CN103717729A

CN103717729A - 细胞培养方法

Info

Publication number: CN103717729A
Application number: CN201280032554.9A
Authority: CN
Inventors: H·普仁泰斯
Original assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: WO2013009648A3; US9475858B2; US20210246477A1; US9914951B2; EP2729561A2; CN103717729B; EP2729561A4; US20160376624A1; US8852889B2; US20140142286A1; US20140120583A1; WO2013009648A2; US10584365B2; US20180187230A1

Abstract

提供了一种用于生产具有羧基端（C端）赖氨酸或精氨酸残基的目标水平的重组多肽的方法，包括抗体。该方法涉及在细胞培养基中培养表达所述多肽的细胞，该细胞培养基具有充足水平的改变细胞内pH的赖氨酸、精氨酸，和/或制剂。在此类条件下培养这些细胞并不影响细胞生长、细胞活力，或效价。

Description

细胞培养方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年7月8日提交的美国临时申请序列号61/505,681的权益，其全部内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明总体上涉及细胞培养方法。

发明背景

治疗性多肽是一种重要类别的治疗性生物技术产品，并且治疗性抗体（包括鼠类的、嵌合体的、人源化的和人类抗体以及其片段）占治疗性生物制剂产品的大部分。

概述

在一个方面中，本发明的特征是一种生产重组多肽群的方法，该方法包括：提供一种重组多肽的C端变体的目标值，提供包括编码该重组多肽的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在以下条件下培养：(i)其中该细胞表达该编码的重组多肽的C端变体群以及(ii)增加该细胞的细胞内pH，并且分离该群，其中该群包括该重组多肽的C端变体的提供的目标值。

在一些实施例中，增加该细胞的细胞内pH的条件包括在一种培养基中培养这些细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(a)大约1g/L至大约50g/L赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸；(b)大约0.1g/L葡萄糖至大约10g/L葡萄糖；(c)大约2mM至大约10mM NH₄Cl；(d)大约10μM至大约500μM氯喹；以及(e)大约10mM至大约30mM谷氨酰胺。

在一些实施例中，相对于对照培养条件，细胞内pH增加至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约100%，或者更多。在一些实施例中，相对于对照培养条件，细胞内pH值增加至少大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3，或更多。

在一些实施例中，该目标值是在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平。在一些实施例中，该目标值是相对于在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平和在羧基端不包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平的总和而言，在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平。在一些实施例中，相对于在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平与在羧基端不包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平的总和而言，在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的多肽的水平大约是0.1、大约是0.2、大约是0.3、大约是0.4、大约是0.5、大约是0.6、大约是0.7、大约是0.8、大约是0.9、或者大约是1。

在一些实施例中，该重组多肽是一种包含Fc的重组多肽（例如，抗体）。在一些实施例中，该目标值是在群中包括C端赖氨酸或精氨酸的重链的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中具有C端赖氨酸或精氨酸的重链的以下水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。在一些实施例中，该目标值是群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的以下的水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。

在一些实施例中，该方法进一步包括测量该群中一种或多种C端变体的水平。在一些实施例中，该群是含Fc多肽或抗体的群，并且该方法进一步包括测量该群中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该方法进一步包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产含Fc多肽的群的方法，该方法包括：提供一种含Fc多肽的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值，提供包括编码该含Fc多肽的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在以下条件下培养：(i)其中该细胞表达该编码的含Fc多肽的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的群以及(ii)增加该细胞的细胞内pH；并且分离该群，其中该群包括该含Fc多肽的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的提供的目标值。

在一些实施例中，增加该细胞的细胞内pH的条件包括在一种培养基中培养这些细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(a)大约2g/L至大约50g/L赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸；(b)大约0.1g/L葡萄糖至大约10g/L葡萄糖；(c)大约2mM至大约10mM NH₄Cl；(d)大约10μM至大约500μM氯喹；以及(e)大约10mM至大约30mM谷氨酰胺。

在一些实施例中，增加该细胞的细胞内pH的条件包括在一种培养基中培养这些细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(a)至少大约1g/L的赖氨酸、精氨酸或组氨酸；(b)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L的葡萄糖；(c)大约2mM至大约10mM的NH₄Cl；(d)大约10μM至大约500μM氯喹；以及(e)大约10mM至大约30mM谷氨酰胺。

在一些实施例中，该目标值是在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平。在一些实施例中，该目标值是相对于在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平和在羧基端不包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平的总和而言，在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平。在一些实施例中，相对于在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平与在羧基端不包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平的总和而言，在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的含Fc多肽的水平大约是0.1、大约是0.2、大约是0.3、大约是0.4、大约是0.5、大约是0.6、大约是0.7、大约是0.8、大约是0.9、或者大约是1。

在一些实施例中，该目标值是在群中包括C端赖氨酸或精氨酸的重链的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中具有C端赖氨酸或精氨酸的重链的以下水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。在一些实施例中，该目标值是群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的以下的水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。

在一些实施例中，该方法进一步包括测量该群中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该方法进一步包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产抗体群的方法，该方法包括：提供一种抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值；提供包括编码该抗体的核酸的一种宿主细胞；将该宿主细胞在以下条件下培养：(i)其中该细胞表达该编码的抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的群以及(ii)增加该细胞的细胞内pH；并且分离该群，其中该群包括该抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的提供的目标值。

在一些实施例中，该目标值是在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平。在一些实施例中，该目标值是相对于在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平和在羧基端不包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平的总和而言，在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平。在一些实施例中，相对于在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平与在羧基端不包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平的总和而言，在羧基端包括赖氨酸残基或精氨酸残基的抗体的水平大约是0.1、大约是0.2、大约是0.3、大约是0.4、大约是0.5、大约是0.6、大约是0.7、大约是0.8、大约是0.9、或者大约是1。

在一些实施例中，该目标值是在该群中包括C端赖氨酸或精氨酸的重链的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中具有C端赖氨酸或精氨酸的重链的以下水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。在一些实施例中，该目标值是在该群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的以下的水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：提供一种重组抗体的C端变体的目标值，提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在包括大约2g/L至大约50g/L赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体的群的条件下培养；并且分离该群，其中该群包括该重组抗体的C端变体的提供的目标值。

在一些实施例中，该培养基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸或赖氨酸、精氨酸、和/或组氨酸的组合，其浓度至少大约1.5g/L、至少大约2g/L、至少大约2.5g/L、至少大约3g/L、至少大约3.5g/L、至少大约4g/L、至少大约4.5g/L、至少大约5g/L、至少大约5.5g/L、至少大约6g/L、至少大约6.5g/L、至少大约7g/L、至少大约7.5g/L、至少大约8g/L、至少大约8.5g/L、至少大约9g/L、至少大约9.5g/L、至少大约10g/L、至少大约10.5g/L、至少大约11g/L、至少大约11.5g/L、至少大约12g/L、至少大约12.5g/L、至少大约13g/L、至少大约13.5g/L、至少大约14g/L、至少大约14.5g/L、至少大约15g/L、至少大约15.5g/L、至少大约16g/L、至少大约16.5g/L、至少大约17g/L、至少大约17.5g/L、至少大约18g/L、至少大约18.5g/L、至少大约19g/L、至少大约19.5g/L、至少大约20g/L、至少大约25g/L、至少大约30g/L、至少大约35g/L、至少大约40g/L、至少大约45g/L、至少大约50g/L，或更多。

特征在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：提供一种重组抗体的C端变体的目标值，提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在包括大约0.1g/L葡萄糖至大约10g/L葡萄糖的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体的群的条件下培养；并且分离该群，其中该群包括该重组抗体的C端变体的提供的目标值。

在一些实施例中，该培养基包括浓度在大约0.5g/L至大约2g/L的葡萄糖。在一些实施例中，该培养基包括浓度大约在0.1g/L至大约10g/L的葡萄糖，例如，大约0.2g/L、大约0.3g/L、大约0.4g/L、大约0.5g/L、大约0.6g/L、大约0.7g/L、大约0.8g/L、大约0.9g/L、大约1g/L、大约1.1g/L、大约1.2g/L、大约1.3g/L、大约1.4g/L、大约1.5g/L、大约1.6g/L、大约1.7g/L、大约1.8g/L、大约1.9g/L、大约2g/L、大约2.1g/L、大约2.2.g/L、大约2.3g/L、大约2.4g/L、大约2.5g/L、大约2.6g/L、大约2.7g/L、大约2.8g/L、大约2.9g/L、大约3g/L、大约3.5g/L、大约4g/L、大约4.5g/L、大约5g/L、大约5.5g/L、大约6g/L、大约6.5g/L、大约7g/L、大约7.5g/L、大约8g/L、大约8.5g/L、大约9g/L、大约9.5g/L、大约10g/L、或更多。在一些实施例中，该葡萄糖浓度是一种受控的葡萄糖浓度。

特征在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：提供一种重组抗体的C端变体的目标值，提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在包括大约1mM至大约50mMNH₄Cl的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体的群的条件下培养；并且分离该群，其中该群包括该重组抗体的C端变体的提供的目标值。

在一些实施例中，该培养基包括NH₄Cl的浓度大约1mM至大约30mM，例如，大约1mM、大约2mM、大约3mM、大约4mM、大约5mM、大约6mM、大约7mM、大约8mM、大约9mM、大约10mM、大约11mM、大约12mM、大约13mM、大约14mM、大约15mM、大约16mM、大约17mM、大约18mM、大约19mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约40mM、大约50mM、或更多。

特征在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：提供一种重组抗体的C端变体的目标值，提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在包括大约10μm至大约500μm氯喹的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体的群的条件下培养；并且分离该群，其中该群包括该重组抗体的C端变体的提供的目标值。

在一些实施例中，该培养基包括以下浓度的氯喹：大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约110μM、大约120μM、大约130μM、大约140μM、大约150μM、大约160μM、大约170μM、大约180μM、大约190μM、大约200μM、大约210μM、大约220μM、大约230μM、大约250μM、大约250μM、大约260μM、大约270μM、大约280μM、大约290μM、大约300μM、大约310μM、大约320μM、大约330μM、大约340μM、大约350μM、大约360μM、大约370μM、大约380μM、大约390μM、大约400μM、大约410μM、大约420μM、大约430μM、大约440μM、大约450μM、大约460μM、大约470μM、大约480μM?大约490μM、大约500μM、或更多。

特征在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：提供一种重组抗体的C端变体的目标值，提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，将该宿主细胞在包括大约5mM至大约80mM谷氨酰胺的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体的群的条件下培养；并且分离该群，其中该群包括该重组抗体的C端变体的提供的目标值。

在一些实施例中，该培养基包括谷氨酰胺的浓度大约在10mM至大约30mM。在其他实施例中，该培养基包括以下浓度的谷氨酰胺：大约5mM、大约10mM、大约15mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约35mM、大约40mM、大约45mM、大约50mM、大约55mM、大约60mM、大约65mM、大约70mM、大约75mM、大约80mM、或更多。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组的含Fc多肽的方法，该方法包括：在包括大约1g/L至大约50g/L组氨酸的培养基中，在其中一种细胞表达该重组抗体的群的条件下培养该细胞；分离该群；并且测量该群的K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该含Fc多肽是一种抗体。

在一些实施例中，该培养基包括以下浓度的组氨酸：至少大约1.5g/L、至少大约2g/L、至少大约2.5g/L、至少大约3g/L、至少大约3.5g/L、至少大约4g/L、至少大约4.5g/L、至少大约5g/L、至少大约5.5g/L、至少大约6g/L、至少大约6.5g/L、至少大约7g/L、至少大约7.5g/L、至少大约8g/L、至少大约8.5g/L、至少大约9g/L、至少大约9.5g/L、至少大约10g/L、至少大约10.5g/L、至少大约11g/L、至少大约11.5g/L、至少大约12g/L、至少大约12.5g/L、至少大约13g/L、至少大约13.5g/L、至少大约14g/L、至少大约14.5g/L、至少大约15g/L、至少大约15.5g/L、至少大约16g/L、至少大约16.5g/L、至少大约17g/L、至少大约17.5g/L、至少大约18g/L、至少大约18.5g/L、至少大约19g/L、至少大约19.5g/L、至少大约20g/L、至少大约25g/L、至少大约30g/L、至少大约35g/L、至少大约40g/L、至少大约45g/L、至少大约50g/L，或更多。

在一些实施例中，该群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体是以下的水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。

在一些实施例中，该方法进一步包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录K0、K1、和/或K2赖氨酸变体水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组的含Fc多肽的方法，该方法包括：特征在包括大约0.1g/L至大约10g/L葡萄糖的培养基中，在其中一种细胞表达该重组抗体的群的条件下培养该细胞；分离该群；并且测量该群的K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该含Fc多肽是一种抗体。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组的含Fc多肽的方法，该方法包括：特征在包括大约1mM NH₄Cl至大约50mM NH₄Cl的培养基中，在其中一种细胞表达该重组抗体的群的条件下培养该细胞；分离该群；并且测量该群的K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该含Fc多肽是一种抗体。

在一些实施例中，在该群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体是以下的水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组的含Fc多肽的方法，该方法包括：特征在包括大约5mM至大约80mM谷氨酰胺的培养基中，在其中一种细胞表达该重组抗体的群的条件下培养该细胞；分离该群；并且测量该群的K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该含Fc多肽是一种抗体。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组的含Fc多肽的方法，该方法包括：特征在包括大约10μM至大约500μM氯喹的培养基中，在其中一种细胞表达该重组抗体的群的条件下培养该细胞；分离该群；并且测量该群的K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该含Fc多肽是一种抗体。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组的含Fc多肽的制品的方法，该方法包括：在一种培养基中培养细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(i)大约2g/L至大约50g/L组氨酸；(ii)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖；(iii)大约2mM至大约10mM NH₄Cl；(iv)大约5mM至大约80mM谷氨酰胺；以及(v)大约10μM至大约500μM氯喹；在其中这些细胞表达重组抗体的条件下；并且从这些细胞或该培养基中分离这些重组抗体以生产一种制品，该制品包括这些重组的含Fc多肽的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值。在一些实施例中，该含Fc多肽是抗体。

在一些实施例中，该目标值是在该群中包括C端赖氨酸或精氨酸的重链的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中具有C端赖氨酸或精氨酸的重链的以下水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。在一些实施例中，该目标值是该群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，该目标值是在群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的以下的水平：至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多。

在一个方面中，本发明的特征是一种生产重组多肽的方法，该方法包括：在包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或至少大约1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组多肽的条件下培养该细胞。

在一些实施例中，该方法进一步包括分离该重组多肽。在一些实施例中，该方法进一步包括测量该分离的重组多肽的C末端的赖氨酸和/或精氨酸残基的水平。在一些实施例中，该方法进一步包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录赖氨酸和/或精氨酸残基的水平。

在一些实施例中，该重组多肽是一种重组抗体或一种重组Fc融合蛋白。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体或重组Fc融合蛋白的方法，该方法包括：在包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或至少大约1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组抗体或一种重组Fc融合蛋白的条件下培养该细胞。

在一些实施例中，该方法进一步包括分离该重组抗体或该重组Fc融合蛋白。在一些实施例中，该方法进一步包括测量该分离的重组抗体或该重组融合蛋白的制品中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该方法进一步包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录K0、K1、或K2赖氨酸残基中的一种或多种的水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：在包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或者至少1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基中，在其中细胞表达重组抗体的条件下培养这些细胞；并且从这些细胞或该培养基中分离这些重组抗体以生产一种包括K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值的制品。

在一些实施例中，该方法进一步包括测量该制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，该方法进一步包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录K0、K1、和/或K2赖氨酸变体水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：特征在包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或者至少1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基中，在其中细胞表达重组抗体的条件下培养这些细胞；并且从这些细胞或该培养基中分离这些重组抗体以生产一种包括至少大约1%的K1和/或K2赖氨酸变体的制品。

在一些实施例中，该方法进一步包括测量K0、K1和/或K2赖氨酸变体的水平以及将它们与参考标准比较（例如，以FDA标签上的产品说明书、医嘱（Physician’s Insert）、USP专论，或者EP专论）。在一些实施例中，该方法进包括以印刷体或电脑可读介质（例如，以测试报告、物质安全数据表（MSDS）或检测证书或分析证书（CofA））记录K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

在一些实施例中，该方法进一步包括确定该制品中K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，该制品包括至少大约1%、至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%、至少大约5%、至少大约6%、至少大约7%、至少大约8%、至少大约9%、至少大约10%、至少大约11%、至少大约12%、至少大约13%、至少大约14%、至少大约15%、至少大约16%、至少大约17%、至少大约18%、至少大约19%、至少大约20%、至少大约25%、至少大约30%、至少大约35%、至少大约40%、至少大约45%、至少大约50%、或更多的K1和/或K2赖氨酸变体。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产具有K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的目标值的重组抗体的制品的方法，该方法包括：在包括赖氨酸和/或精氨酸的培养基中，在其中细胞表达重组抗体的条件下培养这些细胞；测量培养中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平；并且当该培养中的K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平是一个目标值时，从这些细胞或该培养基中分离这些重组抗体以生产这些重组抗体的一种制品。

在另一个方面中，本发明的特征是一种在重组抗体的制品中减小K0赖氨酸变体的水平和/或增加K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平的方法，该方法包括：在包括一个量的赖氨酸、精氨酸，和/或赖氨酸和精氨酸的组合（多于在标准培养基中赖氨酸、精氨酸，和/或赖氨酸和精氨酸的组合的量）的培养基中培养细胞，其中这些细胞在其中这些细胞表达重组抗体的条件下培养；并且分离这些重组抗体，由此相对于从在标准培养基中培养的细胞生产的重组抗体的制品而言，减少该制品中K0赖氨酸变体的水平和/或增加K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种在重组抗体的制品中减小K0赖氨酸变体的水平和/或增加K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平的方法，该方法包括：在包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或至少1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基中，在其中细胞表达重组抗体的条件下培养这些细胞；并且分离这些重组抗体，由此相对于不使用包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或者至少1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基生产的重组抗体制品，在该制品中减小K0赖氨酸变体水平和/或增加K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种培养生产重组抗体的细胞的方法，该方法包括：在包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或至少大约1g/L赖氨酸和精氨酸的组合的培养基中，在其中细胞表达一种重组抗体的条件下培养这些细胞。

在一些实施例中，该方法进一步包括监测该培养中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。在一些实施例中，该方法进一步包括当K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平达到目标值时，将这些细胞从该培养中去除。

在另一个方面中，本发明的特征是由在此描述的方法生产的一种重组多肽，例如一种重组抗体。

在另一个方面中，本发明的特征是包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或者至少1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的细胞培养基。

在另一个方面中，本发明的特征是一种细胞培养，包括：表达重组抗体的细胞；以及包括至少大约1g/L赖氨酸，至少大约1g/L精氨酸，或至少1g/L的赖氨酸和精氨酸的组合的培养基。

在一些实施例中，该培养包括K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的目标值。

在一些实施例中，该培养是一种分批培养，连续培养或流加培养。

在另一个方面中，本发明的特征是包括在此描述的细胞培养的生物反应器。

在此描述的一些方面中，该培养基包括以下量的赖氨酸（例如，L-赖氨酸），精氨酸（例如，L-精氨酸），或者赖氨酸（例如，L-赖氨酸）和精氨酸（例如，L-精氨酸）组合：至少大约1.5g/L、至少大约2g/L、至少大约2.5g/L、至少大约3g/L、至少大约3.5g/L、至少大约4g/L、至少大约4.5g/L、至少大约5g/L、至少大约5.5g/L、至少大约6g/L、至少大约6.5g/L、至少大约7g/L、至少大约7.5g/L、至少大约8g/L、至少大约8.5g/L、至少大约9g/L、至少大约9.5g/L、至少大约10g/L、至少大约10.5g/L、至少大约11g/L、至少大约11.5g/L、至少大约12g/L、至少大约12.5g/L、至少大约13g/L、至少大约13.5g/L、至少大约14g/L、至少大约14.5g/L、至少大约15g/L、至少大约15.5g/L、至少大约16g/L、至少大约16.5g/L、至少大约17g/L、至少大约17.5g/L、至少大约18g/L、至少大约18.5g/L、至少大约19g/L、至少大约19.5g/L、至少大约20g/L、至少大约25g/L、至少大约30g/L、至少大约35g/L、至少大约40g/L、至少大约45g/L、至少大约50g/L，或更多。

在其他方面中，该培养基包括以下量的赖氨酸（例如，L-赖氨酸），精氨酸（例如，L-精氨酸），或者赖氨酸（例如，L-赖氨酸）和精氨酸（例如，L-精氨酸）组合：至少大约1mM、大约2mM、大约3mM、大约4mM、大约5mM、大约6mM、大约7mM、大约8mM、大约9mM、大约10mM、大约11mM、大约12mM、大约13mM、大约14mM、大约15mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约35mM、大约40mM、大约45mM、大约50mM、大约55mM、大约60mM、大约65mM、大约70mM、大约75mM、大约80mM、大约85mM、大约90mM、大约95mM、大约100mM、大约125mM、大约150mM、大约200mM、大约250mM、大约300mM、大约350mM、大约400mM、大约450mM、大约500mM、或更多。

在另一个方面中，本发明的特征是一种在重组抗体的制品中增加K0赖氨酸变体的水平和/或减小K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平的方法，该方法包括：在包括一个量的赖氨酸、精氨酸，和/或赖氨酸和精氨酸的组合（少于在标准培养基中赖氨酸、精氨酸，和/或赖氨酸和精氨酸的组合的量）的培养基中培养细胞，其中这些细胞在其中这些细胞表达重组抗体的条件下培养；并且分离这些重组抗体，由此相对于从在标准培养基中培养的细胞生产的重组抗体的制品而言，增加该制品中K0赖氨酸变体的水平和/或减小K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

在此描述的一些方面中，该方法进一步包括在培养步骤期间，例如在培养步骤期间至少一次，两次，三次或多次监测培养基中的赖氨酸、精氨酸、组氨酸、葡萄糖、NH₄Cl、氯喹，和/或谷氨酰胺。

在此描述的一些方面中，该目标值是在参考标准中列举出的水平，例如用于包含该重组抗体制品的药物制品的产品说明书或质量标准。例如，该产品说明书是一种在FDA标签、医嘱、USP专论，或EP专论中的产品说明。

在具体的实施例中，该目标值是在相应的重组抗体制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

在另一个方面中，本发明的特征是一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：特征在一种培养基中培养细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(i)大约2g/L至大约50g/L组氨酸；(ii)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖；(iii)大约2mM至大约10mM NH₄Cl；(iv)大约5mM至大约80mM谷氨酰胺；以及(v)大约10μM至大约500μM氯喹；在其中这些细胞表达重组抗体的条件下；从这些细胞或该培养基中分离这些重组抗体；测量该制品中这些重组抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平；并且如果K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平是目标值，那么将该制品配制进入一种药物产品。

在另一个方面中，本发明的特征是一种制造药物抗体制品的方法，该方法包括：为一种治疗性重组抗体提供C端赖氨酸变体的目标值，提供包括编码一种重组抗体的轻链和重链的核酸的一种宿主细胞，在以下条件下培养该宿主细胞：(i)其中该细胞表达该编码的轻链和重链以形成该重组抗体以及(ii)增加该细胞的细胞内pH，从该细胞或细胞培养中分离该治疗性重组抗体的群，并且如果该群包括C端赖氨酸变体的提供的目标值则将该分离的群配制进入药物产品中，由此制造一种药物抗体制品。

在一些实施例中，相对于该群中的总重链，C端赖氨酸变体的目标值是C端包含赖氨酸的重链的预选择水平。在一些实施例中，C端赖氨酸变体的目标值是在该群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的预选择水平。

在此描述的一些方面中，其中细胞（例如，哺乳动物细胞）表达重组多肽或重组抗体的条件包括(i)具有以下pH的培养基：大约6、大约6.5、大约6.6、大约6.7、大约6.8、大约6.9、大约7、大约7.1、大约7.2、大约7.3、大约7.4、大约7.5、或大约8；(ii)以下温度：25℃、大约26℃、大约27℃、大约28℃、大约29℃、大约30℃、大约31℃、大约32℃、大约33℃、大约34℃、大约35℃、大约36℃、大约37℃、大约38℃、大约39℃、或大约40℃；和/或(iii)以下的培养体积：大约100mL、大约200mL、大约300mL、大约400mL、大约500mL、大约600mL、大约700mL、大约800mL、大约900mL、大约1L、大约2L、大约3L、大约5L、大约10L、大约20L、大约30L、大约40L、大约50L、大约100L、大约200L、大约300L、大约400L、大约500L、大约600L、大约700L、大约800L、大约900L、大约1000L、或更多。

在此描述的一些方面中，这些细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，这些哺乳动物细胞是CHO、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、或HEK-293细胞。

在此描述的一些方面中，该重组抗体是阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、塞妥珠单抗、达利珠单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗、英利昔单抗、莫罗莫那、那他珠单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、或曲妥单抗。

在此描述的一些方面中，该多肽是一种融合蛋白。在某些实施例中，该融合蛋白是阿发赛特、阿巴西普、依那西普，或地尼白介素。

附图简要说明

当与伴随的附图一起阅读时，在此描述的传授内容将从以下不同说明性实施例的描述中更完整地理解。应当理解的是以下描述的附图仅仅是为了说明目的并且并不是旨在以任何形式限制本传授内容的范围。

图1是来自细胞的模型抗体制品中K1和K2赖氨酸残基的水平的图示，这些细胞生长在对照方法、补充有10g/L赖氨酸的方法、补充有10g/L精氨酸的方法中，与阿达木单抗

制品中的K1和K2赖氨酸残基的水平相比较。

详细说明

发明人已经发现具有羧基端（C端）赖氨酸或精氨酸残基的目标水平的多肽（例如，抗体）可以从在具有充分水平的赖氨酸、精氨酸，和/或改变细胞内pH的制剂的培养基中培养的细胞生产。出人意料的是，在此类条件下培养细胞并不影响细胞生长、细胞活力或效价。本披露包含具有C端赖氨酸和/或精氨酸残基的目标水平的多肽（例如，抗体），生产此类多肽（例如，抗体）的方法，以及使用此类多肽（例如，抗体）的方法。

定义

如在此使用的，“纯化的”（或“分离的”）是指一种核酸序列（例如，多核苷酸）或一种基本上不含其他组分的氨基酸序列（例如，多肽）。在一些实施例中，将一种纯化的多核苷酸或纯化的多肽从存在于其天然环境中的其他组分移除或者分离。例如，一种分离的多肽是从生产它的细胞的其他组分分离的一种（例如，内质网或细胞质蛋白和RNA）。一种分离的多核苷酸是从其他细胞核组分（例如，组蛋白）和/或从上游或下游核酸序列中分离的一种。一种分离的核酸序列或氨基酸序列可以是至少60%、或至少75%、或至少90%，或至少95%无存在于指示核酸序列或氨基酸序列天然环境中的其他组分。

如在此使用的，“多核苷酸”（或“核苷酸序列”或“核酸分子”）是指一种寡核苷酸、核苷酸，或多核苷酸，和其片段或部分，并且是指可以是单链或双链以及代表正义或反义链的基因组来源或合成来源的DNA和RNA。

如在此使用的，“多肽”（或“氨基酸序列”或“蛋白质”）是指一种寡肽、肽、多肽，或蛋白质序列，和其片段或部分，并且是指天然发生的或合成分子。“氨基酸序列”以及类似术语，例如“多肽”或“蛋白质”，并不旨在将指示的氨基酸序列限制在与该引用的蛋白质分子相关的完全的、天然氨基酸序列。

在此使用的冠词“一种（a）”和“一种（an）”是指一个或多于一个的（例如，至少一个）冠词的语法对象。通过举例，“一种元素”是指一个元素或多于一个元素。

术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指在治疗具有在此描述的紊乱或病症的病人的有效量（例如，剂量）。在此还应理解的是“药学有效量”可以解释为给予所希望的治疗效果的量，以一个剂量或以任何剂量或途径摄取，单独或与其他治疗制剂组合摄取。

如在此使用的术语“治疗（treatment）”或“治疗（treating）”是指以一种有效改进与紊乱或病症相关的病症、症状或参数或者预防或减少紊乱或病症的进程到本领域普通技术人员可检测的程度的量、方式，和/或模式给予治疗。一种有效量、方式或模式可以根据该受试者而改变并且可以调适于该受试者。

如在此所使用的，术语“受试者”意为对于其希望进行诊断、预测或治疗的任何受试者。例如，一个受试者可以是哺乳动物，例如，人类或非人类灵长类动物（例如猿、猴子、猩猩，或黑猩猩），狗，猫，几内亚猪、兔、大鼠、小鼠、马、牛或母牛。

如在此使用的，术语“抗体”是指包括至少一个免疫球蛋白可变区的多肽，例如一种提供免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的氨基酸序列。例如，抗体可以包括重（H）链可变区（在此缩写为VH），以及轻链（L）可变区（在此缩写为VL）。在另一个实例中，抗体包括两个重（H）链可变区以及两个轻（L）链可变区。术语“抗体”包含抗体的抗原结合片段（例如，单链抗体、Fab、F(ab')₂、Fd、Fv、和dAb片段）连同完全抗体，例如类型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM的完整免疫球蛋白（连同其亚型）。免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。在一些实施例中，抗体包括Fc区。在一些实施方案中，抗体是一种治疗性抗体。

如在此使用的，术语“恒定区”是指对应于或衍生自抗体的一个或多个恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。恒定区可以包括任何或所有以下免疫球蛋白结构域：CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域（衍生自IgA、IgD、IgG、IgE、或IgM），以及CH4结构域（衍生自IgE或IgM）。

如在此使用的，术语“Fc区”是指包括排除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。“Fc区”是指IgA、IgD，和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且可以包括这些结构域的N端的部分或所有的柔性铰链区。对于IgG，“Fc区”包括免疫球蛋白结构域C伽马2（Cγ2）和C伽马3（Cγ3）以及C伽马1（Cγ1）和C伽马2之间铰链区较低的部分。尽管Fc区的边界可以改变，人类IgG重链Fc区通常定义为包括在T223或C226或P230起始至它的羧基端的残基，其中编号是根据欧洲索引，如在Kabat et al（卡巴特等人）（1991,NIH Publication（国家卫生研究所出版）91-3242,NationalTechnical Information Services（《国家科技信息服务》），斯普林菲尔德，弗吉尼亚州）。对于IgA，该Fc区包括免疫球蛋白结构域C阿尔法2（Cα2）和C阿尔法3（Cα3）以及C阿尔法1（Cα1）和C阿尔法2之间铰链区的较低部分。

如在此使用的，术语“含Fc多肽”是指包括两个包含Fc区多肽的二聚体的多肽，例如一种完整抗体或Fc-受体融合蛋白。

如在此使用的，术语“Fc区突变”是指具有一个或多个在此描述的Fc介导的活性的Fc区的类似物。这个术语包括以下这样的Fc区：这些区包括相对于一种野生型或天然存在的Fc区而言的一个或多个氨基酸修饰。例如，变体Fc区与天然存在的Fc区可以具有至少大约50%同源性、至少大约75%同源性、至少大约80%同源性、至少大约85%同源性、至少大约90%同源性、至少大约95%同源性、或更多。Fc区变体还包括以下这样的Fc区：这些区包括将一个或多个氨基酸残基添加至野生型Fc区N末端或C末端或者从野生型Fc区N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸残基。

如在此使用的，术语“偶联的”，“连接的”、“结合的”、“融合的”和“融合”可以互换使用。这些术语是指将两个以上的元素或组分通过任何方式，包括化学连接或重组方式结合在一起。

术语“过表达”“过量表达”或“过表达的”可互换地是指与对照细胞中的水平相比，转录的和翻译的蛋白质或者转录的核酸处于一种可检测地更高的水平。该术语包括与对照细胞相比，由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位（例如，细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面），以及RNA和蛋白质稳定性的表达。过量表达可以使用传统技术进行检测，例如，用于检测mRNA（例如，RT-PCR、PCR、杂交）或蛋白质（例如，ELISA、免疫组织化学技术）。过量表达可以是与在对照细胞中的表达相比，以高于大约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的量的表达。在某些实例中，与对照细胞中的表达相比，过量表达是1倍、2倍、3倍、4倍或更高水平的转录或翻译。

如在此使用的，一种多肽的“C端变体”（例如，一种抗体或含Fc多肽）是此种多肽（例如，抗体或含Fc多肽）的版本，仅仅由于在它们的羧基末端存在或缺失一个具体的氨基酸残基而在氨基酸序列方面不同。在一些实施例中，多肽的“C端变体”仅仅是由于在它们的C末端存在或缺失赖氨酸或精氨酸残基而不同。在一些实施例中，抗体或含Fc多肽的“C端变体”是K0赖氨酸变体、K1赖氨酸变体、K2赖氨酸变体、R0精氨酸变体、R1精氨酸变体，和/或R2精氨酸变体。

如在此使用的，抗体或含Fc多肽的“K0赖氨酸变体”“K1赖氨酸变体”，和“K2赖氨酸变体”是此类抗体或含Fc多肽（例如，包括Fc二聚体的多肽，例如，一种完整抗体）的版本，仅仅由于在它们的重链羧基末端存在或缺失赖氨酸残基而在氨基酸序列方面不同。“K0赖氨酸变体”在任一重链C端不具有赖氨酸残基。“K1赖氨酸变体”在一个重链C端具有赖氨酸残基。“K2赖氨酸变体”在每个重链C端具有赖氨酸残基。

如在此使用的，抗体或含Fc多肽的“R0精氨酸变体”“R1精氨酸变体”，和“R2精氨酸变体”是此类抗体或含Fc多肽（例如，包括Fc二聚体的多肽，例如，一种完整抗体）的版本，仅仅由于在它们的重链羧基末端存在或缺失精氨酸残基而在氨基酸序列方面不同。“R0精氨酸变体”在任一重链C端都不具有精氨酸残基。“R1精氨酸变体”在一个重链C端具有精氨酸残基。“R2精氨酸变体”在每个重链C端具有精氨酸残基。

如在此使用的，在多肽、融合蛋白、抗体、或含Fc多肽的背景中的“制品”分别是指一组的单独多肽、融合蛋白、抗体、或含Fc多肽，各自包括一种具体的氨基酸序列。在一些实施例中，一种制品包括此类多肽、融合蛋白、抗体、或含Fc多肽的C端变体。在一些实施例中，制品中的单独多肽、融合蛋白、抗体或含Fc多肽具有相同的氨基酸序列但是不同在于在羧基端存在或缺失一种具体的氨基酸残基（例如，一种赖氨酸残基或一种精氨酸残基）。例如，一种“抗体的制品”是指包括一种或多种C端变体的一组抗体。在一些实施例中，“抗体的制品”包括K0赖氨酸变体、K1赖氨酸变体、K2赖氨酸变体、R0精氨酸变体、R1精氨酸变体、以及R2精氨酸变体中的一种或多种。

如在此使用的，“目标值”是一种或多种C端变体的预确定水平，例如K0赖氨酸变体、K1赖氨酸变体、K2赖氨酸变体、R0精氨酸变体、R1精氨酸变体、和/或R2精氨酸变体。在一些实施例中，目标值是一种绝对值。在一些实施例中，目标值是一种相对值。在一些实施例中，目标值是相对于包含C端赖氨酸的多肽和无C端赖氨酸的多肽的水平的总和而言，包含C端赖氨酸的多肽的水平，例如，在此类多肽的群中检测到的。

在一些实施例中，“目标值”是含Fc多肽（包括C端赖氨酸或精氨酸）（例如，抗体）的制品中的重链的水平。在一些实施例中，目标值是具有C端赖氨酸或精氨酸的重链在此类制品中的以下的水平：高于大约5%、高于大约10%、高于大约15%，或高于大约20%，或更多的。

在一些实施例中，“目标值”是在分离的重组的含Fc多肽的制品中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的水平。在一些实施例中，目标值是在此类制品中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的以下的水平：高于大约5%、高于大约10%、高于大约15%，或高于大约20%，或更多。

如在此使用的，一种“相应重组抗体”意为与具体抗体相同的重组抗体，但是由不同的重组方法产生。例如，相应重组抗体可以是生物等价的或生物相似的抗体。

羧肽酶

C端赖氨酸或精氨酸残基通常在分离自哺乳动物细胞培养物的蛋白质中缺失，尽管可以在基因序列的基础上期待它们的存在。这种差异通常来源于一种或多种羧肽酶的活性。外肽酶的羧肽酶家族组成了在多肽中水解羧基端酰胺键的酶的不同组。羧肽酶B是一种催化C端碱性氨基酸残基的精氨酸和赖氨酸从肽和蛋白质的的水解释放的包含锌的外肽酶。除了羧肽酶B的特异地移除末端碱性氨基酸的其他哺乳动物羧肽酶包括羧肽酶H（也称为脑啡肽转化酶或羧肽酶E（Frickler et al.（弗里克勒等人），J.Mol.Endocrinol. （《内分泌分子杂志》），3:666-673(1989)；Manser et al.（曼瑟等人），Biochem.J.（《生物化学杂志》），267:517-525(1990)），羧肽酶M（EC3.4.17.12）（Tan et al.（坦等人），J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》），264:13165-13170(1989)），羧肽酶N（Tan et al.（坦等人），J.Biol.Chem. （《生物化学杂志》），265:13-19(1990)）。

用于多肽的C端修饰的制剂

在一些实施例中，使用羧肽酶的激活剂或抑制剂以生产多肽的C端变体的目标水平（例如，抗体）。已知不同羧肽酶的激活剂和抑制剂。示例性的，用于羧肽酶E和/或M的非限制性的激活剂包括Co²⁺、Zn²⁺、NiCl₂、Na₂SO₄、KCl、NaNO₃、NaCl、和KNO₃。用于这些酶的抑制剂包括，但不限于1,10-二氮杂菲；4-氯代汞苯磺酸酯；氨丙基巯基琥珀酸；精氨酸；CdCl₂（Cd化合物）；CuCl₂；EDTA；FeSO₄；胍基乙基巯基琥珀酸（GEMSA）；HgCl₂；Leu-脑啡肽；促黄体素释放素；赖氨酸；Met-脑啡肽；Met-脑啡肽-Arg-Gly-Leu；催产素；对氯代汞苯磺酸酯；P物质；巯基试剂；促甲状腺激素释放激素；[Leu5]脑啡肽-Arg6；[Met5]脑啡肽-Arg6；和Met-脑啡肽-Arg6-Phe7。在本披露中有用的具体抑制剂是赖氨酸和精氨酸，例如L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸、D-精氨酸、及其衍生物和盐。

在一些实施例中，使用一种可以直接或间接改变pH（例如，在此描述的细胞的细胞内pH）的试剂（“pH改性剂”）以生产多肽（例如，抗体）的C端变体的目标水平。不希望受理论限制，相信改变（例如，增加）细胞内pH可以改变（例如，，增加）多肽（例如，抗体）上的C端赖氨酸和/或精氨酸残基水平，这是通过直接或间接改变一个或多个涉及C端赖氨酸和/或精氨酸残基的调节的机制。此类机制可以包括，或者可以不依赖于羧肽酶活性。例如，不希望受到理论限制，相信增加涉及分泌途径的细胞内隔室的pH可以增加多肽（例如，抗体）的C端赖氨酸和/或精氨酸残基的水平。相应地，在一些实施例中，使用可以在细胞的一个或多个分泌途径的隔室（例如，ER、高尔基体、分泌泡）中增加pH的pH改性剂以增加多肽（例如，抗体）的C端赖氨酸和/或精氨酸残基水平，例如，至目标水平。

此类pH改性剂包括，但不限于，铵盐（例如，硝酸铵、碳酸铵、乙酸铵、甲基磺酸铵、对甲苯磺酸铵、氯化铵、溴化铵、硫酸铵，或磷酸铵），碱性氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸，和/或组氨酸），极性氨基酸（例如，谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸，或苏氨酸），葡萄糖、氯喹、甲胺、三丁胺、苄胺，和三乙胺。

在一些实施例中，羧肽酶的激活剂或抑制剂也是一种pH改性剂。例如，赖氨酸和/或精氨酸可以抑制羧肽酶并且也可以增加细胞内pH。不希望受到理论限制，此类试剂可以通过抑制羧肽酶，通过增加细胞内pH，或者两者来增加多肽（例如，抗体）的C端赖氨酸和/或精氨酸残基的水平。

如在此描述的，使用羧肽酶激活剂、羧肽酶抑制剂，和/或pH改性剂以生产多肽（例如，抗体）的C端变体的目标水平。在具体的例子中，生产抗体的K0赖氨酸变体、K1赖氨酸变体、K2赖氨酸变体、R0精氨酸变体、R1精氨酸变体、和/或R2精氨酸变体。例如，使用羧肽酶抑制剂（例如，精氨酸和/或赖氨酸）、羧肽酶激活剂、和/或pH改性剂以制备K0赖氨酸变体、K1赖氨酸变体、K2赖氨酸变体、R0精氨酸变体、R1精氨酸变体，和/或R2精氨酸变体的目标水平。

细胞

可以用来表达感兴趣的多肽（例如，抗体）的任何宿主细胞可以用于在此描述的方法中。这些细胞可以包含编码感兴趣的多肽（例如，抗体）的核酸序列，例如，基因。例如，有用的细胞可以表达一种重组的多肽。编码一种多肽的基因的重组表达可以包括包含编码该多肽的多核苷酸的表达载体的构建。一旦获得了多核苷酸，可以通过重组DNA技术使用本领域已知的技术生产用于该多肽生产的载体。可以使用已知的方法构建包含多肽编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术，以及体内遗传重组。

表达载体可以通过常规技术转移到宿主细胞，并且然后这些转染细胞可以通过常规技术培养以生产多肽。可以使用不同的宿主表达载体系统（参见，例如，美国专利号5,807,715）。可以使用此类宿主表达系统以生产多肽（例如，抗体）并且，当希望时，随后纯化。此类宿主表达系统包括，但不限于，转化了包含多肽编码序列的重组酵母表达载体的酵母（例如，酵母菌属和毕赤酵母）；使用包含多肽编码序列的重组病毒表达载体（例如，杆状病毒）侵染的昆虫细胞系统；使用重组病毒表达载体（例如，花椰菜嵌合病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV）侵染的或用包含多肽编码序列的重组质粒表达载体（例如，Ti质粒）转化的植物细胞系统；或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统（例如，COS、CHO、BHK、293、NS0、和3T3），这些构建体包含衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子（例如，金属硫蛋白启动子）或者衍生自哺乳动物病毒的启动子（例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子）。

对于哺乳动物宿主细胞中的表达，可以利用基于病毒的表达系统（参见，例如，Logan et al.（洛根等人），1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）8:355-359）。表达的效率可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等等来增强（参见，例如，Bittner et al.（比特纳等人），1987,Methods in Enzymol.（《酶学中的方法》）153:516-544）。

除此之外，可以选择调节插入序列的表达，或者以所希望的特殊形式修饰和处理基因产物的宿主细胞菌株。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性的和具体的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保该表达的多肽（例如，抗体）的正确修饰和加工。此类细胞包括，例如，建立的哺乳动物细胞系和昆虫细胞系，动物细胞、真菌细胞，和酵母细胞。哺乳动物宿主细胞包括，但不限于，CHO、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK-293、NIH-3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NS0（一种并不内源性地生产任何免疫球蛋白链的鼠科动物骨髓瘤细胞系）、CRL7O3O、HsS78Bst细胞、PER.C6、SP2/0-Ag14，以及杂交瘤细胞。此外，动物或哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢细胞，例如CHO-K1（ATCC CCL-61），DG44（Chasin et al.（蔡辛等人），1986,Som.Cell Molec.Genet.（《索姆细胞分子遗传学》），12:555-556；和Kolkekaret al.（寇克卡等人），1997,Biochem.（《生物化学》），36:10901-10909），CHO-DXB11（G.Urlaub（G.乌尔劳布）和L.A.Chasin（L.A.蔡辛），1980Proc.Natl.Acad.Sci.（《美国国家科学院院刊》），77:4216-4220，L.H.Graf（L.H.格拉芙），和L.A.Chasin（L.A.蔡辛）1982,Molec.Cell.Biol.（《分子细胞生物学》），2:93-96），CHO-K1Tet-On细胞系（Clontech公司），CHO指定ECACC（欧洲动物细胞库）85050302（应用微生物研究中心（CAMR），塞尔斯贝里（Salisbury），威尔特郡（Wiltshire），英国），CHO克隆13（GEIMG,Genova,IT)，CHO克隆B（GEIMG,Genova,IT），CHO-K1/SF指定ECACC93061607（应用微生物研究中心，塞尔斯贝里，威尔特郡，英国)，RR-CHOK1指定ECACC92052129（应用微生物研究中心，塞尔斯贝里，威尔特郡，英国），二氢叶酸还原酶阴性CHO细胞（CHO/-DHFR，Urlaub（乌尔劳布）和Chasin（蔡辛），1980,Proc.Natl.Acad. Sci.USA（《美国国家科学院院刊》），77:4216），和dp12.CHO细胞（美国专利号5,721,121）；通过SV40转化的猴肾细胞CV1（COS细胞，COS-7,ATCC CRL-1651）；人胚胎肾细胞（例如，293细胞，或者亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham et al.（格拉哈姆等人），1977,J.Gen.Virol. （《基因病毒学杂志》），36:59）；幼仓鼠肾细胞（BHK,ATCC CCL-10）；猴肾细胞（CV1,ATCC CCL-70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCCCRL-1587；VERO，ATCC CCL-81)；小鼠睾丸支持细胞（TM4，Mather（马瑟），1980,Biol.Reprod.（《繁殖生物学》），23:243-251）；人类宫颈癌细胞（HELA,ATCC CCL-2）；犬肾细胞（MDCK,ATCC CCL-34）；人肺细胞（W138,ATCC CCL-75）；人类肝癌细胞（HEP-G2,HB8065）；小鼠乳腺瘤细胞（MMT060562,ATCC CCL-51）；布法罗大鼠（buffalo rat）肝细胞（BRL3A,ATCC CRL-1442）；TR1细胞（Mather（马瑟），1982,Ann.NY Acad.Sci.（《纽约科学学院年鉴》），383:44-68）；MCR5细胞；和FS4细胞。

对于长期、高产量的重组蛋白的生产，将宿主细胞工程化以稳定表达一种多肽（例如，抗体）。可以使用受本领域已知的适当的表达控制元件控制的DNA转化宿主细胞，这些控制元件包括启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点，以及可选择性标记。可以使用重组DNA技术领域已知的常见方法选择所希望的重组克隆。

一旦通过重组表达生产了在此描述的多肽（例如，一种在此描述的抗体），可以通过本领域已知的用于纯化的任何方法进行纯化，例如通过色谱法（例如，离子交换、亲和、和筛柱色谱）、离心分离、差别性溶解度，或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。例如，一种抗体可以通过适当地选择并且将亲和柱（例如蛋白质A柱）与色谱柱，过滤、超滤、盐析和透析程序进行组合而进行分离和纯化（参见Antibodies:A Laboratory Manual （《抗体：实验室手册》），Ed Harlow（Ed哈洛），David Lane（大卫莱恩），冷泉港实验室，1988）。进一步的，如在此描述的，可以将一种多肽（例如，一种抗体）融合至异源多肽序列以促进纯化。可以通过本领域已知的方法使用凝集素柱分离具有所希望糖链的多肽（参见，例如，WO02/30954）。

根据本披露，可以采用本领域中的常规分子生物、微生物，和重组DNA技术。在文献中描述了此类技术（参见，例如，Sambrook（萨姆布鲁克），Fritsch（费里奇）&Maniatis（马尼亚蒂斯），Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition（《分子克隆：实验室手册，第二版》）（1989）冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；DNA Cloning:A Practical Approach（《DNA 克隆：实用方法》），卷I和II（D.N.Glover ed（格洛维尔编辑），1985）；Oligonucleotide Synthesis（《寡核苷酸合成》）（M.J.Gait ed（M.J.盖特编辑），1984）；Nucleic Acid Hybridization（《核酸杂交》）（B.D.Hames&S.J.Higgins eds（B.D.黑姆丝&S.J.希金斯编辑），（1985））；Transcription And Translation（《转录和翻译》）（B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.（B.D.黑姆丝&S.J.希金斯编辑）（1984））；Animal Cell Culture（《动物细胞培养》）（R.I.Freshney,ed.（R.I.弗莱士内编辑）（1986））；Immobilized Cells and Enzymes（《固定化细胞和酶》）（IRL出版社，（1986））；B.Perbal（B.佩巴尔），A Practical Guide To Molecular Cloning（《分子克隆的实用指南》）（1984）；F.M.Ausubel et al.（F.M.奥苏贝尔等人）（编辑），Current Protocols in Molecular Biology（《分子生物学实验指南》），John Wiley&Sons,Inc.（约翰威利父子出版社）（1994）。

培养方法

通常，多肽（例如，抗体）的C端变体的目标水平可以通过在培养基中培养的细胞进行生产，该培养基包含一种或多种羧肽酶激活剂、羧肽酶抑制剂，和/或pH改性剂。例如，对于生产具有降低水平的C端赖氨酸和/或精氨酸残基的多肽（例如，抗体）的C端变体的制品，表达此类多肽的细胞可以培养在一种培养基中，该培养基包括升高水平的羧肽酶激活剂、降低水平的羧肽酶抑制剂（例如，精氨酸或赖氨酸）、和/或包括降低细胞内pH的试剂。在一些实施例中，对于生产具有较高水平的C端赖氨酸和/或精氨酸残基的多肽（例如，抗体）的C端变体的制品，表达此类多肽的细胞可以培养在一种培养基中，该培养基包括升高水平的羧肽酶抑制剂（例如，精氨酸或赖氨酸）、降低水平的羧肽酶激活剂、和/或包括增加细胞内pH的试剂。

如在此使用的，一种组分的“升高的水平”意为与存在于标准培养基中相比一种组分的较高浓度，和/或与存在于生产多肽的培养基中相比一种组分的较高浓度。在一些实施例中，一种组分并不存在于一种标准培养基中，并且一种“升高的水平”是此类此类组分的任何量。一种培养基最初可以包括一种组分的升高的水平（例如，在培养的起始），或者起始培养基可以使用一种组分进行补充以在培养期间的具体的一个时间或多个时间达到该组分的升高的水平。例如，该起始培养基可以包括至少大约2g/L精氨酸、至少大约2g/L赖氨酸、或至少大约2g/L的精氨酸和赖氨酸的组合。

如在此使用的，一种组分的“降低的水平”意为与存在于标准培养基中相比一种组分的较低浓度，和/或与存在于生产多肽的培养基中相比一种组分的较低浓度。一种培养基最初可以包括一种组分的降低水平（例如，在培养的起始），起始培养基可以在培养期间的具体的一个时间或多个时间进行稀释以降低一种组分的水平，或者起始培养基可以在培养期间的具体的一个时间或多个时间使用一种具有降低水平的一种组分的培养基进行取代。

在一些实施例中，通过培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养是在以下这样的条件下进行：这些条件增加该细胞的细胞内pH，例如增加在此描述的细胞的一种或多种分泌隔室的pH。细胞内pH可以使用已知的方法进行测量，例如通过使用pH敏感的绿色荧光蛋白（参见，例如，Tomkins et al.（汤姆金斯等人），Am.J.Phys.Cell Physiol.（《美国细胞生理学物理杂志》）283:C429-37(2002)；Blackmore et al.（布莱克默等人），J.Physol.（《生理学杂志》）531:605-617(2001)；Miesenbock et al.（米森伯克等人），Nature（《自然》）394:192-195(1998)）。在一些实施例中，使用pH调节试剂，例如一种在此描述的试剂增加细胞内pH。在一些实施例中，细胞内pH（例如，分泌隔室的pH）增加了：至少大约10%、至少大约20%、至少大约30%、至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约100%、或更多。在一些实施例中，细胞内pH（例如，分泌隔室的pH）增加以下的值：至少大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3，或更多。

在一些实施例中，通过在一种培养基中培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养基具有升高水平的铵盐（例如，NH₄Cl）。在一些实施例中，培养基包含浓度在大约1mM至大约30mM的NH₄Cl，例如，大约1mM、大约2mM、大约3mM、大约4mM、大约5mM、大约6mM、大约7mM、大约8mM、大约9mM、大约10mM、大约11mM、大约12mM、大约13mM、大约14mM、大约15mM、大约16mM、大约17mM、大约18mM、大约19mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约40mM、大约50mM、或更多。

在一些实施例中，通过在一种培养基中培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养基具有升高水平的氯喹。在一些实施例中，一种培养基包含大约10μM至大约500μM浓度的氯喹，例如，大约10μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM、大约60μM、大约70μM、大约80μM、大约90μM、大约100μM、大约110μM、大约120μM、大约130μM、大约140μM、大约150μM、大约160μM、大约170μM、大约180μM、大约190μM、大约200μM、大约210μM、大约220μM、大约230μM、大约250μM、大约250μM、大约260μM、大约270μM、大约280μM、大约290μM、大约300μM、大约310μM、大约320μM、大约330μM、大约340μM、大约350μM、大约360μM、大约370μM、大约380μM、大约390μM、大约400μM、大约410μM、大约420μM、大约430μM、大约440μM、大约450μM、大约460μM、大约470μM、大约480μM?大约490μM、大约500μM、或更多。

在一些实施例中，通过在一种培养基中培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养基具有升高水平的甲胺、三丁胺、苄胺，和/或三乙胺。在一些实施例中，一种培养基包含浓度在大约10μM至大约3mM的甲胺、三丁胺、苄胺、三乙胺，或其组合，例如，大约10μM、大约50μM、大约100μM、大约150μM、大约200μM、大约250μM、大约300μM、大约350μM、大约400μM、大约450μM、大约500μM、大约550μM、大约600μM、大约650μM、大约750μM、大约800μM、大约850μM、大约900μM、大约950μM、大约1mM、大约1.25mM、大约1.5mM、大约1.75Mm、大约2mM、大约2.25mM、大约2.5mM、大约2.75mM、大约3mM、或更多。

在一些实施例中，通过在一种培养基中培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养基具有升高水平的葡萄糖。在一些实施例中，一种培养基包含浓度大约在0.1g/L至大约10g/L的葡萄糖，例如，大约0.2g/L、大约0.3g/L、大约0.4g/L、大约0.5g/L、大约0.6g/L、大约0.7g/L、大约0.8g/L、大约0.9g/L、大约1g/L、大约1.1g/L、大约1.2g/L、大约1.3g/L、大约1.4g/L、大约1.5g/L、大约1.6g/L、大约1.7g/L、大约1.8g/L、大约1.9g/L、大约2g/L、大约2.1g/L、大约2.2.g/L、大约2.3g/L、大约2.4g/L、大约2.5g/L、大约2.6g/L、大约2.7g/L、大约2.8g/L、大约2.9g/L、大约3g/L、大约3.5g/L、大约4g/L、大约4.5g/L、大约5g/L、大约5.5g/L、大约6g/L、大约6.5g/L、大约7g/L、大约7.5g/L、大约8g/L、大约8.5g/L、大约9g/L、大约9.5g/L、大约10g/L、或更多。

在一些实施例中，通过在一种培养基中培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养基具有升高水平的葡萄糖组氨酸、赖氨酸、精氨酸、或组氨酸、赖氨酸，和/或精氨酸的组合。在一些实施例中，一种培养基包含浓度在大约1g/L至大约50g/L的组氨酸、赖氨酸、精氨酸、或组氨酸、赖氨酸、和/或精氨酸的组合，例如，至少大约1g/L、至少大约1.5g/L、至少大约2g/L、至少大约2.5g/L、至少大约3g/L、至少大约3.5g/L、至少大约4g/L、至少大约4.5g/L、至少大约5g/L、至少大约5.5g/L、至少大约6g/L、至少大约6.5g/L、至少大约7g/L、至少大约7.5g/L、至少大约8g/L、至少大约8.5g/L、至少大约9g/L、至少大约9.5g/L、至少大约10g/L、至少大约10.5g/L、至少大约11g/L、至少大约11.5g/L、至少大约12g/L、至少大约12.5g/L、至少大约13g/L、至少大约13.5g/L、至少大约14g/L、至少大约14.5g/L、至少大约15g/L、至少大约15.5g/L、至少大约16g/L、至少大约16.5g/L、至少大约17g/L、至少大约17.5g/L、至少大约18g/L、至少大约18.5g/L、至少大约19g/L、至少大约19.5g/L、至少大约20g/L、至少大约25g/L、至少大约30g/L、至少大约35g/L、至少大约40g/L、至少大约45g/L、至少大约50g/L、或更多。

在一些实施例中，通过在一种培养基中培养一种细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，该细胞表达该多肽（例如，抗体），该培养基具有升高水平的谷氨酰胺。在一些实施例中，一种培养基包含浓度在大约5mM至大约80mM的谷氨酰胺，例如，大约5mM、大约10mM、大约15mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约35mM、大约40mM、大约45mM、大约50mM、大约55mM、大约60mM、大约65mM、大约70mM、大约75mM、大约80mM、或更多。

细胞可以在本领域已知的不同细胞培养基中培养，这些培养基根据本披露修改以包括在此描述的一种或多种羧肽酶激活剂、一种或多种羧肽酶抑制剂、和/或一种或多种pH改性剂（例如，在一种升高的或降低的水平）。由本领域那些普通技术人员理解的细胞培养基是指细胞（例如动物细胞或哺乳动物细胞）在其中生长的营养溶液。通常一种细胞培养基包括一种或多种以下组分：一种能量来源（例如，例如碳水化合物，如葡萄糖）；氨基酸；维生素；脂类或游离脂肪酸；和微量元素，例如，在微摩尔范围中的无机化合物或天然发生的元素。细胞培养基也可以包含另外的组分，例如激素和其他生长因子（例如，胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血清和类似物）；盐类（例如，钙、镁，和磷酸盐）；缓冲液（例如，HEPES）；核苷和碱基（例如，腺苷、胸苷、次黄嘌呤）；抗体（例如，庆大霉素）；和细胞保护试剂（例如，普朗尼克多聚醇（普朗尼克F68））。

已经制备的培养基或者商业可购得的培养基可以根据本披露进行改变以在于此描述的方法中利用。此类培养基的非限制性实例包括基本成分培养基（MEM，Sigma（西格玛公司），St.Louis（圣路易斯），密苏里州）；哈姆氏F10培养基（Sigma（西格玛公司））；杜贝尔科氏改良伊格尔氏培养基（DMEM，Sigma（西格玛公司））；RPM I-1640培养基（Sigma（西格玛公司））；HyClone细胞培养基（HyClone公司，Logan（洛根市），犹他州）；Power CHO2（Lonza Inc.（龙沙公司），Allendale（艾伦代尔），新泽西）；以及用于特殊细胞型而配制的化学限定性（CD）培养基，例如，CD-CHO培养基（Invitrogen（英杰公司），Carlsbad（卡尔斯巴德），加利福尼亚州）。适合于特殊细胞培养的培养基可以通过本领域普通技术人员确定而不需要过度实验。

适合于在此描述的多肽（例如，抗体）的细胞生产的细胞培养条件（包括pH、O₂、CO₂，和温度）是本领域已知的那些，例如用于细胞的分批、连续或流加式培养的条件。例如，通常细胞培养基的pH保持在大约6.8至大约7.6。

通常，细胞培养方法被分为分批培养、连续培养，和流加式培养。可以使用任何这些培养方法以培养生产C端变体的目标水平的细胞。

在分批培养中，将少量的种子培养溶液添加至培养基中并且在培养期间的细胞生长不添加任何新的培养基或者不排放该培养溶液。对于使用分批培养的C端变体的目标水平的生产，该培养基包括自细胞培养最初阶段的升高水平或降低水平的一种或多种羧肽酶激活剂，一种或多种羧肽酶抑制剂，和/或一种或多种pH改性剂。

在一些实施例中，通过在一种培养基中分批培养细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，这些细胞表达该多肽，该培养基具有至少大约2g/L的精氨酸、至少大约2g/L的赖氨酸、至少大约2g/L的组氨酸、至少大约2g/L的精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的组合、至少大约5mM的NH₄Cl、大约10μM至大约500μM的氯喹、大约10mM至大约30mM的谷氨酰胺、和/或大约0.5g/L至大约2g/L的葡萄糖。

连续培养是一种在培养期间连续添加并且连续排放培养基的培养方法。这种连续方法包括灌流培养。例如，在使用连续培养的C端变体的目标水平的生产中，在培养期间添加的培养基可以具有升高水平或降低水平的一种或多种羧肽酶激活剂、一种或多种羧肽酶抑制剂，和/或一种或多种pH改性剂。在某些方法中，该初始培养基并不包括升高水平或降低水平的一种或多种羧肽酶激活剂、一种或多种羧肽酶抑制剂，和/或一种或多种pH改性剂，但是在连续培养期间（例如在生产阶段）的一个具体时间点，在培养期间添加的培养基在一种或多种羧肽酶激活剂、一种或多种羧肽酶抑制剂，和/或一种或多种pH改性剂的水平方面是升高或降低的。

在一些实施例中，通过在一种培养基中连续培养细胞来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，这些细胞表达该多肽，该培养基具有至少大约2g/L的精氨酸、至少大约2g/L的赖氨酸、至少大约2g/L的组氨酸、至少大约2g/L的精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的组合、至少大约5mM的NH₄Cl、大约10μM至大约500μM的氯喹、大约10mM至大约30mM的谷氨酰胺、和/或大约0.5g/L至大约2g/L的葡萄糖。

流加式培养是一种在分批培养和连续培养之间的方法。在流加式培养中，在培养期间培养基是连续或顺序馈入，但是不同于连续培养，在培养期间并不实施该培养溶液的排放。例如，对于使用流加式培养的C端变体的目标水平的生产，在培养期间添加的培养基可以具有升高水平或降低水平的一种或多种羧肽酶激活剂、一种或多种羧肽酶抑制剂、和/或一种或多种pH改性剂。

在一些实施例中，通过将培养基添加至细胞的流加式培养中来生产具有C端变体的目标值的多肽（例如，抗体）制品，这些细胞表达该多肽，该添加足以在培养基中达到至少大约2g/L的精氨酸、至少大约2g/L的赖氨酸、至少大约2g/L的组氨酸、至少大约2g/L的精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的组合、至少大约5mM的NH₄Cl、大约10μM至大约500μM的氯喹、大约10mM至大约30mM的谷氨酰胺、和/或大约0.5g/L至大约2g/L的葡萄糖。

根据本披露，细胞培养可以在用于大批量或小批量多肽（例如，抗体）生产的条件下实施，使用动物或哺乳动物细胞培养常规采用的培养瓶和/或培养装置。例如，可以实验室规模使用组织培养皿、T-烧瓶、振荡烧瓶和旋转烧瓶。对于更大规模（例如，500L，5000L，或更多）的培养，可以使用流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养，或搅拌槽生物反应器系统（例如，如在美国专利号7,541,164和7,332,303中描述的）。

在具体的方法中，在具体细胞培养期间监测了多肽（例如，抗体）制品中C端变体的水平，由此允许调整（例如，在培养中增加或减少一种或多种羧肽酶抑制剂、一种或多种羧肽酶激活剂，和/或一种或多种pH改性剂的量）或者可能地终止该培养，例如，以达到C端变体的目标水平。

多肽

可以使用在此描述的方法生产任何感兴趣的多肽，例如一种抗体，一种含Fc多肽和/或融合蛋白。

IgG抗体的基本结构由二硫键连接的两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。定位于每条链氨基端的第一结构域在氨基酸序列方面是可变的，提供了在每个单一抗体中发现的抗体结合特异性。这些是被称为可变重（VH）区和可变轻（VL）区。每条链的其他结构域在氨基酸序列方面是相对不变的并且被称为恒定重区（CH）和恒定轻区（CL）。对于IgG抗体，该轻链包括一个可变区（VL）和一个恒定区（CL）。一个IgG重链包括可变区（VH），第一恒定区（CH1），铰链区，第二恒定区（CH2），和第三恒定区（CH3）。在IgE和IgM抗体中，该重链包括另外的恒定区（CH4）。

典型地，编码抗体和含Fc多肽的核酸序列在该重链的C端编码赖氨酸残基。然而，在从哺乳动物细胞培养中分离的抗体和含Fc多肽中，C端赖氨酸通常是缺失的或者以降低的水平存在。在一些实施例中，本发明的方法可以增加在抗体制品中或含Fc多肽的制品中在抗体或含Fc多肽上的赖氨酸残基的量。如在此使用的，“K0”意为在任一重链C端不具有赖氨酸残基的抗体或含Fc多肽。如在此使用的，“K1”意为在一条重链C端具有赖氨酸残基的抗体或含Fc多肽。如在此使用的，“K2”意为在每条重链C端具有赖氨酸残基的抗体或含Fc多肽。

抗体可以包括，例如，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼化的抗体（camelized antibodies）、嵌合抗体、单链Fvs（scFv）、二硫连接的Fvs（sdFv）、和抗独特型（抗-Id）抗体、和任何以上的抗原结合片段。抗体可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY），任何种类（例IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或子类。

如此使用的，术语“Fc片段”是指一种或多种保留Fc功能和/或活性（例如连接至Fc受体）的Fc区片段。此类片段的实例包括这样的片段，这些片段包括Fc区的N糖基化位点（例如，IgG重链的Asn297或其他抗体同种型的同源位点），例如CH2结构域。如此使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指保留特异结合抗原能力的一种或多种抗体片段。包含在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab')₂片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、dAb片段（Ward et al.（沃德等人），（1989）Nature（《自然》）341:544-546）、和分离的互补决定区（CDR）。这些抗体片段可以使用本领域普通技术人员熟知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。

在此描述的组合物和方法的抗体或片段可以通过本领域已知的任何用于抗体合成的方法生产（参见，例如，Harlow et al.（哈洛等人），Antibodies: A Laboratory Manual（《抗体：实验室手册》）,（冷泉港实验室出版社，第二版1988）；Brinkman et al.（布林克曼等人），1995,J.Immunol.Methods （《免疫学方法杂志》）182:41-50；WO92/22324；WO98/46645）。可以使用描述于例如，Morrison（莫里森），1985,Science（《科学》）229:1202中的方法生产嵌合抗体，和通过描述于例如，美国专利号6,180,370中的方法生产人源化抗体。

在此描述的组合物和方法的另外抗体是双特异性抗体和多价抗体，如描述于例如，Segal et al.（西格尔等人），J.Immunol.Meth.（《免疫学方法杂志》）248:1-6(2001)；和Tutt et al.（塔特等人），J.Immunol.（《免疫学杂志》）147:60(1991)。

含Fc多肽包括，但不限于，融合蛋白，例如，结合或融合至一个或多个异源部分的Fc区或Fc片段。异源部分包括，但不限于，肽、多肽、蛋白、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、和有机分子。在一些情况下，含Fc多肽是或者包括一种融合蛋白，该融合蛋白包括一种肽、多肽、蛋白质支架、scFv、dsFv、双抗体、Tandab、或者融合至Fc区的抗体模拟物、例如糖基化Fc区。该融合蛋白可以包括将Fc区连接至该异源部分的接头区（参见，例如，Hallewell et al.（哈勒威尔等人）（1989），J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》）264,5260-5268；Alfthan et al.（阿尔夫坦等人）（1995）Protein Eng.（《蛋白质工程》）8:725-731）。

在一些情况下，含Fc多肽是或者包括共轭至以下异源多肽的Fc区，该异源多肽至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。在一些情况下，含Fc多肽是或者包括一种共轭至标记物序列（例如一种多肽）的Fc区（或Fc片段）以促进纯化。一种具体的标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体中的提供标签（QIAGEN（凯杰公司），9259EtonAvenue（伊顿大道9259），Chatsworth（查茨沃思），加利福尼亚，91311）。其他用于纯化的肽标签包括，但不限于，对应于衍生自流感血球凝集素蛋白的表位的血球凝集素“HA”标签（Wilson et al.（威尔逊等人），1984,Cell（《细胞》）37:767）以及“Flag”标签。

在其他情况下，含Fc多肽是或者包括一种共轭至诊断或可检测试剂的Fc区。此类含Fc多肽可以是作为临床检测程序的部分用于监测或预测疾病或紊乱的发展和进展有用的，例如确定具体治疗的疗效。此类诊断和检测可以通过将糖蛋白偶联至可检测的物质上完成，这些可检测的物质包括但不限于，不同的酶，例如但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如，但不限于，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，例如，但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如，但不限于，鲁米诺；生物性发光物质，例如但不限于，荧光素酶、荧光素、和水母发光蛋白质；放射性物质，例如但不限于，碘（¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I）、碳（¹⁴C）、硫磺（³⁵S）、氚（³H）、铟（¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In）、锝（⁹⁹Tc）、铊（²⁰¹Ti）、镓（⁶⁸Ga、⁶⁷Ga）、钯（¹⁰³Pd）、钼（⁹⁹Mo）、氙（¹³³Xe）、氟（¹⁸F）、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵³Gd、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁶⁹Yb、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn、和¹¹⁷Sn；使用不同的正电子放射断层造影术的正电子发射金属、非放射性顺磁金属离子、放射性同位素标记的或共轭至特异放射性同位素的分子。

用于将治疗性部分共轭至抗体和/或含Fc多肽的技术是已知的（参见，例如，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”（《癌症治疗中用于免疫寻靶药物的单克隆抗体》），在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（《单克隆抗体和癌症治疗》）中，Reisfeld etal.（莱斯菲尔德等人）（编辑），pp.243-56（Alan R.Liss,Inc.（阿兰R丽斯有限公司）1985）；Hellstrom et al.（赫尔斯特伦等人），“Antibodies ForDrug Delivery”（《用于药物递送的抗体》），在Controlled Drug Delivery （《受控药物递送》）中，（第二版），Robinson et al.（罗宾逊等人）（编辑），pp.623-53（Marcel Dekker,Inc.（马塞尔德克公司）1987））。

可以使用在此描述的方法生产的非限制性，示例性多肽包括阿巴西普（奥瑞希纳

Bristol-Myers Squibb（施贵宝公司））、阿普单抗（

Roche（罗氏公司））、阿达木单抗（阿达木单抗

Bristol-Myers Squibb（施贵宝公司））、阿法赛特（阿密凡夫

Astellas Pharma（阿斯泰来制药公司））、阿仑单抗（阿仑单抗

Genzyme/Bayer（健赞公司/拜耳公司））、巴利昔单抗（巴利昔单抗

Novartis（诺华公司））、贝伐单抗（阿瓦斯丁

Roche（罗氏公司））、赛妥珠单抗（赛妥珠单抗

UCB（优时比公司），布鲁塞尔、比利时）、西妥昔单抗（爱必妥

Merck-Serono（默克-雪兰诺公司））、达利珠单抗（赛尼哌

Hoffmann-La Roche（豪夫迈-罗氏公司））、地尼白介素（Ontak

Eisai（卫材公司））、依库丽单抗（依库珠单抗

Alexion Pharmaceuticals（亚力兄制药公司））、依法利珠单抗（瑞体肤

Genentech（基因泰克公司））、依那西普（依那西普

Amgen-Pfizer（辉瑞公司））、吉妥珠单抗（麦罗塔

Pfizer（辉瑞制药）、替伊莫单抗（泽娃灵

Spectrum Pharmaceuticals（频谱制药）、英夫利昔（英利昔单抗

Centocor（山陶克公司））、莫罗莫那（Orthoclone OKT3

Janssen-Cilag（杨森制药公司））、那他珠单抗（那他珠单抗

Biogen Idec（佰健艾迪公司），Elan（宜兰公司））、奥马珠单抗（奥马珠单抗Novartis（诺华制药））、帕利珠单抗（帕利珠单抗

MedImmune（医学免疫公司））、帕尼单抗（VectibixAmgen（安进公司））、兰尼单抗（雷珠单抗

Genentech（基因泰克公司））、利那西普（Regeneron制药公司）、利妥昔单抗（利妥昔单抗

Roche（罗氏公司））、托西莫单抗（托西莫单抗

GlaxoSmithKline（葛兰素史克公司））、和曲妥单抗（赫赛汀Roche（罗氏公司））。

一种在此描述的重组多肽（例如，抗体）可以合并进入药物组合物。此类药物组合物在疾病的预防和/或治疗中是有用的。包括多肽（例如，抗体）的药物组合物可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行配制。该药物组合物可以以可注射配制品形式（该配制品包括在水中或在另外的药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液）肠胃外给药。例如，该药物组合物可以通过适当地将该多肽与药学上可接受的载体或介质组合，例如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、载体、防腐剂、粘合剂，随后在通常可接受的医学实践所需的单位剂型中混合而进行配制。在药学制品中包括的活性成分的量是提供在指定范围中的这种合适剂量。

给药途径可以是肠胃外的，例如，通过注射给药、经鼻给药、经肺给药或者经皮给药。给药可以是通过静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射的全身或局部的。

一种合适的给药方式可以根据病人的年龄和病症来选择。一种包含多肽（例如，抗体）的单一剂量的药物组合物可以从0.001mg/kg的体重至1000mg/kg的体重的范围选择。另一方面，一种剂量可以在0.001mg/kg的体重至100000mg/kg的体重的范围内选择，但是本披露并不限于此范围。给药的剂量和方法根据病人的体重、年龄、病症，以及等等而改变，并且可以适当地由本领域普通技术人员按照需要选择。

在其他的情况下，可以使用一种重组多肽（例如，抗体）对于疾病或对于可以治疗或预防疾病的制剂进行筛选。

C端变体和多肽活性水平的测定方法

参考多肽（例如，参考抗体）的C端变体的水平可以通过已知的方法进行测定（参见，例如，Dick et al.（迪克等人），Biotechnol.Bioeng.（《生物技术与生物工程》）100:1132-1143(2008)）。例如，多肽（例如，抗体）可以通过色谱方法进行分析，包括但不限于，液相色谱（LC），高效液相色谱（HPLC），超高效液相色谱（UPLC），薄层色谱（TLC），酰胺柱色谱，和其组合。

在其他方法中，多肽（例如，抗体）可以通过质谱法（MS）以及相关的方法进行分析，包括但不限于：串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS）、傅里叶变换质谱法（FTMS）、离子迁移率分离质谱法（IMS-MS）、电子转移解离（ETD-MS）、以及它们的组合。

其他分析多肽（例如，抗体）的方法包括电泳法，包括但不限于：毛细管电泳法（CE）、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）跟随有使用识别特定氨基酸的抗体的蛋白质印迹法、以及它们的组合。

又其他分析方法包括核磁共振（NMR）以及相关方法，包括但不限于：一维NMR（1D-NMR）、二维NMR（2D-NMR）、相关谱磁性角自旋NMR（COSY-NMR）、全相关光谱NMR（TOCSY-NMR）、异核单量子相干NMR（HSQC-NMR）、异核多级量子相干（HMQC-NMR）、旋转核欧沃豪斯效应谱NMR（ROESY-NMR）、核欧沃豪斯效应谱（NOESY-NMR）、以及它们的组合。

在一些情况下，使用在此描述的方法生产的多肽制品中的C端变体的水平（例如，在抗体或含Fc多肽制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平）可以与目标值（例如，参考标准）进行比较，例如，以关于该多肽制品组合物做出的决定，例如，做出分类、选择、接受或丢弃、释放或留存、加工成一种药物产品、以船运送、移动到一个不同的位置、配制、贴标签、包装、准予进入贸易、或销售或许诺销售该多肽（例如，一种重组抗体）的决定。在其他的情况中，该决定可以是接受、改变或拒绝用来生产该多肽（例如，一种抗体）的一个或多个产品参数。特别地，参考标准的非限制性实例包括对照水平（例如，由不同方法生产的多肽）或者在产品说明书中的范围或值（例如，FDA标签或医嘱）或者包含该多肽制品的用于药物制品的质量标准。

在一些情况下，方法（例如，评估、鉴别，和生产方法）包括采取行动（例如，身体活动）对在此披露的方法进行响应。例如，多肽制品可以根据该预选择或目标值是否达到而被分类、选择、接受或丢弃、释放或保留、加工成一种药物产品、以船运送、移动到一个不同的位置、配制、贴标签、包装、准予进入贸易、或销售或许诺销售。在一些情况中，加工可以将多肽制品的至少一部分进行配制（例如，与药物赋形剂组合），包装（例如，以注射器或小瓶），贴标签，或以船运送。在一些情况中，加工包括将作为在此描述的药物产品的制品的至少部分进行配制（例如，与药物赋形剂组合），包装（例如，以注射器或小瓶），以及贴标签。加工可以包括指导和/或联系另一方如在此描述地进行加工。

在一些情况中，评估了多肽制品（例如，抗体制品）的生物活性。该制品的生物活性可以通过任何已知方法分析。在一些实施例中，可以评估一种多肽的结合活性（例如，结合至受体）。在一些实施例中，评估了多肽的治疗活性（例如，在减少疾病或病症的严重性或症状方面的多肽活性，或者在延迟疾病或病症的症状的出现方面的多肽活性）。在一些实施例中，评估了多肽的药理学活性（例如，生物利用率、药物代谢动力学、药效动力学）。用于分析糖蛋白治疗剂的生物利用率、药物代谢动力学，和药效动力学的方法，参见，例如，Weiner et al.（韦纳等人），J.Pharm.Biomed.Anal.（《生物医学药物分析杂志》）15(5):571-9,1997;Srinivas et al.（斯里尼瓦桑等人），J.Pharm.Sci.（《药物科学杂志》）85(1):1-4,1996；以及Srinivas et al.（斯里尼瓦桑等人），Pharm.Res.（《药物研究》）14(7):911-6,1997。

可以检测的具体的生物活性或治疗活性将根据具体多肽（例如，抗体）而改变。可以通过任何可用的方法分析多肽制品的潜在不利活性或毒性（例如，导致高血压、过敏反应、血栓形成事件、癫痫，或其他不良反应的倾向）。在一些实施例中，评估一种多肽制品的免疫原性，例如，通过确定该制品是否在受试者中引发了抗体反应。

所有出版物、专利申请、专利和其他在此提到的引用以其全部通过引用结合。此外，材料、方法和实例仅仅是说明性的而并非旨在进行限定。除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或检测中可以使用与在此描述的那些相似或等价的方法和材料，但是在此描述了合适的方法和材料。

本披露由以下实例进一步说明。仅仅提供了用于说明性目的的实例。不应解释为以任何方式限制本披露的范围或内容。

实施例

具有增加的K1和K2赖氨酸残基的抗体的制备

方法

分析了由CHO细胞产生的模式抗体的羧基端赖氨酸残基。CL320CHO细胞最初培养在具有4mM L-谷氨酰胺和不具有其他补充物的基础培养基（Power CHO2，目录号#BE15-771，Lonza Inc.（龙沙有限公司），Allendale（艾伦代尔），新泽西）的摇瓶中。细胞培养4天，并且细胞的数目从0.54E6/mL增加至4E6/mL。在第4天，细胞以20%Lonza Power Feed A培养基或者以补充有10g/L L-Lys或L-Arg的20%Power Feed A培养基进行饲养。在第5天，添加了10g/L的棉籽水解产物。测定了VCD和生活力，并且在第10天收获细胞。通过离子交换色谱评价了在不同条件下产生的抗体的效价和C端赖氨酸。

结果

如图1中所示，来自以L-Lys馈入或以L-Arg馈入饲养的细胞的抗体均具有与阿达木单抗

相似的K1和K2赖氨酸水平。出人意料的是，添加10mg/L L-Lys或10mg/L L-Arg并不影响生长、生活力或效价。添加L-Lys（10mg/L）和L-Arg（10mg/L）的组合导致了细胞死亡，这可能是没有将pH调整至适当细胞培养水平的结果。

进一步地，当将产生的抗体随后使用羧肽酶进行消化时，K1和K2赖氨酸残基的水平回到了基线，表明K1和K2的水平并不是由于非特异性电荷差异（例如，由于该抗体的酰胺化）。

另外的数据显示受控葡萄糖进料导致了与大剂量葡萄糖进料相比，增加的K1赖氨酸水平。不希望受到理论限制，相信在培养期间通过控制葡萄糖水平，乳酸盐水平可以降低，导致了增加的细胞内pH。

另外的数据显示在培养基中包含NH₄Cl导致了与对照相比增加的K1和K2赖氨酸残基水平。

等效物

应当理解的是虽然已经与其详细说明相连地描述了本披露，上述说明旨在说明而不是限制在本发明的范围内，上述说明由附带的权利要求书的范围所限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求书的范围中。

Claims

1.一种生产重组多肽群的方法，该方法包括：

提供一种重组多肽的C端变体的目标值，

提供包括编码该重组多肽的核酸的一种宿主细胞，

在以下条件下培养该宿主细胞(i)其中该细胞表达该编码的重组多肽的C端变体群并且(ii)增加该细胞的胞内pH，并且

分离该群，其中该群包括该重组多肽的C端变体的提供的目标值。

2.如权利要求1所述的方法，其中增加该细胞的细胞内pH的条件包括在一种培养基中培养这些细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(a)至少大约2g/L的赖氨酸、精氨酸或组氨酸；(b)大约0.5g/L的葡萄糖至大约2g/L的葡萄糖；(c)大约2mM至大约10mM的NH₄Cl；(d)大约10μM至大约500μM氯喹；以及(e)大约10mM至大约30mM谷氨酰胺。

3.一种生产含Fc多肽群的方法，该方法包括：

提供一种含Fc多肽的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值；

提供包括编码该含Fc多肽的核酸的一种宿主细胞；

在以下条件下培养该宿主细胞(i)其中该细胞表达该编码的含Fc多肽的K0、K1、和/或K2的赖氨酸变体群以及(ii)增加该细胞的胞内pH；并且

分离该群，其中该群包括该含Fc多肽的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的提供的目标值。

4.如权利要求3所述的方法，其中增加该细胞的细胞内pH的条件包括在一种培养基中培养这些细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(a)至少大约2g/L的赖氨酸、精氨酸或组氨酸；(b)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖；(c)大约2mM至大约10mM的NH₄Cl；(d)大约10μM至大约500μM氯喹；以及(e)大约10mM至大约30mM谷氨酰胺。

5.一种生产抗体群的方法，该方法包括：

提供一种抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值；

提供包括编码该抗体的核酸的一种宿主细胞；

在以下条件下培养该宿主细胞(i)其中该细胞表达该编码的抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体群以及(ii)增加该细胞的胞内pH；并且

分离该群，其中该群包括该抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的提供的目标值。

6.如权利要求5所述的方法，其中增加该细胞的细胞内pH的条件包括在一种培养基中培养这些细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(a)至少大约2g/L的赖氨酸、精氨酸或组氨酸；(b)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖；(c)大约2mM至大约10mM的NH₄Cl；(d)大约10μM至大约500μM氯喹；以及(e)大约10mM至大约30mM谷氨酰胺。

7.一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：

提供一种重组抗体的C端变体的目标值，

提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，

在包括至少大约2g/L赖氨酸、精氨酸或组氨酸的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体群的条件下培养该宿主细胞；并且

分离该群，其中该群包括该重组抗体的C端变体的提供的目标值。

8.一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：

提供一种重组抗体的C端变体的目标值，

提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，

在包括大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体群的条件下培养该宿主细胞；并且

9.一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：

提供一种重组抗体的C端变体的目标值，

提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，

在包括大约5mM至大约10mM NH₄Cl的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体群的条件下培养该宿主细胞；并且

10.一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：

提供一种重组抗体的C端变体的目标值，

提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，

在包括大约10μm至大约500μm氯喹的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体群的条件下培养该宿主细胞；并且

11.一种生产重组抗体群的方法，该方法包括：

提供一种重组抗体的C端变体的目标值，

提供包括编码该重组抗体的核酸的一种宿主细胞，

在包括大约10mM至大约30mM谷氨酰胺的培养基中，在其中该细胞表达该编码的重组抗体的C端变体群的条件下培养该宿主细胞；并且

12.一种生产重组多肽的方法，该方法包括：

在包括至少大约2g/L赖氨酸和/或精氨酸的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组多肽的条件下培养该细胞；并且

分离该重组多肽。

13.如权利要求12所述的方法，进一步包括测量该重组多肽的C端的赖氨酸和/或精氨酸残基的水平。

14.一种生产重组抗体的方法，该方法包括：

在包括至少大约2g/L赖氨酸和/或精氨酸的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组抗体的条件下培养该细胞；并且

分离该重组抗体。

15.如权利要求14所述的方法，进一步包括测量该分离的重组抗体上的K0、K1、或K2赖氨酸残基中的一种或多种的水平。

16.一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：

在包括至少大约2g/L赖氨酸和/或精氨酸的培养基中，在其中细胞表达重组抗体的条件下培养这些细胞；并且

将这些重组抗体从这些细胞或该培养基中分离以生产一种包括这些重组抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的目标值的制品。

17.如权利要求16所述的方法，其中目标值是在产品说明书中阐明的水平。

18.如权利要求16所述的方法，其中该目标值是在相应的重组抗体的制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

19.如权利要求16所述的方法，进一步包括测量该制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

20.一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：

将这些重组抗体从这些细胞或该培养基中分离以生产一种包括这些重组抗体的至少大约5%的K1和/或K2赖氨酸变体的制品。

21.如权利要求20所述的方法，进一步包括测量该制品中K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

22.一种生产具有K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的目标值的重组抗体制品的方法，该方法包括：

在包括赖氨酸和/或精氨酸的培养基中，在其中细胞表达重组抗体的条件下培养这些细胞；

测量该培养中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平；并且

当该培养中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平是目标值时，将这些重组抗体从这些细胞或该培养基中分离以生产这些重组抗体的一种制品。

23.一种在重组抗体制品中增加K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平的方法，该方法包括：

分离这些重组抗体，由此相对于没有使用包括至少大约2g/L赖氨酸和/或精氨酸产生的重组抗体制品而言增加了该制品中K1或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

24.一种培养生产重组抗体的细胞的方法，该方法包括：

在包括至少大约2g/L赖氨酸和/或精氨酸的培养基中，在其中细胞表达一种重组抗体的条件下培养这些细胞。

25.如权利要求24所述的方法，进一步包括测量该培养中K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平。

26.如权利要求25所述的方法，进一步包括当K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的水平是预定水平时，将这些细胞从该培养中去除。

27.一种通过如权利要求5-11或14-23中任一项所述的方法生产的重组抗体。

28.一种包括至少大约2g/L的精氨酸或赖氨酸的细胞培养基。

29.一种细胞培养，包括：

表达重组抗体的细胞；以及

一种包括至少大约2g/L赖氨酸和/或精氨酸的培养基。

30.如权利要求29所述的细胞培养，其中该培养包括K0、K1、或K2赖氨酸变体中的一种或多种的目标值。

31.一种包括权利要求29的细胞培养的生物反应器。

32.一种生产重组抗体的方法，该方法包括：

在包括至少大约2g/L组氨酸的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组抗体的条件下培养该细胞；

分离该重组抗体；并且

测量该分离的重组抗体上的K0、K1、或K2赖氨酸残基中的一种或多种的水平。

33.一种生产重组抗体的方法，该方法包括：

在包括至少大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组抗体的条件下培养该细胞；

分离该重组抗体；并且

测量该分离的重组抗体上K0、K1、或K2赖氨酸残基中的一种或多种的水平。

34.一种生产重组抗体的方法，该方法包括：

在包括大约2mM NH₄Cl至大约10mM NH₄Cl的培养基中，在其中一种细胞表达一种重组抗体的条件下培养该细胞；

分离该重组抗体；并且

35.一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：

在一种培养基中培养细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(i)至少大约2g/L组氨酸；(ii)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖；以及(iii)大约2mM至大约10mM NH₄Cl；在其中这些细胞表达重组抗体的条件下；以及

36.如权利要求35所述的方法，其中该目标值是在产品说明书中阐明的水平。

37.如权利要求35所述的方法，其中该目标值是在相应的重组抗体的制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

38.如权利要求35所述的方法，进一步包括测量该制品中K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平。

39.一种生产重组抗体制品的方法，该方法包括：

在一种培养基中培养细胞，该培养基包括以下各项中的一个或多个：(i)至少大约2g/L组氨酸；(ii)大约0.5g/L葡萄糖至大约2g/L葡萄糖；以及(iii)大约2mM至大约10mM NH₄Cl；在其中这些细胞表达重组抗体的条件下；

从这些细胞或该培养基中分离这些重组抗体以生产一种制品；

测量该制品中这些重组抗体的K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平；以及

如果K0、K1、和/或K2赖氨酸变体的水平是目标值，则将该制品配制进入一种药物产品中。

40.一种制造药物抗体制品的方法，该方法包括：

提供用于一种治疗性重组抗体的C端赖氨酸变体的目标值，

提供包括编码一种重组抗体的轻链和重链的核酸的一种宿主细胞，

在以下条件下培养该宿主细胞(i)其中该细胞表达该编码的轻链和重链以形成该重组抗体并且(ii)增加该细胞的胞内pH，

从该细胞或细胞培养中分离该治疗性重组抗体的群，以及

如果该群包括C端赖氨酸变体的提供的目标值，那么将该分离的群配制进入一种药物产品中，

由此制造一种药物抗体制品。

41.如权利要求40所述的方法，其中相对于该群中的总重链，C端赖氨酸变体的目标值是C端包含赖氨酸的重链的预选择水平。

42.如权利要求40所述的方法，其中C端赖氨酸变体的目标值是该群中K1赖氨酸变体和/或K2赖氨酸变体的预选择水平。