KR20190115043A

KR20190115043A - 생물학적 생성물 제조에서 복수의 세포를 분석하고 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20190115043A
Application number: KR1020197025835A
Authority: KR
Inventors: 제임스 그레이엄
Original assignee: 론자 리미티드
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2019-10-10
Also published as: EP3565908A1; JP2020505931A; US20190360980A1; WO2018144794A1; IL268153A; CN110418849A

Abstract

생물학적 생성물 제조에서 단백질 서열 변이체를 검출하고 단백질 서열 변이체의 생성 확률을 평가하는 방법이 개시된다.

Description

생물학적 생성물 제조에서 복수의 세포를 분석하고 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법

관련 출원

본 출원은 2017년 2월 3일에 출원된 미국 일련 번호 62/454,567, 2017년 2월 28일에 출원된 미국 일련 번호 62/464,775 및 2017년 5월 24일에 출원된 미국 일련 번호 62/510,559를 우선권 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 개시내용은 생물학적 생성물 제조의 다양한 단계에서 단백질 서열 변이체의 발생률을 평가하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.

단백질 서열 변이체 (PSV)는 게놈 뉴클레오티드 변화 또는 번역 오혼입의 결과로서 발생할 수 있는 의도하지 않은 아미노산 서열 변화로서 정의된다. 낮은 수준의 서열 변이체도 생성물 불균질성에 기여하여 생성물 효능 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 서열 변이체에 대한 체계적 스크리닝 방법론을 안정한 세포주 개발 과정 내로 도입하는 것은 생물약제의 성공적인 제조를 위해 중요하다.

아미노산 서열 변이체가 어떻게 일어날 수 있는지에 대해, 게놈 DNA의 돌연변이, 특정 코돈에서의 오번역 및 영양소 고갈을 비롯한 여러 잠재적 메카니즘이 보고되었다. 서열 변이체에 대한 체계적 스크리닝은 생물약제의 성공적인 제조를 위한 세포주 구축 과정의 필수 분석 요소로서 나타나고 있다. 한가지 접근법은 핵산에서 돌연변이를 확인하기 위해 사용되는 민감한 방법인 앰플리콘 서열분석을 사용하는 것이다. 그러나 정확한 DNA 또는 RNA 서열이 정확한 단백질 서열을 보장해주는 것은 아니고, 번역 과정에 대한 오류율이 훨씬 더 높은 것으로 알려져 있다. 번역에서의 오류율 (10^-4-10^-3)은 일반적으로 전사에서의 오류율 (10^-5-10^-4)보다 약 10배 더 높은 것으로 생각된다. 상기 이유로, 단백질 수준에서 서열 변이체의 분석이 수행되는 것이 중요할 수 있다. LC-MS를 사용한 펩티드 맵핑 분석은 단백질 서열의 심도있는 특징화를 위한 탁월한 특이성 및 감도를 제공한다. 서열 변이체는 MS2 데이터의 드 노보(de novo) 분석에 의해 검출될 수 있다. 방법의 감도는 낮은 존재비 종에 대해 생성되는 매우 높은 품질의 단편화 데이터에 의존한다. 이러한 방법론의 단점은 높은 수준의 가양성이다.

따라서, 생물약제 제조의 다양한 단계에서 단백질 생성물 변이체의 개선된 체계적 평가에 대한 필요가 존재한다.

한 측면에서, 본 발명은

a) 적어도 1개의 세포가 제1 아미노산 서열, 예를 들어 생산 서열을 포함하는 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 있는 것인 복수의 세포를 배양하여, 생성물을 포함하는 조건화 배지를 제조하는 단계;

b) 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제1 폴리펩티드 샘플을 제1 서열-기반 반응, 예를 들어 단백질분해 효소에 의한 소화에 적용하여 제1 반응 생성물, 예를 들어 단백질분해 단편을 제공하는 단계 (및 임의로, 예를 들어 반응 생성물을, 예를 들어 질량 분광측정법에 의한 분리 단계에 적용하는 단계);

c) 제1 반응 생성물에 대한 값, 예를 들어 존재, 이동성 (예를 들어, 비행 시간) 또는 분자량을 참조 값, 예를 들어 참조 서열, 예를 들어 제1 아미노산 서열에 제1 서열-기반 반응을 적용함으로써 생산된 반응 생성물에 대한 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석, 예를 들어 서열분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;

d) 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제2 폴리펩티드 샘플을 제2 서열-기반 반응, 예를 들어 제2 단백질분해 효소에 의한 소화에 적용하여 제2 반응 생성물, 예를 들어 단백질분해 단편을 제공하는 단계 (및 임의로, 예를 들어 반응 생성물을, 예를 들어 질량 분광측정법에 의한 분리 단계에 적용하는 단계);

e) 제2 반응 생성물에 대한 값, 예를 들어 존재, 이동성 (예를 들어, 비행 시간) 또는 분자량을 참조 값, 예를 들어 참조 서열, 예를 들어 제1 아미노산 서열에 제2 서열-기반 반응을 적용함으로써 생산된 반응 생성물에 대한 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석, 예를 들어 서열분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;

f) 임의로, 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제3 폴리펩티드 샘플을 제3 서열-기반 반응, 예를 들어 단백질분해 효소에 의한 소화에 적용하여 제3 반응 생성물, 예를 들어 단백질분해 단편을 제공하는 단계 (및 임의로, 예를 들어 반응 생성물을, 예를 들어 질량 분광측정법에 의한 분리 단계에 적용하는 단계);

g) 임의로, 제3 반응 생성물에 대한 값, 예를 들어 존재, 이동성 (예를 들어, 비행 시간) 또는 분자량을 참조 값, 예를 들어 참조 서열, 예를 들어 제1 서열에 제3 서열-기반 반응을 적용함으로써 생산된 반응 생성물에 대한 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석, 예를 들어 서열분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;

h) 임의로, c) 및 임의로 e) 및/또는 g)의 결과에 대응하여, 제1 아미노산 서열 이외의 서열이 복수의 세포에 존재하는지 여부를 결정하는 단계

를 포함하며, 이에 의해 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 것인,

복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법을 특색으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

a) 단백질 생성물을 생산하는 세포 집단을 제공하는 단계;

b) 세포 집단으로부터 단백질 생성물을 정제하는 단계;

c) 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 준비하는 단계;

d) 준비된 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의해 분석하는 단계;

여기서 a) - d)는 복수 (예를 들어, 1개 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)의 세포 집단에 대해 병행하여 또는 순차적으로 반복됨; 및

e) 복수의 세포 집단으로부터의 질량 분광측정법 데이터와 질량 분광측정법 데이터의 데이터베이스를 비교함으로써 단백질 서열 변이체를 검출하는 단계

를 포함하며, 이에 의해 단백질 서열 변이체를 검출하는 것인,

단백질 서열 변이체를 검출하는 방법을 특색으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

a) 적어도 1개의 세포가 제1 아미노산 서열을 포함하는 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 있는 것인 복수의 세포를 배양하여, 생성물을 포함하는 조건화 배지를 제조하는 단계;

b) 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제1 폴리펩티드 샘플을 제1 서열-기반 반응에 적용하여 제1 반응 생성물을 제공하는 단계;

c) 제1 반응 생성물에 대한 값을 참조 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;

d) 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제2 폴리펩티드 샘플을 제2 서열-기반 반응에 적용하여 제2 반응 생성물을 제공하는 단계;

e) 제2 반응 생성물에 대한 값을 참조 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;

f) 임의로, 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제3 폴리펩티드 샘플을 제3 서열-기반 반응에 적용하여 제3 반응 생성물을 제공하는 단계;

g) 임의로, 제3 반응 생성물에 대한 값을 참조 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계; 및

h) c) 및 임의로 e) 및 g)의 결과에 대응하여, 제1 아미노산 서열 이외의 서열이 복수의 세포에 존재하는지 여부를 결정하는 단계

를 포함하며, 이에 의해 복수의 세포를 분석하는 것인,

복수의 세포를 분석하는 방법을 특색으로 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은

a) 단백질 생성물을 생산하는 세포의 집단, 예를 들어 복수의 세포를 포함하는 배양 배지로부터 정제된 단백질 생성물을 제공하는 단계;

b) 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의해 분석하는 단계;

여기서 a) - b)는 동일한 세포 집단 또는 상이한 세포 집단 내의 복수의 샘플에 대해 병행하여 또는 순차적으로 반복됨; 및

c) 복수의 샘플로부터의 질량 분광측정법 데이터와 질량 분광측정법 데이터의 데이터베이스를 비교함으로써 복수의 샘플 내에서 단백질 서열 변이체를 검출하는 단계

단백질 서열 변이체를 검출하는 방법을 특색으로 한다.

일부 실시양태에서, 샘플은 분취물이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 방법에 의해, 또는 본원에 기재된 임의의 방법의 복수의 세포 또는 세포의 집단에 의해 제조된 폴리펩티드를 특색으로 한다.

도 1은 단백질 서열 변이체 분석의 작업흐름이다.
도 2는 리툭시맙의 소화를 위한 트립신 효율에 대한 우레아 몰농도의 효과를 보여준다.
도 3a는 트라스투주맙의 누락 절단된 펩티드의 수의 측면에서 트립신 효율에 대한 우레아 몰농도 및 온도의 효과를 보여준다. 도 3b는 동일한 데이터를 표 형태로 보여준다.
도 4는 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK 펩티드의 소화 효율에 대한 우레아 몰농도 및 온도의 효과를 보여준다.
도 5는 리툭시맙의 소화를 위한 키모트립신의 활성에 대한 우레아 몰농도의 효과를 보여준다.
도 6a는 키모트립신을 사용한 트라스투주맙의 불완전 소화에 대한 우레아 몰농도 및 온도의 효과를 보여준다. 도 6b는 6a의 데이터를 보여주는 표이다.
도 7은 37℃에서 2M 우레아 중 및 25℃에서 0.5M 우레아 중 트라스투주맙의 키모트립신 소화의 효율에 대한 우레아 몰농도 및 온도의 효과를 보여준다.
도 8은 리툭시맙의 소화를 위한 AspN 효율에 대한 우레아 몰농도의 효과를 보여준다.
도 9는 cB72.3의 소화를 위한 AspN 효율에 대한 우레아 몰농도의 효과를 보여준다.
도 10은 오비트랩 퓨전(Orbitrap Fusion)에 의한 나노LC-MS2 분석을 사용한 트라스투주맙 HC 영역의 합한 트립신/키모트립신 소화물에 대한 커버리지 플롯이다. 1개의 트리펩티드 및 1개의 단일 잔기 펩티드는 중쇄에서 검출되지 않았다 (적색 원).
도 11은 오비트랩 퓨전에 의한 나노LC-MS2 분석을 사용한 트라스투주맙 HC 영역의 합한 트립신/키모트립신/lysC 소화물에 대한 커버리지 플롯이다.
도 12는 모델 단백질 리툭시맙의 단백질 서열 변이체 분석의 작업흐름을 보여준다.
도 13은 후기 세대 클론 4B04에서 검출된 잠재적 서열 변이체에 대한 존재비 프로파일을 보여준다.
도 14는 잠재적 서열 변이체에 대한 MS 프로파일을 보여준다.
도 15는 잠재적 서열 변이체의 표적화된 MS/MS 분석을 보여준다.
도 16은 본원에 기재된 세척 절차와 상용성인 예시 LC 시스템을 보여준다.
도 17은 세척 프로토콜에 사용하기 위한 분석 구배 및 세정 구배에 대한 예시 프로토콜을 보여준다. 화살표는 어떤 색이 어떤 펌프에 상응하는지를 나타낸다.
도 18은 완충제 안정성 스크린에 사용하기 위한 플레이트의 다이어그램을 보여준다.
도 19는 제1일 (아르기닌 부재), 제1일 (아르기닌과 존재), 제3일 (아르기닌이 부재) 및 제3일 (아르기닌 존재)에 대한 완충제 pH에 걸친 응집의 그래프를 보여준다.
도 20은 단백질 서열 변이체 분석의 작업흐름을 보여준다.
도 21은 확인된 서열 변이체에 대한 MS 프로파일을 보여준다.
도 22는 상단에서 서열 변이체의 표적화된 MS/MS 분석 및 하단에서 서열 변이체에 대한 존재비 프로파일을 보여준다.
도 23은 상단에서 S160C 변이체에 대한 MS/MS 데이터의 3d 스펙트럼 및 하단에서 트라스투주맙 변이체 서열 및 그의 트립신 절단 단편 서열을 보여준다.
도 24는 스파이킹된 서열 변이체의 MS/MS 분석을 보여준다.

정의

단수 용어는 본원에서 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)의 물품의 문법적 대상을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "세포"는 하나의 세포 또는 하나 초과의 세포를 의미할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "분취물"은, 예를 들어 정제된 단백질, 준비된 정제된 단백질, 배양 배지 또는 조건화 배양 배지의 소정 부피의 용액을 칭한다. 한 실시양태에서, 각각의 분취물은 부피와 관련된 조건을 충족시키며, 예를 들어 각각의 분취물은 최소 부피, 예를 들어 미리 설정된 최소값을 갖거나; 최소값과 최대값, 예를 들어 미리 설정된 최소값 및/또는 최대값 사이의 범위 내에 속하거나; 대략 동일한 값, 예를 들어 미리 설정된 값을 갖거나; 또는 동일한 부피, 예를 들어 미리 설정된 값을 갖는다. 더 많은 양의 액체, 예를 들어 조건화 배양 배지가 복수의 분취물로 분할되는 경우에, 복수는 더 많은 양 전체와 동일할 수 있거나 또는 더 많은 양 전체보다 더 적을 수 있다.

용어 "약"은 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간 지속기간 등을 언급하는 경우에, 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도되며, 이는 이러한 변동이 개시된 방법을 수행하는데 적절하기 때문이다.

본원에 사용된 용어 "복수의 분취물"은 1개 초과 (예를 들어, 2개 이상)의 분취물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 유래하거나 또는 그 내부에서 자연적으로 생산된 임의의 물질을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되거나 또는 그 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다. 따라서, "외인성 핵산"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되거나 또는 그 외부에서 생산된 핵산을 지칭한다. 한 실시양태에서, 외인성 핵산의 서열은 외인성 핵산이 도입되는 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부에서 자연적으로 생산되지 않거나 또는 자연적으로 발견될 수 없다. 유사하게, "외인성 폴리펩티드"는 외인성 폴리펩티드가, 예를 들어 외인성 핵산 서열로부터의 발현에 의해 도입되는 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부에서 자연적으로 생산되지 않거나 또는 자연적으로 발견될 수 없는 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "이종"은 하나의 종으로부터의 임의의 물질이 상이한 종으로부터의 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되는 경우에 그 물질을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 상호교환가능하게 사용되고, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 또는 그의 DNA 또는 RNA의 조합, 및 그의 중합체를 지칭한다. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA 또는 mRNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 핵산 분자는 합성 (예를 들어, 화학적 합성 또는 인공) 또는 재조합 핵산 분자이다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 함유하는 분자를 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명백하게 나타낸 서열뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP 및 상보적 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

본원에 사용된 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 한 실시양태에서, 단백질은 1개 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 폴리펩티드로 구성될 수 있으며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 공유 또는 비-공유 결합/상호작용에 의해 또 다른 폴리펩티드와 회합된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는, 예를 들어 관련 기술분야에서 통상적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄, 및 관련 기술분야에서 일반적으로 많은 유형이 존재하는 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 예를 들어 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "생성물"은 세포, 예를 들어 생성물을 생산하도록 변형 또는 조작된 세포에 의해 생산되는, 예를 들어 발현되는 분자, 예를 들어 폴리펩티드, 예를 들어 단백질, 예를 들어 당단백질, 핵산, 지질, 사카라이드, 폴리사카라이드 또는 그의 임의의 하이브리드를 지칭한다. 한 실시양태에서, 생성물은 단백질 또는 폴리펩티드 생성물이다. 한 실시양태에서, 생성물은 자연 발생 생성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 생성물은 비-자연 발생 생성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 생성물의 일부분은 자연 발생이며, 한편 생성물의 또 다른 부분은 비-자연 발생이다. 한 실시양태에서, 생성물은 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 생성물은 진단 또는 전임상 용도에 적합하다. 또 다른 실시양태에서, 생성물은 치료 용도, 예를 들어 질환의 치료에 적합하다. 일부 실시양태에서, 생성물은 단백질 생성물이다. 일부 실시양태에서, 생성물은 본원, 예를 들어 표 1-4에 기재된 재조합 또는 치료 단백질이다.

본원에 사용된 "서열 변이체", "단백질 서열 변이체", "단백질 생성물 서열 변이체" 또는 유사 용어는 참조 단백질 생성물과 상이한 종의 단백질 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 단백질. 전형적으로, 서열 변이체는 게놈 뉴클레오티드 변화 또는 번역 오혼입의 결과로서 발생한다. 예를 들어, 단백질의 서열 변이체는 하기 아미노산 서열 변경 중 각각 0, 1개 또는 그 초과를 포함할 수 있다: 치환, 결실 및 삽입.

본원에 사용된 용어 "복수의 서열 변이체", "복수의 단백질 서열 변이체" 및 유사 용어는 1개 초과 (예를 들어, 2개 이상)의 서열 변이체, 단백질 서열 변이체 등을 지칭한다.

본원에 사용된 복수의 세포 또는 세포의 집단 (상호교환가능하게 사용됨)은 1개 초과 (예를 들어, 2개 이상)의 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 세포주의 세포, 예를 들어 클론 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 세포주의 혼합물의 세포, 예를 들어 상이한 클론 계통으로부터의 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 복수의 세포는 주로 세포주의 세포, 예를 들어 클론 세포를 포함할 수 있다 (예를 들어, 복수는 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% 초과를 포함함). 일부 실시양태에서, 복수의 세포 중 적어도 1개의 세포는 제1 서열, 예를 들어 생산 서열, 예를 들어 재조합 단백질 생성물을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포 중 대다수의 세포는 제1 서열, 예를 들어 생산 서열, 예를 들어 재조합 단백질 생성물을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포 중 각각의 세포는 제1 서열, 예를 들어 생산 서열, 예를 들어 재조합 단백질 생성물을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포 중 적어도 1개의 세포는 제1 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 예를 들어 생산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 단백질 생성물을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포 집단은 1개 초과 (예를 들어, 2개 이상)의 세포 집단을 지칭한다.

본원에 사용된 서열-기반 반응은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 폴리펩티드를 프로세싱하여 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개..., 100개 또는 그 초과)의 반응 생성물을 생산하는, 폴리펩티드에 대해 수행되는 반응이다. 일부 실시양태에서, 서열-기반 반응은 프로테아제 또는 단백질분해 효소에 의한 소화이다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 또는 단백질분해 효소는 아미노산의 특정 서열을 인식하고, 아미노산의 특정 서열 내의, 그에 인접한 또는 그와 멀리 떨어진 부위를 절단한다. 본원에 사용된 반응 생성물은 서열-기반 반응의 생성물이다. 일부 실시양태에서, 반응 생성물은 폴리펩티드의 1개 이상의 부분, 예를 들어 1개 이상의 단편, 예를 들어 1개 이상의 단백질분해 단편이다. 일부 실시양태에서, 반응 생성물은 추가의 분석, 예를 들어 질량 분광측정법, 예를 들어 LC/MS 또는 MS/MS의 분석에 적합한 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 반응 생성물의 성분 또는 반응 생성물 성분은 서열-기반 반응에 의해 생산된 폴리펩티드의 단일 부분, 예를 들어 단일 단편, 예를 들어 단일 단백질분해 단편이다.

본원에 사용된 반응 생성물에 대한 값은 반응 생성물과 관련된 파라미터의 값을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 반응 생성물과 관련된 파라미터는 존재, 이동성 (예를 들어, 비행 시간, 예를 들어 질량 분광계에서의 비행 시간; 또는 크로마토그래피 기술에서의 이동 속도), 분자량, 전하, 이온화도, 또는 표지의 존재를 포함한다.

단백질 서열 변이체의 검출

한 측면에서, 본 개시내용의 발명은 복수의 세포, 예를 들어 단백질 생성물을 생산하도록 설계된 세포주에서 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

론자(Lonza)에서 단백질의 1차 구조의 특징화를 위한 현행 절차 (LC-MSMS에 의한 트립신 펩티드 맵핑, UKSL-8092)는 이론적 생성물 서열을 확인하도록 설계되어 있다. 의도하지 않은 단백질 변이체의 검출감도는 크로마토그래피 방법의 분해 용량에 의해 제한된다. 단백질 서열 변이체 분석 (PSVA)의 범주는 다중 아미노산 치환, N- 및 C-말단 연장 및 말단절단의 검출 및 확인이다.

서열 변이체는 다변량 분석의 적용에 의한 펩티드 맵 MS1 데이터의 비교 스크리닝에서 검출되었고, MS2 데이터는 유의하게 상이한 종의 확인을 위해 사용되었다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 인 실리코 면역원성 평가 도구를 사용하여 추가로 분석된다. 가능한 단백질 서열 변이체의 면역원성은 하류 치료 효능 및 생성물 신뢰성에 대한 효과를 가질 수 있다. 인 실리코 도구는 서열 변이체 또는 그의 단편의 면역계의 요소에 대한 결합, 뿐만 아니라 그의 면역 반응 유발 경향을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 서열 변이체의 면역원성의 인 실리코 평가 및 본 발명의 방법과 상용성인 방법은 미국 특허 7,702,465 및 유럽 특허 1516275 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 뿐만 아니라 상업적으로 (예를 들어, 론자의 에피베이스(Epibase)) 찾아볼 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 단백질 응집, 예를 들어 단백질 응집의 경향/가능성을 예측하기 위해 추가로 분석된다. 단백질 응집은 생물약제 개발 동안에 흔히 마주치는 문제이다. 이는 발효, 정제, 제제화 및 저장과 같은 제조 공정의 여러 상이한 단계에서 잠재적으로 발생할 수 있다. 응집의 영향은 제조 공정 뿐만 아니라 표적 생성물 프로파일, 전달 및 결정적으로 환자 안전성에 걸쳐 있다 (Vazquez-Rey and Lang. (2011) Biotechnol.Bioeng. 108. 1494-508). 응집 생성물은 제조 비용을 증가시키고, 개발 타임라인을 늘리고, 제제화 및 전달을 위한 옵션을 제한할 수 있다. 응집은 단백질의 고유 특성 (고유 응집 경향) 및 환경 인자, 예컨대 pH, 농도, 완충제, 부형제 및 전단력 둘 다에 좌우된다. 그러나, 공정 단계 또는 제조 동안 하나의 항체가 응집하고 다른 것은 응집하지 않는 이유에 관한 근본적인 차이는 그의 아미노산 서열 및 고유 응집 경향에 암호화되어 있다. 예측 방법: 기재어로서 항체의 서열 및 구조적 특색을 기초로 기계 학습 알고리즘을 사용하여 센티넬(Sentinel) APART™를 개발하였다 (Obrezanova et al. (2015). MAbs. 7. 352-363). 폭넓은 물리-화학적 기재어 공간을 커버하고 저 발현 및 고 발현 항체 뿐만 아니라 응집 및 비-응집 항체를 함유하도록 설계된 서열-다양 항체의 세트에 대해 모델을 훈련시키고 시험하였다. 그 세트 내의 모든 항체의 특징을 론자에서 실험적으로 결정하였다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 탈아미드화를 검출하기 위해 추가로 분석된다. (아스파라긴) 탈아미드화는 시간 경과에 따라 영향을 받는 위치에서 아스파라긴, 이소아스파르테이트 또는 아스파르테이트 (아스파르트산)를 갖는 분자의 불균질 혼합물을 생산하는 비-효소적 반응이다. 탈아미드화는 아스파라긴 및 글루타민의 측쇄 상의 아미드 기의 가수분해에 의해 야기된다. 다음 3가지 주요 인자가 펩티드의 탈아미드화 비율에 영향을 미친다: pH, 고온 및 1차 서열. 단백질의 2차 및 3차 구조도 또한 탈아미드화 비율을 유의하게 변경시킬 수 있다. (아스파라긴 및 글루타민은 둘 다 탈아미드화에 감수성이다. 실제로 본 발명자들은 단지 그 다음 잔기가 소형이고 친수성인 아스파라긴 부위의 하위세트에만 관심이 있다. 이 섹션을 아스파라긴 및 글루타민 둘 다에 적용하도록 재구성하는 것이 가능하다) 전하 불균질성을 야기하는 것 이외에, (아스파라긴) 탈아미드화는 항체 CDR에서와 같이 결합 계면에서 발생하는 경우 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다 (Harris et al. (2001). J.Chromatogr.B.Biomed.Sci Appl. 752. 233-245). 탈아미드화는 단편화, 응집 및 면역원성과 관련된 후속 문제를 유도할 수 있다 (Vlasak and Ionescu. (2011). MAbs. 3. 253-263; Doyle et al. (2007). Autoimmunity. 40. 131-137; Dunkelberger. (2012). J.Am.Chem.Soc. 134. 12658-12667). 1차 구조 분석 (Robinson and Robinson, 2001; Liu, Hui F., et al. "Recovery and purification process development for monoclonal antibody production." MAbs. Vol. 2. No. 5. Taylor & Francis, 2010) 및 3차 구조 분석의 조합에 의해 결정 시 탈아미드화되기 쉬운 아스파라긴 잔기가 문제인 것으로 예측된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 아스파르트산 이성질체화 및 단편화를 검출하기 위해 추가로 분석된다. 아스파르트산 이성질체화는 아스파르트산 및 이소아스파르트산 잔기의 비-효소적 상호전환이다. 아스파르트산에 대한 C-말단 펩티드 결합은 산성 조건에서 단편화에 감수성일 수 있다. 이들 반응은 아스파라긴 탈아미드화 반응의 중간체와 유사한 중간체를 통해 진행된다. 아스파르트산 이성질체화 및 단편화의 비율은 pH, 온도 및 1차 서열에 의해 영향을 받는다. 단백질의 2차 및 3차 구조도 또한 비율을 변경시킬 수 있다. 아스파르트산 이성질체화는 항체 CDR에서와 같이 결합 계면에서 발생하는 경우 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다 (Harris et al. (2001)). 이성질체화는 또한 전하 불균질성을 야기하고, 펩티드 백본의 절단에 의해 야기된 단편화를 유발할 수 있다. 단편화 반응은 주로 낮은 pH에서 발생하고, Asp-Pro 펩티드 결합은 다른 펩티드 결합보다 더 불안정하다 (Vlasak and Ionescu. (2011)). 아스파르트산 이성질체화는 면역원성을 증가시킬 잠재력을 가지며 (Doyle et al. (2007)), 이는 단편화가 응집체 형성을 유리하게 함에 따라 추가로 증가되는 위험이다. 이성질체화 및/또는 단편화의 위험이 있는 아스파르트산 잔기는 1차 및 3차 구조 분석의 조합을 사용하여 검출된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 C-말단 리신 프로세싱을 검출하기 위해 추가로 분석된다. C-말단 리신 프로세싱은 가능하게는 염기성 카르복시펩티다제의 작용으로 인해 바이오프로세싱 동안 발생하는, 항체 및 다른 단백질에서의 공통적인 변형이다 (Cai et al. (2011). Biotechnol.Bioeng. 108. 404-412). C-말단 리신 프로세싱은 항체 생성물에서의 전하 및 질량 불균질성의 주요 원인이며, 2, 1 또는 0개의 리신을 갖는 종이 형성될 수 있다. C-말단 리신 프로세싱은 질량 및 전하 불균질성의 원인이지만, 항체 효력 또는 안전성 프로파일에는 영향을 미치지 않는 것으로 공지되어 있다. C-말단 리신이 검출된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제를 예측하기 위해 추가로 분석된다. 결정화가능한 항체 단편 (Fc)은 항체 이펙터 기능 및 반감기를 담당하는 영역을 함유한다. 항체 이펙터 기능, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)은 하부 힌지 및 근처 영역에서 Fc 잔기에 의해 매개된다. 항체 반감기는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에의 결합에 의한 재순환에 의존성이다. FcRn-결합 영역은 또한 정제 동안 단백질 A에 의해 결합된다. 생성물의 효능 및/또는 반감기에 영향을 미치는 것 이외에, Fc 수용체 영역 내의 또는 그에 근접한 돌연변이 또는 치환은 Fc-함유 생성물의 정제 가능성을 변경시킬 수 있다. Fc에서의 치환은 정제 및 제조에 대한 그의 잠재적 영향에 대해 평가된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 유리 시스테인 티올 기를 검출하기 위해 추가로 분석된다. 용매 노출된 유리 시스테인 티올 기는 단백질 미스폴딩, 응집, 비-특이적 조직 결합, 디술피드 스크램블링을 통한 증가된 면역원성 또는 용액 내 다른 분자와의 의도하지 않은 반응과 같은 문제를 야기할 수 있다. 관련 서열 및 이에 따른 보존된 디술피드 결합의 위치를 찾아내기 위해 내부 데이터베이스에 대한 서열 검색이 수행된다. 이들 보존된 위치에 맞지 않는 시스테인 잔기가 문제인 것으로 간주된다. 이들 잔기의 디술피드 형성에 대한 그의 잠재력 및 폴딩과 안정성에 대한 그의 영향에 관하여 구조적 분석이 또한 수행된다. 디술피드 결합에 관련된 공지된 문제를 갖는 단백질, 도메인 또는 링커가 또한 검출된다. 예를 들어, 인간 천연 IgG4 및 IgG2 항체는 각각 해리 및 힌지 영역 디술피드 스크램블링에 감수성이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 등전점을 평가하기 위해 추가로 분석된다. 단백질의 등전점 (pI)은 단백질이 0의 순 전기 전하를 갖는 pH이다. 단백질 용액이 단백질의 pI와 동일한 pH인 경우, 단백질 분자 상의 전하 사이의 반발 정전기력은 최소화된다. 부적절한 반발은 소수성 표면 패치가 응집 핫-스팟이 되는 위험을 증가시킬 수 있다. 분자 표면에 걸친 국부 전하 분포가 또한 제제 설계에 영향을 미친다. 생성물이 표준 (항체) 정제 공정에 적합한지 여부를 결정하기 위해 생성물의 pI가 평가된다 (Liu et al. 2010 MAbs). pI가 표준 범위를 훨씬 벗어나는 경우 더 복잡한 정제 전략이 추구되어야 한다. 등전점은 EMBOSS pKa 값을 사용하여 1차 아미노산 서열 내의 하전된 잔기의 수에 기초하여 계산된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 리신 당화를 검출하기 위해 추가로 분석된다. 당화는 주로 리신의 측쇄 ε-아미노기에 영향을 미치는 비-효소적 변형이다. 변형은 세포 배양 동안 고농도의 글루코스가 존재하는 경우 통상적으로 발생한다. 생산된 재조합 단백질의 5-20%가 당화된 리신을 가질 것으로 추정된다 (Saleem et al. (2015). MAbs. 7. 719-731). 모든 용매 노출된 리신은 잠재적으로 감수성이지만, 음전하 및 히스티딘 이미다졸 기는 변형을 촉매하고 감수성 부위에서 리신 당화의 풍부화를 야기할 수 있다. 리신 측쇄 ε-아미노기의 촉매적 거리 내에 히스티딘 또는 산성 잔기 측쇄를 갖는 중요 영역 내의 리신 잔기가 검출된다. 이러한 촉매적 거리는 예를 들어 5Å, 10Å 또는 20Å일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 N- 및 O-글리코실화를 검출하기 위해 추가로 분석된다. 글리코실화는 치료 단백질, 예컨대 항체, 혈액 인자, EPO, 호르몬 및 인터페론에서 나타나는 통상적인 번역후 변형이다 (Walsh. (2010). Drug Discov.Today. 15. 773-780). 적절한 글리코실화는 폴딩뿐만 아니라 안정성, 용해도, 효력, 약동학 및 면역원성에 중요하다. 결합 계면 내 또는 근처에서의 의도하지 않은 글리칸 구조는 결합을 입체적으로 방해하고 친화도에 영향을 미칠 수 있다. N-글리코실화의 경우, N-X-S/T 모티프 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 잔기임)는 일반적으로 부위를 검출하는 역할을 한다. 그러나, 반드시 이러한 모티프가 N-글리코실화되지는 않고, 이러한 모티프에 일치하지 않는 수천개 초과의 다른 특유한 부위가 공지되어 있다. 세린 및 트레오닌의 O-글리코실화는 임의의 단순한 패턴을 따르지 않으며, O-글리코실화를 예측하기 위해 실험적으로 결정된 글리코실화 부위에 대한 부스팅 결정 트리 앙상블 알고리즘이 훈련되었다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 N-말단 고리화를 검출하기 위해 추가로 분석된다. 단백질의 N-말단 고리화는 백본의 제2 카르보닐기에 대한 N-말단 아민의 친핵성 공격을 통해 발생하여, 디케토피페라진 (DKP)을 생산할 수 있다 (Liu et al. (2011). J.Biol.Chem. 286. 11211-11217). N-말단 고리화는 질량 및 전하 불균질성을 야기하며, 이는 제어되고 모니터링되어야 한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 산화를 검출하기 위해 추가로 분석된다. 여러 아미노산은 반응성 산소 종 (ROS)에 의해 야기된 산화로 인한 손상에 감수성이다. 이들에는 히스티딘, 메티오닌, 시스테인, 티로신 및 트립토판이 있다. 산화는 일반적으로 다음 2개의 카테고리로 나뉜다: 부위-특이적 금속-촉매화 산화 및 비-특이적 산화. 메티오닌이 비-부위 특이적 산화에 더 감수성이고, 트립토판은 더 적은 정도로 감수성이다. 메티오닌이 주로 유리 ROS에 민감한 한편, 트립토판은 광-유도된 산화에 더 민감하다. 감도의 정도는 부분적으로 측쇄의 용매 접근성에 의해 결정되며; 매립된 잔기는 덜 민감하거나 또는 반응하는데 더 오래 걸린다. 위험이 있는 잔기를 결정하기 위해 구조적 분석이 사용된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 피로글루타메이트 형성을 검출하기 위해 추가로 분석된다. 피로글루타메이트 형성은 N-말단 글루타민 또는 글루탐산 잔기를 갖는 단백질에서 발생하는 변형이며, 여기서 측쇄는 N-말단 아민 기와 고리화하여 5-원 고리 구조를 형성한다. N-말단 고리화는 질량 및 전하 불균질성을 야기하며, 이는 제어되고 모니터링되어야 한다 (Liu et al. (2008). J.Pharm.Sci. 97. 2426-2447). 피로글루타메이트 형성은 N-말단 글루타민을 갖는 항체에서 통상적으로 발견된다. N-말단 글루탐산으로부터의 피로글루타메이트 형성은 제조 동안 발생할 수 있고, 생체내에서 발견되었다 (Cai et al. (2011). Biotechnol.Bioeng. 108. 404-412). N-말단 글루타민 또는 글루탐산 잔기가 검출된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 검출된 서열 변이체는 하기 중 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 모두)을 검출, 예측 및/또는 평가하기 위해 추가로 분석된다: 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기, 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성.

변성 방법

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 시스템은 정제된 단백질 생성물을 변성시키는 것을 포함한다. 변성 방법은 가열, 카오트로픽제 (예를 들어, 구아니딘 HCl 또는 우레아 단독)의 첨가, 또는 세제 (예를 들어, 소듐 도데실술페이트, SDS)의 첨가를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법 및 시스템은 데옥시콜레이트를 사용하여 정제된 단백질 생성물을 변성시키는 것을 포함한다. 데옥시콜레이트는 수용액 중에서 우레아의 존재에 의해 안정화된다 (우레아가 존재하지 않는 경우 상당한 수준의 염을 함유하는 용액으로부터 침전됨). 이들 물질은 둘 다 분석물 단백질을 변성시키는 작용을 하여, 대안적 샘플 제조 방법과 비교하여 샘플 제조 단계에서 사용될 온도 및 인큐베이션 시간을 더 낮춘다. 이러한 방법에 의해 허용된 온화한 샘플 제조 조건은 다른 제조 방법에 의해 유도될 수 있는 단백질에 대한 변형을 최소화한다. 절차의 말기에, 데옥시콜레이트는 산의 첨가에 의해 용액으로부터 침전될 수 있으며, 한편 분석물 펩티드 (소화 생성물)는 용액 중에서 우레아에 의해 안정화되어, (세제 분자의 사용을 포함하는 대부분의 방법과 달리), 질량 분광측정법에 의한 분석과 상용성인 방법을 가져온다.

동일한 샘플 제조 절차 내에서 이들 물질 둘 다의 조합은 정제된 단백질 제조 절차의 유효성에 중요하다. 구체적으로, 고염 용액 중 우레아와 데옥시콜레이트의 안정화 상호작용, 및 산 침전에 의한 데옥시콜레이트의 제거 시, 우레아와 분석물 단백질/펩티드, 예를 들어 정제된 단백질 생성물과의 안정화 상호작용은 본원에 개시된 방법에 중요하다.

생산을 위한 적용

본원에 개시된 생성물, 예를 들어 생성물 변이체의 제조 방법을 사용하여 다양한 생성물을 생산할 수 있거나, 다양한 세포주를 평가할 수 있거나, 또는 생물반응기 또는 프로세싱 용기 또는 탱크, 또는 보다 일반적으로는 임의의 공급 공급원과 함께 상기 용기 또는 탱크에서 사용하기 위한 다양한 세포주의 생산을 평가할 수 있다. 본원에 기재된 장치, 시설 및 방법은 원핵 및/또는 진핵 세포주를 포함한 임의의 목적하는 세포주의 배양에 적합하다. 또한, 실시양태에서, 장치, 시설 및 방법은 현탁 세포 또는 고정-의존성 (부착성) 세포의 배양에 적합하고, 제약 및 생물제약 생성물-예컨대 폴리펩티드 생성물, 핵산 생성물 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 또는 세포 및/또는 바이러스 요법에 사용된 것들과 같은 세포 및/또는 바이러스의 생산을 위해 구성된 생산 작업에 적합하다.

실시양태에서, 세포는 생성물, 예컨대 재조합 치료 또는 진단 생성물을 발현 또는 생산한다. 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 세포에 의해 생산된 생성물의 예는 항체 분자 (예를 들어, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체), 항체 모방체 (항원에 특이적으로 결합하지만 항체와 구조적으로 관련되지 않는 폴리펩티드 분자, 예컨대, 예를 들어 DARPin, 아피바디, 애드넥틴 또는 IgNAR), 융합 단백질 (예를 들어, Fc 융합 단백질, 키메라 시토카인), 다른 재조합 단백질 (예를 들어, 글리코실화 단백질, 효소, 호르몬), 바이러스 치료제 (예를 들어, 항암 종양용해 바이러스, 유전자 요법 및 바이러스 면역요법을 위한 바이러스 벡터), 세포 치료제 (예를 들어, 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 성체 줄기 세포), 백신 또는 지질-캡슐화된 입자 (예를 들어, 엑소솜, 바이러스-유사 입자), RNA (예컨대, 예를 들어 siRNA) 또는 DNA (예컨대, 예를 들어 플라스미드 DNA), 항생제 또는 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 장치, 시설 및 방법은 바이오시밀러를 생산하는데 사용될 수 있다.

언급된 바와 같이, 실시양태에서, 장치, 시설 및 방법은 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포 또는 하등 진핵 세포, 예컨대, 예를 들어 효모 세포 또는 사상 진균 세포, 또는 원핵 세포, 예컨대 그람-양성 또는 그람-음성 세포 및/또는 진핵 또는 원핵 세포의 생성물, 예를 들어 진핵 세포에 의해 합성된 단백질, 펩티드, 항생제, 아미노산, 핵산 (예컨대 DNA 또는 RNA)의 생산을 대규모 방식으로 가능하게 한다. 본원에 달리 언급되지 않는 한, 장치, 시설 및 방법은 벤치-규모, 파일럿-규모 및 전체 생산 규모 용량을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 목적하는 부피 또는 생산 용량을 포함할 수 있다.

더욱이 및 본원에 달리 언급되지 않는 한, 장치, 시설 및 방법은 교반 탱크, 에어리프트, 섬유, 마이크로섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층 및/또는 분출층 생물반응기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 반응기(들)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "반응기"는 발효기 또는 발효 유닛 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고, 용어 "반응기"는 "발효기"와 상호교환가능하게 사용된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 생물반응기 유닛은 하기 중 1개 이상 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양소 및/또는 탄소 공급원의 공급, 적합한 기체 (예를 들어, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지의 유입구 및 유출구 유동, 기체 및 액체 상의 분리, 온도의 유지, 산소 및 CO2 수준의 유지, pH 수준의 유지, 교반 (예를 들어, 진탕), 및/또는 세정/멸균. 예시 반응기 유닛, 예컨대 발효 유닛은 유닛 내에 다수의 반응기를 함유할 수 있으며, 예를 들어 유닛은 각각의 유닛에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 또는 그 초과의 생물반응기를 가질 수 있고/거나 시설은 시설 내에 단일 또는 다수의 반응기를 갖는 다수의 유닛을 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 생물반응기는 회분식, 반-유가식, 유가식, 관류 및/또는 연속식 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 생물반응기는 약 100 mL 내지 약 50,000 L의 부피를 가질 수 있다. 비제한적 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터의 부피를 포함한다. 추가로, 적합한 반응기는 다중-사용, 단일-사용, 일회용 또는 비-일회용일 수 있고, 금속 합금, 예컨대 스테인레스 스틸 (예를 들어, 316L 또는 임의의 다른 적합한 스테인레스 스틸) 및 인코넬, 플라스틱 및/또는 유리를 포함한 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응기는 원형, 예를 들어 원통형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 반응기는 정사각형, 예를 들어 직사각형일 수 있다. 정사각형 반응기는 일부 경우에 원형 반응기보다 이익, 예컨대 사용 용이성 (예를 들어, 통상의 기술자에 의한 로딩 및 셋업), 반응기 내용물의 더 큰 혼합 및 균질성, 및 더 낮은 바닥 풋프린트를 제공할 수 있다.

실시양태에서 및 본원에 달리 언급되지 않는 한, 제제의 제조 방법과 함께 사용하기 위한 본원에 기재된 장치, 시설 및 방법은 또한 달리 언급되지 않은 임의의 적합한 유닛 작업 및/또는 장비, 예컨대 이러한 생성물의 분리, 정제 및 단리를 위한 작업 및/또는 장비를 포함할 수 있다. 전통적인 스틱-빌트 시설, 모듈식, 이동식 및 일시적 시설, 또는 임의의 다른 적합한 구조, 시설 및/또는 레이아웃과 같은 임의의 적합한 시설 및 환경이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 모듈식 클린-룸이 사용될 수 있다. 추가로 및 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 장치, 시스템 및 방법은 단일 위치 또는 시설에서 수용 및/또는 수행될 수 있거나, 또는 대안적으로는 개별 또는 다중 위치 및/또는 시설에서 수용 및/또는 수행될 수 있다.

비제한적 예로서 및 비제한적으로, 미국 공개 번호 2013/0280797; 2012/0077429; 2011/0280797; 2009/0305626; 및 미국 특허 번호 8,298,054; 7,629,167; 및 5,656,491 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)은 적합할 수 있는 시설, 장비 및/또는 시스템을 기재하고 있다.

본원에 기재된 제제의 제조 방법은 광범위한 세포를 사용할 수 있다. 실시양태에서, 세포는 진핵 세포, 즉 포유동물 세포이다. 포유동물 세포는, 예를 들어 인간 또는 설치류 또는 소 세포주 또는 세포 스트레인일 수 있다. 이러한 세포, 세포주 또는 세포 스트레인의 예는, 예를 들어 마우스 골수종 (NSO)-세포주, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO)-세포주, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK (새끼 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, YB2/0, Y0, C127, L 세포, COS, 예를 들어 COS1 및 COS7, QC1-3, HEK-293, VERO, PER.C6, HeLA, EBl, EB2, EB3, 종양용해 또는 하이브리도마-세포주이다. 바람직하게는 포유동물 세포는 CHO-세포주이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹-아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어 CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어 포텔리젠트(Potelligent)® CHOK1 SV (론자 바이올로직스, 인크.(Lonza Biologics, Inc.))이다. 진핵 세포는 또한 조류 세포, 세포주 또는 세포 스트레인, 예컨대, 예를 들어 EBx® 세포, EB14, EB24, EB26, EB66 또는 EBvl3일 수 있다.

한 실시양태에서, 진핵 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는, 예를 들어 배아 줄기 세포 (ESC), 성체 줄기 세포, 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC), 조직 특이적 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포) 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함한 만능 줄기 세포일 수 있다.

한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 임의의 세포의 분화된 형태이다. 한 실시양태에서, 세포는 배양물 중 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.

실시양태에서, 세포는 간세포, 예컨대 인간 간세포, 동물 간세포 또는 비-실질 세포이다. 예를 들어, 세포는 플레이팅가능한 대사 적격 인간 간세포, 플레이팅가능한 유도 적격 인간 간세포, 플레이팅가능한 쿼리스트 수송자 인증(Qualyst Transporter Certified)™ 인간 간세포, 현탁 적격 인간 간세포 (10명의 공여자 및 20명의 공여자로부터 풀링된 간세포 포함), 인간 간 쿠퍼 세포, 인간 간 성상 세포, 개 간세포 (단일 및 풀링된 비글 간세포 포함), 마우스 간세포 (CD-1 및 C57BI/6 간세포 포함), 래트 간세포 (스프라그-돌리, 위스타 한 및 위스타 간세포 포함), 원숭이 간세포 (시노몰구스 또는 레서스 원숭이 간세포 포함), 고양이 간세포 (단모 가축의 간세포 포함) 및 토끼 간세포 (뉴질랜드 화이트 간세포 포함)일 수 있다. 예시적인 간세포는 미국 27709 노스 캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크 데이비스 드라이브 6 소재 트라이앵글 리서치 랩스, 엘엘씨(Triangle Research Labs, LLC)로부터 상업적으로 입수 가능하다.

한 실시양태에서, 진핵 세포는 하등 진핵 세포, 예컨대, 예를 들어 효모 세포 (예를 들어, 피키아(Pichia) 속 (예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 클루이베리(Pichia kluyveri) 및 피키아 안구스타(Pichia angusta)), 코마가타엘라(Komagataella) 속 (예를 들어 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris) 또는 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii)), 사카로미세스(Saccharomyces) 속 (예를 들어 사카로미세스 세레비자에(Saccharomyces cerevisae), 세레비지아에, 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로미세스 우바룸(Saccharomyces uvarum)), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속 (예를 들어 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)), 칸디다(Candida) 속 (예를 들어 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 카카오이(Candida cacaoi), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii)), 게오트리쿰(Geotrichum) 속 (예를 들어 게오트리쿰 페르멘탄스(Geotrichum fermentans)), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 또는 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)이다. 종 피키아 파스토리스가 바람직하다. 피키아 파스토리스 균주의 예는 X33, GS115, KM71, KM71H; 및 CBS7435이다.

한 실시양태에서, 진핵 세포는 진균 세포 (예를 들어 아스페르길루스(Aspergillus) (예컨대 에이. 니거(A. niger), 에이. 푸미가투스(A. fumigatus), 에이. 오리자에(A. orzyae), 에이. 니둘라(A. nidula)), 아크레모니움(Acremonium) (예컨대 에이. 써모필룸(A. thermophilum)), 카에토미움(Chaetomium) (예컨대 씨. 써모필룸(C. thermophilum)), 크리소스포리움(Chrysosporium) (예컨대 씨. 써모필레(C. thermophile)), 코르디셉스(Cordyceps) (예컨대 씨. 밀리타리스(C. militaris)), 코리나스쿠스(Corynascus), 크테노미세스(Ctenomyces), 푸사리움(Fusarium) (예컨대 에프. 옥시스포룸(F. oxysporum)), 글로메렐라(Glomerella) (예컨대 지. 그라미니콜라(G. graminicola)), 히포크레아(Hypocrea) (예컨대 에이치. 제코리나(H. jecorina)), 마그나포르테(Magnaporthe) (예컨대 엠. 오리자에(M. orzyae)), 미셀리오프토라(Myceliophthora) (예컨대 엠. 써모필레(M. thermophile)), 넥트리아(Nectria) (예컨대 엔. 헤마토코카(N. haematococca)), 뉴로스포라(Neurospora) (예컨대 엔. 크라사(N. crassa)), 페니실리움(Penicillium), 스포로트리쿰(Sporotrichum) (예컨대 에스. 써모필레(S. thermophile)), 티엘라비아(Thielavia) (예컨대 티. 테레스트리스(T. terrestris), 티. 헤테로탈리카(T. heterothallica)), 트리코더마(Trichoderma) (예컨대 티. 레에세이(T. reesei)), 또는 베르티실리움(Verticillium) (예컨대 브이. 달리아(V. dahlia))이다.

한 실시양태에서, 진핵 세포는 곤충 세포 (예를 들어, Sf9, 미믹(Mimic)™ Sf9, Sf21, 하이 파이브(High Five)™ (BT1-TN-5B1-4) 또는 BT1-Ea88 세포), 조류 세포 (예를 들어, 속 암포라(Amphora), 바실라리오피세아에(Bacillariophyceae), 두날리엘라(Dunaliella), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 시아노피타(Cyanophyta) (시아노박테리아), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 스피룰리나(Spirulina) 또는 오크로모나스(Ochromonas)), 또는 식물 세포 (예를 들어, 단자엽 식물 (예를 들어, 옥수수, 벼, 밀 또는 세타리아(Setaria))로부터의 세포, 또는 쌍자엽 식물 (예를 들어, 카사바, 감자, 대두, 토마토, 담배, 알팔파, 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 또는 아라비돕시스(Arabidopsis))로부터의 세포)이다.

한 실시양태에서, 세포는 박테리아 또는 원핵 세포이다.

실시양태에서, 원핵 세포는 그람-양성 세포, 예컨대 바실루스(Bacillus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 또는 락토바실루스(Lactobacillus)이다. 사용될 수 있는 바실루스는, 예를 들어 비. 서브틸리스(B.subtilis), 비. 아밀로리퀘파시엔스(B.amyloliquefaciens), 비. 리케니포르미스(B.licheniformis), 비. 나토(B.natto) 또는 비. 메가테리움(B.megaterium)이다. 실시양태에서, 세포는 비. 서브틸리스, 예컨대 비. 서브틸리스 3NA 및 비. 서브틸리스 168이다. 바실루스는 43210-1214 오하이오주 콜럼버스 웨스트 12번가 애비뉴 484 바이올로지칼 사이언시스 556 소재 바실루스 제네틱 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center)로부터 수득가능하다.

한 실시양태에서, 원핵 세포는 그람-음성 세포, 예컨대 살모넬라(Salmonella) 종 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 예컨대, 예를 들어 TG1, TG2, W3110, DH1, DHB4, DH5a, HMS 174, HMS174 (DE3), NM533, C600, HB101, JM109, MC4100, XL1-블루 및 오리가미, 뿐만 아니라 이. 콜라이 B-균주로부터 유래된 것들, 예컨대, 예를 들어 BL-21 또는 BL21 (DE3)이며, 이들은 모두 상업적으로 입수가능하다.

적합한 숙주 세포는, 예를 들어 배양물 수집처, 예컨대 DSMZ (도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일 브라운슈바이크) 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 상업적으로 입수가능하다.

실시양태에서, 배양된 세포는 치료 용도를 위해 단백질, 예를 들어 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 및/또는 재조합 단백질을 생산하는데 사용된다. 실시양태에서, 배양된 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사물을 생산한다. 예를 들어, 실시양태에서, 약 4000 달톤 내지 약 140,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 분자가 생산될 수 있다. 실시양태에서, 이들 분자는 소정 범위의 복잡성을 가질 수 있고, 글리코실화를 포함한 번역후 변형을 포함할 수 있다.

실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 보톡스, 미오블록, 뉴로블록, 디스포르트 (또는 보툴리눔 신경독소의 다른 혈청형), 알글루코시다제 알파, 답토마이신, YH-16, 코리오고나도트로핀 알파, 필그라스팀, 세트로렐릭스, 인터류킨-2, 알데스류킨, 테세류킨, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 알파-n3 (주사용), 인터페론 알파-nl, DL-8234, 인터페론, 선토리 (감마-1a), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소네르민, 디기Fab, 비페라TAb, 에키TAb, 크로Fab, 네시리티드, 아바타셉트, 알레파셉트, 레비프, 엡토테르미날파, 테리파라티드, 칼시토닌, 에타네르셉트, 헤모글로빈 글루타머 250 (소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나제, 카르페리티드, 재조합 인간 표피 성장 인자, DWP401, 다르베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌, 엡타코그 알파 (활성화), 재조합 인자 VIII+VWF, 리콤비네이트, 재조합 인자 VIII, 인자 VIII (재조합), 알픈메이트, 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리페르민, 인디키나제, 테넥테플라제, 알테플라제, 파미테플라제, 레테플라제, 나테플라제, 몬테플라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 미카펀진, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토그라스팀, 세르모렐린, 글루카곤, 엑세나티드, 프람린티드, 이미글루세라제, 갈술파제, 류코트로핀, 몰그라모스팀, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린 (히드론), 데슬로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤리드 (아트리겔), 류프롤리드 (듀로스), 고세렐린, 유트로핀, 소마트로핀, 메카세르민, 엔파비르티드, Org-33408, 인슐린 글라진, 인슐린 글루리신, 인슐린 (흡입용), 인슐린 리스프로, 인슐린 데테미르, 인슐린 (래피드미스트), 메카세르민 린파베이트, 아나킨라, 셀모류킨, 99 mTc-압시티드, 미엘로피드, 베타세론, 글라티라머 아세테이트, 게폰, 사르그라모스팀, 오프렐베킨, 인간 백혈구-유도된 알파 인터페론, 빌리브, 인슐린 (재조합), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파르트, 메카세닌, 로페론-A, 인터페론-알파 2, 알파페론, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파, 아보넥스 재조합 인간 황체형성 호르몬, 도르나제 알파, 트라페르민, 지코노티드, 탈티렐린, 디보터민알파, 아토시반, 베카플레르민, 엡티피바티드, 제마이라, CTC-111, 산백-B, 옥트레오티드, 란레오티드, 안세스팀, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 라로니다제, 프레자티드 아세트산구리, 라스부리카제, 라니비주맙, 액티뮨, PEG-인트론, 트리코민, 재조합 인간 부갑상선 호르몬 (PTH) 1-84, 에포에틴 델타, 트랜스제닉 항트롬빈 III, 그란디트로핀, 비트라제, 재조합 인슐린, 인터페론-알파, GEM-21S, 바프레오티드, 이두르술파제, 오마파트릴라트, 재조합 혈청 알부민, 세르톨리주맙 페골, 글루카르피다제, 인간 재조합 C1 에스테라제 억제제, 라노테플라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르티드, VGV-1, 인터페론 (알파), 루시나크탄트, 아비프타딜, 이카티반트, 에칼란티드, 오미가난, 오로그랩, 펙시가난아세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가렐릭스, 신트레델린베수도톡스, Favld, MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루티드, 테리파라티드, 티파코긴, AA4500, T4N5 리포솜 로션, 카투막소맙, DWP413, ART-123, 크리살린, 데스모테플라제, 아메디플라제, 코리폴리트로핀알파, TH-9507, 테두글루티드, 디아미드, DWP-412, 성장 호르몬, 재조합 G-CSF, 인슐린, 인슐린 (테크노스피어), 인슐린 (AERx), RGN-303, 디아펩277, 인터페론 베타, 인터페론 알파-n3, 벨라타셉트, 경피 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 세레셉트, 오페바칸, 에이즈박스, GV-1001, 림포스캔, 란피르나제, 리폭시산, 루수풀티드, MP52, 시푸류셀-T, CTP-37, 인세지아, 비테스펜, 인간 트롬빈, 트롬빈, 트랜스MID, 알피메프라제, 퓨리카제, 테를리프레신, EUR-1008M, 재조합 FGF-I, BDM-E, 로티갑티드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 듀라마이신, SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ABT-510, 보우만 버크 억제제, XMP-629, 99 mTc-하이닉-아넥신 V, 카할랄리드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스, 오자렐릭스, 로미뎁신, BAY-504798, 인터류킨4, PRX-321, 펩스칸, 이보크타데킨, rh락토페린, TRU-015, IL-21, ATN-161, 실렌기티드, 알부페론, 비파식스, IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오티드, huN901-DMI, SB-249553, 온코박스-CL, 온코박스-P, BLP-25, 세르박스-16, MART-1, gp100, 티로시나제, 네미피티드, rAAT, CGRP, 페그수네르셉트, 티모신베타4, 플리티뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-1, AC-100, 연어 칼시토닌 (엘리겐), 엑사모렐린, 카프로모렐린, 카르데바, 벨라페르민, 131I-TM-601, KK-220, T-10, 울라리티드, 데펠레스타트, 헤마티드, 크리살린, rNAPc2, 재조합 인자 V111 (PEG화 리포솜), bFGF, PEG화 재조합 스타필로키나제 변이체, V-10153, 소노라이시스 프로라이스, 뉴로박스, CZEN-002, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑세나티드 (제어 방출, 메디소르브), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, ACM-9604, 리나클로티드아세테이트, CETi-1, 헤모스판, VAL, 빠른-작용 인슐린 (주사가능, 비아델), 인슐린 (엘리겐), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라, 멀티카인, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10, 탈락토페린, rEV-131, rEV-131, 재조합 인간 인슐린, RPI-78M, 오프렐베킨, CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3, IRX-3, RDP-58, 타우페론, 담즙 염 자극 리파제, 메리스파제, 알라닌 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄-II, 브레멜라노티드, ATL-104, 재조합 인간 마이크로플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, 디노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, ALTU-135, 재조합 뉴라미니다제, Vacc-5q, Vacc-4x, Tat 톡소이드, YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) (노바솜), 오스타볼린-C, PTH 유사체, MBRI-93.02, MTB72F, MVA-Ag85A, FARA04, BA-210, 재조합 플라크 FIV, AG-702, OxSODrol, rBetV1, Der-p1/Der-p2/Der-p7, PR1 펩티드 항원, 돌연변이체 ras 백신, HPV-16 E7 리포펩티드 백신, 라비린틴, WT1-펩티드, IDD-5, CDX-110, 펜트리스, 노렐린, 시토Fab, P-9808, VT-111, 이크로캅티드, 텔베르민, 루핀트리비르, 레티쿨로스, rGRF, HA, 알파-갈락토시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07, DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 면역독소, DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스, 콜레시스토키닌-B/가스트린-수용체 결합 펩티드, 111In-hEGF, AE-37, 트라스투주맙-DM1, 길항제 G, IL-12, PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647, L-19 기반 ra, Re-188-P-2045, AMG-386, DC/1540/KLH, VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-1 (펩티드), NA17.A2 펩티드, CBP-501, 재조합 인간 락토페린, FX-06, AP-214, WAP-8294A, ACP-HIP, SUN-11031, 펩티드 YY [3-36], FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34, F-18-CCR1, AT-1100, JPD-003, PTH(7-34) (노바솜), 듀라마이신, CAB-2, CTCE-0214, 글리코PEG화 에리트로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 인자 XIII, 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스, EP-51216, hGH, OGP-I, 시푸비르티드, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, 티모펜틴, r(m)CRP, 간선택적 인슐린, 수발린, L19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 효능제, AL-108, AL-208, 신경 성장 인자 길항제, SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 테리파라티드 (엘리겐), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합체, EP-1043, gpE1, gpE2, MF-59, hPTH(1-34), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스쿰닌, BIM-23190, 멀티-에피토프 티로시나제 펩티드, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, 혈관-표적화 TNF, 데스모프레신, 오네르셉트, 및 TP-9201이다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)), 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)™), 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)™/맙 테라(MAB THERA)™) 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)™), 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)™), 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)™), 페그필그라스팀 (뉴라스타(NEULASTA)™), 또는 바이오시밀러 및 바이오베터를 포함한 임의의 다른 적합한 폴리펩티드이다.

다른 적합한 폴리펩티드는 하기 및 US2016/0097074의 표 1에 열거된 것들이다:

표 1.

실시양태에서, 폴리펩티드는 표 2에 제시된 바와 같은 호르몬, 혈액 클로팅/응고 인자, 시토카인/성장 인자, 항체 분자, 융합 단백질, 단백질 백신 또는 펩티드이다.

표 2. 예시적인 생성물

실시양태에서, 단백질은 다중특이적 단백질, 예를 들어 표 3에 제시된 바와 같은 이중특이적 항체이다.

표 3: 이중특이적 포맷

표 4.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 암 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시양태에서, 재조합 또는 치료 폴리펩티드는 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원이다. 일부 실시양태에서, 재조합 또는 치료 폴리펩티드는 HER2, CD20, 9-O-아세틸-GD3, βhCG, A33 항원, CA19-9 마커, CA-125 마커, 칼레티쿨린, 카르보안히드라제 IX (MN/CA IX), CCR5, CCR8, CD19, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD63, CD70, CC123, CD138, 암종 배아 항원 (CEA; CD66e), 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 엔도시알린, 에프린 A2 (EphA2), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), ErbB2, 태아 아세틸콜린 수용체, 섬유모세포 활성화 항원 (FAP), 푸코실 GM1, GD2, GD3, GM2, 강글리오시드 GD3, 글로보 H, 당단백질 100, HER2/neu, HER3, HER4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 1, 루이스-Y, LG, Ly-6, 흑색종-특이적 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸 (MCSCP), 메소텔린, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5_AC, MUC5_B, MUC7, MUC16, 뮐러 억제 물질 (MIS) 수용체 유형 II, 형질 세포 항원, 폴리 SA, PSCA, PSMA, 소닉 헤지호그 (SHH), SAS, STEAP, sTn 항원, TNF-알파 전구체 및 그의 조합으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, 2B4 (CD244), α₄β₁ 인테그린, β₂ 인테그린, CD2, CD16, CD27, CD38, CD96, CDlOO, CD160, CD137, CEACAMl (CD66), CRTAM, CSl (CD319), DNAM-1 (CD226), GITR (TNFRSF18), KIR의 활성화 형태, NKG2C, NKG2D, NKG2E, 1종 이상의 천연 세포독성 수용체, NTB-A, PEN-5 및 그의 조합으로부터 선택되며, 임의로 여기서 β₂ 인테그린은 CD11a-CD18, CD11b-CD18 또는 CD11c-CD18을 포함하고, 임의로 여기서 KIR의 활성화 형태는 KlR2DSl, KIR2DS4 또는 KIR-S를 포함하고, 임의로 여기서 천연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46 또는 NKp80을 포함한다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 억제 수용체이고, KIR, ILT2/LIR-l/CD85j, KIR의 억제 형태, KLRG1, LAIR-1, NKG2A, NKR-P1A, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9 및 그의 조합으로부터 선택되며, 임의로 여기서 KIR의 억제 형태는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2 또는 KIR-L을 포함한다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 활성화 수용체이고, CD3, CD2 (LFA2, OX34), CD5, CD27 (TNFRSF7), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD40L, CD84 (SLAMF5), CD137 (4-1BB), CD226, CD229 (Ly9, SLAMF3), CD244 (2B4, SLAMF4), CD319 (CRACC, BLAME), CD352 (Lyl08, NTBA, SLAMF6), CRTAM (CD355), DR3 (TNFRSF25), GITR (CD357), HVEM (CD270), ICOS, LIGHT, LTβR (TNFRSF3), OX40 (CD134), NKG2D, SLAM (CD150, SLAMF1), TCRα, TCRβ, TCRδγ, TIM1 (HAVCR, KIM1) 및 그의 조합으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 억제 수용체이고, PD-1 (CD279), 2B4 (CD244, SLAMF4), B71 (CD80), B7Hl (CD274, PD-L1), BTLA (CD272), CD160 (BY55, NK28), CD352 (Ly108, NTBA, SLAMF6), CD358 (DR6), CTLA-4 (CD152), LAG3, LAIR1, PD-1H (VISTA), TIGIT (VSIG9, VSTM3), TIM2 (TIMD2), TIM3 (HAVCR2, KIM3) 및 그의 조합으로부터 선택된다.

다른 예시적인 단백질은 문헌 [Leader et al., "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39] (본원에 참조로 포함됨)의 표 1-10에 기재된 임의의 단백질; 또는 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드의 임의의 접합체, 변이체, 유사체 또는 기능적 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

다른 재조합 단백질 생성물은 비-항체 스캐폴드 또는 대안적 단백질 스캐폴드, 예컨대, 이에 제한되지 않지만 DARPin, 아피바디 및 애드넥틴을 포함한다. 이러한 비-항체 스캐폴드 또는 대안적 단백질 스캐폴드는 1 또는 2개 또는 그 초과, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 초과의 상이한 표적 또는 항원을 인식하거나 이에 결합하도록 조작될 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 생성물, 예를 들어 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 선택 마커를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 선택 마커는 글루타민 신테타제 (GS); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 예를 들어 메토트렉세이트 (MTX)에 대한 저항성을 부여하는 효소; 프롤린, 또는 항생제 마커, 예를 들어 히그로마이신, 네오마이신 (G418), 제오신, 퓨로마이신 또는 블라스티시딘과 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 효소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선택 마커는 셀렉시스(Selexis) 선택 시스템 (예를 들어, SURE테크놀로지 플랫폼(SUREtechnology Platform)™ 및 셀렉시스 제네틱 엘레멘츠(Selexis Genetic Elements)™, 셀렉시스 SA로부터 상업적으로 입수가능함) 또는 카탈란트(Catalant) 선택 시스템을 포함하거나 이와 상용성이다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 본원에 기재된 재조합 생성물을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포들을 확인하는데 유용한 선택 마커를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 선택 마커는 본원에 기재된 바와 같이, 재조합 생성물을 코딩하는 핵산 서열의 게놈 내로의 통합을 포함하는 세포 또는 세포들을 확인하는데 유용하다. 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 통합된 세포 또는 세포들의 확인은 생성물을 안정하게 발현하는 세포 또는 세포주의 선택 및 조작에 유용할 수 있다.

넘버링된 실시양태

본 발명은 임의의 하기 넘버링된 단락에서 정의될 수 있다.

1. a) 적어도 1개의 세포가 제1 아미노산 서열, 예를 들어 생산 서열을 포함하는 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 있는 것인 복수의 세포를 배양하여, 생성물을 포함하는 조건화 배지를 제조하는 단계;

복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법.

2. 제1 단락에 있어서, 복수의 세포를 배양하여 생성물을 포함하는 제2 조건화 배지를 제조하고; 제2 조건화 배지에 대해 단계 b-h를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.

3. 제2 단락에 있어서, 복수의 세포를 배양하여 생성물을 포함하는 제3 조건화 배지를 제조하고; 제3 조건화 배지에 대해 단계 b-h를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.

4. 제3 단락에 있어서, 복수의 세포를 배양하여 생성물을 포함하는 후속, 예를 들어 제N (여기서 N = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20) 조건화 배지를 제조하고; 후속, 예를 들어 제N 조건화 배지에 대해 단계 b-h를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.

5. 제1 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 조건화 배양 배지가 생성물의 상이한 생산 스테이지, 예를 들어 생성물 생산 배양물의 초기, 중기 또는 후기 성장 스테이지에서, 또는 상이한 세포주 생산 스테이지에서 생산되는 것인 방법.

6. 제1 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 조건화 배양 배지가 복수의 세포의 배양에서 상이한 시점에 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 시점 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 시점에) 생산되는 것인 방법.

7. 제1 단락 내지 제6 단락 중 어느 한 단락에 있어서,

i) h)에서 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 조건화 배양 배지 중 하나에 대해 이루어진 결정을,

ii) h)에서 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속 제N 조건화 배양 배지 중 또 다른 것에 대해 이루어진 결정과

비교하는 단계를 포함하는 방법.

8. 제1 단락에 있어서, 제2 복수의 세포에 대해 단계 a-h를 수행하는 것을 포함하는, 제2 복수의 세포를 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.

9. 제8 단락에 있어서, 제3의 복수의 세포에 대해 단계 a-h를 수행하는 것을 포함하는, 제3 복수의 세포를 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.

10. 제9 단락에 있어서, 후속, 예를 들어 제N (여기서 N = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20) 복수의 세포에 대해 단계 a-h를 수행하는 것을 포함하는, 후속, 예를 들어 제N 복수의 세포를 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.

11. 제8 단락 내지 제10 단락 중 어느 한 단락에 있어서,

i) h)에서 복수의 세포인, 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 복수의 세포 중 하나에 대해 이루어진 결정을,

ii) h)에서 복수의 세포인, 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 복수의 세포 중 또 다른 것에 대해 이루어진 결정과

비교하는 단계를 포함하는 방법.

12. 제8 단락 내지 제11 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 복수의 세포가 동일한 유형, 예를 들어 동일한 종, 동일한 세포주 (예를 들어, CHO, NSO, HEK), 또는 동일한 세포주 단리물 (예를 들어, 동일한 CHO 세포주 단리물)의 세포를 포함하는 것인 방법.

13. 제8 단락 내지 제11 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 세포 중 1개 이상, 예를 들어 각각이 상이한 유형, 예를 들어 상이한 종, 상이한 세포주 (예를 들어, CHO, NSO, HEK), 또는 상이한 세포주 단리물 (예를 들어, 상이한 CHO 세포주 단리물)의 세포를 포함하는 것인 방법.

14. 제11 단락 내지 제13 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 비교에 대응하여, 예를 들어 제1 아미노산 서열을 포함하는 생성물을 생산하기 위한 복수의 세포, 예를 들어 제1 아미노산 서열 이외의 서열을 포함하는 생성물은 포함하지 않는 복수의 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.

15. 제1 단락 내지 제14 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 아미노산 서열이 표 1-4로부터 선택된 단백질 생성물에 상응하는 것인 방법.

16. 제1 단락 내지 제15 단락 중 어느 한 단락에 있어서, b), d) 및 임의로 f)가 폴리펩티드의 샘플을 변성시키는 것을 포함하는 것인 방법.

17. 제16 단락에 있어서, 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 구아니딘 히드로클로라이드 (GuHCl)의 존재 하에 및 산성 pH (예를 들어, 6.8, 6.5, 6.3, 6, 5.8 또는 5.5의 pH)에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.

18. 제16 단락에 있어서, 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 우레아 및 데옥시콜레이트의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.

19. 제18 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 정제된 단백질 생성물의 소화 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.

20. 제19 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 b) 전에, d) 전에 및/또는 임의로 f) 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.

21. 제19 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 임의로 반응 생성물을, 예를 들어 질량 분광측정법에 의한 분리 단계에 적용하는 단계 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.

22. 제19 단락 내지 제21 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 산의 첨가에 의해 침전되는 것인 방법.

23. 제1 단락 내지 제22항 중 어느 한 단락에 있어서, b), d) 및/또는 임의로 f)가 정제된 단백질을 TCEP로 환원시키는 것을 포함하는 것인 방법.

24. 제1 단락 내지 제22 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 서열-기반 반응이 단백질분해 효소에 의한 소화인 방법.

25. 제24 단락에 있어서, 단백질분해 효소가 트립신, 키모트립신, LysC 및 AspN으로부터 선택되는 것인 방법.

26. 제1 단락 내지 제25 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 1개 이상의 단계가 고처리량 샘플 가공에 적합한 장치에서 수행되는 것인 방법.

27. 제26 단락에 있어서, 1개 이상의 단계가 96-웰 플레이트에서 수행되는 것인 방법.

28. 제1 단락 내지 제27 단락 중 어느 한 단락에 있어서, b), d) 및/또는 임의로 f)가 임의로 LC/MS를 사용하여 반응 생성물, 예를 들어 단백질분해 단편을 분석하는 것을 포함하는 분리 단계를 포함하는 것인 방법.

29. 제1 단락 내지 제28 단락 중 어느 한 단락에 있어서, c), e) 및/또는 임의로 g)가 비교에 의해 확인된 반응 생성물의 성분, 예를 들어 단백질분해 단편의 아미노산 서열을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.

30. 제29 단락에 있어서, 아미노산 서열을 확인하는 것이 비교에 의해 확인된 반응 생성물의 성분, 예를 들어 단백질분해 단편에 대해 MS/MS를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.

31. 제1 단락 내지 제30 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 자동화된 방법.

32. 제1 단락 내지 제31 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 로봇 장비를 사용하는 방법.

33. 제1 단락 내지 제32 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로유체 시스템을 사용하는 방법.

34. 제1 단락 내지 제33 단락 중 어느 한 단락에 있어서, b), d) 및/또는 임의로 f) 전에, 생성물을 함유하는 조건화 배지로부터 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

35. 제34 단락에 있어서, 생성물을 정제하는 단계가 크로마토그래피를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.

36. 제1 단락 내지 제35 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 장비로부터의 캐리오버 오염을 제거하기 위한 세척 프로토콜을 포함하는 방법.

37. 제36 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 LC/MS를 사용하여 블랭크 샘플을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.

38. 제36 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 산성 용액 및 고 유기 용액의 교대 세척을 포함하는 것인 방법.

39. 제36 단락 또는 제38 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법과 병행하여 실행될 수 있는 것인 방법.

40. 제39 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법의 경과 시간을 추가시키지 않는 것인 방법.

41. 제39 단락에 있어서, 세척 프로토콜을 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 방법의 경과 시간을 적어도 약 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키는 것인 방법.

42. 제39 단락에 있어서, 세척 프로토콜을 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 세척에 소요되는 추가의 시간을 적어도 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키는 것인 방법.

43. 제1 단락 내지 제42 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 파트 h)에서 검출된 제1 아미노산 서열 이외의 서열의 면역원성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

44. 제43 단락에 있어서, 면역원성을 평가하는 단계가 파트 h)에서 검출된 제1 아미노산 서열 이외의 서열을 인 실리코 면역원성 도구, 예를 들어 에피베이스를 사용하여 평가하는 것을 포함하는 것인 방법.

45. a) 단백질 생성물을 생산하는 세포 집단을 제공하는 단계;

b) 세포 집단으로부터 단백질 생성물을 정제하는 단계;

단백질 서열 변이체를 검출하는 방법.

46. 제45 단락에 있어서, 복수의 세포 집단이 생성물의 상이한 생산 스테이지, 예를 들어 생성물 생산 배양물의 초기, 중간 또는 후기 성장 스테이지, 또는 상이한 세포주 생산 스테이지에서 생산되는 것인 방법.

47. 단락 45에 있어서, 복수의 세포 집단이 복수의 세포의 배양에서 상이한 시점에 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 시점 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 시점에) 생산되는 것인 방법.

48. 제45 단락에 있어서, 각각의 세포 집단이 동일한 유형, 예를 들어 동일한 종, 동일한 세포주 (예를 들어, CHO, NSO, HEK), 또는 동일한 세포주 단리물 (예를 들어, 동일한 CHO 세포주 단리물)의 세포를 포함하는 것인 방법.

49. 제45 단락에 있어서, 세포 집단 중 1개 이상, 예를 들어 각각이 상이한 유형, 예를 들어 상이한 종, 상이한 세포주 (예를 들어, CHO, NSO, HEK), 또는 상이한 세포주 단리물 (예를 들어, 상이한 CHO 세포주 단리물)의 세포를 포함하는 것인 방법.

50. 제45 단락 내지 제49 단락 중 어느 한 단락에 있어서, e)에 대응하여, 예를 들어 생성물을 생산하기 위한 세포 집단, 예를 들어 단백질 서열 변이체는 포함하지 않는 세포 집단을 선택하는 단계를 포함하는 방법.

51. 제45 단락 내지 제50 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 단백질 생성물이 표 1-4로부터 선택된 재조합 또는 치료 단백질인 방법.

52. 제45 단락 내지 제51 단락 중 어느 한 단락에 있어서, c)가 정제된 단백질을 변성시키는 것을 포함하는 것인 방법.

53. 제52 단락에 있어서, 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 구아니딘 히드로클로라이드 (GuHCl)의 존재 하에 및 산성 pH (예를 들어, 6.8, 6.5, 6.3, 6, 5.8 또는 5.5의 pH)에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.

54. 제52 단락에 있어서, 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 우레아 및 데옥시콜레이트의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.

55. 제54 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 정제된 단백질 생성물의 소화 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.

56. 제54 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 d) 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.

57. 제54 단락 내지 제56 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 데옥시콜레이트가 산의 첨가에 의해 침전되는 것인 방법.

58. 제45 단락 내지 제57 단락 중 어느 한 단락에 있어서, c)가 정제된 단백질을 TCEP로 환원시키는 것을 포함하는 것인 방법.

59. 제45 단락 내지 제58 단락 중 어느 한 단락에 있어서, c)가 정제된 단백질을 트립신, 키모트립신, LysC 또는 AspN으로 소화시키는 것을 포함하는 것인 방법.

60. 제59 단락에 있어서, c)가 정제된 단백질의 복수의 분취물을 형성하고 분취물을 복수의 프로테아제로 소화시키는 것을 포함하며, 여기서 각각의 분취물은 상이한 프로테아제에 의해 소화되고, 여기서 프로테아제는 트립신, 키모트립신, LysC 또는 AspN으로부터 선택되는 것인 방법.

61. 제60 단락에 있어서, 소화 후, 복수의 분취물이 함께 혼합되는 것인 방법.

62. 제45 단락 내지 제61 단락 중 어느 한 단락에 있어서, c)가 고처리량 샘플 가공에 적합한 장치에서 수행되는 것인 방법.

63. 제62 단락에 있어서, c)가 96-웰 플레이트에서 수행되는 것인 방법.

64. 제45 단락 내지 제63 단락 중 어느 한 단락에 있어서, d)가 준비된 정제된 단백질 생성물을 LC/MS를 사용하여 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.

65. 제45 단락 내지 제64 단락 중 어느 한 단락에 있어서, e)가 복수의 세포 집단의 데이터와 질량 분광측정법 데이터베이스의 비교 분석에 의해 존재비의 변화를 디스플레이하는 펩티드를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.

66. 제65 단락에 있어서, e)가 MS/MS에 의해 존재비의 변화를 디스플레이하는 펩티드를 분석하고, MS/MS 데이터를 MS/MS 데이터베이스와 비교함으로써 서열 변경을 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.

67. 제45 단락 내지 제66 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 자동화된 방법.

68. 제45 단락 내지 제67 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 로봇 장비를 사용하는 방법.

69. 제45 단락 내지 제68 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로유체 시스템을 사용하는 방법.

70. 제45 단락 내지 제69 단락 중 어느 한 단락에 있어서, b)가 단백질 생성물을 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.

71. 제45 단락 내지 제70 단락 중 어느 한 단락에 있어서, d)가 캐리오버 오염을 제거하기 위한 세척 프로토콜을 포함하는 것인 방법.

72. 제71 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 LC/MS를 사용하여 블랭크 샘플을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.

73. 제71 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 산성 용액 및 고 유기 용액의 교대 세척을 포함하는 것인 방법.

74. 제71 단락 또는 제73 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법과 병행하여 실행될 수 있는 것인 방법.

75. 제74 단락에 있어서, 세척 프로토콜이 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법의 경과 시간을 추가시키지 않는 것인 방법.

76. 제74 단락에 있어서, 세척 프로토콜을 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 방법의 경과 시간을 적어도 약 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키는 것인 방법.

77. 제74 단락에 있어서, 세척 프로토콜을 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 세척에 소요되는 추가의 시간을 적어도 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키는 것인 방법.

78. 제45 단락 내지 제77 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 검출된 단백질 서열 변이체의 면역원성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

79. 제78 단락에 있어서, 검출된 단백질 서열 변이체의 면역원성을 평가하는 단계가 단백질 서열 변이체를 인 실리코 면역원성 도구, 예를 들어 에피베이스를 사용하여 평가하는 것을 포함하는 것인 방법.

80. 제1 단락 내지 제44 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제1, 제2 및/또는 제3 폴리펩티드 샘플을 추가의 분석에 적용하여 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성 중 1개 이상을 확인, 평가 또는 예측하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

81. 제1 단락 내지 제44 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 아미노산 서열 이외의 서열이 복수의 세포에 존재하는 경우에, 제1 아미노산 서열 이외의 서열을 추가의 분석에 적용하여 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성 중 1개 이상을 확인, 평가 또는 예측하는 것인 방법.

82. 제45 단락 내지 제79 단락 중 어느 한 단락에 있어서,

f) 검출된 단백질 서열 변이체(들)를 분석하여 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성 중 1개 이상을 확인, 검출, 평가 또는 예측하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

83. 면역원성을 평가하는 단계; 단백질 응집, 예를 들어 단백질 응집의 경향을 예측하는 단계; 탈아미드화를 평가하는 단계; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화를 검출하는 단계; C-말단 리신 프로세싱을 검출하는 단계; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제를 예측/평가하는 단계; 유리 시스테인 티올 기를 검출하는 단계; 등전점을 검출하는 단계; 리신 당화를 검출하는 단계; N- 및/또는 O-글리코실화를 확인하는 단계; N-말단 고리화를 검출하는 단계; 산화를 검출하는 단계; 또는 피로글루타메이트 형성을 검출하는 단계 중 1개 이상을 포함하는, 제45 단락 내지 제79 단락 중 어느 한 단락에서 검출된 바와 같은 단백질 서열 변이체를 분석하는 방법.

84. 면역원성을 평가하는 단계; 단백질 응집, 예를 들어 단백질 응집의 경향을 예측하는 단계; 탈아미드화를 평가하는 단계; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화를 검출하는 단계; C-말단 리신 프로세싱을 검출하는 단계; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제를 예측/평가하는 단계; 유리 시스테인 티올 기를 검출하는 단계; 등전점을 검출하는 단계; 리신 당화를 검출하는 단계; N- 및/또는 O-글리코실화를 확인하는 단계; N-말단 고리화를 검출하는 단계; 산화를 검출하는 단계; 또는 피로글루타메이트 형성을 검출하는 단계 중 1개 이상을 포함하는, 제1 단락 내지 제44 단락에서 확인된 바와 같은 서열, 예를 들어 제1 서열 이외의 서열을 분석하는 방법.

85. a) 적어도 1개의 세포가 제1 아미노산 서열을 포함하는 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 있는 것인 복수의 세포를 배양하여, 생성물을 포함하는 조건화 배지를 제조하는 단계;

를 포함하며, 이에 의해 복수의 세포를 분석하는 것인,

복수의 세포를 분석하는 방법.

86. a) 단백질 생성물을 생산하는 세포의 집단, 예를 들어 복수의 세포를 포함하는 배양 배지로부터 정제된 단백질 생성물을 제공하는 단계;

단백질 서열 변이체를 검출하는 방법.

87. 제1 단락 내지 제86 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 샘플이 분취물인 방법.

88. 제1 단락 내지 제87 단락 중 어느 한 단락의 방법의 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드.

실시예

실시예 1: 도입, 정의, 파라미터, 물질 및 방법

단백질 서열 변이체는 게놈 뉴클레오티드 변화 또는 번역 오혼입의 결과로서 발생할 수 있는 의도하지 않은 아미노산 서열 변화이다. 체계적 스크리닝은 생물약제의 성공적인 제조를 위한 세포주 구축 과정의 필수 분석 요소로서 나타나고 있다.

발현 시스템이 서열 변이체를 생성하는 경향을 이해하는 것은 효과적인 위험 완화 전략을 가능하게 한다. GS-CHO 엑시드 발현 시스템(Xceed Expression System)™에 대해 중간 오혼입률을 조사하였다. 오혼입 메카니즘 및 초기 및 후기 세대 번호에서의 세포주 안정성과의 상관관계를 조사하였다. 항체 생성물 내의 상이한 위치에서의 서열 변이체에 대한 검출 한계의 가변성에 관하여 방법 성능을 고려하였다.

표 5.

정의:

PSVA - 단백질 서열 변이체 분석

RP-LC-MS - 역상 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법

LOD - 검출 한계

DDA - 데이터 의존성 획득

MVA - 다변량 분석

PSM - 펩티드-스펙트럼 매치

FDR - 오류 발견율

ACN - 아세토니트릴

FA - 포름산

TFA - 트리플루오로아세트산

NL - 정규화된 강도 수준

MS1 - 질량 분광측정법 데이터 (펩티드 질량 핑거프린팅에 사용됨)

MS2 - 탠덤 질량 분광측정법 데이터 (질량 분광계에 의한 펩티드의 데이터 의존성 단편화)

LC-MS^E - 데이터 비의존성 단편화를 사용한 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법

TIC - 총 이온 크로마토그램

EIC - 추출된 이온 크로마토그램

m/z - 질량-대-전하 비

z - 전하

RCF - 상대 원심력

장비:

워터스 세보(Waters Xevo) G2 QTOF 질량 분광계 시스템 (유지 번호 270420 및 271550)

오비트랩 퓨전 질량 분광계 시스템 (유지 번호 309202 및 309203)

소프트웨어:

매스링스(MassLynx) v4.1

바이오팜링스(BiopharmaLynx) 1.2

크로멜레온(Chromeleon) 6.8

튠(Tune) 2.0

프로게네시스(Progenesis) QI

피크스 스튜디오(PEAKS Studio) (바이오인포매틱스 솔루션즈(Bioinformatics Solutions))

물질:

리툭시맙 배치 B6026B01, 10mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

리툭시맙 배치 H0017B01, 10mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

헤르셉틴 배치 822601, 21mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

트라스투주맙의 바이오시밀러 후보 배치 P20504006, 4.7mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

cB72.3 배치 L22661/B10, 10.5mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

세포주 2A6, 1A12, 3C10, 3C12, 2F7, E22에 대한 cB72.3 세포 배양 상청액 (초기 및 후기 단계), -20℃에서 저장

리툭시맙의 바이오시밀러 후보 배치 213976ARS, 49.3mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

부위-특이적 항체 접합체 구축물 트라스투주맙 LC T180C, HC S160C 및 K217R, 0.57mg/ml, 5±3℃에서 저장

부위-특이적 항체 접합체 구축물 트라스투주맙 LC T180C, HC S160C 및 K217R, 18.7mg/ml, -65℃ 이하에서 저장

방법:

방법의 개요는 하기와 같다:

● 단백질 샘플을 물 중에 ≤10mg/ml로 희석한다.

● 0.12mg 샘플 분취물을 스피드백 처리하여 건조시킨다.

● 각각의 샘플을 90ul 변성 완충제 중에 재용해시킨다.

● 샘플을 인큐베이션한다.

● 샘플당 1개의 제바 스핀 탈염 칼럼을 준비한다.

○ 저장 용액을 1500g에서 1분 동안 원심분리하여 제거한다.

○ 300μl 소화 완충제를 수지층의 상단에 첨가하고, 1500g에서 1분 동안 원심분리한다.

○ 칼럼 평형화를 2회 반복한다.

○ 각각의 샘플의 총 부피를 압축 수지층의 중앙에 적용한다. 1500g에서 2분 동안 원심분리하고, 칼럼 용리액을 유지한다.

● 75μl의 각각의 샘플에, 샘플 및 블랭크당 25μl 트립신 소화 용액을 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합한다. 샘플을 30 ± 2℃에서 195 ± 10분 동안 인큐베이션한다.

● 2μl TFA를 각각의 샘플에 첨가하고, 볼텍싱한다.

● 샘플을 벤치톱 원심분리기에서 14,000rcf로 10분 동안 원심분리한다.

● 분석을 위해 상청액을 제거한다.

● LC-MS에 의해 분석한다.

실시예 2: 샘플 제조

단백질 서열 변이체 분석을 위해 분석 전에 다중 효소에 의한 독립적 단백질 소화 및 불활성화 소화물을 합하는 것을 포함하는 작업흐름을 선택하였다. 개별 다중-효소 소화물을 이용하는 것의 이익은 하기를 포함한다:

● 주어진 단백질에 대한 최소 방법 최적화를 사용한 중복 단백질 서열 커버리지의 수득

● 각각의 소화물로부터의 중첩 펩티드 서열을 사용하여 서열 변이체의 독립적 확인 및 정량화

● 단편화 선택성 차이를 이용하여 펩티드 단편화로부터의 최대화된 서열 확인

본 연구에서 평가된 프로테아제는 트립신, lysC, 키모트립신 및 aspN이었다. 트립신, 키모트립신 및 aspN은 효소의 상보적 특이성으로 인해 초기 평가를 위해 선택되었다. 선택된 프로테아제에 대해 소화 조건의 최적화를 수행하였다.

샘플을 밀리큐 물을 사용하여 ≤10mg/ml로 희석한다. 각각의 희석된 단백질 샘플의 반복적 0.12mg 분취물을 무작위화 순서로 96-웰 플레이트 상에 배치한다. 샘플을 스피드백에서 농축 건조시킨다. 90μl의 변성 완충제를 각각의 샘플에 첨가하고, 플레이트를 인큐베이션한다. 제바 스핀 탈염 플레이트, 96-웰, 7K를 제조업체의 지침에 따라 우레아계 소화 완충제로 평형화시킨다. 각각의 변성된 샘플의 전체 부피를 탈염 플레이트로 옮기고, 1000g에서 2분 동안 회전시킨다. 각각의 샘플의 분취물을 특이적 소화 (예를 들어, 트립신, 키모트립신, aspN, LysC)를 위해 개별 플레이트로 옮긴다. 소화를 특정 효소 대 프로테아제 비로, 제어된 시간 및 온도에서 수행한다. 2% TFA를 첨가하여 반응물을 켄칭한다.

소화의 최적화

PSVA에 대한 소화의 적합성을 평가하기 위해 하기 소화 속성을 결정하였다:

● 완전성 (3개 초과의 누락된 절단을 갖는 잔류하는 비소화 펩티드가 없음)

불완전한 소화는 분석의 정량적 용량에 영향을 미친다.

● 재현성

펩티드 맵에서의 변이는 프로게네시스 QI 소프트웨어를 사용한 서열 변이체의 비교 분석 및 효과적인 확인에 영향을 미칠 수 있다.

● 100% 서열 커버리지의 제공

불완전한 소화, 서열 커버리지 및 펩티드 용해도를 평가함으로써 소화에 대한 우레아 몰농도 및 온도의 효과를 평가하였다. 항체 리폴딩이 낮은 농도의 우레아에서 (가능한 펩티드 용해도 문제와 함께) 발생할 수 있으며 이는 소화 효율에 영향을 미친다.

3종의 상이한 분자 - 리툭시맙, 트라스투주맙 및 cB72.3을 사용하여 소화 조건의 최적화를 수행하였다.

0.1M 트리스-히드로클로라이드, 우레아, 뿐만 아니라 환원된 시스테인을 보존하기 위한 1mM TCEP를 함유하는 소화 완충제를 사용하여 밤새 소화를 수행하였다. 완충제의 pH는 pH8이었으며, 이는 각각의 평가된 효소의 최적 활성을 위한 pH 범위에 속한다. 최적화 과정의 일부로서 하기 조건을 평가하였다:

● 우레아 몰농도: 0.5M, 1M 및 2M

● 인큐베이션 온도: 25℃, 30℃ 및 37℃

트립신

다양한 우레아 몰농도 (0.5M, 1M 및 2M) 및 온도 (25℃, 30℃ 및 37℃)를 사용하여 트립신 소화를 수행하였다. 인큐베이션을 밤새 수행하였고, 효소 대 단백질 비는 1:20이었다.

크로마토그램의 육안 검사에서는 비소화 단백질의 증거가 관찰되지 않았다 (도 2). 단일의 누락된 절단을 허용한 경우 ≥97%의 서열 커버리지가 달성되었으며, 자동화 검색에서 오직 디펩티드는 검출되지 않았다.

또한, 불완전한 소화에 의해 생성된 펩티드 (1개 이상의 누락된 절단을 갖는 펩티드)의 수를 비교함으로써 소화의 효율을 평가하였다. 0.5M 우레아 하의 25℃에서의 소화에 대해 누락된 절단의 최소 집단이 관찰되었다 (도 3).

추가로, 항체 리폴딩의 경우에 영향을 받는 것으로 공지된 중쇄 펩티드 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK를 사용하여 소화에 대한 우레아 몰농도의 효과를 평가하였다. 펩티드의 정규화된 강도를 모든 조건에 대해 비교하였다 (도 4).

크로마토그래피 플롯의 육안 검사에 의해 각각의 조건에 대한 소화의 재현성을 평가하였다. 각각의 조건에 대해 대등한 크로마토그램이 관찰되었다.

키모트립신

다양한 우레아 몰농도 (0.5M, 1M 및 2M) 및 온도 (25℃, 30℃ 및 37℃)를 사용하여 키모트립신 소화를 수행하였다. 인큐베이션을 밤새 수행하였고, 효소 대 단백질 비는 1:20이었다.

모든 평가된 조건에 대해 만족스러운 소화 효율을 달성하였다. 크로마토그램의 육안 검사에서는 비소화 단백질의 증거가 관찰되지 않았다 (도 5). 단일의 누락된 절단을 허용한 경우 ≥95%의 서열 커버리지가 달성되었으며, 자동화 검색에서 오직 디펩티드는 검출되지 않았다.

또한, 트라스투주맙의 불완전한 소화로부터 생성된 하기 대형 중쇄 펩티드의 강도를 비교함으로써 소화의 효율을 평가하였다:

Y1928　AMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW.

이러한 누락-절단된 펩티드의 가장 낮은 존재비 (보다 효율적인 소화를 나타냄)는 0.5M 우레아 하의 25℃에서의 조건에서 관찰되었으며, 이 조건에서는 검출되지 않았다 (도 6 및 도 7).

AspN

다양한 우레아 몰농도 (0.5M, 1M 및 2M)를 사용하여 AspN 소화를 수행하였다. 1:40의 효소 대 단백질 비를 사용하여 37℃에서 밤새 인큐베이션을 수행하였다. 승온 및 긴 인큐베이션 시간으로 인해 샘플 중 일부 증발이 관찰되었으며, 이는 소화 완충제의 조성에 영향을 미쳤다. 비소화 단백질을 나타내는 큰 피크가 검출되었으며, 이는 소화 과정이 비효율적이었다는 것을 나타낸다. 비소화 물질의 존재비는 1M 또는 0.5M 우레아에서보다 2M 우레아에서 더 높았다 (도 8 및 도 9). AspN을 PSVA 샘플 제조를 위한 소화 효소 중 하나로서 혼입시킬 수 있기 전에 절차의 최적화가 요구될 것이다. 1M 미만의 우레아 농도를 사용하여 추가의 최적화를 수행하고, Asp-N의 활성을 증가시키기 위한 아세트산아연의 첨가의 효과를 평가할 수 있었다. 이것은 이번에 소화 절차의 일부로서 진행하지 않기로 결정되었으며, 따라서 샘플 제조 절차의 일부로서 포함되지 않았다.

합한 소화물

0.5M 우레아에서 트립신 및 키모트립신을 사용한 독립적 단백질분해에 의해 트라스투주맙 샘플의 합한 트립신/키모트립신 소화물을 제조하였다. 1:20의 효소 대 단백질 비로 25℃에서 밤새 인큐베이션을 수행하였다. 소화물을 2% TFA로 켄칭하고, 소화물을 합하였다. 2개의 LC-MS 시스템을 사용하여 표준 및 나노-플로우 구성 둘 다를 이용하면서 샘플을 분석하였다.

워터스 세보 G2 QToF를 사용한 RP-LC-MS1 분석의 경우 합한 트립신 및 키모트립신 소화물에 대해 완전한 서열 커버리지가 달성되었다.

써모 오비트랩 퓨전을 사용한 나노LC-MS2 분석에 의해 합한 트립신 및 키모트립신 소화물에 대해 불완전한 서열 커버리지가 수득되었다. 피크스 스튜디오를 사용한 트라스투주맙 소화물의 분석은 경쇄에 대해 100% MS2 커버리지 및 중쇄에 대해 99% 커버리지를 나타냈다. 1개의 트리펩티드 및 1개의 단일 잔기 펩티드는 중쇄에서 검출되지 않았다 (도 10).

나노-플로우 LC의 적용은 분석 칼럼 전에 C18 포획 칼럼 상에 분석물을 포획하는 것을 수반한다. 소형 펩티드 (통상 5개 미만의 아미노산 잔기)는 이러한 칼럼 상에 유지되지 않는다. 마찬가지로, MS2 데이터를 사용한 서열 확인을 위해 적절한 펩티드 크기가 요구된다.

트립신 및 키모트립신으로 밤새 소화시켜 소형 펩티드를 생성하며, 이는 단백질 서열의 일부 영역에 대해 불완전한 커버리지를 나타냈다. 추가로, 키모트립신의 광범위한 활성은 부위 Met, Ala, Asp 및 Glu에서의 높은 절단율 뿐만 아니라 Tyr, Phe, Trp 및 Leu에서의 예상된 소화에 추가로 일부 비-특이적 소화를 유도하였다. 현행 소화 작업흐름은 나노LC 적용에 부적합한 것으로 결정되었다.

나노-플로우 구성을 위한 적절한 펩티드 집단을 생성하기 위해, 소화 작업흐름을 변형시켰다. 트립신 및 키모트립신에 추가로 LysC 프로테아제를 도입하였다. 소화 시간을 195분으로 감소시켜 비-특이적 소화를 최소화하였다. 새로운 소화 절차를 사용하여 피크스 스튜디오에 의해 100%의 트라스투주맙 서열이 검출되었다 (도 11).

실시예 3: LC-MS 분석

단백질 서열 변이체 분석 (PSVA)의 원리는 다변량 분석의 적용에 의한 단백질 펩티드 맵의 비교 스크리닝 및 MS2 분석에 의한 유의하게 상이한 종의 확인이다.

성공적인 방법을 생성하기 위해 다양한 인자의 고려가 요구된다. PSVA는 세포주 구축 단계에서 표적화되고, 이에 따라 강력한 고처리량 방법이도록 요구된다. 재현가능한 크로마토그래피, 각각의 크로마토그래피 피크에 대한 포괄적인 MS1 특징화 및 최소 샘플 캐리오버가 통계적 분석에 중요하다. PSVA는 낮은 수준에서의 변이체의 검출에 의존하며, 따라서 감도 및 폭넓은 동적 스캔 범위가 또한 중요하다. MS2에 의한 서열 커버리지는 추정 변이체의 확인을 위해 요구되는 경우 추가의 표적화된 단편화와 함께, 정확하고 빠른 검출에 좌우된다.

나노-플로우 LC와 대조적으로, 규칙적인 낮은 밀리리터/분 유량의 UHPLC는 높은 재현성의 이익을 갖고 덜 캐리오버되는 경향이 있다.

모델은 설정된 LC 파라미터와 관련해 피크 용량, 피크 형상 및 감도를 설명하는 출력 방정식을 사용하여 적용에 따라 분리 기술의 적응을 가능하게 한다. 모델을 사용하여 고처리량 단백질 서열 변이체 분석에 적합한 짧은 LC 방법을 개발하였다. 방법을 재계산하여 규정된 품질 파라미터를 충족시키는데 요구되는 구배 길이를 최소화하였다.

실시예 4: 방법 개요

샘플 제조

● 단백질 샘플을 물 중에 ≤10mg/ml로 희석한다.

● 각각의 샘플의 이중 분취물을 무작위화 순서로 96-웰 플레이트 상에 배치한다.

● 샘플을 스피드백에서 농축 건조시킨다.

● 90μl의 변성 환원 완충제를 각각의 샘플에 첨가한다.

● 샘플을 인큐베이션한다.

● 제바 스핀 탈염 플레이트, 96-웰, 7K를 제조업체 지침에 따라 준비한다.

○ 플레이트를 1000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 저장 완충제를 제거한다. 유동물을 폐기한다.

○ 250μL의 소화 완충제를 수지층의 상단에 첨가한다. 1000 x g에서 2분 동안 원심분리를 수행하고, 유동물을 폐기한다. 단계를 총 4회 수행한다.

○ 각각의 샘플의 총 부피를 압축 수지층의 중앙에 첨가한다.

○ 플레이트 조립물을 1000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 가공된 샘플을 수집한다.

● 트립신 및 키모트립신 소화를 위해 2개의 25μl 분취물을 취한다.

● 모든 소화를 1:20 효소 대 단백질 비로 수행한다. 특이적 단백질분해를 위해 각각의 분취물 세트에 8.3μl의 0.2mg/ml 효소를 첨가한다.

● 샘플을 인큐베이션한다.

● 2μl의 3개의 TFA 희석물 중 1개를 사용하여 개별적으로 모든 소화물을 켄칭한다.

LC-MS 분석

● C18 포획 칼럼 및 이지-스프레이 펩맵 칼럼, C18, 2μl, 100A, 75cm x 25cm이 구비된 나노-플로우 구성의 오비트랩 퓨전을 사용하여 샘플을 분석한다.

● 이동상 A를 사용하여 용매 B의 5-40%의 구배로 분해를 수행한다.

● 데이터 획득을 수행한다.

● 80% ACN 및 10% FA의 교대 세척을 사용하는 세정 절차를 방법 내로 통합하여, 이를 각각의 샘플 주입 후에 수행한다.

변이체 확인 및 표적화된 MS2 분석

정밀화된 MVA 데이터는 각각의 특색의 발현 프로파일의 조사에 의해 수동으로 평가할 것이다. 특색의 목록은 이용가능한 경우 피크스 스튜디오 MS2 데이터의 도입에 의해 확인할 수 있다. 표적화된 MS2 분석이 요구되는 경우에 체류 시간 윈도우를 갖는 m/z 값의 목록을 내보낸다.

확인된 변이체를 평가하고 보고할 것이다.

실시예 5: 검정간 대조 및 시스템 적합성 시험

낮은 수준의 서열 변이체를 효과적으로 검출하기 위해서는, 각각의 분석 동안 적절한 기기 감도가 달성되도록 보장하기 위해 대조 측정이 수행되어야 한다. 제안된 검정간 대조는 방법의 LOD와 일치하는 1%의 수준으로 서열 변이체가 스파이킹된, 소화된 B72.3 IgG4 분자로 이루어질 것이다.

CHO 세포에서 발현된 재조합 항체에서 발생하는 것으로 보고된 돌연변이에 대해 문헌 연구를 수행하였다. 결과에 기초하여, B72.3 소화물에 대해 예상된 2개의 트립신 및 1개의 키모트립신 펩티드를 선택하고, 아미노산 오혼입을 함유하는 상응하는 펩티드를 캠브리지 펩티드스(Cambridge Peptides)(GPR(subS)VFPLAPCSR, VDNALQSGS(subN)SQESVTEQDSK, TADKSSR(subS)TAY)에 의해 합성하였다. 펩티드를 사용하여 IAC 샘플을 제조할 수 있다.

하기 단백질 돌연변이가 문헌에 보고되었다:

● Phe → Leu 11res F11L

문헌 [Zeck A, Regula JT, Larraillet V, Mautz B, Popp O, Goepfert U, et al. (2012) Low Level Sequence Variant Analysis of Recombinant Proteins: An Optimized Approach. PLoS ONE 7(7): e40328. doi:10.1371/journal.pone.0040328]

문헌 [Dorai H, Sauerwald T, Campbell A, Kyung YS, Goldstein J, et al. (2007) Investigation of Product Microheterogeneity. Bioprocess Int 5: 66-72].

● Gly → Ala LC G40A

TL011 경쇄 변이체의 특징화, 론자 리포트 R04760

● Tyr → Gln HC Y376Q

문헌 [Harris RJ, Murnane AA, Utter SL, Wagner KL, Cox ET, et al. (1993) Assessing genetic heterogeneity in production cell lines: detection by peptide mapping of a low level Tyr to Gln sequence variant in a recombinant antibody. Biotechnology 11: 1293-1297].

● Ser → Arg LC S167R

● Ser → Asn HC S63N

문헌 [Guo D, Gao A, Michels DA, Feeney L, Eng M, et al. (2010) Mechanisms of unintended amino acid sequence changes in recombinant monoclonal antibodies expressed in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Biotechnol Bioeng 107: 163-171].

● Asn → Ser 다중 부위

문헌 [Khetan A, Huang YM, Dolnikova J, Pederson NE, Wen D, et al. (2010) Control of misincorporation of serine for asparagine during antibody production using CHO cells. Biotechnol Bioeng 107: 116-123].

문헌 [Wen D, Vecchi MM, Gu S, Su L, Dolnikova J, et al. (2009) Discovery and investigation of misincorporation of serine at asparagine positions in recombinant proteins expressed in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem 284: 32686-32694].

● Ser → Asn 다중 부위

문헌 [Yu XC, Borisov OV, Alvarez M, Michels DA, Wang YJ, Ling V (2009) Identification of codon-specific serine to asparagine mistranslation in recombinant monoclonal antibodies by high-resolution mass spectrometry. Anal Chem 81: 9282-9290].

시스템 적합성 시험

LC-MS 시스템의 성능에서의 일부 변동이 방법 개발 동안 관찰되었다. 검정 사이의 감도 및 크로마토그래피 재현성의 차이는 모세관 팁의 위치, 분무 안정성, LC 시스템의 성능 및 이지-스프레이 칼럼의 평형화에 대한 일부 미묘한 변화의 결과로서 발생할 수 있다. PSVA 전 적절한 시스템 성능을 보장하기 위해, 신호 강도, 칼럼 압력과 같은 파라미터를 모니터링하여야 한다. 칼럼을 조건화하기 위해 약 30회 블랭크 주입의 실행에 의해 칼럼을 평형화하는 것을 권한다. 검정간 대조 샘플은 적합한 감도가 달성되도록 보장하기 위해 샘플 분석 전에 분석하여야 한다.

실시예 6: 리툭시맙의 서열 변이체를 확인하는 사례 연구

GS 발현 시스템™을 사용하는 대표적인 론자 세포주 구축 과정에서 서열 변이체가 생성되는 경향을 조사하기 위한 모델 단백질로서 리툭시맙을 사용한 사례 연구가 제시된다. 전형적인 생물생산 시나리오를 대표하는 초기 및 후기 세대 번호에서의 배양물로부터 샘플을 분석하였다.

초기 (16) 또는 후기 (86) 세대 번호에서의 8종의 클론 세포주로부터 ambr® 규모로 생산된 리툭시맙 모델 항체를 단백질 A 정제하였다. 후기 세대 배양물의 경우 이중 계통을 생성하였다. 각각의 샘플의 기술적 복제물을 구아니딘-HCl을 사용하여 변성시키고 TCEP로 환원시켰다. 샘플을 개별 반응에서 트립신, lysC 및 키모트립신으로 소화시키고, 각각의 샘플에 대한 소화물을 합하였다. 액퀴티(Acquity) UPLC 및 세보 G2 QTOF 질량 분광계 (워터스)를 사용하여 LC-MS 분석을 수행하였다. 프로게네시스 QI 소프트웨어를 사용한 MS 데이터의 비교 분석에 의해, 분석에 걸쳐 존재비 프로파일의 차이를 디스플레이하는 펩티드의 확인을 수행하였다. 추정 변이체 펩티드의 표적화된 MS/MS 서열분석을 오비트랩 퓨전을 사용하여 수행하고, 피크스 스튜디오 소프트웨어 내에서 스파이더(SPIDER) 알고리즘을 사용하여 확인하였다.

샘플 가공 및 평가는 도 12의 개요를 따랐다.

리툭시맙 모델 항체를 발현하는 임의의 초기-세대 연구 세포 은행에서 서열 변이체의 존재를 나타낼 존재비 프로파일의 변화는 검출되지 않았다 (도 13). 이러한 관찰은 GS CHO 발현 시스템™이 비교적 높은 발생률이 보고된 일부 대안적 발현 시스템보다 이들 변이체를 덜 생성하는 경향이 있다는 것을 시사한다. GS CHO 발현 시스템™에 기반한 생산 세포주는 전형적으로 낮은 카피수를 갖고 고 엄격도로 선택되어, 개방 염색질의 영역 내로의 유전자 삽입이 보다 개연성 있게 된다. 이들 인자는 세포주 구축 동안 DNA 돌연변이를 통한 아미노산 서열 변이체 혼입의 전체 위험을 감소시킬 수 있다.

단일 종이 단지 4B04 세포주의 두 후기-세대 계통에 존재하는 것으로 결정되었다 (p<0.01) (도 14). 비교 작업흐름을 사용하지 않으면, 이 종은 보다 풍부한 이온의 ¹³C 동위원소에 대한 공동-용리 및 동중원소 질량으로 인해 검출하고 확인하기가 극히 어려울 것이다. 이 종은 MS 데이터의 비교 평가를 포함하지 않은 대안적 DDA MS/MS-기반 서열 변이체 분석 접근법을 사용하는 MS/MS 분석을 위해 선택되지 않았고, 120,000 FWHM 분해능의 후속 분석에서 m/z 차원으로 분해되지 않았다. 표적화된 MS/MS 분석은 이들 측정 둘 다에 대해 ≤2%CV의 정확도로 각각의 후기-세대 배양물에 대해 1.0% 및 1.7% 존재비의 프롤린>트레오닌 치환 (P175T)을 확인시켜 주었다 (도 15 및 표 6).

표 6

아미노산 서열 변이체가 어떻게 일어날 수 있는지에 대해, 게놈 DNA 돌연변이, 특정 코돈에서의 오번역 및 영양소 고갈을 비롯한 여러 잠재적 메카니즘이 보고되었다. 초기 및 후기 세대 세포주의 핵산 분석에 의해 결과를 추가로 조사하였다. 일루미나(Illumina) MiSeq (2X300bp)를 사용하여 게놈 DNA 및 cDNA에 대해 분자 바코드를 사용한 앰플리콘 서열분석을 수행하였다. DNA 및 RNA로부터의 결과를 합하였으며, 추정 변이체는 두 하위세트로부터의 데이터가 고 신뢰도로서 등급화될 것을 요구하였다. 2개의 고 신뢰도 단일 점 돌연변이가 확인되었으며, 이들은 단지 클론 4B04 후기 세대 (두 계통)에서만 검출되었다. 한 돌연변이는 이전에 단백질 수준에서 검출된 HC P175T 변이체를 확인시켜 주었고, 다른 것은 R178에서의 침묵 돌연변이인 것으로 밝혀졌다. 돌연변이는 연관되고 동일한 돌연변이체 대립유전자로부터 유래된 것으로 밝혀졌다. 돌연변이체 대립유전자는 DNA 수준에서 4B04 계통 A에서 1.1% 및 계통 B에서 2.3%로 발생하였다. RNA에 대해서, 빈도는 각각 2.9% 및 5.6%였다. 이들 관찰은 아미노산 변이체 종이 세포주 안정성의 함수로서 생산 세포주에 축적될 수 있다는 것 및 이러한 축적이 생물공정 전에 발생한 클론에서 근본적인 유전적 불안정성을 반영할 수 있다는 것을 보여준다.

아미노산 서열 변이체가 초기 세대 번호에서는 검출가능하지 않은 채로 남아있으면서 후기 세대 배양물에서는 1.7%의 존재비로 발생할 수 있다는 관찰은 세포주 개발 프로그램에 대해 영향을 미친다. 세포주 안정성 연구에서의 이러한 분석 유형의 상용적 사용이 공정 개발에 있어서의 전체 프로젝트 위험을 최소화하기 위해 권장된다.

MS 데이터의 비교 분석은 특정 아미노산 변이체의 검출을 위한 중요한 단계인 것으로 밝혀졌으며, 이는 "블라인드 스폿"이 독점적으로 DDA MS/MS 방법에만 의존하는 작업흐름에 존재할 수 있다는 것을 보여준다. 세포주 개발을 지원하기 위해 개발된 분석 작업흐름은 낮은 수준의 변이체를 효과적으로 검출하고 확인할 수 있었으며, 이는 살아있는 세포주 구축 프로젝트에서 클론 선택 과정으로부터의 제거를 가능하게 한다.

실시예 7: 방법 성능

방법은 세포주 구축 시험 동안 <0.1%의 수준에서 변이체를 검출할 수 있었다.

방법 성능을 스파이크 회수 접근법을 사용하여 추가로 조사하였다. 일부 변이체가 <0.1%에서 보고되었지만, 이 방법 유형에 대한 검출 한계는 서열에 걸쳐 달라질 수 있다. 트라스투주맙 및 3종의 공지된 잔기 변화 (HC S160C, HC K217R 및 경쇄 (LC) T180C)를 갖는 변이체의 샘플을 병행하여 제조하였다 (도 22). 소화된 변이체를 1% 및 5%에서 트라스투주맙 내로 스파이킹하고, 스파이킹되지 않은 샘플과 함께 분석하였다. 스파이킹된 샘플의 분석은 모든 3종의 변이체에 대해, 1% 및 5% 수준 둘 다에서 MS1 데이터 비교 분석에서 검출을 나타냈다 (도 23).

MS2 분석은 5% 스파이킹에서 모든 검출된 변이체를 확인하였을 뿐만 아니라 1%에서 HC S160C 및 LC T180C를 확인하였다 (도 24). HC K217R 변이체는 비교적 낮은 수준의 중복 서열 커버리지로, 서열의 리신 풍부 영역 내에 위치하였다. 이론적 펩티드는 극히 소형 또는 대형이었으며, 이는 소형 펩티드가 칼럼 시스템 상에 유지되지 않았으므로 커버리지에 영향을 미쳤다. 이들 영역은 대안적 효소 또는 표적화된 MS2 방법과 같은 분석에 대한 적응을 요구할 수 있다.

GS-CHO 엑시드 발현 시스템™의 경우 >0.2%에서의 오혼입률은 6%로 결정되었다. 핵산 분석은 후기 세대에서 ≥1%의 변이체를 생성하는 게놈 돌연변이가 초기 세대에서는 검출가능하지 않을 수 있다는 것을 확인시켜 주었다. 이러한 분석에 대한 검출 한계는 서열에 걸쳐 균일하지 않다. 서열의 영역은 보다 높은 검출 한계를 나타낼 수 있다.

실시예 8: 트라스투주맙의 서열 변이체의 검출을 시험하는 사례 연구

엑시드 발현 시스템™ 내에서 의도되지 않은 아미노산 변이체 혼입의 전체 비율을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 오혼입 메카니즘 및 대규모 생물제조를 대표하는 세대 번호에서의 세포주 안정성과의 상관관계를 조사하였다. 마지막으로, 항체 생성물 내의 상이한 위치에서의 서열 변이체에 대한 검출 한계의 가변성을 조사하였다.

플랫폼 세포 배양 공정을 사용하는 AMBr 미니어처 생물반응기에서 엑시드 발현 시스템™을 사용하여 항체를 발현시켰다. 배양 상청액을 단백질 A 친화도에 의해 정제하였다. 샘플을 변성시키고, 환원시키고, 개별 소화물로 트립신 및 키모트립신을 사용하여 소화시켰다. 생성된 펩티드를 나노플로우 규모에서 역상 크로마토그래피에 의해 분리하고, 오비트랩 퓨전 Q-OT-LIT 질량 분광계 및 HCD 및 EThcD 단편화를 사용한 데이터-의존성 결정 트리 작업흐름을 사용하여 확인하였다. 프로테오믹스를 위한 프로게네시스 QI 및 피크스 스튜디오 7.0을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.

여러 실시간 개발 프로젝트로부터의 데이터를 평가하는 것에 추가로, 스파이크 회수 접근법을 사용하여 방법 성능을 결정하였다. 모델로서 트라스투주맙을 사용하여, 3종의 아미노산 변이체를 단일 균질 단백질 내에서 발현시키고, 이를 규정된 상대 농도에서 트라스투주맙 내로 스파이킹하였다. 각각의 이들 변이체를 검출하는 방법의 능력을 평가하였다. 개발 프로젝트로부터, 많은 변이체가 0.01% 미만의 수준에서 신뢰도 있게 검출될 수 있는 것으로 결정되었다. 스파이크 회수 접근법은 이 방법에 도전하는 아미노산 서열이 존재하는 가능한 "블라인드 스폿"에서 변이체를 확인하는 방법의 능력을 시험하였다. 이는 검출 한계를 1%로 실질적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이 관찰은 변이체에 대해 이들 영역을 평가할 때 추가의 주의를 기울이도록 하여, 전체 방법의 견고성을 증가시킨다.

세포주 안정성의 함수로서의 변이체 혼입을 초기 및 후기 세포주 세대를 사용하여 조사하였다. 초기 및 후기 세대에서 차등 발현된 다수의 세포주 구축에 걸쳐 3종의 변이체가 검출되었다. 이전에 보고된 변이체의 추가의 분석 동안, 이러한 불안정성은 게놈 DNA에서의 돌연변이에 기인한 것으로 결정되었으며, 이는 단지 후기 세대 배양물에서만 그 자체로 검출되었다.

4종의 상이한 생성물에 대한 5종의 세포주 구축을 시험하여 중간 변이체 비율을 결정하였다. 이는 6%의 오혼입률을 유발하였으며, 이는 엑시드 발현 시스템™의 경우 초기 또는 후기 세대에서 0.2% 초과로 변이체를 나타낸 세포주의 백분율을 나타낸다.

실시예 9: 오혼입률을 조사하는 사례 연구

방법

ambr® 규모에서의 5종의 세포주 구축 연구로부터의 세포 배양 상청액을 단백질 A 정제하였다. 연구는 전형적으로 초기 (~20) 및/또는 후기 (~90) 세대 번호에서의 8종의 클론 세포주로 이루어졌다 (도 20). 복제물을 구아니딘-HCl을 사용하여 변성시키고, TCEP로 환원시키고, 이어서 개별 반응에서 최소 2종의 소화 효소 (트립신, 키모트립신 또는 LysC)에 의해 소화시켰다.

LC-MS 분석을 수행하고, MS1 데이터를 사용하여 분석에 걸쳐 존재비 프로파일의 차이를 디스플레이하는 펩티드를 검출하였다. 이 비교 분석은 프로게네시스 QI 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 피크스 스튜디오에서 분석된 MS2 데이터를 사용하여 추정 서열 변이체를 확인하였다.

일루미나 MiSeq (2X300bp)를 사용하여 게놈 DNA 및 cDNA에 대해 핵산 서열분석을 수행하였다. DNA 및 RNA로부터의 결과를 합하였으며, 추정 변이체는 두 하위세트로부터의 데이터가 고 신뢰도로서 등급화될 것을 요구하였다.

결과

4종의 모노클로날 항체 생성물에 걸친 5종의 세포주 구축의 분석으로부터의 데이터를 사용하여 GS-CHO 엑시드 발현 시스템™에 대한 중간 변이체 비율을 결정하였다 (예를 들어, 도 21). 총 34종의 세포주를 시험하였으며, 2종의 상이한 변이체가 초기 또는 후기 세대에서 >0.2%의 수준으로 확인되었다. 이는 6%의 중간 변이체 비율을 나타냈다.

GS CHO 발현 시스템™은 일부 대안적 발현 시스템보다 이들 변이체에 덜 취약할 수 있다. 이 발현 시스템에 기반한 생산 세포주는 전형적으로 낮은 카피수를 갖고 고 엄격도로 선택되어, 개방 염색질의 영역 내로의 유전자 삽입이 보다 개연성 있게 된다. 이는 세포주 구축 동안 DNA 돌연변이를 통한 오혼입의 위험을 감소시킬 수 있다.

실시예 10: 세척 절차

샘플 구배를 동시에 실행하면서 주입 장치 및/또는 포획 칼럼을 세정하기 위한 LC 시스템 세척 절차를 실시하기 위한 실험을 수행하였다. 세정 절차는 샘플 구배에 영향을 미치지 않아야 하고, 다수의 펌프를 독립적으로 실행할 수 있는 LC 시스템을 요구한다. 이러한 세정 절차는 이전 실시예의 방법 및 본 발명에 의해 교시된 방법에서 실시하는데 유용하다.

본 실시예에서, 제공된 LC 시스템은 펌프 시스템, 유동 경로의 교차를 방지하는 구성으로, 펌프 시스템이 동시에 작동되도록 하는 스위칭 밸브, 및 개별 펌프의 독립적 프로그래밍/제어를 포함한다. 본 실시예는 개별 나노펌프 및 로딩 펌프가 구비된 얼티메이트(Ultimate) 3000 RSLC 나노 (디오넥스(Dionex))를 사용하지만 (도 16), 방법은 특정한 장비 셋업으로 제한되지 않는다.

세척 순서는 산성, 예를 들어 포름산 및 고 유기, 예를 들어 아세토니트릴의 교대 세척인 것으로 결정되었다 (도 17). 이들을 로딩 펌프의 라인 B 및 C로부터 이용하였다. 수행되는 분석 분리에 따라, 나노펌프의 라인 A 및 B에 대해 표준 용매를 사용하였다. 수행되는 분석 분리에 따라, 로딩 펌프의 라인 A에 대해 표준 샘플 로딩 완충제를 사용하였다.

나노펌프로부터의 라인 A 및 B를 사용하여 나노플로우를 사용하는 분석 분리를 수행하였다. 이어서, 표준 분석 방법을 수정하여, 로딩 펌프로부터의 라인 B 및 C를 사용하여 주입 장치 및 포획 칼럼의 병행 세정을 수행하였다.

샘플을 분석 칼럼 상에 로딩한 후 LC 방법에 밸브 스위치를 추가하여, 주입 밸브가 주입 위치에 있는 동안 포획 칼럼이 분석 칼럼이 존재하는 라인에서 제거되도록 하였다. 로딩 펌프를 사용하여, 로딩 펌프 라인 B 및 C로부터의 교대 세척액 (산성 및 고 유기 세척액)으로 주입 시스템 및 포획 칼럼을 세척하였다. 이들 세척액에 대해 유량을 12μl/분에서 20μl/분으로 증가시켰다. 밸브 위치가 포획 칼럼 후에 로딩 펌프를 폐기물로 전환시켰으므로, 세척은 개별 나노펌프를 사용하여 실행되는 분석 구배 동안 수행될 수 있었다. 따라서, 산성/고 유기 세척 단계를 그 후가 아니라, 주요 방법과 병행하여 실행하였으므로, 방법의 경과 시간을 추가시키지 않았다. 이 병행 세정 프로토콜은 경과 분석 방법 시간을 약 92분에서 약 50분으로, 약 46%의 감소로 감소시킨다. 세정에 소요된 추가의 시간 (즉, 추가의 세정 시간)은 약 84% 감소하였다.

이어서, 분석 칼럼에 대한 세척 단계를 분석 방법 (나노펌프 사용)의 말기에 추가하여, 모든 요구되는 성분이 세정되었다. 구배 정보에 대해서는 표 7 및 8을 참조한다.

표 7: 로딩 펌프 구배

표 8: 나노펌프 구배

SEQUENCE LISTING <110> LONZA LTD <120> METHODS OF ANALYZING PLURALITIES OF CELLS AND DETECTING PROTEIN SEQUENCE VARIANTS IN BIOLOGICAL PRODUCT MANUFACTURING <130> L2082-7020WO <140> <141> <150> 62/510,559 <151> 2017-05-24 <150> 62/464,775 <151> 2017-02-28 <150> 62/454,567 <151> 2017-02-03 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1 5 10 15 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 20 <210> 2 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 1 5 10 15 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 20 25 30 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 35 40 45 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 50 55 <210> 3 <211> 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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Cys Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 13 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 10 15 Asp Lys <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Cys Trp 1 5 10 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Ile Cys Asn Val 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Claims

a) 적어도 1개의 세포가 제1 아미노산 서열을 포함하는 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 있는 것인 복수의 세포를 배양하여, 생성물을 포함하는 조건화 배지를 제조하는 단계;
b) 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제1 폴리펩티드 샘플을 제1 서열-기반 반응에 적용하여 제1 반응 생성물을 제공하는 단계;
c) 제1 반응 생성물에 대한 값을 참조 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;
d) 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제2 폴리펩티드 샘플을 제2 서열-기반 반응에 적용하여 제2 반응 생성물을 제공하는 단계;
e) 제2 반응 생성물에 대한 값을 참조 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계;
f) 임의로, 생성물을 포함하는 조건화 배지로부터의 제3 폴리펩티드 샘플을 제3 서열-기반 반응에 적용하여 제3 반응 생성물을 제공하는 단계;
g) 임의로, 제3 반응 생성물에 대한 값을 참조 값과 비교하고, 비교에 대응하여, 추가의 분석을 위한 반응 생성물 성분을 선택하는 단계; 및
h) c) 및 임의로 e) 및 g)의 결과에 대응하여, 제1 아미노산 서열 이외의 서열이 복수의 세포에 존재하는지 여부를 결정하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 복수의 세포를 분석하는 것인,
복수의 세포를 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 복수의 세포를 배양하여 생성물을 포함하는 제2 조건화 배지를 제조하고; 제2 조건화 배지에 대해 단계 b-h를 수행하는 것을 추가로 포함하고;
임의로 복수의 세포를 배양하여 생성물을 포함하는 제3 조건화 배지를 제조하고; 제3 조건화 배지에 대해 단계 b-h를 수행하는 것을 추가로 포함하고;
임의로 복수의 세포를 배양하여 생성물을 포함하는 후속, 예를 들어 제N (여기서 N = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20) 조건화 배지를 제조하고; 후속, 예를 들어 제N 조건화 배지에 대해 단계 b-h를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플이 분취물인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 복수의 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 조건화 배양 배지가 생성물의 상이한 생산 스테이지에서 생산되거나; 또는
(ii) 복수의 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 조건화 배양 배지가 복수의 세포의 배양에서 상이한 시점에 생산되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
i) h)에서 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 조건화 배양 배지 중 하나에 대해 이루어진 결정을,
ii) h)에서 조건화 배양 배지인, 조건화 배양 배지 또는 제2, 제3 또는 후속 제N 조건화 배양 배지 중 또 다른 것에 대해 이루어진 결정과
비교하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 복수의 세포에 대해 단계 a-h를 수행하는 것을 포함하는, 제2 복수의 세포를 분석하는 것을 추가로 포함하고;
임의로 제3 복수의 세포에 대해 단계 a-h를 수행하는 것을 포함하는, 제3 복수의 세포를 분석하는 것을 추가로 포함하고;
임의로 후속, 예를 들어 제N (여기서 N = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20) 복수의 세포에 대해 단계 a-h를 수행하는 것을 포함하는, 후속, 예를 들어 제N 복수의 세포를 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서,
i) h)에서 복수의 세포인, 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 복수의 세포 중 하나에 대해 이루어진 결정을,
ii) h)에서 복수의 세포인, 제2, 제3 또는 후속, 예를 들어 제N 복수의 세포 중 또 다른 것에 대해 이루어진 결정과
비교하는 단계를 포함하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 각각의 복수의 세포가 동일한 유형의 세포를 포함하거나, 또는 복수의 세포 중 1개 이상, 예를 들어 각각이 상이한 유형의 세포를 포함하는 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 비교에 대응하여, 제1 아미노산 서열을 포함하는 생성물을 생산하기 위한 복수의 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 아미노산 서열이 표 1-4로부터 선택된 단백질 생성물에 상응하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, b), d) 및 임의로 f)가 폴리펩티드 샘플을 변성시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서,
(i) 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 구아니딘 히드로클로라이드 (GuHCl)의 존재 하에 및 산성 pH에서 인큐베이션하는 것을 포함하거나; 또는
(ii) 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 우레아 및 데옥시콜레이트의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하며, 임의로 여기서 데옥시콜레이트가 정제된 단백질 생성물의 소화 전에 용액으로부터 침전되고, 임의로 여기서 (1) 데옥시콜레이트가 b) 전에, d) 전에 및/또는 임의로 f) 전에 용액으로부터 침전되거나, 또는 (2) 데옥시콜레이트가 임의로 반응 생성물을 분리 단계에 적용하기 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 데옥시콜레이트가 산의 첨가에 의해 침전되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, b), d) 및/또는 임의로 f)가 정제된 단백질을 TCEP로 환원시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열-기반 반응이 단백질분해 효소에 의한 소화인 방법.
제15항에 있어서, 단백질분해 효소가 트립신, 키모트립신, LysC 및 AspN으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 단계가 고처리량 샘플 가공에 적합한 장치에서 수행되고; 임의로 여기서 1개 이상의 단계가 96-웰 플레이트에서 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, b), d) 및/또는 임의로 f)가 LC/MS를 사용하여 반응 생성물을 분석하는 것을 포함하는 분리 단계를 임의로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, c), e) 및/또는 임의로 g)가 비교에 의해 확인된 반응 생성물의 성분의 아미노산 서열을 확인하는 것을 포함하고; 임의로 여기서 아미노산 서열을 확인하는 것이 반응 생성물의 성분에 대해 MS/MS를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 자동화된 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 로봇 장비를 사용하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체 시스템을 사용하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, b), d) 및/또는 임의로 f) 전에 생성물을 함유하는 조건화 배지로부터 생성물을 정제하는 단계를 추가로 포함하고; 임의로 생성물을 정제하는 단계가 크로마토그래피를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 장비로부터의 캐리오버 오염을 제거하기 위한 세척 프로토콜을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 세척 프로토콜이 LC/MS를 사용하여 블랭크 샘플을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 세척 프로토콜이 산성 용액 및 고 유기 용액의 교대 세척을 포함하는 것인 방법.
제24항 또는 제26항에 있어서, 세척 프로토콜이 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법과 병행하여 실행될 수 있는 것인 방법.
제27항에 있어서,
(i) 세척 프로토콜이 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법의 경과 시간을 추가시키지 않거나;
(ii) 세척 프로토콜을 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 방법의 경과 시간을 적어도 약 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키거나; 또는
(iii) 세척 프로토콜을 복수의 세포, 복수의 세포의 사용 방법, 또는 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드를 분석하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 세척에 소요되는 추가의 시간을 적어도 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키는 것인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 파트 h)에서 검출된 제1 아미노산 서열 이외의 서열의 면역원성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 면역원성을 평가하는 단계가 파트 h)에서 검출된 제1 아미노산 서열 이외의 서열을 인 실리코 면역원성 도구를 사용하여 평가하는 것을 포함하는 것인 방법.
a) 단백질 생성물을 생산하는 세포의 집단, 예를 들어 복수의 세포를 포함하는 배양 배지로부터 정제된 단백질 생성물을 제공하는 단계;
b) 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의해 분석하는 단계;
여기서 a) - b)는 동일한 세포 집단 또는 상이한 세포 집단 내의 복수의 샘플에 대해 병행하여 또는 순차적으로 반복됨; 및
c) 복수의 샘플로부터의 질량 분광측정법 데이터와 질량 분광측정법 데이터의 데이터베이스를 비교함으로써 복수의 샘플 내에서 단백질 서열 변이체를 검출하는 단계
를 포함하며, 이에 의해 단백질 서열 변이체를 검출하는 것인,
단백질 서열 변이체를 검출하는 방법.
제31항에 있어서,
(i) 복수의 세포 집단이 생성물의 상이한 생산 스테이지에서 생산되거나;
(ii) 복수의 세포 집단이 복수의 세포의 배양에서 상이한 시점에 생산되거나;
(iii) 각각의 세포 집단이 동일한 유형의 세포를 포함하거나; 또는
(iv) 세포 집단 중 1개 이상, 예를 들어 각각이 상이한 유형의 세포를 포함하는 것인 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, c)에 대응하여, 생성물을 생산하기 위한 세포 집단을 선택하는 단계를 포함하는 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 생성물이 표 1-4로부터 선택된 재조합 또는 치료 단백질인 방법.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 준비하는 단계가 정제된 단백질을 변성시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 구아니딘 히드로클로라이드 (GuHCl)의 존재 하에 및 산성 pH에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 정제된 단백질을 변성시키는 것이 정제된 단백질을 우레아 및 데옥시콜레이트의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 데옥시콜레이트가 정제된 단백질 생성물의 소화 전에 용액으로부터 침전되거나; 또는 데옥시콜레이트가 b) 전에 용액으로부터 침전되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 데옥시콜레이트가 산의 첨가에 의해 침전되는 것인 방법.
제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 준비하는 단계가 정제된 단백질을 TCEP로 환원시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 준비하는 단계가 정제된 단백질을 트립신, 키모트립신, LysC 또는 AspN으로 소화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 준비하는 단계가 정제된 단백질의 복수의 분취물을 형성하고 분취물을 복수의 프로테아제로 소화시키는 것을 포함하며, 여기서 각각의 분취물은 상이한 프로테아제에 의해 소화되고, 여기서 프로테아제는 트립신, 키모트립신, LysC 또는 AspN으로부터 선택되고; 임의로 여기서 소화 후, 복수의 분취물이 함께 혼합되는 것인 방법.
제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 단백질 생성물을 질량 분광측정법에 의한 분석을 위해 준비하는 단계가 고처리량 샘플 가공에 적합한 장치에서 수행되고; 임의로 여기서 c)가 96-웰 플레이트에서 수행되는 것인 방법.
제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, b)가 준비된 정제된 단백질 생성물을 LC/MS를 사용하여 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, c)가 복수의 세포 집단의 데이터와 질량 분광측정법 데이터베이스의 비교 분석에 의해 존재비의 변화를 디스플레이하는 펩티드를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
제45항에 있어서, c)가 MS/MS에 의해 존재비의 변화를 디스플레이하는 펩티드를 분석하고, MS/MS 데이터를 MS/MS 데이터베이스와 비교함으로써 서열 변경을 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 자동화된 방법.
제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 로봇 장비를 사용하는 방법.
제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로유체 시스템을 사용하는 방법.
제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단으로부터 단백질 생성물을 정제하여 정제된 단백질 생성물을 생산하는 단계가 단백질 생성물을 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 것을 포함하는 것인 방법.
제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, b)가 캐리오버 오염을 제거하기 위한 세척 프로토콜을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 세척 프로토콜이 LC/MS를 사용하여 블랭크 샘플을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 세척 프로토콜이 산성 용액 및 고 유기 용액의 교대 세척을 포함하는 것인 방법.
제51항 또는 제53항에 있어서, 세척 프로토콜이 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법과 병행하여 실행될 수 있는 것인 방법.
제54항에 있어서,
(i) 세척 프로토콜이 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법의 경과 시간을 추가시키지 않거나;
(ii) 세척 프로토콜을 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 방법의 경과 시간을 적어도 약 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키거나; 또는
(iii) 세척 프로토콜을 단백질 서열 변이체를 검출하는 방법과 병행하여 실행하는 것이 세척에 소요되는 추가의 시간을 적어도 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 감소시키는 것인 방법.
제31항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 단백질 서열 변이체의 면역원성을 평가하는 단계를 추가로 포함하고; 임의로 여기서 검출된 단백질 서열 변이체의 면역원성을 평가하는 단계가 단백질 서열 변이체를 인 실리코 면역원성 도구를 사용하여 평가하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 제1, 제2 및/또는 제3 폴리펩티드 샘플을 추가의 분석에 적용하여 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성 중 1개 이상을 확인, 평가 또는 예측하는 단계를 추가로 포함하거나; 또는
(ii) 제1 아미노산 서열 이외의 서열이 복수의 세포에 존재하는 경우에, 제1 아미노산 서열 이외의 서열을 추가의 분석에 적용하여 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성 중 1개 이상을 확인, 평가 또는 예측하는 것인 방법.
제31항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
d) 검출된 단백질 서열 변이체(들)를 분석하여 면역원성; 단백질 응집; 탈아미드화; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화; C-말단 리신 프로세싱; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제; 유리 시스테인 티올 기; 등전점; 리신 당화; N- 및/또는 O-글리코실화; N-말단 고리화; 산화; 또는 피로글루타메이트 형성 중 1개 이상을 확인, 검출, 평가 또는 예측하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
면역원성을 평가하는 단계; 단백질 응집, 예를 들어 단백질 응집의 경향을 예측하는 단계; 탈아미드화를 평가하는 단계; 아스파르트산 이성질체화 및 단편화를 검출하는 단계; C-말단 리신 프로세싱을 검출하는 단계; Fc ADCC/CDC 반응, 반감기 및 단백질 A 정제를 예측/평가하는 단계; 유리 시스테인 티올 기를 검출하는 단계; 등전점을 검출하는 단계; 리신 당화를 검출하는 단계; N- 및/또는 O-글리코실화를 확인하는 단계; N-말단 고리화를 검출하는 단계; 산화를 검출하는 단계; 또는 피로글루타메이트 형성을 검출하는 단계 중 1개 이상을 추가로 포함하는, 제31항 내지 제56항 중 어느 한 항에서 검출된 바와 같은 단백질 서열 변이체를 분석하는 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 방법의 복수의 세포에 의해 제조된 폴리펩티드.