CN111480076A - 抗肾上腺髓质素（adm）结合剂治疗下的疗法监测 - Google Patents

抗肾上腺髓质素（adm）结合剂治疗下的疗法监测 Download PDF

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Abstract

本发明的主题是一种用于监测受试者的疗法的方法，其中所述受试者正在用选自抗体、抗体片段和/或非Ig骨架的抗肾上腺髓质素(ADM)结合剂进行治疗，所述方法包含测定从所述受试者获得的体液中选自以下的肾上腺髓质素原前体片段的水平：中间区域肾上腺髓质素原(MR‑proADM)、C端肾上腺髓质素原(CT‑proADM)和/或肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)或其片段；和将所述肾上腺髓质素原前体片段的水平与所述受试者的临床/医学健康状态和/或不良结果的风险和/或改变治疗措施的要求相关联。

Description

抗肾上腺髓质素(ADM)结合剂治疗下的疗法监测
技术领域
本发明的主题是一种用于监测受试者的疗法的方法，其中所述受试者正在用选自抗体、抗体片段和/或非Ig骨架的抗肾上腺髓质素(ADM)结合剂进行治疗，所述方法包含测定从所述受试者获得的体液中选自以下的肾上腺髓质素原前体片段的水平：中间区域肾上腺髓质素原(MR-proADM)、C端肾上腺髓质素原(CT-proADM)和/或肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)或其片段；和将所述肾上腺髓质素原前体片段的水平与所述受试者的临床/医学健康状态和/或不良结果的风险和/或改变治疗措施的要求相关联。
发明内容
ADM是一种已知调节血管舒张和血管完整性的循环肽。对于几种威胁生命的病症，包括心血管疾病和脓毒性休克，已经描述了血浆ADM浓度的增加。WO2013072509描述了一种用于检测和定量生物活性ADM(bio-ADM)的方法。其中，产生了针对bio-ADM的酰胺化C端和中间部分的单克隆抗体，并将其用于定量血浆中生物活性ADM的免疫测定。
此外，已经发现，施用与ADM结合的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架可以显著降低患有严重急性疾病或急性病症的患者的死亡风险。
在最近的研究中，可以证明在动物实验中脓毒症的诱发导致血浆bio-ADM的增加。令人惊讶的是，在施用抗肾上腺髓质素(ADM)抗体后，表观血浆ADM浓度比媒剂动物中的浓度显著更快升高并且升高至更高水平。考虑到抗ADM抗体相对于内源性bio-ADM的摩尔过量极大，必须假定，在施用抗ADM抗体后测得的血浆ADM浓度实际上主要代表与抗ADM抗体复合的bio-ADM。然而，与媒剂动物相比，在施用抗ADM抗体后观察到的血浆bio-ADM的不成比例的增加与较差的结果无关。
实际上，令人惊讶地发现，在用抗ADM抗体治疗的情况下，bio-ADM的测量不适合监测受试者不良结果的风险。相反，所述抗ADM抗体不结合的源自于ADM前体肽的片段的测量适合于在这样的条件下监测ADM系统的刺激或下调，因为它不会立即受到抗ADM抗体施用的影响，并且随时间推移与正在接受所述抗ADM抗体治疗的患者的临床结果相关。
背景技术
肽肾上腺髓质素(ADM)于1993年首次被描述(Kitamura,K.等人1993.“肾上腺髓质 素：一种从人嗜铬细胞瘤分离的新型降压肽(Adrenomedullin:A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma)”,Biochemical and Biophysical Research Communications,第192(2)卷,第553-560页)为包含52个氨基酸的新型降压肽；其分离自人嗜铬细胞瘤；SEQ ID No.:1。同年，还描述了编码包含185个氨基酸的前体肽的cDNA以及该前体肽的完整氨基酸序列。该前体肽特别是在N端包含21个氨基酸的信号序列，被称为“肾上腺髓质素原前体”(pre-proADM)。在本说明书中，指定的所有氨基酸位置通常涉及pre-proADM，其包含185个氨基酸并具有根据SEQ ID No:2所述的序列。
成熟的肾上腺髓质素肽是酰胺化肽(ADM-NH2)，其包含52个氨基酸(SEQ ID No:1)并且包含pre-proADM的第95至146位氨基酸，通过蛋白水解切割从pre-proADM形成。成熟ADM、bio-ADM和ADM-NH2在本申请全文中同义地使用，并且是根据SEQ ID No.:1所述的分子。
迄今为止，基本上只对在pre-proADM切割中形成的肽片段的几个片段进行了更精确的研究，特别是生理活性肽肾上腺髓质素(ADM)和“PAMP”，一种包含20个氨基酸(22-41)的肽，其跟随在pre-proADM中信号肽的21个氨基酸之后。1993年ADM的发现和表征引发了深入的研究活动，所述研究活动的结果被总结在各种综述文章中，在本说明书的情形下特别参考专门针对ADM的“Peptides”一期中找到的文章(Editorial,Takahashi, K.2001.Peptides,第22卷:1691和Eto,T.2001.Peptides第22卷:1693-1711)。另一篇综述是(Hinson等人2000.Endocrine Reviews第21(2)卷:138-167)。
此外还发现，在许多病理状态下，可以在循环和其他生物液体中测量的ADM浓度显著高于在健康对照者中发现的浓度。因此，在患有充血性心力衰竭、心肌梗塞、肾病、高血压病症、糖尿病、休克急性期以及脓毒症和脓毒性休克的患者中，ADM水平显著提高，尽管提高的程度不同。在某些所述病理状态下，PAMP浓度也增加，但血浆水平相对于ADM较低(Eto T.2001.Peptides,第22卷:1693-1711)。
此外，已知在脓毒症或脓毒性休克中会观察到异常高浓度的ADM(Eto等人 2001.Peptides 22:1693-1711；Hirata等人1996.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4):1449-1453；Ehlenz等人1997.Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:156-162；Tomoda等人2001.Peptides22:1783-1794；Ueda等人 1999Am.J.Respir.Crit.Care Med.160:132-136；Wang等人2001.Peptides22:1835-1840)。这些发现与典型的血液动力学变化有关，所述典型的血液动力学变化已知是患有脓毒症和其他严重综合征例如SIRS的患者的病程的典型现象。肾上腺髓质素在脓毒症发生过程(Wang,Shock 1998,10(5):383-384；Wang等人1998.Archives of surgery 133(12):1298- 1304)以及许多急慢性疾病(Parlapiano等人1999.European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61；Hinson等人2000 Endocrine Reviews 21(2):138- 167)中起关键作用。
在迄今为止的科学研究中，尤其发现ADM可被认为是一种多功能调节肽。它部分以甘氨酸延长的非活性形式释放到循环中(Kitamura等人1998.Biochem.Biophys.Res.Comm un.244(2):551-555)。还有一种结合蛋白(Pio等人2001.The Journal of Biological Chemistry 276(15):12292-12300)，它对ADM具有特异性，并可能同样调节ADM的作用。
此外，已经发现，从pre-proADM形成的上述其他生理活性肽PAMP即使看起来具有不同于ADM的作用机理，也同样显示出降压作用(Eto等人2001.Peptides 22:1693-1711； Hinson等人2000Endocrine Reviews 21(2):138-167；Kuwasako等人1997.FEBS Lett 414 (1):105-110；Kuwasaki等人1999.Ann.Clin.Biochem.36:622-628；Tsuruda等人2001.Life Sci. 69(2): 239-245；Kangawa等人EP 0 622 458)。
描述了几种测量ADM循环水平的方法：直接或通过测定其同源前体肽的更稳定片段而间接地测量ADM循环水平。最近公布了一种方法，描述了一种测量循环成熟ADM的测定法(Marino等人2014.Crit Care 18:R34)。
已经描述了定量源自于ADM前体的片段的其他方法，例如测量MR-proADM(Morgenthaler等人2005.Clin Chem 51(10):1823-9)、PAMP(Washimine等人1994.Biochem Biophys Res Commun 202(2):1081-7)和CT-proADM(EP 2 111 552)。可以使用商业均相时间分辨荧光免疫测定法，用于在全自动系统上测量血浆中的MR-proADM(BRAHMS MR-proADMKRYPTOR；BRAHMS GmbH,Hennigsdorf,Germany)(Caruhel等人2009.Clin Biochem 42(7- 8):725-8)。由于这些肽是从同一前体以化学计量比生成的，因此它们的血浆水平在一定程度上相关。
心力衰竭患者中血浆ADM浓度升高且与疾病严重程度相关(Hirayama等人1999.J Endocrinol 160:297-303；Yu等人2001.Heart 86:155-160)。在这些受试者中，高血浆ADM是一种独立的阴性预后指标(Poyner等人2002.Pharmacol Rev 54:233-246)。
多项研究探讨了MR-proADM在心力衰竭中的作用。在BACH研究(Maisel等人 2010.J.Am.Coll.Cardiol.55:2062-2076)中，MR-proADM对90天的死亡有很强的预后，增加了利钠肽以外的预后价值。来自PRIDE研究(Shah等人2012.Eur.Heart J.33:2197-2205)的后续数据巩固了MR-proADM的潜在预后作用；在患者中，MR-proADM具有最佳的1年死亡率曲线下面积(AUC)。同样，慢性心力衰竭(CHF)患者中MR-proADM水平与疾病严重程度强烈相关，而肽水平升高与随访12个月时死亡风险增加强烈相关(van Haehling等人 2010.European Journal of Heart Failure 12:484-491；Adlbrecht等人2009.European Journal of Heart Failure 11:361-366)。
在急性失代偿性心力衰竭患者的治疗过程中对MR-proADM进行了研究(Boyer等人 2012.Congest Heart Fail 18(2):91-97)：急性治疗期间MR-proADM水平趋于升高的患者具有与持久充血相关的结果。在治疗后的12-24小时时间段内，MR-proADM升高的患者具有增加的外周水肿。Kaiser等人在单室心患者中测量MR-proADM(Kaiser等人2014.Europ J Heart Failure 16:1082-1088)。与没有Fontan衰竭的患者相比，Fontan循环衰竭的患者(表现出腹水和外周水肿)中的水平显著更高。此外，Eisenhut推测导致肾上腺髓质素水平降低的治疗是否可以降低肺炎和败血病中肺泡水肿的严重程度和范围(Eisenhut 2006.Crit Care 10:418)。
在一些研究中，研究了MR-proADM在脓毒症诊断和预后中的作用。MR-proADM被描述为区分脓毒症患者和患有SIRS的非脓毒症患者的生物标志物(Christ-Crain等人 2005.Crit Care 9:R816-824；Angeletti等人2013.Clin Chem Lab Med 51:1059-1067)。此外，一些研究报道了，MR-proADM可作为脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克的预后生物标志物(Christ-Crain等人2005.Crit Care 9:R816-824；Suberviola等人2012.Swiss Med Wkly 142:w13542；Guiginant等人2009.Intensive Care Med 35:1859-1867；DE LA Torre-Prados等人2016.Minerva Anestesiol 82:760-766；Andaluz-Ojeda等人2015.J Infect 71:136-139)。
WO-A1 2004/097423描述了针对肾上腺髓质素的抗体在心血管病症的诊断、预后和治疗中的用途。在本领域中还描述了通过阻断ADM受体来治疗疾病(例如WO-A1 2006/027147、PCT/EP2005/012844)，所述疾病可以是脓毒症、脓毒性休克、心血管疾病、感染、皮肤病、内分泌疾病、代谢性疾病、胃肠病、癌症、炎症、血液病、呼吸系统疾病、肌肉骨骼疾病、神经系统疾病、泌尿科疾病。
已经发现，施用与ADM结合的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架可以显著降低患有严重急性疾病或急性病症的患者的死亡风险(WO2013/072510、WO2013072511、 WO2013072512、WO2013072513、WO2013072514)。
具体实施方式
本申请的主题是一种用于监测受试者的疗法的方法，其中所述受试者正在用选自与SEQ ID NO.1(氨基酸1-52)结合的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体、抗体片段和/或非Ig骨架的结合剂进行治疗，所述方法包含：
·测定从所述受试者获得的体液中选自以下的肾上腺髓质素原前体片段的水平：中间区域肾上腺髓质素原(MR-proADM)、C端肾上腺髓质素原(CT-proADM)和/或肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)或其片段；和
·将选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平与所述受试者的临床/医学健康状态和/或不良结果的风险和/或改变治疗措施的要求相关联，并且
·其中为了测定所述片段的水平，至少一种结合剂与分别选自SEQ ID NO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5的氨基酸序列内的区域结合。
如本文所用，术语“受试者”是指活的人类或非人类生物体，优选地，本文的受试者是人类受试者，其中所述受试者患有疾病或病症，例如慢性或急性疾病或急性病症。这样的疾病可以选自：严重感染例如脑膜炎、全身性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症；其他疾病例如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病例如心力衰竭、心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化；休克例如脓毒性休克和器官功能障碍例如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、创伤。
如本文所用，术语“PAMP”包含PAMP的两种循环形式，即无生物学活性的C端甘氨酸延伸的PAMP(PAMP-Gly)和具有生物学活性的C端酰胺化PAMP(PAMP-酰胺)。
在整个说明书中，本发明的“抗ADM抗体”或“抗ADM抗体片段”或“抗ADM非Ig骨架”能够结合ADM，因此针对ADM，因此可以被称为“抗ADM抗体”、“抗ADM抗体片段”或“抗ADM非Ig骨架”。
根据本发明，与ADM结合的抗ADM抗体或抗ADM抗体片段或与ADM结合的抗ADM非Ig骨架的施用优选是全身性施用。
在本申请的另一个实施方式中，可以在体液中测定的肾上腺髓质素原前体片段选自：
SEQ ID No.3(肾上腺髓质素原N端20肽，PAMP)：preproADM的第22-41位氨基酸
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID No.4(中间区域肾上腺髓质素原，MR-proADM)：preproADM的第45-92位氨基酸
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID No.5(C端肾上腺髓质素原，CT-proADM)：preproADM的第148-185位氨基酸
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
在本申请的另一个实施方式中，具有至少5个氨基酸的所述肾上腺髓质素原前体片段选自：MR-proADM(SEQ ID No.4)、CT-proADM(SEQ ID No.5)和/或PAMP(SEQ ID No.3)。
在本申请的一个实施方式中，pre-proADM的片段和/或其片段的水平通过使用至少一种结合剂来测定，其中所述结合剂与包含在MR-proADM序列(SEQ ID No.4)内的区域结合。
在本申请的另一个实施方式中，pre-proADM的片段和/或其片段的水平通过使用至少一种结合剂来测定，其中所述结合剂与包含在CT-proADM序列(SEQ ID No.5)内的区域结合。
在本申请的另一个实施方式中，pre-proADM的片段和/或其片段的水平通过使用至少一种结合剂来测定，其中所述结合剂与包含在PAMP序列(SEQ ID No.3)内的区域结合。
在本申请的特定实施方式中的主题是方法，其中所述片段可以选自根据SEQ IDNo.:4所述的MR-proADM和/或根据SEQ ID No.:5所述的CT-proADM和/或根据SEQ ID No.:3所述的PAMP。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中与肾上腺髓质素的N端部分aa 1-21结合的用于治疗受试者的抗ADM抗体是与ADM结合的人类CDR移植抗体或其抗体片段，其中所述人类CDR移植抗体或其抗体片段包含包括以下的抗体重链(H链)：
SEQ ID NO.6：
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7：
ILPGSGST
和/或
SEQ ID NO.8：
TEGYEYDGFDY
和/或进一步包含包括以下的抗体轻链(L链)：
SEQ ID NO.9：
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.28：(由于3个氨基酸的长度，未在序列表中提及)
RVS
和/或
SEQ ID NO.10：
FQGSHIPYT。
在本申请的另一个具体实施方式中，用于治疗受试者的抗ADM抗体是与ADM结合的人单克隆抗体或其抗体片段，其中重链包含至少一个选自以下的CDR：
SEQ ID NO.6：
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7：
ILPGSGST
SEQ ID NO.8：
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含至少一个选自以下的CDR：
SEQ ID No.9：
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.28：
RVS
SEQ ID NO.10：
FQGSHIPYT。
在本申请的另一个实施方式中，用于治疗受试者的抗ADM抗体是与ADM结合的人单克隆抗体或其抗体片段，其中重链包含序列
SEQ ID NO.6：
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7：
ILPGSGST
SEQ ID NO.8：
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含序列
SEQ ID NO.9：
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.28：
RVS
SEQ ID NO.10：
FQGSHIPYT。
本申请的另一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中所述用于治疗的抗体或片段是与ADM结合的人单克隆抗体或片段或其抗体片段，其中重链包含序列
CDR1：SEQ ID NO.6：
GYTFSRYW
CDR2：SEQ ID NO.7：
ILPGSGST
CDR3：SEQ ID NO.8：
TEGYEYDGFDY
并且其中轻链包含序列
CDR1：SEQ ID NO.9：
QSIVYSNGNTY
CDR2：SEQ ID NO.28：
RVS
CDR3：SEQ ID NO.10：
FQGSHIPYT。
本申请的另一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中所述用于治疗的抗体或片段包含以下序列作为VH区：
SEQ ID NO.11(AM-VH-C)：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.12(AM-VH1)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.13(AM-VH2-E40)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.14(AM-VH3-T26-E55)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK；或
SEQ ID NO.15(AM-VH4-T26-E40-E55)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK；
并且包含以下序列作为VL区：
SEQ ID NO.16(AM-VL-C)：
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.17(AM-VL1)：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.18(AM-VL2-E40)：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
本申请的另一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中所述用于治疗的抗体或片段包含以下序列作为重链：
SEQ ID No.26：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
并且包含以下序列作为轻链：
SEQ ID NO:27
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
应当理解，选自MR-proADM(SEQ ID No.4)、CT-proADM(SEQ ID No.5)和/或PAMP(SEQ ID No.3)的肾上腺髓质素原前体片段的水平也涵盖其片段，其中缺失至少一个氨基酸，并且所述片段具有至少5个氨基酸，更优选至少10个氨基酸，最优选至少15个氨基酸的长度。
本申请的一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中肾上腺髓质素原前体片段(至少5个氨基酸)的水平通过使用与所述片段(至少5个氨基酸)结合的结合剂来测定。
本申请的另一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中结合剂选自：与肾上腺髓质素原前体片段或其片段(至少5个氨基酸)结合的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
本申请的体液是血液样品。血液样品可以选自：全血、血清和血浆。在本申请的一个实施方式中，所述样品选自：人柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA血浆。
本发明的抗体是一种蛋白质，其包括一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的、特异性结合抗原的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ(IgD)、ε(IgE)和μ(IgM)恒定区基因，以及无数种免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链的长度通常为约25Kd或214个氨基酸。全长免疫球蛋白重链的长度通常为约50Kd或446个氨基酸。轻链由位于NH2-端的可变区基因(长度约110个氨基酸)和位于COOH-端的κ或λ恒定区基因编码。重链类似地由可变区基因(长度约116个氨基酸)和其他恒定区基因之一编码。
抗体的基本结构单元通常是四聚体，其由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链。在每对中，轻链和重链可变区与抗原结合，恒定区介导效应子功能。免疫球蛋白还以多种其他形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')2，以及双功能杂交抗体和单链(例如Lanzavecchia等人1987.Eur.J.Immunol.17:105；Huston等人 1988.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883；Bird等人1988.Science 242:423-426； Hood等人1984 Immunology,Benjamin,N.Y.,第2版；Hunkapiller和Hood 1986.Nature323: 15-16)。免疫球蛋白轻链或重链可变区包括由三个高变区(也称为互补决定区(CDR))间隔开的框架区(参见具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),E.Kabat等人,美国卫生与公共服务部(U.S.Department ofHealth and Human Services),1983)。如上所述，CDR主要负责结合抗原的表位。免疫复合物是与抗原特异性结合的抗体例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体或功能性抗体片段。
嵌合抗体是通常通过遗传工程从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建了轻链和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可以与人类恒定区段例如κ和γ1或γ3连接。在一个实例中，治疗性嵌合抗体因此是由来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人类抗体的恒定或效应结构域组成的杂交蛋白，但可以使用其他哺乳动物物种，或者可变区可以通过分子技术产生。制备嵌合抗体的方法是本领域众所周知的，例如参见美国专利号5,807,715。“人源化”免疫球蛋白是包括人类框架区和来自非人类(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人类免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人类免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方式中，所有CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但如果存在，那么它们必须与人类免疫球蛋白恒定区基本相同，即具有至少约85-90％例如约95％或更高的同一性。因此，除可能的CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以被来自供体框架的氨基酸进行有限数量的取代。人源化抗体或其他单克隆抗体可以具有其他保守氨基酸取代，这些取代对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。示例性的保守取代是例如gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。可以通过遗传工程构建人源化免疫球蛋白(例如参见美国专利号5,585,089)。人类抗体是其中轻链和重链基因是人源的抗体。人类抗体可以使用本领域已知的方法产生。人类抗体可以通过使分泌目的抗体的人类B细胞永生化来产生。永生化可以例如通过EBV感染或通过将人类B细胞与骨髓瘤或杂交瘤细胞融合以产生三瘤细胞来实现。人类抗体也可以通过噬菌体展示方法产生(参见例如Dower等人,PCT公开号WO91/17271；McCafferty等人,PCT公开号WO92/001047；和Winter,PCT公开号WO92/20791)，或选自人类组合单克隆抗体库(参见Morphosys网站)。人类抗体也可以通过使用携带人类免疫球蛋白基因的转基因动物来制备(例如参见Lonberg等人,PCT公开号WO93/12227；和Kucherlapati,PCT公开号WO91/10741)。
因此，抗体可以具有本领域已知的形式。实例是人类抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在一个优选实施方式中，本发明的抗体是重组产生的抗体，例如IgG，典型的全长免疫球蛋白，或至少含有重链和/或轻链的F可变结构域的抗体片段，例如化学偶联的抗体(片段抗原结合)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体，例如Fab-V5Sx2；用CH3结构域二聚化的二价Fab(微抗体)；二价Fab或多价Fab，例如借助于异源结构域通过多聚化形成，例如通过dHLX结构域的二聚化，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab’)2片段、scFv片段、多聚化多价或/和多特异性scFv片段、双价和/或双特异性双抗体、
Figure BDA0002455486530000171
(双特异性T细胞衔接子)、三功能抗体、多价抗体，例如来自于与G不同的类别；单结构域抗体，例如来源于骆驼科或鱼类免疫球蛋白等的纳米抗体。
除抗体外，其他生物聚合物骨架在本领域中是众所周知的，其可与靶分子复合，并已用于产生高度靶特异性生物聚合物。实例是适体、镜像适体(spiegelmer)、模拟抗体(anticalin)和芋螺毒素(conotoxin)。
在一个优选实施方式中，抗体形式选自：Fv片段、scFv片段、Fab片段、scFab片段、(Fab)2片段和scFv-Fc融合蛋白。在另一个优选实施方式中，抗体形式选自：scFab片段、Fab片段、scFv片段和其生物利用度优化的结合物，例如PEG化的片段。最优选的形式之一是scFab形式。
非Ig骨架可以是蛋白骨架，并且可以用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。非Ig骨架可以选自：基于四连接素的非Ig骨架(例如在US 2010/0028995中描述)，纤连蛋白骨架(例如在EP 1266025中描述)；基于脂钙蛋白的骨架(例如在WO 2011/154420中描述)；遍在蛋白骨架(例如在WO 2011/073214中描述)，转移骨架(例如在US 2004/0023334中描述)，蛋白A骨架(例如在EP 2231860中描述)，基于锚蛋白重复序列的骨架(例如在WO2010/060748中描述)，微蛋白(优选形成胱氨酸结的微蛋白)骨架(例如在EP 2314308中描述)，基于Fyn SH3结构域的骨架(例如在WO 2011/023685中描述)，基于EGFR-A结构域的骨架(例如在WO 2005/040229中描述)和基于Kunitz结构域的骨架(例如在EP 1941867中描述)。
本申请的一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中用于治疗受试者的结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的N端部分aa 1-21结合：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC；SEQ ID No.19。
本申请的另一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中用于治疗受试者的结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的C端部分aa 42-52-酰胺结合：
APRSKISPQGY-NH2；SEQ ID No.20。
本申请的另一个实施方式涉及前述实施方式的方法，其中用于治疗受试者的结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段骨架与肾上腺髓质素的中间区域部分aa 21-42结合：
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA；SEQ ID No.21。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述片段的水平的测定至少执行一次。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中在开始用抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架治疗后，所述片段的水平的测定至少执行一次。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中在开始用抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架治疗后，所述片段的水平的测定在一名患者中执行超过一次。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中在开始用抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架治疗后，所述片段的水平的测定在一名患者中执行超过两次。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中在开始用抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架治疗后，所述片段的水平的测定执行超过三次。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述不良结果选自临床病况恶化例如器官功能恶化和死亡。
如本文所用，术语“临床病况恶化”涉及症状的恶化(例如，定义疾病进展的临床参数的改变)、住院需要或死亡，并且可以通过医学评分(例如，急性生理学和慢性健康评估(APACHE，APACHE II))来评估。
本发明的术语“器官功能恶化”包括肾功能恶化(WRF)、心血管功能恶化、肝功能恶化和呼吸功能恶化，并且可以通过增加的序贯器官衰竭评估(SOFA)评分、多器官功能障碍评分(MODS)或简化急性生理学评分(SAPS，SAPS II)来评估。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述受试者患有脓毒症或脓毒性休克。
在以下针对全身性炎症宿主反应(SIRS)脓毒症的临床标准中，将定义脓毒性休克：
1)全身性炎症宿主反应(SIRS)，其特征在于至少两种以下症状：
·患者出现低血压(平均动脉压<65mm Hg)
·血清乳酸水平升高>4mmol/L
·血糖>7.7mmol/L(无糖尿病)
·中心静脉压不在8-12mm Hg范围内
·尿量是<0.5mL×kg-1×hr-1
·中心静脉(上腔静脉)氧饱和度<70％或混合静脉<65％
·心律>90次/分钟
·体温<36℃或>38℃
·呼吸频率>20/min
白细胞计数<4或>12×109/L(白细胞)；>10％不成熟中性粒细胞。
2)脓毒症
·至少两种在1)中提到的症状后，另外还有临床上怀疑的新感染：患者表现为低血压(平均动脉压<65mm Hg)
·血清乳酸水平升高>4mmol/L
·血糖>7.7mmol/L(无糖尿病)
·中心静脉压不在8-12mm Hg范围内
·尿量是<0.5mL×kg-1×hr-1
·中心静脉(上腔静脉)氧饱和度<70％或混合静脉<65％
·心律>90次/分钟
·体温<36℃或>38℃
·呼吸频率>20/min
·白细胞计数<4或>12×109/L(白细胞)；>10％不成熟中性粒细胞，
另外，临床上怀疑的新感染是：
·咳嗽/痰/胸痛
·腹痛/腹胀/腹泻
·血行感染
·心内膜炎
·排尿困难
·头痛伴颈部僵硬
·蜂窝织炎/伤口/关节感染
·任何感染的阳性微生物学
3)严重脓毒症
条件是患者表现出脓毒症，另外还有临床上怀疑的任何器官功能障碍：
·血压收缩压<90/均值；<65mmHG
·乳酸>2mmol/L
·胆红素>34μmol/L
·2h尿量<0.5mL/kg/h
·肌酐>177μmol/L
·血小板<100×109/L
·SpO2>90％，除非给以O2
4)脓毒性休克
表现出至少一种如3)所述的终末器官功能障碍的迹象。如果存在对治疗无反应的难治性低血压，并且仅静脉内输液不足以维持患者的血压免于变低，那么表明存在脓毒性休克。
最近，脓毒症定义工作组已重新审查和更新了脓毒症和脓毒性休克的定义(Singer等人2016.JAMA 315(8):801-810)，其通过引用并入本文。脓毒症被定义为威胁生命的器官功能障碍，是由于身体对感染的反应损害其自身的组织和器官时，宿主对感染的反应失调所致。器官功能障碍可被鉴定为感染后总SOFA评分≥2分的急性变化。对于不知道具有预先存在的器官功能障碍的患者，基线SOFA评分可以假定为零。SOFA评分≥2反映了在怀疑有感染的普通住院群体中总体死亡风险为约10％。甚至表现为中度功能障碍的患者也可能进一步恶化，从而强调了这种病症的严重性，如果尚未采取措施，那么需要及时、适当的干预。
脓毒性休克是脓毒症的一个子集，其中潜在的循环系统异常和细胞/代谢异常严重到足以大大增加死亡率。脓毒性休克患者可以通过脓毒症的临床构造来鉴定，其中持续性低血压需要血管加压药来维持MAP≥65mmHg，并且尽管有足够的容量复苏，但血清乳酸水平仍>2mmol/L(18mg/dL)。
Figure BDA0002455486530000221
Figure BDA0002455486530000231
表1：序贯[脓毒症相关]器官衰竭评估评分
缩写：FIO2，吸入氧气的分数；MAP，平均动脉压；PaO2，氧气的分压。
b)儿茶酚胺的剂量以μg/kg/min给出，持续至少1小时。
c)格拉斯哥昏迷量表评分为3-15；分数越高表示神经功能越好。
APACHE II(“急性生理学和慢性健康评估II”)是一种疾病严重程度分类系统(Knaus等人1985.Crit Care Med 13(10):818-29)，是几种重症监护病房之一。它在患者进入ICU的24小时内使用：根据几次测量计算得出0到71的整数评分；更高的评分对应于更严重的疾病和更高的死亡风险。
SAPS II是疾病严重程度分类系统(Le Gall等人1993.JAMA 270:2957-2963)。它的名称代表“简化急性生理学评分”，是几种重症监护病房(ICU)评分系统之一，并被设计成测量入住ICU的患者的疾病严重程度。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述治疗措施选自：液体复苏、血管加压药/肌力药、肾替代疗法、抗生素、氢化可的松、胰岛素、肠内营养/肠外营养。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述抗ADM抗体或抗体片段或非Ig骨架不与选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的肾上腺髓质素原前体片段结合。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的所述肾上腺髓质素原前体片段的长度分别为至少5个氨基酸。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中通过免疫测定法使用选自分别与MR-proADM或其片段和/或与CT-proADM或其片段和/或与PAMP或其片段结合的结合剂的至少一种结合剂，测定具有至少5个氨基酸的选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP或其片段的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平。
在本申请的一个特定实施方式中，免疫测定法用于测定MR-proADM和/或其片段(具有至少5个氨基酸)的水平，其中这样的免疫测定法是夹心测定法，优选全自动测定法。
在本申请的一个特定实施方式中，免疫测定法用于测定CT-proADM和/或其片段(具有至少5个氨基酸)的水平，其中这样的免疫测定法是夹心测定法，优选全自动测定法。
在本申请的一个特定实施方式中，免疫测定法用于测定PAMP和/或其片段(具有至少5个氨基酸)的水平，其中所述免疫测定法是夹心测定法，优选全自动测定法。
在本申请的一个实施方式中，分别用于测定MR-proADM和/或CT-proADM和/或PAMP的水平的免疫测定法可以是所谓的POC测试(即时检验)，它是一种无需完全自动化的测定系统即可在患者身边不到1小时内进行测试的测试技术。这项技术的一个实例是免疫色谱测试技术。
在本申请的一个实施方式中，这样的免疫测定法是使用任何种类的检测技术的夹心免疫测定法，包括但不限于酶标记、化学发光标记、电化学发光标记，优选全自动测定法。
在本发明的一个实施方式中，这样的免疫测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包含可用于以下系统之一的测定法：Roche
Figure BDA0002455486530000251
Abbott
Figure BDA0002455486530000252
Siemens
Figure BDA0002455486530000253
Brahms
Figure BDA0002455486530000254
Alere
Figure BDA0002455486530000255
多种免疫测定法是已知的并可用于本发明的测定法和方法，这些包括：放射免疫测定法(“RIA”)、均相酶多重免疫测定法(“EMIT”)、酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)、脱辅酶再活化免疫测定法(“ARIS”)、试纸条免疫测定法和免疫色谱测定法。
在本发明的一个特定实施方式中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以便被检测。
优选的检测方法包含各种形式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定法和快速测试形式，例如免疫色谱试纸条测试。
在一个优选实施方式中，所述标记选自：化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射性碘标记。
测定法可以是均相或非均相测定法、竞争性和非竞争性测定法。在一个实施方式中，测定法为夹心测定法的形式，其为非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体和第二抗体结合。第一抗体可以结合至固相，例如珠、孔或其他容器的表面、芯片或条带，第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适当的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”涉及的一般组合物和程序是众所周知的，并且是技术人员已知的(免疫测定法手册(The Immunoassay Handbook),David Wild编,Elsevier LTD,Oxford；第3版(2005年5月),ISBN-13:978- 0080445267；Hultschig C等人,Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(1):4-10.PMID: 16376134)。
在另一个实施方式中，测定法包含两个捕获分子，优选抗体，它们均以分散体形式存在于液体反应混合物中，其中第一标记组分附着于第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光猝灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分附着于第二捕获分子，以便在两个捕获分子均与分析物结合后，在包含样品的溶液中产生可测量的信号，以检测形成的夹心复合物。
在另一个实施方式中，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料，特别是花青类型的染料组合的稀土穴状物或稀土螯合物。
在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包含使用染料，其可以例如选自：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、氧杂蒽、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素例如伞形酮、苯甲酰亚胺例如Hoechst 33258；菲啶例如德克萨斯红(Texas Red)、亚基玛黄(YakimaYellow)、亚历克斯氟(Alexa Fluor)、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩
Figure BDA0002455486530000271
嗪染料、卟啉染料、聚次甲基染料等。
在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包含基于(Kirk-Othmer,化学技术 百科全书(Encyclopedia of chemical technology),第4版,执行编辑J.I.Kroschwitz；编 辑M.Howe-Grant,John Wiley&Sons,1993,第15卷,第518-562页，通过引用并入本文，包括 第551-562页的引用)中关于化学发光材料描述的物理原理使用染料。优选的化学发光染料是吖啶酯。
如本文所提到的，“测定法”或“诊断测定法”可以是在诊断领域中应用的任何类型。这样的测定法可以基于待检测的分析物与一种或多种具有一定亲和力的捕获探针的结合。关于捕获分子与靶分子或感兴趣分子之间的相互作用，亲和常数优选大于108M-1。
在本发明的上下文中，“结合剂分子”是可以用来结合靶分子或感兴趣分子，即来自样品的分析物的分子。因此，结合剂分子必须在空间和表面特征(例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在)方面充分地成形，以特异性结合靶分子或感兴趣分子。因此，结合可以例如在捕获分子与靶分子或感兴趣分子之间通过离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或上述相互作用中的两种或更多种的组合来介导。在本发明的上下文中，结合剂分子例如可以选自：核酸分子、碳水化合物分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，结合剂分子是与感兴趣的靶或分子具有足够亲和力的抗体，包括其片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及源自于长度为至少12个氨基酸的可变链的所述抗体或片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。化学发光标记可以是吖啶酯标记、涉及异鲁米诺标记的类固醇标记等。
酶标记可以是乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、酸性磷酸酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶等。
在本发明的一个特定实施方式中，对于血浆MR-proADM来说，阈值在如下阈值范围内：在0.5与1.5nmol/L之间，优选0.7与1nmol/L之间，最优选使用0.8nmol/L的阈值。
在本发明的一个特定实施方式中，对于血浆CT-proADM来说，阈值在如下阈值范围内：在85与350pmol/L之间，优选100与250pmol/L之间，最优选使用150pmol/L的阈值。
在本发明的一个特定实施方式中，使用0.3与1.2pmol/L之间，优选0.4与1.0pmol/L之间的血浆PAMP-酰胺阈值，最优选0.8pmol/L的阈值。
在本发明的一个特定实施方式中，使用0.5与2.0pmol/L之间，优选0.7与1.8pmol/L之间的血浆PAMP-甘氨酸阈值，最优选1.5pmol/L的阈值。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中结合剂选自：分别与MR-proADM或其片段和/或与CT-proADM或其片段和/或与PAMP或其片段结合的抗体、抗体片段或非Ig骨架。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中与肾上腺髓质素结合的所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或与肾上腺髓质素结合的抗ADM非Ig蛋白骨架是单特异性的。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述抗体或片段或骨架表现出至少10-7M的对ADM的结合亲和力。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中与肾上腺髓质素结合的所述抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架表现出至少10-7M的对ADM的结合亲和力，其中所述结合亲和力使用Biacore 2000系统通过无标记表面等离子体共振来测定。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中对于所述关联来说，选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP或其片段的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平升高到高于某一阈值预示不良结果的风险增加，和/或所述肾上腺髓质素原前体片段或其片段的水平低于某一阈值预示不良结果的风险降低。
如本文所用，术语“水平升高”是指水平高于某一阈值水平。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述阈值是为健康参考人群确定的上限浓度，例如第90、95或99百分位数。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中为了关联所述肾上腺髓质素原前体片段的水平，水平的测定至少执行两次，并且其中与所述片段的第一次测得的水平相比，所述片段的第二次测得的水平的降低预示不良结果的风险降低。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中为了关联所述肾上腺髓质素原前体片段的水平，水平的测定至少执行两次，并且其中与所述片段的第一次测得的水平相比，所述片段的第二次测得的水平的增加预示不良结果的风险增加。
如本文所用，术语“风险”是指遭受不良事件或影响(例如疾病)的可能性。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP或其片段的肾上腺髓质素原前体片段的水平的降低预示不良结果的风险降低。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP或其片段的肾上腺髓质素原前体片段的水平的增加预示不良结果的风险增加。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述降低的特征在于受试者的临床/医学健康状态的改善和/或所述肾上腺髓质素原前体片段的浓度减半。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述增加的特征在于受试者的临床/医学健康状态的恶化和/或所述肾上腺髓质素原前体片段的浓度加倍。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中使用测定法来测定MR-proADM的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的MR-proADM，并且<0.5nmol/L，优选<0.4nmol/L，更优选<0.2nmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中使用测定法来测定CT-proADM的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的CT-proADM，并且<100pmol/L，优选<75pmol/L，更优选<50pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中使用测定法来测定PAMP-酰胺的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的PAMP-酰胺，并且<0.3pmol/L，优选<0.2pmol/L，更优选<0.1pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中使用测定法来测定PAMP-甘氨酸的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够定量健康受试者的PAMP-甘氨酸，并且<0.5pmol/L，优选<0.25pmol/L，更优选<0.1pmol/L。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中使用测定法来测定MR-proADM和/或CT-proADM和/或PAMP的水平，并且其中测定灵敏度对于MR-proADM来说是<0.5nmol/L，优选<0.4nmol/L，更优选<0.2nmol/L，和/或对于CT-proADM来说是<100pmol/L，优选<75pmol/L，更优选<50pmol/L，和/或对于PAMP来说是<0.3pmol/L，优选<0.2pmol/L，更优选<0.1pmol/L。
如实施例中概述的，本发明的proADM水平或其片段已经通过描述的测定法来测定。如果上述阈值以与本发明中使用的测定系统不同的方式进行了校准，那么它们在其他测定法中可能会有所不同。因此，考虑到校准的差异，以上提到的截止值应相应地应用于这样的不同校准的测定法。定量校准差异的一种可能性是通过使用两种方法测量样品中的各个生物标志物(例如bio-ADM)来对所讨论的测定法与本发明中使用的各个生物标志物测定法进行方法比较分析(相关性)。另一种可能性是，鉴于此测试具有足够的分析灵敏度，用所讨论的测定法测定代表性正常人群的中值生物标志物水平，将结果与文献中所述的中值生物标志物水平进行比较，并基于通过这种比较获得的差异重新计算校准。通过本发明中使用的校准，已经测量了来自正常(健康)受试者的样品：中值血浆bio-ADM(成熟ADM-NH2)为24.7pg/ml，最低值为11pg/ml，第99百分位数为43pg/ml。或者，可将市售的对照样品用于调整不同的校准(例如ICI Diagnostics,Berlin,Germany)。
如Caruhel等人(Caruhel等人2009.Clin Biochem 42:725-8)中所述，使用检测MR-proADM的自动夹心荧光测定法，正常(健康)受试者的血浆中值MR-proADM浓度为0.41(四分位间距0.23-0.64)nmol/L(Smith等人2009.Clin Chem 55:1593-1595)。
正常健康受试者(n＝200)的CT-proADM血浆中值浓度为77.6pmol/L(最低46.6pmol/L，最高136.2pmol/L)，95％百分位数为113.8pmol/L(EP 2 111 552 B1)。
正常健康受试者(n＝51)的PAMP-酰胺血浆浓度为0.51±0.19pmol/L(平均值±SD)(Hashida等人2004.Clin Biochem 37:14-21)。
正常健康受试者(n＝51)的PAMP-甘氨酸血浆浓度为1.15±0.38pmol/L(平均值±SD)(Hashida等人2004.Clin Biochem 37:14-21)。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中另外在相关性中确定且另外考虑选自以下的至少一个临床参数：年龄、性别、SOFA评分(或其子评分)、SAPSII评分、BUN、钠、钾、肌酐、胆红素、血小板计数、动脉pH、血细胞比容、白细胞计数、HCO3-、有创机械通气/无创机械通气、血流动力学特征(包括血压、收缩压和舒张压、平均动脉压、中心静脉压、心律)、体液平衡、尿量、碱过剩、氯化物、CRP、PCT、BNP或NT-proBNP、肌钙蛋白T或肌钙蛋白I、前脑啡肽、血红蛋白、葡萄糖、乳酸、INR、碱性磷酸酶、AST、ALT、γGT、总蛋白、白蛋白、体温、呼吸频率、PaO2和FiO2、治疗措施(液体复苏、血管加压药/肌力药、肾替代疗法、抗生素、氢化可的松、胰岛素、肠内营养/肠胃外营养)、既往合并症、慢性药物。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，用于将所述受试者分为风险组。
本申请的另一个实施方式涉及根据前述实施方式所述的方法，其中将所述受试者分为患者组，其中一组包含需要治疗的患者，另一组包含不需要治疗的患者。
在本发明范围内的其他实施方式如下所示：
1.一种用于监测受试者的疗法的方法，其中所述受试者正在用选自与SEQ IDNO.1(氨基酸1-52)结合的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体、抗体片段和/或非Ig骨架的结合剂进行治疗，所述方法包含
·测定从所述受试者获得的体液中选自以下的肾上腺髓质素原前体片段的水平：中间区域肾上腺髓质素原(MR-proADM)、C端肾上腺髓质素原(CT-proADM)和/或肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)或其片段；和
·将选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平与所述受试者的临床/医学健康状态和/或不良结果的风险和/或改变治疗措施的要求相关联，并且
·其中为了测定所述片段的水平，至少一种结合剂与分别选自SEQ ID NO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5的氨基酸序列内的区域结合。
2.根据实施方式1所述的方法，其中用于所述治疗的所述结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的N端部分aa 1-21结合：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC；SEQ ID No.19。
3.根据实施方式1至2所述的方法，其中用于所述治疗的所述结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的C端部分aa 42-52-酰胺结合：
APRSKISPQGY-NH2；SEQ ID No.20。
4.根据实施方式1至3所述的方法，其中用于所述治疗的所述结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的中间区域部分aa21-42结合：
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA；SEQ ID No.21。
5.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述片段的水平的测定至少执行一次。
6.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述不良结果选自临床病况恶化例如器官功能恶化和死亡。
7.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中临床病况恶化涉及症状的恶化(例如定义疾病进展的临床参数的改变)、住院需要或死亡，并且可以通过医学评分(例如急性生理学和慢性健康评估(APACHE，APACHE II))来评估。
8.根据实施方式1至6所述的方法，其中器官功能恶化包含肾功能恶化(WRF)、心血管功能恶化、肝功能恶化和呼吸功能恶化，并且可以通过增加的序贯器官衰竭评估(SOFA)评分、多器官功能障碍评分(MODS)或简化急性生理学评分(SAPS，SAPS II)来评估。
9.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症，例如慢性或急性疾病或急性病症。
10.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述受试者所患的疾病可以选自：严重感染例如脑膜炎、全身性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症；其他疾病例如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病例如心力衰竭、心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化；休克例如脓毒性休克和器官功能障碍例如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、创伤。
11.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述治疗措施选自：液体复苏、血管加压药/肌力药、肾替代疗法、抗生素、氢化可的松、胰岛素、肠内营养/肠外营养。
12.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中通过免疫测定法使用选自分别与MR-proADM或其片段和/或与CT-proADM或其片段和/或与PAMP或其片段结合的结合剂的至少一种结合剂，测定具有至少5个氨基酸的选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平。
13.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中对于所述关联来说，选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP或其片段的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平升高到高于某一阈值预示不良结果的风险增加，和/或所述肾上腺髓质素原前体片段或其片段的水平低于某一阈值预示不良结果的风险降低。
14.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述阈值是为健康参考人群确定的上限浓度，例如第90、95或99百分位数。
15.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中为了关联所述肾上腺髓质素原前体片段的水平，所述片段的水平的测定至少执行两次，并且其中与所述片段的第一次测得的水平相比，所述片段的第二次测得的水平的降低预示不良结果的风险降低。
16.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中为了关联所述肾上腺髓质素原前体片段的水平，所述片段的水平的测定至少执行两次，并且其中与所述片段的第一次测得的水平相比，所述片段的第二次测得的水平的增加预示不良结果的风险增加。
17.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中免疫测定法用于测定MR-proADM和/或CT-proADM和/或PAMP的水平，并且其中测定灵敏度对于MR-proADM来说是<0.5nmol/L，优选<0.4nmol/L，更优选<0.2nmol/L，和/或对于CT-proADM来说是<100pmol/L，优选<75pmol/L，更优选<50pmol/L，和/或对于PAMP来说是<0.3pmol/L，优选<0.2pmol/L，更优选<0.1pmol/L。
18.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
19.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中另外在相关性中确定且另外考虑选自以下的至少一个临床参数：年龄、性别、SOFA评分(或其子评分)、SAPSII评分、BUN、钠、钾、肌酐、胆红素、血小板计数、动脉pH、血细胞比容、白细胞计数、HCO3-、有创机械通气/无创机械通气、血流动力学特征(包括血压、收缩压和舒张压、平均动脉压、中心静脉压、心律)、体液平衡、尿量、碱过剩、氯化物、CRP、PCT、BNP或NT-proBNP、肌钙蛋白T或肌钙蛋白I、前脑啡肽、血红蛋白、葡萄糖、乳酸、INR、碱性磷酸酶、AST、ALT、γGT、总蛋白、白蛋白、体温、呼吸频率、PaO2和FiO2、治疗措施(液体复苏、血管加压药/肌力药、肾替代疗法、抗生素、氢化可的松、胰岛素、肠内营养/肠胃外营养)、既往合并症、慢性药物。
20.根据前述实施方式中任一项所述的方法，用于将所述受试者分为风险组。
实施例1
产生抗体和测定其亲和常数
产生了几种人类和鼠类抗体，并测定了它们的亲和常数(参见表2)。
用于免疫接种的肽/结合物：
合成了用于免疫接种的肽，参见表2(JPT Technologies,Berlin,Germany)，其带有附加的N端半胱氨酸(如果所选的ADM序列中不存在半胱氨酸)残基，用于将所述肽与牛血清白蛋白(BSA)结合。通过使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽与BSA共价连接。根据Perbio的手册进行偶联程序。
根据以下方法生成鼠类抗体：
在第0天和第14天用100μg肽-BSA结合物(在100μl完全弗氏佐剂中乳化)以及在第21天和第28天用50μg肽-BSA结合物(在100μl不完全弗氏佐剂中)对Balb/c小鼠进行免疫接种。在进行融合实验前三天，动物接受了溶于100μl盐水中的50μg结合物，其通过一次腹膜内注射和一次静脉内注射来给予。
将来自免疫接种小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与1ml 50％聚乙二醇在37℃下融合30秒。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充有20％胎牛血清和HAT-Supplement的RPMI 1640培养基]中生长来选择杂交克隆。两周后，将HAT培养基替换为HT培养基，进行三次传代，然后返回正常细胞培养基。
融合后三周，对细胞培养上清液进行抗原特异性IgG抗体的初步筛选。将测试的阳性微培养物转移到24孔板中进行繁殖。重新测试后，使用有限稀释技术克隆和再克隆选择的培养物，并确定同种型(还参见Lane,R.D.1985.J.Immunol.Meth.81:223-228；Ziegler等 人1996.Horm.Metab.Res.28:11-15)。
小鼠单克隆抗体产生：
通过标准抗体产生方法(Marx et al,1997.单克隆抗体生产(Monoclonal Antibody Production),ATLA 25,121)产生抗体，并通过蛋白A纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度>95％。
人类抗体：
根据以下程序，通过噬菌体展示产生了人类抗体：
人类天然抗体基因库HAL7/8被用于分离针对肾上腺髓质素肽的重组单链F可变结构域(scFv)。用淘选策略筛选抗体基因库，所述淘选策略包含使用含有通过两个不同间隔区与肾上腺髓质素肽序列连接的生物素标签的肽。使用非特异性结合的抗原和链霉亲和素结合的抗原的淘选轮的混合被用于使非特异性结合剂的背景最小化。来自第三轮淘选的洗脱的噬菌体已被用于产生表达单克隆scFv的大肠杆菌(E.coli)菌株。这些克隆菌株的培养上清液已被直接用于抗原ELISA测试(还参见Hust等人2011.Journal of Biotechnology 152,159-170；Schütte等人2009.PLoS One 4,e6625)。
已基于抗原的ELISA阳性信号选择了阳性克隆，而链霉亲和素包被的微量滴定板则选择了阴性克隆。为了进一步表征，已将scFv开放阅读框克隆到表达质粒pOPE107(Hust 等人,J.Biotechn.2011)中，通过固定化金属离子亲和色谱法从培养上清液中捕获，并通过尺寸排阻色谱法纯化。
亲和常数：
为了测定抗体对肾上腺髓质素的亲和力，使用Biacore 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)通过无标记表面等离子体共振测定肾上腺髓质素与固定的抗体的结合动力学。根据制造商的说明(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)，使用高密度共价偶联至CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体进行抗体的可逆固定。(Lorenz等人 2011.Antimicrob Agents Chemother.55(1):165-173)。
产生分别针对人类和鼠类ADM的下述ADM区域的单克隆抗体。下表代表了用于进一步实验的获得抗体的选择。选择是基于靶区域：
表2：
Figure BDA0002455486530000391
通过酶消化产生抗体片段：
Fab和F(ab)2片段的产生通过鼠类全长抗体NT-M的酶消化来完成。使用a)基于胃蛋白酶的F(ab)2制备试剂盒(Pierce 44988)和b)基于木瓜蛋白酶的Fab制备试剂盒(Pierce 44985)消化抗体NT-M。根据供应商提供的说明进行片段化程序。在F(ab)2片段化的情况下，在37℃消化8小时。Fab片段化消化分别进行16小时。
Fab产生和纯化程序：
固定化的木瓜蛋白酶通过用0.5ml的消化缓冲液(Digestion Buffer)洗涤树脂并在5000×g下将柱离心1分钟来平衡。此后将缓冲液丢弃。通过去除储存溶液并用消化缓冲液进行洗涤，然后每次以1000×g离心2分钟来制备脱盐柱。将0.5ml制备的IgG样品加入到含有平衡的固定化木瓜蛋白酶的离心柱管中。消化反应的温育时间在37℃的台式摇床上进行16小时。将柱以5000×g离心1分钟以将消化物与固定化木瓜蛋白酶分离开。然后，将树脂用0.5ml PBS洗涤，并以5000×g离心1分钟。将洗涤级分添加至消化的抗体，总样品体积为1.0ml。在室温下用PBS和IgG洗脱缓冲液平衡NAb蛋白A柱。将柱离心1分钟以去除储存溶液(含有0.02％叠氮化钠)，并通过添加2ml PBS来平衡，再次离心1分钟并丢弃流过物(flow-through)。将样品应用至柱，并通过反转进行再悬浮。在室温下进行颠倒混合温育10分钟。将柱离心1分钟，保留具有Fab片段的流过物。(参考文献：Coulter和Harris 1983.J.Immunol.Meth.59,199-203.；Lindner等人2010.Cancer Res.70,277-87；Kaufmann 等人2010.PNAS.107,18950-5.；Chen等人2010.PNAS.107,14727-32；Uysal等人 2009J.Exp.Med.206,449-62；Thomas等人2009.J.Exp.Med.206,1913-27；Kong等人 2009J.Cell Biol.185,1275-840)。
F(ab′)2片段的产生和纯化程序：
固定化的胃蛋白酶通过用0.5ml的消化缓冲液洗涤树脂并在5000×g下将柱离心1分钟来平衡。此后将缓冲液丢弃。通过去除储存溶液并用消化缓冲液进行洗涤，然后每次以1000×g离心2分钟来制备脱盐柱。将0.5ml制备的IgG样品添加到含有平衡的固定化胃蛋白酶的离心柱管中。消化反应的温育时间在37℃的台式摇床上进行16小时。将柱以5000×g离心1分钟以将消化物与固定化木瓜蛋白酶分离开。然后，将树脂用0.5mL PBS洗涤，并以5000×g离心1分钟。将洗涤级分添加至消化的抗体，总样品体积为1.0ml。在室温下用PBS和IgG洗脱缓冲液平衡NAb蛋白A柱。将柱离心1分钟以去除储存溶液(含有0.02％叠氮化钠)，并通过添加2mL PBS来平衡，再次离心1分钟并丢弃流过物。将样品应用至柱，并通过反转进行再悬浮。在室温下进行颠倒混合温育10分钟。将柱离心1分钟，保留具有Fab片段的流过物。(参考文献：Mariani等人1991.Mol.Immunol.28:69-77；Beale 1987.Exp Comp Immunol 11: 287-96；Ellerson等人1972.FEBS Letters 24(3):318-22；Kerbel和Elliot 1983.Meth Enzymol 93:113-147；Kulkarni等人1985.Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4； Lamoyi 1986.Meth Enzymol 121:652-663；Parham等人1982.J Immunol Meth 53:133-73； Raychaudhuri等人1985.Mol Immunol 22(9):1009-19；Rousseaux等人1980.Mol Immunol 17:469-82；Rousseaux等人1983.J Immunol Meth 64:141-6；Wilson等人1991.J Immunol Meth 138:111-9)。
NT-H抗体片段人源化：
通过CDR移植方法使抗体片段人源化(Jones等人1986.Nature 321,522-525)。
完成以下步骤以获得人源化序列：
总RNA提取：使用Qiagen试剂盒从NT-H杂交瘤中提取总RNA。
第一轮RT-PCR：使用
Figure BDA0002455486530000413
OneStep RT-PCR试剂盒(目录号210210)。用对重链和轻链特异的引物组进行RT-PCR。对于每个RNA样品，使用覆盖可变区前导序列的简并正向引物混合物建立了12个独立的重链和11个轻链RT-PCR反应。反向引物位于重链和轻链的恒定区。没有限制位点被工程化到引物中。
反应设置：
Figure BDA0002455486530000411
OneStep RT-PCR缓冲液5.0μl，dNTP混合物(含有10mM的每种dNTP)0.8μl，引物组0.5μl，
Figure BDA0002455486530000412
OneStep RT-PCR酶混合物0.8μl，模板RNA 2.0μl，无RNase的水至20.0μl，总体积20.0μl。PCR条件：逆转录：50℃，30min；初始PCR激活：95℃，15min；循环：20个循环的94℃，25sec；54℃，30sec；72℃，30sec；最后延伸：72℃，10min。第二轮半嵌套式PCR：在第二轮PCR中进一步扩增了来自第一轮反应的RT-PCR产物。使用对抗体可变区具有特异性的半嵌套式引物组，建立了12个独立的重链和11个轻链RT-PCR反应。
反应设置：2×PCR混合物10μl；引物组2μl；第一轮PCR产物8μl；总体积20μl；杂交瘤抗体克隆报告PCR条件：在95℃5分钟的初始变性；25个循环的95℃25sec，57℃30sec，68℃30sec；最后延伸是10min 68℃。
PCR完成后，将PCR反应样品运行到琼脂糖凝胶上以将扩增的DNA片段可视化。对通过嵌套RT-PCR扩增的多于15种的克隆的DNA片段进行测序后，已克隆了数种小鼠抗体重链和轻链，并且看起来正确。蛋白质序列比对和CDR分析可鉴定一条重链和一条轻链。与同源人类框架序列比对后，可变重链的所得人源化序列如下：参见图5。因为可变重链中第26、40和55位的氨基酸和可变轻链中第40位的氨基酸对于结合特性至关重要，所以它们可能会恢复为鼠类来源。所得候选物如下所示。(Padlan1991.Mol.Immunol.28,489-498；Harris和 Bajorath.1995.Protein Sci.4,306-310)。
抗体片段序列(SEQ ID No.:11-18和26-27)的注释：粗体和下划线是按时间顺序排列的CDR 1、2、3；斜体是恒定区；铰链区以粗体字母突出显示，组氨酸标签以粗体和斜体字母突出显示。
SEQ ID No.11(AM-VH-C):
Figure BDA0002455486530000421
SEQ ID No.12(AM-VH1):
Figure BDA0002455486530000431
SEQ ID No.13(AM-VH2-E40):
Figure BDA0002455486530000432
SEQ ID No.14(AM-VH3-T26-E55):
Figure BDA0002455486530000433
SEQ ID No.15(AM-VH4-T26-E40-E55):
Figure BDA0002455486530000434
SEQ ID No.16(AM-VL-C):
Figure BDA0002455486530000441
SEQ ID No.17(AM-VL1):
Figure BDA0002455486530000442
SEQ ID No.18(AM-VL2-E40):
Figure BDA0002455486530000443
SEQ ID No.26(HAM8101的重链):
Figure BDA0002455486530000444
Figure BDA0002455486530000451
SEQ ID No.27(HAM8101的轻链):
Figure BDA0002455486530000452
实施例2
在双命中模型中，已经研究了抗NT-H肾上腺髓质素抗体HAM8101(Adrecizumab)对脓毒症猪的临床和实验室参数的影响。第一次命中是出血性休克，第二次命中是通过施用大肠杆菌纤维蛋白凝块(腹膜污染和感染；PCI)诱发脓毒症。在诱发脓毒症的时间点施用HAM8101。
材料和方法
动物品系：猪(Sus scrofa domestica)(德国长白猪(Deutsche Landrasse))14-16周，30-35kg
组大小：6
组：
a)PCI+媒剂
b)PCI+HAM8101
测试材料
HAM8101(Adrecizumab)批号：HAM-160714-FiB在20mM His/HCl pH 6.0中
媒剂：20mM His/HCl pH 6.0
研究执行
动物
我们麻醉了16只雌性德国长白猪，并使其通气(n＝16；平均值±标准差(SD)33±1.5kg体重(BW))，并按照实验室动物护理的标准程序进行。这项研究得到了动物保护和使用的机构和地方委员会的批准(Landesamt für Natur,Umwelt und VerbraucherschutzNordrhein-Westfalen,Germany,84-02.04.2015.A037)。
全身麻醉和导尿
用阿扎哌隆(1-2mg/kg BW)和氯胺酮(10mg/kg BW)对动物进行预用药，并通过静脉注射异丙酚(1-2mg/kg BW)诱导全身麻醉。将动物经口插管并置于仰卧位置。通过输注异丙酚和芬太尼来维持全身麻醉。选择受控压力模式通气来使动物通气，吸入氧气的分数为0.5，吸气/呼气比为1:1.5，PEEP设置为5cm H2O，潮气量为8-10ml/kg BW。呼吸频率设定成维持3.5-4.5kPa的PaCO2。用保暖毯将体核温度维持在高于37.5℃。通过经皮穿刺将两个中心静脉导管插入颈外静脉和股静脉，并将动脉PICCO导管插入股动脉。
在研究结束时，在动物仍处于深度麻醉状态的情况下，在兽医的陪同下用致死剂量的
Figure BDA0002455486530000461
(Merial,Hallbergmoos,Germany)对动物实施安乐死。
大肠杆菌纤维蛋白凝块
在此模型中，我们使用7-9×1011集落形成单位(CFU)/kg/BW的大肠杆菌纤维蛋白凝块来诱发脓毒性休克。
血液动力学测量
所有的血管内压力测量均以胸中段为参考，并在呼气末获得值。连续记录心率、平均动脉压(MAP)、中心静脉压(CVP)和每搏输出量变异(SVV)。使用经肺热稀释法(PICCO，Pulsion medical systems,Feldkirchen,Germany)测量心输出量。使用标准公式计算血管外肺水(EVLW)、胸腔内血容量(ITBV)和全心舒张末期容积(GEDV)。
实验室
血气分析是使用标准血气血氧测定系统(ABL 800；Radiometer,Copenhagen,Denmark)和辅助血氧测定仪进行的。使用标准实验室技术测定血细胞计数、电解质、肌酐、尿素和肝酶。我们使用市售试剂盒(猪NGAL ELISA试剂盒，BioPorto,Hellerup,Denmark)通过酶联免疫吸附测定法测量了与中性粒细胞明胶酶相关的脂钙蛋白(NGAL)。测定肌酐清除率，以估计肾小球滤过率(ClCrea＝Ucrea×Uvol/Pcrea×尿液收集期间的持续时间；Ucrea＝尿液肌酐浓度；Uvol＝收集期间的尿量；Pcrea＝血清肌酐浓度)。我们在实验前后测量了动物的体重。通过在实验刚结束后和5天后，称量左上叶的一部分来确定肺的湿/干比。使用旋转血栓弹力测定法(ROTEM delta,TEM international,Basel,Switzerland)对凝血进行了分析。通过酶联免疫吸附测定法，使用特异性针对猪的市售试剂盒评估血浆中细胞因子(IL-6和TNF-α)的水平。
如前所述(Marino等人2014.Crit Care 18:R34)，使用由Sphingotec GmbH(Hennigsdorf,Germany)提供的新型化学发光免疫测定法测量生物活性肾上腺髓质素(bio-ADM)。简而言之，在一步夹心化学发光免疫测定法中，基于用于检测未处理的纯净血浆中的生物活性ADM的吖啶NHS-酯标记，它使用两种小鼠单克隆抗体，一种针对中间区域(固相)，另一种针对ADM的酰胺化C端部分(标记的抗体)。该测定法利用50μL血浆样品/校准物和200μL标记的检测抗体。分析测定法的灵敏度为2pg/mL。该测定法适用于测量多种哺乳动物物种(包括人类和猪)的bio-ADM，并且它检测游离的Bio-ADM以及与HAM 8101(Adrecizumab)结合的bio-ADM两者(Weber等人2017.J Appl Lab Medicine,出版中)。
根据制造商的说明(Thermo Fisher,Hennigsdorf,Germany)，用B·R·A·H·M·S MR-proADM KRYPTOR测定法测量血浆MR-proADM。
实验协议
在导管插入过程中，动物接受了10ml/kg BW/hr的平衡晶体溶液。通过股静脉导管使动物流血来诱发出血性休克。给动物放血直至达到基线MAP的一半。维持出血性休克45分钟，然后用平衡晶体溶液进行液体复苏，以恢复基线平均动脉压。出血性休克后2小时，将出血性休克期间所收集的血液回输。作为第二次命中，在出血性休克后6小时将载有大肠杆菌的凝块放入腹腔，诱发脓毒症。随机分配动物以接受肾上腺髓质素抗体或媒剂溶液。溶液以中性袋提供，各组对研究人员保持盲态，并标有A或B。诱发脓毒症后立即开始用抗体或媒剂溶液进行治疗。在30分钟时间内注入2mg/kg BW的抗体/媒剂溶液。诱发脓毒症后4小时，根据需要使用平衡的晶体和去甲肾上腺素开始脓毒性休克的治疗。根据拯救脓毒症运动(Surviving Sepsis Campaign)的建议，对容量替代物和血管加压药进行滴定，以维持8-12mmHg的中心静脉压，高于65mmHg的平均动脉压和70％的中心静脉氧饱和度。脓毒症治疗又持续了8个小时。在出血性休克之前，脓毒症诱发之前和脓毒症诱发后1、2、3、4、6、8、10和12小时进行测量。没有对SHAM组的动物进行出血和脓毒性休克，但除此之外，它们接受了相同的治疗，包括所有血管内导管、正中剖腹术和抗体/媒剂溶液的盲法施用。
结果：
如所预期的，脓毒症的诱发导致媒剂动物中血浆bio-ADM的增加。令人惊讶的是，在施用HAM 8101后，表观血浆bio-ADM浓度比媒剂动物中的浓度明显更快升高，并且升高至更高水平(图2A)。考虑到HAM 8101相对于内源bio-ADM的摩尔过量极大，必须假设，在施用HAM 8101后测得的血浆ADM浓度实际上主要代表与HAM 8101抗体复合的bio-ADM。为了调查观察到的HAM8101诱导的血浆bio-ADM更快、更明显的增加是否是由于ADM基因表达增强和/或ADM基因产物释放引起的，测量源自于ADM前体肽的另一种肽的血浆浓度，即MR-proADM(中间区域肾上腺髓质素原)。如图2B所示，脓毒症诱发后血浆MR-proADM的水平类似地增加，与用HAM8101还是媒剂处理动物无关。因此，看起来HAM8101诱导的血浆ADM的更快和更明显的增加不是由于ADM基因表达增强和/或ADM基因产物释放引起的。
与媒剂动物相比，在施用HAM 8101后观察到的血浆bio-ADM的超比例增加与不良结果无关：
与媒剂动物相比，接受HAM 8101的动物需要更少的容量复苏就能达到目标平均动脉压(图3)。
接受HAM 8101的动物中只有三分之一需要在容量复苏基础上施用去甲肾上腺素以达到目标平均动脉压，而所有媒剂动物都需要去甲肾上腺素(图4)。
如图4所示，在用HAM 8101治疗的动物中，三分之一需要去甲肾上腺素，而三分之二则不需要。这两组中血浆MR-proADM浓度的变化有所不同(图5)。发生休克，例如在液体复苏基础上需要去甲肾上腺素的那些动物与其他动物相比具有高得多的MR-proADM浓度。后者，被成功治疗的动物与媒剂组相比具有较低的MR-proADM浓度。
总而言之，数据表明，令人惊讶地，在HAM 8101的治疗下，bio-ADM的测量不适用于监测受试者不良结果的风险。相反，作为HAM 8101不结合的源自于ADM前体肽的另一个片段的实例，MR-proADM的测量适用于在这种情况下监测ADM系统的刺激或下调，因为它不会立即受到HAM 8101施用的影响，并且随时间推移与临床结果相关。
实施例3
已经研究了针对SEQ ID No.:20产生的单克隆抗C端肾上腺髓质素抗体(HAM2302)对雄性Wistar大鼠(Charles River,Sulzfeld)中ADM水平的影响。
在时间点-3d、12min、1h、3h、6h、24h、48、4d、7d、10d进行血液采样(K3-EDTA-血浆≤150μL或在最终出血(-80℃)下3-4mL)。用单次静脉内注射(5mL/kg体重)处理动物。
注射和采样对所有动物均成功。抗体处理的动物没有明显的毒性作用迹象。
处理 剂量 动物数量
HAM 2302 20mg/kg 6
PBS 0mg/kg 6
血浆中ADM和游离HAM2302的测量
为了测量含有HAM2302的血浆样品中的肾上腺髓质素，使用了tADM测定法。这种测定法使用针对SEQ ID No.:25产生的N端抗ADM抗体作为固相(HAM 1112)和针对ADM的氨基酸27至39(AHQIYQFTDK DKD；SEQ ID No.:22)产生的中间区域抗ADM抗体(HAM 2903)作为示踪剂。由合成的大鼠bio-ADM(1-50)-NH2(YRQSMNQGSRSTGCRFGTCTMQKLAHQIYQFTDKDKDGMAPRNKISPQGY-NH2，Seq ID No.:23)制成的校准物用于定量样品中的ADM。与上述bio-ADM测定法相反，tADM测定法不专门测量ADM的酰胺化形式，但是可以检测ADM的所有形式。
通过在10％标记缓冲液(500mmol/L磷酸钠，pH 8.0)中以1:5mol/L比的MACN-吖啶-NHS-酯(1g/L，InVent GmbH)在暗处于22℃温育30分钟，标记纯化的单克隆HAM 2903抗体(1g/L)。在加入5％1mol/L pH 8.0的Tris-HCl 10分钟后，通过CentriPure P5柱(empBiotech GmbH)并在蛋白KW-803(Shodex,Showa Denko Europe)上通过尺寸排阻HPLC，将HAM 2903抗体与游离标记分离开。
将白色聚苯乙烯微量滴定板(Greiner Bio-One International AG)用单克隆HAM1112抗体(1.5μg/0.2mL/孔，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，pH 7.8)包被(在22℃下18h)。在洗涤并用30g/L的Karion，5g/L的牛血清白蛋白(无蛋白酶)，6.5mmol/L的磷酸二氢钾，3.5mmol/L的磷酸二氢钠(pH 6.5)阻断1.5小时后，将板真空干燥。
使用20mmol/L磷酸氢钾，0.5g/L牛血清白蛋白(BSA)，6mmol/L EDTA钠，50μmol/L阿马他汀(amastatin)，100μmol/L亮肽素；pH 8对合成的大鼠ADM(rADM)(peptides&elephants)进行连续稀释。
将50μL样品/校准物吸移到包被的微量滴定板中。在加入150μL标记的C端抗体HAM2302后，将微量滴定板在搅拌下于2-8℃温育20小时。通过用洗涤溶液(400mmol/L Tris，1g/L Tween 20、3mol/L NaCL，pH 7.5)洗涤五次(每次每孔350μL)来去除未结合的示踪剂。通过使用Centro LB 960微量滴定板发光读数器(Berthold Technologies)，测量孔结合的化学发光，每孔1s。
为了测定游离HAM2302，使用Adrenomab-1测定法。针对氨基酸21-32(SEQ ID No.:24)产生的中间区域抗ADM抗体充当固相。MACN标记的C端抗体(HAM 2302)充当示踪剂。样品中HAM 2302的定量利用了竞争性测定设计。由未标记的HAM 2302和恒定的hADM浓度(10ng/mL)一起制成的校准物用于生成标准曲线，以确定未知样品中的浓度。随着样品中校准物/抗体浓度的增加，由于较少的示踪剂可与肾上腺髓质素结合，因此测得的光信号下降。
通过在10％标记缓冲液(500mmol/L磷酸钠，pH 8.0)中以1:4.5mol/L比的MACN-吖啶-NHS-酯(1g/L，InVent GmbH)在暗处于22℃温育30分钟，标记纯化的单克隆HAM 2302(1g/L)。在加入5％1mol/L pH 8.0的Tris-HCl 10分钟后，通过CentriPure P10柱(empBiotech GmbH)并在蛋白KW-803(Shodex,Showa Denko Europe)上通过尺寸排阻HPLC，将HAM 2302与游离标记分离开。
将白色聚苯乙烯微量滴定板(Greiner Bio-One International AG)用针对ADM的氨基酸21-32的单克隆中间区域抗体(1μg/0.2mL/孔，50mmol/L Tris-HCl，100mmol/LNaCl，pH 7.8)包被(在20℃下18h)。在用30g/L Karion，5g/L BSA(无蛋白酶)，6.5mmol/L磷酸二氢钾，3.5mmol/L磷酸二氢钠(pH 6.5)阻断1.5小时后，将板真空干燥。
使用通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)，2.5g/L牛血清白蛋白pH 7.4制备的HAM 2302连续稀释液。
将50μL样品/校准物和100μL含10ng/mL hADM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，2.5g/L牛血清白蛋白pH 7.4移液到包被的微量滴定板中。在搅拌下于2-8℃温育1小时后，将100μL标记的HAM 2302移液到包被的微量滴定板中。在搅拌下于2-8℃将板温育另外2.5小时后，通过用洗涤溶液(20mmol/L PBS，1g/L Triton X-100，pH 7.4)洗涤五次(每次每孔350μL)来去除未结合的示踪剂。通过使用Centro LB 960微量滴定板发光读数器(BertholdTechnologies)，测量孔结合的化学发光，每孔1s。
结果：
在HAM2302处理的动物样品中，在注射后3h测得的游离HAM2302血浆浓度为481.9μg/mL(±46.8μg/mL)。媒剂动物中的平均ADM浓度为14.6±3.75pg/ml。与媒剂动物相比，HAM2302处理的动物中肾上腺髓质素的浓度高约100倍(1411±67pg/mL)(图6)。
序列表
SEQ ID NO.1(成熟肾上腺髓质素(成熟ADM)；酰胺化DM；bio-ADM)：preproADM的氨基酸95-146-CONH2
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSK ISPQGY-CONH2
SEQ ID NO.2(肾上腺髓质素原前体(pre-proADM))：氨基酸1-185
MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL
SEQ ID NO.3(肾上腺髓质素原N端20肽，PAMP)：preproADM的氨基酸22-41
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID NO.4(中间区域肾上腺髓质素原，MR-proADM)：preproADM的氨基酸45-92
ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARI RV
SEQ ID NO.5(C端肾上腺髓质素原，CT-proADM)：preproADM的氨基酸148-185
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID NO.6：
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7：
ILPGSGST
SEQ ID NO.8：
TEGYEYDGFDY
SEQ ID NO.9：
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.10：
FQGSHIPYT。
SEQ ID NO.11(AM-VH-C)：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.12(AM-VH1)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.13(AM-VH2-E40)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.14(AM-VH3-T26-E55)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.15(AM-VH4-T26-E40-E55)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
SEQ ID NO.16(AM-VL-C)：
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.17(AM-VL1)：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.18(AM-VL2-E40)：
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.19(肾上腺髓质素的N端部分，aa 1-21)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID NO.20(肾上腺髓质素的C端部分，aa 42-52)
APRSKISPQGY-NH2
SEQ ID NO.21(肾上腺髓质素的中间区域部分，aa 21-42)
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
SEQ ID NO.22(肾上腺髓质素的中间区域部分，aa 27-39)
AHQIYQFTDK DKD
SEQ ID NO.23(大鼠肾上腺髓质素氨基酸1-50)
YRQSMNQGSRSTGCRFGTCTMQKLAHQIYQFTDKDKDGMAPRNKISPQGY-NH2
SEQ ID NO.24(肾上腺髓质素的中间区域部分，aa 21-32)
CTVQKLAHQIYQ
SEQ ID NO.25(鼠类肾上腺髓质素的N端部分，aa 1-19)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
SEQ ID NO.28:(由于3个氨基酸的长度，未在序列表中提及)
RVS
SEQ ID NO.26(HAM8101的重链)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGSTNYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.27(HAM8101的轻链)
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
附图说明
图1：双命中猪模型中的研究时间表
图2：血浆bio-ADM(A)和MR-proADM(B)：两组均显示平均值±SEM。对于bio-ADM(A)，相互作用(7h-19h，多变量时间*组)：0.003
图3：液体复苏：两组均显示平均值±SEM。
图4：去甲肾上腺素需求的频率。显示了每组在液体复苏的基础上需要去甲肾上腺素以达到目标MAP的动物所占的百分比。Chi2测试(19h):0.014。
图5：血浆MR-proADM取决于治疗的成功：显示的是三个组的平均值±SEM：HAM8101处理且需要去甲肾上腺素(休克)、HAM 8101处理且不需要去甲肾上腺素(非休克)、媒剂(均需要去甲肾上腺素)。
图6：注射20mg/kg HAM2302后3h肾上腺髓质素浓度的比较(n＝3)。处理动物的平均Ab浓度在图下方列出。
序列表
<110> 艾德里诺医药公司（AdrenoMed AG）
<120> 抗肾上腺髓质素（ADM）结合剂治疗下的疗法监测
<130> A75177WO
<150> EP17197177.3
<151> 2017-10-18
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 52
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20 25 30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35 40 45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe
1 5 10 15
Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys
20 25 30
Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met
35 40 45
Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala
50 55 60
Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg
85 90 95
Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe
100 105 110
Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
115 120 125
Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln
130 135 140
Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly
145 150 155 160
Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
180 185
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1 5 10 15
Ala Leu Ser Arg
20
<210> 4
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20 25 30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35 40 45
<210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly
20 25 30
Ser Ala Pro His Phe Leu
35
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 11
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215
<210> 13
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215
<210> 14
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215
<210> 15
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 17
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1 5 10 15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys
1 5 10 15
Asp Lys Asp Asn Val Ala
20
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
1 5 10
<210> 23
<211> 50
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Thr Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Gly Thr Cys Thr Met Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln
35 40 45
Gly Tyr
50
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1 5 10
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 25
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Gly Thr Cys
<210> 26
<211> 448
<212> PRT
<213> 人源化小鼠
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 27
<211> 219
<212> PRT
<213> 人源化小鼠
<400> 2
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (15)

1.一种用于监测受试者的疗法的方法，其中所述受试者正在用选自与SEQ ID NO.1(氨基酸1-52)结合的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体、抗体片段和/或非Ig骨架的结合剂进行治疗，所述方法包含
·测定从所述受试者获得的体液中选自以下的肾上腺髓质素原前体片段的水平：中间区域肾上腺髓质素原(MR-proADM)、C端肾上腺髓质素原(CT-proADM)和/或肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)或其片段；和
·将选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平与所述受试者的临床/医学健康状态和/或不良结果的风险和/或改变治疗措施的要求相关联，并且
·其中为了测定所述片段的水平，至少一种结合剂与分别选自SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5的氨基酸序列内的区域结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中用于所述治疗的所述结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的N端部分aa 1-21结合：
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC；SEQ ID No.19。
3.根据权利要求1至2所述的方法，其中用于所述治疗的所述结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的C端部分aa 42-52-酰胺结合：
APRSKISPQGY-NH2；SEQ ID No.20。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中用于所述治疗的所述结合剂是抗ADM抗体或抗肾上腺髓质素抗体片段或抗ADM非Ig蛋白骨架，其中所述抗体或片段或骨架与肾上腺髓质素的中间区域部分aa21-42结合：
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA；SEQ ID No.21。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述片段的水平的测定至少执行一次。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不良结果选自临床病况恶化例如器官功能恶化和死亡。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症，例如慢性或急性疾病或急性病症。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者所患的疾病可以选自：严重感染例如脑膜炎、全身性炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症；其他疾病例如糖尿病、癌症、急性和慢性血管疾病例如心力衰竭、心肌梗塞、中风、动脉粥样硬化；休克例如脓毒性休克和器官功能障碍例如肾功能障碍、肝功能障碍、烧伤、手术、创伤。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗措施选自：液体复苏、血管加压药/肌力药、肾替代疗法、抗生素、氢化可的松、胰岛素、肠内营养/肠外营养。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过免疫测定法使用选自分别与MR-proADM或其片段和/或与CT-proADM或其片段和/或与PAMP或其片段结合的结合剂的至少一种结合剂，测定具有至少5个氨基酸的选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对于所述关联来说，选自MR-proADM、CT-proADM和/或PAMP或其片段的所述肾上腺髓质素原前体片段的水平升高到高于某一阈值预示不良结果的风险增加，和/或所述肾上腺髓质素原前体片段或其片段的水平低于某一阈值预示不良结果的风险降低。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中为了关联所述肾上腺髓质素原前体片段的水平，所述片段的水平的测定至少执行两次，并且其中与所述片段的第一次测得的水平相比，所述片段的第二次测得的水平的降低预示不良结果的风险降低。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中为了关联所述肾上腺髓质素原前体片段的水平，所述片段的水平的测定至少执行两次，并且其中与所述片段的第一次测得的水平相比，所述片段的第二次测得的水平的增加预示不良结果的风险增加。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)和唾液。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，用于将所述受试者分为风险组。
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