CN115135999A - 用于通过核磁共振弛豫法来确定aav颗粒的负载状态的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明至少部分基于以下发现：在包含病毒颗粒的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2分别取决于所述病毒颗粒的负载状态(满的与空的)。因此，本发明的一方面为一种用于确定样品中负载的病毒颗粒与空的病毒颗粒的比率的方法，所述方法包括以下步骤：确定与存在于包含负载的病毒颗粒和空的病毒颗粒的混合物的水溶液中的所述水分子的所述质子相关的核磁共振(NMR)参数，所述确定是通过对所述溶液应用NMR测量，以及基于校准函数，用在前一步骤中确定的所述NMR参数来确定负载的病毒颗粒与空的病毒颗粒的所述比率。

Description

用于通过核磁共振弛豫法来确定AAV颗粒的负载状态的方法
本发明属于基因疗法领域。更详细地，本文报道了一种用于确定病毒颗粒的负载状态的方法，即，满的病毒颗粒与空的病毒颗粒之间的比率。为了实现这一点，使用核磁共振。
背景技术
基因疗法广泛地指遗传物质的治疗性施用，以修改活细胞的基因表达，从而改变它们的生物特性。经过数十年的研究，基因疗法已经进入市场，并且预期将变得越来越重要。通常，基因疗法可以分为体内方法或离体方法。
如今，大多数体内疗法依赖于使用重组腺相关病毒(rAAV)载体的DNA递送。AAV为一种小型、天然存在的非致病性细小病毒，其由无包膜的二十面体衣壳构成。它包含大约4.7kb的线性单链DNA基因组。野生型AAV载体的基因组携带两个基因，rep和cap，其侧接反向末端重复序列(ITR)。ITR呈顺式为病毒复制和包装所必需的。rep基因编码四种不同的蛋白质，其表达由两个替代启动子P5和P19驱动。此外，通过选择性剪接来生成不同的形式。Rep蛋白具有多种功能，诸如例如DNA结合、核酸内切酶和解旋酶活性。它们在基因调控、位点特异性整合、切除、复制和包装中发挥作用。cap基因编码三种衣壳蛋白和一种组装激活蛋白。这些蛋白质的差异表达通过选择性剪接和选择性起始密码子使用来实现，并且由位于rep基因编码区的单个启动子P40驱动。
在工程化的治疗性rAAV载体中，病毒基因替换为转基因表达盒，该转基因表达盒仍然侧接病毒ITR，但在所选择的启动子的控制下编码目标基因。与野生型病毒不同，工程化的rAAV载体不会被位点特异性整合至宿主基因组中，在转导细胞的细胞核中主要保持游离型。
AAV本身不具有复制能力，但需要辅助基因的功能。这些在自然界中由合并感染的辅助病毒提供，诸如例如腺病毒或单纯疱疹病毒。例如，已知五种腺病毒基因(即E1A、E1B、E2A、E4和VA)对AAV复制至关重要。与编码蛋白质的其他辅助基因相比，VA为小RNA基因。
为了生产rAAV载体，将携带侧接ITR的转基因的治疗性DNA引入包装宿主细胞系中，该包装宿主细胞系还包含rep和cap基因以及所需的辅助基因以产生rAAV颗粒。由于包装效率(即，在包装细胞系内生成rAAV颗粒期间，将DNA引入病毒衣壳的效率)小于100％rAAV，因此所获得的rAAV颗粒制剂为满的(即，含有DNA的)病毒衣壳和空的(即，不含DNA的)病毒衣壳的混合物。由于治疗效果取决于治疗性DNA的成功转移，因此混合物的组成具有直接影响。
因此，需要方法以用于确定rAAV制剂中的分数以及满的衣壳和空的衣壳的比率。
核磁共振(NMR)为一种已经在广泛的应用中使用以研究生物分子的技术。关于样品中生物分子的不同方面的结论可以基于生物分子(例如蛋白质或肽)本身的NMR信号，或基于衍生自包含生物分子的溶液的NMR信号。例如，Shigemitsu等人(Anal.Biochem.498(2016)59-67)描述了淀粉样蛋白β肽单体和二聚体的NMR信号的测量。Metz和
Figure BDA0003795900650000021
(Int.J.Pharmaceut.364(2008)170-175)示出了用于表征乳液和脂质成分的NMR实验，该乳液和脂质成分可以具体地用于制药领域，特别是用于药物递送。
在WO 2014/169229中，报道了一种使用水分子的NMR弛豫速率作为生物制药制剂的聚集程度的指标的方法。
在WO 2018/102681中，报告了一种使用溶剂NMR信号的横向弛豫速率以非侵入性地评估含有颗粒的产品的方法，该含有颗粒的产品配制为溶剂中的悬浮液或乳液。
Hills等人(Mol.Phys.67(1989)903-918)报道了天然牛血清白蛋白(BSA)溶液中的横向水质子弛豫。
Feng等人(Chem.Commun.51(2015)6804)报道，水质子的横向弛豫速率可以用于量化水中蛋白质聚集和表面活性剂胶束化。
使用人胰岛素制剂，Taraban等人(J.Pharm.Sci.104(2015)4132-4141)证明水质子的横向弛豫速率可以用作用于检测并量化可见蛋白质聚集体和亚可见蛋白质聚集体两者的可靠和敏感指标。
Taraban等人(Anal.Chem.89(2017)5494-5502)报道了水NMR和常规技术(诸如尺寸排阻色谱、微流成像和动态光散射)对检测由不同的应力生成的单克隆抗体聚集体的存在的敏感性差异。
Taraban等人报道了水NMR的在线测量是可能的，并且取决于流动系统配置、流速、蛋白质浓度和蛋白质聚集(7th Annual PANIC Conference,2019,Poster presentationP35:“Water Flow-NMR-A Prospective Contact-Free In-Line Analytical Tool forContinuous Biomanufacturing”)。
发明内容
本文报道了一种用于确定样品中病毒颗粒的负载状态的方法。
本发明至少部分基于以下发现：在包含病毒颗粒的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2分别取决于病毒颗粒的负载状态。
因此，本发明的一方面为一种用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度的方法，
该方法包括以下步骤：
-通过对溶液应用核磁共振(NMR)测量来确定与存在于包含负载的病毒颗粒和空的病毒颗粒的混合物的水溶液中的水分子的质子相关的NMR参数，以及
-使用/基于校准函数，用在前一步骤中确定的NMR参数来确定负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度。
在一个实施例中，NMR参数表示溶液或其分数中水的横向核磁自旋弛豫，特别是水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫。
在一个实施例中，NMR参数为水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2或横向核磁自旋弛豫速率R2。
在一个实施例中，分离的(单体)病毒颗粒具有在5,000kDa至6,000kDa范围内的分子量。在一个优选的实施例中，分离的(单体)病毒颗粒具有5,000kDa至5,250kDa的分子量。
在一个实施例中，病毒颗粒为病毒、病毒样颗粒(VLP)或脂质体。在另一个实施例中，病毒颗粒为病毒或VLP。在另一个实施例中，病毒颗粒为无包膜病毒或无包膜病毒的VLP。在一个优选的实施例中，病毒颗粒为腺相关病毒颗粒(AAV颗粒)。
在一个实施例中，负载的病毒颗粒为含有DNA的病毒颗粒。在一个优选的实施例中，负载的病毒颗粒为含有DNA的AAV颗粒。
在一个实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度为至少1*1012vp/mL(病毒颗粒/mL)，在一个实施例中为至少5*1012vp/mL，在一个优选的实施例中为至少1*1013vp/mL，在一个实施例中为至少2*1013vp/mL。
在一个实施例中，水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液。在一个优选的实施例中，水溶液为包含去污剂和任选的柠檬酸盐的磷酸盐缓冲盐水溶液。
在一个实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含高达80％的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中高达80％的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为线性函数。
在一个实施例中，校准函数为二阶多项式函数。
在一个实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含高达100％的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中高达100％的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为二阶多项式函数。
在一个实施例中，校准函数基于针对至少两个(校准)样品确定的相同NMR参数，该至少两个(校准)样品具有不同的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的比率。
根据本发明的方法在某些实施例中为体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可能涉及例如产生包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒(的混合物)的水溶液，和/或本文其他地方所指示的步骤。此外，所述步骤中的一个或多个步骤可以由自动化设备执行。
本发明还涉及根据本发明的方法的用途，以用于选自由以下项组成的组的目的：产生重组AAV颗粒，并且释放(尤其是实时释放)重组AAV颗粒制剂以用于治疗应用。
因此，本发明的一方面为在AAV颗粒的一个优选的实施例中，使用横向核磁自旋弛豫时间T2以用于确定病毒颗粒的负载状态。
在一个实施例中，负载状态为含有DNA的病毒颗粒与空的病毒颗粒的比率。
在一个实施例中，负载状态为总病毒颗粒中含有DNA的病毒颗粒的分数。
在一个实施例中，负载状态为含有DNA的病毒颗粒的浓度。
在一个实施例中，在样品中确定负载状态。
在一个实施例中，该确定是在水溶液中，并且横向核磁自旋弛豫时间T2为水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2。
在一个实施例中，该用途为体外用途。
除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样，本文所呈现的特定特征，尤其是呈现为方面或实施例，可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于图示和描述的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施例的描述。其并不旨在穷举或将所公开的主题限制为所公开的那些实施例。
具体实施方式
本文报道了一种用于确定样品中的含有DNA的AAV颗粒的比率/分数/浓度的方法，其中该方法包括以下步骤：通过对溶液应用NMR测量来确定包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液中水分子的质子的水质子横向弛豫时间(T2)或水质子横向弛豫速率(R2)，然后基于校准函数，用所确定的核磁自旋弛豫来确定含有DNA的AAV颗粒的比率/分数/浓度。
本发明至少部分基于以下发现：包含更高阶蛋白质结构(例如含有DNA的AAV颗粒)的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2分别受更高阶蛋白质结构的内部组成影响。
本发明至少部分基于以下发现：在包含AAV颗粒的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2分别取决于AAV颗粒的DNA负载。
定义
可用于实施本发明的方法和技术描述于：例如Ausubel,F.M.(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，第I卷至第III卷(1997)；Glover,N.D.和Hames,B.D.编辑，DNA Cloning:A Practical Approach，第I卷和第II卷(1985),Oxford UniversityPress；Freshney,R.I.(编辑)，Animal Cell Culture–a practical approach,IRL PressLimited(1986)；Watson,J.D.等人，Recombinant DNA，第二版，CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.编辑，Cell Biology，第二版，Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique，第二版，Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
使用重组DNA技术能够生成核酸的衍生物。此类衍生物可例如在一个或几个核苷酸位置处通过置换、改变、交换、缺失或插入来修饰。修饰或衍生化可以例如借助定点诱变来进行。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如，Sambrook,J.等人，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA；Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
如本文所用，如果没有另做标注，术语“标准条件”涉及IUPAC标准环境温度和压力(SATP)条件，即，优选地，25℃的温度和100kPa的绝对压力；同样优选地，标准条件包括pH值为7。
必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞和本领域技术人员已知的其等同物，诸如此类。同样，术语“一个/一种”、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。
如本文所用，术语“水溶液”涉及任何液体制剂，其中溶剂中水(H2O)的浓度为至少50％(w/v)，在某个实施例中为至少75％(w/v)，在另一个实施例中为至少90％(w/v)，在另一个实施例中为至少95％(w/v)，在另一个实施例中为至少98％(w/v)，在另一个实施例中为至少99％(w/v)，在另一个实施例中为至少99.5％(w/v)。因此，术语“水溶液”涵盖液体制剂，该液体制剂包含高达50％(w/v)D2O或PEG(聚乙二醇)。
此外，如本文所用，术语“溶液”表示溶液中的化合物(溶质)的至少一个分数溶解在溶剂中。用于制备溶液的方法在本领域中是已知的。因此，在某个实施例中，术语“水溶液”涉及包含病毒颗粒(诸如AAV颗粒)的液体制剂，该病毒颗粒至少部分地溶解在溶剂中，该溶剂包含水，在某个实施例中由水组成。在一个实施例中，水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液。在一个优选的实施例中，水溶液为包含约0.001％(w/v)去污剂和任选地约100mM柠檬酸盐的磷酸盐缓冲盐水溶液。在一个实施例中，去污剂选自泊洛沙姆和聚山梨醇酯。泊洛沙姆可以以商品名
Figure BDA0003795900650000071
或
Figure BDA0003795900650000072
或
Figure BDA0003795900650000073
商购。聚山梨醇酯可以以商品名
Figure BDA0003795900650000074
和
Figure BDA0003795900650000075
商购。在一个实施例中，去污剂为泊洛沙姆188(商品名：Pluronic F-68)并且任选的柠檬酸盐为柠檬酸钠。磷酸盐缓冲盐水溶液包含约137mM氯化钠、约2.7mM氯化钾和约12mM作为磷酸氢盐和磷酸二氢盐的混合物的磷酸盐，调整至pH值为7.4。
术语“包括”还涵盖术语“包含……”。
术语“确定”如技术人员所理解的那样进行使用，并且涉及用合适的方法确定相关参数的值，特别是NMR参数。
在一些实施例中，该确定为离线确定。因此，在某些实施例中，分数或等分试样被转移至测量装置。
在其他实施例中，该确定为连续在线确定。因此，在某些实施例中，等分试样为虚拟等分试样。因此，在某些实施例中，等分试样作为连续的液体流而生成。在其他实施例中，任选地确定的浓度、NMR参数和/或任何其他参数在流通池中进行确定，特别是在浓度的情况下，在流通比色皿中进行确定。参数可以同时或依次进行确定，在具体实施例中，参数依次进行确定。
术语“空的衣壳”和“空的颗粒”是指病毒颗粒，例如AAV颗粒，该病毒颗粒包括病毒蛋白壳但整体或部分缺乏编码蛋白质或被转录为目标转录物的核酸。因此，空的衣壳无法起到将编码蛋白质或被转录为目标转录物的核酸转移到宿主细胞中的作用。
术语“内源性”表示某物在细胞内天然存在；由细胞自然产生；内源性基因座/细胞内源性基因座：细胞中天然存在的基因座。
如本文所用，术语“外源”是指核苷酸序列并非来源于特异性细胞，而是通过DNA递送方法(例如，通过转染、电穿孔或由病毒载体进行的转导)引入所述细胞中。因此，外源核苷酸序列是人工序列，其中人工性可以源自例如不同来源的子序列的组合(例如，具有SV40启动子的重组酶识别序列与绿色荧光蛋白质的编码序列的组合是人工核酸)或源自序列(例如仅编码膜结合受体的细胞外结构域或cDNA的序列)的部分的缺失，或者核碱基突变。术语“内源”是指来源于细胞的核苷酸序列。“外源”核苷酸序列可以具有碱基组成相同的“内源”对应物，但其中“外源”序列例如经由重组DNA技术被引入细胞中。
如本文所用，术语“杂质”表示降低病毒颗粒制剂(例如AAV颗粒制剂)的纯度的所有化合物，尤其是包括空的病毒颗粒。因此，在某些实施例中，杂质为AAV颗粒特异性副产物(尤其是空的AAV颗粒)和宿主细胞蛋白副产物。
“分离的”组合物是已经与其天然环境的组分分离的组合物。在一些实施例中，将组合物纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳、CE-SDS)或色谱(例如，尺寸排阻色谱或离子交换或反相HPLC)或扩增(PCR)方法确定的。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见Flatman,S.等人，J.Chrom.B848(2007)79-87。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“分离的”多肽或抗体是指已经与其天然环境的组分分离的多肽分子或抗体分子。
缩写为“NMR”的术语“核磁共振”具有技术人员所理解的含义。因此，缩写为“NMR参数”的术语“核磁共振参数”原则上涉及可以通过对样品(特别是包含含有DNA的病毒颗粒(例如AAV颗粒)和空的病毒颗粒(的混合物)的水溶液)应用核磁共振测量并且指示核磁自旋弛豫来确定的任何参数。在具体实施例中，NMR参数为可以从水质子NMR(1H2O NMR)导出的参数。
在具体实施例中，NMR参数包含或为在NMR测量中确定的弛豫时间或弛豫速率。在具体实施例中，NMR参数包含或为在1H2O NMR测量中确定的弛豫时间或弛豫速率。在其他实施例中，NMR参数包含或为水溶液或其等分试样中水的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2中的至少一者。在其他实施例中，NMR参数表示水溶液或其等分试样中水的横向核磁自旋弛豫，特别是溶液或其等分试样中水中的质子的横向核磁自旋弛豫。如技术人员所理解的，弛豫时间T为对应弛豫速率R的倒数，即T＝1/R。在某些实施例中，NMR参数为在NMR测量中确定的横向弛豫时间(T2)或横向弛豫速率(R2)。在某些实施例中，NMR参数为在1H2O NMR测量中确定的横向弛豫时间(T2)或横向弛豫速率(R2)。在一个优选的实施例中，NMR参数为水溶液或其等分试样中水的质子的水质子横向弛豫时间(T2)或水质子横向弛豫速率(R2)。在某些实施例中，在确定期间的磁场强度为0.1特斯拉(T)至24T，在某些实施例中为0.2T至10T，在其他实施例中为0.3T至5T，在其他实施例中为0.4T至2T。在一个实施例中，磁场强度在0.45T至0.50T的范围内。在一个优选的实施例中，磁场强度为约0.47T。在某些实施例中，共振频率为5MHz至500MHz，在其他实施例中为7.5MHz至200MHz，在其他实施例中为10MHz至100MHz，在其他实施例中为15MHz至50MHz。在一个优选的实施例中，共振频率为约20MHz。
在某些实施例中，NMR参数针对不是由病毒颗粒(例如AAV颗粒)引起的变化(特别是针对溶质效应)进行校正，这在某些实施例中可以基于pH值和/或离子浓度。在某些实施例中，此类校正通过使用具有已知病毒颗粒含量并且在其他方面与待测试的样品具有相同组成的样品执行预运行来进行提供。
因此，在某些实施例中，含有DNA的病毒颗粒(例如含有DNA的AAV颗粒)的比率/分数/浓度与NMR参数成正比，该NMR参数为水溶液中水分子的质子的横向弛豫时间(T2)。
如本文所用，术语“核磁共振测量装置”和“NMR测量装置”同样包括经配置用于通过对水溶液或其等分试样应用NMR测量来确定NMR参数的任何和所有装置。在某些实施例中，NMR测量装置配置为执行核磁自旋弛豫值的测量，在某些实施例中为水质子核磁自旋弛豫值的测量。在某些实施例中，NMR测量装置经配置用于在线测量，在其他实施例中用于连续在线测量。合适的装置在本领域中是已知的，例如来自Metz&
Figure BDA0003795900650000101
(Int.J.Pharmaceut.364(2008)170)并且来自Taraban等人(Anal.Chem.89(2017)5494；7thAnnual PANIC Conference,2019,Poster presentation P35:“Water Flow-NMR-AProspective Contact-Free In-Line Analytical Tool for ContinuousBiomanufacturing”)。
“重组AAV载体”衍生自病毒(例如AAV)的野生型基因组，方法为通过使用分子方法以从病毒(例如AAV)中去除野生型基因组，并且用非天然核酸(例如转录为转录物或编码蛋白质的核酸)替换它。通常，对于AAV，AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在AAV载体中。“重组”AAV载体区别于天然存在的病毒AAV基因组，因为病毒基因组的全部或部分已经替换为相对于天然病毒基因组核酸的非天然(即，异源)序列。因此，非天然序列的掺入将病毒载体(例如，AAV)定义为“重组”载体，在AAV的情况下该病毒载体可以称为“rAAV载体”。
可以包装重组病毒载体序列(例如，AAV载体序列)-在本文中称为“颗粒”-以用于随后离体、体外或体内的细胞感染(转导)。当重组载体序列被封装或包装至AAV颗粒中时，该颗粒也可以称为“AAV颗粒”或“rAAV颗粒”。此类颗粒包括封装或包装载体基因组的蛋白质。特定示例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下，包括衣壳蛋白，诸如AAV VP1、VP2和VP3。
如本文所用，术语“血清型”为用于指具有在血清学上不同于其他AAV血清型的衣壳的AAV的区别。血清学的独特性基于一种AAV的抗体相比于另一种AAV的抗体之间缺乏交叉反应性来进行确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)。尽管包括衣壳变体在内的AAV变体可能在血清学上与参考AAV或其他AAV血清型没有区别，但与参考AAV血清型或其他AAV血清型相比，它们至少有一个核苷酸或氨基酸残基不同。
在传统定义下，血清型是指已经针对血清测试了目标病毒，该血清对所有现有的和经表征的血清型具有特异性以用于中和活性，并且没有发现中和目标病毒的抗体。随着发现更多天然存在的病毒分离物和/或生成衣壳突变体，与任何当前存在的血清型可能存在或不存在血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具有血清学差异的情况下，该新病毒(例如AAV)将为对应的血清型的亚组或变体。在许多情况下，尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒执行中和活性的血清学测试，以确定它们是否具有根据血清型的传统定义的另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广泛地指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及血清学上并无不同的病毒(例如AAV)两者，它们可能在给定血清型的亚组或变体内。
术语“转导”和“转染”是指将分子例如核酸(质粒)引入细胞。当外源核酸已经被引入细胞膜内时，细胞已经被“转导”或“转染”。因此，“转导细胞”为其中已经被引入“核酸”或“多核苷酸”的细胞，或其中已经被引入外源核酸的其子代。在具体的实施例中，“转导”细胞(例如，在哺乳动物中，诸如细胞或组织或器官细胞)是在掺入外源分子例如核酸(例如，转基因)之后，细胞的遗传变化。“转导”细胞可以进行繁殖并且转录导入的核酸和/或表达蛋白质。
在“转导”或“转染”细胞中，核酸(质粒)可以或无法整合至基因组核酸中。如果引入的核酸整合至受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则它可以稳定地维持在该细胞或生物体中，并且进一步传递至受体细胞或生物体的子代细胞或生物体上或由其遗传.最后，引入的核酸可以在受体细胞或宿主生物体中存在于染色体外，或仅瞬时存在。许多技术为已知的，例如，参见，Graham等人(1973)Virology,52:456；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork；Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；和Chu等人(1981)Gene 13:197。此类技术可以用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞。
“转基因”在本文中用于方便地指旨在或已经被引入细胞或生物体中的核酸。转基因包括任何核酸，诸如转录为转录物或者编码多肽或蛋白质的基因。
“载体”是指重组质粒序列的一部分，其最终直接或者以单链或双链DNA或RNA的形式被包装或封装以形成病毒(例如，AAV)颗粒。在重组质粒用于构建或制造重组病毒颗粒的情况下，病毒颗粒不包括与重组质粒的载体序列不对应的“质粒”部分。重组质粒的该非载体部分称为“质粒骨架”，该质粒骨架对于质粒的克隆和扩增很重要，这是繁殖和重组病毒生产所需的过程，但它本身并没有被包装或封装至病毒(例如AAV)颗粒中。因此，“载体”是指由病毒颗粒(例如，AAV)包装或封装的核酸。
本发明的具体实施例
本发明至少部分基于以下发现：在包含病毒颗粒的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2分别取决于病毒颗粒的负载状态(满的与空的)。
因此，本发明的一方面为一种用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度的方法，
该方法包括以下步骤：
-通过对溶液应用核磁共振(NMR)测量来确定与存在于包含负载的病毒颗粒和空的病毒颗粒的混合物的水溶液中的水分子的质子相关的NMR参数；以及
-基于校准函数，用在前一步骤中确定的NMR参数来确定负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度。
在某些实施例中，NMR参数表示溶液或其分数中水的横向核磁自旋弛豫，特别是溶液或其分数中水中的质子的横向核磁自旋弛豫。
在某些实施例中，NMR参数为水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2或横向核磁自旋弛豫速率R2。
在某些实施例中，病毒颗粒为病毒、病毒样颗粒(VLP)或脂质体。在另一个实施例中，病毒颗粒为病毒或VLP。在另一个实施例中，病毒颗粒为无包膜病毒或无包膜病毒的VLP。在一个优选的实施例中，病毒颗粒为腺相关病毒颗粒(AAV颗粒)。
在某些实施例中，负载的病毒颗粒为含有DNA的病毒颗粒。在一个优选的实施例中，负载的病毒颗粒为含有DNA的AAV颗粒。
在某些实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度等于至少1*1012vg/mL，在一个实施例中至少5*1012vg/mL，在一个优选的实施例中至少1*1013vg/mL，在一个实施例中至少2*1013vg/mL。
在某些实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度为至少1*1012vp/mL(病毒颗粒/mL)，在一个实施例中为至少5*1012vp/mL，在一个优选的实施例中为至少1*1013vp/mL，在一个实施例中为至少2*1013vp/mL。
在某些实施例中，水溶液的pH值在pH 7至pH 8的范围内。在一个优选的实施例中，水性样品的pH值为约7.4。
在某些实施例中，水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液。在一个优选的实施例中，水溶液为包含去污剂和任选的柠檬酸盐，尤其是约0.001％(w/v)去污剂和任选地约100mM柠檬酸盐的磷酸盐缓冲盐水溶液。
在某些实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含高达100％的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中高达100％的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为线性函数。
在某些实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含介于50％与100％之间的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中介于50％与100％之间的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为线性函数。
在某些实施例中，校准函数为二阶多项式函数。
在某些实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含高达100％的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中高达100％的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为二阶多项式函数。
在某些实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含介于50％与100％之间的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中介于50％与100％之间的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为二阶多项式函数。
在某些实施例中，校准函数基于针对至少两个样品确定的相同NMR参数，该至少两个样品具有不同的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的比率。
根据本发明的方法为体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可能涉及例如产生包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒(的混合物)的水溶液，和/或本文其他地方所指示的步骤。此外，所述步骤中的一个或多个步骤可以由自动化设备执行。
本发明还涉及根据本发明的方法的用途，以用于选自由以下项组成的组的目的：产生AAV颗粒、纯化AAV颗粒、从AAV颗粒的制剂中去除杂质，并且释放(尤其是实时释放)重组AAV颗粒制剂以用于治疗应用。
本发明至少部分地进一步基于以下发现：在包含AAV颗粒的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2和横向核磁自旋弛豫速率R2分别取决于AAV颗粒的负载状态(满的与空的)。
本发明至少部分基于：横向核磁自旋弛豫时间T2可以用于独立于AAV颗粒的血清型确定AAV颗粒的负载状态，因此独立于AAV颗粒的血清型。
更详细地，已发现含有DNA的AAV颗粒的分数/比率/百分比/浓度可以通过以下方式来获得：由水质子NMR(1H2O NMR)确定包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的水溶液中的横向核磁自旋弛豫时间T2并且将所述时间与标准/校准值相关联。即，已经发现水质子横向自旋弛豫时间T2与水性样品中含有DNA的AAV颗粒的分数/比率/百分比/浓度相关。
图1示出了T2对血清型2(AAV2)的AAV颗粒的DNA负载的依赖性，即T2对水性样品中的含有DNA的AAV2颗粒的浓度的依赖性。可以看出，在浓度为2*1013颗粒/mL时，空的AAV2颗粒(0％满)与完全含有DNA的AAV2颗粒(100％满)之间的弛豫时间T2的绝对差异为197.1±6.4ms，并且相对差异为12.6±0.4％。数据点可以用R2值为0.996的二阶多项式函数来进行拟合。
图2示出了T2对血清型6(AAV6)的AAV颗粒的DNA负载的依赖性，即T2对水性样品中的含有DNA的AAV6颗粒的浓度的依赖性。可以看出，在浓度为2*1013颗粒/mL时，空的AAV6颗粒(0％满)与完全含有DNA的AAV6颗粒(100％满)之间的弛豫时间T2的绝对差异为149.8±22.1ms，并且相对差异为9.2±1.4％。数据点可以用R2值为0.9987的二阶多项式函数来进行拟合。
图3示出了T2对血清型8(AAV8)的AAV颗粒的DNA负载的依赖性，即T2对水性样品中的含有DNA的AAV8颗粒的浓度的依赖性。可以看出，在浓度为2*1013颗粒/mL时，空的AAV8颗粒(0％满)与完全含有DNA的AAV8颗粒(100％满)之间的弛豫时间T2的绝对差异为206.9ms，并且相对差异为14％。数据点可以用R2值为0.9633的二阶多项式函数来进行拟合。
不受该理论的束缚，假设空的AAV颗粒(0％满)与完全含有DNA的AAV颗粒(100％满)之间的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少5％则足以执行根据本发明的方法。
因此，本发明的一方面为一种用于确定样品中含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的比率的方法。
因此，本发明的一方面为一种用于确定相对于样品中所有AAV颗粒的含有DNA的AAV颗粒的分数的方法。
因此，本发明的一方面为一种用于确定样品中的含有DNA的AAV颗粒的浓度的方法。
根据本发明这三方面的方法包括以下步骤：
-通过对溶液应用核磁共振(NMR)测量来确定包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液(的等分试样)中水分子的质子的NMR参数；以及
-基于校准函数，用在前一步骤中确定的NMR参数来确定含有DNA的AAV颗粒的比率/分数/浓度。
在具体实施例中，NMR参数表示溶液或其等分试样中水的横向核磁自旋弛豫，特别是溶液或其等分试样中水中的质子的横向核磁自旋弛豫。
在具体实施例中，NMR参数为水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2或横向核磁自旋弛豫速率R2。
在一个优选的实施例中，NMR参数为水溶液中水分子的质子的水质子横向弛豫时间(T2)。
在具体实施例中，根据本发明的方法在以下条件下执行：其中用100％空的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2和用100％含有DNA的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少5％。在一个实施例中，该方法在以下条件下执行：其中用100％空的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2和用100％含有DNA的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少8％。在一个优选的实施例中，该方法在以下条件下执行：其中用100％空的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2和用100％含有DNA的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少10％。在一个实施例中，条件为温度、水溶液中AAV颗粒的总浓度、磁场强度、共振频率、缓冲条件、任选的去污剂浓度和任选的盐浓度。两个横向核磁自旋弛豫时间T2中的较小的横向核磁自旋弛豫时间被设置为100％以用于计算相对差异。根据以下方程式来进行该计算：
Figure BDA0003795900650000171
在具体实施例中，在确定NMR参数期间的磁场强度为0.1T至24T，在某些实施例中为0.2T至10T，在其他实施例中为0.3T至5T，在其他实施例中为0.4T至2T。在一个实施例中，磁场强度在0.45T至0.50T的范围内。在一个优选的实施例中，磁场强度为约0.47T。
在具体实施例中，在确定NMR参数期间的共振频率为5MHz至500MHz，在其他实施例中为7.5MHz至200MHz，在其他实施例中为10MHz至100MHz，在其他实施例中为15MHz至50MHz。在一个优选的实施例中，共振频率为约20MHz。
在具体实施例中，该方法在约室温下执行。在一个实施例中，该方法在18℃至25℃范围内的温度下执行。在一个实施例中，该方法在19℃至22℃范围内的温度下执行。在一个优选的实施例中，该方法在约20℃的温度下执行。
在具体实施例中，水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液。在一个实施例中，水溶液为包含去污剂的磷酸盐缓冲盐水溶液。在一个实施例中，去污剂选自由以下项组成的组：泊洛沙姆和聚山梨醇酯。在一个实施例中，去污剂选自由以下项组成的去污剂组：泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯100。在一个实施例中，去污剂以约0.001％(w/v)的浓度存在。在一个优选的实施例中，去污剂为泊洛沙姆188。在另一个实施例中，水溶液进一步包含柠檬酸盐(柠檬酸的盐)。在一个实施例中，柠檬酸盐以100mM的浓度存在。在一个优选的实施例中，柠檬酸盐为柠檬酸钠。磷酸盐缓冲盐水溶液包含约137mM氯化钠、约2.7mM氯化钾和约12mM作为磷酸氢盐和磷酸二氢盐的混合物的磷酸盐，调整至pH值为7.4。
在具体实施例中，AAV颗粒具有选自由以下项组成AAV血清型组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9以及它们的混合物和嵌合体。在一个实施例中，AAV颗粒具有选自由以下项组成AAV血清型组的血清型：AAV2、AAV4、AAV6、AAV8和AAV9。在一个优选的实施例中，AAV颗粒为AAV2血清型、或AAV6血清型或AAV8血清型。
在具体实施例中，AAV颗粒为AAV8颗粒并且水溶液为额外地包含约0.001％(w/v)泊洛沙姆188的磷酸盐缓冲盐水溶液。
在具体实施例中，AAV颗粒为AAV2颗粒并且水溶液为额外地包含约0.001％(w/v)泊洛沙姆188和约100mM柠檬酸钠的磷酸盐缓冲盐水溶液。
在具体实施例中，AAV颗粒为AAV6颗粒并且水溶液为额外地包含约0.001％(w/v)泊洛沙姆188和约100mM柠檬酸钠的磷酸盐缓冲盐水溶液。
在具体实施例中，该方法包括作为第一步骤的步骤
-提供包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液。
在具体实施例中，该方法包括作为第二步骤的步骤
-确定水溶液中AAV颗粒的总浓度。
在具体实施例中，校准函数基于针对至少两个样品确定的相同NMR参数，该至少两个样品具有不同的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的已知浓度和/或比率。
在具体实施例中，校准函数为线性函数。
在一个实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含高达80％的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中高达80％的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为线性函数。
在具体实施例中，通过以下方式来获得校准函数：确定两个校准样品的相同NMR参数，第一校准样品包含比率在10:90至30:70范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约25:75，并且第二校准样品包含比率在70:30至90:10范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约75:25；并且与线性函数拟合以提供校准函数。
在具体实施例中，通过以下方式来获得校准函数：确定两个校准样品的相同NMR参数，第一校准样品仅包含含有DNA的AAV颗粒或仅包含空的AAV颗粒，并且第二校准样品选自由以下样品组成的校准样品组：包含比率在10:90至30:70的范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的样品，在一个优选的实施例中比率为约25:75，包含比率在40:60至60:40的范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的样品，在一个优选的实施例中比率为约50:50，以及包含比率在70:30至90:10的范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的样品，在一个优选的实施例中比率为约75:25；并且与线性函数拟合以提供校准函数。
在具体实施例中，通过以下方式来获得校准函数：确定至少三个校准样品的相同NMR参数，第一校准样品包含比率在0:100至30:70范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约0:100或25:75，第二校准样品包含比率在40:60至60:40范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约50:50，并且第三校准样品包含比率在70:30至100:0的范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约75:25或100:0；并且与线性函数拟合以提供校准函数。
在具体实施例中，通过以下方式来获得校准函数：确定至少三个校准样品的相同NMR参数，第一校准样品包含比率在0:100至30:70范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约0:100或25:75，第二校准样品包含比率在40:60至60:40范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约50:50，并且第三校准样品包含比率在70:30至100:0的范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约75:25或100:0；并且将第一校准样品和第二校准样品与第一线性校准函数拟合，以用于从0:100直至并包括比率50:50的比率，并且将第二校准样品和第三校准样品与第二线性校准函数拟合，以用于从并不包括50:50至100:0的比率。
在一个实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含介于75％与100％之间的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中介于50％与100％之间的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为线性函数。
在具体实施例中，通过以下方式来获得校准函数：确定两个校准样品的相同NMR参数，第一校准样品包含比率在40:60至60:40范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约50:50，并且第二校准样品包含比率在70:30至90:10范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约75:25；并且与线性函数拟合以提供校准函数。
在具体实施例中，校准函数为二阶多项式函数。
在一个实施例中，该方法用于确定样品中的负载的病毒颗粒的比率/分数/浓度，其中样品包含高达100％的含有DNA的病毒颗粒，在一个优选的实施例中高达100％的含有DNA的AAV颗粒，并且校准函数为二阶多项式函数。
在具体实施例中，通过以下方式来获得校准函数：确定至少三个校准样品的相同NMR参数，第一校准样品包含比率在0:100至30:70范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约0:100或25:75，第二校准样品包含比率在40:60至60:40范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约50:50，并且第三校准样品包含比率在70:30至100:00的范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，在一个优选的实施例中比率为约75:25或100:0；并且与线性函数拟合以提供校准函数。
然后，校准函数用于基于未知样品的所确定的NMR参数来获得相应的比率/分数/浓度。
在具体实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度为至少1*1012病毒颗粒/mL(vp/mL)。在一个实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度为至少5*1012vp/mL。在一个优选的实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度为至少1*1013vp/mL。在一个实施例中，水溶液中病毒颗粒的总浓度为至少2*1013vg/mL。
在具体实施例中，水溶液具有至少900μL的体积。
根据本发明的方法为体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可能涉及例如产生包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒(的混合物)的水溶液，和/或本文其他地方所指示的步骤。此外，所述步骤中的一个或多个步骤可以由自动化设备执行。
本发明还涉及根据本发明的方法的用途，以用于选自由以下项组成的组的目的：产生AAV颗粒、纯化AAV颗粒、从AAV颗粒的制剂中去除杂质，并且释放(尤其是实时释放)重组AAV颗粒制剂以用于治疗应用。
具体地，本发明的一方面为使用横向核磁自旋弛豫时间T2以用于确定AAV颗粒的负载状态。在一个实施例中，负载状态为含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的比率。在一个实施例中，负载状态为样品中的含有DNA的AAV颗粒的分数。在一个实施例中，负载状态为样品中含有DNA的AAV颗粒的浓度。
因此，本发明的一个优选方面为一种用于确定样品中的含有DNA的AAV颗粒的浓度的方法，
其中该方法包括以下步骤：
a)通过核磁共振(NMR)来确定包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2；以及
b)基于校准函数，用在步骤a)中确定的横向核磁自旋弛豫时间T2来确定水溶液中含有DNA的AAV颗粒的浓度，
其中AAV颗粒为AAV2或AAV6或AAV8血清型，
其中水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液，该磷酸盐缓冲盐水溶液进一步包含约0.001％(w/v)的泊洛沙姆或聚山梨醇酯，并且任选地进一步包含约100mM的柠檬酸盐，
其中水性样品中AAV颗粒的总浓度为至少5*1012颗粒/mL，
任选地，其中i)如果水性样品包含高达80％的含有DNA的AAV颗粒，则校准函数为线性函数或二阶多项式函数，或ii)如果水溶液包含高达100％的含有DNA的AAV颗粒，则校准函数为线性函数或二阶多项式函数，或iii)对于包含介于0％与小于80％之间的含有DNA的AAV颗粒的水溶液，校准函数为线性函数，并且对于包含介于80％与100％之间的含有DNA的AAV颗粒的水溶液，校准函数为二阶多项式函数，
任选地，其中步骤a)中的确定在温度、水溶液中AAV颗粒的总浓度、磁场强度、共振频率、缓冲条件、任选的去污剂浓度和任选的盐浓度下执行，在该条件下，用100％空的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2和用100％含有DNA的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少10％。
因此，本发明的一个优选方面为一种用于确定样品中的含有DNA的AAV颗粒的分数的方法，
其中该方法包括以下步骤：
a)通过核磁共振(NMR)来确定包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2；以及
b)基于校准函数，用在步骤a)中确定的横向核磁自旋弛豫时间T2来确定水溶液中的AAV颗粒总数中含有DNA的AAV颗粒的分数，
其中AAV颗粒为AAV2或AAV6或AAV8血清型，
其中水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液，该磷酸盐缓冲盐水溶液进一步包含约0.001％(w/v)的泊洛沙姆或聚山梨醇酯，并且任选地进一步包含约100mM的柠檬酸盐，
其中水性样品中AAV颗粒的总浓度为至少5*1012颗粒/mL，
任选地，其中i)如果水性样品包含高达80％的含有DNA的AAV颗粒，则校准函数为线性函数或二阶多项式函数，或ii)如果水溶液包含高达100％的含有DNA的AAV颗粒，则校准函数为线性函数或二阶多项式函数，或iii)对于包含介于0％与小于80％之间的含有DNA的AAV颗粒的水溶液，校准函数为线性函数，并且对于包含介于80％与100％之间的含有DNA的AAV颗粒的水溶液，校准函数为二阶多项式函数，
任选地，其中步骤a)中的确定在温度、水溶液中AAV颗粒的总浓度、磁场强度、共振频率、缓冲条件、任选的去污剂浓度和任选的盐浓度下执行，在该条件下，用100％空的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2和用100％含有DNA的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少10％。
因此，本发明的一个优选方面为一种用于确定样品中含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的比率的方法，
其中该方法包括以下步骤：
a)通过核磁共振(NMR)来确定包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液中水分子的质子的横向核磁自旋弛豫时间T2；以及
b)基于校准函数，用在步骤a)中确定的横向核磁自旋弛豫时间T2来确定水溶液中含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的比率，
其中AAV颗粒为AAV2或AAV6或AAV8血清型，
其中水溶液为磷酸盐缓冲盐水溶液，该磷酸盐缓冲盐水溶液进一步包含约0.001％(w/v)的泊洛沙姆或聚山梨醇酯，并且任选地进一步包含约100mM的柠檬酸盐，
其中水性样品中AAV颗粒的总浓度为至少5*1012颗粒/mL，
任选地，其中i)如果水性样品包含高达80％的含有DNA的AAV颗粒，则校准函数为线性函数或二阶多项式函数，或ii)如果水溶液包含高达100％的含有DNA的AAV颗粒，则校准函数为线性函数或二阶多项式函数，或iii)对于包含介于0％与小于80％之间的含有DNA的AAV颗粒的水溶液，校准函数为线性函数，并且对于包含介于80％与100％之间的含有DNA的AAV颗粒的水溶液，校准函数为二阶多项式函数，
任选地，其中步骤a)中的确定在温度、水溶液中AAV颗粒的总浓度、磁场强度、共振频率、缓冲条件、任选的去污剂浓度和任选的盐浓度下执行，在该条件下，用100％空的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2和用100％含有DNA的AAV颗粒确定的横向核磁自旋弛豫时间T2的相对差异为至少10％。
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
附图说明
图1 T2对血清型2(AAV2)的AAV颗粒DNA负载的依赖性。
图2 T2对血清型6(AAV6)的AAV颗粒DNA负载的依赖性。
图3 T2对血清型8(AAV8)的AAV颗粒DNA负载的依赖性实例
材料和方法
AAV颗粒
不同血清型的含有DNA的AAV颗粒以及空的AAV颗粒购自Virovek,Hayward,CA,United States of America，浓度为2*1013vg/mL。当一个基因组被包装在一个颗粒中时，vg/mL(病毒基因组/mL)的浓度等于vp/mL(病毒颗粒/mL)的浓度。含有DNA的AAV颗粒的DNA包含具有CMV启动子的绿色荧光蛋白表达盒(CMV-GFP)：
在含有0.001％(w/v)Pluronic F-68和灭菌的0.22μm过滤器的1x PBS缓冲液中的AAV8-空(Lot 19-564E)/AAV8-CMV-GFP(Lot 18-737)。
在含有0.001％(w/v)Pluronic F-68、100mM柠檬酸钠和灭菌的0.22μm过滤器的1xPBS缓冲液中的AAV2-空(Lot 19-604E)/AAV2-CMV-GFP(Lot 17-600)。
在含有0.001％(w/v)Pluronic F-68、100mM柠檬酸钠和灭菌的0.22μm过滤器的1xPBS缓冲液中的AAV6-空(Lot 19-540E)/AAV2-CMV-GFP(Lot 19-718)。
NMR
横向弛豫速率(R2)或时间(T2)用Bruker minispec mq20光谱仪(20MHz；BrukerBioSpin GmbH,Rheinstetten,Germany)记录。光谱仪配备有0.47T磁体和H2O-10-25AVGX4探针。在20℃下，对于每个样品至少测量4次采集，其中样品体积为900μl。为了确定T2或R2，信号衰减持续至少5秒。
AAV样品的制备
样品是通过以下方式生成：以不同比率分别混合溶解在相同水溶液中的具有相同浓度(2*1013vg/ml)的满的和空的AAV2、AAV6和AAV8，该水溶液包含含有0.001％(w/v)Pluronic F-68(对于AAV8)和含有0.001％(w/v)Pluronic F-68以及100mM柠檬酸钠(对于AAV2和AAV6)的1x PBS缓冲液。样品无需进一步长期储存(例如<0℃)进行测量。
实例1
确定不同比率的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的横向弛豫时间
将含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒混合在水溶液中(AAV2和AAV6：含有0.001％(w/v)Pluronic F-68、100mM柠檬酸钠的1x PBS缓冲液；AAV8不含柠檬酸钠)以产生不同的满的/空的比率(跨越0％至100％的范围)的含有DNA的AAV颗粒。已经针对血清型2、血清型6和血清型8的AAV颗粒进行该操作。对于各个样品，横向弛豫时间(T2)如上文“材料和方法”章节所概述的进行记录。结果如下表所示。
表1：不同地含有DNA的AAV2颗粒样品的T2值。
Figure BDA0003795900650000251
表2：不同地含有DNA的AAV6颗粒样品的T2值。
Figure BDA0003795900650000261
由于被视为实验误差，75:25比率的值被排除在拟合计算之外。
表3：不同地含有DNA的AAV8颗粒样品的T2值。
Figure BDA0003795900650000262
使用线性函数和二阶多项式函数来拟合所获得的横向弛豫时间。结果在下表4中呈现。
表4：拟合结果。对于血清型6，示出了拟合包括(在括号中)和不包括75:25比率的数据。
Figure BDA0003795900650000263
Figure BDA0003795900650000264
Figure BDA0003795900650000271

Claims (15)

1.一种用于确定样品中含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的比率的方法，其包括以下步骤：
-确定所述样品中水分子的质子的核磁共振(NMR)参数，其中所述样品为包含含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒的混合物的水溶液，所述确定是通过对所述溶液应用NMR测量，以及
-使用校准函数，用经确定的NMR参数来确定含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的所述比率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NMR参数为所述水溶液中所述水分子的所述质子的横向核磁自旋弛豫时间T2或横向核磁自旋弛豫速率R2。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中在确定所述NMR参数期间的磁场强度为约0.47T。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在确定所述NMR参数期间的共振频率为约20MHz。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒为AAV2血清型、或AAV6血清型或AAV8血清型。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述校准函数为二阶多项式函数。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过确定至少三个校准样品的相同NMR参数来获得所述校准函数，第一校准样品包含比率在0:100至30:70范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，第二校准样品包含比率在40:60至60:40范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒，并且第三校准样品包含比率在70:30至100:00范围内的含有DNA的AAV颗粒和空的AAV颗粒。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中AAV颗粒的总浓度为至少1*1012vp/mL。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法为体外方法。
10.横向核磁自旋弛豫时间T2用于确定AAV颗粒的负载状态的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述负载状态为含有DNA的AAV颗粒与空的AAV颗粒的比率。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述负载状态为含有DNA的AAV颗粒的分数。
13.根据权利要求10所述的用途，其中所述负载状态为含有DNA的AAV颗粒的浓度。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的用途，其中在样品中确定所述负载状态。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的用途，其中所述确定是在水溶液中，并且所述横向核磁自旋弛豫时间T2为所述水溶液中所述水分子的所述质子的所述横向核磁自旋弛豫时间T2。
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