JP2023513347A - 標的化合物の精製のための方法/デバイス - Google Patents
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Abstract
本発明は、i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、iii)前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、v)濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することとを含む、分離方法に関する。本発明はさらに、それに関する分離システム、使用、調製、及び方法に関する。【選択図】図1
Description
本発明は、i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、iii)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、v)濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することとを含む、分離方法に関する。本発明はさらに、それに関する分離システム、使用、調製、及び方法に関する。
技術分野
本発明は、生化学的分離方法、分離システム、及び分離システムの使用に関する。本発明の方法及びデバイスは、ある範囲の化合物を含む溶液から標的化合物を分離するために使用され得る。一例として、標的化合物は、タンパク質、核酸、ウイルス、又はリポソームなどの生体分子であり得る。他の標的化合物も許容される。標的化合物は、例えば医薬品有効成分として、治療目的で特に使用され得る。
本発明は、生化学的分離方法、分離システム、及び分離システムの使用に関する。本発明の方法及びデバイスは、ある範囲の化合物を含む溶液から標的化合物を分離するために使用され得る。一例として、標的化合物は、タンパク質、核酸、ウイルス、又はリポソームなどの生体分子であり得る。他の標的化合物も許容される。標的化合物は、例えば医薬品有効成分として、治療目的で特に使用され得る。
広範な生体分子には、大きな治療的価値があることが証明されてきた。しかしながら、治療目的の生体分子の生成には、多くの課題がある。特に、所望の生体分子は、例えば、安全な使用を保証するため、及び法的規制を遵守するために、高純度で提供される必要がある。
治療用生体分子の生成プロセスにおける工程の順序、及び特定の工程それ自体は、通常、インラインで取得した測定データに基づいて制御される。特に、クロマトグラフィー分離方法を使用すると、溶出中に所望の生成物を回収することは、分離手段の溶出液から取られた測定値の定義された開始値及び終了値に基づいて制御されることが多い。しかしながら、生体分子の生成プロセスを直接制御するのに利用可能な方法の数は限定されており、それは、結果が数秒以下の時間範囲内で利用可能でなければならないためである。典型的には、溶出液のタンパク質含有量は、UV吸収測定を使用して測定され得る。さらに、電気伝導率又はpH値における変化も検出され得る。
核磁気共鳴(NMR)は、生体分子を研究するために広範な用途に使用されてきた技法である。サンプル中の生体分子の異なる態様に関する結論は、タンパク質若しくはペプチドなどの生体分子自体のNMRシグナルに、又は生体分子を含む溶液由来のNMRシグナルに基づく場合がある。例えば、Shigemitsu et al.(2016),Analytical Biochemistry 498:59-67(非特許文献1)は、アミロイドベータペプチドモノマー及びダイマーのNMRシグナルの測定について記載している。Metz and Maeder(2008),International Journal of Pharmceutics 364:170-175(非特許文献2)は、製薬分野、特に薬物送達において特に使用され得るエマルション及び脂質成分の特徴付けのためのNMR実験を示している。
国際公開公報第2014/169229号A1(特許文献1)は、概して、生物医薬品製剤の凝集の程度の指標として水分子のNMR緩和速度を使用する方法に関する。同様に、国際公開公報第2018/102681号A1(特許文献2)は、溶媒NMRシグナルの横緩和速度を使用して、溶媒中の懸濁液又はエマルションとして配合された粒子含有生成物を非侵襲的に評価する方法について記載している。どちらの場合も、生物医薬品化合物は、バイアル又は容器を開けるか又は保護シールを傷つけることなく(つまり、壊れることなく)非破壊的に評価することができる。Hills et al.(1989),Molecular Physics,67(4):903-918(非特許文献3))は、天然ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液における水プロトン横緩和を記載している。彼らは、水プロトン横緩和が、水とタンパク質のアミノ酸側鎖との間のプロトンの高速交換によって影響を受けるという証拠を提示している。Feng et al.(2015),Chem.Commun.51:6804(非特許文献4)は、水プロトンの横緩和が、水中でのタンパク質凝集及び界面活性剤のミセル化を定量化するために使用され得ることを記載している。ヒトインスリン調製物を使用して、Taraban et al.(2015),Journal of Pharmaceutical Sciences 104:4132-4141(非特許文献5)は、水プロトンの横緩和速度が、可視の及び肉眼では見ることのできない両方のタンパク質凝集体を検出及び定量化するための信頼性が高く感度の高い指標として機能し得ることを実証している。Taraban et al.(2017),Analytical Chemistry 89:5494-5502(非特許文献6)は、異なる応力によって生成されたモノクローナル抗体凝集体の存在の検出に向けて、水NMRと、サイズ排除クロマトグラフィー、マイクロフローイメージング、及び動的光散乱などの従来の技術との感度の違いを探る。Taraban et al.(2019),Anal Chem 91(6):4107(非特許文献7)は、タンパク質凝集の特徴づけのための水プロトンNMRの使用を開示している。近年、水NMRのインライン測定は可能であるが、フローシステムの構成、流量、タンパク質濃度、及びタンパク質凝集に依存することがわかった(Taraban et al.(2019),7th Annual PANIC Conference,Poster presentation P35:「Water Flow-NMR-A Prospective Contact-Free In-Line Analytical Tool for Continuous Biomanufacturing」(非特許文献8))。
国際公開公報第2012/015912号A1(特許文献3)は、活性ポリペプチド又はイムノコンジュゲートを精製するための方法に関し、国際公開公報第2019/016154号A1(特許文献4)は、タンパク質又は他の生体分子の工業規模の精製のための技法を教示している。
Shigemitsu et al.(2016),Analytical Biochemistry 498:59-67
Metz and Maeder(2008),International Journal of Pharmceutics 364:170-175
Hills et al.(1989),Molecular Physics,67(4):903-918
Feng et al.(2015),Chem.Commun.51:6804
Taraban et al.(2015),Journal of Pharmaceutical Sciences 104:4132-4141
Taraban et al.(2017),Analytical Chemistry 89:5494-5502
Taraban et al.(2019),Anal Chem 91(6):4107
Taraban et al.(2019),7th Annual PANIC Conference,Poster presentation P35:「Water Flow-NMR-A Prospective Contact-Free In-Line Analytical Tool for Continuous Biomanufacturing」
解決すべき問題
上記にもかかわらず、生体分子又は生体分子の複合体、特にタンパク質又はその複合体の精製を支援する手段及び方法が依然として当技術分野で必要とされている。
上記にもかかわらず、生体分子又は生体分子の複合体、特にタンパク質又はその複合体の精製を支援する手段及び方法が依然として当技術分野で必要とされている。
概要
この問題は、独立請求項の特徴を有する方法、システム、使用、調製、及びコンピュータプログラム製品によって対処される。単独の方式又は任意の恣意的な組み合わせで実現され得る有利な実施形態は、従属請求項に記載されている。
この問題は、独立請求項の特徴を有する方法、システム、使用、調製、及びコンピュータプログラム製品によって対処される。単独の方式又は任意の恣意的な組み合わせで実現され得る有利な実施形態は、従属請求項に記載されている。
よって、本発明は、
i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、
ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
iii)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、
v)濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む分離方法に関する。
i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、
ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
iii)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、
v)濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む分離方法に関する。
概して、本明細書で使用される用語は、当業者に通常の慣習的な意味を与えられるべきであり、別途指示がない限り、特別な又はカスタマイズされた意味に限定されるべきではない。以下で使用されるように、「有する(have)」、「含む(comprise)」、若しくは「含む(include)」という用語、又はそれらの任意の文法上の変形は、非排他的に使用される。よって、これらの用語は、これらの用語によって導入された特徴に加えて、この文脈で説明されている存在物にさらなる特徴が存在しない状況と、1つ又は複数の追加の特徴が存在する状況との両方を指す場合がある。一例として、「AはBを有する(A has B)」、「AはBを含む(A comprises B)」及び「AはBを含む(A includes B)」という表現は、B以外に他の要素がAに存在しない状況(つまり、AがBだけで構成されている状況)と、B以外に要素C、要素C及びD、あるいはまたさらなる要素といった1つ又は複数の要素が存在物Aに存在する状況との両方を指す場合がある。また、当業者に理解されるように、用語「1つ(a)」及び「1つ(an)」は、「1つ又は複数」を指し、すなわち「少なくとも1つ」と同等である。よって、「i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、ii)前記水溶液に分離工程を適用し、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、iii)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、v)濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することとを含む、分離方法」は、「i)少なくとも1つの標的化合物を含む少なくとも1つの水溶液を提供することと、ii)前記水溶液に、少なくとも1つの分離工程を適用し、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、少なくとも1つの分離工程を適用することと、iii)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す少なくとも1つの濃度パラメータを決定することと、iv)前記画分に、少なくとも1つの核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによって、少なくとも1つのNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における少なくとも1つの核磁気共鳴スピン緩和を示す、少なくとも1つのNMRパラメータを決定することと、v)濃度パラメータ及び核磁気共鳴パラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の少なくとも1つの標的パラメータを決定することとを含む、分離方法」と同等である。
さらに、以下で使用される場合、用語「好ましくは(preferably)、「より好ましくは(more preferably)」、「最も好ましくは(most preferably)」、「特に(particularly)」、「より具体的には(more particularly)、「特に(specifically)」、「より具体的には(more specifically)」、又は同様の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意選択的な特徴と併せて使用される。よって、これらの用語によって導入される特徴は、任意選択的な特徴であり、いかなる方法によっても特許請求の範囲を制限することを意図したものではない。本発明は、当業者が認識するように、代替的な特徴を使用して実施され得る。同様に、「ある実施態様では」又は同様の表現によって導入された特徴は、本発明のさらなる実施形態に関する制限なしに、本発明の範囲に関する制限なしに、及びそのように導入された特徴を他の任意選択的又は非任意選択的な特徴と組み合わせる可能性に関する制限なしに、任意選択的な特徴であることが意図されている。
本明細書で使用される場合、用語「標準条件」は、別途明記されない場合、IUPAC標準の常温及び圧力(SATP)条件、すなわち、好ましくは、25℃の温度及び100kPaの絶対圧力に関し、また好ましくは、標準条件は7のpHを含む。さらに、別途記載されない場合、用語「約(about)」は、関連分野で一般的に受け入れられている技術的精度を備えた表示値に関連し、好ましくは表示値±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%に関連する。さらに、用語「本質的に(essentially)」は、示された結果及び使用に影響を与える偏差がないことを示す。つまり、潜在的な偏差によって示された結果が、±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%を超えて逸脱することはない。よって、「本質的に~からなる」とは、特定の成分を含むが、不純物として存在する材料を除く他の成分と、成分を提供するために使用されたプロセスの結果として存在する不可避の材料と、本発明の技術的効果を達成する以外の目的で追加された成分を排除することを意味する。例えば、「本質的に~からなる(consisting essentially of)」という語句を使用して定義される組成物は、任意の既知の許容される添加剤、添加物、希釈剤、担体等を包含する。好ましくは、成分のセットから本質的になる組成物は、5重量%未満、より好ましくは3重量%未満、さらにより好ましくは1重量%未満、最も好ましくは0.1重量%未満の不特定の成分を含むことになる。
本発明の方法はin vitro法である。さらに、方法は、上で明示的に言及されたものに加えて工程を含み得る。例えば、さらなる工程は、例えば、工程i)、及び/又は本明細書の他の場所に示される工程、例えば目的の画分であると同定された2つ以上の画分を組み合わせること、及び/又は本明細書に記載される方法の工程より先の及び/又は後のさらなる精製工程のための、標的化合物を含む水溶液を生成することに関連し得る。 特に、方法は、工程iv)の後に少なくとも1つの画分に、少なくとも1つのさらなる、一実施形態では非同一の、一実施形態では非同一の分離原理に基づく、少なくとも1つのさらなる分離工程を適用することが繰り返され得る。さらに、前記工程のうちの1つ又は複数は、自動化装置によって実施され得る。
一実施形態では、本方法の工程は、当業者によって適切であるとみなされる順序で実施される。さらなる実施形態では、少なくとも工程i)は工程ii)の前に実施され、工程iii)及びiv)は工程v)の前に実施される。一実施形態では、工程iii)からiv)、又は工程ii)からv)の少なくとも一部は、本質的に同時に実施され、よって、クロマトグラフィーカラムの出口は、濃度決定デバイス及びNMR測定デバイスに接続され得ることも想定される。さらなる実施形態では、出口は、切り替えバルブなどの液体分配要素に接続されていてもよく、この要素は、標的パラメータが閾値基準を満たしている場合はカラムから出てくる溶液を標的化合物回収デバイスに迂回させ、閾値基準が満たされていない場合はカラムから出てくる溶液を廃棄物回収デバイスに迂回させる。さらなる実施形態では、方法の工程は、示されている順序で実施される。
本明細書で使用される場合の用語「分離方法」は、水溶液に含まれる他の化合物よりも標的化合物の濃縮に適した任意の方法に関し、よって、一実施形態では、分離方法は、他の化合物からの標的化合物の分離を引き起こす。一実施形態では、分離方法は、標的化合物から、異なる分子量を有する分子、一実施形態では標的化合物の75%未満、一実施形態では50%未満、さらなる実施形態では25%未満、さらなる実施形態では10%未満の分子量を有する分子、又は一実施形態では標的化合物の少なくとも150%、一実施形態では少なくとも200%、さらなる実施形態では少なくとも250%の分子量を有する分子を分離する方法である。一実施形態では、分離方法は、標的化合物から、異なるサイズ及び/又は分子量を有するが、同様の物理的、化学的、及び/又は生化学的特性を有する分子を分離する方法であり、よって、一実施形態では、方法は、標的化合物から、標的化合物の凝集体、断片、及び/又は分解生成物を分離する方法である。よって、標的化合物がポリペプチドである場合、分離方法は、一実施形態では、前記ポリペプチドから、宿主細胞タンパク質、凝集体、断片、及び/又は分解生成物を分離する方法であり、さらなる実施形態では、標的化合物がポリペプチドである場合、分離方法は、一実施形態では、前記ポリペプチドから、凝集体、断片、及び/又は分解生成物を分離する方法である。一実施形態では、標的化合物がウイルスカプシドである場合、分離方法は、充填されたウイルスカプシドから、空のウイルスカプシドを、一実施形態では、充填されたアデノ関連ウイルス(AAV)カプシドから、空のAAVウイルスカプシドを分離する方法である。
「空のカプシド」及び「空の粒子」という用語は、一実施形態では、少なくともウイルスタンパク質の殻を含むが、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される核酸の全部又は一部を欠いているウイルス粒子を指す。したがって、空のカプシドは、タンパク質をコードするか又は目的の転写物に転写される核酸を、宿主細胞に転写するように機能しない。
ある実施形態では、NMRパラメータは、ウイルス粒子によって引き起こされない変化、特に溶質効果に対して補正される。これは、ある実施形態では、pH値及び/又はイオン濃度に基づく場合がある。ある実施形態では、そのような補正は、既知のウイルス粒子含有量を有し、他の点では使用される水溶液と同一の組成を有する水溶液を使用して事前補正を実施すること、及び/又はウイルス粒子を含まず、他の点では使用される水溶液と同一の組成を有する水溶液を使用して事前補正を実施することによって提供される。
よって、ある実施形態では、ポリヌクレオチドが負荷されたウイルス粒子の比/画分/濃度は、水溶液における水分子のプロトンの横緩和時間(T2)であるNMRパラメータに正比例する。
「組み換えウイルスベクター」は、一実施形態では、分子法を使用してウイルス(例えばAAV)から野生型ゲノムを除去し、それを、転写物に転写されたか又はタンパク質をコードする核酸などの非天然核酸に置き換えることにより、AAVなどのウイルスの野生型ゲノムに由来する。典型的には、AAVについて、AAVゲノムの一方又は両方の逆方向末端反復(ITR)配列は、AAVベクターに保持される。「組み換え」AAVベクターは、ウイルスゲノムの全部又は一部が、天然のウイルスゲノム核酸に関して非天然(すなわち、異種)配列で置き換えられているため、天然に存在するウイルスAAVゲノムとは区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、ウイルスベクター(例えば、AAV)を「組み換え」ベクターとして定義し、これは、AAVの場合、「rAAVベクター」と呼ぶことができる。
組み換えウイルスベクター(例えばAAV)ポリヌクレオチドは、一実施形態では、ex vivo、in vitro、又はin vivoでの細胞のその後の感染(形質導入)のためにウイルス粒子にパッケージ化することができる。組み換えベクター配列がAAV粒子にカプセル化又はパッケージ化される場合、粒子は「AAV粒子」又は「AAV粒子」とも呼ぶことができる。そのような粒子は、ベクターゲノムをカプセル化又はパッケージ化するタンパク質を含む。特定の例には、ウイルスエンベロープタンパク質が含まれ、AAVの場合、AAV VP1、VP2、及びVP3などの、カプシドタンパク質が含まれる。
「ベクター」は、一実施形態では、ウイルス(例えば、AAV)粒子を形成するために、直接的に、又は1つ又は複数の一本鎖若しくは二本鎖DNA又はRNAの形のいずれかで、最終的にパッケージ化又はカプセル化された組み換えポリヌクレオチドの一部を指す。組み換えプラスミドを使用して組み換えウイルス粒子を構築又は製造する場合、ウイルス粒子は、組み換えプラスミドのベクター配列に対応しない「プラスミド」の一部を含まない。組み換えプラスミドのこの非ベクター部分は、「プラスミドバックボーン」と呼ばれ、これは、プラスミドのクローニング及び増幅に重要であり、増殖及び組み換えウイルスの生成に必要なプロセスであるが、それ自体はウイルス(例えばAAV)粒子にパッケージ化又はカプセル化されていない。よって、「ベクター」は、ウイルス粒子(例えばAAV)によってパッケージ化又はカプセル化された核酸を指す。
本明細書の記載を考慮して当業者によって理解されるように、分離方法は、少なくとも、標的化合物を含む水溶液に、本明細書で指定される分離工程を適用し、それにより、複数の画分を提供する、分離工程を適用する工程と、画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度及び純度に関する情報を提供する1つ又は複数の工程とを含む。よって、一実施形態では、方法は、分離工程における標的化合物のインプロセス制御の方法である。一実施形態では、分離方法は、生化学的精製方法の一部及び/又は標的化合物、特にポリペプチド又はポリペプチド複合体の生成方法の一部である。当業者によって理解されるように、生化学的精製方法は、分離方法からなる場合があるか、又はさらなる精製工程、一実施形態では1つ又は複数のさらなる分離方法、さらなる実施形態では本開示による1つ又は複数のさらなる分離方法を含む場合がある。
一実施形態では、分離方法は、標的化合物を含む水溶液に、本明細書に明記される分離工程を適用し、それにより複数の画分を提供する、分離工程を適用する工程と、濃縮された状態及び/又は精製された状態の標的化合物を含む前記画分の少なくとも1つを同定する工程とを含む。一実施形態では、分離方法は、上に明記された工程i)からiv)に加えて、vi)標的化合物を含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定することと、vii)標的化合物を含む画分の少なくとも2つを組み合わせること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて組み合わせることとを含む、さらなる工程を含む。一実施形態では、工程vii)において、標的パラメータが標的条件を満たす画分が組み合わされる。よって、標的化合物を所望の純度で含む画分は、一実施形態では、前述の標的パラメータに基づいて同定される。
上記によれば、「分離工程」という用語は、水溶液に少なくとも1つの分離原理を適用し、複数の画分を得て、水溶液の成分の分布を前記画分の少なくとも2つにわたって異ならせることを含む工程に関する。分離原理は、成分の分布を分離工程から画分にわたって異ならせる任意の原理、特に物理的原理(例えば、沈降速度又は分子サイズ)、化学的原理(例えば、塩、疎水性、又は電荷の存在下での溶解度)、又は生化学的原理(例えば、別の分子への親和性)、又はそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、分離工程は、液体クロマトグラフィー(LC)工程である。LC法は、当業者に知られており、特に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)、及び当業者に適切とみなされる任意の他のタイプのLCを含む。一実施形態では、LCは、膜及び/又はフィルタベースのLCである。さらなる実施形態では、LCはカラムベースのLCである。いくつかの実施形態では、LCは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィー、相分離クロマトグラフィー、分布クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーからなるリストから選択される。さらなる実施形態では、LCは、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、カチオンイオン交換クロマトグラフィー又はアニオンイオン交換クロマトグラフィーである。一実施形態では、LCは混合モードクロマトグラフィーである。
一実施形態では、分離方法は生化学的分離法である。本明細書で使用される場合、「生化学的分離法」という表現中の「生化学的」という用語は、標的化合物が、本明細書の他の場所に明記される生化学的化合物であり、分離方法又はこれによる分離工程を限定することを意図していない。
用語「水溶液」とは、原則として、当業者に理解される。本明細書で使用される場合、この用語は、任意の液体調製物に関し、ここで、溶媒中の水の濃度は、少なくとも50%、一実施形態では少なくとも75%、さらなる実施形態では少なくとも90%、さらなる実施形態では少なくとも95%、さらなる実施形態では少なくとも98%、さらなる実施形態では少なくとも99%、さらなる実施形態では約100%、さらなる実施形態では本質的に100%である。さらに、本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、溶液中の化合物(溶質)の少なくとも一部分が、溶媒に溶解することを指す。一実施形態では、溶質は、本質的には溶媒に溶解し、さらなる実施形態では、溶質は溶媒に溶解する。溶液を調製するための方法は、当該技術分野で知られている。よって、一実施形態では、水溶液という用語は、少なくとも部分的に、水を含み、一実施形態では水からなる、溶媒に溶解する標的化合物を含む液体調製物に関する。
本明細書で使用される場合、「標的化合物」という用語は、少なくとも1つの目的の高分子量有機化学化合物を含む主題の任意の組成物を指し、一実施形態では、高分子量化学化合物は、少なくとも500(500原子質量単位、及び500Daに対応する;1Daは1.66×10-27kgに対応する)、さらなる実施形態では少なくとも1000、さらなる実施形態では少なくとも10000、さらなる実施形態では少なくとも100000の分子量を有する化学化合物である。よって、この用語は、高分子量有機化学化合物、前記高分子量有機化学化合物を含む複合体、及び前記高分子量有機化学化合物又は前記複合体のコンジュゲートに関する。一実施形態では、高分子量有機化学化合物は高分子であり、一実施形態では生物学的高分子、一実施形態では少なくとも500(0.5kDa)、さらなる実施形態では少なくとも1000(1kDa)、さらなる実施形態では少なくとも10000(10kDa)、さらなる実施形態では少なくとも100000(100kDa)の分子量を有する生物学的高分子である。高分子量有機化学化合物がポリペプチドである場合、分子量は、0.5kDaから500kDa、一実施形態では1kDaから400kDa、さらなる実施形態では5kDaから250kDaであり得る。一実施形態では、高分子量有機化学化合物は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド、特に、DNA、RNA、又はロック核酸(LNA)である。さらなる実施形態では、高分子量有機化学化合物はポリペプチドである。よって、一実施形態では、標的化合物はポリペプチド又はポリヌクレオチド、特に、DNA、RNA、又はLNA、ポリペプチド又はポリヌクレオチドのコンジュゲート、又はポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドを含む複合体、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子(VLP)、又はリポソームである。一実施形態では、標的化合物は、ウイルス又はVLPであり、さらなる実施形態では、標的化合物は、標的化合物は、非エンベロープウイルス又は非エンベロープウイルスのVLPであり、さらなる実施形態では、標的化合物は、アデノ関連ウイルス(AAV)又はAAVのVLPであり、一実施形態では、本明細書中で上に明記される通りである。一実施形態では、AAV粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、並びにその混合物及び/又はキメラからなるAAV血清型の群から選択される血清型を有する。一実施形態では、AAV粒子は、AAV2、AAV4、AAV6、AAV8、及びAAV9からなるAAV血清型の群から選択される血清型を有する。さらなる実施形態では、AAV粒子は、AAV2血清型、又はAAV6血清型、又はAAV8血清型である。
一実施形態では、標的化合物は、(i)PD-1に結合する抗体と、(ii)IL-2Rβγを通じてシグナル伝達するポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートであり、一実施形態では、IL-2Rβγを通じてシグナル伝達するポリペプチドは、IL-2ポリペプチド又はIL-15ポリペプチドであり、一実施形態では、標的化合物は、国際公開公報第2018/184964号A1に明記されるようなイムノコンジュゲートであり、さらなる実施形態では、明細書中以下の実施形態46から68のいずれか1つに明記されるようなイムノコンジュゲートである。
一実施形態では、標的化合物は、(i)抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、(ii)野生型インターロイキン-2(IL-2)分子と比較して、中間親和性IL-2受容体に対する変異IL-2分子の親和性を低下させるアミノ酸変異を含む2つの変異IL-2分子であって、前記変異IL-2分子が配列番号30の配列を含む、2つの変異IL-2分子とを含む、融合タンパク質である。さらなる実施形態では、標的化合物は、(i)抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、(ii)配列番号30の配列を含む2つの変異IL-2分子とを含む融合タンパク質である。一実施形態では、標的化合物は、国際公開公報第2015/118016号A1及び/又はEP 3102595 B1に明記されるような融合タンパク質であり、一実施形態では、国際公開公報第2015/118016号A1及び/又はEP 3102595 B1に明記されるようなDP47GS IgG-(IL2)2又はDP47GS IgG-(IL-2 N88D)2イムノコンジュゲートである。一実施形態では、標的化合物は、本明細書中以下の実施形態69から90のいずれか1つに明記されるような融合タンパク質である。
一実施形態では、標的化合物は、二重特異性抗体であり、一実施形態では、CD3と第2の抗原とに結合する二重特異性抗体であり、さらなる実施形態では、CD3とCEAとに結合する二重特異性抗体である。さらなる実施形態では、標的化合物は、第1、第2、及び第3のFab分子と、2つのサブユニットから構成されるFcドメインとを含む二重特異性抗体であり、一実施形態では、Fcドメインは、IgG Fcドメイン、具体的にはIgG1 Fcドメイン、より具体的にはヒトIgG1 Fcドメインである。一実施形態では、前記標的化合物は二重特異性抗体であり、ここで、第1のFab分子は、C末端で第2のFab分子のN末端に融合し、第2のFab分子は、C末端でFcドメインのサブユニットのうちの一方のN末端に融合し、第3のFab分子は、C末端でFcドメインのサブユニットのうちの他方のN末端に融合し、一実施形態では、第2のFab分子はCD3に結合し、第1及び第3のFab分子は第2の抗原に結合し、さらなる実施形態では、第2の抗原はCEAである。一実施形態では、標的化合物は、本明細書中以下の実施形態91から99のいずれか1つに明記されるような二重特異性抗体であり、さらなる実施形態では、標的化合物は、シビサタマブである(WHO Drug Information(International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances),Recommended INN:List 80,2018,vol.32,no.3,p.438)。
本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、本明細書に明記されるような高分子量有機化学化合物と少なくとも1つの同一又は非同一の化学分子との非共有結合性会合に関する。複合体に含まれるさらなる分子は、本明細書に明記されるように、特に同一の又はさらなる標的化合物を含む、任意の化学分子であり得る。一実施形態では、非高分子量有機化学化合物、特に低分子量(小分子)薬学的化合物が、複合体に含まれる。一実施形態では、複合体は、標準条件下で安定しており、さらなる実施形態では、複合体は、分離工程の条件下で安定しており、「安定」という用語は、上記の条件下で、1日あたり複合体の最大25%、一実施形態では最大10%、さらなる実施形態では最大5%、さらなる実施形態では最大1%の損失に関する。一実施形態では、上記の条件下で、複合体に含まれる高分子量有機化学化合物及び少なくとも1つのさらなる分子の解離のための解離定数Kdは、最大10-6M、一実施形態では最大10-7M、さらなる実施形態では最大10-8M、さらなる実施形態では最大10-9M、さらなる実施形態では最大10-10Mである。
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、本明細書に明記されるような高分子量有機化学化合物と少なくとも1つの同一又は非同一の化学分子との共有結合に関する。コンジュゲートに含まれるさらなる分子は、本明細書に明記されるように、特に同一の又はさらなる標的化合物を含む、任意の化学分子であり得る。一実施形態では、少なくとも1つの非高分子量有機化学化合物、特に低分子量(小分子)薬学的化合物、検出可能な標識、及び/又はビオチンなどの親和性標識がコンジュゲートに含まれる。さらなる実施形態では、少なくとも1つのさらなる高分子量有機化学化合物、特に、ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマー、一実施形態では、当業者に知られている生分解性ポリマー、オリゴ糖又は多糖、ポリペプチド、及び/又はポリヌクレオチドが、コンジュゲートに含まれる。高分子量有機化学化合物が、ポリペプチド、又はポリペプチドを含む複合体である場合、少なくとも1つのさらなる高分子量有機化学化合物は、特に、低分子量(小分子)薬学的化合物、ポリヌクレオチド、特に、ロック核酸、ビオチンなどの親和性標識、グリコシル化、又はPEG化である。
一実施形態では、標的化合物は、生物の細胞内でも検出できる化合物又は生物への投与を目的とした化合物である。よって、一実施形態では、標的化合物は、生細胞によって生成された、及び/又は生細胞の生化学的組成を調節する化合物である。
一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチドであるか又はポリペプチドを含み、さらなる実施形態では、ポリペプチドである。一実施形態では、標的化合物は、治療用ポリペプチド、すなわち、疾患又は不調を予防、改善、又は治療するために生物へ投与するためのポリペプチドである。一実施形態では、標的化合物は、診断用ポリペプチド、すなわち、疾患又は不調を診断するのに使用するためのポリペプチドである。一実施形態では、ポリペプチドは、タンパク質のような抗体、特に、抗体又はその断片、一実施形態では、治療用又は診断用抗体である。一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチド、一実施形態では非凝集及び/又は非分解ポリペプチド、さらなる実施形態では非凝集及び/又は非分解抗体様タンパク質、特に抗体又はその断片である。一実施形態では、標的化合物は、本明細書に明記されるようなポリペプチドを含み、さらなる実施形態では、本明細書に明記されるようなポリペプチドからなる。よって、一実施形態では、標的化合物は、本明細書に明記されるようなポリペプチドのコンジュゲート、特に抗体様タンパク質のコンジュゲート、具体的には抗体又はその断片及び/又はその融合ポリペプチドである。
本明細書で使用される場合、「抗体様タンパク質」という用語は、抗体の少なくとも1つのサブドメイン、特にIgG又はその断片を含む任意のポリペプチドに関する。よって、一実施形態では、抗体様タンパク質は、VH、VL、CL、CH1、CH2、及びCH3ドメインのうちの少なくとも1つ、一実施形態では、Fv、Fab及び/又はFcドメイン、さらなる実施形態では、Fv又はFabドメインを含む。上記のドメインは、原則として、当業者に知られており、本明細書中以下でさらに説明される。一実施形態では、抗体様タンパク質は、多重特異性抗体様タンパク質であり、すなわち、多数のFv及び/又はFabドメインを含み、さらなる実施形態では、抗体様タンパク質は、二重特異性抗体様タンパク質であり、すなわち2つのFv及び/又はFabドメインを含む。
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの抗体又はその断片から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、2つ以上の抗体ドメインの融合ポリペプチド、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体(VHH、ナノボディとしても知られている)、及び抗体断片、並びに上記の化合物の少なくとも1つを含む化合物を網羅する。一実施形態では、抗体は、完全長抗体又は抗体断片であるか、又は完全長抗体又は抗体断片を含む。さらなる実施形態では、抗体は、2つ以上の抗体ドメインの、一実施形態では少なくとも2つの非同一抗体からの、融合ポリペプチドであるか又はそれを含む。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体であるか又はそれを含む。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質若しくはペプチドとの共有的又は非共有的結合により形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、一実施形態では、その抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディ;直鎖状抗体;単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる二つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。パパイン処置は、二つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することが可能なF(ab’)2断片を産生する。「Fv」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。一実施態様において、二本鎖「Fv」種は、一本の重鎖と一本の軽鎖の可変ドメインが堅固な非共有結合をなした二量体からなる。一本鎖Fv(scFv)種では、柔軟なペプチドリンカーによって1の重鎖及び1の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連結することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Fv種におけるものと類似の「二量体」構造に結合することができる。用語「ダイアボディ」は、二つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は、同一ポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン(VL)に連結した重鎖可変ドメイン(VH)を含む(VH-VL)。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成ができないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは二価でも二特異性でもよい。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、本質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、少量で存在しうる可能な変異体、例えば天然発生変異体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。さらなる実施形態では、抗体は、一実施形態では共有結合的に、さらなる化学分子に結合され得る。ポリペプチドが化学分子とどのように共有結合するかについては、当該技術分野で知られている。本発明の結合ポリペプチドとの共有結合に好ましい化学分子は、サイトカインや金属複合体形成剤などの薬学的化合物である。
一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチドを含むコンジュゲートであり、さらなる実施形態では、ポリペプチドコンジュゲートである。本明細書で使用される場合、「ポリペプチドコンジュゲート」という用語は、追加の化学基又は分子への少なくとも1つの共有結合を含むポリペプチドに関し、前記化学結合は、ポリペプチドのペプチド鎖を継続するペプチド結合ではない。一実施形態では、追加の化学基又は分子は、「指標」、すなわち、前記指標を含む分子又は複合体の存在を検出可能にするように適合された化合物である。典型的には、指標は、検出可能な特性、典型的には光学又は/及び酵素特性を有する。しかしながら、前記検出可能な特性は放射性を放出する特性であることも、想定される。本明細書で使用される場合の用語「光学特性」は、光学機器によって検出することができる任意の特性に関する。具体的には、光学的に検出可能な特性は、反射特性、透過特性、発光特性、散乱特性、蛍光特性、蛍光特性、回折特性、及び偏光特性からなる群より選択される少なくとも1つの特性であり得るか又はそれらを含み得る。本発明によって想定されるさらなる光学特性は、色、蛍光、発光、又は屈折である。一実施形態では、本明細書で言及される光学的に決定可能な特性は、光吸収、発光、光寛解、又はそれらに関連する特性など、光学的に検出することができる化合物の特性を指す。本明細書で使用される光学的に決定可能な特性の検出は、以前は検出できなかった特性の存在の検出、以前に検出された特性がないことの検出、及び特性の定量的変化の検出、すなわち、少なくとも1つの光学特性の変化の程度に相関するシグナル強度の変化の検出を包含することが理解されよう。「光学的に決定可能な特性」という用語は、一実施形態では、電気発生化学ルミネセンスとしても知られている電気化学発光にも関連していることが理解される。さらなる実施形態では、追加の化学基又は分子は、「エフェクター」、すなわち、標的化合物の追加の効果、特に追加の治療的効果を媒介する化合物である。よって、エフェクターは、例えば細胞毒素である化学構造体、例えば化学療法化合物、免疫刺激剤、例えばサイトカイン、又は例えば元素の放射性同位体を錯化するための複合体形成基であり得る。
一実施形態では、標的化合物は、治療用ポリペプチドコンジュゲート又は診断用ポリペプチドコンジュゲートである。一実施形態では、ポリペプチドは、本明細書中で上に明記される抗体様タンパク質の、一実施形態では診断用及び/又は治療用抗体の、コンジュゲートである。一実施形態では、ポリペプチドは、抗体コンジュゲート、一実施形態では治療用又は診断用抗体コンジュゲートである。一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチドコンジュゲート、一実施形態では非凝集及び/又は非分解ポリペプチドコンジュゲート、さらなる実施形態では非凝集及び/又は非分解抗体コンジュゲートである。
一実施形態では、標的化合物は、ポリペプチド複合体であるか又はそれを含む。よって、一実施形態では、標的化合物は、同一又は非同一のポリペプチドサブユニットの四次構造を含む複合体である。さらなる実施形態では、ポリペプチド複合体は、ウイルスカプシド、一実施形態では非エンベロープウイルスカプシド、であるか又はそれを含む。本明細書で使用される場合、「ウイルスカプシド」という用語は、1つ又は複数のポリヌクレオチドを含む充填されたカプシド、ポリヌクレオチドがない空のカプシド、並びにそれらの前及び中間形態を含む。一実施形態では、ポリペプチド複合体は、ウイルス様粒子(VLP)であり、さらなる実施形態ではポリペプチド複合体は充填されたウイルスカプシドであり、一実施形態では組み換えポリヌクレオチドを含み、さらなる実施形態では治療用ポリヌクレオチドを含み、さらなる実施形態では組み換え治療用ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、特に、DNA、RNA、又はロック核酸(LNA)であり得る。一実施形態では、ウイルスカプシドは、非エンベロープウイルスのカプシドであり、さらなる実施形態では、アデノ関連ウイルスカプシド、アデノウイルスカプシド、又はパルボウイルスカプシドである。
さらなる実施形態では、標的化合物は、「融合ポリペプチド」、すなわち、ペプチド結合を介してポリペプチドに共有結合しており、ポリペプチドのアミノ酸配列の続きである、少なくとも1つのさらなるペプチド配列を含むポリペプチドである。よって、一実施形態では、融合ポリペプチドは、連続したオープンリーディングフレームによってコードされる。さらなるペプチド配列は、本明細書で上に明記されるような指標であってもよい。よって、一実施形態では、さらなるペプチドは、光学的に決定可能な特性、一実施形態では蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、若しくは赤色蛍光タンパク質(RFP)を有するペプチドであるか、又は酵素特性、例えばオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼを有するペプチドである。さらなるペプチドはまた、本明細書で上に明記されるような指標、一実施形態ではサイトカインであり得る。
さらなる実施形態では、標的化合物は、本明細書に明記されるような融合ポリペプチドの本明細書に明記されるようなコンジュゲート、特に、抗体様タンパク質のコンジュゲートである。一実施形態では、標的化合物は、本明細書中の実施例に明記されるような化合物の1つ、特に、実施例に明記されるようなALP1、ALP2、ALP3、又はALP4である。
一実施形態では、標的化合物はリポソームではない。さらなる実施形態では、標的化合物は、エンベロープウイルス粒子でもそのVLPでもない。さらなる実施形態では、標的化合物は、最大25%(w/w)の割合で、一実施形態では最大10%(w/w)、さらなる実施形態では最大5%(w/w)、さらなる実施形態では最大1%(w/w)の割合で脂質を含む。
「画分」という用語は、当業者には、主題の組成物のサブポーション、一実施形態では水溶液(一実施形態では、水溶液の成分を含むと知られているか又は疑われている)に分離工程を適用することにより生じる本明細書に明記されるような水溶液に関すると理解される。本開示の画分は、水溶液という用語について本明細書で上に明記されているように水性である。一実施形態では、画分のうちの少なくとも1つは、標的化合物を含む。本明細書で上に明記されるように、特に複数の画分が少ない場合、特に3つ又は2つである場合、画分は必ずしも同じ体積を有する必要はない。「画分の少なくとも一部」という用語は、当業者には、提供されたすべての画分の少なくとも1つの画分の数に関すると理解される。一実施形態では、画分の少なくとも一部は、例えば方法を実施する前述の例から、標的化合物を含むと疑われる画分である。一実施形態では、画分の少なくとも一部は、少なくとも2、一実施形態では少なくとも5、さらなる実施形態では少なくとも10の画分である。さらなる実施形態では、画分の少なくとも一部は、提供されたすべての画分の少なくとも1%、一実施形態では少なくとも5%、さらなる実施形態では少なくとも10%、さらなる実施形態では少なくとも25%、さらなる実施形態では少なくとも50%に関する。一実施形態では、画分の少なくとも一部は、提供されたすべての画分を含む。さらに理解されるように、一実施形態では、濃度パラメータ及びNMRパラメータは、同じ画分で決定され、両パラメータは、パラメータが決定される各画分について決定される。しかしながら、いくつかのサンプルについて1つのみのパラメータが決定され、第2のパラメータは、前記サンプルについて決定された第1のパラメータが所与の限界基準を満たす場合にのみ決定されることも想定される。一実施形態では、本明細書に明記されるような画分は、仮想画分であり、すなわち、分離工程の溶出液を同じ又は異なる体積を有し得るサブポーションに形式的に分割し、前述のパラメータを検出することによって生成される、仮想画分である。さらなる実施形態では、画分は物理的画分であり、同じ又は異なる体積を有し、別個の容器に含まれている場合がある。一実施形態では、少なくとも1つの画分中の標的化合物の濃度は、少なくとも1mg/mL、一実施形態では少なくとも5mg/mL、さらなる実施形態では少なくとも10mg/mL、さらなる実施形態では少なくとも20mg/mLであり、また、一実施形態では、標的化合物がウイルス、特にAAVである場合、ウイルス粒子の総濃度は、少なくとも1つの画分中、少なくとも1*1012vg/mL(1mLあたりのウイルスゲノム又はベクター)、さらなる実施形態では少なくとも5*1012vg/mL、さらなる実施形態では少なくとも1*1013vg/mL、さらなる実施形態では少なくとも2*1013vg/mLである。
「複数」という用語は、当業者には少なくとも2の数に関すると知られている。一実施形態では、少なくとも3、さらなる実施形態では少なくとも4、さらなる実施形態では少なくとも5の画分が提供される。しかしながら、少なくとも10、一実施形態では少なくとも20の画分が方法の工程i)において提供されることも想定される。
本明細書で使用される場合、「濃度パラメータ」という用語は、標的化合物の濃度と相関するか、又は主題の組成物中の、標的化合物が属する化合物のクラスの濃度と相関する任意のパラメータに関する。パラメータは、半定量的又は定量的パラメータであってもよく、一実施形態では、定量的パラメータである。そのようなパラメータを決定するための適切なアッセイが、当該技術分野で知られている。一実施形態では、濃度パラメータは、包括的な濃度パラメータ、つまり、適用される決定方法に関連する同じ又は類似の特性を有する化合物の化学クラスの濃度と相関するパラメータであり、例えば280nmでの溶液の吸収は、ポリペプチドの濃度と相関することが当業者に知られている。さらなる実施形態では、濃度パラメータは、特定の濃度パラメータ、つまり、標的化合物の濃度と特異的に相関するパラメータであり、特定の濃度パラメータは、例えば標的化合物がポリペプチド又はそのコンジュゲート若しくは複合体である場合、免疫測定法、例えばELISAによって決定され得る。濃度パラメータは、直接アッセイ、すなわち、標的化合物の特性又は標的化合物が属する化合物の化学クラスの特性を直接決定するアッセイにおいて、又は間接アッセイ、すなわち、検出剤によって誘導された、標的化合物の特性又は標的化合物が属する化合物の化学クラスの特性を検出するアッセイにおいて、決定され得る。よって、標的化合物がポリペプチドである場合、濃度パラメータは、直接アッセイ、すなわち、ポリペプチドの特性を直接決定するアッセイにおいて、又は間接アッセイ、すなわち、検出剤によって誘導されたポリペプチドの特性を検出するアッセイにおいて、決定され得る。間接タンパク質アッセイは、特に、Lowryアッセイ、Bradfordアッセイ、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ、又は当業者によって適切とみなされる任意の他の方法を含む。一実施形態では、濃度パラメータは、インラインで決定され、特に、フロースルー測定の形態で決定される。よって、一実施形態では、濃度パラメータは、直接アッセイにおいて決定され、一実施形態では直接測光アッセイにおいて決定される。一実施形態では、濃度パラメータは、溶液中の標的化合物の吸収、吸光、又は蛍光である。一実施形態では、標的化合物はポリペプチドであり、濃度パラメータは、280nm、235nm、及び/又は205nm、さらなる実施形態では280nmでの吸収である。
用語「核磁気共鳴(NMR)」は、当業者によって理解される。したがって、用語「核磁気共鳴パラメータ」(「NMRパラメータ」と略される)は、原則として、サンプル、特に、本明細書の他の場所に明記されるような水溶液又は画分に、核磁気共鳴測定を適用することによって、及び核磁気スピン緩和を示すことによって決定することができる任意のパラメータに関する。一実施形態では、NMRパラメータは、水プロトンNMR(1H2O NMR)から誘導可能なパラメータである。一実施形態では、NMRパラメータは、NMR測定によって決定された、緩和時間又は緩和速度を含むか又は緩和時間又は緩和速度であり、一実施形態では、1H2O NMR測定において決定された、緩和時間又は緩和速度を含むか又は緩和時間又は緩和速度である。さらなる実施形態では、NMRパラメータは、核磁気スピン横緩和時間T2及び核磁気スピン横緩和速度R2のうちの少なくとも1つを含むか又はそれであり、さらなる実施形態では、NMRパラメータは、溶液における又はその画分における水の核磁気スピン横緩和、特に溶液における又はその画分における水のプロトンの核磁気スピン横緩和を示す。当業者が理解するように、緩和時間Tは、対応する緩和速度Rと相互関係がある。つまりT=1/Rである。一実施形態では、NMRパラメータは、NMR測定において決定された、横緩和時間(T2)又は横緩和速度(R2)であり、一実施形態では、1H2O NMR測定において決定された、横緩和時間(T2)又は横緩和速度(R2)であり、すなわち、一実施形態では、水プロトンの横緩和時間(T2)又は水プロトンの横緩和速度(R2)である。一実施形態では、決定中の磁界の強さは、0.1Tから24T、一実施形態では0.2Tから10T、一実施形態では0.3Tから5T、さらなる実施形態では0.4Tから2T、さらなる実施形態では約0.5T、さらなる実施形態では0.5Tである。一実施形態では、共振周波数は、5MHzから500MHz、一実施形態では7.5MHzから200MHz、一実施形態では10MHzから100MHz、さらなる実施形態では15MHzから50MHz、さらなる実施形態では約20MHz、さらなる実施形態では20MHzである。
一実施形態では、濃度パラメータとNMRパラメータは、非同一であり、よって、一実施形態では、濃度パラメータは、水プロトンの横緩和時間T2ではなく、且つ/又は水プロトンの横緩和速度R2ではなく、さらなる実施形態では、濃度パラメータは、本明細書で上に明記されるような水の核磁気スピン横緩和を示すNMRパラメータではない。
「測定を適用する」及び「決定する」という用語は、当業者には、関連パラメータの値、特に濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータを決定することに関すると理解される。よって、さらなるパラメータ、例えば標的化合物の濃度、温度、pH、イオン濃度などのうちの1つ又は複数のさらなるパラメータが、追加で検出される場合がある。pH(プロトン選択性電極を介して)及びイオン濃度(導電性の測定により)を決定するための方法は、当業者に知られている。一実施形態では、決定はオフライン決定であり、よって、一実施形態では、画分又はそのサブポーションは、測定デバイスに移送される。決定が間接アッセイにおいて実施される場合、サンプルのサブポーションは、測定前に1つ又は複数の検出試薬で前処理され得る。さらなる実施形態では、決定はインラインであり、すなわち、プロセスから画分又はそのサブポーションを除去する必要はない。さらなる実施形態では、決定は連続的なインライン決定であり、よって、一実施形態では、画分は、本明細書で上に明記されるようなウイルス画分である。よって、一実施形態では、画分は、液体の連続流として生成され、さらなる実施形態では、工程iii)及びiv)は、液体の連続流、例えば溶出液で継続して実施される。一実施形態では、濃度パラメータ、NMRパラメータ、及び/又は任意選択的に決定される他のパラメータは、フロースルーセル内で、特に、濃度パラメータの場合は、フロースルーキュベット内で決定される。パラメータは、同時に又は連続して決定されてもよく、一実施形態では連続して決定される。先に検討したように、各パラメータは、一実施形態では、本発明に従って定量的に又は半定量的に決定される。
本明細書で使用される場合、「標的パラメータ」という用語は、少なくとも1つの数学的及び/又は論理的操作によって濃度パラメータ及びNMRパラメータから決定されたパラメータに関する。一実施形態では、標的パラメータは、バイナリパラメータであり、すなわち、0若しくは1、又はyes若しくはnoといった、2つの可能な値のうちの1つを想定している。さらなる実施形態では、標的パラメータは、濃度パラメータ及びNMRパラメータの数値に基づく数値パラメータである。
一実施形態では、標的パラメータはバイナリパラメータである。一実施形態では、濃度パラメータが所与の閾値基準を満たすかどうか、例えば所与の低い光学吸収又は濃度値を超えるかどうかを決定し、NMRパラメータが所与の閾値基準を満たすかどうか、例えば所与の低いT2値を超えるかどうかを決定することにより、及び濃度パラメータとNMRパラメータのうちの少なくとも1つが閾値基準を満たさないすべての場合について第1のバイナリ値を、濃度パラメータとNMRパラメータの両方がそれぞれの閾値基準を満たす場合について第2のバイナリ値を使用することにより、標的パラメータの値が決定される。よって、そのような場合、標的パラメータは、濃度パラメータとNMRパラメータの少なくとも1つが閾値基準を満たさない画分についてプール=Noに設定され得、濃度パラメータ及びNMRパラメータの両方がそれぞれの閾値基準を満たす画分についてプール=YESと設定され得る。
さらなる実施形態では、標的パラメータは、濃度パラメータ及びNMRパラメータの値に基づいて算出された数値パラメータである。原則として、標的パラメータは、濃度パラメータによって決定されるように標的化合物の濃度が高く、NMRパラメータによって決定されるように不要な副生成物の濃度が低い場合、計算の結果は決定的に異なることを確実にする任意の数学的方法によって算出され得る。一実施形態では、濃度パラメータは、標的化合物の濃度に正比例するように数学的に変換され、NMRパラメータは、不要な副生成物の濃度に間接的に比例するように数学的に変換される。よって、一実施形態では、例えば、標的化合物がポリペプチドであり、不要な副生成物がその凝集体である場合、濃度パラメータは、例えば280nmでの、吸収であり、NMRパラメータは、本明細書で上に明記されるような水プロトンNMR T2値である。そのような場合、標的パラメータは、一実施形態では、濃度パラメータ及びNMRパラメータの積として算出される。当業者が理解するように、さらなる計算、及び倍率などの追加のパラメータが、当業者に適切とみなされる標的パラメータの計算に使用され得る。特に、一実施形態では、濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータは、例えば決定されたすべての値を、すべての画分で決定された最高値に対して正規化することによって、0と1の間の値に正規化される。当業者が理解するように、濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータはまた、特に画分のライブモニタリングを使用する用途において、非正規化され得る。さらに、一実施形態では、濃度パラメータは、標的化合物の濃度によって引き起こされたものではない変化、例えばバッファー効果に対して補正され、NMRパラメータは、不要な生成物によって引き起こされたものではない変化、特にバッファー効果に対して補正され、これは、一実施形態では、pHの変化及び/又はイオン濃度の変化によって引き起こされ得る。一実施形態では、このような補正は、標的化合物が存在しない場合、又は水溶液がない場合でも、並行補正又は前補正を実行することによって提供される。一実施形態では、このような補正は、本明細書中の実施例に示されるように実施される。よって、一実施形態では、標的パラメータは、濃度パラメータ及びNMRパラメータの積として算出され、ここで、積の値は正規化されていてもよく、さらなる実施形態では、標的パラメータは、正規化された濃度パラメータ及び正規化されたNMRパラメータの積として算出される。さらなる実施形態では、標的パラメータは、塩及び/又はpH効果について補正された、濃度パラメータ(正規化されていてもよい)及びNMRパラメータ(正規化されていてもよい)の積として算出される。よって、一実施形態では、標的パラメータは、横緩和時間(T2)である、濃度パラメータ及びNMRパラメータに正比例し、一実施形態では、横緩和時間(T2)である、濃度パラメータ及びNMRパラメータの積に正比例する。
一実施形態では、方法は、標的パラメータを閾値と比較するさらなる工程を含む。「閾値」という用語は、当業者に理解され、本明細書の教示を考慮すると、当業者は適切な閾値を確立することができる。閾値は、標的パラメータを算出するのに使用される特定の式に依拠することになり、一実施形態では、当業者によって標的化合物の必要な収率及び/又は純度を達成するように調整されることになる。よって、所与の標的化合物について、適切な閾値の実験的な決定が必要とされ得る。
一実施形態では、方法は、vi)標的化合物を含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定することのさらなる工程を含む。一実施形態では、前記同定することは、デジタル標的パラメータが、それぞれのサンプルが所望の純度を有することを示すかどうかを決定することを含むか、又は、調査中のサンプルについて、決定された標的パラメータの値が標的化合物を所望の純度で含む画分を示すかどうかを決定することを含む。上記から理解されるように、これは、一実施形態では、画分について決定された標的パラメータの値を閾値と比較することにより達成される。一実施形態では、画分は、標的パラメータの値が閾値と少なくとも等しい場合に、標的化合物を所望の純度で含むと同定される。
「純度」という用語は、本明細書では、その従来の意味で、調製物、溶液、又は画分中に非標的化合物の成分がないことについての尺度として使用される。一実施形態では、純度は、少なくとも50%の純度、一実施形態では少なくとも75%の純度、一実施形態では少なくとも90%の純度、一実施形態では少なくとも95%の純度、さらなる実施形態では少なくとも98%の純度、さらなる実施形態では少なくとも99%の純度である。一実施形態では、本明細書で使用される場合の純度という用語は、絶対純度に関し、すなわち、一実施形態では溶媒を除き、非標的化合物成分のいずれも存在しないことの尺度であり、さらなる実施形態では、純度という用語は、相対純度、すなわち、特定の非標的化合物成分が存在しないことにも関係し得る。すなわち、一実施形態では、ポリペプチドである標的化合物の純度は、他のポリペプチド、一実施形態では特定のサイズ及び/又は質量基準を満たす他のポリペプチドが存在しないことの尺度として示され得る。また、一実施形態では、純度という用語は、例えば、標的化合物が、ポリペプチド、前記ポリペプチドの宿主細胞タンパク質、凝集体、断片、及び/又は分解生成物である場合、さらなる実施形態では前記ポリペプチドの凝集体、断片、及び/又は分解生成物である場合、標的化合物と同様であるが同一ではない標的化合物が存在しないことの尺度として使用される。
さらなる実施形態では、方法は、vii)標的化合物を含む画分のうちの少なくとも2つを組み合わせること、一実施形態では、標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて組み合わせることの工程をさらに含む。一実施形態では、少なくとも2つ、さらなる実施形態では少なくとも3つの画分が組み合わされる。さらなる実施形態では、標的化合物を所望の純度で含むと決定されたすべての画分は組み合わされ、さらなる実施形態では、例えば本明細書の他の場所に明記されるような閾値に少なくとも等しい、所与の標的条件を満たすすべての画分は組み合わされる。理解されるように、組み合わせることはまた、非同一の純度の別個のプール、例えば実質的に純粋な標的合物の1つのプールと、純度の低い第2のプール、を確立することを含み得る。一実施形態では、方法は、標的パラメータに基づいて、画分のうちの2つ以上を、自動的に分配すること、割り当てること、又は組み合わせることのうちの少なくとも1つを含む。特に、実施形態では、標的パラメータに基づいて制御される、自動的に制御された液体分配要素、特に自動バルブが使用される。
有利には、濃度測定とNMR測定の組み合わせを使用して、化合物の精製、特に、標的化合物と同様の特性を有する化合物、例えば凝集体の除去を支援することができることが、本発明の根底にある研究で発見された。また有利には、DNAが負荷されたAAV粒子の画分/割合/濃度は、水プロトンNMR(1H2O NMR)によって、DNAが負荷されたAAV粒子と空のAAV粒子とを含む水溶液における核磁気スピン横緩和時間T2と相関すること、及び、この相関関係は、タンパク質濃度の測定と組み合わせて、充填されたカプシドからの空のカプシドの分離の検出に使用することができることが発見された。
上記の定義は、必要な変更を加えて以下に適用される。以下のさらなる追加の定義及び説明も、必要な変更を加えて本明細書に記載されるすべての実施形態に適用される。
本発明は、AAV粒子を生成すること、AAV粒子を精製すること、及びAAV粒子の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、本明細書で上に明記されるような方法の使用にも関する。
本発明は、本発明の方法によって生成されるか又は生成可能な標的化合物の調製にも関する。
本発明は、さらに、
a)標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイスと、
b)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイスと、
c)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定するように構成された核磁気共鳴(NMR)測定デバイスであって、核磁気共鳴パラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、核磁気共鳴(NMR)測定デバイスと、
d)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイスと
を含む分離システムに関する。
a)標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイスと、
b)前記画分の少なくとも一部における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイスと、
c)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定するように構成された核磁気共鳴(NMR)測定デバイスであって、核磁気共鳴パラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気スピン緩和を示す、核磁気共鳴(NMR)測定デバイスと、
d)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイスと
を含む分離システムに関する。
本明細書で使用される場合、「システム」という用語は、互いに作用可能に連結されている示された手段の集合に関する。前記手段は、単一のシステムで実装されてもよく、又は互いに作用可能に連結されている物理的に分離されたデバイスであってもよい。一実施形態では、システムは、水溶液に本明細書で上に明記されるような分離工程を実施するように、複数の画分を提供するように、濃度パラメータを決定するように、NMRパラメータを決定するように、及び画分の少なくとも一部における標的パラメータを決定するように適合される。一実施形態では、システムは、一実施形態では少なくとも標的パラメータを画分の少なくとも一部に割り当てる順序付けされた出力で、評価デバイスによって実施された決定の結果を出力する出力デバイスをさらに含む。一実施形態では、前もって明記された標的基準を満たす、特に、前もって定義された閾値に少なくとも等しい標的パラメータを少なくとも有する、プールされた画分の調製物を提供するように、さらに適合される。一実施形態では、システムは、液体分配要素、一実施形態ではプーリングデバイス又は分配デバイスをさらに含む。よって、一実施形態では、システムは、標的化合物を含む画分のうちの少なくとも2つを組み合わせるためのプーリングデバイス、及び/又は工程d)において決定された標的パラメータの値を出力する出力デバイスをさらに含む。さらなる実施形態では、システムは、画分を別個の容器内へ分配するように構成された分配デバイスを含む。一実施形態では、システムは、特に電子形態で、システムのデバイスによって提供されたデータ、ユーザ入力によって提供されたデータ、特に1つ又は複数の閾値、及び/又は分析を実施するための命令、特に本明細書で上に明記されるようなアルゴリズムを実施するための機械読み取り可能命令を記憶するように構成された、データ記憶デバイスをさらに含む。当業者に理解されるように、前記データ記憶デバイスは、分離デバイス、濃度決定デバイス、及び/又はNMR測定デバイスの一部であってもよく、且つ/又はシステムの他のデバイスに作用可能に連結したスタンドアロンデータ記憶デバイスであってもよい。
本明細書で使用される場合、「分離デバイス」という用語は、水溶液に分離工程を適用し、それにより水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された任意のデバイスに関する。適切な分離工程は本明細書で上に記載されてきた。したがって、適切な分離デバイスは、特に適切な固相を含むクロマトグラフィーカラムを含む。当業者に理解されるように、分離デバイスは、当該技術分野では通常のさらなるデバイス、一実施形態では1つまたは複数のポンプ、接続チューブ、サンプルアプリケーション機器、加熱及び/又は冷却ユニット、圧力センサなどを含み得る。
本明細書で使用される場合、「濃度決定デバイス」という用語は、本明細書で上に明記されるような濃度パラメータを決定するように構成された、ありとあらゆるデバイスを含む。上から理解されるように、標的化合物の濃度を決定する特定の方法は、特に標的化合物の化学的性質に依拠する。一実施形態では、濃度決定デバイスは、インライン測定用に構成されており、さらなる実施形態では、連続インライン測定用に構成されている。よって、一実施形態では、濃度決定デバイスは、フロースルー測定セルを含む。一実施形態では、濃度は測光的に決定され、濃度決定デバイスはフォトセル及び光源を含む。一実施形態では、濃度決定デバイスは、光度計であり、一実施形態では280nmでの測定用に構成された光度計である。適切なデバイスが当該技術分野で知られている。
本明細書で使用される場合、「核磁気共鳴測定デバイス」及び「NMR測定デバイス」という用語は、水溶液又は画分にNMR測定を適用することによりNMRパラメータを決定するように構成された、ありとあらゆるデバイスを等しく含む。一実施形態では、NMR測定デバイスは、核磁気スピン緩和値、一実施形態では、画分の少なくとも一部における水プロトン核磁気スピン緩和値の測定を実施するように構成されたデバイスである。一実施形態では、NMR測定デバイスは、インライン測定用に構成されており、さらなる実施形態では、連続インライン測定用に構成されている。適切なデバイスは、当該技術分野で、例えば、Metz & Maeder(2008),Int J Pharmaceutics 364:170から、及びTaraban et al.(2017),Anal Chem 89:5494,and Taraban et al.(2019),7th Annual PANIC Conference,Poster presentation P35:「Water Flow-NMR-A Prospective Contact-Free In-Line Analytical Tool for Continuous Biomanufacturing」から知られている。
本明細書で使用される場合、「評価デバイス」という用語は、濃度決定デバイスによって決定された濃度パラメータと、NMR測定デバイスによって決定されたNMRパラメータとに、本明細書に明記されるようなアルゴリズムのうちの少なくとも1つを適用するデバイスに関する。よって、一実施形態では、評価デバイスは、少なくとも1つの画分について標的パラメータを決定するように適合されている。さらなる実施形態では、評価デバイスは、標的パラメータを本明細書で上に明記されるような閾値と比較するように構成されている。一実施形態では、評価デバイスは、少なくとも1つの画分の標的パラメータの値及び/又は標的パラメータの前記値を閾値と比較した結果を印刷するために必要なすべての計算及び評価を実施するように適合されている。一実施形態では、評価デバイスは、データ処理デバイス、好ましくはマイクロプロセッサを含む。
本発明は、標的化合物を生成すること、標的化合物を精製すること、及び標的化合物の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、本発明によるシステム及び/又は本発明による方法の使用にも関する。
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、本明細書で上に明記されるような標的化合物の純度を低下させるすべての化合物に関する。よって、不純物は、一実施形態では、生成物に特異的な副生成物、宿主細胞タンパク質副生成物、不要な化学修飾を含む及び/又は非コンジュゲート化合物などの所望の化学修飾を欠く標的化合物(例えば、LNAコンジュゲーションを欠く抗体)、及び/又は本明細書で上に明記されるような凝集体及び他の誘導体などの物理的に修飾された標的化合物である。
本発明は、濃度決定デバイス及び/又は本発明による方法に従って水溶液中の標的化合物を分離するための核磁気共鳴測定デバイスの使用にさらに関する。
本発明は、命令を含むコンピュータプログラム製品であって、命令が、コンピュータ、濃度決定デバイス、及び核磁気共鳴(NMR)測定デバイスを含む適切なシステムで実行されると、少なくとも以下の工程:
I)標的化合物を含む水溶液の少なくとも1つの画分における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定すること、
II)前記少なくとも1つの画分にNMR測定を適用することによって核磁気共鳴パラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記少なくとも1つの画分における核磁気スピン緩和を示す、核磁気共鳴パラメータを決定すること、並びに
III)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記少なくとも1つの画分の標的パラメータを決定すること
を実施させる、コンピュータプログラム製品にも関する。
I)標的化合物を含む水溶液の少なくとも1つの画分における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定すること、
II)前記少なくとも1つの画分にNMR測定を適用することによって核磁気共鳴パラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記少なくとも1つの画分における核磁気スピン緩和を示す、核磁気共鳴パラメータを決定すること、並びに
III)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記少なくとも1つの画分の標的パラメータを決定すること
を実施させる、コンピュータプログラム製品にも関する。
本明細書でさらに開示及び提案されるものは、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されるときに本明細書に含まれる実施形態のうちの1つ又は複数において本発明による方法を実施するためのコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラムである。具体的には、コンピュータプログラムは、コンピュータ可読データキャリアに記憶され得る。よって、具体的には、上に示された方法工程I)からIII)のうちの1つ、複数、又はすべてでさえ、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用して、好ましくはコンピュータプログラムを使用して、実施され得る。
本明細書でさらに開示及び提案されるものは、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されるときに本明細書に含まれる実施形態のうちの1つ又は複数において本発明による方法を実施するためにプログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品である。具体的には、コンピュータコード手段は、コンピュータ可読データキャリアに記憶され得る。
本明細書でさらに開示及び提案されるものは、記憶されたデータ構造を有するデータキャリアであり、これは、コンピュータ又はコンピュータネットワーク内、例えば、ワーキングメモリ又はコンピュータ若しくはコンピュータネットワークのメインメモリ内にロードした後に、本明細書で開示される実施形態のうちの1つ又は複数による方法を実行し得る。
本明細書でさらに開示及び提案されるものは、プログラムがコンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されると、本明細書に開示する実施形態のうちの1つ又は複数による方法を実施するために、機械可読キャリアに記憶されたプログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品である。本明細書で使用される場合、コンピュータプログラム製品とは、取引可能な製品としてのプログラムを指す。製品は、一般に、紙のフォーマットなどの任意のフォーマットで、又はコンピュータ可読データキャリア上に存在し得る。具体的には、コンピュータプログラム製品は、データネットワークにわたって分布し得る。
最後に、本明細書で開示及び提案されるものは、本明細書に開示される実施形態のうちの1つ又は複数による方法を実施するための、コンピュータシステム又はコンピュータネットワークによって読み取り可能な命令を含む、変調データシグナルである。
本発明のコンピュータにより実装される態様を参照すると、本明細書に開示される実施形態のうちの1つ又は複数による方法の方法工程のうちの1つ又は複数、あるいは方法工程のすべてでさえ、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用して実施され得る。よって、概して、データの提供及び/又は操作を含む方法工程のいずれかは、コンピュータ又はコンピュータネットワークを使用して実施され得る。概して、これらの方法工程は、典型的には、サンプルの提供及び/又は実際の測定を実施する特定の態様など、手作業を必要とする方法工程を除いて、方法工程のいずれかを含み得る。
具体的には、本明細書でさらに開示されるものは、
- 少なくとも1つのプロセッサを含むコンピュータ又はコンピュータネットワークであって、プロセッサが本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータ又はコンピュータネットワークと、
- コンピュータによってロード可能なデータ構造であって、コンピュータ上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータによってロード可能なデータ構造と、
- コンピュータプログラムであって、コンピュータ上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータプログラムと、
- コンピュータプログラムであって、コンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するためのプログラム手段を含む、コンピュータプログラムと、
- 上述の実施形態によるプログラム手段を含むコンピュータプログラムであって、コンピュータで読み取り可能な記憶媒体上に記憶される、コンピュータプログラムと、
- 記憶媒体であって、データ構造が記憶媒体上に記憶され、データ構造が、コンピュータの若しくはコンピュータネットワークのメインメモリ及び/又はワーキングメモリ内にロードされた後に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、記憶媒体と、
- プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品であって、プログラムコード手段がコンピュータ上で又はコンピュータネットワーク上で実行される場合、プログラムコード手段が、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するために、記憶媒体上に記憶され得るか又は記憶される、コンピュータプログラム製品と
である。
- 少なくとも1つのプロセッサを含むコンピュータ又はコンピュータネットワークであって、プロセッサが本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータ又はコンピュータネットワークと、
- コンピュータによってロード可能なデータ構造であって、コンピュータ上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータによってロード可能なデータ構造と、
- コンピュータプログラムであって、コンピュータ上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、コンピュータプログラムと、
- コンピュータプログラムであって、コンピュータ又はコンピュータネットワーク上で実行されている間に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するためのプログラム手段を含む、コンピュータプログラムと、
- 上述の実施形態によるプログラム手段を含むコンピュータプログラムであって、コンピュータで読み取り可能な記憶媒体上に記憶される、コンピュータプログラムと、
- 記憶媒体であって、データ構造が記憶媒体上に記憶され、データ構造が、コンピュータの若しくはコンピュータネットワークのメインメモリ及び/又はワーキングメモリ内にロードされた後に、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するように適合されている、記憶媒体と、
- プログラムコード手段を有するコンピュータプログラム製品であって、プログラムコード手段がコンピュータ上で又はコンピュータネットワーク上で実行される場合、プログラムコード手段が、本明細書に記載される実施形態のうちの1つによる方法を実施するために、記憶媒体上に記憶され得るか又は記憶される、コンピュータプログラム製品と
である。
本発明は、本明細書に記載される分離方法によって予め確立された、対応する濃度パラメータ値、NMRパラメータ値、及び/又は標的パラメータ値に割り当てられた画分の数を含む、一実施形態ではデータキャリアに明白に埋め込まれた、データベースにも関する。本発明は、システム、本明細書で上に明記されるような一実施形態では、上記のデータベースをシステムにも関し、前記システムは、一実施形態では、前記データベースから濃度パラメータ値、NMRパラメータ値、及び標的パラメータ値のうちの少なくとも1つを得るために適合されている。
当業者に理解されるように、データベースは、本明細書に明記されるような分離方法を実施すること及び示されたパラメータの対応する値と一緒に画分の数を記憶することにより確立され得る。よって、分離方法が同じ又は本質的に同じ条件下で繰り返される場合、方法に明記されるように3つのパラメータすべてを決定する必要はなく、データベースから前記パラメータのうちの1つ又は複数を読み取ることができる場合がある。よって、原則として、分離方法が同じ又は本質的に同じ条件下で繰り返される場合、濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータを決定することなく、データベースから標的パラメータを読み取ることができるか、又はデータベースから濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータを読み取ることができる場合がある。一実施形態では、濃度パラメータ及びNMRパラメータのうちの少なくとも1つ、一実施形態では濃度パラメータは、分離方法での分離が実際に同じであることを確認するために決定される。
本発明は、透析濾過によって溶液中の標的化合物の濃度を上昇させるための方法であって、以下:
A)前記溶液における又はその画分における経時的な核磁気共鳴パラメータ(NMRパラメータ)の第1の勾配を決定すること、
B)前記溶液における又はその画分における経時的な前記NMRパラメータの第2の勾配を決定すること、並びに
C)前記NMRパラメータの前記第2の勾配の値が、前記NMRパラメータの前記第1の勾配の値から少なくとも10%、一実施形態では少なくとも20%、さらなる実施形態では少なくとも30%外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び/又は撹拌速度を増加させること
を含む方法にも関する。
A)前記溶液における又はその画分における経時的な核磁気共鳴パラメータ(NMRパラメータ)の第1の勾配を決定すること、
B)前記溶液における又はその画分における経時的な前記NMRパラメータの第2の勾配を決定すること、並びに
C)前記NMRパラメータの前記第2の勾配の値が、前記NMRパラメータの前記第1の勾配の値から少なくとも10%、一実施形態では少なくとも20%、さらなる実施形態では少なくとも30%外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び/又は撹拌速度を増加させること
を含む方法にも関する。
標的化合物の濃度を上昇させるための方法は、in vitro法であり、明記されたものに加えて工程を含み得る。
「溶液中の標的化合物の濃度を上昇させる」は、という用語は、通常の意味で使用され、手順開始前の濃度と比較して、手順後の標的化合物の濃度を高くする任意の手順に関する。一実施形態では、濃度上昇は、1.25倍から250倍、一実施形態では1.5倍から125倍、さらなる実施形態では2倍から50倍の範囲にある。一実施形態では、標的化合物はポリペプチドであり、出発濃度は、少なくとも0.5mg/ml、一実施形態では少なくとも1mg/ml、さらなる実施形態では少なくとも2mg/ml、さらなる実施形態では少なくとも5mg/mlである。
「透析濾過」という用語は、当業者に知られている。一実施形態では、透析濾過は限外濾過であり、特に標的化合物がポリペプチドである場合、さらなる実施形態では接線流限外濾過である。「透析濾過速度」という用語はまた、濾液がフィルタ膜の上方に押し出される速度、又は透過液生成の速度、すなわち一実施形態では、時間単位あたりに生成される透過液の体積に関連することを当業者によって理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「透析濾過速度を低下させる」という用語は、一実施形態では本質的に0になるように、さらなる実施形態では0になるように、透析濾過速度を低下させるあらゆる手段を含む。このような手段は、例えば、濾過膜の残留液側の圧力を低下させ、及び/又は濾過膜の濾過生成物側の圧力を上昇させ得る。一実施形態では、少なくとも一時的に透析濾過速度を低下させることは、少なくとも5分間、一実施形態では少なくとも15分間透析濾過を中断することを含む。本明細書で使用される場合、「撹拌速度を増加させる」という用語は、残留液側の濾過膜に平行な溶液の流れを増加させる、及び/又は残留液内の標的化合物の再分配を増加させるすべての手段を含む。
本明細書で使用される場合、「経時的なNMRパラメータの勾配」という用語は、溶液における経時的なNMRパラメータの変化に関する。一実施形態では、NMRパラメータは、NMRスピン緩和パラメータ、一実施形態では本明細書で上に明記されるような水プロトンNMRパラメータである。よって、一実施形態では、NMRパラメータは、NMR測定において決定された、横緩和時間(T2)又は横緩和速度(R2)であり、一実施形態では、1H2O NMR測定において決定された、横緩和時間(T2)又は横緩和速度(R2)であり、すなわち、一実施形態では、水プロトンの横緩和時間(T2)又は水プロトンの横緩和速度(R2)である。
標的化合物の濃度を上昇させるための方法によれば、NMRパラメータの少なくとも2つの勾配が決定される。当業者に理解されるように、前記第1の勾配及び前記第2の勾配は、一実施形態では、同じNMRパラメータを決定することにより、又は比較のために数学的に相互変換することができる2つのNMRパラメータを決定することにより、確立される。また理解されるように、第1及び第2の勾配と同一である必要はない勾配を決定する期間、一実施形態では、前記NMRパラメータの第1の勾配を決定する期間は、前記NMRパラメータの第2の勾配を決定する期間と本質的に同一であり、一実施形態では最大5分間、一実施形態では最大2分間、さらなる実施形態では最大1分間である。一実施形態では、前記NMRパラメータの勾配は、繰り返し決定され、前記NMRパラメータの、最後に決定された勾配は、前記NMRパラメータの第2の勾配であり、一実施形態では、前記NMRパラメータの、最後から2番目に決定された勾配は、前記NMRパラメータの第1の勾配である。一実施形態では、第1及び第2の勾配は時間的に連続して決定され、一実施形態では、前記NMRパラメータの第2の勾配を決定するための期間は、前記NMRパラメータの第1の勾配を決定するための期間の直後に続く。よって、一実施形態では、前記NMRパラメータの勾配は、連続的又は半連続的に決定される。
有利には、本発明の根底にある研究において、透析濾過プロセスにおけるポリペプチドの凝集は、示されたNMRパラメータの測定を介して非常に早期に検出され得ることがわかった。驚くべきことに、凝集の開始はNMRパラメータのかなり突然の変化によって検出できることがわかった。
要約し、さらに可能な実施形態を除外することなく、以下の実施形態を想定することができる。
実施形態1.i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、
ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
iii)前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、
v)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む、分離方法。
ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
iii)前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における核磁気共鳴スピン緩和を示す、NMRパラメータを決定することと、
v)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む、分離方法。
実施形態2.標的パラメータが、横緩和時間(T2)である、濃度パラメータ及びNMRパラメータに正比例し、一実施形態では、横緩和時間(T2)である、濃度パラメータ及びNMRパラメータの積に正比例する、実施態様1に記載の方法。
実施形態3.濃度パラメータ及びNMRパラメータが正規化される、実施形態1又は2に記載の方法。
実施形態4.標的パラメータが閾値と比較される、実施形態1から3のいずれか1つに記載の方法。
実施形態5.vi)前記標的化合物を含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること、一実施形態では、前記標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定すること
をさらに含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の方法。
をさらに含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の方法。
実施形態6.前記純度が、前記標的化合物の凝集体及び/又は分解生成物の非存在の程度である、実施形態1から5のいずれか1つに記載の方法。
実施形態7.vii)前記標的化合物を含む前記画分のうちの少なくとも2つを組み合わせること、一実施形態では、前記標的化合物を所望の純度で含む前記画分を、標的パラメータに基づいて組み合わせること
をさらに含む、実施形態5又は6に記載の方法。
をさらに含む、実施形態5又は6に記載の方法。
実施形態8.工程vii)において、標的パラメータが標的条件を満たす画分が組み合わされる、実施形態7に記載の方法。
実施形態9.工程vii)において、標的パラメータが閾値を超える画分、又は標的パラメータが少なくとも閾値と等しい画分が組み合わされる、実施形態8に記載の方法。
実施形態10.濃度パラメータと核磁気共鳴パラメータの一方又は両方がさらに前提条件に供され、前記標的化合物を含む前記画分を組み合わせることが、前提条件の実現に応じて実施される、実施形態5から9のいずれか1つに記載の方法。
実施形態11.前提条件が、濃度パラメータよりも小さいか又は濃度パラメータと少なくとも等しい、正規化された核磁気共鳴パラメータを含む、実施形態10に記載の方法。
実施形態12.標的パラメータに基づいて、前記画分のうちの2つ以上を、自動的に分配すること、割り当てること、又は組み合わせることのうちの少なくとも1つを含む、実施形態1から11のいずれか1つに記載の方法。
実施形態13.標的パラメータに基づいて制御される、自動的に制御された液体分配要素、特に自動バルブが使用される、実施形態12に記載の方法。
実施形態14.工程ii)において提供された前記画分の少なくとも一部が、異なる化学特性、一実施形態では異なるpH値及び/又は塩濃度を有し、工程iv)が、具体的には、異なる化学特性によって引き起こされるバックグラウンドについて補正することにより、異なる化学特性についてNMRパラメータを補正することを含む、実施形態1から13のいずれか1つに記載の方法。
実施形態15.前記標的化合物を含まない異なる化学特性を有する画分について測定されたバックグラウンドNMRパラメータの測定を含む、実施形態14に記載の方法。
実施形態16.NMRパラメータが、核磁気スピン横緩和時間T2及び核磁気スピン横緩和速度R2のうちの少なくとも1つを含む、実施形態1から15のいずれか1つに記載の方法。
実施形態17.NMRパラメータが、溶液における又はその画分における水の核磁気スピン横緩和、具体的には溶液における又はその画分における水のプロトンの核磁気スピン横緩和を示す、実施形態1から16のいずれか1つに記載の方法。
実施形態18.工程iii)が、生成物サンプルに光学的測定を、具体的には光吸収測定及び光透過測定のうちの少なくとも1つを、より具体的には、紫外線吸収測定及び紫外線透過測定のうちの1つ又は複数を適用することを含む、実施形態1から17のいずれか1つに記載の方法。
実施形態19.工程ii)の分離工程が、クロマトグラフィー分離、一実施形態ではサイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含み、前記画分がクロマトグラフィー分離の溶出液の画分である、実施形態1から18のいずれか1つに記載の方法。
実施形態20.前記画分が、異なるpH値及び/又は異なるイオン濃度を有する、実施形態1から19のいずれか1つに記載の方法。
実施形態21.連続インライン法である、実施形態1から20のいずれか1つに記載の方法。
実施形態22.工程ii)において、前記画分が液体の連続流として生成される、実施形態1から21のいずれか1つに記載の方法。
実施形態23.工程iii)及びiv)が液体の連続流で連続的に実施される、実施形態1から22のいずれか1つに記載の方法。
実施形態24.前記標的化合物が、一実施形態では(i)ポリペプチド、(ii)ポリヌクレオチド、(iii)(i)又は(ii)の1つについての複合体、及び(iv)(i)から(iii)のうちの1つについてのコンジュゲートからなる群から選択される化合物であり、一実施形態ではウイルスカプシド又はポリペプチドであり、さらなる実施形態では非凝集ポリペプチドである、実施形態1から23のいずれか1つに記載の方法。
実施形態25.前記標的化合物が、一実施形態では、ポリペプチドのモノマー、ポリペプチドのオリゴマー、ポリペプチドの凝集体、ポリペプチドの集塊、ポリペプチドのポリマー、ポリペプチドの断片のうちの少なくとも1つであり、一実施形態ではポリペプチドのモノマー又はオリゴマーである、実施形態1から24のいずれか1つに記載の方法。
実施形態26.前記標的化合物の濃度が、少なくとも1mg/mL、一実施形態では少なくとも5mg/mL、さらなる実施形態では少なくとも10mg/mL、さらなる実施形態では少なくとも20mg/mLである、実施形態24又は25に記載の方法。
実施形態27.a)標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイスと、
b)前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイスと、
c)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定するように構成されたNMR測定デバイスであって、核磁気共鳴パラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における、核磁気スピン緩和を、一実施形態では水のNMRスピン緩和を示す、NMR測定デバイスと、
d)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイスと
を含む、分離システム。
b)前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイスと、
c)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによってNMRパラメータを決定するように構成されたNMR測定デバイスであって、核磁気共鳴パラメータが、前記画分の前記少なくとも一部における、核磁気スピン緩和を、一実施形態では水のNMRスピン緩和を示す、NMR測定デバイスと、
d)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイスと
を含む、分離システム。
実施形態28.方法について言及している実施形態1から26のいずれか1つに記載の方法を実施するように構成されている、実施形態28に記載のシステム。
実施形態29.評価デバイスが、標的パラメータと閾値を比較するように構成されている、実施形態27及び28に記載のシステム。
実施形態30.e)前記標的化合物を含む前記画分のうちの少なくとも2つを組み合わせるための、液体分配要素、及び/又は
工程d)において決定された標的パラメータの値を出力する、出力デバイス
をさらに含む、実施形態27から29のいずれか1つに記載のシステム。
工程d)において決定された標的パラメータの値を出力する、出力デバイス
をさらに含む、実施形態27から29のいずれか1つに記載のシステム。
実施形態31.標的化合物を生成すること、標的化合物を精製すること、及び標的化合物の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、実施形態29若しくは30に記載のシステムの使用、及び/又は方法について言及している実施形態1から26のいずれか1つに記載の方法の使用。
実施形態32.方法について言及している実施形態1から26のいずれか1つに記載の方法に従って、水溶液中の標的化合物を分離するための、濃度決定デバイス及び/又は核磁気共鳴測定デバイスの使用。
実施形態33.命令を含むコンピュータプログラム製品であって、命令が、コンピュータ、濃度決定デバイス、及び核磁気共鳴(NMR)測定デバイスを含む適切なシステムで実行されると、少なくとも以下の工程:
I)標的化合物を含む水溶液の少なくとも1つの画分における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定すること、
II)前記少なくとも1つの画分にNMR測定を適用することによって核磁気共鳴パラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記少なくとも1つの画分における、核磁気スピン緩和、一実施形態では水のNMRスピン緩和を示す、核磁気共鳴パラメータを決定すること、並びに
III)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記少なくとも1つの画分の標的パラメータを決定すること
を実施させる、コンピュータプログラム製品。
I)標的化合物を含む水溶液の少なくとも1つの画分における標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定すること、
II)前記少なくとも1つの画分にNMR測定を適用することによって核磁気共鳴パラメータを決定することであって、NMRパラメータが、前記少なくとも1つの画分における、核磁気スピン緩和、一実施形態では水のNMRスピン緩和を示す、核磁気共鳴パラメータを決定すること、並びに
III)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記少なくとも1つの画分の標的パラメータを決定すること
を実施させる、コンピュータプログラム製品。
実施形態34.工程I)、II)、及び/又はIII)が、方法について言及している実施形態1から26のいずれか1つに記載の方法に従って実施される、実施形態33に記載のコンピュータプログラム。
実施形態35.方法について言及している実施形態1から26のいずれか1つに記載の方法の工程を含む、標的化合物の、特にポリペプチドの生成の方法。
実施形態36.方法について言及している実施形態1から26のいずれか1つに記載の方法によって生成されるか又は生成可能な標的化合物の調製物。
実施形態37.透析濾過によって溶液中の標的化合物の濃度を上昇させるための方法であって、以下:
A)前記溶液における又はその画分における経時的な核磁気共鳴パラメータ(NMRパラメータ)の第1の勾配を決定することであって、NMRパラメータが、溶液における、核磁気スピン緩和、一実施形態では水のNMRスピン緩和を示す、第1の勾配を決定すること、
B)前記溶液における又はその画分における経時的な前記NMRパラメータの第2の勾配を決定すること、並びに
C)前記NMRパラメータの前記第2の勾配の値が、前記NMRパラメータの前記第1の勾配の値から少なくとも10%、一実施形態では少なくとも20%、さらなる実施形態では少なくとも30%外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び/又は撹拌速度を増加させること
を含む、方法。
A)前記溶液における又はその画分における経時的な核磁気共鳴パラメータ(NMRパラメータ)の第1の勾配を決定することであって、NMRパラメータが、溶液における、核磁気スピン緩和、一実施形態では水のNMRスピン緩和を示す、第1の勾配を決定すること、
B)前記溶液における又はその画分における経時的な前記NMRパラメータの第2の勾配を決定すること、並びに
C)前記NMRパラメータの前記第2の勾配の値が、前記NMRパラメータの前記第1の勾配の値から少なくとも10%、一実施形態では少なくとも20%、さらなる実施形態では少なくとも30%外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び/又は撹拌速度を増加させること
を含む、方法。
実施形態38.前記NMRパラメータの第1の勾配を決定する期間が、前記NMRパラメータの第2の勾配を決定する期間と本質的に同一である、実施形態37に記載の方法。
実施形態39.前記NMRパラメータの第1及び/又は第2の勾配を決定する期間が、最大5分間、一実施形態では最大2分間、さらなる実施形態では最大1分間である、実施形態37及び38に記載の方法。
実施形態40.前記NMRパラメータの前記第1の勾配が、前記少なくとも1つのNMRパラメータの前記第2の勾配の前に決定される、実施形態37から39に記載に記載の方法。
実施形態41.前記NMRパラメータの勾配が繰り返し決定され、前記NMRパラメータの、最後に決定された勾配が、前記NMRパラメータの第2の勾配であり、一実施形態では、前記NMRパラメータの、最後から2番目に決定された勾配が、前記NMRパラメータの第1の勾配である、実施形態37から40に記載の方法。
実施形態42.前記NMRパラメータの勾配が、連続的又は半連続的に決定される、実施形態37から41に記載の方法。
実施形態43.前記少なくとも一時的に透析濾過速度を低下させることが、少なくとも5分間、一実施形態では少なくとも15分間、透析濾過を中断することを含む、実施形態37から42に記載の方法。
実施形態44:実施形態1から26のいずれか1つに記載の分離方法によって予め確立された、対応する濃度パラメータ値、NMRパラメータ値、及び/又は標的パラメータ値に割り当てられた画分の数を含む、一実施形態ではデータキャリアに明白に埋め込まれた、データベース。
実施形態45:実施形態27から30のいずれか1つに記載の実施形態において、実施形態44に記載のデータベースを含み、一実施形態では、前記データベースから濃度パラメータ値、NMRパラメータ値、及び標的パラメータ値のうちの少なくとも1つを得るように適合されている、分離システム。
実施形態46:前記標的化合物が、(i)PD-1に結合する抗体と、(ii)IL-2Rβγを通じてシグナル伝達するポリペプチド、特にIL-2ポリペプチド又はIL-15ポリペプチドとを含むイムノコンジュゲートである、実施形態1から45のいずれか1つに記載の主題。
実施形態47:IL-2ポリペプチドが変異IL-2ポリペプチドであり、変異IL-2ポリペプチドが、アミノ酸置換F42A、Y45A、及びL72G(ヒトIL-2配列の配列番号19に対する番号付け)を含むヒトIL-2分子である、実施形態46に記載の主題。
実施形態48:IL-2ポリペプチドが変異IL-2ポリペプチドであり、変異IL-2ポリペプチドが、アミノ酸置換F42A、Y45A、及びL72G(ヒトIL-2配列の配列番号19に対する番号付け)を含むヒトIL-2分子であり、抗体が、(a)配列番号1のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号2のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号3のアミノ酸配列を含むHVR-H3と、Kabat番号付けによる位置71-73で配列番号7のアミノ酸配列を含むFR-H3とを含む、重鎖可変領域(VH)、及び(b)配列番号4のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、実施形態46又は47に記載の主題。
実施形態49:IL-2ポリペプチドが変異IL-2ポリペプチドであり、変異IL-2ポリペプチドが、アミノ酸置換F42A、Y45A、及びL72G(ヒトIL-2配列の配列番号19に対する番号付け)を含むヒトIL-2分子であり、抗体が、(a)配列番号8のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む、重鎖可変領域(VH)、及び(b)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、配列番号13のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む、軽鎖可変領域(VL)を含む、実施形態46から48のいずれか1つに記載の主題。
実施形態50:IL-2ポリペプチドが変異IL-2ポリペプチドであり、変異IL-2ポリペプチドが、アミノ酸置換F42A、Y45A、及びL72G(ヒトIL-2配列の配列番号19に対する番号付け)を含むヒトIL-2分子であり、抗体が、(a)配列番号14のアミノ酸配列少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)、及び(b)配列番号15、配列番号16、配列番号17、及び配列番号18からなる群より選択されるアミノ酸配列と95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む、実施形態46から49のいずれか1つに記載の主題。
実施形態51:変異IL-2ポリペプチドが、アミノ酸置換T3A及び/又はアミノ酸置換C125Aをさらに含む、実施形態46から50のいずれか1つに記載の主題。
実施形態52:変異IL-2ポリペプチドが、配列番号20の配列を含む、実施形態47から51のいずれか1つに記載の主題。
実施形態53:イムノコンジュゲートが、1つ以下の変異IL-2ポリペプチドを含む、実施形態47から52のいずれか1つに記載の主題。
実施形態54:抗体が、第1及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む、実施形態46から53のいずれか1つに記載の主題。
実施形態55:Fcドメインが、IgGクラス、特にIgG1サブクラス、Fcドメインである、実施形態54に記載の主題。
実施形態56:FcドメインがヒトFcドメインである、実施形態54又は55に記載の主題。
実施形態57:抗体が、IgGクラス、特にIgG1サブクラス免疫グロブリンである、実施形態46から56のいずれか1つに記載の主題。
実施形態58:Fcドメインが、Fcドメインの第1のサブユニットと第2のサブユニットの会合を促す改変を含む、実施形態54から57のいずれか1つに記載の方法。
実施形態59:Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部の空洞内に配置可能な突起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部の突起が配置可能である空洞が生成される、実施形態54から58のいずれか1つに記載の方法。
実施形態60:Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、366位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、407位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており(Y407V)、任意選択的に366位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており(T366S)、368位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている(L368A)(Kabat EUインデックスによる番号付け)、実施形態54から59のいずれか1つに記載の主題。
実施形態61:Fcドメインの第1のサブユニットにおいてさらに、354位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている(S354C)か、又は356位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており(E356C)、Fcドメインの第2のサブユニットにおいてさらに、349位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる(Y349C)(Kabat EUインデックスによる番号付け)、実施形態60に記載の主題。
実施形態62:変異IL-2ポリペプチドが、そのアミノ末端アミノ酸で、場合によってはリンカーペプチドを通じて、Fcドメインのサブユニットのうちの1つ、特にFcドメインの第1のサブユニットの、カルボキシ末端アミノ酸に融合している、実施形態54から61のいずれか1つに記載の主題。
実施形態63:リンカーペプチドが、配列番号21のアミノ酸配列を有する、実施形態62に記載の主題。
実施形態64:Fcドメインが、Fc受容体、特にFcγ受容体への結合、及び/又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)を低減させる、1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、実施形態54から63のいずれか1つに記載の主題。
実施形態65:前記1つ又は複数のアミノ酸置換が、L234、L235、及びP329(Kabat EUインデックス番号付け)の群より選択される1つ又は複数の位置におけるものである、実施形態64に記載の方法。
実施形態66:Fcドメインの各サブユニットが、アミノ酸置換L234A、L235A、及びP329G(Kabat EUインデックス番号付け)を含む、実施形態54から65のいずれか1つに記載の主題。
実施形態67:配列番号22の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号23又は配列番号24の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号25の配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含む、実施形態46から66のいずれか1つに記載の主題。
実施形態68:リンカー配列によって結合されている、変異IL-2ポリペプチドと免疫グロブリン分子とから本質的になる、実施形態46から67のいずれか1つに記載の主題。
実施形態69:前記標的化合物が、(i)抗原に特異的に結合することができない免疫グロブリン分子と、(ii)野生型インターロイキン-2(IL-2)分子と比較して、中間親和性IL-2受容体に対する変異IL-2分子の親和性を低減させるアミノ酸変異を含む2つの変異IL-2分子であって、前記変異IL-2分子が配列番号30の配列を含む、2つの変異IL-2分子とを含む、融合タンパク質である、実施形態1から45のいずれか1つに記載の主題。
実施形態70:前記免疫グロブリン分子が、IgGクラス免疫グロブリン分子、特にIgG1サブクラス免疫グロブリン分子である、実施形態69に記載の主題。
実施形態71:前記免疫グロブリン分子がヒト免疫グロブリン分子である、実施形態69又は70に記載の主題。
実施形態72:前記免疫グロブリン分子が、ヒトVh3-23生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む、実施形態69から71のいずれか1つに記載の主題。
実施形態73:前記免疫グロブリン分子が、配列番号26の重鎖可変領域配列を含む、実施形態69から72のいずれか1つに記載の主題。
実施形態74:前記免疫グロブリン分子が、ヒトVk3-20生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む、実施形態69から73のいずれか1つに記載の主題。
実施形態75:前記免疫グロブリン分子が、配列番号27の軽鎖可変領域配列を含む、実施形態69から74のいずれか1つに記載の主題。
実施形態76:前記免疫グロブリン分子が、改変を伴わない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を低減させる改変を含む、実施形態65から75のいずれか1つに記載の主題。
実施形態77:前記Fc受容体が、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である、実施形態76に記載の主題。
実施形態78:前記Fc受容体が活性化Fc受容体である、実施形態76又は77に記載の主題。
実施形態79:前記Fc受容体が、FcγRll la(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRlla(CD32)、及びFcaRI(CD89)の群から選択される、実施形態76から78のいずれか1つに記載の主題。
実施形態80:前記Fc受容体が、FcγRllla、特にヒトFcγRlllaである、実施形態76から79のいずれか1つに記載の主題。
実施形態81:前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖の329位(EU番号付け)のアミノ酸置換を含む、実施形態69から80のいずれか1つに記載の主題。
実施形態82:前記アミノ酸置換がP329Gである、実施形態81に記載の主題。
実施形態83:前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖の234位及び235位(EU番号付け)のアミノ酸置換を含む、実施形態69から82のいずれか1つに記載の主題。
実施形態84:前記アミノ酸置換がL234A及びL235A(LALA)である、実施形態83に記載の主題。
実施形態85:前記免疫グロブリン分子が、免疫グロブリン重鎖においてアミノ酸置換L234A、L235A、及びP329G(番号付け)を含む、実施形態69から84のいずれか1つに記載の主題。
実施形態86:前記変異IL-2分子がそれぞれ、それぞれのN末端アミノ酸で、場合によってはペプチドリンカーを通じて、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖のうちの1つのC末端アミノ酸に融合している、実施形態69から85のいずれか1つに記載の主題。
実施形態87:前記変異IL-2分子がそれぞれ、ペプチドリンカーを通じて前記免疫グロブリン分子に融合している、実施形態69から86のいずれか1つに記載の主題。
実施形態88:前記ペプチドリンカーが、少なくとも10個、特に少なくとも15個の、アミノ酸を含む、実施形態87に記載の主題。
実施形態89:前記リンカーペプチドが、アミノ酸配列(G4Sh(配列番号31)を含む、実施形態87又は88に記載の主題。
実施形態90:融合タンパク質が、配列番号28及び配列番号29のポリペプチド配列を含む、実施形態69から89のいずれか1つに記載の主題。
実施形態91:前記標的化合物が二重特異性抗体である、実施形態1から45のいずれか1つに記載の主題。
実施形態92:前記標的化合物が、CD3と第2の抗原とに結合する二重特異性抗体である、実施形態91に記載の主題。
実施形態93:前記標的化合物が、CD3とCEAとに結合する二重特異性抗体である、実施形態91又は92に記載の主題。
実施形態94:前記標的化合物が、第1、第2、及び第3のFab分子と、2つのサブユニットで構成されたFcドメインとを含む二重特異性抗体である、実施形態91から93のいずれか1つに記載の主題。
実施形態95:Fcドメインが、IgG、具体的にはIgG1、より具体的にはヒトIgG1、Fcドメインである、実施形態94に記載の主題。
実施形態96:第1のFab分子が、C末端で第2のFab分子のN末端に融合し、第2のFab分子が、C末端でFcドメインのサブユニットのうちの一方のN末端に融合し、第3のFab分子が、C末端でFcドメインのサブユニットのうちの他方のN末端に融合している、実施形態94又は95に記載の主題。
実施形態97:第2のFab分子がCD3に結合し、第1及び第3のFab分子が第2の抗原に結合する、実施形態94から96のいずれか1つに記載の主題。
実施形態98:第2の抗原がCEAである、実施形態92から97のいずれか1つに記載の主題。
実施形態99:前記標的化合物がシビサタマブである、実施形態91から98のいずれか1つに記載の主題。
実施形態100:前記標的化合物が、ウイルス、又はウイルス様粒子である、実施形態1から45のいずれか1つに記載の主題。
実施形態101:前記標的化合物が、1つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、充填されたウイルス、又は充填されたVLPである、実施形態100に記載の主題。
実施形態102:前記分離工程が、空のウイルス粒子及び/又は空のVLPから、充填されたウイルス粒子及び/又は充填されたVLPを分離する工程である、実施形態100又は101に記載の主題。
実施形態103:濃度パラメータが、前記標的化合物の濃度に正比例する、実施形態1から102のいずれか1つに記載の主題。
実施形態104:濃度パラメータが、水プロトンの横緩和時間T2ではなく、水プロトンの横緩和速度R2ではなく、一実施形態では水プロトンの横緩和NMRパラメータではない、実施形態1から103のいずれか1つに記載の主題。
さらなる任意の特徴及び実施形態は、好ましくは従属請求項と併せて、実施形態の後続の説明においてより詳細に開示される。その中で、それぞれの任意の特徴は、当業者が理解するように、単独で、及び任意の実行可能な組み合わせで、実現され得る。本発明の範囲は、好ましい実施形態によって制限されない。実施形態は、図面に概略的に示されている。その中で、これらの図面の同一の参照番号は、同一又は機能的に同等の要素を指す。
実施形態の詳細な説明
実施例1:材料及び方法
抗体様タンパク質
実施例で使用される抗体様タンパク質(ALP)の概略が、図2に示されている。シビサタマブ(ALP1)は、WHO Drug Information(International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances),Recommended INN:List 80,2018,vol.32,no.3,p.438に記載されるように、がん胎児性抗原(CEA)及びCD3を標的とする2+1二重特異性抗体であり、IgG-IL2(ALP2)は、国際公開公報第2015/118016号A1に記載されるように、IgGと、それぞれ重鎖に融合した2つのIL-2ペプチドとの間の融合タンパク質である。PD1-IL2(ALP3)は、国際公開公報第2018/184964号A1に記載されるように、IL-2ペプチドにC末端融合した抗PD1抗体である。ALP4は、VH/VLドメインと金属錯体とに融合したIgG構造を含む2+1二重特異性融合タンパク質である。
抗体様タンパク質
実施例で使用される抗体様タンパク質(ALP)の概略が、図2に示されている。シビサタマブ(ALP1)は、WHO Drug Information(International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances),Recommended INN:List 80,2018,vol.32,no.3,p.438に記載されるように、がん胎児性抗原(CEA)及びCD3を標的とする2+1二重特異性抗体であり、IgG-IL2(ALP2)は、国際公開公報第2015/118016号A1に記載されるように、IgGと、それぞれ重鎖に融合した2つのIL-2ペプチドとの間の融合タンパク質である。PD1-IL2(ALP3)は、国際公開公報第2018/184964号A1に記載されるように、IL-2ペプチドにC末端融合した抗PD1抗体である。ALP4は、VH/VLドメインと金属錯体とに融合したIgG構造を含む2+1二重特異性融合タンパク質である。
NMR
横緩和速度(R2)又は時間(T2)は、Bruker minispec mq20分光計(20MHz;Bruker BioSpin GmbH,Rheinstetten、ドイツ)を用いて記録された。分光計には、0.47 T磁石及びH20-10-25AVGX4プローブが装備されていた。20℃でサンプル量900μlの各サンプルについて、少なくとも4回の取得が測定された。T2又はR2を決定するために、シグナル減衰を少なくとも5秒間追跡した。
横緩和速度(R2)又は時間(T2)は、Bruker minispec mq20分光計(20MHz;Bruker BioSpin GmbH,Rheinstetten、ドイツ)を用いて記録された。分光計には、0.47 T磁石及びH20-10-25AVGX4プローブが装備されていた。20℃でサンプル量900μlの各サンプルについて、少なくとも4回の取得が測定された。T2又はR2を決定するために、シグナル減衰を少なくとも5秒間追跡した。
タンパク質負荷溶液の調製
使用したタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞から発現された。発酵上清をMabSelect SuReカラム(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg、ドイツ)に適用し、pH<5の酸性バッファーで溶出した。溶出後、適量の1Mトリス溶液を加えることにより、タンパク質プールをpH5.0から5.5に調整した。
使用したタンパク質は、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞から発現された。発酵上清をMabSelect SuReカラム(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg、ドイツ)に適用し、pH<5の酸性バッファーで溶出した。溶出後、適量の1Mトリス溶液を加えることにより、タンパク質プールをpH5.0から5.5に調整した。
クロマトグラフィー
SEC
サイズ排除クロマトグラフィーの前に、10kDa又は30kDaのカットオフを有する限外濾過ディスクを備えたAmicon撹拌式セル(Merck KGaA,Darmstadt、ドイツ)を使用して、限外濾過により、タンパク質Aプールの濃度を、>20mg/mlに上昇させた。30mgから180mgのタンパク質A精製タンパク質サンプルを、Superdex 200 prepグレードカラム(カラム高さ60cm、直径1.6cm;GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg、ドイツ)に負荷することにより、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。20mM His/His-HCL、140mM NaCl、pH5.5中、1.6ml/分の流量で、クロマトグラフィーを実施した。溶出中、280nmでの吸収を記録し、画分を回収した。
SEC
サイズ排除クロマトグラフィーの前に、10kDa又は30kDaのカットオフを有する限外濾過ディスクを備えたAmicon撹拌式セル(Merck KGaA,Darmstadt、ドイツ)を使用して、限外濾過により、タンパク質Aプールの濃度を、>20mg/mlに上昇させた。30mgから180mgのタンパク質A精製タンパク質サンプルを、Superdex 200 prepグレードカラム(カラム高さ60cm、直径1.6cm;GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg、ドイツ)に負荷することにより、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。20mM His/His-HCL、140mM NaCl、pH5.5中、1.6ml/分の流量で、クロマトグラフィーを実施した。溶出中、280nmでの吸収を記録し、画分を回収した。
CEX
カチオン交換クロマトグラフィー(CEX)のために、25mg/mlと30mg/mlの間の負荷密度で、10ml Poros XSカラム(カラム高さ20cm、直径0.8;Thermo Fisher,Scientific,Waltham、マサチューセッツ州、米国)にタンパク質を負荷した。
カチオン交換クロマトグラフィー(CEX)のために、25mg/mlと30mg/mlの間の負荷密度で、10ml Poros XSカラム(カラム高さ20cm、直径0.8;Thermo Fisher,Scientific,Waltham、マサチューセッツ州、米国)にタンパク質を負荷した。
導電性勾配溶出については、カラムを40mM酢酸塩pH5.5で平衡化した。その後、タンパク質A精製タンパク質溶液を2.0ml/分で負荷し、3カラム体積(CV)の平衡化バッファーでカラムを洗浄した。結合したタンパク質を溶出するために、20又は15CV内でそれぞれ500又は750mMの酢酸塩勾配、及びpH5.5又は6.5で2.5ml/分の流速を使用した。溶出中、280nmでの吸着を記録し、画分を回収した。
pH勾配溶出については、20mMクエン酸塩、20mMリン酸ナトリウム、20mMトリス、pH5.0、及び50mMと100mMの間のNaCl濃度で、カラムを平衡化した。その後、タンパク質A精製タンパク質溶液を2.0ml/分で負荷し、5CV平衡化バッファーでカラムを洗浄した。結合したタンパク質を溶出するために、20から30CV内で5.0から8.5のpH勾配、及び2.5ml/分の流量を使用した。溶出中、280nmでの吸着を記録し、溶出液画分を回収した。
さらに、導電率及びpH勾配溶出のためにバッファーコントロールを実施した。これらの実施について、上記の手順を使用したが、カラムにはタンパク質を負荷しなかった。
分析的SEC
クロマトグラフィーのプール及び画分を分析的SECによって分析した。この目的のため、およそ25μg(ただし100μl以下)のタンパク質をTSKgel UP-SW3000カラム(Tosoh Bioscience,Griesheim、ドイツ)に注入して、200mMリン酸カリウム、250m塩化カリウム中、pH6.2、流量0.25ml/分で、アイソクラティッククロマトグラフィーに供した。Software Chromeleon 7(Thermo Fisher,Scientific,Waltham、マサチューセッツ州、米国)を用いて、280nmでの吸収に基づいて純度を算出した。
クロマトグラフィーのプール及び画分を分析的SECによって分析した。この目的のため、およそ25μg(ただし100μl以下)のタンパク質をTSKgel UP-SW3000カラム(Tosoh Bioscience,Griesheim、ドイツ)に注入して、200mMリン酸カリウム、250m塩化カリウム中、pH6.2、流量0.25ml/分で、アイソクラティッククロマトグラフィーに供した。Software Chromeleon 7(Thermo Fisher,Scientific,Waltham、マサチューセッツ州、米国)を用いて、280nmでの吸収に基づいて純度を算出した。
UF
400mlの容器及び30kDaのSartorius(Sartorius AG,Goettingen、ドイツ)膜を備えた手動ベンチトップデバイスを用いて限外濾過を行った。平衡化バッファーのpH及び導電性が一定になるまで、デバイスを0.5M NaOHで再生し、水でフラッシュし、対応するバッファーで平衡化した。続いて、平衡化バッファーをタンパク質溶液と交換した。1-1.2バールの圧力制御下で限外濾過を行った。既定の体積減少後に、サンプルを取った。タンパク質濃度、SE-HPLC、及びwNMR T2を各サンプルについて決定した。実験を2セット行った。1つはRTで、もう1つは人工的な応力条件下(50℃)であった。人工的な応力を適用して、特定の濃度での迅速なHMW形成を実行誘導した。
400mlの容器及び30kDaのSartorius(Sartorius AG,Goettingen、ドイツ)膜を備えた手動ベンチトップデバイスを用いて限外濾過を行った。平衡化バッファーのpH及び導電性が一定になるまで、デバイスを0.5M NaOHで再生し、水でフラッシュし、対応するバッファーで平衡化した。続いて、平衡化バッファーをタンパク質溶液と交換した。1-1.2バールの圧力制御下で限外濾過を行った。既定の体積減少後に、サンプルを取った。タンパク質濃度、SE-HPLC、及びwNMR T2を各サンプルについて決定した。実験を2セット行った。1つはRTで、もう1つは人工的な応力条件下(50℃)であった。人工的な応力を適用して、特定の濃度での迅速なHMW形成を実行誘導した。
実施例2
図1に示すように、分離システムでは、サンプル118は分離デバイス118に適用され、分離デバイス118は、LCカラム、膜、又はフィルタ、超遠心分離若しくは遠心分離ビーカー、限外濾過デバイス等であり得る。分離工程、及び液体分配要素120の手段により、画分122は、少なくとも2つの異なる組成物から形成される。画分の少なくとも一部又はそのアリコートでは、標的化合物の、又は標的化合物が属する標的化合物のクラスの濃度は、濃度決定デバイス112によって決定され、濃度決定デバイス112は、特に、光度計、例えばUV光度計であり得る。また、画分の少なくとも一部又はそのアリコートでは、NMRパラメータはNMR測定デバイス114によって決定され、NMR測定デバイス114は、特にベンチトップNMRデバイスであり得る。濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータの決定は、図1に示すように、液体分配要素120による画分の実際の形成の前に、例えばフロースルー測定によって実施され得るか、又は確立された画分又はそのアリコートにおける画分の形成の後に実施され得る。濃度パラメータの値及びNMRパラメータの値に基づいて、評価デバイス116は標的パラメータを決定する。
図1に示すように、分離システムでは、サンプル118は分離デバイス118に適用され、分離デバイス118は、LCカラム、膜、又はフィルタ、超遠心分離若しくは遠心分離ビーカー、限外濾過デバイス等であり得る。分離工程、及び液体分配要素120の手段により、画分122は、少なくとも2つの異なる組成物から形成される。画分の少なくとも一部又はそのアリコートでは、標的化合物の、又は標的化合物が属する標的化合物のクラスの濃度は、濃度決定デバイス112によって決定され、濃度決定デバイス112は、特に、光度計、例えばUV光度計であり得る。また、画分の少なくとも一部又はそのアリコートでは、NMRパラメータはNMR測定デバイス114によって決定され、NMR測定デバイス114は、特にベンチトップNMRデバイスであり得る。濃度パラメータ及び/又はNMRパラメータの決定は、図1に示すように、液体分配要素120による画分の実際の形成の前に、例えばフロースルー測定によって実施され得るか、又は確立された画分又はそのアリコートにおける画分の形成の後に実施され得る。濃度パラメータの値及びNMRパラメータの値に基づいて、評価デバイス116は標的パラメータを決定する。
実施例3
図3は、カチオンイオン交換クロマトグラフィーによる治療用抗体の精製における、溶出量に対するさまざまなパラメータの変化を表すグラフを示す。理解されるように、280nmでの吸収測定によるタンパク質濃度の標準的な測定(実線)は、広いピークを提供し、これは、どの画分が所望の単量体抗体を含むかを決定することを不可能にする。対照的に、T2及びc[タンパク質]の正規化された積を表すグラフ(短い破線)は、はるかに狭いピークを示し、これは、特に、望ましくない抗体の凝集体を排除している。
図3は、カチオンイオン交換クロマトグラフィーによる治療用抗体の精製における、溶出量に対するさまざまなパラメータの変化を表すグラフを示す。理解されるように、280nmでの吸収測定によるタンパク質濃度の標準的な測定(実線)は、広いピークを提供し、これは、どの画分が所望の単量体抗体を含むかを決定することを不可能にする。対照的に、T2及びc[タンパク質]の正規化された積を表すグラフ(短い破線)は、はるかに狭いピークを示し、これは、特に、望ましくない抗体の凝集体を排除している。
実施例4
酢酸塩又はpH勾配のいずれかを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによる、又はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるLC精製に、4つの異なる抗体様タンパク質(ALP、図2、表1)を適用した。クロマトグラフィーの後、c[タンパク質](UV測定)のみに従って、正規化されたT2のみに従って、又はT2及びc[タンパク質]に従って、画分をプールした(表2)。クロマトグラフィーに使用されたプールの組成を表1に示す。データから明らかなように、T2及びc[タンパク質]を標的パラメータとして使用することにより、生成物の純度が改善され、特に、高分子量及び/又は低分子量の汚染物質の除去が改善される。
酢酸塩又はpH勾配のいずれかを使用するカチオン交換クロマトグラフィーによる、又はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によるLC精製に、4つの異なる抗体様タンパク質(ALP、図2、表1)を適用した。クロマトグラフィーの後、c[タンパク質](UV測定)のみに従って、正規化されたT2のみに従って、又はT2及びc[タンパク質]に従って、画分をプールした(表2)。クロマトグラフィーに使用されたプールの組成を表1に示す。データから明らかなように、T2及びc[タンパク質]を標的パラメータとして使用することにより、生成物の純度が改善され、特に、高分子量及び/又は低分子量の汚染物質の除去が改善される。
(表1)示されたLCカラムに適用されたタンパク質溶液の組成
ALP:抗体様タンパク質;HMW:高分子量(凝集体)、LMW:低分子量(分解生成物)、na:適用せず/決定せず、SEC:サイズ排除クロマトグラフィー。
ALP:抗体様タンパク質;HMW:高分子量(凝集体)、LMW:低分子量(分解生成物)、na:適用せず/決定せず、SEC:サイズ排除クロマトグラフィー。
(表2)c[タンパク質]定量(UV測定)のみに従って(c[タンパク質])、正規化されたT2のみに従って(正規化されたT2)、並びにT2及びc[タンパク質]の正規化された積に従って(T2及びc[タンパク質])プールされた後、示されたLC工程に適用されたタンパク質溶液の組成
HMW:高分子量(凝集体)、LMW:低分子量(分解生成物)、na:適用せず/決定せず、SEC:サイズ排除クロマトグラフィー。
HMW:高分子量(凝集体)、LMW:低分子量(分解生成物)、na:適用せず/決定せず、SEC:サイズ排除クロマトグラフィー。
実施例4:さまざまな濃度のタンパク質溶液に人工的にストレスを加えて、凝集を誘発するかどうかを、また、wNMR-T2値を測定した。図4に示すように、凝集の開始により、T2シグナルの迅速な低下が引き起こされ、これは、限外濾過法における凝集の開始を検出するために使用することができる。
実施例5:充填されたAAVカプシド及び空のAAVカプシド
材料及び方法
AAV粒子
異なる血清型の、DNAが負荷されたAAV粒子と、空のAAV粒子とを、Virovek,Hayward,CA、米国から購入した。充填されたAAV粒子について、1ゲノムが1粒子内にパッケージ化されているため、vg/mLの濃度(1mLあたりのウイルスゲノム)は、vp/mLの濃度(1mLあたりのウイルス粒子)に等しい。空のAAV粒子について、vp/mLの数は、例えばカプシドタンパク質の量を、vg/mLでの既知の濃度の充填されたAAV粒子の調製物中のカプシドタンパク質の量と比較することによって、決定することができる。DNAが負荷されたAAV粒子のDNAは、CMVプロモータを有する緑色蛍光タンパク質(CMV-GFP)の発現カセットを構成した:
0.22μmフィルタで滅菌した、0.001%プルロニックF-68を含む1×PBSバッファー中のAAV8-空(Lot 19-564E)/AAV8-CMV-GFP(Lot 18-737)。
0.22μmフィルタで滅菌した、0.001%プルロニックF-68、100mMクエン酸ナトリウムを含む1×PBSバッファー中のAAV2-空(Lot 19-604E)/AAV2-CMV-GFP(Lot 17-600)。
0.22μmフィルタで滅菌した、0.001%プルロニックF-68、100mMクエン酸ナトリウムを含む1×PBSバッファー中のAAV6-空(Lot 19-540E)/AAV2-CMV-GFP(Lot 19-718)。
材料及び方法
AAV粒子
異なる血清型の、DNAが負荷されたAAV粒子と、空のAAV粒子とを、Virovek,Hayward,CA、米国から購入した。充填されたAAV粒子について、1ゲノムが1粒子内にパッケージ化されているため、vg/mLの濃度(1mLあたりのウイルスゲノム)は、vp/mLの濃度(1mLあたりのウイルス粒子)に等しい。空のAAV粒子について、vp/mLの数は、例えばカプシドタンパク質の量を、vg/mLでの既知の濃度の充填されたAAV粒子の調製物中のカプシドタンパク質の量と比較することによって、決定することができる。DNAが負荷されたAAV粒子のDNAは、CMVプロモータを有する緑色蛍光タンパク質(CMV-GFP)の発現カセットを構成した:
0.22μmフィルタで滅菌した、0.001%プルロニックF-68を含む1×PBSバッファー中のAAV8-空(Lot 19-564E)/AAV8-CMV-GFP(Lot 18-737)。
0.22μmフィルタで滅菌した、0.001%プルロニックF-68、100mMクエン酸ナトリウムを含む1×PBSバッファー中のAAV2-空(Lot 19-604E)/AAV2-CMV-GFP(Lot 17-600)。
0.22μmフィルタで滅菌した、0.001%プルロニックF-68、100mMクエン酸ナトリウムを含む1×PBSバッファー中のAAV6-空(Lot 19-540E)/AAV2-CMV-GFP(Lot 19-718)。
NMR
横緩和速度(R2)又は時間(T2)を、本明細書中実施例1で上に明記されるように記録した。
横緩和速度(R2)又は時間(T2)を、本明細書中実施例1で上に明記されるように記録した。
AAVサンプルの調製
充填された及び空のAAV2、AAV6、及びAAV8粒子を混合することによってサンプルを生成した。それぞれの粒子は、同じ濃度(2*1013vg/ml)を有し、0.001%(w/v)プルロニックF-68(AAV8の場合)を含む、及び0.001%(w/v)プルロニックF-68と(AAV2及びAAV6の場合は)100mMクエン酸ナトリウムも異なる比で含む、1×PBSバッファーを含む同じ水溶液に溶解していた。サンプルは、さらに長期間保存せずに例えば<0℃で測定した。
充填された及び空のAAV2、AAV6、及びAAV8粒子を混合することによってサンプルを生成した。それぞれの粒子は、同じ濃度(2*1013vg/ml)を有し、0.001%(w/v)プルロニックF-68(AAV8の場合)を含む、及び0.001%(w/v)プルロニックF-68と(AAV2及びAAV6の場合は)100mMクエン酸ナトリウムも異なる比で含む、1×PBSバッファーを含む同じ水溶液に溶解していた。サンプルは、さらに長期間保存せずに例えば<0℃で測定した。
実施例5.1
異なる比のDNAが負荷されたAAV粒子と空のAAV粒子についての横緩和時間の決定
DNAが負荷されたAAV粒子と空のAAV粒子とを水溶液(AAV2及びAAV6:0.001%(w/v)プルロニックF-68、100mMクエン酸ナトリウムを含む1×PBSバッファー;AAV8:クエン酸ナトリウムを含まない同じバッファー)中で溶かして、0%から100%のDNAを負荷したAAV粒子の範囲にまたがる異なる充填/空の比を得た。これは、血清型2、6、及び8のAAV粒子について行われた。個別のサンプルについて、上の「材料及び方法」のセクションに概説したように、横緩和時間(T2)を記録した。結果を以下の表に示す。
異なる比のDNAが負荷されたAAV粒子と空のAAV粒子についての横緩和時間の決定
DNAが負荷されたAAV粒子と空のAAV粒子とを水溶液(AAV2及びAAV6:0.001%(w/v)プルロニックF-68、100mMクエン酸ナトリウムを含む1×PBSバッファー;AAV8:クエン酸ナトリウムを含まない同じバッファー)中で溶かして、0%から100%のDNAを負荷したAAV粒子の範囲にまたがる異なる充填/空の比を得た。これは、血清型2、6、及び8のAAV粒子について行われた。個別のサンプルについて、上の「材料及び方法」のセクションに概説したように、横緩和時間(T2)を記録した。結果を以下の表に示す。
図5は、血清型2のAAV粒子(AAV2)のDNA負荷に対するT2の依存関係、つまり、水性サンプル中のDNA含有AAV2粒子の濃度に対するT2の依存関係を示す。2*1013粒子/mLの濃度での空のAAV2粒子(0%充填)と完全にDNAが負荷されたAAV2粒子(100%充填)との間の緩和時間の絶対差は197.1±6.4msであり、相対差は12.6±0.4%であることがわかる。データポイントは、0.996のR2値の2次関数を用いてフィッティングすることができる。
図6は、血清型6のAAV粒子(AAV6)のDNA負荷に対するT2の依存関係、つまり、水性サンプル中のDNA含有AAV6粒子の濃度に対するT2の依存関係を示す。2*1013粒子/mLの濃度での空のAAV6粒子(0%充填)と完全にDNAが負荷されたAAV6粒子(100%充填)との間の緩和時間の絶対差は149.8±22.1msであり、相対差は9.2±1.4%であることがわかる。データポイントは、0.9987のR2値の2次関数を用いてフィッティングすることができる。
図7は、血清型8のAAV粒子(AAV8)のDNA負荷に対するT2の依存関係、つまり、水性サンプル中のDNA含有AAV8粒子の濃度に対するT2の依存関係を示す。2*1013粒子/mLの濃度での空のAAV8粒子(0%充填)と完全にDNAが負荷されたAAV8粒子(100%充填)との間の緩和時間の絶対差は206.9msであり、相対差は14%であることがわかる。データポイントは、0.9633のR2値の2次関数を用いてフィッティングすることができる。
文献
Feng et al.(2015),Chem.Commun.51:6804
Hills et al.(1989),Molecular Physics,67(4):903-918)
Metz and Maeder(2008),International Journal of Pharmceutics 364:170-175
Shigemitsu et al.(2016),Analytical Biochemistry 498:59-67
Taraban et al.(2015),Journal of Pharmaceutical Sciences 104:4132-4141
Taraban et al.(2017),Analytical Chemistry 89:5494-5502
Taraban et al.(2019),7th Annual PANIC Conference,Poster presentation P35:「Water Flow-NMR-A Prospective Contact-Free In-Line Analytical Tool for Continuous Biomanufacturing」
Taraban et al.(2019),Anal Chem 91(6):4107
国際公開公報第2012/015912号A1
国際公開公報第2014/169229号A1
国際公開公報第2015/118016号A1
国際公開公報第2018/102681号A1
国際公開公報第2018/184964号A1
国際公開公報第2019/016154号A1
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国際公開公報第2014/169229号A1
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国際公開公報第2018/102681号A1
国際公開公報第2018/184964号A1
国際公開公報第2019/016154号A1
参照番号のリスト
110 分離デバイス
112 濃度決定デバイス
114 NMR測定デバイス
116 評価デバイス
118 サンプル(水溶液)/移動相入口
120 液体分配要素
122 画分
110 分離デバイス
112 濃度決定デバイス
114 NMR測定デバイス
116 評価デバイス
118 サンプル(水溶液)/移動相入口
120 液体分配要素
122 画分
Claims (24)
- i)標的化合物を含む水溶液を提供することと、
ii)前記水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分を提供する、分離工程を適用することと、
iii)前記画分の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定することと、
iv)前記画分に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによって、水の核磁気スピン横緩和を示すNMRパラメータを決定することと、
v)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて、前記画分の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定することと
を含む、分離方法。 - NMRパラメータが、水のプロトンの核磁気スピン横緩和を示す、請求項1に記載の方法。
- NMRパラメータが、核磁気スピン横緩和時間T2及び核磁気スピン横緩和速度R2のうちの少なくとも1つを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 濃度パラメータが、前記標的化合物の濃度に正比例する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 濃度パラメータが、水の核磁気スピン横緩和を示すNMRパラメータではない、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 標的パラメータが、濃度パラメータと、横緩和時間(T2)であるNMRパラメータとに正比例する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 標的パラメータが、濃度パラメータと、横緩和時間(T2)であるNMRパラメータとの積に正比例する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化合物を所望の純度で含む画分を、標的パラメータに基づいて同定する工程vi)をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化合物を所望の純度で含む前記画分のうちの少なくとも2つを組み合わせる工程vii)をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 工程ii)における分離工程が、クロマトグラフィー分離を含み、前記画分が、クロマトグラフィー分離の溶出液の画分である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程ii)における分離工程が、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が連続的なインライン法であり、且つ/又は、工程ii)において、前記画分が液体の連続流として生成される、請求項1から10に記載の方法。
- 前記標的化合物が、(i)ポリペプチド、(ii)ポリヌクレオチド、(iii)(i)又は(ii)のうちの1つについての複合体、及び(iv)(i)から(iii)のうちの1つについてのコンジュゲートからなる群より選択される化合物を含み、一実施形態では(i)ポリペプチド、(ii)ポリヌクレオチド、(iii)(i)又は(ii)のうちの1つについての複合体、及び(iv)(i)から(iii)のうちの1つについてのコンジュゲートからなる群より選択される化合物である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化合物が、ポリペプチドを含み、一実施形態ではポリペプチドである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化合物が、非凝集ポリペプチドを含み、一実施形態では非凝集ポリペプチドである、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的化合物が、ウイルス、又はウイルス様粒子である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 濃度パラメータが、直接測光アッセイにおいて決定される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 濃度パラメータが、前記標的化合物の吸収、吸光、又は蛍光である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- a)標的化合物を含む水溶液に分離工程を適用して、それにより前記水溶液の複数の画分(122)を提供する、分離工程を適用するように構成された分離デバイス(110)と、
b)前記画分(122)の少なくとも一部における前記標的化合物の濃度を示す濃度パラメータを決定するように構成された濃度決定デバイス(112)と、
c)前記画分(122)に核磁気共鳴(NMR)測定を適用することによって、水の核磁気スピン横緩和を示すNMRパラメータを決定するように構成された核磁気共鳴(NMR)測定デバイス(114)と、
d)濃度パラメータ及びNMRパラメータに基づいて前記画分(122)の前記少なくとも一部の標的パラメータを決定するように構成された評価デバイス(116)と
を含む、分離システム。 - e)前記標的化合物を含む前記画分(122)のうちの少なくとも2つを組み合わせるための、液体分配要素(120)、及び/又は
工程d)において決定された標的パラメータの値を出力する、出力デバイス
をさらに含む、請求項19に記載のシステム。 - 標的化合物を生成すること、標的化合物を精製すること、及び標的化合物の調製物から不純物を除去することからなる群より選択される目的のための、請求項19若しくは20に記載のシステムの使用、及び/又は請求項1から18のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法の工程を含む、標的化合物の、特にポリペプチドの生成方法。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法によって生成されるか又は生成可能な標的化合物の調製物。
- 透析濾過によって溶液中の標的化合物の濃度を上昇させるための方法であって、以下:
A)前記溶液における又はその画分における経時的な水の核磁気スピン横緩和を示す核磁気共鳴パラメータ(NMRパラメータ)の第1の勾配を決定すること、
B)前記溶液における又はその画分における経時的な前記NMRパラメータの第2の勾配を決定すること、並びに
C)前記NMRパラメータの前記第2の勾配の値が、前記NMRパラメータの前記第1の勾配の値から少なくとも10%外れた場合に、少なくとも一時的に、透析濾過速度を低下させる、及び/又は撹拌速度を増加させること
を含む、方法。
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