TW202221026A - 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途 - Google Patents

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塔瑪 瑪格達萊娜 齊姆
塔里克 阿夫羅茲
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Abstract

本發明屬於分子量為43kDa的反式啟動應答DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein，TARDB或也稱為TDP-43)的領域。本發明涉及人源化TDP-43特異性結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段或衍生物及其用途。本發明提供了診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43聚集體相關的包括但不限於以下的疾病、障礙和/或異常的手段和方法：額顳癡呆(frontotemporal dementia，FTD)、肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、慢性創傷性腦病(Chronic traumatic encephalopathy，CTE)和邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(Limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy，LATE)。

Description

人源化抗TDP-43結合分子及其用途
本發明屬於分子量為43kDa的反式啟動應答DNA結合蛋白(TARDB或也為TDP-43)的領域。本發明涉及人源化TDP-43特異性結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段或衍生物及其用途。本發明提供了診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病(proteinopathy)的手段和方法，所述疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病包括但不限於額顳癡呆(Frontotemporal dementia，FTD)、肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、慢性創傷性腦病(Chronic Traumatic Encephalopathy，CTE)和邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy，LATE)。
以蛋白質在中樞神經系統(central nervous system，CNS)(蛋白質病)和外周器官中病理性聚集為特徵的年齡相關性腦病是世界上失能和死亡率的主要原因之一。形成聚集體的最佳表徵的蛋白質是阿爾茨海默病和相關障礙中的β澱粉樣蛋白。導致神經變性的其他疾病相關的、傾向於聚集的蛋白質包括但不限於Tau、α-突觸核蛋白(aSyn、a-syn)、亨廷頓蛋白(huntingtin)、肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma，FUS)、通過C9orf72重複擴增的非常規翻譯產生的二肽重複蛋白(dipeptide repeat protein，DPR)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)和TDP-43。涉及TDP-43聚集體的疾病通常被列為TDP-43蛋白質病，包括但不限於ALS和FTD。
I. TDP-43介紹
反式啟動應答(transactive response，TAR)DNA結合蛋白43kDa(TDP-43)是由染色體1p36.2(ALS10)上的TARDBP基因編碼的具有414個氨基酸的蛋白質。TARDBP由六個外顯子(外顯子1是非編碼的；外顯子2至6是蛋白質編碼的)構成。TDP-43屬於異質核糖核蛋白(hnRNP)RNA結合蛋白家族(Wang et al.,Trends in Molecular Medicine Vol.14 No.11,2008,479-485；Lagier-Tourenne et al.,Human Molecular Genetics,2010,Vol.19,Review Issue 1 R46-R64)。TDP-43包含五個功能結構域(Warraich et al.,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 42(2010)1606-1609，圖1)：兩個RNA識別基序(RRM1和RRM2)，其具有兩個高度保守的六聚核糖核蛋白2(ribonucleoprotein 2，RNP2)和八聚核糖核蛋白1(ribonucleoprotein 1，RNP1)區域；核輸出信號(nuclear export signal，NES)和核定位元信號(nuclear localization signal，NLS)，使其能夠在細胞核和細胞質之間穿梭，轉運結合的mRNA；以及位於C-末端的富含甘氨酸的結構域，其介導蛋白質間相互作用。TDP-43涉及RNA加工的多個方面，包括轉錄、剪接、轉運和穩定化(Buratti and Baralle,FEBS Journal 277(2010)2268-2281)。TDP-43是高度保守、普遍表達且表達水準嚴格自調節的蛋白質，其不斷在細胞核與細胞質之間穿梭，但主要定位於細胞核。2006年，TDP-43被鑒定為在絕大部分具有tau陰性、泛素陽性包涵體的額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration，FTLD)(之後稱為FTLD-TDP)的病例中，以及在大多數肌萎縮側索硬化(ALS)病例中積累的蛋白質(Arai et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications 351(2006)602-611；Neumann et al.,Science 314,(2006),130-133)。
已在散發性和家族性ALS患者以及患有遺傳性FTD的患者中鑒定了38個TDP-43負顯性突變，其主要位於富含甘氨酸的結構域中(Lagier-Tourenne and Cleveland,Cell 136,2009,1001-1004，圖1)。TDP-43本質上是傾向聚集的，如沉降測定所示，並且這種傾向由於一些ALS相關的TARDBP突變而進一步提高(Ticozzi et al.,CNS Neurol.Disord.Drug Targets.2010,9(3),285-296.)使TDP-43聚集與臨床疾病表現相聯繫。
II.神經變性中的TDP-43
已在越來越多的神經退行性病症中鑒定出TDP-43聚集體(Lagier-Tourenne et al.,Human Molecular Genetics,2010,Vol.19,Review Issue 1 R46-R64)，包括但不限於：額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元疾病(motor-neuron disease，MND)、有顆粒蛋白前體(Granulins，GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(valosine-containing protein，VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病(Argyrophilic grain disease)、皮克病(Pick’s disease)、語義變異型原發性進行性失語(semantic variant primary progressive aphasia，svPPA)、行為變異型FTD(behavioural variant FTD，bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(Nonfluent Variant Primary Progressive Aphasia，nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(angiogenin，ANG)突變)、亞歷山大病(Alexander disease，AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(Chronic traumatic encephalopathy，CTE)、佩里綜合征(Perry syndrome)、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征(Down syndrome)、家族性英國型癡呆(Familial British dementia)、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3(spinocerebellar ataxia type 3)；也稱為馬-約病(Machado Joseph Disease)))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白突變(valosin-containing protein，VCP；以及佩吉特骨病(Paget disease of bone)和額顳癡呆)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(myotilin，MYOT)基因突變或編碼結蛋白(desmin,DES)之基因的突變的肌原纖維肌病))、創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury，TBI)、路易體癡呆(Dementia with Lewy Body，DLB)或帕金森病(PD)。術語LATE旨在涵蓋與TDP-43蛋白質病相關的幾個先前使用的名稱，這些名稱可能與認知損害相關，包括海馬硬化、衰老性海馬硬化、海馬硬化性癡呆、腦年齡相關性TDP-43及硬化(cerebral age related TDP-43 with sclerosis,CARTS)，和老年人中的TDP-43病理狀況(綜述參見Kuslansky et al.，2004；Lippa and Dickson，2004；Nelson et al.，2013，2016b；Dutra et al.，2015)。
來自患者腦的聚集TDP-43顯示出大量異常修飾，包括過度磷酸化、泛素化、乙醯化和通過蛋白水解切割的C-末端片段(Arai et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications 351(2006)602-611；Neumann et al.,Science 314,(2006),130-133；Neumann et al.,Acta Neuropathol.(2009)117：137-149；Hasegawa et al.,(2008)Annals of Neurology Vol 64 No 1,60-70；Cohen et al.,Nat Commun.6：5845,2015)。TDP-43病理狀況的另一個特徵性特徵是TDP-43從細胞核到細胞質的重分佈和積累。FTLD-TDP的標誌性病變是神經元胞質包涵體和膠質細胞胞質包涵體(分別為NCI(neuronal cytoplasmic inclusion)和GCI(glial cytoplasmic inclusion))和營養不良性神經突(dystrophic neurite，DN)，其對TDP-43以及泛素和p62具有免疫反應性，但對其他神經退行性疾病相關蛋白呈陰性。包涵體形態及其組織分佈的差異與特定突變和/或臨床表現相關。迄今為止，通過組織學分類描述了四種類型的TDP-43病理狀況(Mackenzie and Neumann,J.Neurochem.(2016)138(增刊1),54-70)。FTLD-TDP A型病例的特徵在於大量的短的營養不良性神經突(dystrophic neuritis，DN)和緊湊的橢圓形或新月形NCI，主要在新皮質II層(Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2f)。這種病理的情況通常在臨床上在行為變異型額顳癡呆(behavioral variant frontotemporal dementia，bvFTD)或非流利性/語法變異型原發性進行性失語(nonfluent variant primary progressive aphasia，nfvPPA)的情況下出現，並且與顆粒蛋白前體(GRN)突變相關。B型病例在淺表和深皮質層二者中均顯示出中等數目的緊湊或顆粒狀NCI，且具有相對較少的DN和NII(神經元核內包涵體(neuronal intranuclear inclusion,NII)；Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2g)。發現大多數同時出現FTD和ALS症狀的病例具有FTLD-TDP B型病理。C型病例有大量長而彎曲的神經突，主要在淺表皮質層中，具有很少或沒有NCI(Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2j)。這種病理特別地在出現語義變異型原發性進行性失語(Semantic Variant Primary Progressive Aphasia，svPPA)的病例中發現。FTLD-TDP D型顯示在新皮質層中具有豐富的豆狀神經元核內包涵體(NII)和短的DN，且具有僅稀少的NCI(Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2k)。E型的特徵在於：除白質中的曲線 性少突膠質細胞包涵體之外還有顆粒絲狀神經元包涵體(granulofilamentous neuronal inclusion，GFNI)和非常細的點狀神經氈聚集體，其影響所有新皮質層(Edward B.Lee et al.,Acta Neuropathol.2017 July；134(1)：65-78.)。這種病理模式僅在VCP與包涵體肌炎相關的病例中發現。
III. FTD中的TDP-43
額顳癡呆(FTD)是一個臨床術語，其涵蓋基於額和顳葉的變性-稱為額顳葉變性(FTLD)的病理性特徵的廣譜障礙。FTD是65歲以下年齡組中早期退行性癡呆的第二大最主要原因(Le Ber,Revue Neurologique 169(2013)811-819)。FTD表現為數種綜合征，包括以人格和行為變化為特徵的bvFTD；以語言功能變化為特徵的語義癡呆(semantic dementia，SD)和進行性非流利性失語(progressive nonfluent aphasia，PNFA)；以運動功能障礙為特徵的皮質基底節綜合征(corticobasal syndrome，CBS)、進行性核上性麻痹綜合征和運動神經元疾病(FTD-MND)。這些綜合征的臨床診斷複雜並且最終結論只能通過進行死後組織病理學分析以檢測聚集的蛋白質並確定受影響的腦區域而得出。就病理性蛋白質包涵體而言，約45%的病例顯示出錯折疊Tau的病理性積累，45%的病例具有病理性TDP-43並且較小的亞組具有FUS和其他蛋白質的聚集體。
IV. ALS中的TDP-43
肌萎縮側索硬化(ALS)是一種神經退行性疾病，其特徵在於上和下運動神經元的過早喪失。ALS的進展以致命性麻痹和呼吸衰竭為特徵，其病程從診斷到死亡為1至5年。在大多數散發性ALS病例中，該神經病理的特徵在於初級運動皮質、腦幹運動核、脊髓和相關白質道的神經元和膠質細胞中TDP-43的異常細胞質積累。伴有癡呆的ALS涉及運動外新皮質和海馬中TDP-43的積累。TDP-43磷酸化在ALS患者中的作用已借助於抗體進行了探索，所述抗體與細胞核和細胞質包涵體中磷酸化TDP-43特異性結合，其中氨基酸S379、S403、S404、S409、S410為TDP-43磷酸化的主要位點(Hasegawa et al.,Ann Neurol 2008；64：60-70；Neumann et al.,Acta Neuropathol(2009)117：137-149)。
V. AD和其他疾病中的TDP-43
TDP-43病理狀況發生在多達57%的患有阿爾茨海默病的患者的腦中(Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(6)：811-824；Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(3)：441-450；McAleese et al.,Brain Pathol.2017 Jul；27(4)：472-479)。TDP-43聚集與患者的年齡相關，並且與AD中認知下降、記憶喪失和顳內側萎縮相關。顯然，在AD中，TDP-43代表與顳葉內側中β澱粉樣蛋白和tau病理共有重疊腦分佈的第二或獨立的病理。病理性TDP-43遵循常規的進行性沉積模式，這種模式已通過所謂的AD中TDP-43(TAD)分期方案進行了描述：TDP-43首先在杏仁核中沉積(I期)，然後在海馬、邊緣、顳並且最終是額葉紋狀體(frontostriatum)(V期)中沉積(Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(6)：811-824；Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(3)：441-450)。
VI. TDP-43擴散
儘管ALS和FTD發作和初始症狀在患者間明顯不同，但疾病進展的共同特徵是病理從最初的病灶區域向大多數神經元擴散。症狀的持續惡化可通過TDP-43病理狀況的進行性擴散來解釋。ALS患者腦中的TDP-43病理狀況顯示以四階段過程擴散並且認為使用順行軸突運輸通過離皮質軸突透射經突觸發生傳播(Brettschneider et al.,Ann Neurol.2013 July；74(1)：20-38.)。最近的實驗證據支持β澱粉樣蛋白、Tau、α-突觸核蛋白和TDP-43通過朊病毒樣機制在神經元組織中進行蛋白質傳播的假設(Hasegawa et al.,2017)，其中起點和地形學擴散模式對於四種蛋白質是不同的(Brettschneider J et al.,Nature Rev.Neuroscience,2015,109)。認為常見的疾病統一機制是基於病理性蛋白質聚集體的細胞間擴散。該機制由以下組成：聚集體從病變細胞釋放，被幼稚細胞攝取，以及通過內源性蛋白質的範本化構象變化對病理性蛋白質構象進行播種(seed)。
TDP-43細胞間擴散已在分子水準上在少數體外模型中進行了研究，其中來自患者腦的不溶性TDP-43製備物能夠誘導接受體細胞中的細胞內聚集體形成(Nonaka et al.,Cell Reports 4(2013),124-134；Feiler et al.,2015； Porta et al.,Nat.Comm.,2018)。此外，已觀察到細胞內TDP-43聚集體在擴散至下一個細胞之前與外排體聯合釋放(Nonaka et al.,Cell Reports 4(2013,124-134))。類似地，腺病毒轉導的TDP-43表達導致磷酸化、泛素化且更重要地充當啟動細胞間擴散的種子(seed)的細胞質聚集體(Ishii et al.,PLoS ONE 12(6)：e0179375,2017)。患者來源的病理性TDP-43在顱內接種到轉基因小鼠和野生型小鼠之後可導致內源性TDP-43廣泛沉積(Porta et al.,Nat.Comm.,2018)。
VII. TDP-43蛋白質病的預防和治療
TDP-43聚集和病理擴散是ALS和FTD-目前不可治癒的致命性疾病的主要標誌。因此，需要新的方法來治療和預防TDP-43蛋白質病。TDP-43中的突變與ALS和FTD的家族性病例相關，提供了TDP-43錯折疊與疾病進展之間的因果聯繫。
VIII. TDP-43蛋白質病的診斷
基於臨床表現的FTD診斷是不充分的，因為臨床表現可與其他疾病重疊，特別是在早期階段。
許多方法旨在開發生物化學生物標誌物來區分不同類型的FTD病理。針對TDP-43不同構象的抗體的開發可允許產生更加靈敏且特異性的診斷工具。與生物化學生物標誌物並行，成像生物標誌物的開發能夠實現TDP-43蛋白質病中病理的早期且特異性檢測。對腦中TDP-43沉積成像的能力可為TDP-43蛋白質病的診斷和藥物開發的重大成就。使用細胞可滲透的抗體片段可實現這樣的檢測。
基於不同蛋白質的錯折疊的神經退行性疾病中最早的事件是獲得使蛋白質有毒的替代構象。此外，這種錯折疊的構象可通過將內源性正常蛋白質募集到錯折疊的構象中而自傳播，作為觀察到的通過受影響組織擴散的機制基礎。
為了開發針對給定蛋白質的不同構象狀態的抗體，設計了超分子抗原性構建體，其中控制所呈遞抗原的構象以產生針對特定構象狀態下給定靶 標的構象特異性抗體(WO2012/055933和WO2012/020124)。構象特異性抗體提供許多優勢，因為其可區分這些蛋白質的疾病相關構象與功能性內源性構象。該方法在治療應用中提供了許多優勢，因為這樣的抗體在靶向蛋白質的錯折疊疾病相關異形體的同時不太可能被其正常構象吸引。與此類似，在診斷應用中，這樣的抗體僅識別蛋白質的疾病相關結構狀態，這對於靈敏且特異性的診斷的開發至關重要。
基於TDP-43的生物標誌物在TDP-43蛋白質病中的應用仍有待建立。這樣的評價受到阻礙，部分是由於缺乏可用於合適免疫測定中用來對生物流體中病理性TDP-43進行定量的高親和力抗體(Feneberg et al.,Molecular Neurobiology,2018)。
因此，明確需要能夠檢測，特別是在人樣品中檢測錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的生物標誌物，用於診斷不同類型的TDP-43蛋白質病和/或用於監測用於治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和異常、或TDP-43蛋白質病的治療藥物的效力。
TDP-43蛋白質病定義為一組以病理性TDP-43為特徵的神經退行性疾病。
IX.現有技術
專利申請WO 2008/151055公開了使用生物流體中TDP-43多肽和/或TDP-43多肽切割產物(例如25kD和35kD TDP-43多肽切割產物)的水準來確定哺乳動物是否患有神經退行性疾病的方法和材料。
專利申請WO 2013/061163公開了TDP-43特異性結合分子，其包括多肽例如人抗體及其片段、衍生物和變體。
鑒於上述內容，存在對結合錯折疊的聚集TDP-43和非聚集的生理性TDP-43的人源化抗TDP-43結合分子的需求。這樣的人源化結合分子、特別是抗體及其抗原結合片段可與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的特定表位結合。此外，開發可區分FTD譜內病理狀況類型的敏感和特異性生物標誌物是一項緊 迫的任務。
本文中提供的一些實施方案解決了該技術問題。
本發明的結合分子是鼠抗體的人源化形式，特別地，它們是與人TDP-43(SEQ ID NO：1)結合的鼠單克隆抗體的人源化形式。選擇本文中稱為ACI-7069-633B12-Ab1的抗體來開發人源化結合分子。如本文中所述，該抗體源自雜交瘤克隆633B12C8。它與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位氨基酸內的表位結合。更特別地，它與來自人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位氨基酸的表位結合。該抗體具有SEQ ID NO：28中所示的VH核苷酸序列和SEQ ID NO：29中所示的VL核苷酸序列(由其編碼)，參見本文中表10。該抗體具有SEQ ID NO：20中所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO：24中所示的VL氨基酸序列，參見本文中表11。該抗體具有SEQ ID NO：21中所示的VH CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：22中所示的VH CDR2氨基酸序列和ES的VH CDR3氨基酸序列，參見本文中表11。該抗體具有SEQ ID NO：25中所示的VL CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：16中所示的VL CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：27中所示的VL CDR3氨基酸序列，參見本文中表11。
所選擇的CDR(Complementarity Determining Region，互補決定區)序列可在特定位置處發生突變。在一些實施方案中，進行這樣的突變以避免潛在的翻譯後修飾位點。在一些具體的實施方案中，以下殘基中的一個或更多個、直至所有在VH區(CDRH2)中發生突變：N53、N54和G55。一些具體突變包括：N53G、N53S、N53Q、N54Q、N54G和G55A。殘基根據Kabat進行編號。在一些具體的實施方案中，以下殘基中的一個或更多個、直至所有在VL區(CDRL1和/或CDRL2和/或CDRL3)中發生突變：K24、D28、G29、D55、S56和W89。殘基根據Kabat進行編號。一些具體突變包括：K24R、D28E、D28G、G29A、D55E、S56A、W89Y、W89F和W89L。
在一些具體的實施方案中，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段包含人重鏈可變結構域亞家族1框架序列。更特別地，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段可包含IGHV1-3(IMGT登錄號X62109、X62107、MK540645、MH779622和 MN337616；UniProtKB-A0A0C4DH29)、IGHV1-2(IMGT登錄號X07448、X62106、X92208、KF698733、HM855674、MH267285和MN337615；UniProtKB-P23083)、IGHV1-46(IMGT登錄號X92343、J00240、L06612和MK540650；UniProtKB-P01743)或IGHV1-24(IMGT登錄號M99642；UniProtKB-A0A0C4DH33)VH框架序列，優選IGHV1-3 VH框架序列。
在一些具體的實施方案中，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段包含人輕鏈可變結構域κ亞家族2框架序列。更特別地，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段可包含IGKV2-30(IMGT登錄號X63403和FM164408；UniProtKB-P06310)、IGKV2-29(IMGT登錄號X63396、U41645和AJ783437；UniProtKB-A2NJV5)、IGKV2D-29(IMGT登錄號M31952和U41644；UniProtKB-A0A075B6S2)或IGKV2-24(IMGT登錄號X12684；UniProtKB-A0A0C4DH68)VL框架序列，優選IGKV2-30或IGKV2-29 VL框架序列，最優選IGKV2-30 VL(IMGT登錄號X63403和FM164408)框架序列，特別是IGKV2-30*02 VL(IMGT登錄號FM164408)框架序列。
所選擇的框架序列可在特定位置處發生突變。在一些實施方案中，進行這樣的突變以積極影響CDR環構象和/或VH和VL結構域之間的可變結構域堆積(packing)。在某些實施方案中，下表12中所列的根據Kabat編號的殘基中的一個或更多個、直至所有發生突變。在一些具體的實施方案中，進行了根據Kabat編號的以下VH突變中的一個或更多個、直至所有：Q1E、A24T、R38K、P41H、M48I、V67A、I69L、R71V、T73K。在可與VH突變組合的一些具體實施方案中，進行了以下VL突變(根據Kabat編號)中的一個或更多個、直至所有：R24K、F36L、R45K、G57R、V58I。
因此，本發明涉及特異性識別錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。在本發明中，錯折疊的TDP-43包括錯折疊的單體TDP-43和/或錯折疊的寡聚TDP-43和/或錯折疊的聚集和/或經翻譯後修飾的TDP-43和/或錯折疊的截短TDP-43。經翻譯後修飾的TDP-43包含磷酸化、泛素化、乙醯化、類泛素化和/ 或甲基化的TDP-43。生理性TDP-43包括可溶性細胞核TDP-43。本文中表明，本發明的人源化結合分子能夠結合病理性TDP-43，包括TDP-43聚集體和磷酸化TDP-43。因此，本發明提供了特異性識別錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。這樣的結合分子在本文中稱為人源化“泛-TDP-43”結合分子、特別是人源化泛-TDP-43抗體。如本文中說明的，本發明的人源化TDP-43結合分子可同等地結合錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43，或者在與兩種類型的TDP-43特異性結合時相對于一者優先與另一者結合。本發明還提供了用於預防、減輕、治療和/或診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和異常、或TDP-43蛋白質病的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。本發明還提供了用於檢測和/或瞭解(即鑒定)引起神經變性的特定病理類型的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。設想了用作診斷性生物標誌物，實現臨床研究中縱向監測的更有效且精確的物件選擇，支援TDP-43蛋白質病的新治療的開發的用途。
本發明還提供了作為藥物(治療劑)的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。
不希望受理論束縛，本發明是基於以下假設而開發的：來源於TDP-43蛋白的經修飾構象特異性抗原性肽和肽片段或整個TDP-43蛋白以及可通過或通過使用所述肽或片段或整個TDP-43蛋白作為抗原而獲得的人源化抗體阻斷TDP-43細胞間傳播，和/或使TDP-43聚集體解聚和/或阻斷TDP-43播種和/或抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集。本發明的人源化結合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與錯折疊的聚集TDP-43，特別是與細胞質錯折疊TDP-43和細胞外錯折疊TDP-43結合。本發明的人源化結合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與全長TDP-43和/或截短的TDP-43結合。在一個實施方案中，本發明的人源化結合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞質錯折疊TDP-43特異性結合。
錯折疊的聚集TDP-43或病理相關TDP-43由失去其正常折疊(即 是錯折疊的)和定位的TDP-43蛋白構成。錯折疊的聚集TDP-43可在以下中發現：前包涵體(preinclusion)，以及神經元胞質包涵體和膠質細胞胞質包涵體(分別為NCI和GCI)、神經元核內包涵體(NII)和營養不良性神經突(DN)，其對TDP-43具有免疫反應性。
非聚集生理性TDP-43是主要位於細胞核並穿梭至細胞質，處於能夠在體內細胞環境中展示其期望功能的狀態的生理功能性TDP-43蛋白。
本發明的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段，出乎意料地具有以下特徵中的至少一個，優選兩個，更優選三個，甚至更優選全部四個：
- 阻斷TDP-43細胞間傳播；
- 使TDP-43聚集體解聚；
- 抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集；
- 阻斷TDP-43播種；
- 阻斷TDP-43擴散。
獨立於一個、兩個、三個、四個或五個上述列舉特徵的組合，本發明的人源化抗TDP-43結合分子，優選人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段，可改善/抑制/降低TDP-43蛋白質病體內模型中並且更重要地患有TDP-43病理狀況的患者中TDP-43病理狀況的形成。
人源化抗TDP-43結合分子與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位元氨基酸內的區域結合，更特別地，人源化TDP-43結合分子與人TDP-43(SEQ ID NO：1)第400至405位氨基酸殘基內的表位結合。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子包含：
- 包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；和
- 包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3。
本發明尤其另外涉及：(i)包含人源化TDP-43結合分子的免疫綴合物，(ii)包含人源化TDP-43結合分子的經標記抗體，(iii)包含人源化TDP-43結合分子和可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物，(iv)人源化TDP-43結合分子，其用於人用或獸用藥物用途，(v)人源化TDP-43結合分子，其用於預防、減輕、治療與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，(vi)人源化TDP-43結合分子，其用於診斷用途(特別是用於體內診斷，但也用於體外測試)，(vii)人源化TDP-43結合分子，其用於研究用途，特別是作為分析工具或參考分子，(viii)人源化TDP-43結合分子，其用作監測與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的診斷工具，(ix)通過用人源化TDP-43結合分子治療患有與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的個體來在所述個體中保持或提高認知記憶能力或減緩記憶喪失的方法，(x)通過用人源化TDP-43結合分子治療所述個體來降低個體中聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43水準的方法，(xi)編碼人源化TDP-43結合分子的核酸分子，(xii)包含本發明核酸分子的重組表達載體，(xiii)包含本發明核酸和/或載體的宿主細胞，(xiv)包含本發明重組表達載體的無細胞表達系統，(xv)用於產生人源化TDP-43結合分子的方法，(xvi)使用人源化TDP-43結合分子對從物件獲得的樣品中的TDP-43進行定量的方法，以及(xvii)包含本發明的人源化TDP-43結合分子和/或核酸、表達載體、宿主細胞和/或用於產生它們的無細胞表達系統的試劑盒。
本發明的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段，可募集和/或啟動小膠質細胞。更特別地，本發明的人源化TDP-43結合分子可在細胞尺寸和活化狀態方面影響小膠質細胞形態。這可有助於由本發明的TDP-43結合分子表明的TDP-43病理狀況降低。
在本發明中，人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段，特異性識別TDP-43。本發明的人源化結合分子包括對TDP-43蛋白具有特異性的人源化多肽和/或人源化抗體和/或其抗原結合片段。“特異性識別TDP-43”意指，與其他表位相比，本發明的人源化結合分子特異性地、一般地且共同地以更大的親和力與TDP-43，特別是TDP-43中的一些表位，特別是 TDP-43蛋白的以一種或更多種病理性構象暴露/可及的表位結合。本發明的與TDP-43特異性結合的人源化結合分子、特別是人源化多肽，更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，特異性識別錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43。
本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與非聚集生理性TDP-43和聚集TDP-43二者結合。因此，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，可與可溶性TDP-43和聚集TDP-43大致同等良好地結合。本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與非聚集TDP-43相比，可與聚集TDP-43大致同等地結合。更具體地，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞核中的非聚集TDP-43相比，可與細胞質中的聚集TDP-43大致同等地結合。在另一些實施方案中，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與非聚集TDP-43相比，可優先與聚集TDP-43結合。更具體地，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞核中的非聚集TDP-43相比，可優先與細胞質中的聚集TDP-43結合。或者，在另一些實施方案中，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與聚集TDP-43相比，可優先與非聚集TDP-43結合。更特別地，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞質中聚集TDP-43相比，可優先與細胞核中的非聚集TDP-43結合。這些結合特性可例如使用免疫組織化學來證明。
在一些實施方案中，本發明涵蓋特異性結合TDP-43的本文中所述的本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體及其抗原結合片段，以及這些人源化結合分子診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的用途，所述疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病包括但不限於：額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE) 和邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。本文中公開的方法和組合物可應用於診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，包括但不限於額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)。優選地，這些人源化結合分子診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的用途針對肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)或額顳癡呆(FTD)。更優選地，該用途針對肌萎縮側索硬化(ALS)。更優選地，該用途針對阿爾茨海默病(AD)。更優選地，該用途針對額顳癡呆(FTD)。
在另一個實施方案中，使對TDP-43具有特異性的本文中所述的本發明的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段與樣品接觸以檢測、診斷和/或監測與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，其選自額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。
在一個實施方案中，本發明涵蓋特異性結合TDP-43的本文中所 述的本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段，以及這些人源化結合分子，特別是這些人源化抗體檢測樣品中TDP-43的存在的用途。因此，本發明的人源化TDP-43結合分子，例如本文中所述的人源化抗TDP43抗體可特別用於針對樣品中TDP-43的存在篩選臨床樣品，特別是人血液、CSF、組織間液(interstitial fluid，ISF)和/或尿，例如，通過使用基於ELISA的測定或表面適應測定進行。在一些情況下，可使用組織樣品，例如腦組織樣品。本發明的方法和組合物還可應用於診斷症狀前疾病和/或監測疾病進展和/或治療效力。根據一些實施方案，使對TDP-43具有特異性的人源化抗體(例如，全長人源化抗體或人源化抗體的TDP-43結合片段或衍生物)與樣品(例如，血液、腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)、組織間液(ISF)或腦組織)接觸以檢測、診斷和/或監測額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。本發明的人源化TDP-43結合分子可用于對合適樣品，特別是臨床樣品，例如血液、CSF、ISF或尿中的TDP-43進行定量，其中與合適的對照相比，相對高的TDP-43水準指示患病和/或患有較晚期的疾病。許多合適的免疫測定形式是已知的。因此，可出於診斷目的進行該方法(例如ELISA、MSD(中尺度發現(Meso Scale Discovery))、HTRF(均 相時間分辨螢光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence))和AlphaLISA)，其中高TDP-43水準指示患病。或者，可出於監測目的進行該方法。隨時間提高的水準可指示疾病進展。隨時間降低的水準可指示疾病消退。該方法還可用於監測治療，特別是監測特定治療的效力。成功的治療可參考治療之後穩定或下降的TDP-43水準來測量。本文中表明(實施例12)，來自TDP-43蛋白質病患者的CSF樣品中的TDP-43水準高於取自健康物件(健康對照)的對照樣品中的。對照樣品可以或可以不與受試樣品並行運行。在一些實施方案中，對照水準是在類似或相同的實驗條件下由取自健康物件的一系列對照樣品確定的，並且用作在受試樣品中確定的水準的比較水準。使用本發明的人源化結合分子對合適樣品中TDP-43進行定量的方法也可用於選擇治療(用於物件的另外的治療)。因此，設想了個性化治療方法。在治療之前和之後取樣。如果使用該治療的治療導致在治療之後穩定或優選降低的TDP-43水準，則可為該物件選擇該治療。如果該治療在治療之後不導致穩定或優選降低的TDP-43水準，則不為物件選擇該治療。該治療可以是用於治療TDP-43蛋白質病的任何合適的候選治療劑。在一些優選實施方案中，所述治療包含本發明的人源化TDP-43結合分子，通常以如本文中所述的藥物組合物的形式。
本發明的人源化TDP-43結合分子還可用于將疾病分類為特定類型或亞型。因此，提供了用於對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常進行分類或用於對TDP-43蛋白質病進行分類的方法，其包括：
a.進行本發明的方法，其中與合適的對照相比較地對TDP-43的水準進行定量；
b.任選地鑒定來自物件的樣品中的突變，包括但不限於顆粒蛋白前體(GRN)突變、C9orf72突變、TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、TARDBP突變、血管生成蛋白(ANG)突變)、含纈酪肽蛋白(VCP)突變、肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變；以及
c.對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病進行分類。
類似地，提供了用於對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常進行分類或用於對TDP-43蛋白質病進行分類的方法，其包括：進行本發明的方法，其中對從患有與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的物件獲得的樣品中的TDP-43的水準進行定量，其中將該水準與取自患有不同類型或亞型的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的對象的對照樣品(即，針對目標類型或亞型確定一組代表性對照水準)進行比較；並基於比較結果對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病進行分類。因此，分類基於確定受試樣品與一個或更多個對照樣品之間的最接近的匹配。這些方法還可包括鑒定樣品中的突變，包括但不限於顆粒蛋白前體(GRN)突變、C9orf72突變、TADBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、TARDBP突變、血管生成蛋白(ANG)突變)、含纈酪肽蛋白(VCP)突變、肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)的基因的突變，其中鑒定出的突變也用於對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病進行分類。為免生疑問，對樣品中突變的鑒定可通過任何合適的方法進行；例如，基於樣品內核酸分子的核酸測序。樣品可與其中測定TDP-43水準的樣品分開和不同，但來自同一物件。
在另一些實施方案中，本發明提供了用於預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的方法。根據一個實施方案，本發明的方法包括向物件施用有效濃度的本文中所述的對TDP-43具有特異性的本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體(例如，全長抗體或抗體的TDP-43結合片段或衍生物)。在另一個實施方案中，本發明提供了用於預防、減輕和/或治療TDP-43蛋白質病的方法。根據一些實施方案，施用對TDP-43具有特異性的本文中所述的人源化結合分子、特別是本發明的人源化抗體或其抗原結合片段，以治療、減輕和/或預防額顳變性(FTD)或肌萎縮側索硬化(ALS)。在另一個實施方案中，施用對TDP-43具有特異性的本文中所述的人源化結合分子、特別是本發明的人源化抗體或其 抗原結合片段以預防、減輕和/或治療選自以下的神經退行性疾病：額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
在另一個實施方案中，施用對TDP-43具有特異性的本文中所述的人源化結合分子、特別是本發明的人源化抗體或其抗原結合片段以預防、減輕和/或治療選自以下的疾病：額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。
圖1：來自患有具有A型病理的額顳癡呆(FTD)的物件的組織切片中TDP-43的檢測。使用用於檢測的經螢光標記的二抗對來自具有A型病理的FTD物件的額皮質的10μm厚冷凍切片進行免疫組織化學。使用以下抗體作為對照：用於檢測病理性包涵體和生理性細胞核TDP-43的兔多克隆泛TDP-43抗體(Proteintech，10782-2-AP)；用於檢測病理性聚集和磷酸化TDP-43的兔單克 隆磷酸化TDP-43 p409/410抗體(Cosmobio，TIP-PTD-P02)。箭頭指示TDP-43聚集體；粗箭頭指示細胞核中的生理性TDP-43(細胞核通過DAPI染色視覺化)。雜交瘤名稱或商業抗體來源示出於每個圖像的左上角。
圖2：從FTD A型死後腦組織(額皮質)獲得的洗滌劑(sarkosyl)可溶性和不溶性級分中的TDP-43檢測。在與N端區域(A，B)或C端區域(C)結合的商業抗體的情況下的免疫印跡顯示在sarkosyl可溶性(泳道1)和不溶性(泳道2)級分中存在TDP-43。表位元在TDP-43的N端區域的在該研究中產生的針對TDP-43的mAb的免疫印跡(D至I)。在TDP-43的C端區域結合的針對TDP-43的mAb的免疫印跡(J至N)。針對TDP-43的所有mAb均特異性識別全長TDP-43。另外，一些mAb(K、M、N)識別病變狀態的病理特徵，例如不溶性級分中的C端片段。
圖3：示出了針對經載劑(n=30，灰色條)和經ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(n=25，帶點的灰色條)處理的小鼠的兩個腦區域：紋狀體(A)和大腦皮質(B)所測量的pTDP-43免疫反應物體的密度。(C)經載劑(n=30)和經ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(n=25)處理的組中針對總TDP-43對從左腦半球的皮質中獲得的不溶性級分進行定量(*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。
圖4：在30小時之後通過600nm處的濁度測量在存在ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)或同種型對照的情況下通過TEV切割誘導的TDP-43聚集。將30小時之後的終點相對於同種型對照(灰色條)歸一化，並針對ACI-7069-633B12-Ab1(帶點的灰色條)計算聚集TDP-43(%)。示出了三個獨立實驗的平均值±SD，並且通過Welch t檢驗分析同種型對照與ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)之間的統計學差異(***p<0.001)。
圖5：(A)示出了針對經載劑(n=16，灰色條)和經ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(n=16，帶點的灰色條)處理的小鼠的腦皮質所測量的Iba1陽性免疫反應面積。誤差棒表示平均值的標準誤差(SEM)。(B至C)示出了針對經載劑(n=16，灰色條)和經ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(n=16，帶點的灰色條)處理的小鼠的腦皮質所測量的平均小膠質細胞尺寸。小膠質細 胞基於其形態分類為三類：(B)大肥大性(large hypertrophic)，(C)小分枝(small ramifying)和(D)分枝靜息(ramified resting)。通過t檢驗分析載劑對照與ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)之間的統計學差異(*p<0.05)。
圖6：使用AlphaLISA測定使用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)和ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a變體)，對多個FTLD-TDP患者與健康對照的CSF中TDP-43水準進行定量。對多個CSF樣品(x軸)獲得總TDP-43的原始AlphaLISA計數(y軸)。使用組、實驗、性別和年齡作為固定因素，並將個體作為隨機因素用來自三個獨立實驗的資料使用線性混合模型對原始計數進行統計學分析(**p<0.01)。
圖7：來自從FTD A型死後腦組織中獲得的洗滌劑(sarkosyl)不溶性級分的通過抗體ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(1)、ACI-7069-642D12-Ab1(IgG2a變體)(2)和小鼠IgG2a對照(3)的TDP-43和pTDP-43的免疫耗竭。使用TDP-43或pTDP-43特異性檢測抗體，通過Western印跡對經免疫耗竭級分1至3進行分析。IN是指輸入材料(在免疫耗竭之前)。
圖8：(A)IgG4同種型的ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體對TDP-43從頭聚集的抑制。(B)IgG1同種型的ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體對TDP-43從頭聚集的抑制。將曲線下面積(AUC)相對於同種型對照歸一化，並將資料以TDP-43聚集的百分比抑制表示。將資料以三個獨立重複的平均值±SD表示。
圖9：來自從FTD A型死後腦組織中獲得的洗滌劑(sarkosyl)不溶性級分的通過抗體hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(hIgG1同種型)和人IgG1同種型對照的TDP-43和pTDP-43的免疫耗竭和免疫沉澱。使用TDP-43或pTDP-43特異性檢測抗體通過Western印跡對經免疫耗竭級分(泳道2至3)和經免疫沉澱級分(泳道4至5)進行分析。泳道1顯示輸入材料(在免疫耗竭和免疫沉澱之前)。
X、定義
本文中使用的“抗原結合分子”是可與抗原、特別是TDP-43特異 性或選擇性結合的任何分子。結合分子可包括或可以是抗體或其片段。抗TDP-43結合分子是在特定識別位點(表位)與TDP-43蛋白結合的分子，例如抗TDP-43抗體或其片段。即，本發明的抗原結合分子與SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的表位結合。本文中提供的抗原結合分子、特別是抗體或其抗原結合片段，識別全長TDP-43。另一些抗TDP-43結合分子也可包括多價分子、多特異性分子(例如，雙抗體(diabody))、融合分子、適配體、親合體(avimer)或者其他天然存在或重組產生的分子。可用于本發明的舉例說明性抗原結合分子包括抗體樣分子。抗體樣分子是可通過與靶分子結合而發揮功能的分子(參見，例如，Current Opinion in Biotechnology 2006,17：653-658；Current Opinion in Biotechnology 2007,18：1-10；Current Opinion in Structural Biology 1997,7：463-469；Protein Science 2006,15：14-27)，並且包括例如DARPin(WO 2002/020565)、親和體(Affibody)(WO 1995/001937)、親合體(WO 2004/044011；WO 2005/040229)、Adnectin(WO 2002/032925)和fynomer(WO 2013/135588)。
本文中使用的術語“抗TDP-43抗體”和“與TDP-43結合的抗體”或簡稱為“抗體”是指以下抗體，其能夠以足夠的親和力結合TDP-43，使得該抗體可用作靶向TDP-43的診斷劑和/或治療劑。一般而言，術語“抗體”在本文中以最廣義使用，並且涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性或雙互補位抗體)、全人抗體和抗體片段，只要它們表現出所期望的抗原結合活性即可。在本發明內的抗體也可以是嵌合抗體、重組抗體、重組抗體的抗原結合片段、人源化抗體或者展示在噬菌體表面上或展示在嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)T細胞表面上的抗體。
抗體的“抗原結合片段”或“其功能片段”是指不同于完整或全長抗體的包含完整或全長抗體的一部分並且結合(完全或部分地)與完整或全長抗體結合的抗原的分子。抗體片段的一些實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。抗原結合片段也可稱為“功能片段”，因為它們保 留了它們所來源的原始抗體的結合功能。
“與蛋白質限定區域中表位元結合的抗體”是要求該區域中存在一個或更多個氨基酸以與蛋白質結合的抗體。
在某些實施方案中，“與蛋白質限定區域中表位元結合的抗體”通過突變分析來鑒定，其中對該蛋白質的氨基酸進行突變，並且該抗體與所得經改變蛋白質(例如，包含該表位的經改變蛋白質)的結合確定為與未經改變蛋白質的結合的至少20%。在一些實施方案中，“與蛋白質限定區域中表位元結合的抗體”通過突變分析來鑒定，其中對該蛋白質的氨基酸進行突變，並且該抗體與所得經改變蛋白質(例如，包含該表位的經改變蛋白質)的結合確定為與未經改變蛋白質的結合的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在某些實施方案中，抗體的結合通過FACS、WB或通過合適的結合測定例如ELISA來確定。
在本發明的上下文中使用的術語“與......結合”定義至少兩個“抗原相互作用位點”彼此的結合(相互作用)。根據本發明，術語“抗原相互作用位點”定義多肽的基序，即本發明的抗體或抗原結合片段的一部分，其顯示出與TDP-43抗原中的特定抗原或特定組特異性相互作用的能力。所述結合/相互作用也應理解為定義“特異性識別”。根據本發明，術語“特異性識別”意指抗體能夠與如本文中定義的TDP-43的至少兩個氨基酸特異性相互作用和/或結合，特別地與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第181至195位、第199至213位、第307至321位、第352至366位、第389至411位、第397至411位和第140至200位氨基酸殘基中的至少兩個氨基酸相互作用/結合，甚至更特別地與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第183至188位、第203至213位、第204至208位、第204至211位、第205至210位、第316至323位、第358至361位、第400至405位、第400至406位或第400至412位氨基酸殘基中的至少兩個氨基酸相互作用/結合。
術語“泛TDP-43抗體”是指與錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43，包括單體TDP-43、寡聚TDP-43、經翻譯後修飾的TDP-43(例如磷酸化、泛素化、乙醯化、類泛素化和/或甲基化)、聚集TDP-43和截短TDP-43 結合的抗體。
根據本發明使用的術語“特異性相互作用”意指本發明的抗體或其抗原結合片段不與或基本上不與具有相似結構的(多)肽交叉反應。因此，本發明的抗體或其抗原結合片段與由人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第181至195位、第199至213位、第307至321位、第352至366位、第389至411位、第397至411位和第140至200位氨基酸殘基中特定氨基酸序列形成的TDP-43結構特異性結合/相互作用，更特別地，與由人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第183至188位、第203至213位、第204至208位、第204至211位、第205至210位、第316至323位、第358至361位、第400至405位、第400至406位或第400至412位氨基酸殘基中特定氨基酸序列形成的TDP-43結構結合/相互作用。
正在研究的抗原結合分子、特別是抗體或其抗原結合片段的組的交叉反應性可例如通過以下來測試：評估在常規條件下(參見例如Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988)和Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1999))抗體或其抗原結合片段的所述組與目的(多)肽以及與許多或多或少(結構上和/或功能上)緊密相關的(多)肽的結合。只有與如本文中定義的某些TDP-43結構，例如如本文中定義的TDP-43的特定表位或(多)肽/蛋白質結合但不與或基本上不與同一TDP-43的任何其他表位或(多)肽結合的那些構建體(即抗體、其抗原結合片段等)被認為對目的表位元或(多)肽/蛋白質具有特異性，並選擇用以根據本文中提供的方法進行進一步研究。這些方法尤其可包括與結構和/或功能上密切相關的分子的結合研究、阻斷和競爭研究。這些結合研究還包括FACS分析、表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR，例如用BIACORETM進行)、分析型超離心、等溫滴定量熱法、螢光各向異性、螢光光譜術或通過經放射性標記配體結合測定。
因此，特異性可通過本領域中已知的方法和如本文中所述的方法通過實驗確定。這樣的方法包括但不限於Western印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-測試和肽掃描。
本文中使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同質抗體的群體中獲得的抗體，即，除可能以少量存在的可能天然存在的突變之外，構成該群體的單獨抗體是相同的。單克隆抗體具有高度特異性，針對單一抗原位點。單克隆抗體的優點在於：其可通過雜交瘤培養物合成，基本上不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”指示該抗體在基本上同質的抗體群體中的特徵，並且不應解釋為要求該抗體通過任何特定方法來產生。如上所述，根據本發明使用的單克隆抗體可通過由Kohler,Nature 256(1975),495描述的雜交瘤方法來製備。
本文中使用的術語“多克隆抗體”是指在一種或更多種其他不同抗體之中或者在存在一種或更多種其他不同抗體的情況下產生的抗體。一般而言，多克隆抗體由B淋巴細胞在存在數種產生不同抗體的其他B淋巴細胞的情況下產生。通常，多克隆抗體從經免疫接種的動物中直接獲得。
本文中使用的術語“完全人抗體”是指僅包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果在小鼠中、小鼠細胞中或來源於小鼠細胞的雜交瘤中產生，則完全人抗體可包含鼠糖鏈。類似地，“小鼠抗體”或“鼠抗體”是指僅包含小鼠/鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。或者，如果在大鼠中、大鼠細胞中、來源於大鼠細胞的雜交瘤中產生，則“完全人抗體”可包含大鼠糖鏈。類似地，術語“大鼠抗體”是指僅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗體。完全人抗體也可例如通過噬菌體展示來產生，噬菌體展示是廣泛使用的篩選技術，其能夠產生和篩選完全人抗體。噬菌體抗體也可用于本發明的背景。噬菌體展示方法描述於例如US 5,403,484、US 5,969,108和US 5,885,793中。能夠開發完全人抗體的另一項技術涉及對小鼠雜交瘤技術的改進。對小鼠進行轉基因以包含人免疫球蛋白基因座，以交換其自身的小鼠基因(參見，例如，US 5,877,397)。
術語“嵌合抗體”是指包含與來自另一、人或非人物種(例如，小鼠、馬、兔、狗、牛、雞)的抗體區域(例如，恒定區)融合或嵌合的本發明的可變區的抗體。
術語抗體還涉及重組人抗體、異源抗體和異雜合抗體。術語“重組(人)抗體”包括通過重組手段製備、表達、產生或分離的所有人序列抗體，例如從針對人免疫球蛋白基因進行轉基因的動物(例如，小鼠)中分離的抗體； 使用轉染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體；從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體；或者通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段製備、表達、產生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區(如果存在的話)。然而，這樣的抗體可進行體外誘變(或，當使用針對人Ig序列轉基因的動物時，進行體內體細胞誘變)，並且因此重組抗體的VH和VL區的氨基酸序列是這樣的序列：其儘管來源於人種系VH和VL序列並且與之相關但在體內人抗體種系庫中可能非天然存在。
“異源抗體”相對於產生這樣的抗體的轉基因非人生物體進行定義。該術語是指具有與存在於不由轉基因非人動物組成的生物體中的氨基酸序列或編碼核酸序列對應的氨基酸序列或編碼核酸序列的抗體，並且該生物體通常來自除轉基因非人動物的物種之外的物種。
術語“異雜合抗體”是指具有不同生物體來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠輕鏈締合的人重鏈的抗體是異雜合抗體。異雜合抗體的一些實例包括嵌合抗體和人源化抗體。
本發明特別地涉及人源化抗體。“人源化”形式的非人(例如，鼠或兔)抗體是包含來源於非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈，或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗體的其他抗原結合子序列)。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中來自接受體的互補決定區(complementary determining region，CDR)的殘基被具有所期望的特異性、親和力和能力的來自非人物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人殘基替換。因此，當本文中提及特定的人框架序列，例如IGHV1-3 VH框架序列時，這旨在不僅涵蓋種系序列而且還涵蓋突變形式。此外，人源化抗體可包含在接受體抗體中或導入的CDR或框架序列中均未發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步完善和優化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，並且通常兩個可變結構域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些，並且所有或基本上所有的FR區是人免疫球 蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可包含免疫球蛋白恒定區(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定區)的至少一部分。對於另外的細節，參見：Jones et al.,Nature 321(1986),522-525；Reichmann Nature 332(1998),323-327和Presta Curr Op Struct Biol 2(1992),593-596。可參考實施例14以描述可根據本發明使用的抗體人源化方法，包括特定突變。
用於抗體人源化的流行方法涉及CDR接枝，其中將來自非人“供體”抗體的功能性抗原結合位點接枝到人“接納體”抗體上。CDR接枝方法是本領域中已知的，並且描述於例如US 5,225,539、US 5,693,761和US 6,407,213中。另一相關方法是從轉基因動物中產生人源化抗體，該動物經遺傳改造以包含能夠進行基因重排和基因轉換的一個或更多個人源化免疫球蛋白基因座(參見，例如，US 7,129,084)。
因此，在本發明的上下文中，術語“抗體”涉及完整的免疫球蛋白分子以及這樣的免疫球蛋白分子的部分(即，“其抗原結合片段”)。此外，如上所述，該術語涉及經修飾和/或經改變的抗體分子。該術語還涉及重組或合成產生/合成的抗體。該術語還涉及完整的抗體及其抗體片段，例如分離的輕鏈和重鏈、Fab、Fv、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2。術語抗體還包括但不限於完全人抗體、嵌合抗體、人源化抗體、CDR接枝的抗體和抗體構建體，例如單鏈Fv(single-chain variable fragment，scFv)或抗體融合蛋白。
在本發明的上下文中，“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段具有抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽還在VH與VL結構域之間包含多肽接頭，其使scFv能夠形成所期望的抗原結合結構。描述用於產生單鏈抗體的技術描述於例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,N.Y.(1994),269-315中。
本文中使用的“Fab片段”包含一條輕鏈，以及一條重鏈的CH1和可變區。Fab分子的重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區包含兩個含有抗體的CH2和CH3結構域的重鏈片段。兩個 重鏈片段通過兩個或更多個二硫鍵以及通過CH3結構域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab’片段”包含一條輕鏈，以及一條重鏈的一部分，所述一條重鏈的一部分包含VH結構域和CH1結構域以及還具有在CH1與CH2結構域之間的區域，使得可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含兩條輕鏈和兩條重鏈，所述重鏈包含在CH1與CH2結構域之間的恒定區的一部分，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段構成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恒定區。
根據本發明使用的人源化抗體、人源化抗體構建體、人源化抗體片段、人源化抗體衍生物(全部是Ig來源的)，或其相應的免疫球蛋白鏈可使用本領域中已知的常規技術進一步修飾，例如通過單獨或組合使用氨基酸缺失、插入、替換、添加和/或重組和/或本領域中已知的任何其他修飾。用於在以免疫球蛋白鏈的氨基酸序列為基礎的DNA序列中引入這樣的修飾的方法是本領域技術人員公知的；參見，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)。術語“Ig來源的結構域”特別地涉及包含至少一個CDR的(多)肽構建體。所列舉的Ig來源的結構域的片段或衍生物定義以下(多肽)肽，其是以上抗體分子的一部分和/或通過化學/生物化學或分子生物學方法進行修飾。相應的方法是本領域中已知的，並且尤其描述於實驗室手冊(參見，Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)；Gerhardt et al.,Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press(1994)；Lefkovits,Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press(1997)；Golemis,Protein-Protein Interactions：A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002))中。
本文中使用的術語“CDR”涉及“互補決定區”，其是本領域中公知的。CDR是免疫球蛋白的一部分，其決定所述分子的特異性並且與特定配體接觸。CDR是所述分子的最可變的部分，並且有助於這些分子的多樣性。每個V結構域中均存在三個CDR區：CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H示出了可變重鏈的CDR區，而CDR-L涉及可變輕鏈的CDR區。VH意指可變重鏈，VL意指可變輕鏈。Ig來源區域的CDR區可如Kabat“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版.NIH出版物no.91-3242 U.S.Department of Health and Human Services(1991)中所述確定。本文中提供的CDR序列根據Kabat進行定義。然而，技術人員將理解，本發明旨在涵蓋其中根據任何有用的標識/編號方案定義CDR序列的結合分子。例如，可採用以下編號方案以定義CDR：Chothia(Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.Chothia C,Lesk AM.J Mol Biol.1987 Aug 20；196(4)：901-17)；IMGT(IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Giudicelli V,Chaume D,Bodmer J,Müller W,Busin C,Marsh S,Bontrop R,Marc L,Malik A,Lefranc MP.Nucleic Acids Res.1997 Jan 1；25(1)：206-11和Unique database numbering system for immunogenetic analysis.Lefranc MP.Immunol Today.1997 Nov；18(11)：509)；MacCallum(MacCallum RM,Martin AC,Thornton JM,J Mol Biol.1996 Oct 11；262(5)：732-45)以及Martin(Abhinandan KR,Martin ACR.Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains.Mol Immunol.(2008)45：3832-9.10.1016/j.molimm.2008.05.022)。
因此，在本發明的上下文中，本文中以上所述的人源化抗體分子選自完整抗體(免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgA1、IgGA2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE)、F(ab)-、Fab’-SH-、Fv-、Fab’-、F(ab’)2-片段、嵌合抗體、CDR接枝抗體、完全人抗體、二價抗體構建體、抗體融合蛋白、合成抗體、二價單鏈抗體、三價單鏈抗體和多價單鏈抗體。
“人源化方法”在本領域中是公知的，並且特別針對抗體分子，例如Ig來源的分子來描述。術語“人源化”是指包含來源於非人抗體的序列的一些 部分的非人(例如，鼠)抗體或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)、scFv或抗體的其他抗原結合部分序列)的人源化形式。人源化抗體包括人免疫球蛋白，其中來自人免疫球蛋白互補決定區(CDR)的殘基被具有所期望結合特異性、親和力和能力的來自非人物種(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基替換。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，並且通常兩個可變結構域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些，並且所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗體還將包含免疫球蛋白恒定區(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定區)的至少一部分；尤其參見：Jones et al.,Nature 321(1986),522-525，Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2(1992),593-596。用於使非人抗體人源化的方法是本領域中公知的。通常，人源化抗體具有從非人來源中引入其中的一個或更多個氨基酸，仍保留了該抗體的原始結合活性。用於使抗體/抗體分子人源化的方法還詳述於Jones et al.,Nature 321(1986),522-525；Reichmann et al.,Nature 332(1988),323-327；以及Verhoeyen et al.,Science 239(1988),1534-1536中。人源化抗體的一些具體實例，例如針對EpCAM的抗體在本領域中是已知的(參見例如LoBuglio,Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997),1562和Khor,Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997),847)。
因此，在本發明的上下文中，提供了抗體分子或其抗原結合片段，其是人源化的並且可成功地用於藥物組合物中。
本發明的人源化抗體或抗原結合片段的特異性不僅可由如上定義的該人源化抗體或抗原結合片段的氨基酸序列的性質來表示，而且還可由該抗體能夠結合的表位來表示。因此，在一個實施方案中，本發明涉及與本發明的抗體識別相同表位的抗錯折疊人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段。
本領域技術人員可理解，表位可以包含在TDP-43蛋白中，但是也可包含在其降解產物中或者可以是化學合成的肽。僅指出氨基酸位置是為了顯示相應氨基酸序列在TDP-43蛋白序列中的位置。本發明涵蓋所有包含表位的肽。所述肽可以是長度大於100個氨基酸的多肽的一部分，或者可以是小於 100個，優選小於50個，更優選小於25個氨基酸，甚至更優選小於16個氨基酸的小肽。這樣的肽的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸(例如，β氨基酸、γ氨基酸、D-氨基酸)或其組合。此外，本發明可涵蓋表位的相應逆反肽(retro-inverso peptide)。所述肽可以是未結合的或結合的。其可與例如小分子(例如，藥物或螢光團)、高分子量聚合物(例如，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯亞胺(polyethylene imine，PEI)、甲基丙烯酸羥丙酯(hydroxypropylmethacrylate，HPMA)等)或蛋白質、脂肪酸、糖部分結合或者可插入膜中。
為了測試所討論的抗體和本發明的抗體是否識別相同的表位，可進行以下競爭研究：將以3種MOI(感染複數)感染的Vero細胞在20小時之後與不同濃度的作為競爭者的所討論抗體孵育1小時。在第二孵育步驟中，以100nM的恒定濃度施加本發明的抗體，並使用針對本發明抗體的恒定結構域的螢光標記抗體，通過流式細胞術檢測其結合。以與所討論的抗體的濃度成反比例(成反比)進行結合指示兩種抗體識別相同表位。然而，可使用本領域中已知的許多其他測定。
本發明還涉及針對TDP-43的天然多肽和重組多肽的特異性抗體的產生。該產生例如基於動物如小鼠的免疫接種。然而，在本發明中還設想了用於產生抗體/抗血清的其他動物。例如，單克隆抗體和多克隆抗體可由兔、小鼠、山羊、驢等產生。可將編碼TDP-43的相應選擇的多肽的多核苷酸亞克隆到合適的載體中，其中使重組多肽在能夠表達的生物體，例如在細菌中表達。因此，可將表達的重組蛋白腹膜內注射到小鼠中，並且所得特異性抗體可例如從通過心臟內血液穿刺提供的小鼠血清中獲得。本發明還設想通過使用如所附實施例中例示的DNA疫苗策略來產生針對天然多肽和重組多肽的特異性抗體。DNA疫苗策略是本領域中公知的，並且涵蓋脂質體介導的遞送、通過基因槍或噴射注射以及肌內或皮內注射。因此，針對TDP-43的多肽或蛋白質或表位，特別是本文中提供的抗體表位的抗體可通過肌內直接注射表達TDP-43的所期望多肽或蛋白質或表位的載體對動物直接進行免疫接種來獲得，所述表位特別地是以下本發明抗體表位，其位於SEQ ID NO：1的第397至411位氨基酸 殘基中；更特別地是以下本發明抗體表位，其位於SEQ ID NO：1的第400至405位氨基酸殘基中。可使用ELISA對獲得的特異性抗體的量進行定量，這也在下文中描述。用於產生抗體的另外的方法是本領域中公知的，參見，例如Harlow and Lane,“Antibodies,A Laboratory Manual”,CSH Press,Cold Spring Harbor,1988。
因此，在指定的測定條件下，特定的抗體與TDP-43的相應表位彼此結合，而不與樣品中存在的其他組分以顯著量結合。在這樣的條件下與靶分析物的特異性結合可需要結合部分，該結合部分針對其對特定靶分析物的特異性進行選擇。可使用多種免疫測定形式來選擇與特定抗原特異性反應的抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫測定來選擇與分析物特異性免疫反應的單克隆抗體。參見Shepherd and Dean(2000),Monoclonal Antibodies：A Practical Approach,Oxford University Press and/or Howard and Bethell，對可用於確定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條件的描述。通常來說，特異性或選擇性反應將是背景信噪比的至少兩倍，並且更通常是背景的超過10至100倍大。本領域技術人員能夠提供和產生針對新多肽的特異性結合分子。對於特異性結合測定，其可容易地用於避免不期望的交叉反應性，例如，可通過已知方法容易地純化和選擇多克隆抗體(參見Shepherd and Dean,loc.cit.)。
抗體的“類別”是指其重鏈所具有的恒定結構域或恒定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些中的數種可進一步劃分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。
在某些實施方案中，考慮了本文中提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可期望改善抗體的結合親和力和/或其他生物學特性。抗體的氨基酸序列變體可通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或通過肽合成來製備。這樣的修飾包括，例如，抗體氨基酸序列中殘基的缺失和/或其中的插入和/或其替換。可進行缺失、插入和替換的任意組合以獲得最終的構建體，前提是最終的構建體具有所期望的特徵，例如抗原結合。
在某些實施方案中，提供了具有一個或更多個氨基酸替換的抗體 變體。替換型誘變的目的位元點包括CDR和FR。保守替換示於表1中“優選替換”的標題下。更多的替換型變化提供於表1中“示例性替換”的標題下，並且如以下參考氨基酸側鏈類別進一步描述的。可將氨基酸替換引入目的抗體中，並針對所期望活性，例如，保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC篩選產物。
Figure 110130007-A0202-12-0033-1
氨基酸可根據共同的側鏈特性進行分組：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)鹼性：His、Lys、Arg；
(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守替換將需要將這些類別之一的成員更換為另一類別。
一種類型的替換型變體涉及替換親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或更多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步研究的所得變體將相對於親本抗體在某些生物學特性方面具有改進(例如，改善)(例如，提高的親和力、降低的免疫原性)和/或將基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種示例性替換型變體是親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，例如本文中所述的那些方便地產生。簡言之，使一個或更多個CDR殘基突變，將變體抗體展示在噬菌體上並針對特定的生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。
可在CDR中進行改變(例如，替換)，例如以提高抗體親和力。這樣的改變可在CDR“熱點”，即由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變的密碼子編碼的殘基(參見，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中進行，並測試所得變體VH或VL的結合親和力。通過構建二級文庫和從二級文庫中再選擇而進行的親和力成熟已描述於例如Hoogenboom et al.,Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟的一些實施方案中，通過多種方法(例如，易錯PCR、鏈混編或寡核苷酸定向誘變)中的任一種將多樣性引入選擇用於成熟的可變基因中。然後創建二級文庫。然後篩選該文庫以鑒定具有所期望親和力的任何抗體變體。用於引入多樣性的另一方法涉及CDR指導的方法，其中數個CDR殘基(例如，一次4至6個殘基)是隨機化的。涉及抗原結合的CDR殘基可例如使用丙氨酸掃描誘變或建模來特別地鑒定。特別地，CDR-H3和CDR-L3通常被靶向。
在某些實施方案中，替換、插入或缺失可在一個或更多個CDR 中發生，只要這樣的改變基本上不降低抗體結合抗原的能力即可。例如，可在CDR中進行基本上不降低結合親和力的保守改變(例如，如本文中提供的保守替換)。這樣的改變可在CDR“熱點”或SDR之外。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未經改變的，或包含不超過一個、兩個或三個氨基酸替換。
用於鑒定抗體的可靶向誘變的殘基或區域的可用方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如由Cunningham and Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在該方法中，鑒定殘基或靶殘基組(例如，帶電荷的殘基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並將其用中性或帶負電荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)進行替換以確定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。可在氨基酸位置引入另外的替換，顯示對初始替換的功能敏感性。作為替代或補充，抗原-抗體複合體的晶體結構用於鑒定抗體與抗原之間的接觸點。這樣的接觸殘基和鄰近殘基可作為替換的候選物被靶向或消除。可對變體進行篩選以確定其是否包含所期望的特性。
氨基酸序列插入包括長度為一個殘基至包含100或更多個殘基的多肽的氨基和/或羧基端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的一些實例包括具有N端甲硫氨醯基殘基的抗體。抗體分子的另一些插入型變體包括抗體的N或C端與提高抗體的血清半衰期的酶(例如，對於ADEPT)或多肽的融合體。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體被改變以提高或降低抗體被糖基化的程度。針對抗體的糖基化位點的添加或缺失可通過改變氨基酸序列使得產生或去除一個或更多個糖基化位點而方便地實現。
當抗體包含Fc區時，與其連接的碳水化合物可被改變。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含通常通過N鍵與Fc區之CH2結構域的Asn297連接的分支的雙觸角寡糖。參見，例如，Wright et al.,TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角寡糖結構的“莖(stem)”中與GlcNAc連接的岩藻糖。在一些實施方案中，可對本發明 的抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善的特性的抗體變體。
在一個實施方案中，提供了具有缺少與Fc區(直接或間接)連接的岩藻糖的碳水化合物結構的抗體變體。例如，這樣的抗體中岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%、或20%至40%。岩藻糖的量通過計算在Asn297的糖鏈中岩藻糖的平均量來確定，這相對於與Asn 297連接的所有糖結構(例如，複合、雜合和高甘露糖結構)的總和進行，如通過MALDI-TOF質譜測量的，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區中約第297位的天冬醯胺殘基(Fc區殘基的Eu編號；參見Edelman,G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))；然而，由於抗體中的微小序列變化，Asn297也可位於第297位上游或下游約±3個氨基酸，即在第294位與第300位處。這樣的岩藻糖基化變體可具有改善的ADCC功能。參見，例如，美國專利公開No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。與“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗體變體有關的出版物的一些實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體的細胞系的一些實例包括蛋白質岩藻糖基化缺陷型Lec13 CHO細胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請No US 2003/0157108 A1，Presta,L；以及WO 2004/056312 A1，Adams et al.，尤其在實施例11)，以及敲除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(參見，例如，Yamane-Ohnuki et al.,Bioteeh.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.et al.,Bioteehnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085 107)。
還提供了具有二等分的寡糖的抗體變體，例如，其中與抗體的Fc區連接的雙觸角寡糖被GlcNAc二等分。這樣的抗體變體可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。這樣的抗體變體的一些實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美國專利No.6,602,684(Umana et al.)；以及US 2005/0123546(Umana et al.)中。還提供了在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這樣的抗體變體可具有改善的CDC功能。這樣的抗體變體描述於例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些實施方案中，可將一種或更多種氨基酸修飾引入本文中提供的抗體的Fc區中，從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一個或更多個氨基酸位置包含氨基酸修飾(例如，替換)的人Fc區序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施方案中，本發明考慮了以下抗體變體，其具有一些但並非全部效應物功能，這使其成為其中抗體的體內半衰期是重要的而某些效應物功能(例如補體啟動和ADCC)是不必要或有害的應用的所期望候選物。可進行體外和/或體內細胞毒性測定，以確定CDC和/或ADCC活性的降低/耗盡。例如，可進行Fc受體(Fc receptor，FcR)結合測定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞和小膠質細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達概述於Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464頁的表3中。評估目的分子的ADCC活性的體外測定的一些非限制性實例描述於美國專利No.5,500,362(參見，例如，Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom,Iet al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。
或者，可採用非放射性測定方法(參見，例如用於流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox 96®非放射性細胞毒性測定(Promega，Madison，WI))。用於這樣的測定的可用效應細胞包括外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和自然殺傷(natural killer，NK)細胞。
作為替代或補充，可在體內，例如在動物模型例如公開於Clynes et al.,Proc.Nat’l Acad.sci.USA 95：652-656(1998)的動物模型中評估目的分子的ADCC活性。也可進行C1q結合測定以確定抗體不能結合C1q，並且因此缺乏CDC活性。參見，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體啟動，可進行CDC測定(參見，例如，Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。還可使用本領域中已知的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期的確定(參見，例如，Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效應物功能的抗體包括Fc區第234位、第235位、第238位、第265位、第269位、第270位、第297位、第327位和第329位殘基中的一個或更多個被替換的抗體(美國專利No.6,737,056)。描述了與FcR的結合增強或減弱的某些抗體變體。(參見，例如，美國專利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。這樣的Fc突變體包括在第265位、第269位、第270位、第297位和第327位氨基酸中的兩個或更多個處進行替換的Fc突變體，包括第265位和第297位殘基被替換為丙氨酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利No.7,332,581)，或者第265位殘基被替換為丙氨酸以及第297位殘基被替換為甘氨酸的所謂的“DANG”FC突變體。或者，具有降低的效應物功能的抗體包括Fc區第234位、第235位和第329位殘基中的一個或更多個被替換的抗體，即第234位和第235位殘基被替換為丙氨酸以及第329位被替換為甘氨酸的所謂的“PG-LALA”Fc突變體(Lo,M.et al.,Journal of Biochemistry,292,3900-3908)。可使用在第234位、第235位和第321位的其他已知突變，即在CH2結構域中包含突變L234F/L235E/P331S的所謂的TM突變體(Oganesyan et al.Acta Cryst.D64,700-704.(2008))。來自人IgG4同種型的抗體包含突變S228P/L235E以使鉸鏈穩定並降低FgR結合(Schlothauer et al,PEDS,29(10)：457-466)。
另一些Fc變體包括在以下Fc區殘基中的一個或更多個處進行替換的Fc變體：第238位、第256位、第265位、第272位、第286位、第303位、第305位、第307位、第311位、第312位、第317位、第340位、第356 位、第360位、第362位、第376位、第378位、第380位、第382位、第413位、第424位或第434位，例如Fc區第434位殘基被替換的Fc變體(美國專利No.7,371,826)。還參見Duncan & Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利No.5,648,260；美國專利No.5,624,821。
在某些實施方案中，Fc區進行突變以提高其在pH 6.0下對FcRn的親和力並因此延長抗體半衰期。對FcRn具有增強的親和力的抗體包括以下Fc區殘基中的一個或更多個被替換的那些：第252位、第253位、第254位、第256位、第428位、第434位，包括具有替換M252Y/S254T/T256E的所謂的YTE突變(Dall’ Acqua et al,J Immunol.169：5171-5180(2002))或LS突變M428L/N434S(Zalevsky et al,Nat Biotechnol.28(2)：157-159(2010))。
在某些實施方案中，可期望產生半胱氨酸改造抗體，例如“thioMAb”，其中抗體的一個或更多個殘基被半胱氨酸殘基替換。在一些具體實施方案中，所替換的殘基出現在抗體的可及位點。通過用半胱氨酸替換這些殘基，反應性巰基由此位於抗體的可及位點，並且可用於將抗體與其他部分，例如藥物部分或接頭-藥物部分綴合，以產生免疫綴合物，如本文中進一步所述。在某些實施方案中，以下殘基中的任意一個或更多個可被半胱氨酸替換：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(EU編號)；以及重鏈Fc區的S400(EU編號)。半胱氨酸改造抗體可如例如美國專利No.7,521,541中所述產生。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體還可被修飾以包含本領域中已知且容易獲得的另外的非蛋白質性部分。適合於抗體衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的一些非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無規共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中穩定而在製造中可具有優勢。該聚合物可具有任意分子量，並且可以是支鏈或非支鏈的。與抗體連接的聚合物的數目可變化，並且如果連接多於一個聚合 物，則它們可以是相同或不同的分子。一般而言，用於衍生化的聚合物的數目和/或類型可基於以下考慮因素來確定，所述考慮因素包括但不限於待改進抗體的特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於以下限定條件下的治療中，等。
在另一個實施方案中，提供了抗體與可通過暴露於輻射而選擇性加熱的非蛋白質性部分的綴合物。在一個實施方案中，非蛋白質性部分是碳納米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可以是任何波長，包括但不限於不損害普通細胞但將非蛋白質性部分加熱至殺傷鄰近抗體-非蛋白質性部分的細胞的溫度的波長。
可使用重組方法和組合物產生抗體，例如，如美國專利No.4,816,567中所述。在一個實施方案中，提供了編碼本文中所述的抗錯折疊TDP-43抗體的分離的核酸。這樣的核酸可編碼包含抗體的VL的氨基酸序列和/或包含抗體的VH的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個實施方案中，提供了包含這樣的核酸的一種或更多種載體(例如，表達載體)。在另一個實施方案中，提供了包含這樣的核酸的宿主細胞。在一個這樣的實施方案中，宿主細胞包含以下(例如，已經用以下轉化)：(1)載體，其包含編碼包含抗體VL的氨基酸序列和包含抗體VH的氨基酸序列的核酸；或(2)第一載體和第二載體，所述第一載體包含編碼包含抗體VL的氨基酸序列的核酸，所述第二載體包含編碼包含抗體VH的氨基酸序列的核酸。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的，例如，中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如YO、NSO、Sp20)。在一個實施方案中，提供了製備抗錯折疊TDP-43抗體的方法，其中該方法包括：在適合於表達抗體的條件下，培養如上所提供的包含編碼抗體的核酸的宿主細胞，以及任選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。
對於重組產生抗錯折疊TDP-43抗體，分離例如如上所述的編碼抗體的核酸，並將其插入一個或更多個載體中，以進一步克隆和/或在宿主細胞或無細胞表達系統中表達。這樣的核酸可容易地使用常規操作分離和測序(例如，通過使用能夠與編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針來進行)。
用於克隆或表達抗體編碼載體的合適宿主細胞包括本文中所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是在不需要糖基化和Fc效應物功能時。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達，參見，例如，美國專利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(還參見Charlton,Methods in Molecular Biology,Val.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，pp.245-254，描述了抗體片段在大腸桿菌(E.coli)中的表達)。在表達之後，可從細菌細胞糊中分離在可溶性級分中的抗體，並可將其進一步純化。
除原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母也是適合於抗體編碼載體的克隆或表達宿主，包括其中糖基化途徑已被“人源化”從而導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體的真菌和酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)以及Li et al.,Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表達糖基化抗體的合適宿主細胞也來源於多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的一些實例包括植物和昆蟲細胞。已鑒定出許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，特別地用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
植物細胞培養物也可用作宿主。參見例如美國專利No 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用於在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於懸浮培養的哺乳動物細胞系。可用的哺乳動物宿主細胞系的另一些實例是由SV40轉化的獼猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎細胞系(293或293細胞，如描述於例如Graham et al.,J.Gen Viral.36：59(1977)中)；幼倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠塞托利細胞(TM4細胞，如描述於例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中)；獼猴腎細胞(CV 1)；非洲綠獼猴腎細胞(VER0-76)；人宮頸癌細胞(HeLa)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如描述於例如Mather et al.,AnnalsN.Y Aead.Sei.383：44-68(1982)中；MRC5細胞；以及FS4細胞。另一些可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠 卵巢(CHO)細胞，包括DHFR CHO細胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.cii.USA 77：4216(1980))；以及骨髓瘤細胞系，例如YO、NSO和Sp2/0。對於適合於抗體產生的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見，例如，Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Val.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
對於遞送分子穿過血腦屏障(blood brain barrier，BBB)，存在數種本領域已知的方法，例如施用途徑的改變、對BBB的破壞及其通透性的改變、納米粒遞送、特洛伊木馬方法(Trojan horse approach)、受體介導的轉運以及細胞和基因治療。
施用途徑的改變可通過以下來實現：直接注射到腦中(參見，例如，Papanastassiou et al.,Gene Therapy9：398-406(2002))，在腦中植入遞送裝置(參見，例如，Gillet al.,Nature Med.9：589-595(2003)；和Gliadel WafersTM,Guildford Pharmaceutical)，以及繞過BBB的鼻內施用(Mittal et al,Drug Deliv.21(2)：75-86.(2014))。
屏障破壞的方法包括但不限於：超聲(參見，例如，美國專利公開No.2002/0038086)；滲透壓(例如，通過施用高滲甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Vols 1 & 2,Plenum Press,N.Y.(1989)))；透化，通過例如緩激肽或透化劑A-7(參見，例如，美國專利No.5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)。
改變BBB通透性的方法包括但不限於：使用糖皮質激素阻斷劑來提高血腦屏障的通透性(參見，例如，美國專利申請公開No.2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；啟動鉀通道(參見，例如，美國專利申請公開No.2005/0089473)；以及抑制ABC藥物轉運蛋白(參見，例如，美國專利申請公開No.2003/0073713)。
遞送人源化抗體或其人源化抗體片段穿過血腦屏障的特洛伊木馬遞送方法包括但不限於：使抗體陽離子化(參見，例如，美國專利No.5,004,697)，以及使用細胞穿透肽例如Tat肽以得以進入CNS。(參見，例如， Dietz et al.,J.Neurochem.104：757-765(2008))。
遞送人源化抗體或其抗原結合片段穿過血腦屏障的納米粒遞送方法包括但不限於：將抗體或其抗原結合片段包封在脂質體或胞外囊泡例如外泌體中，所述脂質體或胞外囊泡與與血腦屏障的血管內皮上的受體結合的抗體或抗原結合片段或作為替代的肽偶聯(不限於此)(參見，例如，美國專利申請公開No.20020025313)；以及將抗體或其抗原結合片段包被在低密度脂蛋白顆粒中(參見，例如，美國專利申請公開No.20040204354)或包被在載脂蛋白E中(參見，例如，美國專利申請公開No.20040131692)。
本發明的人源化抗體可被另外修飾以增強血腦屏障穿透。
本發明的人源化抗體或其抗原結合片段可與與血腦屏障受體結合的多肽融合。BBB受體包括但不限於運鐵蛋白受體、胰島素受體或低密度脂蛋白受體。多肽可以是肽、受體配體、單結構域抗體(VHH)、scFv或Fab片段。
本發明的人源化抗體也可作為編碼所述人源化抗體的相應核酸遞送。這樣的核酸分子可以是用於靶向遞送至血腦屏障或CNS中的任何其他細胞類型的病毒載體的一部分。病毒載體可以是選自本領域已知的任何腺相關病毒(adeno-associated viral vector,AAV)血清型(包括但不限於AAV1至AAV12)的重組腺相關病毒載體(recombinant adeno-associated viral vector，rAAV)，以使得人源化抗體或人源化抗體片段或人源化抗體衍生物能夠在細胞內表達或在腦實質中表達。
遞送本發明的人源化抗體或人源化抗體片段或人源化抗體衍生物穿過血腦屏障的細胞治療方法包括但不限於：使用用我們具有所有權的載體離體轉染的內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)的歸巢能力，以及通過這些細胞分泌抗體或抗體片段並向腦遞送所述抗體或抗體片段，以克服血腦屏障的強大過濾活動(參見，例如，Heller and al.,J Cell Mol Med.00：1-7(2020))；或者使用裝載有經遺傳改造細胞的聚合物細胞植入裝置來分泌抗體或抗體片段(參見，例如Marroquin Belaunzaran et al.PLoS ONE 6(4)：e18268(2011))。
可藥用載體、稀釋劑、輔料和賦形劑是製藥領域公知的，並且在例如Remington’s Pharmaceutical Scienc中描述。可藥用載體、稀釋劑、輔料和賦形劑是製藥領域公知的，並且在例如以下中描述：Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版或第18版.(Alfonso R.Gennaro,ed.；Mack Publishing Company,Easton,PA,1990)；Remington：the Science and Practice of Pharmacy第19版.(Lippincott,Williams & Wilkins,1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版.(Arthur H.Kibbe,ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc,1999)；Pharmaceutical Codex：Principles and Practice of Pharmaceutics第12版.(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press,London,1994)；The United States Pharmacopeia：The National Formulary(United States Pharmacopeial Convention)；Fiedler’s“Lexikon der Hilfstoffe”第5版.,Edition Cantor Verlag Aulendorf 2002；“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版.,American Pharmaceuticals Association,2003；以及Goodman and Gilman’s：the Pharmacological Basis of Therapeutics(Louis S.Goodman and Lee E.Limbird,eds.；McGraw Hill,1992)，其公開內容在此通過引用併入。
載體、稀釋劑、輔料和藥用賦形劑可根據預期的施用途徑和標準藥學實踐進行選擇。這些化合物必須是在對其接受者無害的意義上可接受的。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版或第18版.(Alfonso R.Gennaro,ed.；Mack Publishing Company,Easton,PA,1990)；Remington：the Science and Practice of Pharmacy第19版.(Lippincott,Williams & Wilkins,1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版.(Arthur H.Kibbe,ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc,1999)；Pharmaceutical Codex：Principles and Practice of Pharmaceutics第12版.(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press,London,1994)；The United States Pharmacopeia：The National Formulary(United States Pharmacopeial Convention)；Fiedler’s“Lexikon der Hilfstoffe”第5版.,Edition Cantor Verlag Aulendorf 2002；“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版.,American Pharmaceuticals Association,2003；以及Goodman and Gilman’s：the Pharmacological Basis of Therapeutics(Louis S.Goodman and Lee E.Limbird,eds.； McGraw Hill,1992)，其公開內容在此通過引用併入。
載體、稀釋劑、輔料和藥用賦形劑可根據預期的施用途徑和標準藥學實踐進行選擇。這些化合物必須是在對其接受者無害的意義上可接受的。
待施用於物件的化合物的“有效量”是根據合理的醫學判斷適合於治療、預防或減輕疾病、障礙或異常的劑量。具體的劑量水準和劑量頻率可取決於例如多種因素，包括：所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時長、施用方式和時間。待施用於物件的化合物的“有效量”是根據合理的醫學判斷適合於治療、預防或減輕病症、疾病、障礙或異常的劑量。具體的劑量水準和劑量頻率可取決於例如多種因素，包括：所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時長、施用方式和時間、排泄速率和藥物組合。患者特異性的因素，例如年齡、體重、一般健康、性別、飲食以及特定病症的嚴重程度，也會影響待施用的量。患者特異性的因素，例如年齡、體重、一般健康、性別、飲食以及特定病症的嚴重程度，也會影響待施用的量。
XI. TDP-43特異性結合分子的一些發明性實施方案
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
c)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
d)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：182的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3； 或
e)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：192的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
f)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：212的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
g)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或
h)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
b)包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
c)包含SEQ ID NO：185的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
d)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
e)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：206的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
f)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
g)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列的VL-CDR3；或
h)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
i)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：247的氨基酸序列的VL-CDR3；或
j)包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或
k)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
l)包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
m)包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
n)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)重鏈可變區(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iv.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：182的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：192的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：212的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
viii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；和
b)輕鏈可變區(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
iii.包含SEQ ID NO：185的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
iv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：206的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
viii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16 的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ix.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：247的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
x.包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xi.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或
xiii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xiv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)重鏈可變區(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：202具有 至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：22具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：172的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：172具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
iv.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：182的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：182具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：192的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：192具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：212的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：212具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：222具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
viii.包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：382具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及
b)輕鏈可變區(VH)，其包含：
i.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ii.包含SEQ ID NO：175的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：175具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；或者
iii.包含SEQ ID NO：185的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：185具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含 SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
iv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：195具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
v.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：206的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：206具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vi.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：216具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
vii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：227具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
viii.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO： 25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：237具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
ix.包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：247的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：247具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
x.包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：265具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xi.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：195具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：237具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：305具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：237具有至少 80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xiii.包含SEQ ID NO：305的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：305具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：216具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：237具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
xiv.包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：195具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：216具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：202具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
b)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：382具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者
c)輕鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的 VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：195具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：237具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3；或者
d)輕鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3。
更特別地，在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：202具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及
b)輕鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：195具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：237具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3。
類似地，在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段，其包含：
a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：382具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VH-CDR2；和包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；和
b)輕鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：202或SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；(c)包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：195或SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：237或SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列的VH-CDR2；(c)包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2；(c)包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VL-CDR2；以及(f)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL-CDR3。
在另一個實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的重鏈可變結構域(VH)：SEQ ID NO：160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370和任選地SEQ ID NO：380，包括該序列的翻譯後修飾。在一個具體實施方案中，重鏈可變結構域(VH)包含選自以下的至少一個、兩個或三個CDR：(a)包含選自SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH-CDR1，(b)包含選自SEQ ID NO：12、22、172、182、192、202、212、222和任選地SEQ ID NO：382的氨基酸序列的VH-CDR2，(c)包含氨基酸ES(Glu-Ser)的VH-CDR3。
在另一個實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的輕鏈可變結構域(VL)：SEQ ID NO：164、174、184、194、204、214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344和任選地SEQ ID NO：354，包括該序列的翻譯後修飾。在一個具體的實施方案中，輕鏈可變結構域(VL)包含選自以下的至少一個、兩個或三個CDR：(a)包含選自SEQ ID NO：25、175、185、195、265、305的氨基酸序列的VL-CDR1，和(b)包含選自SEQ ID NO：16、206、216的氨基酸序列的VL-CDR2，(c)包含選自SEQ ID NO：27(其與SEQ ID NO：17相同)、227、237、247的氨基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：310 的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
f.包含SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：
a.包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
b.包含SEQ ID NO：324的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
c.包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
d.包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈 可變區(VL)；或者
e.包含SEQ ID NO：354的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或抗原片段包含：
a)重鏈可變區(VH)，其選自：
i.包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：160的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
ii.包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：170的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
iii.包含SEQ ID NO：180的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：180的氨基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
iv.包含SEQ ID NO：190的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：190的氨基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
v.包含SEQ ID NO：200的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：200的氨基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
vi.包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：210的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
vii.包含SEQ ID NO：220的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：220的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
viii.包含SEQ ID NO：230的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：230的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
ix.包含SEQ ID NO：240的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：240的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
x.包含SEQ ID NO：250的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：250的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xi.包含SEQ ID NO：260的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：260的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xii.包含SEQ ID NO：270的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：270的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xiii.包含SEQ ID NO：280的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：280的氨基酸序列具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xiv.包含SEQ ID NO：290的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：290的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xv.包含SEQ ID NO：300的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xvi.包含SEQ ID NO：310的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xvii.包含SEQ ID NO：320的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xviii.包含SEQ ID NO：330的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：330的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xix.包含SEQ ID NO：340的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xx.包含SEQ ID NO：350的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xxi.包含SEQ ID NO：360的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：360的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xxii.包含SEQ ID NO：370的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：370的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
xxiii.包含SEQ ID NO：380的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和
b)輕鏈可變區(VL)，其選自：
i.包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)； 或者
ii.包含SEQ ID NO：174的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：174的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
iii.包含SEQ ID NO：184的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：184的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
iv.包含SEQ ID NO：194的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：194的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
v.包含SEQ ID NO：204的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：204的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
vi.包含SEQ ID NO：214的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：214的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
vii.包含SEQ ID NO：224的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：224的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
viii.包含SEQ ID NO：234的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：234的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
ix.包含SEQ ID NO：244的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：244的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
x.包含SEQ ID NO：254的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO： 254的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xi.包含SEQ ID NO：264的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：264的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xii.包含SEQ ID NO：274的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：274的氨基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xiii.包含SEQ ID NO：284的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：284的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xiv.包含SEQ ID NO：294的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xv.包含SEQ ID NO：304的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：304的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xvi.包含SEQ ID NO：314的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：314的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xvii.包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xviii.包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xix.包含SEQ ID NO：344的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
xx.包含SEQ ID NO：354的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原片段包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
f.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：324的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
g.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
h.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
i.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
j.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350 的氨基酸序列具有至少90%、91%、92、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
k.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
1.包含SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：354的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：
a.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
b.包含SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
c.包含SEQ ID NO：320的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
d.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
f.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：324 的序列的輕鏈可變區(VL)；或
g.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
h.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)；或
i.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
j.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)；或
k.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
l.包含SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：354的序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：
a.包含SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
b.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
c.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)；或
d.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
e.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)；或
f.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
g.包含SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：354的序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，本發明涉及選自以下的人源化TDP-43結合分子：hACI-7069-633B12-Ab1_H15L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H17L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L17、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H15L18或hACI-7069-633B12-Ab1_H23L20。
優選地，人源化TDP-43結合分子選自hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18或hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H15L18或hACI-7069-633B12-Ab1_H23L20。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中(分離的)核酸編碼本文中所述的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體及其片段。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：168。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：169。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：178。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：179。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：188。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：189。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：198。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：199。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：208。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：209。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：218。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：219。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：228。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：229。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：238。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：239。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：248。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：249。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：258。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：259。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：268。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：269。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：278。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：279。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：288。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：289。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：298。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：299。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：308。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：309。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：318。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：319。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：328。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：329。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：338。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：339。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：348。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：349。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：358。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：359。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：368。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：378。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中該(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：398。
XII.組合物和方法
本發明還涉及包含如本文中所述的本發明人源化TDP-43結合分 子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段以及可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物。
在一些實施方案中，提供了藥物組合物，其包含本文中所述的(分離的)人源化抗體和可藥用載體。
在一些實施方案中，提供了包含以下的綴合的結合分子，特別是抗體或其抗原結合片段：本文中所述的結合分子，特別是抗體或其抗原結合片段，和綴合分子。本發明的綴合物可被稱為免疫綴合物。根據本發明可使用任何合適的綴合分子。一些合適的實例包括但不限於：酶(例如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶)、親和素、鏈黴親和素、生物素、蛋白A/G、磁珠、螢光團、放射性同位素(即放射性綴合物)、核酸分子、可檢測標記、治療劑、毒素和血腦屏障穿透部分。綴合方法是本領域公知的，並且用於使抗體與標記或其他分子綴合的數種技術是可商購的。綴合通常是通過包含在本發明結合分子內的氨基酸殘基(例如賴氨酸、組氨酸或半胱氨酸)的。它們可依賴於例如NHS(琥珀醯亞胺)酯法、異硫氰酸酯法、碳二亞胺法和高碘酸鹽法的方法。綴合可通過例如產生融合蛋白來實現。這在結合分子與另一蛋白質分子綴合的情況下是合適的。因此，可形成合適的遺傳構建體，其允許本發明的結合分子與標記或其他分子的融合體的表達。綴合可以是通過合適的接頭部分的，以確保抗體與綴合分子(例如可檢測標記)的合適空間分離。但是，並非在所有情況下都需要接頭。在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43特異性結合分子與可檢測標記連接。
本發明還涉及包含與一種或更多種治療劑綴合的本文中提供的人源化TDP-43結合分子的免疫綴合物，所述治療劑例如：化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白質毒素、酶活性毒素，或其片段)、放射性同位素(即放射性綴合物)、血腦屏障穿透部分或可檢測標記。存在多種用於改善如本文中所討論的穿過血腦屏障(BBB)的藥物遞送的技術，該討論加以必要的修改應用。非侵入性技術包括所謂的“特洛伊木馬方法”，其中綴合分子通過與BBB受體結合並介導轉運來遞送本發明的結合分子。合適的分子可包含內源性配體或抗體，特別是單克隆抗體，其結合BBB 受體上的特定表位。
在一些實施方案中，提供了免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含本文中所述的(分離的)人源化抗體和治療劑。在一些實施方案中，提供了經標記人源化抗體，其包含本文中所述的人源化抗體和可檢測標記。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子是其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物的一部分。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子或包含其的免疫綴合物作為包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物存在。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子是包含與可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑組合的以下的藥物組合物的一部分：人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子是包含以下的檢測和/或診斷試劑盒的一部分：人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物。
還提供了包含本發明的人源化結合分子的試劑盒。特別地，這樣的試劑盒可用于進行本發明的診斷方法(其包括分類、監測和治療選擇方法)。因此，提供了用於診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病或者用於本發明方法的試劑盒，其包含本發明的人源化TDP-43特異性結合分子。這樣的試劑盒可包含用於進行本文中提供的方法的所有必要組分。通常來說，每種組分單獨儲存在單個整體包裝中。包含在試劑盒中的合適的另外的組分是例如緩衝劑、可檢測染料、實驗室設備、反應容器、說明書，等。使用說明書可針對待使用試劑盒的具體方法進行定制。還提供了經適當標記的本發明的人源化TDP-43結合分子，其可包含在這樣的 試劑盒中。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於用於預防、診斷或治療TDP-43蛋白質病的免疫診斷方法中。
在一些實施方案中，向有此需要的物件施用人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物，用於診斷、預防、減輕或治療包括但不限於以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病：額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
在一些實施方案中，向有此需要的物件施用人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物，用於診斷或監測選自以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的方法中：額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與染色體9p相關、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白突變(VCP；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病))、創傷性腦損 傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。
在另一些實施方案中，本發明涉及用於檢測、診斷或監測選自以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的任何方法：額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)和邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病選自肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)和額顳癡呆(FTD)。更優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是肌萎縮側索硬化(ALS)。更優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是阿爾茨海默病(AD)。更優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是額顳癡呆(FTD)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於這樣的方法中：其用於診斷症狀前疾病或用於監測疾病進展和治療效力，或用於預測回應性，或用於選擇可能對用人源化TDP-43特異性結合分子進行的治療作出回應的對象。所述方法優選地使用人血液或尿的樣品進行。最優選地，所述方法涉及基於ELISA的測定或表面適應測定。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於其中使本發明的人源化TDP-43特異性結合分子與樣品(例如，血液、腦脊液、組織間液(ISF)或腦組織)接觸以檢測、診斷或監測以下的方法中：額顳變性(FTD)或肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於其中使本發明的人源化TDP-43特異性結合分子與樣品(例如，血液、腦脊液、組織間液(ISF)或腦組織)接觸以檢測、診斷或選自以下的疾病的方法中：額顳癡 呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與染色體9p相關、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS，有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白突變(VCP；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病))、創傷性腦損傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。
在一些實施方案中，向有此需要的物件施用人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物，用於預防、減輕或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病、或額顳變性(FTD)或肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征和邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
在一些實施方案中，向有此需要的物件施用人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物，用於治療選自以下的疾病：額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與染色體9p相關、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、 皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白突變(VCP；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病))、創傷性腦損傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。優選地，所述疾病治療有助於保持或提高心理認知，和/或降低腦中TDP-43聚集體的水準。
在一些實施方案中，向有此需要的物件施用人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物，用於製造用於治療以下的藥物：與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病、或額顳變性(FTD)或肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征和邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
如本文中所述的人源化抗TDP-43抗體(TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物的藥物製劑通過將具有所期望純度的這樣的人源化抗體或免疫綴合物與一種或更多種任選的可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980))混合來製備。通常來說，抗體或其片段被製備為凍幹製劑或水溶液。可藥用載體通常在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒，並且包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁 醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡合物(例如Zn蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可藥用載體還包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein，sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述於美國專利公開No.2005/0260186和2006/0104968中。在一個方面中，將sHASEGP與一種或更多種另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)例如軟骨素酶組合。可用於配製組合物的可藥用賦形劑包括但不限於：離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、緩衝物質例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基於纖維素的物質(例如羧甲基纖維素鈉)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。稀釋劑可以是緩衝劑。其可包含選自磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和酒石酸鹽的鹽，和/或其中緩衝劑包含組氨酸、甘氨酸、TRIS甘氨酸、Tris或其混合物。在本發明的上下文中進一步設想稀釋劑是選自磷酸鉀、乙酸/乙酸鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、琥珀酸/琥珀酸鈉、酒石酸/酒石酸鈉、和組氨酸/組氨酸HCl或其混合物的緩衝劑。
示例性的凍幹抗體或免疫綴合物製劑描述於美國專利No.6,267,958中。水性抗體或免疫綴合物製劑包括描述於美國專利No.6,171,586和W02006/044908中的那些，後者的製劑包含組氨酸-乙酸鹽緩衝劑。
針對所治療的特定適應證，本文中的製劑必要時還可包含多於一種的活性成分，優選具有不彼此不利影響的互補活性的那些。
可將活性成分包封在例如通過凝聚技術或通過介面聚合而製備的微囊，例如分別羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中；在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳劑、納米粒和納米囊)中；或在粗乳劑(macroemulsion)中。這樣的技術公開於Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑的一些合適實例包括包含抗體或免疫綴合物的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質為成型製品的形式，例如，膜或微囊。用於體內施用的製劑通常是無菌的。無菌可例如通過經由無菌濾膜進行過濾容易地實現。
本文中提供的任何人源化抗原結合分子、人源化抗TDP-43抗體或免疫綴合物可用於方法，例如治療方法中。
在另一個方面中，提供了用作藥物的人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物。在另外的方面中，提供了用於治療方法中的抗錯折疊人源化TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物。在某些實施方案中，提供了用於預防、診斷和/或治療TDP-43蛋白質病的人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物。在本發明的一個優選實施方案中，提供了人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物，用於預防、診斷和/或治療包括但不限於以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病：額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)和/或邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
在另一個方面中，本發明提供了人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物在製造或製備藥物中的用途。在一個這樣的實施方案中，該方法還包括向個體施用有效量的至少一種另 外的治療劑，例如，如下所述。
根據一些實施方案中的任一個，“物件”或“個體”可以是動物，哺乳動物，優選人。
在另一個方面中，本發明提供了例如用於治療方法中任一種的包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物的藥物製劑。在一個實施方案中，藥物製劑包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物，以及可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑(如在本文中其他部分討論的)。在另一個實施方案中，藥物製劑包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物，以及至少一種另外的治療劑，例如如下所述。
本發明的人源化抗體或免疫綴合物在治療中可單獨使用或與其他藥劑組合使用。例如，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可與靶向α-突觸核蛋白、BACE1(beta-site APP cleaving enzyme 1)、Tau、β-澱粉樣蛋白、TDP-43或神經炎症蛋白的至少一種另外的治療劑共施用。
例如，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可與至少一種另外的治療劑共施用，所述治療劑選自但不限於神經藥物、抗-β澱粉樣蛋白抗體、抗Tau抗體、Tau聚集抑制劑(包括小分子)、β-澱粉樣蛋白聚集抑制劑(包括小分子)、抗BACE1抗體、BACE1抑制劑、抗α-突觸核蛋白抑制劑、抗α-突觸核蛋白抗體和神經炎症抑制劑。
以上所述的這樣的組合治療涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一或分開的製劑中)和分開施用，在分開施用的情況下，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物的施用可在施用另外的治療劑和/或輔助劑之前、同時和/或之後發生。本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物也可與放射治療組合使用。
本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物(和任何另外的治療劑)可通過任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內、以及如果需要的話，進行局部治療、病灶內、子宮內或膀胱內施用。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可通過任何合適的途徑，例如通過注射，例如靜脈內或皮下注射來進行，這部分取決於短暫還是長期施用。本文中考慮了多種給藥方案，包括但不限於單次施用或在不同時間點內的多次施用、推注施用(bolus administration)和脈衝輸注。
本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可以以與良好醫學實踐一致的方式配製、給藥和施用。在該情況下考慮的因素包括：治療的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的特定疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病；治療的特定哺乳動物；個體物件的臨床狀況；與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的原因；藥劑的遞送部位；施用方法；施用方案；以及醫學實踐者已知的其他因素。人源化抗體或免疫綴合物不需要但任選地與目前用於預防或治療所討論的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的一種或更多種藥劑一起配製。這樣的其他藥劑的有效量取決於存在於製劑中的人源化抗體或免疫綴合物的量；與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的類型；或者治療，以及上述其他因素。這些通常以與如本文中所述的相同的劑量和施用途徑，或以本文中所述劑量的約1%至99%，或以憑經驗/在臨床上確定合適的任何劑量和任何途徑使用。
對於預防或治療疾病，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物(當單獨地或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的合適劑量將取決於待治療的疾病類型、抗體或免疫綴合物的類型、疾病的嚴重程度和原因、是出於預防目的還是治療目的施用抗體或免疫綴合物、先前治療、物件的臨床史和對抗體或免疫綴合物的回應，以及主治醫師的判斷。將人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類 型)或免疫綴合物適當地一次或通過一系列治療施用於對象。根據疾病的類型和嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可以是用於向物件施用的初始候選劑量，無論例如是通過一次或更多次分開的施用，還是通過連續輸注。根據上述因素，一種典型的日劑量可以是約1μg/kg至100mg/kg或更高。對於在數天或更長時間內的重複施用，根據病症，通常將持續治療直至出現所期望的疾病症狀抑制。人源化抗體或免疫綴合物的一個示例性劑量是約0.05mg/kg至約10mg/kg。因此，可向物件施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一個或更多個劑量(或其任意組合)。這樣的劑量可間歇地施用，例如，每週或每三周(例如，使對象接受約2至約20，或例如約6個劑量的抗體)。可施用較高的初始負荷劑量，隨後施用一個或更多個較低的劑量。然而，可使用其他劑量方案。該治療的進展通過常規技術和測定容易地監測。
應當理解，任何以上製劑或治療方法可使用本發明的免疫綴合物和人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)二者來進行。
在本發明的另一個方面中，提供了包含上述可用於治療、預防和/或診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙或異常、或TDP-43蛋白質病的材料的製品。該製品包含容器以及在容器上或與容器相聯接的標記或包裝插入物。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料，例如玻璃或塑膠形成。容器容納單獨地或與另一組合物組合有效治療、預防和/或診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的組合物，並且可具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有可通過皮下注射針刺穿的塞的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑是本發明的人源化抗體或免疫綴合物。標記或包裝插入物指示所述組合物用於治療所選擇的病症。
此外，該製品可包含：(a)第一容器，其中包含組合物，其中所述組合物包含本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類 型)或免疫綴合物；以及(b)第二容器，其中包含組合物，其中所述組合物包含另外的治療劑。在本發明的該實施方案中的製品可還包含指示所述組合物可用於治療特定病症的包裝插入物。作為替代或補充，該製品可還包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含可藥用緩衝劑，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸緩衝鹽水、林格溶液或右旋糖溶液。其還可包含從商業和使用者的角度來看所期望的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針和注射器。
在另一個實施方案中，本發明涉及在物件中保持或提高認知記憶能力、運動和語言功能或者預防和/或減慢認知記憶能力、運動和語言功能的衰退的方法，其包括施用本發明的人源化結合分子、本發明的免疫綴合物、本發明的組合物或本發明的藥物組合物。
在另一個實施方案中，本發明涉及降低TDP-43水準的方法，其包括施用本發明的人源化結合分子、本發明的免疫綴合物、本發明的組合物或本發明的藥物組合物。
本發明的方法可包括施用至少一種另外的治療，優選地其中所述另外的治療選自但不限於：靶向α-突觸核蛋白、BACE1、tau、β-澱粉樣蛋白、TDP-43或神經炎症蛋白的抗體或小分子，特別是神經藥物、抗β-澱粉樣蛋白抗體、抗Tau抗體、Tau聚集抑制劑、β-澱粉樣蛋白聚集抑制劑、抗BACE1抗體、BACE1抑制劑、抗α-突觸核蛋白抗體和神經炎症抑制劑。
本發明還涉及檢測TDP-43的方法，其包括使樣品與本發明的人源化結合分子，優選本發明的人源化抗體接觸，其中所述樣品是腦樣品、腦脊液樣品、尿樣品或血液樣品。
在某些實施方案中，如本文中提供的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體及其片段的解離常數(dissociation constant，KD)為
Figure 110130007-A0202-12-0084-45
1μM、
Figure 110130007-A0202-12-0084-46
100nM、
Figure 110130007-A0202-12-0084-47
10nM、
Figure 110130007-A0202-12-0084-48
1nM、
Figure 110130007-A0202-12-0084-49
0.1nM、
Figure 110130007-A0202-12-0084-50
0.01nM或
Figure 110130007-A0202-12-0084-52
0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)，特別是關於結合TDP-43，特別是可溶性TDP-43。例如，本發明的人源化TDP-43結合 分子對於可溶性全長TDP-43的KD可以為2nM或更小，在一些具體實施方案中為1nM或更小，在一些更具體的實施方案中，對於可溶性全長TDP-43的KD為700pM或更小。參考表13，在實施例14中對本發明的人源化TDP-43結合分子證明了這一點。
在一個實施方案中，對全長(full length，FL)TDP-43的結合親和力可通過使用表面等離激元共振(surface plasmon resonance，SPR；Biacore 8K，GE Healthcare Life Sciences)測定解離常數(KD)來評價。對於可採用的合適SPR方法的詳細描述，可參考實施例14。
本發明的人源化TDP-43結合分子對於TP-51肽的KD可為15nM或更小，在一些具體實施方案中為10nM或更小。參考表13，在實施例14中對本發明的人源化TDP-43結合分子也證明了這一點。
實施例
實施例1：TDP-43疫苗組合物的製備
基於脂質體的疫苗根據公佈於WO2012/055933中的方案進行製備。包含全長TDP-43(FL TDP-43)蛋白作為抗原(表2，SEQ ID NO：1)的疫苗用於抗體產生。
Figure 110130007-A0202-12-0085-2
實施例2：抗TDP-43抗體的產生
A.小鼠免疫接種
在9周齡時接受雌性C57BL/6JOlaHsd(C57BL/6)和BALB/cOlaHsd(BALB/c)野生型小鼠(Harlan，USA)。疫苗接種開始于10周時。在存在作為佐劑的單磷醯基六醯基脂質A,3-脫醯基(合成)(3D-(6-醯基)PHAD®)的情況下，用存在於脂質體表面上的全長TDP-43蛋白對小鼠進行疫苗接種。
在第0、4、8、21、35和60天通過皮下注射(s.c.)對小鼠進行疫苗接種。在免疫接種之前7天(免疫前血漿)和在第一次免疫接種之後第14、28、42、81和121天對小鼠采血並製備肝素化血漿。另外，通過在無佐劑的情況下按照i.p.注射進行TDP-43蛋白的每天三次加強注射對用於骨髓瘤融合的小鼠進行疫苗接種。
在小鼠血漿中測量疫苗應答。來自經免疫接種小鼠的血漿來源抗體與固定化重組全長(FL)TDP-43的結合指示抗體針對TDP-43的高效價。
B.雜交瘤的產生和對亞克隆的選擇
對小鼠進行安樂死，並使用來自四隻單個小鼠的脾細胞進行與骨髓瘤細胞的融合。從成功融合的雜交瘤細胞系中篩選抗體如下進行。使用基於Luminex珠的多重測定(Luminex，The Netherlands)分析經稀釋的(1：32)細胞培養上清液。將Luminex珠與FL TDP-43綴合，並用對IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3亞類具有特異性的抗小鼠IgG-Fc抗體(Jackson Immunoresearch，USA)捕獲IgG。與與FL TDP-43綴合的珠的結合鑒定出來源於用FL TDP-43脂質體疫苗免疫接種的小鼠的386個命中物(hit)。
使用含血清的選擇培養基培養活雜交瘤。選擇與人FTD腦中TDP-43包涵體優先結合的克隆和與TDP-43的C端結合的克隆進行進一步亞克隆。在有限稀釋之後，將克隆雜交瘤在含低免疫球蛋白的培養基中培養，並選擇穩定的集落進行抗體篩選和選擇。示於表3中的抗體是從該篩選中鑒定出的。
實施例3：結合效力(EC50)的確定
如前所述，進行在抗體的系列稀釋情況下的Luminex測定，以確定抗體與FL TDP-43結合的半最大效應濃度(EC50)。所有的EC50值概述於表3中。總之，所有受試抗體均以高親和力與全長TDP-43結合。
Figure 110130007-A0202-12-0087-3
實施例4：與人FL TDP-43結合的抗體
與人FL TDP-43結合的抗體使用間接ELISA確定。在4℃下於碳酸鹽緩衝液中用1μg/ml人FL TDP-43進行ELISA板包被過夜。將板用0.05%吐溫20/PBS洗滌，並且然後用0.05%吐溫20/PBS中的1%牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封閉1小時。然後，以3倍系列稀釋度(起始於1μg/ml)添加從雜交瘤上清液中純化的抗體，並在37℃下孵育2小時，在此之後將板洗滌。在37℃下，以0.05%吐溫20/PBS中的1/1000稀釋度添加AP綴合的抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，United Kingdom)，持續1小時。在最後洗滌之後，將板與pNPP(Sigma-Aldrich，Switzerland)磷酸酶底物溶液一起孵育，並使用ELISA讀板儀(Tecan，Switzerland)在405nm處讀取。所 有受試克隆均與全長TDP-43結合，其不同EC50值為10至1567ng/ml(表4)。
Figure 110130007-A0202-12-0088-4
實施例5：通過ELISA和肽陣列進行的表位作圖
使用40-66aa線性肽或者在N端生物素化且以9 aa偏移(offset)和6 aa重疊(overlap)覆蓋整個TDP-43序列的15-mer肽的文庫，通過間接ELISA測定篩選從無血清雜交瘤上清液中純化的抗體，以確定結合區。肽序列提供於表5中。
將96孔板在4℃下於碳酸鹽緩衝液中用5μg/ml非生物素化肽包被過夜。將板用0.05%吐溫20/PBS洗滌，並且然後用0.05%吐溫20/PBS中的1%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)在37℃下封閉1小時。然後以1μg/ml添加從雜交瘤上清液中純化的抗體，並在37℃下孵育2小時，在此 之後將板洗滌。在37℃下，以0.05%吐溫20/PBS中的1/1000稀釋度添加AP綴合的抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，United Kingdom)，持續1小時。在最後洗滌之後，將板與pNPP(Sigma-Aldrich，Switzerland)磷酸酶底物溶液一起孵育，並使用ELISA讀板儀(Tecan，Switzerland)在405nm處讀取。
對於生物素化肽，將96孔經鏈黴親和素包被的ELISA板與5μg/mL的生物素化15-mer肽一起孵育。將板用0.05%吐溫20/PBS洗滌3次，並且然後用0.05%吐溫20/PBS中的1%牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封閉1小時。然後以1μg/ml添加從雜交瘤上清液中純化的抗體，並在37℃下孵育2小時，在此之後將板洗滌。在37℃下，以0.05%吐溫20/PBS中的1/1000稀釋度添加AP綴合的抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，United Kingdom)，持續1小時。在最後洗滌之後，將板與pNPP(Sigma-Aldrich，Switzerland)AP底物溶液一起孵育，並使用ELISA讀板儀(Tecan)在405nm處讀取。確定的結合區提供於表6中。發現受試抗體與以下肽結合：分別對應於SEQ ID NO：1的第181至195位、第199至213位、第307至321位、第352至366位、第389至411位、第140至200位元區域的TP-21、TP-23、TP-35、TP-40、TP-48、TDP-6。
更確切的線性表位元使用直接在固體支援物上合成並且以1aa偏移和14 aa重疊覆蓋根據SEQ ID NO：1的整個TDP-43序列的15-mer肽的文庫(Pepscan，Netherlands)進行作圖。將肽陣列用馬血清和卵清蛋白進行封閉，並在4℃下與濃度為0.75至5μg/ml的經純化抗體溶液孵育過夜。在洗滌之後，將肽陣列與1/1000稀釋度的兔抗小鼠IgG(H+L)HRP綴合物(Southern Biotech，USA)在25℃下孵育1小時。在洗滌之後，添加過氧化物酶底物2,2’-疊氮基-二-3-乙基苯並噻唑啉磺酸鹽(ABTS)和20μl/ml的3% H2O2。在一個小時之後，用電荷耦合器件(charge coupled device，CCD)-相機和影像處理系統對顯色進行定量。這些結合區通過表位作圖確定，並且鑒定了以下表位(提供於表6中)：SEQ ID NO：1的第183至188位、第203至213位、第204至208位、第204至211位、第205至210位、第316至323位、第358至361 位、第400至405位、第400至406位、第400至412位氨基酸。
Figure 110130007-A0202-12-0090-5
Figure 110130007-A0202-12-0090-6
實施例6：通過免疫組織化學的來自FTD/ALS物件的腦組織中TDP-43的檢測
在來自FTD物件腦的組織的免疫組織化學實驗中評價靶標接 合。人FTD腦組織從荷蘭腦庫(The Netherlands Brain Bank)、荷蘭神經系統科學協會(Netherlands Institute for Neuroscience)(Amsterdam)(開放訪問：www.brainbank.nl)和皇后廣場神經病腦庫(Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders)(UCL)獲得。所有材料均從捐贈者中收集，腦庫已從所述捐贈者獲得關於腦屍檢以及出於研究目的使用材料和臨床資訊的書面知情同意。使用用於檢測的經螢光標記的二抗對10μm厚冷凍切片進行免疫組織化學。使用以下抗體作為對照：用於檢測病理性包涵體和生理性細胞核TDP-43的兔多克隆泛TDP-43抗體(Proteintech，10782-2-AP)；用於檢測病理性聚集和磷酸化TDP-43的兔單克隆磷酸化TDP-43 p409/410抗體(Cosmobio，TIP-PTD-P02)；以及用於檢測非特異性背景的無一抗的二抗(無1° Ab)。
本發明的所有抗體均與細胞核TDP-43、非聚集TDP-43以及聚集TDP-43結合。本發明的一些抗體優先與A型病理中細胞質中的聚集TDP-43結合(圖1)。對結合特徵的詳細評價概述於表7中。
Figure 110130007-A0202-12-0091-7
 NA：資料不可用；-：不存在；+/-：不清楚；+：弱；++：中等；+++：豐富
實施例7：通過Western印跡的來自FTD/ALS物件的腦組織中TDP-43的檢測
使用precellys使用CK混合勻化管(Labgene，BER0092)，在4℃下於勻化-增溶緩衝液(HS緩衝液)中，以1：4(w/v)比例使腦組織區域(額皮質)勻化。以下順序用於勻化：3個以5000rpm進行30秒的迴圈(每個迴圈之間具有15秒的停頓)。將經勻化的樣品等分，並在-80℃下於1.5ml低蛋白質結合管(Axygen MCT-175-L-C)中儲存。
‧HS緩衝液-10mM Tris.HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、完全無EDTA蛋白酶抑制劑(Roche，32524300)和PhosSTOP磷酸酶抑制劑(Roche，4906837001)。
將腦勻漿在冰上解凍，並重懸於HS緩衝液中，以獲得2% Sarkosyl、1單位/μL Benzonase和1mM MgCl2的最終濃度。然後，將樣品在熱混合器上於37℃下以600rpm的恒定搖動孵育45分鐘。將上清液收集在新管中。將沉澱重懸於1000μl的髓磷脂浮選緩衝液中，並在臺式離心機上於4℃下以20,000g離心60分鐘。小心地去除上清液以去除所有的漂浮脂質。如果無法在單個步驟中去除所有脂質，則重複該步驟。隨後將沉澱用PBS洗滌，並在臺式離心機上於4℃下離心30分鐘。將最終沉澱重懸於200μl PBS中，並在-80℃下儲存。在變性條件下通過免疫印跡分析樣品。
‧含有Sarkosyl、Benzonase和MgCl2的HS緩衝液-10mM Tris.HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、4% Sarkosyl、1單位/μL Benzonase(Novagen 70746-4)、4mM MgCl2、完全無EDTA蛋白酶抑制劑(Roche)和PhosSTOP磷酸酶抑制劑(Roche)。
‧髓磷脂浮選緩衝液-含有1% Triton X-100和30%蔗糖的HS緩衝液
使用MES SDS運行緩衝液(Thermofisher)在Bolt 12% Bis-Tris Plus凝膠1.0mm(Thermofisher)上進行Western印跡。一旦在PBS中稀釋，將樣品(30μl/樣品)裝載到凝膠上，裝載緩衝液(1×，Licor，928-40004)包含100mM的DTT。使蛋白質在100V的恒定電壓下分解1小時。在電泳之後，使用iBLOT(Thermofisher，IB21001)以20伏特將蛋白質轉移到硝化纖維素膜(Thermofisher，IB23001)上，持續7分鐘。在蛋白質轉移之後，將膜在以 1：3在PBS中稀釋的Licor封閉緩衝液(Odyssey封閉緩衝液927-40000)中封閉1小時。將膜與以下一抗孵育過夜：總TDP-43(Proteintech，60019-2-Ig或10782-2-AP)、pTDP-43(Cosmobio，TIP-PTD-M01)。對於一抗，將封閉緩衝液在PBS-T(含有0.4%吐溫20的PBS)中以1：1進行稀釋。在用PBS-T(含有0.1%吐溫20的PBS)洗滌4次之後，將膜與與LICOR染料偶聯的二抗一起孵育。將二抗-驢抗小鼠(目錄號926-68072)或山羊抗兔(目錄號926-32211)在室溫下在用PBS-T(含有0.4%吐溫20的PBS)以1：1稀釋的Licor封閉緩衝液中以1：10000的稀釋度使用，持續1小時。將膜再次用PBS-T(含有0.1%吐溫20的PBS)洗滌4次，並使用LICOR系統進行掃描。圖2顯示，所有mAb均特異性識別全長TDP-43。另外，一些mAb(K、M、N)識別疾病狀態的病理特徵，例如不溶性級分中的C端片段和高分子量聚集體。
實施例8A：使用SPR進行的親合力測量
與可溶性或聚集FL TDP-43的結合親合力通過使用表面等離子體共振(SPR；Biacore T200，GE Healthcare Life Sciences)確定解離常數(KD)評價。通過胺偶聯使重組人可溶性或聚集FL TDP-43固定在CM5 Series S感測器晶片(GE Healthcare Life Sciences)上。可溶性TDP-43以在10mM乙酸鈉(pH 4.5)中5μg/ml的濃度在5μl/分鐘的流量下固定化，持續420秒，使得固定水準為150RU。聚集TDP-43以在10mM乙酸鈉(pH 4.5)中50μg/ml的濃度在5μl/分鐘的流量下固定化，持續840秒，使得固定水準為110RU。使生物素化TP-73肽(SEQ ID NO：1的第181至190位氨基酸)以在PBS-P+中5μg/ml的濃度在5μl/分鐘的流量下固定在Series S Sensor Chip SA(GE Healthcare Life Sciences)上，持續30秒，使得固定水準為400RU。為了評價KD值，將經純化抗體和對照抗體(2E2-D3)在PBS-P+中以3倍稀釋度開始於333nM並稀釋降低至0.15nM進行注射。將抗體以50μl/分鐘的流量注射，持續90秒的接觸時間和700秒的解離階段，隨後在10mM甘氨酸-HCl pH 1.7下進行三次再生。對於優化的SPR方案，將抗體以起始於300nM並稀釋降低至1.2nM進行3倍稀釋，並且以30μl/分鐘注射持續300秒，隨後解離600秒。通過一次注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.7使表面再生。從結合動力學獲得的結 果使用空白流通池和緩衝液迴圈進行雙重參考，並使用帶有RI的整體1：1擬合模型進行評價。11種抗體和兩種Fab片段的親合力示於表8中。本發明的抗體以0.62nM至4.64nM的KD結合聚集TDP-43。另外，與可溶性TDP-43相比，一些抗體顯示優先與聚集TDP-43結合。兩種Fab片段以2.8nM至21.8nM的KD與可溶性TDP-43結合，並且針對聚集TDP-43顯示出類似的KD。使用允許更準確KD確定，尤其是對於解離速率較慢的抗體的經優化SPR方案(具有更長的締合和解離階段)，對兩種抗體(標有*)進行再分析。兩種抗體以0.22nM至3.9nM的KD與可溶性TDP-43結合，並且以0.18nM至0.69nM的KD與聚集TDP-43結合。抗體ACI-7069-642D12-Ab1以3.6nM的KD與TP-73肽結合。
Figure 110130007-A0202-12-0095-8
 NA，不適用，由於可用於擬合的曲線少於三個。*使用經優化SPR方案對重組產生的IgG2a同種型抗體的結合進行表徵。
實施例8B：使用SPR進行的親合力測量
與可溶性FL TDP-43的結合親和力通過使用表面等離子體共振(SPR；Biacore T200，GE Healthcare Life Sciences)確定解離常數(KD)評價。通過胺偶聯使山羊抗小鼠捕獲抗體固定在CM5 Series S感測器晶片(GE Healthcare Life Sciences)上。使抗體以在PBS-P+(GE Healthcare Life Sciences)中2至5μg/ml的濃度在10μl/分鐘的流量下捕獲，持續120秒，使得捕獲水準為350至1000RU。為了評價KD值，將FL TDP-43或TP-51肽(SEQ ID NO：1的第352至414位氨基酸)在PBS-P+中以3倍稀釋度起始於1.2nM直至100nM以30μl/分鐘的流量以單迴圈動力學注射，持續300秒接觸時間。記錄解離持續1小時，隨後用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7進行一次再生。從結合動力學獲得的結果使用空白流通池和緩衝液迴圈進行雙重參考，並使用帶有RI的整體1：1擬合模型進行評價。將3種抗體的結合速率(on-rate)(ka)、解離速率(off-rate)(kd)和親和力(KD)作為12(ACI-7069-633B12-Ab1)、2(ACI-7069-642D12-Ab1)或3(ACI-7071-809F12-Ab1)個重複的平均值±SD示於表9中。抗體ACI-7069-633B12-Ab1、ACI-7069-642D12-Ab1和ACI-7071-809F12-Ab1分別以15至135pM、226至272pM和389至457pM的親和力與可溶性TDP-43結合。抗體ACI-7069-633B12-Ab1以1184至1316pM的親和力與TP-51肽結合。
Figure 110130007-A0202-12-0097-9
實施例9：抗體測序
克隆雜交瘤細胞裂解物用於可變區的基因測序。收穫小鼠雜交瘤並使用包含胍鹽的裂解緩衝液裂解以使RNase失活。然後通過無RNase的DNase消除基因組DNA，並使用基於二氧化矽的親和柱採用多次洗滌純化RNA，並將其使用無RNase水從柱中洗脫。一旦提取RNA，其純度和濃度通過分光光度法測量。在變性瓊脂糖凝膠上評估RNA的完整性，並使用逆轉錄酶(reverse transcriptase，RT)將RNA逆轉錄成cDNA。在添加RT反應混合物之前，將RNA加熱至70℃持續10分鐘以破壞RNA二級結構。將RT產物直接用於PCR擴增。對於cDNA的高保真PCR擴增，將對應於編碼抗體的不同基因家族的可變區引物中的每個單獨地與VH和VL的恒定引物分開以50μl的總反應體積混合。最初，使用簡並引物庫(VH為12以及VL為12)，並且根據結果，使用第二庫以獲得PCR產物。在PCR反應之後，產物通過在經溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠上進行凝膠電泳分析。VL和VH的PCR產物單獨地使用tris乙酸鹽EDTA(tris-acetate-EDTA,TAE)在瓊脂糖凝膠上進行純化。使用與用於PCR的引物相同的引物，使用染料終止劑測序方法對從凝膠切下的經純化片段進行測序。以兩個方向進行測序以提供在兩端的重疊。使用多重序 列比對(Clustal工具)分析序列，並使用Kabat演算法進行注釋，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,91-3242(1991)中所述的。重鏈和輕鏈可變結構域(VH和VL)的核苷酸序列示於表10中。所選擇的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變結構域、及其互補決定區(CDR)的翻譯蛋白質序列示於表11中。
Figure 110130007-A0202-12-0098-10
Figure 110130007-A0202-12-0099-11
Figure 110130007-A0202-12-0100-12
Figure 110130007-A0202-12-0101-13
Figure 110130007-A0202-12-0102-14
Figure 110130007-A0202-12-0103-15
Figure 110130007-A0202-12-0104-16
Figure 110130007-A0202-12-0104-17
Figure 110130007-A0202-12-0105-18
Figure 110130007-A0202-12-0106-19
Figure 110130007-A0202-12-0107-20
Figure 110130007-A0202-12-0108-21
Figure 110130007-A0202-12-0109-22
實施例10：ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)在TDP-43蛋白質病的轉基因小鼠模型中的體內效力
為了評價ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)的體內效力，對ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)在NEFH-tTA x hTDP-43△NLS雙轉基因小鼠(rNLS8小鼠，Walker et al.2015)中降低TDP-43病理狀況的能力進行測試。每週用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(n=30)或載劑(n=30)對rNLS8小鼠進行注射，並且在給藥結束時分析分子病理標誌物，例如磷酸化TDP-43和/或總不溶性TDP-43。
10.1 動物
在開始研究之前，使所有動物適應環境，對其檢查，處理和稱重，以確保足夠健康，並使與實驗操作相關的非特異性應激最小化。在飼養期間和在8周齡之前，使小鼠保持包含多西環素(200mg/kg)的食物飲食。在8周齡時，將飲食改變為不包含多西環素(DOX)的食物飲食，以允許轉基因表達。在整個該研究中，使光/暗迴圈(12/12)、室溫(20℃至23℃)和相對濕度(約50%)保持恒定。在研究期間隨意提供食物飲食和水。當小鼠開始表現出運動困難時，將飲食改變為在籠底上的濕食物和水凝膠。所有行為測試均在動物的光迴圈階段期間進行。
10.2.化合物施用
在注射當天，新鮮製備ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)(60mg/kg)和載劑，並在整個研究期間遵循每週給藥方案i.p施用。
10.3.腦的收集
將腦分為兩個半球。解剖左半球以收集皮質腦區域。將小鼠皮質和剩餘的腦組織快速冷凍以進行進一步的生物化學分析。將剩餘的右半球在室溫下灌注3小時之後直接浸沒固定，並收集在新鮮製備的包含4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的1×PBS中。
10.4.免疫組織化學
將浸沒固定的右腦半球以均勻、系統的隨機方案在Leica CM1950低溫切片機上以10微米的切片厚度矢狀切開。對每只小鼠的系統性隨機矢狀切片集合(來自腦的第2、3、4、6、8、10和11水準的7個切片)進行針對TDP-43和磷酸化TDP-43的免疫染色。進行Iba1染色以對腦中小膠質細胞數目和形態進行定量。使用經螢光標記的二抗使抗體結合視覺化。標準陰性對照包括野生型腦切片以及來自未施加一抗的轉基因動物的切片。
10.5.免疫反應性的成像和確定
將經封固的切片在由ZEN軟體驅動的Axio.Scan Z1玻片掃描器上以10×放大率使用LED(Colibri2)照明和靈敏性Orca Flash 4.0單色相機作為整體進行成像。使用大腦皮質和背側紋狀體中目的區域的單獨描繪確定腦尺寸。物體密度(object density，OD)(以每mm2物體的數目計)針對以下確定：所有標誌物、經標記面積百分比和相對於第二描繪的目的區域尺寸(不包括任何組織偽影(組織褶皺(tissue fold)等))的OD。
10.6.從腦皮質製備蛋白質樣品：
將組織在冰上解凍，並且然後在包含1mM PMSF和蛋白酶-/磷酸酶抑制劑混合物(Roche Applied Science)的5X v/w放射免疫沉澱測定緩衝液(RIPA，50mM Tris，150mM NaCl，1% IGEPAL CA630，5mM EDTA，0.5%去氧膽酸鈉和0.1% SDS，pH 8.0)中進行聲處理。將樣品在4℃，100,000g下離心30分鐘，並且將上清液視為可溶性級分。將沉澱通過用RIPA聲處理進行洗滌，並棄去上清液。將RIPA不溶性沉澱在2X v/w尿素緩衝液(7M尿素，2M硫脲，4% CHAPS和30mM Tris，pH8.5)中進行聲處理，並在22℃，100,000g下離心30分鐘。該上清液被視為RIPA不溶性/尿素可溶性級分。RIPA可溶性級分的蛋白質濃度使用BCA蛋白質測定(Pierce)確定。
10.7.不溶性TDP-43的定量
RIPA不溶性級分中的總TDP-43水準通過商業人TDP-43 AlphaLISA試劑盒(Perkin Elmer，AL387HV)分析。
10.8.統計學分析
將IHC和AlphaLISA資料表示為平均值±SEM。經載劑處理的動物與經ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)處理的動物之間的統計學差異通過Welch t檢驗分析，並通過相應條上方的星號指示(*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001)。組織學測量中的異常值被排除，為組或水準中的格魯布斯異常值(Grubbs outlier)(單測量)，或者由於技術原因(圖像偽影、組織褶皺等)。
10.9.結果
用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)進行處理降低rNLS8小鼠中的磷酸化TDP-43和不溶性TDP-43
在rNLS8小鼠模型中，K82A/R83A/K84A突變型人TDP-43(hTDP-43△NLS)的DOX可阻遏形式的過表達導致神經元胞質中TDP-43明顯積累和聚集。該模型的病理標誌是不溶性和磷酸化TDP-43包涵體(pTDP-43)的沉積。這些小的球形胞質包涵體僅存在于轉基因動物中，而在WT或單基因轉基因tTA對照小鼠中則完全不存在。此外，pTDP-43在不存在DOX的第一周的期間普遍不存在，而在3至4周、去除DOX期間以急劇的進展積累(Walker et al.,2015)。與經載劑處理的小鼠相比，ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)處理導致紋狀體和大腦皮質二者中磷酸化TDP-43的密度統計學上顯著地降低(圖3A至B)，表明其降低TDP-43病理狀況的功能效力。選擇紋狀體和大腦皮質進行定量是由於這些區域中轉基因的高表達。
10.10.用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)進行處理降低rNLS8小鼠中的不溶性TDP-43
為了確定在免疫組織化學讀出中觀察到的TDP-43病理狀況降低，在生物化學分級之後，對腦中總不溶性/聚集TDP-43的量進行定量。由包含不溶性/聚集TDP-43的左腦半球的皮質製備RIPA不溶性級分。與經載劑處理的動物相比，在經ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)處理的小鼠中觀察到不溶性TDP-43的量顯著降低(圖3C)。分子TDP-43病理狀況的這種降低與通過免疫組織化學觀察到的結果一致，確定了用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)處理的效力。據我們所知，這是首次在針對TDP-43蛋白質病的體內模 型中施用外周抗體改善了TDP-43病理狀況的形成。
10.11. rNLS8小鼠中的ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)處理提高小膠質細胞免疫反應面積
在抑制轉基因表達之後rNLS8小鼠中的功能恢復涉及小膠質細胞活性的提高。小膠質細胞體面積在該階段提高，並且導致TDP-43病理狀況清除和運動缺陷在功能上恢復，表明在rNLS8小鼠模型中的治療範例(Spiller K.J et al.,Nature Neuroscience,2018)。
為了評價ACI-7069-633B12-Ab1在rNLS8小鼠中降低TDP-43病理狀況的作用模式，評估了其對小膠質細胞活化的作用。通過免疫組織化學進行Iba1染色，以對小鼠大腦皮質中小膠質細胞的數目和狀態進行定量。在rNLS8小鼠中在末期(距Dox 5周)發現小膠質細胞增生。與經載劑處理的對照相比，ACI-7069-633B12-Ab1處理顯著提高了皮質中Iba1陽性免疫反應面積(圖5A)。這種提高可能是由小膠質細胞數目增多或小膠質細胞形態改變而產生。為此，首先評價皮質中Iba1陽性細胞的密度。與經載劑處理的對照相比，ACI-7069-633B12-Ab1處理不影響小膠質細胞密度，代表細胞數。
接下來，評價ACI-7069-633B12-Ab1對小膠質細胞形態的作用。為了使Iba1免疫反應面積的提高與代表形態的小膠質細胞活化狀態的變化相關聯，將小膠質細胞基於其尺寸和形態分類為三種狀態(大肥大性、小分枝和分枝靜息)。與經載劑處理的對照相比，在ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)處理中，看到大肥大性小膠質細胞的平均細胞尺寸顯著提高(圖5B)。在代表較低活化狀態的其他兩類小膠質細胞中，未發現顯著差異(圖5C至D)。該分析表明，在ACI-7069-633B12-Ab1處理組群中觀察到的總Iba1陽性免疫反應面積的提高是由反映在小膠質細胞尺寸和活化狀態提高的形態變化產生。這表明，ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)在該動物模型中至少部分地通過募集小膠質細胞和使其活化來降低TDP-43病理狀況。
實施例11：在重組TDP-43聚集測定中ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)的體外功能
為了評價ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)在體外的功能，對ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)抑制TDP-43聚集的能力進行測試。FL TDP-43在C端與被煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)蛋白酶切割位點分開並且重組產生的麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein，MBP)融合。通過添加TEV蛋白酶(AcTEV，Invitrogen)誘導在存在2.5μM ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)或不與TDP-43結合的同種型對照的情況下在30mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4中2.5μM TDP-43-TEV-MBP融合蛋白的聚集，並在30小時內於600nm處在μclear 96孔板(Greiner)中監測吸光度。為了進行評價，將終點相對於同種型對照歸一化，並針對ACI-7069-633B12-Ab1計算聚集TDP-43的百分比。與同種型對照相比，抗體ACI-7069-633B12-Ab1顯著抑制TDP-43聚集，抑制了98%(圖4)。
實施例12：使用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)和ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a變體)的生物流體中TDP-43的檢測和定量
方法：使用ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a變體)和ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a變體)建立PerkinElmer基於珠的AlphaLISA免疫測定。對於CSF樣品，在摻入回收率實驗中建立稀釋度線性。然後在經稀釋的CSF樣品中測量TDP-43的濃度。在白色optiplateTM-384微板中製備樣品，並測量615nm處的發射量，作為原始AlphaLISA計數。
結果：在該免疫測定中，對來自健康對照和FTLD-TDP(語義癡呆、C9orf72或GRN)患者的腦脊液(CSF)樣品中的總TDP-43進行定量(圖6)。在三個獨立的實驗中，與健康對照相比，來自具有GRN突變的FTLD-TDP患者的多個患者CSF樣品的相對TDP-43定量顯示出顯著更高的TDP-43水準(圖6)。在三個獨立的實驗中，與健康對照相比，來自具有C9orf72突變和語義癡呆的FTLD-TDP患者的多個患者CSF樣品的相對TDP-43定量也顯示出更高的TDP-43水準(圖6)。
實施例13：在FTD腦提取物中通過免疫耗竭評估的與病理性TDP-43的結合
為了評價抗體在特異性結合天然狀態下TDP-43聚集體中的效 力，進行在富含病理性TDP-43的腦提取物中的免疫耗竭實驗。
方法：如實施例7中所述製備來自FTD A型(FTD-A)死後腦的不溶性級分。使用DynabeadsTM磁珠、蛋白G(Thermoscientific 10003D)進行免疫耗竭。在重懸于管中之後，將130μl的珠轉移至1.5ml低結合管中。使用磁體將珠用補充有0.05%吐溫20的PBS沖洗兩次以去除上清液。將珠均分在三個不同的低結合管中。將抗體(ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a同種型)、ACI-7069-642D12-Ab1(IgG2a同種型)、小鼠IgG2a對照)稀釋至100μg/ml，並在去除上清液(使用磁體)之後，向每個管中添加100μl。將抗體-珠混合物在室溫下孵育1小時。將珠-抗體複合體用500μl PBS-0.05%吐溫20洗滌一次，並用PBS洗滌一次，然後重懸於250μl PBS中。將抗體-珠分到兩個新管(每管120μl)中。將不溶性級分在冰上解凍，並在冰上以振幅30進行聲處理持續30秒。在去除上清液之後，向每個抗體-珠管添加30微克的腦材料，並在4℃下於持續旋轉下孵育過夜。將管置於磁體上，並收集上清液作為經免疫耗竭的級分。輸入材料和經免疫耗竭的材料通過Western印跡進一步分析。Western印跡如實施例7中所述進行。每個泳道裝載20μl的樣品。使用以下抗體進行免疫印跡：分別以1：2000和1：1000的稀釋度使用的總TDP-43(與DyLight680偶聯的ACI-7069-633B12-Ab1)、pTDP-43(Biolegend，829901)。以1：10000的稀釋度使用山羊抗大鼠二抗(目錄號925-32219)。
結果：與同種型對照抗體相比，ACI-7069-633B12-Ab1和ACI-7069-642D12-Ab1能夠特異性結合並且耗竭來自從FTD A型腦組織中獲得的sarkosyl不溶性級分的TDP-43和pTDP-43(圖7)。該資料確定了這些抗體與人患者中的靶標接合的特性。
實施例14. 抗人TDP-43小鼠單克隆抗體的人源化
人源化可變區的設計
使用同源匹配來選擇人接納體框架以接枝ACI-7069-633B12-Ab1 CDR。人和小鼠種系可變基因的資料庫，例如IMGT資料庫(Ehren mann,F et al,(2010)Nucl.Acids Res.,38(S1)：D301-D307)或IgBlast(Ye J.et al,(2013),Nucleic Acids Res.2013 Jul；41(Web Server issue)：W34-W40)或VBASE2(Retter I et al,(2005)Nucleic Acids Res.33,Database issue D671-D674)可用於鑒定與鼠重鏈和輕鏈V區(分別為SEQ ID NO：20和24)最接近的人可變結構域亞家族。
例如，使用IMGT資料庫表明了接枝物ACI-7069-633B12-Ab1重鏈可變(VH)結構域框架與人重鏈可變結構域亞家族1成員之間的最佳序列同源性。對於種系序列：IGHV1-3、IGHV1-2、IGHV1-46、IGHV1-24，觀察到CDR與框架序列二者的最高同源性和同一性，所有這些種系序列對於直至CDR3的整個序列都具有高於65%的序列同一性。IGHV1-3由於其高序列同源性而被選擇作為VH框架。
使用相同的方法，ACI-7069-633B12-Ab1輕鏈可變結構域序列顯示出與人輕鏈可變(VL)結構域κ亞家族2成員的最佳序列同源性。對於種系序列：IGKV2-30、IGKV2-29、IGKV2D-29、IGKV2-24，觀察到CDR與框架序列二者的最高同源性和同一性，所有這些種系序列對於直至CDR3的整個序列都具有高於70%的序列同一性。IGKV2-30由於其高序列同源性而被選擇作為VL框架。
在ACI-7069-633B12-Ab1 CDR序列內鑒定潛在的翻譯後修飾位點。在可變重鏈中，N53、N54和G55被鑒定為兩個脫醯胺位點。在可變輕鏈中，在位置D28和G29處識別出異構化位點，而在位置W89(根據Kabat編號系統)處識別出氧化位點。在一些構建體中，包括N53G和/或G55A在內的點突變被引入到VH區，而G29A和/或W89F被引入到VL區以去除CDR L1和L3中的翻譯後修飾位點。
作為人源化過程的起點，將鼠CDR接枝到VH和VL區二者的人接納體框架上。
為了將CDR供應至人接納體框架上，通過將人殘基替換為小鼠殘基來修飾關鍵位置。
為了鑒定可最大影響CDR構象和/或VH/VL取向的殘基，使用Abodybuilder伺服器(8)通過同源建模生成了人-小鼠雜交VH-VL對的3D模 型。模型分析允許選擇包括表12中所列位置在內的位置的子集。
Figure 110130007-A0202-12-0117-23
組合來自表12的回復突變以產生分別列於表13和15中的序列。
Figure 110130007-A0202-12-0117-24
Figure 110130007-A0202-12-0118-25
表14：人源化重鏈可變結構域(VH)的DNA
Figure 110130007-A0202-12-0119-26
Figure 110130007-A0202-12-0120-27
Figure 110130007-A0202-12-0121-28
Figure 110130007-A0202-12-0122-29
Figure 110130007-A0202-12-0122-30
Figure 110130007-A0202-12-0123-31
Figure 110130007-A0202-12-0124-32
人源化抗體變體的產生
使用標準分子生物學技術合成重鏈和輕鏈可變結構域二者的DNA編碼序列並將其克隆到允許在哺乳動物細胞中表達的質粒中。重鏈可變結構域與含有S228P突變的人免疫球蛋白IgG4恒定結構域融合以防止半分子形成，或者與人IgG1恒定結構域融合，並且輕鏈可變結構域被克隆到含有恒定κ輕鏈結構域的質粒中。通過使用ExpiFectamineTM 293轉染試劑盒(ThermoFischer science，A14524)共轉染重鏈和輕鏈質粒，嵌合抗體和人源化變體在Expi293F細胞中暫態表達。轉染之後，將細胞維持在37℃下、150rpm攪拌下和8% CO2水準下。在轉染之後6天，收穫上清液並在預裝有1mL MabSelect Sure樹脂(GE Healthcare Life Sciences，17543803)的蛋白A柱上純化。在裝載細胞培養物液體之前，將柱用0.1M Tris(pH 7.0)平衡。裝載之後，將柱用0.1M Tris(pH 7.0)洗滌，隨後使用0.1M檸檬酸鹽(pH3.5)進行洗脫。然後通過添加0.1M Tris(pH 9.0)來中和洗脫。然後將樣品在PBS緩衝液中透析。
通過表面等離激元共振(SPR)對ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體進行的表徵
通過將可溶性TDP-43固定在CM5系列S感測器晶片(GE Healthcare，BR-1005-30)上來在Biacore 8K儀器(GE Healthcare Life Sciences)上進行測量。
通過SPR進行的針對可溶性TDP-43的KD測定
儀器用運行緩衝液PBS-P+進行準備，並且通道1至8的流動池(Fc)1和2用EDC/NHS(胺偶聯試劑盒，兩種試劑的比例為1：1，GE HealthcareLife Sciences，BR-1006-33)的新鮮溶液以10μL/分鐘啟動，持續420秒。將可溶性TDP-43(Selvita)在乙酸鈉pH 4.5中稀釋至5μg/mL的終濃度並以5μL/分鐘的流量注射到Fc 2上，持續900秒。所有流通池均用1M乙醇胺(GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)以10μL/分鐘淬滅，持續420秒。乙醇胺淬滅之後的固定水準在所有八個通道上均為680RU。在分析之前，運行了兩個啟動週期。將1.2至100nM的提高的mAb濃度以單迴圈動力學注射，其由運行緩衝液中的3倍連續稀釋來製備，接觸時間為300秒，並且解離時間為900秒，流量為30μL/分鐘。每個迴圈之後是一次再生，其使用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7以30μL/分鐘、以30秒的接觸時間進行，隨後是300秒的穩定期。從單迴圈動力學獲得的結果使用空白Fc 1和緩衝液迴圈進行雙重參考，並使用Biacore 8K評價軟體使用具有RI和整體Rmax的1：1動力學擬合模型進行評價。獲得以下動力學參數：結合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、親和常數(KD)和飽和回應(Rmax)。
通過SPR進行的針對TP-51肽的KD測定
儀器用運行緩衝液PBS-P+進行準備，並且通道1至8(8K)的Fc 1至2用EDC/NHS(胺偶聯試劑盒，兩種試劑的比例為1：1，GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)的新鮮溶液以10μL/分鐘啟動，持續420秒，並且山羊抗人抗體(GE Healthcare Life Sciences，29234600)以25μg/mL在10mM乙酸鈉pH 5中固定，持續420秒。接下來，所有Fc均用1M乙醇胺(GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)淬滅，持續420秒。任何非共價結合的抗體均通過兩次用10mM甘氨酸-HCl pH 1.7進行的持續30秒的再生來去除。在乙醇胺淬滅之後評價固定水準(所有通道均為10000RU)。
每個迴圈都以人源化變體的非共價捕獲開始，這些人源化變體在運行緩衝液中稀釋至2μg/mL的終濃度，並以10μL/分鐘的流量注射，持續60秒。TDP-43 mAb在通道1至8上被捕獲，使Fc 1作為空白Fc。在每次mAb 注射之後的120秒穩定期之後，評價捕獲水準，並且其範圍為300至500RU。
TP-51肽(Pepscan)的注射以單迴圈動力學進行，其為1.2至100nM的提高的濃度，由連續的3倍稀釋來製備。以25μL/分鐘的流量以300秒/注射的接觸時間進行注射。3600秒的解離階段在最後一次注射之後。通過以10μL/分鐘的流量一次注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.7 120秒來使感測器表面再生，隨後是300秒的穩定期。從單迴圈動力學獲得的結果使用空白Fc 1和緩衝液迴圈進行雙重參考，並通過Biacore 8K評價軟體用具有RI和整體Rmax的1：1動力學擬合模型進行評價。獲得以下動力學參數：結合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、親和常數(KD)和飽和回應(Rmax)。
所有參數(Rmax除外)均在表17至18中報告為來自2至8個獨立實驗的平均值±SD。
Figure 110130007-A0202-12-0126-33
總體而言，所有人源化變體都保留了對TDP-43和TP-51肽的良好親和力(表17)，如先前針對鼠抗體所觀察到的(表8)。具有最佳親和力的 變體是hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19。
重新格式化為人IgG1的人源化變體的靶標結合親和力的確定。
Figure 110130007-A0202-12-0127-34
總體而言，當重新格式化為人IgG1同種型時，所有人源化變體都保留對TDP-43和TP-51肽的相似親和力(表18)。所有受試變體在pM範圍內都顯示出對可溶性TDP-43的良好親和力。
體外重組TDP-43從頭聚集測定
測試了人源化抗體抑制TDP-43聚集的能力。在該測定中使用了與被煙草蝕紋病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)蛋白酶切割位點分開的麥芽糖結合蛋白(Maltose-Binding Protein，MBP)融合的TDP-43。使用離心篩檢程式將儲存緩衝液(20mM Tris-Cl pH 8.0、300mM NaCl、5%甘油、1mM DTT)更換為測定緩衝液(30mM Tris、150mM NaCl，pH 7.4)，並通過在280nm下的紫外(ultraviolet，UV)光譜術(NanoDrop)來確定蛋白質濃度。將TDP-43-MBP在測定緩衝液中稀釋至2.5μM的終濃度，並在低結合管中與833nM的人源化 變體或者IgG4或IgG1同種型對照混合。通過在96孔板中添加終濃度為10μg/mL的TEV蛋白酶來誘導聚集，每孔終體積為80μL。在24小時內每15分鐘通過在孔中心在600nm下的一式三份的吸光度測量來監測聚集，每次測量之前搖晃5秒。將板一直保持在25℃下在讀板器中並用箔密封。1.5小時之後，通過Western印跡分析確定TEV切割。
為了進行分析，將24小時內的曲線下面積(area under curve，AUC)相對於IgG4或IgG1同種型對照歸一化，並計算每種mAb的聚集TDP-43百分比。資料表示為三個獨立重複的平均值±SD。圖8A和8B示出了相對於嵌合抗體(IgG4或IgG1同種型)對一些人源化ACI-7069-633B12-Ab1變體的聚集的抑制的比較。與嵌合抗體相比，所有人源化變體在抑制重組TDP-43聚集中均顯示出良好的效力。與嵌合抗體cACI-7069-633B12-Ab1(IgG4或IgG1同種型)相比，在所有受試的人源化變體中，hACI-7069-633B12-Ab1_H16L14、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L18、hACI-7069-633B12-Ab1_H20L19、hACI-7069-633B12-Ab1_H15L18和hACI-7069-633B12-Ab1_H23L20在抑制TDP-43聚集中顯示出相等的效力。
在FTD腦提取物中通過免疫耗竭評估的與病理性TDP-43結合的人源化變體
為了評價抗體在特異性結合天然狀態下TDP-43聚集體中的效力，進行在富含病理性TDP-43的腦提取物中的免疫耗竭和免疫沉澱實驗。
如實施例7中所述製備來自FTD A型(FTD-A)死後腦的不溶性級分。使用DynabeadsTM磁珠、蛋白G(Thermoscientific 10003D)進行免疫耗竭。在重懸于管中之後，將珠轉移到1.5ml低結合管中。使用磁體將珠用補充有0.05%吐溫-20的PBS沖洗兩次以去除上清液。將抗體(hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(IgG1同種型)，人IgG1對照)以8微克抗體/毫克珠(珠飽和)的比率添加至珠。將抗體-珠混合物在室溫下孵育30分鐘。將珠-抗體複合體用1000μl PBS-0.05%吐溫-20洗滌3次，並用500μl PBS洗滌一次。將不溶性級分在冰上解凍，並在冰上以振幅30進行聲處理，持續30秒，然後在PBS中稀釋至100μg/ml。在去除上清液之後，每微克抗體添加10微克 腦材料，並在連續旋轉下在室溫下孵育30分鐘。將管置於磁體上，並收集上清液作為免疫耗竭級分。輸入材料、經免疫耗竭的材料和經免疫沉澱的材料通過Western印跡進一步分析。Western印跡如實施例7中所述進行。每個泳道裝載20μl樣品。使用以下抗體進行免疫印跡：分別以1：2000和1：1000的稀釋度使用的總TDP-43(與DyLight680偶聯的ACI-7069-633B12-Ab1)、pTDP-43(Biolegend，829901)。以1：10000的稀釋度使用山羊抗大鼠二抗(目錄號925-32219)。
與同種型對照抗體相比，人源化變體hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(IgG1同種型)能夠特異性結合並耗竭來自從FTD A型腦組織獲得的sarkosyl不溶性級分的TDP-43(圖9A)和pTDP-43(圖9B)。這些資料確定了這些抗體在人患者樣品中與靶標接合的期望特性。
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Claims (74)

  1. 人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：
    a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
    b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：222和SEQ ID NO：382的氨基酸序列；
    c. VH-CDR3，其包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)；
    d. VL-CDR1，其選自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：265和SEQ ID NO：305的氨基酸序列；
    e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：206和SEQ ID NO：216的氨基酸序列；和
    f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：247的氨基酸序列。
  2. 請求項1所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：
    a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
    b. VH-CDR2，其包含SEQ ID NO：202的氨基酸序列；
    c. VH-CDR3，其包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)；
    d. VL-CDR1，其包含SEQ ID NO：195的氨基酸序列；
    e. VL-CDR2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和
    f. VL-CDR3，其包含SEQ ID NO：237的氨基酸序列；
    或者，包含：
    i. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；
    ii. VH-CDR2，其包含SEQ ID NO：382的氨基酸序列；
    iii. VH-CDR3，其包含氨基酸序列ES(Glu-Ser)；
    iv. VL-CDR1，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列；
    v. VL-CDR2，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和
    vi. VL-CDR3，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
  3. 請求項1或2所述的人源化TDP-43結合分子，其包含人重鏈可變結構域亞家族1框架序列。
  4. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含IGHV1-3、IGHV1-2、IGHV1-46或IGHV1-24 VH框架序列，優選IGHV1-3 VH框架序列。
  5. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含人輕鏈可變結構域κ亞家族2框架序列。
  6. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含IGKV2-30、IGKV2-29、IGKV2D-29或IGKV2-24 VL框架序列，優選IGKV2-30或IGKV2-29 VL框架序列。
  7. 請求項6所述的人源化TDP-43結合分子，其包含IGKV2-30 VL框架序列，優選IGKV2-30*02 VL框架序列。
  8. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含以下VH突變中的一個或更多個、直至所有：Q1E、A24T、R38K、P41H、M48I、V67A、I69L、R71V、T73K。
  9. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含以下VL突變中的一個或更多個、直至所有：R24K、F36L、R45K、G57R、V58I。
  10. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：
    重鏈可變區(VH)，其選自：
    i.包含SEQ ID NO：160的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：160的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    ii.包含SEQ ID NO：170的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：170的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    iii.包含SEQ ID NO：180的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：180的氨基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    iv.包含SEQ ID NO：190的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：190的氨基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    v.包含SEQ ID NO：200的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：200的氨基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    vi.包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：210的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    vii.包含SEQ ID NO：220的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：220的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    viii.包含SEQ ID NO：230的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：230的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    ix.包含SEQ ID NO：240的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：240的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    x.包含SEQ ID NO：250的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO： 250的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xi.包含SEQ ID NO：260的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：260的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xii.包含SEQ ID NO：270的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：270的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xiii.包含SEQ ID NO：280的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：280的氨基酸序列具有至少93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xiv.包含SEQ ID NO：290的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：290的氨基酸序列具有至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xv.包含SEQ ID NO：300的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xvi.包含SEQ ID NO：310的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xvii.包含SEQ ID NO：320的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xviii.包含SEQ ID NO：330的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：330的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xix.包含SEQ ID NO：340的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xx.包含SEQ ID NO：350的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xxi.包含SEQ ID NO：360的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：360的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xxii.包含SEQ ID NO：370的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：370的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者
    xxiii.包含SEQ ID NO：380的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和
    輕鏈可變區(VL)，其選自：
    i.包含SEQ ID NO：164的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    ii.包含SEQ ID NO：174的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：174的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    iii.包含SEQ ID NO：184的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：184的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    iv.包含SEQ ID NO：194的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO： 194的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    v.包含SEQ ID NO：204的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：204的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    vi.包含SEQ ID NO：214的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：214的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    vii.包含SEQ ID NO：224的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：224的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    viii.包含SEQ ID NO：234的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：234的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    ix.包含SEQ ID NO：244的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：244的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    x.包含SEQ ID NO：254的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：254的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xi.包含SEQ ID NO：264的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：264的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xii.包含SEQ ID NO：274的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：274的氨基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xiii.包含SEQ ID NO：284的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：284的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xiv.包含SEQ ID NO：294的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xv.包含SEQ ID NO：304的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：304的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xvi.包含SEQ ID NO：314的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：314的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xvii.包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xviii.包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xix.包含SEQ ID NO：344的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    xx.包含SEQ ID NO：354的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
  11. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：
    a.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    b.包含SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：310的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    c.包含SEQ ID NO：320的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：320的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    d.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    e.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：294的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    f.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：324的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    g.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    h.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：340的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    i.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    j.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：350的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：344的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    k.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：300的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者
    l.包含SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：380的氨基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：354的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：354的氨基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
  12. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：
    a.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    b.包含SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    c.包含SEQ ID NO：320的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    d.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    e.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    f.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：324的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    g.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    h.包含SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    i.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    j.包含SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    k.包含SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)；或
    l.包含SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：354的序列的輕鏈可變區(VL)。
  13. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：310的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：294的序列的輕鏈可變區(VL)。
  14. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)。
  15. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：340的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)。
  16. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)。
  17. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：350的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：344的序列的輕鏈可變區(VL)。
  18. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：300的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：334的序列的輕鏈可變區(VL)。
  19. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含含有SEQ ID NO：380的序列的重鏈可變區(VH)和含有SEQ ID NO：354的 序列的輕鏈可變區(VL)。
  20. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其結合錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43。
  21. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與單體和/或寡聚和/或聚集和/或翻譯後修飾和/或截短的TDP-43結合。
  22. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其結合錯折疊的聚集人TDP-43和非聚集生理性人TDP-43。
  23. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其表現出以下特徵中的一種或更多種、直至所有：
    a.抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集，
    b.阻斷TDP-43細胞間傳播，
    c.使TDP-43聚集體解聚，
    d.阻斷TDP-43播種；以及
    e.阻斷TDP-43擴散。
  24. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其減輕體內TDP-43病理狀況。
  25. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其降低體內聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43的水準。
  26. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位氨基酸殘基內的表位結合或與非人TDP-43中的等同表位結合。
  27. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位氨基酸殘基內的表位結合或與非人TDP-43中的等同表位結合。
  28. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是 抗體或其抗原結合片段。
  29. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2，優選Fab。
  30. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，當在體外重組TDP-43從頭聚集測定中測量時，其抑制至少60%的TDP-43聚集(例如，如實施例14中所述)。
  31. 請求項23所述的人源化TDP-43結合分子，當在體外重組TDP-43從頭聚集測定中測量時，其抑制至少90%的TDP-43聚集(例如，如實施例14中所述)。
  32. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其對於可溶性TDP-43結合的解離常數(KD)為小於2nM、優選小於700pM。
  33. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其對於可溶性TDP-51肽結合的解離常數(KD)為小於15nM、優選小於10nM。
  34. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是IgA、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或者其抗原結合片段。
  35. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是IgG1或IgG4抗體或其抗原結合片段。
  36. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含Fc突變，優選S228P突變。
  37. 免疫綴合物，其包含根據前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  38. 免疫綴合物，其包含如請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其中所述免疫綴合物使用遞送載劑或血腦屏障部分穿過血腦屏障。
  39. 請求項37或38所述的免疫綴合物，其中所述遞送載劑包含脂質體或胞外囊泡。
  40. 請求項37或38所述的免疫綴合物，其中所述人源化TDP-43結合分子與血腦屏障部分連接。
  41. 請求項40所述的免疫綴合物，其中所述血腦屏障部分是多肽或小分子，優選肽、受體配體、單結構域抗體(VHH)、scFv或Fab片段。
  42. 請求項38、40或41所述的免疫綴合物，其中所述血腦屏障部分結合血腦屏障受體。
  43. 請求項42所述的免疫綴合物，其中血腦屏障受體包括但不限於運鐵蛋白受體、胰島素受體或低密度脂蛋白受體。
  44. 經標記結合分子，特別是經標記抗體，其包含如請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  45. 藥物組合物，其包含請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物以及可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑。
  46. 請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，或如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物，或請求項45所述的藥物組合物，其用於人用或獸用藥物用途。
  47. 如請求項46中所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其用於預防、減輕、治療與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病。
  48. 請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，或如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物，或請求項45所述的藥物組合物，其用於診斷用途。
  49. 如請求項48中所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其用於診斷與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病。
  50. 請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，或 如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物，或請求項45所述的藥物組合物，其用於研究用途，特別是作為分析工具或參考分子。
  51. 請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，或如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物，或請求項45所述的藥物組合物，其用作監測與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的診斷工具。
  52. 如請求項47、49或51中任一項所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是：額顳癡呆(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌萎縮側索硬化(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病、佩里綜合征、阿爾茨海默病(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合征、家族性英國型癡呆、多聚穀氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳癡呆)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體癡呆(DLB)或帕金森病(PD)。
  53. 如請求項52所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是：額顳癡呆(FTD)、肌萎縮側索硬化(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)或邊緣主導年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
  54. 如請求項53所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是肌萎縮側索硬化(ALS)。
  55. 如請求項53所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是阿爾茨海默病(AD)。
  56. 如請求項53所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是額顳癡呆(FTD)。
  57. 在患有與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的個體中保持或提高認知記憶能力或減緩記憶喪失的方法，其包括向所述個體施用請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物或請求項45所述的藥物組合物。
  58. 降低個體中聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43水準的方法，其包括向所述個體施用請求項1至36所述的人源化TDP-43結合分子或如請求項37至43中任一項所述的免疫綴合物或請求項45所述的藥物組合物。
  59. 請求項57或58所述的方法，其中所述方法包括施用至少一種另外的治療劑。
  60. 請求項59所述的方法，其中所述另外的治療劑靶向α-突觸核蛋白、BACE1、Tau、β-澱粉樣蛋白、TDP-43或神經炎症蛋白。
  61. 核酸分子，其編碼請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  62. 核酸，其包含SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：239、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：259、 SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：278、SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：288、SEQ ID NO：289、SEQ ID NO：298、SEQ ID NO：299、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：309、SEQ ID NO：318、SEQ ID NO：319、SEQ ID NO：328、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：339、SEQ ID NO：348、SEQ ID NO：349、SEQ ID NO：358、SEQ ID NO：359、SEQ ID NO：368、SEQ ID NO：378或SEQ ID NO：398中提供的核苷酸序列。
  63. 核酸分子，其包含以下所示的核苷酸序列：
    a. SEQ ID NO：308中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：299中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    b. SEQ ID NO：318中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：299中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    c. SEQ ID NO：328中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：299中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    d. SEQ ID NO：348中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：299中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    e. SEQ ID NO：358中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：299中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    f. SEQ ID NO：348中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：329中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    g. SEQ ID NO：348中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：339中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    h. SEQ ID NO：348中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：349中提供的輕鏈可變區(VL)或
    i. SEQ ID NO：358中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：339中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    j. SEQ ID NO：358中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：349中提供 的輕鏈可變區(VL)；或
    k. SEQ ID NO：308中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：339中提供的輕鏈可變區(VL)；或
    l. SEQ ID NO：398中提供的重鏈可變區(VH)和SEQ ID NO：359中提供的輕鏈可變區(VL)。
  64. 核酸分子，其包含以下所示的核苷酸序列：
    a.由SEQ ID NO：318編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：299編碼的輕鏈可變區(VL)；或
    b.由SEQ ID NO：348編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：339編碼的輕鏈可變區(VL)；或
    c.由SEQ ID NO：348編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：349編碼的輕鏈可變區(VL)或
    d.由SEQ ID NO：358編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：339編碼的輕鏈可變區(VL)；或
    e.由SEQ ID NO：358編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：349編碼的輕鏈可變區(VL)；或
    f.由SEQ ID NO：308編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：339編碼的輕鏈可變區(VL)；或
    g.由SEQ ID NO：398編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：359編碼的輕鏈可變區(VL)。
  65. 核酸，其編碼如請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其中所述核酸是用於靶向遞送至血腦屏障或CNS中的任何其他細胞類型的病毒載體的一部分。
  66. 如請求項61至64中任一項所述的核酸，其中所述核酸是用於靶向遞送至血腦屏障或CNS中的任何其他細胞類型的病毒載體的一部分。
  67. 如請求項65或66所述的核酸，其中所述病毒載體是重組腺 相關病毒載體(rAAV)，優選是選自AAV1至AAV12的重組腺相關病毒載體。
  68. 重組表達載體，其包含請求項61至67中任一項所述的核酸。
  69. 宿主細胞，其包含請求項61至67中任一項所述的核酸和/或請求項68所述的載體。
  70. 宿主細胞，其表達如請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  71. 無細胞表達系統，其包含請求項68所述的重組表達載體。
  72. 用於產生人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段的方法，其包括以下步驟：
    a.在適合產生所述人源化TDP-43結合分子、特別是所述人源化抗體或其抗原結合片段的條件下培養請求項69或70所述的宿主細胞或請求項71所述的無細胞表達系統；以及
    b.分離所述人源化TDP-43結合分子，特別是所述人源化抗體或其抗原結合片段。
  73. 對從物件獲得的樣品中的TDP-43進行檢測和/或定量的方法，所述方法包括使所述樣品與如請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子接觸，以及將所述樣品中的TDP-43水準與對照樣品中的TDP-43水準進行比較。
  74. 試劑盒，其用於診斷與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，或如請求項46至56中任一項所述應用，或用於請求項57至60中任一項所述的方法，所述試劑盒包含如請求項1至36中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
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