JP2023513903A - 核磁気共鳴緩和測定によってａａｖ粒子のローディング状態を決定するための方法 - Google Patents

核磁気共鳴緩和測定によってａａｖ粒子のローディング状態を決定するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ウイルス粒子を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２がそれぞれ、ウイルス粒子の（充填対空の）ローディング状態に依存するという知見に少なくとも部分的に基づく。したがって、本発明の一局面は、試料中のロードされたウイルス粒子と空のウイルス粒子の比を決定するための方法であって、ロードされたウイルス粒子と空のウイルス粒子の混合物を含む水溶液中に存在する水分子のプロトンに関する核磁気共鳴（ＮＭＲ）パラメータを、ＮＭＲ測定を水溶液に対して行うことによって決定する工程と、較正関数に基づいて、前の工程で決定されたＮＭＲパラメータを用いて、ロードされたウイルス粒子と空のウイルス粒子の比を決定する工程とを含む、方法である。TIFF2023513903000007.tif115140

Description

本発明は、遺伝子療法の分野に属する。より詳細には、本明細書では、ウイルス粒子のローディング状態、すなわち、充填ウイルス粒子と空のウイルス粒子との間の比を決定するための方法が報告される。この目的を達成するために、核磁気共鳴が使用される。
発明の背景
遺伝子療法とは、広義には、生細胞の遺伝子発現を改変し、それによってその生物学的特性を変化させるための遺伝物質の治療的投与を指す。数十年の研究の後、遺伝子療法は市場に進歩しており、ますます重要になると予想されている。一般的に、遺伝子療法は、インビボまたはエクスビボアプローチのいずれかに分けることができる。
今日では、ほとんどのインビボ療法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターによるＤＮＡ送達に依存している。ＡＡＶは、小さな天然に存在する非病原性パルボウイルスであり、これは、非エンベロープ正二十面体キャプシドで構成される。これは、約４．７ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。野生型ＡＡＶベクターのゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する２つの遺伝子、ｒｅｐおよびｃａｐを保有する。ＩＴＲは、ウイルス複製およびパッケージングのためにシスで必要である。ｒｅｐ遺伝子は４つの異なるタンパク質をコードし、その発現は２つの代替プロモーターＰ５およびＰ１９によって駆動される。さらに、選択的スプライシングによって異なる形態が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、例えば、ＤＮＡ結合、エンドヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性等の複数の機能を有する。それらは、遺伝子調節、部位特異的組み込み、切除、複製およびパッケージングにおいて役割を果たす。ｃａｐ遺伝子は、３つのキャプシドタンパク質および１つの集合体活性化タンパク質をコードする。これらのタンパク質の差次的発現は、選択的スプライシングおよび選択的開始コドン使用によって達成され、ｒｅｐ遺伝子のコード領域に位置する単一プロモーターＰ４０によって駆動される。
操作された治療用ｒＡＡＶベクターにおいて、ウイルス遺伝子は、ウイルスＩＴＲに隣接したままであるが、選択されたプロモーターの制御下で目的の遺伝子をコードする導入遺伝子発現カセットで置き換えられる。野生型ウイルスとは異なり、操作されたｒＡＡＶベクターは宿主ゲノムへの部位特異的組み込みを受けず、形質導入細胞の核内で主にエピソームのままである。
ＡＡＶは、それ自体が複製能ではないが、ヘルパー遺伝子の機能を必要とする。これらは、例えばアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス等の共感染ヘルパーウイルスによって自然に提供される。例えば、５つのアデノウイルス遺伝子、すなわちＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡがＡＡＶ複製に必須であることが知られている。タンパク質をコードする他のヘルパー遺伝子とは対照的に、ＶＡは低分子ＲＮＡ遺伝子である。
ｒＡＡＶベクターの産生のために、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を保有する治療用ＤＮＡを、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにｒＡＡＶ粒子を産生するために必要なヘルパー遺伝子も含むパッケージング宿主細胞株に導入する。パッケージング効率、すなわちパッケージング細胞株内でのｒＡＡＶ粒子生成中にウイルスキャプシドにＤＮＡを導入する効率は１００％ ｒＡＡＶ未満であるため、得られたｒＡＡＶ粒子調製物は、充填、すなわちＤＮＡ含有ウイルスキャプシドと空、すなわちＤＮＡ非含有ウイルスキャプシドとの混合物である。治療用効果は治療用ＤＮＡの転写の成功に依存するため、混合物の組成は直接的な効果を有する。
したがって、これらは、ｒＡＡＶ調製物中の充填キャプシドおよび空キャプシドの画分ならびに比を決定する方法の必要性である。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、生体分子を研究するための広範囲の用途で使用されてきた技術である。試料中の生体分子の異なる局面に関する結論は、生体分子、例えばタンパク質またはペプチド自体のＮＭＲシグナル、または生体分子を含む溶液に由来するＮＭＲシグナルに基づき得る。例えば、Ｓｈｉｇｅｍｉｔｓｕら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９８（２０１６）５９－６７））（非特許文献1）は、アミロイドベータペプチド単量体および二量体のＮＭＲシグナルの測定を記載している。ＭｅｔｚおよびＭａｄｅｒ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．３６４（２００８）１７０－１７５）（非特許文献2）は、医薬分野、特に薬物送達において特に使用され得るエマルジョンおよび脂質成分の特性評価のためのＮＭＲ実験を示す。
国際公開第２０１４／１６９２２９号（特許文献1）では、生体医薬製剤の凝集の程度の指標として水分子のＮＭＲ緩和速度を使用する方法が報告されている。
国際公開第２０１８／１０２６８１号（特許文献2）では、溶媒中の懸濁液またはエマルジョンとして製剤化された粒子含有生成物を非侵襲的に評価するために溶媒ＮＭＲシグナルの横緩和速度を使用する方法が報告されている。
Ｈｉｌｌｓら（Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓ．６７（１９８９）９０３－９１８）（非特許文献3）は、天然ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液における横方向の水プロトン緩和を報告した。
Ｆｅｎｇら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５１（２０１５）６８０４）（非特許文献4）は、水プロトンの横緩和速度を使用して、水中でのタンパク質凝集および界面活性剤ミセル化を定量できることを報告した。
ヒトインスリン調製物を使用して、Ｔａｒａｂａｎら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４（２０１５）４１３２－４１４１）（非特許文献5）は、水プロトンの横緩和速度が、可視および不可視の両方のタンパク質凝集体を検出および定量するための信頼性が高く高感度の指標として役立ち得ることを実証している。
Ｔａｒａｂａｎら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８９（２０１７）５４９４－５５０２）（非特許文献6）は、異なるストレスによって生じるモノクローナル抗体凝集体の存在の検出に対する、水ＮＭＲおよび従来の技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィ、マイクロフローイメージングおよび動的光散乱の感度の違いを報告した。
Ｔａｒａｂａｎらは、水ＮＭＲのインライン測定が可能であり、フローシステムの構成、流量、タンパク質濃度、およびタンパク質凝集に依存することを報告した（７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＰＡＮＩＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２０１９，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐ３５：「Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ－ＮＭＲ－Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｔａｃｔ－Ｆｒｅｅ Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」）（非特許文献7）。
国際公開第２０１４／１６９２２９号 国際公開第２０１８／１０２６８１号
Ｓｈｉｇｅｍｉｔｓｕら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９８（２０１６）５９－６７）） ＭｅｔｚおよびＭａｄｅｒ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．３６４（２００８）１７０－１７５） Ｈｉｌｌｓら（Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓ．６７（１９８９）９０３－９１８） Ｆｅｎｇら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５１（２０１５）６８０４） Ｔａｒａｂａｎら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４（２０１５）４１３２－４１４１） Ｔａｒａｂａｎら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８９（２０１７）５４９４－５５０２） ７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＰＡＮＩＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２０１９，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐ３５：「Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ－ＮＭＲ－Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｔａｃｔ－Ｆｒｅｅ Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」）
本明細書では、試料中のウイルス粒子のローディング状態を決定するための方法を報告する。
本発明は、ウイルス粒子を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２がそれぞれ、ウイルス粒子のローディング状態に依存するという知見に少なくとも部分的に基づく。
したがって、本発明の一局面は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するための方法であって、以下：
－ ロードしたウイルス粒子と空のウイルス粒子との混合物を含む水溶液に存在する水分子のプロトンに関連する核磁気共鳴（ＮＭＲ）パラメータを、水溶液に対してＮＭＲ測定を行うことによって決定する工程、および
－ 較正関数を使用して／較正関数に基づいて、前の工程で決定されたＮＭＲパラメータを用いてロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定する工程
を含む、方法である。
一実施形態において、ＮＭＲパラメータは、溶液またはその画分中の水、特に水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和を示す。
一実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２または横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２である。
一実施形態において、単離された（単量体）ウイルス粒子は、５，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａの範囲の分子量を有する。好ましい一実施形態において、単離された（単量体）ウイルス粒子は、５，０００ｋＤａ～５，２５０ｋＤａの範囲の分子量を有する。
一実施形態において、ウイルス粒子は、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはリポソームである。さらなる実施形態において、ウイルス粒子はウイルスまたはＶＬＰである。他の実施形態において、ウイルス粒子は、非エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのＶＬＰである。好ましい一実施形態において、ウイルス粒子はアデノ随伴ウイルス粒子（ＡＡＶ粒子）である。
一実施形態において、ロードしたウイルス粒子はＤＮＡ含有ウイルス粒子である。好ましい一実施形態において、ロードしたウイルス粒子はＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子である。
一実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも１＊１０１２ｖｐ／ｍＬ（ウイルス粒子／ｍＬ）、一実施形態においては少なくとも５＊１０１２ｖｐ／ｍＬ、好ましい一実施形態においては、少なくとも１＊１０１３ｖｐ／ｍＬ、一実施形態においては少なくとも２＊１０１３ｖｐ／ｍＬである。
一実施形態においては、水溶液はリン酸緩衝生理食塩水である。好ましい一実施形態において、水溶液は、界面活性剤および任意にクエン酸塩を含む、リン酸緩衝生理食塩水である。
一実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は最大８０％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては最大８０％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は線形関数である。
一実施形態において、較正関数は二次多項式関数である。
一実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は最大１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は二次多項式関数である。
一実施形態において、較正関数は、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空ＡＡＶ粒子の比が異なる少なくとも２つの（較正）試料について決定された同じＮＭＲパラメータに基づく。
本発明による方法は、特定の実施形態において、インビトロ法である。さらに、方法は、先に明示的に述べられたものに加えて、複数の工程を含んでもよい。例えば、さらなる工程は、例えば、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子（の混合物）を含む水溶液の生成、および／または本明細書の他の箇所に示される工程に関するものであり得る。さらに、前記工程の１つ以上は、自動化された機器によって実行されてもよい。
本発明はまた、組換えＡＡＶ粒子の産生および治療用途のための組換えＡＡＶ粒子調製物の放出、特にリアルタイム放出からなる群から選択される目的のための、本発明による方法の使用に関する。
したがって、本発明の一局面は、ウイルス粒子の、好ましい一実施形態においては、ＡＡＶ粒子のローディング状態を決定するための横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２の使用である。
一実施形態において、ローディング状態は、ＤＮＡ含有ウイルス粒子と空のウイルス粒子との比である。
一実施形態において、ローディング状態は、総ウイルス粒子に対するＤＮＡ含有ウイルス粒子の画分である。
一実施形態において、ローディング状態は、ＤＮＡ含有ウイルス粒子の濃度である。
一実施形態でおいて、ローディング状態は試料中で決定される。
一実施形態において、決定は、水溶液中で行われ、横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２は水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２である。
一実施形態において、使用はインビトロ使用である。
図示および特許請求された様々な実施形態に加えて、本開示の主題はまた、本明細書に開示され、特許請求された特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される、特に局面または実施形態として示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例示および説明目的のために提示されている。網羅的であること、または本開示の主題を開示されたそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。
発明の詳細な説明
本明細書には、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の比／画分／濃度を決定するための方法が報告されており、この方法は、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液中の水分子のプロトンの水プロトン横緩和時間（Ｔ２）または水プロトン横緩和速度（Ｒ２）を、水溶液に対してＮＭＲ測定を行うことによって決定する工程と、その後、較正関数に基づいて、決定された核磁気スピン緩和によってＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の比／画分／濃度を決定する工程とを含む。
本発明は、少なくとも部分的には、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子等の高次タンパク質構造を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２がそれぞれ、高次タンパク質構造の内部組成によって影響を受けるという知見に基づく。
本発明は、ＡＡＶ粒子を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２がそれぞれ、ＡＡＶ粒子のＤＮＡローディングに依存するという知見に少なくとも部分的に基づく。
定義
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ｔｏ ＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体生成を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で改変することができる。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。このような改変は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ参照）。
本明細書で使用される場合、「標準条件」という用語は、特に明記しない限り、ＩＵＰＡＣ標準周囲温度および圧力（ＳＡＴＰ）条件、すなわち好ましくは２５℃の温度および１００ｋＰａの絶対圧力に関し、また好ましくは、標準条件は７のｐＨ値を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知のその均等物等を含む。同様に、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。
「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。一実施形態において、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。一実施形態において、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
本明細書で使用される「水溶液」という用語は、溶媒中の水（Ｈ２Ｏ）の濃度が少なくとも５０％（ｗ／ｖ）、一実施形態においては少なくとも７５％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９０％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９５％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９８％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９９％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９９．５％（ｗ／ｖ）である任意の液体調製物に関する。したがって、水溶液という用語は、最大５０％（ｗ／ｖ）のＤ２ＯまたはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む液体調製物を包含する。
さらに、本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、溶液中の化合物（溶質）の少なくとも一画分が溶媒に溶解していることを示す。溶液を調製する方法は、当技術分野で公知である。したがって、水溶液という用語は、一実施形態においては、水を含む、一実施形態においては水からなる溶媒に少なくとも部分的に溶解したＡＡＶ粒子等のウイルス粒子を含む液体調製物に関する。一実施形態においては、水溶液はリン酸緩衝生理食塩水である。好ましい一実施形態においては、水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤および任意に約１００ｍＭのクエン酸塩を含む、リン酸緩衝生理食塩水である。一実施形態において、界面活性剤は、ポロキサマーおよびポリソルベートから選択される。ポロキサマーは、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）またはＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）またはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）で市販されている。ポリソルベートは、商品名Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｃａｔｔｉｃｓ（登録商標）、Ａｌｋｅｓｔ（登録商標）およびＣａｎａｒｃｅｌ（登録商標）で市販されている。一実施形態において、界面活性剤はポロキサマー１８８（商品名：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）であり、任意のクエン酸塩はクエン酸ナトリウムである。リン酸緩衝生理食塩水は、ｐＨ値７．４に調整された、リン酸水素とリン酸二水素の混合物として約１３７ｍＭの塩化ナトリウム、約２．７ｍＭの塩化カリウムおよび約１２ｍＭのリン酸塩を含む。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
「決定する」という用語は、当業者によって理解されるように使用され、適切な方法で関連パラメータ、特にＮＭＲパラメータの値を決定することに関する。
いくつかの実施形態において、決定はオフライン決定である。したがって、特定の実施形態において、画分またはアリコートを測定装置に移す。
他の実施形態において、決定は連続的インライン決定である。したがって、特定の実施形態において、アリコートは事実上のアリコートである。したがって、特定の実施形態において、アリコートは液体の連続流として生成される。さらなる実施形態において、濃度、ＮＭＲパラメータおよび／または任意に決定される任意の他のパラメータは、フロースルーセル、特に濃度の場合、フロースルーキュベット内で決定される。パラメータは、同時にまたは順次に決定されてもよく、特定の実施形態において、パラメータは、順次に決定される。
「空のキャプシド」および「空の粒子」という用語は、ウイルスタンパク質シェルを含むが、タンパク質をコードするかまたは目的の転写産物に転写される核酸の全体または一部を欠くウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子を指す。したがって、空のキャプシドは、タンパク質をコードする、または目的の転写産物に転写される核酸を宿主細胞に移入するように機能しない。
「内在性」という用語は、細胞内で自然に発生し；細胞によって自然に生成されるもの；内在性遺伝子座／細胞内在性遺伝子座：細胞内に自然に発生する遺伝子座を指す。
本明細書において使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、またはウイルスベクターによる形質転換によって前記細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である）から、または配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失もしくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。「内在性」という用語は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内在性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、特に空のウイルス粒子を含む、ＡＡＶ粒子調製物等のウイルス粒子調製物の純度を低下させる全ての化合物を示す。したがって、特定の実施形態において、不純物は、ＡＡＶ粒子特異的副生成物、特に空のＡＡＶ粒子、および宿主細胞タンパク質副生成物である。
「単離された」組成物とは、その天然環境の構成要素から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）またはクロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィまたはイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）または増幅（ＰＣＲ）法によって測定した場合に９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「単離された」ポリペプチドまたは抗体とは、その天然環境の構成要素から分離されたポリペプチド分子または抗体分子を意味する。
「核磁気共鳴」という用語は、「ＮＭＲ」と略され、当業者によって理解される意味を有する。したがって、「ＮＭＲパラメータ」と略記される「核磁気共鳴パラメータ」という用語は、原則として、試料、特にＡＡＶ粒子等のＤＮＡ含有ウイルス粒子および空ウイルス粒子（の混合物）を含む水溶液に対して核磁気共鳴測定を行うことによって決定することができる、核磁気スピン緩和を示す、任意のパラメータに関する。特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水プロトンＮＭＲ（１Ｈ２Ｏ ＮＭＲ）から導出可能なパラメータである。特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、ＮＭＲ測定で決定される緩和時間もしくは緩和速度を含むか、または緩和時間または緩和速度である。特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、１Ｈ２Ｏ ＮＭＲ測定で決定される緩和時間もしくは緩和速度を含むか、または緩和時間または緩和速度である。さらなる実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水溶液またはそのアリコート中の水の横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２の少なくとも１つを含むか、または横方向核磁気スピン緩和時間および横方向核磁気スピン緩和速度の少なくとも１つである。さらなる実施形態において、ＮＭＲパラメータは、溶液中またはそのアリコートの水、特に水溶液またはそのアリコート中の水のプロトンの横方向核磁気スピン緩和を示す。当業者が理解するように、緩和時間Ｔは、対応する緩和速度Ｒの逆数、すなわちＴ＝１／Ｒである。特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、ＮＭＲ測定で決定される横緩和時間（Ｔ２）または横緩和速度（Ｒ２）である。特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、１Ｈ２Ｏ ＮＭＲ測定で決定される横緩和時間（Ｔ２）または横緩和速度（Ｒ２）である。好ましい一実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水溶液またはそのアリコート中の水のプロトンの水プロトンの横方向核磁気スピン緩和時間（Ｔ２）または水プロトン横方向核磁気スピン緩和速度（Ｒ２）である。特定の実施形態において、決定中の磁場強度は、０．１テスラ（Ｔ）～２４Ｔ、特定の実施形態においては０．２Ｔ～１０Ｔ、さらなる実施形態においては０．３Ｔ～５Ｔ、さらなる実施形態においては０．４Ｔ～２Ｔである。一実施形態において、磁場強度は０．４５～０．５０Ｔの範囲である。好ましい一実施形態において、磁場強度は約０．４７Ｔである。特定の実施形態において、共鳴周波数は、５ＭＨｚ～５００ＭＨｚ、さらなる実施形態においては７．５ＭＨｚ～２００ＭＨｚ、さらなる実施形態においては１０ＭＨｚ～１００ＭＨｚ、さらなる実施形態においては１５ＭＨｚ～５０ＭＨｚである。好ましい一実施形態においては、共鳴周波数は約２０ＭＨｚである。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、特定の実施形態においてｐＨ値および／またはイオン濃度に基づき得る、ＡＡＶ粒子等のウイルス粒子によって引き起こされない変化、特に溶質効果について補正される。特定の実施形態において、そのような補正は、試験される試料としてウイルス粒子含有量が分かっている、およびそうでなければ同一の組成を有する試料を使用して予備運転を行うことによって提供される。
したがって、特定の実施形態において、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子等のＤＮＡ含有ウイルス粒子の比／画分／濃度は、水溶液中の水分子のプロトンの横緩和時間（Ｔ２）であるＮＭＲパラメータに正比例する。
本明細書で使用される「核磁気共鳴測定装置」および「ＮＭＲ測定装置」という用語は、ＮＭＲ測定を水溶液またはそのアリコートに対して行うことによってＮＭＲパラメータを決定するように構成されたありとあらゆる装置を等しく含む。特定の実施形態において、ＮＭＲ測定装置は、核磁気スピン緩和値、特定の実施形態においては水プロトン核磁気スピン緩和値の測定を実行するように構成される。特定の実施形態において、ＮＭＲ測定装置は、インライン測定用に構成され、さらなる実施形態において、連続的インライン測定用に構成される。適切な装置は、例えばＭｅｔｚ＆Ｍａｄｅｒ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．３６４（２００８）１７０）およびＴａｒａｂａｎら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８９（２０１７）５４９４；７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＰＡＮＩＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２０１９，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐ３５：「Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ－ＮＭＲ－Ａ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｔａｃｔ－Ｆｒｅｅ Ｉｎ－Ｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」）から当技術分野で公知である。
「組換えＡＡＶベクター」は、分子的方法を使用してウイルス（例えば、ＡＡＶ）から野生型ゲノムを除去し、それを非天然核酸、例えば転写産物に転写された核酸またはタンパク質をコードする核酸で置き換えることによって、ＡＡＶ等のウイルスの野生型ゲノムから得られる。典型的には、ＡＡＶについては、ＡＡＶゲノムの一方または両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶベクターに保持される。「組換え」ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムの全てまたは一部が天然のウイルスゲノム核酸に関して非天然（すなわち、異種性）配列で置き換えられているため、天然に存在するウイルスＡＡＶゲノムとは区別される。したがって、非天然配列の組み込みは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を「組換え」ベクターと定義し、これはＡＡＶの場合は「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。
組換えウイルスベクター配列（例えば、ＡＡＶベクター配列）は、エクスビボ、インビトロまたはインビボでの細胞のその後の感染（形質導入）のために、パッケージングされ、本明細書では「粒子」と呼ばれ得る。組換えベクター配列がＡＡＶ粒子に封入またはパッケージングされる場合、粒子は「ＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶ粒子」とも呼ばれ得る。そのような粒子は、ベクターゲノムを封入またはパッケージングするタンパク質を含む。特定の例としては、ウイルスエンベロープタンパク質が挙げられ、ＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるキャプシドを有するＡＡＶを指すために使用される区別である。血清学的特異性は、他のＡＡＶと比較して、１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。そのような交差反応性の差異は、通常、キャプシドタンパク質配列／抗原決定基（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３配列の差異に起因する）の差異によるものである。キャプシドバリアントを含むＡＡＶバリアントは、参照ＡＡＶまたは他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別できない可能性があるにもかかわらず、参照または他のＡＡＶ血清型と比較して少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が異なる。
従来の定義の下では、血清型は、中和活性について既存のおよび特徴付けられた全ての血清型に特異的な血清に対して目的のウイルスが試験され、目的のウイルスを中和する抗体が見出されていないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス分離株が発見され、および／またはキャプシド変異体が生成されるにつれて、現在存在する血清型のいずれとも血清学的差異があってもなくてもよい。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差異を有しない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループまたはバリアントである。多くの場合、中和活性についての血清学的試験は、それらが血清型の従来の定義に従って他の血清型であるかどうかを決定するために、キャプシド配列改変を有する変異ウイルスに対してまだ行われていない。したがって、便宜上、および繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、広義には、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）ならびに所与の血清型のサブグループまたはバリアント内にあり得る血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を指す。
「形質導入」および「トランスフェクト」という用語は、核酸（プラスミド）等の分子の細胞への導入を指す。外因性核酸が細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「形質導入」または「トランスフェクト」されている。したがって、「形質導入細胞」は、「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」が導入された細胞、または外因性核酸が導入されたその子孫である。特定の実施形態において、「形質導入」細胞（例えば、哺乳動物、例えば、細胞または組織または器官細胞において）は、外因性分子、例えば核酸（例えば導入遺伝子）の組み込み後の細胞の遺伝的変化である。「形質導入」細胞を増殖させ、導入された核酸を転写および／またはタンパク質を発現させることができる。
「形質導入」または「トランスフェクト」した細胞では、核酸（プラスミド）はゲノム核酸に組み込まれても組み込まれなくてもよい。導入された核酸がレシピエント細胞または生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれると、これは前記細胞または生物内で安定的に維持され、さらにレシピエント細胞または生物の子孫細胞または生物に渡されるかまたは子孫細胞または生物によって継承され得る。最後に、導入された核酸は、染色体外に、または一過性にのみレシピエント細胞または宿主生物に存在し得る。いくつかの技術が知られており、例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓら（１９８６）、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
「導入遺伝子」は、本明細書では、意図されたまたは細胞または生物に導入された核酸を好都合に指すために使用される。導入遺伝子には、任意の核酸、例えば、転写産物に転写されるか、またはポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
「ベクター」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成するために、直接または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの形態で、最終的にパッケージングまたは封入された組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドを使用して組換えウイルス粒子を構築または製造する場合、ウイルス粒子は、組換えプラスミドのベクター配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクター部分は「プラスミド骨格」と呼ばれ、これは増殖および組換えウイルス産生に必要なプロセスであるプラスミドのクローニングおよび増幅にとって重要であるが、それ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージングまたは封入されていない。したがって、「ベクター」は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージングまたは封入された核酸を指す。
本発明の特定の実施形態
本発明は、ウイルス粒子を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２がそれぞれ、ウイルス粒子の（充填対空の）ローディング状態に依存するという知見に少なくとも部分的に基づく。
したがって、本発明の一局面は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するための方法であって、以下：
－ ロードしたウイルス粒子と空のウイルス粒子との混合物を含む水溶液に存在する水分子のプロトンに関連する核磁気共鳴（ＮＭＲ）パラメータを、水溶液に対してＮＭＲ測定を行うことによって決定する工程、および
－ 較正関数に基づいて、前の工程で決定されたＮＭＲパラメータを用いてロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定する工程
を含む、方法である。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、溶液またはその画分中の水、特に水溶液またはその画分中の水のプロトンの横方向核磁気スピン緩和を示す。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２または横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２である。
特定の実施形態において、ウイルス粒子は、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはリポソームである。さらなる実施形態において、ウイルス粒子はウイルスまたはＶＬＰである。他の実施形態において、ウイルス粒子は、非エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのＶＬＰである。好ましい一実施形態において、ウイルス粒子はアデノ随伴ウイルス粒子（ＡＡＶ粒子）である。
特定の実施形態において、ロードしたウイルス粒子はＤＮＡ含有ウイルス粒子である。好ましい一実施形態において、ロードしたウイルス粒子はＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子である。
特定の実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも１＊１０１２ｖｇ／ｍＬ、一実施形態においては少なくとも５＊１０１２ｖｇ／ｍＬ、好ましい一実施形態においては、少なくとも１＊１０１３ｖｇ／ｍＬ、一実施形態においては少なくとも２＊１０１３ｖｇ／ｍＬに同等である。
特定の実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも１＊１０１２ｖｐ／ｍＬ（ウイルス粒子／ｍＬ）、一実施形態においては少なくとも５＊１０１２ｖｐ／ｍＬ、好ましい一実施形態においては、少なくとも１＊１０１３ｖｐ／ｍＬ、一実施形態においては少なくとも２＊１０１３ｖｐ／ｍＬである。
特定の実施形態において、水溶液は、ｐＨ７～ｐＨ８の範囲のｐＨ値を有する。好ましい一実施形態において、水性試料は約７．４のｐＨ値を有する。
特定の実施形態において、水溶液はリン酸緩衝生理食塩水である。好ましい一実施形態において、水溶液は、界面活性剤および任意にクエン酸塩を含む、特に約０．００１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤および任意に約１００ｍＭのクエン酸塩を含む、リン酸緩衝生理食塩水である。
特定の実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は最大１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は線形関数である。
特定の実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は５０％～１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては５０～１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は線形関数である。
一実施形態において、較正関数は二次多項式関数である。
特定の実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は最大１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は二次多項式関数である。
特定の実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は５０％～１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては５０％～１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は二次多項式関数である。
特定の実施形態において、較正関数は、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空ＡＡＶ粒子の比が異なる少なくとも２つの試料について決定された同じＮＭＲパラメータに基づく。
本発明による方法は、インビトロ法である。さらに、前記方法は、先に明示的に述べられたものに加えて、複数の工程を含んでもよい。例えば、さらなる工程は、例えば、ＤＮＡ含有および空のＡＡＶ粒子（の混合物）を含む水溶液の生成、および／または本明細書の他の箇所に示される工程に関するものであり得る。さらに、前記工程の１つ以上は、自動化された機器によって実行されてもよい。
本発明はまた、ＡＡＶ粒子の産生、ＡＡＶ粒子の精製、ＡＡＶ粒子の調製物からの不純物の除去および治療用途のための組換えＡＡＶ粒子調製物の放出、特にリアルタイム放出からなる群から選択される目的のための、本発明による方法の使用に関する。
本発明はさらに、ＡＡＶ粒子を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２および横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２がそれぞれ、ＡＡＶ粒子の（充填対空の）ローディング状態に依存するという知見に少なくとも部分的に基づく。
本発明は、少なくとも部分的に、横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を、ＡＡＶ粒子の血清型とは無関係にＡＡＶ粒子のローディング状態の決定に使用することができ、したがってこれはＡＡＶ粒子の血清型とは無関係であることに基づいている。
より詳細には、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分／比／パーセンテージ／濃度は、水プロトンＮＭＲ（１Ｈ２Ｏ ＮＭＲ）によってＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含む水溶液中の横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を決定し、前記時間を標準／較正値と相関させることによって得ることができることが見出された。すなわち、水プロトン横方向スピン緩和時間Ｔ２が、水性試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分／比／パーセンテージ／濃度と相関することが見出された。
図１は、血清型２のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２）のＤＮＡローディングに対するＴ２の依存性、すなわち水性試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ２粒子の濃度に対するＴ２の依存性を示す。２＊１０１３粒子／ｍＬの濃度における空のＡＡＶ２粒子（０％充填）と完全ＤＮＡ含有ＡＡＶ２粒子（１００％充填）との間の緩和時間Ｔ２の絶対差は１９７．１±６．４ｍｓであり、相対差は１２．６±０．４％であることが分かる。データポイントは、０．９９６のＲ２値を有する二次多項式関数で適合させることができる。
図２は、血清型６のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ６）のＤＮＡローディングに対するＴ２の依存性、すなわち水性試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ６粒子の濃度に対するＴ２の依存性を示す。２＊１０１３粒子／ｍＬの濃度における空のＡＡＶ６粒子（０％充填）と完全ＤＮＡ含有ＡＡＶ６粒子（１００％充填）との間の緩和時間Ｔ２の絶対差は１４９．８±２２．１ｍｓであり、相対差は９．２±１．４％であることが分かる。データポイントは、０．９９８７のＲ２値を有する二次多項式関数で適合させることができる。
図３は、血清型８のＡＡＶ粒子（ＡＡＶ８）のＤＮＡローディングに対するＴ２の依存性、すなわち水性試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ８粒子の濃度に対するＴ２の依存性を示す。２＊１０１３粒子／ｍＬの濃度における空のＡＡＶ８粒子（０％充填）と完全ＤＮＡ含有ＡＡＶ８粒子（１００％充填）との間の緩和時間Ｔ２の絶対差は２０６．９ｍｓであり、相対差は１４％であることが分かる。データポイントは、０．９６３３のＲ２値を有する二次多項式関数で適合させることができる。
この理論に束縛されるものではないが、空のＡＡＶ粒子（０％充填）と完全ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子（１００％充填）との間の横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２の相対差は、少なくとも５％であれば、本発明による方法を実施するのに十分であると仮定される。
したがって、本発明の一局面は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子の比を決定するための方法である。
したがって、本発明の一局面は、試料中の全ＡＡＶ粒子に対するＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分を決定するための方法である。
したがって、本発明の一局面は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の濃度を決定するための方法である。
本発明のこれら３つの局面による方法は、以下：
－ ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液（のアリコート）中の水分子のプロトンの核磁気共鳴（ＮＭＲ）パラメータを、水溶液に対してＮＭＲ測定を行うことによって決定する工程、および
－ 較正関数に基づいて、前の工程で決定されたＮＭＲパラメータを用いてＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の比／画分／濃度を決定する工程
を含む。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、溶液またはそのアリコート中の水、特に溶液またはそのアリコート中の水のプロトンの横方向核磁気スピン緩和を示す。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２または横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２である。
好ましい一実施形態において、ＮＭＲパラメータは、水溶液中の水の水分子のプロトンの水プロトン横方向核磁気スピン緩和時間（Ｔ２）である。
特定の実施形態において、本発明による方法は、１００％の空のＡＡＶ粒子を用いて決定された横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２と、１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を用いて決定された緩和時間の相対差が少なくとも５％である条件で実施される。一実施形態において、方法は、１００％の空のＡＡＶ粒子を用いて決定された横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２と、１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を用いて決定された緩和時間の相対差が少なくとも８％である条件で実施される。一実施形態において、方法は、１００％の空のＡＡＶ粒子を用いて決定された横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２と、１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を用いて決定された緩和時間の相対差が少なくとも１０％である条件で実施される。一実施形態において、条件は、温度、水溶液中のＡＡＶ粒子の総濃度、磁場強度、共鳴周波数、緩衝液条件、任意に界面活性剤濃度、および任意に塩濃度である。２つの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２のうち小さい方を１００％として、相対差を算出する。計算は、以下の式：
Figure 2023513903000002
に従って行われる。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータの決定中の磁場強度は、０．１Ｔ～２４Ｔ、特定の実施形態においては０．２Ｔ～１０Ｔ、さらなる実施形態においては０．３Ｔ～５Ｔ、さらなる実施形態においては０．４Ｔ～２Ｔである。一実施形態において、磁場強度は０．４５Ｔ～０．５０Ｔの範囲である。好ましい一実施形態において、磁場強度は約０．４７Ｔである。
特定の実施形態において、ＮＭＲパラメータの決定中の共鳴周波数は、５ＭＨｚ～５００ＭＨｚ、さらなる実施形態においては７．５ＭＨｚ～２００ＭＨｚ、さらなる実施形態においては１０ＭＨｚ～１００ＭＨｚ、さらなる実施形態においては１５ＭＨｚ～５０ＭＨｚである。好ましい一実施形態においては、共鳴周波数は約２０ＭＨｚである。
特定の実施形態においては、方法はほぼ室温で実施される。一実施形態において、方法は、１８℃～２５℃の範囲の温度で実施される。一実施形態において、方法は、１９℃～２２℃の範囲の温度で実施される。一実施形態において、方法は、約２０℃の温度で実施される。
特定の実施形態において、水溶液はリン酸緩衝生理食塩水である。一実施形態において、水溶液は界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水である。一実施形態において、界面活性剤は、ポロキサマーおよびポリソルベートの群から選択される。一実施形態において、界面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０およびポリソルベート１００からなる界面活性剤の群から選択される。一実施形態において、界面活性剤は、約０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。好ましい一実施形態において、界面活性剤はポロキサマー１８８である。他の実施形態において、水溶液はクエン酸塩（クエン酸の塩）をさらに含む。一実施形態において、クエン酸塩は１００ｍＭの濃度で存在する。好ましい一実施形態において、クエン酸塩はクエン酸ナトリウムである。リン酸緩衝生理食塩水は、ｐＨ値７．４に調整された、リン酸水素とリン酸二水素の混合物として約１３７ｍＭの塩化ナトリウム、約２．７ｍＭの塩化カリウムおよび約１２ｍＭのリン酸塩を含む。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびその混合物ならびにキメラからなるＡＡＶ血清型の群から選択される血清型を有する。一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９からなるＡＡＶ血清型の群から選択される血清型を有する。好ましい一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２血清型、またはＡＡＶ６血清型、またはＡＡＶ８血清型である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ８粒子であり、水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８をさらに含むリン酸緩衝生理食塩水である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２粒子であり、水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８および約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムをさらに含むリン酸緩衝生理食塩水である。
特定の実施形態において、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ６粒子であり、水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマー１８８および約１００ｍＭのクエン酸ナトリウムをさらに含むリン酸緩衝生理食塩水である。
特定の実施形態において、方法は、第１の工程として、
－ ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空ＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液を提供する工程
を含む。
特定の実施形態において、方法は、第２の工程として、
－ 水溶液中のＡＡＶ粒子の総濃度を決定する工程
を含む。
特定の実施形態において、較正関数は、異なった既知のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子の濃度および／または比を有する少なくとも２つの試料について決定された同じＮＭＲパラメータに基づく。
特定の実施形態において、較正関数は線形関数である。
一実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は最大８０％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては最大８０％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は線形関数である。
特定の実施形態において、較正関数は、２つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定し、ここで、第１の較正試料は、１０：９０～３０：７０の範囲、好ましい一実施形態においては約２５：７５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第２の較正試料は、７０：３０～９０：１０の範囲、好ましい一実施形態においては約７５：２５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子を含み、線形関数に適合させて較正関数を得ることによって得られる。
特定の実施形態において、較正関数は、２つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定し、ここで、第１の較正試料はＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子のみまたは空のＡＡＶ粒子のみを含み、第２の較正試料は、１０：９０～３０：７０の範囲、好ましい一実施形態においては約２５：７５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含む試料、４０：６０～６０：４０の範囲、好ましい一実施形態においては約５０：５０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含む試料、ならびに７０：３０～９０：１０の範囲、好ましい一実施形態においては約７５：２５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含む試料からなる較正試料の群から選択され、線形関数に適合させて較正関数を得ることによって得られる。
特定の実施形態において、較正関数は、少なくとも３つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定し、ここで、第１の較正試料は０：１００～３０：７０の範囲、好ましい一実施形態においては約０：１００または２５：７５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第２の試料は、４０：６０～６０：４０の範囲、好ましい一実施形態においては約５０：５０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、ならびに第３の試料は、７０：３０～１００：０の範囲、好ましい一実施形態においては約７５：２５または１００：０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、線形関数に適合させて較正関数を得ることによって得られる。
特定の実施形態において、較正関数は、少なくとも３つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定し、ここで、第１の較正試料は０：１００～３０：７０の範囲、好ましい一実施形態においては約０：１００または２５：７５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第２の試料は、４０：６０～６０：４０の範囲、好ましい一実施形態においては約５０：５０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、ならびに第３の試料は、７０：３０～１００：０の範囲、好ましい一実施形態においては約７５：２５または１００：０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第１および第２の較正試料を０：１００からの５０：５０以下の比についての第１の線形関数に適合させ、第２および第３の較正試料を５０：５０超の１００：０までの第２の線形較正関数に適合させることによって得られる。
一実施形態において、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は７５％～１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては５０～１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は線形関数である。
特定の実施形態において、較正関数は、２つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定し、ここで、第１の較正試料は、４０：６０～６０：４０の範囲、好ましい一実施形態においては約５０：５０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第２の較正試料は、７０：３０～９０：１０の範囲、好ましい一実施形態においては約７５：２５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子を含み、線形関数に適合させて較正関数を得ることによって得られる。
特定の実施形態において、較正関数は二次多項式関数である。
一実施形態においては、方法は、試料中のロードしたウイルス粒子の比／画分／濃度を決定するためのものであり、試料は最大１００％のＤＮＡ含有ウイルス粒子、好ましい一実施形態においては最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含み、較正関数は二次多項式関数である。
特定の実施形態において、較正関数は、少なくとも３つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定し、ここで、第１の較正試料は０：１００～３０：７０の範囲、好ましい一実施形態では約０：１００または２５：７５の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第２の試料は、４０：６０～６０：４０の範囲、好ましい一実施形態では約５０：５０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、ならびに第３の試料は、７０：３０～１００：００の範囲、好ましい一実施形態では約７５：２５または１００：０の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、線形関数に適合させて較正関数を得ることによって得られる。
次いで、較正関数を使用して、未知試料について決定されたＮＭＲパラメータに基づいてそれぞれの比／画分／濃度を得る。
特定の実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも１＊１０１２ウイルス粒子／ｍＬ（ｖｐ／ｍＬ）である。一実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも５＊１０１２ｖｐ／ｍＬである。一実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも１＊１０１３ｖｐ／ｍＬである。一実施形態において、水溶液中のウイルス粒子の総濃度は、少なくとも２＊１０１３ｖｇ／ｍＬである。
特定の実施形態において、水溶液は少なくとも９００μＬの体積を有する。
本発明による方法は、インビトロ法である。さらに、前記方法は、先に明示的に述べられたものに加えて、複数の工程を含んでもよい。例えば、さらなる工程は、例えば、ＤＮＡ含有および空のＡＡＶ粒子（の混合物）を含む水溶液の生成、および／または本明細書の他の箇所に示される工程に関するものであり得る。さらに、前記工程の１つ以上は、自動化された機器によって実行されてもよい。
本発明はまた、ＡＡＶ粒子の産生、ＡＡＶ粒子の精製、ＡＡＶ粒子の調製物からの不純物の除去および治療用途のための組換えＡＡＶ粒子調製物の放出、特にリアルタイム放出からなる群から選択される目的のための、本発明による方法の使用に関する。
特に、本発明の一局面は、ＡＡＶ粒子のローディング状態を決定するための横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２の使用である。一実施形態において、ローディング状態は、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との比である。一実施形態において、ローディング状態は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分である。一実施形態において、ローディング状態は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の濃度である。
したがって、本発明の好ましい一局面は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の濃度を決定するための方法であって、以下：
ａ）ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定する工程、および
ｂ）較正関数に基づいて、工程ａ）で決定された横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を用いて水溶液中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の濃度を決定する工程
を含み、
ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２またはＡＡＶ６またはＡＡＶ８血清型の粒子であり、
水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマーまたはポリソルベートをさらに含み、任意に約１００ｍＭのクエン酸塩をさらに含むリン酸緩衝生理食塩水であり、
水性試料中のＡＡＶ粒子の総濃度は少なくとも５＊１０１２粒子／ｍＬであり、
任意に、（ｉ）水性試料が最大８０％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む場合、較正関数は線形関数もしくは二次多項式関数であるか、または（ｉｉ）水溶液が最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む場合、前記較正関数は線形関数もしくは二次多項式関数であるか、または（ｉｉｉ）較正関数は、０％～８０％未満のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む水溶液については線形関数であり、および８０％～１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む水溶液については二次多項式関数であり、
任意に、工程ａ）における決定が、１００％の空のＡＡＶ粒子を用いて決定される横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２と、１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を用いて決定される緩和時間の相対差が少なくとも１０％である温度、水溶液中のＡＡＶ粒子の総濃度、磁場強度、共鳴周波数、緩衝液条件、任意に界面活性剤濃度、および任意に塩濃度において行われる
方法である。
したがって、本発明の好ましい一局面は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分を決定するための方法であって、以下：
ａ）ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定する工程、および
ｂ）較正関数に基づいて、工程ａ）で決定された横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を用いて水溶液中のＡＡＶ粒子の総数のうちのＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分を決定する工程
を含み、
ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２またはＡＡＶ６またはＡＡＶ８血清型の粒子であり、
水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマーまたはポリソルベートをさらに含み、任意に約１００ｍＭのクエン酸塩をさらに含むリン酸緩衝生理食塩水であり、
水性試料中のＡＡＶ粒子の総濃度は少なくとも５＊１０１２粒子／ｍＬであり、
任意に、（ｉ）水性試料が最大８０％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む場合、較正関数は線形関数もしくは二次多項式関数であるか、または（ｉｉ）水溶液が最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む場合、前記較正関数は線形関数もしくは二次多項式関数であるか、または（ｉｉｉ）較正関数は、０％～８０％未満のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む水溶液については線形関数であり、および８０％～１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む水溶液については二次多項式関数であり、
任意に、工程ａ）における決定は、１００％の空のＡＡＶ粒子を用いて決定される横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２と、１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を用いて決定される緩和時間の相対差が少なくとも１０％である温度、水溶液中のＡＡＶ粒子の総濃度、磁場強度、共鳴周波数、緩衝液条件、任意に界面活性剤濃度、および任意に塩濃度において行われる
方法である。
したがって、本発明の好ましい一局面は、試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子の比を決定するための方法であって、以下：
ａ）ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定する工程、および
ｂ）較正関数に基づいて、工程ａ）で決定された横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２を用いて水溶液中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子の比を決定する工程
を含み、
ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２またはＡＡＶ６またはＡＡＶ８血清型の粒子であり、
水溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）のポロキサマーまたはポリソルベートをさらに含み、任意に約１００ｍＭのクエン酸塩をさらに含むリン酸緩衝生理食塩水であり、
水性試料中のＡＡＶ粒子の総濃度は少なくとも５＊１０１２粒子／ｍＬであり、
任意に、（ｉ）水性試料が最大８０％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む場合、較正関数は線形関数もしくは二次多項式関数であるか、または（ｉｉ）水溶液が最大１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む場合、前記較正関数は線形関数もしくは二次多項式関数であるか、または（ｉｉｉ）較正関数は、０％～８０％未満のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む水溶液については線形関数であり、および８０％～１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を含む水溶液については二次多項式関数であり、
任意に、工程ａ）における決定が、１００％の空のＡＡＶ粒子を用いて決定される横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２と、１００％のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子を用いて決定される緩和時間の相対差が少なくとも１０％である温度、水溶液中のＡＡＶ粒子の総濃度、磁場強度、共鳴周波数、緩衝液条件、任意に界面活性剤濃度、および任意に塩濃度において行われる
方法である。
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
血清型２（ＡＡＶ２）のＡＡＶ粒子のＤＮＡローディングに対するＴ２の依存性。 血清型６（ＡＡＶ６）のＡＡＶ粒子のＤＮＡローディングに対するＴ２の依存性。 血清型８（ＡＡＶ８）のＡＡＶ粒子のＤＮＡローディングに対するＴ２の依存性。
材料および方法
ＡＡＶ粒子
異なる血清型のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子ならびに空のＡＡＶ粒子を、２＊１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で、Ｖｉｒｏｖｅｋ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａから購入した。ｖｇ／ｍＬの濃度（ウイルスゲノム／ｍＬ）は、１つのゲノムが１つの粒子にパッケージングされているため、ｖｐ／ｍＬの濃度（ウイルス粒子／ｍＬ）に等しい。ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子のＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターを有する緑色蛍光タンパク質の発現カセット（ＣＭＶ－ＧＦＰ）を含んでいた。
ＡＡＶ８－空（ロット１９－５６４Ｅ）／ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰ（ロット１８－７３７）は、０．００１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含有し、０．２２μｍフィルタ滅菌した１×ＰＢＳ緩衝液中にある。
ＡＡＶ２－空（ロット１９－６０４Ｅ）／ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（ロット１７－６００）は、０．００１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有し、０．２２μｍフィルタ滅菌した１×ＰＢＳ緩衝液中にある。
ＡＡＶ６－空（ロット１９－５４０Ｅ）／ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（ロット１９－７１８）は、０．００１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有し、０．２２μｍフィルタ滅菌した１×ＰＢＳ緩衝液中にある。
ＮＭＲ
横緩和速度（Ｒ２）または時間（Ｔ２）をＢｒｕｋｅｒ ｍｉｎｉｓｐｅｃ ｍｑ ２０分光計（２０ＭＨｚ；Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ＧｍｂＨ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で記録した。分光計は、０．４７Ｔ磁石およびＨ２Ｏ－１０－２５ＡＶＧＸ４プローブを備えていた。２０℃で９００μｌの試料体積を有する各試料について少なくとも４回の取得を測定した。Ｔ２またはＲ２を決定するために、信号減衰を少なくとも５秒間追跡した。
ＡＡＶ試料の調製
０．００１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（ＡＡＶ８用）を含有し、０．００１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８ならびに１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ＡＡＶ２およびＡＡＶ６用）を異なる比率で含有する１×ＰＢＳ緩衝液を含む同じ水溶液に溶解した同じ濃度（２＊１０１３ｖｇ／ｍｌ）を有する、それぞれ充填および空のＡＡＶ２、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８を混合することによって試料を生成した。試料は、さらに長期保存せずに、例えば０℃未満で測定した。
実施例１
ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子の異なる比についての横緩和時間の決定
ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子を水溶液（ＡＡＶ２およびＡＡＶ６：０．００１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ緩衝液；ＡＡＶ８はクエン酸ナトリウムを含まない）中で混合して、０％～１００％の範囲にわたるＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の異なる充填／空の比を得た。これは、血清型２、６および８のＡＡＶ粒子について行われている。個々の試料について、横緩和時間（Ｔ２）を上記の材料および方法のセクションで概説したように記録した。これらの結果を下記の表に提示する。
（表１）異なるＤＮＡ含有ＡＡＶ２粒子試料のＴ２値
Figure 2023513903000003
（表２）異なるＤＮＡ含有ＡＡＶ６粒子試料のＴ２値
Figure 2023513903000004
７５：２５比の値は、実験誤差と見なされたため、適合計算から除外された。
（表３）異なるＤＮＡ含有ＡＡＶ８粒子試料のＴ２値
Figure 2023513903000005
得られた横緩和時間を、線形および二次多項式関数を用いて適合させた。これらの結果を下記の表４に提示する。
（表４）適合結果
血清型６については、７５：２５比のデータを（括弧内に）含んだ、および除外した適合を示す。
Figure 2023513903000006

Claims (15)

  1. 試料中のＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との比を決定するための方法であって、以下：
    － ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との混合物を含む水溶液である前記試料中の、水分子のプロトンの核磁気共鳴（ＮＭＲ）パラメータを、前記水溶液に対してＮＭＲ測定を行うことによって決定する工程、および
    － 較正関数を使用して、決定された前記ＮＭＲパラメータを用いてＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との比を決定する工程
    を含む、方法。
  2. 前記ＮＭＲパラメータが、前記水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２または横方向核磁気スピン緩和速度Ｒ２である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＮＭＲパラメータの決定中の磁場強度が約０．４７Ｔである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＮＭＲパラメータの決定中の共鳴周波数が約２０ＭＨｚである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ２血清型、またはＡＡＶ６血清型、またはＡＡＶ８血清型の粒子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記較正関数が二次多項式関数である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記較正関数が、少なくとも３つの較正試料について同じＮＭＲパラメータを決定することによって得られ、第１の較正試料が、０：１００～３０：７０の範囲の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第２の較正試料が、４０：６０～６０：４０の範囲の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含み、第３の較正試料が、７０：３０～１００：００の範囲の比でＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子および空のＡＡＶ粒子を含む、請求項６に記載の方法。
  8. ＡＡＶ粒子の総濃度が少なくとも１＊１０１２ｖｐ／ｍＬである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. インビトロ法である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＡＡＶ粒子のローディング状態を決定するための、横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２の使用。
  11. 前記ローディング状態が、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子と空のＡＡＶ粒子との比である、請求項１０に記載の使用。
  12. 前記ローディング状態が、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の画分である、請求項１０に記載の使用。
  13. 前記ローディング状態が、ＤＮＡ含有ＡＡＶ粒子の濃度である、請求項１０に記載の使用。
  14. 前記ローディング状態が試料中で決定される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の使用。
  15. 前記決定が、水溶液中で行われ、前記横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２が前記水溶液中の水分子のプロトンの横方向核磁気スピン緩和時間Ｔ２である、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の使用。
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