KR20200016597A - Gly-Tβ4의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글리신-티모신 β4(Gly-thymosin β4, Gly-Tβ4)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 GST 융합 티모신 β4(GST fusion thymosin β4, GST-Tβ4)를 함유하는 시료를 크로마토그래피, 효소 처리 및 여과하는 단계를 통해 대용량의 고순도 Gly-Tβ4를 높은 생산성으로 수득할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

Gly-Tβ4의 제조방법{The processing method of Gly-Tβ4}

본 발명은 Gly-Tβ4 (Gly-티모신β4)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 Gly-Tβ4 의 전구물질인 GST fusion recombinant human thymosin β4 (이하, "GST-TB4")를 발현하는 발현공정 및 Gly-Tβ4의 정제공정을 포함하는 Gly-Tβ4 제조방법에 관한 것이다.

대량의 단백질 정제는 생물공학 산업 분야에서 점점 중요한 문제가 되고 있다. 일반적으로, 단백질은 세포 배양에 의해, 목적 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 삽입시켜 목적 단백질을 생산하게끔 조작된 포유류 또는 박테리아 세포 라인을 사용하여 생산된다. 사용된 세포 라인이 생물체이기 때문에, 그들에게는 일반적으로 동물 혈청 제제로부터 공급되는 당류, 아미노산류 및 성장 인자를 함유하는 복합 배양 배지가 공급될 것이다. 이러한 세포에 공급된 화합물들의 혼합물 및 세포 자체의 부산물로부터 원하는 단백질을 인체 치료용으로 충분한 순도로 분리하는 것은 매우 어려운 일이다.

그러나 약제로 사용되는 단백질 등의 생물의약품인 경우에는 산물의 수율 뿐만 아니라 불순물의 제거도 매우 중요하다. 공정 의존적 불순물과 산물 의존적 불순물 사이에는 차이가 있을 수 있다. 공정 의존적 불순물은 단백질 및 핵산과 같은 숙주 세포의 성분을 함유하고 세포 배양물(예컨대, 배지 성분)에서 유래되거나, 후처리 공정(예, 염 또는 분리된 크로마토그래피 리간드)에서 유래되기도 한다. 산물 의존적 불순물은 성질이 다른 산물의 분자 변형체이다. 그 예에는 전구체 및 가수분해적 분해 산물과 같은 단축된 형태뿐만 아니라 탈아민화, 부정확한 글리코실화 또는 잘못 결합된 이황화 브릿지 등에 의해 생산된 변형된 형태도 포함된다. 산물 의존적 변형체는 또한 중합체 및 응집물도 포함한다. 오염물이란 용어는 제조 공정에 직접 속하지 않은 화학적, 생화학적 또는 미생물학적 특성의 기타 모든 물질을 나타내는데 사용된다. 오염물의 예는 세포 배양물에서 바람직하지 않게 나타날 수 있는 바이러스를 포함한다.

불순물 및 오염물은 생물의약품인 경우에 안전성 문제를 야기한다. 이것은 생물의약품인 경우에 매우 흔한 경우로서, 치료용 단백질이 주사 또는 주입에 의해 혈류로 직접 투여된다면 심각해진다. 이에 따라, 숙주 세포 성분은 알레르기 반응 또는 면역병리학적 효과를 야기할 수 있다. 또한, 불순물은 투여된 단백질의 바람직하지 않은 면역원성으로 이어질 수도 있고, 즉 치료제에 대하여 환자의 바람직하지 않은 면역 반응을, 아마도 치명적인 아나필락시스 쇼크 순간까지 촉발시킬 수 있다. 따라서, 모든 바람직하지 않은 물질이 무의미한 수준까지 제거될 수 있는 적당한 정제 방법이 요구되고 있다.

한편, 생물의약품인 경우에는 경제적 관점을 무시할 수 없다. 이에 따라, 사용된 생산 및 정제 방법은 이와 같이 생산된 생물의약품의 경제적 실현가능성을 위협하지 않아야 한다. 또한, 새로운 정제 방법이 확립될 수 있는 시간의 척도는 중요한 역할을 한다. 즉, 비용에 미치는 영향 외에도, 공정 개발은 약물의 임상전 개발 및 임상 개발과 조화를 이루어야 한다. 이에 따라, 예컨대 일부 임상전 시도와 모든 임상 시도는 충분한 순도의 생물의약품이 충분한 양으로 이용 가능한 경우에만 시작할 수 있다.

세포 파편으로부터 단백질을 정제하는 방법은 처음에는 그 단백질의 발현 부위에 따라 좌우된다. 어떤 단백질은 세포로부터 주위 증식 배지로 직접 분비될 수 있도록 할 수 있고, 어떤 단백질은 세포내에서 만들어진다. 후자 단백질의 경우, 정제 방법의 제1 단계는 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소 처리를 비롯한 여러 방법에 의해 수행될 수 있는 세포의 용균 단계를 포함한다. 이러한 세포 파열로, 세포의 전체 내용물이 세포 현탁액으로 방출되고, 또한 크기가 작아 제거하기 어려운 세포내 단편들이 생성된다. 이 세포내 단편들은 일반적으로 분획 원심분리법 또는 여과법에 의해 제거된다. 정도는 덜 하지만, 이러한 문제는 세포의 자연사 및 단백질 생산 과정 중 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 직접 분비된 단백질에 있어서도 마찬가지이다.

목적 단백질을 함유하는 정제된 용액이 수득되면, 세포에 의해 생산된 다른 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 것은 일반적으로 다른 크로마토그래피 기술을 병용함으로써 수행된다. 이러한 크로마토그래피 기술의 핵심은 단백질이 긴 컬럼의 아래 방향으로 다른 속도로 이동하여 그들이 컬럼 아래 방향으로 계속 내려감에 따라 점점 더 크게 물리적으로 분리되거나, 또는 단백질을 분리 배지에 선별적으로 부착시킨 다음, 다른 용매에 의해 차별적으로 용출시킬 수 있다는 것이다. 경우에 따라, 불순물은 컬럼에 특이적으로 부착되고 목적 단백질은 컬럼에 부착되지 않는, 즉 목적 단백질은 통액(flow-through) 중에 존재하게 되는 경우에 목적 단백질이 불순물로부터 분리되고, 또는 목적 단백질이 컬럼에 특이적으로 부착되는 경우에 부착된 목적 단백질을 용출(elution)시켜 불순물로부터 분리할 수도 있다. 이 단계에 사용될 수 있는 칼럼 크로마토그래피 방법과 크로마토그래피 물질은 수많은 종류가 공지되어 있다. 하지만, 대안적인 방법의 수가 증가할수록, 정제 효과, 수율, 생물학적 활성, 시간, 비용 등의 면에서 최적의 물질 및 방법을 결정하기 위해서는 훨씬 많은 수의 예비 시도가 수행되어야만 한다.

또한, 정제 방법의 확립 및 최적화 시에는 정제될 특정 분자(표적 분자, 표적 단백질)의 생화학적 및 생물물리학적 성질 및 생물학적 출발 물질이 수득되는 조건에 따라 매우 개별적으로 조정되어야 한다는 것을 명심해야 한다. 표적 물질이 분리되어야만 하는 생물학적 출발 물질은 일반적으로 매우 복잡한 물질의 혼합물로 이루어진다. 표적 분자를 분리 및 농축하기 위해서는 모양, 크기, 용해성, 표면 전하, 표면 소수성 및 결합 파트너에 대한 생물특이적 친화성과 같은 특정 성질이 이용된다. 각각 새로운 표적 분자에 대하여, 심지어 이전 단계들 중 하나(예컨대, 발효 배양 배지의 조성의 변화)만이 변화된 동일한 표적 분자에 대해서도, 상기 관점으로부터 가능한 최상의 결과가 상기 새로운 조건 하에서 더 이상 달성되지 않을 수 있기 때문에 정제 공정은 새롭게 조정되어야 한다.

이와 동시에, 이론적으로 추정할 수 있는 대체 공정의 수는 앞에서 열거한 매개변수의 수에 의해 좌우된다. 칼럼 크로마토그래피에서 예컨대 전체 공정에서 일련의 크로마토그래피 단계, 칼럼 물질, pH, 염 함량 및 사용된 각종 용출 완충액의 특성, 칼럼에 충전할 때의 단백질 농도 및 기타 많은 관점은 최적화되어야 한다. 이것은 산업적 규모에서 적당한 비용과 적당한 시간 범위 내 최적의 칼럼 크로마토그래피 공정을 개발하는 것을 사실상 불가능하게 한다. 한편, 경제적 실현가능성 및 장치 관련 제한(예컨대, 가능한 적은 수의 완충액 사용 및 완충액과 크로마토그래피 물질의 가능한 최소 양 또는 용적의 필요성, 가능한 적은 용적의 산물 함유 분획 유지의 필요성, 및 공정 시간과 폐수 용적의 최소화 필요성)도 공정의 각 단계에 대해 전술한 최적화를 요구한다.

따라서, 생체분자의 칼럼 크로마토그래피 정제 방법이 빠르고 저비용으로 확립 및 최적화될 수 있으면서, 생체분자의 대규모 산업적 생산 및 정제 조건 하에서 만족스러운 결과도 산출하는 공정의 필요성은 여전히 절실하다.

한편, Gly-Tβ4 (Gly-티모신 β4)는 44개의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로서 기존의 Thymosin β4(Tβ4)의 N-말단에 Gly(글리신)을 추가한 것이다. Gly-Tβ4는 이미 공지된 Tβ4의 4차 구조 분석과 상기 단백질 N-말단의 유전 공학적 변형을 통해 발견된 것으로 본래 Tβ4과는 다른 활성을 보인다. Tβ4는 구조와 기능이 상대적으로 정의되고 공지된 주요 흉선 인자 중 하나이다. Tβ4는 소 유선에서 추출된 티모신 분획 5 (TF5)에서 처음 분리된 폴리펩티드이며, 43개의 아미노산을 가지며, 이황화 결합과 글리코실화 없이 4963KD의 분자량을 갖는 것으로 공지되어 있다(The Journal of Biological Chemistry, Vol 257, No2, pp1000-1006, 1982, Chemical Characterization of Thymosin beta).

Gly-Tβ4 는 종래 Gly-Tβ4 이 발현되도록 조작된 균주에서 발효 공정을 통해 Gly-Tβ4 를 발현하고 정제하는 과정을 거쳐 Gly-Tβ4를 수득한다. 그러나 정제 과정 중에 유실되는 단백질이 양이 상당하고, 이러한 공정을 통해 수득되는 Gly-Tβ4의 생산성이 극히 낮다는 문제점이 지적되어 왔다. 또한, 종래의 중국 Beijing Northland Biotech사의 30 L 배양 batch record (이하 "NR 배양공정")에 따라 GST-TB4를 발효시키는 경우, 낮은 생산성뿐만 아니라, 배지 침전물 형성 및 아세테이트 축적 등의 단점이 지적되어 왔다. 또한 Northland Biotech사의 정제공정에 따라 정제를 진행하는 경우 낮은 정제 수율로 인하여 단가가 높다는 문제점과 최종산물의 낮은 순도 때문에, 의약품으로 사용되기에 많은 문제점을 나타내었다.

The Journal of Biological Chemistry, Vol 257, No2, pp1000-1006, 1982, Chemical Characterization of Thymosin beta

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 고순도의 Gly-Tβ4를 대규모로 안정적으로 수득하는 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 다음 단계를 포함하는, 글리신-티모신 β4(Gly-thymosin β4, Gly-Tβ4)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다: (S1) GST 융합 티모신 β4(GST fusion thymosin β4, GST-Tβ4) 함유하는 시료를 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 1차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하고 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계; (S2) 용출물을 친화성 크로마토그래피하는 단계; (S3) 용출물에 트롬빈 처리하여 효소 절단하는 단계; (S4) 절단물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 2차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 1.8mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계; (S5) 용출물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 5mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계; 및 (S6) 용출물을 여과하는 단계.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 글리신-티모신 β4(Gly-thymosin β4, Gly-Tβ4)를 제조하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 Gly-Tβ4를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다:

(S1) 시료를 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 1차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계;

(S2) 용출물을 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계;

(S3) 용출물에 트롬빈 처리하여 효소 절단하는 단계;

(S4) 절단물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 2차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 3 mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계;

(S5) 용출물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 3 ~ 8 mg/mL 에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계; 및

(S6) 용출물을 여과하는 단계.

바람직하게, 상기 (S4) 단계에서 절단물을 pH 8 ~ 9, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 (S4) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30 mM Tris-HCl 및 30 ~ 130 mM NaCl 포함하는 pH 7 ~ 9의 완충액으로 용출하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피에서, 상기 절단물은 pH 4 ~ 7, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30mM 아세테이트 및 150 ~ 210 mM NaCl 포함하는 pH 4 ~ 5의 완충액으로 용출하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 (S3) 단계에서 트롬빈 대비 목적 단백질은 5 ~ 0.5 : 1 (unit:mg) 인 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 (S3) 단계에서의 반응 온도는 13~27 ℃ 인 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 방법에 따른 최종 정제 원액의 순도가 97% 이상인 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 (S1) 단계에서의 시료는 다음 단계를 포함해 수득하는 것을 특징으로 한다:

목적 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 숙주 세포를 파쇄하는 단계; 및 파쇄물을 세척 및 여과하는 단계.

바람직하게, 상기 숙주 세포의 본배양은 인덕션(Induction) 시작시 OD600 는 40 ~ 65, 인덕션(induction) 온도 25 ~ 35℃ 에서 패드-뱃치(fed-batch) 배양하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게, 상기 방법에 따른 세포생산성은 180 g pellet/L 이상, 목적 단백질 생산성은 54 mg/g pellet 이상인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 다음 단계를 포함하는, 글리신-티모신 β4(Gly-thymosin β4, Gly-Tβ4)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

(S1) 시료를 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 1차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계;

(S2) 용출물을 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계;

(S3) 용출물에 트롬빈 처리하여 효소 절단하는 단계;

(S4) 절단물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 2차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 1.8mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계;

(S5) 용출물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 5mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계; 및

(S6) 용출물을 여과하는 단계.

본 발명에 있어서, 용어 "글리신-티모신 β4(Gly-thymosin β4, Gly-Tβ4)"는 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게 인간 Gly-Tβ4 단백질 또는 이의 폴리펩티드를 의미한다. 인간 Gly-Tβ4 단백질의 아미노산 서열은 젠뱅크(Genebank) no. NP_066932.1 에 기재되어 있으며, 인간 Gly-Tβ4 단백질의 유전자 서열은 젠뱅크(Genebank) no. NM_021109 에 기재되어 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "시료"는 목적 단백질과 1종 이상의 오염 물질이 혼합된 것을 의미하며, 상기 "목적 단백질"은 Gly-Tβ4, 이의 폴리펩티드 또는 이의 전구체를 포함하며, 바람직하게 상기 Gly-Tβ4의 전구체는 GST 융합 티모신 β4(GST fusion thymosin β4, GST-Tβ4)를 의미한다. 본 발명의 구체예에 따르면, 시료에는 GST 융합 티모신 β4(GST fusion thymosin β4, GST-Tβ4) 함유한다.

본 발명에서는 적어도 4회 이상의 크로마토그래피를 수행한다. 바람직하게, 4회의 크로마토그래피를 수행한다. 가장 바람직하게, 2회의 음이온 크로마토그래피, 1회의 친화성 크로마토그래피, 1회의 양이온 크로마토그래피를 수행한다. 이외에, S1) 단계 이전 또는 이후, S2) 단계 이전 또는 이후, S3) 단계 이전 또는 이후, S4) 단계 이전 또는 이후, S5) 단계 이전 또는 이후, 또는 S6) 단계 이전 또는 이후에, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) 및 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 크로마토그래피는 모두 바람직하게, 결합 및 용출 방식(B/E)에 따른다. 상기 용어 "결합 및 용출 방식"은 정제될 목적 단백질을 함유하는 용액(예. 시료)이 크로마토그래피 물질에 적용되어, 목적 단백질이 크로마토그래피 물질에 결합하는 크로마토그래피 단계의 작업 방식을 의미한다. 따라서, 목적 단백질은 크로마토그래피 물질 상에 유지되는 반면, 목적 단백질에 해당되지 않는 물질은 관류 또는 상등액과 함께 제거된다. 목적 단백질은 그 다음에 용출 완충액에 의해 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 본 발명에 있어서, 결합 및 용출 방식에 따름으로써, 고효율의 고순도 목적 단백질 수득이 가능하다.

상기 용어 "적용"은 목적 단백질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 물질과 접촉하게 되는 정제 방법의 부분 단계를 의미한다. 이것은 (a) 용액이 크로마토그래피 물질이 함유된 크로마토그래피 장치에 첨가되거나, 또는 (b) 크로마토그래피 물질이 용액에 첨가되는 것을 의미한다. (a)의 경우, 용액은 장치를 통과하여 크로마토그래피 물질과 용액에 함유된 물질 사이의 상호작용을 가능하게 한다. 예를 들면, pH, 전도도, 염 농도, 온도 및/또는 유량과 같은 조건에 따라서, 용액의 일부 물질은 크로마토그래피 물질에 결합될 수 있고 다른 물질은 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다. 용액에 잔류하거나 또는 크로마토그래피 물질로부터 회수되는 물질은 관류(flow-through)에서 찾을 수 있다. 상기 용어 "관류"는 컬럼을 세척하기 위해 또는 크로마토그래피 물질에 결합된 물질의 용출을 유발하기 위해 사용되는, 적용된 완충액(또는 용액)일 수 있는, 장치 통과 후 수득되는 용액을 의미한다. 상기 장치는 컬럼 또는 카세트이다. (b)의 경우, 크로마토그래피 물질은, 예를 들면, 고체로서, 예를 들면, 정제될 해당 물질을 함유하는 용액에 첨가되어, 크로마토그래피 물질과 용액중 물질 사이의 상호작용을 가능하게 할 수 있다. 상호작용 후에, 크로마토그래피 물질은, 예를 들면, 여과에 의해 제거되며, 크로마토그래피 물질에 결합된 물질은 또한 그와 함께 용액으로부터 제거되는 반면, 크로마토그래피 물질에 결합되지 않은 물질은 용액중에 잔류한다.

본 발명의 크로마토그래피 단계에서 평형(또는 평형화), 적재, 세척 및 용출 공정이 포함되며, 각 공정에서 완충액이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "완충액"은 산-염기 복합 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 원하는 pH에 따라 사용할 수 있는 여러 가지 완충액이 문헌[Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological System, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 약학적으로 허용되는 완충액을 사용한다. 한 태양에서, 완충액은 인산 및/또는 그의 염으로 이루어진 포스페이트 완충액, 또는 아세트산 및 그의 염으로 이루어진 아세테이트 완충액, 또는 시트르산 및/또는 그의 염으로 이루어진 시트레이트 완충액, 또는 모폴린 완충액, 또는 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 완충액, 또는 히스티딘 완충액, 또는 글리신 완충액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스) 완충액으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 완충액은 트리스 완충액, 또는 트리스-염산 완충액 또는 시트레이트 완충액, 또는 히스티딘 완충액으로부터 선택된다. 완충액은, 예를 들면, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 염화암모늄 또는 황산암모늄과 같은 무기 염을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "평형 완충액"은 시료를 컬럼에 적재하기에 앞서 사용하며, 상기 평형 완충액은 예를 들어, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), 트리스(Tris)-염산(HCl), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 용어 "세척 완충액"은 목적 단백질을 용출하기에 앞서 이온 교환 수지를 세척 또는 재평형화하는데 사용되는 완충액을 의미한다. 이온 교환 수지를 "세척"하는 것은 적당한 (세척) 완충액이 이온 교환 수지를 통과하거나 지나치게 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), 트리스(Tris)-염산(HCl), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 용어 "용출"은 이온 교환 수지(또는 컬럼)로부터 분자(예를 들어, 목적 단백질 또는 오염 물질)를 용출시키는 것으로, 이온 교환 수지(또는 컬럼)를 둘러싸는 완충액의 이온 농도를 변화시켜 이온 교환 수지의 하전된 부위에 대해 완충액이 분자와 경합함으로써 이온 교환 수지(또는 컬럼)로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 용출은 목적 단백질의 효율적인 용리를 야기시키기에 충분한 완충액으로 수행하여 목적 단백질 함유 용출 완충액을 회수한다. 상기 "효율적인 용리"는 수지에 로딩된 목적 단백질 포함 용액의 75% 이상, 80% 이상 등, 예컨대, 85% 이상 등이 수지로부터 용출되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 용어 "용출 완충액"은 이온 교환 수지(또는 컬럼)으로부터 목적 단백질을 용출하는데 사용된다. 상기 용출 완충액은 예를 들어, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), 트리스(Tris)-염산(HCl), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 용출 완충액의 전도도 및(또는) pH는 목적 단백질이 수지(컬럼)로부터 용출되는 전도도 및(또는) pH이다. 본 발명에서의 상기 전도도 및(또는) pH는 사실상 모든 오염 물질 및 목적 단백질이 수지를 통해 용출되는 정도의 것이다.

본 발명에 있어서, 용어 "전도도"는 두 전극 사이의 전류 흐름을 통하게 하는 수용액의 능력을 의미한다. 용액에서는, 이온 운반에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 더 높은 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 측정 단위는 mmhos(mS/cm)이며, 시판되는 전도도 측정기, 예를 들어 오리온(Orion)을 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도도를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 원하는 전도도를 얻기 위해 용액 중 완충 물질의 농도 및(또는) 염(예를 들어, 시트르산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 인산나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 트리스(Tris), MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 및 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane sulfonate) 등)의 농도를 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 각종 완충액의 염 농도를 변경하여 원하는 전도도를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "동적 결합 능력(Dynamic Binding Capacity, DBC)"은 크로마토그래피를 진행하는 조건 하에서 일정 용량의 수지에 타겟 분자가 결합할 수 있는 능력(Q)을 의미한다. 물질과 물질 사이의 결합 능력은 온도, pH, 유속 등에 따라 평형 및 해리 상수 (K)의 변화를 가져오기 때문에, 필요한 수지의 용량을 계산하거나 컬럼 당 검체의 로딩량을 계산하기 위해서는 수지에서의 타겟 분자의 결합 능력을 알아두어야 한다. 동적 결합 능력은 얼마만큼의 물질을 분리 정제할 것인지를 정하는 참고 데이터로 사용될 수 있다. 동적 결합 능력은 컬럼에 모든 타겟 분자가 결합된 후 용출되기 시작하는 시점을 측정하며 일반적으로 로딩된 타겟 분자의 10%의 농도가 되는 시점을 기점 (Q_{B, 10%}: Binding Capacity at 10% Breakthrough point)으로 잡는다. 타겟 분자의 성질에 따라 Identity test 및 측정방법은 예를 들어 ELISA나 SEC, UV 흡광도 등의 분석법으로 10% breakthough point를 잡은 뒤, 로딩한 순간에서부터 해당 기점까지의 전체 볼륨을 계산하여 타겟 물질의 전체 양, 로딩 양(Loding amount) (V_10% * C₀) 을 계산한 뒤, 수지 볼륨(Resin volume) (Vc)로 나누어주면 된다 :

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본 발명의 방법에 따라 얻어진 목적 단백질 시료는 필요하다면 추가의 정제 단계를 거칠 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "정제"는 목적 단백질 및 1종 이상의 오염 물질이 혼합된 시료로부터 1종 이상의 오염 물질을 완전히 또는 부분적으로 제거함으로써, 목적 단백질의 순도를 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에 따르면, 최종 정제 원액의 순도가 97% 이상인 우수한 효과가 있다.

이하, 각 단계 별로 설명한다. 단, 각 단계에서 중복되는 설명은 과도한 반복을 피하기 위해 최초 언급되는 부분에서 1회만 설명하고 생략한다.

(S1) GST 융합 티모신 β4(GST fusion thymosin β4, GST-Tβ4)를 함유하는 시료를 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 1차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서의 음이온 교환 수지는 예를 들어 고체상에 부착된 1종 이상의 양으로 하전된 리간드로, 예를 들어 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 강염기성의 음이온 교환 수지로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 1차 음이온 교환 수지로 Fractogel EMD TMAE (M)을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 목적 단백질 용액 양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 음이온 교환 수지는 바람직하게는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.

본 발명의 구체예에 따르면, (S1) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피에서, 시료를 pH 8 ~ 9, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재할 수 있다. 더욱 바람직하게, pH 8, 전도도(conductivity) 2 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재할 수 있다.

본 발명에 있어서, (S1) 단계의 음이온 교환 크로마토그래피는 8 ~ 9의 pH의 완충액을 이용하여 수행된다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S1) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 컬럼은 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 로 pH가 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8가 되도록 평형화시킨다.

또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S1) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피의 이온 교환 수지는 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 포함 pH 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8의 완충액으로 세척한다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S1) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr, 바람직하게 200 cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 및 200 ~ 400 mM, 바람직하게 300 mM NaCl 포함 pH 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8의 완충액으로 용출한다.

본 발명의 구체예에 따르면, (S1) 단계의 음이온 교환 크로마토그래피에서의 동적 결합 능력은 5 ~ 9, 바람직하게 7.5 mg GST-Tβ4 / mL of resin 이다.

(S2) 용출물을 친화성 크로마토그래피하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "친화성 크로마토그래피" 는 목적 단백질이 목적 단백질에 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기법을 말한다. 상기 리간드는 일반적으로 생물특이적 리간드로 불리는바, 목적 단백질과 특이적 상호작용을 한다(예. 효소-기질, 효소-저해제, 항원-항체). 일부 구현예에서, 생물특이적 리간드는 크로마토그래피 수지에 공유결합으로 부착되고 용액이 크로마토그래피 수지에 접촉함에 따라 용액 중 목적 단백질에 접근가능하다. 목적 단백질은 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생물특이적 리간드에 대해 이의 특이적인 결합 친화성을 보유하나, 혼합물 중 다른 용질 및/또는 단백질은 뚜렷이 또는 특이적으로 리간드에 결합하지 않는다. 고정화 리간드에 대한 목적 단백질의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 수지를 통과하는 것을 허용하는 반면, 목적 단백질은 고체상 재료 상의 고정화 리간드에 특이적으로 결합된 채로 유지된다. 특이적으로 결합된 목적 단백질은 그 후 적합한 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등) 하에 고정화 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 앞서 컬럼을 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물 없이, 용출 완충액과 함께 크로마토그래피 컬럼을 통과한다.

친화성 크로마토그래피 단계에서의 친화성 수지는 고체상에 부착된 1종 이상의 리간드로, 예를 들면, Blue Trisacryl M, Protein A Ceramic HyperD, MEP HyperCel, Lysine HyperD, Heparin HyperD M, HA Ultrogel, 또는 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 친화성 수지를 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 친화성 수지로 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S2) 단계에서의 친화성 크로마토그래피를 위한 컬럼은 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 및 100 ~ 200 mM, 바람직하게 150 mM NaCl 로 pH가 7~9, 바람직하게 pH 8 이 되도록 평형화시킨 후, (S2) 단계에서의 친화성 크로마토그래피의 수지를 20 mM Tris-HCl 및 100 ~ 200 mM, 바람직하게 150 mM NaCl 을 포함하는 pH가 7~9, 바람직하게 pH 8인 완충액으로 세척하고, 친화성 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 53 ~ 73cm/hr, 바람직하게 63cm/hr의 유속으로, 40 ~ 60mM, 바람직하게 50 mM Tris-HCl 및 5 ~ 15 mM, 바람직하게 10 mM 글루타티온(Glutathione) 포함 pH 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8 인완충액으로 용출한다. 산 완충액으로는 90 ~ 110mM, 바람직하게 100 mM Sodium Acetate, 400 ~ 600 mM, 바람직하게 500 mM NaCl, pH 4~6, 바람직하게 4.5 를 사용하고, 염기 완충액으로는 50 ~ 150 mM, 바람직하게 100 mM Tris-HCl, 400 ~ 600 mM, 바람직하게 500 mM NaCl, pH 7~9, 바람직하게 pH 8을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에 따르면, (S2) 단계의 친화성 크로마토그래피에서의 GST-Tβ4에 대한 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow의 동적 결합 능력은 9.3 ~ 9.5 mg GST-Tβ4 / mL of resin 이다.

(S3) 용출물에 트롬빈 처리하여 효소 절단하는 단계를 포함한다.

본 단계에서는, 상기 (S2) 단계의 친화성 크로마토그래피를 거쳐 수득한 용출물에 효소 (특히, 트롬빈)를 처리한다. 본 단계를 통해, (S2) 단계의 친화성 크로마토그래피를 거쳐 수득한 용출물에 포함된 Gly-Tβ4의 전구체인, GST 융합 티모신 β4(GST fusion thymosin β4, GST-Tβ4)은 효소 절단에 의해 Gly-Tβ4가 된다. 따라서, 바람직하게, (S3) 단계 이전의 크로마토그래피에서 정제하고자 하는 목적 단백질은 GST-Tβ4이고, (S3) 단계 이후의 크로마토그래피에서 정제하고자 하는 목적 단백질은 Gly-Tβ4일 수 있다.

효소 (예를 들어, 트롬빈) 대비 목적 단백질 (예를 들어, GST-Tβ4)의 용량비는 이에 제한되지 않지만, 바람직하게 0.5 ~ 5 : 1 (unit:mg)이고, 더욱 바람직하게 3 ~ 1 : 1 (unit:mg), 가장 바람직하게 2 : 1 (unit:mg)이다. 0.5 ~ 5 : 1 (unit:mg) 범위 내에서 효소 반응율이 특히 우수하다. 효소 (특히, 트롬빈) 처리 시간은 이에 제한되지 않지만, 바람직하게 16~20 (h)이다. 효소 (특히, 트롬빈) 처리 온도는 이에 제한되지 않지만, 바람직하게 13~27 ℃, 더욱 바람직하게 20~24 ℃이다. 상술한 효소 용량, 효소 처리 시간 및 효소 처리 온도 등은 통상의 기술자가 조건에 따라 적절히 변경할 수 있으나, 상술한 바람직한 범위에서 가장 우수한 효과를 발휘한다.

(S4) 절단물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 2차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 3 mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 구체예에 따르면, 2차 음이온 교환 수지로 Fractogel EMD TMAE (M)을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, (S4) 단계의 음이온 교환 크로마토그래피는 8 ~ 9의 pH의 완충액을 이용하여 수행된다

본 발명의 구체예에 따르면, (S4) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피에서, 상기 단계의 절단물은 pH 8 ~ 9, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재할 수 있다. 더욱 바람직하게, pH 8, 전도도(conductivity) 2 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S4) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 컬럼은 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 로 pH가 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8 이 되도록 평형 완충액을 이용해 평형화시킨다.

또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S4) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피의 이온 교환 수지는 pH 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8의 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 포함 완충액으로 세척한다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S4) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr, 바람직하게 200cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30 mM, 바람직하게 20 mM Tris-HCl 및 30 ~ 130 mM, 바람직하게 80 mM NaCl 포함하는 pH 7 ~ 9, 바람직하게 pH 8의 용액으로 용출시켰다.

본 발명의 구체예에 따르면, (S4) 단계의 음이온 교환 크로마토그래피에서의 동적 결합 능력은 3 mg GST-Tβ4 / mL of resin 이하, 바람직하게 1.8 mg GST-Tβ4 / mL of resin 이다. 이때, 본 발명의 컬럼의 양과 동적 결합 능력을 곱하면, 최대 로드 양을 구할 수 있는바, 예컨대 컬럼의 양(수지의 부피)가 24 mL 이고 동적 결합 능력이 1.8 mg Gly-Tβ4 / mL of resin 일 때, Gly-Tβ4 의 최대 로드 양은 45.2 mg이다.

(S5) 용출물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 3 ~ 8 mg/mL 에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, "양이온 교환 크로마토그래피"는 목적 단백질과 수지에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 결합되어야 하는 분자는 양전하로 하전되며, 고정된 리간드는 음전하로 하전된다. 통상적으로 이용되는 양이온 교환 수지는 S-수지(설포네이트), SP 수지(설포프로필), SE 수지(설포에틸), 및 CM 수지(카르복시메틸)이다. 그러나, 일반적으로, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 모든 상업적으로 구입가능한 양이온 교환 수지에 의해 수행될 수 있다. 전형적인 상업적으로 구입가능한 제품은 예를 들면, Macro-Prep High S, Macro-Prep CM, Unosphere Rapid S, Unosphere Rapid S40, Nuvia S, 및 Nuvia HR-S(Bio-Rad, California, USA), Toyopearl CM, Toyopearl SP, 및 Toyopearl GigaCap S(Tosoh Bioscience, Germany), Milli기공 ProRes S, Fractogel EMD COO-, Fractogel EMD SO3-(Merck KGaA, Germany), Biosepra CM 세라믹 HyperD, Biosepra S 세라믹 HyperD, S HyperCel(Pall Corperation, New York, USA), Poros HS, Poros XS(Applied Biosystems, Germany), YMC BioPro 30S, YMC BioPro 70S(YMC Europe) CM-Sepharose FF, SP-Sepharose FF, S-Sepharose FF, SP-Sepharose HP, SP-Sepharose XL, SP-Sepharose Big Beads, CM-Sephadex, Capto S, Capto SP ImpRes, 및 Source S(모두 GE Healthcare, Germany)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "양이온 교환 수지"에는 이온 교환 기능과 소수성 상호작용 기능의 혼합 방식 크로마토그래피 수지(예; Capto adhere, Capto MMC, MEP HyperCell, Eshmuno HCX 등), 음이온 교환기능과 양이온 교환 기능의 혼합 방식 크로마토그래피 수지(예; hydroxyapatite, Ceramic hydroxyapatite 등) 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 양이온 교환 수지는 설포네이트 또는 설포프로필 리간드를 이용하는 강 양이온 교환기이다. 가장 바람직한 것은 고도로 가교결합된 아가로스, 예를 들어, Nuvia HR-S, 또는 폴리(스티렌비닐벤젠), 예를 들어, Poros 50 HS와 같이 단단한 매트릭스에 결합된 설포네이트 또는 설포프로필 리간드이다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 양이온 교환 수지로 설포네이트 기 및 고도로 가교결합된 아가로스 매트릭스에 기반하는 강 양이온 교환기인 Nuvia HR-S을 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, (S5) 단계의 양이온 교환 크로마토그래피는 4 ~ 7의 pH의 완충액을 이용하여 수행된다.

본 발명의 구체예에 따르면, (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피에서, 절단물은 pH 4 ~ 7, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재할 수 있다. 더욱 바람직하게, pH 4.5, 전도도(conductivity) 2 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피를 위한 컬럼은 10 ~ 30mM, 바람직하게 20 mM 아세테이트로 pH가 4 ~ 5, 바람직하게 4.5 가 되도록 평형화시킨다.

또한, 본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피의 이온 교환 수지는 10 ~ 30mM, 바람직하게 20 mM 아세테이트 및 50 ~ 150 mM, 바람직하게 100 mM NaCl 포함하는 pH 4 ~ 5, 바람직하게 pH 4.5의 완충액으로 세척한다.

본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명의 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr, 바람직하게 200 cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30mM, 바람직하게 20 mM 아세테이트 및 150 ~ 210 mM, 바람직하게 180 mM NaCl 포함하는 pH 4 ~ 5, 바람직하게 pH 4.5의 완충액으로 용출한다.

본 발명에 있어서, (S5) 단계의 양이온 교환 크로마토그래피에서의 동적 결합 능력은 8 mg 이하 Gly-Tβ4 / mL of resin, 3 ~ 8 mg Gly-Tβ4 / mL of resin, 바람직하게 5 mg Gly-Tβ4 / mL of resin 이다. 이때, 본 발명의 컬럼의 양과 동적 결합 능력을 곱하면, 최대 로드 양을 구할 수 있는바, 컬럼의 양(수지의 부피)가 12.6 mL 이고 동적 결합 능력이 5 mg Gly-Tβ4 / mL of resin 일 때, Gly-Tβ4 의 최대 로드 양은 63 mg이다.

(S6) 용출물을 여과하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 (S6) 단계의 여과는 당업계 공지된 다양한 방법에 따를 수 있으나, 바람직하게 나노여과(nanofiltration) 또는 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게 한외여과/투석여과를 이용할 수 있다. 한외여과/투석여과에 따르면, 용매와 분자크기가 다른 2가지 이상의 용질이 함유된 유체로부터 일부 용질만 제거하는 방법으로서 고분자 물질의 정제에 효과적이며, 일반 투석법에 비하여 시간과 경비가 절감되는 장점이 있다. 상기 한외여과/투석여과는 삼투압 330 mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 8로 조절하는 것을 특징으로 한다.

본 단계에 의해, 용출물은 투석되고 농축될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 시료는 다음 단계를 포함해 수득할 수 있다:

목적 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 상기 숙주 세포를 파쇄하는 단계; 및 파쇄물을 세척 및 여과하는 단계.

상기 목적 단백질에는 Gly-Tβ4, 이의 폴리펩티드, 이의 전구체가 포함되며, 상기 Gly-Tβ4의 전구체에 GST 융합 티모신 β4가 포함된다.

본 발명에서 사용되는 숙주 세포는 당업계 공지된 다양한 종이 사용될 수 있으며, 본 발명의 구체예에 따르면, E.coli를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 용어 "배양"에는 숙주 세포의 생존 내지 증식을 위한 종배양과 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키기 위한 발효용 본배양이 포함된다.

본 발명에서 사용되는 숙주 세포는 여러가지 배지에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어 Ham's F10(시그마사(Sigma)), LB (Lysogeny broth) 배지, 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium(MEM), (시그마사)), RPMI-1640(시그마사) 및 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, 시그마사))가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 함(Ham) 등의 문헌[Meth. Enz. 58:44 (1979)], 반스(Barns) 등의 문헌[Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호, 제4,657,866호, 제4,927,762호, 제4,560,655호 또는 제5,122,469호, 국제 특허 출원 공개 제90/03430호, 제87/00195호 또는 미국 특허 제30,985호에 기재된 임의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 임의 배지에 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 증식 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 겐타마이신(GENTAMYCIN, 등록상표) 약물), 미량 원소(일반적으로, 최종 농도에서 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원을 보충할 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적합한 농도로 포함시킬 수도 있다. 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대한 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 기존에 사용되던 조건이며 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

본 발명의 종배양 및 본배양을 위한 배지는 상술한 배지 및 필요한 보충물 중에서 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으나, 바람직하게 종배양은 LB 배지에서 35~40℃, 바람직하게 37℃의 온도에서 3~4h 동안 배양하고 OD₆₀₀이 2~6 이 되면 배양 종료할 수 있다. 또한, 본배양은 글루코스 및 MgSO_4·7H₂O 를 보충하는 Feed A 및 트립톤 및 이스트 추출물을 보충하는 Feed B 에서 수행될 수 있다. 또한, 본배양은 35~40℃, 바람직하게 37±0.5℃의 온도에서 17h 이하 동안 pH 7~8에서 수행하는 것이 바람직하다. 본배양은 바람직하게 Feed A에서 시작하고 OD₆₀₀이 40 ~ 65, 바람직하게 49 ~ 59에서 인덕션(Induction)을 시작하면 IPTG 첨가 및 온도 변동(25 ~ 35℃, 바람직하게 30℃)과 함께 Feed B를 적용하고 인덕션이 종료하면 Feed B 배지 공급은 중단할 수 있다. 이로써, 세포 성장 및 목적 단백질 생산성을 극대화할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 배양은 바람직하게 패드-뱃치(fed-batch) 발효 공정에 따를 수 있다. 상기 패드-뱃치는 배양의 진행과 동시에 영양배지를 발효조에 서서히 첨가하면서 배양종료까지 발효조에서 배양액을 뽑지 않는 배양방법을 의미한다. 본 발명에서, 패드-뱃치 발효 공정에 따르면, 높은 생산성을 나타내며, 배지 침전물 및 아세테이트 형성의 단점을 해소할 수 있는 우수한 효과가 있다. 본 발명의 배양 방법에 따르면, 세포생산성은 180 g pellet/L 이상, 바람직하게 185 g pellet/L 이상 이고, 목적 단백질(GST-T4) 생산성은 54 mg/g pellet 이상, 바람직하게 56 mg/g pellet 이상의 우수한 효과가 있다.

숙주 세포는 목적 단백질 발현을 위해 바람직하게, 재조합 기술을 사용하는 경우, 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되며, 프로모터를 유도하고 형질전환체를 선별하고 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적합하게끔 변형된 통상의 상술한 배지에서 배양된다.

본 발명에 있어서, 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현하기 위해, 재조합 기술을 사용하는 경우, 목적 단백질은 세포내, 막간 공간에서 생성되거나 또는 배지내로 직접 분비될 수 있다. 목적 단백질이 세포내에서 생산되는 경우, 숙주 세포를 파쇄하고 파쇄물을 세척 및 여과하는 단계가 포함되는바, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용균 세포의 파쇄 미립자(예를 들어, 균질화하여 생성됨)가 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 목적 단백질이 배지내로 분비되는 경우, 이 발현 계의 상등액은 일반적으로 시판 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 먼저 농축된다. 바람직하게, 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 숙주 세포를 파쇄하는 단계 및 파쇄물을 세척 및 여과하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따르면, 고순도의 Gly-Tβ4를 대규모로 안정적으로 제조할 수 있는바, 산업적 이용 가치가 우수한 Gly-Tβ4를 경제적이고 고효율로 수득할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 5 L verification run feeding strategy를 도시한 것이다.
도 2는 50 L verification run feeding strategy를 도시한 것이다.
도 3은 Cell growth 및 glucose & acetate 농도 (verification run 5 L 배양)를 도시한 것이다.
도 4는 SDS-PAGE 분석 (5 L verification run)결과를 도시한 것이다.
도 5는 Cell growth 및 glucose & acetate 농도 (verification run 50 L 배양)를 도시한 것이다.
도 6은 SDS-PAGE 분석 (verification run 50 L 배양)결과를 도시한 것이다.
도 7은 Flask 배양 cell growth (flask 1: w/YE, flask 2: w/o YE)를 도시한 것이다.
도 8은 Cell growth 및 glucose & acetate 농도 (5 L fed-batch growth 테스트)를 도시한 것이다.
도 9(도 9a 내지 도 9m)는 DoE 13 runs의 cell growth 및 배양액내 glucose & acetate 잔존량을 도시한 것이다.
도 10은 SDS-PAGE & Protein quantification (Run 정보: DoE 12, 7, 8, 5, 10, 2, 13)을 도시한 것이다.
도 11은 SDS-PAGE & Protein quantification (Run 정보: DoE 11, 3, 9, 1, 6, 4)을 도시한 것이다.
도 12는 DoE 분산분석의 적합도 결과 (잔차 그림)를 도시한 것이다.
도 13은 Minitab 반응조건 최적화를 도시한 것이다.
도 14는 반응치 (GST-TB4 및 세포 생산성)에 대한 등고선도를 도시한 것이다.
도 15는 Cell growth 및 glucose & acetate 농도 (DoE 최적조건 재현성 확인)를 도시한 것이다.
도 16은 SDS-PAGE & Protein quantification 분석 1 (최적조건 재현성 뱃치)을 도시한 것이다.
도 17은 SDS-PAGE & Protein quantification 분석 2 (최적조건 재현성 뱃치)를 도시한 것이다.
도 18은 Cell growth 및 glucose & acetate 농도 (최적조건 50 L 규모 Scale-up)를 도시한 것이다.
도 19는 50L verification Run Downstream Process Flow Chart를 도시한 것이다.
도 20은 SDS-PAGE analysis for cell lysate by cell disruption buffer conditions 를 도시한 것이다.
도 21은 SDS-PAGE analysis for ammonium sulfate study in cell lysate 를 도시한 것이다.
도 22는 Regression curve for GST-Tβ4 using Affinity column 를 도시한 것이다.
도 23은 AEXI process chromatography for linear flow rate 61 cm/hr 를 도시한 것이다.
도 24는 AEXI process chromatography for linear flow rate 200 cm/hr 를 도시한 것이다.
도 25(도 25a 내지 도 25b)는 SDS-PAGE Analysis for Linear flow rate study (a: 61 cm/hr, b: 200 cm/hr) 를 도시한 것이다.
도 26은 AEXI process chromatogram for 500 mM NaCl elution condition 를 도시한 것이다.
도 27은 AEXI process chromatogram for 200 mM NaCl elution condition 를 도시한 것이다.
도 28(도 28a 및 도 28b)은 SDS-PAGE Analysis for elution buffer study (a: 500mM NaCl, b: 200mM NaCl) 를 도시한 것이다.
도 29는 AEXI process chromatogram for loading sample condition (Control) 를 도시한 것이다.
도 30은 AEXI process chromatogram for loading sample condition (50 mM NaCl) 를 도시한 것이다.
도 31은 AEXI process chromatogram for loading sample condition (80 mM NaCl) 를 도시한 것이다.
도 32(도 32a 및 도 32b)는 SDS-PAGE Analysis for loading sample & EQ buffer study(a: 80mM NaCl, b: 50mM NaCl) 를 도시한 것이다.
도 33(도 33a, 도 33b 및 도 33c)은 SDS-PAGE Analysis for AEX DBC test(a: 10 mg GST-Tβ4/mL of Resin, b: 8 mg GST-Tβ4/mL of Resin, c: 75 mg GST-Tβ4/mL of Resin) 를 도시한 것이다.
도 34(도 34a 및 도 34b)는 Hold time study with AEXI eluted pool in two different conditions(a: storage temp 2~8 ℃, b: storage temp 18~22 ℃) 를 도시한 것이다.
도 35는 Affinity chromatogram for linear flow rate 90 cm/hr 를 도시한 것이다.
도 36은 Affinity chromatogram for linear flow rate 180 cm/hr 를 도시한 것이다.
도 37(도 37a 및 도 37b)은 AEXI chromatogram for scale up test from XK16(a) to XK50(b) 를 도시한 것이다.
도 38(도 38a 및 도 38b)은 Affinity chromatogram for feasibility test in LRC10 scale(a)와 XK50 scale(b) 를 도시한 것이다.
도 39(도 39a 및 도 39b)는 Hold time study with Affinity eluted pool in two different conditions(A: storage temp 2~8℃, B: storage temp 18~22℃) 를 도시한 것이다.
도 40은 SEC-HPLC chromatogram of reaction mixtures after digestion at three different temperatures 를 도시한 것이다.
도 41은 CEX process Chromatogram in pH 45 condition 를 도시한 것이다.
도 42는 RPC-HPLC chromatogram for CEX process in pH 45 condition 를 도시한 것이다.
도 43(도 43a 및 도 43b)은 HIC chromatogram for Butyl (a) and Phenyl (b) 를 도시한 것이다.
도 44는 CaptoMMC Process chromatogram 를 도시한 것이다.
도 45는 RP-HPLC analysis for MMC process elution fraction 를 도시한 것이다.
도 46은 MMC chromatogram by step elution after wash 를 도시한 것이다.
도 47은 MMC Chromatogram for 100mM NaCl Washing step 를 도시한 것이다.
도 48은 MMC Chromatogram for 120mM NaCl Washing step 를 도시한 것이다.
도 49는 MMC Chromatogram for 140mM NaCl Washing step 를 도시한 것이다.
도 50은 DSP flow chart 를 도시한 것이다.
도 51은 SEC-HPLC analysis for AEXII DBC elution sample 를 도시한 것이다.
도 52는 AEXII process chromatogram for loading amount 1mg Gly-Tβ4 per resin mL 를 도시한 것이다.
도 53은 AEXII process chromatogram for loading amount 15mg Gly-Tβ4 per resin mL 를 도시한 것이다.
도 54는 RP-HPLC analysis for AEXII process elution sample 를 도시한 것이다.
도 55는 AEXII process chromatogram with increased conductivity of loading sample 를 도시한 것이다.
도 56은 RP-HPLC chromatogram for AEXII hold time study 를 도시한 것이다.
도 57은 CEX process chromatogram (at Huons) 를 도시한 것이다.
도 58은 CEX process chromatogram (at BINEX) 를 도시한 것이다.
도 59는 CEX process chromatogram for prepack column (Height 10cm)를 도시한 것이다.
도 60은 CEX process chromatogram for XK16 column (Height 20cm) 를 도시한 것이다.
도 61은 CEX process chromatogram with bed height 10cm column 를 도시한 것이다.
도 62는 RP-HPLC chromatogram for CEX hold time study 를 도시한 것이다.
도 63은 AEXI process chromatogram at 5L scale process 를 도시한 것이다.
도 64는 Affinity process chromatogram at 5L scale process 를 도시한 것이다.
도 65는 AEXII process chromatogram at 5L scale process 를 도시한 것이다.
도 66은 CEX process chromatogram at 5L scale process 를 도시한 것이다.
도 67(도 67a, 도 67b 및 도 67c)은 AEXI process chromatogram (a: Cycle 1, b: Cycle 2, c: Cycle 3) 를 도시한 것이다.
도 68(도 68a, 도 68b 및 도 68c)은 Affinity process chromatogram (a: Cycle 1, b: Cycle 2, c: Cycle 3) 를 도시한 것이다.
도 69(도 69a 및 도 69b)는 AEXII process chromatogram (a: Cycel 1, b: Cycle 2) 를 도시한 것이다.
도 70(도 70a 및 도 70b)은 CEX process Chromatogram (a: Cycle 1, b: Cycle 2) 를 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[1. 발효공정]

실시예 (1) 균주 정보

Escherichia coli BL21 균주를 이용하여, GST-TB4 (GST-fusion Human Thymosinβ4) 생산 재조합 균주를 제작하였고, RCB를 제조하여 본 발명에 사용하였다(표 1).

실시예 (2) 중국 Northland 공정 재현성 확인

(2-1) 5 L 규모 배양

중국 Beijing Northland Biotech사의 30 L 배양 batch record (이하 "NR 공정") 자료를 참고하여 5 L 규모로 scale-down 배양공정 조건을 도출하였고 (표 2, 3 및 4), 1 ~ 4차 배양을 진행하였다.

5 L verification run 배양 조건

5 L verification run 배지 조성

Microelement solution 조성 (verification run)

(2-2) 50 L 규모 시료 생산

5 L 규모 배양 결과 및 일부 조건 변경 결과를 토대로, 시료생산을 위한 50 L 규모의 scale-up 조건을 도출하였다(표 5 및 표 6). 아울러, 50 L feeding strategy 확립한 후, 2 뱃치의 비임상 시료 생산을 위한 공정을 진행하였다(도 1).

50 L verification run 배양 조건

50 L verification run 배지조성

실시예 (3) GST-TB4 생산성 증대를 위한 fed-batch 발효공정 개발

상술한 NR 공정에서, 낮은 생산성, 배지 침전물 형성, acetate 축적 등 기타 여러 문제점이 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 문제점을 해소할 수 있는 기본 배지 조성 및 공정조건을 개발하고자 하였다.

(3-1) Flask 배양 (batch-culture )

BNS-platform의 배지조성으로 yeast extract (이하 “YE”)성분의 첨가 유무를 통해 flask 배양실험 (flask 1, 2)을 진행하였다 (표 7, 8). Fed-batch 공정 개발을 위한 균주 특이적인 growth parameter를 파악하고, fermenter 본배양 수행을 위한 종배양 조건을 확인하였다.

Flask test 배지조성

Flask test 배양조건

(3-2) 5 L 규모 fed-batch 배양 조건

(3-2-1) Feeding strategy

Fed-batch 배양 parameter (표 9)를 설정하여 Feed-A 배지의 최적 feeding 속도를 산출하였다. Feed-B는 DoE 실험 조건에 따라 induction 구간 (induction 시작 ~ 배양 종료) 동안 constant feeding 방식으로 제조량이 모두 첨가될 수 있는 속도를 계산하여 적용하였다(표 10).

Exponential feeding parameter

DoE fed-batch 배양 feeding strategy

(3-2-2) 배지제조 및 공정 조건

initial media 2.5 L에서 시작해서 4.2 L (feed-A 0.7 L, feed-B 1.0 L) 규모로 종료되는 DoE fed-batch 배양 공정을 수립하였고 (표 11, 12, 13), DoE 배양 실험에 동일하게 적용하였다.

DoE fed-batch 배양 배지조성 (BNS-Platform)

Microelement solution 조성 (BNS-Platform)

DoE fed-batch 배양 공정 조건

(3-3) 최적 fed-batch 배양조건 도출

Induction strategy를 최적화 하기 위하여 Response surface method (이하 “RSM”) 실험을 설계하였다. Minitab 소프트웨어로 2 개의 인자 (induction 시작 시점, induction 온도)에 대한 2수준 완전 중심합성 실험을 설계하여 13 runs의 fed-batch 배양 실험을 진행하였다 (표 14~16).

DoE 실험인자 (factor) 및 조건 범위

DoE 실험 설계 조건

2 수준 완전 중심합성 요인 실험설계

(3-4) 최적 배양공정 재현성 확인

RSM DoE 배양 실험 결과를 통계적으로 분석하여 최적 조건 및 반응치의 목표기준을 도출하였고, 최적 조건으로 배양을 진행하여 결과의 재현성을 확인하였다(표 17).

DoE 최적조건 재현성 확인

실시예 (4) 최적조건 50 L 규모 Scale-up (시료생산)

(4-1) 배양공정 조건

5 L 규모 공정개발 최적조건을 scale-up하여 시료생산을 위한 50 L 배양 공정을 수행하였다 (표 18, 19).

최적조건 50 L 규모 Scale-up 배양 조건

* 배양온도 및 pH는 BNS-platform 조건임

** 75 L 장비 최대 교반속도 700 rpm 반영함.

최적조건 50 L 규모 Scale-up 배지조성

(4-2) 회수공정 조건

(4-2-1) Cell slurry 회수

(A) 배양액 회수

- 회수시점: 배양액 냉각 (≤15.0℃) 후 overnight

- 회수부피: 40 ~ 42 L

(B) Cell slurry 회수 (연속원심분리 공정)

① 1차 회수

- 회수 전 고형분 함량: ≥20%

- Bowl 회전속도: 9,500 rpm (11,119 x g)

- Inlet flow rate: 100 L/M

- Outlet pressure: 100 kPa

- Cell 세척: 3차수 40 L

② 2차 회수

- 회수 전 고형분 함량: ≥ 10%

- Bowl 회전속도: 9,500 rpm

- Inlet flow rate: 100 L/m

- Outlet pressure: 100 kPa

- Cell 세척: 3차수 40 L

③ 3차 회수

- 회수 전 고형분 함량: ≥10%

- Bowl 회전속도: 9,500 rpm

- Inlet flow rate: 100 L/m

- Outlet pressure: 100 kPa

(4-2-2) 세포파쇄 및 상등액 회수

(A) Lysis buffer 제조 (20Ⅹ)

- 400 mM Tris buffer, pH 8.0 ± 0.2 (적정시약: HCl), Conductivity 17 ± 2 mS/cm

- 400 mM Tris buffer 조성: Tris 21.8 g/L, Tris-HCl 34.7 g/L

(B) Cell slurry preparation (15±1.5%, w/w)

① 20Ⅹ lysis buffer와 3차수를 첨가하여 고형분 15±1.5% 가 되도록 부피를 맞추었다.

② 산출공식

# Total weight = Cell cake weight / 0.15

# 20X Lysis Buffer weight = Total weight / 20

# 3차수 첨가량 = Total weight - slurry weight - 20X Lysis buffer weight

(C) CIP (Microfluidizer)

- 0.5 N NaOH: 11,000 psi 조건, 300 mL 1회, 500 mL 1회

- 3차수: 11,000 psi 조건, 300 mL 1회, 500 mL 1회

(D) 세포파쇄 (Microfluidizer)

① EQ: 11,000 psi 조건, *1Ⅹ lysis buffer 300 mL

② 세포파쇄: 11,000 psi 조건, 15±1.5% Cell slurry 파쇄 2회 연속

- 세포파쇄 기준: 파쇄 전후 OD 비율 ≤ 30%

- 세포파쇄율 계산: (파쇄 후 OD₆₀₀ / 파쇄 전 OD₆₀₀) ⅹ 100

③ Flushing: 11,000 psi 조건, 1Ⅹ lysis buffer 50 mL

(E) Cell lysate 상등액 회수 (연속원심분리)

- Bowl 회전속도: 9,500 rpm

- Inlet flow rate: 100 L/M

- Outlet pressure: 250 kPa

(4-2-3) Depth filtration

(A) Filter 정보

① Depth filter:

- Millistak+ POD C0HC: 0.11 ㎡ ⅹ 2ea

- Millistak+ POD F0HC: 0.11 ㎡ ⅹ 2ea

② Membrane filter

- Opticap XL10 (0.45μm) 0.69 ㎡ⅹ 1ea

(B) Filter washing

- Depth filter: 3차수 100 L/ ㎡, flow rate 300 LMH (1,100 mL/min)

- Sterile filter: 3차수 10 L/㎡, flow rate 1,000 mL/min

(C) Depth filtration

실시예 (5) 배양액 분석

(5-1) Cell density 측정

배양액의 균체 농도는 600nm에서 흡광도 (Optical density)를 측정하였다. 배양액 1 mL을 취해서 OD₆₀₀=0.2~0.5 가 되도록 증류수로 희석한 다음 흡광도 (OD₆₀₀)를 측정하고, 흡광도 (OD₆₀₀)값에 희석배수를 곱해서 cell density를 구하였다. 샘플 희석은 표 20의 방법으로 표준화하여 진행하였다.

OD value 측정 희석조건

(5-2) 세포대사물 측정

배양액의 glucose 및 acetate 농도는 배양액 1 mL을 13,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리 후 상등액을 Cedex Bio (Roche, Switzerland) 장비로 측정하였다(SOP No. FE02-921).

(5-3) 세포생산성 측정

(5-3-1) Wet cell weight 측정 (g/L)

다음의 방법으로 Wet cell weight를 측정하였다.

① 500 mL tube + SUPPORT CUSHION 무게 측정 (2개 준비)

② 배양액 500 mL씩 분주 (500 mL 메스실린더 사용)

③ 4500 rpm, 4℃ 조건으로 1시간 동안 원심분리 (CE-6140 장비)

④ 상등액 비우고 pellet 포함된 용기 (tube + cushion) 무게 측정

⑤ Wet cell weight 무게 계산 (g/L)

Wet cell weight =

(Pellet 포함 무게 - 용기무게) g /0.5 L (배양액 부피)

⑥ 세포생산성은 wet cell weight 측정치 2 개의 평균으로 결정하였다.

(5-3-2) 고형분 함량 측정 (%)

① Micro tube 2개 준비

② 정밀저울로 tube 무게 각각 측정 및 기록

③ 배양액 1 mL 포함된 tube 무게 측정 및 기록

④ 13,000 rpm, 4℃ 조건으로 5분 원심분리

⑤ 상등액 비우고 pellet 포함된 tube 무게 측정

⑥ 고형분 함량 (%) 계산

⑦ 고형분 함량 측정치 2 개의 평균값을 취함

(5-4) GST-TB4 생산성 측정 (SDS-PAGE & Protein quantification)

① OD600=5의 cell pellet 샘플에 lysis buffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.1 % 2ME, 5 mM EDTA, pH 7.0) 1,000 μL를 넣고 vortexing 실시

② Sonication 10 초 실시하고 ice에서 1분 방치 (7회 반복)

③ 10,000 X g에서 20 분 원심분리 후 상등액 15 μL를 취함

④ BSA (bovine serum albumin) 단백질 표준시약을 0.5, 1, 2, 4 μg의 양이 각각 첨가되도록 맞추어서 15 μL의 부피로 준비

⑤ 샘플 15 μL (원심분리 상등액 및 BSA standard)와 ④에서 준비한 sample buffer mixture 5 μL를 각각 섞음 (총부피 20 μL)

⑥ 70℃, 10 분 반응

⑦ 시료 전체 (20 μL)를 gel의 각 well에 로딩

⑧ 200 V, 400 mA 조건으로 35 분 running

⑨ Coomassie blue staining 20 분 이상 실시

⑩ Destaining 2 시간 이상 실시

⑪ Densitometer 장비에서 gel band density의 image 분석

실험예 (1) 중국 Nothland 공정 재현성 확인

(1-1) 5 L 규모 배양

NR공정을 scale-down 하여 5 L 규모 verification run을 수행하였고, SDS-PAGE 분석을 통해 GST-TB4의 정상적인 발현을 확인하였다 (도 4). 최종 cell density가 OD₆₀₀=85, 81, 61, 41, 86으로서 (표 21), 3차 2 뱃치 (Batch No. 160428-B1, B2)를 제외하고 NR공정과 유사한 growth를 나타내었다 (도 3). 그러나 전체공정에서 배양액 내 glucose가 누적되어 feed-A 공급 중단 및 재개를 통해 제어하였고, 4차까지 진행하면서 계속적인 C-source (feed-A 배지) 공급 개선을 시도하였으나, 4차 공정을 제외하고 acetate의 축적이 관찰되다. 따라서 feed-A 배지의 더 정밀한 feeding 속도 개선이 필요하였다. 또한 배지조제 후 침전물이 많이 형성되었고, 배지조성의 pH가 최적화되어 있지 않아서 접종 전 별도의 적정 과정이 요구되는 등 기존 NR 공정의 단점이 확인되었다.

5 L verification run 배양결과

(1-2) 50 L 규모 배양 (시료 생산)

NR공정을 scale-down하여 수행한 5 L 규모 verification 배양 결과를 토대로 50 L 규모 공정 조건을 도출하였고 (표 5~6, 도 2), 2 뱃치의 50 L 시료 생산 공정을 수행하였다. NR공정 (30 L 규모 배양 결과)에 비해 배양 초기 세포 성장의 lag phase가 두 뱃치(1, 2차) 모두 길었으나, 최종 cell density는 OD₆₀₀=84, 98 에 각각 도달하면서 NR공정과 유사하였다 (도 5, 표 22). Acetate 농도는 두 뱃치 모두 1 g/L 이하로 배양 종료까지 잘 제어되었으나, 2차 뱃치 (Batch No. 160729)의 경우 배양 후반기 (17 h 이후)에 glucose가 2 g/L까지 축적되었다. SDS-PAGE 분석을 통해 GST-TB4 발현을 확인하였고 (도 6), 배양액의 연속원심 분리 공정 후 최종 3.0 kg, 3.3 kg의 균체를 회수하였다 (표 22).

50 L verification run 배양결과

실험예 (2) GST-TB4 생산성 증대를 위한 fed-batch 발효공정 개발

(2-1) Flask 배양

DoE fed-batch 배양공정의 feeding rate를 산출하기 위해 필요한 cell growth parameter 및 종배양 공정 시간을 확인하기 위해서 flask 배양 실험을 수행하였다. Flask 1은 fed-batch의 initial media와 동일한 배지조성이고, flask 2는 initial media에서 YE만 제외된 조성으로 batch culture를 진행하였다. Flask 1 (YE 포함)은 flask 2에 비해 lag phase 구간이 짧았으며, 최대 cell density (OD₆₀₀)는 각각 8.3 (flask 1), 6.9 (flask 2)까지 성장하였다 (도 7). Exponential phase 구간의 OD value 및 glucose 농도를 토대로 glucose 기질에 대한 세포수율 (Y_X/S)과 최대 비성장 속도 (μm)를 각각 산출하였다 (표 23). Fermenter를 이용한 5 L fed-batch 배양 실험은 YE가 첨가된 배지조성을 선택하였고, 따라서 flask 1의 parameter 값을 사용하여 feeding 속도를 산출하였다. 5 L fed-batch 종배양 공정은 OD₆₀₀=≥2, 배양시간은 4 h 이상으로 결정하였다.

HU024 cell growth parameter

(2-2) Feeding strategy

(2-2-1) Exponential fed-batch parameter

앞서 진행된 flask 1의 배양 테스트 결과를 참고하여 C-source의 feeding 속도를 계산하기 위한 각 parameter를 표 24와 같이 설정하였다. YE가 포함된 initial media 조성의 flask batch culture에서 최대 비성장 속도 (μm)는 0.43 h^-1이었는데 (표 23), E.coli 배양 시 균체의 빠른 성장은 soluble 단백질 타입의 product 생산에 불리하기 때문에, 정밀한 feeding 속도 제어를 통해 quasi-steady state 상태를 유도하여 비성장 속도를 0.3 ~ 0.14 h^-1로 제어하고자 하였다.

Exponential fed-batch parameter

(2-2-2) Feeding 속도 계산 (feed-A)

Feed-A 배지의 feeding 속도는 아래의 식들을 이용하여 산출하였다. 각 parameter 값 (표 24)을 식 ④에 대입하여 batch-culture가 종료되는 시점의 첫 번째 feeding 속도를 산출하였고, 이어서 VX 값 (식 ①), V값 (식 ②), X값 (식 ③), F값 (식 ④)을 순서대로 1시간 단위 (dt)마다 계산하였다. 계산된 flow rate (F)는 L/h 단위이므로, mL/min 단위로 전환 후 다시 최종적으로 펌프 장비의 속도 단위인 g/min 단위로 전환하였다 (표 25).

Exponential feeding 속도 계산

(2-3) Fed-batch 공정에서의 cell growth 확인

5 L 발효기를 이용한 fed-batch 공정에서 기본적인 cell growth 확인을 위해서, 산출된 feed-A feeding 속도 (표 23)를 적용하여 feed-A만 공급하면서 fed-batch 배양을 진행하였다(도 8). 배양 종료까지 총 788.8 mL의 feed-A 배지가 공급되었고, 배양기 내에 유입된 glucose 총량 397 g (초기 glucose 포함)을 최종 배양부피 (3.3 L)로 환산하여 기질수율 (Y_X/S)을 적용했을 때 예측되는 최대 cell density가 OD₆₀₀=136인데, 이는 실제 배양 결과의 최대 cell density (OD₆₀₀=142)와 거의 유사하였다. Acetate 농도는 배양 시작부터 종료까지 1 g/L 미만으로 잘 제어되었고, 배양 3 h를 지나면서 initial media에 있던 초기 glucose가 급격히 소모되면서 glucose feeding을 시작한 (4h) 이후에도 배양 종료까지 계속 0 g/L에 가깝게 잘 제어되었으며, 실제 cell growth 또한 설정된 μ값에 가깝게 quasi-steady state가 잘 유도되었기 때문에, 앞서 산출된 feeding 속도 (표 25)는 적절한 것으로 판단되었다. 또한 본 fedbatch 배양 실험의 cell growth 결과는 DoE 배양 실험의 induction 시점을 예측하기 위한 자료로도 활용하였다.

(2-4) 최적 배양조건 도출 (DoE)

(2-4-1) 배양결과

DoE RSM 설계 조건대로 13 runs의 배양을 진행하였다. 각 DoE 조건의 induction 시작 시점에 IPTG 첨가 및 온도 shift와 동시에 feed-B 배지 feeding을 시작하였으며, 고농도 YE로 구성된 feed-B 배지는 induction 구간만 공급하여 cell growth 및 GST-TB4 생산성을 극대화하는 전략으로 배양을 진행하였다. DoE 5번 뱃치 (Batch No. 161027-B1)를 제외하고 최대 cell density OD₆₀₀= 140 ~ 196까지 성장하였고, glucose 및 acetate의 과잉 축적 없이 전체적으로 잘 제어되었다 (도 9a 내지 9m). DoE 5번 뱃치 (161027-B1)는 RSM DoE 실험설계상 가장 빠른 induction 시작 조건 (OD₆₀₀=19.6)으로서 배양액 내 glucose 및 acetate가 가장 많이 축적되었는데, 이는 충분한 cell growth 전에 induction과 온도 shift가 이루어졌기 때문인 것으로 판단된다. DoE run 전체 뱃치의 세포생산성 평균은 185±31 g/L (wet cell weight)이었고, SDS-PAGE와 gel band image 분석 (도 10, 11)을 통해 확인한 GST-TB4 생산성 전체 평균은 56.4±10.0 mg/g (wet cell당 생산성), 10.4±2.2 g/L (배양부피당 생산성)로서, 50 L verification run 2 뱃치 (1차, 2차)의 평균값 대비 세포생산성은 약 1.5 배, GST-TB4 생산성은 약 2.5배 증대되었다 (표 26).

DoE 13 runs 배양공정 결과 요약

(2-4-2) DoE 통계분석

(2-4-2-1) 분산분석

DoE 수행 뱃치 모두 (13 runs)의 세포생산성 및 GST-TB4 생산성 결과값으로 Minitab 소프트웨어에서 분산분석을 진행하였다 (표 27). 모형설명력을 의미하는 R² 값이 각각 79.78%(GST-TB4 생산성), 58.57% (세포생산성)로써 반복이 없는 실험 설계 (개발기간 고려)와, 반응치에 대해 여러 인자가 관여되는 배양 분야 특성을 고려할 때 일반적인 수준이라고 판단되었다. Induction OD 의 p-value 가 각각 0.002 (GST-TB4 생산성), 0.029 (세포생산성)이었으므로, 신뢰 수준 0.05 미만에서 2 개의 반응치 (GST-TB4 및 세포생산성) 모두에 대해 유의한 인자로 확인되었고, induction 온도의 p-value는 각각 0.399 (GST-TB4 생산성), 0.299 (세포생산성)로써, GSTTB4 및 세포생산성 결과에 대해 영향이 없는 것으로 판단된다. “Induction OD*온도” 항의 p-value가 각각 0.374, 0.413 이므로, 반응치에 대해 두 인자의 상호조건 간섭을 의미하는 “교호 작용” 효과는 없는 것으로 확인되었다.

RSM DoE 실험 회귀계수 및 분산분석 결과

(2-4-2-2) 잔차분석 (Residual plot)

수행된 DoE 모형결과의 잔차분석 (residual plot) 결과, 대체로 특별한 경향성이나 특이점 없이 일정한 분산을 나타내었다. 또한 시간 및 실험순서에 대해서 독립적으로 랜덤하게 실험이 진행되었고, 정규분포를 따르며, 적합성 결여가 존재하지 않음을 확인하였다 (도 12).

(2-4-2-3) 최적조건 도출 및 design space 설정

DoE RSM 설계를 통한 배양 실험의 분산분석 결과에 대해서 Minitab 소프트웨어의 반응 최적화 tool을 이용하여 최적조건을 구하였다. 세포생산성과 GST-TB4 생산성에 대하여 합성만족도 0.67을 만족하는 수준에서 제시된 최적조건은 induction OD₆₀₀= 53.9, induction 온도 28.9℃ 이었고, 반응치 목표는 각각 58.5 mg/g, 194 g/L로 예측되었다 (표 28, 도 13). 제시된 최적조건은 중앙점 조건에 가까웠기 때문에 초기 DoE 설계의 인자 수준 (level) 설정은 적절했던 것으로 판단되었고, 최적 공정의 생산성 목표 하한 범위를 중앙점 평균의 최저점으로 설정하였다 (표 29).

Minitab 반응조건 최적화

중앙점 평균 최저점 (54.1 mg/g & 180 g/L)을 하한 목표 기준으로 하고, 상위 5개의 평균값(64.1 mg/g & 208 g/L)을 상한 목표 기준으로 하는 등고선도를 확인하였다 (표 29, 도 14). 등고선도의 흰색 바탕은 GST-TB4 생산성과 세포생산성 목표기준 (≥54.1 mg/g, ≥180 g/L)을 동시에 만족시키는 조건 영역 (design space)을 나타내는데, 이 영역의 안정적인 범위를 기준으로 다시 도출된 최종적인 최적공정 조건을 induction OD₆₀₀ = 54 ± 5, induction 온도 30 ± 1℃로 결정하였다 (표 30).

HU024 배양 최적조건 공정 반응치 목표 기준

HU024 배양 최적 공정 조건

(2-5) 최적 배양조건 재현성 확인

DoE RSM 배양실험 결과의 통계 분석에서 도출된 최종 최적조건 (OD₆₀₀ =54 ± 5, 온도 30 ± 1℃)으로 반응치 재현성 확인 배양을 수행하였다. DoE 실험에 사용했던 YE 제품(Springer 0202)과 동일한 제품 사용하여 1 뱃치 (Batch No. 161122-B1), YE의 제조사를 BD사 제품으로 변경하여 2 뱃치 (Batch No. 161115-B1, 161122-B2), antifoam 제품 (Dow corning) 및 aeration 조건 (0.5 vvm)까지 변경하여 1 뱃치 (161124-B1), 총 4 뱃치 배양공정을 진행하였다 (표 17). Dow corning사 안티폼 사용 시에는 안티폼 사용량이 기존 안티폼 (sigma 204) 대비 10 배 이상 증가하였지만, 4 뱃치 모두 비슷한 growth를 보여주면서 최대 cell density는 OD₆₀₀=160 이상 성장하였으며, glucose 및 acetate 농도도 1 g/L 이하로 잘 제어되었다 (도 15). 세포생산성은 각각 182, 202, 208, 205 g/L 이었고 (표 32), 2회 반복 분석된 GST-TB4 생산성 평균은 각각 66.5 ± 0.3, 57.5 ± 2.4, 65.1 ± 9.5, 66.6 ± 2.6 mg/g 으로써 (표 31, 도 16, 도 17), 4 뱃치 모두 최적조건 반응치 목표기준 (표 29) 이상의 결과를 달성하였다. 결과적으로 본 연구에서 확립된 5 L 규모 최적 배양공정 조건의 재현성이 확인되었으며, NR공정을 재현한 verification 50 L 배양 결과 (Batch No. 160629, 160729) 대비 세포 생산성은 약 1.6 배, GST-TB4 생산성은 약 2.8 배 증대되었다 (표 32).

최적조건 GST-TB4 생산성 분석 결과

5 L 규모 최적 배양조건 재현성 확인 결과 요약

실험예 (3) 최적조건 50 L 규모 Scale-up (시료생산)

5 L 규모 공정개발 최적조건을 scale-up하여 시료생산을 위한 50 L 배양 공정을 수행하였다. 5 L 규모의 feeding strategy와 동일한 파라미터를 적용하여 50 L 규모의 fed-batch 배양 feeding 속도를 산출하였다 (표 33). 50 L 규모 시료 생산 배양 2 뱃치 (Batch No. 170104, 170114) 수행 결과, 세포생산성은 각각 207, 208 g/L 이었고, GST-TB4 생산성은 각각 76.9, 69.7 mg/g (pellet당 생산성)으로서 (표 34), 최적조건 반응치 목표 기준 (표 29, 세포생산성 ≥ 180 g/L & GST-TB4 생산성 ≥ 54.1 mg/g)을 만족하였고, growth 및 대사 (glucose & acetate) trend 또한 5 L 규모의 최적조건 재현성 뱃치와 동일한 패턴을 나타내었다 (도 18). 시료생산 공정으로 진행된 (batch No. 170114) 뱃치의 경우, 배양종료 후 배양액 회수 전까지 배양기에서 10℃까지 냉각하여 overnight (이하 “O/N”) holding 테스트를 진행하였는데, O/N 전후 OD₆₀₀값은 174.6 (전), 171.5 (후) 이었고, pellet 생산성은 221 g/L (전), 208 g/L (후)로 측정되었다 (표 34). 시료생산 공정 (batch No. 170114) 수행 결과는 표 35에 요약하였다.

50 L 규모 Scale-up 공정 Exponential feeding 속도

최적조건 50 L 규모 Scale-up 배양 결과 요약

50 L 시료생산 공정 결과 요약 (batch No. 170114)

[2. 정제공정]

실시예 (1) 배경 및 예비실험

Q FF - GST FF - enzyme digestion - UF/DF - Q XL - Source 30RPC - Q HP - UF/DF으로 진행하는 중국공정과, Q FF - GST FF - enzyme digestion - Q FF - UF/DF 인 좀 더 최적화된 휴온스 공정을 비교하였다. 따라서, 휴온스 공정을 기본으로 순도 개선 및 단위공정 최적화, 그리고 고가의 GST FF 레진 비용 최소화를 목표로 하였다.

(1-1) 1차 컬럼 레진 스크리닝

고가의 GST 컬럼 DBC를 극대화하기 위해 중국공정에서 1차컬럼으로 사용했던 Q FF resin 대신 Nuvia Q, Factrogel TMAE(M)을 적용하여, 용출 분획의 순도 개선에 의한 GST 레진의 DBC 향상 효과를 확인하고자 하였다. 2 종류의 Resin을 통해 정제된 elution pool을 GST 컬럼에 적용하였을 때, 레진 종류와 상관없이 42~44 mg/mL 정도의 DBC를 확인하였다 (표 36, 37). 따라서, 비교적 yield가 높았던 Fractogel TMAE(M)를 적용하여 공정개발에 사용하기로 결정하였다.

Step yield for Nuvia Q resin and DBC for Affinity resin using Nuvia Q eluted sample

Step yield for TMAE(M) resin and DBC for Affinity resin using TMAE(M) eluted sample

(1-2) 50L Verification Run Test

휴온스 공정을 기준으로, small scale 공정 재현성을 확인하고, 50L 규모 배양액으로 1^st Verification Run 과 2^nd verification Run을 2회 진행하였다 (도 19, 표 38, 표 39).

50L 1^st verification run process conditions

1^st Verification Run은 Small scale 공정에 의거하여 동일하게 진행되었으며, 공정 결과는 다음과 같이 확인되었다 (표 39, 표 40)

Step Yield of HU024 Small Scale verification Run

Step yield of HU024 1^st Verification Run

Small scale 정제 결과와 1^st verification Run 결과, AEXII 공정 (Thrombin Digestion 이후 AEX 공정)에서 flow through (F/T) 분획에서 많은 target protein이 확인되었다 (표 40). 따라서, 2^nd Verification에서는 flow through mode로 공정을 진행하였다 (표 41).

50L 2^nd verification run process conditions

Step yield of HU024 2^nd Verification Run

1st verification run에서 AEXII 공정 시 F/T 분획의 순도는, 99.4 % (RP-HPLC), 97.9 % (SE-HPLC)로 확인되었고, 반면, elution 분획의 순도는 기준 부적합으로 확인되었다 (표 43). 2^nd Verification run에서 AEXII 공정을 flow through mode로 진행하였을 때, 1st Verification때보다 정제수율은 개선되었지만 (4.3 --> 7.6 %), 순도는 약간 저하되었다 (97.9 -->97.0 %) (표 44) .

Quality profile for 1^st Verification Run

Quality profile for 2^nd Verification Run

그러나, 두 번의 verification run에서 최종 정제원액의 SE-HPLC 순도가 98 % 미만이었다. 따라서, 단위공정 최적화 이외에 98 % 이상으로 순도 개선을 위한 공정개발을 계획하였다.

(1-3) 세포파쇄조건 최적화

단위공정 최적화 목적으로, 세포파쇄 효율을 개선할 수 있는지 확인하였다.

(1-3-1) 파쇄 완충액 개선 실험

세포 파쇄 효율 개선 가능성을 확인하였다. EDTA와 detergent인 Triton X-100을 넣었을 때, 회수된 target protein 함량 증가가 유의하지 않아(약 4~6 % 증가) 기존 조건을 유지하기로 결정하였다 (도 20, 표 45).

comparison GST-Tβ4 band density by cell disruption buffer condition

(1-3-2) 불순물 제거 실험

NR(중국공정)에 의거하여 Ammonium sulfate 첨가에 의한 Salt-out현상을 이용하여 불순물 제거 가능성을 확인하였다. NR공정에서는 파쇄액 100 mL당 5.6 g (33 %)의 Ammonium sulfate가 첨가하는 공정을 적용하여, 본 실험에는 Ammonium sulfate를 16.5 %, 33 %, 66 %로 처리한 파쇄액의 GST-Tβ4의 양을 확인하였다. Ammonium sulfate의 함량이 높아질수록 GST-Tβ4 함량은 미첨가 시료 대비 각각 20 %, 37 %, 43 % 감소되었다 (도 21, 표 46). Ammonium sulfate 사용 시 GST-Tβ4 함량도 감소하므로 첨가하지 않는 조건으로 결정하였다.

Relative reduction of GST-Tβ4 amount by adding ammonium sulfate

(1-3-3) 파쇄 조건 변경

세포파쇄기 (Microfluidizer) 조건을 변경하였다. Verification run 2회 수행 시 사용한 세포 파쇄 조건(cell slurry 30 %, 15,000 psi 압력, 3회 반복 파쇄)을 현재 바이넥스 GMP 작업장에서 적용하는 세포 파쇄 조건(cell slurry 15%, 11,000 psi 압력, 2회 반복 파쇄)으로 변경하였다. 변경된 파쇄 조건 적용 시 파쇄 후 시료의 흡광도 (OD₆₀₀) 감소 정도도 기존 방법보다 동등 이상이었다 (표 47). 변경된 조건은 5L 규모 배양액 사용한 정제공정개발부터 적용되었다.

Cell optical density according to different conditions of disruption

(1-3-4) Depth filtration sizing test

머크밀리포어에서 제공한 filter test 1차 결과에 따르면, C0HC, F0HC 가 선정되었고, verification run에 적용하였다. 공정 진행 중 필터 막힘 현상 발생하였고 원인 분석은 진행되지 않았다. 이후 5L 및 50L 공정에서도 동일한 필터를 사용하였지만, 막힘 현상이 없었다. 따라서, 필터 종류와는 상관없이 막힘 현상이 발생했던 것으로 판단되며, 파쇄 조건 변경에 따라 막힘 현상이 해결된 것으로 예상되었다.

파쇄 조건이 변경된 후 머크밀리포아측에 2차로 filter test를 의뢰하였고, X0HC를 추천하였다 사토리우스측에 filter test를 의뢰하여, Sartoclear PC2가 선정되었다 (표 48). 결론적으로 머크밀리포아의 Depth filter를 사용하였으며, 5L process, 50L 3rd Verification run에는 C0HC, F0HC를 이용하여 진행하였다 (Merck report Revision #2 <2016.06.17>, Merck report revision #1 <2016.10.20>, Sartorius report <Doc No. SKB201604>).

Information on depth filter and sterile filter recommended by each venders

실시예 (2) 각 공정시료에 대한 분석조건

(2-1) UV 정량법

단백질 정량은 아래 식 (식 1)에 의하여 산출되었고, Affinity process에 대한 공정시료의 단백질 정량에 사용되었다.

[식 1]

(2-2) SEC-HPLC 분석법

Thrombin Digestion이후 공정시료에 대해서 분석을 진행하며, 공정시료에 대한 SEC-HPLC 분석법은 GST와 Gly-TB4의 분리가 가능한 조건을 이용하여 Gly-TB4의 정량 측정이 가능한 Gly-TB4 공정 중 시료 크기배제 크로마토그래피 정량시험 및 순도 측정이 가능한 Gly-TB4 크기배제 크로마토그래피 순도시험(2016.11.16. 자 개정 의약품 SOP(표준운용절차)에 따름)에 의거하여 진행되었다. 그 조건은 아래와 같았다.

SEC-HPLC Analysis Method and Condition

(2-3) RP-HPLC 분석법

Thrombin Digestion이후 공정시료에 대해서 분석을 진행하며, 공정시료에 대한 RP-HPLC 분석법은 Gly-TB4와 Impurity을 분리 할 수 있는 조건을 이용하여 정량 측정이 가능한 Gly-TB4 역상 크로마토그래피 정량시험 및 순도 측정이 가능한 Gly-TB4 역상 크로마토그래피 순도시험(2016.11.16. 자 개정 의약품 SOP(표준운용절차)에 따름)에 의거하여 분석을 진행하였다. 그 조건은 아래와 같다. 또한, SOP 개정 이전에 진행했던 1st & 2nd verification run 정제원액의 순도는 신뢰할 수 없는 측정치로 간주하였다.

RP-HPLC Analysis Method and Condition

(2-4) Endotoxin 분석법

Endotoxin 정량은 바이넥스에서 분석법 개발한 Gly-TB4의 PTS를 이용한 엔도촉신 시험법에 의거하여 진행하였으며, 이를 통해 공정시료 중의 Endotoxin을 확인하였다.

(2-5) Host cell Protein (HCP) 분석법

HCP 정량은 바이넥스에서 분석법 개발한 Gly-TB4의 Host Cell Protein 분석법에 의거하여 진행하였으며, 이를 통해 공정시료 중의 HCP 제거 경향을 확인하였다.

(2-6) Host cell DNA (HCD) 분석법

HCD 정량은 바이넥스에서 분석법 개발한 Gly-TB4의 잔류 E.coli HCD 분석법에 의거하여 진행하였으며, 이를 통해 최종산물의 HCD 잔류 양을 확인하였다.

(2-7) SDS-PAGE 분석법

SDS-PAGE 분석은 Gly-TB4와 Impurity를 Size에 따라 분리 할 수 있는 조건을 이용하여 Gly-TB4의 전기영동 시험법에 의거하여 진행하였으며, 이를 통해 Impurity profiles을 정성적으로 확인하였고, 필요에 의해서 reference를 BSA 또는 affinity pool 시료를 통해 Densitometer를 사용하여 정량적으로 cell recovery 및 AEXI eluted pool을 정량적으로 분석하였다.

실시예 (3) Anion Exchange Chromatography (AEXI)

(3-1) 예비실험

용출 완충액의 NaCl 농도를 최대한 낮추어 순도 개선을 목적으로, 예비실험을 진행하였다.

(3-1-1) Target protein 용출 위치 확인

GST-Tβ4가 용출되는 NaCl 농도를 screening하고자 정제된 GST-Tβ4 2 mg (160709, 1^st Verification Run에서 확보된 2차 컬럼 용출분획 IPC 시료)를 이용하여 0-500 mM NaCl 범위에서 linear gradient 조건으로 진행하였다. 그 결과, 용출된 주피크 꼭지점 위치는 전도도 20 mS/cm로 확인되었고, 용출 범위는 200 ~ 300 mM NaCl 범위임을 확인하였다.

(3-1-2) GST-Tβ4 정량 분석법 (간이정제)

AEXI 공정의 경우 Loading Sample 및 Elution 시료 내 Impurity가 많아 UV 정량법을 통하여 단계수율을 측정하는 것이 불가능하였다. Affinity column을 이용하여 표준물질의 peak Area 정량선을 산출, target protein의 양을 확인할 수 있는 분석법을 개발하고자 하였다(표 51).

GST-Tβ4 Quantity Analysis condition

표준물질은 1^st Verification Run Affinity pool를 Dilution Buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH8)로 완충액 교환하여 UV 정량(흡광계수 1.385)으로 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 mg/mL 농도의 표준물질을 제조하였고, 이를 표 51에 기술된 방법으로 분석한 후, AKTA operation program (Unicon 5.11)을 사용하여 Integrated area를 산출하였다. 산출된 값을 이용하여 Linearity 곡선을 작성하였고, 그 결과 Linearity 0.99 이상의 곡선을 산출하였으며, AEXI 공정시료 (loading sample & elution pool)를 분석하였다.

(3-2) 공정시간 단축을 위한 Flow rate 검증시험

(3-2-1) 실험목적

공정은 61cm/hr 선속도를 유지하였고, 단위공정 소요시간을 단축하기 위해 200 cm/hr까지 선속도를 증가시키고자 하였다 단계수율 및 순도가 유지되는지 확인하였다.

(3-2-2) 실험방법

AEXI 공정은 아래 표 (표 52)와 같이 진행하였다. Flow rate은 61 cm/hr와 200 cm/hr을 적용하여 각각 실험을 진행하였다. 공정 전후 시료에 대해서 (3-1-2)에 명시된 방법에 의하여 분석하였고, SDS-PAGE를 통하여 Impurity profile을 확인하였다.

AEXI Process condition

(3-2-3) 실험결과

AEXI 공정 후 Flow rate에 따른 Chromatogram은 도 23 & 도 24와 같으며, 빨간색 점선 원으로 표시한 부분은 Elution peak에 해당한다.

각 조건별 Elution pool에 대한 step yield (표 53) 및 SDS-PAGE 분석 (도 25) 결과 AEXI 공정에서의 Flow rate을 200 cm/hr로 증가시켜도 단계수율 및 순도에 영향이 없음을 확인하였다. 단, Load amount가 약 5 mg/mL resin 조건이므로, Load amount 증가 시 재확인이 필요하였다.

Yield for AEXI Linear flow rate study

(3-3) 순도향상을 위한 AEXI Elution 조건시험

(3-3-1) 실험목적

고가의 affinity column (GST FF) 경제성을 고려하여, DBC를 극대화하고자 하였다. 이를 위해 Loading sample의 순도를 최대한 높이고자 하였다. 따라서, 기존 조건인 500 mM NaCl 조건에서 200 mM NaCl 조건으로 변경하여 수행한 후 단계수율 및 순도를 비교 분석하였다.

(3-3-2) 실험방법

실험방법은 (3-2-2)의 표 51을 기본으로 사용하였으며 (본 실험에 사용된 cell cake batch No. 160603), Elution Buffer의 NaCl 농도를 500 mM NaCl과 200 mM NaCl로 각각 적용하여 시험하였다. 공정 전후 시료에 대해서 (2-1-2)에 명시된 방법에 의하여 HU024를 분석하였고, SDS-PAGE를 통하여 Impurity profile을 확인하였다.

(3-3-3) 실험결과

AEXI 공정 후 Elution Buffer 조성에 따른 Chromatogram은 도 26 & 도 27와 같으며, 빨간색 점선 원으로 표시한 부분은 Elution peak에 해당한다.

각 조건별 Elution pool에 대한 step yield (표 54) 및 SDS-PAGE 분석 (도 28) 결과 AEXI 회수율 내에서는 차이가 없었으며, SDS-PAGE 분석결과 Target band 아래 있는 Major impurity peak이 elution pool이 아닌 strip pool에서 관찰되어 순도 개선 효과를 예상할 수 있었다. 단, 낮아진 NaCl 농도에 따라 용출부피가 증가하는 단점이 확인되었다. 또한, Load amount를 5 mg/mL resin 이상 증가시킬 경우 추가 실험이 필요할 수 있었다.

Yield for AEXI Elution buffer study

(3-4) AEXI Loading sample condition study

(3-4-1) 실험목적

AEXI 컬럼에서 Loading sample의 전도도는 컬럼에 Target protein이 결합할 수 있는 중요한 공정변수로 알려져 있다. 본 실험에서는 적용 가능한 Loading sample의 전도도 범위를 확인하고, 변경에 따른 불순물 함량 및 단계수율 변화를 확인하고자 하였다.

(3-4-2) 실험방법

실험방법은 (3-2-2)의 표 51을 기본으로 사용하였으며 (본 실험에 사용된 cell cake batch No. 160603), Loading sample의 전도도를 10 mS/cm(80 mM NaCl), 8 mS/cm(50 mM NaCl), control(≤ 2.8 mS/cm)로 제조하였고, 평형완충액의 NaCl 농도를 80 mM, 50 mM, 0 mM 조건으로 제조하여 사용하였다. 용출 완충액 조성은 200 mM NaCl를 사용하여 공정을 진행하였다. 공정 전후 시료에 대해서 (2-1-2)에 명시된 방법에 의하여 HU024를 분석하였고, SDS-PAGE를 통하여 Impurity profile을 확인하였다.

(3-4-3) 실험결과

AEXI 공정 후 Loading sample과 Equilibration buffer의 Conductivity 변화에 따른 Chromatogram은 도 29 ~ 도 31와 같으며, 빨간색 점선 원으로 표시한 부분은 Elution peak에 해당한다.

각 조건별 Elution pool에 대한 회수율 (표 55) 및 SDS-PAGE 분석 (도 32) 결과 Control (0 mM NaCl)과 50 mM NaCl에서는 회수율은 각각 81 %, 97 %로 확인되었으나, 80 mM NaCl를 적용하였을 때는 회수율은 19.1 %로 확인되어 F/T 분획을 분석하였으며, 분석결과 Target protein이 F/T 분획에서 57 %정도 있음을 확인하였다. SDS-PAGE 분석결과 control과 50 mM NaCl 조건 간에 순도 차이가 없음을 확인하였다.

Step yield with different conductivity of loading sample for AEXI

Loading sample과 평형완충액 전도도 조건 시험결과를 따라, Loading sample의 전도도는 ≤ 2.8 mS/cm 경우와 8.0 mS/cm (50 mM NaCl) 경우에서 단계수율 및 순도가 동등함을 확인할 수 있었다. 하지만 10 mS/cm (80 mM NaCl)의 조건에서는 Target protein이 F/T로 유실되므로 적용하기에는 부적합함을 확인하였고, AEXI 공정에서 Loading sample의 전도도는 최대 8.0 mS/cm까지는 AEXI Binding에는 큰 영향을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 단, Load amount가 5 mg/mL resin 이상 증가할 경우 추가 실험이 필요하였다.

(3-5) AEXI Dynamic Binding capacity (DBC) Test

(3-5-1) 실험목적

GST-Tβ4의 AEXI에 대한 DBC를 확인하고자 하였다.

(3-5-2) 실험방법

실험방법은 (3-2-2)의 표 51을 기본으로 사용하되 (본 실험에 사용된 cell cake batch No. 160603), Column을 LRC10 column에 Fractogel TMAE(M)을 2 mL을 충진하여 사용하였으며, Working linear flow rate는 150 cm/hr (Flow rate 2 mL/min)으로 진행하였고, Elution buffer와 EQ buffer의 조성은 공정개발에서 확립된 조건 (EQ : 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH8.0, Elution : 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH8.0)으로 진행하였다. Load amount를 각각 10 mg, 8 mg, 7.5 mg GST-Tβ4 / mL of resin으로 하여 공정을 진행하였다 (기존 실험 조건은 <5mg/mL of resin). F/T와 Elution pool을 SDS-PAGE 분석하였고, Target protein이 나오는 위치를 확인하였다.

(3-5-3) 실험결과

F/T pool과 Elution pool을 SDS-PAGE를 통하여 분석한 결과는 도 33과 같았다. 7.5 mg GST-Tβ4를 주입하였을 경우에는 F/T pool에서 Target protein이 확인되지 않았으며, 8.0, 10.0 mg GST-Tβ4를 주입한 경우에는 Load amount가 많을 수록 F/T pool에서 Target band가 많아짐을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 AEXI의 DBC는 7.5 mg/mL 이하로 예상되었다.

(3-6) AEXI 공정시료에 대한 Hold time Study

(3-6-1) 실험목적

GMP 생산 시 적용 가능한 보관 조건 및 기간을 확보하기 위해, AEXI 공정 시 용출분획 시료를 냉장 (2~8 ℃), 상온 (18 ~ 22 ℃) 조건에서 7일간 보관한 후 순도 변화를 확인하였다.

(3-6-2) 실험방법

실험방법은 (3-2-2)의 표 52를 기본으로 사용하였으며 (본 실험에 사용된 cell cake batch No. 160906), Loading sample의 전도도는 8 mS/cm (50 mM NaCl)로 하였고, 용출조건은 200 mM NaCl 조건을 사용하였다. Eluted pool을 제균 여과를 하여, Microtube에 500 uL씩 소분하여 냉장과 상온조건에서 7일간 보관하였다. Sampling된 시료를 -70℃에 보관하여 완전히 냉동시켰고, 보관 기간 종료 후 다음날 동시에 모든 Sample을 해동하여 SDS-PAGE을 통해 분석하였다.

(3-6-3) 실험결과

SDS-PAGE 분석을 진행한 결과는 도 34와 같았다. 냉장 보관한 시료의 SDS-PAGE 분석 결과에서 큰 차이점이 발견되지 않았다. 하지만 상온보관을 진행한 결과 2일차부터 약 55.4 kDa에 해당하는 Band가 증가하고, 약 40 kDa에 해당하는 Band는 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, AEXI 공정시료는 냉장상태 (2~8 ℃)에서는 7일 동안 안정하지만, 상온(18~22 ℃) 조건에서는 불안정함을 확인하였다.

(3-7) AEXI process summary

Summary of AEXI process

실시예 (4) Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (Affinity Chromatography)

(4-1) 공정시간 단축을 위한 Flow rate 조건 시험

(4-1-1) 실험목적

기존 제공 공정은 90 cm/hr 선속도를 유지하였고, 단위공정 소요시간을 단축하기 위해 180 cm/hr까지 선속도를 증가시키고자 하였다 단계수율이 유지되는지 확인하였다.

(4-1-2) 실험방법

Affinity 공정은 아래 표 (표 57)와 같이 진행하였다. Flow rate은 90 cm/hr와 180 cm/hr을 적용하여 각각 실험을 진행하였다. 공정 전후 시료에 대해서 (2-1)에 명시된 방법에 의하여 HU024를 분석하여 단계수율을 확인하였다.

Affinity Process condition

(4-1-3) 실험결과

Affinity 공정에 따른 조건 별 Chromatogram은 도 35, 36과 같이 확인되었다.

각 조건별 Elution pool에 대한 회수율 (표 58) 결과 Affinity 공정에서의 Flow rate을 180 cm/hr로 증가시켜도 단계수율에 영향이 없음을 확인하였다. 단, Load amount가 약 4.4 mg/mL resin 조건이므로, Load amount 증가 시 재확인 필요하였다.

Yield for Affinity Linear flow rate study

(4-2) Dynamic Binding Capacity (DBC) test

(4-2-1) 실험목적

GST-Tβ4의 Affinity column에 대한 DBC를 확인하고자 하였다.

(4-2-2) 실험방법

Affinity 공정은 (4-2)의 표 57 조건으로 공정을 진행하였으며, LRC10 column에 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow resin을 1mL 충진하였고, Linear flow rate 76.4 cm/hr (flow rate 1 mL/min, 단, 용출 시에는 150 cm/hr)으로 적용하여 진행하였다. Loading sample은 AEXI 최적화된 공정을 통해 나온 AEXI Eluted pool (GST-Tβ4 41 mg)을 주입하여 Resin manual에 있는 DBC (≒ 11 mg GST-tagged protein / mL media)보다 overloading을 하였으며, Affinity 공정 후 공정시료는 321항의 UV 정량법을 통해 분석하였다.

(4-2-3) 실험결과

Resin 1 mL에 Overloading한 후 용출하여 확보한 용출 분획의 함량을 측정하였고(표 59), GST-Tβ4에 대한 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow의 DBC는 9.3 mg/mL로 확인되었다.

DBC for Glutathione Sepharose 4 Fast Flow

(4-3) AEXI 공정 스케일업 및 Affinity 공정 재현성 실험

(4-3-1) 실험목적

AEXI 공정 스케일업 실험(XK16 --> XK50)을 수행하였다.

Affinity 공정조건 (Sample loading시 linear flow rate 80 cm/hr, Elution시 linear flow rate 150 cm/hr, LRC10 --> XK50 조건)을 소내에서 수행하여 재현성 및 스케일업 실험을 수행하였다.

(4-3-2) 실험방법

AEXI 공정은 (3-7)에 명시된 조건을 동일하게 적용하였고, 컬럼은 각각 XK16 (h: 20 cm)와 XK50 (h: 20 cm)을 적용하였다. Affinity 공정은 아래 표 (표 60)와 같이 진행하였으며, 컬럼은 각각 LRC10 (h: 15 cm), XK50 (h: 15 cm)을 적용하여 진행하였다.

Conditions for Affinity chromatography

(4-3-3) 실험결과

AEXI 컬럼 스케일업 결과, chromatogram은 도 37과 같이 확인되었으며, 단계수율은 표 61과 같이 확인되었다.

AEXI step yield for scale up study from XK16 to XK50

2종류 컬럼에서 유사한 단계수율이 측정되어 스케일업 되었음을 확인하였다. 용출분획은 이후 Affinity 컬럼에 각각 적용하였다 (도 38, 표 62).

Affinity step yield for feasibility test in LRC10 and XK50 scale

선행실험에서 결정된 DBC 9.3 mg/mL of resin의 90% 수준으로 설정하여(8.6 mg/mL of resin) 진행, Loading 80 cm/hr, Elution 150 cm/hr)으로 수행한 결과, 단계수율은 60 %와 73 %로 확인되었다.

(4-4) Affinity column cleaning

(4-4-1) Background

50L Verification Run 1^st 배치에서 6 M GHCl 처리 CIP 후 측정된 엔도톡신 함량이 0.1 EU/mL 보다 높게 측정되어, 그 외 CIP 방법들을 추가하여 진행하였다(표 63).

Endotoxin removal in affinity column by various CIP methods

0.1N NaOH와 GE에서 추천한 Ethanol를 적용하는 CIP 방법(CIP Run5)으로 변경하여 이후 공정에 적용하기로 하였다(표 63).

(4-5) Affinity 공정시료에 대한 Hold Time Study

(4-5-1) 실험목적

Affinity 공정시료를 냉장 (2~8 ℃), 상온 (18 ~ 22 ℃) 조건에서 7일간 보관 후 순도 변화를 확인하여 공정시료 보관조건 및 기간을 설정하고자 한다.

(4-5-2) 실험방법

실험방법은 (4-2)의 표 58을 기본으로 사용하였으며, Loading sample은 (3-6)에서의 AEXI Hold time Study 시료를 제외한 나머지 공정시료를 사용하였다. Eluted pool을 제균 여과를 하여 Microtube에 500 uL씩 소분하여 냉장과 상온조건에서 7일간 보관하였다. Sampling된 시료를 -70도에 보관하여 완전히 냉동시켰고, 보관 기간 종료 후 다음날 동시에 모든 Sample을 해동하여 SDS-PAGE을 통해 분석하였다.

(4-5-3) 실험결과

각 보관 조건 (상온, 냉장) 시험 후 SDS-PAGE 분석을 진행한 결과는 도 39와 같았다. 냉장과 상온 보관한 시료의 SDS-PAGE분석결과에서 큰 차이점이 발견되지 않았다. 따라서, Affinity 공정시료는 냉장상태 (2~8 ℃) 또는 상온보관 (18~22 ℃) 조건에서 7일 동안 안정한 것으로 확인되었다.

(4-6) Affinity process summary

Summery of affinity process

실시예 (5) Thrombin Digestion

(5-1) Background

중국 공정에 의거하여 Thrombin Digestion 조건 (2.6 mg GST-Tβ4)을 적용하였을 때, Affinity pool내의 Target protein 농도가 낮을 경우 Enzyme cleavage efficiency가 낮은 것을 확인하였다, p 35~36, 39 ~ 40 - Affinity pool의 농도 0.3 mg/mL에서 Thrombin 2 mg/unit을 넣어주면 SDS-PAGE 상 약 50 %만 반응이 진행되었음). 따라서, 본 실험에서는 1 mg GST-Tβ4 / 2 unit of Thrombin을 적용하였고, 반응시간은 16시간으로 고정한 후, 반응 온도 범위 설정을 위해 13~27 ℃ 범위에서 효소 절단 효율이 유사한 지 확인하고자 하였다.

Thrombin digestion condition

(5-2) Thrombin digestion sample 준비

Thrombin digestion study를 진행하기 위해 AEXI, Affinity 공정을 진행하였으며, 공정조건은 공정 개발에서 명시된 조건을 이용하여 진행되었다. 공정이 완료된 Affinity pool은 40 mL씩 Conical tube에 소분한 후 냉동 (-20 ℃)에 보관하여 필요에 따라 해동하여 사용하였다.

(5-3) 반응 온도별 Thrombin digestion study

(5-3-1) 실험목적

Thrombin digestion의 반응조건에서, 추가로 온도 범위를 설정하고자 하였다.

(5-3-2) 실험방법

(5-2)에서 제조한 Affinity elution pool (209.1 mg GST-Tβ4)를 사용하였고, Thrombin은 반응시킬 Affinity pool 부피의 15%(v/v)의 20 mM Tris-HCl, pH8.0에 용해한 후 각 Elution pool에 처리하였다. 이후 표 65에 명시된 방법에 따라 반응 시켰으며, 다만, 반응온도는 각각 15 ± 2 ℃ (cold room), 20 ± 2 ℃(room temperature), 25 ± 2 ℃(Incubator)에서 동시에 반응을 진행하였다. 반응이 완료된 시료는 (2-2)에 명시된 SEC-HPLC 분석을 통하여 Gly-Tβ4을 정량적으로 확인하여 수율를 확인하였다 (2016-037, p 13, 18).

(5-3-3) 실험결과

반응 온도별 Thrombin Digestion 완료된 시료의 SEC-HPLC분석결과는 도 40과 같이 확인되었다. Chromatogram과 회수율 (표 66)을 확인하였을 때, 온도에 따른 큰 차이점은 확인할 수 없었다. 따라서 Thrombin 반응온도 조건은 13 ~ 27 ℃에서 수율과 순도에 영향이 없는 것으로 확인되었다.

Step yield for cleavage reaction mixtures

실시예 (6) 4차 공정 Stduy

( 6-1) Background

50L 1^st Verification Run 결과에 따르면, AEXII 공정에서 F/T Fraction으로 target protein 유실이 관찰되었으며, Elution pool의 RP-HPLC 및 SEC-HPLC의 순도가 F/T Fraction보다 낮은 것을 확인하였다. 이 실험결과를 근거로, 2^nd Verification Run 조건을 F/T Mode로 변경하였고 순도 및 수율 측면에서 개선되었지만, 최종 정제원액의 SE-HPLC 분석 시 순도는 97.0 %로 추가 향상이 필요했고, 최적화 안 된 RP-HPLC 분석 시에도 98.7 % 순도로 확인되어, 4차 컬럼 도입을 고려하게 되었다.

(6-2) 4차 컬럼 공정 개발을 위한 시료 생산

4차 컬럼 공정 실험에 필요한 시료 확보를 위해, 2^nd verification run 조건인 F/T mode로 AEX II 공정을 진행하여 시료를 준비하였다. 시료 생산을 위해 5L DOE Batch 2 개 (Batch No. 161019-B1, B2)을 Depth sizing Test를 위해 Cell lysate를 준비하였다. Sizing test 이후, 남은 cell lysate (약 1200 mL)을 이용하여 AEXI, Affinity, Thrombin digestion, AEXII 공정을 진행하여 7099 mg의 Gly-Tβ4를 확보하였다. AEXI와 Affinity는 (3-7)과 (4-1)에 따라 진행하되, Column scale은 AEXI (XK50, h: 20 cm), Affinity (XK50, h: 15 cm)로 적용하였으며, AEXII 공정은 표 67에 명시된 방법에 따라 진행하였다. 확보한 시료는 Microfiltration (0.2μm) 한 후 100 mL씩 소분하여 -20 ℃에 보관하였고, 이를 이용하여 4차 컬럼 공정개발을 진행하였다.

AEXII process condition

확보된 3차 컬럼 용출분획의 단계수율 및 순도를 분석하였다 (표 68, 표 69). SE-HPLC 순도는 98.9 %까지 향상되었지만, RP-HPLC 순도는 97.6 %를 나타냈다 그러나, 최적화된 RP-HPLC 분석법으로 분석 시 92.2 %까지 순도가 떨어졌고, 따라서, 99.0 % 이상 순도를 개선하고자 하였다.

Step yield of AEX II for preparing load sample on 4^th column

Purity analysis after UF/DF for preparing load sample on 4^th column

(6-3) Resin scouting

( 6-3-1) Cation Exchange Chromatogram (CEX) process

순도향상을 위해 기본적인 CEX 레진인 SP FF를 적용해 보았다 (표 70).

CEX process condition as 4th column

CEX 공정을 진행한 Chromatogram은 도 41과 같이 확인되었다. Peak가 2개로 분리되어 나왔으며, 각 pH 4.5와 5.0으로 진행한 공정의 Step Yield를 확인하였다 (표 71).

Yield for CEX process by various pH

pH 5.0의 경우 분리되는 Peak는 관찰되지 않았으며, 회수율이 pH 4.5 조건보다 낮은 것을 확인하였다. 이는 F/T fraction을 분석하였을 때, Target protein이 확인되어 이에 기인한 것으로 예상해볼 수 있었다. 따라서 pH 4.5 조건만을 RP-HPLC 분석하였고, 그에 대한 결과는 도 42와 같이 확인되었다.

Main peak의 앞쪽과 뒤쪽의 Impurity peak가 많이 제거된 것을 확인하였으며, Loading sample과 Elution sample의 RP-HPLC purity는 각각 92.2 %, 97.6 %로 확인되었다. 그러나, Main peak 앞에 존재하는 Impurity peak은 제거되지 않았으며, UF/DF을 진행한 결과 (표 69)에서의 RP-HPLC 순도 (97.6 %)와 큰 차이가 없었으므로, 99 % 이상 순도를 확보하기 위해 CEX 형태 레진 대신 소수성 레진을 확인하고자 하였다.

(6-3-2) Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) process

Main Impurity와 Target peak의 RP-HPLC분석에서 분리가 되는 점을 고려하여 소수성 컬럼을 시도하였으며, 공정조건은 표 72와 같이 진행하였다 소수성 정도에 따라 2개의 레진(Butyl, phenyl)을 실험하였고, Salt의 조건은 NaCl과 Na₂SO₄ 2개를 사용하였다.

HIC process condition as 4th column

진행된 공정 Chromatogram은 도 43과 같이 확인되었다 Chromatogram 앞쪽에 높은 Peak가 형성되며, Elution step에 관찰되는 Peak는 없었다.

결과적으로, 2개 레진 모두 Target protein이 결합하지 않았고, 따라서, 추가 진행은 없었다.

(6-3-3) Mixed-Mode Chromatography (MMC) process

CEX와 HIC Resin의 Study 결과 main Impurity (RP-HPLC 분석법 ver 1.0을 적용했을 때의 17.5 min peak)의 제거를 확인할 수 없었다. 따라서 Capto MMC를 적용해 보았다.

(6-3-3-1) 실험방법

MMC Resin의 경우 Binding 조건은 CEX Mode 작동을 유도하고자 낮은 pH에서 Process를 진행하며, 보통은 pH를 중성으로 바꾸면서 pH와 Salt gradient를 주어 Elution을 하는 방법을 사용한다 (참고문헌 6.2). 실험을 통해 EQ buffer의 pH 4.5 ~ 5.0, Elution buffer pH 4.5 ~ 7.5로 변경하여 진행하였고, 그 결과 Elution pH가 올라갈수록 Peak의 면적이 좁아지면서 Main impurity와 Target protein의 분리능이 떨어지는 것을 확인하였다. 따라서 Capto MMC 조건은 낮은 pH에서 수행하는 것이 적절하다고 판단되었다. 따라서, 낮은 pH (EQ, Elution buffer, pH 4.5) 조건에서 표 73 조건과 같이 진행하였다.

MMC process condition as 4th column

Elution pool을 Fractionation하여서 각각 RP-HPLC 분석을 진행하였고, 순도 98 %이상 pool을 모아서 순도 및 수율을 확인하였다.

(6-3-3-2) 실험결과

Capto MMC을 진행한 Chromatogram은 도 37과 같이 확인되었다. Elution step에서 단일 peak로 형성되는 것이 확인되었으며, 각 Fraction을 RP-HPLC (ver 1.0) 분석한 결과는 도 44와 같았다. 그 결과, peak 앞쪽 fraction에는 main Impurity peak이 높게 확인되는 것에 반해 Peak 중간에서 뒤쪽까지의 Fraction에는 Main impurity peak이 거의 확인되지 않음을 확인할 수 있었다.

용출 분획별로 RP-HPLC 순도분석 결과를 보면, Main impurity peak이 앞쪽 분획에 편중되어 존재함을 확인할 수 있었다. B8, B7, B6 분획을 pooling한 경우, 70% 단계수율에 99.6% 순도를 확보할 수 있었다 (표 74).

Yield for CaptoMMC process

(6-4) 4차 공정 최적화 study 1

(6-4-1) 실험목적

단계수율 향상을 위한 Step elution 조건 최적화 실험을 진행하였다.

(6-4-2) 실험방법

Step에 따른 Target 용출 조건을 확인하였으며, 용출되는 조건은 200 mM NaCl 이상에서 용출이 됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 Target이 용출될 수 있는 Salt 농도 보다 낮게 Washing step 조건을 185 mM NaCl을 적용하여 확인하고자 하였고, 기본적인 정제조건은 (6-3-3-1)의 표 73에 따라 진행하되, Elution buffer의 NaCl 농도를 400 mM로 변경하였다. 또한 확인된 조건에서 Loading amounts를 올렸을 때, 공정 재현성을 보고자 하였다.

(6-4-3) 실험결과

Wash step을 185 mM NaCl (conductivity 20.7~21.2 mS/cm)을 적용한 Chromatogram은 도 46과 같았다. 0.5 mg/mL of resin으로 Loading한 후 Elution step fraction (C6 ~ C9) 를 각각 2 종류로 pooling 하여 RP-HPLC를 확인해 보았으며, 각각 98.6 % (C6 ~ C9 pool), 99.0 % (C7 ~ C9 pool)로 98 %이상, Yield에서는 C6~C9 Fraction을 pooling 하였을 때 78.7 %을 확인할 수 있었다(표 75).

Step yield of MMC step elution with loading amounts 0.5mg/mL of resin)

Step yield of MMC step elution with loading amounts 4.0mg/mL of resin

그러나, 47.8 mg Gly-Tβ4를 Loading 하였을 경우(4.0 mg/mL of resin), 대부분 Target protein이 wash 단계에서 흘러나왔고 수율은 32 %로 확인되어 (표 76), 공정 적용이 불가능하였다.

(6-5) 4차 공정 최적화 study 2

(6-5-1) 실험목적

Loading amounts를 기존 0.5 mg 보다는 높고, 4.0 mg 보다는 낮은 3 mg Gly-Tβ4 / mL of resin 조건에서, Washing step의 NaCl 농도 조건(100, 120, 140 mM)에 따른 순도 및 단계수율을 확인하였다.

(6-5-2) 실험방법

실험방법은 표 77과 같았다. 공정 후 시료는 RP-HPLC (ver 2.0)에 의하여 분석하였으며, 분석 결과를 통해 공정 시료의 순도와 단계수율을 확인하였다.

MMC process condition with loading of 3 mg/mL resin

(6-5-3) 실험 결과

각 Washing step의 NaCl 농도에 따른 Chromatogram은 아래와 같았다 (도 47, 48, 49). Elution step에서 Peak가 2개로 갈라지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Elution Buffer 내 salt에 의해서 pH가 내려가 Elution이 지연되는 것으로 추측되었다. 나눠진 2개의 Elution peak를 분획하여 각각 분석 후 pooling 후 재분석하였다 (표 78).

Purity and Step yield of MMC with increasing NaCl for washing

100 mM NaCl로 Washing을 진행하였을 경우 수율측면에서는 95 %로 높으나, Elution pool의 평균 순도는 93.7% 정도로 Impurity를 제거하는데는 부족함이 확인되었다. 140 mM NaCl로 Washing의 경우는 순도 측면에서는 99 %이상을 만족하나 수율이 47 %로 매우 낮음을 확인하였다. 따라서 순도 및 수율에서 가장 적합한 Washing step의 NaCl 농도는 120 mM로 확인되었으며, 그때의 수율은 74 %, 순도는 99 % 이상임을 확인할 수 있었다.

(6-6) 4차 공정 Dynamic Binding Capacity (DBC) Test

(6-6-1) 실험목적

Gly-Tβ4에 대한 MMC의 DBC의 확인하고자 하였다.

(6-6-2) 실험방법

실험방법은 표 79와 같이 수행하였으며, Washing step 없이 Binding한 모든 단백질을 한번에 Elution 하여 RP-HPLC를 통해 정량을 진행하였다.

Capto MMC process condition for DBC test

(6-6-3) 실험결과

Resin 1 mL에 Overloading하여 얻은 MMC 공정시료에 대한 RP-HPLC 분석결과는 다음 표 (표 80)와 같았고, Gly-Tβ4에 대한 Capto MMC의 DBC는 9.6 mg/mL로 확인되었다. 이 결과는 이전 실험결과와 차이를 보이며, 즉, 4.0 mg/mL of resin 조건에서 대부분 단백질이 Wash 분획에 존재했었다. 따라서, 두 실험 간의 조건 차이(flow rate 200 vs 76 cm/hr)를 의심하였다.

DBC for Capto MMC process

(6-7) Capto MMC Process 요약

Summary for Capto MMC process

실시예 (7) 제공 공정 연구

(7-1) Background

AEXI 공정의 load sample 전도도 조건과 용출 완충액의 NaCl 농도가 변경되었고, AEXII 공정을 bind-elute mode로 변경하였으며, 4차 컬럼으로 Nuvia HR-S 레진을 사용하는 공정이 최종 공정으로 결정되었다. 또한, 최종 정제원액 순도 기준은 97% 이상(on RP-HPLC)으로 확정되었다. 따라서, 공정을 소규모 실험으로 재현하고 스케일업하는 업무를 수행하였다.

comparison DSP condition

(7-2) 3차 및 4차 컬럼 공정 연구용 시료 준비

본 실험에 사용된 시료는 (5-2)에 명시된 Affinity pool을 사용하였으며 (GST-Tβ4 농도 6.97 mg/mL), 3차 공정을 진행하기 전날에 표 65에 명시된 방법으로 진행하여 Thrombin digestion을 시작하여 준비하였다.

(7-3) 3차 컬럼 공정 연구(AEXII - B/E mode)

( 7-3-1) 3차 컬럼 공정 Dynamic Binding Capacity (DBC) 확인

( 7-3-1-1) 실험목적

AEXII에 대한 DBC를 확인하고자 하였다. 단, Flow rate은 기존 200-->153 cm/hr로 변경하여 진행하였다.

( 7-3-1-2) 실험방법

실험방법은 표 83과 같이 수행하였으며, 컬럼에 시료를 Overloading (5 mg/mL of resin)한 후 용출분획을 SEC-HPLC 방법으로 정량하여 용출된 Gly-Tβ4의 양을 확인하였다.

AEXII process conditions for DBC test

(7-3-1-3) 실험결과

Resin 2mL에 Overloading 하여 얻은 Elution pool에 대한 SEC-HPLC 분석결과는 도 51과 같았다. AEXII에 Overloading 하였을 때, GST도 같이 나오는 것이 확인되었고, AEXII에 다음과 같은 조건일 경우, AEXII에 붙는 Gly-Tβ4 DBC는 1.7 mg Gly-Tβ4 / mL 로 확인되었다 (표 84). 단, 유속이 153-->200 cm/hr로 변경될 경우 추가 실험이 필요하였다.

DBC for AEXII process

(7-3-2) 3차 컬럼 공정 재현성 실험

(7-3-2-1) 실험목적

설정된 DBC에 약 90 %만을 적용하고 유속을 200cm/hr로 증가시켜 재현성 여부(단계수율 80% 내외, 순도 RP-HPLC 90~96% 수준)를 확인하고자 하였다.

(7-3-2-2) 실험방법

3차 공정에 대한 실험방법은 다음 표 85와 같이 진행을 하였고, 공정이 완료된 실험에 대해서는 SEC-HPLC를 통하여 정량을 확인하였고, RP-HPLC를 통해 순도 분석을 진행하였다.

AEXII process conditions

(7-3-2-3) 실험결과

Resin mL 당 1.0 mg과 1.5 mg Gly-Tβ4를 각각 Loading하여 공정을 진행한 Chromatogram은 도 52, 53과 같다.

Elution전에 높은 UV peak가 확인되었으며, peak를 분석한 결과 Target protein이 없는 것으로 확인되어 Impurity (GSH)에 기인한 peak로 확인되었다. 공정에 대한 회수율 및 순도는 표 86과 같이 확인되었다.

quality and quantity profile for AEXII process

Loading amounts에 대한 회수율 및 순도에서 큰 차이점이 관찰되지 않았다. 따라서 AEXII의 DBC 및 조건에 대한 재현성을 확인할 수 있었다.

(7-3-3) 3차 공정 Loading Sample 부피 감소 실험

( 7-3-3-1) 실험목적

B/E mode로 변경됨에 따라 기존 10배의 희석배수를 적용할 때 증가하는 Loading sample 부피를 줄이기 위해, 4배 희석할 때 영향이 있는 지 확인하고자 하였다.

(7-3-3-2) 실험방법

실험방법은 표 85에 명시된 방법과 동일하게 진행하였고, Loading sample 준비는 DW로 4배 희석하여 전도도를 2~3 mS/cm에서 유지하였다. 공정 후 시료에 대해서 SEC-HPLC를 통해 정량을 하였고, RP-HPLC를 통해 순도를 분석하였다.

(7-3-3-3) 실험결과

Loading sample의 전도도를 변경한 후 공정을 진행한 Chromatogram은 도 55와 같다.

Purity and yield of AEXII with increased conductivity of loading sample

Loading sample 희석배수 감소로 전도도가 증가(1mg Gly-Tβ4 / resin mL Loading sample conductivity 1.16 -> 2.76 mS/cm, 1.5mg Gly-Tβ4 / resin mL Loading sample conductivity 1.13 -> 2.80 mS/cm)되었지만, 수율과 순도 모두 (표 87) 큰 차이점을 확인할 수 없었다.

(7-3-4) 3차 공정 Hold time study

( 7-3-4-1) 실험목적

GMP 생산 시 적용 가능한 보관 조건 및 기간을 확보하기 위해, AEXII 공정 시 용출분획 시료를 냉장 (2~8 ℃), 상온 (18 ~ 22 ℃) 조건에서 7일간 보관한 후 순도 변화를 확인하였다.

(7-3-4-2) 실험방법

실험방법은 5L scale process 공정에서 3차 공정 Eluted pool을 제균 여과를 하여, Microtube에 300 uL씩 소분하여 냉장과 상온조건에서 7일간 보관하였다. 이때, 보관 기간종료 시점에 시료를 -70도에 보관하여 완전히 냉동한 후 보관 기간이 모두 종료한 다음날 동시에 모든 시료를 해동한 후 RP-HPLC을 통해 분석하였다.

(7-3-4-3) 실험결과

각 보관 조건 (상온, 냉장) 시험 후 RP-HPLC분석을 진행한 Chromatogram은 도 56과 같았으며, Purity와 Main peak에 대한 Area를 나타낸 표는 표 88과 같이 확인되었다.

공정시료의 안정성 판정기준은 (2-3)의 RP-HPLC 분석법에 따른 시스템 적합성 기준 (%CV ≤ 2.0%)에 의거하여 기간이 경과함에 따른 Main peak의 Area의 %CV는 2.0 이하로 확인되어 변화가 없는 것으로 판단하였다. 따라서, 3차 공정시료는 냉장상태 (2~8 ℃)또는 상온보관 조건 (18~22 ℃)에서 7일 동안 안정한 것으로 확인되었다.

RP-HPLC analysis for AEXII hold time study

(7-3-5) AEXII process summury

Summary of AEXII process

(7-4) 4차 컬럼 공정 연구

( 7-4-1) 조건 재현성 확인실험

4차 컬럼 재현성 실험에 사용할 Loading sample은, AEXII의 Elution criteria를 50L 2^nd Verification Run의 기준(50 mAU ~ 50mAU)을 적용하여 B/E mode로 진행하여 준비하였고, 그 이외에 모든 4차 컬럼 조건은 하기 표 90에 기재된 바에 따라 수행하였다. 2회 반복실험을 수행하였다 (도 57, 58).

CEX process conditions

Loading Sample preparation for CEX feasibility test

실험 결과, 주피크 용출 위치가 종래와 약간 차이를 보였다(도 57, 58). 실험 조건에서 차이를 고찰하였고, Resin bed height 차이, Loading sample의 단백질 농도와 부피가 다른 점 이외에 동일하였다. 종래의 경우 AEXII Elution pool의 Gly-Tβ4의 농도는 1~1.5 mg/mL였으나, Elution criteria를 50 mAU ~ 50 mAU로 수행한 소내 실험에서는 Elution pool의 Gly-Tβ4의 농도가 0.4 mg/mL로 확인되었다. 따라서, Loading sample 부피가 증가하였는데, 종래 수행한 조건은 7.5 CV , 소내에서 수행한 2회 실험에서는 각각 14.5, 17.0 CV로 수행되었다. 정확한 원인 파악을 위해 먼저 Bed height 차이에 의한 영향을 확인하고자 하였다.

(7-4-2) Bed height 차이에 의한 영향

(7-4-2-1) 실험목적

Bed height 차이에 따른 용출 위치 차이 유무를 확인하고자 하였다.

(7-4-2-2) Loading sample 준비

종래 사용했던 Loading sample과 최대한 유사하게 준비하기 위하여, AEXII Elution criteria를 100 mAU~172 mAU로 변경하여 용출분획을 확보하였다. 이렇게 준비된 용출분획의 순도 및 단계수율을 확인하였다 (표 92). 그러나, 단백질 농도는 0.9 mg/mL로 종래의 1~1.5 mg/mL 보다 약간 낮았다.

quality and quantity profile for AEXII process

(7-4-2-3) 실험방법

실험방법은 표 90에 명시된 방법과 동일하게 진행하되, Manual packing한 XK16 (Bed height 20 cm, CV 40 mL) 컬럼과 Prepack column (Bed height 10 cm, CV 5 mL)를 사용하여 각각 독립적으로 실험을 진행하였고, 공정에 Loading 되는 조건은 표 93에 따라 동일하게 맞춰서 진행하였다.

Loading sample의 부피(5.5 CV)를 2회 실험에서 동일하게 적용하였다. 그러나, 이전 실험과 비교해서 약 3배 정도 줄어든 부피였다. Flow rate은 200 cm/hr로 일정하게 유지하였지만, Bed height 차이에 의해 실험 간에 Residence time은 2배 차이가 있었다 이전 수행한 실험과 비교해서, Loading sample 전도도가 1.7-->2.0 mS/cm로 약간 증가하였다. 이후 공정이 완료된 시료에 대해서 RP-HPLC를 통하여 순도를 분석하였다.

Loading Sample Volume for bed height study

(7-4-2-4) 실험결과

실험을 진행한 공정에 대한 Chromatogram은 도 59, 60과 같다. Bed height 10 cm로 진행한 결과는 Wash step에서 peak가 보이지 않고 Elution step에서 나오는 것을 확인할 수 있었다. 종래의 Chromatogram (도 56)과 유사하게 확인되었다.

Bed height를 20cm로 진행한 결과는 Wash step 8CV 부근부터 용출되기 시작했고 Elution 단계에서 완전히 용출되었다. 그러나, 동일한 Bed height 조건으로 수행한 이전 실험 결과에서는 Wash 단계에서 주피크가 완전히 용출되었다. 이러한 차이는 Loading sample 부피 차이 (14.5 vs 5.5 CV)와 연관성이 있다고 추측되었다.

quality and quantity profile for CEX column length study

결과적으로, Residence time 차이를 유발하는 Bed height를 일정하게 유지하기 위해 10 cm 조건을 선정하였고, Flow rate 200 cm/hr, Loading sample 부피 5.5 CV 조건에서 종래 결과와 동일한 용출 위치가 재현됨을 확인하였다.

(7-5) 4차 컬럼 공정 재현성 실험

(7-5-1) 4차 컬럼 공정 시료 준비

4차 컬럼 공정 재현성을 확인하고자 AEXII 공정을 진행하였으며, 3차 컬럼 공정에 대한 실험방법은 표 90과 동일하게 진행하되, 3차 컬럼 용출분획 시료의 부피를 줄이기 위해 200 mAU ~ 200 mAU로 Pooling criteria를 변경하여 진행하였다. 3차 공정이 완료된 시료는 SEC-HPLC 정량과 RP-HPLC 순도를 분석하여 이전 결과와 다름이 없음이 확인되었으며, 그 결과는 표 95와 같다.

Purity & step yield for preparation of loading sample for the study of CEX bed height

(7-5-2) 실험목적

Bed height 10 cm (XK16 충진) 조건에서 prepacked column이 아닌 Manual packing 방법으로 충진된 컬럼을 사용하여 실험 결과가 동일하게 재현되는지 확인하고자 하였다.

(7-5-3) 실험방법

실험방법은 표 96과 같이 진행하였으며, Loading sample 부피는 이전 실험 결과인 5.5 CV와 유사한 7.0 CV를 적용하였고, Loading amount는 이전 실험 결과인 1.1 mg 보다 약간 많은 1.65 mg Gly-Tβ4/mL of Resin 조건으로 진행하였다. 공정이 완료된 시료는 SEC-HPLC를 통해 정량을 진행하였으며, RP-HPLC를 통해 순도를 확인하였다.

CEX process conditions

(7-5-4) 실험결과

공정을 진행한 Chromatogram은 도 61과 같으며, 예상과 다르게, 용출 완충액으로 변경하기 전 세척단계 마지막 부분에서부터 주피크가 용출되기 시작하였다. 이전 실험 결과와 비교해서 용출 시작되는 시점이 약간 빨라진 원인은, Loading amount 증가(1.1-->1.7 mg/mL of resin), Loading volume 증가(5.5-->7.0 CV)에서 유래한 것으로 추측되었다.

Loading Sample preparation for CEX feasibility test

Purity & yield of purified sample for CEX bed height study

CEX 공정결과 단계수율은 91 %로 확인되었고, 순도는 98.8 %로 확인되었다 (표 98) 이전 실험 결과 (99.7 %)보다 약간 낮은 순도를 보였고, 단계수율은 이전 결과가 없어서 비교할 수 없었다.

(7-6) 4차 컬럼 공정 Hold time study

( 7-6-1) 실험 목적

GMP 생산 시 적용 가능한 보관 조건 및 기간을 확보하기 위해, 4차 컬럼 용출분획 시료를 냉장 (2~8 ℃), 상온 (18 ~ 22 ℃) 조건에서 7일간 보관한 후 순도 변화를 확인하였다.

(7-6-2) 실험 방법

실험방법은 5L scale process 공정에서 4차 공정 Eluted pool을 제균 여과를 하여, Microtube에 300 uL씩 소분하여 냉장과 상온조건에서 7일간 보관하였다. 이때, 보관 기간종료 시점에 시료를 -70도에 보관하여 완전히 냉동한 후 보관 기간 종료 후 다음날 동시에 모든 시료를 해동한 후 RP-HPLC을 통해 분석하였다.

(7-6-3) 실험 결과

각 보관 조건 (상온, 냉장) 시험 후 RP-HPLC분석을 진행한 Chromatogram은 도 62와 같았으며, Puirty와 main peak에 대한 Area를 나타낸 표는 표 99와 같이 확인되었다. 공정시료의 안정성 판정기준은 (2-3)의 RPC-HPLC 분석법 (HU024-SOP-004)에 따른 시스템 적합성 기준(%CV ≤ 2.0%)을 적용했고, 냉장 및 상온보관 조건에서 기간이 경과해도 Main peak의 Area의 %CV는 2.0 이하로 확인되어 변화가 없는 것으로 판단되었다. 그러나, 상온보관한 시료에서는 빨간색 원으로 표시된 부분 (Retention time 27.4min)의 Impurity peak가 Day 0시료와 비교하였을 때, 기간이 경과함에 따라 Peak area가 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (표 100). 따라서, 4차 공정시료는 냉장상태 (2~8 ℃)에서 7일 동안 안정하며, 상온보관은 적절하지 않다고 판단되었다.

Purity on RP-HPLC analysis for CEX hold time study

Impurity analysis on RP-HPLC analysis for CEX eluted pool hold time in room temperature (18 ~ 22℃)

(7-7) CEX process summary

Summary of CEX process

실시예 (8) 5L 규모 배양액 정제

(8-1) 실험 목적

XK16 크기에서 수행한 결과를 BPG100 이상 크기 컬럼에서 재현성을 확인하고자 하였다.

(8-2) 실험방법

4차 컬럼 정제는 표 101에 명시된 방법에 의거하여 진행하였으며, 나머지 공정 조건은 표 102와 같이 진행하였다. Depth filtration 과 AEXI 공정에 대해서는 (2-6)에 기술된 방법으로 GST-Tβ4 표준물질 (50L 1^st Verification Run에서 제조됨)을 사용하여 공정 단계수율을 계산하였으며, Thrombin, AEXII와 CEX 공정에 대해서는 SEC-HPLC와 RP-HPLC를 이용하여 단계수율을 산출하였다. 또한 각 공정시료는 (2-4), (2-5)에 기술된 방법에 따라 Endotoxin과 HCP를 분석하였다.

5L scale process buffer and sample preparation condition

5L scale process conditions

Loading Sample preparation for 5L scale process

(8-3) 실험결과

각 공정에 대한 Chromatogram은 다음과 같이 나왔으며, 본 공정개발과 큰 차이점이 없이 수행되었음을 확인하였다(도 63, 64, 65). 하지만 XK16 컬럼 조건에서 진행되었던 CEX 이전 실험에서는 약 9 CV 이상 Wash 진행되었을 때 용출되었던 주피크가 6 CV 진행 시점부터 용출되기 시작하였다(도 66). 이미 언급했던 것처럼, 주피크가 용출 시작되는 시점이 빨라지는 원인은, Loading amount 증가(1.7-->2.8 mg/mL of resin), Loading volume 증가(7.0-->8.8 CV)에서 유래할 수 있다는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다. 따라서, 4차 컬럼 Loading sample 정보는 일정한 용출 위치를 유지하기 위하여 향후 GMP 생산 시 반드시 고려할 사항이라고 판단되었다.

Yield & purity in 5L scale process

Impurity analysis in 5L scale process

5L scale process를 통한 최종수율은 7.8 %로 확인되었으며, 3차 컬럼 공정 용출액의 RP-HPLC 순도는 96.3 %로 소규모 실험 결과와 동등한 수준으로 확인되었으며, 4차 컬럼 공정 용출액의 RP-HPLC 순도도 98.0 %로 기준 97 %이상을 만족시켰다. 그러나, 이전 CEX 소규모 정제 결과(99.6 %, 98.8 %)와 비교해서 상대적으로 낮은 순도(98.4 %)를 보였지만, 단계수율은 99.4 %로 약 8 % 이상 증가하였다 4차 컬럼 공정 시 이전 실험보다 빨라진 주피크 용출 시점이 영향을 준 것으로 판단되었다. 단계수율 증가에 따른 순도 저하로 예상되었다 (표 105). 공정유래불순물(HCP, Endotoxin)의 제거율은 AEXI 공정시료 대비 Affinity 공정에서 HCP 97.0 %, Endotoxin 98.0 %가 제거 되었다. Affinity 이후 AEXII 공정에서 Endotoxin은 99.9 % 이상 제거 되었으며, Endotoxin 제거율은 AEXII 공정에서 가장 우수함이 확인되었다. 최종 정제원액의 Endotoxin (≤ 0.5 EU/mg)과 HCP (≤ 100 ppm) 결과도 기준에 적합하였다 (표 106) 위 결과를 근거로 GMP 기술이전 protocol을 작성하였다.

(9-1) 실험목적

50L 규모 배양액 정제를 통해, 비임상 시험용 시료를 생산하고, 표준품 100 vial을 제조하고자 하였다.

(9-2) 실험방법

50L verification Run에 대한 완충액에 대한 조건은 표 107 같으며, 4차 컬럼 공정의 경우 5L scale process에서 진행한 Washing 조건과 다르게, NaCl 농도를 80 mM 에서 60 mM 로 변경되었고, 그 외 공정은 기존과 동일하게 진행되었다. 그리고 1,2,3차 컬럼 공정의 경우 기존 50L verification Run에서 적용하였던 Flow rate를 동일하게 적용하였으며, 4차 컬럼 공정은 BPG200 컬럼을 사용하게 되어 AKTA pilot에서 구동할 수 있는 최대 유속을 적용하였지만, 기존 200 cm/hr 조건을 적용할 수 없었다. 따라서, 150cm/hr 조건을 적용하여 진행하였다 (제조지시 및 기록서 batch No HU024-RD1603).

50L 3^rd verification run process conditions

(9-3) 실험결과

각 공정에 Chromatogram은 도 67 내지 70과 같이 확인되었으며, 재현성 있는 결과가 도출됨을 확인하였다. 누적 정제공정 수율은 12.4 %였다 (표 108).

Purity & Yield for 50L 3^rd Verification run

각 공정에 대한 공정유래 불순물 함량을 측정하였다 (표 109).

HCP & endotoxin analysis for 50L 3^rd verification run

최종 정제원액 약 13g을 확보하였고, RP-HPLC 순도는 98.1 %로 확인되어, 기준(97%이상)에 적합함을 확인하였다 (표 108). HCP 및 Endotoxin 함량도 기준에 적합하였다 (표 109). 공정유래불순물의 단위공정 제거율은 Affinity 공정에서 HCP 97.7 %, Endotoxin 99.5 %로 확인되었다. Affinity 이후 AEXII 공정에서 Endotoxin 단위공정 제거율은 99.9 %로 확인되었다. 이러한 결과는 선행실험인 5L 규모 배양액 정제 결과와 동등함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (12)

1. 다음 단계를 포함하는, 글리신-티모신 β4(Gly-thymosin β4, Gly-Tβ4)를 제조하는 방법:
   (S1) 시료를 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 1차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계;
   (S2) 용출물을 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계;
   (S3) 용출물에 트롬빈 처리하여 효소 절단하는 단계;
   (S4) 절단물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 2차 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 3 mg/mL 이하에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계;
   (S5) 용출물을 평형 완충액(equilibration buffer)으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피에 적재한 다음, 세척 완충액(Wash buffer)으로 상기 컬럼을 세척하고, 동적 결합 능력(Dynamic binding capacity, DBC) 3 ~ 8 mg/mL 에서 용출 완충액(elution buffer)으로 컬럼에 부착된 분획을 용출하는 단계; 및
   (S6) 용출물을 여과하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (S4) 단계에서 절단물을 pH 8 ~ 9, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (S4) 단계에서의 음이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30 mM Tris-HCl 및 30 ~ 130 mM NaCl 포함하는 pH 7 ~ 9의 완충액으로 용출하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 (S5) 단계에서 용출물을 pH 4.5 ± 0.1, 전도도(Conductivity) 2 ± 0.2 mS/cm 에서 컬럼에 적재하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피에서, 상기 절단물은 pH 4 ~ 7, 전도도(conductivity) 4 mS/cm 이하에서 컬럼에 적재하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 (S5) 단계에서의 양이온 교환 크로마토그래피에서 컬럼에 부착된 분획은 100 ~ 300 cm/hr의 유속으로, 10 ~ 30mM 아세테이트 및 150 ~ 210 mM NaCl 포함하는 pH 4 ~ 5의 완충액으로 용출하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 (S3) 단계에서 트롬빈 대비 GST-Tβ4 는 5 ~ 0.5 : 1 (unit:mg) 인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 (S3) 단계에서의 반응 온도는 13~27 ℃ 인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 방법에 따른 최종 정제 원액의 순도가 97% 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 (S1) 단계에서의 시료는 다음 단계를 포함해 수득하는 것을 특징으로 하는, 방법:
    목적 단백질을 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
    상기 숙주 세포를 파쇄하는 단계; 및
    파쇄물을 세척 및 여과하는 단계.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 숙주 세포의 본배양은 인덕션(Induction) 시작시 OD₆₀₀ 은 40 ~ 65, 인덕션(induction) 온도 25 ~ 35℃ 에서 패드-뱃치(fed-batch) 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 방법에 따른 세포생산성은 180 g pellet/L 이상, 목적 단백질 생산성은 54 mg/g pellet 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.

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