CN115087861A - 用于靶标化合物纯化的方法/装置 - Google Patents

用于靶标化合物纯化的方法/装置 Download PDF

Info

Publication number
CN115087861A
CN115087861A CN202180014126.2A CN202180014126A CN115087861A CN 115087861 A CN115087861 A CN 115087861A CN 202180014126 A CN202180014126 A CN 202180014126A CN 115087861 A CN115087861 A CN 115087861A
Authority
CN
China
Prior art keywords
parameter
ser
leu
target compound
nmr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180014126.2A
Other languages
English (en)
Inventor
M·哈特尔
D·芬克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN115087861A publication Critical patent/CN115087861A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/085—Analysis of materials for the purpose of controlling industrial production systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/14—Preparation by elimination of some components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/448—Relaxometry, i.e. quantification of relaxation times or spin density
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/465—NMR spectroscopy applied to biological material, e.g. in vitro testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Iron (AREA)

Abstract

本发明涉及一种分离方法，其包括：i)提供包含靶标化合物的水溶液；ii)对所述水溶液应用分离步骤，从而提供所述水溶液的多个级分；iii)确定指示所述靶标化合物在所述级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；iv)通过对所述级分应用核磁共振(NMR)测量来确定NMR参数，所述NMR参数指示在所述级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫；以及v)基于所述浓度参数和所述核磁共振参数来确定所述级分的所述至少一部分的靶标参数。本发明进一步涉及与其相关的分离系统、用途、制剂以及方法。

Description

用于靶标化合物纯化的方法/装置
本发明涉及一种分离方法，其包括：i)提供包含靶标化合物的水溶液；ii)对水溶液应用分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；iii)确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；iv)通过对级分应用核磁共振(NMR)测量来确定NMR参数，NMR参数指示在级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫；以及v)基于浓度参数和核磁共振参数来确定级分的所述至少一部分的靶标参数。本发明进一步涉及与其相关的分离系统、用途、制剂以及方法。
技术领域
本发明涉及一种生化分离方法、分离系统和分离系统的用途。本发明的方法和装置可以用于将靶标化合物与包含一系列化合物的溶液分离。作为示例，靶标化合物可以为生物分子，诸如蛋白质、核酸、病毒或脂质体。其他靶标化合物也是可行的。靶标化合物可以例如作为活性药物成分具体地用于治疗目的。
背景技术
广泛的生物分子已被证明具有巨大的治疗价值。然而，用于治疗目的的生物分子的生产带来了许多挑战。特别地，所需的生物分子必须以高纯度提供，例如以保证安全使用并遵守法律规定。
治疗性生物分子的生产过程中的步骤的次序以及特定步骤本身通常基于在线获取的测量数据来进行控制。特别是当使用色谱分离方法时，在洗脱期间收集所需产物通常基于从分离装置的洗脱液中获取的所定义的测量的开始值和结束值来进行控制。然而，可用于直接控制生物分子生产过程的方法数量受限，因为结果必须在几秒钟或更短的时间范围内可用。通常，洗脱液的蛋白质含量可以使用UV吸收测量来进行测量。此外，还可以检测到电导率或pH值的变化。
核磁共振(NMR)为一种已经用于广泛的应用中以研究生物分子的技术。关于样品中生物分子的不同方面的结论可以基于生物分子(例如蛋白质或肽)本身的NMR信号或基于衍生自包含生物分子的溶液的NMR信号。例如，Shigemitsu等人(2016),AnalyticalBiochemistry 498:59-67)描述了淀粉样蛋白β肽单体和二聚体的NMR信号的测量。Metz和
Figure BDA0003793034260000021
((2008),International Journal of Pharmceutics 364:170-175)示出了NMR实验，该实验用于表征可能专门用于制药领域中，特别是用于药物递送中的乳液和脂质成分。
WO 2014/169229 A1总体上涉及一种使用水分子的NMR弛豫速率作为生物制药制剂聚集程度的指示物的方法。类似地，WO 2018/102681 A1描述了一种使用溶剂NMR信号的横向弛豫速率以非侵入性地评估配制为溶剂中的悬浮液或乳液的含颗粒产物的方法。在这两种情况下，均可以无损地评估生物制药化合物，而无需打开小瓶或容器或者损坏保护密封(即破损)。希尔斯等人(1989),Molecular Physics,67(4):903-918)描述了天然牛血清白蛋白(BSA)的溶液中的横向水质子弛豫。他们提出的证据表明，横向水质子弛豫受水与蛋白质的氨基酸侧链之间的质子快速交换的影响。Feng等人(2015),Chem.Commun.51:6804描述了水质子的横向弛豫速率可以用于量化水中的蛋白质聚集和表面活性剂胶束化。使用人胰岛素制剂，Taraban等人(2015),Journal of Pharmaceutical Sciences 104:4132-4141)证明水质子的横向弛豫速率可以用作用于检测和量化可见和亚可见蛋白质聚集体两者的可靠性和敏感指示物。Taraban等人(2017),Analytical Chemistry 89:5494-5502)探索水NMR和常规技术(诸如尺寸排阻色谱、微流成像和动态光散射)对检测由不同应力生成的单克隆抗体聚集体的存在的灵敏度的差异。Taraban等人(2019),Anal Chem 91(6):4107公开了使用水质子NMR以用于表征蛋白质聚集体。最近，人们发现水NMR的在线测量是可能的，然而，这取决于流动系统配置、流速、蛋白质浓度和蛋白质聚集(Taraban等人(2019)，第7届PANIC年度会议，壁报论文第35页：“Water Flow-NMR—A Prospective Contact-FreeIn-Line Analytical Tool for Continuous Biomanufacturing”)。
WO 2012/015912 A1涉及纯化活性多肽或免疫缀合物的方法；
WO 2019/016154 A1教导了蛋白质和其他生物分子的工业规模纯化的技术。
待解决的问题
尽管如此，本领域仍需要协助纯化生物分子或生物分子复合物，特别是其蛋白质或复合物的装置和方法。
发明内容
这个问题通过具有独立权利要求的特征的方法、系统、用途、制备和计算机程序产品来解决。在从属权利要求中列出了可能以单独的方式或者以任何任意组合实现的有利实施例。
因此，本发明涉及一种分离方法，其包括：
i)提供包含靶标化合物的水溶液；
ii)对水溶液应用分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；
iii)确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；
iv)通过对级分应用核磁共振(NMR)测量来确定NMR参数，NMR参数指示在级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫；以及
v)基于浓度参数和核磁共振参数来确定级分的所述至少一部分的靶标参数。
通常，本文所使用的术语被赋予对本领域普通技术人员而言其普通且惯常的含义，并且除非另有说明，否则不限于特殊或自定义的含义。如下文所使用的，术语“具有”、“包括”或“包含”或者它们的任何任意语法变化形式以非排他性方式使用。因此，这些术语既可以指其中除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况，也可以指其中存在一个或多个另外的特征的情况。作为示例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”既可指除B之外，A中不存在其他任何元素的情况(即，A由B单独且唯一地组成的情况)，也可指除B之外，实体A中还存在一个或多个其他元素诸如元素C、元素C和D或甚至其他元素的情况。此外，如技术人员所理解的，术语“一”和“一个”是指“一个或多个”，即等同于“至少一个”。因此，例如表述方式“一种分离方法，其包括：i)提供包含靶标化合物的水溶液；ii)对水溶液应用分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；iii)确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；iv)通过对级分应用核磁共振(NMR)测量来确定NMR参数，NMR参数指示在级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫；以及v)基于浓度参数和核磁共振参数来确定级分的所述至少一部分的靶标参数”等同于“一种分离方法，其包括：i)提供包含至少一种靶标化合物的至少一种水溶液；ii)对水溶液应用至少一个分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；iii)确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的至少一个浓度参数；iv)通过对级分应用至少一个核磁共振(NMR)测量来确定至少一个NMR参数，NMR参数指示在级分的所述至少一部分中的至少一个核磁自旋弛豫；以及v)基于浓度参数和核磁共振参数来确定级分的所述至少一部分的至少一个靶标参数。”
此外，如下文所使用的，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语与任选的特征结合使用，而不限制其他可能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不旨在以任何方式限制权利要求的范围。如技术人员将认识到的，本发明可通过使用替代性特征来执行。类似地，由“在实施例中”引入的特征或类似表述旨在成为任选的特征，而对本发明的其他实施例没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以此类方式引入的特征与本发明的其他任选的或非任选的特征相结合的可能性也没有任何限制。
如本文所用，如果没有另做标注，则术语“标准条件”涉及IUPAC标准环境温度和压力(SATP)条件，即优选地，25℃的温度和100kPa的绝对压力；同样优选地，标准条件包括pH为7。此外，如果没有另外说明，则术语“约”涉及具有相关领域公认的技术精度的指示值，优选地涉及指示值±20％，更优选地±10％，最优选地±5％。此外，术语“基本上”表示不存在对所指示的结果或使用有影响的偏差，即潜在偏差不会导致所指示的结果偏离超过±20％，更优选地±10％，最优选地±5％。因此，“基本上由...组成”意指包括所指定的组分，但排除其他组分，除了作为杂质存在的材料、作为用于提供组分的过程的结果而存在的不可避免的材料，以及为了实现本发明的技术效果以外的目的而添加的组分。例如，使用短语“基本上由...组成”定义的组合物涵盖任何已知的可接受的添加剂、赋形剂、稀释剂、载体等。优选地，基本上由一组组分组成的组合物将包含小于5重量％、更优选地小于3重量％、甚至更优选地小于1重量％、最优选地小于0.1重量％的非指定组分。
本发明的方法为体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可以涉及例如产生包含靶标化合物的水溶液，以用于步骤i)和/或本文别处表明的步骤(例如组合被识别为目标级分的两个或更多个级分)和/或在如本文所述的方法的步骤之前和/或之后的其他纯化步骤。特别地，在步骤iv)之后，在基于不相同分离原理的实施例中，可以重复该方法，从而对至少一个级分应用至少一个其他(在一个实施例中为不相同的)分离步骤。此外，所述步骤中的一个或多个步骤可以由自动化设备执行。
在一个实施例中，该方法的步骤以技术人员认为适当的顺序执行。在另一个实施例中，至少步骤i)在步骤ii)之前执行，并且步骤iii)和iv)在步骤v)之前执行。还可以设想，在一个实施例中，步骤iii)至iv)或者步骤ii)至v)的至少部分基本上同时执行；因此，例如色谱柱的出口可以连接至浓度确定装置和NMR测量装置。在另一个实施例中，出口可以连接至液体分配元件(例如开关阀)，在靶标参数满足阈值标准的情况下，该液体分配元件将从色谱柱中流出的溶液转向靶标化合物收集装置，并且在不满足阈值标准的情况下，该液体分配元件将从色谱柱中流出的溶液转向废弃物收集装置。在另一个实施例中，该方法的步骤以所指示的次序执行。
如本文所用，术语“分离方法”涉及适用于相对于水溶液中包含的其他化合物而富集靶标化合物的任何方法；因此，在一个实施例中，分离方法导致靶标化合物与其他化合物分离。在一个实施例中，分离方法为将具有不同分子量的分子与靶标化合物分离的方法，在一个实施例中该分子具有小于靶标化合物的75％、在一个实施例中小于50％、在另一个实施例中小于25％、在另一个实施例中小于10％的分子量，或者该分子具有靶标化合物的至少150％、在一个实施例中至少200％、在另一个实施例中至少250％的分子量。在一个实施例中，分离方法为将具有不同尺寸和/或分子量，但在其他方面具有类似的物理、化学和/或生化特性的分子与靶标化合物分离的方法；因此，在一个实施例中，该方法为将靶标化合物的聚集体、片段和/或降解产物与靶标化合物分离的方法。因此，在靶标化合物为多肽的情况下，一个实施例中的分离方法为将宿主细胞蛋白、聚集体、片段和/或降解产物与所述多肽分离的方法；在另一个实施例中，在靶标化合物为多肽的情况下，一个实施例中的分离方法为将聚集体、片段和/或降解产物与所述多肽分离的方法。在一个实施例中，在靶标化合物为病毒衣壳的情况下，分离方法为将空的病毒衣壳与经填充的病毒衣壳分离，在一个实施例中，为将空的腺相关病毒(AAV)衣壳的方法与经填充的AAV衣壳分离。
在一个实施例中，术语“空的衣壳”和“空的颗粒”是指病毒颗粒，该病毒颗粒包括至少一个病毒蛋白壳但全部或部分地缺乏编码蛋白质或转录为目标转录物的核酸。因此，空的衣壳无法起到将编码蛋白质或转录为目标转录物的核酸转移至宿主细胞中的作用。
在某些实施例中，针对并非由病毒颗粒引起的变化而校正NMR参数，特别是针对溶质效应，该溶质效应在某些实施例中可以基于pH值和/或离子浓度。在某些实施例中，通过如下方法提供此类校正：使用具有已知病毒颗粒含量且在其他方面与待使用的水溶液相同的组成的水溶液来执行预运行和/或使用不包含病毒颗粒且在其他方面与待使用的水溶液相同的组成的水溶液来执行预运行。
因此，在某些实施例中，负载多核苷酸的病毒颗粒的比率/级分/浓度与作为水溶液中水分子的质子的横向弛豫时间(T2)的NMR参数成正比。
在一个实施例中，“重组病毒载体”衍生自病毒的野生型基因组(例如AAV)，通过使用分子方法从病毒(例如，AAV)中去除野生型基因组，并且将其替换为非天然核酸(例如转录为转录物或编码蛋白质的核酸)来进行该衍生。通常，对于AAV，AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”AAV载体区别于天然存在的病毒AAV基因组，因为病毒基因组的全部或一部分已经替换为相对于天然病毒基因组核酸的非天然(即异源)序列。因此，非天然序列的掺入将病毒载体(例如，AAV)定义为“重组”载体，该载体在AAV的情况下可以称为“rAAV载体”。
在一个实施例中，可以将重组病毒载体(例如，AAV)多核苷酸包装至病毒颗粒中，以用于随后的细胞、离体、体外或体内的感染(转导)。其中当重组载体序列被封装或包装至AAV颗粒中时，该颗粒也可以称为“AAV颗粒”或“rAAV颗粒”。此类颗粒包括封装或包装载体基因组的蛋白质。具体示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下，包括衣壳蛋白，诸如AAV VP1、VP2和VP3。
在一个实施例中，“载体”是指重组多核苷酸的部分，该部分直接或以一种或多种单链或双链DNA或RNA的形式最终包装或封装，以形成病毒(例如AAV)颗粒。在重组质粒用于构建或制备重组病毒颗粒的情况下，病毒颗粒不包括与重组质粒的载体序列不对应的“质粒”的部分。重组质粒的该非载体部分称为“质粒主干”，该“质粒主干”对于质粒的克隆和扩增很重要，是繁殖和重组病毒生产可能需要的过程，但其本身并未包装或封装至病毒(例如，AAV)颗粒中。因此，“载体”是指由病毒颗粒(例如，AAV)包装或封装的核酸。
如技术人员根据本文的描述所理解的，分离方法包括对包含靶标化合物的水溶液应用如本文所指定的分离步骤，从而提供多个级分的至少一个步骤，以及提供关于级分的至少一部分中靶标化合物的浓度和纯度的信息的一个或多个步骤。因此，在一个实施例中，该方法为在分离步骤中对靶标化合物进行过程控制的方法。在一个实施例中，分离方法为生化纯化方法的一部分和/或靶标化合物(特别是多肽或多肽复合物)的生产方法的一部分。如技术人员将理解的，生化纯化方法可以由分离方法组成，或者可以包括其他纯化步骤，在一个实施例中包括一个或多个其他分离方法，在另一个实施例中包括根据本公开的一个或多个其他分离方法。
在一个实施例中，分离方法包括对包含靶标化合物的水溶液应用如本文所指定的分离步骤，从而提供多个级分的步骤，以及鉴别包含处于富集和/或纯化状态的靶标化合物的所述级分中的至少一个级分的步骤。在一个实施例中，分离方法包括除了上文所指定的步骤i)至iv)之外的其他步骤，在一个实施例中包括以下项中的至少一者：vi)基于靶标参数来鉴别包含靶标化合物的级分，在一个实施例中基于靶标参数来鉴别包含处于所需纯度的靶标化合物的级分，以及vii)组合包含靶标化合物的级分中的至少两个级分，在一个实施例中，基于靶标参数，组合包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。在一个实施例中，在步骤vii)中，组合靶标参数满足目标条件的级分；因此在一个实施例中，基于前述靶标参数而识别包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。
根据上文，术语“分离步骤”涉及包括将至少一种分离原理应用于水溶液并且获得多个级分的步骤，从而导致水溶液的成分的分布在所述级分中的至少两个级分上不同。分离原理可以为导致成分的分布在来自分离步骤的级分上不同的任何原理，特别是物理原理(例如，沉降速度或分子尺寸)、化学原理(例如，在盐、疏水性或电荷存在下的溶解度)、或生化原理(例如，对另一个分子的亲和力)或它们的组合。在一个实施例中，分离步骤为液相色谱(LC)步骤。LC方法为技术人员已知的并且特别包括高效液相色谱法(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)和技术人员认为适当的任何其他类型的LC。在一个实施例中，LC为基于膜和/或过滤器的LC。在另一个实施例中，LC为基于色谱柱的LC。在一个实施例中，LC选自由以下项组成的列表：尺寸排阻色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、手性色谱、相分离色谱、分配色谱和混合模式色谱。在另一个实施例中，LC为尺寸排阻色谱或离子交换色谱。在一个实施例中，离子交换色谱为阳离子交换色谱或阴离子交换色谱。在一个实施例中，LC为混合模式色谱。
在一个实施例中，分离方法为生化分离方法。如本文所用，表述“生化分离方法”中的术语“生化”涉及靶标化合物为如本文别处指定的生化化合物的事实，并非旨在限制分离方法或分离步骤本身。
术语“水溶液”原则上被技术人员所理解。如本文所用，该术语涉及任何液体制剂，其中溶剂中水的浓度为至少50％、在一个实施例中为至少75％、在另一个实施例中为至少90％、在另一个实施例中为至少95％、在另一个实施例中为至少98％、在另一个实施例中为至少99％、在另一个实施例中约为100％、在另一个实施例中基本上为100％。此外，如本文所用，术语“溶液”表示溶液中化合物(溶质)的至少一部分溶解在溶剂中。在一个实施例中，溶质基本上溶解在溶剂中，在另一个实施例中，溶质溶解在溶剂中。用于制备溶液的方法在本领域中是已知的。因此，在一个实施例中，术语“水溶液”涉及包含靶标化合物的液体制剂，该靶标化合物至少部分地溶解在包含水(在一个实施例中由水组成)的溶剂中。
如本文所用，术语“靶标化合物”涉及包含至少一种目标高分子量有机化学化合物的任何物质组合物，在一个实施例中，其中高分子量化学化合物为具有至少500(对应于500原子质量单位，并且对应于500Da；1Da对应于1.66×10-27kg)、在另一个实施例中至少1000、在另一个实施例中至少10000、在另一个实施例中至少100000分子量的化学化合物。因此，该术语涉及高分子量有机化学化合物、涉及包含所述高分子量有机化学化合物的复合物、并且涉及所述高分子量有机化学化合物或所述复合物的缀合物。在一个实施例中，高分子量有机化学化合物为大分子，在一个实施例中为生物大分子，在一个实施例中具有至少500(0.5kDa)、在另一个实施例中至少1000(1kDa)、在另一个实施例中至少10000(10kDa)、在另一个实施例中至少100000(100kDa)的分子量。在高分子量有机化学化合物为多肽的情况下，分子量可以为0.5kDa至500kDa，在一个实施例中为1kDa至400kDa，在另一个实施例中为5kDa至250kDa。在一个实施例中，高分子量有机化学化合物为多肽或多核苷酸，特别是DNA、RNA或锁核酸(LNA)。在另一个实施例中，高分子量有机化学化合物为多肽。因此，在一个实施例中，靶标化合物为多肽或多核苷酸(特别是DNA、RNA或LNA)、多肽或多核苷酸的缀合物、或包含多肽和/或多核苷酸的复合物(诸如病毒、病毒样颗粒(VLP)或脂质体)。在一个实施例中，靶标化合物为病毒或VLP；在另一个实施例中，靶标化合物为无包膜病毒或无包膜病毒的VLP，在另一个实施例中，靶标化合物为腺相关病毒(AAV)或AAV的VLP，在如上文所指定的实施例中。在一个实施例中，AAV颗粒具有选自由以下项组成的AAV血清型组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和它们的混合物和/或嵌合体。在一个实施例中，AAV颗粒具有选自由以下项组成的AAV血清型组的血清型：AAV2、AAV4、AAV6、AAV8和AAV9。在另一个实施例中，AAV颗粒具有AAV2血清型、或AAV6血清型或AAV8血清型。
在一个实施例中，靶标化合物为免疫缀合物，该免疫缀合物包含(i)与PD-1结合的抗体和(ii)通过IL-2Rβγ进行信号传导的多肽，在一个实施例中，其中通过IL-2Rβγ进行信号传导的多肽为IL-2多肽或IL-15多肽；在一个实施例中，靶标化合物为如WO 2018/184964 A1中所指定的免疫缀合物，在另一个实施例中为如下文实施例46至68中任一项中所指定的免疫缀合物。
在一个实施例中，靶标化合物为融合蛋白，该融合蛋白包含(i)不能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和(ii)两个突变白介素-2(IL-2)分子，与野生型IL-2分子相比，其包含降低突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变，其中所述突变IL-2分子包含SEQ ID NO:30的序列。在另一个实施例中，靶标化合物为融合蛋白，该合蛋白包含(i)不能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和(ii)包含SEQ ID NO:30的序列的两个突变IL-2分子。在一个实施例中，靶标化合物为如WO 2015/118016 A1中和/或EP3102595B1中所指定的融合蛋白，在另一个实施例中，为如WO 2015/118016A1中和/或EP3102595 B1中所指定的DP47GS IgG-(IL2)2或DP47GS IgG-(IL-2N88D)2免疫缀合物。在一个实施例中，靶标化合物为如下文实施例69至90中任一项中所指定的融合蛋白。
在一个实施例中，靶标化合物为双特异性抗体，在一个实施例中为与CD3和第二抗原结合的双特异性抗体，在另一个实施例中为与CD3和CEA结合的双特异性抗体。在另一个实施例中，靶标化合物为双特异性抗体，该双特异性抗体包含第一、第二和第三Fab分子和由两个亚基构成的Fc结构域，在一个实施例中，其中Fc结构域为IgG Fc结构域，具体地为IgG1 Fc结构域，更具体地为人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，所述靶标化合物为双特异性抗体，其中第一Fab分子在C末端处与第二Fab分子的N末端融合，第二Fab分子在C末端处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端融合，并且第三Fab分子在C末端处与Fc结构域的亚基中的另一个亚基的N末端融合，在一个实施例中，其中第二Fab分子与CD3结合，并且第一和第三Fab分子与第二抗原结合，在另一个实施例中，其中第二抗原为CEA。在一个实施例中，靶标化合物为如下文实施例91至99中任一项所指定的双特异性抗体，在另一个实施例中，靶标化合物为赛必妥单抗(WHO药物信息(药物的国际非专属名称)，推荐INN：清单80，2018，第32卷，第3期，第438页)。
如本文所用，术语“复合物”涉及如本文所指定的高分子量有机化学化合物与至少一种相同或不相同的化学分子的非共价缔合。复合物中包含的其他分子可以为任何化学分子，特别地包括如本文所指定的相同或其他靶标化合物。在一个实施例中，非高分子量有机化学化合物包含在复合物中，特别是低分子量(小分子)药物化合物。在一个实施例中，复合物在标准条件下是稳定的，在另一个实施例中，复合物在分离步骤的条件下是稳定的，术语“稳定”涉及在前述条件下每天损失至多25％、在一个实施例中至多10％、在另一个实施例中至多5％、在另一个实施例中至多1％的复合物。在一个实施例中，在前述条件下，用于解离高分子量有机化学化合物和包含在复合物中的至少一个其他分子的解离常数Kd为至多10-6M、在一个实施例中为至多10-7M、在另一个实施例中为至多10-8M、在另一个实施例中为至多10-9M、在另一个实施例中为至多10-10M。
如本文所用，术语“缀合物”涉及如本文所指定的高分子量有机化学化合物与至少一种相同或不相同的化学分子的共价连接。缀合物中包含的其他分子可以为任何化学分子，特别地包括如本文所指定的相同或其他靶标化合物。在一个实施例中，至少一种非高分子量有机化学化合物包含在缀合物中，特别是低分子量(小分子)药物化合物、可检测标记物和/或亲和标记(例如生物素)。在另一个实施例中，至少一种其他高分子量有机化学化合物包含在缀合物中，特别是聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，在一个实施例中，为技术人员已知的可生物降解的聚合物、寡糖或多糖、多肽和/或多核苷酸。在高分子量有机化学化合物为多肽或包含多肽的复合物的情况下，该至少一种其他高分子量有机化学化合物可以特别地为低分子量(小分子)药物化合物、多核苷酸，特别是锁核酸、亲和标记(例如生物素)、糖基化或聚乙二醇化。
在一个实施例中，靶标化合物为也可以在生物细胞中检测到的化合物或旨在向其施用的化合物；因此，在一个实施例中，靶标化合物为由活细胞产生和/或调节活细胞的生化组成的化学化合物。
在一个实施例中，靶标化合物为或包含多肽，在另一个实施例中为多肽。在一个实施例中，靶标化合物为治疗性多肽，即用于施用于生物以预防、改善或治愈疾病或不利状况的多肽。在一个实施例中，靶标化合物为诊断性多肽，即用于诊断疾病或不利状况的多肽。在一个实施例中，多肽为抗体样蛋白，特别是抗体或其片段，在一个实施例中为治疗性或诊断性抗体。在一个实施例中，靶标化合物为多肽，在一个实施例中为未聚集的和/或未降解的多肽，在另一个实施例中为未聚集的和/或未降解的抗体样蛋白，特别是抗体或其片段。在一个实施例中，靶标化合物包含如本文所指定的多肽，在另一个实施例中由如本文所指定的多肽组成。因此，在一个实施例中，靶标化合物为如本文所指定的多肽的缀合物，特别是抗体样蛋白，具体为抗体或其片段和/或其融合多肽的缀合物。
如本文所用，术语“抗体样蛋白”涉及包含抗体(特别是IgG)或其片段的至少一个亚结构域的任何多肽。因此，在一个实施例中，抗体样蛋白包含以下项中的至少一者：VH、VL、CL、CH1、CH2和CH3结构域，在一个实施例中为Fv、Fab和/或Fc结构域，在另一个实施例中为Fv或Fab结构域。原则上，前述结构域为技术人员已知的并且在下文中进一步描述。在一个实施例中，抗体样蛋白为多特异性抗体样蛋白，即包含大量Fv和/或Fab结构域。在另一个实施例中，抗体样蛋白为双特异性抗体样蛋白，即包含两个Fv和/或Fab结构域。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且特别地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种抗体或其片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、两个或更多个抗体结构域的融合多肽、单链抗体、单结构域抗体(VHH，也称为纳米抗体)和抗体片段，以及包含前述化合物中的至少一种化合物的化合物。在一个实施例中，抗体为或包括全长抗体或抗体片段。在另一个实施例中，该抗体为或包含两个或更多个抗体结构域的融合多肽，该两个或更多个抗体结构域在一个实施例中来自至少两个不相同的抗体。在一个实施例中，抗体为或包括单克隆抗体。抗体可以是较大融合分子的一部分，该融合分子是通过抗体与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，在一个实施例中，包含其抗原结合区。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其是否容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab')2片段具有两个抗原结合位点并且仍能够与抗原交联。“Fv”是包含完全的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv物种由紧密和非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物种中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可缔合成类似于在双链Fv物种中的“二聚体”结构。术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，其片段包含连接至与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体可为二价抗体或双特异性抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即除了可能存在的少量突变例如天然存在的突变，该抗体群包含的单个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆的”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。在另一个实施例中，抗体可以在一个实施例中共价地连接至另一个化学分子。如何将多肽与化学分子共价地连接的方法在本领域中是已知的。用于与本发明的结合多肽共价连接的优选化学分子为药物化合物，诸如细胞因子、金属复合物形成剂等。
在一个实施例中，靶标化合物为包含多肽的缀合物，在另一个实施例中为多肽缀合物。如本文所用，术语“多肽缀合物”涉及包含与附加的化学基团或分子结合的至少一个共价键的多肽，其中所述化学键不是延续多肽肽链的肽键。在一个实施例中，附加的化学基团或分子为“指示物”，即适于使包含所述指示物的分子或复合物的存在可检测的化合物。通常，指示物具有可检测的特性，通常是光学或/和酶促特性。然而，还可以设想所述可检测的特性为发射放射性的特性。如本文所用，术语“光学特性”涉及可由光学仪器检测到的任何特性。具体地，可光学确定的特性可以为或可以包括选自由以下项组成的组的至少一种特性：反射特性、透射特性、发射特性、散射特性、荧光特性、磷光特性、衍射特性和极化特性。本发明设想的其他光学特性为颜色、荧光、发光或折射。在一个实施例中，如本文所指的可光学确定的特性是指化学化合物的可以光学检测的特性，诸如光吸收、光发射、光再发射(remission)或与其相关联的特性。应当理解，如本文所用，检测可光学确定的特性涵盖：检测以前不可检测的特性的存在、检测以前已经检测到的特性的缺失，以及检测特性的定量变化，即检测与该至少一种光学特性的变化程度相关的信号强度变化。应当理解，在一个实施例中，术语“可光学确定的特性”还涉及电化学发光，其也称为电致化学发光。在另一个实施例中，附加的化学基团或分子为“效应子”，即介导靶标化合物的附加作用，特别是附加治疗作用的化合物。因此，效应子可以例如为作为细胞毒素的化学结构，该细胞毒素为例如化疗化合物、免疫刺激剂(例如细胞因子)或复合物形成基团，例如以用于络合元素的放射性同位素。
在一个实施例中，靶标化合物为治疗性多肽缀合物或诊断性多肽缀合物。在一个实施例中，在诊断性和/或治疗性抗体的一个实施例中，多肽为如上文所指定的抗体样蛋白的缀合物。在一个实施例中，多肽为抗体缀合物，在一个实施例中为治疗性或诊断性抗体缀合物。在一个实施例中，靶标化合物为多肽缀合物，在一个实施例中为未聚集和/或未降解的多肽缀合物，在另一个实施例中为未聚集和/或未降解的抗体缀合物。
在一个实施例中，靶标化合物为或包含多肽复合物。因此，在一个实施例中，靶标化合物为包含相同或不相同多肽亚基的四级结构的复合物。在另一个实施例中，多肽复合物为或包含病毒衣壳，在一个实施例中为无包膜病毒衣壳。如本文所用，术语“病毒衣壳”包括包含一种或多种多核苷酸的经填充的衣壳、没有多核苷酸的空的衣壳，以及它们的前体和中间体形式。在一个实施例中，多肽复合物为病毒样颗粒(VLP)；在另一个实施例中，多肽复合物为经填充的病毒衣壳，在一个实施例中包含重组多核苷酸、在另一个实施例中包含治疗性多核苷酸、在另一个实施例中包含重组治疗性多核苷酸，其中所述多核苷酸可以特别地为DNA、RNA或锁核酸(LNA)。在一个实施例中，病毒衣壳为无包膜病毒的衣壳，在另一个实施例中为腺相关病毒衣壳、腺病毒衣壳或细小病毒衣壳。
在另一个实施例中，靶标化合物为“融合多肽”，即包含经由肽键与多肽共价结合的至少一个其他肽序列并且作为多肽的氨基酸序列的延续的多肽。因此，在一个实施例中，融合多肽由连续的开放阅读框来进行编码。其他肽序列可以为如上文所指定的指示物；因此，在一个实施例中，其他肽为具有可光学确定的特性(在一个实施例中为荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或红色荧光蛋白(RFP))的肽；或具有酶促特性(例如氧化酶或萤光素酶)的肽。其他肽也可以为如上文所指定的效应子，在一个实施例中为细胞因子。
在另一个实施例中，靶标化合物为如本文所指定的融合多肽的如本文所指定的缀合物，特别是抗体样蛋白的缀合物。在一个实施例中，靶标化合物为在示例中如本文所指定的化合物中的一种化合物，特别是如示例中所指定的ALP1、ALP2、ALP3或ALP4。
在一个实施例中，靶标化合物不是脂质体。在另一个实施例中，靶标化合物不是包膜病毒颗粒或其VLP。在另一个实施例中，靶标化合物包含处于至多25％(w/w)、在一个实施例中至多10％(w/w)、在另一个实施例中至多5％(w/w)、在另一个实施例中至多1％(w/w)的级分的脂质。
术语“级分”被技术人员理解为涉及物质组合物(在一个实施例中为如本文所指定的水溶液)的子部分，通过对水溶液应用分离步骤而产生该子部分，在一个实施例中，已知或怀疑该水溶液包含水溶液的成分。本公开的级分为水性的，如上文针对术语“水溶液”所指定的。在一个实施例中，级分中的至少一个级分包含靶标化合物。如上文所指定，特别是在该多个级分的数量较少的情况下，特别是数量为三个或两个的情况下，级分不一定需要具有相同的体积。术语“级分的至少一部分”被技术人员理解为涉及所提供的所有级分的多个至少一个级分。在一个实施例中，级分的至少一部分为疑似级分，例如来自执行该方法的先前实例，以包含靶标化合物。在一个实施例中，级分的至少一部分为至少两个，在一个实施例中为至少5个，在另一个实施例中为至少10个级分。在另一个实施例中，级分的至少一部分涉及所提供的所有级分的至少1％、在一个实施例中为至少5％、在另一个实施例中为至少10％、在另一个实施例中为至少25％、在另一个实施例中为至少50％。在一个实施例中，级分的至少一部分包括所提供的所有级分。如进一步所理解的，在一个实施例中，在相同的级分中确定浓度参数和NMR参数，并且对于在其中确定参数的每个级分确定这两个参数。然而，还可以设想对于一些样品仅确定一个参数，并且仅在对于所述样品确定的第一参数满足给定阈值标准的情况下才确定第二参数。在一个实施例中，如本文所指定的级分为虚拟级分，即，通过形式上将分离步骤的洗脱液分为可具有相同或不同体积的子部分并检测前述参数而生成该虚拟级分。在另一个实施例中，该部分为包含在单独的容器中的物理部分，该物理部分可以具有相同或不同的体积。在一个实施例中，在至少一个级分中的靶标化合物的浓度为至少1mg/mL、在一个实施例中为至少5mg/mL、在另一个实施例中为至少10mg/mL、在另一个实施例中为至少20mg/mL；同样在一个实施例中，在靶标化合物为病毒(特别是AAV)的情况下，在至少一个级分中的病毒颗粒的总浓度为至少1*1012vg/mL(病毒基因组或载体/mL)、在另一个实施例中为至少5*1012vg/mL、在另一个实施例中为至少1*1013vg/mL、在另一个实施例中为至少2*1013vg/mL。
技术人员已知术语“多个”涉及至少两个的数量。在一个实施例中，提供至少三个、在另一个实施例中至少四个、在另一个实施例中至少五个级分。然而，还可以设想在该方法的步骤i)中提供至少十个、在一个实施例中至少二十个级分。
如本文所用，术语“浓度参数”涉及在物质组合物中与靶标化合物的浓度相关或与靶标化合物所属的化合物类别的浓度相关的任何参数。该参数可以为半定量或定量参数，在一个实施例中为定量参数。用于确定此类参数的合适测定在本领域中是已知的。在一个实施例中，浓度参数为通用浓度参数，即与化合物的化学类别的浓度相关的参数，该化合物具有与所应用的确定方法相关的相同或类似特性；例如技术人员已知溶液在280nm处的吸收与多肽的浓度相关。在另一个实施例中，浓度参数为特定浓度参数，即与靶标化合物的浓度特别相关的参数；特定浓度参数可以(例如例如在靶标化合物为多肽或其缀合物或复合物的情况下)在免疫测定(例如ELISA)中进行确定。浓度参数可以在直接测定(即直接确定靶标化合物的特性或靶标化合物所属的化合物化学类别的特性的测定)中或在间接测定(即由检测剂诱导而检测靶标化合物的特性或靶标化合物所属的化合物化学类别的特性的测定)中进行确定。因此，在靶标化合物为多肽的情况下，浓度参数可以在直接测定(即直接确定多肽特性的测定)中或在间接测定(即由检测剂诱导而检测多肽特性的测定)中进行确定。间接蛋白质测定特别包括Lowry测定、Bradford测定、二辛可宁酸(BCA)测定或技术人员认为适当的任何其他方法。在一个实施例中，浓度参数为在线确定的，特别是以流通测量的形式。因此，在一个实施例中，浓度参数是在直接测定(在一个实施例中为直接光度测定)中确定的。在一个实施例中，浓度参数为溶液中的靶标化合物的吸收、消光或荧光。在一个实施例中，靶标化合物为多肽并且浓度参数为在280nm、235nm和/或205nm处，在另一个实施例中为在280nm处的吸收。
术语“核磁共振”(NMR)被技术人员所理解。因此，缩写为“NMR参数”的术语“核磁共振参数”原则上涉及可以通过对如本文别处所指定的样品(特别是水溶液或级分)应用核磁共振测量来进行确定并且表示核磁自旋弛豫的任何参数。在一个实施例中，NMR参数为可以从水质子NMR(1H2O NMR)导出的参数。在一个实施例中，NMR参数包括或为在NMR测量中确定的弛豫时间或弛豫速率，在一个实施例中包括或为在1H2O NMR测量中确定的弛豫时间或弛豫速率。在另一个实施例中，NMR参数包括或为横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2中的至少一者，在另一个实施例中，NMR参数指示溶液或其级分中的水的横向核磁自旋弛豫，特别是溶液或其级分中的水中的质子的横向核磁自旋弛豫。如技术人员所理解的，弛豫时间T为对应弛豫速率R的倒数，即T＝1/R。在一个实施例中，NMR参数为在NMR测量中确定的横向弛豫时间(T2)或横向弛豫速率(R2)，在一个实施例中为在1H2O NMR测量中确定的横向弛豫时间(T2)或横向弛豫速率(R2)，即在一个实施例中为水质子横向弛豫时间(T2)或水质子横向弛豫速率(R2)。在一个实施例中，在确定期间的磁场强度为0.1T至24T、在一个实施例中为0.2T至10T、在一个实施例中为0.3T至5T、在另一个实施例中为0.4T至2T、在另一个实施例中为约0.5T、在另一个实施例中为0.5T。在一个实施例中，共振频率为5MHz至500MHz、在一个实施例中为7.5MHz至200MHz、在一个实施例中为10MHz至100MHz、在另一个实施例中为15MHz至50MHz、在另一个实施例中为约20MHz、在另一个实施例中为20MHz。
在一个实施例中，浓度参数和NMR参数不相同；因此，在一个实施例中，浓度参数不是水质子横向弛豫时间T2和/或不是水质子横向弛豫速率R2；在另一个实施例中，浓度参数不是如上文所指定的指示水的横向核磁自旋弛豫的NMR参数。
术语“应用测量”和“确定”被技术人员理解为涉及确定相关参数的值，特别是浓度参数和/或NMR参数。因此，可以另外地确定其他参数，诸如靶标化合物浓度、温度、pH、离子浓度等的一个或多个其他参数。用于确定pH(例如经由质子选择性电极)和离子浓度(例如通过测量电导率)的方法为技术人员已知的。在一个实施例中，该确定为离线确定；因此，在一个实施例中，其级分或子部分被转移至测量装置。在间接测定中执行确定的情况下，则可以在测量之前用一种或多种检测试剂来预处理样品的子部分。在另一个实施例中，该确定为在线的，即不需要从该过程中去除其级分或子部分。在另一个实施例中，该确定为连续在线确定；因此，在一个实施例中，级分为如上文所指定的虚拟级分。因此，在一个实施例中，级分作为连续的液体流而生成；在另一个实施例中，在连续的液体(例如洗脱液)流上连续执行步骤iii)和iv)。在一个实施例中，任选地确定的浓度参数、NMR参数和/或任何其他参数在流通池中进行确定，特别是在浓度参数的情况下，在流通比色池中进行确定。参数可以同时地或顺序地进行确定，在一个实施例中为顺序地进行确定。如前文所讨论，在一个实施例中，根据本发明定量地或半定量地确定每个参数。
如本文所用，术语“靶标参数”涉及通过至少一种数学和/或逻辑运算来从浓度参数和NMR参数中确定的参数。在一个实施例中，靶标参数为二进制参数，即假设两个可能值中的一个可能值，如0或1，或者是或否；在另一个实施例中，靶标参数为基于浓度参数和NMR参数的数值的数值参数。
在一个实施例中，靶标参数为二进制参数。在一个实施例中，靶标参数的值通过以下方法来进行确定：确定浓度参数是否满足给定的阈值标准，例如超过给定的较低光学吸收或浓度值；以及确定NMR参数是否满足给定的阈值标准，例如超过给定的较低T2值；以及对于其中浓度参数和NMR参数中的至少一者不满足其阈值标准的所有情况，使用第一二进制值，以及对于其中浓度参数和NMR参数两者均满足它们各自的阈值标准的情况，使用第二二进制值；因此，在此类情况下，对于其中浓度参数和NMR参数中的至少一者不满足其阈值标准的级分，靶标参数可以设置为pool＝no，并且对于其中浓度参数和NMR参数两者均满足它们各自的阈值标准的级分，靶标参数可以设置为pool＝yes。
在另一个实施例中，靶标参数为基于浓度参数和NMR参数的值来计算的数值参数。原则上，可以通过任何数学方法来计算靶标参数，从而确保在靶标化合物的浓度较高(由浓度参数确定)且不需要的副产物浓度较低(由NMR参数确定)的情况下，计算结果为可确定地不同的。在一个实施例中，浓度参数与靶标化合物的浓度成正比或经数学转换为与靶标化合物的浓度成正比；并且NMR参数与不需要的副产物的浓度间接成比例或经数学转换为与不需要的副产物的浓度间接成比例。因此，在一个实施例中，例如在靶标化合物为多肽并且不需要的副产物为其聚集体的情况下，浓度参数为例如在280nm处的吸收，并且NMR参数为如上文所指定的水质子NMR T2值。在此类情况下，在一个实施例中，靶标参数被计算为浓度参数和NMR参数的乘积。如技术人员所理解的，其他计算和附加的参数(例如比例因子)可以用于如技术人员认为适当的靶标参数的计算。特别地，在一个实施例中，浓度参数和/或NMR参数被归一化为介于0与1之间的值，例如通过将所有确定的值归一化为所有级分中确定的最高值。如技术人员所理解的，浓度参数和/或NMR参数也可以为非归一化的，特别是在使用级分的实时监测的应用中。此外，在一个实施例中，针对并非由靶标化合物的浓度引起的变化(例如缓冲效应)而校正浓度参数，和/或针对并非由不需要的副产物引起的变化(特别是针对缓冲效应)而校正NMR参数，在一个实施例中，该缓冲效应可能由pH变化和/或离子浓度变化引起。在一个实施例中，通过在不存在靶标化合物或甚至不存在水溶液的情况下执行平行或预运行来提供此类校正。在一个实施例中，在示例中如本文所示执行此类校正。因此，在一个实施例中，靶标参数被计算为浓度参数和NMR参数的乘积，其中乘积值可以任选地被归一化；在另一个实施例中，靶标参数被计算为归一化浓度参数和归一化NMR参数的乘积。在另一个实施例中，靶标参数被计算为任选地归一化的浓度参数和针对盐和/或pH效应而校正的任选地归一化的NMR参数的乘积。因此，在一个实施例中，靶标参数与浓度参数成正比，并且与作为横向弛豫时间(T2)的NMR参数成正比，在一个实施例中，与浓度参数和作为横向弛豫时间(T2)的NMR参数的乘积成正比。
在一个实施例中，该方法包括将靶标参数与阈值进行比较的其他步骤。术语“阈值”为被技术人员所理解，并且鉴于本说明书的教导，技术人员能够建立合适的阈值。阈值的值将取决于用于计算靶标参数的特定式，并且在一个实施例中将由技术人员调整以实现靶标化合物的所需产率和/或纯度。因此，对于给定的靶标化合物，可能需要通过合适阈值的实验确定。
在一个实施例中，该方法包括其他步骤vi)基于靶标参数，鉴别包含靶标化合物的级分，在一个实施例中，基于靶标参数，鉴别包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。在一个实施例中，所述鉴别包括确定数字靶标参数是否指示相应样品具有所需纯度；或包括针对每个研究中的样品而确定所确定的靶标参数的值是否指示包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。如根据上文所理解的，在一个实施例中，这通过将针对级分确定的靶标参数的值与阈值进行比较来实现。在一个实施例中，在靶标参数的值至少等于阈值的情况下，则级分被识别为包含处于所需纯度的靶标化合物。
术语“纯度”在本文中以其常规含义使用，作为制剂、溶液或级分中不存在非靶标化合物组分的量度。在一个实施例中，纯度为至少50％纯度、在一个实施例中为至少75％纯度、在一个实施例中为至少90％纯度、在一个实施例中为至少95％纯度、在另一个实施例中为至少98％纯度、在另一个实施例中为至少99％纯度。在一个实施例中，如本文所用的术语“纯度”涉及绝对纯度，即，在一个实施例中除了溶剂之外，为不存在任何非靶标化合物组分的量度；在另一个实施例中，术语“纯度”也可以涉及相对纯度，即涉及不存在特定的非靶标化合物组分。即，在一个实施例中，作为多肽的靶标化合物的纯度在其他多肽满足特定尺寸和/或质量标准的一个实施例中可以被指示为不存在其他多肽的量度。同样在一个实施例中，术语“纯度”被用作不存在与该靶标化合物类似但不相同的靶标化合物的量度，例如，在靶标化合物为多肽、所述多肽的宿主细胞蛋白、聚集体、片段、和/或降解产物(在另一个实施例中为所述多肽的聚集体、片段和/或降解产物)的情况下。
在另一个实施例中，该方法进一步包括步骤vii)组合包含靶标化合物的级分中的至少两个级分，在一个实施例中，基于靶标参数，组合包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。在一个实施例中，组合至少两个、在另一个实施例中至少三个级分。在另一个实施例中，组合经确定包含处于所需纯度的靶标化合物的所有级分；在另一个实施例中，组合满足给定的目标条件(例如至少等于如本文别处所指定的阈值)的所有级分。如应当理解的，组合还可以包括建立不相同纯度的单独的合并物，例如一个基本上纯的靶标化合物的合并物和纯度较低的第二合并物。在一个实施例中，该方法包括基于靶标参数而对级分中的两个或更多个级分进行以下操作中的至少一个操作：自动发布、分配或组合。特别地，在一个实施例中，使用基于靶标参数而控制的自动控制的液体分配元件，特别是自动阀。
有利地，在本发明的基础工作中发现，浓度测量和NMR测量的组合可以用于协助纯化化合物，特别是协助去除具有与靶标化合物类似特性的化合物(例如聚集体等)。同样有利地，已经发现负载DNA的AAV颗粒的级分/百分比/浓度通过水质子NMR(1H2O NMR)与在包含负载DNA的和空的AAV颗粒的水溶液中的横向核磁自旋弛豫时间T2相关，并且该相关性(与蛋白质浓度的测量相结合)可用于检测空的衣壳与经填充的衣壳的分离。
上文作出的定义比照适用于下文。下文进一步作出的附加定义和解释也比照适用于本说明书中所述的所有实施例。
本发明还涉及如上文所指定的方法的用途，该用途用于选自由以下项组成的组的目的：产生AAV颗粒、纯化AAV颗粒以及去除来自AAV颗粒的制剂中的杂质。
本发明还涉及根据本发明的方法生产或可生产的靶标化合物的制剂。
本发明进一步涉及一种分离系统，其包括：
a)分离装置，该分离装置经配置用于对包含靶标化合物的水溶液应用分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；
b)浓度确定装置，该浓度确定装置经配置用于确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；
c)核磁共振(NMR)测量装置，该核磁共振测量装置经配置用于通过对级分应用NMR测量来确定NMR参数，核磁共振参数指示在级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫；以及
d)评估装置，该评估装置经配置用于基于浓度参数和NMR参数来确定级分的所述至少一部分的靶标参数。
如本文所用，术语“系统”涉及彼此可操作地连接的所指示的装置的集合。所述装置可以在单个系统中实现或者可以为彼此可操作地连接的物理分离的装置。在一个实施例中，该系统适于对水溶液执行如上文所指定的分离步骤，以提供多个级分，以用于确定浓度参数、用于确定NMR参数并且用于确定在级分的至少一部分中的靶标参数。在一个实施例中，该系统进一步包括输出装置，该输出装置输出由评估装置执行的该确定的结果，在一个实施例中，在有序输出中，该输出装置将至少一个靶标参数分配至级分的至少一部分。在一个实施例中，该系统进一步适于提供满足预指定目标标准(特别是至少具有至少等于预指定阈值的靶标参数)的合并级分的制剂。在一个实施例中，该系统进一步包括液体分配元件，在一个实施例中为汇集装置或分配装置。因此，在一个实施例中，该系统进一步包括用于组合包含靶标化合物的级分中的至少两个级分的汇集装置和/或输出在步骤d)中确定的靶标参数的值的输出装置。在另一个实施例中，该系统包括配置为将级分分配至单独容器中的分配装置。在一个实施例中，该系统进一步包括数据存储装置，该数据存储装置经配置用于特别是以电子形式存储由系统的装置提供的数据、由用户输入提供的数据(特别是一个或多个阈值)，和/或用于执行分析的指令，特别是用于执行如上文所指定的算法的机器可读指令。如技术人员所理解的，所述数据存储装置可以为分离装置、浓度确定装置和/或NMR测量装置的一部分，和/或可以是可操作地连接至系统的其他装置的独立数据存储装置。
如本文所用，术语“分离装置”涉及经配置用于对水溶液应用分离步骤从而提供水溶液的多个级分的任何装置。上文已经描述了合适的分离步骤；因此，合适的分离装置特别地包括包含适当固相的色谱柱。如技术人员将理解的，分离装置可以包括本领域常用的其他装置，在一个实施例中，一个或多个泵、连接管、样品应用仪器、加热和/或冷却单元、压力传感器等。
如本文所用，术语“浓度确定装置”包括经配置用于确定如上文所指定的浓度参数的任何和所有装置。如根据上文将理解的，确定靶标化合物的浓度的具体方法将特别取决于靶标化合物的化学性质。在一个实施例中，浓度确定装置经配置用于在线测量，在另一个实施例中经配置用于连续在线测量。因此，在一个实施例中，浓度确定装置包括流通测量单元。在一个实施例中，用光度法确定浓度并且浓度确定装置包括光电池和光源。在一个实施例中，浓度确定装置为光度计，在一个实施例中，该浓度确定装置经配置用于在280nm处测量。合适的装置在本领域中是已知的。
如本文所用，术语“核磁共振测量装置”和“NMR测量装置”同样包括经配置用于通过对水溶液或级分应用NMR测量来确定NMR参数的任何和所有装置。在一个实施例中，NMR测量装置配置为在级分的至少一部分中执行核磁自旋弛豫值(在一个实施例中为水质子核磁自旋弛豫值)的测量。在一个实施例中，NMR测量装置经配置用于在线测量，在另一个实施例中经配置用于连续在线测量。合适的装置在本领域中是已知的，例如根据Metz&
Figure BDA0003793034260000231
(2008),Int J Pharmaceutics 364:170并且根据Taraban等人(2017),Anal Chem 89:5494和Taraban等人(2019)，第7届PANIC年度会议，壁报论文第35页：“Water Flow-NMR—AProspective Contact-Free In-Line Analytical Tool for ContinuousBiomanufacturing”。
如本文所用，术语“评估装置”涉及对由浓度确定装置确定的浓度参数和由NMR测量装置确定的NMR参数的装置应用如本文所指定的算法中的至少一个算法。因此，在一个实施例中，评估装置适于确定至少一个级分的靶标参数。在另一个实施例中，评估装置进一步配置为将靶标参数与如上文所指定的阈值进行比较。在一个实施例中，评估装置适于执行打印出至少一个级分的靶标参数的值和/或靶标参数的所述值与阈值的比较结果所需的所有计算和评估。在一个实施例中，评估装置包括数据处理装置，优选地为微处理器。
本发明还涉及根据本发明的系统的用途和/或根据本发明的方法的用途，以用于选自由以下项组成的组的目的：生产靶标化合物、纯化靶标化合物以及去除来自靶标化合物的制剂中的杂质。
如本文所用，术语“杂质”涉及降低如上文所指定的靶标化合物的纯度的所有化合物。因此，在一个实施例中，杂质为特定于产物的副产物、宿主细胞蛋白副产物、包含非期望的和/或缺乏期望的化学修饰的靶标化合物(例如非缀合的化合物(例如，缺乏LNA缀合的抗体))和/或物理修饰的靶标化合物，诸如如上文所指定的聚集体和其他衍生物。
本发明进一步涉及浓度确定装置和/或核磁共振测量装置用于根据本发明所述的方法来分离水溶液中的靶标化合物的用途。
本发明还涉及包括指令的计算机程序产品，当在包括计算机、浓度确定装置和核磁共振(NMR)测量装置的合适系统上执行该指令时，该指令至少导致执行以下步骤I)确定指示靶标化合物在包含靶标化合物的水溶液的至少一个级分中的浓度的浓度参数；
II)通过对所述至少一个级分应用NMR测量来确定核磁共振参数，NMR参数指示在所述至少一个级分中的核磁自旋弛豫；以及
III)基于浓度参数和NMR参数来确定所述至少一个级分的靶标参数。
本文进一步公开并提出了一种包括计算机可执行指令的计算机程序，当在计算机或计算机网络上执行该程序时，所述计算机可执行指令用于在本文公开的一个或多个实施例中执行根据本发明的方法。具体地，计算机程序可以存储在计算机可读数据载体上。因此，具体地，可通过使用计算机或计算机网络，优选地通过使用计算机程序来执行如上文所指示的一个、多于一个或甚至所有方法步骤I)至III)。
本文进一步公开并提出了一种具有程序代码工具的计算机程序产品，以便在计算机或计算机网络上执行该程序时，在本文所附的一个或多个实施例中执行根据本发明的方法。具体地，程序代码工具可存储在计算机可读数据载体上。
本文进一步公开并提出了一种具有存储在其上的数据结构的数据载体，在加载到计算机或计算机网络中之后，诸如在加载到计算机或计算机网络的工作存储器或主存储器中之后，该数据载体可执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法。
本文进一步公开并提出了一种具有存储在机器可读载体上的程序代码工具的计算机程序产品，以便在计算机或计算机网络上执行该程序时，执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法。如本文所用，计算机程序产品是指作为可交易产品的程序。该产品通常能够以任意格式(诸如以纸质格式)存在，或在计算机可读数据载体上存在。具体地讲，计算机程序产品可以分布在数据网络上。
本文进一步公开并提出了一种包含可由计算机系统或计算机网络读取的指令的调制数据信号，用于执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法。
参考本发明的计算机实现方面，可通过使用计算机或计算机网络来执行根据本文所公开的一个或多个实施例的方法的一个或多个方法步骤或甚至所有方法步骤。因此，一般来讲，可通过使用计算机或计算机网络来执行包括提供和/或处理数据的任何方法步骤。一般来讲，这些方法步骤可包括通常除需要手动操作(诸如提供样品和/或执行实际测量的某些方面)的方法步骤之外的任何方法步骤。
具体地，本文进一步公开了：
-计算机或计算机网络，该计算机或计算机网络包括至少一个处理器，其中该处理器适于执行根据本说明书中所述的实施例中的一个实施例的方法，
-计算机可加载数据结构，该计算机可加载数据结构适于当在计算机上执行该数据结构时，执行根据本说明书中所述的实施例中的一个实施例的方法，
-计算机程序，其中该计算机程序适于当在计算机上执行该程序时，执行根据本说明书中所述的实施例中的一个实施例的方法，
-计算机程序，该计算机程序包括程序工具，该程序工具用于当在计算机上或在计算机网络上执行该计算机程序时，执行根据本说明书中所述的实施例中的一个实施例的方法，
-计算机程序，该计算机程序包括根据前述实施例的程序工具，其中程序工具存储在计算机可读的存储介质上，
-存储介质，其中数据结构存储在该存储介质上并且其中该数据结构适于在已经被加载至计算机或计算机网络的主存储器和/或工作存储器中之后，执行根据本说明书中所述的实施例中的一个实施例的方法，以及
-计算机程序产品，该计算机程序产品具有程序代码工具，其中该程序代码工具能够被存储或被存储在存储介质上，以用于在计算机或计算机网络上执行该程序代码工具的情况下，执行根据本说明书中所述的实施例中的一个实施例的方法。
本发明还涉及一种数据库(在一个实施例中有形地嵌入在数据载体上)，该数据库包括分配给根据本文所述的分离方法而预先建立的对应浓度参数值、NMR参数值和/或靶标参数值的级分编号。本发明还涉及一种系统，该系统在如上文所指定的实施例中包括前述数据库，其中在一个实施例中，所述系统适于获得来自所述数据库的浓度参数值、NMR参数值和靶标参数值中的至少一者。
如技术人员将理解的，可以通过执行如本文所指定的分离方法并将级分编号与所指示的参数的对应值一起存储来建立数据库。因此，如果在相同或基本上相同的条件下重复分离方法，则可能不需要确定如方法中所指定的所有三个参数，并且可以从数据库中读取所述参数中的一个或多个参数。因此，原则上，在相同或基本上相同条件下重复分离方法的情况下，可以从数据库中读取靶标参数而无需确定浓度参数和/或NMR参数，或者可以从数据库中读取浓度参数和/或NMR参数。在一个实施例中，确定浓度参数和NMR参数中的至少一者，在一个实施例中为浓度参数，以确保分离方法中的分离确实为相同的。
本发明还涉及用于通过渗滤来增加溶液中靶标化合物的浓度的方法，该方法包括
A)确定所述溶液中或其级分中随时间推移的核磁共振参数(NMR参数)的第一梯度，
B)确定所述溶液中或其级分中随时间推移的所述NMR参数的第二梯度，以及
C)在所述NMR参数的所述第二梯度的值与所述NMR参数的所述第一梯度的值偏离至少10％、在一个实施例中至少20％、在另一个实施例中至少30％的情况下，至少暂时降低渗滤速率和/或增加搅拌速率。
用于增加靶标化合物的浓度的方法为体外方法，并且可以包括除了特别指示的那些步骤之外的步骤。
术语“增加溶液中靶标化合物的浓度”以其通常含义使用，并且涉及导致与该过程开始之前的浓度相比，在该过程之后靶标化合物的浓度偏高的任何过程。在一个实施例中，浓度增加在1.25倍至250倍、在一个实施例中为1.5倍至125倍、在另一个实施例中为2倍至50倍的范围内。在一个实施例中，靶标化合物为多肽并且起始浓度为至少0.5mg/ml、在一个实施例中为至少1mg/ml、在另一个实施例中为至少2mg/ml、在另一个实施例中为至少5mg/ml。
术语“渗滤”为技术人员已知的。在一个实施例中，渗滤为超滤(特别是在靶标化合物为多肽的情况下)，在另一个实施例中为切向流超滤。术语“渗滤速率”还被技术人员理解为涉及迫使滤液通过过滤膜的速率，或透过物产生的速率，即在一个实施例中，每时间单位产生的透过物的体积。因此，如本文所用，术语“降低渗滤速率”包括导致渗滤速率降低的任何和所有措施，在一个实施例中该渗滤速率基本上变为0，在另一个实施例中变为0。此类措施可以例如正在降低过滤膜的滞留物侧上的压力和/或增加过滤膜的透过物侧上的压力。在一个实施例中，至少暂时降低渗滤速率包括停止渗滤至少5min，在一个实施例中至少15min。如本文所用，术语“增加搅拌速率”包括增加在滞留物侧处平行于过滤膜的溶液流动和/或增加靶标化合物在滞留物内的再分配的所有措施。
如本文所用，术语“随时间推移的NMR参数的梯度”涉及溶液中所述NMR参数随时间推移的变化。在一个实施例中，NMR参数为NMR自旋弛豫参数，在一个实施例中为如上文所指定的水质子NMR参数。因此，在一个实施例中，NMR参数为在NMR测量中确定的横向弛豫时间(T2)或横向弛豫速率(R2)，在一个实施例中为在1H2O NMR测量中确定的横向弛豫时间(T2)或横向弛豫速率(R2)，即在一个实施例中为水质子横向弛豫时间(T2)或水质子横向弛豫速率(R2)。
根据增加靶标化合物的浓度的方法，确定NMR参数的至少两个梯度。如技术人员将理解的，在一个实施例中，通过确定相同的NMR参数或通过确定可以在数学上相互转化以用于进行比较的两个NMR参数来建立所述第一和第二梯度。如还应当理解的，对于第一和第二梯度，确定梯度的时间段不需要相同；尽管如此，在一个实施例中，确定所述NMR参数的第一梯度的时间段与确定所述NMR参数的第二梯度的时间段基本上相同，并且在一个实施例中为至多5min、在一个实施例中为至多2min、在另一个实施例中为至多1min。在一个实施例中，重复确定所述NMR参数的梯度，并且最近确定的所述NMR参数的梯度为所述NMR参数的第二梯度，并且在一个实施例中，倒数第二个确定的所述NMR参数的梯度为所述NMR参数的第一梯度。在一个实施例中，第一和第二梯度在时间上紧密地连续确定，在一个实施例中，用于确定所述NMR参数的第二梯度的时间段紧随用于确定所述NMR参数的第一梯度的时间段之后。因此，在一个实施例中，连续或半连续地确定所述NMR参数的梯度。
有利地，在本发明的基础工作中发现，在渗滤过程中的多肽的聚集可以经由测量经指示的NMR参数来非常早地检测到。令人惊讶的是，发现起始聚集可以通过NMR参数的相当突然的变化来检测到。
总结并且不排除另外的可能的实施例，可以设想以下实施例：
实施例1.一种分离方法，其包括：
i)提供包含靶标化合物的水溶液；
ii)对水溶液应用分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；
iii)确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；
iv)通过对级分应用核磁共振(NMR)测量来确定NMR参数，NMR参数指示在级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫；以及
v)基于浓度参数和NMR参数来确定级分的所述至少一部分的靶标参数。
实施例2.根据前述实施例所述的方法，其中靶标参数与浓度参数成正比，并且与作为横向弛豫时间(T2)的NMR参数成正比，在一个实施例中，与浓度参数和作为横向弛豫时间(T2)的NMR参数的乘积成正比。
实施例3.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中浓度参数和NMR参数被归一化。
实施例4.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中将靶标参数与阈值进行比较。
实施例5.根据前述实施例中任一项所述的方法，其进一步包括：
vi)基于靶标参数，鉴别包含靶标化合物的级分，在一个实施例中，基于靶标参数，鉴别包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。
实施例6.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述纯度为不存在所述靶标化合物的聚集体和/或降解产物的程度。
实施例7.根据前述两个实施例所述的方法，其进一步包括：
vii)组合包含靶标化合物的级分中的至少两个级分，在一个实施例中，基于靶标参数，组合包含处于所需纯度的靶标化合物的级分。
实施例8.根据前述实施例所述的方法，其中在步骤vii)中，组合靶标参数满足目标条件的级分。
实施例9.根据前述实施例所述的方法，其中，在步骤vii)中，组合靶标参数超过阈值的级分或靶标参数至少等于阈值的级分。
实施例10.根据前述五个实施例中任一项所述的方法，其中浓度参数和核磁共振参数中的一者或两者另外地受制于前提条件，其中取决于是否满足前提条件而执行对包含靶标化合物的级分的组合。
实施例11.根据前述实施例所述的方法，其中前提条件包括归一化的核磁共振参数小于浓度参数或至少等于浓度参数。
实施例12.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该方法包括基于靶标参数而对级分中的两个或更多个级分进行以下操作中的至少一个操作：自动发布、分配或组合。
实施例13.根据前述实施例所述的方法，其中使用基于靶标参数而控制的自动控制的液体分配元件，特别是自动阀。
实施例14.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤ii)中提供的级分的至少一部分具有不同的化学特性，在一个实施例中具有不同的pH值和/或盐浓度，并且其中步骤iv)包括针对不同的化学特性来校正NMR参数，特别是通过针对由不同化学特性所导致的背景来进行校正。
实施例15.根据前述实施例所述的方法，其中该方法包括对针对具有不同化学特性但不含靶标化合物的级分而测量的背景NMR参数进行测量。
实施例16.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中NMR参数包括横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2中的至少一者。
实施例17.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中NMR参数指示溶液或其级分中的水的横向核磁自旋弛豫，特别是溶液或其级分中的水中的质子的横向核磁自旋弛豫。
实施例18.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤iii)包括对产品样品应用光学测量，具体地，光学吸收测量和光学透射测量中的至少一者，更具体地，紫外线吸收测量和紫外线透射测量中的一者或多者。
实施例19.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中步骤ii)中的分离步骤包括色谱分离，在一个实施例中为尺寸排阻色谱或离子交换色谱，其中该级分为色谱分离的洗脱液的级分。
实施例20.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中级分具有不同的pH值和/或不同的离子浓度。
实施例21.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中该方法为连续在线方法。
实施例22.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤ii)中，级分作为连续的液体流而生成。
实施例23.根据前述实施例所述的方法，其中在连续的液体流上连续执行步骤iii)和iv)。
实施例24.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中靶标化合物包括，在一个实施例中该靶标化合物为，选自由以下项组成的组的化合物：(i)多肽、(ii)多核苷酸、(iii)(i)或(ii)中的一者的复合物；以及(iv)(i)至(iii)中的一者的缀合物；在一个实施例中为病毒衣壳或多肽，在另一个实施例中为非聚集多肽。
实施例25.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述靶标化合物包括，在一个实施例中该靶标化合物为，以下项中的至少一者：多肽的单体；多肽的寡聚物、多肽的聚集体；多肽的团聚体；多肽的聚合物；多肽的片段；在一个实施例中为多肽的单体或寡聚物。
实施例26.根据前述两个实施例中任一项所述的方法，其中所述靶标化合物的浓度为至少1mg/mL、在一个实施例中为至少5mg/mL、在另一个实施例中为至少10mg/mL、在另一个实施例为至少20mg/mL。
实施例27.一种分离系统，其包括：
a)分离装置，该分离装置经配置用于对包含靶标化合物的水溶液应用分离步骤，从而提供水溶液的多个级分；
b)浓度确定装置，该浓度确定装置经配置用于确定指示靶标化合物在级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；
c)核磁共振(NMR)测量装置，该核磁共振测量装置经配置用于通过对级分应用NMR测量来确定NMR参数，核磁共振参数指示在级分的所述至少一部分中的核磁自旋弛豫，在一个实施例中为水的NMR自旋弛豫；以及
d)评估装置，该评估装置经配置用于基于浓度参数和NMR参数来确定级分的所述至少一部分的靶标参数。
实施例28.根据前述实施例所述的系统，该系统经配置用于执行根据涉及方法的前述实施例中任一项所述的方法。
实施例29.根据前述两个实施例所述的系统，其中评估装置经配置用于将靶标参数与阈值进行比较。
实施例30.根据前述三个实施例中任一项所述的系统，该系统进一步包括：
e)用于组合包含靶标化合物的级分中的至少两个级分的液体分配元件和/或输出在步骤d)中确定的靶标参数的值的输出装置。
实施例31.根据前述两个实施例中任一项所述的系统的用途和/或根据涉及方法的前述实施例中任一项所述的方法的用途，以用于选自由以下项组成的组的目的：生产靶标化合物、纯化靶标化合物以及去除来自靶标化合物的制剂中的杂质。
实施例32.浓度确定装置和/或核磁共振测量装置用于根据涉及方法的前述实施例中任一项所述的方法来分离水溶液中的靶标化合物的用途。
实施例33.一种包括指令的计算机程序产品，当在包括计算机、浓度确定装置和核磁共振(NMR)测量装置的合适系统上执行该指令时，该指令至少导致执行以下步骤I)确定指示靶标化合物在包含靶标化合物的水溶液的至少一个级分中的浓度的浓度参数；
II)通过对所述至少一个级分应用NMR测量来确定核磁共振参数，NMR参数指示在所述至少一个级分中的核磁自旋弛豫，在一个实施例中为水的NMR自旋弛豫；以及
III)基于浓度参数和NMR参数来确定所述至少一个级分的靶标参数。
实施例34.根据前述实施例所述的计算机程序，其中根据涉及方法的前述实施例中任一项所述的方法来执行步骤I)、II)和/或III)。
实施例35.一种生产靶标化合物，特别是多肽的方法，该方法包括根据涉及方法的前述实施例中任一项所述的方法的步骤。
实施例36.一种根据涉及方法的前述实施例中任一项所述的方法生产或可生产的靶标化合物的制剂。
实施例37.一种用于通过渗滤来增加溶液中靶标化合物的浓度的方法，其包括
A)确定所述溶液中或其级分中随时间推移的核磁共振参数(NMR参数)的第一梯度，NMR参数指示溶液中的核磁自旋弛豫，在一个实施例中为水的NMR自旋弛豫；
B)确定所述溶液中或其级分中随时间推移的所述NMR参数的第二梯度，以及
C)在所述NMR参数的所述第二梯度的值与所述NMR参数的所述第一梯度的值偏离至少10％、在一个实施例中至少20％、在另一个实施例中至少30％的情况下，至少暂时降低渗滤速率和/或增加搅拌速率。
实施例38.根据前述实施例所述的方法，其中确定所述NMR参数的第一梯度的时间段与确定所述NMR参数的第二梯度的时间段基本上相同。
实施例39.根据前述两个实施例所述的方法，其中确定所述NMR参数的第一和/或第二梯度的时间段为至多5min、在一个实施例中为至多2min、在另一个实施例中为至多1min。
实施例40.根据前述三个实施例所述的方法，其中在所述至少一个NMR参数的所述第二梯度之前确定所述NMR参数的所述第一梯度。
实施例41.根据前述四个实施例所述的方法，其中重复确定所述NMR参数的梯度，并且其中最近确定的所述NMR参数的梯度为所述NMR参数的第二梯度，在一个实施例中，其中倒数第二个确定的所述NMR参数的梯度为所述NMR参数的第一梯度。
实施例42.根据前述五个实施例所述的方法，其中连续或半连续地确定所述NMR参数的梯度。
实施例43.根据前述六个实施例所述的方法，其中所述至少暂时降低渗滤速率包括停止渗滤至少5min，在一个实施例中至少15min。
实施例44：一种数据库(在一个实施例中有形地嵌入在数据载体上)，该数据库包括分配给根据实施例1至26中任一项所述的分离方法而预先建立的对应浓度参数值、NMR参数值和/或靶标参数值的级分编号。
实施例45：一种分离系统，该分离系统在根据实施例27至30中任一项所述的实施例中包括根据实施例44所述的数据库，在一个实施例中其中所述分离系统适于获得来自所述数据库的浓度参数值、NMR参数值和靶标参数值中的至少一者。
实施例46：根据实施例1至45中任一项所述的主题，其中所述靶标化合物的为免疫缀合物，该免疫缀合物包含(i)与PD-1结合的抗体和(ii)通过IL-2Rβγ进行信号传导的多肽，特别是IL-2多肽或IL-15多肽。
实施例47：根据实施例46所述的主题，其中IL-2多肽为突变IL-2多肽，其中突变IL-2多肽为包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:19编号)的人IL-2分子。
实施例48：根据实施例46或47所述的主题，其中IL-2多肽为突变IL-2多肽，其中突变IL-2多肽为包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:19编号)的人IL-2分子；并且其中该抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包括：根据Kabat编号，在位置71至73处含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR-H3，以及(b)轻链可变区(VL)，其包括：含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
实施例49：根据实施例46至48中任一项所述的主题，其中IL-2多肽为突变IL-2多肽，其中突变IL-2多肽为包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:19编号)的人IL-2分子；并且其中该抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包括：含有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HVR-H3，以及(b)轻链可变区(VL)，其包括：含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-L3。
实施例50：根据实施例46至49中任一项所述的主题，其中IL-2多肽为突变IL-2多肽，其中突变IL-2多肽为包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G(相对于人IL-2序列SEQ ID NO:19编号)的人IL-2分子；并且其中该抗体包括：(a)重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，和(b)轻链可变区(VL)，其包含与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18组成的组的氨基酸序列有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
实施例51：根据实施例46至50中任一项所述的主题，其中突变IL-2多肽进一步包含氨基酸取代T3A和/或氨基酸取代C125A。
实施例52：根据实施例47至51中任一项所述的主题，其中突变IL-2多肽包含SEQID NO:20的序列。
实施例53：根据实施例47至52中任一项所述的主题，其中免疫缀合物包含不超过一个突变IL-2多肽。
实施例54：根据实施例46至53中任一项所述的主题，其中所述抗体包含由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域。
实施例55：根据实施例54所述的主题，其中Fc结构域为IgG类，特别是IgG1亚类Fc结构域。
实施例56：根据实施例54或55所述的主题，其中Fc结构域为人Fc结构域。
实施例57：根据实施例46至56中任一项所述的主题，其中抗体为IgG类，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
实施例58：根据实施例54至57中任一项所述的主题，其中Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基进行缔合的修饰。
实施例59：根据实施例54至58中任一项所述的主题，其中在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内生成突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中；并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内生成空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。
实施例60：根据实施例54至59中任一项所述的主题，其中在Fc结构域的第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基替换(T366W)；并且在Fc结构域的第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基替换(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基替换(T366S)，且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基替换(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
实施例61：根据实施例60所述的主题，其中在Fc结构域的第一亚基中，另外地，位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基替换(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基替换(E356C)；并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地，位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基替换(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
实施例62：根据实施例54至61中任一项所述的主题，其中突变IL-2多肽在其氨基末端氨基酸处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的羧基末端氨基酸融合，特别是与Fc结构域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合，任选地通过连接肽进行融合。
实施例63：根据实施例62所述的主题，其中连接肽具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
实施例64：根据实施例54至63中任一项所述的主题，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体，特别是Fcγ受体的结合，和/或降低效应子功能，特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
实施例65：根据实施例64所述的主题，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自由L234、L235和P329(Kabat EU索引编号)组成的组的一个或多个位置处。
实施例66：根据实施例54至65中任一项所述的主题，其中Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)。
实施例67：根据实施例46至66中任一项所述的主题，其包含：含有与SEQ ID NO:22的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，含有与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，和含有与SEQ ID NO:25的序列有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
实施例68：根据实施例46至67中任一项所述的主题，其基本上由通过连接序列接合的突变IL-2多肽和IgG1免疫球蛋白分子组成。
实施例69：根据实施例1至45中任一项所述的主题，其中所述靶标化合物为融合蛋白，该融合蛋白包含(i)不能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和(ii)两个突变白介素-2(IL-2)分子，与野生型IL-2分子相比，其包含降低突变IL-2分子对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变，其中所述突变IL-2分子包含SEQ ID NO:30的序列。
实施例70：根据实施例69所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白分子，特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。
实施例71：根据实施例69或70所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子为人免疫球蛋白分子。
实施例72：根据实施例69至71中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含基于人Vh3-23种系序列的重链可变区序列。
实施例73：根据实施例69至72中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO:26的重链可变区序列。
实施例74：根据实施例69至73中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含基于人Vk3-20种系序列的轻链可变区序列。
实施例75：根据实施例69至74中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO:27的轻链可变区序列。
实施例76：根据实施例69至75中任一项所述的主题，其中与不含所述修饰的对应免疫球蛋白分子相比，所述免疫球蛋白分子包含降低免疫球蛋白分子与Fc受体的结合亲和力的修饰。
实施例77：根据实施例76所述的主题，其中所述Fc受体为Fcγ受体，特别是人Fcγ受体。
实施例78：根据实施例76或77所述的主题，其中所述Fc受体为活化性Fc受体。
实施例79：根据实施例76至78中任一项所述的主题，其中所述Fc受体选自由以下项组成的组：FcγRll la(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRlla(CD32)和FcaRI(CD89)。
实施例80：根据实施例76至79中任一项所述的主题，其中所述Fc受体为FcγRIIIa，特别是人FcγRIIIa。
实施例81：根据实施例69至80中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链的位置329(EU编号)处的氨基酸取代。
实施例82：根据实施例81所述的主题，其中所述氨基酸取代为P329G。
实施例83：根据实施例69至82中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链的位置234和235(EU编号)处的氨基酸取代。
实施例84：根据实施例83所述的主题，其中所述氨基酸取代为L234A和L235A(LALA)。
实施例85：根据实施例69至84中任一项所述的主题，其中所述免疫球蛋白分子包含在免疫球蛋白重链中的氨基酸取代L234A、L235A和P329G(EU编号)。
实施例86：根据实施例69至85中任一项所述的主题，其中所述突变IL-2分子各自在其N末端氨基酸处与所述免疫球蛋白分子的免疫球蛋白重链中的一个免疫球蛋白重链的C末端氨基酸融合，任选地通过肽接头。
实施例87：根据实施例69至86中任一项所述的主题，其中所述突变IL-2分子各自通过肽接头与所述免疫球蛋白分子融合。
实施例88：根据实施例87所述的主题，其中所述肽接头包含至少10个，特别是至少15个氨基酸。
实施例89：根据实施例87或88所述的主题，其中所述肽接头包含氨基酸序列(G4Sh(SEQ ID NO:31)。
实施例90：根据实施例69至89中任一项所述的主题，其中融合蛋白包含SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29的多肽序列。
实施例91：根据实施例1至45中任一项所述的主题，其中所述靶标化合物为双特异性抗体。
实施例92：根据实施例91所述的主题，其中所述靶标化合物为与CD3和第二抗原结合的双特异性抗体。
实施例93：根据实施例91或92所述的主题，其中所述靶标化合物为与CD3和CEA结合的双特异性抗体。
实施例94：根据实施例91至93中任一项所述的主题，其中所述靶标化合物为双特异性抗体，该双特异性抗体包含第一、第二和第三Fab分子和由两个亚基构成的Fc结构域。
实施例95：根据实施例94所述的主题，其中Fc结构域为IgG，具体地为IgG1，更具体地为人IgG1 Fc结构域。
实施例96：根据实施例94或95所述的主题，其中第一Fab分子在C末端处与第二Fab分子的N末端融合，第二Fab分子在C末端处与Fc结构域的亚基中的一个亚基的N末端融合，并且第三Fab分子在C末端处与Fc结构域的亚基中的另一个亚基的N末端融合。
实施例97：根据实施例94至96中任一项所述的主题，其中第二Fab分子与CD3结合，并且第一和第三Fab分子与第二抗原结合。
实施例98：根据实施例92至97中任一项所述的主题，其中第二抗原为CEA。
实施例99：根据实施例91至98中任一项所述的主题，其中所述靶标化合物为赛必妥单抗。
实施例100：根据实施例1至45中任一项所述的主题，其中靶标化合物为病毒或病毒样颗粒。
实施例101：根据实施例100所述的主题，其中靶标化合物为包含一种或多种多核苷酸的经填充的病毒或经填充的VLP。
实施例102：根据实施例100或101所述的主题，其中所述分离步骤为将经填充的病毒颗粒和/或经填充的VLP与空的病毒颗粒和/或空的VLP分离的步骤。
实施例103：根据前述实施例中任一项所述的主题，其中浓度参数与靶标化合物的浓度成正比。
实施例104：根据前述实施例中任一项所述的主题，其中浓度参数不是水质子横向弛豫时间T2并且不是水质子横向弛豫速率R2，在一个实施例中不是水质子横向弛豫NMR参数。
附图说明
优选地结合从属权利要求，在随后的实施例描述中将更详细地公开另外的任选特征和实施例。其中，如本领域技术人员将认识到的，各个任选特征可以按单独的方式以及按任何任意可行的组合来实现。本发明的范围不受优选的实施例的限制。在附图中示意性地描绘了实施例。其中，这些附图中相同的附图标记是指相同或功能上相当的元件。
在附图中：
图1示意性地示出了分离系统的示例性设置，该分离系统包括分离装置110，该分离装置例如配置为具有样品和流动相入口118的色谱柱；浓度确定装置112和NMR测量装置114对来自分离装置110的洗脱液执行在线测量并向评估装置116提供测量数据，所述评估装置116任选地引导液体分配元件120中的阀；作为替代，液体分配元件120可以自主操作并且例如在预定义的时间间隔内可以收集级分122。
图2示出了在示例中使用的化合物(抗体样蛋白(ALP))的概述；M：金属。
图3示出了在通过阳离子交换色谱法来纯化治疗性抗体的过程中的多种参数的图形表示；参数为：归一化c[蛋白质]：归一化为最高测量的蛋白质浓度的蛋白质浓度；归一化T2：归一化为最高测量T2值的T2值；归一化(T*C[蛋白质])：T2和c[蛋白质]的归一化乘积；归一化T2(不具有蛋白质的缓冲液)：在不存在抗体的情况下来自测试运行的归一化T2值；和归一化T2-归一化T2(不具有蛋白质的缓冲液)：归一化T2减去归一化T2(不具有蛋白质的缓冲液)。
图4示出了对于无应力(实线)和人工应力(虚线)蛋白质溶液，wNMR弛豫T2(y轴)取决于蛋白质浓度的增加(在该过程期间随着倍数体积减少(x轴)而增加)。插图示出溶液的外观，箭头表示开始聚集。
图5T2对血清型2(AAV2)的AAV颗粒的负载DNA的依赖性。
图6T2对血清型6(AAV6)的AAV颗粒的负载DNA的依赖性。
图7T2对血清型8(AAV8)的AAV颗粒的负载DNA的依赖性。
具体实施方式
实例1：材料和方法
抗体样蛋白
图2中给出了在示例中使用的抗体样蛋白(ALP)的概述。赛必妥单抗(ALP1)为靶向癌胚抗原(CEA)和CD3的2+1双特异性抗体，如WHO药物信息(药物的国际非专属名称)，推荐INN：清单80，2018，第32卷，第3期，第438页所述；IgG-IL2(ALP2)为介于IgG与两个IL-2肽(分别与重链融合)之间的融合蛋白，如WO 2015/118016 A1所述。如WO 2018/184964A1中所述，PD1-IL2(ALP3)为在C末端与IL-2肽融合的抗PD1抗体。ALP4为2+1双特异性融合蛋白，其包含与VH/VL结构域并且与金属复合物融合的IgG结构。
NMR
用Bruker minispec mq20光谱仪(20MHz；Bruker BioSpin GmbH,Rheinstetten,Germany)记录横向弛豫速率(R2)或时间(T2)。光谱仪配备有0.47T磁体和H20-10-25AVGX4探针。在20℃下，对于每个样品至少测量4份采集，其中样品体积为900μl。为了确定T2或R2，随后信号衰减至少持续5秒。
负载蛋白质的溶液的制备
所使用的蛋白质是从稳定转染的CHO细胞中表达的。将发酵上清液应用于MabSelect SuRe柱(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)并用其中pH<5的酸性缓冲溶液进行洗脱。洗脱后，通过添加足够量的1M Tris溶液来将蛋白质合并物的pH调整至5.0至5.5。
色谱法
SEC
在尺寸排阻色谱法之前，通过使用Amicon搅拌池和具有10kDa或30kDa截止值的超滤盘(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)进行超滤，来将蛋白A合并物的浓度增加至>20mg/ml。通过将30mg至180mg的蛋白A纯化蛋白样品加载至Superdex 200制备级柱(60cm柱高，1.6cm直径；GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)来进行尺寸排阻色谱。在20mM His/His-HCL、140mM NaCl、pH 5.5中以1.6ml/min的流速执行色谱运行。在洗脱期间，记录在280nm处的吸收并且收集级分。
CEX
对于阳离子交换色谱法(CEX)，在10ml Poros XS柱(20cm柱高，0.8cm直径；ThermoFisher,Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)上加载蛋白质，其中负载密度介于25mg/ml与30mg/ml之间。
对于电导率梯度洗脱，用40mM乙酸盐pH 5.5来平衡色谱柱。然后以2.0ml/min的流速加载蛋白A纯化蛋白溶液，并且用3柱体积(CV)的平衡缓冲液来洗涤色谱柱。为了洗脱结合的蛋白质，在pH 5.5或6.5下，使用在20CV或15CV内分别高达500mM或750mM的乙酸盐梯度和2.5ml/min的流速。在洗脱期间，记录在280nm处的吸附并且收集级分。
对于pH梯度洗脱，用20mM柠檬酸盐、20mM磷酸钠、20mM Tris、pH 5.0和介于50mM与100mM之间的NaCl浓度来平衡色谱柱。然后以2.0ml/min的流速加载蛋白A纯化蛋白溶液，并且用5CV的平衡缓冲液来洗涤色谱柱。为了洗脱结合的蛋白质，使用在20CV至30CV内从5.0至8.5的pH梯度和2.5ml/min的流速。在洗脱期间，记录280nm处的吸附并且收集洗脱液级分。
此外，对于电导率和pH梯度洗脱，还执行了缓冲液对照运行。对于这些运行，使用上述程序，但没有将蛋白质加载至色谱柱中。
分析SEC
通过分析SEC来分析色谱的合并物和级分。为此，将大约25μg(但不超过100μl)的蛋白质注射在TSKgel UP-SW3000柱(Tosoh Bioscience,Griesheim,Germany)上并在200mM磷酸钾、250mM氯化钾、pH 6.2中进行等度层析，其中流速为0.25ml/min。基于280nm处的吸收，使用Software Chromeleon 7(Thermo Fisher,Scientific,Waltham,Massachusetts,USA)来计算纯度。
UF
用具有400ml容器和30kDa Sartorius(Sartorius AG,
Figure BDA0003793034260000431
,Germany)膜的手动台式装置来进行超滤。该装置用0.5M NaOH再生，用水冲洗并用对应的缓冲液来进行平衡，直至平衡缓冲液的pH和电导率恒定。随后，由蛋白质溶液来交换平衡缓冲液。超滤在1巴至1.2巴的压力控制下运行。在发生所定义的体积减少后进行采样。对于每个样品确定蛋白质浓度、SE-HPLC和wNMR T2。进行了两组实验。一组实验在室温下，并且一组实验在人工应力条件下(50℃)。应用人工应力以在特定浓度下诱导快速HMW形成。.
实例2
如图1所示，在分离系统中，将样品118应用于分离装置118，该分离装置可以为LC柱、膜或过滤器、超速离心烧杯或离心烧杯、超滤装置等。通过分离步骤并且借助于液体分配元件120，形成其中至少两个级分的组成不同的级分122。在级分的至少一部分或其等分试样中，靶标化合物的浓度或靶标化合物所属的化合物类别的浓度由浓度确定装置112确定，该浓度确定装置具体可以为光度计，例如UV光度计。同样在级分的至少一部分或其等分试样中，NMR参数由NMR测量装置114确定，该测量装置特别地可以为台式NMR装置。浓度参数和/或NMR参数的确定可以在由液体分配元件120实际形成级分之前执行，如图1所示，例如通过流通测量来执行，或可以在形成已建立的级分或其等分试样中的级分之后执行。基于浓度参数和NMR参数的值，评估装置116确定靶标参数。
实例3
图3示出了在通过阳离子交换色谱法来纯化治疗性抗体的过程中的多种参数随洗脱体积推移而变化的图形表示。如应当理解的，通过在280nm处的吸收测量而进行蛋白质浓度(实线)的标准测量提供了宽峰，使得不可能确定哪些级分包含所需的单体抗体。相比之下，T2和c[蛋白质]的归一化产物(短虚线)的图形表示示出了窄得多的峰，特别排除了非期望的抗体的聚集体。
实例4
四种不同的抗体样蛋白(ALP，图2，表1)通过使用乙酸盐或pH梯度的阳离子交换色谱法或通过尺寸排阻色谱法(SEC)来应用于LC纯化。层析后，根据单独的c[蛋白质]确定(UV测量)、根据单独的归一化T2或根据T2和c[蛋白质]的归一化乘积(表2)来合并级分。用于色谱的合并物的组成如表1所示。从数据中可以明显地看出，使用T2和c[蛋白质]的组合作为靶标参数提供了经改善的产品纯度，并且特别地提供了经改善的高和/或低分子量污染物的去除。
表1：应用于所指示的LC柱的蛋白质溶液的组成；ALP：抗体样蛋白；HMW：高分子量(聚集体)，LMW：低分子量(降解产物)，na：不适用/未确定，SEC：尺寸排阻色谱。
靶标化合物 柱 HMW 二聚体 单体 LMW
ALP1 SEC 15.6 na 81.4 2.93
ALP1 Poros XS 10.2 na 85.0 4.81
ALP2 SEC 9.53 na 90.0 0.44
ALP3 Poros XS 5.58 na 93.1 1.34
ALP4 SEC 12.6 19.3 68.0 na
ALP4 Poros XS 10.5 21.75 67.7 na
Figure BDA0003793034260000451
实例4：对处于不同浓度的蛋白质溶液施加人工应力以诱导聚集，或不施加人工应力，并且测量wNMR-T2值。如图4所示，开始聚集导致T2信号快速下降，这可以用于检测超滤方法中的开始聚集。
实例5：经填充的和空的AAV衣壳
材料和方法
AAV颗粒
不同血清型的负载DNA的AAV颗粒以及空的AAV颗粒购自Virovek,Hayward,CA,United States of America。对于经填充的AAV颗粒，当一个基因组被包装在一个颗粒中时，vg/mL(病毒基因组/mL)的浓度等于vp/mL(病毒颗粒/mL)的浓度；对于空AAV颗粒，可以确定vp/mL的数量，例如通过将衣壳蛋白的数量与具有以vg/mL为单位的已知浓度的经填充的AAV颗粒制剂中的衣壳蛋白的数量进行比较。负载DNA的AAV颗粒的DNA包含用于具有CMV启动子的绿色荧光蛋白(CMV-GFP)的表达盒：
在含有0.001％普朗尼克F-68和0.22μm灭菌过滤器的1x PBS缓冲液中的AAV8-空的(Lot 19-564E)/AAV8-CMV-GFP(Lot 18-737)。
在含有0.001％普朗尼克F-68、100mM柠檬酸钠和0.22μm灭菌过滤器的1x PBS缓冲液中的AAV2-空的(Lot 19-604E)/AAV2-CMV-GFP(Lot17-600)。
在含有0.001％普朗尼克F-68、100mM柠檬酸钠和0.22μm灭菌过滤器的1x PBS缓冲液中的AAV6-空的(Lot 19-540E)/AAV2-CMV-GFP(Lot19-718)。
NMR
如上文实例1中指定的，记录横向弛豫速率(R2)或时间(T2)。
AAV样品的制备
样品通过分别以不同比率混合满的和空的AAV2、AAV6和AAV8颗粒而生成，该颗粒具有溶解在相同水溶液中的相同浓度(2*1013vg/ml)，该水溶液包含含有0.001％(w/v)普朗尼克F-68(对于AAV8)，和含有0.001％(w/v)普朗尼克F-68以及对于AAV2和AAV6，100mM柠檬酸钠的1x PBS缓冲液。样品无需进一步长期储存而进行测量，例如<0℃。
实例5.1
针对负载DNA的和空的AAV颗粒的不同比率来确定横向弛豫时间
将负载DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒混合在水溶液(AAV2和AAV6：含有0.001％(w/v)普朗尼克F-68、100mM柠檬酸钠的1x PBS缓冲液；AAV8：不含柠檬酸钠的相同缓冲液)中，以产生不同的满/空比率范围跨越0％至100％的负载DNA的AAV颗粒。这已针对血清型2、血清型6和血清型8的AAV颗粒而进行。对于单个样品，如上文章节“材料和方法”所概述，记录横向弛豫时间(T2)。结果在下表中呈现。
表3：不同地负载DNA的AAV2颗粒样品的T2值。
Figure BDA0003793034260000471
表4：不同地负载DNA的AAV6颗粒样品的T2值。
Figure BDA0003793034260000472
由于被认为是实验误差，对于拟合计算，75:25比率的值被排除。
表5：不同地负载DNA的AAV8颗粒样品的T2值。
Figure BDA0003793034260000473
使用线性和二阶多项式函数来拟合所获得的横向弛豫时间。结果在下表6中呈现。
表6：拟合结果。对于血清型6，示出该拟合，其包括(在括号中)并且排除75:25比率的数据。
Figure BDA0003793034260000481
图5示出了T2对血清型2(AAV2)的AAV颗粒的负载DNA的依赖性，即T2对水性样品中含有DNA的AAV2颗粒浓度的依赖性。可以看出，在2*1013个颗粒/mL的浓度下，空的AAV2颗粒(0％满)与完全负载DNA的AAV2颗粒(100％满)之间的弛豫时间的绝对差为197.1±6.4ms，而相对差为12.6±0.4％。数据点可以用R2值为0.996的二阶函数进行拟合。
图6示出了T2对血清型6(AAV6)的AAV颗粒的负载DNA的依赖性，即T2对水性样品中含有DNA的AAV6颗粒浓度的依赖性。可以看出，在2*1013个颗粒/mL的浓度下，空的AAV6颗粒(0％满)与完全负载DNA的AAV6颗粒(100％满)之间的弛豫时间的绝对差为149.8±22.1ms，而相对差为9.2±1.4％。数据点可以用R2值为0.9987的二阶函数进行拟合。
图7示出了T2对血清型8(AAV8)的AAV颗粒的负载DNA的依赖性，即T2对水性样品中含有DNA的AAV8颗粒浓度的依赖性。可以看出，在2*1013个颗粒/mL的浓度下，空的AAV8颗粒(0％满)与完全负载DNA的AAV8颗粒(100％满)之间的弛豫时间的绝对差为206.9ms，而相对差为14％。数据点可以用R2值为0.9633的二阶函数进行拟合。
文献：
Feng et al.(2015),Chem.Commun.51:6804
Hills et al.(1989),Molecular Physics,67(4):903-918)
Metz and
Figure BDA0003793034260000491
(2008),International Journal of Pharmceutics 364:170-175
Shigemitsu et al.(2016),Analytical Biochemistry 498:59-67
Taraban et al.(2015),Journal of Pharmaceutical Sciences 104:4132-4141
Taraban et al.(2017),Analytical Chemistry 89:5494-5502
Taraban et al.(2019),7th Annual PANIC Conference,Poster presentationP35:"Water Flow-NMR—A Prospective Contact-Free In-Line Analytical ToolforContinuous Biomanufacturing"
Taraban et al.(2019),Anal Chem 91(6):4107
WO 2012/015912A1
WO 2014/169229 A1
WO 2015/118016 A1
WO 2018/102681 A1
WO 2018/184964 A1
WO 2019/016154A1
附图标记列表
110 分离装置
112 浓度确定装置
114 NMR测量装置
116 评估装置
118 样品(水溶液)/流动相入口
120 液体分配元件
122 级分
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 用于靶标化合物纯化的方法/装置
<130> RD13582PC
<150> EP20157222.9
<151> 2020-02-13
<160> 31
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Ser Ser Tyr Thr
1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Gly Arg Val Tyr Phe
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Thr Ser Asp Asn Ser Phe
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Asn Tyr Asp Val Pro Trp
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Arg Asp Asn
1
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gly Gly Arg
1
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser Asp Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Arg Ser Ser
1
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Asn Tyr Asp Val Pro Trp
1 5
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 20
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 22
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
465 470 475 480
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
485 490 495
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
500 505 510
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
515 520 525
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
530 535 540
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
545 550 555 560
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
565 570 575
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
580 585 590
Ile Ser Thr Leu Thr
595
<210> 23
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 24
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 25
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser
20 25 30
Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS VH
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS VL
<400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS LC
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 29
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47GS HC(Fc wt,P329G LALA)-IL2 N88D
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 30
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-2 N88D T3A C125A
<400> 30
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asp Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)3 接头
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (24)

1.一种分离方法，其包括：
i)提供包含靶标化合物的水溶液；
ii)对所述水溶液应用分离步骤，从而提供所述水溶液的多个级分；
iii)确定指示所述靶标化合物在所述级分的至少一部分中的浓度的浓度参数；
iv)通过对所述级分应用核磁共振(NMR)测量来确定指示水的横向核磁自旋弛豫的NMR参数；以及
v)基于所述浓度参数和所述NMR参数来确定所述级分的所述至少一部分的靶标参数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NMR参数指示水中的质子的横向核磁自旋弛豫。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述NMR参数包括横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2中的至少一者。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述浓度参数与所述靶标化合物的所述浓度成正比。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述浓度参数不是指示水的横向核磁自旋弛豫的NMR参数。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述靶标参数与所述浓度参数成正比，并且与作为横向弛豫时间(T2)的所述NMR参数成正比。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述靶标参数与所述浓度参数和作为所述横向弛豫时间(T2)的所述NMR参数的乘积成正比。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其进一步包括步骤vi)基于所述靶标参数来鉴别包含处于所需纯度的所述靶标化合物的级分。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括步骤vii)组合包含处于所需纯度的所述靶标化合物的所述级分中的至少两个级分。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤ii)中的所述分离步骤包括色谱分离，其中所述级分为所述色谱分离的洗脱液的级分。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤ii)中的所述分离步骤包括尺寸排阻色谱法或离子交换色谱法。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法为连续在线方法，和/或其中在步骤ii)中，所述级分作为连续的液体流而生成。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述靶标化合物包括，在一个实施例中为，选自由以下项组成的组的化合物：(i)多肽、(ii)多核苷酸、(iii)(i)或(ii)中的一者的复合物；以及(iv)(i)至(iii)中的一者的缀合物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述靶标化合物包括，在一个实施例中为，多肽。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述靶标化合物包括，在一个实施例中为，非聚集多肽。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述靶标化合物为病毒或病毒样颗粒。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述浓度参数在直接光度测定中确定。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述浓度参数为所述靶标化合物的吸收、消光或荧光。
19.一种分离系统，其包括：
a)分离装置(110)，其经配置用于对包含靶标化合物的水溶液应用分离步骤，从而提供所述水溶液的多个级分(122)；
b)浓度确定装置(112)，其经配置用于确定指示所述靶标化合物在所述级分(122)的至少一部分中的浓度的浓度参数；
c)核磁共振(NMR)测量装置(114)，其经配置用于通过对所述级分(122)应用NMR测量来确定指示水的横向核磁自旋弛豫的NMR参数；以及
d)评估装置(116)，其经配置用于基于所述浓度参数和所述NMR参数来确定所述级分(122)的所述至少一部分的靶标参数。
20.根据权利要求19所述的系统，所述系统进一步包括：
e)用于组合包含所述靶标化合物的所述级分(122)中的至少两个级分的液体分配元件(120)和/或输出在步骤d)中确定的所述靶标参数的值的输出装置。
21.根据权利要求19或20所述的系统和/或根据权利要求1至18中任一项所述的方法用于选自由以下项组成的组的目的的用途：生产靶标化合物、纯化靶标化合物以及去除来自靶标化合物的制剂中的杂质。
22.一种生产靶标化合物，特别是多肽的方法，其包括根据权利要求1至18中任一项所述的方法的步骤。
23.一种依据根据权利要求1至18中任一项所述的方法生产或可生产的靶标化合物的制剂。
24.一种用于通过渗滤来增加溶液中靶标化合物的浓度的方法，其包括
A)确定所述溶液中或其级分中指示水的横向核磁自旋弛豫的随时间推移的核磁共振参数(NMR参数)的第一梯度，
B)确定所述溶液中或其级分中随时间推移的所述NMR参数的第二梯度，以及
C)在所述NMR参数的所述第二梯度的值与所述NMR参数的所述第一梯度的值偏离至少10％的情况下，至少暂时降低渗滤速率和/或增加搅拌速率。
CN202180014126.2A 2020-02-13 2021-02-12 用于靶标化合物纯化的方法/装置 Pending CN115087861A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20157222 2020-02-13
EP20157222.9 2020-02-13
PCT/EP2021/053429 WO2021160787A1 (en) 2020-02-13 2021-02-12 Method / device for target compound purification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115087861A true CN115087861A (zh) 2022-09-20

Family

ID=69699738

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180014521.0A Pending CN115135999A (zh) 2020-02-13 2021-02-12 用于通过核磁共振弛豫法来确定aav颗粒的负载状态的方法
CN202180014126.2A Pending CN115087861A (zh) 2020-02-13 2021-02-12 用于靶标化合物纯化的方法/装置

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180014521.0A Pending CN115135999A (zh) 2020-02-13 2021-02-12 用于通过核磁共振弛豫法来确定aav颗粒的负载状态的方法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20230047531A1 (zh)
EP (2) EP4103937A1 (zh)
JP (2) JP2023513347A (zh)
KR (1) KR20220137672A (zh)
CN (2) CN115135999A (zh)
AU (1) AU2021219957A1 (zh)
BR (1) BR112022015920A2 (zh)
CA (1) CA3168607A1 (zh)
IL (1) IL295143A (zh)
MX (1) MX2022009642A (zh)
WO (2) WO2021160799A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117179737B (zh) * 2023-11-06 2024-02-20 哈尔滨医科大学 多核素同步一体化磁共振成像核素定量系统及其使用方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3434346T (pt) 2010-07-30 2020-11-26 Medimmune Llc Polipéptidos ou imunoconjugados ativos purificados
EP2984482B1 (en) 2013-04-12 2020-09-09 University of Maryland, Baltimore Biopharmaceutical aggregation assessment using magnetic resonance relaxometry
CR20160333A (es) 2014-02-06 2016-09-05 F Hoffman-La Roche Ag Proteinas de fusión de interleucina-2 y usos de las mismas
WO2018102681A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 University Of Maryland, Baltimore Solvent nuclear magnetic resonance for noninvasive inspection of particle-containing products
ES2928718T3 (es) 2017-04-03 2022-11-22 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-PD-1 con una IL-2 mutante o con IL-15
GB201711481D0 (en) 2017-07-17 2017-08-30 Ucb Biopharma Sprl Protein purification

Also Published As

Publication number Publication date
BR112022015920A2 (pt) 2022-10-04
KR20220137672A (ko) 2022-10-12
EP4103937A1 (en) 2022-12-21
WO2021160799A1 (en) 2021-08-19
JP2023513347A (ja) 2023-03-30
WO2021160787A1 (en) 2021-08-19
MX2022009642A (es) 2022-09-07
IL295143A (en) 2022-09-01
US20230047531A1 (en) 2023-02-16
EP4103938A1 (en) 2022-12-21
AU2021219957A1 (en) 2022-08-04
CN115135999A (zh) 2022-09-30
JP2023513903A (ja) 2023-04-04
US20220381750A1 (en) 2022-12-01
CA3168607A1 (en) 2021-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6868572B2 (ja) アフィニティー精製工程を含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子の精製
JP2024123159A (ja) 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクターのくも膜下腔内投与
Marichal‐Gallardo et al. State‐of‐the‐art in downstream processing of monoclonal antibodies: Process trends in design and validation
CA2890575C (en) Antibody and antibody composition production method
JP2023081967A (ja) ジスルフィド結合の還元を最小限にする抗体製造法
CN110198952B9 (zh) 制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法
US20220381750A1 (en) Method / device for target compound purification
Horenstein et al. Design and scaleup of downstream processing of monoclonal antibodies for cancer therapy: from research to clinical proof of principle
Khanal et al. Adeno-associated viral capsid stability on anion exchange chromatography column and its impact on empty and full capsid separation
WO2023155918A1 (zh) Vegf结合分子及其医药用途
WO2022191971A1 (en) Parallel chromatography systems and methods
CN114014906A (zh) 一种利用阳离子交换层析纯化疏水性蛋白的方法
CN113912715A (zh) 一种抗α-突触核蛋白抗体及其相关产品和应用
WO2020084503A1 (en) A composition comprising antibody with reduced level of basic variants thereof
US20240255475A1 (en) METHOD FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs) USING AN AFFINITY MATRIX
WO2020183332A1 (en) Purification of adalimumab using tandem chromatography
Rodrigues Continuous polishing of recombinant antibodies after continuous precipitation
Stange Characterization of excipients for their application during purification of monoclonal antibodies and other therapeutic proteins
US20240092883A1 (en) Methods of purifying ranibizumab or a ranibizumab variant
WO2024165043A1 (en) Preparation methods for a highly concentrated pd1 antibody solution by applying single-pass tangential flow filtration (sptff)
US20220267370A1 (en) Process for Separating Antigen-Binding Polypeptide Monomers Comprising One or More Immunoglobulin Single Variable Domains from Aggregates of Said Monomers
CN118459586A (zh) 通过应用单程切向流过滤（sptff）制备高度浓缩的pd1抗体溶液的方法
CN117043173A (zh) 重组蛋白的纯化方法
CN116832154A (zh) 通过超滤/渗滤（uf/df）制备高度浓缩的pd1抗体溶液的方法
CN117756932A (zh) 抗鼠疫耶尔森氏菌LcrV抗原的重链抗体及其相关生物材料与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40078241

Country of ref document: HK