COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR INFECCIÓN
PATÓGENA
Campo de la invención La presente invención en general se caracteriza por composiciones diagnósticas y terapéuticas y procedimientos derivados de la caracterización de la unión de polipéptido de lisozima a un polipéptido P17 de Treponema pallidum (Tp17) o a polipéptidos similares al Tp17. Además, la invención proporciona procedimientos y composiciones para incrementar o disminuir la unión entre una lisozima y un polipéptido TP-17 o de tipo TP-17. Antecedentes de la invención La sífilis es una enfermedad causada por la infección por Treponema pallidum (en lo sucesivo también denominado "Tp"). El diagnóstico de sífilis generalmente se hace mediante un ¡nmunoensayo de anticuerpos antiTp en la sangre usando, por ejemplo, la prueba de hemaglutinación de Treponema pallidum (TPHA), la prueba de absorción fluorescente de anticuerpos anti Treponema (FTA-
ABS) y/o la prueba de inmovilización de Treponema pallidum (TPI), así como el ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) y sistemas Western Blot. Estas pruebas detectan anticuerpos que reaccionan con Tp o preparaciones antigénicas de Tp, tales como los antígenos de Tp Tp15, Tp17, y Tp47, por ejemplo. La prueba TPI implica una valoración microscópica de la el punto hasta el cual los anticuerpos activadores del complemento en el suero de un paciente inhiben la motilidad de Tp. Esta prueba no se suele usar como prueba diagnóstica debido a su elevado coste. La prueba TPHA implica la aglutinación de anticuerpos del suero del paciente con los eritrocitos a los que el antígeno Tp sometido a ultrasonidos está unido. La prueba FTA-ABS implica la microscopía de inmunofluorescencia indirecta para detectar la unión de anticuerpos específicos en el suero de pacientes a Tp fijado en un soporte sólido a través de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Aunque estos ensayos se usan de forma habitual, carecen de la sensibilidad requerida para detectar infecciones en un estadio temprano o de bajo nivel, cuando los niveles de anticuerpos frente a Tp en los fluidos del organismo son muy bajos. Además, el uso habitual de antígenos de Tp individuales recombinantes o purificados en los inmunoensayos existentes para la sífilis no incluye la unión de algunos anticuerpos a complejos formados entre antígenos Tp y otros antígenos (es decir, las parejas de unión al antígeno de Tp) que normalmente están presentes en el fluido del organismo del sujeto. Por tanto, los inmunoensayos existentes no pueden detectar tales anticuerpos en ausencia de la pareja de unión al antígeno de Tp, que resulta en algunos casos en unos resultados del ensayo de baja sensibilidad o falsos negativos. En consecuencia existe una necesidad de ensayos de diagnóstico de patógenos con una sensibilidad mejorada, que detecten
anticuerpos que se unen a complejos de parejas de unión/antígeno patógeno. Sumario de la invención La invención proporciona composiciones y procedimientos para la detección y el tratamiento de una infección patógena. La invención en general se refiere al descubrimiento de que el polipéptido de Treponema pallidum, Tp17, se une a la lisozima, un péptido antimicrobiano producido por el huésped, e inhibe la actividad antímicrobiana de la lisozima. Se identificaron el sitio de unión en Tp17 para la lisozima y el sitio de unión en la lisozima para Tp17. Las comparaciones de las secuencias TP17 requeridas pata la unión y la inhibición de la lisozima con las proteínas relacionadas proporcionaron la identificación de las secuencias consenso de unión a la lisozima que se conservan entre muchos patógenos diferentes, incluidos los virus del Herpes Simples, lo que sugiere que la unión del polipéptido relacionado con TP17 a la lisozima proporciona un mecanismo general para inhibir una respuesta inmune del huésped. En consecuencia, la invención también proporciona la identificación de polipéptidos lisozima mutantes que contienen mutaciones que interfieren en o desestabilizan la unión de TP17. Tales polipéptidos o fragmentos de los mismos son útiles en la prevención o tratamiento de una infección patógena. Además, la invención proporciona ensayos diagnósticos mejorados que se basan en la detección de anticuerpos que se unen a un complejo Tp17 - lisozima. La identificación de un MOTIVO de unión a la lisozima en Tp17, así como la identificación de las secuencias consenso del MOTIVO de unión a la lisozima compartidas por otras proteínas derivadas de patógenos, también proporciona composiciones útiles y procedimientos para la detección o inhibición de la lisozima, así como la detección de patógenos específicos y la inhibición de las infecciones correspondientes además de la sífilis. Además, los polipéptidos derivados de patógenos son útiles en el diagnóstico, profilaxis y tratamiento de una serie de enfermedades, incluidas las enfermedades relacionadas con la actividad aberrante de la lisozima. Estos polipéptidos también proporcionan un marcador de afinidad útil para usar en la purificación de proteínas usando la económica cromatografía de afinidad con la lisozima. En un aspecto, la invención en general se caracteriza por un fragmento de un polipéptido similar a Tp17 que contiene al menos un motivo de unión a lisozima que contiene una secuencia de aminoácidos de Xaan Pro His Xaan (SEC ID NO:1), donde Xaa es cualquier aminoácido y n es al menos uno y el fragmento es capaz de unirse a un polipéptido de lisozima y donde el motivo no es CKPHDC (SEC ID NO:24). En una forma de realización, el fragmento es de entre aproximadamente 4 aminoácidos a aproximadamente 200 aminoácidos (p. ej., 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175) de un polipéptido similar a Tp17. En otra forma de realización, el fragmento es menor a aproximadamente 30 ó 100 aminoácidos de un polipéptido
similar a Tp17. En otra forma de realización, el fragmento es capaz de inhibir sustancialmente una actividad enzimática o una actividad antimicrobiana de la lisozima. En otra forma de realización, el motivo de unión a la lisozima contiene una secuencia aminoacídica consenso CS1 : Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaa12 Xaa13 Cys (SEC ID NO:2), donde Xaai,
Xaa2, Xaa3, Xaa , Xaas, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaan, Xaa12, o Xaa13 es cualquier aminoácido, está ausente o es un enlace peptídico. En aspectos relacionados, la invención se caracteriza por una molécula de ácido nucleico sustancialmente pura que codifica el fragmento del aspecto anterior, un vector que contiene la molécula de ácido nucleico y una célula huésped que contiene tal vector. En otro aspecto , la invención se caracteriza por un polipéptido mutante de lisozima sustancialmente puro que contiene al menos una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión entre el polipéptido mutante de lisozima y un polipéptido similar a Tp17 (p. ej., reduce la unión en un 5%, 10%, 25%, 50%, 75%,
85%, o 95% en comparación con la unión de tipo salvaje), donde el polipéptido mutante de lisozima retiene al menos un 50%, 60%, 75%, 85%, o 95% de la actividad antimicrobiana de un polipéptido de lisozima de tipo salvaje. En una forma de realización, la mutación reduce la afinidad de unión entre el polipéptido mutante de lisozima y un polipéptido similar a Tp17 en al menos un 5% en comparación con la afinidad de unión del polipéptido de lisozima de tipo salvaje. En otra forma de realización, la mutación afecta a la carga de superficie en el correspondiente polipéptido de tipo salvaje. En otras formas de realización, la mutación está en un residuo aminoacídico de carga positiva, en un residuo aminoacídico de carga negativa o en un residuo aminoacídico hidrófobo de un polipéptido de lisozima de tipo salvaje que entra en contacto con un polipéptido similar a Tp17. En otras formas de realización, la mutación es de al menos, uno, dos, tres, cuatro o más posiciones de aminoácidos seleccionados del grupo constituido por Lys19, Arg23, Lys51 , Gly 55, Asn57, Arg131 , Asn132 y Arg133 de lisozima humana o está presente en una posición correspondiente en una lisozima derivada de otra especie
(p. ej., procariota, eucariota, mamífero). En un aspecto relacionado, la invención se caracteriza por una molécula de ácido nucleico sustancialmente pura que codifica el polipéptido de la lisozima del aspecto previo, un vector que contiene la molécula de ácido nucleico y una célula huésped que contiene este vector. En otro aspecto más, la invención se caracteriza por una composición que contiene un polipéptido similar a Tp17 sustancialmente puro y un polipéptido de lisozima sustancialmente puro, donde el polipéptido similar a Tp17 no es un polipéptido Ivy. En una forma de realización, la lisozima es exógena. En una forma de realización, la composición además contiene partículas vehículo (p. ej.,
eritrocitos, partículas de agregados polipeptídicos, partículas poliméricas, partículas inorgánicas, partículas paramagnéticas y levaduras). En otro aspecto más, la invención se caracteriza por un procedimiento para detectar una respuesta inmunitaria contra un patógeno en un sujeto, El procedimiento implica (a) poner en contacto una muestra biológica del suero con una lisozima exógena y un polipéptido similar a Tp17; y (b) detectar la unión del anticuerpo al polipéptido similar a Tp17 o a un complejo polipéptido similar a Tp17- polipéptido de lisozima. En otro aspecto más, la invención se caracteriza por un procedimiento para aumentar la sensibilidad de un ensayo diagnóstico para detectar la respuesta inmunitaria contra un patógeno. El procedimiento implica añadir un polipéptido de lisozima al ensayo diagnóstico (p. ej., un ensayo de aglutinación), donde la adición del polipéptido de lisozima incrementa la sensibilidad del ensayo en al menos un 5%. En varias formas de realización de los aspectos anteriores, el polipéptido de lisozima se pone en contacto con el polipéptido similar a Tp17 antes, durante o después del contacto de la muestra biológica. En otras formas de realización, el ensayo es un inmunoensayo (p. ej., ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western blot, ensayo de inmunoaglutinación, radioinmunoensayo, ensayos turbídimétricos, ensayo nefelométrico, ensayo inmunocromatográfico, ensayo quimioluminiscente y ensayo de fluorescencia. En otras formas de realización, la muestra biológica se selecciona del grupo constituido por sangre, suero, plasma, lagrimas, saliva, esputo, fluido nasal, diluido ótico, fluido genital, fluido mamario, leche, calostro, fluido de la placenta, perspiración, fluido sinovial, fluido ascítico, fluido gastrointestinal, exudado, transudado, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido amniótico, fluido cefalorraquídeo, bilis, fluido gástrico, semen, materia fecal, fluido de las vías respiratorias superiores, fluido peritoneal, fluido recogido desde un punto de inflamación, fluido recogido desde un punto de acumulación, lavado bronquial, orina, materia de biopsia, humor acuoso, materia del estómago anterior en los rumiantes, muestras de células nucleadas, cualquier fluido asociado con una superficie mucosa, pelo y piel. En una forma de realización preferida, el procedimiento se usa para diagnosticar sífilis. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una composición para detectar un patógeno en una muestra, en la que la composición contiene un fragmento polipeptídico de lisozima que contiene la secuencia de aminoácidos Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln lie Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa (SEC ID NO:28), donde Xaa es un aminoácido o está ausente, donde el fragmento es capaz de unirse a un polipéptido similar a Tp17. En otro aspecto más, la invención se caracteriza por un procedimiento para detectar o identificar un patógeno o un polipéptido de un patógeno. , El procedimiento implica (a) poner en contacto una muestra con un fragmento polipeptídico de lisozima que contiene la secuencia de aminoácidos: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa
Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln lie Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa (SEC
ID NO:28), donde Xaa es cualquier aminoácido o está ausente, en condiciones que permitan la unión; y (2) detectar la unión del polipéptido de lisozima a un polipéptido en la muestra, donde la unión indica la presencia de un patógeno o un polipéptido de patógeno en la muestra. En otra forma de realización, la invención además implica la determinación de la secuencia del polipéptido unido al polipéptido de la lisozima. En algunas formas de realización, el polipéptido de lisozima contiene una secuencia derivada de un polipéptido de lisozima humana. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para detectar lisozima en una muestra, el procedimiento implica (a) poner en contacto la muestra con polipéptido similar a Tp17 unido a un soporte sólido; y (b) detectar la unión del polipéptido a un polipéptido en la muestra, donde la unión indica la presencia de lisozima en la muestra (p. ej., un fluido biológico, un cultivo celular, una muestra corporal, una muestra de agua, una muestra de fluido, un alimento, una medicina o un cultivo de patógenos). En una forma de realización, el procedimiento además implica la obtención de la lisozima de la muestra mediante la unión. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un equipo para detectar una respuesta inmunitaria a un patógeno que contiene un polipéptido similar a Tp17 y un polipéptido de lisozima. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un equipo para detectar una un patógeno en una muestra que contiene un polipéptido de lisozima marcado que contiene la SEC ID N° 28. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un polipéptido de fusión que contiene al menos un motivo de unión de lisozima a un fragmento de un polipéptido similar a Tp17equipo condensado con una segunda secuencia de aminoácidos con
ru
la que no está unida de forma natural. En una forma de realización, el polipéptido de fusión se fija a un soporte sólido. En otra forma de realización el motivo está en el extremo del polipéptido de fusión. En otra forma de realización, el polipéptido de fusión es capaz de reducir la actividad antimicrobiana de una lisozima. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para asilar un polipéptido de fusión, en el que el procedimiento contiene las etapas de : (1) proporciona el polipéptido de fusión del aspecto anterior; (b) poner en contacto el polipéptido de fusión con un polipéptido de lisozima, en el que la lísozima se fija a un soporte sólido, en condiciones que permitan la unión del polipéptido de fusión al polipéptido de lisozima; y (c) fluir el polipéptido de fusión del polipéptido de lisozima. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para identificar un compuesto candidato que incrementa la actividad antímicrobiana de la lisozima. El procedimiento implica detectar una reducción en la unión entre un polipéptido de lisozima y un polipéptido que contenga un motivo de unión a lisozima en presencia del compuesto candidato. En una forma de realización, el compuesto candidato reduce la afinidad de unión de un motivo de unión a lisozima a un ácido glutámico catalítico que corresponde a Glu53 de la lisozima humana. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para identificar un polipéptido mutante de lisozima que tenga una actividad antimicrobiana aumentada. El procedimiento implica (a) proporcionar un polipéptido de lisozima que contiene al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos del polipéptido respecto a la secuencia de la lisozima de tipo salvaje; y (b) detectar una reducción en la afinidad de unión entre el polipéptido mutante de lisozima y un polipéptido similar a Tp17. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para tratar o prevenir una infección patógena en un sujeto que lo necesite. El procedimiento implica administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido mutante de lisozima que contiene una mutación aminoacídica, donde la mutación reduce la afinidad de unión entre el polipéptido de lisozima y un polipéptido similar a Tp17. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para tratar o prevenir una infección patógena en un sujeto que lo necesite. El procedimiento implica administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido similar a Tp17 mutante que contiene una mutación aminoacídica, donde la administración del polipéptido similar a Tp17 mutante reduce la unión entre un patógeno que expresa el polipéptido similar a Tp17 y un polipéptido de lisozima endógena. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una vacuna que incrementa una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite, en la que la composición contiene al menos una de las glicoproteínas gJ y GD del virus del Herpes Simples- 2. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una vacuna que incrementa
una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite, en la que la composición contiene un polipéptído de unión a lisozima. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una vacuna que incrementa una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite, en la que la composición contiene un polipéptido de lisozima y un polipéptido que contiene un motivo de unión a lisozima. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para diagnosticar una infección por el virus del Herpes Simplex de tipo 2 en un sujeto. El procedimiento implica detectar la presencia de un motivo de unión a la lisozima proteína gJ en una muestra del sujeto. En una forma de realización, el motivo de unión a la lisozima se detecta en un ensayo de unión a lisozima. En otra forma de realización, el motivo de unión a la lisozima se detecta en un inmunoensayo. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para reducir la actividad enzimática de la lisozima en una muestra. El procedimiento implica poner en contacto una muestra con un polipéptido similar a Tp17 en las condiciones que permitan la unión del polipéptido a la lisozima, donde el polipéptido similar a Tp17 no contiene una proteína Ivy. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para reducir la actividad enzimática de la lisozima en un sujeto. El procedimiento implica administrar al sujeto una cantidad eficaz del polipéptido similar a Tp17 o un fragmento del mismo. En varias formas de realización de los aspectos anteriores, el polipéptido es la glicoproteína J del virus del Herpes Simplex tipo 2. En otras formas de realización de los aspectos anteriores, el procedimiento se usa para tratar o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo constituido por cáncer, enfermedad de
Alzheimer, amiloidosis renal, leucemia, enfermedad de Crohn y alergias. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un fragmento de un polipéptido similar a Tp17 sustancialmente puro que contiene al menos un motivo de unión a lisozima que contiene una secuencia de aminoácidos Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 His Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaaι0 Xaan Xaa12 Xaa13 Cys (SEC ID
NO: 175), donde Xaa es cualquier aminoácido o está ausente y el fragmento es capaz de unirse a un polipéptido de lisozima. En una forma de realización, el fragmento deriva de Porphyromonas gingivalis o Helicobacter pylori. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un fragmento de un polipéptido similar a APP sustancialmente puro que contiene al menos un motivo de unión a lisozima que contiene una secuencia de aminoácidos Cys Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaa12 Xaa13 Cys, donde Xaa!, Xaa2 , Xaa3 , Xaa4 y Xaa5 son cualquier aminoácido o está ausente, Xaa6 es aminoácido K, R o H, Xaa7 es A o G, Xaa8 es K, R, o H, Xaa9 y Xaaio son aminoácidos o están ausentes, Xaa! i es aminoácido K o R, Xaa12 es cualquier aminoácido o está
ausente, y Xaa 3 es aminoácido E, D, Q o N (SEC ID NO:177). En otra forma de realización, el polipéptido similar a APP es la proteína precursora β-amiloide. En otra forma de realización, el fragmento es sustancialmente un fragmento de una la proteína precursora β-amiloide. En aspectos relacionados la invención se caracteriza por ácidos nucleicos que codifican los fragmentos del aspecto anterior, vectores que contienen los ácidos nucleicos y células huésped que contienen tales vectores. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una composición que contiene un polipéptido similar a APP y un polipéptido de lisozima sustancialmente puro. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto. El procedimiento implica detectar la presencia en una muestra biológica (muestra se duermo muestra de fluido cefalorraquídeo o una muestra de tejido) del sujeto de un complejo entre un polipéptido similar a la APP y un polipéptido de lisozima. En una forma de realización, el procedimiento implica un inmunoensayo. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de la presencia de un anticuerpo que se une a un complejo entre un polipéptido similar a la APP y un polipéptido de lisozima. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para identificar un compuesto candidato que modula la unión entre el polípéptido similar a la APP y un polipéptido de lisozima. El procedimiento implica la detección de una reducción de la unión entre el polipéptido similar al Tp17 y el polipéptido de lisozima en presencia del compuesto candidato. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un polipéptido similar al Tp17 que contiene al menos un motivo de unión a lisozima que tiene una secuencia de aminoácidos de Xaan Pro His Xaan (SEC ID NO:1), donde Xaa es cualquier aminoácido y n es al menos uno y el fragmento es capaz de unirse a SLLP1. En una forma de realización, el fragmento es de entre aproximadamente 4 aminoácidos a aproximadamente 200 aminoácidos de un polipéptido similar a Tp17. En una forma de realización, el motivo contiene la secuencia aminoacídica consenso CS1 : Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa^ Xaa12 Xaa13 Cys (SEC ID NO:2), donde Xaa!, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaan, Xaa12, o Xaa13 es cualquier aminoácido, está ausente o es un enlace peptídico. En aspectos relacionados la invención se caracteriza por una molécula de ácido nucleico que codifica el fragmento del aspecto anterior, un vector que contiene la molécula de ácido nucleico y una célula huésped que contiene tal vector.
En otro aspecto, la invención se caracteriza por un polipéptido mutante SLLP1 sustancialmente puro que contiene al menos una mutación de aminoácido que reduce la unión entre el polipéptido mutante de SLLP1 y un polipéptido similar a Tp-17 respecto a un polipéptido SLLP1 de tipo salvaje. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un polipéptido mutante
SLLP1 sustancialmente puro que contiene al menos una mutación de aminoácido que aumente la actividad enzimática del polipéptido mutante de SLLP1 respecto a un polipéptido SLLP1 de tipo salvaje. En una forma de realización, la actividad enzimática incluye una actividad antimicrobiana. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para modular la fertilidad en un sujeto que lo necesita. El procedimiento implica administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido mutante de SLLP1 que contiene al menos una mutación aminoacídica, donde la administración del polipéptido mutante de SLLP1 altera la unión entre un polipéptido similar a Tp17 y un polipéptido SLLP1 endógeno, de forma que se modula la fertilidad del sujeto. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para modular la fertilidad en un sujeto que lo necesita. El procedimiento implica administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido similar a TP17, donde la administración del polipéptido similar a Tp17 reduce la unión entre el polipéptido
SLLP1 endógeno y un receptor conocido en la superficie de un ovocito, de forma que se modula la fertilidad del sujeto. En otro aspecto más, la invención se caracteriza por un procedimiento para identificar un compuesto candidato que modula la fertilidad humana. El procedimiento implica la detección de una reducción en la unión entre un polipéptido SLLP1 y un polipéptido que contiene un motivo de unión a lisozima en presencia del compuesto candidato. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para tratar o prevenir una infección patógena de transmisión sexual en un sujeto. El procedimiento implica administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido mutante de SLLP1 que contiene al menos una mutación aminoacídica, donde la mutación reduce la unión entre un polipéptido de SLLP1 endógeno y un polipéptido similar a Tp17 expresado en un patógeno. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para tratar o prevenir una infección patógena de transmisión sexual en un sujeto. El procedimiento implica administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido similar a Tp17, donde la administración del polipéptido similar a Tp17 reduce la unión entre un polipéptido similar a Tp17 expresado en un patógeno y un polipéptido SLLP1 endógeno. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para
identificar un compuesto candidato útil para el tratamiento o la prevención de una infección patógena de transmisión sexual. El procedimiento implica (a) poner en contacto un polipéptido SLLP1 y un polipéptido similar a Tp17 con un compuesto candidato; y (b) detectar una reducción en la afinidad de unión entre el polipéptido de lisozima y el polipéptido similar a Tp17 expresado en el patógeno en presencia del compuesto candidato En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para reducir la unión de SLLP1 a un polipéptido similar a Tp17 expresado en el patógeno de y transmisión sexual en un sujeto. El procedimiento implica administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido similar a Tp17 o de un polipéptido de lisozima, o un fragmento de los mismos. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una composición anticonceptiva que contiene un polipéptido similar a Tp17 que interfiere en la unión de SLLP1 durante un proceso de fertilización. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una composición farmacéutica para prevenir o tratar una infección patógena de transmisión sexual, en la que la composición contiene un polipéptido similar a Tp17 que interfiere en la unión de SLLP1 durante un proceso de infección. En otro aspecto, la invención se caracteriza por una composición farmacéutica para usar como antimicrobiano que contiene al menos una cantidad eficaz de lisozima del bacteriófago T4 y papaína o bacitracina. En una forma de realización, la composición farmacéutica del aspecto anterior, donde la composición contienen una lisozima del bacteriófago T4, papaína y bacitracina. En una forma de realización, la cantidad de lisozima T4 presente en una dosis unitaria está entre 2 mg y 100 mg (p. ej., 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o 90). Preferentemente, la cantidad de lisozima T4 presente en una dosis unitaria es de 5 mg. En otra forma de realización, la cantidad de papaína presente en una dosis unitaria es de 2 mg. La cantidad de bacitracina presente es de 3 mg por dosis unitaria. En otra forma de realización, la composición es una formulación oral (p. ej., un comprimido oral). En otro aspecto, la invención se caracteriza por un procedimiento para tratar una infección patógena en un sujeto, que implica administrar a un sujeto diagnosticado de una infección patógena una composición farmacéutica que contiene la lisozima del bacteriófago T4 y papaína y bacitracina. En una forma de realización, la composición farmacéutica contiene la lisozima del bacteriófago T4 y papaína y bacitracina. En otra forma de realización, la composición farmacéutica está en forma de formulación oral. En varias formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido similar a Tp17 deriva de un patógeno seleccionado del grupo constituido por una bacteria, un virus, un parásito, un plásmido, un prión, un micoplasma y un agente micótico.
En otras formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el patógeno es Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia pestis, Shigella flexnerii, Treponema denticola, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahemolyticus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Helicobacter hepaticus, Helicobacter pylori, Salmonella typhímurium, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae, Pasteurella multocida, Brucella melitensis, Brucella suis, Porphyromonas gingivalis, coronavirus causante del síndrome repsoratorio agudo grave (SARS) , Virus sincitial respiratorio, el virus de la Hepatitis A, el virus de la Hepatitis B, el virus de la Hepatitis C, el virus de la rubéola, Toxoplasma gondii, Trypanozoma spp., Gardnerella vaginalis, Mycobacterium avium, Mycobacterium leprae, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Campylobacter jejuni, Helicobacter spp., Agrobacterium tumefaciens, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyii, Propionibacterium acnés, Listeria monocytogenes.el virus del Herpes Simples tipo 2, Influenza virus, virus TACARIBE, virus de la lengia azul, Bacteroides thetaiotaomicron, Coxiella burnetti, Legionella pneumophila,
Salmonella typhi, citomegalovirus de Chimpancé, citomegalovirus humano, papilloma virus humano, el virus del Dengue, virus de la enfermedad pie boca, virus del oeste del Nilo, virus de la gripe aviar, virus de la inmunodeficiencia humana, LdMNPV, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Emeiria tenella, Eimeria acervulina, Giardia lamblia, Plasmodium yoelii y patógenos transportados por Anopheles gambiae. En otras formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el patógeno es Treponema denticola, Bacteroides thetaiotaomicron, Coxiella burnetti, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Legionella pneumophila, Staphylococcus, aureus, y Salmonella typhi, Neisseria meningitidis serogrupo A y serogrupo B, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Haemophilus ducreyi, y Bordetella pertussis. Preferiblemente el patógeno es Treponema pallidum. En otras formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el motivo contiene la secuencia consenso aminoacídica CS2: Xaa1 Xaa2 Pro His Xaa3 Xaa4, (SEC ID NO:3), donde Xaa1 es Cys, Lys, Val, Ala, o está ausente; Xaa2 es Ala, Cys, o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, o Glu, y Xaa4 es Cys, Gly, o Lys. En otras formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido similar a Tp17 contiene la secuencia Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaa 2 Xaa13 Cys (SEC ID NO:2), donde Xaa^ Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaan, Xaaι2, o Xaa13 es cualquier
aminoácido o está ausente. En otras formas de realización más de cualquiera de los aspectos anteriores, el motivo contiene una secuencia consenso aminoacídica CS3: Xaa Cys Pro His Ala Gly (SEC ID NO:25), donde Xaa es Cys or Val. En otras formas de realización más de cualquiera de los aspectos anteriores, el motivo se selecciona del grupo constituido por CCPHAG (SEC ID NO:4), VCPHAG (SEC ID
NO:5), VAPHDC (SEC ID NO:6), KAPHDK (SEC ID NO:7), VKPHDG (SEC ID NO:8); KKPHAK (SEC ID NO:9), KAPHEK (SEC ID NO:10), KKPHAC (SEC ID NO:11), VAPHAG (SEC ID NO:12), VKPHAK (SEC ID NO:13), VKPHAC (SEC ID NO:14), VAPHEG (SEC ID NO:15), VKPHEK (SEC ID NO:16), VCPHEK (SEC ID NO:17), CKPHAG (SEC ID NO:18), ACPHAG (SEC ID NO:19) o KCPHDC (SEC ID
NO:20), VKPHDK (SEC ID NO:21), KKPHAG (SEC ID NO:22), y CAPHEK (SEC ID NO:23). En varias formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido de lisozima contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln lie Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa (SEC ID NO:28), donde Xaa es cualquier aminoácido o está ausente. En otras formas de realización de cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido similar a Tp17 o el polipéptido de lisozima, o un fragmento del mismo, se aisla de una muestra biológica, es un polipéptido recombinante, se fusiona con un marcador de afinidad, se fija a un soporte sólido (p. ej., una resina, un gel, una perla, un pocilio, una columna, una placa, una membrana, una matriz, una placa, un dispositivo para filtros), deriva de un polipéptido humano, está marcado para su detección (p. ej., marcado con un fluoróforo, una proteína fluorescente, un cromóforo, un resto radiactivo, un resto luminífero y un marcador enzímáticamente activo). En otras formas de realización más, el polipéptido de lisozima y el polipéptido similar a Tp17 están presentes en una proporción molecular de entre aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1.000.00.
La invención proporciona composiciones para detectar anticuerpos antipatógeno que comprenden (a) un polipéptido similar a Tp17 sustancialmente puro y (b) una lisozima exógena sustancialmente pura. La invención es operativa al margen de la fuente de los péptidos importantes. Por ejemplo, el polipéptido similar a Tp17 y/o la lisozima pueden purificarse a partir de un fluido del organismo o de
otra fuente natural u obtenerse en una forma sustancialmente pura de otros componentes celulares o de fluidos corporales. También pueden usarse polipéptidos recombinantes similares aTp-17 y/o lisozima. La composición puede además comprender partículas transportadoras, tales como, por ejemplo, eritrocitos, partículas proteicas agregadas, partículas poliméricas, partículas inorgánicas, partículas paramagnéticas y células de levaduras. Cualquier péptido similar a Tp17 puede usarse en la invención. Hay un número de especies preferidas, por ejemplo, un polipéptido similar a Tp17 preferido comprende la secuencia aminoacídica consenso de Xaan Pro His Xaan (SEC ID N°:1), en la que Xaa es cualquier aminoácido y n es al menos uno. Otra secuencia preferida comprende la secuencia aminoacídica consenso CS1 : Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa Xaa12 Xaa13 Cys (SEC ID N°:2), en la que Xaa!, Xaa2, Xaa3, Xaa , Xaa5, Xaa6, Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaan, Xaa12, o Xaai3 es cualquier aminoácido, está ausente, o es un enlace peptídico. En una forma de realización preferida, Xaa1 es Lys, Gly, lie, Arg, Leu, Ala, Ser, Thr,
Gln, Asn, Phe, o está ausente; Xaa2 es Thr, His, Cys, Gln, Asn, lie, Ser, Leu, o está ausente; Xaa3 es His, Lys, o está ausente; Xaa4 es Asn, Gly, Tyr, Leu, Ala, Cys, Glu, Thr, Arg, Met, Pro, lie, Val, Phe, His, Gln, Lys, o está ausente; Xaa5 es His, Arg, Asn, Leu, Ser, Lys, Glu, Gly, Pro, lie, Thr, Cys, Trp, Val, Gln, Phe, Ala, Asp, o está ausente; Xaa6 es Val, Cys, Ala, Asp, Ser, Pro, Gly, Glu, Lys, Leu, Gln, He, Tyr,
Arg, Asn, Met, o está ausente; Xaa7 es Asp, Glu, Ala, His, Val, Met, Pro, Lys, Arg, Cys, Asn, Gln, Phe, Leu, Ser, o está ausente; Xaa8 es Gly, Asn, Ala, lie, Arg, Glu, Lys, Thr, Tyr, Pro, Asp, Leu, Ser, o está ausente; Xaa9 es Leu, Arg, Phe, lie, Ala, Pro, Asn, Gln, Lys, o está ausente; Xaa10 es Val, Thr, Asp, Glu, Tyr, Arg, Ala, Trp, o está ausente; Xaa es Pro, Asp, Lys, Asn, Gly, Thr, lie, o está ausente; Xaa12 es lie, Val, Gly, Asp, Asn, Leu, o está ausente; y Xaa13 es Asp, Glu, Cys, Thr, o está ausente. Generalmente, los péptidos similares a Tp17 también se identifican por su capacidad para unirse a un anticuerpo frente al polipétido similar a Tp17. El polipétido similar a Tp17 comprende la secuencia aminoacídica consenso CS2: Xaa! Xaa2 Pro His Xaa3 Xaa , (SEC ID N°:3) en la que Xaa! es Cys,
Lys, Val, Ala, o está ausente; Xaa2 es Ala, Cys, o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, o Glu, y Xaa4 es Cys, Gly, o Lys. Los polipéptidos similares a Tp17 preferidos comprenden la secuencia de aminoácidos CCPHAG (SEC ID N°:4), VCPHAG (SEC ID N°:5), VAPHDC (SEC ID N°:6), KAPHDK (SEC ID N°:7), VKPHDG (SEC ID N°:8); KKPHAK (SEC ID N°:9), KAPHEK (SEC ID N°:10), KKPHAC (SEC ID N°:11), VAPHAG (SEC ID N°:12), VKPHAK (SEC ID N°:13), VKPHAC (SEC ID N°:14), VAPHEG (SEC ID N°:15), VKPHEK (SEC ID N°:16), VCPHEK (SEC ID N°:17), CKPHAG (SEC ID N°:18), ACPHAG (SEC ID N°:19) o KCPHDC (SEC ID N°:20), VKPHDK (SEC ID N°:21), KKPHAG (SEC ID N°:22), o CAPHEK (SEC ID N°:23). Preferiblemente, el polipéptido similar a Tp17 comprende la proteína P17 de
Treponema pallidum o la glucoproteína J del Virus del Herpes Simple Tipo 2. En una forma de realización, el polipéptido no comprende la proteína Ivy. En otra forma de realización, el polipéptido no comprende CKPHDC (SEC ID N°:24). En una forma de realización, el polipéptido similar a Tp17 comprende la secuencia consenso CS3: Xaa Cys Pro His Ala Gly (SEC ID N°:25), en la que Xaa es Cys o Val. Las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para identificar y/o cuantificar anticuerpos frente a patógenos tales como, por ejemplo, Treponema pallidum, Escherichia coli (por ejemplo, E. coli O157:H7 y E. coli K1), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia pestis, Shigella flexnerii,
Treponema denticola, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahemolyticus, Chlamydia pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Helicobacter hepaticus, Salmonella typhimurium, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestrís, Pseudomonas syringae, Pasteurella multocida, Brucella melitensis, Brucella suis, Mycobacterium tuberculosis, Campylobacter jejuni, Helicobacter spp., Agrobacterium tumefaciens, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis, Neisser/a gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyii, Propionobacteríum acnés, Listeria monocytogenes, virus de Herpes Simple tipo 2, virus de Influenza, virus TACARIBE , virus Bluetongue, citomegalovirus de Chimpancé, citomegalovirus humano, virus del papiloma humano, virus del Dengue, enfermedad de pie y boca, virus de inmunodeficiencia humano, LdMNPV, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Emeiria tenella, Eimeria acervulina, Giardia lamblia, Plasmodium yoelii, y patógenos portados por Anopheles gambiae. En otra forma de realización, se detectan patógenos tales como Mycobacterium paratuberculosis, virus de Ébola, virus de la fiebre de Rift Valley, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (SDRA), virus de la viruela, Bacillus anthracis, Leishmania Spp., micoplasma, rickettsia, hongos y levaduras. En otra forma de realización, la invención proporciona composiciones para detectar anticuerpos antipatógeno en una muestra, que comprenden (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de TAPHRGLATLYNGDC (SEC ID N°:26) o CSPEVGQMDC (SEC ID N°:27) y (b) una lisozima exógena En una forma de realización, la lisozima comprende una secuencia de aminoácidos de: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln lie Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa (SEC ID N°:28), En la que Xaa es cualquier aminoácido, está ausente o es un enlace peptídico. En una forma de realización preferida, la lisozima es lisozima humana. En otra forma de realización, la lisozima no se une al péptidoglucano. En otra forma más de realización, la lisozima no inhibe los polipéptidos similares a Tp17. En todavía otra forma de realización, la lisozima no se ve inhibida por los polipéptidos similares a TP17. En una forma de realización concreta, el polipéptido similar a Tp17 está presente en un intervalo de concentración de alrededor de 1 femtogramo/ml a alrededor de 999 miligramos/ml. Más preferiblemente, el polipétido similar a Tp17 está presente en un intervalo de concentración de alrededor de 1 ng/ml a alrededor de 999 microgramos/ml. En una forma de realización concreta, la lisozima exógena está presente en un intervalo de concentración de alrededor de 1 femtogramo/ml a alrededor de 999 miligramos/ml. Más preferiblemente, la lisozima está presente en un intervalo de concentración de alrededor de 1 nanogramo/ml a alrededor de 999 microgramos/ml. En una forma de realización, la lisozima (A) y los polipéptidos similares a
Tp17 (B) están presentes en una proporción molar (A/B) de entre alrededor de
0,001 y alrededor de 1.000.000. En una forma de realización preferida, la lisozima
(A) y los polipéptidos similares a Tp17 (B) están presentes en una proporción molar (A/B) de entre alrededor de 0,01 y alrededor de 1.000.000. En otra forma de realización, la lisozima (A) y los polipéptidos similares a Tp17 (B) están presentes en una proporción molar (A/B) de entre alrededor de 0,1 y alrededor de 1.000.000.
Más preferiblemente, la lisozima (A) y los polipéptidos similares a Tp17 (B) están presentes en una proporción molar (A/B) de entre alrededor de 1 y alrededor de 1000, entre alrededor de 10 y alrededor de 1000, o entre alrededor de 100 y alrededor de 1000. Los péptidos usados en la invención se aislan de una fuente natural o son recombinantes. Pueden fusionarse con un marcador de afinidad, tal como, por ejemplo, glutatión S-transferasa (GST), una cola de 6-histidina (HIS), proteína de unión a maltosa, péptido similar a elastina (Meyer (2002) Protein Purification by
Inverse Transition Cycling. En Protein Protein Interactions: a molecular cloning manual. GOLEMIS (Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) o Strep- Tag (IBA, Goettingen, Alemania). Los polipéptidos similares a Tp17 o las lisozimas pueden estar fijadas a un soporte sólido tal como resina, perlas, pocilios, cápsula, columna, gel, membrana o dispositivo de filtros.
La invención proporciona procedimientos para detectar anticuerpos antipatógeno en una muestra que comprende las etapas de (a) poner en contacto una muestra con un polipéptido similar a Tp17 en las condiciones que permitan la unión de un anticuerpo al polipéptido, (b) poner en contacto una muestra con una lisozima exógena en las condiciones que permitan la unión de un anticuerpo a la lisozima; y (c) detectar la unión, si existe, de los anticuerpos antipatógeno a (i) el polipéptido solo; (ii) la lisozima sola; y (iii) el polípéptido y la lisozima (por ejemplo, un complejo). Los procedimientos de la invención son capaces de medir los anticuerpos antilisozima en la muestra. Los procedimientos de la invención aumentan la sensibilidad de los ensayos de aglutinación para detectar anticuerpos antipatógeno, tales como un ensayo de hemoaglutinación. Por ejemplo, una muestra se pone en contacto con lisozima exógena en un intervalo de concentración de alrededor de 1 femtogramo/ml a alrededor de 999 miligramos/ml y más preferiblemente de alrededor de 100 nanogramos/ml a alrededor de 100 microgramos/ml, en la que la adición de lisozima aumenta la aglutinación relativa a la aglutinación en ausencia de lisozima. Un polipéptido similar a Tp17 y una lisozima puede combinarse antes del contacto con la muestra. Pueden usarse inmunoensayos, tal como inmunoensayos sandwich, ensayos de ¡nmunoabsorbencia ligado a enzimas, Western blot, ensayo de inmunoaglutinación, ensayo de hemoaglutinación, inmunoensayo competitivo, radioinmunoensayo, ensayo de turbidometría, ensayo nefelométrico, ensayo inmunocromatográfico, ensayo de fluorescencia y ensayo de quimioluminiscencia. Entre las muestras que se someten a los ensayos de la invención se incluyen muestras biológicas, tales como, por ejemplo, sangre, suero, plasma, lágrimas, saliva, fluido nasal, esputos, fluido ótico, flujo genital, fluido de las mamas, leche, calostro, líquido placentario, líquido amniótico, sudor, líquido sinovial, líquido ascítico, líquido cefalorraquídeo, bilis, fluido gástrico, fluido gastrointestinal, exudado, transudado, líquido pleural, líquido pericárdico, semen, material fecal, fluido de las vías aéreas superiores, líquido peritoneal, líquido recogido de un sitio con inflamación, líquido recogido de un sitio de acumulación, lavado bronquial, humor acuoso, humor vitreo, orina, material de biopsia, material del estómago anterior o del rumen de un animal rumiante, muestras de células nucleadas, líquido asociado con una superficie mucosa, pelo o piel. Los procedimientos de la invención se usan para diagnosticar enfermedades tales como, por ejemplo, sífilis, infección por VIH, herpes genital, peste bubónica, disentería, shigellosis, caries dental , infección por E. coli, fibrosis quística, tuberculosis, cólera, infecciones por estreptococos del grupo A o del grupo B, infecciones por estafilococos, úlcera gástrica, tos ferina, infecciones por enterococos, clamidiosis, brucellosis, otitis media, otitis interna, meningitis, gripe, paludismo, infecciones por los virus de la Hepatitis B y Hepatitis C. En otra forma de
realización, los procedimientos de la invención se usan para diagnosticar salmonelosis, gonorrea, vibriosis, colibacilosis, neumonía, bronquitis, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (SDRA), y enfermedades de depósito citoplasmático, tales como enfermedades de depósito de lísosomas. La invención también proporciona procedimientos para detectar lisozima en una muestra poniendo en contacto la muestra con un polipéptido similar a Tp17 y detectando la unión del polipéptido similar a Tp17 a la lisozima. La actividad antimicrobiana de la lisozima se reduce poniendo en contacto una muestra con un polipéptido similar a Tp17 en condiciones que permitan la unión del polipéptido similar a Tp17 a la lisozima. La muestra puede ser una preparación de patógenos, tal como, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un plásmido, un micoplasma, un agente micótico (por ejemplo, hongos y levaduras) y una preparación de priones. La muestra también puede ser un material que necesita estar libre de con aminación de lisozima, tal como una muestra biológica (por ejemplo, aspirado de garganta, hemocultivo, líquido cefalorraquídeo), un vaso de cultivo, un cultivo celular, una cubeta, aparatos de diagnóstico clínico o material del ensayo, instrumentación médica, líquidos, agua, alimentos, medicinas, implantes o injertos. Los procedimientos de la invención también pueden usarse para reducir la actividad microbiana en un sujeto (p. ej., un animal, tal como un ser humano) mediante la administración al sujeto de una cantidad eficaz de un polipéptido similar a Tp17. Los procedimientos se usan para tratar o prevenir enfermedades tal como cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad inflamatoria, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis renal, leucemia, enfermedad de Crohn y alergia, que se asocian con un aumento de la actividad de la lisozima por encima de los niveles normales. En otro aspecto, la invención proporciona composiciones para detectar un patógeno en una muestras, que comprenden un ligando o una pareja de unión capaz de unirse a un polipéptido similar a Tp17. En una forma de realización, el ligando comprende un polipéptido lisozima, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento Fab, o aptámeros de ADN o ARN, por ejemplo.
En una forma de realización, el ligando comprende una molécula de detección. En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para detectar un patógeno en una muestra (1) poniendo en contacto una muestra con un ligando (por ejemplo un polipéptido lisozima) capaz de unirse a un polipéptido similar a Tp17 en las condiciones que permitan la unión del ligando a un patógeno o a un polipéptido patógeno; y (2) detectando la unión del ligando al patógeno o al polipéptido patógeno, si existe, en la que tal unión es indicativa de la presencia del patógeno o del polipéptido patógeno en la muestra. En una forma de realización, el ligando se marca con una molécula de detección, tal como un fluoróforo, una proteína fluorescente, un cromóforo, una fracción radioactiva, una fracción
luminífera o un indicador enzimáticamente activo. En otro aspecto, la invención proporciona un equipo que comprende un polipéptido similar a Tp17 y un ligando capaz de unirse al polipéptido similar a
Tp17. En una forma de realización, el ligando se fija a un soporte sólido tal como resina, perlas, pocilios, cápsula, columna, gel, membrana o un dispositivo de filtros.
En una forma de realización preferida, el ligando es un polipéptido de lisozima. En otro aspecto, la invención proporciona proteínas recombinantes de fusión que comprenden un polipéptido similar a Tp17 unido a un polipéptido de interés. En una forma de realización, el polipéptido similar a Tp17 está en el extremo N o C del polipéptido de interés. En otra forma de realización, el polipéptido similar a Tp17 está entre el extremo N o C del polipéptido de interés. En una forma de realización, la proteína recombinante es capaz de reducir la actividad de la lisozima. Además, la invención proporciona procedimientos para preparar las proteínas recombinantes de fusión mediante la unión del polipéptido similar a Tp17 al polipéptido de interés. Todavía más, la invención proporciona procedimientos para usar las proteínas de fusión recombinantes para purificar con afinidad un polipéptido de interés (1) poniendo en contacto una muestra que comprende un polipéptido recombinante de fusión con lisozima en condiciones que permitan la unión del polipéptido a la lisozima; (2) lavando la muestra; y (4) eluyendo el polipéptido recombinante de fusión de la lisozima. En una forma de realización, el procedimiento comprende aislar el polipéptido de interés del polipéptido similar a Tp17. En una forma de realización, la lisozima está unida a un soporte sólido.
En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con una infección patógena mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de una lisozima que es resistente a la inhibición por un polipéptido similar a Tp17.
En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar o prevenir una enfermedad asociada con una infección patogénica mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de un reactivo que inhibe la unión de un polipéptido similar a Tp-17 a un polipéptido de lisozima. En una forma de realización, el reactivo inhibe la unión de un polipéptido similar a Tp-17 al ácido glutámico 53 de la lisozima humana o de pollo o a los correspondientes residuos de aminoácidos en otras especies (los números representan la longitud total de la secuencia de la lisozima humana depositada bajo el número de referencia P00695NP_000230). En otra forma de realización, el reactivo es un péptido, un fármaco químico, un anticuerpo, un ácido nucleico, PNA, ARN de pequeño interferencia o bacteriófago, un aptámero de ADN o un aptámero de ARN. En otra forma de realización, el reactivo es un ligando de lisozima. La invención también proporciona tratamientos o vacunas que comprenden al menos una de las glucoproteínas gJ y gD del virus del Herpes Simple -2. LA
invención también proporciona vacunas que comprenden (a) un ligando de lisozima y/o (b) una lisozima. Por "polipéptido similar a Tp-17" se quiere decir una secuencia de aminoácido, o fragmento de la misma, que comprende la secuencia consenso Xaan Pro His Xaan y que tiene la capacidad de unirse a un polipéptido de lisozima o de inhibir una actividad biológica de la lisozima. En las figuras 1 y 2 se proporcionan ejemplos de polipéptidos similares a Tp-17. Entre los polipéptidos similares a Tp-17 se incluyen, pero no se limita a ellos, todas las variantes, homólogos y mutantes de TP-17, longitud total o fragmentos de los mismos, y proteínas de fusión que contienen cualquiera de los anteriores como parte material. En algunas formas de realización, un polipéptido similar a Tp-17 comprende una secuencia consenso Xaan Pro His Xaan y es al menos un 50%, 75%, 85%, 95%, o 99% idéntica al TP17 (Genbank número de referencia. P29722; SEC ID NO:31) o un fragmento del mismo. En otras formas de realización, un "polipéptido similar a Tp-17" comprende las siguientes secuencias consenso:
CX(1 ,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C(SEC ID No: 178) y se une a lisozima Por "polipéptido mutante similar a Tp17" se quiere decir un polipéptido similar a TP-17 que tiene al menos un cambio en un aminoácido en relación con la secuencia de una secuencia natural. Tales cambios incluyen por ejemplo, sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. En algunas formas de realización, los homólogos del polipéptido mutante similar a Tp-17, mutantes, fragmentos, sustituciones y modificaciones retienen la capacidad para unirse a la lisozima. En una forma de realización preferida, tales polipéptidos se unen a la lisozima, pero no inhiben su actividad antimicrobiana. La Figura 7 describe ejemplos de procedimientos para la identificación dirigida y aleatoria de mutantes polipeptídicos. Por "molécula de ácido nucleico similar a Tp17" o "molécula mutante de ácido nucleico similar a Tp17" se quiere decir la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido similar a Tp17 o un polipéptido similar a Tp17 mutante, respectivamente. Por "polipéptido similar a APP" se quiere decir un polipéptido que se une a la lisozima y que contiene la siguiente secuencia consenso: CX(1 ,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C (SEC ID No: 178). Por "polipéptido de lisozima" se quiere decir una secuencia de aminoácidos que comprende la siguiente secuencia consenso Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln lie Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa (SEQ ID NO:28), Y que tiene actividad antimicrobiana o actividades enzimáticas. Ejemplos de polipéptidos de lisozima se enumeran en las figuras 3A y 3B. En una forma de realización preferida, un polípéptido de lisozima es al menos un 50%, 75%, 85%, 95%, o 99% idéntico a la lisozima humana (Genbank número de referencia NP_000230, NP_783862 , NP 115906, NP_898881 , NP_653235, NP_065159, NP_776246, NP_995328, NP_002280). Por "polipéptido de lisozima mutante" se quiere decir una secuencia aminoacídica de lisozíma que contiene al menos un cambio de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos natural. Por "molécula de ácido nucleico de la lisozima" o "molécula mutante de ácido nucleico de la lisozima" se quiere decir una molécula de ácido nucleico que codifica una lisozima o un polipéptido mutante de la lisozima, respectivamente.
Breve descripción de las figuras Los anteriores objetos, características y ventajas de la presente invención, así como la propia invención, se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas junto con la lectura de las figuras adjuntas, en las que:
Las Figuras 1A y 1 B ilustran los sitios de unión a la lisozima en los polipéptidos similares a Tp17 de una serie de bacterias, virus, parásitos y organismos mamífero y la secuencia consenso de 17 aminoácidos que definen. En la Figura 1 B, los polipéptidos relacionados con Tp17 de T. denticola, B. thetaiotaomicron, C. burnetti, H. influenzae, N. meningitidis serogrupo A y serogrupo B, V. cholerae, V. vulnificus, H. ducreyi, S. typhi, L. pneumophila, S. aureus, N. gonorrhoeae, y B. pertussis se ajustan a las siguientes secuencias consenso: Cys Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16
Xaa17 Cys (SEQ ID NO:176) donde Xaa es cualquier aminoácido o está ausente. Las dos proteínas restantes de P. gingivalis, y H. plori se agrupan en las siguientes secuencias consenso: secuencia Cys Xaa1 Xaa2 Xaa3 His Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Cys (SEQ ID NO: 175), donde x es cualquier aminoácido o está ausente. La Figura 1 B es una tabla que define un motivo de unión a lisozima conservado entre una variedad de patógenos bacterianos clínicamente relevantes.
La Figura 2 ilustra los sitios de unión a la lisozima en los polipéptidos similares a Tp17 de una serie de bacterias, virus, parásitos, insectos y organismos mamífero y
la secuencia consenso de 6 aminoácidos que definen .
La Figura 3A es una alineación de secuencias de lisozima madura de una serie de especies. E35 y D53 en lisozima madura de pollo (o D52 en lisozima madura humana) (Y) pertenecen al diodo catalítico y se conservan en todas las secuencias de lisozima conocidas. En la parte inferior de la alineación se muestra una secuencia consenso. La conservación de los aminoácidos se representa según los símbolos de comparación de Risler (Risler y col. (1988) J. Mol. Biol. 204:1019). En ese sistema de representación, X representa cualquier aminoácido o no aminoácido, las letras el cuadro a una conservación de aminoácidos del 100%, las letras del cuadro inferior corresponden a un valor de conservación de aminoácidos comprendido entre 50% y 90%. Es más, los cambios conservadores compartidos por más del 50% de las secuencias se representan usando los siguientes símbolos $ corresponde a leucina o metionina, ! corresponde a isoleucina o valina, y # corresponde a asparagina o ácido aspártico. La Figura 3B es una continuación de la alineación de las secuencias de lisozima madura presentadas en la Figura 3A. En la parte inferior de la alineación se muestra una secuencia consenso usando la nomenclatura descrita con respecto a la Figura 3A. La Figura 4 ilustra una ventaja de la presente invención ya que los equipos de detección de anticuerpos Tp17 convencionales no detectan anticuerpos frente al complejo Tp17-lisozima. En una forma de realización, la invención se caracteriza por un equipo que contiene un polipéptido similar a Tp17 y un polipéptido de lisozima. Tales equipos son capaces de detectar anticuerpos frente a Tp17 solo, lisozima sola o un complejo Tp17-lisozima, si existe. La Figura 5 ilustra un ensayo western blot de interacción lisozima-proteína que comprende las siguientes cinco etapas: (1) inmovilización de lisozima purificada en un soporte sólido; (2) sondaje del soporte sólido con un ligando para lisozima (por ejemplo, GST-Tp17); (3) unión de GST-Tp17 con anticuerpo antiGST de cabra; (4) unión del anticuerpo de cabra con un conjugado de fosfatas alcalina anticabra; y (5) mareaje con el sustrato cromogénico nitroazul tetrazolio/bromocloro indolil fosfato fosfatasa alcalina (NAT/BCIF).
La Figura 6 ¡lustra la secuencia de aminoácidos (SEC ID N°:29) y de nucleótidos (SEC ID N°:30) de la proteína de fusión GST-Tp17. Las secuencias correspondientes a la fracción GST y al Tp17 se representan in cursiva y en negrita, respectivamente. Las líneas numeradas, SEC ID N° 30, representan la hebra sentido de ADN ; la hebra antisentido o la de ARN está por debajo de la hebra sentido.
La Figura 7 ilustra el constructo de expresión de Tp17-HIS pET24a_Tpp17His. Este vector deriva del vector de expresión pET24 (Novagen Inc., Madison, Wl). La Figura 8A es un gel marcado con azul de Coomasie Brillante de fracciones
cromatográficas de GST-Tp17 purificado. Calle 1 : proceso de purificación con lisozima de pollo adicional; calle 2: proceso de purificación sin la lisozima de pollo adicional; calle 3: MPM: marcadores de peso molecular.
La Figura 8B es un Western Blot y un gel marcado con azul de Coomasie Brillante de fracciones cromatográficas de Tp17-HIS purificado. Calle 1 : Western blot usando suero humano positivo para sífilis de proteínas recuperadas del proceso de purificación en presencia de lisozima de pollo adicional; calle 2: tinción con azul de Coomasie Brillante de proteínas recuperadas del proceso de purificación en presencia de lisozima de pollo adicional. Se indican las secuencias peptídicas obtenidas por secuenciación de los aminoácidos del extremo N-terminal de las proteínas recuperadas de las bandas electroforética en los carriles uno y dos. La Figura 9A ¡lustra los resultados de sondar la lisozima de pollo con GST-Tp47 en un ensayo Far Western blot . Calle PM: marcadores de peso molecular; calle 1 : 1 μg de lisozima de pollo purificada; calle 2: 5 μg de lisozima de pollo purificada; calle 3: 10 μg de lisozima de pollo purificada.
La Figura 9B ilustra los resultados de sondar la lisozima de pollo con GST-Tp17 en un ensayo Far Western blot . Calle PM: marcadores de peso molecular; calle 4: 1 μg de lisozima de pollo purificada; calle 5:5 μg de lisozíma de pollo purificada; calle 6: 10 μg de lisozima de pollo purificada. La Figura 9C ilustra resultados de sondar la lisozima humana con GST-Tp47 en un ensayo Far Western blot. Calle PM: marcadores de peso molecular ; calle 7: 1 μg de lisozima humana purificada; calle 8: 5 μg de lisozima humana purificada; calle 9: 10 μg de lisozima humana purificada. La Figura 9D ilustra resultados de sondar la lisozima humana con GST-Tp17 en un ensayo Far Western blot . Calle PM: marcadores de peso molecular; calle 10: 1 μg de lisozima humana purificada; calle 11 : 5 μg de lisozima humana purificada; calle 12: 10 μg de lisozima humana purificada.
La Figura 10 muestra una representación gráfica del efecto del polipéptido sobre la actividad antibacteriana de la lisozima. La concentración of GST-Tp17 en presencia de lisozima humana (O) y de pollo (A) se representó frente a la intensidad relativa de fluorescencia. Como control, la concentración de GST-Tp47 en presencia de lísozima humana (*) también se representó frente a la intensidad relativa de fluorescencia. La Figura 11A muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína IVY de E. coli con la secuencia de aminoácidos de Tp17 de T. pallidum. Debajo de la alineación se muestra una secuencia consenso. # identifica cambios conservativos (Asp/Glu) y semiconservadores (Asp/Asn ). mientras que " !" indica cambios Val/lie.
La Figura 11 B ilustra la estructura cristalina de las tres posibles regiones de contacto de la lisozima de pollo con la proteína IVY de E.coli: proteína: péptidos I, II,
and III se indican son sombreado.
La Figura 12 ilustra las interacciones atómicas entre E. coli Ivy y la lisozima de pollo, incluida la interacción entre el átomo de nitrógeno de H88-lvy y el átomo de oxígeno de E53-chkc ys y entre el átomo de oxígeno de D89.ιvy y el átomo de nitrógeno de R132-C kcLy La distancia entre los centros atómicos fue 2,56 A (1 angstrom = 10"10 metros) en la interacción H88-lvy / E53.cnkCLyS y 2,46 A en la interacción D88-ιvy / R132. chkcLys-
La Figura 13A ilustra la superficie molecular, accesible al agua (claro) de la lisozima de pollo sola. La región accesible al agua, expuesta a la superficie, del residuo aminoacídíco está sombreada.
La Figura 13B ilustra la superficie molecular accesible al agua de la lisozima de pollo en forma de complejo con la IVY de E. coli. El residuo de aminoácido E53 está completamente oculto y es poco accesible al disolvente.
La Figura 13C ilustra la superficie molécula (clara), accesible al agua, de la lisozima de pollo. La región accesible al agua, expuesta a la superficie, del residuo de aminoácido R132 está sombreada.
La Figura 13D ilustra la superficie moléculas accesible al agua de la lisozima de pollo en forma de complejo con la IVY de E coli. El residuo de aminoácido R132 permanece parcialmente expuesto al disolvente. La Figura 14A ilustra los puentes de unión entre las dos cisteínas adyacentes del sitio de unión de IVY de E co//-lisozima de pollo que aproxima los residuos de histidína y ácido glutámico, en una configuración capaz de hacer contacto con los residuos E53 y R132 de la lisozima de pollo.
La Figura 14B ilustra los puentes de unión entre las dos cisteínas adyacentes del sitio de unión de Tp17 de T. pallidum -lisozima que probablemente aproxima los residuos de histidina y ácido aspártico, posiblemente en una configuración capaz de hacer contacto con los residuos E53 y R132 de la lisozima.
La Figura 15 ilustra una alineación de la proteína gJ del virus del Herpes simple tipo 1 (VHS1) y del virus del Herpes simple tipo 2 (VHS2). Debajo de la alineación se amplía una secuencia consenso. El inserto demuestra que la gj del VHS1 no comparte la secuencia consenso de tipo Tp17 encontrada en la gJ del VHS2 gJ. "#" identifica los cambios semiconservadores tales como Asp/Asn.
La Figura 16A es una tabla que ilustra la intensidad relativa de hemaglutinación correspondiente a 4 sueros dudosos de sífilis humana (HPM10, HG38, HG48 y HG82). Las muestras de suero se combinaron con Tp17 (R) en presencia o ausencia de lisozima de pollo (ChickenLyz) o de lisozima humana (HumanLyz). Los resultados se expresan en títulos de dilución recíproca (por ejemplo, 80 significa positivo a la dilución 1/80).
La Figura 16B es una representación gráfica de los resultados de hemaglutinación de la Figura 16A. Reactivo Tp17 sin lisozima (barras negras); Reactivo Tp17
complementado con lisozima de pollo (barras tramadas); Reactivo Tp17 complementado con lisozima humana (barras vacías). Los resultados se expresan como títulos de dilución recíproca (por ejemplo, 80 significa positivo a la dilución 1/80). La Figura 17A es una tabla que ilustra la intensidad relativa de hemaglutinación correspondiente a 10 sueros humanos de sífilis (Sif71 , 09-4, 09-3, HSP91 , HSP17, HSP3, 4932, 5895, HG62, and HG82). Las muestras de suero se combinaron con Tp17 (R) en presencia o ausencia de lisozima humana natural (LyzN) o lisozima humana recombinante (LyzR). Los resultados se expresan como títulos de dilución recíproca (por ejemplo, 80 significa positivo a la dilución 1/80).
La Figura 17B es una representación gráfica de los resultados de hemaglutinación de la Figura 17A. Reactivo Tp17 sin lisozima (barras negras); Reactivo Tp17 complementado con lisozima humana natural (barras a cuadros); Reactivo Tp17 complementado con lisozima humana recombinante (barras huecas). Los resultados se expresan como títulos de dilución recíproca (por ejemplo, 80 significa positivo a la dilución 1/80).
La Figura 18A ilustra la mejora de la intensidad relativa de la hemaglutinación con la adición de lisozima humana recombinante. Se analizó un total of 34 sueros usando un reactivo Tp17 (R) o un reactivo Tp17 complementado con lisozima humana recombinante (R+LyzR). Los resultados de la técnica de dan como la inversa de la última dilución que dieron una aglutinación positiva. Cada resultado se convirtió en un número (dilución 1/80 es 1 , la dilución 1/160 es 2, etc.). El corte está en la dilución 1/80 y un valor inferior a 1 se considera un resultado negativo. FN y P respectivamente representan resultados Falsos negativos y positivos, respectivamente.
La Figura 18B ¡lustra la intensidad relativa de hemaglutinación con la adición de lisozima humana recombinante en muestras de suero falsos negativos usando reactivo Tp17 (R) o reactivo Tp17 complementado con lisozima humana recombinante (R+LyzR). La intensidad de la aglutinación en las muestras falsas negativas se representa por un número entre 0 y 1 (1 representa el corte de la técnica de hemaglutinación).
La Figura 19 ilustra un ensayo de hemaglutinación realizado con 34 sueros humanos. El ensayo se llevó a cabo usando un reactivo Tp17 (barras negras ) o un reactivo Tp17 complementado con lisozima humana recombinante (barras huecas). El resultado de la técnica se da con la inversa de la última dilución que dio una aglutinación positiva. El corte está en la dilución 1/80. Los resultados se expresan como títulos de dilución recíproca (por ejemplo, 80 significa positivo a la dilución 1/80). La Figura 20 ilustra el efecto de la lisozima sobre la especificidad del ensayo de hemaglutinación en 200 muestras de suero del banco de sangre negativos para
sífilis usando reactivo Tp17 (R) o reactivo Tp17 complementado con lisozima humana recombinante (R+LyzR). La intensidad de la aglutinación en las muestras negativas se representa con un número entre 0 y 0,5. DE, desviación estándar. La Figura 21 A ilustra la sensibilidad mejorada de un ensayo ELISA de segunda generación para sífilis en presencia de lisozima humana recombinante.
La Figura 21 B ilustra la sensibilidad mejorada de un ensayo ELISA de tercera generación para sífilis en presencia de lisozima humana recombinante. La Figura 22 muestra una separación por cromatografía de exclusión por tamaño molecular de las isoformas de Tp17-His. Los Tp17-HIS purificado por afinidad está compuesto por tres oblaciones de moléculas: Tp17-His monomérica (pico 3), Tp17-
His dimérica (pico 2) y Tp17-His multimérica (pico 1).
La Figura 23 muestra una separación por cromatografía de exclusión por tamaño de lisozíma humana recombínante purificada (Ventria Biosciences, Sacramento, CA, EE.UU.). La lisozima humana recombinante está compuesta por una única población de moléculas altamente homogénea (pico 1).
La Figura 24 muestra_una separación por cromatografía de exclusión por tamaño de complejos_Tp17-His/huLYS. Los perfiles cromatográficos correspondientes al complejo huLYS con Tp17-His monomérico (círculos) o Tp17-His dimérico (rombos) se representan. Los picos corresponden a los complejos proteicos Tp17/huLYS (picosl y 2) o excesos monoméricos (huLys yTp17) (picos 3 y 4).
La Figura 25 muestra una separación electroforética de SDS-PAGE de sobrenadantes concentrados de cultivos bacterianos (5X) y la detección de proteínas bacterianas secretadas mediante tinción con plata. Se analizaron los siguientes patógenos: Enterococcus faecalis (carril 2), Enterococcus faecium (carril 3), Staphylococcus aureus (carril 4), Streptococcus pneumoniae (carril 5),
Streptococcus pyogenes (carril 6), Propionibacterium acnés (carril 7), Staphylococcus epidermidis (carril 8), Streptococcus agalactiae (carril 9). La Figura 26 es un gráfico de barras que muestra la actividad enzimática de la lisozíma humana medida en ausencia o en presencia de sobrenadantes concentrados de cultivos bacterianos (5X) recogidos de las siguientes especies bacterianas: Propionibacterium acnés, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis y Enterococcus faecium. La altura de cada barra indica la actividad enzimática detectada. Un control de la lisozima se encuentra en la parte izquierda de la figura.
La Figura 27 es un esquema que muestra el principio u el diseño de un ensayo de detección selectiva de alto rendimiento para la identificación de compuestos candidatos capaces de interferir en la formación de complejos similares a Tp17 con isozima. La etapa 1 : Contacto de una muestra de prueba con huLYS marcado con peroxidasa de rábano (POD) y un polipéptido similar a Tp17. Etapa2: incubación de
la muestra de prueba a 37°C. Etapa 3: Lavado extenso, adición de sustrato POD y detección de señal.
Las Figuras 28A y 28B son gráficas de barras que muestran la inhibición de preparaciones terapéuticas comercialmente disponibles, preparaciones terapéuticas de lisozima de pollo por Tp17. La Figura 28A muestra la inhibición de la actividad bacteriolítica de Lizipaina® (Boehringer Ingelheim) por GST-Tp17 y Tp17-His a varias proporciones molares. La Figura 28B muestra la inhibición de la actividad bacteriolítica de Lisozima CHIESI (Laboratorio CHIESI) por GST-Tp17 a varias proporciones molares. La altura de cada barra indica la actividad enzimática detectada. Un control de lisozima se encuentra en la parte izquierda de la figura.
La Figura 29 es un gráfico de barras que muestra la muestra que la actividad bacteriolítíca de la-Lysozyme™ (Novagen, VWR International, Mollet del Valles, España) no fue susceptible a la inhibición por GST-Tp17 o Tp17-HIS, mientras que se produjo una fuerte inhibición de la actividad antibacteriana de la lisozima humana. La altura de cada barra indica la fluorescencia detectada. Un control de r-
Lysozyme™ y control de la lisozima humana (HuLys) se encuentra presente a la izquierda de cada serie de experimentos.
La Figura 30 muestra las alineaciones de la secuencia de las secuencias de unión/inhibición de lisozimas de Escherichia coli Ivy, Pseudomonas aeruginosa Ivy, Yersinia pestis Ivy, Treponema pallidum sp. pallidum Tp17 y de las tres isoformas
(APP770, APP751 & APP695) de la proteína precursora humana Beta amiloide (β- APP). Se indica el número de referencia de The Genbank correspondiente a cada secuencia peptídica. La secuencia consenso deducida se representa usando el patrón usado en la base de datos PROSITE . La Figura 31 muestra vistas 3D de los dominios de unión/inhibición de la lisozima de Escherichia coli Ivy, Pseudomonas aeruginosa Ivy y la β-APP humana. La Figura 32 es un esquema que muestra la organización de los dominios de sAPP y la proteína precursora de meta amiloidde de Homo sapiens (β-APP). La Figura 33 muestra la detección de la unión de huLYS marcada con peroxidasa de rábano (POD) a APPα inmovilizada pero no a sAPPα(304-612) inmovilizada. Se colocaron puntos de 10 μg de sAPPα y de sAPPα (304-612) en un papel de membrana de nitrocelulosa y se pusieron en contacto con sondas de POD-HuLYS diluidas al 1/1000. Las Figuras 34A y 34B son tablas que muestran una alineación de las proteínas de unión/inhibidoras de lisozima, sus números de referencia en Genbank y las especies huésped en las que el péptido está presente Estas secuencias aminoacídicas se identificaron en sílice usando el patrón peptídico CX(1 ,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C (que se muestra en la Figura 31) para la búsqueda en las bases de datos Swíss-Prot y TrEMBL usando el
algoritmo de ScanProsite .
La Figura 35A es un esquema que muestra un polipéptido Tp17 de tipo salvaje y polipéptidos mutantes Tp17 CPA y KPA. En TP17 CPA, la histidina en la posición aminoacídica 31 se sustituyó con alanina, y en Tp17 KPA, la histidina en la posición aminoacídica 107 se sustituyó con alanina.
La Figura 35B es una tabla que muestra la capacidad inhibidora de los polipéptidos mutantes Tp17 CPA y KPA en relación con el polipéptido Tp17 de tipo salvaje. La Figura 36 es un Western que muestra proteínas que tiene pesos moleculares de 45 kDA en cada uno de los carriles 1 , 2, y 3, donde el carril 1 es el Tp17 de tipo salvaje y el carril 2 el CPA mutante y el carril 3 el KPA mutante.
La Figura 37 muestra una alineación de las secuencias peptídicas correspondientes a lisozima humana (huLYS) y lisozima de pollo (chkLYS), asía como huLYS y proteína similar a la lisozima de esperma humano (SLLP1). Esta alineación muestra que la SLLP1 está estrechamente relacionada con la huLYS y la chkLYS y apoyan que el Tp17 se puede unir á la SLLP1.
La Figura 38 es un esquema que muestra que el Tp17 se puede unir a la SLLP1 en la superficie del esperma e interferir posteriormente en el proceso de fertilización.
Descripción detallada de la invención En general, la invención se caracteriza por composiciones y procedimientos relacionados con la detección y el tratamiento de sujetos con una infección patógena, tal como por Treponema pallidum. Como se describe con más detalle a continuación, esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que un polipéptido expresado en un patógeno, el Tp17, se une e inhibe la lisozima, un polipéptido antimicrobiano expresado en un huésped. Dado que muchos patógenos expresan proteínas relacionadas con Tp17, este procedimiento de inhibición de la respuesta inmunitaría de un huésped es probable que se conserve entre un gran número de patógenos. En consecuencia, la invención proporciona procedimientos para tratar o prevenir una infección patógena según esta observación. Además, la invención proporciona ensayos diagnósticos mejorados basados en la detección de anticuerpos que se unen al complejo lisozima-Tp17.
Polipéptidos similares a P17 de Treponema pallidum Las composiciones y procedimientos de la invención comprenden el polipéptido P17 de Treponema pallidum (Tp17) (N° de referencia de Genbank
P29722; SEC ID N°:31) y polipéptidos similares a Tp17. Estos polipéptidos comparten ciertas similaridades estructurales en su secuencia, como se ilustra en las Figuras 1A, 1B y 2, denominados en conjunto en la presente "polipéptidos similares a Tp17 y/o similaritudes funcionales, tales como la capacidad para unir lisozima o inhibir la actividad antimicrobiana o enzimática de la lisozima. Al menos
i 28
una y posiblemente dos regiones del polipéptido Tp17 (SEC ID N° 31)se unen a la lisozima: la secuencia polipeptídica VCPHAG (SEC ID N°:5) en las posiciones aminoacídicas 28-33 y la secuencia polipeptídica KAPHEK (SEC ID N°:10) en las posiciones aminoacídicas 114-119 (SEC ID N°. Las figuras 1A y 2 proporcionan una alineación de los ejemplos de polipéptidos similares a Tp17 de una serie de especies bacterianas, víricas, parasíticas y mamíferos, junto con sus números de acceso. En particular, la alineación mostrada en la figura 2 identifica una secuencia consenso conservada Xaan Pro His Xaan,, que es común a todos los polipéptidos similares a TP17. En una forma de realización, un polipéptido similar a Tp17 comprende la secuencia aminoacídica consenso de Xaan Pro His Xaan (SEC ID N°:1), en la que Xaa es cualquier aminoácido, está ausente o es un enlace peptídico, y n es al menos uno. En cuanto a las Figuras 1A y 1 B, en otra forma de realización, el polipéptido similar a Tp17 comprende la secuencia aminoacídica consenso CS1 : Cys Xaai
Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaa12 Xaa13 Cys (SEC ID N°:2), en la que Xaa^ Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa , Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaan, Xaa12, o Xaa13 es cualquier aminoácido, ningún aminoácido o un enlace peptídico. En una forma de realización preferida, Xaa1 es Lys, Gly, lie, Arg, Leu, Ala, Ser, Thr, Gln, Asn, Phe, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa2 es
Thr, His, Cys, Gln, Asn, He, Ser, Leu, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa3 es His, Lys, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa4 es Asn, Gly, Tyr, Leu, Ala, Cys, Glu, Thr, Arg, Met, Pro, He, Val, Phe, His, Gln, Lys, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa5 es His, Arg, Asn, Leu, Ser, Lys, Glu, Gly, Pro, He, Thr, Cys, Trp, Val, Gln, Phe, Ala, Asp, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa6 es Val, Cys, Ala, Asp, Ser, Pro, Gly, Glu, Lys, Leu, Gln, He, Tyr, Arg, Asn, Met, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa7 es Asp, Glu, Ala, His, Val, Met, Pro, Lys, Arg, Cys, Asn, Gln, Phe, Leu, Ser, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa8 es Gly, Asn, Ala, He, Arg, Glu, Lys, Thr, Tyr, Pro, Asp, Leu, Ser, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa9 es Leu, Arg, Phe, He, Ala, Pro, Asn,
Gln, Lys, ningún aminoácido o un enlace peptídíco; Xaa10 es Val, Thr, Asp, Glu, Tyr, Arg, Ala, Trp, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaan es Pro, Asp, Lys, Asn, Gly, Thr, He, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa12 es He, Val, Gly, Asp, Asn, Leu, ningún aminoácido o un enlace peptídico; y Xaa13 es Asp, Glu, Cys, Thr, ningún aminoácido o un enlace peptídico. También, un polipéptido similar a
Tp17 preferido que no se ajusta estrictamente a la CS1 consenso es la proteína Int del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) con el motivo relacionado CSPEVGQMDC (SEC ID N°:27) y la proteína VP1 del virus de la enfermedad pie boca (FMDV)I con el motivo relacionado TAPHRGLATLYNGDC (SEC ID N°:26) (Figura 1A).
Refiriéndonos ahora a la Figura 2, en otra forma de realización, el polipéptido similar a Tp17 comprende la secuencia aminoacídica consenso CS2: Xaa! Xaa2 Pro His Xaa3 Xaa4 (SEC ID N°:3), en la que Xaa! es Cys, Lys, Val, Ala, ningún aminoácido o un enlace peptídico; Xaa2 es Ala, Cys, o Lys; Xaa3 es Ala, Asp, o Glu, y Xaa4 es Cys, Gly, o Lys. En una forma de realización preferida, el polipéptido similar a Tp17 comprende la secuencia de aminoácidos CCPHAG (SEC ID NO:4), VCPHAG (SEC ID NO:5), VAPHDC (SEC ID NO:6), KAPHDK (SEC ID NO:7), VKPHDG (SEC ID NO:8), KKPHAK (SEC ID NO:9), KAPHEK (SEC ID NO: 10), KKPHAC (SEC ID NO: 11), VAPHAG (SEC ID NO: 12), VKPHAK (SEC ID NO:13), VKPHAC (SEC ID NO:14), VAPHEG (SEC ID NO:15), VKPHEK (SEC ID
NO: 16), VCPHEK (SEC ID NO:17), CKPHAG (SEC ID NO:18), ACPHAG (SEC ID NO:19), KCPHDC (SEC ID NO:20), VKPHDK (SEC ID NO:21), KKPHAG (SEC ID NO:22), o CAPHEK (SEC ID NO:23) . En una forma de realización preferida, el polipéptído similar a Tp17 comprende la proteína P17 de Treponema pallidum o la glucoproteína J del virus del Herpes Simple Tipo 2 . En una forma de realización, el polipéptido similar a Tp17, como se define en la presente, no comprende la proteína Ivy . En otra forma de realización, la invención no comprende una proteína que comprende CKPHDC (SEC ID NO:24). En otra forma de realización, los polipéptidos similares a Tp17 comprenden la secuencia consenso CS3, compartida por Tp17 y la proteína gJ del virus del
Herpes simple tipo 2 , por ejemplo, correspondiente a Xaa Cys Pro His Ala Gly (SEC ID NO:25), en la que Xaa= Cys o Val.
La Figura 7 describe procedimientos de ejemplo para la identificación dirigida y aleatoria de mutantes polipeptídicos. Moléculas de lisozima La lisozima causa la hidrólisis de las paredes de las células bacterianas. Generalmente se encuentra en líquidos en contacto con superficies mucosas así como en otros líquidos corporales y constituye un mecanismo de defensa frente a las infecciones bacterianas. La enzima fragmenta el enlace glicosídico entre el carbono número 1 del ácido N-acetilmurámico y el carbono número 4 de la N- acetil-D-glucosamina. In vivo, estos dos carbohidratos se polimerizan para formar un polisacárido de la pared celular. La lisozima tiene múltiples dominios, una estructura de plegamiento mixto alfa y beta, contiene cuatro puentes disulfuro conservados. La lisozima también tiene un fuerte efecto antivírico frente a los virus del herpes simple (VHS) y del VIH tipo 1 (VIH-1). La formación de sincitios en las monocapas celulares infectadas con VHS está inhibida por la lisozima blanca de huevo de gallina (Cisani y col. (1989) Microbios. 59:73-83). Además, la lisozima aumenta la actividad antiherpética del ácido glicirrizico en los ensayos in vitro (Lampi y col. (2001) Antivir. Chem. Chemother. 12:125-131). Además, la actividad
antiVIH-1 encontrada en las preparaciones de gonadotropina coriónica humana (hCG) se ha atribuido en parte a la lisozima C (Lee-Huang y col. (1999) Proc. Nati. Acid. Sci. USA 96:2678-2681). Además, se ha informado que una proteína de E coli llamada IVY se une e inhibe la lisozima humana y de pollo (Monchois y col. (2001) J. Biol. Chem. 276:18437-18441). Las interacciones entre la lisozima y tales proteínas patógenas y el mecanismo de su acción no están cairos en la técnica anterior. Como se describe en la presente, la caracterización de la interacción entre el antígeno Tp17 y la lísozima proporciona, al menos en parte, una explicación de cómo la lisozima interacciona con las proteínas patogénicas e inhibe su actividad. Los niveles de lisozima son menores en pacientes que sufren infección por
VHS comparados con los controles sanos, lo que sugiere que la infección patógena está asociada con una disminución de la producción de lisozima o una inhibición de la actividad de la lisozima. La presente invención proporciona, al menos en parte, una explicación de cómo las proteínas producidas por los virus patógenos invasores inhiben la actividad de la lisozima, lo que sugiere un mecanismo por el cual los virus patogénicos evaden la lisis producida por la lisozima produciendo un inhibidor de la misma. Por tanto, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para reducir la inhibición de la lisozíma in vitro y para la prevención o el tratamiento de infecciones patógenas in vivo. Las composiciones y procedimientos de la invención comprenden lisozima humana y polipéptidos con similitudes. Las Figuras 3A y 3 B proporcionan una alineación de polipéptidos de lisozima de una serie de especies, incluyendo patos, pollo, codorniz, cobaya, faisán, gallina pintada, pavo, chachalaca, cabra, oveja, vaca, ciervo, cerdo, rata, ratón, perro, conejo, mono, mono abísinio, mono rhesus, babuino, tití, tamarino, ardilla mono, gorila, ser humano, orangután, gibón, colobus, mono de las hojas, camello, zarigüeya, trucha, platija, peces, perro, caballo, burro, équidos, paloma, hoatzin, anofeles, gusano de seda, cecropoia, mariposa de seda, gusano de la col, gusano cornudo y croci. La alineación de las proteínas de lisozima define una secuencia consenso de la lisozima de: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln He Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa (SEC ID NO:28), en la que Xaa es cualquier aminoácido o está ausente. En una secuencia consenso de la lisozima comprende la secuencia de
"XkXXXrCelaXX$kXXgXdgyXgXs$X#WvClaXXESXXnTXatnXnXXXgStDYGifQINsX yWCndgktpXXXnXCX!XCsXL1Xd#itXaCAKk!vXdXXgXXaWvaWkXhCXgXdlsXyXXg CXXX" (SEC ID NO:32), donde la conservación de aminoácidos se representa según los símbolos de comparación de Risler (Risler y col. (1988) J. Mol. Biol. 204:1019). En ese sistema de representación, X representa cualquier aminoácido o está ausente, las letras del cuadro superior corresponden a una conservación de aminoácidos del 100%, las letras del cuadro inferior corresponden a un valor de conservación de aminoácidos comprendido entre 50% y 90%. Es más, los cambios conservativos compartidos por más del 50% de las secuencias se representan usando los siguientes símbolos: $ corresponde a leucina o metionina, ! corresponde a isoleucina o valina, y # corresponde a asparagina o ácido aspártico. El término "lisozima" o "polipéptido de lisozima" abarca todos los homólogos, mutantes, toda la longitud o fragmentos, sustituciones y modificaciones del mismo, incluyendo deleciones y adiciones del mismo. En una forma de realización, un polipéptido de lisozima incluye una mutación que disminuye su capacidad de unirse a o asociarse o interaccionar con el polipéptido similar a Tp17. Como resultado, el polipéptido de lisozima mutante es resistente a la inhibición por un polipéptido similar a Tp-17 expresado por un patógeno. El ejemplo 7 describe procedimientos de ejemplo para la identificación dirigida o aleatoria de mutantes de lisozima resistentes a la inhibición. La lisozima exógena es una lisozima que se origina fuera de, por ejemplo no se produce de forma natural o se produce en concentraciones significativamente bajas, en la muestra de la preparación de polipéptido similar a Tp17 usada en los procedimientos de la invención. En una forma de realización, la lisozima exógena es una lisozima que se añade a la muestra o al polipéptido similar a Tp17 para preparar las composiciones y procedimientos de la invención. Polipéptido similar a Tp17 y homólogos, mutantes v derivados de Lisozima La invención también proporciona variantes purificadas o recombinantes de un polipéptido similar a Tp17 o de polipéptidos de lisozima, incluidos los homólogos, los mutantes y los derivados. En algunos ejemplos, los polipéptidos mutantes recombinantes contienen mutaciones específicas (por ejemplo mutaciones en sentido erróneo, inserciones, deleciones o mutaciones sin sentido) que inhiben la actividad biológica del polipéptido recombinante en comparación con un polipéptido similar a Tp17 nativo o con un polipéptido de lisozima. Particularmente, los polipéptídos mutantes similares a Tp-17 se unen a lisozima con una afinidad igual o mayor a la afinidad de un polipéptido natural, pero no inhiben la actividad antimicrobiana de la lisozima, tal como su capacidad para escindir un polisacárido expresado en un patógeno, Tales polipéptidos mutantes similares a Tp-17 son útiles en el tratamiento o la prevención de una infección patogénica. Los polipéptidos de lisozima mutantes particularmente ventajosos de la invención son incapaces de unirse, o exhiben una afinidad de unión a un
polipéptido similar a Tp17 reducida en comparación de una lisozima nativa (Figura 3). Preferentemente, la unión , por ejemplo la afinidad de unión o la cantidad, se reduce en la menos un 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 95%, o 100. Otros polipéptidos de lisozima ventajosos retienen la capacidad para unirse a un polipéptido similar a Tp17, aunque tal unión no inhibe la actividad antimícrobiana del polipéptido de lisozima, como su actividad enzimática. Por el uso de un homólogo, un mutante o un derivado de función limitada pueden deducirse los efectos biológicos específicos , por ejemplo, con menos efectos secundarios o mayor potencia terapéutica, respecto del uso de una forma de referencia o natural (es decir, el tipo salvaje) de un polipéptido similar a Tp17 o de un polipéptido de lisozima. Los mutantes de polipéptidos similares a Tp17 o de los polipéptidos de lisozima pueden generarse por mutagénesis, como, por ejemplo, introduciendo una pequeña mutación o mutaciones puntuales, o una inserción, una deleción u otras modificaciones y alteraciones. Por ejemplo, las mutaciones naturales o inducidas en laboratorio pueden generar mutantes de los polipéptidos similares a Tp-17 o polipéptidos de lisozima que retengan sustancialmente la misma, o solo un poco, de la actividad biológica del polipéptido similar a Tp17 o del polipéptido de lisozima del que el polipéptido mutante deriva. Por otra parte, pueden generarse formas antagonistas de un polipéptido similar a Tp17 o de un polipéptido de lisozima. Tales antagonistas inhiben la función de una forma espontánea del polipéptido similar a Tp17 o del polipéptido de lisozima, mediante unión competitiva a un ligando natural. Los homólogos purificados o recombinantes de polipéptidos similares a Tp17 o los polipéptidos de lisozima de la presente invención también incluyen homólogos naturales de los polipéptidos similares a Tp17 de tipo salvaje o de los polipéptidos de lisozima que son resistentes de forma natural a la fragmentación proteolítíca. Los polipéptidos similares a Tp17 o los polipéptidos de lisozima pueden también sufrir modificaciones químicas para crear derivados del polipéptido similar a Tp17 o de polipéptidos de lisozima, respectivamente, formando conjugados covalentes o agregados con otras fracciones químicas, tales como grupos glícosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de los polipéptidos similares a Tp17 o de los polipéptidos de lisozíma pueden prepararse uniendo las fracciones químicas a grupos funcionales en las cadenas de aminoácidos de la proteína o en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la proteína. Se pueden realizar modificaciones de la estructura de los polipéptidos similares a Tp17 o de los polípéptidos de lisozima (por ejemplo, mutaciones de aminoácidos) se puede realizar para propósitos tales como aumentar la eficacia terapéutica o profiláctica, la estabilidad, (por ejemplo, ex vivo duración y resistencia
a la degradación proteolítica), o modificaciones postraduccionales (por ejemplo, alterar el patrón de fosforilación de la proteína). Tales polipéptidos similares a Tp17 o polipéptidos de lisozima modificados o mutantes, cuando están diseñados para retener al menos una actividad de la forma natural de los polipéptidos similares a Tp17 o de los polipéptidos de lisozima, o para producir antagonistas específicos de los mismos, se consideran equivalentes funcionales de los polipéptidos similares a Tp17 o de los polipéptidos de lisozima descritos con más detalle en la presente. Tales polípéptidos similares a Tp17 o polipéptidos de lisozima modificados pueden producirse, por ejemplo, Mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos La variante sustitutiva puede ser un aminoácido sustituido conservado o un aminoácido sustituido no conservado. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado (es decir, mutaciones isostéricas y/o isoeléctricas) no tienen un efecto principal sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservadoras son aquéllas que tienen lugar en una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados pueden dividirse en cuatro familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. De forma parecida, el repertorio de aminoácidos puede agruparse como (1 ) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina histidina, (3) alifáticos = glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, con serina y treonina opcionalmente agrupados por separado como alifáticos-hidroxilo; (4) aromáticos = fenilalanina, tirosina, triptófano; (5) amidas = asparagina, glutamina; y (6) con azufre = cisteína y metionina. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un péptido resulta o no en un homólogo funcional de un polipéptido similar a Tp17 o de un polipéptido de lisozima (por ejemplo, funcional en el sentido de que el polipéptido resultante imita o antagoniza la forma de tipo salvaje) puede determinarse con facilidad valorando la capacidad del péptido variante para producir una respuesta en un ensayo o en células de un modo similar a la proteína de tipo salvaje, o para inhibir competitivamente tal respuesta. Los polipéptidos en los que ha tenido lugar más de una sustitución pueden analizarse con facilidad de la misma manera. En esta descripción de recogen ejemplos de ensayos y reactivos útiles para analizar tales homólogos . Por tanto, el término "polipéptido" incluye péptidos o proteínas naturales , así como péptidos o proteínas producidos de forma sintética o recombinante. El polipéptido puede abarcar cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, en los
que los residuos de aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes. Sin embargo, la invención también abarca peptidomimético de tales polipéptidos en los que los aminoácidos y/o los enlaces peptídicos se han sustituido por análogos funcionales. De acuerdo con la invención, un aminoácido abarca un análogo de aminoácido. Esta invención además contempla un procedimiento para generar conjuntos de mutantes combinatorios de polipéptidos similares a Tp17 o polipéptidos de lisozima, así con mutantes de fragmentación y es especialmente útil para identificar posibles secuencias variantes (por ejemplo, homólogos). El propósito de detectar de forma selectiva tales bibliotecas combinatorias es generar, por ejemplo, nuevos mutantes de polipéptidos similares a Tp17 o mutantes de polipéptidos de lisozima que puedan actuar como agonistas o antagonistas, o, de forma alternativa, que posean nuevas actividades en conjunto. Por tanto, pueden generarse polipéptidos mutantes derivados de forma combinatorial que tengan una mayor potencia relativa a una forma natural (de tipo salvaje) del polipéptido. En otra forma de realización, la invención trata de polipéptidos similares a Tp17 o de polipéptidos de lisozima aislados, preferiblemente preparaciones sustancialmente puras, por ejemplo, de polipéptidos derivados de líquidos corporales o producidos de forma recombinante. Los polipéptidos similares a Tp17 o lo polipéptidos de lisozíma pueden comprender polipéptidos de longitud total o pueden comprender fragmentos más pequeños correspondientes a uno o más dominios/motivos concretos, o fragmentos que comprenden al menos alrededor de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, alrededor de 20, alrededor de 25, alrededor de 50, alrededor de 75, alrededor de 100, alrededor de 125, alrededor de 148, aminoácidos de longitud, por ejemplo. Los péptidos pueden producirse mediante síntesis peptídíca directa usando técnicas de fase sólida (por ejemplo, Stewart y col. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co. San Francisco; Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). La síntesis proteica In vitro puede realizarse mediante transcripción y traducción acopladas in vitro, por ejemplo usando un equipo de TnT® (Promega,
Madison, Wl) o un equipo de RTS (Roche Applied Science, Barcelona, España) o usando un enfoque automatizado, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los péptidos se pueden preparar mediante uno o más procedimientos y se pueden unir químicamente para producir una molécula de longitud total. La caracterización del sitio de unión de la lisozima en Tp17 y la secuencia consenso de ese sitio de unión que es compartida por una serie de polipéptidos similares a Tp17 derivados de patógenos puede explotarse para proporcionar inhibidores de la unión lisozima/polipéptido similar a Tp17 y procedimientos para
hacerlo y usarlos como diagnóstico (por ejemplo, sondas), profilácticos o tratamientos de una serie de enfermedades patogénicas o enfermedades caracterizadas por la alteración de la actividad de la lisozima. Asimismo, la invención proporciona variantes naturales y genéticamente modificadas de lisozimas, incluidos homólogos, mutantes y derivados, y procedimientos para fabricarlas, que son incapaces de unirse a polipéptidos similares a Tp17 que retienen otras funciones de la lisozima, tales como la unión e hidrólisis de péptidoglucano por ejemplo, escapando por tanto de la inhibición por los polipéptidos similares a Tp17. Estas lisozimas que no son de tipo salvaje, incluidos homólogos, mutantes y derivados se usan para tratar o prevenir muchas enfermedades patogénicas, incluidas sífilis, SIDA y herpes genital. La invención también proporciona polipéptidos mutantes similares a Tp17 que tienen secuencias de unión a lisozima alteradas y polipéptidos mutantes de lisozima que tienen secuencias de unión alteradas a un polipéptido similar a Tp17. Preferentemente estos polipéptidos mutantes exhiben afinidades de unión alteradas. Particularmente preferidos son los polipéptidos mutantes similares a Tp- 17 que tiene un incremento (p. ej., 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, o 100%) en su afinidad de unión a la lisozima en comparación con un polipéptido similar na Tp-17 nativo. Tales polipéptidos mutantes compiten con un polipéptido similar a Tp17 por la unión a lisozima. Los más preferidos son los polipéptidos mutantes similares a
Tp-17 que se unen a lisozima con una afinidad al menos nativa, pero que no inhiben la actividad antimícrobiana de una lisozima, como una actividad enzimática. Particularmente preferidas son los polipéptidos mutantes de lisozíma que tiene puntos de unión alterados que reducen (p. ej., en un 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, o 100%) o eliminan la unión a un polipéptido relacionado con Tp-17. Otros polipéptidos mutantes de lisozima preferidos se unen a un polipéptido relacionado con Tp-17, pero tal unión no reduce ni elimina la actividad antimicrobiana de la lisozima. Otras alteraciones en un polipéptido relacionado con Tp-17 o en un polipéptido de lisozima alteran la función in vitro o in vivo, por ejemplo, como se ha efectuado por la mutágenesis dirigida a sitio o la bioquímica combinatoria. Por ejemplo, se proporcionan variantes de lisozima que han perdido la capacidad para unirse a péptidoglucano pero retienen la capacidad para unirse a un polipéptido similar a Tp17. The invención además proporciona polipéptidos similares a Tp17 que puedan usarse para preparar polipéptidos de fusión con un polipéptido de interés, que puedan purificarse con afinidad de forma económica usando lisozima (por ejemplo, que está unido a un soporte sólido tal como una resina, perlas, un pocilio, cápsula, una columna, un gel, una membrana u un dispositivo de filtros). La información de las secuencias proporcionada por la presente invención
i J / i.- «- 36
también proporciona sondas específicas para la identificación de polipéptidos similares a Tp17, usando una lisozima como sonda, o identificación de lisozima, usando un polipéptído similar a Tp17 como sonda. Además, pueden prepararse anticuerpos frente a secuencias que definan estos sitios de unión usando procedimientos estándar.
Procedimientos para mejorar los procedimientos de detección de infección patógena La presente invención también proporciona la los procedimientos y composiciones para la detección mejorada de anticuerpos antipatógenos en una muestra, por ejemplo, como diagnóstico de infección patógena. Mientras que los ejemplos de tales procedimientos diagnósticos pueden referirse específicamente a la sífilis, un experto en la técnica entenderá que tales procedimientos son en general útiles para detectar una respuesta inmunitaria contra prácticamente cualquier patógeno que produzca un polipéptido similar a Tp-17. Los procedimientos diagnósticos de la invención implican la detección de un anticuerpo antipatógeno en una muestra usando reactivos que incluye, entre otras cosas, lisozima. El Ejemplo 8 proporciona una descripción de un ensayo de ejemplo para la sífilis para detectar anticuerpos antipolipéptído similar a Tp17.Los anteriores y otros procedimientos se analizan con más detalle a continuación. Sin una determinada base teórica, es muy probable que un sujeto son sífilis genere una respuesta inmunítaria, no sólo contra una proteína Tp17 aislada, sino también contra el complejo polipéptido Tp17/lisozíma. El contacto de una muestra biológica de tal sujeto con la lisozima permite la detección de anticuerpos que reconozcan el complejo Tp17/lisozima y aumenta la sensibilidad del ensayo diagnóstico de sífilis. De igual modo, cualquier procedimiento diagnóstico de patógenos que implique la detección de un anticuerpo que reconozca un complejo proteína similar a Tp.17/lisozima se ve aumentado por la inclusión de lisozima en los reactivos de ensayo. Preferentemente, la adición de lisozima a un reactivo de ensayo incrementa la sensibilidad del procedimiento diagnóstico en al menos un 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, o incluso un 85% o un 95% en comparación con los procedimientos diagnósticos estándar. Composiciones v Procedimientos para detectar anticuerpos antipatógénos La invención proporciona composiciones y procedimientos para detectar anticuerpos antipatógeno en una muestra, que son indicativos de la presencia de, o infección por, o de una respuesta inmunológica (por ejemplo, respuesta inmunológica humoral ) a un patógeno bacteriano tal como, por ejemplo, Treponema pallidum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia pestis, Shigella flexnerii, Treponema denticola, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahemolyticus, Chlamydia pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Helicobacter hepaticus, Salmonella typhimurium, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae, Pasteurella multocida, Brucella melitensis, Brucella suis, Mycobacterium tuberculosis, Campylobacter jejuni,
Helicobacter spp., and Agrobacterium tumefaciens, Moraxella catarrhalis, Neisseria meningitidis, Neisseπa gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyii, Propionobacterium acnés, Listeria monocytogenes. Además, la composición se usa para detectar la presencia de, infección por o respuesta inmunológica (por ejemplo, respuesta ¡nmunológica humoral) a un patógeno vírico, tal como, por ejemplo, virus del Herpes Simple tipo 2, virus de la Influenza A , virus TACARIBE , virus Bluetongue , citomegalovirus del chimpancé, citomegalovirus humano, virus del papiloma humano, virus del Dengue , enfermedad de pie-mano- boca , virus de la inmunodeficiencia humana y LdMNPV. Además, la composición se usa para detectar la presencia de, infección por o respuesta inmunológica (por ejemplo, respuesta inmunológica humoral) a un parásito, tal como, por ejemplo, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Emeiria tenella, Eimeria acervulina, Giardia lamblia, Plasmodium yoelii y patógenos transportados por Anopheles gambiae. Además, la composición se usa para detectar la presencia de, infección por o respuesta inmunológica (por ejemplo, respuesta inmunológica humoral) a un
Mycobacterium paratuberculosis, virus de Ébola , virus de la fiebre de Rift Valley , síndrome de dificultad respiratoria grave (SARS) virus, virus de la viruela, Bacillus anthracis, Leishmania Spp., micoplasma, rickettsia, hongos o levaduras. Tales anticuerpos se identifican, por ejemplo, mediante un ensayo que detecta la unión de anticuerpos a un polipéptido similar a Tp17, un polipéptido de lisozima, un complejo de polipéptido similar a Tp17/ polipéptido de lisozima o un fragmento de los mismos. El polipéptido similar a Tp17 o el polipéptido de lisozima puede comprender un marcador de afinidad, tal como, por ejemplo, glutatión S-transferasa (GST), cola de 6-histidina (HIS), proteína de unión a la maltosa, péptido de tipo elastina o una
Strep-Tag (IBA, Goettingen, Alemania). El polipéptido similar a Tp17, la lisozima y/o el complejo polipéptido similar a Tp17-lisozima puede fijarse a un soporte sólido tal como resina, perlas, pocilio, cápsula, columna, gel, membrana, matriz, placa o dispositivo de filtros. El uso de una placa de varios pocilios o de una microcápsula es útil para los análisis a gran escala de numerosas muestras o para analizar una única muestra por duplicado o para detectar la presencia de una serie de agentes patogénicos. En una forma de realización, el procedimiento de la invención comprende detectar la unión, si existe, de anticuerpos antipatógenos presentes en la muestra de (i) el polípéptido similar a Tp17 solo; (ii) la lisozima sola; (iii) el complejo
polipéptido similar a Tp17-lisozima. En una forma de realización, el procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una muestra son un polipéptido similar a Tp17 en las condiciones que permitan la unión de un anticuerpo en la muestra al polipéptido similar a Tp17; y (b) poner en contacto la muestra con una lisozima sustancialmente pura, exógena en las condiciones que permitan la unión de un anticuerpo a la lisozima. El polipéptido similar a Tp17 y la lisozíma pueden estar unidas entre sí o asociadas de manera un anticuerpo pueda unirse a ambas, el polipéptido similar a Tp17 y la lisozima, por ejemplo se puede unir un complejo de polipéptido similar a Tp17 y lísozima. La unión del anticuerpo al polipéptido similar a Tp17, la lisozima o su complejo puede producirse a 15-25 °C, o a cualquier temperatura que permita la unión del anticuerpo al polipéptido similar a Tp17 y/o a la lisozima. En una forma de realización preferida, el ensayo es un ensayo de aglutinación tal como, por ejemplo un ensayo de hemaglutinación realizado como se describe en los ejemplos 8 y 9. Las partículas transportadoras usadas en el ensayo de aglutinación pueden ser, por ejemplo, eritrocitos, partículas agregados proteicos, partículas poliméricas, partículas inorgánicas, partículas paramagnéticas o células de levadura. En una forma de realización preferida, la adición de lisozíma aumenta la hemaglutinación en al menos alrededor de 0,1 a alrededor de 20 veces, alrededor de 0,3 a alrededor de 10 veces o alrededor de 1 a alrededor de
10 veces, por ejemplo, preferiblemente al menos de 3 veces. La lisozima puede proceder de la misma especie que el sujeto del que se extrae la muestra (p. ej., un ser humano). La lisozima se añade al reactivo polipéptído similar a Tp17, el tampón de dilución o cualquiera de los reactivos de vasos usados en el ensayo y puede añadirse en cualquier momento, de una vez o por partes, por ejemplo antes, durante o después de que la muestra ha entrado en contacto con el resto de los reactivos o vasos del ensayo. En una forma de realización concreta, la lisozima exógena está presente en un intervalo de concentraciones de alrededor de 1 femtogramo/ml a alrededor de 999 miligramos/ml. La lisozima está presente en un intervalo de concentraciones de alrededor de 1 nanogramo/ml a alrededor de 999 microgramos/ml. (p. ej., 1 , 10, 25, 50, 100, 250, 500 o 1000 nanogramos o microgramos/ml). En otra forma de realización, los anticuerpos antipatógeno se detectan usando un ensayo de ELISA. Los procedimientos para llevar a cabo los ensayos de ELISA son bien conocidos en la técnica. Brevemente, para detectar la presencia de anticuerpos frente a polipéptidos similares a Tp17 en una muestra, por ejemplo, una fase sólida, tal como una placa de ELISA , se reviste con un polipéptido similar a Tp17 solo, una combinación de polipéptido similar a Tp17 y lisozima, o lisozima sola, en distintos pocilios en una palca. Después de lavar, a los pocilios se añade una muestra que puede contener un anticuerpo antipolipéptido similar a Tp17, un
complejo anticuerpo antípolipéptido similar a Tp17-lisozima , y/o anticuerpo antilisozima. La muestra puede aplicarse a varios pocilios de la placa de ELISA y puede detectarse a través de mareaje directo (si es adecuado), usando una pareja de unión secundaria para el anticuerpo antipolipéptido similar a Tp17 tal como una antilgG humana de conejo que tiene un marcador detectable o ussando un anticuerpo terciario o reactivo de detección (p. ej., estreptavidina-biotina o proteína A o proteína G marcadas). Por otra parte, la detección también se puede llevar a cabo usando un polipéptido similar a Tp17 marcado. Si los anticuerpos específicos están marcados de forma distinta, se puede detectar más de un anticuerpo en la misma muestra, por ejemplo en el mismo pocilio de la placa de ELISA. Esto puede realizarse mediante el uso de marcadores que produzcan señales diferentes que puedan cuantificarse de forma independiente, por ejemplo usando pigmentos con absorciones UV máximas diferentes. Los valores para los pocilios tratados de forma variable pueden compararse para determinar la presencia de anticuerpos frente al polipéptido similar a Tp17 solo, frente al complejo polipéptido similar a Tp17- lisozima y/o frente a la lisozima sola. Cualquiera de los inmunoensayos descritos en la presente puede usarse en la práctica para detectar anticuerpos frente al polipéptido similar a Tp17 y al complejo polipéptido similar a Tp17-lisozima mediante el uso de lisozima para la que se crean, en la fase líquida o en la sólida, complejos polipéptido similar a Tp17-lisozima que puedan unirse a sus anticuerpos conocidos, según procedimientos estándar. Para no limitarnos a una teoría concreta, es probable que el ensayo esté estimulado por la adición de lisozima porque la lisozima forma complejos con los polipéptidos similares a Tp17, formando por tanto sustrato para la unión con anticuerpos que solo se unen al complejo Tp17-lisozima y no al polipéptido similar a
Tp17 solo. En consecuencia, al añadir lisozima al ensayo se detectan en la muestra los anticuerpos dirigidos al polipéptido similar a Tp17 solo, la lisozima sola o el complejo (Figura 4). En una forma de realización de la invención, el ensayo se puede llevar a cabo usando una lisozima natural purificada o recombinante que no tiene actividad de unión al péptidoglucano (por ejemplo, un mutante de lisozima) de forma que se enriquece la unión de la lisozima al polipéptido similar a Tp17. Esta unión selectiva se puede lograr, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio u otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 7. En otra forma de realización, la molécula de lisozima puede alterarse para eliminar su capacidad para unirse al polipéptido similar a Tp17, de forma que el mutante resultante es resistente a la inhibición por un polipéptido similar a Tp17. Tales mutantes pueden exhibir una actividad antimicrobiana aumentada frente a patógenos provistos con factores de virulencia de polipéptidos similares a Tp17.
Las mutaciones localizadas en la secuencia codificadora de la, seleccionados de forma que las actividades acetil muramidasa/o antimicrobiana no se vean afectadas, desestabilizan la interacción lisozimas/inhibidor y confieren resistencia a la inhibición por proteínas patógenas tales como el antígeno de T. pallidum o miembros de la familia Ivy. Tales lisozimas mutantes representan composiciones nuevas e interesantes para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Además, dada su potencia y espectro de actividad mejorados, son superiores a la lisozima de pollo usada en la actualidad en las preparaciones medicinales disponibles en el mercado. Composiciones y procedimientos para inhibir la actividad de la lisozima In Vitro En otro aspecto, la invención proporciona composiciones y procedimientos para reducir la actividad de la lisozima en una muestra mediante el contacto de una muestra con un polipéptido similar a Tp17, o un fragmento del mismo, en el que el polipéptido similar a Tp17 se une e inhibe la actividad de la lisozima en la muestra. El tratamiento es útil para cualquier muestra que requiera la inactivación o la neutralización de la lisozima, tale como, por ejemplo, una preparación de un líquido farmacéutico para la administración a seres humanos, un líquido de cultivo celular, un alimento, una medicina, agua u otros líquidos o agentes de ingestión, un implante, un injerto o cualquier otra preparación en la que no se desea la presencia de lísozima o ésta es perjudicial. Las composiciones y procedimientos de la invención son adecuadas para tratamientos a pequeña o gran escala de suministros de agua, por ejemplo. Las composiciones y procedimientos pueden usarse para inhibir lisozimas en un material que se supone que está libre de contaminación por lisozima , o para los cuales es deseable la inhibición de la actividad de la, tal como una muestra biológica, un vaso de cultivo, una cubeta, una torunda de algodón, aparatos de diagnóstico clínico o material de ensayos, instrumentación médica, cultivos celulares, aspirados de garganta, muestra de líquido cefalorraquídeo o hemocultivos. En algunas formas de realización, el polipéptido similar a Tp17 o los fragmentos de unión a la lisozima está fijado a un soporte sólido y la lisozima presente en la muestra está unida al polipéptido similar a Tp17. En una forma de realización, el material del estómago anterior de un animal rumiante puede analizarse o tratarse usando los procedimientos y composiciones de la invención. Este material incluye bacterias, levaduras, hongos y protozoos, por ejemplo. Esta flora controla la degradación y la asimilación de nutrientes en rumiantes. En una forma de realización, la inhibición de lisozima medíante un polipéptido similar a Tp17 o la inhibición de un polipéptido similar a Tp17 por la lisozima, puede alterara la tasa de asimilación de nutrientes y puede presentar ventajas en ciertas circunstancias. La muestra puede también ser una muestra bacteriana, de forma tal que la recuperación de un extracto patógeno está estimulada por la lisis celular inhibidora .
Además, la invención es útil para identificar una bacteria determinando el punto hasta el cual la lisozima en presencia de un polipéptído similar a Tp17 de secuencia predeterminada puede inhibir la lisis celular bacteriana. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden usarse para distinguir entre infección por VHS-1 y la infección por VHSV-2 (véase el Ejemplo 6).
Procedimiento para reducir la actividad de la lisozima In Vivo La identificación del motivo de unión a la lisozima en los polipéptidos similares a Tp17 también proporciona composiciones y procedimientos (por ejemplo, terapéuticos o profilácticos, incluyendo vacunas) para inhibir, inactivar o neutralizar la actividad de la lisozima en un animal, tal como un mamífero, un ave o un pez. Los polipéptidos similares a Tp17 que comprenden el motivo de unión a la lisozima pueden usarse para bloquear la unión del polipéptido similar a Tp17 con la lisozíma. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para reducir la actividad de la lisozima en un animal mediante la administración de una cantidad eficaz de un polipéptído similar a Tp17. Tal procedimiento puede usarse para tratar o prevenir enfermedades como cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis renal, leucemia, la enfermedad de Crohn y alergias. Procedimientos para detectar patógenos y ligandos de polipéptido similar a Tp17 Las composiciones y procedimientos de la invención pueden también usarse para detectar un patógeno en una muestra. Pueden usarse composiciones que comprendan un ligando capaz de unirse al polipéptído similar a Tp17, tal como polipéptidos de lisozima o una molécula que pueda competir con la unión de la lisozima. Por otra parte, el ligando puede ser un anticuerpo monoclonal , un anticuerpo policlonal o un fragmento Fab que se une al polipéptido similar a Tp17. Los ligandos pueden detectarse directamente, por ejemplo unidas a una molécula de detección, tal como un fluoróforo, una proteína fluorescente, un cromóforo, una fracción radioactiva, una fracción luminífera o un indicador o marcador enzimáticamente activo. Los ejemplos de moléculas de detección son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, conjugados de fluoresceína, conjugados de peroxidasa de rábano, conjugados de fosfatasa alcalina y conjugados de isoluminol. En esta forma de realización de la invención, se pone en contacto una muestra con lísozima u otro ligando similar a Tp17 en las condiciones que permitan la unión del ligando a un patógeno o a un polipéptido patógeno y se detecta la unión de la lisozima al patógeno o al polipéptido patógeno, si está presente. Tal unión es indicativa de la presencia del patógeno o del polipéptido patógeno en la muestra. Las composiciones y procedimientos de la invención también son útiles para detectar la presencia de lisozima en una muestra. Una muestra se pone en contacto con un polipéptido similar a Tp17 y se detecta la unión del polipéptido similar a Tp17 a la lisozima en la muestra.
Equipos Las composiciones y procedimientos de la invención pueden realizarse en un equipo que contenga al menos uno de los siguientes un polipéptido similar a Tp17, lisozima y ligandos de los mismos. Los reactivos necesarios o útiles para administración, ensayo o purificación del polipéptido similar a Tp17 o del polipéptido lisozima también pueden estar incluidos en el equipo, tal como vasos de reacción (por ejemplo, que comprendan un soporte sólido, una resina, perlas, pocilios, cápsula, columna, gel, membrana y dispositivos de filtración), valores estándar de control o manuales de instrucciones. Péptidos de fusión y cromatografía de afinidad Los polipéptidos similares a Tp17 de la invención son útiles como marcadores de afinidad para usar en cromatografía de afinidad usando polipéptidos de lisozima, por ejemplo, que estén unidos a un soporte sólido, así como una columna. Por tanto, la invención proporciona proteínas de fusión recombinantes (por ejemplo, proteínas de fusión Tp17) que comprenden una primera secuencia polipeptídica unida por un enlace peptídíco a una segunda secuencia polipeptídica, en la que la primera secuencia polipeptídica comprende un polipéptido similar a Tp17 y la segunda secuencia polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos de interés. En una forma de realización, la primera secuencia polipeptídica está unida de forma natural a la segunda secuencia polipeptídica. El polipéptido similar a Tp17 actúa como un cásete de purificación que se usa para unir el polipéptido de interés a la columna de afinidad de la lisozima. El cásete de purificación puede colocarse en cualquier lugar de la molécula, por ejemplo en el extremo N terminal o en el extremo C terminal del polipéptido de interés. Por otra parte, el cásete de purificación puede colocarse entre el extremo N terminal y el extremo C terminal. El polipéptido recombinante de fusión se prepara uniendo una primera secuencia polípeptídica mediante un enlace peptídico a una segunda secuencia polipeptídica, en la que la primera secuencia polipeptídica comprende un cásete de purificación de polipéptido similar a Tp17 y la segunda secuencia polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos de interés. A continuación la proteína de fusión Tp17 se usa en procedimientos para purificar el polipéptido de interés poniendo en contacto una muestra que comprende la proteína de fusión Tp17 con lisozima en condiciones que permitan la unión del polipéptido similar a Tp17 con la lisozima. Después, el complejo formado se lava y la proteína de fusión Tp17 se eluye de la lisozima y puede aislarse la proteína de interés a partir del cásete de purificación según procedimientos bien conocidos en la técnica. En una forma de realización, el fragmento del polipéptido similar a TP17 es un fragmento de 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75 ó 100 aminoácidos que comprende al menos una secuencia consenso de unión a lisozima (p. ej., SEC ID N° 1). Procedimientos para tratar o prevenir otras enfermedades
Se proporcionan polipéptidos de lísozima que no se unen a al menos algunos polipéptidos similares a Tp17 (p. ej., inhibición de las funciones de la lisozima) debido a la presencia de mutaciones. Estas mutaciones están dirigidas a residuos que no afectan a la actividad catalítica de la lisozima. Tales polipéptidos de lisozima alterados se preparan mediante procedimientos estándar (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio o aleatoria, como se describe en la presente). Tales lisozimas son útiles para evitar la inhibición por los polipéptídos similares a Tp17 y pueden usarse para prevenir o tratar infecciones patógenas. La invención también proporciona procedimientos para inhibir infecciones patógenas mediante la administración de una cantidad eficaz de un polipéptido de lisozima que no pueda unirse a los polipéptidos similares a Tp17. La invención también proporciona un reactivo que inhibe la unión de un inhibidor de lisozima tal como un polipéptido similar a Tp17 al E53 de una lisozima (la numeración se refiere a la secuencia de lisozima humana de longitud total depositada bajo el número de acceso P00695NP_000230). En una forma de realización preferida, el reactivo es un polipéptido, una sustancia química, un fármaco, un anticuerpo, un ácido nucleico, un aptámero o PNA. El inhibidor es, por ejemplo, cualquier molécula de estas que impida la unión de polipéptidos similares a Tp17 al E53 de la lisozima. Ensayos de selección
Como se ha comentado antes, la unión de un polipéptido similar a Tp17 a un polipéptido de lísozima puede inhibir la actividad antimicrobiana de la lisozima. Según este descubrimiento, las composiciones de la invención son útiles para la selección de bajo coste y alto rendimiento de compuestos candidatos para identificar los que incrementan o disminuyen la afinidad de unión entre un polipéptido similar a TP17 y un polipéptido de lisozima. Se dispone de una serie de procedimientos que se contemplan en esta invención para llevar a cabo los ensayos de selección para identificar nuevos compuestos candidatos que modulan la afinidad de unión de un polipéptido similar a TP17 y un polipéptido de lisozima. En una forma de realización, los compuestos candidatos se seleccionan según lo que se unen de forma específica a un polipéptido similar a Tp17 o a polipéptidos de lisozima. La eficacia de tal compuesto candidato depende de su capacidad para interaccionar con tal polipéptido o un equivalente funcional del mismo. Tal interacción se puede analizar con facilidad usando un número de técnicas de unión estándar y ensayos funcionales (p, ej., los descritos por Ausubel y col., supra). En una forma de realización, un compuesto candidato puede probarse in vitro para determinar su capacidad para unirse de forma específica a un polipéptido de la invención. En otra forma de realización, un compuesto candidato se prueba in vitro para determinar su capacidad para aumentar la actividad biológica de un polipéptido de lisozima descrito en la presente memoria descriptiva,
tal como un polipéptido similar a Tp-17 o un polipéptído de lisozima. El efecto de la actividad biológica del compuesto candidato sobre el polipéptido similar a Tp-17 y/o el polipéptido de lisozima se analiza usando cualquier procedimiento estándar, conocido para e profesional experto, tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 3. En un ejemplo concreto, un compuesto candidato que se une a un polipéptido similar a Tp-17 o a un polipéptido de lisozima se identifica usando una técnica basada en cromatografía. Por ejemplo, un polipéptido recombinante de la invención se puede purificar mediante técnicas estándar a partir de las células producidas por ingeniería genética para expresar el polípéptido (p. ej., las descritas en la presente) y pueden inmovilizarse en una columna. Una solución de compuestos candidatos se pasa a través de la columna y un compuesto que interaccione de forma específica con un polipéptído similar a Tp-17 o una lisozima se identifica sobre la base de su capacidad para unirse al polipéptido e inmovilizarse en la columna. Para aislar el compuesto, la columna se lava para eliminar las moléculas que no se han unido de forma específica y el compuesto de interés se libera a continuación de la columna y se recoge. Se pueden usar procedimientos similares para aislar un compuesto unido a una micromatriz polípeptídica, por ejemplo, una matriz que contenga una pluralidad de motivos de unión a lisozima similar a Tp17. Los compuestos aislados mediante este procedimiento (o cualquier otro procedimiento adecuado) pueden , si se desea, purificarse más (p. ej., mediante cromatografía líquida de alto rendimiento). Además, estos compuestos candidatos pueden probarse para determinar su capacidad para modular la afinidad de unión entre un polipéptido similar a Tp17 y un polipéptído de lisozima. La unión puede alterarse, por ejemplo, mediante incremento o disminución del número de moléculas en complejos, la alteración de la afinidad de unión, la alteración de la probabilidad de que se forme un complejo o la competición con una o ambas moléculas por la unión. En otras formas de realización, el compuesto se analiza para determinar su capacidad para incrementa la actividad antimicrobiana de la lisozima. En otras formas de realización, el compuesto se analiza para determinar su capacidad para modular la interacción entre un polipéptido que contiene un motivo consenso CX(1 ,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C (tal como una proteína precursora de β-amiloide) y un polipéptido de lisozima. Los compuestos aislados medíante este abordaje se pueden usar, por ejemplo, como terapéuticos para tratar una infección patógena, un trastorno por lisozima o la enfermedad de Alzheímer en un paciente humano. Los compuestos que se identifican como que se unen a un polipéptido de la invención con una constante de afinidad inferior a o igual a 10 mM se consideran particularmente útiles en la invención. Como alternativa se puede usar cualquier sistema de detección de interacciones proteicas in vivo, por ejemplo, cualquier ensayo con dos híbridos.
Entre los posibles agonistas y antagonistas se incluyen moléculas orgánicas, péptidos, miméticos peptídicos, polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos que se unen a una secuencia de ácido nucleico o a un polipéptido de la invención, tal como un polipéptido relacionado con Tp-17 o un polipéptido de lisozima. Para los pacientes que presentan un trastorno caracterizado por la inhibición de la lisozima por el polipéptido similar a Tp-17 (p. ej., una infección patógena), los compuestos que inhiben la unión del polipéptido similar a Tp-17 a la lisozima o que aumentan la actividad antimicrobiana de la lisozima o su actividad enzimática son particularmente útiles. Para los pacientes que tienen un trastorno caracterizado por un exceso de actividad de la lisozima, un compuesto que se une a la lisozima e inhibe su actividad, o que incrementa la unión entre un polipéptido similar a Tp-17 y la lisozima son particularmente útiles. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptídos similares a Tp-17 y los polipéptidos de lisozima que se enumeran en la presente memoria descriptiva también pueden usarse en el descubrimiento y desarrollo de un compuesto terapéutico para el tratamiento de pacientes con una infección patógena, un trastorno por lisozima o la enfermedad de Alzheimer. Las proteínas codificadas, tras su expresión, pueden usarse como objetivos para la selección de fármacos. Opcionalmente, los compuestos identificados en cualquiera de los ensayos descritos antes pueden confirmarse como útiles en un ensayo in vivo para compuestos que modulan la unión entre un polipéptido similar a Tp-17 y un polipéptido de lisozima o que modulan la actividad de un polipéptido de lisozima. Las moléculas pequeñas de la invención, preferentemente tiene un peso molecular por debajo de 2.000 daltons, más preferentemente entre 300 y 1.000 daltons y más preferentemente entre 400 y 700 daltons. Se prefiere que estas moléculas pequeñas sean moléculas orgánicas. Compuestos y Extractos de prueba En general, los compuestos capaces para modular la unión de un polipéptido similar a Tp-17 un polipéptido de lisozima se identifican de una serie de bibliotecas de gran tamaño de productos naturales o extractos sintéticos (o semisintéticos) o bibliotecas químicas o de bibliotecas de polipéptidos o de ácidos nucleicos, según los procedimientos conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica de descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos entenderán que la fuente exacta de los extractos o compuestos de prueba no es fundamental para el o los procedimientos de selección. De la invención. Los compuestos usados en las detecciones pueden incluir compuestos conocidos (p. ej., terapéuticos conocidos usados para otras enfermedades o trastornos). Como alternativa, casi cualquier número de extractos o compuestos químicos desconocidos se pueden seleccionar usando los procedimientos descritos en la presente. Ejemplos de tales extractos o compuestos incluyen, aunque no se limita a ellos, extractos vegetales, fúngicos,
procarióticos o animales, caldos de fermentación y compuestos sintéticos, así como modificación de compuestos existentes. También se dispone de numerosos procedimientos para generar síntesis dirigida o aleatoria (p. ej., semisíntesis o síntesis total) de cualquier número de compuestos químicos, incluidos, pero no limitados a ellos, compuestos de base sacárida, lipídica, peptídica y nucleica. Las bibliotecas se compuestos sintéticos se comercializan por Brandos Associates (Merrimack, N. H.) y Aldrích Chemical (Milwaukee, Wis). Como alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles en el mercado en numerosas fuentes, incluidos Biotics (Sussex, RU), Xenova (Solugh, rU), Harbor branco Oceangraphics
Institute (Ft. Pierce, Fia) y Phatma Mar, EE.UU. (Cambridge, Mass). Además, las bibliotecas naturales y sintética se producen, si se desea, según procedimientos conocidos en la técnica, p. ej., mediante procedimientos estándar de extracción y fracionamiento. Además, si se desea, cualquier biblioteca o compuesto se modifica con facilidad usando procedimientos bioquímicos, químicos o físicos estándar. Además, los expertos en la técnica del descubrimiento y desarrollo de fármacos entenderán con facilidad que los procedimientos para la desreplicación (p. ej., desreplicación taxonómica, desreplicación biológica y desreplicación química, o combinaciones de los mismos) o la eliminación de replicados o repeticiones de materiales ya conocidos por su actividad debe emplearse siempre que sea posible. Cuando se encuentra que un extracto bruto modula la unión entre un polipéptido similar a Tp17 y un polipéptído de lisozima, es necesario más fraccionamiento del extracto positivo para aislar los constituyentes químicos responsables del efecto observado. Por tanto, el objetivo de la extracción, el fraccionamiento y la purificación es la caracterización cuidadosa de una entidad química en el extracto bruto que altera la unión entre un polipéptido similar a Tp17 y un polipéptído de lísozima. Los procedimientos de fraccionamiento y purificación de tales extractos heterogéneos se conocen en la técnica. Si se desea, los compuestos que se ha mostrado que son útiles como terapéuticos para el tratamiento de una infección patógena o un trastorno por lisozima se modifican químicamente según procedimientos conocidos en la técnica. Preparación de anticuerpos Pueden prepararse anticuerpos monoclonales adecuados para usar en los inmunoensayos de la invención mediante procedimientos de hibridoma estándar, usando ensayos de unión diferencia para asegurar que los anticuerpos son específicos para un polipéptido similar a Tp17, lisozima, un complejo polipéptído similar a Tp17-lisozima u otro antígeno de interés y no muestran reactividad cruzada o muestran una reactividad cruzada limitada entre las proteínas relacionadas. Por otro lado, pueden prepararse anticuerpos monoclonales adecuados usando procedimientos de ingeniería de anticuerpos como expresión en
fagos. En la técnica se conocen procedimientos para obtener anticuerpos altamente específicos procedentes de bibliotecas de fagos que expresan anticuerpos y hay varias bibliotecas de fagos de expresión de anticuerpos disponibles en el mercado de, por ejemplo, MorphoSys (Martinsried, Alemania), Cambridge Anticuerpo Technology (Cambridge, GB) y Dyax (Cambridge, MA). Procedimientos adecuados de expresión en fagos se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n°. 6,.00.064 y 5.969.108, que se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Véase también, por ejemplo "Anticuerpo Engineering," McCafferty y col. (Eds.)(IRL Press 1996) y la bibliografía que contiene. Los procedimientos de expresión de anticuerpos en fagos pueden usar bibliotecas de anticuerpos en el formato Fab o scFv. Una vez que se recuperan los genes de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos del fago, pueden prepararse en cualquier formato adecuado (por ejemplo, anticuerpos enteros, Fab, scFv, etc.). También se pueden usar otras preparaciones de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos Camelid, que contienen solo las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas. Véase, por ejemplo, Muyldermans y col. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302 y la bibliografía que contiene. Por otra parte, pueden usarse preparaciones de anticuerpos policlonales para detectar antígenos tales como polipéptidos similares a Tp17, lisozíma, u otros antígenos de interés. Los procedimientos de expresión en fagos también pueden usarse para preparar poblaciones reproducibles de anticuerpos policlonales. Por ejemplo, en una biblioteca de anticuerpos pueden eliminarse de forma exhaustiva los clones que sufran reacción cruzada por absorción en los antígenos unidos a una superficie sólida y después pasados sobre una superficie sólida para identificar los anticuerpos que se unen al antígeno de interés En la población de clones resultante se pueden eliminar también los clones que muestran reactividad cruzada por absorción sobre superficies con proteínas irrelevantes, tales como seroalbúmina bovina, etc., usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Esto resulta en la identificación de una población de anticuerpos que se unen de forma específica a un antígeno de interés. También pueden prepararse anticuerpos policlonales específicos para un antígeno de interés usando procedimientos tradicionales con animales. Estos antígenos, tales como, por ejemplo, péptidos, pueden conjugarse en sus extremos N o C a sus proteínas transportadoras tales como seroalbúmina bovina (SAB) o hemocianina de lapa californiana (KLH) y usarse para inmunizar animales, tales como conejos, usando regímenes de inmunización bien conocidos. Pueden obtenerse anticuerpos policlonales específicos a partir del suero del animal mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad sobre una matriz que contiene el péptido usado para la inmunización unido a un soporte sólido. De nuevo, por ejemplo, el antisuero formado frente a polipéptidos similares a Tp17 puede
adsorberse frente a otros polipéptidos unidos a un soporte sólido para eliminar los anticuerpos con reactividad cruzada, y viceversa.
Inmunoensayos En la práctica de los procedimientos de la invención puede usarse cualquier número de ¡nmunoensayos. Por ejemplo, ensayo de ¡nmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), ensayos de aglutinación, radioinmunoensayos, ensayos turbidimétricos, ensayo nefelométrico, inmunocromatografía, ensayos de quimiolumíniscencia y ensayos de fluorescencia. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica y se describen con detalle en la presente (Andreotti y col. (2003) Biotechniques 35:850-859). Los procedimientos para llevar a cabo ensayos ELISA son bien conocidos en la técnica. Brevemente, para detectar la presencia de polipéptidos similares a Tp17 en una muestra, se reviste, por ejemplo, una fase sólida, como una placa de ELISA , con lisozima. Después de lavar, se añade una muestra que pueda contener un polipéptido similar a Tp17. La muestra puede aplicarse a varios pocilios de la placa de ELISA y detectarse a través de mareaje directo (si es adecuado), usando un anticuerpo frente a un polipéptido similar a Tp17 que está marcado o usando anticuerpos secundarios y anticuerpos terciarios o reactivos de detección (estreptavidina-biotina) o proteína A o proteína G marcadas. Si los anticuerpos específicos están marcados de forma distinta, se puede detectar más de un antígeno en la misma muestra, por ejemplo en el mismo pocilio de la placa de ELISA. Esto requiere el uso de marcadores que produzcan señales diferentes que puedan cuantificarse de forma independiente, por ejemplo usando pigmentos con absorciones UV máximas diferentes. Pigmentos y espectros útiles incluyen, pero no se limitan a ellos, ABTS (ácido 2, 2' - azinobis ( 3-etilen-tiazolin-b-sulfónico) sustrato cromogénico para la peroxidasa de rábano (absorbe la luz a 410nm) y TMB (3, 3', 5, 5' - Tetrametil bencidina) sustrato cromogénico para la peroxidasa de rábano (absorbe la luz a 450 nm tras la adición de H2SO 1 M. Otros procedimientos de detección de proteínas conocidos pueden usarse en vez de o además de los inmunoensayos anteriores. Por ejemplo, cuando se usan anticuerpos frente a epítopos proteicos que no son de superficie, antes de la detección puede usarse digestión enzimática o química de las proteínas (por ejemplo, CNBr). Por ejemplo, podría obtenerse un polipéptido similar a Tp17 de longitud total usando un anticuerpo genérico que se une al polipéptido similar a Tp17, seguido por digestión enzimática de las proteínas y detección de anticuerpos específicos de polipéptidos similares a Tp17. En Kaiser y col. (1999) Anal. Bíochem. 266:1-8 se describen procedimientos mejorados para la digestión de proteínas con CNBr . Otros procedimientos que pueden usarse incluyen transferencia Western, transferencia Far Western, inmunohistoquímica, técnicas de transferencia spot/slot ,
chips proteicos y biosensores. Para el Western Blot, por ejemplo, las muestras proteicas por duplicado pueden someterse a electroforesis en gel de acrilamida y transferirse a una membrana como nitrocelulosa o PVDF. Una transferencia se detecta con un anticuerpo para un polipéptido similar a Tp17 y una marca se detecta con un anticuerpo frente a una proteína control. A continuación, estos anticuerpos primarios se detectan, por ejemplo, con anticuerpos secundarios marcados. Por otro lado, cada anticuerpo específico de una proteína de interés y de una proteína control se marca con un pigmento fluorescente diferente y reaccionan con la misma marca de forma simultánea. Se mide la intensidad de la fluorescencia de cada pigmento y la tase de intensidad indica la proporción de las dos proteínas. Una transferencia Far Western implica la inmovilización de una proteína en un soporte sólido, poniendo una sonda en el soporte con un ligando más probable que se una directamente a la proteína, y la ¡nmunodetección del ligando de la proteína unida. Un ejemplo de Western blot far se muestra en la Figura 5 y se describe con detalle en el Ejemplo 2. Para la inmunohistoquímica, pueden tratarse secciones tisulares por duplicado con anticuerpos específicos de un polipéptido de interés y un polipéptido control. Estos anticuerpos primarios pueden teñirse directamente o pueden detectarse con anticuerpos secundarios adecuados. La intensidad de la tinción puede medirse con una cámara con dispositivo de carga acoplado (DCA) y se cuantífican las proteínas. La tasa de intensidad de la tinción indica la proporción de las cantidades de proteínas. Por otro lado, se puede teñir una única sección con ambos anticuerpos si los anticuerpos se han marcado con marcadores fluorescentes diferentes. Las técnicas de transferencia Spot/slot también son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, cantidades idénticas de una muestra biológica que contiene anticuerpo frente a polipéptido similar a Tp17, anticuerpo frente al complejo polipéptido similar a Tp17-lisozima o anticuerpo frente a lisozima pueden marcarse directamente en una membrana y detectarse con polipéptido similar a Tp17, lisozima y/o el complejo polipéptido similar a Tp17-lisozima, como se ha descrito antes. Las sondas pueden marcarse o puede usarse un ligando secundario. En la técnica se conocen muchos tipos de procedimientos basados en biosensores y pueden usarse para detectar y cuantíficar anticuerpos antipolipéptido similar a Tp17, anticuerpos anticomplejo polipéptido similar a Tp17-lisozima o anticuerpos antilisozima. Por ejemplo, a la superficie del biosensor pueden unirse muestras con anticuerpos específicos de polipéptido similar a Tp17 y/o lisozima de manera que cuando el polipéptido similar a Tp17 y/o la lisozima se una a la superficie recubierta se produzca algún cambio detectable en alguna propiedad de la superficie. Los bíosensores miden, por ejemplo, cambios de masa en la superficie, cambios en las propiedades eléctricas o cambios en las propiedades
ópticas. Cada uno de estos procedimientos se conoce bien en la técnica y son adecuados para usar en los presentes procedimientos. Procedimientos basados en biosensores están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Bíacore (Piscataway, NJ) y son adecuados para usar en la presente invención para detectar y cuantificar cambios en los niveles de anticuerpos frente a polipéptído similar a Tp17 y/o lisozima. Véase también, por ejemplo, los procedimientos de detección de proteínas descritos en la patente de EE.UU. No. 6.225.047, los contenidos de la cual se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, y Davies y col. (1999) Biotechniques 27:1258-61. Procedimientos de detección de proteínas con cápsula comerciales están disponibles en Ciphergen
(Fremont, CA). La invención puede aumentarse de escala para detectar o diferenciar entre dos o más patógenos, por ejemplo, para determinar si una cepa de bacterias es una cepa resistente a fármacos o es incapaz de unirse o inhibir la lisozima. En otra forma de realización, cualquiera de los procedimientos descritos en la presente pueden ser inmunoensayos competitivos, que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un inmunoensayo de tipo sandwich competitivo para medir el nivel de anticuerpo frente a un polipéptido similar a Tp17 y/o frente a lisozima, en el que se usan anticuerpos conocidos frente a polipéptido similar a Tp17 para competir con el anticuerpo frente a polipéptído similar a Tp17 en la muestra para la unión al polipéptido similar a Tp17. Por ejemplo, pueden incubarse diluciones seriadas de anticuerpos conocidos frente a polipéptido similar a Tp17 con la muestra o con el polipéptido similar a Tp17 antes de la adición al ensayo. También se pueden usar procedimientos de espectrometría de masas para la detección de proteínas y para detectar y cuantificar cambios en los niveles de anticuerpos o fragmentos de los mismos, frente a polipéptido similar a Tp17 y/o lisozima en una muestra, por ejemplo. Véase, por ejemplo, los procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. n° 5.719.060; 5.894.063; y Shimizu y col. (2002) J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 25:776:15-30; Kiernan y coll. (2002) Anal. Biochem. 301:49-56; y Pramanik y col. (2002) Protein Sci. 11 :2676-87. Procedimientos de detección de proteínas basados en espectrometría de masas también se pueden conseguir en Ciphergen (Fremont, CA). Muestra biológica La muestra analizada o tratada usando cualquiera de las composiciones y procedimientos de la invención puede comprender una muestra corporal como sangre, suero, plasma, lágrimas, saliva, fluido nasal, esputos, fluido ótico, flujo genital, fluido de las mamas, calostro, leche, líquido placentario, sudor, líquido sinovial, líquido ascítíco, líquido cefalorraquídeo, bilis, fluido gástrico, fluido gastrointestinal, exudado, transudado, líquido pleural, líquido pericárdico, semen,
material fecal, fluido de las vías aéreas superiores, líquido peritoneal, líquido recogido de un sitio con inflamación, líquido recogido de un sitio de acumulación, lavado bronquial, orina, humor acuoso, material de biopsia, material del estómago anterior de un animal rumiante, muestra de células nucleadas, líquido asociado con una superficie mucosa, por ejemplo. Por otra parte, las composiciones y procedimientos según la invención pueden realizarse sobre muestras de células secas (por ejemplo, pelo o piel) o muestras de biopsia de cualquier tejido en el que se expresen o depositen los genes de interés o los anticuerpos. Otras muestras Como se usa en la presente, "muestra" también significa cualquier muestra diagnóstica, experimental o clínica de la que se pueda sospechar que contienen lisozima o un polipéptido similar a Tp17, que, por el contrario, requiere análisis o tratamiento para detectar la presencia de lisozima o de un polipéptído similar a Tp17 o de un anticuerpo frente a ellos, tal como vasos de cultivo, cubetas, torundas de algodón, instrumentación médica (por ejemplo, instrumentación quirúrgica). Una muestra también puede ser un cultivo celular o de líquido (por ejemplo, aspirado de garganta, muestra de líquido cefalorraquídeo, hemocultivo). Una muestra puede ser una preparación patógena, tal como, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un plásmido, un micoplasma, un agente micótico (por ejemplo, un hongo o una levadura) o una preparación previa. La muestra puede ser un agente líquido o sólido, tal como un alimento, un medicamento, un implante, un injerto, un medio de cultivo celular o tisular, una muestra de agua u otra solución, reactivo o aparato para los cuales la esterilidad es algo deseable o requerido. Las composiciones y procedimientos pueden usarse para diagnosticar o tratar la contaminación o la infección por patógenos, por ejemplo, enfermedades relacionadas con patógenos tales como, por ejemplo, sífilis, infección por VIH, herpes genital, peste bubónica, disentería, shigellosis, caries dental , infección por E coli, fibrosis quística, tuberculosis, cólera, infecciones por estreptococos del grupo A o del grupo B, infecciones por estafilococos, úlcera gástrica, tos ferina, clamidiosis, brucellosis, otitis media, meningitis, gripe, paludismo, salmonelosis, gonorrea, vibriosis, colibacilosis, neumonía, bronquitis, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (SDRA). En una forma de realización, las composiciones y procedimientos de la invención son útiles en el diagnóstico o tratamiento de enfermedades de depósito citoplasmáticos tales como enfermedades de depósito de lisosomas. Además, las composiciones y procedimientos de la invención pueden usarse para diagnosticar o tratar enfermedades como cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedad de Alzheimer, amiloidosis renal, leucemia, enfermedad de Crohn y alergias. Administración
Los inhibidores de polipéptidos similares a Tp17 que compiten con los polipéptidos similares a Tp17 para unirse con la lisozima pueden administrarse a un sujeto (p. ej., un mamífero tal como un ser humano) para inhibir la unión de los polipéptidos similares a Tp17 a la lisozima, de forma que la lisozima puede combatir el agente patogénico. Por otro lado, puede administrarse lisozima mutante insensible a la inhibición por los polipéptidos similares a Tp17. Cualquier medio técnico (por ejemplo, fármacos químicos, péptidos competidores, anticuerpos, vectores, ARNsi) que interfiera en la unión de la lisozima y sus inhibidores conocidos (por ejemplo, tales como un polipéptido similar a Tp17) puede usarse profilácticamente o terapéuticamente para combatir la enfermedad patogénica causada por cualquier patógeno que comprenda tal inhibidor (por ejemplo, sífilis, , infección por VIH, herpes genital, peste bubónica, disentería, shigellosis, caries dental , infección por E coli, fibrosis quística, tuberculosis, cólera, infecciones por estreptococos del grupo A o del grupo B, infecciones por estafilococos, úlcera gástrica, tos ferina, infecciones por enterococos, clamidiosis, brucellosis, otitis media, meningitis, gripe, paludismo, salmonelosis, gonorrea, vibriosis, colibacilosis, neumonía, bronquitis, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave (SDRA), por ejemplo. En una forma de realización, las composiciones y procedimientos de la invención son útiles en la profilaxis o tratamiento de enfermedades de depósito citoplásmico, tales como enfermedades de depósito de lisosomas. Por otro lado, los ligandos que compiten con lisozima por la unión con polipéptidos similares a Tp17 pueden administrarse a pacientes para inactivar la actividad de la lisozima en pacientes que sufren enfermedades relacionadas con una superproducción de lisozima o cualquier enfermedad o trastorno en el que se desea una disminución de la actividad de la lisozima. Las preparaciones para la administración oral de inhibidores de la unión de polipéptido similar a Tp17/lisozima pueden formularse de forma adecuada para proporcionar la liberación controlada del compuesto activo. Para la administración oral, los inhibidores pueden tener al forma de comprimidos o pildoras formuladas de forma convencional. Por otro lado en una zona se puede frotar, pulverizar o aplicar los inhibidores antes de obtener una muestra postratamiento (por ejemplo, mediante raspado). Para la administración por inhalación, los inhibidores para usar según los procedimientos de la invención se liberan convenientemente en la forma de un aerosol en envases presurizados o nebulizadores, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para liberar una cantidad medida. Las cápsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para usar en un inhalador o insuflador pueden
formularse conteniendo una mezcla de polvos de los inhibidores y un polvo base adecuado tal como lactosa o almidón. Los inhibidores pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitarias, por ejemplo, en ampollas o envases multidosis, con un conservante añadido. Los inhibidores pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o de dispersión. Por otra parte, los inhibidores pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de usar. Los inhibidores también pueden formularse para su administración por vía rectal, inhibidores tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que conteniendo bases de supositorio convencional tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Los inhibidores también pueden formularse como una preparación depot. Por ejemplo, sistemas depot parenterales (SDP) se inyectan o implantas en el músculo o en el tejido subcutáneo y el fármaco incorporado se libera de forma controlada, permitiendo el ajuste de las tasas de liberación en periodos extensos , que oscilan desde varios días a un año. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Los inhibidores pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados muy poco solubles, como una sal muy poco soluble. Otros sistemas de liberación adecuados incluyen microesferas que ofrecen la posibilidad de liberar localmente de forma no invasiva los inhibidores a lo largo de un periodo extenso de tiempo. Esta tecnología usa microesferas de tamaño precapilar que pueden inyectarse a través de un catéter coronario en una parte seleccionada del cuerpo, por ejemplo, el ojo u otros órganos, sin causar inflamación o isquemia. El inhibidor administrado se libera despacio de estas microesferas y es captado por las células de los tejidos adyacentes. La administración sistémica de los inhibidores también puede ser por vía transmucosa o transdérmica. Para las administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan agentes de penetración adecuados para atravesar la barrera. Generalmente, tales penetrantes se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa sales biliares y derivados de ácido fusídico. Además, para facilitar la permeabilizacíón pueden usarse detergentes. La administración transmucosa puede realizarse a través de pulverizadores nasales o usando supositorios. Para la administración tópica, los oligómeros de la invención
se formulan como ungüentos, pomadas espesas, geles o cremas, como generalmente se conocen en la técnica. Se puede usar una solución de lavado localmente para tratar una lesión o inflamación para acelerar la cicatrización. Células La invención puede requerir células para la preparación o análisis de péptidos patógenos, por ejemplo. Líneas celulares animales o bacterianas primarias o permanentes cultivadas pueden ser: células primarias (incluyendo, pero no se restringe a estas, monocitos, sinoviocitos, fibroblastos y células endoteliales) derivadas del mismo sujeto que la muestra de líquido o derivadas de otro individuo; líneas celulares permanentes de una gama de tejidos y órganos como origen
(incluidas, pero no restringidas a ellas, líneas celulares disponibles en depósitos acceso público como la American Tissue Type Collection); o líneas celulares primarias o permanentes que se han sometido a transfeccíón estable con constructos "promotor-lector". Las técnicas de cultivo de células bacterianas se conocen bien en la técnica.
Por ejemplo, las células bacterianas pueden creces en caldo 2XYT en un agitador a 37°C. Procedimientos para el crecimiento de bacterias transformadas con un plásmido o un virus también pueden incluir el crecimiento en agentes selectivos tales como ampicilina u otro antibiótico. Las preparaciones de células y usados celulares, así como purificación de proteínas y ácidos nucleicos también son bien conocidos en la técnica. La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmmunología, dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía. Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Sambrook et y col. (Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Capítulos 16 y 17; Hogan y col. (1986) Manípulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; U.S. Patente n° 4.683.195; DNA Cloning, Volúmenes I y II (1985)
Glover (Ed.); Olígonucleotíde Synthesis (1984) Gait (Ed.); Nucleic Acíd Hybridization (1984) Hames & Higgins (Eds.); Transcriptíon and Translation (1984) Hames & Higgins (Eds.); Culture Of Animal Cells (1987) Freshney, Alan R. Liss, Inc.; Immobilized Cells And Enzymes (1986) IRL Press; Perbal (1984) A Practical Guíde To Molecular Cloning; Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene
Transfer Vectors For Mammalian Cells (1987) Miller and Calos (Eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu et al. (Eds.) Academic Press Inc., N.Y.; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (1987) Mayer and Walker (Eds.) Academic Press, London; Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes l-IV (1986) Weir y Blackwell (Eds.).
Por tanto, los procedimientos de la invención son útiles como herramienta diagnóstica y pronostica, como un medio para tratar o inmunizar frente a enfermedades, para controlar la progresión y resolución de la enfermedad, para seguir la respuesta o la ausencia de la misma, como terapia, para evaluar la eficacia de medicación alternativa o concomitante y para establecer la dosis terapéutica correcta de un medicamento, Los procedimientos de la invención también pueden usarse, en el contexto de la investigación y desarrollo de fármacos, para valorar la eficacia potencial y los efectos secundarios de fármacos en investigación y aprobados en muestras biológicas obtenidas en el curso de pruebas en animales y/o en ensayos clínicos de fases I, II, III y IV y/o estudios posteriores a la comercialización. Ejemplos La práctica de la invención se entenderá más completamente a partir de los siguientes ejemplos, que se presentan en la presente sólo con propósitos ilustrativos y no deben interpretarse como ejemplos que limitan la invención de ninguna manera.
EJEMPLO 1: Lisozima de pollo copurifica con formas recombinantes del antígeno de 17 kDa de Treponema Pallidum En el contexto de la purificación del antígeno Tp17 recombinante de T. pallidum derivado de E. coli (GST-Tp17 o Tp17-HIS), se purificó de forma simultánea con Tp17una proteína. Esta proteína "contaminante", que tenía un peso molecular de 14KDa y no reaccionó con un suero policlonal ant¡Tp17, se identificó como la lisozima de pollo como se describe a continuación. . Se separó una fracción proteica que contenía ambas entidades (Tp17 y el "contaminante") mediante PAGE-SDS, se escindió del gel y se sometió a secuenciación de los aminoácidos del extremo N. El experimento dio pequeñas secuencias peptídicas N-terminales (6 - 7 aminoácidos) que coincidían perfectamente con la secuencia esperada del antígeno Tp17 de T. pallidum o de la lisozima de pollo, que se había incluido en el tampón de resuspensión de la pasta celular para facilitar la lisis bacteriana. Estas observaciones sugerían que el Tp17 interacciona físicamente con la lisozima de pollo. A continuación se presentan los protocolos experimentales correspondientes a la purificación de GST-Tp17 y Tp17- HIS, así como experimentos de microsecuenciación. Cromatografía de GST-Tp17 Se indujo el crecimiento de la E coli DH5D recombinante que contiene pGEX2T-Tp17 (Akins y col. (1993) Infect. Immun. 61 :1202-1210) (Figura 6) en un fermentador de 5 litros en caldo 2xYT (Sambrook y col. (1989) Molecular Cloníng: A Laboratory Manual 2a, Chris Nolan (Ed.) Cold Spring Harbor Press.) con 100μg/ml de ampicilina (Roche Diagnostics, Barcelona, España). El cultivo se indujo con 0,3mM de IPTG (Roche Diagnostics Mannheim, Alemania) durante cuatro horas.
Se recogieron las células y se resuspendieron en Tris 50 mM (pH 8,0), NaCI 85mM, EDTA 2mM, polioxietileno 10 tridecil éter al 1%, que contienen proteasa una mezcla inhibidora (1 m1/g de pasta celular, Sigma-Aldrich, Madrid, España) y 0,5mg/ml de lisozima de pollo (Sigma-Aldrich, Madrid, España). Después de incubar durante 50 minutos, las células se sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron a 28.000 g. El
GST-Tp17 recombinante se purificó del sobrenadante mediante cromatografía de intercambio iónico (Q Sepharose XL, Amersham Biosciences, Cerdanyola, España). El flujo se purificó posteriormente mediante cromatografía de afinidad con glutatión (glutathione sepharose FF, Amersham, Cerdanyola, España). Para eluir el GST- Tp17 se usó un tampón de glutatión reducido 100mM . Las fracciones recogidas se analizaron mediante electroforesis en gel. Siguiendo el mismo protocolo se realizó otro procedimiento de purificación sin usar lisozima. Cromatografía de Tp17-HIS La secuencia génica codificadora de la proteína Tp17 madura (incluidos los residuos 23 a 156 de la secuencia de Tp17 depositada con el número de acceso
NCBI P29722) se amplificó mediante PCR usando el vector pProExHT-Tp17 (Dr. Norgard, Universidad de Dallas, Texas, EE.UU.) como molde. La amplificación por PCR se realizó usando un equipo de sistema Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y oligonucleótidos P17-Ndel (5'- AGA TAT ACÁ TAT GGT CTC GTG CAC AAC CGT GTG TCC GCA CGC CGG GAA GGC CAÁ -
3') (SEC ID NO:33) y P17-rev1 (Xhol) (5'- ATG TAG CGA ACG GAG TTA -3') (SEC ID NO:34) en las condiciones recomendadas por el proveedor (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Las condiciones de ciclado térmico fueron las siguientes: un ciclo de desnaturalización (1 min a 94°C) seguido por 30 ciclos de amplificación (1 min a 94°C, 1 min a 55°C, 1 min a 72°C). El amplicón resultante de la PCR
(∞300pb) se purificó usando el sistema de purificación Nucleotrap (Macherey- Nagel, Duren, Alemania). Se digirieron 1 μg de fragmento de PCR purificado y 1 Dg del plásmido pET24a purificado con 10 unidades de Λ/ctel y 10 unidades de Xho\ usando las condiciones recomendadas por el proveedor (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Los fragmentos de restricción se separaron con un gel de agarosa al 0,8% (Sambrook y col. (1989)) y los fragmentos correspondientes al Tp17 (~300pb) y los vectores pET24a (~5300pb) se escindieron y se sometieron a purificación en gel usando el sistema de purificación Nucleotrap (Macherey-Nagel, Duren, Alemania). Ambos fragmentos se ligaron usando la T4 DNA ligasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) con las condiciones recomendadas por el proveedor. La reacción de unión se usó para transformar E coli TOP10 químicamente competente (Invitrogen SA, Barcelona España) y los transformantes se seleccionaron en placas LB (Sambrook y col. (1989)) complementadas con 100Dg/ml of ampicilina (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se preparó ADN
plasmídico para 10 clones individuales y se analizó medíante digestión con endonucleasas de restricción usando Nde\ y Xho\. Ocho de 10 clones contenían el plásmido recombinante pET24a-Tp17 correcto. La secuencia de un clon plasmídico se verificó mediante secuenciación de ADN (Centro de secuenciación de ADN, UAB, Barcelona, España) y posteriormente se usó para transformar la cepa de expresión E. coli BL21 (DE3) Rosetta (Novagen, Madison, Wl) . La cepa resultante se llamó EcBK633 (véase la Figura 7). Se indujo el crecimiento de la E. coli EcBK633 recombinante en un biorreactor de 5 litros en caldo 2xYT con ampicilina (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El cultivo se indujo con IPTG 1mM (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania) durante cuatro horas. Las células se recogieron y se resuspendieron en Tris 50mM (pH 8,5) con inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich Madrid, España) y 0,6mg/ml de lisozima de pollo (Sígma-Aldrich, Madrid, España). Tras incubar durante 45 minutos, las células se sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron a 30.100 g. La Tp17-HIS recombínante se purificó del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad de ion metálico, usando una resina cargada con níquel (Chelating HP; Amersham, Cerdanyola, España) y una elución en gradiente de imidazol 10 - 200mM (Merck, Darhmstadt, Alemania) e imidazol 500mM, como recomienda el proveedor. Las fracciones recogidas se analizaron mediante electroforesis en gel y Western Blot.
Electroforesis y análisis de Western Blot Las fracciones cromatográficas y los marcadores proteicos de peso molecular (Véase Blue Plus II™, Invitrogen, Barcelona, España) se separaron por electroforesis a través de dos geles idénticos de SDS-PAGE al 15%, como describen Sambrook y col. (1989). Posteriormente, se tiñó un gel con Azul brillante de Coomasie R250 (Merck, Darhmstadt, Alemania) para detectar la proteína total. Como se muestra en la figura 8A, en la fracción correspondiente a la proteína Tp17 purificada se observaron dos bandas principales (14kDa y 17kDa). Las proteínas del otro gel se electrotransfirieron a una membrana Immobilon™ P PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts), como recomienda el proveedor. Después la membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (18-22°C) en 5 mi de Blotto™ (BioRad, Hercules, California) con PBS, 0,05 % p/v de Tween y 10% p/v de leche desnatada desgrasada en polvo (PBST). Después, la membrana se procesó de la siguiente forma: (1) tres lavados de 10 minutos con PBST, (2) 1 hora de incubación a temperatura ambiente (18-22°C) en presencia de 10 mi de un suero humano de un paciente con sífilis diluido 1/200 en Blotto™, (3) tres lavados de 10 minutos con PBST, (4) 1 hora de incubación a temperatura ambiente con 10 mi de conjugado de fosfatasa alcalina, antisuero policlonal humano de conejo (BioRad, Hercules, California, EE.UU.) diluido 1/2000 en PBST, (5) tres lavados de 10 minutos con PBST, y (6) una incubación final con 5 mi de NAT/BCIF sustrato
cromogénico de fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich, Madrid, España) hasta la aparición de color. Como se muestra en la Figure 8B, este ensayo detecta la unión de IgG humana a la proteína de 17kDa (Tp17-HIS) pero no a la proteína de 14kDa. Secuenciación de N-Terminal La fracción cromatográfica que contiene la Tp17-HIS purificada con la proteína contaminante (14kDa) y un marcador proteico de peso molecular (Véase Blue Plus II™, Invitrogen SA, Barcelona, España) se separó mediante electroforesis a través de un gel SDS-PAGE al 15%, como se describe en Sambrook y col. (1989). Posteriormente, las proteínas en el gel se electrotransfírieron a una membrana Immobílon™ P PVDF (Millipore Corp., Bedford, MA) usando las directrices de los proveedores. La membrana se tiñó con azul brillante de Coomassie R250 y las dos bandas se cortaron y secaron para el análisis de secuenciación. El análisis del N-terminal mediante degradación automática de Edman se realizó en un secuencíador Beckman LF3000 con un analizador de aminoácidos PTH (System Gold, Beckman Coulter, Fullerton, California).
Las secuencias obtenidas fueron: NH2-VS(C)TTV.COOH para la proteína de 17KDa (SEC ID N°:35). NH2-KVFGR(C)ELΛA.COOH para la proteína de 14KDa (SEC ID N°:36). Como se muestra en la Figura 8B, la secuencia N-terminal de la proteína de 17kDa correspondía a la de Tp17 de Treponema pallidum y la secuencia de la proteína de 14kDa correspondía a la lisozima de pollo.
EJEMPLO 2: Detección por Far Western de la unión de Tp17 a la lisozima de pollo y humana La observación de que el antígeno de la proteína de 17 kDa de T. pallidum (Tp17) purifica al mismo tiempo que la lisozima de pollo era una fuerte sugerencia de la existencia de una interacción física directa entre ambas proteínas. Para comprobar esta hipótesis se realizó un ensayo de interacción por transferencia Far- Western lisozima-proteína. El ensayo se resuma en la Figura 5 y comprende, en general, las tres etapas siguientes: (1) inmovilización de la lisozíma purificada en una membrana; (2) colocar como sonda en la membrana un ligando con probabilidad de unirse directamente a la lísozima; y (3) inmunodetección de la unión lisozima-ligando. A continuación se presenta un procedimiento experimental detallado. Detección mediante transferencia Far Western Blotting de las interacciones Lisozima-proteína Tp17 La lisozima blanca de huevo de gallina y la lisozíma de leche de mama humana purificadas se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Madrid, España). Dos series de fracciones alícuotas con 1 μg, 5 μg y 10 μg de lisozima purificada y un marcador proteico de peso molecular (Véase Blue Plus II™, Invitrogen SA, Barcelona, España) se separaron electroforéticamente a través de un gel de SDS-PAGE al 4-
12% usando las condiciones recomendadas por el proveedor (Invitrogen). Después el gel se procesó para realizar la transferencia Western, como se describen en Sambrook y col. (1989) según procedimientos conocidos en la técnica, y las proteínas se electrotransfirieron a una membrana Immobílon™ P PVDF (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts). La presencia de lisozima inmovilizada en la membrana de PVDF se valoró mediante tinción durante 1 minuto con colorante Ponceau S (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y después se quitó el tinte medíante lavado enérgico durante 5 minutos con agua desíonizada. La membrana se dividió en dos, conteniendo cada porción una marca de proteínas y tres cantidades de lisozima de pollo o humana (1 μg, 5 μg y 10 μg por carril). A continuación se incubó cada membrana durante 16 horas a 4°C en 5 mi de TBST (Tris-HC1 10 mM, pH 8,0, NaCI 150 mM, 0,05 % peso/vol de Tween 20™,) complementado con 5% (peso/vol) de leche desnatada desgrasada en polvo SVELTESSE™ (NESTLÉ, ESPAÑA, Barcelona, España) (para preparar leche TBST). Después, las membranas se procesaron por separado de la siguiente forma: (1) tres lavados de 1 minuto con 10 mi de TBST, (2) 1 hora de incubación a temperatura ambiente (18-22°C) en presencia de 10 mi de 100mg/ml de la proteína de fusión GST-Tp17 (Akin y col. (1993)) o una proteína control GST-Tp47, (Hsu y col. (1989) Infect. Immun. 57:196- 203; Weígel y col. (1992) Infecí. Immun. 60:1568-1576) (3) tres lavados de 10 minutos con 5 mi de TBST, (4) incubación de 30 minutos a temperatura ambiente con 10 mi de un suero policlonal antiGST de cabra (Amersham Biosciences, Cerdanyola, España) diluido al 1/7500 con leche TBST, (5) tres lavados de 10 minutos con 5 mi de TBST a temperatura ambiente, (6) 1 hora de incubación a temperatura ambiente con 10 mi de un conjugado-fosfatasa alcalina, suero policlonal anticabra de conejo (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) diluido al 1/5000 en leche TBST, (7) tres lavados de 10 minutos con 5 mi de TBST y (8) incubación de minutos con 5 mi de sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina de Nitroazul tetrazolio/Bromo Cloro Indolil Fosfato (NAT/BCIF) (Sigma-Aldrich, Madrid, España) hasta la aparición de color.. El ensayo anterior detectó la unión de la proteína de fusión GST-Tp17 a la lisozima de pollo y humana (banda de14 kDa en las Figuras 9B y 9D, respectivamente. Es más, la unión de GST-Tp17 a la lisozíma es fuerte, ya que resistió numerosos lavados en presencia de detergente (Tween 20™ al 005%). Cuando la membrana se incubó con el antígeno control GST-Tp47 no se detectó ninguna señal (Figuras 9A y 9C), demostrando que la interacción entre Tp17 y la lisozima es específica y no implica a la fracción GST, compartida por ambas, GST- Tp17 y GST-Tp47. Estos resultados demuestran que (i) el antígeno Tp17 de T. pallidum se une con fuerza y de forma específica a la lisozima humana y de pollo, y (¡i) esta propiedad está contenida entre residuos 22 a 156 de Tp17 (los números representan la secuencia peptídica de Tp17 depositada bajo el número de acceso
P29722). Este ensayo se usa para caracterizar nuevas proteínas de unión a lisozima así como para identificar los mutantes de lisozima incapaces de unirse al inhibidor conocido de la lísozima. Por el contrario, este ensayo se usa para detectar los mutantes de Tp17 incapaces de unirse o asociarse con la lisozima. Asimismo, este ensayo se usa para detectar sustancias (por ejemplo, péptidos, proteínas, fármacos, anticuerpos, ácidos nucleicos, PNA, etc.) que interfieren en la unión de lisozima a su inhibidor conocido.
EJEMPLO 3: El antígeno de la proteína Tp17 de T. Pallidum inhibe la actividad antibacteriana de la lisozima humana y de pollo Las lisozimas son agentes antibacterianos bien caracterizados que se encuentran en las superficies mucosas y en los líquidos biológicos. Dada su potente actividad enzimática acetil-muramidasa, las lisozimas son capaces de hidrolizar el péptidoglucano de la pared celular, matando por tanto muchas bacterias patogénicas. La fuerte unión entre Tp17 y la lisozima humana sugirió que esta unión puede alterar la actividad antibacteriana de la lisozima. Esta hipótesis es compatible con la observación de que (i) 7. pallidum es un patógeno mucoso e (ii) está en contacto con lísozima humana en su nicho ecológico, a lo largo de su ciclo de vida infeccioso. Para comprobar esta hipótesis, se analizó la actividad antibacteriana de la lisozima humana y de pollo, en presencia o ausencia de GST-Tp17, usando un equipo de ensayo de lisozima EnzCheck® (Molecular Probes, Eugene, Oregón). El ensayo comprende el uso de células bacterianas de Micrococcus lysodeikticus marcadas con fluoresceína como sustrato fluorescente de lisozima. En esta bacteria Grampositiva, la capa de péptidoglucano está directamente accesible a la lisozima, y se ha marcado con fluoresceína de una forma tal que la fluorescencia se templa de forma natural. Tras la hidrólisis de la lisozima, se suaviza la inactivación y la fluoresceína se libera en una cantidad proporcional a la actividad de la lisozima. Se usó el siguiente protocolo experimental. Ensayo de inhibición de lisozima Una reacción típica de 100 μl consistió en 25μl de solución de lisozima (10 unidades por lisozima de pollo o 50 unidades de lisozima humana, disueltos en agua desionizada), 25μl de la solución de proteínas de prueba y 50μl de una suspensión de Micrococcus lysodeikticus (50 μg/ml) marcada con fluoresceína. La reacción se incubó durante 45 minutos a 37°C y se midió la fluorescencia (λexc = 485 nm; λem¡. = 520 nm) usando un lector de fluorescencia de placas multipocíllo modelo FLxδOO (Bio TEK instruments, Winoosky, Vermont) equipado con un software de adquisición de datos KC júnior (Bio TEK Instruments, Winoosky, Vermont). Cada punto experimental se expresó como la media y la desviación estándar correspondiente a la lectura de tres pocilios independientes. Los pocilios
que contenían 50μl de agua desionizada y 50μl de Micrococcus lysodeikticus marcados con fluoresceína se usaron como blanco. Para variar la concentración de la proteína de prueba de 83,5 a 1 ,3 μg/pocillo se usaron dos diluciones en serie a la mitad de la proteína de prueba. Como se muestra en la Figura 10, la actividad acetil muramidasa de las lisozimas humana y de pollo se inhibieron fuertemente (> 85% de inhibición) por la adición de tan poco como 1 ,3 μg/pocillo de la proteína de fusión GST-Tp17 . En cambio, la proteína de fusión control GST-Tp47 no ejerció ningún efecto inhibidor sobre la actividad enzímática acetil muramidasa de la lisozima tanto humana como de pollo. Estos datos demuestran que Tp17 inhibe específicamente la actividad antibacteriana de las lisozimas humana y de pollo y no depende del resto GST. Además, este ensayo se usa para caracterizar nuevos inhibidores de lisozíma así como para identificar mutantes de lisozima incapaces de unirse a su inhibidor conocido y/o insensibles a la inhibición por Tp17, Ivy, u otras proteínas similares a Tp17. Este ensayo también proporciona una detección útil de sustancias (por ejemplo, péptidos, proteínas, fármacos, anticuerpos, ácidos nucleicos o PNA, etc.) que interfieren en la inhibición de la actividad antibacteriana de lisozima. EJEMPLO 4: Determinante estructural requerido para la unión de Escherichia Coli Ivy a la lisozima de pollo Para identificar las regiones polipeptídicas implicadas en la unión de Tp17 de T pallidum a la lisozima y la inhibición de la actividad acetil muramidasa de la lisozima, se investigó en bases de datos biológicas en busca de polipéptidos acerca de los que ya se había descrito que inhibían la actividad acetil muramidasa de la lisozima. Una búsqueda en la base de datos de PubMed del Instituto Nacional de Salud usando los términos "lísozima" e "inhibidor" como palabras clave, identificó una proteína de Escherichia coli llamada Ivy (por inhibidor de lisozima de vertebrados), de la que se había publicado que se unía e inhibía la actividad acetil muramidasa de las lisozimas humana y de pollo (Monchois y col. (2001) J. Biol. Chem. 276:18437-18441)). Esta proteína era de interés ya que (i) es de tamaño similar (polipéptido maduro de 14 kDa) a la Tp17 madura (polipéptido maduro de
15kDa) e (ii) una estructura cristalina de Ivy en forma de complejo con la lisozima de pollo estaba disponible en el banco de datos de proteínas PDB en el la Research Collaboration for Structural Bioinformatics (RCSB) con el número de acceso 1GPQ. Sin embargo, como se representa en la Figura 11A, la proteína Ivy comparte menos de un 21 % de la secuencia de aminoácidos con Tp17 (como determina el algoritmo de Multalin (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) de alineación de múltiples secuencias) y no se pudo deducir ningún motivo peptídico obvio de alineaciones de secuencias polipeptídicas. La estructura cristalina en tres dimensiones de la Ivy/lisozima de pollo se examinó para buscar residuos localizados en la interfase entre ambas moléculas. Se usó el visor Cn3D de la
estructura molecular en tres dimensiones (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml) para analizar las interacciones moleculares entre Ivy y la lisozima de pollo. En los siguientes ejemplos, toda la numeración se refiere y corresponde a los datos archivados con los siguientes números de acceso NCBI : P00698 para la lisozíma de pollo,
P00695NP_000230 para la lísozima humana, P45502 para Ivy de E. Coli y P29722 para Tp17 de T. pallidum. Como se representa en la Figura 11 B, se identificaron tres zonas de posible contacto de la lisozima de pollo con Ivy. Las correspondientes secuencias peptídicas son: Péptido I: NH2-52QGHKLPAWVMKGG[TΫJ]P67-COOH (SEC ID NO:37) Péptido II: NH285-CKpHDlCG91-COOH (SEC ID NO:38) Péptido III: NH2145-GS[LE^HPDGFN155-COOH (SEC ID NO:39) El péptido II exhibió una estructura en forma de dedo compuesta por un puente disulfuro cys-cys cerrando en ambos extremos un bucle peptídico que comprende un motivo KPHD (SEC ID NO:40; Figure 14A). Un análisis refinado de los aminoácidos presentes en este bucle reveló dos fuertes interacciones electrostáticas no covalentes: entre H88.ιvy y E53-c kcL s, y entre D89.ιvy y Ri32-c kcLys- El átomo de nitrógeno de H88.ιvy ¡nteraccionaba con el átomo de oxígeno de E53.chkci.ys y el átomo de oxígeno de D89-ιvy interaccionaba con el átomo de nitrógeno de Ri32.chkcLy (Figura 12). Usando el software informático de visión en 3-D Mol (Vector NTI suite 8.0, Informax, Frederick, Maryland), la distancia entre los centros atómicos se midió a 2,56 A (1 angstrom = 10"10 metros) en la interacción de H88-lvy / E53-chkcLys y a 2,46 A en la interacción de D89.ιvy / Rι32.chkci.ys • La naturaleza (atracción electrostática entre los residuos de las cadenas laterales) y la proximidad (en el intervalo de 2,4-3,4 A) de los centros atómicos indicaron la presencia de un tipo determinado de enlace no covalente, denominado "puente salino." Esta observación fue interesante porque la mayoría de los puentes salinos se producen en depresiones relativamente libres de agua o en las ¡nterfases biomoleculares en las que no hay agua. (Petsko y col. (2003) Protein Structure and Function. Lawrence y
Robertson (Eds.) New Science Press Ltd., GB). Las Figuras 13A-13D ¡lustran que el puente salino que implica D89.lvy zz R 32. chkcLys se expuso parcialmente a las moléculas de agua del disolvente (Figuras 13C y 13D), mientras que el puente salino que implica H88.,vy ^ E53 hkcLys se ocultó por completo y, en consecuencia, protegido del disolvente por la interfase proteína- proteína (Figuras 13A y 13B). Dado que la hidratación de un puente salino reduce su fuerza de unión, el puente salino de H88-lvy ^* E53_c kcLys es menos probable que se rompa a causa del disolvente que el puente salino de D89.,vy z Ri32-Chkc ys • Un hecho interesante es que las Figuras 13A y 13B también muestran que el puente
salino de H88-lvy ^ E53-c kc ys bloqueaba la accesibilidad al ácido glutámico 53 (E53) de la lísozima de pollo. El ácido glutámico número (E53) y el ácido aspártico 71 (D7ι) en la secuencia de la lisozima de longitud total corresponden a los residuos E35 and D53 de la cadena peptídica de la lisozima madura. Como se representa en las Figuras 3A y 3B, E53 junto con D53 en la lisozima de pollo madura (e en la lisozima humana) están conservados en todas las secuencias de lisozima conocidas y se piensa que son los dos residuos catalíticos requeridos para la hidrólisis del péptidoglucano (Malcolm y col. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:133-7). En conjunto, estos datos demuestran que Ivy establece dos puentes salinos con la lisozima: uno esencial para la especificidad y la estabilidad de la interacción
(H88-IVy £S E53.c kCLyS) así como para la inhibición de la actividad antibacteriana de la lisozima mediante impedimento esférico, y el otro (D89.ιvy zz Rι32.ChkcLys) implicado hasta un punto menor, en la estabilización de la interacción lisozima/inhibidor. Debido a la estricta conservación de los residuos E35 y D53/D52 D52 (la numeración se refiere a la secuencia de la lisozima madura) entre las especies, estas observaciones demuestran que la Tp17 inhibe un amplio abanico, si no todas, de lisozimas.
EJEMPLO 5: Identificación de una secuencia peptídica consenso compartida por inhibidores proteicos de lisozimas de mamíferos El Ejemplo 4 demostró que la secuencia del péptido II NH2-CKPHDCG-COOH
(SEC ID NO:38) es necesaria para la unión a y la inhibición de la actividad enzimática de la lisozima. Un examen detallado de la secuencia polipeptídica de Tp17 identificó dos secuencias candidatas que posiblemente median en la unión y en la inhibición de las lisozimas humana y de pollo. Ambas secuencias, denominadas Tp17_pep1 y Tp17_pep2, se enumeran a continuación:
Tp17_pep1 : NH2-29C P H A G K A K A E K V E C42-COOH (SEC IDS NO:41 ) Tp17_pep2: NH2-n4K A P H E K E120-COOH (SEC ID NO:42) El Tp17_pep1 está muy relacionado con el motivo NH2-8SCKPHDCG91-COOH (SEC ID NO:38) de la proteína Ivy de E coli Ivy pero difiere por la presencia de un trozo de nueve aminoácidos separando el residuo de histídina del residuo de ácido aspártico. Como se muestra en la Figura 14B, y como se ha encontrado para el motivo Ivy (Figura 14A), los puentes de las dos cisteínas adyacentes probablemente acercan en el espacio los residuos críticos de histidina y ácido aspártico, posiblemente en una configuración capaz de poner en contacto los residuos E53 y R132 de la lisozíma. Aunque en la actualidad se desconoce la función del posible bucle de 9 aminoácidos de Tp17, su composición sugiere que es altamente hidrofílico y probablemente inmunogéníco. Los residuos de lisina cargados positivamente contenidos en este bucle de 9 aminoácidos pueden contactar directamente con una superficie de lisozima cargada negativamente, proporcionando también un punto de anclaje adicional para reforzar la unión.
Alineando el péptido Tp17_pep1 con el motivo de unión a la lisozima de la proteína Ivy, se obtuvo la secuencia consenso CXιPHXn X2C (SEC ID NO:43), en la que X^ es al menos un aminoácido, está ausente o un enlace peptídicos, Xn es de cero a nueve aminoácidos o un enlace peptídíco y X2 es ácido glutámico o ácido aspártico. Aunque sin las dos cisteínas adyacentes, el Tp17_pep2 también está muy relacionado con el motivo NH2-CKPHDCG-COOH SEC ID NO:38 de la proteína Ivy de E coli, ya que comparte los residuos PH críticos seguidos por un residuo ácido (D/E). La recopilación de los datos estructurales, la información bibliográfica y las búsquedas en bases de datos reveló una secuencia consenso de unión a la lisozima [CKVA] [ACK] P H [AED] [CGK] (SEC ID NO:3), escrito usando el formato syntax de patrón peptídico universal PROSITE. Se determinaron secuencias consenso adicionales y se escribieron usando el formato syntax de patrón peptídico universal PROSITE , que está disponible en el Sistema De Análisis Proteico de Expertos (base de datos SWISSProt), de la siguiente manera:
(a) XnPHXn (SEC ID NO:1), en la que Xn es al menos un aminoácido.
(b) CX1X2X3PHX4X5X6X7X8X9X1oXnXι2Xi3C (SEC ID NO:2), en la que X! a X13 son cualquier aminoácido, ningún aminoácido o un enlace peptídico.
(c) XiCPHAG (SEC ID NO:25), en la que X! es C o V. Las formas de realización preferidas de polipéptidos similares a Tp17 se ilustran en las Figuras 1 y 2.
EJEMPLO 6: Identificación In Silico de proteínas putativas de unión a lisozima e inhibidores Dada la baja conservación global de la secuencia peptídica compartida por las proteínas Ivy de E Coli y Tp17 de T. pallidum, es probable que motivos de unión a la lisozima previamente no detectados estuvieran presentes en el genoma de otros microorganismos patogénicos. Para comprobar esta hipótesis, las secuencias consenso definidas en el Ejemplo 5 se usaron para examinar las bases de datos de proteínas (Swiss-Prot, TrEMBL, TrEMBLnew y PDB) ussando el algoritmo ScanProsite (http://us.expasy.org/tools/scanprosite/). Las Figuras 1 A, 1 B y 2 ilustran que las proteínas que contienen una señal peptídica que se ajusta a las secuencias consenso estaban presentes en numeroso patógenos humanos y animales. Las proteínas de 7. denticola, B. thetaiotaomicron, C. burnetti, H. influenzae, los serogrupos A y B de N. meningitidis, V. cholerae, V. vulnificus, H. ducreyi, S. typhi, L. pneumophila, S. aureus, N. gonorrhoeae y B. pertus se pueden agrupar siguiendo la siguiente secuencia consenso: CX(0,3)PHX(0,14), que corresponde a Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 Pro His Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaaι2 Xaa13 Xaa 4 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Cys (SEC ID NO:176), donde Xaa es cualquier aminoácido o está ausente.
Las proteínas (de P. gingivalis y H. pylori) son variantes ligeramente atípicas que podrían agruparse en la siguiente secuencia consenso:
CX(0,3)HX(0,10)C que corresponde a Cys Xaa! Xaa2 Xaa3 His Xaa Xaa5 Xaa6
Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaaι2 Xaaι3 Cys (SEC ID NO: 175), donde x es cualquier aminoácido o está ausente. Este resultado es interesante, ya que todos estos microorganismos son patógenos de mucosas durante parte o la mayoría de su ciclo de vida infeccioso. De un interés particular era la presencia de un motivo peptídico consenso en el extremo carboxi de la glucoproteína gJ del virus del Herpes Simple tipo 2. Aunque en la actualidad se desconoce la función de esta proteína, está codificada por el gen Us5 presente en la región corta única (Us) del virus. Se sabe que esta región contienen la mayoría de las proteínas implicadas en la virulencia y las interacciones mediadas proteína-proteína con las proteínas del huésped humano, respaldando un papel de gJ en la patogenia de la infección por VHS. Un hecho interesante es que en varias publicaciones se ha documentado que la lisozima tiene un fuerte efecto inhibidor tras la infección por V HS2 y sus manifestaciones clínicas (Cisani y col. (1989) Microbios. 59:73-83; Oevermann y col. (2003) Antivír. Res. 59:23-33). La proteína gJ del VHS-2 también es una proteína de unión/inhibidora de la lisozima. Sorprendentemente, el motivo de unión consenso de la lisozima no existe en la proteína gJ del VHS-1 estrechamente relacionado (Figura 15). Esta observación proporciona una posible explicación para las observaciones clínicas que documentan un tropismo preferencial, pero no exclusivo, del VHS-1 por la región orofacial, mientras que el VHS-2 se encuentra con más frecuencia en la mucosa genital, rica en lisozima (Lowhagen y col. (2002) Acta Derm. Venereol. 82:118-21 ; Bruisten y col. (2003) Curr. Womens Health Report 3:288-98). Además, es interesante observar que dos patógenos genitales, un virus (VHS-2) y una bacteria (T. pallidum), comparten una secuencia peptídica inhibidora de lisozima común. Estas observaciones demuestran que la gJ, sola o combinada con lisozima humana, es útil para discriminar las infecciones por VHS-1 y por VHS-2 usando ensayos de diagnóstico diferencial serológico o virológíco. También proporciona composiciones y procedimientos para tratar las infecciones por Herpes simple con mutantes de lisozima que pueden evadir la inhibición por gJ y/o miembros de las familias lvy y Tp17. EJEMPLO 7: Identificación de mutaciones puntuales que desestabilizan la interacción proteína-proteína de la lisozima /inhibidor Está ampliamente reconocido que las interacciones proteína-proteína dependen de la complementariedad estructural y fisicoquímica. La irregularidad y la heterogeneidad local de las superficies proteicas capacitan la unión específica y la asociación con ligandos y proporciona una base para la formación de la estructura cuaternaria. El ensamblaje entre una superficie proteica y otra depende de algo
más que de su forma. Se extiende a los débiles enlaces fisícoquímicos que mantienen los complejos juntos: enlaces covalentes, puentes de hidrógeno, puentes salinos, interacciones electrostáticas de intervalo amplio e interacciones de Van der Waals. Esta propiedad de complementariedad es universal, ya sea entre una proteína y una molécula pequeña o entre una proteína y otro tipo de macromolécula
(Petsko y col. (2003)). Las mutaciones localizadas en la secuencia codificadora de la lisozima , seleccionada de manera que no afecten a las actividades acetil muramidasa y antimicrobiana, desestabilizan la interacción lisozímas/inhibidor y confieren resistencia a la inhibición por proteínas patógenas tales como el antígeno Tp17 de
7 pallidum o miembros de la familia Ivy . En una forma de realización, la lisozima mutante retiene sustancialmente la actividad microbiana deseada (p. ej., al menos aproximadamente un 30%, 50% o incluso un 80%) de la lisozima correspondiente de tipo salvaje. Tales lisozimas mutantes representan nuevas e interesantes herramientas para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Asimismo son sustituías de la lisozima natural derivada de huevo de gallina usada en las preparaciones medicinales disponibles en el mercado y tienen una mejor potencia y espectro de actividad. A continuación figura una lista de fármacos potenciales con más probabilidad de mejorar con el uso de tales mutantes de lisozima resistentes a la inhibición:
Fármaco comercializado Laboratorio farmacéutico LYSOPAINE ORL Boehringer Ingelheim LYSO-6 UCB Health Care GLOSSITHIASSE Laboratorio Jolly-Jatel CANTALENE Laboratorio Cooper HEXALYSE Laboratorio Bouchara-Recordati
Tales mutantes de lísozima se obtienen usando ambos enfoques, dirigido y aleatorio.
Identificación dirigida de los mutantes de lisozima resistentes a la inhibición deducida a partir de los datos cristalográficos Dado su elevado punto isoeléctrico (pl), la lisozima humana(pl teórico= 9,28) y la lisozima de pollo ( pl teórico = 9,32) exhiben una fuerte carga positiva a los valores fisiológicos de pH comprendidos entre pH 3 y pH 7. Todos los inhibidores de la lisozima conocidos tienen valores bajos de pl. Por ejemplo, las proteínas Ivy maduras (Monchois y col. (2001) J. Biol. Chem. 276:18437-18441) de E coli (pl =
5,51) y P. aeruginosa (pl = 5,69), así como la proteína Sic madura (Femie-King y
col. (2002) Infecí. Immun. 70:4908-4916) de S. pneumoniae (pl = 4,39) están cargados negativameníe al pH fisiológico. Se presentó la hipólesis de que los residuos de lísozima cargados posiíivameníe preseníes en el área de confaclo lisozima/ínhibídor son blancos atracíivos para la mutagénesís. La producción de un mutante de lisozima con una superficie de contactó cargada negativamenfe podría dar lugar a una repulsión elecírosíáíica impidiendo la unión del inhibidor. Dado que eslas muíaciones no afecían a los residuos caíalííicos de la lisozima, es probable que produzcan mutantes de lisozima activos, no inhibidos por patógenos. La estructura cristalina de Ivy de E co//7lisozima de pollo con el número de acceso PDB 1GPQ, así como la estrucíura crislalina de Ivy de P. aeruginosa deposiíada con el número de acceso PDB 1 HKE, se esíudiaron con un leclor molecular VNTI 3D . Se idenlificaron residuos críticos en cada lisozima se realizaron las siguientes muíaciones puníuales que alíeran la unión del inhibidor:
![Figure imgf000068_0001](https://patentimages.storage.googleapis.com/53/a7/4a/dc92d585e3c20d/imgf000068_0001.png)
Introducción de mutaciones puntuales mediante mutagénesis dirigida a sitio: Las mutaciones se introducen usando el kif de mutagénesis dirigida de QuikChange® Site-Directed Muíagenesis , siguiendo las insírucciones recomendadas por el proveedor (Síralagene, La Jolla, CA). Brevemente, el kit QuikChange® Site-Directed Mutagenesis se usa para hacer muíaciones punluales, sustituir aminoácidos y delecionar o insertar uno o varios aminoácidos. El procedimienío QuikChange® de mufagénesis dirigida de sifio se lleva a cabo usando la ADN polimerasa de PfuTurbo ® y un ciclador de temperatura. La ADN polimerasa PfuTurbo® replica ambas hebras plasmídicas con una elevada fidelidad y sin desplazar los oligonucleótidos cebadores muíanles. El procedimienlo
básico usa u vecíor de ADN bicalenario superenrrollado (ADNds) con un inserto de inferes y dos cebadores oligonucleólidos siníéíicos que coníienen la muíación deseada. Los cebadores oligonucleóíidos, cada uno complemenlario de las hebras opuesías del veclor, se exlienden duraníe los ciclos de íemperalura por la ADN polimerasa PfuTurbo. La incorporación de los cebadores oligonucleófidos genera un plásmido mutado que contiene mellas alternadas. Tras los ciclos de temperalura, el produelo se írala con Dpn I. La endonucleasa Dpn I (secuencia diana: 5'-Gm 6 ATC-3
') es específica de ADN meíilado y hemimelilado y se usa para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar el ADN sintelizado que conliene la mutación. El ADN aislado de casi todas las cepas de E coli se metila y por tanlo es susceplible a la digeslión con Dpn I. Después, el vecíor mellado de ADN que conliene las mulaciones deseadas se íransforma en células XL1-Blue supercompeleníes. La pequeña canlidad de ADN molde inicial requerida para realizar este procedimiento, la elevada fidelidad de la ADN polimerasa PfuTurbo y el número bajo de ciclos térmicos , todo ello conlribuye a la elevada eficiencia de mulación y al menor polencíal para generar muíaciones alealorias durante la reacción.
Aislamiento alea orio de mutaníes de lisozima resislentes a la inhibición usando mutagénesis aleaíoria mediada por PCR seguida por una deíección selectiva de dos híbridos microbianos El sislema de dos híbridos se basa en el hecho de que muchos activadores de la transcripción eucariota están compuestos por dos dominios modulares físicamente diferentes: el dominio de unión al ADN (ADN-BD) y el dominio de activación (AD). El ADN-BD se une a una secuencia promoíora específica y el AD dirige el complejo de la ARN polimerasa II para íranscribir el gen en dirección 3'( downstream) confiriendo un fenotipo seleccionable/detecfable. Los dominios acfúan como módulos independieníes: ninguno solo puede activar la íranscripción, pero cada dominio continúa funcionando cuando se fusiona a oirás proleínas. Los síslemas comerciales adecuados incluyen el sisíema lisio para usar BacíerioMaích® II Two-Hybrid Syslem (Síraíagene, La Jolla, CA,) o el síslema BD Maíchmaker™ syslem (BD Biosciences Clonlech, Palo Alto, CA). Se expresan la lisozima y la Tp17, una fusionada al AD y la otra fusionada al ADN-BD. Si las dos proteínas interaccionan, los dominios ADN-BD y AD se acercan esírechamente y activan la transcripción de un gen indicador. Dependiendo del sisfema de huésped usado (por ejemplo, bacíeria, levadura o mamífero), la interacción se detecta mediante delección selectiva del cambio fisiológico o eslruclural observable (por ejemplo, el color de la colonia, emisión de fluorescencia, actividad enzimática, etc.). Por ejemplo, los dominios AD y ADN-BD se fusionan con lisozima y Tp17 respectivamente, se transforman en un huésped microbiano adecuado (por ejemplo, bacleria o levadura), y los transformantes
resultanles se examinan en busca de la aparición de colonias azules indicativas de la activación del gen indicador (por ejemplo, beía-galactosidasa). Una vez que se han obíenido los clones, la secuencia de ADN plasmídíco que lleva el marco de lectura abierto para la lisozima humana se someíe a una extensa mutagénesis alealoria mediada por PCR. Los transformaníes resullanles se examinan visualmente en busca de mulantes que hayan perdido el color azul y que probablemente tengan una o más mutaciones que perjudican la interacción lisozima/polipéptido similar a Tp17. Después se extrae el ADN plasmídico de los clones correspondientes y se secuencia. EJEMPLO 8: La lisozima humana y no la de pollo mejora la sensibilidad de los kit de Hemaglutinación usados para el diagnóstico de sífilis El Ejemplo 3 demuestra que, in vitro, la proteína de 17 kDa Tp17 de 7 pallidum se une fuertemente a las lisozimas humana y de pollo e inhibe fuertemente la actividad antibacteriana de ambas lisozimas. El siguiente experimento demuestra que estas interacciones de unión e inhibición también se producen in vivo durante la infección de superficies mucosas humanas por 7 pallidum. Como consecuencia de la unión de Tp17 a la lisozima, es probable que se formen epítopos nuevos y se expongan al sistema inmunológico. Los pacientes sifilíticos pueden tener una respuesta inmunitaria frente a los epítopos de Tp17 así como frente a los epítopos compartidos por el complejo Tp17-lisozima o incluso frente a la lisozima sola, como se muestra en la Figura 4. Para comprobar estos, se añadió lisozima humana o de pollo a los reactivos de hemaglutinación usados para un ensayo diagnóstico de sífilis para detectar los anticuerpos generados frente al complejo, mejorando de este modo la sensibilidad del ensayo. Se observó un aumento de la sensibilidad del ensayo para sífilis que era específico de la lisozima humana. La lisozima blanca de huevo de gallina (L-6876) y la lisozima de leche de mama humana (L-6394) purificadas se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Madrid, España). Se añadió una cantidad de lisozima humana y de pollo suficiente para mantener la proporción: 3 μg lisozima / 1 μg Tp17 al reactivo de hemaglutinación (Biokit SA, Llica d'Amunt, España), preparado de la siguiente manera. Se recogieron eritrocitos de pollo, se fijaron y se recubrieron con GST-Tp17 (40 Gg/ml) como se ha descrito antes (Herbert y col. (1979) Passive Haemagglutination With Special Reference to the Tanned Cell Technique. Handbook of Experimental Immunology (vol. 1), págs 20.1-22.20 (DMWeir (Ed.) Blackwell Scientific Publications (Oxford)); Stefen y col. (1951) J. Exp. Med. 93:107-120; Hirata (1968)
J. Immunol. 100:641-46). Un lote de eritrocitos de pollo fijados y recubiertos con GST-Tp17 (5 mi) se complementó con 6 μl de lisozima blanca de huevo de gallina (100 μg/μl). Otro lote de eritrocitos de pollo fijados y recubíertos con GST-Tp17 (1 mi) se complementó con 120 μl de lisozima de leche de mama humana (1 μg/μl). Ambos lotes de eritrocitos sensibilizados se homogeneizaron mediante agitación
magnética, durante 30 minutos a temperatura ambiente. La sensibilidad de cada lote se evaluó llevando a cabo una reacción de hemaglutinación usando un conjunto de sueros de sífilis humanos, caracterizada por dar una respuesta dudosa con otros reactivos comerciales de hemaglutinación. La reacción de hemaglutinacíón se realizó del siguiente modo. En una placa de microtitulación de fondo redondo (forma de U), se añadieron 25 μl de díluyente (Syphagen TPHA, Biokit SA, Barcelona, España) al pocilio 1 , 100 μl al pocilio 2 y 25 μl a cada uno de los pocilios 3 a 8. Al pocilio 1 se añadieron 25 μl de la muestra. Se mezcló el contenido del pocilio y 25 μl se transfirieron al pocilio 2 y se mezclaron. 25 μl del pocilio 2 al pocilio 3. Después se realizaron diluciones seriadas dobles hasta el pocilio 8. 25 μl del pocilio 8 se desecharon. A los pocilios 3-8 se añadieron 75 μl de reactivo de hemaglutinación (las diluciones finales de la muestra fueron de 1/80 a 1/2560). Los contenidos de los pocilios se mezclaron usando un agitador durante al menos 30 segundos. Se cubrió la placa y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los resultados del ensayo se leyeron aplicando los siguientes criterios. Un resultado se puntuó como positivo cuando se observó una maraña lisa de células cubriendo todo el fondo del pocilio o una maraña lisa de células cubriendo parcialmente el fondo del pocilio y rodeadas de un anillo grueso de células. Un resultado se puntuó negativo cuando se observó un botón de células con una pequeña abertura central o un botón de células con o sin un orificio muy pequeño en el centro. El título de una muestra correspondía a la dilución más elevada que dio una reacción positiva. El punto de corte de esta técnica fue 1/80. Como se muestra en las Figuras 16A y 16B, la adición de lisozima humana al ensayo mejora la intensidad de la hemaglutinación (es decir, la hemaglutinación se produjo a diluciones más elevadas en presencia de lisozima humana comparada con la ausencia de lisozima) de forma dependiente de concentración. Esta mejora pareció ser específica de lisozima humana porque la adición de lisozima de pollo no aumentó la respuesta. La adición de lisozima humana mejoró de forma drástica la sensibilidad del reactivo de hemaglutinación para sífilis para la detección de anticuerpos que no se detectan en kit que en la actualidad están en el mercado. EJEMPLO 9: La lisozima humana tanto natural como recombinante mejora la sensibilidad de la prueba de Hemaglutinación usada para el diagnóstico de sífilis La leche de mama humana es la fuente natural de la lisozima humana. Sin embargo, la purificación de la lisozima de este líquido corporal es tedioso debido a: (i) su poca abundancia, (ii) la dificultad para asegurar un suministro regular y reproducible, (iii) la posible contaminación con patógenos sin detectar, así como (iv) intereses sociales y éticos. Por tanto es preferible una fuente recombinante de lisozima humana para usar a escala industrial. Se comparó la potencia de la
lisozima natural humana derivada de leche de mama y la lisozima humana recombinante derivada de arroz transgénico. La lisozima natural humana purificada de leche de mama (L-6394; Sigma- Aldrich, Madrid, España) tenía 101.000 unidades/mg de proteína y un 10% de contenido en lisozima. La lisozíma recombinante humana purificada de arroz transgénico (159-53LZ-90P; Ventria Bioscíence, Sacramento, California) tenía 187.000 unidades/mg de proteína y un 90% de contenido en lisozima. La definición de unidad para ambas lisozimas es como sigue. Una unidad produce un incremento de la absorbancia a 450 nm de 0,001 por minuto a pH 6,24 a 25°C, usando una suspensión de Micrococcus lysodeikticus como sustrato, en una mezcla de reacción de 2,6 mi (recorrido de 1 cm) (Shugar y col. (1952) Biochem. Biophys. 8:302-309). Para que los resultados del experimento sean comparables, se usó una proporción de 594 unidades de lisozima humana / μg GST-Tp17 de cada una. Se realizó una reacción de hemoaglutinación, como se detalla en el Ejemplo, añadiendo una cantidad equivalente de la lisozima natural o recombinante al reactivo de hemaglutinación para sífilis. La potencia de ambas lisozimas se probó frente a muestras de sífilis positivas y negativas. Como se ilustra en las Figuras 17A y 17B, 6 de las 10 muestras probadas mostraron una mejora en la sensibilidad del ensayo con la adición de lisozima humana natural (LysN) o recombinante (LysR). La Figura 18A ilustra que la adición de lisozima humana recombinante a un reactivo de hemaglutinación para sífilis mejoró sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En una evaluación de 34 muestras verdaderamente positivas, 14 de las 19 muestras que dieron negativo usando el reactivo que no contenía lisozima, eran de hecho positivas cuando se añadió lisozima a la reacción. Como se ¡lustra en la
Figura 18B, la discriminación visual entre una reacción positiva y negativa se simplifica cuando se añade lisozima humana recombinante al reactivo. La Figura 19 ilustra el rendimiento (intensidad relativa de hemoaglutinacíón) de dos reactivos de hemaglutinación, con (reactivo Lys R) o sin (reactivo R) lisozíma humana recombinante. En ese experimento el rendimiento del reactivo de hemaglutinación LysR fue mayor que el del reactivo R, exhibiendo para todos los sueros probados (μ=34) un título de aglutinación relativa de entre alrededor de 1 y alrededor de dos veces mayor. La Figura 20 ilustra que la adición de lisozíma humana recombinante (LysR) a un reactivo de hemaglutinación para sífilis no da resultados falsos positivos. En una evaluación de 200 muestras del banco de sangre, el resultado medio y la desviación estándar entre ambos reactivos eran muy parecidos. La potencia de la lisozima humana recombinante es por tanto equivalente a la de la lisozima natural de leche de mama. Por tanto, la lisozima recombinante puede sustituir a la lísozima natural para aplicaciones diagnósticas.
EJEMPLO 10: La lisozima humana mejora la sensibilidad de los kit del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) usados para el diagnóstico de sífilis La detección selectiva de sífilis se realiza de forma rutinaria usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). Estos equipos detectan la unión de anticuerpos antísífilis frente a antígenos de 7 pallidum inmovilizados en los pocilios de una placa de microtitulación. La detección de la unión de los anticuerpos antisífilis a la placa se suele llevar a cabo mediante un antisuero marcado enzimáticamente dirigido frente a cadenas Fe de anticuerpo humano (kit de segunda generación) o un antígeno de 7 pallidum marcado enzimáticamente (kit de tercera generación). Ejemplos de tales reactivos diagnósticos disponibles en el mercado se enumeran a continuación:
![Figure imgf000073_0001](https://patentimages.storage.googleapis.com/73/11/76/179ff1eab45b52/imgf000073_0001.png)
Detección de anticuerpos frente a sífilis usando un formato de kit de segunda generación Todos los reactivos usados en este estudio son suministrados por Bioelisa Syphilís 3.0 kit de detección (Biokit S.A., Llica d'Amunt, España). El protocolo usado es el recomendado en el paquete incluido en el kit. Brevemente, muestras de suero o plasma se añaden a los pocilios de una placa de microtitulación. Si en la muestra hay anticuerpos específicos para 7 pallidum, forman complejos estables con los antígenos del pocilio. Después de lavar para eliminar el material sin unir, se añade un conjugado de conejo de IgG antihumana y de IgM antihumana marcado con peroxidasa de rábano y, si el complejo antígeno/anticuerpo está presente, el conjugado se une al complejo. Tras un segundo lavado, se añade una solución se sustrato enzimático que contiene un cromógeno. Esta solución se vuelve de color azul si la muestra es positiva. El color azul cambia a amarillo después de bloquear la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpo anti-7 pallidum en la muestra. Los pocilios que contenían las muestras negativas permanecieron incoloros.. Detección de anticuerpos frente a sífilis usando un formato de kit de tercera generación Todos los reactivos usados en este estudio son suministrados por Bioelisa
Syphilis 3.0 kit de detección (Biokit S.A., Llica d'Amunt, España). El protocolo usado es el recomendado en el paquete incluido en el kit. Brevemente, la prueba se lleva a cabo incubando muestras de prueba en los pocilios de una placa de mícrotitulacíón revestidos con proteínas de 7 pallidum (por ejemplo, antígenos Tp15, Tp17 o Tp47 recombínantes). Los anticuerpos IgG e IgM específicos presentes en la muestra se unen a los antígenos de la fase sólida. Posteriormente, los pocilios se lavan para eliminar los restos de la muestra de prueba y se añaden antígenos de 7 pallidum conjugados con la enzima peroxidasa. El conjugado se une a los anticuerpos específicos capturados. Después de otro lavado para eliminar el material sin unir, se añade una solución de sustrato enzimático y cromógeno. Esta solución se vuelve de color azul si la muestra contiene anticuerpos anti-7 pallidum. El color azul cambia a amarillo después de bloquear la reacción con ácido sulfúrico. La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpo ant¡-7 pallidum en la muestra. Adición de lisozima humana recombinante Para el formato de ELISA de segunda generación, se añadió lisozíma humana recombinante (Ventria Bioscience, Ventura, CA) a 2,86 μg/ml a las placas de Bioelisa Syphilis 3.0 ELISA Para el kit de tercera generación, se añadió lisozima humana recombinante en el tampón de dilución de la muestra a una concentración de 10,8 μg/ml o en el tampón de dilución de conjugado a una concentración de 1 ,08 μg/ml. Como se representa en las Figuras 21 A y 21 B, cuando se analizaron sueros humanos positivos para sífilis con reactivos de ELISA de Bioelisa Syphilis (segunda generación) y de Bioelisa Syphilis 3.0 (tercera generación), se detectó una ganancia significativa en la intensidad de la señal en presencia de lisozima humana. El aumento en la intensidad de la señal estaba en el intervalo de alrededor de 20% cuando la lisozima se añadió a la placa y los sueros analizados en el formato de segunda generación, y en el intervalo de alrededor de 200% (para 3 de 4 sueros) cuando la lísozima se añadió en el tampón de dilución de la muestra y en el tampón de dilución del conjugado y se procesaron de acuerdo con el formato de tercera generación. Un hecho interesante es que la adición de lisozíma no modifica la respuesta de los sueros humanos negativos para sífilis. Estos datos demuestran que la lisozima humana aumenta la sensibilidad de la detección y selección de sífilis con ELISA. EJEMPLO 11 : Purificación del complejo lisozima humana/Tp17
El complejo lisozima humana/proteína Tp17 es muy antigénico y, como se ha descrito antes, es útil en los ensayos diagnósticos . El aislamiento del complejo purificado lisozima humana/Tp17 facilita la realización de estudios estructurales, tales como cristalización proteica y determinación de la estructura atómica a través de difracción de rayos X. Usando los procedimientos experimentales que se
describen a continuación, se obtuvieron las cantidades en mg de complejo lísozima humana purificada/Tp17-His.
Aislamiento de monómero Tp17-HIS y dímeros Tp17-HIS
La proteína Tp17-His, obtenida como se ha descrito en el ejemplo 1 , se purificó más mediante cromatografía de filtración en gel con el fin de separar los monómeros y los dímeros de otras formas agregadas (Figura 22). Una columna HR 16/50 (diámetro 1 ,6 cm x 60 cm de altura; Amersham Biosciences, Cerdanyola, España). A continuación se inyectaron 2 mi de la muestra con 8 mg de la proteína de fusión Tp17-HIS y se llevó a cabo la cromatografía a un caudal de 1-1 ,25 ml/min a presión constante de 0,70 MPa. Las fracciones (1 ,5 mi) correspondiente a monómeros
Tp17-HIS y a dímeros Tp17-HIS se recogieron de tres carreras cromatográficas consecutivas y después se agruparon en una fracción monomérica de 8 mi de To17-HIS y una fracción dimérica de 6 mi de Tp17-HIS. Formación del complejo Tp17-HIS/lisozima humana in vitro Lisozíma humana recombinante (obtenida comercialmente de Ventria Bioscience,
Sacramento, CA, EE.UU.) estaba compuesta por proteínas monoméricas altamente homogéneas, como se muestra mediante los resultados del ensayo que se representan en la Figura 23. Para formar un complejo ¡n vitro, 3,8 mg de monómeros purificados de Tp17-HIS y dímeros Tp17-HIS se incubaron por separado durante 30 minutos a
22°C sin agitación en presencia de un exceso molar del doble de lisozima recombinante humana purificada (Ventria Bioscience, Sacramento, CA, EE.UU.). Purificación del complejo Tp17-HIS/lisozima humana mediante filtración en gel. Como se muestra en la Figura 24, los complejos Tp17-HIS/lisozima humana se separaron de monómeros sin ensamblar mediante filtración en gel en un gel de Superosa 12 HR 16/50 como se ha descrito antes. Las fracciones correspondientes al pico de Tp17-HIS/lisozima humana se recogieron y concentraron usando dispositivos Centricon Plus 20 (UFC2LGC08, The Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.) con un punto de corte en 10 kDa. Durante la filtración en centrífuga se intercambió tampón mediante lavado con tres volúmenes de columna (10 mi) de Tris HCI 10 mM, NaCI 50 mM, pH 8,0. Las muestras finales de Tp17- HlSmonómeros/lisozima humana y Tp17-HISdímeros/lisozima humana se recuperaron a 1 ,62 mg/ml y 1 ,57 mg/ml, respectivamente. El rendimiento final de recuperación de proteína fue del 60% para los complejos Tp17-HISmonómeros/l¡sozima humana y del
44% para los complejos Tp17-HIS [meros/lisozima humana
EJEMPLO 12: Procedimiento para descubrir nuevas proteínas similares a Tp17 El tp17 y las proteínas similares a Tp17 comparten la capacidad para unirse a la lisozima humana. Según esta observación, se dilucidaron procedimientos
genéricos para proporcionar la detección de proteínas similares a Tp17 en extractos proteicos totales de organismos patogénicos. En una forma de realización, la lisozima humana conjugada con un marcador detectable se híbrida a una muestra proteica. La unión de la lisozima identifica un polipéptido similar a Tp17 en la muestra.
Preparación de conjugado lisozima humana-peroxidasa de rábano (HuLYS-POD) Los conjugados de lisozima humana-peroxidasa de rábano se produjeron mediante la mezcla de 9,72 mg de lisozíma humana recombinante (159-53LZ-90P, Ventria Bioscience, Sacramento, CA, EE.UU.) y 13,6 mg de peroxidasa activada (POD) (1.428.861; Roche, Mannheim, Alemania) en un volumen total de 3,5 mi de tampón carbonato (carbonato sódico/hidrogeno carbonato 50 mM, pH 9,55). La reacción de conjugación se llevó a cabo durante 2 horas a 25°C en un baño de agua con agitación manual cada 30 minutos. La reacción se terminó mediante la adición sucesiva de 364 μl de trietanolamina 2M (108379; Merck, Darmstadt, Alemania) y 455 μl de borohidruro sódico (45,288-2; Sigma Aldrich Chemie,
Steinheim, Alemania) a una concentración de 4 mg/ml en agua desionizada. La solución resultante se agitó manualmente durante 15 segundos y después se incubó durante 30 minutos a 2-8°C. Después se añadieron 227 μl de trietanolamina 2M y la mezcla se incubó durante 2 horas a 2-8°C. Después, se añadieron 91 μl de glicina 1M (104201 ; Merck, Darmstadt, Alemania) y la solución se sometió a diálisis durante 15 horas contra tampón TSG (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM, Glicina 10 mM, pH 7,5. A continuación, la solución se aclaró mediante centrifugación durante 30 minutos a 15.000 g. Se recuperaron 4,5 mi de sobrenadante. Al conjugado se añadieron 500 μl de BSA (Pentex Miles Inc., Kankakee, IL, EE.UU. 10% en peso/volumen en tampón TSG (Tris-HCI y 25 μl de mertiolato - gentamicina sulfato.
El mertiolato-gentamicina sulfato se preparó mediante disolución de 25 mg de gentamicína sulfato (22191 E1 ; Jescuder, Terrassa, España) y 400 mg de Thimerosal (T-5125 Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) en 8,0 mi de suero bovino fetal. Después se ajustó el pH a 8,0 con hídróxido sódico (5M). Después el conjugado se filtró en esterilidad mediante un filtro Millex GV de 0,22 μm (SLGV
R04 NL; The Millípore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.) y se guardó protegido de la luz a 2-8°C hasta su uso. Procesamiento de la muestra proteica del patógeno Una muestra de 15 μl que contiene de 2 a 20 μg de proteína derivada de patógeno se mezcla con 5 μl de tampón de carga NuPAGE® LDS (4X) (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EE.UU.) y se separaron inmediatamente en un gel de Bis-Tris poliacrilamida 4-12% NuPAGE® Novex (NPO323BOX; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) usando un tampón de proceso NuPAGE® MES SDS (1X) (NP0002; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El voltaje aplicado es de 165 voltios durante 35 minutos. Después de dejar que las proteínas migraran, el gel se recupera y se
incuba durante 15 minutos en tampón de electrotransferencia (tampón ET: Tris 25 mM, 192 mM Glicina, 10% Metanol, sin ajuste de pH). Las proteínas separadas en el gen se transfieren mediante electroforesís a una membrana IMMOBILON® P (IPVH00010; The Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.). LA membrana se preparó enjuagando una vez con metanol y dos veces con agua desionizada. Para llevar a cabo la transferencia electroforética, el voltaje aplicado se mantuvo constante a 65 voltios durante una hora. Ensayo de superposición proteica HuLYS-POD Tras la electrotransferencia, la membrana se incuba 1 hora a 22°C en TBST (Tris-HCI 10 mM pH 8,0, NaCI 150mM, Tween 20) complementado con 5%
(peso/volumen) de leche desnatada SVELTESSE® (Nestlé España, Barcelona, España). Después, la membrana se lava con TBST y después se incuba durante 1 hora a 22°C en leche con TBST que contiene el conjugado HuLYS-HRP, que se diluye a 1/5000. Tras la incubación, la membrana se lava tres veces en TBST. Después se lleva a cabo la inmunotinción mediante la inmersión de la membrana en
10 mi de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) (T0565; SIGMA-ALDRICH Inc., Saint- louis, MO, EE.UU.) para visualizar las proteínas. Como control positivo en extracto celular (DE3) de E. coli BL21 se detecta una única banda que migra a 17 kDa y corresponde a IVY . EJEMPLO 13 Los patógenos bacterianos gram-positivos secretan inhibidores de la lisozima humana Las bacterias gram-positivas carecen de una membrana externa y muestran en el lado del medio de cultivo una gruesa capa de peptidoglucano. Como consecuencia, es probable que estas bacterias sean más sensibles a la acción de la lisozima que las bacterias gram-negativas. Por tanto, la hipótesis de los inventores es que las bacterias gram-positivas que son patógenos humanos poseen inhibidores de la lisozima. Debido a la ausencia de una membrana externa, estos inhibidores pueden estar presentes en el medio de cultivo bacteriano. Como se describe más adelante, los inventores han realizado análisis para determinar la presencia de inhibidores de lisozima en el medio de cultivo de ocho especies bacterianas gram-positivas clínicamente relevantes (cepa CECT184 de Enterococcus faecalis, cepa ATCC10541 de Enterococcus faecium, cepa ATCC11632 de Staphylococcus aureus, cepa ATCC12228 de Staphylococcus epídermidís, cepa ATCC49619 de Streptococcus pneumoniae, cepa CECT598 de Streptococcus pyogenes, cepa CIP105451 de Streptococcus agalactiae y cepa
NMR-GF de Propionibacterium acnes . Estas cepas se cultivaron durante 48 horas a 37°C en caldo Mueller-Hinton ajustado con cationes (CAMHB). Las células bacterianas sedimentaron medíante centrifugación (20 minutos, 14.000 g, 4°C) y 1 mi de sobrenadante se concentró hasta un volumen final de « 200 μl usando dispositivos de filtros en centrifugación
Microcon® YM-10 (The Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.). Quince μl de cada concentrado de sobrenadantes se analizaron mediante electroforesis en SDS PAGE usando un gel en gradiente al 4-12% NuPAGE® y después se tiñeron con plata (SilverXpress® kit) para visualizar las proteínas según las instrucciones del fabricante (The Invitrogen company, Prat de Llobregat, Barcelona, España). Como se deduce del resultado del ensayo representado en la figura 25, se detectaron distintos patrones proteicos para cada una de las ocho especies bacterianas probadas. La actividad bacteriolítica de la lisozima humana (1 unidad) se determinó en ausencia, o en presencia de 10 μl del sobrenadante concentrado correspondiente a cada una de las ocho especies bacterianas. El ensayo se llevó a cabo como se ha descrito antes, usando el EnzCheck® Lysozyme según las instrucciones del fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.). Como se muestra en la Figura 26, se observó inhibición completa de la actividad enzimática de la lisozima en presencia de sobrenadantes concentrados de Propionibacterium acnés, Streptococcus agalactiae, y Streptococcus pyogenes. En presencia de sobrenadantes concentrados de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, y Streptococcus pneumoníae se observó inhibición parcial. No se detectó inhibición alguna en los sobrenadantes concentrados de Enterococcus faecium y Staphylococcus epidermidis en las condiciones de este ensayo. Estos datos demuestran que hay inhibidores sin caracterizar de la lisozima humana presentes en las bacterias gram-positivas clínicamente relevantes, que pueden ser una posible fuente de descubrimiento de tales inhibidores. Estos inhibidores representan nuevos y atractivos objetivos para fármacos y vacunas, así como para nuevos ensayos diagnósticos. Estos experimentos también indican que las bacterias grampositivas se pueden usar para seleccionar polípéptidos de lisozima expresados en bacterias de tipo salvaje o mutantes que son resistentes a la inhibición del polipéptido similar a Tp17.
EJEMPLO 14 Procedimientos para identificar compuestos candidatos que inhiben la formación o la estabilidad del complejo Tp17/lisozima Numerosos patógenos animales y humanos expresan las proteínas Tp17 y similar a Tp17 (p.ej., virus, bacterias, hongos y protozoos). Los fármacos que interfieren en la formación y/o la estabilidad de los complejos proteicos HuLYS/similar a Tp17 son prometedores compuestos candidatos antimicrobianos que se pueden usar para prevenir o tratar una infección patógena en un sujeto. Con el fin de aislar tales moléculas antimicrobianas, se diseñó una prueba de selección in vitro como se describe más adelante. Para un experto en la técnica será evidente que esta prueba es útil para la selección de alto rendimiento de extractos biológicos y bibliotecas químicas. Como se muestra en la Figura 27, un ejemplo de procedimiento implica las siguientes etapas:
Preparación de reactivos Se preparó PBS 10X medíante la disolución de 29 g de Na2HPO4/12 H2O, 2 g de KH2PO y 80 g de NaCI en 1 litro de agua destilada apirógena y el ajuste del pH a un pH de 6,8 con hidróxido sódico (10M). Se preparó una solución de BSA- Glicina mediante la disolución de 10 g de BSA (81-003; Pentex Miles Inc.,
Kankakee, EE.UU.), 7,5 g de Glicina (500190; Merck, Darmstadt, Alemania) y 1 g de azida sódica (6688; Merck, Darmstadt, Alemania) en 1 litro de agua destilada (MilliQ grade, The Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.). El pH de la solución resultante fue de 7,4 con NaOH (10M). El tampón de lavado 10X para ELISA, el sustrato cromogéníco TMB y el tampón de dilución TMB están disponibles comercialmente (Kit BioELISA ANTI-HBS de 96 pocilios, 3000-1101 ; biokit SA, Lliga d'Amunt, España). El tampón de dilución de muestra del ELISA se obtuvo de BioELISA Syphilis 3.0 (3000-1148; biokit SA, Lliςa d'Amunt, España). Inmovilización de Tp17 y/o proteína similar a Tp17 en un sustrato sólido La proteína GST-Tp17 purificada, producida como se ha descrito en el ejemplo 1 , se resuspendió en PBS 1X a una concentración de 0,4 μg/ml y 150 μl de esa solución se dispensaron en placas de microtitulación de 96 pocilios (MaxiSorp™ Lockwell™ ; NUNC, Roskilde, Dinamarca) y se incubaron durante 16 horas a temperatura ambiente (22°C). A continuación, se añadieron 100 μl de solución de
BSA-Glicina y se incubaron durante 1 hora a 22°C. Después se vaciaron los pocilios mediante aspiración y se llenaron de inmediato con 200 μl de BSA-sacarosa. La incubación se llevó a cabo durante 1 hora y 30 minutos a 22°C. Los contenidos líquidos de cada pocilio se aspiraron cuidadosamente y las placas se secaron al aire durante 3 horas en un cuarto seco (15% de humedad relativa) antes de envasarse en bolsa de plástico sin aire. Contacto de Tp17 y/o similar a Tp17 con productos químicos y HuLYS- POD A un micropocillo se añadieron 100 μl de compuesto candidato (disuelto a una concentración variable de 10 ng/ml a 10 mg/ml en tampόn de dilución de muestra de ELISA y se incuban durante 15 minutos a 37°C. Al pocilio se añaden 50 μl de HuLYS-POD diluida al 1/20.000 en tampón de dilución de muestra de ELISA y se incuban durante un periodo adicional de 15 minutos. Después, los pocilios se lavan cuatro veces con tampón de lavado. Adquisición de loro y puntuación de los compuestos candidatos Después a cada pocilio se añaden 100 μl de sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano (POD) diluido en tampón de dilución de sustrato y se detiene el desarrollo del color después de 30 minutos de la adición de 100 μ de H2SO4 2M. En este experimento, la absorbancia media de tres pocilios incubados sin compuesto candidato se normaliza hasta un valor de 100%. Las moléculas o
extractos biológicos capaces de reducir la unión de HuLYS-POD por debajo de al menos 40%, 50%, 60%, 75%, 85%, 95%, o más se consideran candidatos'Ηit", como se pone de manifiesto mediante las reducciones respectivas en el canal de la señal en comparación con el valor normalizado. Preferentemente, la unión se reduce por debajo del 85% en relación con los pocilios control que no han puesto en contacto con un compuesto candidato.
EJEMPL0 15 El Tp17 inhibe las preparaciones de lisozima terapéuticas disponibles comercialmente La lisozima de pollo es una potente enzima antimicrobiana activa contra bacterias y virus. Las preparaciones comerciales que contienen lisozima como agente activo incluyen, pero no se limita a ellas, LIZIPAINA® (Boehringer Ingelheím, San Cugat del Valles, España) y LISOZIMA CHIESI (CHIESI ESPAÑA SA, Barcelona, España). Dado que se ha mostrado que la proteína Tp17 inhibe la actividad antibacteriana enzimática in vitro de la lisozima purificada, los inventores han postulado que la Tp17 también puede inhibir la actividad antibacteriana de
LIZIPAINA® y de LISOZIMA CHIESI. Para probar esta hipótesis, un comprimido de cada fármaco, LIZIPAINA® (que contiene 5 mg de lísozima de pollo por comprimido) y de LISOZIMA CHIESI (que contiene 250 mg de lisozima de pollo por comprimido) se resuspendió en agua desionizada (The Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.) para ajustar la concentración de lisozima a 4 μg/ml. A continuación, estas muestras se incubaron en ausencia o en presencia de una cantidad creciente de GST-Tp17 o de Tp17-HIS. En este experimento, la proporción molar entre la lisozima de pollo y su inhibidor conocido se varió de 1 :5 a 1 :50 para GST-Tp17 y de 1 :16 a 1 :160 para Tp17-HIS. Después de un periodo de incubación de 5 minutos a 20°C, las muestras se analizaron para determinar la actividad enzimática de la lisozima usando el kit de ensayo EnzCheck® Lysozyme (E-22013; Molecular Probes Inc., Eugene, OR, EE.UU.) según se recomienda en las instrucciones proporcionadas por el proveedor. Como se muestra en las Figuras 28a y 28B, tanto GST-Tp17 como Tp17-HIS indujeron una fuerte inhibición de la actividad antibacteriana enzímática de
LIZIPAINA® y de LISOZIMA CHIESI, respectivamente. Por tanto, las proteínas Tp17 y similar a Tp17 son capaces de inhibir la actividad antibacteriana enzimática de dos fármacos antimicrobianos disponibles comercíalmente. Es probable que algo de la eficacia terapéutica proporcionada por LIZIPAINA® y LISOZIMA CHIESI, y fármacos relacionados, se pierda in vivo a causa de la inhibición de proteínas Tp17 y similar a Tp17. Como se ha comentado antes, las proteínas Tp17 y similar a Tp17 se expresan ampliamente en patógenos bacterianos, víricos, fúngicos y parásitos humanos. En consecuencia, las variantes de la lisozima que no están sujetas a inhibición enzimática por las proteínas Tp17 y similar a Tp17 son una clase
prometedora de nuevos fármacos antimicrobianos.
EJEMPLO 16 La proteína Tp17 no inhibe la actividad antibacteriana de r-
Lysozyme™ En la búsqueda de una variante de la lisozima capaz de resistir la inhibición de las proteínas Tp17 y similar a Tp17, se probó la rLysozyme™ disponible en el mercado (71110-5; Novagen® MerckKGaA, Darmstadt, Alemania). La rLysozyme™ es una lisozima altamente recombinante que está recomendada para la lisis de las células de E. coli. La enzima cataliza la hidrólisis de enlaces N-Acetilmuramida en la pared celular bacteriana. La actividad específica de la solución de rLysozyme (1.700.000 U/mg) es 250 veces superior a la lisozima blanca de huevo de pollo y, por tanto, se requiere menos enzima para conseguir la lisis de E. coli. Además, la rLysozyme™ es óptimamente activa a un pH fisiológico (6,0-8,0) que es compatible con la línea de Novagen de reactivos de extracción proteica y de ácidos nucleicos. En este contexto, los inventores compararon la actividad antibacteriana de la lisozima humana (Ventria Bioscience, Sacramento, CA, EE.UU.) y la rLysozyme™ usando el ensayo EnzCheck Lysozyme (E-22013; Molecular Probes, Eugene, Oregon). En primer lugar determinaron que en las condiciones prescritas por el fabricante, 1 unidad de lisozima humana produjo la misma intensidad de fluorescencia que 230 unidades de rLysozyme™. Después los inventores midieron la intensidad de fluorescencia de 1 unidad de lisozíma humana o de 230 unidades de rLysozyme™, en presencia o ausencia de 10 μg de GST-Tp17 o de Tp17-HIS. Como se muestra en la Figura 29, la rLysozyme™ no fue susceptible a la inhibición de GST-Tp17 o de Tp17-HIS, mientras que se produjo una fuerte inhibición de la actividad antibacteriana de la lisozima humana. Es interesante el hecho de que se observo de forma reiterada un ligero incremento (en el intervalo de 20%) de la actividad antibacteriana de la rLysozyme™ en presencia de Tp17. En conjunto, estos resultados sugieren que la rLysozyme™ no es susceptible a la inhibición por Tp17 y posiblemente a las proteínas similares a Tp17. Como consecuencia de esto, la rLysozyme™ representa un fármaco antimicrobiano nuevo y prometedor que podría, en último término, sustituir a la lisozima de pollo en varias preparaciones terapéuticas pretendidas para uso humano y animal. Además, se puede usar como antiséptico y/o como conservante de alimentos.
EJEMPL0 17 La proteína precursora del Alzheimer (βAPP) comparte similitudes estructurales con las proteínas similares a Tp17 Entre las proteínas que comparten una extensa similitud de secuencia con la Tp17 (véase, por ejemplo, la Figura 1), los inventores identificaron la Proteína precursora beta amiloide (βAPP). Esta proteína es de un interés diagnóstico y médico fundamental ya que está implicada en la generación de depósitos amiloides
durante la enfermedad de Alzheimer. Como se muestra en la figura 30, los inventores han descubierto un motivo peptídíco bien conservado compartido por los miembros de la familia de proteínas Ivy, Tp17, y las tres isoformas de D-APP (APP770, APP751 y APP695). La realización manual de varias alineaciones permitió a los inventores agrupar todas estas secuencias peptídicas en la siguiente secuencia consenso:
CX(1 ,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C (SEC ID No: 178) En este consenso, C, K, R, H, A, G, E, D, Q y N corresponden al código de una letra para los aminoácidos para Cisteína, Lisina, Arginina, Histidina, Alanina, Glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, Glutamina y Asparagina, respectivamente.
Las normas syntax son las usadas en la base de datos PROSITE. Este consenso también se puede representar del siguiente modo: Cys Xa3ι Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Xaa8 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa-io Xaan Xaa-ι2 Xaa-i3 Cys (SEC ID NO: 177) donde Xaa^ Xaa2 , Xaa3 , Xaa4 y Xaa5 son cualquier aminoácido o están ausentes,
Xaa6 es aminoácido K, R o H, Xaa7 es A o G, Xaa8 es K, R, o H, Xaa9 y Xaa10 son cualquier aminoácido o están ausentes, Xaan es aminoácido K o R, Xaa12 es cualquier aminoácido o está ausente, y Xaa13 es aminoácido E, D, Q o N. Para tres de esta proteínas (Ivy de E coli, Tp17, y P. aeruginosa) estaban disponibles las estructuras cristalinas. Usando el visualizador molecular Cn3D, los inventores encontraron que los segmentos peptídicos relacionados de cada una de las tres proteínas exhibían una organización tridimensional conservada. Como se muestra en la Figura 31 , las tres formas se encuentran en lámina beta y despliegan un bucle peptídico con puentes disulfuro. Estas proteínas comparten una organización estructural tridimensional conservada. Las tres moléculas contienen una estructura en lámina beta desplegada y un bucle peptídico con puentes disulfuro expuesto. Este motivo estructural se conserva en las tres isoformas (APP770, APP751 y APP695) de la proteína β-APP humana. Las imágenes 3D se generaron usando en software Cn3D gratis disponible, que se puede obtener en la página web del National Center for_Biotechnology y en los siguientes archivos de átomos coordinados del Banco de Datos de Proteínas (PDB): 1GPQ (E. coli Ivy), 1 UUZ (P. aeruginosa Ivy) y 1 MWP (Homo sapiens β-APP).. Estos datos sugieren que Ivy, Tp17, y D-APP están estructural y funcionalmente relacionadas. EJEMPL0 18 La lisozima humana se une a la proteína precursora de Alzheimer (βAPP) Como se muestra en la Figura 32, el sitio de unión a la lisozima identificado en la (βAPP) reside en el extremo N de la proteína y se extiende por los residuos 92 a 116. La ¡soforma APP751 (751 aminoácidos de longitud) es un ejemplo de polipéptido similar a APP. Las conclusiones extraídas de esta figura son también ciertas para las isoformas APP695 y APP770. Los números de los aminoácidos se
refieren a las posiciones de los aminoácidos en la secuencia de la βAPP depositada en el GenBank con el número de acceso NP958816. El sitio de unión a la lisozima se localiza entre los residuos 92 a 116. Específicamente, los inventores usaron un fragmento más largo de derivado de βAPP, denominado sAPPα y un fragmento más corto denominado sAPPα (304-612). Ambas formas sAPPα y sAPPα (304-
612). Derivan de la isoforma APP695 y, en consecuencia, carecen del dominio inhibidor de la proteasa kunitz (residuos 289 a 342 en APP770 y APP751. Para comprobar si la proteína β-APP se une a huLYS, se realizaron ensayos de unión a lisozima usando formas recombinantes, purificadas de β-APP. Tanto la sAPPα (número de producto: S9564) como la sAPPα (302-612) (número de producto: S8065) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Tres cantos, Madrid, España). Se rociaron 10 μg de cada proteína en una membrana Nytran (Scleicher & Schüell, Dassel, Alemania). Los sitios de adsorción inespecífica se bloquearon mediante incubación durante 1 hora con lisozima humana marcada con peroxidasa de rábano (POD) diluida a 1/1000 en leche TBST. Después, la membrana se lavó tres veces durante 5 minutos cada lavado, con TBST. La tinción se llevó a cabo mediante la adición de 5 mi de sustrato cromogénico POD (TMB, número de producto: T0565, Sigma). Como se muestra el la figura 33, la huLYS se unió a sAPPα, pero no a APPα (302-612). Esta observación sugirió que la proteína β-APP se une a huLYS y que el sitio de unión se localiza en la región N terminal, entre los residuos 92 y 116 de la β-APP. Estos datos definen nuevos objetivos farmacológicos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Además, es probable que el complejo proteico β-APP/huLYS sirva como marcador diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Las composiciones diagnósticas y los procedimientos relacionados con la enfermedad de Alzheimer se caracterizan por fragmentos de un polipéptido similar a APP sustancialmente puro, que comprende una secuencia de aminoácidos de Cys Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaan Xaa12 Xaa13 Cys (SEC ID NO: 177), donde Xaa^ Xaa2 , Xaa3 , Xaa y Xaa5 son aminoácidos o están ausentes, Xaa6 es aminoácido K, R o H, Xaa7 es A o G, Xaa8 es K, R, o H, Xaa9 y
Xaa10 son aminoácidos o están ausentes, Xaan es aminoácido K o R, Xaa12 es aminoácido o está ausente, y Xaa13 es aminoácido E, D, Q o N. Las composiciones y los procedimientos también se caracterizan por moléculas de ácido nucleico que codifican estos fragmentos polipeptídicos, vectores para la expresión de tales fragmentos y células huésped que contienen estos vectores. Tales fragmentos pueden expresarse como polipéptídos recombinantes y usarse para la generación de anticuerpos que reconozcan el fragmento o que reconozcan el fragmento cuando esté en forma de complejo con un polipéptido de lisozima. Los anticuerpos que se unen de forma específica a un complejo polipéptido
similar a la APP/lisozíma son útiles en los procedimientos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, donde el anticuerpo se usa como sonda de una muestra biológica del sujeto, tal como una muestra de suero, una muestra de fluido cefalorraquídeo o una muestra de tejido. En la actualidad, un diagnóstico definitivo de enfermedad de Alzheimer generalmente requiere un estudio posmortem del tejido cerebral de un sujeto. Por tanto, las presentes composiciones y procedimientos, que facilitan el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en los fluidos corporales obtenidos de un sujeto vivo, proporcionan una mejora significativa sobre los procedimientos diagnósticos existentes. Específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de la presencia en una muestra del sujeto de un complejo entre un polipéptido similar a APP y un polipéptido lisozima, o la presencia de un anticuerpo que se une a tal complejo. Además, se proporciona un procedimiento para identificar un compuesto candidato que modula la unión entre el polipéptido similar a APP y un polipéptido de lisozima mediante la detección de una reducción en la unión entre el polipéptido similar a Tp1 y el polipéptido de lisozima en presencia del compuesto candidato. EJEMPLO 19 Identificación por ordenador de nuevas proteínas similares a Tp17 Se realizaron búsquedas en las bases de datos de secuencias (Swissprot & TrEMBL) para detectar las proteínas que comparten la secuencia consenso
CX(1 ,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C (SEC ID NO: 178) definida en la figura 30.Las proteínas bacterianas, víricas y eucarióticas identificadas con esta secuencia se muestran en las Figuras 34A y 34B. Estas proteínas representan nuevos objetivos terapéuticos y composiciones inmunogénicas que es muy probable que interfieran en la formación de complejos proteicos similar aTp17huLYS. Además, estas proteínas, en complejo con huLYS, pueden representar marcadores atractivos para el diagnóstico de enfermedades humanas, animales y vegetales. EJEMPLO 20 Inhibición y capacidad de unión de mutantes de Tp17 Para determinar si H31 y His104de Tp17 contribuían a la inhibición de huLYS, los inventores realizaron mutagénesis dirigida a sitio del gen que codifica GST-Tp17 (Figura 35A). Se generaron polipéptidos mutantes H31A e His104A GST-Tp17 medíante la introducción de dos cambios nucleotídícos en el vector plasmídico pGEX2T-Tp17 usando el kit de mutagénesis dirigida QuickChange® Site-directed (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Con tal propósito, los oligonucleótidos mutagénicos Fw: CPAAG (5'-CCG TGT GTC CGG CCG CCG GGA AGG C-3') (SEQ ID NO: 298) y Bw CPAAG (5'-GCC TTC CCG GCG GCC GGA CAC ACG G- 3') (SEQ ID NO: 299), y los oligonucleótidos Fw_KPAE (5*-AAT CGA AGG CAC CGG CCG AGA AAG AGC TGT ACG-3) (SEQ ID NO: 300)y Bw_KPAE (5*-CGT ACÁ GCT CTT TCT CGG CCG GTG CCT TCG ATT-3') (SEQ ID NO: 301) se
hibrídaron por separado al pGEX2T-Tp17 desnaturalizado y se extendieron usando la ADN polímerasa Pfu Turbo en las condiciones recomendadas por el proveedor. El molde de ADN no metilado se eliminó mediante digestión con Dpnl y la mezcla resultante de la digestión se usó para transformar células XL-1 Blue® supercompetentes. Los plásmidos mutantes se seleccionaron mediante mapeo de restricción de los amplicones resultantes de la PCR. La presencia de una mutación H3 A se confirmó mediante secuenciación del gen Tp17 mutado de longitud completa. A continuación se produjo en GST-To17 mutante con la mutación H31A o His104A y se purificó como se describe en el Ejemplo 1. Los ensayos de inhibición de la lisozima se llevaron a cabo como se describe más adelante. Cada 100 μl de la mezcla de reacción contenían 25 μl de solución de lisozíma (2 unidades para la lisozíma humana, disuelta en tampón de reacción), 25 μl de una solución proteica de prueba y 50 μl de una suspensión de Micrococcus lysodeikticus (50 μg/ml) marcado con fluoresceína. Después, la mezcla de reacción se incubó durante 45 minutos a 37°C. La fluorescencia presente en la mezcla de reacción se midió ((λeXc = 485 nm; λemι = 520 nm) usando un modelo de lector de placas de múltiples pocilios FLxδOO (Bio TEK instruments, Winoosky, Vermont) equipado con un software de adquisición de los datos júnior KC ( BioTEK Instruments, Winoosky, Vermont ( Los datos fluorescentes resultantes , que se muestran en la figura 35B), representan la medía y la desviación estándar correspondiente a la lectura de tres pocilios independientes. Un pocilio control negativo contenía 50 μl de agua desíonizada y 50μl de una suspensión de Micrococcus lysodeikticus marcada con fluoresceína. Como se muestra en las figuras 35A y 35B, los polipéptidos mutantes H31A y
His104A mostraron una disminución de la inhibición de la lisozíma, pero retuvieron su capacidad para unirse a la lisozima (Figura 36). Estos datos demostraron que las posiciones aminoacídicas 31 y 104 contribuyen a la inhibición y/o unión a la lísozima. Por tanto, las formas de realización de un Tp17 mutante según la presente invención incluyen una o más mutaciones en y/o alrededor de H31 e His10 de Tp-17 y los sitios correspondientes en otras patógenos similares a Tp-17 . Tal mutante puede interferir en la inhibición normal de una proteína similar a Tp-17 in vivo y, por tanto, puede tener los efectos terapéuticos descritos antes. EJEMPLO 21 L Tp17 se puede unir a la proteína similar a la lisozima SLLP1 En el acrosoma del esperma humano hay una proteína única, no bacteriolítica, de pollo o de tipo convencional (tipo C) similar a la lisozima, SLLP1 (Mandal y col. Biol Reprod. 68:1525-37, 2003). Por lo general las lisozimas de tipo C son bacteriolíticas y pueden unirse a N-acetílglucosaminas unidas por enlaces beta-1 ,4-glicosídicos. La mayoría de los residuos invariantes (17 de 20), incluidas todas las cisteínas, estaban conservadas en la SLLP1 , pero los dos residuos
catalíticos E35 y D52 conservaron las lisozimas de tipo C donde se habían sustituido en la SLLP! Con T y N, respectivamente, para convertirse en T122 y N139. Mandal y col. Postularon la hipótesis de que, tras una reacción acrosómica, la SLLP1 pudo ser un posible receptor para el residuo oligosacárido del huevo N- acetilglucosamína, que está presente en la matriz extracelular en la superficie de la membrana plasmática del huevo, dentro del espacio perivitelimo, en los poros de la zona pelúcida y en las capas acumuladas. Los inventores han encontrado que huLYS, chkLYS y SLLP1 comparten más del 55% de identidad en la secuencia. Como se muestra en la Figura 37, mientras que la lisozima humana y la lisozima de pollo comparten una identidad de secuencia del 63%, I aSLLPI y la lisozima humana comparten una identidad de la secuencia del 58%. Dado que la Tp17 es capaz de unirse a HuLYS y chkLYS, y con base en el nivel elevado de identidad de la secuencia entre estas proteínas, es probable que los polipéptidos similares a Tp17, incluido el Tp17, sean capaces de unirse a SLLP1. Esta interacción puede facilitar la transmisión de patógenos durante el contacto sexual. Como se muestra en la Figura 38, un complejo SLLP1/polipéptido similar a Tp17 representa un prometedor objetivo terapéutico para el control de la fertilidad humana y animal. Por ejemplo, como se ¡lustra en la figura 38, la administración de una cantidad eficaz de un polipéptido similar a Tp17 puede servir como procedimiento para la anticoncepción ya que interfiere con la llegada normal de un espermatozoide a un receptor conocido en la superficie de un huevo. Además, los compuestos candidatos que disminuyen la afinidad de unión de un polipéptido similar a TP17 a SLLP1 son inhibidores útiles de enfermedades de transmisión sexual. Los procedimientos para la selección de tales compuestos se han descrito anteriormente. Además, aunque el SLLP1 de tipo salvaje no es probable que sea un bacteriolítico, es probable que el SLLP1 mutante, que contiene las alteraciones en los aminoácidos de t122 a E y de N139 a D, o especialmente los mutantes dobles que contienen mutaciones en la secuencia conservada de la lisozima de tipo C que adquieran actividad bacteriolítíca. Es probable que la SLLP1 mutante que contiene estas mutaciones no se podría unir al polipéptidos de tipo Tp17 y probablemente tendría un aumento de la actividad enzimática respecto a la lisozima de pollo, por ejemplo. Como al, la SLLP1 mutante se puede usar para intensificar la actividad antimicrobiana, por ejemplo, bacteriolítíca, la capacidad como composición farmacéutica o desinfectante. Otra variante de la lisozima, como la lisozima del barteriófago T4, también se puede usar de un modo similar. Una forma de realización de la composición puede incluir de entre a aproximadamente 2 a 100 mg/de la variante de lísozima (preferentemente de aproximadamente 5 mg), aproximadamente 2 mg de papaína y/o acerca de 3 mg de bacitracina. Una forma
de realización preferida se puede disolver para la ingesta oral. Otras formas de realización
La invención puede realizarse en otras formas específicas sin salirse fuera del espíritu o de las características esenciales de la misma. Se puede combinar cualquier aspecto y característica de la invención descrita anteriormente. Las formas de realización anteriores deben considerarse a todos los efectos ilustrativos y no limitantes de la invención descrita en la presente. Por tanto, el alcance de la invención está indicado en las reivindicaciones adjuntas más que en la descripción anterior, y en ella se abarcan todos los cambios que entren dentro del significado y de la serie de equivalencias de las reivindicaciones.
Incorporación como referencias
Todas las publicaciones y documentos de patentes citados en esta solicitud se incorporan en su totalidad como referencias para todos los propósitos hasta el mismo punto, como si los contenidos de cada publicación o patente estuvieran incorporados en la presente.