KR20240021943A - 암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법 - Google Patents

암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20240021943A
KR20240021943A KR1020247001492A KR20247001492A KR20240021943A KR 20240021943 A KR20240021943 A KR 20240021943A KR 1020247001492 A KR1020247001492 A KR 1020247001492A KR 20247001492 A KR20247001492 A KR 20247001492A KR 20240021943 A KR20240021943 A KR 20240021943A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
ifn
masked
leu
gly
Prior art date
Application number
KR1020247001492A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 스토버
셰리 모리슨
알렉스 바수타사와트
캄 트린
Original Assignee
남미 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 남미 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 남미 테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20240021943A publication Critical patent/KR20240021943A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

마스킹된 IFN을 포함하는 융합 단백질 조성물 및 마스킹된 IFN을 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 결과적으로, 마스킹된 IFN은 Mab 또는 그의 결합 단편에 융합되고, 치료 양식으로서 환자에게 투여되고, 암, 면역학적 장애 및 다른 질환을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 6월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/259,105에 대해 우선권을 주장하며, 이의 내용은 완전히 본원에 참조로 포함된다.
종이 사본 및 ASCII 파일로의 서열 목록의 제출
하기 제출의 내용(들)은 그 전문이 완전히 본원에 참조로 포함된다: 2022년 6월 17일에 기록된 서열 목록의 종이 사본. 추가적으로, ASCII 텍스트 파일 (파일명: 1441-20003.40 - SEQ LIST - As-Filed XX-June-2022.txt, 기록일 2022년 6월 XX일, 크기: XXX KB)로의 사본 1 대체물이라는 명칭의 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF)의 내용 및 ASCII 텍스트 파일 (파일명: 1441-20003.40 - SEQ LIST - As-Filed XX-Jun-2022.txt, 기록일 2022년 6월 XX일, 크기: XXX KB)로의 사본 2 대체물이라는 명칭의 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF)의 내용.
연방정부 지원된 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리의 진술
해당되지 않음.
발명의 분야
본원에 기재된 발명은 암 요법 및 다른 면역학적 장애 또는 질환의 요법의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 종양 항원 결합 단백질에 융합되고 인간에서 표적화된 암 요법을 위한 비히클로서 사용될 수 있는 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFN) 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 장애 또는 질환, 예컨대 암 및 다른 면역학적 장애 및 질환의 치료에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 관상동맥 질환 다음으로 사망의 두번째로 선두적인 원인이다. 수백만 명의 사람들이 매년 암으로 죽고 있고, 미국에서만 암은 연간 50만 명이 넘는 사람들을 죽이고 있으며, 2017년에 새롭게 진단된 암 사례는 1,688,780건이다 (American Cancer Society). 심장 질환으로부터의 사망은 유의하게 감소하고 있었지만, 암으로부터 초래되는 사망은 일반적으로 상승하고 있다. 이번 세기의 초기에, 암은 의학 발달이 현재의 경향을 변화시키지 않는 한, 사망의 선두적인 원인이 될 것으로 예측된다.
몇몇 암은 높은 사망률을 갖는 것으로서 두드러진다. 골수종을 포함하는 혈액 악성종양은 미국에서만 연간 50,000건의 사망을 유발한다 (American Cancer Society, 2018). 또한, 폐 (전체 암 사망의 18.4%), 유방 (전체 암 사망의 6.6%), 결장직장 (전체 암 사망의 9.2%), 간 (전체 암 사망의 8.2%), 및 위 (전체 암 사망의 8.2%)의 암종은 전세계적으로 모든 연령에서 모든 성별에 대한 암 사망의 주요한 원인을 나타낸다 (GLOBOCAN 2018). 이들 및 사실상 모든 다른 암종은 이들이 원발성 종양으로부터 먼 부위로 전이된다는 점에서 공통적인 치명적 특색을 공유하며, 매우 소수의 예외가 있지만, 전이성 질환은 치명적이다. 더욱이, 심지어 처음에 원발성 암에 생존한 암 환자에 대해서도, 공통적인 경험은 그들의 삶이 극적으로 변화됨을 나타내었다. 많은 암 환자는 재발에 대한 잠재성 또는 치료 실패의 의식에 의해 유래되는 강한 불안을 경험한다. 많은 암 환자는 또한 치료 후에도 신체적 쇠약을 경험한다. 더욱이, 많은 암 환자는 질환의 재발을 경험한다.
암 요법은 과거 수십 년에 걸쳐 개선되었고 생존율은 증가하였지만, 암의 이질성은 복수개의 치료 양식을 이용하는 새로운 치료 전략을 여전히 요구한다. 이는 특히 때때로 표준 방사선요법 및/또는 화학요법에 제한되는 해부학적으로 중요한 부위에서의 고형 종양 (예를 들어, 교모세포종, 두경부의 편평 암종 및 폐 선암종)을 치료하는데 있어서 사실이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 요법의 유해한 효과는 화학- 및 방사선 저항성이며, 이는 환자의 삶의 질을 감소시키는 중중 부작용 외에도, 국소-영역 재발, 원거리 전이 및 제2 원발성 종양을 촉진시킨다.
더욱이, 모노클로날 항체 (mAb)의 치료 유용성 (G. Kohler and C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975))이 실현되고 있다. 모노클로날 항체는 이식, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환, 및 염증에서의 요법으로서 현재 승인되었다. 상이한 이소타입은 상이한 이펙터 기능을 갖는다. 이러한 기능의 차이는 다양한 이뮤노글로불린 이소타입에 대한 별개의 3차원 구조에서 반영된다 (P. M. ALZARI, et al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)).
추가적으로, IFNα 및 IFNβ (유형 I) 및 IFNγ (유형 II)를 포함하는 인터페론은 많은 암에 대한 직접적 항-증식 효과 뿐만 아니라 다수의 항-종양 면역치료 효과 둘 다를 갖는 항암 면역의 필수적인 매개자이다. 그러나, IFNα는 다수의 인간 암에 대해 효능을 나타내었지만, 지금까지 그의 임상적 유용성은 전신 독성을 유발하지 않으면서 종양 부위에서 IFN의 유효 농도를 달성할 수 없기 때문에 제한되었다.
전신 독성으로 인해, 몇몇 그룹은 IFN을 종양 부위에 직접 운반하는 모노클로날 항체의 종양-표적화 능력을 사용함으로써 이 문제에 접근하였다. 문헌 [Huang, et al., J. Immunol. 179(10), pp. 6881-6888 (2007)] 및 [Vasuthasawat, et al., J. Immunol. 36(5), pp. 305-318 (2013)]을 참조한다. 초기 연구는 IFNα를 림프종 상에 발현되는 CD20에 표적화하는 항-CD20-IFNα2 단백질 및 다발 골수종 상에 발현되는 CD138을 표적화하는 항-CD138-IFNα2 융합 단백질을 사용하였음이 주목된다. 문헌 [Vasuthasawat, et al., MAbs 8(7), pp. 1386-1397 (2016)]을 참조한다. 이러한 접근법은 큰 치료 전망을 나타내었고, 현재 인간 임상 시험에서 시험되고 상업적으로 개발되고 있지만, 몇몇 결점이 있다.
표적 종양-연관 항원에 대한 항체 결합 특이성을 사용하는 것은 IFN이 그 자체로 주사되는 경우 달성되는 것보다 더 큰 백분율 (%)의 IFN을 종양의 부위에 전달함이 주목되지만, 부착된 인터페론은 종양 연관되지 않은 신체 전반에 걸쳐 발현되는 인터페론 수용체에 의해 여전히 인식되고 결합된다. 따라서, Mab-융합된 IFN은 여전히 독성을 유도할 수 있고/거나 전신 노출 및 신체 전반에 걸쳐 IFN 수용체와의 상호작용으로 인해 증가된 청소를 가질 수 있다.
상기 언급된 것으로부터, 암 및 면역학적 질환의 치료에 새로운 치료 패러다임이 필요함이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다.
IFN을 암 세포에 전달하는 것과 연관된 현재의 결점을 고려하여, 본 발명의 목적은 IFN의 활성을 그것이 종양에 도달할 때까지 억제하는 마스킹된 IFN을 이용한 암(들), 면역학적 장애, 및 다른 질환을 치료하는 새롭고 개선된 방법을 제공하는 것이다. 이러한 필요를 충족시키는 조성물, 키트 및 사용 방법이 제공된다.
본 발명은 폭넓은 종양 연관 항원 (TAA)에 결합하는 항체, 항원-결합 단편, 및 융합 단백질 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 융합 단백질 조성물은 유형 I 인터페론을 포함한다. 추가의 실시양태에서, IFN은 마스킹되며, 따라서 그의 활성은 그것이 종양 세포에 도달할 때까지 감소되거나 무효화된다. 추가의 실시양태에서, TAA는 표 I에 제시된다. 바람직한 실시양태에서, TAA는 고형 종양과 연관된다. 한 실시양태에서, TAA는 CD138을 포함한다. 추가의 실시양태에서, TAA는 CD20이다. 추가의 실시양태에서, TAA는 메소텔린이다. 또 다른 실시양태에서, TAA는 5T4이다. 또 다른 실시양태에서, TAA는 FAP이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, IFN 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체는 표 II에 제시된다. 바람직한 실시양태에서, IFN은 IFNA2를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적화된 마스킹된 IFN을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적화된 마스킹된 IFN은 IFNA1을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적화된 마스킹된 IFN을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적화된 마스킹된 IFN은 IFNA14를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적화된 마스킹된 IFN을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 표적화된 마스킹된 IFN은 IFNB1을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 표적화된 마스킹된 IFN을 생산하는 방법을 교시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 인간에서 암(들), 면역학적 장애, 및 다른 질환을 치료하는 방법을 교시한다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용은 TAA에 결합하는 MAb에 융합된 마스킹된 IFN으로 암을 치료하는 방법을 교시한다.
일부 임의의 실시양태에서, 암을 치료하는 방법(들)은 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 임의의 융합 단백질, 예컨대 임의의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 대상체, 예컨대 인간 대상체에게 투여하는 것을 수반한다.
또한, 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 임의의 융합 단백질, 예컨대 임의의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일부 임의의 실시양태에서, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이다. 일부 임의의 실시양태에서, 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 암은 조혈계에서 발생한다. 일부 임의의 실시양태에서, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함한다.
또한, 키트, 예컨대 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 임의의 융합 단백질, 예컨대 임의의 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 키트가 제공된다.
도 1. IFNAR2의 아미노산 서열. 신호 서열은 회색이다. 이들이 유형 I 인터페론과의 상호작용의 영역임을 지시하는 결정 구조 데이터에 기반하여 마스킹 펩티드로서 선택된 펩티드는 밑줄친다.
도 2. IFNα 마스킹 펩티드(들).
도 3. 융합 단백질(들) 및 마스킹 펩티드(들)의 설명.
도 4. 융합 단백질(들) 및 마스킹 펩티드(들)의 설명.
도 5. 마트립타제(Matriptase) ST 14는 항-CD138 융합 Ab의 중쇄로부터 복수개의 IFNa 마스크(들)를 절단한다.
도 6. 마스킹된 항-CD138 (마스크 1) 융합 Ab 및 마스킹된 항-CD138 (마스크 2) 융합 Ab는 언마스킹된 융합 단백질에 비해 감소된 친화도로 IFNα2 수용체에 결합한다.
도 7. 마스킹된 항-CD138 (마스크 1) 융합 Ab 및 마스킹된 항-CD138 (마스크 2) 및 마스킹된 항-CD138 (마스크 3) 융합 Ab는 언마스킹된 융합 단백질에 비해 감소된 친화도로 IFNα2 수용체에 결합한다.
도 8. 마스킹된 항-CD138 (마스크 1) 융합 Ab, 마스킹된 항-CD138 (마스크 2), 마스킹된 항-CD138 (마스크 2.2), 및 마스킹된 항-CD138 (마스크 3) 융합 Ab는 언마스킹된 융합 단백질에 비해 감소된 친화도로 IFNα2 수용체에 결합한다.
도 9. ELISA에 의한 마스크(들)에의 융합 Ab의 결합. 도 9는 마스크 (펩티드 6)에의 결합을 나타낸다.
도 10. 마스킹된 항-5T4 (마스크 1) 및 마스킹된 항-메소텔린 (마스크 1) 융합 Ab는 언마스킹된 항-CD138 융합 단백질에 비해 감소된 친화도로 IFNα2 수용체에 결합한다.
도 11 (A-B). 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 11(A)는 MST를 갖지 않는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1 및 마스크 2)를 제시한다. 도 11(B)는 MST를 갖는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1 및 마스크 2)를 제시한다.
도 12 (A-B). 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 12(A)는 MST를 갖는 및 MST를 갖지 않는 항-CD138 융합 Ab 및 항-5T4 마스크 1을 제시한다. 도 12(B)는 MST를 갖는 및 MST를 갖지 않는 항-CD138 융합 Ab 및 항-메소텔린 마스크 1을 제시한다.
도 13 (A-B). 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 13(A)는 MST를 갖지 않는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 및 마스크 3)를 제시한다. 도 13(B)는 MST를 갖는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 및 마스크 3)를 제시한다.
도 14 (A-B). 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 14(A)는 MST를 갖지 않는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 마스크 2.2, 및 마스크 3)를 제시한다. 도 14(B)는 MST를 갖는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 마스크 2.2, 및 마스크 3)를 제시한다.
도 15 (A-C). 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 15(A)는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1, 마스크 1 N297Q, MST를 갖는(w/ MST) 마스크 1, 및 MST를 갖는 마스크 1 N297Q)를 제시한다. 도 15(B)는 항-CD138 융합 Ab (마스크 2.2, 마스크 2.2 N297Q, MST를 갖는 마스크 2.2, 및 MST를 갖는 마스크 2.2 N297Q)를 제시한다. 도 15(C)는 항-CD138 융합 Ab (마스크 3, 마스크 3.2 N297Q, MST를 갖는 마스크 3, 및 MST를 갖는 마스크 3.2 N297Q)를 제시한다.
도 16. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 16(A)는 항-CD138 융합 Ab (마스크 1 N297Q, MST를 갖는 마스크 1 N297Q, 마스크 3.2 N297Q, 및 MST를 갖는 마스크 3.2 N297Q)를 제시한다.
도 17. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 IP-10의 유도.
도 18. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 IP-10의 유도.
도 19. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 글리코실화된 마스크 대 비글리코실화된 마스크의 비교 분석.
도 20. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 IP-10의 용량 의존적 유도.
도 21. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 글리코실화된 마스크 대 비글리코실화된 마스크의 용량 의존적 비교 분석.
도 22. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 글리코실화된 마스크 대 비글리코실화된 마스크의 용량 의존적 비교 분석.
도 23. ELISA를 사용한 인간 말초 혈액 단핵 세포 ("PMBC")에서의 글리코실화된 마스크 대 비글리코실화된 마스크 MCP-1 유도의 용량 의존적 비교 분석.
도 24. QXL138AM2.2 경쇄의 특징 및 서열 정보.
도 25. 비글리코실화된 QXL138AM2.2 중쇄 아미노산의 서열 정보.
도 26. 비글리코실화된 QXL138AM2.2 중쇄 핵산의 서열 정보.
도 27. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 28. ELISA를 사용한 인간 PBMC에서의 IP-10의 용량 의존적 유도.
도 29. 비글리코실화된 마스킹된 2.2 융합 단백질은 언마스킹된 비글리코실화된 2.2 융합 단백질에 비해 감소된 친화도로 IFNα2 수용체에 결합한다.
도 30. ELISA를 사용한 인간 PBMC에서의 IP-10의 용량 의존적 유도.
도 31. 가용성 CD138에의 QXL138AM2.2-N297Q 결합.
도 32. 가용성 CD138에의 QXL138AM2.2-N297Q의 다중 제조 로트 (로트 2 및 로트 3)의 결합 비교.
도 33. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 34. QXL138AM2.2-N297Q의 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 35. PBMC에서의 IP-10 유도의 감소 및 복원.
도 36. 생체내에서의 OVCAR3 세포에서의 QXL138AM의 종양 억제.
도 37. 생체내에서의 H929 세포에서의 QXL138AM의 종양 억제.
도 38. 생체내에서의 Capan-2 세포에서의 QXL138AM의 종양 억제.
도 39. 추가적인 IFNα 마스킹 펩티드(들).
도 40. 추가적인 융합 단백질(들) 및 마스킹 펩티드(들)의 설명.
도 41. 추가적인 융합 단백질(들) 및 마스킹 펩티드(들)의 설명.
도 42. 마트립타제 ST 14는 항-CD138-IFNα 융합 Ab의 중쇄로부터 IFNa 마스킹된 YNS 돌연변이체를 절단한다.
도 43. ELISA에 의한 마스크(들)에의 융합 Ab의 결합.
도 44. ELISA에 의한 마스크(들)에의 융합 Ab의 결합.
도 45. ELISA에 의한 마스크(들)에의 융합 단백질(들)의 결합.
도 46. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 47. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 48. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 49. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 50. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 51. PBMC에서의 IP-10 유도의 감소 및 복원.
도 52. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 53. 마트립타제 ST 14는 항-CD138-IFNα 융합 Ab의 중쇄로부터 QXL138AM4.2-N297Q 상의 마스크 4를 절단한다.
도 54. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 55. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 56 (A-B). 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법. 도 56(A)는 QXL138A-N297Q, QXL138AM2.2-N297Q (로트 10), 및 QXL138AM4.2-N297Q를 제시한다. 도 56(B)는 QXL138A-N297Q, QXL138AM2.2-N297Q (로트 10) + MST, 및 QXL138AM4.2-N297Q + MST를 제시한다.
도 57. 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
도 58. PBMC에서의 IP-10 유도의 감소 및 복원.
도 59. QXL138AM4.2 중쇄 아미노산의 특징 및 서열 정보.
도 60. QXL138AM4.2 중쇄 핵산의 특징 및 서열 정보.
도 61. QXL138YNS4.2-N297Q 중쇄 아미노산의 특징 및 서열 정보.
도 62. QXL138YNS4.2-N297Q 중쇄 핵산의 특징 및 서열 정보.
인터페론 (IFN)을 포함하는 융합 단백질 및 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 융합 단백질 및 조성물은 IFN 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 종양-연관 항원 (TAA)에 대해 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인터페론은 유형 I IFN이다. 일부 측면에서, 제공된 융합 단백질 및 조성물은 IFN 및 마스크, 예컨대 IFN 및 그의 수용체, 예를 들어, IFN-α 수용체 (IFNAR) 사이의 상호작용을 차단하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 융합 단백질 또는 조성물은 IFN, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 마스크를 포함한다. 일부 임의의 제공된 실시양태에서, 융합 단백질 또는 조성물은 또한 가요성 펩티드 링커를 함유한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 또는 조성물은 또한 프로테아제 절단 부위, 예컨대 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 함유한다. 일부 측면에서, 예를 들어 종양의 부위에서 또는 그 부근에서 또는 종양 미세환경 (TME)에서 프로테아제 절단 부위의 절단은 IFN의 "언마스킹"을 초래하고 그의 수용체에의 IFN의 결합을 허용할 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어, TAA에 대해 특이적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 융합 단백질 또는 조성물을 종양 또는 암의 특정한 부위 또는 위치에 표적화할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 제공된 융합 단백질 및 조성물은 질환 또는 장애, 예컨대 암 또는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 융합 단백질 또는 조성물을 제조하는 방법, 예컨대 치료의 방법에서 또는 치료 방법에서 이러한 융합 단백질 또는 조성물을 사용하는 것에 관한 방법, 및 이러한 융합 단백질 또는 조성물을 포함하는 제약 조성물 또는 키트가 제공된다.
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 제공된 실시양태는 그의 활성이 그것이 종양의 부위에 도달할 때까지 유의하게 감소되고/거나 제거되므로, 비-특이적 활성이 최소화되고, 융합 단백질이 종양 부위에 있지 않은 인터페론 수용체에 의해 트랩되지 않는 마스킹된 IFN을 포함하는, 몇몇 이유에서 이용가능한 접근법에 비해 고유한 이점을 제공한다. 종양의 부위에서, 마스크는 제거될 수 있고, IFN의 결합 및 활성은 재-활성화되며, 이는 종양에서의 효능을 최대화하고, 독성을 증가시키지 않으면서 융합 단백질의 유효 농도를 증가시킬 수 있다. 또한, IFN에 부착된 항체에 의해, 융합 단백질은 특이적 종양 (예를 들어, 항체에 의해 특이적으로 결합된 TAA를 발현하는 종양)에 표적화될 수 있다. 특이적 표적화는 IFN이 관심의 암에 지정되고 비-암성 또는 비-종양성 조직을 회피할 기회가 보다 크게 한다.
섹션의 개요
I.) 정의
II.) 항체
III.) 인터페론(들)
IV.) IFN을 마스킹하는 방법
a. 이용가능한 접근법의 논의
b. 본 개시내용의 IFN을 마스킹하는 방법
i. IFNα 마스킹 펩티드 및 마스킹 구축물
V.) 종양 연관 항원 (TAA)을 발현하는 암(들)의 치료
VI.) 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 칵테일
VII.) 조합 요법
VIII.) 키트/제조품
본 출원에 언급된 특허 문서, 과학 기사, 및 데이터베이스를 포함하는 모든 간행물은 각각의 개별적 간행물이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함되는 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물에 제시된 정의와 반대되거나 또는 다른 방식으로 불일치하는 경우, 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함되는 정의에 우선한다.
본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
I.) 정의:
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기 및 다른 과학 용어 또는 용어들은 본 발명이 관련되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에서 이러한 정의의 포함은 반드시 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되지는 않아야 한다. 본원에 기재되거나 언급된 많은 기법 및 절차는 널리 이해되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의한 통상적인 방법론, 예컨대, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 폭넓게 이용되는 분자 클로닝 방법론을 사용하여 통상적으로 채용된다. 적절하게는, 상업적으로 입수가능한 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 달리 언급되지 않는 한, 일반적으로 제조업체가 정의한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행된다.
상표명이 본원에서 사용되는 경우, 상표명에 대한 언급은 또한 맥락에 의해 달리 지시되지 않는 한, 제품 제제, 제네릭 약물, 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들)을 지칭한다.
용어 "진행성 암", "국소 진행성 암", "진행성 질환" 및 "국소 진행성 질환"은 관련된 조직낭을 통해 확대된 암을 의미하며, 미국 비뇨기과 협회(American Urological Association) (AUA) 시스템 하의 단계 C 질환, 화이트모어-주이트(Whitmore-Jewett) 시스템 하의 단계 C1-C2 질환, 및 TNM (종양, 절, 전이) 시스템 하의 단계 T3-T4 및 N+ 질환을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 국소 진행성 질환을 갖는 환자에 대해 수술은 권고되지 않으며, 이들 환자는 임상적으로 국재화된 (기관-국한된) 암을 갖는 환자에 비해 실질적으로 덜 바람직한 결과를 갖는다.
"천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것"은 본원의 목적상 천연 항체 서열에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 삭제하는 것 (기저의 글리코실화 부위를 제거함으로써 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 삭제함으로써), 및/또는 천연 항체 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미하는 것으로 의도되고, 여기서 "천연 글리코실화 패턴"은 사용된 항체 서열, 세포 유형, 및 성장 조건의 특정한 조합으로부터 초래되는 자연적인 번역후 글리코실화 패턴을 지칭한다. 또한, 상기 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 모이어티의 성질 및 비율의 변화를 수반하는, 천연 단백질의 글리코실화의 정성적 변화를 포함한다.
용어 "유사체"는 또 다른 분자 (예를 들어, TAA-관련 단백질)와 구조적으로 유사하거나, 유사한 또는 상응하는 속성을 공유하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, TAA 단백질의 유사체는 TAA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 T 세포에 의해 특이적으로 결합될 수 있다.
용어 "항체"는 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서, "항체"는 통상적인 하이브리도마 또는 트랜스제닉 마우스 기술에 의해 생산된 천연 발생 또는 합성, 예컨대 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 이들 항체의 항원-결합 도메인 및/또는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 함유하는 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 TAA에 특이적으로 결합하고/거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체 또는 그의 단편을 지칭하고, 이들이 TAA에 특이적으로 결합하고/거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 커버한다. 임의의 특이적 항체는 본원에서 제공된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서 용어 "항체"는 조합으로 표적 항원에 대한 특이적 결합 부위를 형성하는 경쇄 이뮤노글로불린 분자로부터의 적어도 하나의 가변 영역 및 중쇄 분자로부터의 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 분자를 포괄한다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 예를 들어, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 항체 또는 임의의 공지된 항체 이소타입이다. 본 방법 및 조성물에 유용한 항체는 세포 배양에서, 파지에서, 또는 소, 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 및 유인원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동물에서 생성될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유동물 항체이다. 파지 기법은 초기 항체를 단리하는데 또는 변경된 특이성 또는 결합력 특징을 갖는 변이체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 기법은 통상적이고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 항체는 관련 기술분야에 공지된 재조합 수단에 의해 생산된다. 예를 들어, 재조합 항체는 숙주 세포를 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 형질감염시킴으로써 생산될 수 있다. 하나 이상의 벡터는 숙주 세포에서 적어도 하나의 VL 및 적어도 하나의 VH 영역을 발현하는 DNA 서열을 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 항체 생성 및 생산의 재조합 수단의 예시적인 설명은 문헌 [Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997)]; [Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000)]; [Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993)]; 및 [CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, most recent edition)]을 포함한다. 본 발명의 항체는 원하는 기능을 매개하는데 있어서 항체의 효능을 증가시키는 재조합 수단에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 항체가 재조합 수단을 사용한 치환에 의해 변형될 수 있음은 본 발명의 범주 내에 있다. 전형적으로, 치환은 보존적 치환일 것이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역 내의 적어도 하나의 아미노산은 상이한 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821, 미국 특허 번호 6,194,551, 출원 번호 WO 9958572; 및 문헌 [ANGAL, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993)]을 참조한다. 아미노산의 변형은 아미노산의 결실, 부가, 및 치환을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변화는 원하지 않는 활성, 예를 들어, 보체-의존성 세포독성을 감소시키기 위해 이루어진다. 빈번히, 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질을 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결시킴으로써 표지된다. 폭넓게 다양한 표지 및 접합 기법은 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌 둘 다에 광범위하게 보고되어 있다. 이들 항체는 정상 또는 결함성 TAA에의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996)]을 참조한다. 원하는 생물학적 활성을 갖는 적합한 항체는 증식, 이동, 부착, 연한천 성장, 혈관신생, 세포-세포 통신, 아폽토시스, 수송, 신호 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는 시험관내 검정, 및 종양 성장의 억제와 같은 생체내 검정을 사용하여 확인될 수 있다. 본원에서 제공된 항체는 또한 진단 적용에 유용할 수 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 이들은 수용체-결합 또는 항원의 생물학적 활성을 억제하지 않으면서 특이적 항원에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 중화 항체로서, 항체는 경쟁적 결합 검정에 유용할 수 있다. 이들은 또한 TAA 또는 그의 수용체를 정량화하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항체 단편" (또는 간단히 "항체 부분")은 TAA 항원 (예를 들어, CD138, CD20, 메소텔린, 5T4 및 그의 변이체; 또한 표 I 참조)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 TAA 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 제시되었다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)로서 생성되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득되며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 용어 "Fc"는 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 영역을 지칭한다.
본원에 사용된 임의의 형태의 "항원"은 TAA에 대해 특이적인 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 유발 항원은 단독으로 또는 관련 기술분야에 공지된 1종 이상의 면역원성 증진제와 조합으로 단일 에피토프, 다중 에피토프, 또는 전체 단백질일 수 있다. 유발 항원은 단리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 항원의 적어도 부분으로 형질감염된 세포로 면역화함), 또는 가용성 단백질 (예를 들어, 단백질의 세포외 도메인 부분만으로 면역화함)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생산될 수 있다. 항원을 코딩하는 DNA는 게놈 또는 비-게놈 (예를 들어, cDNA)일 수 있으며, 세포외 도메인 또는 세포내 도메인의 적어도 부분을 코딩한다. 항원의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "부분"은 적절하게, 관심의 항원의 면역원성 에피토프를 구성하는 최소 수의 아미노산 또는 핵산을 지칭한다. 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 양이온성 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관심의 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전적 벡터가 채용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원의 방법 및 조성물의 항체는 관심의 TAA의 세포외 도메인의 적어도 부분에 특이적으로 결합한다.
본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 "생물활성제"를 구성하거나 그의 일부일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "생물활성제"는 항원에 결합하고/거나 원하는 생물학적 효과를 증진시키거나 매개하여 세포-살해 독소를 증진시키는 임의의 합성 또는 천연 발생 화합물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 유 용한 결합 단편은 생물학적으로 활성인 단편이다. 본원에 사용된 용어 "생물학적으로 활성인"은 원하는 항원성 에피토프에 결합하고 생물학적 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 발휘할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 직접적 효과는 성장 신호의 조정, 자극, 및/또는 억제, 항-아폽토시스 신호의 조정, 자극, 및/또는 억제, 아폽토시스 또는 괴사 신호의 조정, 자극, 및/또는 억제, ADCC 캐스케이드의 조정, 자극, 및/또는 억제, 및 CDC 캐스케이드의 조정, 자극, 및/또는 억제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 아미노산 및/또는 아미노산 서열의 치환을 지칭하며, 일반적으로 결과로 얻어진 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역 내의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않음을 인식하고 있다 (예를 들어, 문헌 [Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)] 참조). 이러한 예시적인 치환은 바람직하게는 표(들) III에 제시된 아미노산에 따라 이루어진다. 예를 들어, 이러한 변화는 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L) 중 임의의 것을 이들 소수성 아미노산 중 임의의 다른 것에 대해 치환하는 것; 아스파르트산 (D)을 글루탐산 (E)에 대해 치환하는 것 (및 그 역도 마찬가지임); 글루타민 (Q)을 아스파라긴 (N)에 대해 치환하는 것 (및 그 역도 마찬가지임); 및 세린 (S)을 트레오닌 (T)에 대해 치환하는 것 (및 그 역도 마찬가지임)을 포함한다. 다른 치환은 특정한 아미노산의 환경 및 단백질의 3차원 구조에서의 그의 역할에 따라 또한 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A)은, 알라닌 (A) 및 발린 (V)이 그럴 수 있는 것처럼 빈번히 상호교환가능할 수 있다. 상대적으로 소수성인 메티오닌 (M)은 빈번히 류신 및 이소류신과, 때때로 발린과 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R)은 아미노산 잔기의 중요한 특색이 그의 전하이며, 이들 2개의 아미노산 잔기의 상이한 pK는 중요하지 않은 위치에서 빈번히 상호교환가능하다. 추가의 다른 변화는 특정한 환경에서 "보존적"인 것으로 간주될 수 있다 (예를 들어, 본원의 표 III; 문헌 [pages 13-15 "Biochemistry" 2nd ED. Lubert Stryer ed. (Stanford University)]; [Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919]; [Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6] 참조). 다른 치환은 또한 허용가능하며, 경험적으로 또는 공지된 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "융합 단백질"은 관련 기술분야에 공지된 링커 및 방법을 사용하여 C-말단에서 본 발명의 IFN에 융합된 본 발명의 단백질을 의미한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 U.S. 9,803,021을 참조한다. IFN을 본 발명의 단백질에 융합시키는데 사용될 수 있는 예시적인 링커는 (i) GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호(SEQ ID NO): 1); (ii) GGGGS (서열식별번호: 2); (iii) SGGGGS (서열식별번호: 3); AGAAAKGAAAKAG (서열식별번호: 4); SGGAGGS (서열식별번호: 5); 란다르(Landar); 이중 란다르; 1qo0E_1; IgG3 힌지; IgG3 힌지Δcys; 및/또는 IgG1 힌지Δcys를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "의 억제"는 측정가능한 양만큼 감소시키는 것, 또는 전적으로 방지하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "인터페론"은 몇몇 바이러스의 존재에 대한 반응으로 숙주 세포에 의해 제조되고 방출되는 신호전달 단백질의 그룹을 의미한다. 전형적인 시나리오에서, 바이러스-감염된 세포는 인터페론을 방출하여 인근의 세포가 그들의 항-바이러스 방어를 고조시키는 것을 유발할 것이다. IFN은 병원체를 근절시키는 것을 돕는 면역계의 보호적 방어를 촉발시키는 세포 사이의 통신에 사용되는 분자인 시토카인으로 공지된 단백질의 큰 부류에 속한다.
본원에 사용된 용어 "유형 1 인터페론" 또는 "유형 I 인터페론"은 면역계의 활성을 조절하는 것을 돕는 인터페론 단백질의 큰 하위그룹을 의미한다. 모든 유형 I IFN은 IFNAR1 및 IFNAR2 쇄로 이루어진 IFN-α 수용체 (IFNAR)로 공지된 특이적 세포 표면 수용체 복합체에 결합한다. 본 개시내용의 유형 I 인터페론의 예시적인 목록은 표 II에 제시된다.
용어 "포유동물"은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 및 인간을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 유기체를 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 포유동물은 마우스이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
마스킹된 IFN (또한 "마스킹된" IFN으로 표시됨)에 대해 용어 "마스크"는 본 발명의 목적상, 시토카인 상호작용 및/또는 IFNAR의 활성화를 차단하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 의미한다. "마스크"는 재조합 수단을 사용한 치환에 의해 변형될 수 있음은 본 발명의 범주 내에 있다. 아미노산의 변형은 아미노산의 결실, 부가, 및 치환을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "표적화된 마스킹된 IFN"은 폴리펩티드가 IFN의 카르복시 말단에 부착되어, 그에 의해 IFNAR에 결합하는 능력을 감소시키는 유형 I 인터페론을 의미한다. 마스킹된 IFN은 표적화된 결합 단백질 (즉, 항체)의 카르복시 말단에의 부착을 추가로 포함한다. "표적화된 마스킹된 IFN(들)이 재조합 수단을 사용한 치환에 의해 변형될 수 있음은 본 발명의 범주 내에 있다. 아미노산의 변형은 아미노산의 결실, 부가, 및 치환을 포함한다.
용어 "전이성 암" 및 "전이성 질환"은 국지적 림프절로 또는 먼 부위로 확산된 암을 의미하며, AUA 시스템 하의 단계 D 질환 및 TNM 시스템 하의 단계 TxNxM+를 포함함을 의미한다.
"분자 인식"은 숙주 분자가 제2 분자 (즉, 게스트)와 복합체를 형성할 수 있는 화학적 사건을 의미한다. 이 과정은 수소 결합, 소수성 상호작용, 이온성 상호작용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-공유 화학 결합을 통해 일어난다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개별적 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원성 에피토프에 대해 지정된다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지정된 (또는 그에 대해 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 다수의 항원성 에피토프를 함유하는 단일 항원 내에 상이한 에피토프 특이성, 친화도, 또는 결합력을 갖는 복수개의 모노클로날 항체를 함유한다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동질 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 지시하며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 통상적으로 ELISA에 의해 결정된 적어도 약 1 μM, 보다 통상적으로 적어도 약 300 nM, 전형적으로 적어도 약 30 nM, 바람직하게는 적어도 약 10 nM, 보다 바람직하게는 적어도 약 3 nM 또는 그보다 좋은 Kd로 통상적으로 결합할 것이다.
"제약상 허용되는"은 비-독성, 불활성, 및/또는 인간 또는 다른 포유동물과 생리학적으로 혼화성인 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 또는 "단일 쇄" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해서는, 문헌 [Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "특이적", "특이적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하다"는 표적 항원 에피토프에의 항체의 선택적 결합을 지칭한다. 항체는 적절한 항원에의 결합을 주어진 조건의 세트 하에서 무관한 항원 또는 항원 혼합물에의 결합과 비교함으로써 결합의 특이성에 대해 시험될 수 있다. 항체가 무관한 항원 또는 항원 혼합물에 대해서보다 적절한 항원에 적어도 2배, 5배, 7배, 및 바람직하게는 10배 더 많이 결합하는 경우, 이는 특이적인 것으로 간주된다. 한 실시양태에서, 특이적 항체는 단지 TAA 항원에만 결합하지만, 무관한 항원에는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 항체는 인간 TAA 항원에 결합하지만, TAA 항원과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 아미노산 상동성을 갖는 비-인간 TAA 항원에는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 항체는 인간 TAA 항원에 결합하지만, TAA 항원의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 퍼센트 동일성을 갖는 비-인간 TAA 항원에는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 항체는 인간 TAA 항원에 결합하고 뮤린 TAA 항원에 결합하지만, 인간 항원에 더 큰 정도로 결합하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 항체는 인간 TAA 항원에 결합하고 영장류 TAA 항원에 결합하지만, 인간 항원에 더 큰 정도로 결합하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 항체는 인간 TAA 항원 및 임의의 비-인간 TAA 항원에 결합하지만, 인간 항원에 더 큰 정도로 결합하는 것 또는 이들의 임의의 조합이다.
본원에 사용된 "치료하는 것" 또는 "치료적" 및 문법적으로 관련된 용어는 질환의 임의의 결과의 임의의 개선, 예컨대 연장된 생존, 더 적은 이환율, 및/또는 대안적인 치료 양식의 부산물인 부작용의 감소를 지칭하며; 관련 기술분야에 용이하게 인식된 바와 같이, 질환의 완전한 근절은 바람직하지만, 치료 작용을 위한 요건은 아니다.
II.) 항체
일부 실시양태에서, 제공된 융합 단백질, 예컨대 표적화된 마스킹된 인터페론 (IFN), 및 조성물은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 임의의 제공된 실시양태에서, 항체는 질환 또는 장애, 예컨대 암 또는 면역학적 장애 또는 질환과 연관된 항원, 예컨대 종양 연관 항원 (TAA)인 항원에 결합하고, 예컨대 특이적으로 결합하고, 이를 인식하고, 표적화한다. 일부 측면에서, 항원 (예를 들어, TAA)에의 결합에 의해, 제공된 융합 단백질, 예컨대 표적화된 마스킹된 IFN은 요법을 위한 관련된 물리적 위치, 예컨대 암 또는 종양의 영역에 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 예를 들어, 본원에서 제공된 임의의 표적화된 IFN, 항체-IFN 융합 단백질 또는 표적화된 마스킹된 IFN에서, 본원에서 제공된 임의의 융합 단백질에 대한 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 측면은 암 또는 종양과 연관된 항원, 예컨대 종양 연관 항원 (TAA) 및 TAA-관련 단백질에 결합하는 항체를 제공한다 (표 I 참조). 한 실시양태에서, TAA-관련 단백질에 결합하는 항체는 표 I에 제시된 단백질의 아미노산을 포함하는 TAA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이다. 예를 들어, 표 I에 제시된 단백질 중 하나의 아미노산 서열을 포함하는 TAA 단백질에 결합하는 항체는 TAA-관련 단백질, 예컨대 TAA 변이체 및 그의 동족체 또는 유사체에 결합할 수 있다.
일부 측면에서, TAA 또는 TAA-관련 단백질에 결합하는 항체, 예컨대 제공된 실시양태의 항-TAA 항체는 특히 암에서, 예측적 검정, 영상화, 진단, 및 치료 방법론을 위해 유용하다. 일부 측면에서, 제공된 실시양태의 항체는 치료 항체, 예를 들어, TAA, 예컨대 표 I에 제시된 TAA에 특이적으로 결합하는 치료 항체이다. 유사하게, 이러한 항체는 (예를 들어, 치료제와 조합되는 경우, 융합 단백질에서, 암, 예컨대 난소암, 두경부암, 다발 골수종, 및 다른 암의 치료, 및/또는 예측에서, TAA가 또한 이들 다른 암에서 발현되거나 과발현되는 정도까지 유용하다. 더욱이, 세포내로 발현된 항체 (예를 들어, 단일 쇄 항체)를 포함하는 제공된 실시양태의 항체는 TAA의 발현이 관여하는 암, 예컨대 고형 종양에서의 진행성 또는 전이성 암 또는 다른 진행성 또는 전이성 암을 치료하는데 있어서 치료적으로 유용하다. 한 실시양태에서 암의 검출에, 예를 들어, 면역검정에 사용하기 위한 TAA 결합 검정이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 제공된 융합 단백질 또는 조성물은 종양 연관 항원 (TAA), 예를 들어 표 I에 제시된 예시적인 TAA로부터 선택되는 TAA에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, TAA는 종양의 표면, 예컨대 종양 세포 또는 암 세포의 표면 상에 발현되는 항원이다. 일부 실시양태에서, TAA는 본원에 기재된 임의의 질환 또는 상태, 예컨대 본원에 기재된 임의의 암과 연관된 임의의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, TAA는 종양과 연관된 세포, 예컨대 종양 미세환경 (TME)에 존재하는 세포의 표면 상에 발현되는 항원이다. 일부 실시양태에서, TAA는 TME에 존재하는 항원이다.
일부 실시양태에서, 제공된 융합 단백질 또는 조성물은 조혈계에서 발생하는 종양, 예컨대 혈액 악성종양과 연관된 종양 연관 항원에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 융합 단백질 또는 조성물은 CD138 항원에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 표 I에 제시된 TAA 중 하나에 결합하며, 예컨대 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 융합 단백질을 포함하거나 그에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체는 본원에서 제공된 임의의 융합 단백질 또는 조성물에 포함된다. 일부 실시양태에서, 항체는 유형-1 IFN, 예컨대 표 II에 제시된 유형 I IFN을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 표적화된 IFN-알파를 추가로 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 표적화된 마스킹된 IFN-알파를 추가로 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
일부 측면에서, 항체는 항체 단편, 예컨대 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'2 단편, 단일-쇄 항체 분자, 예를 들어, 단일 쇄 Fv 단백질 ("scFv"), 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), Fv, Fab'-SH, 디아바디, 선형 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
항체, 예컨대 모노클로날 항체의 제조를 위한 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 단리된 또는 면역접합된 형태로 TAA-관련 단백질, 펩티드, 또는 단편을 사용하여 적합한 포유동물 숙주를 면역화함으로써 제조될 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). 또한, TAA의 융합 단백질, 예컨대 TAA GST-융합 단백질이 또한 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 도 1의 아미노산 서열의 전부 또는 대부분을 포함하는 GST 융합 단백질이 생산되고, 이어서 적절한 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, TAA-관련 단백질은 합성되고, 면역원으로서 사용된다.
또한, 관련 기술분야에 공지된 네이키드 DNA 면역화 기법은 코딩된 면역원에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 사용된다 (정제된 TAA-관련 단백질 또는 TAA 발현 세포의 존재 또는 부재 하에서) (검토를 위해, 문헌 [Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648] 참조).
표 I에 제시된 TAA 단백질의 아미노산 서열을 분석하여 예를 들어 항체를 생성하기 위한 면역원 또는 에피토프로서 TAA 단백질의 특이적 영역을 선택할 수 있다. 예를 들어, TAA 아미노산 서열의 소수성 및 친수성 분석은 TAA 구조에서 친수성 영역을 확인하기 위해 사용된다. 면역원성 구조를 나타내는 TAA 단백질의 영역, 뿐만 아니라 다른 영역 및 도메인은 관련 기술분야에 공지된 다양한 다른 방법, 예컨대 추-파스만(Chou-Fasman), 가르니어-롭슨(Garnier-Robson), 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle), 아이젠베르크(Eisenberg), 카르플루스-슐츠(Karplus-Schultz) 또는 제임슨-울프(Jameson-Wolf) 분석을 사용하여 용이하게 확인될 수 있다. 친수성 프로파일은 문헌 [Hopp, T. P. and Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828]의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 소수성 프로파일은 문헌 [Kyte, J. and Doolittle, R. F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132]의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 퍼센트 (%) 접근가능한 잔기 프로파일은 문헌 [Janin J., 1979, Nature 277:491-492]의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 평균 가요성 프로파일은 문헌 [Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255]의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 베타-턴 프로파일은 문헌 [Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294]의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 따라서, 임의의 이들 프로그램 또는 방법에 의해 확인된 각각의 영역은 본 발명의 범주 내에 있다. TAA 항체의 생성을 위한 바람직한 방법은 본원에서 제공된 실시예에 의해 추가로 예시된다. 면역원으로서 사용하기 위한 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 운반체, 예컨대 BSA, KLH 또는 다른 운반체 단백질과 단백질의 면역원성 접합체를 제조하는 방법은 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일부 상황에서, 예를 들어, 카르보디이미드 시약을 사용한 직접적 접합이 사용되며; 다른 경우에, 연결 시약, 예컨대 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chemical Co.)에 의해 공급되는 것들이 효과적이다. TAA 면역원의 투여는 관련 기술분야에서 이해되어 있는 바와 같이, 대개 적합한 기간에 걸쳐 및 적합한 아주반트를 사용하여 주사에 의해 수행된다. 면역화 스케줄 동안, 항체의 역가는 항체 형성의 적절성을 결정하기 위해 취해질 수 있다.
TAA 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화 세포주는 일반적으로 공지된 바와 같이, 콜러 및 밀스테인(Kohler and Milstein)의 표준 하이브리도마 기술 또는 항체-생산 B 세포를 불멸화하는 변형을 사용하여 제조된다. 원하는 항체를 분비하는 불멸화 세포주는 항원이 TAA-관련 단백질인 면역검정에 의해 스크리닝된다. 적절한 불멸화 세포 배양이 확인되는 경우, 세포는 확장될 수 있고, 항체는 시험관내 배양물로부터 또는 복수액으로부터 생산된다.
본 발명의 항체 또는 단편은 또한 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. TAA 단백질의 원하는 영역에 특이적으로 결합하는 영역은 또한 다수의 종 기원의 키메라 또는 상보성-결정 영역 (CDR) 그라프팅된 항체의 맥락에서 생산될 수 있다. 인간화 또는 인간 TAA 항체는 또한 생산될 수 있으며, 치료 맥락에서 사용하기 위해 바람직하다. 비-인간 항체 CDR 중 하나 이상을 상응하는 인간 항체 서열에 대해 치환함으로써 뮤린 및 다른 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525]; [Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327]; [Verhoeyen, et al., 1988, Science 239: 1534-1536] 참조). 또한, 문헌 [Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285] 및 [Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296]을 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 이뮤노글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH 절편) 및/또는 카파 경쇄 (VK 및 JK) 유전자좌에 내인성 마우스 가변 절편을 보유하는 게놈 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 인간 이뮤노글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH) 및/또는 카파 경쇄 (VK 및 JK) 유전자좌의 비재배열된 배선 가변 절편을 보유하는 인간 게놈 서열로 대체된 벨로크이뮨(VelocImmune) 마우스를 사용하여 제조될 수 있다 (리제네론(Regeneron), 미국 뉴욕주 테리타운). 예를 들어, 미국 특허 번호 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, 6,528,313, 6,638,768, 및 6,528,314를 참조한다.
또한, 본 발명의 인간 항체는 내인성 뮤 및 카파 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 비재배열된 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유하는 HuMAb 마우스 (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))를 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 완전히 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스염색체 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 형성될 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727] 및 도미즈카(Tomizuka) 등의 PCT 공개 WO 02/43478에 기재되어 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 제시 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 제시 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 미국 특허 번호 5,571,698; 다우어(Dower) 등의 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197; 및 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어, 윌슨(Wilson) 등의 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767에 기재되어 있다.
추가적으로, 본 발명의 인간 항체는 제노마우스(Xenomouse) (암젠 프레몬트, 인크.(Amgen Fremont, Inc.), 이전에 압제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는, 항체 생산을 위해 불활성화되고, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌로 조작된 트랜스제닉 마우스를 사용한 기법으로 제조될 수 있다. 인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스를 제조하는 예시적인 설명은 미국 특허 번호 6,657,103에서 발견될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 및 5,545,806; 및 문헌 [Mendez, et al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1998)]; [Kellerman, S. A. & Green, L. L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002)]을 참조한다.
상기 임의의 생산 방법은 TAA, 또는 동족체 또는 단편 또는 TAA와 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 9, 98, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열에 결합하는 특정 능력을 갖는 항체를 발생시킨다. TAA에 대한 항체, 그의 결합 단편, 및 이를 포함하는 항체 약물 접합체의 결합 친화도 (KD)는 1 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하일 수 있다. 대안적으로, KD는 5 내지 10 nM; 또는 1 내지 2 nM일 수 있다. KD는 1 마이크로몰 내지 500 마이크로몰 또는 500 마이크로몰 내지 1 nM일 수 있다.
항원 결합 단백질의 결합 친화도는 회합 상수 (Ka) 및 해리 상수 (Kd) (KD=Kd/Ka)에 의해 결정된다. 결합 친화도는 비아코어(BIACORE)에 의해 예를 들어, 단백질-A 코팅된 센서 표면 상으로 시험 항체를 포획하고, TAA를 이 표면 위로 유동시킴으로써 측정될 수 있다. 대안적으로, 결합 친화도는 포르테바이오(FORTEBIO)에 의해 예를 들어, 단백질-A 코팅된 바늘 상으로 시험 항체 수용체를 포획하고, TAA를 이 표면 위로 유동시킴으로써 측정될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 결합 친화도를 측정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 검정을 확인할 수 있다.
TAA 항원 결합에 관하여 본원에 사용된 용어 단백질에 "특이적으로 결합하다"는 항원 결합 단백질이 다른 (예를 들어, 비관련된) 단백질에의 결합 없이 또는 비유의한 결합으로, TAA 뿐만 아니라 TAA 내의 별개의 도메인, 또는 별개의 아미노산 서열에 결합함을 의미한다. 그러나, 이 용어는 항체 또는 그의 결합 단편이 또한 가깝게 관련된 분자와 교차-반응성일 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 본원에 기재된 것들을 포함하는 항체 및 그의 단편 뿐만 아니라 융합 단백질은 가깝게 관련된 분자에 결합하는 것보다 적어도 2, 5, 10, 50, 100, 또는 1000배 더 큰 친화도로 TAA에 특이적으로 결합할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 종양 연관 항원 (TAA)에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 고형 암 종양과 연관된 종양 연관 항원 (TAA)에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조혈계에서 발생하는 종양과 연관된 종양 연관 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD138 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD20 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 메소텔린 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 5T4 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 FAP 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 PSCA 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 표 II에 제시된 유형 1 IFN을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 표적화된 IFN-알파를 추가로 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체는 표적화된 마스킹된 IFN-알파를 추가로 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 도 25에 제시된 중쇄를 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 서열을 갖는 중쇄를 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다:
Figure pct00001
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다:
Figure pct00002
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 갖는 중쇄를 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 갖는 (서열식별번호: 6)에 제시된 중쇄를 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 갖는 (서열식별번호: 7)에 제시된 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (서열식별번호: 7)에 제시된 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하고, (서열식별번호: 5)에 제시된 가요성 링커를 추가로 포함하고, (서열식별번호: 10)에 제시된 IFNa2를 추가로 포함하고, (서열식별번호: 38)에 제시된 프로테아제 절단가능한 링커를 추가로 포함하고, (서열식별번호: 34)에 제시된 마스크 서열을 추가로 포함하고, 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다. 도 25 (서열식별번호: 41)를 참조한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 도 24에 제시된 경쇄를 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 서열을 갖는 경쇄를 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다:
Figure pct00003
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다:
Figure pct00004
또 다른 측면에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 (서열식별번호: 9) 및 중쇄 가변 영역 (서열식별번호: 7)을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 (서열식별번호: 9) 및 중쇄 가변 영역 (서열식별번호: 7)을 추가로 포함하고, 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 경쇄 (서열식별번호: 8) 및 중쇄 (서열식별번호: 6)를 추가로 포함하고, 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 추가로 포함하는 CD138에 결합하는 항체를 포함한다.
III.) 인터페론(들)
일부 실시양태에서, 제공된 융합 단백질, 예컨대 표적화된 인터페론 (IFN), 예를 들어, 표적화된 마스킹된 IFN, 및 조성물은 인터페론 (IFN) 또는 그의 변이체인 성분을 포함한다. 일부 측면에서, 항체, 그의 단편, 또는 쇄, 및 "인터페론 마스크"와 융합된 표적화된 마스킹된 IFN, 예컨대 유형 I IFN이 또한 제공된다.
일부 실시양태에서, 인터페론 (IFN) 또는 그의 변이체, 및 종양 연관 항원 (TAA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 예컨대 항체-IFN 융합 단백질 또는 표적화된 IFN이 제공된다. 일부 측면에서, IFN은 본원에 기재된 임의의 유형의 IFN이다. 특정한 측면에서, 제공된 실시양태에서의 예시적인 IFN은 임의의 공지된 유형 I IFN 및 본원에 기재된 임의의 것, 예컨대 표 II에 제시된 것들을 포함하는 유형 I IFN을 포함한다. 융합 단백질에서의 예시적인 항체는 본원에, 예를 들어, 섹션 II 또는 표 I에 기재된 임의의 것을 포함한다. 일부 임의의 실시양태에서, 또한, 일부 경우에 인터페론 마스크로 지칭되는 "마스크", 예컨대 시토카인 상호작용 및/또는 인터페론 α 수용체 (IFNAR)의 활성화를 차단하는 펩티드 또는 단백질에 부착되거나 연결된 인터페론 (IFN) 또는 그의 변이체가 제공된다. 일부 측면에서, 마스킹된 IFN이 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 마스킹된 IFN에서 예시적인 IFN은 임의의 공지된 유형 I IFN 및 본원에 기재된 임의의 것, 예컨대 표 II에 제시된 것들을 포함하는 유형 I IFN을 포함한다. 예시적인 마스크 및 인터페론을 마스킹하는 방법은 본원에, 예를 들어, 섹션 IV에 기재된 임의의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 표 II에서의 IFN으로부터 선택되는 IFN 성분을 포함하는 "마스킹된" IFN을 포함한다.
일부 측면에서, IFN은 질환 또는 장애의 요법 또는 치료를 위해 사용되는 단백질이다. 일부 측면에서, 제공된 융합 단백질 및 조성물은 질환 또는 장애, 예컨대 암 또는 종양을 치료하는데 있어서 유효할 수 있는, 및/또는 치료제, 예컨대 항암 또는 항-신생물제의 유효성을 증가시키는데 사용될 수 있는 IFN 성분을 함유한다.
IFN은 신체에서 외래 실체, 예컨대 몇몇 바이러스를 포함하는 병원체의 존재에 반응하여 대상체 또는 숙주의 세포, 예컨대 숙주 세포에 의해 제조되고 방출되는 신호전달 단백질의 그룹이다. 전형적인 시나리오에서, 바이러스-감염된 세포는 인터페론을 방출하여 인근의 세포가 그들의 항-바이러스 방어를 고조시키는 것을 유발할 것이다.
IFN은 병원체를 근절시키는 것을 돕는 면역계의 보호적 방어를 촉발시키는 세포 사이의 통신에 사용되는 분자인 시토카인으로 공지된 단백질의 큰 부류에 속한다. 인터페론은 세포를 바이러스 감염으로부터 보호함으로써 바이러스 복제를 "방해하는" 그들의 능력 때문에 명명된다. 일부 측면에서, IFN은 또한 다양한 다른 기능을 갖는다: (i) 이들은 면역 세포, 예컨대 자연 킬러 세포 및 대식세포를 활성화시키고; (ii) 이들은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 항원의 발현을 증가시킴으로써 항원 제시를 상향-조절함으로써 숙주 방어를 증가시킨다.
스무 (20)개 초과의 별개의 IFN 유전자 및 단백질이 인간을 포함하는 동물에서 확인되었다. 이들은 전형적으로 3가지 부류 중에서 나누어진다: 유형 I IFN, 유형 II IFN, 및 유형 III IFN. 모든 3개의 부류에 속하는 IFN은 바이러스 감염을 대적하기 위해 및 면역계의 조절을 위해 중요하다.
인터페론 유형 I: 모든 유형 I IFN은 IFNAR1 및 IFNAR2 쇄로 이루어진 IFN-α/β 수용체 (IFNAR)로 공지된 특이적 세포 표면 수용체 복합체에 결합한다. IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 및 IFN-ω를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 인간에 존재하는 열세 (13)개의 유형 I 인터페론이 있다. 일반적으로, 유형 I 인터페론은 신체가 그것에 침입한 바이러스를 인식할 때 생산된다. 이들은 섬유모세포 및 단핵구에 의해 생산된다. 그러나, 유형 I IFN-α의 생산은 인터류킨-10으로 공지된 또 다른 시토카인에 의해 금지된다. 방출되면, 유형 I 인터페론은 표적 세포 상의 특이적 수용체에 결합하며, 이는 바이러스가 그의 RNA 및 DNA를 생산하고 복제하는 것을 방지할 단백질의 발현을 초래한다.
인터페론 유형 II (인간에서 IFN-γ): 이는 또한 면역 인터페론으로 공지되어 있으며, 인터류킨-12에 의해 활성화된다. 더욱이, 유형 II 인터페론은 세포독성 T 세포 및 T 헬퍼 세포, 유형 I에 의해 특이적으로 방출된다. 그러나, 이들은 T 헬퍼 세포 유형 2의 증식을 차단한다. 이전의 것은 Th2 면역 반응의 억제 및 Th1 면역 반응의 추가의 유도를 발생시키며, 이는 쇠약성 질환, 예컨대 다발 경화증의 발달을 초래한다. IFN 유형 II는 IFNGR1 및 IFNGR2 쇄로 이루어진 IFNGR에 결합한다.
인터페론 유형 III: IL10R2 (또한 CRF2-4로 지칭됨) 및 IFNLR1 (또한 CRF2-12로 지칭됨)로 이루어진 수용체 복합체를 통한 신호. 현재의 정보는 일부 유형의 바이러스 또는 진균 감염에서 유형 III IFN의 중요성을 입증한다.
일반적으로, 유형 I 및 II 인터페론은 면역 반응을 조절하고 활성화시키는 것을 담당한다. 유형 I 및 III IFN의 발현은 세포질 및 엔도솜 수용체에 의한 바이러스 성분, 특히 핵산의 인식시 사실상 모든 세포 유형에서 유도될 수 있는 반면, 유형 II 인터페론은 시토카인, 예컨대 IL-12에 의해 유도되고, 그의 발현은 면역 세포, 예컨대 T 세포 및 NK 세포에 제한된다.
일부 측면에서, IFN 및 IFN을 함유하거나 그로부터 유래된 단백질은 치료제로서 사용될 수 있다. 일부 임의의 제공된 실시양태에서, 융합 단백질, 예를 들어, 표적화된 마스킹된 IFN의 IFN 성분은 질환 또는 장애, 예컨대 암의 치료를 위한 치료제로서 사용된다.
일부 측면에서, 인터페론 요법은 일부 암에 대한 치료로서 (화학요법 및 방사선과 조합으로) 사용된다. 이 치료는 혈액 악성종양; 유모 세포 림프종, 만성 골수성 백혈병, 결절성 림프종, 및 피부 T-세포 림프종을 포함하는 백혈병 및 림프종에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 재발성 흑색종을 갖는 환자는 재조합 IFN-α2b를 받는다.
암 요법에서 이용가능한 IFN을 사용하는 것의 주요한 제한은 전신 독성을 유발하지 않으면서 종양 부위에서 IFN의 유효 농도를 달성할 수 없는 것이었다. 이 제한을 극복하기 위해, IFN을 종양 부위에 직접 운반하는 모노클로날 항체의 종양 표적화 능력을 사용함으로써, 몇몇 시도가 이 문제를 해결하기 위해 이루어졌다. 문헌 [Huang, et al., J. Immunol. 179(10), pp. 6881-6888 (2007)] 및 [Vasuthasawat, et al., J. Immunol. 36(5), pp. 305-318 (2013)]을 참조한다. 초기 연구는 IFNα를 림프종 상에 발현되는 CD20에 표적화하는 항-CD20-IFNα2 단백질 및 다발 골수종 상에 발현되는 CD138을 표적화하는 항-CD138-IFNα2 융합 단백질을 사용하였다. 문헌 [Vasuthasawat, et al., MAbs 8(7), pp. 1386-1397 (2016)]을 참조한다. 이들 접근법은 큰 치료 전망을 나타내었고, 현재 인간 임상 시험에서 시험되고 상업적으로 개발되고 있지만, 이들 이용가능한 접근법의 몇몇 결점이 있다.
표적 종양-연관 항원에 대한 항체 결합 특이성을 사용하는 것은 IFN이 홀로 주입되는 경우 달성되는 것보다 더 큰 백분율의 IFN을 종양의 부위에 전달하지만, 부착된 인터페론은 신체 전반에 걸쳐 세포, 예컨대 종양 연관되지 않은 세포 또는 정상 세포에 의해 발현되는 인터페론 수용체에 의해 여전히 인식되고 결합될 수 있다. 이 결합은 종양에 도달하는 더 적은 IFN 및 원하지 않는 오프-타겟 독성 둘 다를 발생시킬 수 있다. 이러한 제한 및 결점을 극복하는 실시양태가 제공된다.
따라서, 본 발명의 목적은 IFN이 질환 또는 장애, 예컨대 종양의 치료를 위해 관련되는 위치 또는 영역에 도달할 때까지 IFN의 기능 또는 활성을 "마스킹"하는 메카니즘을 제공함으로써 이러한 제한을 극복하는 것이다. 그 때, IFN은 "언마스킹되며", 활성 및 기능은 효과적으로 다시 켜진다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단지 치료 효과를 위한 관심의 위치, 예컨대 종양에서만 "언마스킹되는" 또는 "활성화되는" 융합 단백질, 예를 들어, 표적화된 마스킹된 IFN이 제공된다. 일부 측면에서, 신체의 나머지, 예를 들어, 전신 순환에서 IFN의 기능 또는 활성의 마스킹은 일반적으로, IFN의 비-특이적 활성을 감소시키거나 방지하고, 또한 치료제, 예를 들어, IFN이 신체에서 비-암성 또는 비-종양성 세포에 의해 트랩되거나 흡수되는 것을 감소시키거나 방지할 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 실시양태에 존재하는 항체에 의해, IFN의 기능 또는 활성의 마스킹 및 IFN을 관심의 위치, 예를 들어, 종양에 표적화하는 것은 예를 들어, IFN이 항체에 의한 작용제의 특이적 표적화에 의해 결합되고/거나 트랩되는 것을 방지함으로써, 치료제 (예를 들어, IFN)의 농도를 효과적으로 증가시킬 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 IFN이 그것이 종양에 도달하면 IFN 수용체에 선택적으로 결합할 항체-IFN 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리된 IFN을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 "마스킹된" IFN을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리된 "마스킹된" IFN을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 "마스킹된" IFNA1을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리된 "마스킹된" IFNA1을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 "마스킹된" IFNA2를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리된 "마스킹된" IFNA2를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 "마스킹된" IFNB1을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리된 "마스킹된" IFNB1을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 표 II에 제시된 IFN으로부터 선택되는 "마스킹된" IFN을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리되고, 표 II에 제시된 IFN으로부터 선택되는 "마스킹된" IFN을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체-IFN 융합 단백질은 하기를 포함하는 IFNα를 포함한다:
Figure pct00005
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 결합 친화도를 증가시키는 것은 IFNα의 항증식 효력을 특이적으로 증가시킬 것임이 이해된다. 문헌 [KALLE, et al., J. Bio. Chem., vol. 282, no. 15 (April 13, 2007)] 및 [URIN, et al., Plos One, DOI:10.1371/journal.pone.01030797 (July 9, 2015)]을 참조한다. 따라서, 본 개시내용의 한 측면에서, 항체-IFN 융합 단백질은 YNS 돌연변이 (H57Y, E58N, 및 Q61S)를 추가로 포함하는 IFNα (서열식별번호: 10)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 항체-IFN 융합 단백질은 하기를 포함하는 IFNα를 포함한다:
Figure pct00006
. 예를 들어, 도 62 (QXL138YNS4.2-N297Q)를 참조한다.
IV.) IFN을 마스킹하는 방법
이전에 언급된 바와 같이, 본 발명의 목적은 본 발명의 IFN (표 II 참조)의 활성이 그것이 종양에 도달하고, 마스크가 프로테아제, 예컨대 종양-연관 프로테아제에 의해 제거될 시간까지 억제되는 표적화된 마스킹된 IFN 조성물을 제공하는 것이다. 일부 측면에서, 제공된 마스킹된 IFN, 예컨대 표적화된 마스킹된 IFN은 치료될 질환 또는 장애의 위치에서 또는 그 부근에서, 예를 들어, 종양, 예컨대 종양 미세환경에서 또는 그 부근에서 "언마스킹되고", 인터페론 수용체 (예를 들어, IFNAR)에 결합하고/거나 이를 활성화시키게 될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 융합 단백질의 언마스킹 또는 활성화는 종양의 환경 내의 단백질, 예컨대 종양 연관 프로테아제에 의해, 성분의 절단, 예컨대 펩티드 링커에 의해 일어난다.
(a) 이용가능한 접근법의 논의 .
이 시도와 관련된 이용가능한 접근법은 제한된다. 본 개시내용은 본 발명의 기술적 이점을 추가로 입증하고 제시하는 이용가능한 접근법의 설명을 제시한다. 치료제의 종양 특이적 전달을 개선시키는 이전의 접근법은 종양 연관 프로테아제에 의해 활성화된 치료제를 생성하는 것이었다. 이 접근법의 예는 종양 연관 항원을 인식하는 항체를 이용했지만, 이들이 또한 정상 세포 상에 존재하는 항원을 인식하고, 이들이 단지 표적 종양에 국재화될 때 항원에 결합하도록 이들을 변형시키기 때문에 그 효능에 있어서 제한된다. U.S. 8,563,269 (사이톰엑스 테라퓨틱스(CytomX Therapeutics), 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코)를 참조한다. 소위 "프로바디"는 종양 미세환경에 존재하는 프로테아제에 의해 절단가능한 링커에 의해 연결된 항체 결합 부위를 차단하는 연관된 펩티드를 갖는다. 한 경우에, 단지 종양에 국재화될 때 활성화되어 결합하는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 대해 특이적인 항체, 세툭시맙이 생산되었다. 문헌 [Desnoyers, et al., Sci. Transl. Med., 16:5(207) pp.207ra144 (2013)]을 참조한다. 이 "프로바디"에서, 세툭시맙의 가변 영역, 이어서 GS-링커, 및 이어서 서열 LSGRSDNHGSSGT (서열식별번호: 11)에 결합하는 마스크 서열은 항체의 중쇄의 아미노 말단에 부착되었다. 그 경우에, 밑줄친 서열은 정상 조직에서 최소 활성을 갖는 다양한 인간 암종에서 상향 조절되는 것으로 공지된 프로테아제인 UPA 및 마트립타제에 대한 기질이다. 이 프로바디는 비인간 영장류에서 개선된 안전성 및 증가된 반감기를 입증하였다.
종양 미세환경에서 활성화된 항체 결합을 갖는 프로바디를 생산하는 것 외에도, 프로테아제 활성화된 인터페론 알파 프로단백질을 생산하는 것이 가능하였다. U.S. 8,399,219 (사이톰엑스 테라퓨틱스, 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코)를 참조한다. 그 경우에, IFN-α TDVDYYREWSWTQVS (서열식별번호: 12)에 대한 펩티드 마스크는 절단가능한 서열에 의해 IFNα로부터 분리된 단일 쇄 재조합 IFNα의 아미노 말단에 놓였다. 결과로 얻어진 구축물: GQSGQ TDVDYYREWSETQVS GSSGGS VHMPLGFLGP GGS (서열식별번호: 13) IFNα는 종양 미세환경에서 선택적으로 활성화된 IFNα를 함유하였다. VHMPLGFLGP (서열식별번호: 14)는 MMP-9에 대한 기질임이 교시된다.
(b) 본 개시내용의 IFN을 마스킹하는 방법 .
이전에, 본 발명자들은 TAA에 결합하는 항체에 융합될 수 있는 마스킹된 IFN을 생성하기 위한 대안적인 접근법을 개시하였다. 예를 들어, 2020년 10월 22일에 공개된 미국 특허 출원 공개 번호: US2020/0331966 (퀵셀 테라퓨틱스, 인크.(Qwixel Therapeutics, Inc.), 미국 캘리포니아주 로스 앤젤리스)을 참조한다. 본원에 개시된 마스크(들)는 파지 제시를 통해 확인된 펩티드로부터 유래되며, 천연 인간 서열이 아니다. 본 개시내용의 대상은 마스킹된 IFN을 생성하기 위한 신규한 대안을 교시한다. 개시된 펩티드 마스크는 질환 또는 장애의 위치에서 또는 그 부근에서 언마스킹될 수 있다. 상기 언급된 것으로부터 본 개시내용의 IFN을 마스킹하는 방법은 명확하게 구별가능하며, 임의의 이용가능한 접근법에 비해 이점을 제공한다. 일부 이점은 (i) 유형 I 인터페론을 실질적으로 마스킹하는 능력, (ii) 보다 높은 친화도에 기반한 우수한 마스킹 특성, 및 (iii) 감소된 면역원성의 위험을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
더욱이, 상기 기재된 바와 같이, 제공된 실시양태는 IFN이 질환 또는 장애, 예컨대 종양의 치료를 위해 관련되는 위치 또는 영역에 도달할 시간까지 IFN의 기능 또는 활성을 "마스킹"하는 메카니즘, 및 IFN에 융합된 TAA-특이적 항체에 의한 종양의 위치에서의 융합 단백질의 특이적 물리적 표적화를 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 융합 단백질은 IFN이 단지 치료 효과를 위한 관심의 위치, 예컨대 종양에서만 "언마스킹되거나" 또는 "활성화되는" 것; IFN의 비-특이적 활성이 감소되는 것; IFN이 신체에서 비-암성 또는 비-종양성 세포에 의해 트랩되거나 흡수되는 것을 방지하는 것; 및/또는 독성의 증가 없이 치료제 (예를 들어, IFN)의 농도를 효과적으로 증가시키는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 이점을 제공한다.
일부 임의의 실시양태에서, 제공된 융합 단백질, 예를 들어, 표적화된 마스킹된 IFN은 단지 질환 또는 장애의 부위, 예를 들어, 종양에서 또는 그 부근에서만 언마스킹된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 IFN이 그것이 종양의 위치 또는 영역에 도달하면 IFN 수용체에 선택적으로 결합할 항체-IFN 융합 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체-IFN 융합 단백질은 단백질분해적 절단을 위한 부위인 펩티드 링커에 의해 분리된 IFN을 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드 링커의 단백질분해적 절단은 예를 들어, 종양에서 또는 그 부근에서 IFN을 "언마스킹"하거나 활성화시킬 수 있다.
본 개시내용에 기재된 바와 같이, 제공된 실시양태는 IFN, 예컨대 본원의 섹션 III 또는 표 II에 기재된 것들이 본원에, 예를 들어 섹션 II 또는 표 I에 기재된 바와 같은 항체에 융합된 항체-IFN을 포함한다. IFN은 이어서 그것이 단지 종양의 부위에서 그의 수용체를 활성화시키고 그에 결합하게 되도록 "마스킹된다". 비절단된 상태에서 이상적인 펩티드 마스크는 그의 결합 상대 (예를 들어, 인터페론 수용체, 예컨대 IFNAR)에의 단백질 (예를 들어, IFN)의 결합을 억제하고, 절단 후 펩티드 마스크는 그의 결합 상대에의 단백질의 결합을 억제하지 않는다. 본원에서 제공된 실시양태에서, 예를 들어, 종양의 부위에서의 또는 그 부근에서의 "마스크"의 절단은 유형 I IFN이 그의 수용체 (예를 들어, IFNAR)에 결합하고, 그의 치료 효과를 발휘하는 것을 허용한다.
하기는 예시적인 실시양태를 기재한다.
(i) IFNα 마스킹 펩티드 및 마스킹 구축물
IFNAR2에의 IFNα 결합의 결정 구조 모델에 기반하여 디자인된 신규한 펩티드 마스크가 본원에 개시된다. 이러한 연구의 결과로서, IFNα와 상호작용하는 IFNAR2의 영역을 펩티드로서 합성하고, IFNα에의 결합에 대해 뿐만 아니라 IFNα-IFNAR2의 경쟁적 억제에 대해 시험하였다.
본원에 개시된 펩티드의 개발은 모든 유형 I IFN이 동일한 수용체-결합 방식을 공유하고 구조적으로 매우 유사한 신호전달 복합체를 형성한다는 이유에 기반한다. 문헌 [PIEHLER, et. at., Immunol Rev., 250(1): 317-334 (Nov. 2012)]을 참조한다. 더욱이, IFNα2 및 IFNAR2의 수용체-리간드 교차-반응성은 생물학적 활성을 조정하는 명백한 세포외 '리간드 교정' 메카니즘에서, 상대 IFN 결합 친화도를 '조정하는' 리간드-특이적 상호작용 중에서 산재된 보존된 수용체-리간드 "부착점"에 의해 가능해진다. 추가적으로, IFN 사이의 기능적 차이는 집합적으로 신호 개시 및 복합체 안정성을 제어하여, 궁극적으로 차등적 STAT 인산화 프로파일, 수용체 내재화 속도, 및 하류 유전자 발현 패턴을 조절하는 IFNAR1의 리간드-유도된 형태적 변화와 협력하여, 그들의 각각의 수용체 인식 화학과 관련된다. 문헌 [THOMAS, et al., Cell, 146(4): 621-632 (Aug. 2011)]을 참조한다. 또한, IFNα2 및 IFNAR2의 상호 결합 부위의 비교는 IFNα2가 IFNAR2의 둘 다의 도메인과 상호작용하고 몇몇 "핫 스폿" 잔기를 노출시킴을 시사한다. 문헌 [ROISMAN, et al., PNAS, vol. 98, no. 23, 13231-13236 (Nov. 2001)] 및 도 1을 참조한다. 상기에 기반하여, 몇몇 펩티드가 생성되었고, 도 2 및 도 39에 제시된다.
IFNα2는 프로테아제 절단 부위 (예를 들어, LSGRSDNH (서열식별번호: 15) 또는 KQSRVVNH (서열식별번호: 16)) 및 CH3에 융합된 3' 말단 상에 놓인 IFN 결합을 억제하는 펩티드 "마스크" (도 2 및 도 39)와 함께 사용된다. 종양의 부위에서, 종양 미세환경 내의 프로테아제는 프로테아제 절단 부위를 절단하여 마스크를 방출시키고 IFN을 그것이 그의 수용체에 결합할 수 있도록 유리시킬 것임이 본 개시내용에 의해 구상된다.
프로테아제 절단 부위 및 IFN 억제 마스크를 갖는 재조합 중쇄의 구축을 위한 핵산을 수득하고 (ATUM, 미국 캘리포니아주 뉴어크), 그의 3' 단부에서 하기 융합물을 생성함으로써 항-TAA-IFNα2의 중쇄 (H 쇄)를 변형시키는데 사용하였다:
Figure pct00007
.
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 4)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00008
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 5)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00009
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 6)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00010
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 7)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00011
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 1)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00012
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 21)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00013
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 22)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00014
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 23)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00015
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 24)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
프로테아제 절단 부위 및 IFN 억제 마스크를 갖는 재조합 중쇄의 구축을 위한 핵산을 수득하고 (ATUM, 미국 캘리포니아주 뉴어크), 그의 3' 단부에 하기 융합물을 생성함으로써 항-TAA-IFNα2의 중쇄 (H 쇄)를 변형시키는데 사용하였다:
Figure pct00016
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 4)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00017
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 5)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00018
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 6)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00019
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 7)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00020
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 1)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00021
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 21)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00022
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 22)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00023
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 23)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
또 다른 실시양태에서, 구축물은 하기를 포함한다:
Figure pct00024
단일 밑줄은 IFNα2의 카르복시-말단을 지시하고, 이중 밑줄은 프로테아제 절단 부위에 대한 서열을 나타내고, 파선 밑줄은 IFNα 마스크 (펩티드 24)를 나타낸다. 링커 서열은 소문자로서 제시된다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00025
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα4를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα5를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00048
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα4를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα5를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00071
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα4를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα5를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00094
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα4를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, IFNα5를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα1을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD138에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CD20에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, Her2에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CSPG4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, PSCA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, CEA에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, RCC에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 5T4에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 를 포함하고, 메소텔린에 결합하는 항체에 융합된 IFNα2를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00117
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00118
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00119
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00120
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00121
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00122
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00123
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은
Figure pct00124
를 포함한다.
한 실시양태에서, "마스킹된" IFN은 IFNAR을 마스킹하는 상승작용적 능력을 제공하는 마스크로서 또한 작용하는 중화 scFv (본 개시내용의 맥락 내에서 정의된 바와 같음)를 포함한다.
결과로 얻어진 실시양태, 예컨대 표적화된 마스킹된 IFN은 몇몇 이유에서 이전의 접근법에 비해 고유한 이점을 제공한다. 첫째로, IFN은 그것이 종양에 도달할 때까지 그의 활성이 유의하게 감소되고/거나 제거되도록 마스킹된다. 그 때, 마스크는 제거되고, 활성은 종양에서 효능을 최대화하도록 재-활성화된다. 둘째로, C-말단 연결된 마스킹된 IFN을 항체의 C-말단에 부착시킴으로써, 마스킹된 IFN은 특이적 TAA에 표적화될 수 있다. 특이적 표적화는 IFN이 관심의 암에 지정되고 정상 조직을 회피할 보다 큰 기회를 허용한다. 셋째로, 마스킹 서열은 인간 단백질 (IFNAR2)의 세포외 서열로부터 유래되기 때문에, 이들은 면역원성 반응을 생성할 더 낮은 잠재성을 갖는다. 넷째로, 여기서 제공된 마스크는 보다 넓은 범위의 유형 I 인터페론을 마스킹할 잠재성을 제공하고, 보다 높은 친화도로 보다 효과적인 마스킹을 제공할 수 있다.
본 개시내용은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 결과로 얻어진 표적화된 마스킹된 IFN의 일반적 실시양태를 구상한다:
첫째로, 본원에 제시된 바와 같은 조성물:
(i) 항체-링커-시토카인 (예를 들어, IFN)-링커-프로테아제 절단 (PC) 부위-링커-마스크; 및
둘째로, 본원에 제시된 바와 같은 조성물:
(ii) 항체-링커-PC 절단 부위-링커-시토카인 (예를 들어, IFN)
관련 기술분야의 통상의 기술자는 (ii)에 제시된 조성물이 조성물에 제공된 시토카인의 입체 장해를 통해 부분 마스크로서 작용하는 항체의 추가적인 특성을 가짐을 인식하고 이해할 것임이 인식될 것이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제 절단 부위는 종양-연관 프로테아제 절단 부위이다. 본원에서 제공된 바와 같은 "종양-연관 프로테아제 절단 부위"는 그의 발현이 종양 세포 또는 그의 종양 세포 환경에 대해 특이적인 프로테아제에 의해 인식되는 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, 예시적인 프로테아제 절단 부위는 종양-연관 프로테아제 절단 부위, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 절단 부위, 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인-함유 (ADAM) 메탈로프로테아제 절단 부위, 전립선 특이적 항원 (PSA) 프로테아제 절단 부위, 우로키나제-유형 플라스미노겐 활성화제 (uPA) 프로테아제 절단 부위, 막 유형 세린 프로테아제 1 (MT-SP1) 프로테아제 절단 부위, 마트립타제 프로테아제 절단 부위 (ST14) 또는 레구마인 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 측면에서 프로테아제 절단 부위는 특이적 아미노산 서열에 의해 표시될 수 있다. 본 개시내용의 한 측면에서 프로테아제 절단 부위는 LSGRSDNH (서열식별번호: 15)이다. 본 개시내용의 한 측면에서 프로테아제 절단 부위는 KQSRVVNH (서열식별번호: 16)이다.
V.) 종양 연관 항원 (TAA)을 발현하는 암(들)의 치료
또한, 다양한 치료, 진단, 및 예방 방법 및 용도에 유용한 융합 단백질, 예컨대 표적화된 마스킹된 IFN, 또는 조성물이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 융합 단백질 및 조성물은 대상체에서 다양한 질환 및 장애, 예컨대 암 또는 종양을 치료하는데 유용하다. 이러한 방법 및 용도는 예를 들어, 질환 또는 장애, 예컨대 종양 또는 암을 갖는 대상체에게 융합 단백질 또는 조성물을 투여하는 것을 수반하는 치료 방법 및 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 또는 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 실행하기 위한 유효량으로 투여된다. 용도는 이러한 방법 및 치료에 있어서의, 및 이러한 치료 방법을 수행하기 위한 의약의 제조에 있어서의 융합 단백질 또는 조성물의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 또는 조성물은 예를 들어, 치료 방법에 따라, 대상체에서 다양한 질환 및 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 질환 또는 장애, 예컨대 종양 또는 암을 갖거나 또는 가질 경향이 있는 대상체에게 융합 단백질 또는 조성물을 투여함으로서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 그에 의해 대상체에서 질환 또는 장애를 치료한다.
일부 측면에서, 제공된 융합 단백질, 예를 들어, 표적화된 마스킹된 IFN은 종양-연관 항원 (TAA)을 발현하는 것들을 포함하는 질환 또는 장애, 예컨대 종양 또는 암의 치료를 위한 방법 또는 용도에서 채용된다. 조직 또는 세포의 제한된 세트에서 정상적으로 발현되지만, 암, 예를 들어, 고형 종양 암에서도 발현되는 단백질로서 본 개시내용의 TAA를 확인한 것은 본원에 개시된 마스킹된 융합 단백질을 이용하는 이러한 암의 치료에 대한 다수의 치료 접근법을 열었다.
중요하게는, 표적화된 항종양 요법은 심지어 표적화된 단백질이 정상 조직 또는 세포, 심지어 필수적인 정상 기관 조직에서 발현되는 경우에도 유용하였다. 필수적인 기관은 생명을 지속시키는데 필요한 것, 예컨대 심장 또는 결장이다. 비-필수적인 기관은 제거되어도 개체가 여전히 생존할 수 있는 것이다. 비-필수적인 기관의 예는 난소, 유방, 및 전립선이다.
정상 조직, 심지어 필수적인 정상 조직에서의 표적 단백질의 발현은 단백질이 또한 과발현되는 특정 종양에 대한 치료제로서의 단백질에 대한 표적화제의 유용성을 무산시키지 않는다. 예를 들어, 필수적인 기관에서의 발현은 그것 자체는 유해하지 않다. 또한, 없어도 되는 것으로 간주되는 기관, 예컨대 전립선 및 난소는 사망률에 영향을 미치지 않으면서 제거될 수 있다. 마지막으로, 일부 필수적인 기관은 면역특권 때문에 정상 기관 발현에 의해 영향을 받지 않는다. 면역특권화된 기관은 혈액-기관 장벽에 의해 혈액으로부터 보호되고 따라서 면역요법에 접근가능하지 않은 기관이다. 면역특권화된 기관의 예는 뇌 및 고환이다.
따라서, 본 발명의 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질을 포함하는 TAA 단백질의 활성을 억제하는 치료 접근법은 TAA를 발현하는 암 (예컨대, 예를 들어, 폐, 신장, 전립선, 난소, 유방에서의 고형 종양 암, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유형의 암)을 앓고 있는 환자에 대해 유용하다. 치료 접근법은 IFNA 유도된 살해 (예를 들어, "마스크"가 제거되고 IFN이 관심의 종양에서 재활성화되는 경우), ADCC, CDC, 및/또는 면역 조정을 수반한다. 또한, TAA에 결합하는 항체는 또한 암 세포의 기능을 상승작용적으로 조정할 수 있다. 또한, 추가로, "언마스킹된" 또는 활성화된 IFN은 인터페론 수용체 (예를 들어, IFNAR)에의 IFN의 결합에 의해, 항-종양 또는 항암 면역에 관여하는 면역 세포의 활성을 조정할 수 있다. TAA에 결합하는 항체의 조정은 일반적으로 2가지 부류에 해당한다. 첫번째 부류는 그것이 종양 세포 성장의 억제 또는 지연을 초래하거나 그의 살해를 유도하는 종양 세포 성장과 관련되기 때문에 TAA 기능을 조정한다. 두번째 부류는 그의 결합 상대와의 또는 다른 단백질과의 TAA 단백질의 결합 또는 회합을 억제하는 다양한 방법을 포함한다.
따라서, 암 환자는 바람직하게는 종양 조직의 면역조직화학적 평가, 정량적 TAA 영상화, 또는 TAA 발현의 존재 및 정도를 신뢰성 있게 지시하는 다른 기법을 사용하여, TAA 발현의 존재 및 수준에 대해 평가될 수 있다. 종양 생검 또는 외과적 시편의 면역조직화학적 분석은 적용가능한 경우 이 목적을 위해 바람직하다. 종양 조직의 면역조직화학적 분석을 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
VI.) 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 칵테일
본 발명의 치료 방법은 상이한 MAb (즉, 마스킹된 IFN 융합 단백질과 동일한 TAA에 결합하는 네이키드 MAb 또는 모두 함께 또 다른 TAA에 결합하는 또 다른 단백질 또는 또 다른 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질에 결합하는 MAb)의 단일 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 뿐만 아니라 조합, 또는 칵테일의 투여를 구상한다. 이러한 MAb 칵테일은 이들이 상이한 에피토프를 표적화하거나, 상이한 이펙터 메카니즘을 이용하거나, 또는 세포독성 MAb를 면역 이펙터 기능성에 의존하는 MAb와 직접 조합하는 MAb를 함유한다는 점에서 특정 이점을 가질 수 있다. 이러한 MAb는 조합으로 상승작용적 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질은 다양한 화학치료제 및 생물학적 작용제, 안드로겐-차단제, 면역 조정제 (예를 들어, IL-2, GM-CSF), 수술 또는 방사선을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 치료 양식과 수반하여 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 표적화된 마스킹된 IFN은 융합 단백질 형태로 투여된다.
표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 제제는 항체를 종양 세포에 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해 투여된다. 투여의 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 피내 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치료는 일반적으로 전형적으로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25 mg/kg 체중을 포함하지만 이에 제한되지 않는 범위의 용량으로의 허용되는 투여의 경로, 예컨대 정맥내 주사 (IV)를 통한 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 제제의 반복된 투여를 수반한다. 일반적으로, 주당 10-1000 mg 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질의 범위의 용량은 유효하며 잘 내성화된다.
전이성 유방암의 치료에서 헤르셉틴(Herceptin)® (트라스투주맙)으로의 임상적 경험에 기반하여, MAb 제제의 대략 4 mg/kg 환자 체중 IV의 초기 로딩 용량, 이어서 약 2 mg/kg IV의 매주 용량은 허용되는 투여 레지멘을 대표한다. 바람직하게는, 초기 로딩 용량은 90-분 이상의 주입으로서 투여된다. 주기적 유지 용량은 초기 용량이 잘 내성화되었다면, 30분 이상의 주입으로서 투여된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식된 바와 같이, 다양한 인자는 특정한 경우에 이상적인 용량 레지멘에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자는 예를 들어, 사용되는 TAA MAb의 결합 친화도 및 반감기, 환자에서의 TAA 발현의 정도, 순환 쉐딩된 TAA 항원의 정도, 원하는 정상-상태 항체 농도 수준, 치료의 빈도, 및 본 발명의 치료 방법 (즉, 표적화된 마스킹된 IFN)과 조합으로 사용되는 화학치료제 또는 다른 작용제의 영향, 뿐만 아니라 특정한 환자의 건강 상태를 포함한다.
임의로, 환자는 가장 유효한 투여 레지멘의 결정 등을 보조하기 위해 주어진 샘플에서의 TAA의 수준 (예를 들어, 순환 TAA 및/또는 TAA 발현 세포의 수준)에 대해 평가되어야 한다. 이러한 평가는 또한 요법 전반에 걸쳐 모니터링 목적을 위해 사용되며, 다른 파라미터 (예를 들어, 방광암 요법에서 소변 세포학 및/또는 이뮤노시트(ImmunoCyt) 수준, 또는 유추에 의해 전립선 암 요법에서 혈청 PSA 수준에 의해)의 평가와 조합으로 치료 성공을 판단하는데 유용하다.
본 발명의 목적은 융합 단백질이 결합하는 특이적 TAA를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하거나 지연시키는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 TAA에 결합하는 융합 단백질을 포함하는 이러한 표적화된 마스킹된 IFN을 사용하여, 및 특히 다른 약물 또는 면역학적으로 활성인 치료와 조합된 특이적 TAA를 발견하는 융합 단백질을 포함하는 이러한 표적화된 마스킹된 IFN을 사용하여, 포유동물, 바람직하게는 인간에서 혈관신생 및 다른 생물학적 기능을 억제하고, 그에 의해 종양 성장을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
VII.) 조합 요법
일부 실시양태에서, 예를 들어, 임의의 제공된 융합 단백질 또는 조성물, 및 추가적인 치료제, 예컨대 화학치료제 또는 방사선의 사용을 수반하는 조합 요법을 수반하는 방법 및 용도가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 제공된 융합 단백질 또는 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 위한 추가적인 치료제, 예컨대 항암 또는 항-종양제와 조합으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 종양을 포함하는 종양이 추가적인 치료제, 예컨대, 화학치료제, 방사선, 면역조정 요법, 또는 이들의 임의의 조합과 함께 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질로 치료되는 경우 상승작용이 있다. 다시 말해서, 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질에 의한 종양 성장의 억제는 화학치료제 또는 방사선 또는 이들의 조합과 조합되는 경우 예상되는 것 초과로 증진된다. 상승작용은 예를 들어, 단지 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질만의 치료로부터 예상될 것 또는 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 및 화학치료제 또는 방사선으로의 치료의 상가 효과보다 조합된 치료로의 종양 성장의 더 큰 억제에 의해 제시될 수 있다. 바람직하게는, 상승작용은 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질로부터의 치료로부터 또는 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 및 화학치료제 또는 방사선의 상가적 조합을 사용한 치료로 예상되지 않는 암의 완화에 의해 입증된다.
특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 및 화학요법, 방사선, 또는 면역조정 요법의 조합, 또는 임의의 1개, 2개, 또는 3개의 조합을 사용하여 종양 세포의 성장을 억제하는 방법은 화학요법 또는 방사선 요법, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합을 시작하기 전에, 동안, 또는 후에 (즉, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 시작하기 전에 및 동안, 전에 및 후에, 동안 및 후에, 또는 전에, 동안, 및 후에) 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질은 전형적으로 방사선 요법 및/또는 화학요법을 시작하기 전 1 내지 60일, 바람직하게는 3 내지 40일, 보다 바람직하게는 5 내지 12일에 투여된다. 그러나, 치료 프로토콜 및 특이적 환자 필요에 따라, 방법은 가장 효과적인 치료를 제공하고 궁극적으로 환자의 생명을 연장시킬 방식으로 수행된다.
화학치료제의 투여는 비경구 및 장관 경로에 의한 전신적으로를 포함하는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질, 및 화학치료제는 별개의 분자로서 투여된다. 화학치료제 또는 화학요법의 특정한 예는 보르테조밉, 카르필조밉, 레날리도미드, 포말리도미드, 시스플라틴, 다카르바진 (DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 (아드리아마이신), 다우노루비신, 프로카르바진, 미토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소텔), 알데스류킨, 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 클라드리빈, 다카르바진, 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 인터페론 알파, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가스, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 스트렙토조신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 겜시타빈, 클로람부실, 탁솔 및 이들의 조합을 포함한다.
특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질과 조합으로 사용되는 방사선의 공급원은 치료될 환자에 대해 외부 또는 내부일 수 있다. 공급원이 환자에 대해 외부인 경우, 요법은 외부 빔 방사선 요법 (EBRT)으로 공지되어 있다. 방사선의 공급원이 환자에 대해 내부인 경우, 치료는 근접요법 (BT)으로 지칭된다.
상기 기재된 치료 레지멘은 추가적인 암 치료제 및/또는 레지멘, 예를 들어, 보르테조밉, 포말리도미드, 및/또는 추가적인 화학요법, 암 백신, 신호 전달 억제제, 비정상적 세포 성장 또는 암을 치료하는데 유용한 작용제, 항체 (예를 들어, WO/2005/092380 (화이자(Pfizer))에 기재된 바와 같은 항-CTLA-4 항체) 또는 IGF-1R에 결합함으로써 종양 성장을 억제하는 다른 리간드, 및 시토카인과 추가로 조합될 수 있다.
암 치료에 사용되는 면역조정 요법의 예는 항-(CTLA-4, PD-1, PD-L1, TIGIT, LAG3, T1B7-H3, B7-H4) 및 관련 기술분야에 공지된 다른 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포유동물이 추가적인 화학요법에 적용되는 경우, 상기 기재된 화학치료제가 사용될 수 있다. 추가적으로, 성장 인자 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬 요법, 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 혈관신생 억제제, 및 항-안드로겐이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-호르몬, 예를 들어 항-에스트로겐, 예컨대 놀바덱스(Nolvadex) (타목시펜) 또는 항-안드로겐, 예컨대 카소덱스(Casodex) (4'-시아노-3-(4-플루오로페닐술포닐)-2-히드록시-2-메틸-3-'-(트리플루오로메틸)프로피온아닐리드)가 사용될 수 있다.
상기 치료 접근법은 폭넓게 다양한 외과적, 화학요법 또는 방사선 요법 레지멘 중 임의의 하나와 조합될 수 있다. 본 발명의 치료 접근법은 모든 환자에 대한 및 특히 화학치료제의 독성을 잘 내성화하지 않는 환자에 대한 이점인 화학요법 (또는 다른 요법)의 감소된 투여량의 사용 및/또는 덜 빈번한 투여를 가능하게 할 수 있다.
VIII.) 키트/제조품
본원에 기재된 실험실, 예측, 예방, 진단 및 치료 적용에 사용하기 위해, 키트, 제조품, 시스템, 및 장치는 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알, 튜브 등에 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함할 수 있으며, 용기(들)의 각각은 사용, 예컨대 본원에 기재된 사용을 위한 지시서를 포함하는 표지 또는 삽입물과 함께, 방법에 사용될 별개의 요소 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기(들)는 특이적 TAA 또는 본 개시내용의 몇몇 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질을 포함할 수 있다. 키트는 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질의 전부 또는 일부 및/또는 암 및/또는 다른 면역학적 장애를 검출하기 위한 진단 검정을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지; 캐리어, 패키지, 용기, 바이알 및/또는 내용물을 열거하는 튜브 표지 및/또는 사용을 위한 지시서, 및 사용을 위한 지시서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 그와 회합된 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
표지는 조성물이 특이적 요법 또는 비-치료 적용, 예컨대 예측, 예방, 진단, 또는 실험실 적용에 사용됨을 지시하기 위해 용기 상에 또는 용기와 함께 제공될 수 있고, 또한 생체내 또는 시험관내 용도, 예컨대 본원에 기재된 것들을 위한 지시를 지시할 수 있다. 지시 및 또는 다른 정보는 또한 키트와 함께 또는 키트 상에 포함되는 삽입물(들) 또는 표지(들) 상에 포함될 수 있다. 표지는 용기 상에 있거나 그와 회합될 수 있다. 표지는 표지를 형성하는 글자, 숫자 또는 다른 문자가 용기 자체 내에 성형되거나 식각되는 경우 용기 상에 있을 수 있으며; 표지는 예를 들어, 패키지 삽입물로서, 용기를 또한 보유하는 상자 또는 캐리어 내에 존재하는 경우 용기와 회합될 수 있다. 표지는 조성물이 상태, 예컨대 암 또는 다른 면역학적 장애를 진단하거나, 치료하거나, 예방하거나, 예측하는데 사용됨을 지시할 수 있다.
용어 "키트" 및 "제조품"은 동의어로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 조성물, 예컨대 본 개시내용의 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질을 함유하는 제조품(들). 제조품은 전형적으로 적어도 하나의 용기 및 적어도 하나의 표지를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 보틀, 바이알, 시린지, 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 금속, 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 특이적 TAA에 결합하는 하나 또는 몇몇 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질 및/또는 표적화된 마스킹된 IFN의 하나 이상의 치료제 용량을 보유할 수 있다.
용기는 대안적으로 상태를 치료하거나, 진단하거나, 예측하거나, 예방하는데 유효한 조성물을 보유할 수 있고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 활성제는 본 개시내용의 특이적 TAA에 결합하는 표적화된 마스킹된 IFN 융합 단백질일 수 있다.
제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수, 링거(Ringer) 용액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 교반기, 바늘, 시린지, 및/또는 사용을 위한 표시물 및/또는 지시서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태
1)
Figure pct00125
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원 ("TAA")에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
2)
Figure pct00126
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
3)
Figure pct00127
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
4)
Figure pct00128
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
5)
Figure pct00129
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
6)
Figure pct00130
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
7)
Figure pct00131
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
8)
Figure pct00132
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
9)
Figure pct00133
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
10)
Figure pct00134
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
11)
Figure pct00135
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
12)
Figure pct00136
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 종양 연관 항원에 결합하는 항체에 융합된 융합 단백질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
13) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 조성물.
14) 제13항에 있어서, 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 조성물.
15) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα1을 포함하는 것인 조성물.
16) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα2를 포함하는 것인 조성물.
17) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα4를 포함하는 것인 조성물.
18) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα5를 포함하는 것인 조성물.
19) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα6을 포함하는 것인 조성물.
20) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα14를 포함하는 것인 조성물.
21) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNβ1을 포함하는 것인 조성물.
22) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 바와 같은 유형-1 인터페론으로부터 선택되는 것인 조성물.
23) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TAA가 CD138을 포함하는 것인 조성물.
24) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TAA가 CD20을 포함하는 것인 조성물.
25) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TAA가 PSCA를 포함하는 것인 조성물.
26) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TAA가 FAP를 포함하는 것인 조성물.
27) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TAA가 표 I에 제시된 바와 같은 종양 연관 항원으로부터 선택되는 것인 조성물.
28) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 25)를 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
29) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 26)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
30) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 27)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
31) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 28)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
32) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 30)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
33) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 31)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
34) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 32)를 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
35) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 33)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
36) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 34)를 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
37) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 35)를 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
38) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 47)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
39) a. 종양 연관 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 48)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
40) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론의 N-말단이 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
41) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론 마스크가 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
42) 제40항에 있어서, 상기 항체 및 상기 가요성 펩티드 링커 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
43) 제41항에 있어서, 상기 IFN 및 상기 IFN 마스크 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN.
44) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 표 I에 제시된 종양 연관 항원에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
45) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
46) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적으로 활성인 돌연변이체가 YNS 돌연변이체인 표적화된 마스킹된 인터페론.
47) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD138에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
48) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD20에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
49) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 표적화된 마스킹된 인터페론을 제조하는 방법.
50) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물이며, (i) 여기서, 임의로, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이고, 임의로, (a) 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 (b) 암은 조혈계에서 발생하고, (ii) 임의로, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
51) 제28항 내지 제39항 중 어느 한 항의 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 키트.
52) 제28항, 제29항, 제30항, 제31항, 제32항, 제33항, 제34항, 제35항, 제36항, 제37항, 제38항, 또는 제39항에 따른 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
53)
Figure pct00137
를 포함하는 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 유형-1 인터페론의 활성을 마스킹하고, 상기 조성물은 CD138에 결합하는 항체에 융합된 (서열식별번호: 5)를 포함하는 융합 단백질을 추가로 포함하고, 항체는 (서열식별번호: 6)에 제시된 중쇄를 포함하고, (서열식별번호: 8)에 제시된 경쇄를 추가로 포함하는 것인 조성물.
54) 제53항에 있어서,
Figure pct00138
로서 제시된 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하고, 여기서 상기 가요성 펩티드 링커는
Figure pct00139
로서 제시된 절단가능한 링커를 추가로 포함하는 것인 조성물.
55) 제53항에 있어서, 항체가 (서열식별번호: 7)에 제시된 가변 중쇄를 포함하는 것인 조성물.
56) 제53항에 있어서, 항체가 (서열식별번호: 9)에 제시된 가변 경쇄를 포함하는 것인 조성물.
57) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα1을 포함하는 것인 조성물.
58) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα2를 포함하는 것인 조성물.
59) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα4를 포함하는 것인 조성물.
60) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα5를 포함하는 것인 조성물.
61) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα6을 포함하는 것인 조성물.
62) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNα14를 포함하는 것인 조성물.
63) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 IFNβ1을 포함하는 것인 조성물.
64) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 바와 같은 유형-1 인터페론으로부터 선택되는 것인 조성물.
65) 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유형-1 인터페론이 YNS 돌연변이를 포함하는 것인 조성물.
66) a. (서열식별번호: 7)에 제시된 가변 중쇄 및 (서열식별번호: 9)에 제시된 가변 경쇄를 포함하는, CD138 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 30)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
67) 제66항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론의 N-말단이 (서열식별번호: 38)에 제시된 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
68) 제67항에 있어서, 인터페론 마스크가 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
69) 제67항에 있어서, 상기 항체 및 상기 가요성 펩티드 링커 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
70) 제67항에 있어서, 상기 IFN 및 상기 IFN 마스크 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN.
71) 제67항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
72) 제65항에 있어서, 기능적으로 활성인 돌연변이체가 YNS 돌연변이체인 표적화된 마스킹된 IFN.
73) 제67항에 있어서, 상기 항체가 CD138에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
74) 제67항의 표적화된 마스킹된 인터페론을 제조하는 방법.
75) 제67항의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물이며, (i) 여기서, 임의로, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이고, 임의로, (a) 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 (b) 암은 조혈계에서 발생하고, (ii) 임의로, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
76) 제67항의 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 키트.
77) 제65항에 따른 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
78) 도 25에 제시된 서열 (서열식별번호: 41)을 포함하는 조성물.
79) 제78항의 조성물을 포함하는 키트.
80) 제78항에 따른 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
81) a. 중쇄 가변 영역 (서열식별번호: 7) 및 중쇄 불변 영역 (서열식별번호: 54), 및 (서열식별번호: 9)에 제시된 가변 경쇄를 포함하는, CD138 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 48)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
82) 제81항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론의 N-말단이 (서열식별번호: 37)에 제시된 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
83) 제81항에 있어서, 인터페론 마스크가 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
84) 제81항에 있어서, 상기 항체 및 상기 가요성 펩티드 링커 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
85) 제81항에 있어서, 상기 IFN 및 상기 IFN 마스크 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN.
86) 제81항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
87) 제81항에 있어서, 기능적으로 활성인 돌연변이체가 YNS 돌연변이체인 표적화된 마스킹된 IFN.
88) 제81항에 있어서, 상기 항체가 CD138에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
89) 제81항의 표적화된 마스킹된 인터페론을 제조하는 방법.
90) 제81항의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물이며, (i) 여기서, 임의로, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이고, 임의로, (a) 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 (b) 암은 조혈계에서 발생하고, (ii) 임의로, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
91) 제81항의 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 키트.
92) 제81항에 따른 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
93) 도 59에 제시된 서열 (서열식별번호: 49)을 포함하는 조성물.
94) 제93항의 조성물을 포함하는 키트.
95) 제93항에 따른 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
96) a. 중쇄 가변 영역 (서열식별번호: 7) 및 중쇄 불변 영역 (서열식별번호: 55), 및 (서열식별번호: 9)에 제시된 가변 경쇄를 포함하는, CD138 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
c. (서열식별번호: 48)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
97) 제96항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론의 N-말단이 (서열식별번호: 37)에 제시된 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
98) 제97항에 있어서, 인터페론 마스크가 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
99) 제96항에 있어서, 상기 항체 및 상기 가요성 펩티드 링커 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
100) 제96항에 있어서, 상기 IFN 및 상기 IFN 마스크 사이에 삽입된 종양 연관 프로테아제 절단 부위를 추가로 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN.
101) 제96항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
102) 제96항에 있어서, 기능적으로 활성인 돌연변이체가 YNS 돌연변이체인 표적화된 마스킹된 IFN.
103) 제96항에 있어서, 상기 항체가 CD138에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
104) 제96항의 표적화된 마스킹된 인터페론을 제조하는 방법.
105) 제96항의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물이며, (i) 여기서, 임의로, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이고, 임의로, (a) 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 (b) 암은 조혈계에서 발생하고, (ii) 임의로, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
106) 제96항의 표적화된 마스킹된 IFN을 포함하는 키트.
107) 제96항에 따른 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
108) 도 61에 제시된 서열 (서열식별번호: 51)을 포함하는 조성물.
109) 제108항의 조성물을 포함하는 키트.
110) 제108항에 따른 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서, 임의로, 대상체는 인간 대상체인 방법.
실시예:
본 발명의 다양한 측면은 이어지는 몇몇 실시예에 의해 추가로 기재되고 예시되며, 이 중 어느 것도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 항-CD138에 융합된 표적화된 마스킹된 IFNα2 (항-CD138-IFNα2)의 특징규명.
본 실시예에서, IFN 마스크가 마트리파제(Matripase) ST 14 ("MST 14")를 사용하여 H 쇄로부터 절단될 수 있음이 제시된다. 간략하게, MST14 (알앤디 시스템스(R&D Systems))로 처리된 샘플에 대해, 50 ug의 Ab를 0.5 ug MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 일 (1) ug의 각각의 정제된 Ab를 95 ℃로 가열함으로써 변성시키고, 약 2% 베타-머캅토에탄올 (써모피셔(Thermofisher))로 환원시키고, 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) SDS-PAGE 겔 (인비트로젠(Invitrogen)) 상에서 실행하였다. 사 (4) ug의 각각의 비-환원된 Ab를 95 ℃로 가열함으로써 변성시키고, 5% PO4 SDS-PAGE 겔 상에서 실행하였다.
결과로 얻어진 분석은 MST 14가 항-CD138 융합 Ab 상의 IFN 마스크를 효율적으로 절단함을 제시한다. 마스크를 갖지 않는 항-CD138-IFNα를 대조군으로서 사용하였다. (도 5 참조).
실시예 2: IFNα2 수용체에의 마스킹된 융합 Ab (마스크 1 및 마스크 2를 이용함)의 결합.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스킹된 융합 Ab (마스크 2를 이용함)는 IFNα2 수용체에 결합할 수 있음이 제시된다. 간략하게, 이뮬론(Immulon) 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNαR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔(Fisher))로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 이어서, 웰을 PBS + 0.05% 트윈(Tween) (시그마(Sigma))으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 이어서 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크(Southern Biotech))로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍(Biotek) 에포크(EPOCH) ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 마스크 1 및 마스크 2 둘 다가 IFNαR2에의 융합 Ab 결합을 억제할 수 있음을 제시한다. (도 6 참조).
실시예 3: IFNα2 수용체에의 마스킹된 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 및 마스크 3을 이용함)의 결합.
또 다른 실험에서, 마스킹된 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 및 마스크 3을 이용함)를 분석하여 IFNα2 수용체에의 결합을 평가하였다. 간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNαR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 이어서, 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 이어서 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하여다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 마스크 1 및 마스크 2 둘 다가 IFNαR2에의 융합 Ab 결합을 억제할 수 있음을 제시한다. 그러나, 마스크 3은 IFNAR에의 융합 Ab 결합을 유의한 방식으로 억제하는 것으로 보이지 않았다. (도 7 참조).
실시예 4: IFNα2 수용체에의 마스킹된 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 마스크 2.2, 및 마스크 3을 이용함)의 결합.
또 다른 실험에서, 마스킹된 융합 Ab (마스크 1, 마스크 2, 마스크 2.2, 및 마스크 3을 이용함)를 분석하여 IFNα2 수용체에의 결합을 평가하였다. 간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNαR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 이어서, 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 이어서 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 마스크 1, 마스크 2, 및 마스크 2.2가 IFNαR2에의 융합 Ab 결합을 억제할 수 있음을 제시한다. 그러나, 마스크 3은 IFNAR에의 융합 Ab 결합을 억제하는 것으로 보이지 않았다. 결과는 마스크 3이 IFNAR2에의 결합을 강화시킴을 제시하는 것으로 보인다 (도 8 참조).
실시예 5: 융합 Ab를 마스킹 펩티드에 결합시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 융합 Ab가 본 개시내용의 추가적인 펩티드 마스크에 특이적으로 결합함이 제시된다. 참조를 위해, 한 (1)개의 펩티드 마스크를 시험하였다:
펩티드 6 (마스크3): TLFSSSHNFWLAIDMS (서열식별번호: 27);
간략하게, 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 (피어스)를 50 uM의 각각의 지시된 펩티드 (써모피셔)로 실온에서 최소 두 (2)시간 동안 오버레이하였다. 이어서 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 이어서 지시된 농도에서의 Ab를 4 ℃에서 밤새 결합하게 하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 펩티드 6이 시험된 모든 IFN 융합 Ab에 결합함을 제시한다. (도 9 참조). 추가적으로, 펩티드 1 (실시예 3 참조)에 비해, 펩티드 6은 유사한 Kd로 모든 IFN 융합 Ab에 결합한다. (도 9 참조).
실시예 6: IFNα2 수용체에의 마스킹된 융합 Ab (상이한 표적을 갖는 Ab를 이용함)의 결합.
본 실시예에서, 다양한 융합 Ab (항-CD138 IgG1-IFNa, 항-5T4 IgG1-IFNa 마스크, 및 항-메소텔린 IgG1-IFNa 마스크)를 시험하여 마스킹된 항-5T4 및 항-메소텔린 융합 Ab의 IFNAR2 결합 친화도를 언마스킹된 항-CD138 융합 Ab와 비교하였다. 간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNαR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 이어서, 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 이어서 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 마스킹된 항-5T4 및 항-메소텔린 Ab가 언마스킹된 (항-CD138 IgG1-IFNa) 융합 Ab와 비교할 경우 대략 40x-80x 더 낮은 친화도로 IFNAR에 결합함을 제시한다. (도 10 참조).
실시예 7: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크1 및 마스크2 둘 다가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음이 제시된다. 간략하게, HEK 블루(Blue) IFNa/b 세포 (인비보젠(Invivogen))를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (50 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 50 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 지시된 농도에서의 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 10 uL의 상청액을 90 uL/웰 콴티-블루(Quanti-Blue) 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 마스킹된 항-CD138-IFNα (마스크1) 및 마스킹된 항-CD138-IFNα (마스크2)에서의 IFNα 활성이 마스크가 절단된 경우에 비해 감소되었음을 제시한다. (도 11(A) 및 11(B) 참조).
실시예 8: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (50 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 50 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 지시된 농도에서의 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 10 uL의 상청액을 90 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 IFNa 마스크 (항-5T4 및 항-메소텔린)가 마스크가 절단된 경우에 비해 IFNa 활성을 1 내지 2 로그 감소시킴을 제시한다. (도 12(A) 및 12(B) 참조).
실시예 9: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크 (IFNa 마스크 1, IFNa 마스크 2, 및 IFNa 마스크 3)가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (50 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 50 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 지시된 농도에서의 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 10 uL의 상청액을 90 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 IFNa 마스크 1 및 IFNa 마스크 2가 IFNα 활성을 감소시킴을 제시한다. 그러나, IFNa 마스크 3은 활성을 효과적으로 감소시키지 않았다. (도 13(A) 및 13(B) 참조).
실시예 10: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크 (IFNa 마스크 1, IFNa 마스크 2, IFNa 마스크 2.2, 및 IFNa 마스크 3)가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (50 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 50 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 지시된 농도에서의 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 10 uL의 상청액을 90 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 IFNa 마스크 1, IFNa 마스크 2, 및 IFNa 마스크 2.2가 IFNα 활성을 감소시킴을 제시한다. 그러나, IFNa 마스크 3은 활성을 효과적으로 감소시키지 않았다. (도 14(A) 및 14(B) 참조).
실시예 11: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크 (IFNa 마스크 1, IFNa 마스크 1 N297Q, IFNa 마스크 2.2, IFNa 마스크 2.2 (N297Q), IFNa 마스크 3, 및 IFNa 마스크 3.2 N297Q)가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (50 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 50 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 지시된 농도에서의 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 10 uL의 상청액을 90 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 N297Q 돌연변이를 도입하는 것이 그의 야생형 대응물에 비해 융합 단백질의 IFNa 활성에 영향을 미치지 않았음을 제시한다. 또한, 마스크를 제거하는 것은 N297Q 융합 단백질의 IFNa 활성을 그의 야생형 대응물에 대해 관찰된 수준으로 다시 복원한다. (도 15(A), 15(B), 및 15(C) 참조).
실시예 12: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크 (IFNa 마스크 1 N297Q, 및 IFNa 마스크 3.2 N297Q)가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (50 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 50 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 지시된 농도에서의 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 10 uL의 상청액을 90 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 IFNa 마스크 3.2가 마스크가 제거되는지 아닌지 여부와 무관하게 융합 단백질의 IFNα 활성을 감소시킴을 제시한다. (도 16 참조).
실시예 13: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 복수개의 마스킹된 융합 Ab (항-5T4 IFNa 마스크 1 및 항-메소텔린 IFNa 마스크 1)가 IP-10 유도를 감소시킬 수 있음이 제시된다. 간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼 셀즈 바이오사이언시스(Human Cells Biosciences))를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔(Themofisher)) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 기재된 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 300 nM 비융합된 항-CD138 IgG1을 세포에 첨가하여 한 (1) 시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 이어서, 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (5T4 또는 메소텔린)를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 일곱 (7)시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠(Abcam))에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 마스크가 항-5T4 및 항-메소텔린 융합 Ab 둘 다에서 IP-10 유도를 감소시킴을 제시한다 (도 17 참조).
실시예 14: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 융합 Ab (글리코실화된 및 비글리코실화된 둘 다) (항-CD138 IFNa 마스크 1, 항-CD138 IFNa 마스크 1 N297Q)를 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼 셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 기재된 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 300 nM 비융합된 항-CD138 IgG1을 세포에 첨가하여 한 (1)시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 비글리코실화된 마스킹된 융합 단백질이 시험된 농도 (즉, 1.5 nM 및 0.15 nM)에서 PBMC에서 IP-10 발현을 유도하지 않는 반면, 마스킹된 및 비-마스킹된 융합 단백질은 1.5 nM에서 유의한 양의 IP-10을 유도함을 제시한다 (도 18 참조).
실시예 15: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 융합 Ab (글리코실화된 및 비글리코실화된 둘 다) (항-CD138 IFNa 마스크 1, 항-CD138 IFNa 마스크 1 N297Q)를 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼 셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 기재된 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 300 nM 비융합된 항-CD138 IgG1을 세포에 첨가하여 한 (1)시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 비글리코실화된 마스킹된 융합 단백질이 시험된 농도 (즉, 1.5 nM 및 15 nM)에서 PBMC에서 IP-10 발현을 유도하지 않는 반면, 글리코실화된 마스킹된 항-CD138 IFNa 융합 단백질은 1.5 nM 및 15 nM에서 IP-10을 유도함을 제시한다 (도 19 참조).
실시예 16: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 융합 Ab (항-CD138 IFNa 마스크 1, 항-CD138 IFNa 마스크 2, 항-CD138 IFNa 마스크 2.2, 및 항-CD138 IFNa 마스크 3 (MST를 갖는 및 갖지 않는))를 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 167 nM 인간 Fc 블록 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) + 300 nM 비융합된 항-CD138 IgG1을 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 7시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 보다 낮은 농도에서, 모든 마스킹된 융합 단백질이 IP-10의 유도를 감소시킬 수 있음을 제시한다. IFNa 마스크 3의 경우를 제외하고는, MST14 처리는 IP-10을 유도하는 마스킹된 융합 단백질의 능력을 복원한다. (도 20).
실시예 17: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 융합 Ab (항-CD138 IFNa 마스크 1, 항-CD138 IFNa 마스크 1 N297Q, 및 항-CD138 IFNa 마스크 2.2를 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체를 667 nM 인간 IgG를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 7시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 야생형 마스크 1 융합 단백질과 동일한 양의 IP-10을 억제하기 위해 대략 10x 더 많은 비글리코실화된 마스크 1 융합 단백질이 요구됨을 제시한다. 또한, 야생형 마스크 2.2 융합 단백질과 동일한 양의 IP-10을 억제하기 위해 대략 100x 더 많은 비글리코실화된 마스크 1 융합 단백질이 요구된다. (도 21).
실시예 18: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 융합 Ab (항-CD138 IFNa 마스크 1, 항-CD138 IFNa 마스크 1 N297Q, 및 항-CD138 IFNa 마스크 2.2를 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체를 1uM 인간 IgG를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 7시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 글리코실화 부위를 제거하는 것이 융합 단백질에 의한 IP-10 유도를 유의하게 감소시킴을 제시한다. (도 22).
실시예 19: PBMC에서 MCP-1 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 융합 Ab (글리코실화된 및 비글리코실화된) (항-CD138 IFNa 마스크 1, 항-CD138 IFNa 마스크 1 N297Q, 및 항-CD138 IFNa 마스크 2.2)를 MCP-1 유도의 감소에 대해 시험하였다. MCP-1은 단핵구, 기억 T 림프구, 및 NK 세포의 이동 및 침윤을 조절하는 것을 담당하는 케모카인이다. 그의 발현은 IFNa를 포함하는 시토카인에 의해 유도될 수 있다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체를 667 nM 인간 IgG를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 7시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 MCP-1 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 IFNa 및 IFNa 융합 단백질 (15 nM 농도에서)이 MCP-1 발현을 유도할 수 있지만, 마스킹된 융합 단백질의 MCP-1의 유도는 재조합 IFNa 또는 언마스킹된 IFNa 융합 단백질보다 더 낮음을 제시한다. 또한, 결과는 비글리코실화된 마스킹된 융합 단백질이 비처리된 샘플에 비해 MCP-1을 단지 무시가능하게 유도함을 제시한다. (도 23).
실시예 20: 마스크 융합 단백질을 제조하는 방법.
본 실시예에서, QXL138AM2.2의 구축물 디자인 및 특징규명이 제시된다. 간략하게, 항-CD138 IgG1은 관련 기술분야의 표준 방법을 사용하여 제조된다. 중쇄 이소타입은 인간 감마 1이고, 경쇄 이소타입은 인간 카파이다. QXL138AM2.2 중쇄의 서열이 제시되고, (서열식별번호: 6)으로서 개시된다. 본 개시내용의 목적상, 중쇄는 글리코실화 부위를 돌연변이시키기 위해 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 포함한다. 이는 융합 단백질이 내인성 Fc 수용체에 결합하는 것을 방지한다.
마스크를 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성하였다. 본 개시내용의 IFN을 마스킹하는 방법을 참조한다. QXL138AM2.2로 표시되는 결과로 얻어진 구축물 (항-CD138-링커-IFNα2-절단가능한 링커-마스크)은 IgG 중쇄 가변 영역 (적색으로 제시됨) ((서열식별번호: 7)로서 기재됨), 융합 단백질 링커 SGGAGGS (서열식별번호: 5), IFNα (밝은 청색으로 제시됨) (서열식별번호: 10), 흑색 굵은 글씨 밑줄로 제시된 절단가능한 링커 KQSRVVNH (서열식별번호: 16)를 포함하는 제2 융합 단백질 링커 GSSG KQSRVVNH GSSGGSGGSGGS (흑색 밑줄로 제시됨) (서열식별번호: 38) 및 본 개시내용의 마스크 GTDVDYYREWSWTQV (오렌지색 밑줄로 제시됨) (서열식별번호: 34)를 포함한다 (도 25 및 서열식별번호: 41 참조). QXL138AM2.2. 중쇄의 핵산 서열은 도 26에 제시되고, (서열식별번호: 39)로서 기재된다.
QXL138AM2.2 경쇄의 서열은 도 24에 제시되고, (서열식별번호: 8)로서 개시된다. 결과로 얻어진 구축물은 가변 영역 (적색으로 제시됨)을 포함하고, (서열식별번호: 9)로서 개시된다. QXL138AM2.2. 경쇄의 핵산 서열은 도 24에 제시되고, (서열식별번호: 40)으로서 기재된다.
도 24 및 도 25에 제시된 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 CHO 세포에서 일시적으로 발현된다. 중쇄 및 경쇄의 추가의 분석을 표준 방법을 사용하여 질량 분광계에 의해 평가한다.
실시예 21: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 마스크 (IFNa 마스크 2.2 N297Q, 및 MST를 갖는 IFNa 마스크 2.2 N297Q)가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab (FAP)를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 20 uL의 상청액을 이어서 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 마스킹된 항-FAP 융합 단백질에 대한 EC50이 이전의 데이터에서에 비해 마스킹된 항-CD138 융합 단백질에 대해서보다 적어도 100x 더 높음을 제시한다. 이는 HEK-블루 IFNa/b 세포에서의 CD138 항원의 발현에 기인하며, 여기서 항-CD138 융합 단백질의 표적화는 비-표적화 항-FAP 융합 단백질에 비해 국소 IFNa 농도에 영향을 미친다. 항-FAP 융합 Ab로부터 마스크를 제거하는 것은 EC50을 약 50x 감소시킨다. (도 27 참조).
실시예 22: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 마스킹된 융합 Ab (항-CD138 IFNa 마스크 2.2 N297Q, 항-CD138 IFNa N297Q)를 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 1 uM hIgG (피셔)를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 이어서, 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서, 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 동일한 양의 IP-10을 유도하는데 재조합 hIFNa보다 대략 1000x 더 많은 비글리코실화된 마스킹된 2.2 FP가 필요함을 제시한다. 또한, 동일한 양의 IP-10을 유도하는데 비글리코실화된 언마스킹된 FP보다 대략 10x 더 많은 비글리코실화된 마스킹된 2.2 FP가 필요하다. (도 28).
실시예 23: 비글리코실화된 마스킹된 2.2 융합 단백질은 언마스킹된 비글리코실화된 2.2 융합 단백질에 비해 감소된 친화도로 IFNα2 수용체에 결합한다.
본 실시예에서, 다양한 융합 Ab (항-huCD138 IFNa, 항-huCD138 IFNa 마스크 1.1, 항-huCD138 IFNa N297Q, 및 항-huCD138 IFNa 마스크 2.2 N297Q를 시험하여 IFNAR2 결합 친화도를 언마스킹된 융합 ab와 비교하였다. 간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNaR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 이어서, 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기로 검정하였다.
결과는 비글리코실화된 마스크 2.2 융합 단백질의 Kd 값이 결코 마스킹되지 않은 비글리코실화된 융합 단백질보다 약 4x 더 높음을 제시한다. 이전에 언급된 바와 같이, 야생형 마스크 2.2 융합 단백질의 Kd 값은 결코 마스킹되지 않은 야생형 융합 단백질보다 약 30x 더 높다. (도 29 참조).
실시예 24: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키는 방법.
본 실시예에서, 마스킹된 융합 Ab (항-CD138 IFNa 마스크 2.2 N297Q, 항-CD138 IFNa N297Q)를 용량 의존적 방식으로 IP-10 유도의 감소에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 1 uM hIgG (피셔)를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 이어서, 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 언마스킹된 융합 단백질(들)에 비해 PBMC에서 동일한 수준의 IP-10을 유도하는데 대략 10x 더 많은 마스킹된 융합 단백질이 필요함을 제시한다. (도 30).
실시예 25: 가용성 CD138에의 QXL138AM2.2-N297Q 결합.
본 실시예에서, QXL138AM2.2-N297Q는 CD138에 용량 의존적 방식으로 결합하는 것으로 제시되었다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL 가용성 CD138 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 QXL138AM2.2-N297Q가 가용성 CD138에 용량 의존적 방식으로 특이적으로 결합함을 제시한다. (도 31).
실시예 26: 가용성 CD138에의 QXL138AM2.2-N297Q의 다중 제조 로트 (로트 2 및 로트 3)의 결합 비교.
본 실시예에서, QXL138AM2.2-N297Q의 다중 로트는 CD138에 일관된 방식으로 결합하는 것으로 제시되었다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL 가용성 CD138 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 QXL138AM2.2-N297Q의 다중 제조 로트에 대한 Kd 값이 유사함을 제시한다. (도 32).
실시예 27: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, QXL138AM이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 QXL138AM의 EC50이 재조합 IFNa보다 약 4x 더 높음을 제시한다. 마스크의 제거는 IFNa 활성을 복원한다. (도 33 참조).
실시예 28: QXL138AM2.2-N297Q의 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, QXL138AM2.2-N297Q가 IFNAR2에 결합하는 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 연구를 수행하였다. 간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 QXL138AM2.2-N297Q의 EC50이 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질의 EC50보다 약 4x 더 높음을 제시한다. QXL138AM2.2-N297Q로부터 마스크를 제거하는 것은 IFNAR2 결합을 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질의 수준으로 복원한다. (도 34 참조).
실시예 29: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, QXL138A, QXL138AM, 및 QXL138AM + MST를 IP-10 유도의 감소 및 복원에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 1 uM 인간 IgG (피셔)를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 마스킹된 융합 단백질 QXL138AM에 의한 IP-10 유도가 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질에 비해 유의하게 감소됨을 제시한다. 또한, MST를 갖는 마스크를 제거하는 것은 IP-10 유도를 복원한다. (도 35).
실시예 30: 생체내에서 OVCAR3 세포에서 QXL138AM의 종양 억제를 수행하는 방법.
본 실시예에서, QXL138A 및 QXL138AM을 생체내에서 OVCAR3 세포에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.
간략하게, 5x10^6개의 OVCAR3 세포를 대략 육 (6) 내지 팔 (8)주령인 암컷 NSG 마우스 내로 200 ul 부피로 피하로 주사하였다. 종양이 대략 0.15 - 0.2 cm2에 도달하였을 때 처리를 시작하였다. 이어서 마우스를 제49일, 제52일, 제56일, 제59일, 제69일, 제72일, 제76일, 제79일, 제83일, 제86일, 제90일, 제93일, 및 제97일에 (즉, 7주 동안 주 2회) PBS, 5mg/kg QXL138AM, 또는 5mg/kg QXL138A 중 어느 하나로 정맥내로 (i.v.) 처리하였다. 종양 크기(들)를 기록하고, 표준 방법을 사용하여 비교하였다.
결과는 QXL138A 및 QXL138AM 둘 다가 생체내에서 유사한 종양 억제를 가지며, QXL138AM이 종양의 부위에서 언마스킹되고 있고 활성임을 제시한다. (도 36).
실시예 31: 생체내에서 H929 세포에서 QXL138AM의 종양 억제를 수행하는 방법.
본 실시예에서, QXL138AM을 생체내에서 H929 세포에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.
간략하게, 1x10^6개의 H929 세포를 육 (6) 내지 팔 (8)주령의 암컷 NSG 마우스 내로 마트리겔과 함께 200ul 부피로 피하로 주사하였다. 종양이 0.15 - 0.2cm^2에 도달하였을 때 처리를 시작하였다. 마우스를 제14일, 제18일, 제21일, 제25일, 제28일, 제32일, 제35일, 제39일, 제46일, 제50일에 (즉, 5주 동안 주 2회) PBS, 0.1mg/kg QXL138AM, 0.03mg/kg QXL138AM, 또는 0.01mg/kg QXL138AM 중 어느 하나로 정맥내로 (i.v.) 처리하였다. 종양 크기를 기록하고, 표준 방법을 사용하여 비교하였다.
결과는 최소 예상된 생물학적 효과 수준 용량이 0.01mg/kg임과 동시에, 처리 기간 동안 0.1mg/kg 용량에서 완전한 반응을 가짐을 제시한다. (도 37).
실시예 32: 생체내에서 Capan-2 세포에서 QXL138AM의 종양 억제를 수행하는 방법.
본 실시예에서, QXL138AM을 생체내에서 Capan-2 세포에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험하였다.
간략하게, 5x10^6개의 Capan-2 세포를 육 (6) 내지 팔 (8)주령의 암컷 NSG 마우스 내로 마트리겔과 함께 200ul 부피로 피하로 주사하였다. 종양이 0.15 - 0.2cm^2에 도달하였을 때 처리를 시작하였다. 마우스를 제9일, 제13일, 제16일, 제20일, 제23일, 제27일, 제30일, 제34일, 제37일, 제41일, 제44일, 제48일, 제51일, 제55일, 제58일, 제62일, 제65일, 제69일, 제72일, 제76일, 제79일, 제83일, 제86일, 제90일, 제93일에 (즉, 13주 동안 주 2회) PBS 또는 5.0 mg/kg QXL138AM 중 어느 하나로 정맥내로 (i.v.) 처리하였다. 종양 크기를 기록하고, 표준 방법을 사용하여 비교하였다.
결과는 QXL138AM 마스킹된 치료제가 처리 기간 동안 종양 성장을 억제하고, 또한 종양이 처리가 중단되면 성장하기를 계속함을 제시한다. (도 38).
실시예 33: 항-CD138에 융합된 표적화된 마스킹된 YNS 돌연변이체의 특징규명.
본 실시예에서, 복수개의 마스킹된 YNS 돌연변이체(들)가 마트리파제 ST 14 ("MST 14")를 사용하여 H 쇄로부터 절단될 수 있음이 제시된다. 간략하게, MST14 (알앤디 시스템스)로 처리된 샘플에 대해, 50 ug의 Ab를 0.5 ug MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가적으로, 일 (1) ug의 각각의 정제된 Ab를 95 ℃로 가열함으로써 변성시키고, 약 2% 베타-머캅토에탄올 (써모피셔)로 환원시키고, 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 겔 (인비트로젠) 상에서 실행하였다. 겔을 EZ 스테인(EZ Stain) (피셔)으로 제조업체의 프로토콜에 따라 염색하였다.
결과로 얻어진 분석은 마스킹된 YNS 돌연변이체 상의 마스크가 MST로 절단될 수 있음을 제시한다. MST 처리는 또한 비융합된 Ab의 밴드 크기의 증가에 의해 관찰된 바와 같이 IFN/마스크 모이어티의 부분 절단을 발생시킨다. (도 42 참조).
실시예 34: 융합 단백질을 마스킹 펩티드에 결합시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 융합 Ab가 본 개시내용의 추가적인 펩티드 마스크에 특이적으로 결합함이 제시된다. 참조를 위해, PEP1, PEP21, PEP22, PEP23, 및 PEP24의 펩티드 서열이 도 39에 제시된다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL 항-CD138 IFNaYNS 융합 단백질로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 펩티드 (써모피셔) 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 펩티드를 PBS + 1% BSA에 1:5000 희석된 스트렙타비딘-HRP (피어스)로 검출하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척한 후, HRP 기질 TMB (피셔)를 웰에 첨가하였다. 0.1 M 황산 (피셔)의 첨가에 의해 반응을 종결시키고, 흡광도 변화를 450 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 펩티드 22 및 펩티드 23이 시험된 모든 IFN 융합 Ab 중에서 고정화된 융합 단백질에 가장 강하게 결합함을 제시한다. (도 43 참조).
실시예 35: 융합 단백질을 마스킹 펩티드에 결합시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 융합 Ab가 본 개시내용의 추가적인 펩티드 마스크에 특이적으로 결합함이 제시된다. 참조를 위해, PEP22 및 PEP23의 펩티드 서열이 도 39에 제시된다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL 항-CD138 IFNaYNS 융합 단백질로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 융합 단백질 농도를 10 uM 펩티드 (써모피셔)와 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 펩티드를 PBS + 1% BSA에 1:5000 희석된 스트렙타비딘-HRP (피어스)로 검출하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척한 후, HRP 기질 TMB (피셔)를 웰에 첨가하였다. 0.1 M 황산 (피셔)의 첨가에 의해 반응을 종결시키고, 흡광도 변화를 450 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 유리 융합 단백질이 고정화된 융합 단백질에의 PEP22 및 PEP23의 결합을 용량 의존적 방식으로 경쟁할 수 있음을 제시한다. (도 44 참조).
실시예 36: 융합 단백질을 고정화된 펩티드에 결합시키는 방법.
본 실시예에서, 복수개의 융합 단백질이 본 개시내용의 추가적인 펩티드 마스크에 특이적으로 결합함이 제시된다. 참조를 위해, PEP21, PEP22, 및 PEP23의 펩티드 서열이 도 39에 제시된다.
간략하게, 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 (피어스)를 50 uM의 각각의 지시된 펩티드 (써모피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 이어서 지시된 농도에서의 Ab를 4 ℃에서 밤새 결합하게 하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 융합 단백질이 고정화된 PEP23에 결합할 수 있지만, PEP21 또는 PEP22에는 결합하지 않음을 제시한다. (도 45 참조).
실시예 37: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS, QXL138YNSM1.2-N297Q, 및 MST를 갖는 QXL138YNSM1.2-N297Q)이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 YNS 돌연변이체가 활성이지만, YNS 돌연변이체 상의 마스크 (PEP23에 기반함)는 활성인 것으로 보였음을 제시한다. (도 46 참조).
실시예 38: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS 및 QXL138YNSM2.2-N297Q)이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 QXL138YNSM2.2-N297Q (PEP2 및 PEP23의 조합에 기반함)가 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질보다 약 3X 더 높은 EC50으로 마스킹 효과를 나타내는 것으로 보임을 제시한다. (도 47 참조).
실시예 39: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS, QXL138YNSM2.2-N297Q, 및 MST를 갖는 QXL138YNSM2.2-N297Q)이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 대다수의 마스크가 절단되었음을 제시하는 SDS-PAGE에도 불구하고, MST로 처리된 QXL138YNSM2.2-N297Q는 IFN 활성을 복원하는 것으로 보이지 않음을 제시한다. (도 48 참조).
실시예 40: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS 및 QXL138YNSM2.2-N297Q)이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNaR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 QXL138YNSM2.2-N297Q가 결코 마스킹되지 않은 FP보다 약 15X 더 높은 EC50으로, QXL138YNS보다 더 적게 IFNAR2에 결합하는 것으로 보임을 제시한다. (도 49 참조).
실시예 41: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS, QXL138YNSM2.2-N297Q, MST를 갖는 QXL138YNSM2.2-N297Q, 및 QXL138)이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNaR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 MST를 갖는 QXL138YNSM2.2-N297Q로부터 마스크를 제거하는 것이 실질적으로 모든 IFNAR2 결합 능력을 복원하는 것으로 보임을 제시한다. (도 50 참조).
실시예 42: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, QXL138YNS 및 QXL138YNSM2.2-N297Q를 IP-10 유도의 감소 및 복원에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 1 uM 인간 IgG (피셔)를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 0.01 nM QXL138YNS에 의해 생산된 IP-10 유도의 수준을 1 nM QXL138YNSM2.2-N297Q 대비 비교하는 것이 결코 마스킹되지 않은 FP와 동일한 수준의 유도를 달성하는데 100x 초과의 마스킹된 FP가 필요함을 제시하였음을 제시한다. (도 51).
실시예 43: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS-N297Q, QXL138YNSM1.2-N297Q, MST를 갖는 QXL138YNSM1.2-N297Q, QXL138YNSM2.2-N297Q, 및 MST를 갖는 QXL138YNSM2.2-N297Q)이 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 QXL138YNSM1.2-N297Q (PEP23에 기반함)가 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질에 비해 유의미한 마스킹 활성을 갖는 것으로 보이지 않음을 제시한다. QXL138YNS2.2-N297Q (PEP23 및 PEP2에 기반함)는 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질에 비해 단지 보통의 마스킹 활성을 나타낸다. (도 52 참조).
실시예 44: QXL138AM4.2-N297Q의 특징규명.
본 실시예에서, QXL138AM4.2-N297Q가 마트리파제 ST 14 ("MST 14")를 사용하여 H 쇄로부터 절단될 수 있음이 제시된다. 간략하게, MST14 (알앤디 시스템스)로 처리된 샘플에 대해, 50 ug의 Ab를 0.5 ug MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1 ug의 각각의 정제된 Ab를 95 ℃로 가열함으로써 변성시키고, 약 2% 베타-머캅토에탄올 (써모피셔)로 환원시키고, 4-12% 비스-트리스 SDS-PAGE 겔 (인비트로젠) 상에서 실행하였다. 겔을 EZ 스테인 (피셔)으로 제조업체의 프로토콜에 따라 염색하였다.
결과로 얻어진 분석은 QXL138AM4.2-N297Q 상의 마스크 4가 MST로 절단될 수 있음을 제시한다. (도 53 참조).
실시예 45: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 다중 제조 로트로부터의 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138AM2.2-N297Q (로트 10), QXL138AM2.2-N297Q (로트 1), QXL138AM2.2-N297Q (로트 10) + MST, 및 QXL138AM2.2-N297Q (로트 1) + MST가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 QXL138AM4.2-N297Q (IFNAR2의 D1 루프에 기반함)의 EC50이 마스크가 제거된 경우보다 약 50x 내지 100x 더 높은 것으로 보임을 제시하며, 이는 QXL138AM2.2-N297Q에 비해 유의한 마스킹 효과를 지시한다. 더욱이, QXL138AM4.2-N297Q에 대한 EC50은 QXL138AM2.2에 대한 EC50보다 약 20x 더 높으며, 이는 마스크2.2에 비해 개선을 지시한다. (도 54 참조).
실시예 46: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS-N297Q, QXL138AM4.2-N297Q, QXL138YNSM4.2-N297Q, 및 QXL138YNSM4.2-N297Q+MST가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, HEK 블루 IFNa/b 세포 (인비보젠)를 96-웰 조직 배양 플레이트 (피셔) 내로 1x10e4개의 세포/웰 (100 uL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 100 uL/웰의 재조합 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 최종 지시된 농도를 생성하는데 충분한 농도에서 세포와 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 이어서 20 uL의 상청액을 180 uL/웰 콴티-블루 기질 (인비보젠)을 함유하는 플레이트에 첨가하였다. 흡광도 변화를 630 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 판독하였다.
결과는 마스크4.2 (IFNAR2의 D1 루프에 기반함)가 IFNa의 YNS 돌연변이체에 대한 효과적인 마스크일 수 있음을 제시한다. QXL138YNS4.2-N297Q의 EC50은 마스크가 제거된 경우보다 약 30x 더 높은 것으로 보이며, 이는 결코 마스킹되지 않은 QXL138YNS-N297Q에 비해 유의한 마스킹 효과를 지시한다. 마스크의 제거는 IFNa 활성을 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질의 수준으로 복원한다. QXL138AM4.2-N297Q에 대한 EC50은 QXL138YNSM4.2-N297Q에 대한 EC50보다 약 4x 더 높으며, 이는 마스크4.2가 YNS 돌연변이체와 반대로 야생형 IFNa와 함께 사용되는 경우 IFNa 활성을 보다 효율적으로 감소시킴을 지시한다. (도 55 참조).
실시예 47: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138A-N297Q, QXL138AM2.2N297Q (로트 10), QXL138AM4.2-N297Q, QXL138AM2.2N297Q (로트 10)+MST, 및 QXL138AM4.2-N297Q+MST가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNaR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 IFNAR2에의 QXL138AM4.2-N297Q 결합에 대한 EC50이 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질 QXL138A-N297Q에 대한 EC50보다 약 50x 더 높고, QXL138AM2.2에 대한 EC50보다 약 10x 더 높음을 제시하며, 이는 마스크2.2에 비해 개선을 지시한다. (도 56 참조).
실시예 48: 마스킹된 IFNα 활성을 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, 본 개시내용의 융합 단백질 (QXL138YNS-N297Q, QXL138YNS4.2-N297Q, QXL138YNS4.2-N297Q+MST, 및 QXL138AM4.2-N297Q가 IFNα 활성을 감소시키고 복원할 수 있음을 제시하기 위한 추가의 연구를 수행하였다.
간략하게, 이뮬론 2 HB 플레이트 (써모피셔)를 10 ug/mL IFNaR2 (알앤디 시스템스)로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 2% BSA (피셔)로 실온에서 최소 2시간 동안 차단하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈 (시그마)으로 3x 세척하였다. 지시된 Ab 농도를 4 ℃에서 밤새 오버레이하였다. 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 3x 세척하였다. 결합된 Ab를 PBS + 1% BSA에 1:3000 희석된 항-인간 카파-AP (서던 바이오테크)로 검출하였다. AP 기질 (시그마)의 첨가 후의 흡광도 변화를 410 nm에서 비오텍 에포크 ELISA 판독기를 사용하여 검정하였다.
결과는 IFNAR2 D1 마스크가 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질에 비해 야생형 IFNa 융합 단백질 및 YNS 돌연변이체의 EC50을 각각 약 40배 및 약 20배 증가시킴을 제시한다. 마스크가 제거된 경우, YNS 돌연변이체의 활성은 결코 마스킹되지 않은 융합 단백질의 수준으로 복원된다. (도 57 참조).
실시예 49: PBMC에서 IP-10 유도를 감소시키고 복원하는 방법.
본 실시예에서, QXL138A-N297Q, QXL138AM2.2-N297Q, QXL138AM2.2-N297Q+MST, QXL138AM4.2-N297Q, QXL138AM4.2-N297Q+MST를 IP-10 유도의 감소 및 복원에 대해 시험하였다.
간략하게, 신선하게 해동된 인간 PBMC (휴먼셀즈 바이오사이언시스)를 차가운 RPMI + 10% FBS (인비트로젠)로 1회 세척하고, 12-웰 플레이트 (테모피셔) 내로 약 1x10e6개의 세포/웰 (1 mL/웰)의 밀도로 시딩하였다. 실험으로 진행하기 전에, 임의의 Fc 수용체 및/또는 CD138 항원 발현을 1 uM 인간 IgG (피셔)를 세포에 첨가하여 1시간 동안 차단하였다/감소시켰다. 재조합 인간 IFNa (노부스 바이올로지칼스) 또는 지시된 Ab를 세포에 첨가하고, 37 ℃에서 추가적인 7시간 동안 인큐베이션하였다. 50 ug의 Ab를 0.5 ug의 MST14와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 MST14 (알앤디 시스템스)로 절단된 Ab를 제조하였다. 일곱 (7)시간 인큐베이션 후, 세포를 500xg에서 3분 동안 스핀 다운시키고, 각각의 샘플로부터의 20 uL의 상청액을 IP-10 (앱캠)에 대해 ELISA에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 검정하였다.
결과는 QXL138AM4.2-N297Q의 PBMC에서의 IP-10 유도에 대한 EC50이 결코 마스킹되지 않은 QXL138A-N297Q에 대한 EC50보다 약 30x 더 높고, QXL138AM2.2-N297Q에 대해 약 3x 더 높음을 제시하며, 이는 마스크2.2에 비해 개선을 제시한다. (도 58).
실시예 50: 마스크 융합 단백질을 제조하는 방법.
본 실시예에서, QXL138AM4.2-N297Q (또는 대안적으로 QXL138AM4.2)의 구축물 디자인 및 특징규명이 제시된다. 간략하게, 항-CD138 IgG1을 관련 기술분야의 표준 방법을 사용하여 제조한다. 중쇄 이소타입은 인간 감마 1이고, 경쇄 이소타입은 인간 카파이다. QXL138AM4.2-N297Q 중쇄의 서열이 제시되고, (서열식별번호: 6)으로서 개시된다. 본 개시내용의 목적상, 중쇄는 글리코실화 부위를 돌연변이시키기 위해 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 추가로 포함한다. 이는 융합 단백질이 내인성 Fc 수용체에 결합하는 것을 방지한다.
마스크를 본 개시내용에 기재된 바와 같이 생성하였다. 본 개시내용의 IFN을 마스킹하는 방법을 참조한다. QXL138AM4.2-N297Q로 표시되는 결과로 얻어진 구축물 (항-CD138-링커-IFNα2-절단가능한 링커-마스크)은 신호 펩티드 (자주색으로 제시됨) (서열식별번호: 53), IgG 항-CD138 중쇄 가변 영역 (오렌지색으로 제시됨) ((서열식별번호: 7)로서 기재됨), 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (흑색으로 제시됨) ((서열식별번호: 54)로서 기재됨), N297Q 돌연변이 (굵은 글씨 흑색으로 제시됨) (즉, 위치 297에서의 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이), 융합 단백질 링커 SGGAGGS (서열식별번호: 5) (밑줄친 흑색으로서 제시됨), IFNα (밝은 청색으로 제시됨) (서열식별번호: 10), 녹색 굵은 글씨 밑줄로 제시된 절단가능한 링커
Figure pct00140
(서열식별번호: 16)를 포함하는 제2 융합 단백질 링커
Figure pct00141
(녹색으로 제시됨) (서열식별번호: 38), 및 본 개시내용의 마스크 (IFNAR2의 D1 루프)
Figure pct00142
(적색으로 제시됨) (서열식별번호: 48)를 포함한다 (도 59 및 서열식별번호: 49 참조). QXL138AM4.2-N297Q. 중쇄의 핵산 서열은 도 60에 제시되고, (서열식별번호: 50)으로서 기재된다.
QXL138AM4.2-N297Q 경쇄의 서열은 도 24에 제시되고, (서열식별번호: 8)로서 개시된다. 결과로 얻어진 구축물은 가변 영역 (적색으로 제시됨)을 포함하고, (서열식별번호: 9)로서 개시된다. QXL138AM4.2-N297Q 경쇄의 핵산 서열은 도 24에 제시되고, (서열식별번호: 40)으로서 기재된다.
도 24 및 도 59에 제시된 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 CHO 세포에서 일시적으로 발현된다. 중쇄 및 경쇄의 추가의 분석을 표준 방법을 사용하여 질량 분광계에 의해 평가한다.
실시예 51: 마스크 융합 단백질을 제조하는 방법.
본 실시예에서, QXL138YNS4.2-N297Q의 구축물 디자인 및 특징규명이 제시된다. 간략하게, 항-CD138 IgG1을 관련 기술분야의 표준 방법을 사용하여 제조한다. 중쇄 이소타입은 인간 감마 1이고, 경쇄 이소타입은 인간 카파이다. QXL138AM4.2-N297Q 중쇄의 서열이 제시되고, (서열식별번호: 6)으로서 개시된다. 본 개시내용의 목적상, 중쇄는 글리코실화 부위를 돌연변이시키기 위해 위치 297에 아미노산 치환 (N297Q)을 추가로 포함한다. 이는 융합 단백질이 내인성 Fc 수용체에 결합하는 것을 방지한다.
마스크를 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성하였다. 본 개시내용의 IFN을 마스킹하는 방법을 참조한다. QXL138YNS4.2-N297Q로 표시되는 결과로 얻어진 구축물 (항-CD138-링커-IFNα2-절단가능한 링커-마스크)은 신호 펩티드 (자주색으로 제시됨) (서열식별번호: 53), IgG 항-CD138 중쇄 가변 영역 (오렌지색으로 제시됨) ((서열식별번호: 7)로서 기재됨), 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 (흑색으로 제시됨) ((서열식별번호: 55)로서 기재됨), N297Q 돌연변이 (굵은 글씨 흑색으로 제시됨) (즉, 위치 297에서의 아스파라긴으로부터 글루타민으로의 돌연변이), 융합 단백질 링커 SGGAGGS (서열식별번호: 5) (밑줄친 흑색으로서 제시됨), 굵은 글씨 청색으로 제시된 YNS 돌연변이 (서열식별번호: 56)를 갖는 IFNα (밝은 청색으로 제시됨), 녹색 굵은 글씨 밑줄로 제시된 절단가능한 링커 (서열식별번호: 16)를 포함하는 제2 융합 단백질 링커
Figure pct00144
(녹색으로 제시됨) (서열식별번호: 38), 및 본 개시내용의 마스크 (IFNAR2의 D1 루프)
Figure pct00145
(적색으로 제시됨) (서열식별번호: 48)를 포함한다 (도 61 및 서열식별번호: 51 참조). QXL138YNS4.2-N297Q. 중쇄의 핵산 서열은 도 62에 제시되고, (서열식별번호: 52)로서 기재된다.
QXL138YNS4.2-N297Q 경쇄의 서열은 도 24에 제시되고, (서열식별번호: 8)로서 개시된다. 결과로 얻어진 구축물은 가변 영역 (적색으로 제시됨)을 포함하고, (서열식별번호: 9)로서 개시된다. QXL138YNS4.2-N297Q 경쇄의 핵산 서열은 도 24에 제시되고, (서열식별번호: 40)으로서 기재된다.
도 24 및 도 61에 제시된 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 CHO 세포에서 일시적으로 발현된다. 중쇄 및 경쇄의 추가의 분석을 표준 방법을 사용하여 질량 분광계에 의해 평가한다.
실시예 52: 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질의 사용을 통한 인간 암종의 치료를 위한 인간 임상 시험.
종양 세포에서 특이적으로 축적되는 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질을 본 발명에 따라 합성하고, 특정 종양 및 다른 면역학적 장애 및/또는 다른 질환의 치료에 사용한다. 이들 적응증의 각각에 관하여, 2가지 임상적 접근법이 성공적으로 추구된다.
I.) 보조 요법: 보조 요법에서, 환자를 화학치료제 또는 제약 또는 생물제약 작용제 또는 이들의 조합과 조합으로 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질로 치료한다. 프로토콜 디자인은 원발성 또는 전이성 병변의 종양 질량의 감소, 증가된 무진행 생존, 전체 생존, 환자의 건강의 개선, 질환 안정화, 뿐만 아니라 표준 화학요법 및 다른 생물학적 작용제의 통상적인 용량을 감소시키는 능력을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 하기 실시예에 의해 평가된 바와 같은 유효성을 다룬다. 이러한 투여량 감소는 화학치료제 또는 생물학적 작용제의 용량-관련 독성을 감소시킴으로써 추가적인 및/또는 연장된 요법을 허용한다.
II.) 단독요법: 종양의 단독요법에서 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질의 사용에 관하여, 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질을 화학치료제 또는 제약 또는 생물학적 작용제 없이 환자에게 투여한다. 한 실시양태에서, 단독요법은 광범위한 전이성 질환을 갖는 말기 암 환자에서 임상적으로 수행된다. 프로토콜 디자인은 원발성 또는 전이성 병변의 종양 질량의 감소, 증가된 무진행 생존, 전체 생존, 환자의 건강의 개선, 질환 안정화, 뿐만 아니라 표준 화학요법 및 다른 생물학적 작용제의 통상적인 용량을 감소시키는 능력을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 하기 실시예에 의해 평가된 바와 같은 유효성을 다룬다.
투여량
투여량 레지멘은 최적의 원하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 TAA에 결합하는 단일 마스킹된 IFN 융합 단백질 주사가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할된 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 본원에 사용된 "투여 단위 형태"는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세는 (a) 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질의 고유한 특징, 및 달성되어야 할 특정한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 이러한 화합물을 배합하는 관련 기술분야에서 고유한 제한에 의해 지시되고, 그에 직접적으로 좌우된다.
임상 개발 계획 (CDP)
CDP는 보조 요법 또는 단독요법에 관련하여 본 개시내용의 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질을 사용한 암(들) 및/또는 면역학적 장애의 치료를 따르고 개발된다. 시험은 처음에 안전성을 입증하고, 그 후 반복 용량에서의 효능을 확인한다. 시험은 표준 화학요법을 표준 요법 더하기 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질과 비교하는 개방 표지이다. 인식될 것인 바와 같이, 환자의 등록에 관련하여 이용될 수 있는 한 비-제한적 기준은 관련 기술분야에 공지된 표준 검출 방법에 의해 결정된 바와 같은 종양에서의 특이적 TAA에 결합하는 마스킹된 IFN 융합 단백질의 농도이다.
본 발명은 본 발명의 개별적인 측면의 단일 예시로서 의도되는 본원에 개시된 실시양태에 의해 범주에 있어서 제한되지 않아야 하며, 기능적으로 등가인 임의의 것은 본 발명의 범주 내에 있다. 본원에 기재된 것들 외에도, 본 발명의 모델, 방법, 및 생활 주기 방법론에 대한 다양한 변형은 상기 설명 및 교시내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이고, 유사하게 본 발명의 범주 내에 해당하는 것으로 의도된다. 이러한 변형 또는 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다.
표 I. 선택 종양 연관 항원(들).
Figure pct00146
표 II. 인터페론(들) 및 기능적 돌연변이체의 목록.
Figure pct00147
표 III. 아미노산 약어.
Figure pct00148
SEQUENCE LISTING <110> Nammi Therapeutics, Inc. <120> Fusion Protein Composition(s) Comprising Masked Type I Interferons (IFNa and IFNb) For Use in The Treatment of Cancer and Methods Thereof <130> 1441-20003.40 <140> Not Yet Assigned <141> 2022-06-17 <150> US 63/259,105 <151> 2021-06-18 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Gly Ala Ala Ala Lys Gly Ala Ala Ala Lys Ala Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 475 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 20 25 30 Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 35 40 45 Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg 50 55 60 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly 65 70 75 80 Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 100 105 110 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn 115 120 125 Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 320 Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 325 330 335 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 340 345 350 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 355 360 365 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 405 410 415 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 435 440 445 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 475 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly 35 40 45 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Glu Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser 100 105 110 Lys Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Gln Ser Gly Gln Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Glu 1 5 10 15 Thr Gln Val Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly 20 25 30 Phe Leu Gly Pro Gly Gly Ser 35 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro 1 5 10 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Gln Ser Arg Val Val Asn His 1 5 <210> 17 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 50 55 60 <210> 18 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Thr His Glu Ala Thr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly 50 55 60 <210> 19 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met 50 55 60 Ser 65 <210> 20 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Asn 50 55 60 Thr Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met 65 70 75 80 Ser <210> 21 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 50 55 60 <210> 22 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Thr His Glu Ala Thr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly 50 55 60 <210> 23 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met 50 55 60 Ser 65 <210> 24 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Asn 50 55 60 Thr Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met 65 70 75 80 Ser <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Thr His Glu Ala Thr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Asn Thr 1 5 10 15 Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 20 25 30 <210> 29 <211> 515 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Leu Leu Ser Gln Asn Ala Phe Ile Phe Arg Ser Leu Asn Leu Val 1 5 10 15 Leu Met Val Tyr Ile Ser Leu Val Phe Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Pro 20 25 30 Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile Ser Leu Arg Asn Phe 35 40 45 Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His Ser Ile Val Pro Thr 50 55 60 His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys Pro Glu Asp Leu Lys 65 70 75 80 Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser Phe Cys Asp Leu Thr 85 90 95 Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val Thr Val Leu Glu Gly 100 105 110 Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser His Asn Phe Trp Leu 115 120 125 Ala Ile Asp Met Ser Phe Glu Pro Pro Glu Phe Glu Ile Val Gly Phe 130 135 140 Thr Asn His Ile Asn Val Met Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Glu Glu 145 150 155 160 Glu Leu Gln Phe Asp Leu Ser Leu Val Ile Glu Glu Gln Ser Glu Gly 165 170 175 Ile Val Lys Lys His Lys Pro Glu Ile Lys Gly Asn Met Ser Gly Asn 180 185 190 Phe Thr Tyr Ile Ile Asp Lys Leu Ile Pro Asn Thr Asn Tyr Cys Val 195 200 205 Ser Val Tyr Leu Glu His Ser Asp Glu Gln Ala Val Ile Lys Ser Pro 210 215 220 Leu Lys Cys Thr Leu Leu Pro Pro Gly Gln Glu Ser Glu Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ser Ala Lys Ile Gly Gly Ile Ile Thr Val Phe Leu Ile Ala Leu Val 245 250 255 Leu Thr Ser Thr Ile Val Thr Leu Lys Trp Ile Gly Tyr Ile Cys Leu 260 265 270 Arg Asn Ser Leu Pro Lys Val Leu Asn Phe His Asn Phe Leu Ala Trp 275 280 285 Pro Phe Pro Asn Leu Pro Pro Leu Glu Ala Met Asp Met Val Glu Val 290 295 300 Ile Tyr Ile Asn Arg Lys Lys Lys Val Trp Asp Tyr Asn Tyr Asp Asp 305 310 315 320 Glu Ser Asp Ser Asp Thr Glu Ala Ala Pro Arg Thr Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Tyr Thr Met His Gly Leu Thr Val Arg Pro Leu Gly Gln Ala Ser Ala 340 345 350 Thr Ser Thr Glu Ser Gln Leu Ile Asp Pro Glu Ser Glu Glu Glu Pro 355 360 365 Asp Leu Pro Glu Val Asp Val Glu Leu Pro Thr Met Pro Lys Asp Ser 370 375 380 Pro Gln Gln Leu Glu Leu Leu Ser Gly Pro Cys Glu Arg Arg Lys Ser 385 390 395 400 Pro Leu Gln Asp Pro Phe Pro Glu Glu Asp Tyr Ser Ser Thr Glu Gly 405 410 415 Ser Gly Gly Arg Ile Thr Phe Asn Val Asp Leu Asn Ser Val Phe Leu 420 425 430 Arg Val Leu Asp Asp Glu Asp Ser Asp Asp Leu Glu Ala Pro Leu Met 435 440 445 Leu Ser Ser His Leu Glu Glu Met Val Asp Pro Glu Asp Pro Asp Asn 450 455 460 Val Gln Ser Asn His Leu Leu Ala Ser Gly Glu Gly Thr Gln Pro Thr 465 470 475 480 Phe Pro Ser Pro Ser Ser Glu Gly Leu Trp Ser Glu Asp Ala Pro Ser 485 490 495 Asp Gln Ser Asp Thr Ser Glu Ser Asp Val Asp Leu Gly Asp Gly Tyr 500 505 510 Ile Met Arg 515 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Gly Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser Gly 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln 1 5 10 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val 1 5 10 <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Thr Leu Phe Ser Ser Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 1 5 10 15 Gly Gly <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 20 25 <210> 38 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 20 25 <210> 39 <211> 2067 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60 ctgagctacg gccaggtgca actgcaacag agcggcagcg agctgatgat gcccggagca 120 agcgtgaaga tctcctgcaa ggccaccggc tacaccttca gcaactactg gatcgagtgg 180 gtgaagcaga ggcccggaca cggcctggag tggatcggcg agatcctccc cggcaccggc 240 aggaccatct acaacgagaa gttcaagggc aaggcaacct ttaccgccga catcagcagt 300 aacaccgtgc agatgcagct cagcagcctg accagtgagg acagcgccgt gtactactgc 360 gccaggaggg actactacgg caacttttac tatgccatgg attactgggg tcagggcacc 420 agtgtgaccg tgagctctgc tagcaccaag ggccccagcg tgttccctct ggcccccagc 480 agcaagagca ccagcggcgg aaccgccgcc ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc 540 gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcggc gctctgacca gcggagtgca caccttccct 600 gccgtgctgc agagcagcgg cctgtactcc ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc 660 agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg 720 gacaagaagg tggagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc 780 cccgagctgc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccctc ccaagcccaa ggacaccctg 840 atgatcagcc gcacccccga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc 900 gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagcct 960 cgggaggagc agtaccaatc cacctaccgc gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 1020 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgagca acaaggccct gcccgctccc 1080 atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagccccggg agcctcaggt gtacaccctg 1140 ccccccagcc gcgacgagct gaccaagaac caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc 1200 ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcctga gaacaactac 1260 aagaccaccc ctcccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc 1320 gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1380 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc ccggaagcgg aggtgcaggg 1440 ggatcctgcg acctgcccca gacccacagc ctgggcagca ggcgaaccct gatgctgctg 1500 gcccagatga ggaggatcag ccttttcagc tgccttaaag acaggcacga cttcggcttc 1560 ccccaggagg agttcggcaa ccagttccag aaggccgaaa ccatccccgt gttgcacgag 1620 atgatccagc agatcttcaa cctgttctcc accaaggata gttctgccgc gtgggacgag 1680 actttgctgg acaagttcta caccgagctg taccagcagt tgaacgacct ggaggcctgc 1740 gtgattcagg gcgtgggcgt gaccgagacg cctttgatga aggaagacag catcctggcc 1800 gtgaggaagt atttccagag gattacactg tacctgaaag agaagaagta cagcccctgc 1860 gcctgggaag tggtgagggc cgagatcatg aggtccttca gtttgagtac caacttgcag 1920 gaaagcctga gatctaagga gggcagtagc ggcaagcagt caagggtggt caaccacggc 1980 tctagcggag gaagcggtgg ctcagggggc agtggcaccg acgtggacta ctacagggag 2040 tggagctgga cccaggttgg agggtaa 2067 <210> 40 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60 gacatccaga tgacccagag cacaagcagc ctgagcgcca gcctgggcga cagggtgacc 120 ataagctgct cagccagcca gggcatcaac aactacctga actggtatca acagaagccc 180 gacggcactg tggagctgct gatctactac accagcaccc tgcagagcgg cgtgcccagc 240 aggttcagcg gaagcggcag cggcaccgat tacagcttga ccatcagcaa cctggagccc 300 gaggacatcg gcacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgcccaggac cttcgggggt 360 gggaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 420 agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 480 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540 gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 660 ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa 705 <210> 41 <211> 688 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 20 25 30 Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 35 40 45 Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg 50 55 60 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly 65 70 75 80 Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 100 105 110 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn 115 120 125 Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 320 Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 325 330 335 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 340 345 350 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 355 360 365 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 405 410 415 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 435 440 445 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly 465 470 475 480 Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 485 490 495 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 500 505 510 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 515 520 525 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 530 535 540 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 545 550 555 560 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 565 570 575 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu 580 585 590 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 595 600 605 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 610 615 620 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 625 630 635 640 Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg Val 645 650 655 Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 660 665 670 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Gly Gly 675 680 685 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly 1 5 <210> 47 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser 20 25 30 Trp Lys Ile Gly Val Tyr Ser 35 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ile Ser Tyr Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys 1 5 10 15 Ile Ser Leu Arg Asn Phe Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn 20 25 30 His Ser Ile Val Pro Thr His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser 35 40 45 Lys Pro Glu Asp Leu Lys Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg 50 55 60 Ser Phe Cys Asp Leu Thr Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 100 105 <210> 49 <211> 778 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 20 25 30 Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 35 40 45 Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg 50 55 60 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly 65 70 75 80 Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 100 105 110 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn 115 120 125 Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 320 Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 325 330 335 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 340 345 350 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 355 360 365 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 405 410 415 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 435 440 445 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly 465 470 475 480 Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 485 490 495 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 500 505 510 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 515 520 525 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 530 535 540 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 545 550 555 560 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 565 570 575 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu 580 585 590 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 595 600 605 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 610 615 620 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 625 630 635 640 Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg Val 645 650 655 Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ile 660 665 670 Ser Tyr Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile 675 680 685 Ser Leu Arg Asn Phe Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His 690 695 700 Ser Ile Val Pro Thr His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys 705 710 715 720 Pro Glu Asp Leu Lys Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser 725 730 735 Phe Cys Asp Leu Thr Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val 740 745 750 Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser 755 760 765 His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 770 775 <210> 50 <211> 2337 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60 ctgagctacg gccaggtgca actgcaacag agcggcagcg agctgatgat gcccggagca 120 agcgtgaaga tctcctgcaa ggccaccggc tacaccttca gcaactactg gatcgagtgg 180 gtgaagcaga ggcccggaca cggcctggag tggatcggcg agatcctccc cggcaccggc 240 aggaccatct acaacgagaa gttcaagggc aaggcaacct ttaccgccga catcagcagt 300 aacaccgtgc agatgcagct cagcagcctg accagtgagg acagcgccgt gtactactgc 360 gccaggaggg actactacgg caacttttac tatgccatgg attactgggg tcagggcacc 420 agtgtgaccg tgagctctgc tagcaccaag ggccccagcg tgttccctct ggcccccagc 480 agcaagagca ccagcggcgg aaccgccgcc ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc 540 gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcggc gctctgacca gcggagtgca caccttccct 600 gccgtgctgc agagcagcgg cctgtactcc ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc 660 agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg 720 gacaagaagg tggagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc 780 cccgagctgc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccctc ccaagcccaa ggacaccctg 840 atgatcagcc gcacccccga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc 900 gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagcct 960 cgggaggagc agtaccaatc cacctaccgc gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 1020 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgagca acaaggccct gcccgctccc 1080 atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagccccggg agcctcaggt gtacaccctg 1140 ccccccagcc gcgacgagct gaccaagaac caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc 1200 ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcctga gaacaactac 1260 aagaccaccc ctcccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc 1320 gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1380 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc ccggaagcgg aggtgcaggg 1440 ggatcctgcg acctgcccca gacccacagc ctgggcagca ggcgaaccct gatgctgctg 1500 gcccagatga ggaggatcag ccttttcagc tgccttaaag acaggcacga cttcggcttc 1560 ccccaggagg agttcggcaa ccagttccag aaggccgaaa ccatccccgt gttgcacgag 1620 atgatccagc agatcttcaa cctgttctcc accaaggata gttctgccgc gtgggacgag 1680 actttgctgg acaagttcta caccgagctg taccagcagt tgaacgacct ggaggcctgc 1740 gtgattcagg gcgtgggcgt gaccgagacg cctttgatga aggaagacag catcctggcc 1800 gtgaggaagt atttccagag gattacactg tacctgaaag agaagaagta cagcccctgc 1860 gcctgggaag tggtgagggc cgagatcatg aggtccttca gtttgagtac caacttgcag 1920 gaaagcctga gatctaagga gggcagtagc ggcaagcagt caagggtggt caaccacggc 1980 tctagcggag gaagcggtgg ctcagggggc agtatcagct acgacagccc cgactacaca 2040 gacgagagct gcaccttcaa gatcagcctg aggaacttca ggagcatcct gagctgggag 2100 ctgaaaaacc acagcatcgt gcccacccac tacaccctgc tgtacaccat catgagcaag 2160 cccgaggacc tgaaagtggt gaagaactgc gccaacacca caaggagctt ctgcgacctg 2220 accgacgagt ggaggagcac ccacgaggcc tacgtgaccg tgctggaggg cttcagcggc 2280 aacacaaccc tgttcagctg ctctcacaac ttctggctgg ccatcgacat gagctga 2337 <210> 51 <211> 778 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly 20 25 30 Ser Glu Leu Met Met Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala 35 40 45 Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg 50 55 60 Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly 65 70 75 80 Arg Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala 85 90 95 Asp Ile Ser Ser Asn Thr Val Gln Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 100 105 110 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn 115 120 125 Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 165 170 175 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 180 185 190 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215 220 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230 235 240 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 260 265 270 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 275 280 285 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 290 295 300 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 320 Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 325 330 335 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 340 345 350 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 355 360 365 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375 380 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 385 390 395 400 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 405 410 415 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 420 425 430 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 435 440 445 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 450 455 460 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly 465 470 475 480 Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 485 490 495 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 500 505 510 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 515 520 525 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln 530 535 540 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 545 550 555 560 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 565 570 575 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu 580 585 590 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 595 600 605 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 610 615 620 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 625 630 635 640 Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg Val 645 650 655 Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ile 660 665 670 Ser Tyr Asp Ser Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ser Cys Thr Phe Lys Ile 675 680 685 Ser Leu Arg Asn Phe Arg Ser Ile Leu Ser Trp Glu Leu Lys Asn His 690 695 700 Ser Ile Val Pro Thr His Tyr Thr Leu Leu Tyr Thr Ile Met Ser Lys 705 710 715 720 Pro Glu Asp Leu Lys Val Val Lys Asn Cys Ala Asn Thr Thr Arg Ser 725 730 735 Phe Cys Asp Leu Thr Asp Glu Trp Arg Ser Thr His Glu Ala Tyr Val 740 745 750 Thr Val Leu Glu Gly Phe Ser Gly Asn Thr Thr Leu Phe Ser Cys Ser 755 760 765 His Asn Phe Trp Leu Ala Ile Asp Met Ser 770 775 <210> 52 <211> 2337 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60 ctgagctacg gccaggtgca actgcaacag agcggcagcg agctgatgat gcccggagca 120 agcgtgaaga tctcctgcaa ggccaccggc tacaccttca gcaactactg gatcgagtgg 180 gtgaagcaga ggcccggaca cggcctggag tggatcggcg agatcctccc cggcaccggc 240 aggaccatct acaacgagaa gttcaagggc aaggcaacct ttaccgccga catcagcagt 300 aacaccgtgc agatgcagct cagcagcctg accagtgagg acagcgccgt gtactactgc 360 gccaggaggg actactacgg caacttttac tatgccatgg attactgggg tcagggcacc 420 agtgtgaccg tgagctctgc tagcaccaag ggccccagcg tgttccctct ggcccccagc 480 agcaagagca ccagcggcgg aaccgccgcc ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc 540 gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcggc gctctgacca gcggagtgca caccttccct 600 gccgtgctgc agagcagcgg cctgtactcc ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc 660 agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg 720 gacaagaagg tggagcctaa gagctgcgac aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc 780 cccgagctgc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccctc ccaagcccaa ggacaccctg 840 atgatcagcc gcacccccga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaggacccc 900 gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagcct 960 cgggaggagc agtaccaatc cacctaccgc gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 1020 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgagca acaaggccct gcccgctccc 1080 atcgagaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagccccggg agcctcaggt gtacaccctg 1140 ccccccagcc gcgacgagct gaccaagaac caggtgagcc tgacctgcct ggtgaagggc 1200 ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcctga gaacaactac 1260 aagaccaccc ctcccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc 1320 gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1380 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc ccggaagcgg aggtgcaggg 1440 ggatcctgcg acctgcccca gacccacagc ctgggcagca ggcgaaccct gatgctgctg 1500 gcccagatga ggaggatcag ccttttcagc tgccttaaag acaggcacga cttcggcttc 1560 ccccaggagg agttcggcaa ccagttccag aaggccgaaa ccatccccgt gttgtacaac 1620 atgatcagcc agatcttcaa cctgttctcc accaaggata gttctgccgc gtgggacgag 1680 actttgctgg acaagttcta caccgagctg taccagcagt tgaacgacct ggaggcctgc 1740 gtgattcagg gcgtgggcgt gaccgagacg cctttgatga aggaagacag catcctggcc 1800 gtgaggaagt atttccagag gattacactg tacctgaaag agaagaagta cagcccctgc 1860 gcctgggaag tggtgagggc cgagatcatg aggtccttca gtttgagtac caacttgcag 1920 gaaagcctga gatctaagga gggcagtagc ggcaagcagt caagggtggt caaccacggc 1980 tctagcggag gaagcggtgg ctcagggggc agtatcagct acgacagccc cgactacaca 2040 gacgagagct gcaccttcaa gatcagcctg aggaacttca ggagcatcct gagctgggag 2100 ctgaaaaacc acagcatcgt gcccacccac tacaccctgc tgtacaccat catgagcaag 2160 cccgaggacc tgaaagtggt gaagaactgc gccaacacca caaggagctt ctgcgacctg 2220 accgacgagt ggaggagcac ccacgaggcc tacgtgaccg tgctggaggg cttcagcggc 2280 aacacaaccc tgttcagctg ctctcacaac ttctggctgg ccatcgacat gagctga 2337 <210> 53 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly 20 <210> 54 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 55 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 56 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 57 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser 50 55 60 <210> 58 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile 50 55 <210> 59 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr Ser 50 55 <210> 60 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr 50 55 60 Ser 65 <210> 61 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Leu Ser Gly Arg 20 25 30 Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly 50 55 <210> 62 <211> 64 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Asp Val Asp Tyr Tyr Arg Glu Trp Ser Trp Thr Gln Val Ser 50 55 60 <210> 63 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Leu Lys Leu Asn Val Tyr Glu Glu Ile 50 55 <210> 64 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Gly Leu Ser Phe Thr Tyr Ser 50 55 <210> 65 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Lys Val Lys Ala Ala Leu Leu Thr Ser Trp Lys Ile Gly Val Tyr 50 55 60 Ser 65 <210> 66 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu 1 5 10 15 Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Gly Ser Ser Gly Lys Gln Ser Arg 20 25 30 Val Val Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly His Ala Phe Leu Lys Arg Asn Pro Gly 50 55

Claims (20)

  1. a. 중쇄 가변 영역 (서열식별번호: 7) 및 중쇄 불변 영역 (서열식별번호: 54), 및 (서열식별번호: 9)에 제시된 가변 경쇄를 포함하는, CD138 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
    b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
    c. (서열식별번호: 48)을 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
    를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
  2. 제1항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론의 N-말단이 (서열식별번호: 37)에 제시된 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
  3. 제1항에 있어서, 인터페론 마스크가 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
  4. 제1항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
  5. 제1항에 있어서, 기능적으로 활성인 돌연변이체가 YNS 돌연변이체인 표적화된 마스킹된 IFN.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체가 CD138에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
  7. 제1항의 표적화된 마스킹된 인터페론을 제조하는 방법.
  8. 제1항의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물로서, (i) 여기서, 임의로, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이고, 임의로, (a) 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 (b) 암은 조혈계에서 발생하고, (ii) 임의로, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  9. 도 59에 제시된 서열 (서열식별번호: 49)을 포함하는 조성물.
  10. 제9항의 조성물을 포함하는 키트.
  11. a. 중쇄 가변 영역 (서열식별번호: 7) 및 (서열식별번호: 9)에 제시된 가변 경쇄를 포함하는, CD138 항원에 특이적으로 결합하는 항체;
    b. 유형-1 인터페론의 N-말단이 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인, 유형-1 인터페론; 및
    c. (서열식별번호: 34)를 포함하고, 그에 의해 인터페론 마스크가 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착되는 것인, 인터페론 마스크
    를 포함하는 "표적화된 마스킹된 IFN".
  12. 제11항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론의 N-말단이 (서열식별번호: 38)에 제시된 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단에 융합된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
  13. 제11항에 있어서, 인터페론 마스크가 가요성 펩티드 링커를 추가로 포함하는 상기 유형-1 인터페론의 C-말단에 부착된 것인 "표적화된 마스킹된 IFN".
  14. 제11항에 있어서, 상기 유형-1 인터페론 또는 기능적으로 활성인 돌연변이체가 표 II에 제시된 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
  15. 제11항에 있어서, 기능적으로 활성인 돌연변이체가 YNS 돌연변이체인 표적화된 마스킹된 IFN.
  16. 제11항에 있어서, 상기 항체가 CD138에 결합하는 것인 표적화된 마스킹된 인터페론.
  17. 제11항의 표적화된 마스킹된 인터페론을 제조하는 방법.
  18. 제11항의 표적화된 마스킹된 IFN의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물로서, (i) 여기서, 임의로, 제약 조성물은 암의 치료를 포함하는 요법에 사용하기 위한 것이고, 임의로, (a) 암은 고형 종양에서 발견되는 암을 포함하거나; 또는 (b) 암은 조혈계에서 발생하고, (ii) 임의로, 제약 조성물은 1종 이상의 항-신생물제를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
  19. 도 25에 제시된 서열 (서열식별번호: 41)을 포함하는 조성물.
  20. 제19항의 조성물을 포함하는 키트.
KR1020247001492A 2021-06-18 2022-06-17 암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법 KR20240021943A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163259105P 2021-06-18 2021-06-18
US63/259,105 2021-06-18
PCT/US2022/000011 WO2022265679A2 (en) 2021-06-18 2022-06-17 FUSION PROTEIN COMPOSITION(S) COMPRISING MASKED TYPE I INTERFERONS (IFNα AND IFNβ) FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER AND METHODS THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240021943A true KR20240021943A (ko) 2024-02-19

Family

ID=82786512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247001492A KR20240021943A (ko) 2021-06-18 2022-06-17 암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4329794A2 (ko)
JP (1) JP2024523290A (ko)
KR (1) KR20240021943A (ko)
CN (1) CN117529330A (ko)
AU (1) AU2022292462A1 (ko)
CA (1) CA3221878A1 (ko)
IL (1) IL308959A (ko)
WO (1) WO2022265679A2 (ko)

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
BRPI0509274A (pt) 2004-03-26 2007-09-04 Pfizer Prod Inc usos de anticorpos anti-ctla-4
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
US8399219B2 (en) * 2009-02-23 2013-03-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease activatable interferon alpha proprotein
WO2014089354A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 The Regents Of The University Of California Cd138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
CA3136602A1 (en) * 2019-04-15 2020-10-22 Qwixel Therapeutics Llc Fusion protein composition(s) comprising targeted masked type i interferons (ifna and ifnb) and an antibody against tumor antigen, for use in the treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022292462A1 (en) 2023-12-07
CN117529330A (zh) 2024-02-06
WO2022265679A3 (en) 2023-01-26
EP4329794A2 (en) 2024-03-06
WO2022265679A2 (en) 2022-12-22
CA3221878A1 (en) 2022-12-22
IL308959A (en) 2024-01-01
WO2022265679A9 (en) 2023-05-19
JP2024523290A (ja) 2024-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7222024B2 (ja) 上皮増殖因子受容体変異体ｉｉｉおよびｃｄ３の単一および二重特異性抗体およびそれらの使用
US11136353B2 (en) Fusion protein composition(s) comprising masked type I interferons (IFNA and IFNB) for use in the treatment of cancer and methods thereof
JP6632984B2 (ja) 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体およびその使用
CN107532188B (zh) Cd20结合分子及其用途
US9777071B2 (en) Anti-DPEP3 antibodies and methods of use
EP2322560B1 (en) Anti-mesothelin antibodies
KR102522419B1 (ko) Baff-r 표적 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 및 그 용도
KR20180088445A (ko) 신규한 항-클라우딘 항체 및 사용 방법
KR20170123712A (ko) Ｃｘｃｒ4에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
JP7048567B2 (ja) 二重特異性抗原結合ポリペプチド
CN113825774A (zh) 抗cd47/抗pd-l1多抗原结合蛋白及其使用方法
JP2019525768A (ja) Ｂａｆｆ−ｒ抗体及びその使用
US20240279342A1 (en) Compositions and methods for immunotherapy
TW202309088A (zh) 新的穩定抗ｖｉｓｔａ抗體
KR20230009459A (ko) 인간 ceacam1/3/5에 특이적으로 결합하는 신규 항체 및 그의 용도
KR20240021943A (ko) 암의 치료에 사용하기 위한 마스킹된 유형 I 인터페론 (IFNα 및 IFNβ)을 포함하는 융합 단백질 조성물(들) 및 그의 방법
RU2819624C2 (ru) Композиции анти-cd112r антител и сопутствующие способы
CA3191224A1 (en) Multispecific binding compounds that bind to pd-l1