究的RP-HPLC色谱图。

图57示出了CEX工艺色谱图(在Huons)。

图58示出了CEX工艺色谱图(在BINEX)。

图59示出了预装柱(高：10cm)的CEX工艺色谱图。

图60示出了XK16色谱柱(高：20cm)的CEX工艺色谱图。

图61示出了具有床高为10cm的柱的CEX工艺色谱图。

图62示出了用于CEX保持时间研究的RP-HPLC色谱图。

图63示出了用于5L规模工艺的AEXI工艺色谱图。

图64示出了用于5L规模工艺的亲和工艺色谱图。

图65示出了用于5L规模工艺的AEXII工艺色谱图。

图66示出了用于5L规模工艺的CEX工艺色谱图。

图67(图67a，67b和67c)示出了AEXI工艺色谱图(a：循环1，b：循环2，c：循环3)。

图68(图68a，68b和68c)示出了亲和工艺色谱图(a：循环1，b：循环2，c：循环3)。

图69(图69a和69b)示出了AEXII工艺色谱图(a：循环1，b：循环2)。

图70(图70a和70b)示出了CEX工艺色谱图(a：循环1，b：循环2)。

具体实施方式

在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，而不是限制本发明。

1.发酵工艺

实施例(1)菌株信息

使用大肠杆菌BL21菌株制备产生GST融合人胸腺素β4(GST-Tβ4)的重组菌株，并制备RCB以用于本发明(表1)

表1

实施例(2)确认中国诺思兰德工艺的可重复性

(2-1)5L规模培养

参考中国北京诺思兰德生物技术股份有限公司的30L培养批次记录(以下称为“NR工艺”)，推导了5L缩小培养工艺的条件(表2、3和4)以及进行了第1至第4次培养。

表2

5L验证运行的培养条件

表3

5L验证运行的培养基组成

表4

组成	制备标准(L<sup>-1</sup>)
		氯化铁	16.0g
二氯化钴	2.0g
		氯化铜	1.0g
氯化锌	2.0g
		钼酸钠	2.0g
硼酸	0.5g
		浓盐酸	100.0mL
氯化钙	15.0g
		维生素B1	1.0g

微量元素溶液的组成(验证运行)

(2-2)生产50L规模样品

根据5L规模培养的结果和部分条件变化的结果，推导出样品生产的50L扩大条件(表5和6)。此外，在建立50L的进料策略之后，进行了2批非临床样品生产的工艺(图1)

表5

50L验证运行的培养条件

表6

50L验证运行的培养基组成

实施例(3)：用于提高GST-Tβ4生产率的补料分批发酵方法的开发

证实了上述NR工艺具有几个问题，例如生产率低、形成培养基沉淀和乙酸盐积累。因此，旨在开发能够解决上述问题的基本培养基组成和工艺条件。

(3-1)烧瓶培养(分批培养)

根据在BNS平台的培养基组成中是否存在酵母提取物(下文中称为“YE”)进行烧瓶培养实验(烧瓶1、2)(表7和8)。确定了用于补料分批工艺开发的菌株特异性生长参数，并确定了用于在发酵罐中进行主要培养的种子培养条件。

表7

烧瓶测试培养基组成

表8

烧瓶测试培养条件

(3-2)5L规模补料分批培养条件

(3-2-1)进料策略

设置补料分批培养参数(表9)以计算进料-A培养基的最佳补料速率。根据DoE实验条件(表10)，通过在诱导部分(诱导开始至培养结束)期间以恒定的进料方法计算添加所有制剂量的速率来施用进料-B。

表9

指数进料参数

表10

DoE补料分批培养的进料策略

(3-2-2)培养基的制备和工艺条件

建立了DoE补料分批培养工艺，该工艺从2.5L初始培养基开始并终止于4.2L(0.7L进料A，1.0L进料B)规模(表11、12和13)，相同条件应用于DoE培养实验。

表11

DoE补料分批培养基的组成(BNS-平台)

表12

微量元素溶液的组成(BNS-平台)

表13

DoE分批补料培养工艺的条件

(3-3)最佳补料分批培养条件的推导

为了优化诱导策略，设计了响应面法(以下称为“RSM”)测试。使用Minitab软件设计了针对两个因素(诱导起点和诱导温度)的2级全中心复合实验，以进行13次补料分批培养实验(表14至16)

表14

DoE因素和条件范围

表15

DoE实验设计的条件

表16

2级全中心复合因素实验的设计

(3-4)最佳培养工艺的可重复性合成

对RSM DoE培养实验的结果进行统计分析，得出最佳条件和响应值的目标标准，并在最佳条件下进行培养以确认培养的可重复性(表17)

表17

DoE最佳条件的可重复性确认

实施例(4)50L规模工艺(样品生产)的最佳条件放大

(4-1)培养工艺的条件

通过扩大用于开发5L规模工艺的最佳条件，进行了用于样品生产的50L培养工艺(表18和19)。

表18

用于优化的50L扩大培养的条件

*培养温度和pH与BNS-平台条件相同。

**反映75L设备(700rpm)的最大搅拌速度

表19

50L最佳条件放大培养的培养基组成

(4-2)回收条件

(4-2-1)细胞浆回收

(A)培养液的回收

-回收时间：培养液冷却后过夜(≤15.0℃)

-回收量：40至42L

(B)细胞浆的回收(连续离心)

①第一次回收

-回收前固体含量：≥20％

-滚筒转速：9,500rpm(11,119x g)

-进口流量：100L/M

-出口压力：100kPa

-细胞洗涤：40升去离子水(DIW)

②第二次回收

-回收前固体含量：≥10％

-滚筒转速：9,500rpm

-进口流量：100L/m

-出口压力：100kPa

-细胞洗涤：40L DIW

③第三次回收

-回收前固体含量：≥10％

-滚筒转速：9,500rpm

-进口流量：100L/m

-出口压力：100kPa

(4-2-2)细胞裂解和上清液回收

(A)裂解缓冲液的制备(20X)

-400mM Tris缓冲液，pH 8.0±0.2(合适的试剂：HCl)，电导率17±2mS/cm

-400mM Tris缓冲液组成：Tris 21.8g/L，Tris-HCl 34.7g/L

(B)细胞浆制备(15±1.5％，w/w)

①通过加入20X裂解缓冲液和DIW调节体积以使固体含量为15±1.5％。

②计算公式

#总重量＝细胞饼重量/0.15

#20X裂解缓冲液重量＝总重量/20

#添加的DIW量＝总重量-浆料重量-20X裂解缓冲液重量

(C)CIP(微流化床)

-0.5N NaOH：在11,000psi条件下，一次300mL，一次500mL

-DIW：在11,000psi条件下，一次300mL，一次500mL

(D)细胞裂解(微流化床)

①EQ：在11,000psi条件下，*300mL 1X裂解缓冲液

②细胞裂解：在11,000psi条件下，连续两次进行15±1.5％的细胞浆裂解

-细胞裂解标准：裂解前后的OD比率≤30％

-细胞裂解率的计算：(裂解后的OD₆₀₀/裂解前的OD₆₀₀)×100

③冲洗：在11,000psi条件下，使用1X裂解缓冲液50mL

(E)回收细胞裂解物的上清液(连续离心)

-滚筒转速：9,500rpm

-进口流量：100L/M

-出口压力：250kPa

(4-2-3)深度过滤

(A)过滤器信息

①深度过滤器：

-Millistak+POD C0HC：0.11m²×2ea

-Millistak+POD F0HC：0.11m²×2ea

②膜过滤器

-Opticap XL10(0.45μm)0.69m²×1ea

(B)过滤器清洗

-深度过滤器：DIW 100L/m²，流速300LMH(1,100mL/分钟)

-无菌过滤器：DIW 10L/m²，流速1,000mL/分钟

(C)深度过滤

实施例(5)培养液分析

(5-1)细胞密度的测定

通过测量600nm处的光密度获得培养液中的细胞浓度。将1mL培养液用蒸馏水稀释至OD600＝0.2至0.5，并测量光密度(OD₆₀₀)，然后乘以稀释倍数，从而获得细胞密度。通过标准化以表20中所示的方式进行样品稀释。

表20

OD值测量的稀释条件

(5-2)细胞代谢物测量

使用Cedex Bio(Roche，瑞士)分析仪(SOP No.FE02-921)，通过将1mL培养液在13,000rpm下离心5分钟而获得的上清液来测量培养液中的葡萄糖和乙酸盐浓度。

(5-3)细胞生产率的测定

(5-3-1)湿细胞重量的测量(g/L)

湿细胞重量通过以下方法测定。

①测量500mL试管+支持衬垫(SUPPORT CUSHION)的重量(准备两个)

②加入500mL的培养液的等分试样(使用500mL量筒)

③在4500rpm和4℃的条件下离心1小时(CE-6140设备)

④弃去上清液并测量含有小球的容器的重量(试管+衬垫)

⑤计算湿细胞重量(g/L)

湿细胞重量＝

(包含的小球重量–容器重量)g/0.5L(培养液体积)

⑥通过两次测得的湿细胞重量的平均值确定细胞的生产率。

(5-3-2)固体含量的测定(％)

①准备两个微试管

②使用精密天平测量并记录管的重量

③测量并记录装有1mL培养液的试管重量

④在13,000rpm和4℃的条件下离心5分钟

⑤弃去上清液并测量含有小球的试管的重量

⑥计算固体含量(％)：

⑦取两个测得的固体含量的平均值

(5-4)GST-Tβ4生产率的测量(SDS-PAGE和蛋白质定量)

①向OD600＝5的细胞小球样品中加入1,000μL裂解缓冲液(50mM Tris，100mMNaCl，0.1％2ME，5mM EDTA，pH 7.0)

②进行10秒钟的超声处理，并在冰上放置1分钟(重复7次)

③以10,000X g离心20分钟后，取15μL上清液

④制备15μL牛血清白蛋白(BSA)蛋白质标准试剂，其含量为0.5、1、2或4μg

⑤将15μL样品(离心上清液和BSA标准品)与5μL④中制备的样品缓冲液混合物混合(总体积：20μL)

⑥在70℃反应10分钟

⑦将整个样品(20μL)装入每个凝胶孔中

⑧在200V和400mA的条件下运行35分钟

⑨进行考马斯蓝染色20分钟或更多

⑩脱色2小时或更多

使用光密度计分析凝胶带密度的图像

实验实施例(1)确认中国诺思兰德工艺的可重复性

(1-1)5L规模培养

通过按比例缩小NR过程进行5L规模的验证运行，并且通过SDS-PAGE确认了GST-Tβ4的正常表达(图4)。最终细胞密度为OD600＝85、81、61、41、86(表21)，除了两个第三批(批次编号160428-B1，B2)，显示出类似于NR工艺的生长(图3)。然而，在整个工艺中，通过中断和恢复进料A的供应来积累培养液中的葡萄糖以控制生长，并且在进行第四步工艺时，试图不断改善碳源(进料A培养基)的供应。但是，除了第四步工艺，观察到乙酸盐的积累。因此，需要更精确地提高进料A培养基的进料速度。此外，在制备培养基之后，形成大量的沉淀，并且培养基组成的pH没有被优化，因此，常规NR工艺的缺点，例如在接种前单独滴定法的需求已经被确认。

表21

5L验证运行培养的结果

(1-2)50L规模培养(样品生产)

基于通过NR工艺的按比例缩小进行的5L规模验证培养的结果，推导出50L规模工艺条件(表5和表6，图2)，进行了2批50L样品的生产。与NR工艺相比(30L规模培养的结果)，两个批次(第1和第2个批次)中初始细胞生长的延滞期都比较长，但是最终细胞密度达到OD₆₀₀＝84或98，与NR工艺的结果(图5，表22)类似。两个批次中的乙酸盐浓度均在1g/L或更低，直到培养终点时都得到了很好的控制，但是在第二批次(批次编号160729)的情况下，培养的后半部分(17小时后)中葡萄糖的累积量高达2g/L。通过SDS-PAGE证实了GST-Tβ4表达(图6)，并且在连续离心培养液后，最终回收了3.0kg或3.3kg的细胞(表22)。

表22

50L验证运行的培养结果

实验实施例(2)：为了提高GST-Tβ4的生产率而进行的补料分批发酵工艺的开发

(2-1)烧瓶培养

为了确认用于计算DoE补料分批培养工艺的补料速率所需的细胞生长参数和种子培养工艺时间，进行了烧瓶培养实验。用与补料分批的初始培养基相同的培养基组成进行烧瓶1，并且使用从初始培养基中仅除去YE的组成进行烧瓶2。烧瓶1(包含YE)的延滞期比烧瓶2短，并且最大细胞密度(OD₆₀₀)一直生长到8.3(烧瓶1)或6.9(烧瓶2)(图7)。基于指数期的OD值和葡萄糖浓度，计算相对于葡萄糖底物的细胞产率(Y_X/S)和最大比生长速率(μm)(表23)。在使用发酵罐的5L补料分批培养实验中，选择了含YE的培养基组成，因此，使用烧瓶1的参数值计算了进料速度。对于5L分批补料种子培养工艺，OD₆₀₀≥2，并且培养时间确定为4小时以上。

表23

HU024细胞生长参数

(2-2)进料策略

(2-2-1)指数补料分批参数

参照先前进行的烧瓶1培养试验的结果，如表24所示，设定用于计算碳源的进料速度的各参数。在含有YE初始培养基组成的烧瓶分批培养中，最大比生长速率(μm)为0.43小时^-1(表23)，并且由于大肠杆菌培养中细胞的快速生长不利于可溶性蛋白型产物的产生，因此通过精确控制进料速度诱导准稳定状态以将比生长速率控制在0.3至0.14小时^-1。

表24

指数补料分批参数

(2-2-2)进料速度的计算(进料-A)

使用以下公式计算进料-A的进料速度。通过将每个参数值(表24)代入方程式④，然后每小时(dt)依次计算VX值(方程式①)，V值(方程式②)，X值(等式③)和F值(等式④)，计算出分批培养结束时的第一次进料速度。由于计算出的流量(F)表示为L/小时，因此换算为mL/分钟后，最终将流量转换为g/分钟单位，即泵设备的速度单位(表25)。

VX＝V_o·X_o+F_o ^＊dt^＊Si^＊Y_X/s---------------------①

V＝V₀+dt^＊F₀ ^＊比重---------------------②

X＝VX/V---------------------③

表25

指数进料速度的计算

(2-3)补料分批工艺中细胞生长的确认

为了确认在使用5L发酵罐的补料分批工艺中基础细胞的生长，通过以计算出的进料A的进料速度提供进料-A来进行补料分批培养(表23)(图8)。总共供应788.8mL的进料-A培养基，直到培养结束，并且通过将加入培养箱的总葡萄糖量397g(含初始葡萄糖)转化为最终培养体积(3.3L)来预测底物产量为(Y_X/S)时的最大细胞密度(OD₆₀₀)为136，几乎与实际培养结果的最大细胞密度(OD₆₀₀＝142)相似。从培养开始到结束，乙酸盐的浓度被很好地控制在小于1g/L，并且在培养3小时后，由于初始培养基中的初始葡萄糖被迅速消耗，因此甚至在开始葡萄糖进料后(4小时)，将浓度很好地控制在接近0g/L，直至培养结束，并且由于实际细胞生长的准稳态都被很好地诱导到接近设定的μ值，因此认为先前计算的进料速度(表25)是适当的。此外，补料分批培养实验的细胞生长结果被用作预测DoE培养实验起点的材料。

(2-4)最佳培养条件(DoE)的推导

(2-4-1)培养结果

根据DoE RSM设计条件进行了13次培养。在每种DoE条件下的诱导起点，开始IPTG添加和温度变化以及进料B培养基的进料，仅在诱导期提供由高浓度YE组成的进料B培养基，以便以最大化细胞生长和GST-Tβ4生产率的策略进行培养。除了第五批DoE(批次编号161027-B1)，最大细胞密度(OD₆₀₀)增长到140至196，并且总体控制良好，没有过多的葡萄糖和乙酸盐积聚(图9A至9M)。根据RSM DoE实验设计，在第5批DoE(161027-B1)中，作为最快的诱导起始条件(OD₆₀₀＝19.6)，葡萄糖和乙酸盐在培养液中的积累最多，这被认为归因于在足够的细胞生长之前进行诱导和温度变化。整个DoE批次运行的平均细胞生产率为185±31g/L(湿细胞重量)，并且通过SDS-PAGE和凝胶带图像分析(图10和11)确定的GST-Tβ4的总平均生产率为56.4±10.0mg/g(每个湿细胞的生产率)和10.4±2.2g/L(每个培养体积的生产率)，相对于50L验证运行的2个批次(一级，二级)的平均值，细胞生产率提高了大约1.5倍，而GST-Tβ4的生产率提高了大约2.5倍(表26)。

表26

DoE13次运行培养工艺结果的总结

(2-4-2)DoE统计分析

(2-4-2-1)方差分析(ANOVA)

使用Minitab软件对所有基于DoE的批次(13次运行)的细胞生产率和GST-Tβ4生产率值进行ANOVA(表27)。代表模型解释力的R²值是79.78％(GST-Tβ4生产率)和58.57％(细胞生产率)，被确定为普通水平，考虑了无重复的实验设计(考虑开发周期)以及其中涉及响应值的多个因素的培养场合的特征。由于诱导OD的p值为0.002(GST-Tβ4生产率)和0.029(细胞生产率)，因此被确认为相对于两个响应值(GST-Tβ4和细胞生产率)的重要因素，置信度小于0.05。由于诱导温度的p值为0.399(GST-Tβ4生产率)和0.299(细胞生产率)，因此确定对GST-Tβ4和细胞生产率结果没有影响。由于“诱导OD*温度”项中的p值分别为0.374和0.413，因此可以确定在响应值上没有“相互”影响，即两个因素之间的条件间干扰。

表27

RSM DoE实验的回归系数和ANOVA的结果

(2-4-2-2)残差图

参照执行的DoE模型结果的残差图的结果，通常显示出恒定的方差，没有特定的趋势或奇点。另外，根据时间和实验顺序独立地和随机地进行实验，并且根据正态分布，证实没有显示不拟合(图12)。

(2-4-2-3)推导最佳条件并确定设计空间

根据通过DoE RSM设计进行的培养实验的ANOVA结果，使用Minitab软件的响应优化工具获得了最佳条件。相对于细胞生产率和GST-Tβ4生产率，满足合成满意度0.67的水平上给出的最佳条件是诱导OD₆₀₀为53.9和诱导温度为28.9℃，目标响应值预测为58.5mg/g和分别为194g/L(表28，图13)。由于建议的最佳条件接近中心点条件，因此初始DoE设计的因素水平设置被认为是适当的，并且将最佳工艺中目标生产率的下限设置为中心点平均值的最低点(表29)。

表28

优化Minitab响应条件

使用平均中心点(54.1mg/g和180g/L)的最低点作为目标标准的下限以及前五批的平均值(64.1mg/g和208g/L)为目标标准的上限绘制的等高线图被确认(表29，图14)。等高线图的白色区域表示既满足GST-Tβ4生产率又满足细胞生产率的目标标准(≥54.1mg/g，≥180g/L)的设计空间，并且根据该空间的稳定范围再次推导出的最终优化工艺条件确定为诱导OD₆₀₀为54±5，诱导温度为30±1℃(表30)。

表29

HU024培养的最佳条件工艺的响应值的目标标准

表30

HU024培养的最佳工艺条件

(2-5)确认最佳培养条件的可重复性

从DoE RSM培养实验结果的统计分析得出的最终最佳条件(OD₆₀₀＝54±5，温度：30±1℃)进行培养，以确认响应值的可重复性。总共进行了4批培养工艺(表17)：1批(批次编号161122-B1)，使用与DoE实验中使用的YE产品(Springer 0202)相同的产品；2批次(批次编号161115-B1，161122-B2)使用BD公司生产的YE；和1批次(161124-B1)使用消泡产品(道康宁)和更改的曝气条件(0.5vvm)。对于道康宁公司生产的消泡剂，与现有消泡剂(Sigma204)相比，消泡剂的使用量增加了10倍以上。然而，所有4批次显示相似的生长，但是最大细胞密度(OD₆₀₀)为160或更高，并且葡萄糖和乙酸盐的浓度被良好地控制为1g/L或更低(图15)。细胞生产率为182、202、208或205g/L(表32)，两次重复GST-Tβ4生产率分析的平均值为66.5±0.3、57.5±2.4、65.1±9.5或66.6±2.6mg/g(表31，图16和图17)，并且所有4批次均达到最佳条件响应值的目标标准的结果(表29)或更高。结果，证实了在该研究中建立的5L规模的最佳培养工艺条件的可重复性，并且与再现NR工艺(批次编号160629、160729)的验证50L培养结果相比，细胞生产率大约提高了1.6倍，GST-Tβ4生产率提高了约2.8倍(表32)。

表31

*YE:酵母提取物

**DC:道康宁

确认5L规模最佳培养条件可重复性的结果汇总

实验实施例(3)50L规模最佳条件放大过程(样品生产)

通过扩大用于开发5L规模工艺的最佳条件，进行了样品生产的50L培养工艺。通过应用与5L规模进料策略相同的参数，计算50L规模补料分批培养的进料速度(表33)。作为2批次(批次编号170104、170114)的50L规模样品生产培养的结果，细胞生产率分别为207和208g/L，GST-Tβ4生产率分别为76.9和69.7mg/g(每小球的生产率)(表34)，满足了最佳条件响应值的目标标准(表29，细胞生产率≥180g/L和GST-Tβ4生产率≥54.1mg/g)，以及生长和代谢(葡萄糖和乙酸盐)趋势显示出与5L规模最佳条件可重现批次相同的模式(图18)。对于分批生产(批次编号170114)作为样品生产工艺的情况，从培养结束到培养液回收，将温度在培养箱中冷却至10℃，然后过夜(以下简称“O/N”)保持测试。O/N之前和之后的OD₆₀₀值分别为174.6(之前)和171.5(之后)，测得的小球生产率分别为221g/L(之前)和208g/L(之后)(表34)。表35中汇总了样品生产(批次编号170114)的结果。

表33

50L放大工艺中指数进料速度

表34

50L最佳条件放大培养的结果汇总

表35

50L样品生产(批次编号170114)结果的汇总

2.纯化工艺

实施例(1)背景和初步实验

将使用Q FF-GST FF-酶消化-UF/DF-Q XL-来源30RPC-Q HP-UF/DF进行的中国工艺与使用Q FF-GST FF-酶消化-Q FF-UF/DF进行的更优化的Huons工艺进行比较。因此，基于Huons工艺，进行了旨在提高纯度、优化单元工艺并最小化GST FF树脂的高成本的实验。

(1-1)一级色谱柱的树脂筛选

为了使昂贵的GST色谱柱的DBC最大化，取代了在中国工艺中用作一级色谱柱的QFF树脂，通过提高洗脱级分的纯度，Nuvia Q，Factrogel TMAE(M)被用于证实改善GST树脂的DBC的效果。将使用两种树脂类型纯化的洗脱池应用于GST色谱柱时，无论树脂类型如何，DBC约为42至44mg/mL(表36和37)。因此，决定在工艺开发中使用产率相对较高的FractogelTMAE(M)。

表36

*Nuvia Q的CV：6.8mL，加载量：7.2mg/mL树脂

**亲和CV：使用1mL柱

使用Nuvia Q洗脱样品的Nuvia Q树脂的分步收率和亲和树脂的DBC

表37

*TMAE(M)的CV：8.6mL，加载量：6.8mg/mL树脂

**亲和CV：使用1mL柱

使用TMAE(M)洗脱样品的TMAE(M)树脂的分步收率和亲和性树脂的DBC

(1-2)50L验证运行测试

基于Huons工艺，确认了小规模工艺的可重复性，并且使用50L规模的培养液进行了第一次验证运行和第二次验证运行(图19，表38和39)。

表38

第一批50L验证运行工艺的条件

以与小规模工艺中相同的方式进行第一次验证运行，结果显示如下(表39和40)。

表39

HU024小规模验证运行的分步产率

表40

*回收&AEXI为通过2个循环获得的结果

**亲和工艺是通过3个循环获得的结果

***仅从流通液级分获得

第一批HU024验证运行的分步产率

参考小规模纯化结果和第一次验证运行结果，在AEXII工艺(凝血酶消化后的AEX工艺)中，从流通液(F/T)级分中确认了许多靶蛋白(表40)。因此，在第二次验证中，以流通模式进行工艺(表41)

表41

*每个工艺的树脂与第一次验证运行使用的相同

第二批50L验证运行工艺的条件

表42

*回收&AEXI为通过2个循环获得的结果

**亲和工艺是通过3个循环获得的结果

***UF/DF是通过由于内毒素的两次再加工获得的UF/DF值

第二次HU024验证运行的分步产率

在第一次验证运行中，AEXII工艺中F/T级分的纯度被确认为99.4％(RP-HPLC)和97.9％(SE-HPLC)，而洗脱级分的纯度被确认为非标准(表43)。在第二次验证运行的情况下，当AEXII工艺以流通模式进行时，与第一批验证相比，纯化产率提高了(4.3->7.6％)，但纯度略有降低(97.9->97.0％)(表44)。

表43

第一次验证运行的质量概况

表44

*再加工是应用样品至AEX(F/T)→AEX(B/E)的两个循环

第二次验证运行的质量概况

但是，在两次验证运行中，最终纯化提取物的SE-HPLC纯度小于98％。因此，除了优化单元工艺以外，还计划开发工艺以将纯度提高到98％或更高。

(1-3)细胞破碎条件的优化

对于单元工艺优化，检查是否改善细胞破碎效率。

(1-3-1)改善裂解缓冲液的实验

证实了改善细胞破碎效率的可能性。当添加EDTA和Triton X-100作为清洁剂时，回收的靶蛋白含量的增加是微不足道的(大约增加4％至6％)，因此确定为保持先前的条件(图20和表45)

表45

*基础缓冲液组成:20mM Tris-HCI,pH 8.0

通过细胞破碎缓冲液比较GST-Tβ4条带密度的条件

(1-3-2)去除杂质实验

根据NR(中国工艺)，检查了利用通过添加硫酸铵引起的盐析去除杂质的可能性。在NR工艺中，采用了每100mL裂解物溶液添加5.6g(33％)硫酸铵的工艺，而在本实验中，确认了在用16.5％，33％或66％的硫酸铵处理的裂解物溶液中的GST-Tβ4的量。与不含硫酸铵的样品相比(图21和表46)，随着硫酸铵含量的增加，GST-Tβ4含量降低了20％，37％或43％。当使用硫酸铵时，GST-Tβ4含量也降低，因此确定不添加硫酸铵。

表46

*通过光密度计定量

通过加入硫酸铵可相对减少GST-Tβ4的量

(1-3-3)破碎条件的改变

改变了微流化床的条件。将两次验证运行中使用的细胞破碎条件(30％的细胞浆，压力为15,000psi，并重复破碎3次)更改为目前在Binex GMP设施中使用的细胞破裂条件(15％的细胞浆，压力为10,000psi，并且重复破碎两次)。当应用改变的破碎条件时，破碎后样品的光密度(OD₆₀₀)的降低程度等于或高于常规方法(表47)。从使用5L规模培养液的纯化工艺的开发中应用改变的条件。

表47

根据不同破碎条件的细胞光密度

(1-3-4)深度过滤筛分试验

根据默克密理博(Merck Millipore)提供的过滤器测试的第一个结果，选择了C0HC和F0HC，并将其应用于验证运行。在工艺过程中发生过滤器堵塞，其原因尚未分析。之后，在5L和50L工艺中使用了相同的过滤器，但未发现堵塞。因此，可以确认不管过滤器的种类如何都发生了堵塞，并且期望通过改变破碎条件来解决堵塞。

改变破碎条件后，要求对默克密理博进行第二次过滤器测试，并建议使用X0HC。对赛多利斯(Satorius)要求进行过滤器测试，因此选择了Sartoclear PC2(表48)。结果是，使用了默克密理博公司生产的深度过滤器，并用C0HC和F0HC进行了5L工艺和第三次50L验证运行(默克报告修订版#2<2016.06.17>，默克报告修订版#1<2016.10.20>，赛多利斯报告<文件号SKB201604>)。

表48

每个供应商推荐的深度过滤器和无菌过滤器的信息

实施例(2)每个工艺样品的分析条件

(2-1)紫外线定量法

通过以下方程式(方程式1)进行蛋白质定量，并将其用于亲和工艺的工艺样品的蛋白质定量。

[方程式1]

蛋白质浓度(mg/mL)＝吸光度(280nm)/1.385

(2-2)SEC-HPLC分析

凝血酶消化后对工艺样品进行分析，并根据样品尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)定量测试和Gly-TB4 SEC-HPLC纯度测试进行SEC-HPLC分析工艺样品(根据于2016年11月16日修订的药品标准操作程序(SOP))，可以在Gly-TB4工艺中进行纯度测量，并可以使用能实现GST和Gly-TB4分离的条件对Gly-TB4进行定量测量。条件如下。

表49

SEC-HPLC分析方法和条件

(2-3)RP-HPLC分析

在凝血酶消化后对工艺样品进行分析，并根据可进行定量测量的Gly-TB4 RP-HPLC定量测试和可进行纯度测量的Gly-TB4 RP-HPLC纯度测试进行工艺样品的RP-HPLC分析(根据2016年11月16日修订的药品SOP)，使用允许Gly-TB4和杂质分离的条件。条件如下。此外，在SOP修订之前进行的，从第一次和第二次验证运行中获得的纯化提取物的纯度认为是不可靠的测量值。

表50

RP-HPLC分析的方法和条件

(2-4)内毒素分析

根据内毒素测试方法，使用Binex开发的Gly-TB4的PTS进行内毒素定量，从而鉴定工艺样品中的内毒素。

(2-5)宿主细胞蛋白质(HCP)分析

根据Binex开发的Gly-TB4的HCP分析进行HCP定量，从而确定从工艺样品中去除HCP的趋势。

(2-6)宿主细胞DNA(HCD)分析

根据Binex开发的Gly-TB4的残留大肠杆菌HCD分析进行HCD定量，从而确认最终产品的残留HCD量。

(2-7)SDS-PAGE分析

根据Gly-TB4的电泳，使用按大小分离Gly-TB4和杂质的条件进行SDS-PAGE分析，从而定性地确认杂质分布，并以BSA为参照或根据需要使用光密度计的亲和池定量分析细胞回收率和AEXI洗脱池。

实施例(3)阴离子交换色谱法(AEXI)

(3-1)初步实验

进行了初步实验，以通过尽可能降低洗脱缓冲液中的NaCl浓度来提高纯度。

(3-1-1)靶蛋白洗脱部位的确认

使用2mg纯化的GST-Tβ4(160709，从第1次验证运行中获得的第2柱洗脱级分IPC样品)在0-500mM的NaCl范围内的线性梯度条件下筛选洗脱GST-Tβ4的NaCl浓度。结果是，鉴定出洗脱的主峰的顶点的位置为20mS/cm，并且证实了在200至300mM NaCl的范围内进行了洗脱。

(3-1-2)GST-Tβ4定量分析(简单纯化)

在AEXI工艺中，由于加载样品和洗脱样品中存在大量杂质，因此无法通过UV定量测量分步产率。旨在开发一种使用亲和柱绘制标准材料的峰面积标准曲线并确认靶蛋白量的分析方法(表51)。

表51

GST-Tβ4定量分析的条件

用稀释缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH8)置换第一次验证运行亲和池的缓冲液，通过紫外定量(吸光度系数为1.385)制备0.3、0.6、0.9和1.2mg/mL标准材料，并通过表51中列出的方法进行分析，然后使用AKTA操作程序(Unicon 5.11)计算积分面积。使用计算出的值绘制线性曲线，从而获得线性度为0.99或更高的曲线，并分析AEXI工艺样品(加载样品和洗脱池)。

(3-2)可缩短工艺时间的流量验证测试

(3-2-1)实验目的

在保持线速度为61cm/小时的同时进行该工艺，并且将线速度增加至200cm/小时以缩短单元工艺所需的时间。确认维持了分步产率和纯度。

(3-2-2)实验方法

如下表所示进行AEXI工艺(表52)。通过分别施加61cm/小时和200cm/小时的流量进行实验。用(3-1-2)所述的方法分析工艺前后获得的样品，并通过SDS-PAGE确认杂质分布。

表52

AEXI工艺的条件

(3-2-3)实验结果

在图23和24中示出了根据AEXI工艺之后的流量的色谱图。红色虚线圆圈表示的区域对应于洗脱峰。

作为每种条件下洗脱池的分步产率(表53)和SDS-PAGE分析(图25)的结果，可以确认，即使在AEXI工艺中的流量增加到200cm/小时时，对分步产率和纯度没有影响。但是，由于负载量约为5mg/mL树脂，因此在负载量增加时需要再次确认。

表53

AEXI线性流量研究的产率

(3-3)用于提高纯度的AEXI洗脱条件测试

(3-3-1)实验目的

考虑到昂贵的亲和柱(GST FF)的经济可行性，旨在实现最大化DBC。为此，将加载样品的纯度提高到尽可能高的水平。因此，通过将500mM NaCl条件改变为200mM NaCl条件来进行实验，然后比较分析了分步产率和纯度。

(3-3-2)实验方法

实验方法基本上与(3-2-2)的表51中所示(本实验中使用的细胞饼批次编号160603)相同，并且用NaCl浓度为500mM或200mM NaCl的洗脱缓冲液进行实验。根据(2-1-2)中所述的方法，通过分析工艺前后的样品来鉴定HU024，并通过SDS-PAGE确认杂质分布。

(3-3-3)实验结果

根据AEXI工艺之后洗脱缓冲液组成的色谱图如图26和27所示，红色虚线圆圈表示的区域对应于洗脱峰。

根据条件洗脱池的分步产率结果(表54)和SDS-PAGE分析结果(图28)，AEXI产率没有差异，并且作为SDS-PAGE分析的结果，在剥离池中而不是在洗脱池中观察到主要杂质峰低于目标带，因此，可以预期纯度提高的效果。但是，可以确认的是，洗脱液的体积随NaCl浓度的降低而增加。此外，当负载量增加5mg/mL树脂或更多时，可能需要其他实验。

表54

AEXI洗脱缓冲液研究的产率

(3-4)AEXI加载样品条件研究

(3-4-1)实验目的

AEXI色谱柱中加载样品的电导率被认为是重要的工艺变量，靶蛋白可通过该工艺变量与色谱柱结合。进行该实验以确认适用的加载样品的电导率范围，以及根据该变量的杂质含量和分步产率的变化。

(3-4-2)实验方法

实验方法基本上与(3-2-2)的表51所示(本实验中使用的细胞饼批次编号160603)相同，并且制备了具有10mS/cm(80mM NaCl)，8mS/cm(50mM NaCl)的电导率的加载样品和≤2.8mS/cm作为对照，并制备了NaCl浓度为80mM，50mM或0mM的平衡缓冲液。该工艺用含有200mM NaCl的洗脱缓冲液进行。采用与(2-1-2)相同的方法分析工艺前后的样品中的HU024，并通过SDS-PAGE确认杂质分布。

(3-4-3)实验结果

AEXI工艺之后，根据加载样品和平衡缓冲液的电导率变化的色谱图如图29至31所示，由红色虚线圆圈表示的区域对应于洗脱峰。

参照条件下洗脱池的产率(表55)和SDS-PAGE结果(图32)，对于在对照(0mM NaCl)和50mM NaCl的情况，产率分别为81％和97％，但在80mM NaCl的情况下，产率为19.1％，然后分析F/T级分。根据分析结果，确认了在F/T级分中观察到约57％的靶蛋白。根据SDS-PAGE，证实对照和50mM NaCl条件之间的纯度没有差异。

表55

AEXI加载样品不同电导率时的分步产率

根据加载样品和平衡缓冲液的电导率的测试结果，可以确定，当加载样品的电导率≤2.8mS/cm和8.0mS/cm(50mM NaCl)时，分步产率和纯度相同。但是，当电导率为10mS/cm(80mM NaCl)时，靶蛋白因F/T损失，因此被证实是不适用的，并且可以确认AEXI工艺中加载样品的电导率高达8.0mS/cm时不会显著影响AEXI结合。但是，当加载量增加了5mg/mL树脂或更多时，需要进行其他实验。

(3-5)AEXI动态结合载量(DBC)测试

(3-5-1)实验目的

相对于AEXI的GST-Tβ4的DBC待确认。

(3-5-2)实验方法

实验方法基本上与(3-2-2)的表51中所示(本实验中使用的细胞饼批次编号160603)相同，但是LRC10柱装有2mL Fractogel TMAE(M)，工作线性流量为150cm/小时(流量为2mL/分钟)，洗脱缓冲液和EQ缓冲液的组成与工艺开发中建立的条件相同(EQ：20mMTris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0，洗脱：20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH 8.0)。以10mg，8mg或7.5mg GST-Tβ4/mL树脂(常规实验条件<5mg/mL树脂)的负载量进行该工艺。通过SDS-PAGE分析F/T和洗脱池，并确认靶蛋白的位置。

(3-5-3)实验结果

通过SDS-PAGE分析F/T和洗脱池的结果示于图33。当注射7.5mg GST-Tβ4时，在F/T池中未发现靶蛋白，而当注射8.0或10.0mg GST-Tβ4时，已确认负载量越大，则F/T池中的目标带越多。因此，预期AEXI的DBC为7.5mg/mL或更少。

(3-6)AEXI工艺样品的保持时间研究

(3-6-1)实验目的

为了确保可用于GMP生产的储存条件和期限，在AEXI工艺中，将洗脱的级分样品在冷藏室(2至8℃)和室温(18至22℃)中保存7天，然后确认纯度的变化。

(3-6-2)实验方法

实验方法与(3-2-2)的表52中所示(本实验中使用的细胞饼批次编号160906)基本相同，并且在加载样品的电导率8mS/cm(50mM NaCl)下进行实验，洗脱条件为200mM NaCl。将洗脱池进行无菌过滤，将其分成500uL的微管，并在冷藏和室温条件下保存7天。采样后的样品在-70℃下保存，完全冷冻，保存期之后同时解冻一天，然后进行SDS-PAGE。

(3-6-3)实验结果

SDS-PAGE结果示于图34。储存在冰箱中的样品之间没有显著差异。但是，从室温保存的第2天起，已确认对应于约55.4kDa的条带的强度增加，并且对应于约40kDa的条带的强度降低。因此，证实了AEXI工艺样品在冷藏室条件(2至8℃)下可稳定7天，而在室温(18至22℃)条件下则不稳定。

(3-7)AEXI工艺总结

表56

*根据客户需求，最终确定为300mM NaCl

AEXI工艺总结

实施例(4)Glutathione Sepharose 4Fast Flow(亲和色谱)

(4-1)缩短工艺时间的流量条件测试

(4-1-1)实验目的

在常规工艺中，线性速度保持在90cm/小时，并且线性速度增加到180cm/小时，以缩短单元工艺所需的时间。确认维持了分步产率。

(4-1-2)实验方法

如下表(表57)所示进行亲和工艺。通过施加90cm/小时和180cm/小时的流量进行实验。以(2-1)中所述的方式分析工艺之前和之后的样品中的HU024，从而确认了分步产率。

表57

亲和工艺的条件

(4-1-3)实验结果

在图35和36中示出了根据亲和工艺的条件的色谱图。

对于通过条件的洗脱池的收率(表58)，可以确认，即使亲和工艺中的流量增加到180cm/小时，对分步产率也没有影响。但是，由于负载量约为4.4mg/mL树脂，因此，在负载量增加时需要再次确认。

表58

亲和线性流量研究的产率

(4-2)动态结合载量(DBC)测试

(4-2-1)实验目的

确认相对于亲和柱的GST-Tβ4的DBC。

(4-2-2)实验方法

在(4-2)的表57中所示的条件下进行亲和工艺，并在LRC10柱中填充1mL谷胱甘肽琼脂糖4急流(Glutathione Sepharose 4Fast Flow)树脂，并应用线性流量76.4cm/小时(流量：1mL/分钟，但是在洗脱过程中为150cm/小时)。与树脂手册中DBC(＝11mg GST标记的蛋白/mL培养基)相比通过将AEXI优化工艺获得的AEXI洗脱池(GST-Tβ441mg)注入，加载样品过载，并且亲和工艺之后，通过(2-1)UV定量方法中描述的UV定量方法分析了工艺样品。

(4-2-3)实验结果

测定了在1mL树脂中过载后通过洗脱获得的洗脱级分的含量(表59)，并且Glutathione Sepharose 4Fast Flow相对于GST-Tβ4的DBC被确认为9.3mg/mL。

表59

Glutathione Sepharose 4Fast Flow的DBC

(4-3)AEXI工艺放大和亲和工艺可重复性实验

(4-3-1)实验目的

进行了AEXI工艺放大实验(XK16->XK50)。

通过应用亲和工艺条件(样品加载的线性流量：80cm/小时，洗脱中的线性流量：150cm/小时，LRC10->XK50条件)进行可重复性和放大实验。

(4-3-2)实验方法

将(3-7)中指定的相同条件应用于AEXI工艺，并将XK16(h：20cm)或XK50(h：20cm)应用于每根色谱柱。以与下表(表60)中所示相同的方式进行亲和工艺，并且将LRC10(h：15cm)或XK50(h：15cm)施加于每根色谱柱。

表60

*当CIP流动时，线性流量设定为80cm/小时，和当DW流动时，需要使用相同的流量。(树脂最大压力:1bar)

亲和色谱的条件

(4-3-3)实验结果

作为AEXI色谱柱放大的结果，色谱图如图37所示，表61显示了分步产率。

表61

*以负载量为6.7mg/mL树脂进行加载

从XK16到XK50的放大研究的AEXI分步产率

通过在两种类型的色谱柱中测量相似的分步产率，确认了放大。然后将洗脱的级分施用到亲和柱上(图38和表62)

表62

*以负载量为8.6mg/mL树脂进行加载

在LRC10和XK50规模下同于可行性测试的亲和分步产率

通过将样品的负载量(8.6mg/mL树脂)设置为先前实验中确定的DBC(9.3mg/mL树脂)的90％，并采用80cm/小时的加载速度和150cm/小时的洗脱速度进行实验，确认了分步产率为60％和73％。

(4-4)亲和柱清洁

(4-4-1)背景

在第一批50L验证运行中，测量6M GHCl处理的CIP后测得的内毒素含量高于0.1EU/mL，因此进行了其他CIP方法(表63)。

表63

通过各种CIP方法去除亲和柱中的内毒素

将应用GE推荐的0.1N NaOH和乙醇的CIP方法(CIP运行5)应用于后续过程(表63)。

(4-5)亲和工艺样品的保持时间研究

(4-5-1)实验目的

将亲和工艺样品在冷藏室(2至8℃)和室温(18至22℃)条件下保存7天，然后确认纯度的变化以设置工艺样品的保存条件和期限。

(4-5-2)实验方法

实验方法基本上与(4-2)的表58中所示的相同，并且使用(3-6)中的AEXI保持时间研究样品以外的工艺样品作为加载样品。将洗脱池进行无菌过滤，将其分成500uL的微管，并在冷藏室和室温条件下保存7天。采样的样品在-70℃下保存，完全冷冻，保存期结束后同时解冻一天，然后进行SDS-PAGE。

(4-5-3)实验结果

储存条件(室温和冷藏室)的实验之后的SDS-PAGE结果示于图39。在冷藏和室温下储存的样品的SDS-PAGE结果中没有发现显著差异。因此，证实了亲和过程样品在冷藏(2至8℃)或室温(18至22℃)下可稳定保存7天。

(4-6)亲和工艺总结

表64

*当CIP流动时，线性流量设定为80cm/小时，和当DW流动时，使用相同的流量。(树脂最大压力:1bar)

亲和工艺总结

实施例(5)凝血酶消化

(5-1)背景

当按照中国工艺应用凝血酶消化条件(2.6mgGST-Tβ4)时，已证实，当亲和池中的靶蛋白浓度低时，酶裂解效率低(当以0.3mg/mL的亲和池浓度添加2mg/单位的凝血酶时，在SDS-PAGE中只有约50％反应)。因此，在该实验中，使用每2单位凝血酶1mgGST-Tβ4，将反应时间固定在16小时，然后确认在13到27℃的范围内酶切效率的相似性以设定反应温度范围。

表65

凝血酶消化条件

(5-2)凝血酶消化样品的制备

为了进行凝血酶消化研究，进行了AEXI和亲和工艺，并且工艺条件与工艺开发中指定的工艺条件相同。将工艺完成后的亲和池按40mL分配到锥形管中，保存在冷藏室(-20℃)中，并根据需要解冻。

(5-3)通过反应温度进行凝血酶消化的研究

(5-3-1)实验目的

在凝血酶消化反应条件下，应另外设定温度范围。

(5-3-2)实验方法

使用(5-2)中制备的亲和洗脱池(209.1mg GST-Tβ4)，将凝血酶溶解在体积为待反应的亲和池体积的15％(v/v)的20mM Tris-HCl(pH 8.0)中，以进行反应，然后用于处理洗脱池。之后，用表65中指定的方法进行反应，但是反应同时在15±2℃(冷藏室)，20±2℃(室温)和25±2℃(培养箱)中进行。对反应完成后的样品进行(2-2)指定的SEC-HPLC以定量Gly-Tβ4，从而确认了产率(2016-037，第13、18页)。

(5-3-3)实验结果

通过反应温度进行了凝血酶消化的样品的SEC-HPLC结果示于图40。检查色谱图和产率(表66)时，未确认到根据温度的显著差异。因此，证实了凝血酶反应温度条件为13至27℃不影响产率和纯度。

表66

裂解反应混合物的分步产率

实施例(6)第四工艺研究

(6-1)背景

根据第一次50L验证运行的结果，观察到由于AEXII工艺中的F/T级分而导致靶蛋白的损失，并且可以确认洗脱池的RP-HPLC和SEC-HPLC纯度低于F/T级分。根据实验结果，将第二次验证运行的条件变化为F/T模式，从而提高了纯度和收率。但是，在最终纯化的提取物的SE-HPLC中，有必要进一步将纯度提高到97.0％，而在未优化的RP-HPLC中，确认纯度为98.7％，因此考虑引入第4色谱柱。

(6-2)用于开发第4色谱柱工艺的样品生产

为了确保第4色谱柱工艺实验所需的样品，通过在F/T模式(这是第2个验证运行条件)中执行AEX II工艺来制备样品。为了进行样品生产，制备了细胞裂解液，用于两个5LDoE批次(批次编号161019-B1，B2)的深度筛分测试(depth sizing test)。在筛分测试之后，通过使用剩余的细胞裂解物(约1200mL)进行AEXI、亲和、凝血酶消化和AEXII工艺来固定7099mg的Gly-Tβ4。以与(3-7)和(4-1)中所述相同的方式进行AEXI和亲和工艺，柱规模用于AEXI(XK50，h：20cm)和亲和力(XK50，h：15cm)工艺，并按照表67中指定的方法进行AEXII工艺。对获得的样品进行微滤(0.2μm)，按100mL分配，并在-20℃下保存，然后进行使用此的第4色谱柱工艺。

表67

AEXII工艺条件

分析了固定的第3色谱柱洗脱级分的分步产率和纯度(表68和69)。SE-HPLC的纯度提高到98.9％，而RP-HPLC的纯度为97.6％。然而，当通过优化的RP-HPLC分析方法进行分析时，纯度下降至92.2％，因此旨在将纯度提高至99.0％以上。

表68

用于制备第4色谱柱上的加载样品的AEX II的分步产率

表69

用于制备第4色谱柱加载样品的UF/DF后的纯度分析

(6-3)树脂筛查

(6-3-1)阳离子交换色谱(CEX)工艺

为了提高纯度，使用了作为基本CEX树脂的SP FF(表70)

表70

用于第4色谱柱的CEX工艺条件

CEX工艺的色谱图如图41所示。显示了两个分离的峰，并确认了在pH4.5和5.0的条件下进行的工艺的分步产率(表71)。

表71

通过pH的CEX工艺的产率

在pH 5.0的情况下，未发现分离的峰，并且证实产率低于在pH 4.5条件的情况下的产率。当分析F/T级分时，鉴定了靶蛋白，因此预期上述结果是由靶蛋白引起的。因此，仅将pH 4.5条件进行RP-HPLC分析，分析结果示于图42。

可以确认，去除了主峰前后的许多杂质峰，加载样品和洗脱样品的RP-HPLC纯度分别为92.2％和97.6％。但是，未除去主峰之前存在的杂质峰，参照UF/DF结果(表69)，与RP-HPLC纯度(97.6％)相比没有显著差异，因此确认使用疏水性树脂而不是CEX型树脂，以确保纯度为99％或更高。

(6-3-2)疏水相互作用色谱(HIC)工艺

考虑到RP-HPLC中主峰和杂质峰与目标峰之间的分离，对疏水柱进行了测试，工艺条件列于表72中。根据疏水度对两种树脂(丁基和苯基)进行了测试，作为盐条件，同时使用NaCl和Na₂SO₄。

表72

用于第4色谱柱的HIC工艺条件

工艺色谱图如图43所示。在色谱图的前面形成了一个高峰，在洗脱步骤中没有观察到峰。

结果，靶蛋白不与两种树脂结合，因此没有额外的进展。

(6-3-3)混合模式色谱(MMC)工艺

作为CEX工艺和HIC树脂研究的结果，未确认主要杂质的去除(当使用RP-HPLC分析方法1.0版时，17.5分钟峰值)。因此，使用了Capto MMC。

(6-3-3-1)实验方法

在MMC树脂的情况中，对于结合条件，在低pH值下进行工艺以诱导CEX模式操作，通常通过将pH值更改为中性并给出pH值和盐梯度来使用洗脱方法(参考文件6.2)。根据实验，将EQ缓冲液的pH值更改为4.5至5.0，并将洗脱缓冲液的pH值更改为4.5至7.5，这证实了随着洗脱液pH值的增加，峰面积变小，并且主要杂质和靶蛋白的分辨率降低。因此，确定CaptoMMC条件适合在低pH下进行。因此，在低pH(EQ，洗脱缓冲液，pH 4.5)条件下，该工艺在表73的条件下进行。

表73

用于第4色谱柱的MMC工艺条件

进行洗脱池的分级以进行RP-HPLC分析，并且通过收集纯度为98％或更高的池来确认纯度和产率。

(6-3-3-2)实验结果

Capto MMC的色谱图如图37所示。在洗脱步骤中，确认形成单峰，并且在图44中示出了每个级分的RP-HPLC(1.0版)结果。结果是，在峰前的级分中，高度确认了主要杂质峰，而在峰的中部至后部的级分中几乎没有发现主要杂质峰。

关于通过洗脱级分的RP-HPLC纯度分析结果，可以确认主要杂质峰集中在前级分中。在合并B8，B7和B6级分时，能够以70％的分步产率确保99.6％的纯度(图74)。

表74

Capto MMC工艺的产率

(6-4)第四工艺优化研究1

(6-4-1)实验目的

进行了用于提高分步产率的分步洗脱条件优化实验。

(6-4-2)实验方法

逐步确认目标洗脱条件，可以确认洗脱条件为200mM NaCl或更多洗脱。因此，应通过施加低于可以洗脱靶标的盐浓度的185mM NaCl来确定洗涤步骤条件，并且基本纯化条件如(6-3-3-1)的表73所示，但洗脱缓冲液的NaCl浓度更改为400mM。此外，要确认在确认条件下施加负载量时的工艺可重复性。

(6-4-3)实验结果

在洗涤步骤中通过施加185mM NaCl(电导率20.7至21.2mS/cm)获得的色谱图如图46所示。在以0.5mg/mL树脂加载后，将洗脱步骤级分(C6-C9)合并为两种类型，以进行RP-HPLC。结果是，确认了纯度为98.6％(C6-C9池)和99.0％(C7-C9池)，它们的纯度为98％或更高，并且在C6-C9级分池中的收率为78.7％(表75)。

表75

0.5mg/mL树脂的负载量的MMC步骤洗脱的分步产率

表76

4.0mg/mL树脂的负载量的MMC步骤洗脱的分步产率

然而，当加载47.8mg Gly-Tβ4(4.0mg/mL树脂)时，大多数靶蛋白在洗涤步骤中流出，并且确认产率为32％(表76)，从而无法应用于该工艺。

(6-5)第四工艺优化研究2

(6-5-1)实验目的

在负载量为3mg Gly-Tβ4/mL树脂，高于0.5mg(常规量)且低于4.0mg的条件下，根据洗涤步骤的NaCl浓度条件(100、120和140mM)确认纯度和分步产率。

(6-5-2)实验方法

实验方法与表77指定的相同。工艺后，通过RP-HPLC(2.0版)分析样品，并根据分析结果确认工艺样品的纯度和分步产率。

表77

加载为3mg/mL树脂的MMC工艺条件

(6-5-3)实验结果

根据在洗涤步骤中NaCl浓度的色谱图在图47、48和49中示出。在洗脱步骤中，证实了峰被分成两个峰。假定由于洗脱缓冲液中的盐而使pH降低而延迟了洗脱。分馏(fraction)并分析两个分离的洗脱峰，然后合并，然后重新分析(表78)。

表78

用于洗涤的氯化钠含量增加的MMC的纯度和分步产率

当用100mM NaCl洗涤时，确认了产率高达95％，但是洗脱池中的平均纯度约为93.7％，这不足以除去杂质。当用140mM NaCl洗涤时，确认纯度为99％或更高，但产率非常低，为47％。因此，在洗涤步骤中，就纯度和收率而言最合适的NaCl浓度被确认为120mM，并且在此，确认收率为74％，纯度为99％或更高。

(6-6)第四步工艺动态结合载量(DBC)测试

(6-6-1)实验目的

确认了关于Gly-Tβ4的MMC的DBC。

(6-6-2)实验方法

如表79中所指定进行实验方法，并且一次洗脱所有没有洗涤步骤的结合蛋白，并通过RP-HPLC定量。

表79

DBC测试的Capto MMC工艺条件

(6-6-3)实验结果

通过在1mL树脂中过载获得的MMC工艺样品的RP-HPLC结果示于表80中，并且确认了Capto MMC相对于Gly-Tβ4的DBC为9.6mg/mL。该结果与先前的实验结果有所不同，即在4.0mg/mL树脂条件下，大多数蛋白质均存在于洗涤级分中。因此，猜测两个实验之间存在条件差异(流量200vs.76cm/小时)。

表80

Capto MMC工艺的DBC

(6-7)Capto MMC工艺的总结

表81

*稍后进一步研究

Capto MMC工艺的总结

实施例(7)工艺研究

(7-1)背景

改变加载样品的电导率条件和AEXI工艺中洗脱缓冲液中的NaCl浓度，并将AEXII工艺更改为结合洗脱模式，并将使用Nuvia HR-S树脂作为第4色谱柱的工艺确定为最终工艺。此外，最终纯化的提取物的纯度标准被确认为97％或更高(在RP-HPLC中)。因此，进行了在小规模实验中再现该工艺并按比例放大该工艺的任务。

表82

对比DSP的条件

(7-2)用于第3和第4色谱柱工艺研究的样品制备

作为本实验中使用的样品，使用(5-2)中指定的亲和池(GST-Tβ4浓度6.97mg/mL)，并在第三步工艺的前一天通过表65中指定的方式启动凝血酶消化来制备。

(7-3)第三色谱柱工艺研究(AEXII-B/E模式)。。

(7-3-1)确认第3色谱柱工艺动态结合载量(DBC)

(7-3-1-1)实验目的

AEXII的DBC待确认。但是，通过将流量从200cm/小时(常规)更改为153cm/小时来进行实验。

(7-3-1-2)实验方法

如表83所示进行实验，将样品(5mg/mL树脂)过载于柱中后，通过SEC-HPLC对洗脱级分进行定量，从而确认了Gly-Tβ4的洗脱量。

表83

DBC测试的AEX II工艺条件

(7-3-1-3)实验结果

通过在2mL树脂中过载获得的洗脱池的SEC-HPLC结果示于图51中。当洗脱池在AEXII中超载时，还会发现GST，并且当AEXII具有以下条件时，确认与AEXII附着的Gly-Tβ4DBC为1.7mgGly-Tβ4/mL(表84)。但是，当流量从153cm/小时更改为200cm/小时时，需要进行其他实验。

表84

AEXII工艺的DBC

(7-3-2)第3色谱柱工艺可重复性实验

(7-3-2-1)实验目的

通过仅对设定的DBC施加约90％并将流量提高至200cm/小时，确认了可重复性(分步产率：80％以内，纯度：RP-HPLC为90％至96％的水平)。

(7-3-2-2)实验方法

如下表85所示进行了第三工艺的实验方法，该工艺完成后，通过SEC-HPLC进行定量，然后通过RP-HPLC进行纯度分析。

表85

AEXII工艺条件

(7-3-2-3)实验结果

通过加载每毫升树脂1.0mg和1.5mg Gly-Tβ4所获得的色谱图分别如图52和53所示。

在洗脱之前，发现一个高的UV峰，并且作为分析该峰的结果，确认了没有靶蛋白，并且该峰是由杂质(GSH)引起的。如表86所示，确认了该工艺的产率和纯度。

表86

AEXII工艺的质量和数量概况

相对于负载量，没有观察到产率和纯度的显著差异。因此，可以确认AEXII的条件和DBC的可重复性。

(7-3-3)减少第3步工艺加载样品体积的实验

(7-3-3-1)实验目的

旨在确认4倍稀释对减少加载样品体积的效果，当根据B/E模式的变化应用常规10倍稀释因子时，该体积会增加。

(7-3-3-2)实验方法

以表85中指定的相同方式进行实验方法，并用DW将加载样品稀释4倍，以将电导率维持在2至3mS/cm。工艺后的样品通过SEC-HPLC定量，并通过RP-HPLC分析纯度。

(7-3-3-3)实验结果

通过进行改变加载样品的电导率的工艺而获得的色谱图如图55所示。

表87

随着加载样品的电导率的提高，AEXII的纯度和产率

由于加载样品的稀释因子降低，电导率增加(1mg Gly-Tβ4/树脂mL加载样品电导率1.16->2.76mS/cm，1.5mg Gly-Tβ4/树脂mL加载样品电导率1.13->2.80mS/cm)，但收率和纯度无明显差异(表87)。

(7-3-4)第三工艺保持时间研究

(7-3-4-1)实验目的

为了确保可用于GMP生产的存储条件和期限，在AEXII工艺中，洗脱的级分样品在冷藏室(2至8℃)和室温(18至22℃)条件下存储7天，然后确认纯度变化。

(7-3-4-2)实验方法

在实验方法中，在5L规模的工艺中，对第3工艺的洗脱池进行无菌过滤，将其按照300uL分配到微管中，并在冷藏室和室温条件下保存7天。在此，在保存期结束时，将样品在-70℃下保存至完全冻结，并且在保存期结束后的一天，将所有样品同时解冻，然后进行RP-HPLC。

(7-3-4-3)实验结果

通过在每种保存条件(室温或冷藏室)和RP-HPLC中的测试获得的色谱图如图56所示。表88示出了展示纯度和主峰面积的表。

就工艺样品的稳定性标准而言，与根据(2-3)的RP-HPLC的系统适用标准(％CV≤2.0％)相比，随时间的推移，主峰面积的％CV被确认为2.0或更少，确定在此没有变化。因此，确认了第三工艺样品在冷藏室(2至8℃)或室温(18至22℃)的储存条件下可稳定7天。

表88

AEX II保持时间研究的RP-HPLC分析

(7-3-5)AEXII工艺总结

表89

AEXII工艺的总结

(7-4)第四色谱柱工艺研究

(7-4-1)确认条件可重复性的实验

通过使用第二次50L验证运行标准(50mAU-50mAU)作为AEXII的洗脱标准，以B/E模式制备了待用于第4色谱柱可重复性实验的加载样品，除此之外，还在表90中描述了所有第4色谱柱条件。实验重复两次(图57和58)。

表90

CEX工艺条件

表91

CEX可行性测试的加载样品制备

实验的结果是，主峰洗脱位置与常规结果略有不同(图57和58)。检查实验条件的差异，并确认除了树脂床的高度，蛋白质浓度和加载样量外条件相同。在常规实施例中，AEXII洗脱池中的Gly-Tβ4浓度为1至1.5mg/mL，但在以50mAU-50mAU洗脱标准进行的内部实验中，洗脱池中的Gly-Tβ4浓度确认为0.4mg/mL。因此，加载样品的体积增加了：例如，常规条件为7.5CV，并且分别对14.5和17.0CV的样品进行了两次重复的内部实验。为了确定确切原因，首先，要检查床高差异的影响。

(7-4-2)床高差异造成的影响

(7-4-2-1)实验目的

根据床高的差异，确认洗脱位置是否存在差异。

(7-4-2-2)加载样品准备

为了制备与常规使用的加载样品尽可能相似的样品，可通过将AEXII洗脱标准更改为100mAU-172mAU获得洗脱级分。确认了如上所述制备的洗脱级分的纯度和分步产率(表92)。但是，蛋白质浓度为0.9mg/mL，略低于常规情况(1至1.5mg/mL)。

表92

AEXII的质量和数量概况

(7-4-2-3)实验方法

以表90中指定的相同方式进行实验方法，使用手动填充的XK16(床高20cm，CV40mL)色谱柱和预装柱(床高10cm，CV 5mL)独立进行实验，并根据表93中所示的条件执行每个工艺的加载。

在两个实验中均使用了相同体积(5.5CV)的加载样品。但是，与之前的实验相比，该体积约小3倍左右。尽管流量恒定保持在200cm/小时，由于床高的不同，实验之间的停留时间有两倍的差异。与之前的实验相比，加载样品的电导率从1.7mS/cm略微增加到2.0mS/cm。该工艺完成后，通过RP-HPLC分析样品的纯度。

表93

用于床高研究的加载样品体积

(7-4-2-4)实验结果

用于实验工艺的色谱图示于图59和60中。根据床高为10cm进行的实验的结果，确认在洗脱步骤而不是洗涤步骤中发现了峰。确认了该结果类似于常规色谱图(图56)。

在20cm的床高下进行的实验的结果表明，在洗涤步骤中在8CV的时间点开始洗脱，并在洗脱步骤中完成。但是，根据在相同床高条件下进行的先前实验的结果，在洗涤步骤中主峰被完全洗脱。估计这种差异与样品加载体积的差异(14.5vs 5.5CV)有关。

表94

*工艺期间由于洗脱样品的损失未测量

CEX柱长度研究的质量和数量概况

因此，为了恒定地保持引起停留时间差异的床高度，选择了10cm条件，并且确认了在200cm/小时的流量和加载样品体积5.5CV的条件下可以再现与常规结果相同的洗脱位置。

(7-5)第四色谱柱工艺可重复性实验

(7-5-1)制备第4色谱柱工艺样品

为了确认第4色谱柱工艺的可重复性，进行AEXII工艺，并按照与表90所示相同的方式进行第4色谱柱工艺，不同之处在于将合并标准更改为200mAU-200mAU以减小第4色谱柱洗脱的级分样品的体积。对第4工艺完成的样品通过SEC-HPLC进行定量，并且通过RP-HPLC进行纯度测量，确认与先前的结果没有差异，结果示于表95。

表95

用于CEX床高研究的加载样品制备的纯度和分步产率

(7-5-2)实验目的

确认是否在10厘米床高(XK16填充)条件下使用手动填充的色谱柱而不是预装色谱柱再现了实验结果。

(7-5-3)实验方法

尽管如表96所示进行实验方法，但加载样品体积为7.0CV，与之前的5.5CV的实验结果相似，负载量为1.65mg Gly-Tβ4/mL树脂，略大于先前的实验结果1.1mg。通过SEC-HPLC对工艺完成的样品进行定量，并通过RP-HPLC确认其纯度。

表96

CEX工艺条件

(7-5-4)实验结果

该工艺的色谱图如图61所示，预想不到地，在更换为洗脱缓冲液之前，主峰从洗涤步骤结束时开始被洗脱。可以认为洗脱开始时间比以前的实验结果快一点的原因是由于负载量的增加(1.1->1.7mg/mL树脂)和加载体积的增加(5.5->7.0CV)。

表97

CEX可行性测试的加载样品制备

表98

用于CEX床高研究的纯化样品的纯度和产率

作为CEX工艺的结果，确认了分步产率为91％，纯度为98.8％(表98)。纯度略低于先前的实验结果(99.7％)，并且由于没有先前的结果而无法比较分步产率。

(7-6)第四色谱柱工艺保持时间研究

(7-6-1)实验目的

为确保可用于GMP生产的储存条件和期限，将第4色谱柱洗脱的级分样品在冷藏室(2至8℃)和室温(18至22℃)条件下保存7天，然后检查纯度的变化。

(7-6-2)实验方法

对于实验，将第4工艺洗脱池在5L规模工艺中进行无菌过滤，然后按照300uL分配到微管中，并在冷藏室和室温条件下保存7天。在此，在保存期结束时将样品保存在-70℃以完全冷冻，并且在保存期结束后的一天，将所有样品同时解冻并通过RP-HPLC分析。

(7-6-3)实验结果

通过在每种储存条件(室温或冷藏室)下进行实验，然后进行RP-HPLC所获得的色谱图如图62所示，纯度和主峰面积示于表99中。作为工艺样品的稳定性标准，根据(2-3)中的RPC-HPLC(HU024-SOP-004)，应用系统适用性标准(％CV≤2.0％)，且在冷藏室和室温条件下，即使经过一段时间，主峰面积的％CV仍为2.0或更少，确认了没有变化。但是，当将冷藏室中保存的样品中以红色圆圈表示的部分的杂质峰(保留时间为27.4分钟)与第0天的样品进行比较，随着时间的流逝，确认峰面积增加了(表100)。因此，确定了第四工艺样品在冷藏室条件(2至8℃)下稳定7天，但不适用于室温存储。

表99

用于CEX保持时间研究的RP-HPLC分析中的纯度

表100

用于室温(18至22℃)下CEX洗脱池的保持时间的RP-HPLC分析中的杂质分析。

(7-7)CEX工艺总结

表101

CEX工艺的总结

实施例(8)5L规模的培养液的纯化

(8-1)实验目的

确认是否使用BPG100色谱柱尺寸或更大尺寸再现了以XK16尺寸执行的结果。

(8-2)实验方法

通过表101中指定的方法进行第四色谱柱纯化，其他工艺条件示于表102中。对于深度过滤和AEXI工艺，使用GST-Tβ4标准材料(在第一个50L验证运行中制备的)通过(2-6)中所述的方法计算工艺分步产率，并且对于凝血酶、AEXII和CEX工艺，通过SEC-HPLC和RP-HPLC计算分步产率。此外，根据(2-4)和(2-5)中所述的方法对每个工艺样品进行内毒素和HCP分析。

表102

5L规模工艺缓冲液和样品制备条件

表103

5L规模工艺条件

表104

5L规模工艺的加载样品制备

(8-3)实验结果

各个工艺的色谱图如下所示，并且确认了进行的该工艺与工艺开发时没有显著差异(图63、64和65)。然而，在先前的在XK16柱条件下进行的CEX实验中，当以大约9CV或更高的速度洗涤时，洗脱的主峰从6CV时间点开始洗脱(图66)。如上所述，可以再次确认主峰的洗脱开始时间变快的原因是由于负载量的增加(1.7->2.8mg/mL树脂)和加载体积的增加(7.0->8.8CV)。因此，为了保持恒定的洗脱位置，已确定在将来的GMP生产中应考虑第4色谱柱加载样品数据。

表105

*细胞批次编号161115-B1，161122-B2

5L规模工艺中的产率和纯度

表106

5L规模工艺中的纯度分析

经确认，通过5L规模工艺获得的最终产率为7.8％，并且第三色谱柱工艺洗脱溶液的RP-HPLC纯度为96.3％，这等于小规模的实验结果，而第4色谱柱工艺洗脱液的RP-HPLC纯度为98.0％，也符合标准97％或更高。但是，与之前的小规模CEX纯化结果(99.6％和98.8％)相比，纯度相对较低(98.4％)，但分步产率为99.4％，增加了大约8％或更高。可以确定，这是由于主峰洗脱时间比第4色谱柱工艺中的先前实验的主峰洗脱时间更快。纯度预期会随着分步产率的增加而降低(表105)。与AEXI工艺样品相比，亲和工艺中工艺衍生杂质(HCP和内毒素)的去除率分别为HCP 97.0％和内毒素98.0％。在亲和工艺之后，在AEXII工艺中去除了99.9％或更多的内毒素，并且确认了AEXII工艺中内毒素去除率是最优异的。最终纯化提取物中的内毒素(≤0.5EU/mg)和HCP(≤100ppm)结果也符合标准(表106)。基于以上结果，编写了GMP技术转移协议。

(9-1)实验目的

通过纯化50L规模的培养液，制备了用于非临床测试的样品，并且准备了100瓶标准产品。

(9-2)实验方法

表107中示出了用于50L验证运行的缓冲液的条件，在第4色谱柱工艺中，与5L规模工艺中使用的洗涤条件不同，NaCl浓度从80mM更改为60mM，其他工艺为与常规工艺中使用的相同。此外，在第一，第二和第三色谱柱工艺中，采用了常规50L验证运行中应用的流量，而第四色谱柱工艺中使用了BPG200色谱柱，因此使用可以在AKTA试验中驱动的最大流量，但不使用常规的200cm/小时条件。因此，使用了150cm/小时的条件(生产商的说明和记录，批次编号HU024-RD1603)。

表107

第三次50L验证运行工艺条件

(9-3)实验结果

该工艺的色谱图示于图67至图70中。确认得到了可再现的结果。累积纯化工艺的产率为12.4％(表108)。

表108

*通过RP-HPLC确认的纯度

第三次50L验证运行纯度和产率

用于每个工艺测量的工艺来源的杂质含量(表109)

表109

第3次50L验证运行的HCP和内毒素分析

获得大约13g的最终纯化提取物，并且确认RP-HPLC纯度为98.1％，符合标准(97％或更高)(表108)。HCP和内毒素含量也符合标准(表109)。确认了在亲和工艺中，来自工艺的杂质的单位工艺去除率对于HCP是97.7％，对于内毒素是99.5％。亲和工艺后，在AEXII工艺中，内毒素单位工艺去除率被确认为99.9％。可以看出，该结果与先前实验的5L规模培养液纯化的结果相同。

本领域普通技术人员应该理解，本发明的以上描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或基本特征的情况下，本文公开的示例性实施方式可以容易地修改为其他特定形式。因此，上述示例性实施方式应被解释为说明性的，并且在任何方面均不限制。

工业实用性

根据本发明，可以稳定地大规模制备高纯度的Gly-Tβ4，因此认为本发明具有很大的工业价值，因为可以经济高效地获得具有优异工业价值的Gly-Tβ4。

Claims

1.一种制备甘氨酸-胸腺素β4（Gly-胸腺素β4，Gly-Tβ4）的方法，包括：

（S1）将样品加载到用平衡缓冲液平衡的一级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，并用洗脱缓冲液洗脱附着在所述柱上的级分；

（S2）对洗脱物进行亲和色谱；

（S3）通过凝血酶处理酶切洗脱物；

（S4）将裂解产物加载到用平衡缓冲液平衡的二级阴离子交换色谱柱中，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，并用洗脱缓冲液以3mg/mL或更少的动态结合能力（DBC）洗脱附着于所述柱的级分；

（S5）将洗脱物加载到用平衡缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱上，用洗涤缓冲液洗涤所述柱，并用洗脱缓冲液以3至8 mg/mL的DBC洗脱附着于所述柱的级分；和

（S6）过滤洗脱物。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S4）中，将裂解产物在pH 8至9和电导率为4mS/cm或更小的条件下加载到柱中。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中，用pH 7至9的缓冲液洗脱附着至步骤（S4）中阴离子交换色谱中柱的级分，所述缓冲液包含10至30mM Tris-HCl和30至130mM NaCl，流速为100至300 cm/小时。

4. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S5）中，将洗脱产物以pH 4.5±0.1和2±0.2mS/cm或更小的电导率加载到所述柱中。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S5）中的阳离子交换色谱中，将裂解产物以pH为4至7且电导率为4mS/cm或更小的电导率加载到柱中。

6. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S5）中的阳离子交换色谱中，用pH 4至5的缓冲液洗脱附着于所述柱的级分，所述缓冲液包含10至30mM乙酸盐和150至210mM NaCl，流速为100至300 cm/小时。

7. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤（S3）中，GST-Tβ4与凝血酶的比例为5至0.5：1（单位：mg）。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（S3）中的反应温度为13至27℃。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，根据所述方法的最终纯化提取物的纯度为97％或更高。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（S1）中的样品是通过以下步骤获得的：

培养表达靶蛋白的宿主细胞；

裂解宿主细胞；和

洗涤并过滤裂解物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在诱导开始时，所述宿主细胞的主要培养是在40至65的OD₆₀₀和25至35℃的诱导温度下补料分批培养。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，根据所述方法的细胞生产率为180g小球/L或更高，并且所述靶蛋白的生产率为54mg/g小球或更高。