JP7329288B2 - 腫瘍細胞を死滅させるための医薬 - Google Patents

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Description

本発明は、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物、及びタラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを含む、腫瘍細胞を死滅させるための医薬に関する。
日本国内でがんで死亡する人は、年間37万人に上り、昭和56年より継続して死因の第一位である。これまでに、国内外で数多のがんに対する治療方法が開発されてきているが、効薬は未だ生まれていない。
いわゆる低分子の抗癌剤（がん化学療法）が開発されてきているが、必ずしも薬効が強くないばかりか、強い副作用による患者への苦痛が大きく望ましい医薬とはいえない。抗体医薬は、がんへの特異性が強い特徴から、低分子抗癌剤にみられる強い副作用は軽減されるこができ、広く使用されるようになってきているが、未だ固形がんに有効な、抗体医薬は数すくない。薬効を強化するために、ADC（抗体薬物複合体）が開発されてきているが、毒性面も含めて満足にいたってはいない。
また、新規の抗体医薬である免疫治療抗体（チェックポイント阻害剤）は、新規メカニズムで広いガン種に強い薬効をしめしているが、効果のある患者がかならずしも多くなく、かつ場合によっては死に至るような激烈な副作用を示すことがわかってきている。
一方、治療部位を限局化し副作用を軽減するという考えから、PDT（Photo Dynamic Therapy：光線力学療法）が開発されてきている。PDTは、腫瘍部位に集まった光増感色素を活性化させる波長の光を患部に照射し治療する方法で、肺がんなどで一定の効果を示しているが、満足な薬効がえられているとは言えない。
本発明者らは、そのような状況下で、副作用の少なく、薬効の強い医薬品の開発の必要性を感じ、本開発に至った。本発明は、副作用の少ない、腫瘍細胞を死滅するための医薬を提供することを解決すべき課題とする。
PDTは、腫瘍組織に増感色素を集積させ、これに光を照射することにより、腫瘍細胞を破壊する方法である。PDTにもちいられる増感色素としては、タラポルフィンナトリウム（Talaporfin Sodium）、ポルフィマーナトリウム（Porfimer Sodium）またはベルテポルフィン（Verteporfin）等の水溶性の高く、腫瘍集積性の高い増感色素が知られており、いずれも肺がん等の治療に既に使用されている。PDTは、侵襲性が少ない治療方法ではあるが、薬効がかならずしも満足できるものではないという欠点を有する。
PCI(PhotochemicalInternalization,光化学的内在化法)は、エンドゾーム膜に光増感剤を集積させこれに光を照射することによりエンドゾーム膜を破壊する方法である。これにより、エンドゾーム膜内に封入されている抗癌剤やイムノトキシンを細胞質内に放出し腫瘍細胞を破壊すると考えられている。PCIの色素はエンドゾーム膜に集積させる目的から、PDTとは異なりスルフォン化テトラフェニルクロリン (TPCS2a)や、アルミニウムフタロシアニン（AlPcS2a）等の両親媒性の光増感剤が使用されている。
しかしながら、両親媒性であるスルフォン化テトラフェニルクロリン (TPCS2a)や、アルミニウムフタロシアニン（AlPcS2a）には、(1)神経毒性が懸念される、(2)エンドゾーム膜以外の細胞膜に集積し細胞障害性を生じる、(3)腫瘍集積性が低く非特異的な副作用が生じる などの欠点が懸念される。
我々は、これまでの問題を解決するために、鋭意努力した結果、水溶性の高いタラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンが、低濃度でエンドゾーム膜の透過性をあげるという予知できない効果があることを見出した。さらに、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物と、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンとを組み合わせることにより、細胞障害性と腫瘍特異性を著しく強化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物；及び
タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィン；
を含む、腫瘍細胞を死滅させるための医薬。
＜２＞ 腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質が、抗体、抗体断片、リガンド、又はペプチドである＜１＞に記載の医薬。
＜３＞ 細胞毒が サポリン、ゲロニン、または緑膿菌外毒素である、＜１＞又は＜２＞に記載の医薬。
＜４＞ 腫瘍細胞が、細胞表面にEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadherin17(CDH17)、又はRoundabout homolog 1 （Robo1）を発現している細胞である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の医薬。
＜５＞ 腫瘍細胞が、頭頚部がん、肺がん，肝がん、大腸がん、皮膚がん、食道がん、胃がん、子宮けいがん、子宮内膜がん、中皮腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、乳がん、胆管がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん又は悪性リンパ腫、骨肉腫の何れかのがん細胞である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の医薬。
＜６＞ （１）前記結合物を腫瘍細胞と接触させる工程；
（２）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
（３）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
により腫瘍細胞を死滅させる、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の医薬。
＜７＞ （１）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを腫瘍細胞と接触させる工程；
（２）前記結合物を前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
（３）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
により腫瘍細胞を死滅させる、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の医薬。
＜８＞ （１）前記結合物と、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンとを腫瘍細胞と接触させる工程、及び
（２）その後、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
により腫瘍細胞を死滅させる、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の医薬。
＜Ａ＞（１）腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を腫瘍細胞に接触させる工程；
（２）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
（３）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させること工程：
を含む、腫瘍細胞を死滅させる方法。
＜Ｂ＞（１）腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物と、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンとを前記腫瘍細胞と接触させる工程、
（２）その後、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
を含む、腫瘍細胞を死滅させる方法。
本発明によれば、副作用の少ない、腫瘍細胞を死滅させるための医薬を提供することができる。
図１は、Ａ４３１細胞障害性アッセイにおける細胞生存率を示す。 図２は、Ａ５４９細胞障害性アッセイにおける細胞生存率を示す。 図３は、ＭＫＫ７細胞障害アッセイにおける細胞生存率を示す。 図４は、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞障害アッセイにおける細胞生存率を示す。 図５は、Ａ４３１／ＰＥＰ－Ｔ細胞障害アッセイにおける細胞生存率を示す。 図６は、Ａ４３１／Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ細胞障害アッセイにおける細胞生存率を示す。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜本発明の概要＞
本発明者等は、薬効が強く副作用の少ない腫瘍の治療方法を検討した結果、光による局所的に薬効を強くする、PDT,PCIの手法に可能性があると考えた。しかし、PDTには薬効が弱いという欠点、PCIには薬効、毒性ともに満足にいくものではなかった。
そこで、本発明者等は鋭意努力した結果、水溶性の増感色素であるタラポルフィリン、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンが光照射によりエンドソームの透過性を向上させることを初めて見出した。この「色素」と、「腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物」と、「腫瘍への光照射」とを組み合わせることにより、薬効が強くかつ副作用の懸念が少ない治療方法を見出し、本発明を完成するに至った。
つまり、本発明においては、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物が、腫瘍に結合したのちエンドソームに内包される。別途（または同時に）加えたタラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンに光を照射して、エンドソーム内のイムノトキシン（またはその分解物）を細胞質内に放出させ。腫瘍細胞を死滅させることができると考えている。
タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィンは、水溶性であり、両親媒性のスルフォン化テトラフェニルクロリン (TPCS2a)や、アルミニウムフタロシアニン（AlPcS2a）のような膜に局在化する上での副作用の懸念が少ないという利点を有する。さらに、吸収波長がヘモグロビンの吸収波長と重ならない664nm であるため、光の到達する深度も深い。
＜細胞を死滅させる方法に関する形態＞
本発明における、腫瘍細胞を死滅させる方法としては、(1)腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物、(2)およびタラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンの共存在下で、(3)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させる波長の光を照射する形態があげられる。
さらに具体的形態として、(1)腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を投与後、(2)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを投与し、その後 (3)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させる波長の光を照射する ことによっても達成できる。
また別の形態としては、(1)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを投与後 (2)腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を投与し、その後 (3)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させる波長の光を照射する ことによっても達成できる。
また、別の形態として、(1)腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物と(2)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンとを同時に投与し、その後(3)タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させる波長の光を照射する ことによっても達成できる。
＜光増感色素＞
本発明では、タラポルフィリンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを増感剤として使用する。
タラポルフィンナトリウムは、レザフィリン、NPe6,モノアスパラチルクロリン e6とも呼ばれるPDTに使用されている増感色素である。
また、別の形態として、ポルフィマーナトリウム（Porfimer Sodium）を増感色素として使用することもできる。ポルフィマーナトリウムは、フォトフィリンとも呼ばれるPDT色素である。
また、別の形態としてベルテポルフィン（Verteporfin）を増感色素として使用することもできる。ベルテポルフィンはビスダイン（Visudyne）とも呼ばれるPDT色素である。
＜腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質＞
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質としては、抗体、抗体断片、リガント、またはペプチドなどを挙げることができるが、特に限定されない。
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質としては抗体を使用する場合には、腫瘍細胞表面上の標的物質（例えば、Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadhelin17(CDH17)、Cadherin3（CDH3）,Roundabout homolog 1 （Robo1）等のタンパク質）に特異的に結合する抗体を使用することができる。
本発明で用いる抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体 、例えば、キメラ抗体 、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体 は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体 の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体 の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体 のCDRとヒト抗体 のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体 定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（EP 239400号公報 、国際公開WO96/02576号公報など）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体 を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体 遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体 を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体 ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体 を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体 の可変領域を一本鎖抗体 （scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体 の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
腫瘍細胞に結合する抗体とは、好ましくはヒト化またはヒト抗体であるがそれに限定されるものではない。
また、これらの抗体は 腫瘍細胞表面上の抗原遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体の断片とは、ROBO1への結合能力を保持している抗体の部分である。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）などを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体 断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。抗体 の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体 の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させることができる。
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質として、リガントを使用することができる。腫瘍細胞表面上の標的物質が、例えば、Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）などレセプターの場合には、上記レセプターに対するリガンドを使用することができる。
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質として、ペプチドを使用することもできる。腫瘍細胞表面の標的物質に結合するペプチドは、当業者であれば、設計及び製造することが可能である。
＜細胞毒＞
細胞毒は、細胞毒性をもつ蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、ブレオマイシンのような合成・天然の抗癌作用を有する化合物や、ADCで使用される化合物であってもいい。
細胞毒性をもつ蛋白質の好ましい態様としては、サポリン、ゲロニン、緑膿菌外毒素、リシンＡ鎖、脱糖鎖リシンＡ鎖、リボゾーム不活性化タンパク質、アルファサルシン、アスペルギリン、リストリクトシン、リボヌクレアーゼ、エポドフィロトキシン、ジフテリアトキシン、シガトキシン及びその変異体、遺伝子組換体を挙げることができる。
＜腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物＞
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒とは、直接または間接的に結合していなければならない。
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質として抗体またはその断片を使用する場合、これと細胞毒とを直接化学的に結合させる方法は、既知のADC（Antibody Drug Conjugate；抗体薬物複合体）で用いられる結合方法を使用できる。また、細胞毒が蛋白質である場合には、2官能性の架橋剤を用いることも可能である。
また、細胞毒が蛋白質である場合は、トキシンと抗体またはその断片を遺伝子組換え的に融合した蛋白質とすることによりイムノトキシンを作成することも可能である。
また別の方法として、抗体またはその断片と細胞毒とを、第二の結合対を用いて間接的に結合する手法を使用することも可能である。第２の結合対の例としては、アビジン-ビオチン、抗体-ハプテン等の利用が可能である。
また、本発明では抗体と毒素の結合したイムノトキシンの代わりに、腫瘍細胞表面の標的物質に結合するペプチド又はリガンドと、毒素との結合物を使用することも可能である。
＜投与方法及び投与量＞
本発明の医薬を、腫瘍（例えば、がんなど）を有する被験体に投与する際の投与方法は特に限定されない。
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物は、例えば、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、または経口投与により、投与することができる。また、腫瘍組織及びその周辺に局所注射、塗布、噴霧などの方式で投与する方法もある。
タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンは、例えば、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、または経口投与により、投与することができる。また、腫瘍組織及びその周辺に局所注射、塗布、噴霧などの方式で投与するなどの方法もある。
腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合の投与量は、特に限定されないが、例えば、１μｇ／体重ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１０μｇ／体重ｋｇ～１０ｍｇ／体重ｋｇで投与することはできる。
タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンの投与量は、特に限定されないが、例えば、１μｇ／体重ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１０μｇ／体重ｋｇ～１０ｍｇ／体重ｋｇで投与することはできる。
投与回数は特に限定されず、１回以上複数回（１回から２０回、好ましくは１回から１０回）行うことができ、例えば、２～４週間毎に、又は１～２カ月毎に行うことができる。また、光照射回数も特に限定されず、１回以上複数回行う事ができる。
＜対象となる細胞・疾患＞
本発明の医薬の投与の対象となる腫瘍は、Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadhelin17(CDH17)、Cadhelin3（CDH3）,またはRoundabout homolog 1 （Robo1） 等を表面に発現している腫瘍である。
具体的には頭頚部がん、肺がん，肝がん、大腸がん、皮膚がん、食道がん、胃がん、子宮けいがん、子宮内膜がん、中皮腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、乳がん、胆管がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん又は悪性リンパ腫、骨肉腫等のがんをあげることができる。
また、本発明は人間（ヒト）の疾患の治療以外に、犬、猫、馬等のヒト以外の動物類の治療に用いることもできる。
実施例１：
＜材料の入手＞
EGFR発現株として、A431（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）を株式会社ケーエーシー（京都、日本）から入手した。抗EGFR抗体として、CetuximabをSelleck Biotech株式会社（東京、日本）から入手した。光増感剤は、タラポルフィンナトリウム（Talaporfin sodium）をMedchemexpress社 （ニュージャージー）より購入し使用した。650nm にピーク波長を持つLEDランプ（54W）をKing Do Way (18PCS E27, Amazon.co.jp)より購入した。
＜細胞培養＞
A431はダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）の高グルコース含有培地に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下にて培養を行った。
＜イムノトキシン調整＞
PBS(-)に溶解させたCetuximabと超純水に溶解させたEZ-LINK スルホ-NHS-LC-ビオチン化試薬（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州）を1:40のモル比となるように混合、反応させたのち、PD SpinTrap G-25 （GE Healthcare Life Sciences、イングランド）を用いて精製した。得られたビオチン化Cetuximabとstreptavidin-saporin (Biotin-Z Internalization Kit [KIT-27-Z], Advanced Targeting Systems, カリフォルニア）を当量ずつ混ぜ、30分間室温にて反応させることでサポリンを付加したCetuximab（IT-Cetuximab）を得た。
＜細胞障害性アッセイ＞
96ウェルプレートにA431を1ウェル当たり1.0×104 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、イムノトキシンや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximabのみを添加
条件２：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び30 μMのTalaporfin sodiumを添加
条件３：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び30 μMのTalaporfin sodiumを添加後、光照射（650 nm、37.6mJ/cm2）
各条件に沿ってIT-Cetuximab 及びTalaporfin sodiumを添加し、16時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件３の細胞群には、さらに４時間後、650 nmの光を 37.6mJ/cm2となるように光照射を行った。
72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 (Cell Counting Kit-8, 同仁化学研究所, 日本)を、各ウェルに10μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450nmの吸収を測定した。得られた結果を用いて以下の計算式の通りに細胞生存率を算出した（図１）。
細胞生存率（％）＝(a-c)/(b-c)×100
ここで、a は各検体の吸光度, b はIT非添加の陰性対照検体の吸光度, そして c は培地のみの吸光度を表す。
EC50値は、オープンソース解析ソフトであるImageJを用いて、シグモイド曲線にフィッティングし、50％生存率を示すIT-Cetuximab濃度を求めた（表１）。
＜結果＞
A431細胞株に対し、IT-Cetuximabは濃度依存的な細胞障害活性を認め、その50%効果濃度（EC50）は0.36 nMであった。また、条件2のIT-Cetuximabとレザフィリンを同時に添加した群では、IT-Cetuximabに対する濃度依存的な活性があるものの、そのEC50は0.23 nMと条件１の結果とほぼ変わらず、レザフィリン添加による影響は見られなかった。一方でIT-Cetuximabとレザフィリンを添加しさらに光照射を行った条件３では、細胞障害活性が顕著に増大し、そのEC50は1.5 pMであった。
実施例２：
＜材料の入手＞
EGFR発現株として、A549（ヒト肺癌細胞）を株式会社ケーエーシー（京都、日本）から入手した。抗EGFR抗体のCetuximab、光増感剤のTalaporfin sodium、650nm にピーク波長を持つLEDランプは実施例１で使用したものと同じものを使用した。
＜細胞培養＞
A549はダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）の高グルコース含有培地に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下にて培養を行った。
＜イムノトキシン調整＞
サポリンを付加したCetuximab（IT-Cetuximab）は、実施例１で作成したものと同じものを使用した。
＜細胞障害性アッセイ＞
96ウェルプレートにA549を1ウェル当たり2.5×103 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、イムノトキシンや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximabのみを添加
条件２：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び30 μMのTalaporfin sodiumを添加
条件３：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び30 μMのTalaporfin sodiumを添加後、光照射（650 nm、37.6mJ/cm2）
各条件に沿ってIT-Cetuximab 及びTalaporfin sodiumを添加し、16時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件３の細胞群には、さらに４時間後、650 nmの光を 37.6mJ/cm2となるように光照射を行った。
72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 を、各ウェルに10μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450nmの吸収を測定した。実施例１と同様に得られた吸光度より、細胞生存率（図２）及び、50％生存率を示すIT-Cetuximab濃度を算出した（表２）。
＜結果＞
A549細胞株に対し、IT-Cetuximabは濃度依存的な細胞障害活性を認め、その50%効果濃度（EC50）は0.70 nMであった。また、条件2のIT-Cetuximabとレザフィリンを同時に添加した群では、IT-Cetuximabに対する濃度依存的な活性があるものの、そのEC50は1.4 nMと条件１の結果とほぼ変わらず、レザフィリン添加による影響は見られなかった。一方でIT-Cetuximabとレザフィリンを添加しさらに光照射を行った条件３では、細胞障害活性が顕著に増大し、そのEC50は6.9 pMであった。
実施例３：HER2発現株（MKN7、MDA-MB-453）、Talaporfin sodium、IT-Trastuzumabを用いた細胞障害アッセイ
＜細胞培養＞
HER2発現株として、MKN7（ヒト胃癌由来細胞）及びMDA-MB-453（ヒト乳癌細胞）を用いて実験を行った。MKN7はRPMI1640培地に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下にて培養を行った。またMDA-MB-453はL-15培地に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度0%の条件下にて培養を行った。
＜イムノトキシン調整＞
抗HER2抗体としてTrastuzumab（Selleck Biotech株式会社）を用い、実施例１のイムノトキシン調整方法と同様の手法を用いてサポリンを付加したTrastuzumab（IT-Trastuzumab）を得た。
＜細胞障害性アッセイ＞
96ウェルプレートにMKN7及びMDA-MB-453を1ウェル当たり1×104 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、イムノトキシンや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Trastuzumabのみを添加
条件２：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Trastuzumab及び20 μMのTalaporfin sodiumを添加
条件３：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Trastuzumab及び20 μMのTalaporfin sodiumを添加後、光照射（650 nm、37.6J/cm2）
各条件に沿ってIT-Trastuzumab 及びTalaporfin sodiumを添加し、16時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件３の細胞群には、さらに４時間後、650 nmの光を 37.6J/cm2となるように光照射を行った。
72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 を、各ウェルに10 μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450nmの吸収を測定した。実施例１と同様に得られた吸光度より、細胞生存率（図３及び図４）及び、50％生存率を示すIT-Trastuzumab濃度を算出した。
＜結果＞
MKN7細胞株に対し、IT-Trastuzumabのみを添加した群は今回添加した濃度範囲（20 nM以下）ではほぼ細胞障害活性が見られなかった。また、条件2のIT-Trastuzumab及び条件とレザフィリンを同時に添加した群でも同様に細胞障害活性は見られず、レザフィリン添加による影響は見られなかった。一方でIT-Trastuzumabとレザフィリンを添加しさらに光照射を行った条件３では、濃度依存的に細胞障害活性が見られ、そのEC50は1.01 nMであった。MDA-MB-453細胞株に対して同様に条件３でのみ濃度依存的な細胞障害活性が見られ、そのEC50は0.12 nMであった。
実施例４：EGFR発現株（A431）、Talaporfin sodium、ペプチドトキシン(PEP-T)を用いた細胞障害アッセイ
＜細胞培養＞
EGFR発現株としてA431を用いて実験を行った。A431の培養は実施例１と同様にダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）の高グルコース含有培地に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下にて培養を行った。
＜ペプチド-トキシンの調整＞
EGFRに結合する物質としてペプチド分子が知られている。例えば2005年にファージディスプレイペプチドライブラリーから同定されたペプチドGE11（配列：YHWYGYTPQNVI）[Li, Z.et al. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB J. 2005, 19, 1978-1985.] や、コンピューターデザインによって発見された6-merペプチドD4（配列：LARLLT）など[Song, S.et al. Novel peptide ligand directs liposomes toward EGF-R high-expressing cancer cells in vitro and in vivo. FASEB J. 2009, 23, 1396-1404.] である。本発明ではGE11の類縁体でありEGFRへの結合が認められているペプチド（配列：YHWYGYTPENVI）を用いた。
このペプチドのC末端にビオチン修飾したものをコスモバイオ株式会社より購入し、実験に用いた。購入したビオチンペプチドとstreptavidin-saporinを当量ずつ混ぜ、30分間室温にて反応させることでサポリンを付加したペプチド（PET-T）を得た。
＜細胞障害性アッセイ＞
96ウェルプレートにA431を1ウェル当たり1×104 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、PEP-Tや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.032 - 20 nM の 濃度のPEP-Tのみを添加
条件２：0.032 - 20 nM の 濃度のPEP-T及び20 μMのTalaporfin sodiumを添加
条件３：0.032 - 20 nM の 濃度のPEP-T及び20 μMのTalaporfin sodiumを添加後、光照射（650 nm、37.6J/cm2）
各条件に沿ってPEP-T 及びTalaporfin sodiumを添加し、16時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件３の細胞群には、さらに４時間後、650 nmの光を 37.6J/cm2となるように光照射を行った。
72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 を、各ウェルに10μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450nmの吸収を測定した。実施例１と同様に得られた吸光度より、細胞生存率（図５）及び、50％生存率を示すPEP-T濃度を算出した。
＜結果＞
A431細胞株に対し、PEP-Tのみを添加した群は今回添加した濃度範囲（20 nM以下）ではほぼ細胞障害活性が見られなかった。また、条件2のPEP-T及び条件とレザフィリンを同時に添加した群でも同様に細胞障害活性は見られず、レザフィリン添加による影響は見られなかった。一方でPEP-Tとレザフィリンを添加しさらに光照射を行った条件３では、濃度依存的に細胞障害活性が見られ、そのEC50は0.70 nMであった。
実施例６：EGFR発現株（A431）、Verteporfin、IT-Cetuximabを用いた細胞障害アッセイ
＜材料の入手＞
光増感剤のVerteporfinはCayman Chemical社（米国）から入手した。
EGFR発現株であるA431、抗EGFR抗体のCetuximab、650nm にピーク波長を持つLEDランプは実施例１で使用したものと同じものを使用した。
＜細胞培養＞
A431はダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）の高グルコース含有培地に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下にて培養を行った。
＜イムノトキシン調整＞
サポリンを付加したCetuximab（IT-Cetuximab）は、実施例１で作成したものと同じものを使用した。
＜細胞障害性アッセイ＞
96ウェルプレートにA431を1ウェル当たり1×104 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、イムノトキシンや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximabのみを添加
条件２：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び0.7 μMのVerteporfinを添加
条件３：0.006 - 4 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び0.7 μMのVerteporfinを添加後、光照射（650 nm、2.82J/cm2）
各条件に沿ってIT-Cetuximabを添加、その20時間後にVerteporfinを添加した。さらに2時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件３の細胞群には、650 nmの光を 2.82J/cm2となるように光照射を行った。
72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 を、各ウェルに10μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450nmの吸収を測定した。実施例１と同様に得られた吸光度より、細胞生存率（図６）及び、50％生存率を示すIT-Cetuximab濃度を算出した。
＜結果＞
A431細胞株に対し、IT-Cetuximabは濃度依存的な細胞障害活性を認めた。また、条件2のIT-CetuximabとVerteporfinを同時に添加した群では、IT-Cetuximabに対する濃度依存的な障害活性が見られ、そのEC50は0.3 nMであった。IT-Cetuximab単体を加えたものと比較してVerteporfin添加によって細胞障害活性が増加する傾向が見られた。さらにIT-CetuximabとVerteporfinを添加しさらに光照射を行った条件３では、細胞障害活性がより増大し、そのEC50は0.05 nMであった。

Claims (13)

  1. 腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物；及び
    タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィン；
    を含み、
    タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で腫瘍細胞を照射することと組み合わせて使用する、
    腫瘍細胞を死滅させるための医薬。
  2. 腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質が、抗体、抗体断片、リガンド、又はペプチドである請求項１に記載の医薬。
  3. 細胞毒が サポリン、ゲロニン、または緑膿菌外毒素である、請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 腫瘍細胞が、細胞表面にEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadherin17(CDH17)、又はRoundabout homolog 1 （Robo1）を発現している細胞である、請求項１から３の何れか一項に記載の医薬。
  5. 腫瘍細胞が、頭頚部がん、肺がん，肝がん、大腸がん、皮膚がん、食道がん、胃がん、子宮けいがん、子宮内膜がん、中皮腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、乳がん、胆管がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん又は悪性リンパ腫、骨肉腫の何れかのがん細胞である、請求項１から４の何れか一項に記載の医薬。
  6. （１）前記結合物を腫瘍細胞と接触させる工程；
    （２）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
    （３）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
    により腫瘍細胞を死滅させる、請求項１から５の何れか一項に記載の医薬。
  7. （１）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを腫瘍細胞と接触させる工程；
    （２）前記結合物を前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
    （３）タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
    により腫瘍細胞を死滅させる、請求項１から５の何れか一項に記載の医薬。
  8. （１）前記結合物と、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンとを腫瘍細胞と接触させる工程、及び
    （２）その後、タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
    により腫瘍細胞を死滅させる、請求項１から５の何れか一項に記載の医薬。
  9. タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウムまたはベルテポルフィンを活性化させるのに有効な波長が650 nmである、請求項６～８の何れか一項に記載の医薬。
  10. 腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質が抗EGFR抗体であり、細胞毒がサポリンであり、タラポルフィンナトリウムを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の医薬。
  11. 抗EGFR抗体がCetuximabである、請求項１０に記載の医薬。
  12. 腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質が抗HER2抗体であり、細胞毒がサポリンであり、タラポルフィンナトリウムを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の医薬。
  13. 抗HER2抗体がTrastuzumabである、請求項１２に記載の医薬。
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