JP2023513347A - 標的化合物の精製のための方法／デバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、ｉ）標的化合物を含む水溶液を提供することと、ｉｉ）前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、ｉｖ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、ＮＭＲパラメータを決定することと、ｖ）濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することとを含む、分離方法に関する。本発明はさらに、それに関する分離システム、使用、調製、及び方法に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、ｉ）標的化合物を含む水溶液を提供することと、ｉｉ）前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、ｉｖ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、ＮＭＲパラメータを決定することと、ｖ）濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することとを含む、分離方法に関する。本発明はさらに、それに関する分離システム、使用、調製、及び方法に関する。

技術分野
本発明は、生化学的分離方法、分離システム、及び分離システムの使用に関する。本発明の方法及びデバイスは、ある範囲の化合物を含む溶液から標的化合物を分離するために使用され得る。一例として、標的化合物は、タンパク質、核酸、ウイルス、又はリポソームなどの生体分子であり得る。他の標的化合物も許容される。標的化合物は、例えば医薬品有効成分として、治療目的で特に使用され得る。

広範な生体分子には、大きな治療的価値があることが証明されてきた。しかしながら、治療目的の生体分子の生成には、多くの課題がある。特に、所望の生体分子は、例えば、安全な使用を保証するため、及び法的規制を遵守するために、高純度で提供される必要がある。

治療用生体分子の生成プロセスにおける工程の順序、及び特定の工程それ自体は、通常、インラインで取得した測定データに基づいて制御される。特に、クロマトグラフィー分離方法を使用すると、溶出中に所望の生成物を回収することは、分離手段の溶出液から取られた測定値の定義された開始値及び終了値に基づいて制御されることが多い。しかしながら、生体分子の生成プロセスを直接制御するのに利用可能な方法の数は限定されており、それは、結果が数秒以下の時間範囲内で利用可能でなければならないためである。典型的には、溶出液のタンパク質含有量は、ＵＶ吸収測定を使用して測定され得る。さらに、電気伝導率又はｐＨ値における変化も検出され得る。

核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、生体分子を研究するために広範な用途に使用されてきた技法である。サンプル中の生体分子の異なる態様に関する結論は、タンパク質若しくはペプチドなどの生体分子自体のＮＭＲシグナルに、又は生体分子を含む溶液由来のＮＭＲシグナルに基づく場合がある。例えば、Ｓｈｉｇｅｍｉｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９８：５９－６７（非特許文献１）は、アミロイドベータペプチドモノマー及びダイマーのＮＭＲシグナルの測定について記載している。Ｍｅｔｚ ａｎｄ Ｍａｅｄｅｒ（２００８），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃｓ ３６４：１７０－１７５（非特許文献２）は、製薬分野、特に薬物送達において特に使用され得るエマルション及び脂質成分の特徴付けのためのＮＭＲ実験を示している。

国際公開公報第２０１４／１６９２２９号Ａ１（特許文献１）は、概して、生物医薬品製剤の凝集の程度の指標として水分子のＮＭＲ緩和速度を使用する方法に関する。同様に、国際公開公報第２０１８／１０２６８１号Ａ１（特許文献２）は、溶媒ＮＭＲシグナルの横緩和速度を使用して、溶媒中の懸濁液又はエマルションとして配合された粒子含有生成物を非侵襲的に評価する方法について記載している。どちらの場合も、生物医薬品化合物は、バイアル又は容器を開けるか又は保護シールを傷つけることなく（つまり、壊れることなく）非破壊的に評価することができる。Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ，６７（４）：９０３－９１８（非特許文献３））は、天然ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液における水プロトン横緩和を記載している。彼らは、水プロトン横緩和が、水とタンパク質のアミノ酸側鎖との間のプロトンの高速交換によって影響を受けるという証拠を提示している。Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５１：６８０４（非特許文献４）は、水プロトンの横緩和が、水中でのタンパク質凝集及び界面活性剤のミセル化を定量化するために使用され得ることを記載している。ヒトインスリン調製物を使用して、Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０４：４１３２－４１４１（非特許文献５）は、水プロトンの横緩和速度が、可視の及び肉眼では見ることのできない両方のタンパク質凝集体を検出及び定量化するための信頼性が高く感度の高い指標として機能し得ることを実証している。Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８９：５４９４－５５０２（非特許文献６）は、異なる応力によって生成されたモノクローナル抗体凝集体の存在の検出に向けて、水ＮＭＲと、サイズ排除クロマトグラフィー、マイクロフローイメージング、及び動的光散乱などの従来の技術との感度の違いを探る。Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９１（６）：４１０７（非特許文献７）は、タンパク質凝集の特徴づけのための水プロトンＮＭＲの使用を開示している。近年、水ＮＭＲのインライン測定は可能であるが、フローシステムの構成、流量、タンパク質濃度、及びタンパク質凝集に依存することがわかった（Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９），７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＰＡＮＩＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐ３５：「Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ－ＮＭＲ－Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｔａｃｔ－Ｆｒｅｅ Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」（非特許文献８））。

国際公開公報第２０１２／０１５９１２号Ａ１（特許文献３）は、活性ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを精製するための方法に関し、国際公開公報第２０１９／０１６１５４号Ａ１（特許文献４）は、タンパク質又は他の生体分子の工業規模の精製のための技法を教示している。

国際公開公報第２０１４／１６９２２９号Ａ１ 国際公開公報第２０１８／１０２６８１号Ａ１ 国際公開公報第２０１２／０１５９１２号Ａ１ 国際公開公報第２０１９／０１６１５４号Ａ１

Ｓｈｉｇｅｍｉｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９８：５９－６７ Ｍｅｔｚ ａｎｄ Ｍａｅｄｅｒ（２００８），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃｓ ３６４：１７０－１７５ Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ，６７（４）：９０３－９１８ Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５１：６８０４ Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０４：４１３２－４１４１ Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８９：５４９４－５５０２ Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９１（６）：４１０７ Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９），７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＰＡＮＩＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐ３５：「Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ－ＮＭＲ－Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｔａｃｔ－Ｆｒｅｅ Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」

解決すべき問題
上記にもかかわらず、生体分子又は生体分子の複合体、特にタンパク質又はその複合体の精製を支援する手段及び方法が依然として当技術分野で必要とされている。

概要
この問題は、独立請求項の特徴を有する方法、システム、使用、調製、及びコンピュータプログラム製品によって対処される。単独の方式又は任意の恣意的な組み合わせで実現され得る有利な実施形態は、従属請求項に記載されている。

よって、本発明は、
ｉ）標的化合物を含む水溶液を提供することと、
ｉｉ）前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
ｉｖ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、ＮＭＲパラメータを決定することと、
ｖ）濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む分離方法に関する。

概して、本明細書で使用される用語は、当業者に通常の慣習的な意味を与えられるべきであり、別途指示がない限り、特別な又はカスタマイズされた意味に限定されるべきではない。以下で使用されるように、「有する（ｈａｖｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語、又はそれらの任意の文法上の変形は、非排他的に使用される。よって、これらの用語は、これらの用語によって導入された特徴に加えて、この文脈で説明されている存在物にさらなる特徴が存在しない状況と、１つ又は複数の追加の特徴が存在する状況との両方を指す場合がある。一例として、「ＡはＢを有する（Ａ ｈａｓ Ｂ）」、「ＡはＢを含む（Ａ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ Ｂ）」及び「ＡはＢを含む（Ａ ｉｎｃｌｕｄｅｓ Ｂ）」という表現は、Ｂ以外に他の要素がＡに存在しない状況（つまり、ＡがＢだけで構成されている状況）と、Ｂ以外に要素Ｃ、要素Ｃ及びＤ、あるいはまたさらなる要素といった１つ又は複数の要素が存在物Ａに存在する状況との両方を指す場合がある。また、当業者に理解されるように、用語「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、「１つ又は複数」を指し、すなわち「少なくとも１つ」と同等である。よって、「ｉ）標的化合物を含む水溶液を提供することと、ｉｉ）前記水溶液に分離工程を適用し、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、ｉｖ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、ＮＭＲパラメータを決定することと、ｖ）濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することとを含む、分離方法」は、「ｉ）少なくとも１つの標的化合物を含む少なくとも１つの水溶液を提供することと、ｉｉ）前記水溶液に、少なくとも１つの分離工程を適用し、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、少なくとも１つの分離工程を適用することと、ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す少なくとも１つの濃度パラメータを決定することと、ｉｖ）前記画分に、少なくとも１つの核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによって、少なくとも１つのＮＭＲパラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における少なくとも１つの核磁気共鳴スピン緩和を示す、少なくとも１つのＮＭＲパラメータを決定することと、ｖ）濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の少なくとも１つの標的パラメータを決定することとを含む、分離方法」と同等である。

さらに、以下で使用される場合、用語「好ましくは（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）、「より好ましくは（ｍｏｒｅ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」、「最も好ましくは（ｍｏｓｔ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」、「特に（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ）」、「より具体的には（ｍｏｒｅ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ）、「特に（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」、「より具体的には（ｍｏｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」、又は同様の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意選択的な特徴と併せて使用される。よって、これらの用語によって導入される特徴は、任意選択的な特徴であり、いかなる方法によっても特許請求の範囲を制限することを意図したものではない。本発明は、当業者が認識するように、代替的な特徴を使用して実施され得る。同様に、「ある実施態様では」又は同様の表現によって導入された特徴は、本発明のさらなる実施形態に関する制限なしに、本発明の範囲に関する制限なしに、及びそのように導入された特徴を他の任意選択的又は非任意選択的な特徴と組み合わせる可能性に関する制限なしに、任意選択的な特徴であることが意図されている。

本明細書で使用される場合、用語「標準条件」は、別途明記されない場合、ＩＵＰＡＣ標準の常温及び圧力（ＳＡＴＰ）条件、すなわち、好ましくは、２５℃の温度及び１００ｋＰａの絶対圧力に関し、また好ましくは、標準条件は７のｐＨを含む。さらに、別途記載されない場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、関連分野で一般的に受け入れられている技術的精度を備えた表示値に関連し、好ましくは表示値±２０％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％に関連する。さらに、用語「本質的に（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、示された結果及び使用に影響を与える偏差がないことを示す。つまり、潜在的な偏差によって示された結果が、±２０％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％を超えて逸脱することはない。よって、「本質的に～からなる」とは、特定の成分を含むが、不純物として存在する材料を除く他の成分と、成分を提供するために使用されたプロセスの結果として存在する不可避の材料と、本発明の技術的効果を達成する以外の目的で追加された成分を排除することを意味する。例えば、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句を使用して定義される組成物は、任意の既知の許容される添加剤、添加物、希釈剤、担体等を包含する。好ましくは、成分のセットから本質的になる組成物は、５重量％未満、より好ましくは３重量％未満、さらにより好ましくは１重量％未満、最も好ましくは０．１重量％未満の不特定の成分を含むことになる。

本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。さらに、方法は、上で明示的に言及されたものに加えて工程を含み得る。例えば、さらなる工程は、例えば、工程ｉ）、及び／又は本明細書の他の場所に示される工程、例えば目的の画分であると同定された２つ以上の画分を組み合わせること、及び／又は本明細書に記載される方法の工程より先の及び／又は後のさらなる精製工程のための、標的化合物を含む水溶液を生成することに関連し得る。 特に、方法は、工程ｉｖ）の後に少なくとも１つの画分に、少なくとも１つのさらなる、一実施形態では非同一の、一実施形態では非同一の分離原理に基づく、少なくとも１つのさらなる分離工程を適用することが繰り返され得る。さらに、前記工程のうちの１つ又は複数は、自動化装置によって実施され得る。

一実施形態では、本方法の工程は、当業者によって適切であるとみなされる順序で実施される。さらなる実施形態では、少なくとも工程ｉ）は工程ｉｉ）の前に実施され、工程ｉｉｉ）及びｉｖ）は工程ｖ）の前に実施される。一実施形態では、工程ｉｉｉ）からｉｖ）、又は工程ｉｉ）からｖ）の少なくとも一部は、本質的に同時に実施され、よって、クロマトグラフィーカラムの出口は、濃度決定デバイス及びＮＭＲ測定デバイスに接続され得ることも想定される。さらなる実施形態では、出口は、切り替えバルブなどの液体分配要素に接続されていてもよく、この要素は、標的パラメータが閾値基準を満たしている場合はカラムから出てくる溶液を標的化合物回収デバイスに迂回させ、閾値基準が満たされていない場合はカラムから出てくる溶液を廃棄物回収デバイスに迂回させる。さらなる実施形態では、方法の工程は、示されている順序で実施される。

本明細書で使用される場合の用語「分離方法」は、水溶液に含まれる他の化合物よりも標的化合物の濃縮に適した任意の方法に関し、よって、一実施形態では、分離方法は、他の化合物からの標的化合物の分離を引き起こす。一実施形態では、分離方法は、標的化合物から、異なる分子量を有する分子、一実施形態では標的化合物の７５％未満、一実施形態では５０％未満、さらなる実施形態では２５％未満、さらなる実施形態では１０％未満の分子量を有する分子、又は一実施形態では標的化合物の少なくとも１５０％、一実施形態では少なくとも２００％、さらなる実施形態では少なくとも２５０％の分子量を有する分子を分離する方法である。一実施形態では、分離方法は、標的化合物から、異なるサイズ及び／又は分子量を有するが、同様の物理的、化学的、及び／又は生化学的特性を有する分子を分離する方法であり、よって、一実施形態では、方法は、標的化合物から、標的化合物の凝集体、断片、及び／又は分解生成物を分離する方法である。よって、標的化合物がポリペプチドである場合、分離方法は、一実施形態では、前記ポリペプチドから、宿主細胞タンパク質、凝集体、断片、及び／又は分解生成物を分離する方法であり、さらなる実施形態では、標的化合物がポリペプチドである場合、分離方法は、一実施形態では、前記ポリペプチドから、凝集体、断片、及び／又は分解生成物を分離する方法である。一実施形態では、標的化合物がウイルスカプシドである場合、分離方法は、充填されたウイルスカプシドから、空のウイルスカプシドを、一実施形態では、充填されたアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）カプシドから、空のＡＡＶウイルスカプシドを分離する方法である。

「空のカプシド」及び「空の粒子」という用語は、一実施形態では、少なくともウイルスタンパク質の殻を含むが、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される核酸の全部又は一部を欠いているウイルス粒子を指す。したがって、空のカプシドは、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される核酸を、宿主細胞に転写するように機能しない。

ある実施形態では、ＮＭＲパラメータは、ウイルス粒子によって引き起こされない変化、特に溶質効果に対して補正される。これは、ある実施形態では、ｐＨ値及び／又はイオン濃度に基づく場合がある。ある実施形態では、そのような補正は、既知のウイルス粒子含有量を有し、他の点では使用される水溶液と同一の組成を有する水溶液を使用して事前補正を実施すること、及び／又はウイルス粒子を含まず、他の点では使用される水溶液と同一の組成を有する水溶液を使用して事前補正を実施することによって提供される。

よって、ある実施形態では、ポリヌクレオチドが負荷されたウイルス粒子の比／画分／濃度は、水溶液における水分子のプロトンの横緩和時間（Ｔ_２）であるＮＭＲパラメータに正比例する。

「組み換えウイルスベクター」は、一実施形態では、分子法を使用してウイルス（例えばＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去し、それを、転写物に転写されたか又はタンパク質をコードする核酸などの非天然核酸に置き換えることにより、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムに由来する。典型的には、ＡＡＶについて、ＡＡＶゲノムの一方又は両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、ＡＡＶベクターに保持される。「組み換え」ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムの全部又は一部が、天然のウイルスゲノム核酸に関して非天然（すなわち、異種）配列で置き換えられているため、天然に存在するウイルスＡＡＶゲノムとは区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を「組み換え」ベクターとして定義し、これは、ＡＡＶの場合、「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。

組み換えウイルスベクター（例えばＡＡＶ）ポリヌクレオチドは、一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のその後の感染（形質導入）のためにウイルス粒子にパッケージ化することができる。組み換えベクター配列がＡＡＶ粒子にカプセル化又はパッケージ化される場合、粒子は「ＡＡＶ粒子」又は「ＡＡＶ粒子」とも呼ぶことができる。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプセル化又はパッケージ化するタンパク質を含む。特定の例には、ウイルスエンベロープタンパク質が含まれ、ＡＡＶの場合、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３などの、カプシドタンパク質が含まれる。

「ベクター」は、一実施形態では、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成するために、直接的に、又は１つ又は複数の一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形のいずれかで、最終的にパッケージ化又はカプセル化された組み換えポリヌクレオチドの一部を指す。組み換えプラスミドを使用して組み換えウイルス粒子を構築又は製造する場合、ウイルス粒子は、組み換えプラスミドのベクター配列に対応しない「プラスミド」の一部を含まない。組み換えプラスミドのこの非ベクター部分は、「プラスミドバックボーン」と呼ばれ、これは、プラスミドのクローニング及び増幅に重要であり、増殖及び組み換えウイルスの生成に必要なプロセスであるが、それ自体はウイルス（例えばＡＡＶ）粒子にパッケージ化又はカプセル化されていない。よって、「ベクター」は、ウイルス粒子（例えばＡＡＶ）によってパッケージ化又はカプセル化された核酸を指す。

本明細書の記載を考慮して当業者によって理解されるように、分離方法は、少なくとも、標的化合物を含む水溶液に、本明細書で指定される分離工程を適用し、それにより、複数の画分を提供する、分離工程を適用する工程と、画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度及び純度に関する情報を提供する１つ又は複数の工程とを含む。よって、一実施形態では、方法は、分離工程における標的化合物のインプロセス制御の方法である。一実施形態では、分離方法は、生化学的精製方法の一部及び／又は標的化合物、特にポリペプチド又はポリペプチド複合体の生成方法の一部である。当業者によって理解されるように、生化学的精製方法は、分離方法からなる場合があるか、又はさらなる精製工程、一実施形態では１つ又は複数のさらなる分離方法、さらなる実施形態では本開示による１つ又は複数のさらなる分離方法を含む場合がある。

一実施形態では、分離方法は、標的化合物を含む水溶液に、本明細書に明記される分離工程を適用し、それにより複数の画分を提供する、分離工程を適用する工程と、濃縮された状態及び／又は精製された状態の標的化合物を含む前記画分の少なくとも１つを同定する工程とを含む。一実施形態では、分離方法は、上に明記された工程ｉ）からｉｖ）に加えて、ｖｉ）標的化合物を含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定することと、ｖｉｉ）標的化合物を含む画分の少なくとも２つを組み合わせること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて組み合わせることとを含む、さらなる工程を含む。一実施形態では、工程ｖｉｉ）において、標的パラメータが標的条件を満たす画分が組み合わされる。よって、標的化合物を所望の純度で含む画分は、一実施形態では、前述の標的パラメータに基づいて同定される。

上記によれば、「分離工程」という用語は、水溶液に少なくとも１つの分離原理を適用し、複数の画分を得て、水溶液の成分の分布を前記画分の少なくとも２つにわたって異ならせることを含む工程に関する。分離原理は、成分の分布を分離工程から画分にわたって異ならせる任意の原理、特に物理的原理（例えば、沈降速度又は分子サイズ）、化学的原理（例えば、塩、疎水性、又は電荷の存在下での溶解度）、又は生化学的原理（例えば、別の分子への親和性）、又はそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、分離工程は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）工程である。ＬＣ法は、当業者に知られており、特に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、及び当業者に適切とみなされる任意の他のタイプのＬＣを含む。一実施形態では、ＬＣは、膜及び／又はフィルタベースのＬＣである。さらなる実施形態では、ＬＣはカラムベースのＬＣである。いくつかの実施形態では、ＬＣは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィー、相分離クロマトグラフィー、分布クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーからなるリストから選択される。さらなる実施形態では、ＬＣは、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、カチオンイオン交換クロマトグラフィー又はアニオンイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態では、ＬＣは混合モードクロマトグラフィーである。

一実施形態では、分離方法は生化学的分離法である。本明細書で使用される場合、「生化学的分離法」という表現中の「生化学的」という用語は、標的化合物が、本明細書の他の場所に明記される生化学的化合物であり、分離方法又はこれによる分離工程を限定することを意図していない。

用語「水溶液」とは、原則として、当業者に理解される。本明細書で使用される場合、この用語は、任意の液体調製物に関し、ここで、溶媒中の水の濃度は、少なくとも５０％、一実施形態では少なくとも７５％、さらなる実施形態では少なくとも９０％、さらなる実施形態では少なくとも９５％、さらなる実施形態では少なくとも９８％、さらなる実施形態では少なくとも９９％、さらなる実施形態では約１００％、さらなる実施形態では本質的に１００％である。さらに、本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、溶液中の化合物（溶質）の少なくとも一部分が、溶媒に溶解することを指す。一実施形態では、溶質は、本質的には溶媒に溶解し、さらなる実施形態では、溶質は溶媒に溶解する。溶液を調製するための方法は、当該技術分野で知られている。よって、一実施形態では、水溶液という用語は、少なくとも部分的に、水を含み、一実施形態では水からなる、溶媒に溶解する標的化合物を含む液体調製物に関する。

本明細書で使用される場合、「標的化合物」という用語は、少なくとも１つの目的の高分子量有機化学化合物を含む主題の任意の組成物を指し、一実施形態では、高分子量化学化合物は、少なくとも５００（５００原子質量単位、及び５００Ｄａに対応する；１Ｄａは１．６６×１０^－２７ｋｇに対応する）、さらなる実施形態では少なくとも１０００、さらなる実施形態では少なくとも１００００、さらなる実施形態では少なくとも１０００００の分子量を有する化学化合物である。よって、この用語は、高分子量有機化学化合物、前記高分子量有機化学化合物を含む複合体、及び前記高分子量有機化学化合物又は前記複合体のコンジュゲートに関する。一実施形態では、高分子量有機化学化合物は高分子であり、一実施形態では生物学的高分子、一実施形態では少なくとも５００（０．５ｋＤａ）、さらなる実施形態では少なくとも１０００（１ｋＤａ）、さらなる実施形態では少なくとも１００００（１０ｋＤａ）、さらなる実施形態では少なくとも１０００００（１００ｋＤａ）の分子量を有する生物学的高分子である。高分子量有機化学化合物がポリペプチドである場合、分子量は、０．５ｋＤａから５００ｋＤａ、一実施形態では１ｋＤａから４００ｋＤａ、さらなる実施形態では５ｋＤａから２５０ｋＤａであり得る。一実施形態では、高分子量有機化学化合物は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はロック核酸（ＬＮＡ）である。さらなる実施形態では、高分子量有機化学化合物はポリペプチドである。よって、一実施形態では、標的化合物はポリペプチド又はポリヌクレオチド、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＬＮＡ、ポリペプチド又はポリヌクレオチドのコンジュゲート、又はポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む複合体、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はリポソームである。一実施形態では、標的化合物は、ウイルス又はＶＬＰであり、さらなる実施形態では、標的化合物は、標的化合物は、非エンベロープウイルス又は非エンベロープウイルスのＶＬＰであり、さらなる実施形態では、標的化合物は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）又はＡＡＶのＶＬＰであり、一実施形態では、本明細書中で上に明記される通りである。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、並びにその混合物及び／又はキメラからなるＡＡＶ血清型の群から選択される血清型を有する。一実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からなるＡＡＶ血清型の群から選択される血清型を有する。さらなる実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２血清型、又はＡＡＶ６血清型、又はＡＡＶ８血清型である。

一実施形態では、標的化合物は、（ｉ）ＰＤ－１に結合する抗体と、（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγを通じてシグナル伝達するポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートであり、一実施形態では、ＩＬ－２Ｒβγを通じてシグナル伝達するポリペプチドは、ＩＬ－２ポリペプチド又はＩＬ－１５ポリペプチドであり、一実施形態では、標的化合物は、国際公開公報第２０１８／１８４９６４号Ａ１に明記されるようなイムノコンジュゲートであり、さらなる実施形態では、明細書中以下の実施形態４６から６８のいずれか１つに明記されるようなイムノコンジュゲートである。

一実施形態では、標的化合物は、（ｉ）抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）野生型インターロイキン－２（ＩＬ－２）分子と比較して、中間親和性ＩＬ－２受容体に対する変異ＩＬ－２分子の親和性を低下させるアミノ酸変異を含む２つの変異ＩＬ－２分子であって、前記変異ＩＬ－２分子が配列番号３０の配列を含む、２つの変異ＩＬ－２分子とを含む、融合タンパク質である。さらなる実施形態では、標的化合物は、（ｉ）抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）配列番号３０の配列を含む２つの変異ＩＬ－２分子とを含む融合タンパク質である。一実施形態では、標的化合物は、国際公開公報第２０１５／１１８０１６号Ａ１及び／又はＥＰ ３１０２５９５ Ｂ１に明記されるような融合タンパク質であり、一実施形態では、国際公開公報第２０１５／１１８０１６号Ａ１及び／又はＥＰ ３１０２５９５ Ｂ１に明記されるようなＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ－（ＩＬ２）_２又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ－（ＩＬ－２ Ｎ８８Ｄ）_２イムノコンジュゲートである。一実施形態では、標的化合物は、本明細書中以下の実施形態６９から９０のいずれか１つに明記されるような融合タンパク質である。

一実施形態では、標的化合物は、二重特異性抗体であり、一実施形態では、ＣＤ３と第２の抗原とに結合する二重特異性抗体であり、さらなる実施形態では、ＣＤ３とＣＥＡとに結合する二重特異性抗体である。さらなる実施形態では、標的化合物は、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子と、２つのサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含む二重特異性抗体であり、一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、より具体的にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一実施形態では、前記標的化合物は二重特異性抗体であり、ここで、第１のＦａｂ分子は、Ｃ末端で第２のＦａｂ分子のＮ末端に融合し、第２のＦａｂ分子は、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合し、第３のＦａｂ分子は、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの他方のＮ末端に融合し、一実施形態では、第２のＦａｂ分子はＣＤ３に結合し、第１及び第３のＦａｂ分子は第２の抗原に結合し、さらなる実施形態では、第２の抗原はＣＥＡである。一実施形態では、標的化合物は、本明細書中以下の実施形態９１から９９のいずれか１つに明記されるような二重特異性抗体であり、さらなる実施形態では、標的化合物は、シビサタマブである（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ），Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ ８０，２０１８，ｖｏｌ．３２，ｎｏ．３，ｐ．４３８）。

本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、本明細書に明記されるような高分子量有機化学化合物と少なくとも１つの同一又は非同一の化学分子との非共有結合性会合に関する。複合体に含まれるさらなる分子は、本明細書に明記されるように、特に同一の又はさらなる標的化合物を含む、任意の化学分子であり得る。一実施形態では、非高分子量有機化学化合物、特に低分子量（小分子）薬学的化合物が、複合体に含まれる。一実施形態では、複合体は、標準条件下で安定しており、さらなる実施形態では、複合体は、分離工程の条件下で安定しており、「安定」という用語は、上記の条件下で、１日あたり複合体の最大２５％、一実施形態では最大１０％、さらなる実施形態では最大５％、さらなる実施形態では最大１％の損失に関する。一実施形態では、上記の条件下で、複合体に含まれる高分子量有機化学化合物及び少なくとも１つのさらなる分子の解離のための解離定数Ｋ_ｄは、最大１０^－６Ｍ、一実施形態では最大１０^－７Ｍ、さらなる実施形態では最大１０^－８Ｍ、さらなる実施形態では最大１０^－９Ｍ、さらなる実施形態では最大１０^－１０Ｍである。

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、本明細書に明記されるような高分子量有機化学化合物と少なくとも１つの同一又は非同一の化学分子との共有結合に関する。コンジュゲートに含まれるさらなる分子は、本明細書に明記されるように、特に同一の又はさらなる標的化合物を含む、任意の化学分子であり得る。一実施形態では、少なくとも１つの非高分子量有機化学化合物、特に低分子量（小分子）薬学的化合物、検出可能な標識、及び／又はビオチンなどの親和性標識がコンジュゲートに含まれる。さらなる実施形態では、少なくとも１つのさらなる高分子量有機化学化合物、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、一実施形態では、当業者に知られている生分解性ポリマー、オリゴ糖又は多糖、ポリペプチド、及び／又はポリヌクレオチドが、コンジュゲートに含まれる。高分子量有機化学化合物が、ポリペプチド、又はポリペプチドを含む複合体である場合、少なくとも１つのさらなる高分子量有機化学化合物は、特に、低分子量（小分子）薬学的化合物、ポリヌクレオチド、特に、ロック核酸、ビオチンなどの親和性標識、グリコシル化、又はＰＥＧ化である。

一実施形態では、標的化合物は、生物の細胞内でも検出できる化合物又は生物への投与を目的とした化合物である。よって、一実施形態では、標的化合物は、生細胞によって生成された、及び／又は生細胞の生化学的組成を調節する化合物である。

一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチドであるか又はポリペプチドを含み、さらなる実施形態では、ポリペプチドである。一実施形態では、標的化合物は、治療用ポリペプチド、すなわち、疾患又は不調を予防、改善、又は治療するために生物へ投与するためのポリペプチドである。一実施形態では、標的化合物は、診断用ポリペプチド、すなわち、疾患又は不調を診断するのに使用するためのポリペプチドである。一実施形態では、ポリペプチドは、タンパク質のような抗体、特に、抗体又はその断片、一実施形態では、治療用又は診断用抗体である。一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチド、一実施形態では非凝集及び／又は非分解ポリペプチド、さらなる実施形態では非凝集及び／又は非分解抗体様タンパク質、特に抗体又はその断片である。一実施形態では、標的化合物は、本明細書に明記されるようなポリペプチドを含み、さらなる実施形態では、本明細書に明記されるようなポリペプチドからなる。よって、一実施形態では、標的化合物は、本明細書に明記されるようなポリペプチドのコンジュゲート、特に抗体様タンパク質のコンジュゲート、具体的には抗体又はその断片及び／又はその融合ポリペプチドである。

本明細書で使用される場合、「抗体様タンパク質」という用語は、抗体の少なくとも１つのサブドメイン、特にＩｇＧ又はその断片を含む任意のポリペプチドに関する。よって、一実施形態では、抗体様タンパク質は、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３ドメインのうちの少なくとも１つ、一実施形態では、Ｆ_ｖ、Ｆ_ａｂ及び／又はＦ_ｃドメイン、さらなる実施形態では、Ｆ_ｖ又はＦ_ａｂドメインを含む。上記のドメインは、原則として、当業者に知られており、本明細書中以下でさらに説明される。一実施形態では、抗体様タンパク質は、多重特異性抗体様タンパク質であり、すなわち、多数のＦ_ｖ及び／又はＦ_ａｂドメインを含み、さらなる実施形態では、抗体様タンパク質は、二重特異性抗体様タンパク質であり、すなわち２つのＦ_ｖ及び／又はＦ_ａｂドメインを含む。

用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの抗体又はその断片から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、２つ以上の抗体ドメインの融合ポリペプチド、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ、ナノボディとしても知られている）、及び抗体断片、並びに上記の化合物の少なくとも１つを含む化合物を網羅する。一実施形態では、抗体は、完全長抗体又は抗体断片であるか、又は完全長抗体又は抗体断片を含む。さらなる実施形態では、抗体は、２つ以上の抗体ドメインの、一実施形態では少なくとも２つの非同一抗体からの、融合ポリペプチドであるか又はそれを含む。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であるか又はそれを含む。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質若しくはペプチドとの共有的又は非共有的結合により形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、一実施形態では、その抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。パパイン処置は、二つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）２断片を産生する。「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様において、二本鎖「Ｆｖ」種は、一本の重鎖と一本の軽鎖の可変ドメインが堅固な非共有結合をなした二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連結することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に結合することができる。用語「ダイアボディ」は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ－ＶＬ）。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは二価でも二特異性でもよい。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、本質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、少量で存在しうる可能な変異体、例えば天然発生変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。さらなる実施形態では、抗体は、一実施形態では共有結合的に、さらなる化学分子に結合され得る。ポリペプチドが化学分子とどのように共有結合するかについては、当該技術分野で知られている。本発明の結合ポリペプチドとの共有結合に好ましい化学分子は、サイトカインや金属複合体形成剤などの薬学的化合物である。

一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチドを含むコンジュゲートであり、さらなる実施形態では、ポリペプチドコンジュゲートである。本明細書で使用される場合、「ポリペプチドコンジュゲート」という用語は、追加の化学基又は分子への少なくとも１つの共有結合を含むポリペプチドに関し、前記化学結合は、ポリペプチドのペプチド鎖を継続するペプチド結合ではない。一実施形態では、追加の化学基又は分子は、「指標」、すなわち、前記指標を含む分子又は複合体の存在を検出可能にするように適合された化合物である。典型的には、指標は、検出可能な特性、典型的には光学又は／及び酵素特性を有する。しかしながら、前記検出可能な特性は放射性を放出する特性であることも、想定される。本明細書で使用される場合の用語「光学特性」は、光学機器によって検出することができる任意の特性に関する。具体的には、光学的に検出可能な特性は、反射特性、透過特性、発光特性、散乱特性、蛍光特性、蛍光特性、回折特性、及び偏光特性からなる群より選択される少なくとも１つの特性であり得るか又はそれらを含み得る。本発明によって想定されるさらなる光学特性は、色、蛍光、発光、又は屈折である。一実施形態では、本明細書で言及される光学的に決定可能な特性は、光吸収、発光、光寛解、又はそれらに関連する特性など、光学的に検出することができる化合物の特性を指す。本明細書で使用される光学的に決定可能な特性の検出は、以前は検出できなかった特性の存在の検出、以前に検出された特性がないことの検出、及び特性の定量的変化の検出、すなわち、少なくとも１つの光学特性の変化の程度に相関するシグナル強度の変化の検出を包含することが理解されよう。「光学的に決定可能な特性」という用語は、一実施形態では、電気発生化学ルミネセンスとしても知られている電気化学発光にも関連していることが理解される。さらなる実施形態では、追加の化学基又は分子は、「エフェクター」、すなわち、標的化合物の追加の効果、特に追加の治療的効果を媒介する化合物である。よって、エフェクターは、例えば細胞毒素である化学構造体、例えば化学療法化合物、免疫刺激剤、例えばサイトカイン、又は例えば元素の放射性同位体を錯化するための複合体形成基であり得る。

一実施形態では、標的化合物は、治療用ポリペプチドコンジュゲート又は診断用ポリペプチドコンジュゲートである。一実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中で上に明記される抗体様タンパク質の、一実施形態では診断用及び／又は治療用抗体の、コンジュゲートである。一実施形態では、ポリペプチドは、抗体コンジュゲート、一実施形態では治療用又は診断用抗体コンジュゲートである。一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチドコンジュゲート、一実施形態では非凝集及び／又は非分解ポリペプチドコンジュゲート、さらなる実施形態では非凝集及び／又は非分解抗体コンジュゲートである。

一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチド複合体であるか又はそれを含む。よって、一実施形態では、標的化合物は、同一又は非同一のポリペプチドサブユニットの四次構造を含む複合体である。さらなる実施形態では、ポリペプチド複合体は、ウイルスカプシド、一実施形態では非エンベロープウイルスカプシド、であるか又はそれを含む。本明細書で使用される場合、「ウイルスカプシド」という用語は、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む充填されたカプシド、ポリヌクレオチドがない空のカプシド、並びにそれらの前及び中間形態を含む。一実施形態では、ポリペプチド複合体は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、さらなる実施形態ではポリペプチド複合体は充填されたウイルスカプシドであり、一実施形態では組み換えポリヌクレオチドを含み、さらなる実施形態では治療用ポリヌクレオチドを含み、さらなる実施形態では組み換え治療用ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、特に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はロック核酸（ＬＮＡ）であり得る。一実施形態では、ウイルスカプシドは、非エンベロープウイルスのカプシドであり、さらなる実施形態では、アデノ関連ウイルスカプシド、アデノウイルスカプシド、又はパルボウイルスカプシドである。

さらなる実施形態では、標的化合物は、「融合ポリペプチド」、すなわち、ペプチド結合を介してポリペプチドに共有結合しており、ポリペプチドのアミノ酸配列の続きである、少なくとも１つのさらなるペプチド配列を含むポリペプチドである。よって、一実施形態では、融合ポリペプチドは、連続したオープンリーディングフレームによってコードされる。さらなるペプチド配列は、本明細書で上に明記されるような指標であってもよい。よって、一実施形態では、さらなるペプチドは、光学的に決定可能な特性、一実施形態では蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、若しくは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を有するペプチドであるか、又は酵素特性、例えばオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼを有するペプチドである。さらなるペプチドはまた、本明細書で上に明記されるような指標、一実施形態ではサイトカインであり得る。

さらなる実施形態では、標的化合物は、本明細書に明記されるような融合ポリペプチドの本明細書に明記されるようなコンジュゲート、特に、抗体様タンパク質のコンジュゲートである。一実施形態では、標的化合物は、本明細書中の実施例に明記されるような化合物の１つ、特に、実施例に明記されるようなＡＬＰ１、ＡＬＰ２、ＡＬＰ３、又はＡＬＰ４である。

一実施形態では、標的化合物はリポソームではない。さらなる実施形態では、標的化合物は、エンベロープウイルス粒子でもそのＶＬＰでもない。さらなる実施形態では、標的化合物は、最大２５％（ｗ／ｗ）の割合で、一実施形態では最大１０％（ｗ／ｗ）、さらなる実施形態では最大５％（ｗ／ｗ）、さらなる実施形態では最大１％（ｗ／ｗ）の割合で脂質を含む。

「画分」という用語は、当業者には、主題の組成物のサブポーション、一実施形態では水溶液（一実施形態では、水溶液の成分を含むと知られているか又は疑われている）に分離工程を適用することにより生じる本明細書に明記されるような水溶液に関すると理解される。本開示の画分は、水溶液という用語について本明細書で上に明記されているように水性である。一実施形態では、画分のうちの少なくとも１つは、標的化合物を含む。本明細書で上に明記されるように、特に複数の画分が少ない場合、特に３つ又は２つである場合、画分は必ずしも同じ体積を有する必要はない。「画分の少なくとも一部」という用語は、当業者には、提供されたすべての画分の少なくとも１つの画分の数に関すると理解される。一実施形態では、画分の少なくとも一部は、例えば方法を実施する前述の例から、標的化合物を含むと疑われる画分である。一実施形態では、画分の少なくとも一部は、少なくとも２、一実施形態では少なくとも５、さらなる実施形態では少なくとも１０の画分である。さらなる実施形態では、画分の少なくとも一部は、提供されたすべての画分の少なくとも１％、一実施形態では少なくとも５％、さらなる実施形態では少なくとも１０％、さらなる実施形態では少なくとも２５％、さらなる実施形態では少なくとも５０％に関する。一実施形態では、画分の少なくとも一部は、提供されたすべての画分を含む。さらに理解されるように、一実施形態では、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータは、同じ画分で決定され、両パラメータは、パラメータが決定される各画分について決定される。しかしながら、いくつかのサンプルについて１つのみのパラメータが決定され、第２のパラメータは、前記サンプルについて決定された第１のパラメータが所与の限界基準を満たす場合にのみ決定されることも想定される。一実施形態では、本明細書に明記されるような画分は、仮想画分であり、すなわち、分離工程の溶出液を同じ又は異なる体積を有し得るサブポーションに形式的に分割し、前述のパラメータを検出することによって生成される、仮想画分である。さらなる実施形態では、画分は物理的画分であり、同じ又は異なる体積を有し、別個の容器に含まれている場合がある。一実施形態では、少なくとも１つの画分中の標的化合物の濃度は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、一実施形態では少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、さらなる実施形態では少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、さらなる実施形態では少なくとも２０ｍｇ／ｍＬであり、また、一実施形態では、標的化合物がウイルス、特にＡＡＶである場合、ウイルス粒子の総濃度は、少なくとも１つの画分中、少なくとも１＊１０^１２ｖｇ／ｍＬ（１ｍＬあたりのウイルスゲノム又はベクター）、さらなる実施形態では少なくとも５＊１０^１２ｖｇ／ｍＬ、さらなる実施形態では少なくとも１＊１０^１３ｖｇ／ｍＬ、さらなる実施形態では少なくとも２＊１０^１３ｖｇ／ｍＬである。

「複数」という用語は、当業者には少なくとも２の数に関すると知られている。一実施形態では、少なくとも３、さらなる実施形態では少なくとも４、さらなる実施形態では少なくとも５の画分が提供される。しかしながら、少なくとも１０、一実施形態では少なくとも２０の画分が方法の工程ｉ）において提供されることも想定される。

本明細書で使用される場合、「濃度パラメータ」という用語は、標的化合物の濃度と相関するか、又は主題の組成物中の、標的化合物が属する化合物のクラスの濃度と相関する任意のパラメータに関する。パラメータは、半定量的又は定量的パラメータであってもよく、一実施形態では、定量的パラメータである。そのようなパラメータを決定するための適切なアッセイが、当該技術分野で知られている。一実施形態では、濃度パラメータは、包括的な濃度パラメータ、つまり、適用される決定方法に関連する同じ又は類似の特性を有する化合物の化学クラスの濃度と相関するパラメータであり、例えば２８０ｎｍでの溶液の吸収は、ポリペプチドの濃度と相関することが当業者に知られている。さらなる実施形態では、濃度パラメータは、特定の濃度パラメータ、つまり、標的化合物の濃度と特異的に相関するパラメータであり、特定の濃度パラメータは、例えば標的化合物がポリペプチド又はそのコンジュゲート若しくは複合体である場合、免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡによって決定され得る。濃度パラメータは、直接アッセイ、すなわち、標的化合物の特性又は標的化合物が属する化合物の化学クラスの特性を直接決定するアッセイにおいて、又は間接アッセイ、すなわち、検出剤によって誘導された、標的化合物の特性又は標的化合物が属する化合物の化学クラスの特性を検出するアッセイにおいて、決定され得る。よって、標的化合物がポリペプチドである場合、濃度パラメータは、直接アッセイ、すなわち、ポリペプチドの特性を直接決定するアッセイにおいて、又は間接アッセイ、すなわち、検出剤によって誘導されたポリペプチドの特性を検出するアッセイにおいて、決定され得る。間接タンパク質アッセイは、特に、Ｌｏｗｒｙアッセイ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、又は当業者によって適切とみなされる任意の他の方法を含む。一実施形態では、濃度パラメータは、インラインで決定され、特に、フロースルー測定の形態で決定される。よって、一実施形態では、濃度パラメータは、直接アッセイにおいて決定され、一実施形態では直接測光アッセイにおいて決定される。一実施形態では、濃度パラメータは、溶液中の標的化合物の吸収、吸光、又は蛍光である。一実施形態では、標的化合物はポリペプチドであり、濃度パラメータは、２８０ｎｍ、２３５ｎｍ、及び／又は２０５ｎｍ、さらなる実施形態では２８０ｎｍでの吸収である。

用語「核磁気共鳴（ＮＭＲ）」は、当業者によって理解される。したがって、用語「核磁気共鳴パラメータ」（「ＮＭＲパラメータ」と略される）は、原則として、サンプル、特に、本明細書の他の場所に明記されるような水溶液又は画分に、核磁気共鳴測定を適用することによって、及び核磁気スピン緩和を示すことによって決定することができる任意のパラメータに関する。一実施形態では、ＮＭＲパラメータは、水プロトンＮＭＲ（^１Ｈ_２Ｏ ＮＭＲ）から誘導可能なパラメータである。一実施形態では、ＮＭＲパラメータは、ＮＭＲ測定によって決定された、緩和時間又は緩和速度を含むか又は緩和時間又は緩和速度であり、一実施形態では、^１Ｈ_２Ｏ ＮＭＲ測定において決定された、緩和時間又は緩和速度を含むか又は緩和時間又は緩和速度である。さらなる実施形態では、ＮＭＲパラメータは、核磁気スピン横緩和時間Ｔ_２及び核磁気スピン横緩和速度Ｒ_２のうちの少なくとも１つを含むか又はそれであり、さらなる実施形態では、ＮＭＲパラメータは、溶液における又はその画分における水の核磁気スピン横緩和、特に溶液における又はその画分における水のプロトンの核磁気スピン横緩和を示す。当業者が理解するように、緩和時間Ｔは、対応する緩和速度Ｒと相互関係がある。つまりＴ＝１／Ｒである。一実施形態では、ＮＭＲパラメータは、ＮＭＲ測定において決定された、横緩和時間（Ｔ_２）又は横緩和速度（Ｒ_２）であり、一実施形態では、^１Ｈ_２Ｏ ＮＭＲ測定において決定された、横緩和時間（Ｔ_２）又は横緩和速度（Ｒ_２）であり、すなわち、一実施形態では、水プロトンの横緩和時間（Ｔ_２）又は水プロトンの横緩和速度（Ｒ_２）である。一実施形態では、決定中の磁界の強さは、０．１Ｔから２４Ｔ、一実施形態では０．２Ｔから１０Ｔ、一実施形態では０．３Ｔから５Ｔ、さらなる実施形態では０．４Ｔから２Ｔ、さらなる実施形態では約０．５Ｔ、さらなる実施形態では０．５Ｔである。一実施形態では、共振周波数は、５ＭＨｚから５００ＭＨｚ、一実施形態では７．５ＭＨｚから２００ＭＨｚ、一実施形態では１０ＭＨｚから１００ＭＨｚ、さらなる実施形態では１５ＭＨｚから５０ＭＨｚ、さらなる実施形態では約２０ＭＨｚ、さらなる実施形態では２０ＭＨｚである。

一実施形態では、濃度パラメータとＮＭＲパラメータは、非同一であり、よって、一実施形態では、濃度パラメータは、水プロトンの横緩和時間Ｔ_２ではなく、且つ／又は水プロトンの横緩和速度Ｒ_２ではなく、さらなる実施形態では、濃度パラメータは、本明細書で上に明記されるような水の核磁気スピン横緩和を示すＮＭＲパラメータではない。

「測定を適用する」及び「決定する」という用語は、当業者には、関連パラメータの値、特に濃度パラメータ及び／又はＮＭＲパラメータを決定することに関すると理解される。よって、さらなるパラメータ、例えば標的化合物の濃度、温度、ｐＨ、イオン濃度などのうちの１つ又は複数のさらなるパラメータが、追加で検出される場合がある。ｐＨ（プロトン選択性電極を介して）及びイオン濃度（導電性の測定により）を決定するための方法は、当業者に知られている。一実施形態では、決定はオフライン決定であり、よって、一実施形態では、画分又はそのサブポーションは、測定デバイスに移送される。決定が間接アッセイにおいて実施される場合、サンプルのサブポーションは、測定前に１つ又は複数の検出試薬で前処理され得る。さらなる実施形態では、決定はインラインであり、すなわち、プロセスから画分又はそのサブポーションを除去する必要はない。さらなる実施形態では、決定は連続的なインライン決定であり、よって、一実施形態では、画分は、本明細書で上に明記されるようなウイルス画分である。よって、一実施形態では、画分は、液体の連続流として生成され、さらなる実施形態では、工程ｉｉｉ）及びｉｖ）は、液体の連続流、例えば溶出液で継続して実施される。一実施形態では、濃度パラメータ、ＮＭＲパラメータ、及び／又は任意選択的に決定される他のパラメータは、フロースルーセル内で、特に、濃度パラメータの場合は、フロースルーキュベット内で決定される。パラメータは、同時に又は連続して決定されてもよく、一実施形態では連続して決定される。先に検討したように、各パラメータは、一実施形態では、本発明に従って定量的に又は半定量的に決定される。

本明細書で使用される場合、「標的パラメータ」という用語は、少なくとも１つの数学的及び／又は論理的操作によって濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータから決定されたパラメータに関する。一実施形態では、標的パラメータは、バイナリパラメータであり、すなわち、０若しくは１、又はｙｅｓ若しくはｎｏといった、２つの可能な値のうちの１つを想定している。さらなる実施形態では、標的パラメータは、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの数値に基づく数値パラメータである。

一実施形態では、標的パラメータはバイナリパラメータである。一実施形態では、濃度パラメータが所与の閾値基準を満たすかどうか、例えば所与の低い光学吸収又は濃度値を超えるかどうかを決定し、ＮＭＲパラメータが所与の閾値基準を満たすかどうか、例えば所与の低いＴ２値を超えるかどうかを決定することにより、及び濃度パラメータとＮＭＲパラメータのうちの少なくとも１つが閾値基準を満たさないすべての場合について第１のバイナリ値を、濃度パラメータとＮＭＲパラメータの両方がそれぞれの閾値基準を満たす場合について第２のバイナリ値を使用することにより、標的パラメータの値が決定される。よって、そのような場合、標的パラメータは、濃度パラメータとＮＭＲパラメータの少なくとも１つが閾値基準を満たさない画分についてプール＝Ｎｏに設定され得、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの両方がそれぞれの閾値基準を満たす画分についてプール＝ＹＥＳと設定され得る。

さらなる実施形態では、標的パラメータは、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの値に基づいて算出された数値パラメータである。原則として、標的パラメータは、濃度パラメータによって決定されるように標的化合物の濃度が高く、ＮＭＲパラメータによって決定されるように不要な副生成物の濃度が低い場合、計算の結果は決定的に異なることを確実にする任意の数学的方法によって算出され得る。一実施形態では、濃度パラメータは、標的化合物の濃度に正比例するように数学的に変換され、ＮＭＲパラメータは、不要な副生成物の濃度に間接的に比例するように数学的に変換される。よって、一実施形態では、例えば、標的化合物がポリペプチドであり、不要な副生成物がその凝集体である場合、濃度パラメータは、例えば２８０ｎｍでの、吸収であり、ＮＭＲパラメータは、本明細書で上に明記されるような水プロトンＮＭＲ Ｔ_２値である。そのような場合、標的パラメータは、一実施形態では、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの積として算出される。当業者が理解するように、さらなる計算、及び倍率などの追加のパラメータが、当業者に適切とみなされる標的パラメータの計算に使用され得る。特に、一実施形態では、濃度パラメータ及び／又はＮＭＲパラメータは、例えば決定されたすべての値を、すべての画分で決定された最高値に対して正規化することによって、０と１の間の値に正規化される。当業者が理解するように、濃度パラメータ及び／又はＮＭＲパラメータはまた、特に画分のライブモニタリングを使用する用途において、非正規化され得る。さらに、一実施形態では、濃度パラメータは、標的化合物の濃度によって引き起こされたものではない変化、例えばバッファー効果に対して補正され、ＮＭＲパラメータは、不要な生成物によって引き起こされたものではない変化、特にバッファー効果に対して補正され、これは、一実施形態では、ｐＨの変化及び／又はイオン濃度の変化によって引き起こされ得る。一実施形態では、このような補正は、標的化合物が存在しない場合、又は水溶液がない場合でも、並行補正又は前補正を実行することによって提供される。一実施形態では、このような補正は、本明細書中の実施例に示されるように実施される。よって、一実施形態では、標的パラメータは、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの積として算出され、ここで、積の値は正規化されていてもよく、さらなる実施形態では、標的パラメータは、正規化された濃度パラメータ及び正規化されたＮＭＲパラメータの積として算出される。さらなる実施形態では、標的パラメータは、塩及び／又はｐＨ効果について補正された、濃度パラメータ（正規化されていてもよい）及びＮＭＲパラメータ（正規化されていてもよい）の積として算出される。よって、一実施形態では、標的パラメータは、横緩和時間（Ｔ_２）である、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに正比例し、一実施形態では、横緩和時間（Ｔ_２）である、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの積に正比例する。

一実施形態では、方法は、標的パラメータを閾値と比較するさらなる工程を含む。「閾値」という用語は、当業者に理解され、本明細書の教示を考慮すると、当業者は適切な閾値を確立することができる。閾値は、標的パラメータを算出するのに使用される特定の式に依拠することになり、一実施形態では、当業者によって標的化合物の必要な収率及び／又は純度を達成するように調整されることになる。よって、所与の標的化合物について、適切な閾値の実験的な決定が必要とされ得る。

一実施形態では、方法は、ｖｉ）標的化合物を含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定することのさらなる工程を含む。一実施形態では、前記同定することは、デジタル標的パラメータが、それぞれのサンプルが所望の純度を有することを示すかどうかを決定することを含むか、又は、調査中のサンプルについて、決定された標的パラメータの値が標的化合物を所望の純度で含む画分を示すかどうかを決定することを含む。上記から理解されるように、これは、一実施形態では、画分について決定された標的パラメータの値を閾値と比較することにより達成される。一実施形態では、画分は、標的パラメータの値が閾値と少なくとも等しい場合に、標的化合物を所望の純度で含むと同定される。

「純度」という用語は、本明細書では、その従来の意味で、調製物、溶液、又は画分中に非標的化合物の成分がないことについての尺度として使用される。一実施形態では、純度は、少なくとも５０％の純度、一実施形態では少なくとも７５％の純度、一実施形態では少なくとも９０％の純度、一実施形態では少なくとも９５％の純度、さらなる実施形態では少なくとも９８％の純度、さらなる実施形態では少なくとも９９％の純度である。一実施形態では、本明細書で使用される場合の純度という用語は、絶対純度に関し、すなわち、一実施形態では溶媒を除き、非標的化合物成分のいずれも存在しないことの尺度であり、さらなる実施形態では、純度という用語は、相対純度、すなわち、特定の非標的化合物成分が存在しないことにも関係し得る。すなわち、一実施形態では、ポリペプチドである標的化合物の純度は、他のポリペプチド、一実施形態では特定のサイズ及び／又は質量基準を満たす他のポリペプチドが存在しないことの尺度として示され得る。また、一実施形態では、純度という用語は、例えば、標的化合物が、ポリペプチド、前記ポリペプチドの宿主細胞タンパク質、凝集体、断片、及び／又は分解生成物である場合、さらなる実施形態では前記ポリペプチドの凝集体、断片、及び／又は分解生成物である場合、標的化合物と同様であるが同一ではない標的化合物が存在しないことの尺度として使用される。

さらなる実施形態では、方法は、ｖｉｉ）標的化合物を含む画分のうちの少なくとも２つを組み合わせること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて組み合わせることの工程をさらに含む。一実施形態では、少なくとも２つ、さらなる実施形態では少なくとも３つの画分が組み合わされる。さらなる実施形態では、標的化合物を所望の純度で含むと決定されたすべての画分は組み合わされ、さらなる実施形態では、例えば本明細書の他の場所に明記されるような閾値に少なくとも等しい、所与の標的条件を満たすすべての画分は組み合わされる。理解されるように、組み合わせることはまた、非同一の純度の別個のプール、例えば実質的に純粋な標的合物の１つのプールと、純度の低い第２のプール、を確立することを含み得る。一実施形態では、方法は、標的パラメータに基づいて、画分のうちの２つ以上を、自動的に分配すること、割り当てること、又は組み合わせることのうちの少なくとも１つを含む。特に、実施形態では、標的パラメータに基づいて制御される、自動的に制御された液体分配要素、特に自動バルブが使用される。

有利には、濃度測定とＮＭＲ測定の組み合わせを使用して、化合物の精製、特に、標的化合物と同様の特性を有する化合物、例えば凝集体の除去を支援することができることが、本発明の根底にある研究で発見された。また有利には、ＤＮＡが負荷されたＡＡＶ粒子の画分／割合／濃度は、水プロトンＮＭＲ（^１Ｈ_２Ｏ ＮＭＲ）によって、ＤＮＡが負荷されたＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子とを含む水溶液における核磁気スピン横緩和時間Ｔ_２と相関すること、及び、この相関関係は、タンパク質濃度の測定と組み合わせて、充填されたカプシドからの空のカプシドの分離の検出に使用することができることが発見された。

上記の定義は、必要な変更を加えて以下に適用される。以下のさらなる追加の定義及び説明も、必要な変更を加えて本明細書に記載されるすべての実施形態に適用される。

本発明は、ＡＡＶ粒子を生成すること、ＡＡＶ粒子を精製すること、及びＡＡＶ粒子の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、本明細書で上に明記されるような方法の使用にも関する。

本発明は、本発明の方法によって生成されるか又は生成可能な標的化合物の調製にも関する。

本発明は、さらに、
ａ）標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイスと、
ｂ）前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイスと、
ｃ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定するように構成された核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定デバイスであって、核磁気共鳴パラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定デバイスと、
ｄ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイスと
を含む分離システムに関する。

本明細書で使用される場合、「システム」という用語は、互いに作用可能に連結されている示された手段の集合に関する。前記手段は、単一のシステムで実装されてもよく、又は互いに作用可能に連結されている物理的に分離されたデバイスであってもよい。一実施形態では、システムは、水溶液に本明細書で上に明記されるような分離工程を実施するように、複数の画分を提供するように、濃度パラメータを決定するように、ＮＭＲパラメータを決定するように、及び画分の少なくとも一部における標的パラメータを決定するように適合される。一実施形態では、システムは、一実施形態では少なくとも標的パラメータを画分の少なくとも一部に割り当てる順序付けされた出力で、評価デバイスによって実施された決定の結果を出力する出力デバイスをさらに含む。一実施形態では、前もって明記された標的基準を満たす、特に、前もって定義された閾値に少なくとも等しい標的パラメータを少なくとも有する、プールされた画分の調製物を提供するように、さらに適合される。一実施形態では、システムは、液体分配要素、一実施形態ではプーリングデバイス又は分配デバイスをさらに含む。よって、一実施形態では、システムは、標的化合物を含む画分のうちの少なくとも２つを組み合わせるためのプーリングデバイス、及び／又は工程ｄ）において決定された標的パラメータの値を出力する出力デバイスをさらに含む。さらなる実施形態では、システムは、画分を別個の容器内へ分配するように構成された分配デバイスを含む。一実施形態では、システムは、特に電子形態で、システムのデバイスによって提供されたデータ、ユーザ入力によって提供されたデータ、特に１つ又は複数の閾値、及び／又は分析を実施するための命令、特に本明細書で上に明記されるようなアルゴリズムを実施するための機械読み取り可能命令を記憶するように構成された、データ記憶デバイスをさらに含む。当業者に理解されるように、前記データ記憶デバイスは、分離デバイス、濃度決定デバイス、及び／又はＮＭＲ測定デバイスの一部であってもよく、且つ／又はシステムの他のデバイスに作用可能に連結したスタンドアロンデータ記憶デバイスであってもよい。

本明細書で使用される場合、「分離デバイス」という用語は、水溶液に分離工程を適用し、それにより水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された任意のデバイスに関する。適切な分離工程は本明細書で上に記載されてきた。したがって、適切な分離デバイスは、特に適切な固相を含むクロマトグラフィーカラムを含む。当業者に理解されるように、分離デバイスは、当該技術分野では通常のさらなるデバイス、一実施形態では１つまたは複数のポンプ、接続チューブ、サンプルアプリケーション機器、加熱及び／又は冷却ユニット、圧力センサなどを含み得る。

本明細書で使用される場合、「濃度決定デバイス」という用語は、本明細書で上に明記されるような濃度パラメータを決定するように構成された、ありとあらゆるデバイスを含む。上から理解されるように、標的化合物の濃度を決定する特定の方法は、特に標的化合物の化学的性質に依拠する。一実施形態では、濃度決定デバイスは、インライン測定用に構成されており、さらなる実施形態では、連続インライン測定用に構成されている。よって、一実施形態では、濃度決定デバイスは、フロースルー測定セルを含む。一実施形態では、濃度は測光的に決定され、濃度決定デバイスはフォトセル及び光源を含む。一実施形態では、濃度決定デバイスは、光度計であり、一実施形態では２８０ｎｍでの測定用に構成された光度計である。適切なデバイスが当該技術分野で知られている。

本明細書で使用される場合、「核磁気共鳴測定デバイス」及び「ＮＭＲ測定デバイス」という用語は、水溶液又は画分にＮＭＲ測定を適用することによりＮＭＲパラメータを決定するように構成された、ありとあらゆるデバイスを等しく含む。一実施形態では、ＮＭＲ測定デバイスは、核磁気スピン緩和値、一実施形態では、画分の少なくとも一部における水プロトン核磁気スピン緩和値の測定を実施するように構成されたデバイスである。一実施形態では、ＮＭＲ測定デバイスは、インライン測定用に構成されており、さらなる実施形態では、連続インライン測定用に構成されている。適切なデバイスは、当該技術分野で、例えば、Ｍｅｔｚ ＆ Ｍａｅｄｅｒ（２００８），Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３６４：１７０から、及びＴａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８９：５４９４，ａｎｄ Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９），７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＰＡＮＩＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐ３５：「Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ－ＮＭＲ－Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｔａｃｔ－Ｆｒｅｅ Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」から知られている。

本明細書で使用される場合、「評価デバイス」という用語は、濃度決定デバイスによって決定された濃度パラメータと、ＮＭＲ測定デバイスによって決定されたＮＭＲパラメータとに、本明細書に明記されるようなアルゴリズムのうちの少なくとも１つを適用するデバイスに関する。よって、一実施形態では、評価デバイスは、少なくとも１つの画分について標的パラメータを決定するように適合されている。さらなる実施形態では、評価デバイスは、標的パラメータを本明細書で上に明記されるような閾値と比較するように構成されている。一実施形態では、評価デバイスは、少なくとも１つの画分の標的パラメータの値及び／又は標的パラメータの前記値を閾値と比較した結果を印刷するために必要なすべての計算及び評価を実施するように適合されている。一実施形態では、評価デバイスは、データ処理デバイス、好ましくはマイクロプロセッサを含む。

本発明は、標的化合物を生成すること、標的化合物を精製すること、及び標的化合物の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、本発明によるシステム及び／又は本発明による方法の使用にも関する。

本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、本明細書で上に明記されるような標的化合物の純度を低下させるすべての化合物に関する。よって、不純物は、一実施形態では、生成物に特異的な副生成物、宿主細胞タンパク質副生成物、不要な化学修飾を含む及び／又は非コンジュゲート化合物などの所望の化学修飾を欠く標的化合物（例えば、ＬＮＡコンジュゲーションを欠く抗体）、及び／又は本明細書で上に明記されるような凝集体及び他の誘導体などの物理的に修飾された標的化合物である。

本発明は、濃度決定デバイス及び／又は本発明による方法に従って水溶液中の標的化合物を分離するための核磁気共鳴測定デバイスの使用にさらに関する。

本発明は、命令を含むコンピュータプログラム製品であって、命令が、コンピュータ、濃度決定デバイス、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定デバイスを含む適切なシステムで実行されると、少なくとも以下の工程：
Ｉ）標的化合物を含む水溶液の少なくとも１つの画分における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定すること、
ＩＩ）前記少なくとも１つの画分にＮＭＲ測定を適用することによって核磁気共鳴パラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記少なくとも１つの画分における核磁気スピン緩和を示す、核磁気共鳴パラメータを決定すること、並びに
ＩＩＩ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて、前記少なくとも１つの画分の標的パラメータを決定すること
を実施させる、コンピュータプログラム製品にも関する。

本明細書でさらに開示及び提案されるものは、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されるときに本明細書に含まれる実施形態のうちの１つ又は複数において本発明による方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラムである。具体的には、コンピュータプログラムは、コンピュータ可読データキャリアに記憶され得る。よって、具体的には、上に示された方法工程Ｉ）からＩＩＩ）のうちの１つ、複数、又はすべてでさえ、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用して、好ましくはコンピュータプログラムを使用して、実施され得る。

本明細書でさらに開示及び提案されるものは、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されるときに本明細書に含まれる実施形態のうちの１つ又は複数において本発明による方法を実施するためにプログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品である。具体的には、コンピュータコード手段は、コンピュータ可読データキャリアに記憶され得る。

本明細書でさらに開示及び提案されるものは、記憶されたデータ構造を有するデータキャリアであり、これは、コンピュータ又はコンピュータネットワーク内、例えば、ワーキングメモリ又はコンピュータ若しくはコンピュータネットワークのメインメモリ内にロードした後に、本明細書で開示される実施形態のうちの１つ又は複数による方法を実行し得る。

本明細書でさらに開示及び提案されるものは、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されると、本明細書に開示する実施形態のうちの１つ又は複数による方法を実施するために、機械可読キャリアに記憶されたプログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品である。本明細書で使用される場合、コンピュータプログラム製品とは、取引可能な製品としてのプログラムを指す。製品は、一般に、紙のフォーマットなどの任意のフォーマットで、又はコンピュータ可読データキャリア上に存在し得る。具体的には、コンピュータプログラム製品は、データネットワークにわたって分布し得る。

最後に、本明細書で開示及び提案されるものは、本明細書に開示される実施形態のうちの１つ又は複数による方法を実施するための、コンピュータシステム又はコンピュータネットワークによって読み取り可能な命令を含む、変調データシグナルである。

本発明のコンピュータにより実装される態様を参照すると、本明細書に開示される実施形態のうちの１つ又は複数による方法の方法工程のうちの１つ又は複数、あるいは方法工程のすべてでさえ、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用して実施され得る。よって、概して、データの提供及び／又は操作を含む方法工程のいずれかは、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用して実施され得る。概して、これらの方法工程は、典型的には、サンプルの提供及び／又は実際の測定を実施する特定の態様など、手作業を必要とする方法工程を除いて、方法工程のいずれかを含み得る。

具体的には、本明細書でさらに開示されるものは、
－ 少なくとも１つのプロセッサを含むコンピュータ又はコンピュータネットワークであって、プロセッサが本明細書に記載される実施形態のうちの１つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータ又はコンピュータネットワークと、
－ コンピュータによってロード可能なデータ構造であって、コンピュータ上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの１つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータによってロード可能なデータ構造と、
－ コンピュータプログラムであって、コンピュータ上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの１つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータプログラムと、
－ コンピュータプログラムであって、コンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの１つによる方法を実施するためのプログラム手段を含む、コンピュータプログラムと、
－ 上述の実施形態によるプログラム手段を含むコンピュータプログラムであって、コンピュータで読み取り可能な記憶媒体上に記憶される、コンピュータプログラムと、
－ 記憶媒体であって、データ構造が記憶媒体上に記憶され、データ構造が、コンピュータの若しくはコンピュータネットワークのメインメモリ及び／又はワーキングメモリ内にロードされた後に、本明細書に記載される実施形態のうちの１つによる方法を実施するように適合されている、記憶媒体と、
－ プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品であって、プログラムコード手段がコンピュータ上で又はコンピュータネットワーク上で実行される場合、プログラムコード手段が、本明細書に記載される実施形態のうちの１つによる方法を実施するために、記憶媒体上に記憶され得るか又は記憶される、コンピュータプログラム製品と
である。

本発明は、本明細書に記載される分離方法によって予め確立された、対応する濃度パラメータ値、ＮＭＲパラメータ値、及び／又は標的パラメータ値に割り当てられた画分の数を含む、一実施形態ではデータキャリアに明白に埋め込まれた、データベースにも関する。本発明は、システム、本明細書で上に明記されるような一実施形態では、上記のデータベースをシステムにも関し、前記システムは、一実施形態では、前記データベースから濃度パラメータ値、ＮＭＲパラメータ値、及び標的パラメータ値のうちの少なくとも１つを得るために適合されている。

当業者に理解されるように、データベースは、本明細書に明記されるような分離方法を実施すること及び示されたパラメータの対応する値と一緒に画分の数を記憶することにより確立され得る。よって、分離方法が同じ又は本質的に同じ条件下で繰り返される場合、方法に明記されるように３つのパラメータすべてを決定する必要はなく、データベースから前記パラメータのうちの１つ又は複数を読み取ることができる場合がある。よって、原則として、分離方法が同じ又は本質的に同じ条件下で繰り返される場合、濃度パラメータ及び／又はＮＭＲパラメータを決定することなく、データベースから標的パラメータを読み取ることができるか、又はデータベースから濃度パラメータ及び／又はＮＭＲパラメータを読み取ることができる場合がある。一実施形態では、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータのうちの少なくとも１つ、一実施形態では濃度パラメータは、分離方法での分離が実際に同じであることを確認するために決定される。

本発明は、透析濾過によって溶液中の標的化合物の濃度を上昇させるための方法であって、以下：
Ａ）前記溶液における又はその画分における経時的な核磁気共鳴パラメータ（ＮＭＲパラメータ）の第１の勾配を決定すること、
Ｂ）前記溶液における又はその画分における経時的な前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配を決定すること、並びに
Ｃ）前記ＮＭＲパラメータの前記第２の勾配の値が、前記ＮＭＲパラメータの前記第１の勾配の値から少なくとも１０％、一実施形態では少なくとも２０％、さらなる実施形態では少なくとも３０％外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び／又は撹拌速度を増加させること
を含む方法にも関する。

標的化合物の濃度を上昇させるための方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であり、明記されたものに加えて工程を含み得る。

「溶液中の標的化合物の濃度を上昇させる」は、という用語は、通常の意味で使用され、手順開始前の濃度と比較して、手順後の標的化合物の濃度を高くする任意の手順に関する。一実施形態では、濃度上昇は、１．２５倍から２５０倍、一実施形態では１．５倍から１２５倍、さらなる実施形態では２倍から５０倍の範囲にある。一実施形態では、標的化合物はポリペプチドであり、出発濃度は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、一実施形態では少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、さらなる実施形態では少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、さらなる実施形態では少なくとも５ｍｇ／ｍｌである。

「透析濾過」という用語は、当業者に知られている。一実施形態では、透析濾過は限外濾過であり、特に標的化合物がポリペプチドである場合、さらなる実施形態では接線流限外濾過である。「透析濾過速度」という用語はまた、濾液がフィルタ膜の上方に押し出される速度、又は透過液生成の速度、すなわち一実施形態では、時間単位あたりに生成される透過液の体積に関連することを当業者によって理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「透析濾過速度を低下させる」という用語は、一実施形態では本質的に０になるように、さらなる実施形態では０になるように、透析濾過速度を低下させるあらゆる手段を含む。このような手段は、例えば、濾過膜の残留液側の圧力を低下させ、及び／又は濾過膜の濾過生成物側の圧力を上昇させ得る。一実施形態では、少なくとも一時的に透析濾過速度を低下させることは、少なくとも５分間、一実施形態では少なくとも１５分間透析濾過を中断することを含む。本明細書で使用される場合、「撹拌速度を増加させる」という用語は、残留液側の濾過膜に平行な溶液の流れを増加させる、及び／又は残留液内の標的化合物の再分配を増加させるすべての手段を含む。

本明細書で使用される場合、「経時的なＮＭＲパラメータの勾配」という用語は、溶液における経時的なＮＭＲパラメータの変化に関する。一実施形態では、ＮＭＲパラメータは、ＮＭＲスピン緩和パラメータ、一実施形態では本明細書で上に明記されるような水プロトンＮＭＲパラメータである。よって、一実施形態では、ＮＭＲパラメータは、ＮＭＲ測定において決定された、横緩和時間（Ｔ_２）又は横緩和速度（Ｒ_２）であり、一実施形態では、^１Ｈ_２Ｏ ＮＭＲ測定において決定された、横緩和時間（Ｔ_２）又は横緩和速度（Ｒ_２）であり、すなわち、一実施形態では、水プロトンの横緩和時間（Ｔ_２）又は水プロトンの横緩和速度（Ｒ_２）である。

標的化合物の濃度を上昇させるための方法によれば、ＮＭＲパラメータの少なくとも２つの勾配が決定される。当業者に理解されるように、前記第１の勾配及び前記第２の勾配は、一実施形態では、同じＮＭＲパラメータを決定することにより、又は比較のために数学的に相互変換することができる２つのＮＭＲパラメータを決定することにより、確立される。また理解されるように、第１及び第２の勾配と同一である必要はない勾配を決定する期間、一実施形態では、前記ＮＭＲパラメータの第１の勾配を決定する期間は、前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配を決定する期間と本質的に同一であり、一実施形態では最大５分間、一実施形態では最大２分間、さらなる実施形態では最大１分間である。一実施形態では、前記ＮＭＲパラメータの勾配は、繰り返し決定され、前記ＮＭＲパラメータの、最後に決定された勾配は、前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配であり、一実施形態では、前記ＮＭＲパラメータの、最後から２番目に決定された勾配は、前記ＮＭＲパラメータの第１の勾配である。一実施形態では、第１及び第２の勾配は時間的に連続して決定され、一実施形態では、前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配を決定するための期間は、前記ＮＭＲパラメータの第１の勾配を決定するための期間の直後に続く。よって、一実施形態では、前記ＮＭＲパラメータの勾配は、連続的又は半連続的に決定される。

有利には、本発明の根底にある研究において、透析濾過プロセスにおけるポリペプチドの凝集は、示されたＮＭＲパラメータの測定を介して非常に早期に検出され得ることがわかった。驚くべきことに、凝集の開始はＮＭＲパラメータのかなり突然の変化によって検出できることがわかった。

要約し、さらに可能な実施形態を除外することなく、以下の実施形態を想定することができる。

実施形態１．ｉ）標的化合物を含む水溶液を提供することと、
ｉｉ）前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
ｉｖ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、ＮＭＲパラメータを決定することと、
ｖ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む、分離方法。

実施形態２．標的パラメータが、横緩和時間（Ｔ_２）である、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに正比例し、一実施形態では、横緩和時間（Ｔ_２）である、濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータの積に正比例する、実施態様１に記載の方法。

実施形態３．濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータが正規化される、実施形態１又は２に記載の方法。

実施形態４．標的パラメータが閾値と比較される、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５．ｖｉ）前記標的化合物を含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること、一実施形態では、前記標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること
をさらに含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６．前記純度が、前記標的化合物の凝集体及び／又は分解生成物の非存在の程度である、実施形態１から５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７．ｖｉｉ）前記標的化合物を含む前記画分のうちの少なくとも２つを組み合わせること、一実施形態では、前記標的化合物を所望の純度で含む前記画分を、標的パラメータに基づいて組み合わせること
をさらに含む、実施形態５又は６に記載の方法。

実施形態８．工程ｖｉｉ）において、標的パラメータが標的条件を満たす画分が組み合わされる、実施形態７に記載の方法。

実施形態９．工程ｖｉｉ）において、標的パラメータが閾値を超える画分、又は標的パラメータが少なくとも閾値と等しい画分が組み合わされる、実施形態８に記載の方法。

実施形態１０．濃度パラメータと核磁気共鳴パラメータの一方又は両方がさらに前提条件に供され、前記標的化合物を含む前記画分を組み合わせることが、前提条件の実現に応じて実施される、実施形態５から９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１１．前提条件が、濃度パラメータよりも小さいか又は濃度パラメータと少なくとも等しい、正規化された核磁気共鳴パラメータを含む、実施形態１０に記載の方法。

実施形態１２．標的パラメータに基づいて、前記画分のうちの２つ以上を、自動的に分配すること、割り当てること、又は組み合わせることのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１３．標的パラメータに基づいて制御される、自動的に制御された液体分配要素、特に自動バルブが使用される、実施形態１２に記載の方法。

実施形態１４．工程ｉｉ）において提供された前記画分の少なくとも一部が、異なる化学特性、一実施形態では異なるｐＨ値及び／又は塩濃度を有し、工程ｉｖ）が、具体的には、異なる化学特性によって引き起こされるバックグラウンドについて補正することにより、異なる化学特性についてＮＭＲパラメータを補正することを含む、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１５．前記標的化合物を含まない異なる化学特性を有する画分について測定されたバックグラウンドＮＭＲパラメータの測定を含む、実施形態１４に記載の方法。

実施形態１６．ＮＭＲパラメータが、核磁気スピン横緩和時間Ｔ_２及び核磁気スピン横緩和速度Ｒ_２のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１７．ＮＭＲパラメータが、溶液における又はその画分における水の核磁気スピン横緩和、具体的には溶液における又はその画分における水のプロトンの核磁気スピン横緩和を示す、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１８．工程ｉｉｉ）が、生成物サンプルに光学的測定を、具体的には光吸収測定及び光透過測定のうちの少なくとも１つを、より具体的には、紫外線吸収測定及び紫外線透過測定のうちの１つ又は複数を適用することを含む、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１９．工程ｉｉ）の分離工程が、クロマトグラフィー分離、一実施形態ではサイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含み、前記画分がクロマトグラフィー分離の溶出液の画分である、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２０．前記画分が、異なるｐＨ値及び／又は異なるイオン濃度を有する、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２１．連続インライン法である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２２．工程ｉｉ）において、前記画分が液体の連続流として生成される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２３．工程ｉｉｉ）及びｉｖ）が液体の連続流で連続的に実施される、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２４．前記標的化合物が、一実施形態では（ｉ）ポリペプチド、（ｉｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の１つについての複合体、及び（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のうちの１つについてのコンジュゲートからなる群から選択される化合物であり、一実施形態ではウイルスカプシド又はポリペプチドであり、さらなる実施形態では非凝集ポリペプチドである、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２５．前記標的化合物が、一実施形態では、ポリペプチドのモノマー、ポリペプチドのオリゴマー、ポリペプチドの凝集体、ポリペプチドの集塊、ポリペプチドのポリマー、ポリペプチドの断片のうちの少なくとも１つであり、一実施形態ではポリペプチドのモノマー又はオリゴマーである、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２６．前記標的化合物の濃度が、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、一実施形態では少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、さらなる実施形態では少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、さらなる実施形態では少なくとも２０ｍｇ／ｍＬである、実施形態２４又は２５に記載の方法。

実施形態２７．ａ）標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイスと、
ｂ）前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイスと、
ｃ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによってＮＭＲパラメータを決定するように構成されたＮＭＲ測定デバイスであって、核磁気共鳴パラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における、核磁気スピン緩和を、一実施形態では水のＮＭＲスピン緩和を示す、ＮＭＲ測定デバイスと、
ｄ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイスと
を含む、分離システム。

実施形態２８．方法について言及している実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法を実施するように構成されている、実施形態２８に記載のシステム。

実施形態２９．評価デバイスが、標的パラメータと閾値を比較するように構成されている、実施形態２７及び２８に記載のシステム。

実施形態３０．ｅ）前記標的化合物を含む前記画分のうちの少なくとも２つを組み合わせるための、液体分配要素、及び／又は
工程ｄ）において決定された標的パラメータの値を出力する、出力デバイス
をさらに含む、実施形態２７から２９のいずれか１つに記載のシステム。

実施形態３１．標的化合物を生成すること、標的化合物を精製すること、及び標的化合物の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、実施形態２９若しくは３０に記載のシステムの使用、及び／又は方法について言及している実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法の使用。

実施形態３２．方法について言及している実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法に従って、水溶液中の標的化合物を分離するための、濃度決定デバイス及び／又は核磁気共鳴測定デバイスの使用。

実施形態３３．命令を含むコンピュータプログラム製品であって、命令が、コンピュータ、濃度決定デバイス、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定デバイスを含む適切なシステムで実行されると、少なくとも以下の工程：
Ｉ）標的化合物を含む水溶液の少なくとも１つの画分における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定すること、
ＩＩ）前記少なくとも１つの画分にＮＭＲ測定を適用することによって核磁気共鳴パラメータを決定することであって、ＮＭＲパラメータが、前記少なくとも１つの画分における、核磁気スピン緩和、一実施形態では水のＮＭＲスピン緩和を示す、核磁気共鳴パラメータを決定すること、並びに
ＩＩＩ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて、前記少なくとも１つの画分の標的パラメータを決定すること
を実施させる、コンピュータプログラム製品。

実施形態３４．工程Ｉ）、ＩＩ）、及び／又はＩＩＩ）が、方法について言及している実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法に従って実施される、実施形態３３に記載のコンピュータプログラム。

実施形態３５．方法について言及している実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法の工程を含む、標的化合物の、特にポリペプチドの生成の方法。

実施形態３６．方法について言及している実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法によって生成されるか又は生成可能な標的化合物の調製物。

実施形態３７．透析濾過によって溶液中の標的化合物の濃度を上昇させるための方法であって、以下：
Ａ）前記溶液における又はその画分における経時的な核磁気共鳴パラメータ（ＮＭＲパラメータ）の第１の勾配を決定することであって、ＮＭＲパラメータが、溶液における、核磁気スピン緩和、一実施形態では水のＮＭＲスピン緩和を示す、第１の勾配を決定すること、
Ｂ）前記溶液における又はその画分における経時的な前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配を決定すること、並びに
Ｃ）前記ＮＭＲパラメータの前記第２の勾配の値が、前記ＮＭＲパラメータの前記第１の勾配の値から少なくとも１０％、一実施形態では少なくとも２０％、さらなる実施形態では少なくとも３０％外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び／又は撹拌速度を増加させること
を含む、方法。

実施形態３８．前記ＮＭＲパラメータの第１の勾配を決定する期間が、前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配を決定する期間と本質的に同一である、実施形態３７に記載の方法。

実施形態３９．前記ＮＭＲパラメータの第１及び／又は第２の勾配を決定する期間が、最大５分間、一実施形態では最大２分間、さらなる実施形態では最大１分間である、実施形態３７及び３８に記載の方法。

実施形態４０．前記ＮＭＲパラメータの前記第１の勾配が、前記少なくとも１つのＮＭＲパラメータの前記第２の勾配の前に決定される、実施形態３７から３９に記載に記載の方法。

実施形態４１．前記ＮＭＲパラメータの勾配が繰り返し決定され、前記ＮＭＲパラメータの、最後に決定された勾配が、前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配であり、一実施形態では、前記ＮＭＲパラメータの、最後から２番目に決定された勾配が、前記ＮＭＲパラメータの第１の勾配である、実施形態３７から４０に記載の方法。

実施形態４２．前記ＮＭＲパラメータの勾配が、連続的又は半連続的に決定される、実施形態３７から４１に記載の方法。

実施形態４３．前記少なくとも一時的に透析濾過速度を低下させることが、少なくとも５分間、一実施形態では少なくとも１５分間、透析濾過を中断することを含む、実施形態３７から４２に記載の方法。

実施形態４４：実施形態１から２６のいずれか１つに記載の分離方法によって予め確立された、対応する濃度パラメータ値、ＮＭＲパラメータ値、及び／又は標的パラメータ値に割り当てられた画分の数を含む、一実施形態ではデータキャリアに明白に埋め込まれた、データベース。

実施形態４５：実施形態２７から３０のいずれか１つに記載の実施形態において、実施形態４４に記載のデータベースを含み、一実施形態では、前記データベースから濃度パラメータ値、ＮＭＲパラメータ値、及び標的パラメータ値のうちの少なくとも１つを得るように適合されている、分離システム。

実施形態４６：前記標的化合物が、（ｉ）ＰＤ－１に結合する抗体と、（ｉｉ）ＩＬ－２Ｒβγを通じてシグナル伝達するポリペプチド、特にＩＬ－２ポリペプチド又はＩＬ－１５ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートである、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態４７：ＩＬ－２ポリペプチドが変異ＩＬ－２ポリペプチドであり、変異ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列の配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－２分子である、実施形態４６に記載の主題。

実施形態４８：ＩＬ－２ポリペプチドが変異ＩＬ－２ポリペプチドであり、変異ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列の配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－２分子であり、抗体が、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と、Ｋａｂａｔ番号付けによる位置７１－７３で配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ－Ｈ３とを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態４６又は４７に記載の主題。

実施形態４９：ＩＬ－２ポリペプチドが変異ＩＬ－２ポリペプチドであり、変異ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列の配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－２分子であり、抗体が、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２と、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３とを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１と、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態４６から４８のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５０：ＩＬ－２ポリペプチドが変異ＩＬ－２ポリペプチドであり、変異ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列の配列番号１９に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－２分子であり、抗体が、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｂ）配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態４６から４９のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５１：変異ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｔ３Ａ及び／又はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａをさらに含む、実施形態４６から５０のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５２：変異ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号２０の配列を含む、実施形態４７から５１のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５３：イムノコンジュゲートが、１つ以下の変異ＩＬ－２ポリペプチドを含む、実施形態４７から５２のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５４：抗体が、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、実施形態４６から５３のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５５：Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス、Ｆｃドメインである、実施形態５４に記載の主題。

実施形態５６：ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、実施形態５４又は５５に記載の主題。

実施形態５７：抗体が、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである、実施形態４６から５６のいずれか１つに記載の主題。

実施形態５８：Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す改変を含む、実施形態５４から５７のいずれか１つに記載の方法。

実施形態５９：Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な突起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の突起が配置可能である空洞が生成される、実施形態５４から５８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態６０：Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５４から５９のいずれか１つに記載の主題。

実施形態６１：Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態６０に記載の主題。

実施形態６２：変異ＩＬ－２ポリペプチドが、そのアミノ末端アミノ酸で、場合によってはリンカーペプチドを通じて、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つ、特にＦｃドメインの第１のサブユニットの、カルボキシ末端アミノ酸に融合している、実施形態５４から６１のいずれか１つに記載の主題。

実施形態６３：リンカーペプチドが、配列番号２１のアミノ酸配列を有する、実施形態６２に記載の主題。

実施形態６４：Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合、及び／又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減させる、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、実施形態５４から６３のいずれか１つに記載の主題。

実施形態６５：前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）の群より選択される１つ又は複数の位置におけるものである、実施形態６４に記載の方法。

実施形態６６：Ｆｃドメインの各サブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含む、実施形態５４から６５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態６７：配列番号２２の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２３又は配列番号２４の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２５の配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、実施形態４６から６６のいずれか１つに記載の主題。

実施形態６８：リンカー配列によって結合されている、変異ＩＬ－２ポリペプチドと免疫グロブリン分子とから本質的になる、実施形態４６から６７のいずれか１つに記載の主題。

実施形態６９：前記標的化合物が、（ｉ）抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、（ｉｉ）野生型インターロイキン－２（ＩＬ－２）分子と比較して、中間親和性ＩＬ－２受容体に対する変異ＩＬ－２分子の親和性を低減させるアミノ酸変異を含む２つの変異ＩＬ－２分子であって、前記変異ＩＬ－２分子が配列番号３０の配列を含む、２つの変異ＩＬ－２分子とを含む、融合タンパク質である、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態７０：前記免疫グロブリン分子が、ＩｇＧクラス免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリン分子である、実施形態６９に記載の主題。

実施形態７１：前記免疫グロブリン分子がヒト免疫グロブリン分子である、実施形態６９又は７０に記載の主題。

実施形態７２：前記免疫グロブリン分子が、ヒトＶｈ３－２３生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む、実施形態６９から７１のいずれか１つに記載の主題。

実施形態７３：前記免疫グロブリン分子が、配列番号２６の重鎖可変領域配列を含む、実施形態６９から７２のいずれか１つに記載の主題。

実施形態７４：前記免疫グロブリン分子が、ヒトＶｋ３－２０生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む、実施形態６９から７３のいずれか１つに記載の主題。

実施形態７５：前記免疫グロブリン分子が、配列番号２７の軽鎖可変領域配列を含む、実施形態６９から７４のいずれか１つに記載の主題。

実施形態７６：前記免疫グロブリン分子が、改変を伴わない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Ｆｃ受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を低減させる改変を含む、実施形態６５から７５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態７７：前記Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体である、実施形態７６に記載の主題。

実施形態７８：前記Ｆｃ受容体が活性化Ｆｃ受容体である、実施形態７６又は７７に記載の主題。

実施形態７９：前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲｌｌ ｌａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲｌｌａ（ＣＤ３２）、及びＦｃａＲＩ（ＣＤ８９）の群から選択される、実施形態７６から７８のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８０：前記Ｆｃ受容体が、ＦｃγＲｌｌｌａ、特にヒトＦｃγＲｌｌｌａである、実施形態７６から７９のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８１：前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖の３２９位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸置換を含む、実施形態６９から８０のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８２：前記アミノ酸置換がＰ３２９Ｇである、実施形態８１に記載の主題。

実施形態８３：前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸置換を含む、実施形態６９から８２のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８４：前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である、実施形態８３に記載の主題。

実施形態８５：前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖においてアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（番号付け）を含む、実施形態６９から８４のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８６：前記変異ＩＬ－２分子がそれぞれ、それぞれのＮ末端アミノ酸で、場合によってはペプチドリンカーを通じて、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖のうちの１つのＣ末端アミノ酸に融合している、実施形態６９から８５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８７：前記変異ＩＬ－２分子がそれぞれ、ペプチドリンカーを通じて前記免疫グロブリン分子に融合している、実施形態６９から８６のいずれか１つに記載の主題。

実施形態８８：前記ペプチドリンカーが、少なくとも１０個、特に少なくとも１５個の、アミノ酸を含む、実施形態８７に記載の主題。

実施形態８９：前記リンカーペプチドが、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓｈ（配列番号３１）を含む、実施形態８７又は８８に記載の主題。

実施形態９０：融合タンパク質が、配列番号２８及び配列番号２９のポリペプチド配列を含む、実施形態６９から８９のいずれか１つに記載の主題。

実施形態９１：前記標的化合物が二重特異性抗体である、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態９２：前記標的化合物が、ＣＤ３と第２の抗原とに結合する二重特異性抗体である、実施形態９１に記載の主題。

実施形態９３：前記標的化合物が、ＣＤ３とＣＥＡとに結合する二重特異性抗体である、実施形態９１又は９２に記載の主題。

実施形態９４：前記標的化合物が、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子と、２つのサブユニットで構成されたＦｃドメインとを含む二重特異性抗体である、実施形態９１から９３のいずれか１つに記載の主題。

実施形態９５：Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ１、より具体的にはヒトＩｇＧ１、Ｆｃドメインである、実施形態９４に記載の主題。

実施形態９６：第１のＦａｂ分子が、Ｃ末端で第２のＦａｂ分子のＮ末端に融合し、第２のＦａｂ分子が、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合し、第３のＦａｂ分子が、Ｃ末端でＦｃドメインのサブユニットのうちの他方のＮ末端に融合している、実施形態９４又は９５に記載の主題。

実施形態９７：第２のＦａｂ分子がＣＤ３に結合し、第１及び第３のＦａｂ分子が第２の抗原に結合する、実施形態９４から９６のいずれか１つに記載の主題。

実施形態９８：第２の抗原がＣＥＡである、実施形態９２から９７のいずれか１つに記載の主題。

実施形態９９：前記標的化合物がシビサタマブである、実施形態９１から９８のいずれか１つに記載の主題。

実施形態１００：前記標的化合物が、ウイルス、又はウイルス様粒子である、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の主題。

実施形態１０１：前記標的化合物が、１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、充填されたウイルス、又は充填されたＶＬＰである、実施形態１００に記載の主題。

実施形態１０２：前記分離工程が、空のウイルス粒子及び／又は空のＶＬＰから、充填されたウイルス粒子及び／又は充填されたＶＬＰを分離する工程である、実施形態１００又は１０１に記載の主題。

実施形態１０３：濃度パラメータが、前記標的化合物の濃度に正比例する、実施形態１から１０２のいずれか１つに記載の主題。

実施形態１０４：濃度パラメータが、水プロトンの横緩和時間Ｔ_２ではなく、水プロトンの横緩和速度Ｒ_２ではなく、一実施形態では水プロトンの横緩和ＮＭＲパラメータではない、実施形態１から１０３のいずれか１つに記載の主題。

さらなる任意の特徴及び実施形態は、好ましくは従属請求項と併せて、実施形態の後続の説明においてより詳細に開示される。その中で、それぞれの任意の特徴は、当業者が理解するように、単独で、及び任意の実行可能な組み合わせで、実現され得る。本発明の範囲は、好ましい実施形態によって制限されない。実施形態は、図面に概略的に示されている。その中で、これらの図面の同一の参照番号は、同一又は機能的に同等の要素を指す。

例えばサンプル及び移動相入口１１８を有するクロマトグラフィーカラムとして構成されている分離デバイス１１０と、分離デバイス１１０からの溶出液についてインライン測定を実施し、評価デバイス１１６に測定データを提供する濃度決定デバイス１１２及びＮＭＲ測定デバイスとを含む、分離システムの例示的なセットアップを概略的に示す。前記評価デバイス１１６は、場合によっては液体分配要素１２０にバルブを向け、あるいは、液体分配要素１２０は、自立的に作用し得、例えば所定の間隔にわたって、画分１２２を回収し得る。 実施例で使用される化合物（抗体様タンパク質（ＡＬＰ））の概略を示す。Ｍは金属。 カチオン交換クロマトグラフィーによる治療用抗体の精製におけるさまざまなパラメータを表すグラフを示す。パラメータは、正規化されたｃ［タンパク質］：測定された最高のタンパク質濃度に対して正規化されたタンパク質濃度；正規化されたＴ２：測定された最高のＴ２値に対して正規化されたＴ２値；正規化された（Ｔ＊Ｃ［タンパク質］）：Ｔ２及びｃ［タンパク質］の正規化された積；正規化されたＴ２（タンパク質を含まないバッファー）：抗体の非存在下での試験からの正規化されたＴ２値；及び正規化されたＴ２－正規化されたＴ２（タンパク質を含まないバッファー）：正規化されたＴ２（タンパク質を含まないバッファー）が差し引かれた、正規化されたＴ２。 非ストレス（実線）及び人工的にストレスを加えられた（破線）タンパク質溶液のタンパク質濃度の増加（プロセス中の体積減少の倍数として、ｘ軸）に依存するｗＮＭＲ緩和Ｔ２（ｙ軸）を示す。挿入図は溶液の外観を示し、矢印は凝集の開始を示す。 血清型２のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２）のＤＮＡ負荷に対するＴ_２の依存関係。 血清型６のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ６）のＤＮＡ負荷に対するＴ_２の依存関係。 血清型８のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８）のＤＮＡ負荷に対するＴ_２の依存関係。

実施形態の詳細な説明

実施例１：材料及び方法
抗体様タンパク質
実施例で使用される抗体様タンパク質（ＡＬＰ）の概略が、図２に示されている。シビサタマブ（ＡＬＰ１）は、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ），Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ＩＮＮ：Ｌｉｓｔ ８０，２０１８，ｖｏｌ．３２，ｎｏ．３，ｐ．４３８に記載されるように、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＣＤ３を標的とする２＋１二重特異性抗体であり、ＩｇＧ－ＩＬ２（ＡＬＰ２）は、国際公開公報第２０１５／１１８０１６号Ａ１に記載されるように、ＩｇＧと、それぞれ重鎖に融合した２つのＩＬ－２ペプチドとの間の融合タンパク質である。ＰＤ１－ＩＬ２（ＡＬＰ３）は、国際公開公報第２０１８／１８４９６４号Ａ１に記載されるように、ＩＬ－２ペプチドにＣ末端融合した抗ＰＤ１抗体である。ＡＬＰ４は、Ｖ_Ｈ／Ｖ_Ｌドメインと金属錯体とに融合したＩｇＧ構造を含む２＋１二重特異性融合タンパク質である。

ＮＭＲ
横緩和速度（Ｒ_２）又は時間（Ｔ_２）は、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｎｉｓｐｅｃ ｍｑ２０分光計（２０ＭＨｚ；Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ＧｍｂＨ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、ドイツ）を用いて記録された。分光計には、０．４７ Ｔ磁石及びＨ２０－１０－２５ＡＶＧＸ４プローブが装備されていた。２０℃でサンプル量９００μｌの各サンプルについて、少なくとも４回の取得が測定された。Ｔ_２又はＲ_２を決定するために、シグナル減衰を少なくとも５秒間追跡した。

タンパク質負荷溶液の調製
使用したタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から発現された。発酵上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）に適用し、ｐＨ＜５の酸性バッファーで溶出した。溶出後、適量の１Ｍトリス溶液を加えることにより、タンパク質プールをｐＨ５．０から５．５に調整した。

クロマトグラフィー
ＳＥＣ
サイズ排除クロマトグラフィーの前に、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過ディスクを備えたＡｍｉｃｏｎ撹拌式セル（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を使用して、限外濾過により、タンパク質Ａプールの濃度を、＞２０ｍｇ／ｍｌに上昇させた。３０ｍｇから１８０ｍｇのタンパク質Ａ精製タンパク質サンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐグレードカラム（カラム高さ６０ｃｍ、直径１．６ｃｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）に負荷することにより、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。２０ｍＭ Ｈｉｓ／Ｈｉｓ－ＨＣＬ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５中、１．６ｍｌ／分の流量で、クロマトグラフィーを実施した。溶出中、２８０ｎｍでの吸収を記録し、画分を回収した。

ＣＥＸ
カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）のために、２５ｍｇ／ｍｌと３０ｍｇ／ｍｌの間の負荷密度で、１０ｍｌ Ｐｏｒｏｓ ＸＳカラム（カラム高さ２０ｃｍ、直径０．８；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州、米国）にタンパク質を負荷した。

導電性勾配溶出については、カラムを４０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．５で平衡化した。その後、タンパク質Ａ精製タンパク質溶液を２．０ｍｌ／分で負荷し、３カラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファーでカラムを洗浄した。結合したタンパク質を溶出するために、２０又は１５ＣＶ内でそれぞれ５００又は７５０ｍＭの酢酸塩勾配、及びｐＨ５．５又は６．５で２．５ｍｌ／分の流速を使用した。溶出中、２８０ｎｍでの吸着を記録し、画分を回収した。

ｐＨ勾配溶出については、２０ｍＭクエン酸塩、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ５．０、及び５０ｍＭと１００ｍＭの間のＮａＣｌ濃度で、カラムを平衡化した。その後、タンパク質Ａ精製タンパク質溶液を２．０ｍｌ／分で負荷し、５ＣＶ平衡化バッファーでカラムを洗浄した。結合したタンパク質を溶出するために、２０から３０ＣＶ内で５．０から８．５のｐＨ勾配、及び２．５ｍｌ／分の流量を使用した。溶出中、２８０ｎｍでの吸着を記録し、溶出液画分を回収した。

さらに、導電率及びｐＨ勾配溶出のためにバッファーコントロールを実施した。これらの実施について、上記の手順を使用したが、カラムにはタンパク質を負荷しなかった。

分析的ＳＥＣ
クロマトグラフィーのプール及び画分を分析的ＳＥＣによって分析した。この目的のため、およそ２５μｇ（ただし１００μｌ以下）のタンパク質をＴＳＫｇｅｌ ＵＰ－ＳＷ３０００カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ、ドイツ）に注入して、２００ｍＭリン酸カリウム、２５０ｍ塩化カリウム中、ｐＨ６．２、流量０．２５ｍｌ／分で、アイソクラティッククロマトグラフィーに供した。Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州、米国）を用いて、２８０ｎｍでの吸収に基づいて純度を算出した。

ＵＦ
４００ｍｌの容器及び３０ｋＤａのＳａｒｔｏｒｉｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）膜を備えた手動ベンチトップデバイスを用いて限外濾過を行った。平衡化バッファーのｐＨ及び導電性が一定になるまで、デバイスを０．５Ｍ ＮａＯＨで再生し、水でフラッシュし、対応するバッファーで平衡化した。続いて、平衡化バッファーをタンパク質溶液と交換した。１－１．２バールの圧力制御下で限外濾過を行った。既定の体積減少後に、サンプルを取った。タンパク質濃度、ＳＥ－ＨＰＬＣ、及びｗＮＭＲ Ｔ２を各サンプルについて決定した。実験を２セット行った。１つはＲＴで、もう１つは人工的な応力条件下（５０℃）であった。人工的な応力を適用して、特定の濃度での迅速なＨＭＷ形成を実行誘導した。

実施例２
図１に示すように、分離システムでは、サンプル１１８は分離デバイス１１８に適用され、分離デバイス１１８は、ＬＣカラム、膜、又はフィルタ、超遠心分離若しくは遠心分離ビーカー、限外濾過デバイス等であり得る。分離工程、及び液体分配要素１２０の手段により、画分１２２は、少なくとも２つの異なる組成物から形成される。画分の少なくとも一部又はそのアリコートでは、標的化合物の、又は標的化合物が属する標的化合物のクラスの濃度は、濃度決定デバイス１１２によって決定され、濃度決定デバイス１１２は、特に、光度計、例えばＵＶ光度計であり得る。また、画分の少なくとも一部又はそのアリコートでは、ＮＭＲパラメータはＮＭＲ測定デバイス１１４によって決定され、ＮＭＲ測定デバイス１１４は、特にベンチトップＮＭＲデバイスであり得る。濃度パラメータ及び／又はＮＭＲパラメータの決定は、図１に示すように、液体分配要素１２０による画分の実際の形成の前に、例えばフロースルー測定によって実施され得るか、又は確立された画分又はそのアリコートにおける画分の形成の後に実施され得る。濃度パラメータの値及びＮＭＲパラメータの値に基づいて、評価デバイス１１６は標的パラメータを決定する。

実施例３
図３は、カチオンイオン交換クロマトグラフィーによる治療用抗体の精製における、溶出量に対するさまざまなパラメータの変化を表すグラフを示す。理解されるように、２８０ｎｍでの吸収測定によるタンパク質濃度の標準的な測定（実線）は、広いピークを提供し、これは、どの画分が所望の単量体抗体を含むかを決定することを不可能にする。対照的に、Ｔ２及びｃ［タンパク質］の正規化された積を表すグラフ（短い破線）は、はるかに狭いピークを示し、これは、特に、望ましくない抗体の凝集体を排除している。

実施例４
酢酸塩又はｐＨ勾配のいずれかを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによる、又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＬＣ精製に、４つの異なる抗体様タンパク質（ＡＬＰ、図２、表１）を適用した。クロマトグラフィーの後、ｃ［タンパク質］（ＵＶ測定）のみに従って、正規化されたＴ２のみに従って、又はＴ２及びｃ［タンパク質］に従って、画分をプールした（表２）。クロマトグラフィーに使用されたプールの組成を表１に示す。データから明らかなように、Ｔ２及びｃ［タンパク質］を標的パラメータとして使用することにより、生成物の純度が改善され、特に、高分子量及び／又は低分子量の汚染物質の除去が改善される。

（表１）示されたＬＣカラムに適用されたタンパク質溶液の組成
ＡＬＰ：抗体様タンパク質；ＨＭＷ：高分子量（凝集体）、ＬＭＷ：低分子量（分解生成物）、ｎａ：適用せず／決定せず、ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー。

（表２）ｃ［タンパク質］定量（ＵＶ測定）のみに従って（ｃ［タンパク質］）、正規化されたＴ２のみに従って（正規化されたＴ２）、並びにＴ２及びｃ［タンパク質］の正規化された積に従って（Ｔ２及びｃ［タンパク質］）プールされた後、示されたＬＣ工程に適用されたタンパク質溶液の組成
ＨＭＷ：高分子量（凝集体）、ＬＭＷ：低分子量（分解生成物）、ｎａ：適用せず／決定せず、ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー。

実施例４：さまざまな濃度のタンパク質溶液に人工的にストレスを加えて、凝集を誘発するかどうかを、また、ｗＮＭＲ－Ｔ２値を測定した。図４に示すように、凝集の開始により、Ｔ２シグナルの迅速な低下が引き起こされ、これは、限外濾過法における凝集の開始を検出するために使用することができる。

実施例５：充填されたＡＡＶカプシド及び空のＡＡＶカプシド
材料及び方法
ＡＡＶ粒子
異なる血清型の、ＤＮＡが負荷されたＡＡＶ粒子と、空のＡＡＶ粒子とを、Ｖｉｒｏｖｅｋ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ、米国から購入した。充填されたＡＡＶ粒子について、１ゲノムが１粒子内にパッケージ化されているため、ｖｇ／ｍＬの濃度（１ｍＬあたりのウイルスゲノム）は、ｖｐ／ｍＬの濃度（１ｍＬあたりのウイルス粒子）に等しい。空のＡＡＶ粒子について、ｖｐ／ｍＬの数は、例えばカプシドタンパク質の量を、ｖｇ／ｍＬでの既知の濃度の充填されたＡＡＶ粒子の調製物中のカプシドタンパク質の量と比較することによって、決定することができる。ＤＮＡが負荷されたＡＡＶ粒子のＤＮＡは、ＣＭＶプロモータを有する緑色蛍光タンパク質（ＣＭＶ－ＧＦＰ）の発現カセットを構成した：
０．２２μｍフィルタで滅菌した、０．００１％プルロニックＦ－６８を含む１×ＰＢＳバッファー中のＡＡＶ８－空（Ｌｏｔ １９－５６４Ｅ）／ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｌｏｔ １８－７３７）。
０．２２μｍフィルタで滅菌した、０．００１％プルロニックＦ－６８、１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含む１×ＰＢＳバッファー中のＡＡＶ２－空（Ｌｏｔ １９－６０４Ｅ）／ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｌｏｔ １７－６００）。
０．２２μｍフィルタで滅菌した、０．００１％プルロニックＦ－６８、１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含む１×ＰＢＳバッファー中のＡＡＶ６－空（Ｌｏｔ １９－５４０Ｅ）／ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｌｏｔ １９－７１８）。

ＮＭＲ
横緩和速度（Ｒ_２）又は時間（Ｔ_２）を、本明細書中実施例１で上に明記されるように記録した。

ＡＡＶサンプルの調製
充填された及び空のＡＡＶ２、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ８粒子を混合することによってサンプルを生成した。それぞれの粒子は、同じ濃度（２＊１０^１３ｖｇ／ｍｌ）を有し、０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ－６８（ＡＡＶ８の場合）を含む、及び０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ－６８と（ＡＡＶ２及びＡＡＶ６の場合は）１００ｍＭクエン酸ナトリウムも異なる比で含む、１×ＰＢＳバッファーを含む同じ水溶液に溶解していた。サンプルは、さらに長期間保存せずに例えば＜０℃で測定した。

実施例５．１
異なる比のＤＮＡが負荷されたＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子についての横緩和時間の決定
ＤＮＡが負荷されたＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子とを水溶液（ＡＡＶ２及びＡＡＶ６：０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ－６８、１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含む１×ＰＢＳバッファー；ＡＡＶ８：クエン酸ナトリウムを含まない同じバッファー）中で溶かして、０％から１００％のＤＮＡを負荷したＡＡＶ粒子の範囲にまたがる異なる充填／空の比を得た。これは、血清型２、６、及び８のＡＡＶ粒子について行われた。個別のサンプルについて、上の「材料及び方法」のセクションに概説したように、横緩和時間（Ｔ_２）を記録した。結果を以下の表に示す。

（表３）ＤＮＡが異なって負荷されたＡＡＶ２粒子サンプルについてのＴ_２値

（表４）ＤＮＡが異なって負荷されたＡＡＶ６粒子サンプルについてのＴ_２値

比７５：２５についての値は、実験誤差と見なされたため、フィッティング計算から除外された。

（表５）ＤＮＡが異なって負荷されたＡＡＶ８粒子サンプルについてのＴ_２値

得られた横緩和時間は、線形及び２次多項式関数を使用してフィッティングした。結果を以下の表６に示す。

（表６）フィッティング結果
血清型６について、フィッティングは、比７５：２５についてのデータを含んで（括弧内）及び除外して示す。

図５は、血清型２のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２）のＤＮＡ負荷に対するＴ２の依存関係、つまり、水性サンプル中のＤＮＡ含有ＡＡＶ２粒子の濃度に対するＴ２の依存関係を示す。２＊１０^１３粒子／ｍＬの濃度での空のＡＡＶ２粒子（０％充填）と完全にＤＮＡが負荷されたＡＡＶ２粒子（１００％充填）との間の緩和時間の絶対差は１９７．１±６．４ｍｓであり、相対差は１２．６±０．４％であることがわかる。データポイントは、０．９９６のＲ^２値の２次関数を用いてフィッティングすることができる。

図６は、血清型６のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ６）のＤＮＡ負荷に対するＴ２の依存関係、つまり、水性サンプル中のＤＮＡ含有ＡＡＶ６粒子の濃度に対するＴ２の依存関係を示す。２＊１０^１３粒子／ｍＬの濃度での空のＡＡＶ６粒子（０％充填）と完全にＤＮＡが負荷されたＡＡＶ６粒子（１００％充填）との間の緩和時間の絶対差は１４９．８±２２．１ｍｓであり、相対差は９．２±１．４％であることがわかる。データポイントは、０．９９８７のＲ^２値の２次関数を用いてフィッティングすることができる。

図７は、血清型８のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８）のＤＮＡ負荷に対するＴ２の依存関係、つまり、水性サンプル中のＤＮＡ含有ＡＡＶ８粒子の濃度に対するＴ２の依存関係を示す。２＊１０^１３粒子／ｍＬの濃度での空のＡＡＶ８粒子（０％充填）と完全にＤＮＡが負荷されたＡＡＶ８粒子（１００％充填）との間の緩和時間の絶対差は２０６．９ｍｓであり、相対差は１４％であることがわかる。データポイントは、０．９６３３のＲ^２値の２次関数を用いてフィッティングすることができる。

文献
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Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９１（６）：４１０７
国際公開公報第２０１２／０１５９１２号Ａ１
国際公開公報第２０１４／１６９２２９号Ａ１
国際公開公報第２０１５／１１８０１６号Ａ１
国際公開公報第２０１８／１０２６８１号Ａ１
国際公開公報第２０１８／１８４９６４号Ａ１
国際公開公報第２０１９／０１６１５４号Ａ１

参照番号のリスト
１１０ 分離デバイス
１１２ 濃度決定デバイス
１１４ ＮＭＲ測定デバイス
１１６ 評価デバイス
１１８ サンプル（水溶液）／移動相入口
１２０ 液体分配要素
１２２ 画分

Claims (24)

1. ｉ）標的化合物を含む水溶液を提供することと、
   ｉｉ）前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
   ｉｉｉ）前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
   ｉｖ）前記画分に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによって、水の核磁気スピン横緩和を示すＮＭＲパラメータを決定することと、
   ｖ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
   を含む、分離方法。
2. ＮＭＲパラメータが、水のプロトンの核磁気スピン横緩和を示す、請求項１に記載の方法。
3. ＮＭＲパラメータが、核磁気スピン横緩和時間Ｔ_２及び核磁気スピン横緩和速度Ｒ_２のうちの少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 濃度パラメータが、前記標的化合物の濃度に正比例する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 濃度パラメータが、水の核磁気スピン横緩和を示すＮＭＲパラメータではない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 標的パラメータが、濃度パラメータと、横緩和時間（Ｔ_２）であるＮＭＲパラメータとに正比例する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 標的パラメータが、濃度パラメータと、横緩和時間（Ｔ_２）であるＮＭＲパラメータとの積に正比例する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定する工程ｖｉ）をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記標的化合物を所望の純度で含む前記画分のうちの少なくとも２つを組み合わせる工程ｖｉｉ）をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. 工程ｉｉ）における分離工程が、クロマトグラフィー分離を含み、前記画分が、クロマトグラフィー分離の溶出液の画分である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程ｉｉ）における分離工程が、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記方法が連続的なインライン法であり、且つ／又は、工程ｉｉ）において、前記画分が液体の連続流として生成される、請求項１から１０に記載の方法。
13. 前記標的化合物が、（ｉ）ポリペプチド、（ｉｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のうちの１つについての複合体、及び（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のうちの１つについてのコンジュゲートからなる群より選択される化合物を含み、一実施形態では（ｉ）ポリペプチド、（ｉｉ）ポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のうちの１つについての複合体、及び（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のうちの１つについてのコンジュゲートからなる群より選択される化合物である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記標的化合物が、ポリペプチドを含み、一実施形態ではポリペプチドである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記標的化合物が、非凝集ポリペプチドを含み、一実施形態では非凝集ポリペプチドである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記標的化合物が、ウイルス、又はウイルス様粒子である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 濃度パラメータが、直接測光アッセイにおいて決定される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 濃度パラメータが、前記標的化合物の吸収、吸光、又は蛍光である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ａ）標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分（１２２）を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイス（１１０）と、
    ｂ）前記画分（１２２）の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイス（１１２）と、
    ｃ）前記画分（１２２）に核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を適用することによって、水の核磁気スピン横緩和を示すＮＭＲパラメータを決定するように構成された核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定デバイス（１１４）と、
    ｄ）濃度パラメータ及びＮＭＲパラメータに基づいて前記画分（１２２）の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイス（１１６）と
    を含む、分離システム。
20. ｅ）前記標的化合物を含む前記画分（１２２）のうちの少なくとも２つを組み合わせるための、液体分配要素（１２０）、及び／又は
    工程ｄ）において決定された標的パラメータの値を出力する、出力デバイス
    をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
21. 標的化合物を生成すること、標的化合物を精製すること、及び標的化合物の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、請求項１９若しくは２０に記載のシステムの使用、及び／又は請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法の使用。
22. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法の工程を含む、標的化合物の、特にポリペプチドの生成方法。
23. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法によって生成されるか又は生成可能な標的化合物の調製物。
24. 透析濾過によって溶液中の標的化合物の濃度を上昇させるための方法であって、以下：
    Ａ）前記溶液における又はその画分における経時的な水の核磁気スピン横緩和を示す核磁気共鳴パラメータ（ＮＭＲパラメータ）の第１の勾配を決定すること、
    Ｂ）前記溶液における又はその画分における経時的な前記ＮＭＲパラメータの第２の勾配を決定すること、並びに
    Ｃ）前記ＮＭＲパラメータの前記第２の勾配の値が、前記ＮＭＲパラメータの前記第１の勾配の値から少なくとも１０％外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び／又は撹拌速度を増加させること
    を含む、方法。

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