JP2009291208A - 病原体感染の検出のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は病原体感染の検出のための組成物および方法に関連する。本発明は、リゾチームポリペプチドと、Treponema pallidumのP17ポリペプチド(TP17)またはTp17に類似のポリペプチドとの間の結合を増強または減弱させるための治療用組成物または診断用組成物または治療方法または診断方法の使用を含むことで、基本的に特徴付けられる。より具体的には本発明は、病原体感染または慢性的な変質の検出、処置または予防のための組成物および方法、ならびにTp17に類似のポリペプチドおよびリゾチームポリペプチドを用いる結合アッセイに関連する。
【選択図】なし
Description
本発明は概して、リゾチームポリペプチドのTreponema pallidum P17ポリペプチド(Tp17)またはTp17様ポリペプチドへの結合の特徴付けから得られた診断用組成物および治療用組成物ならびに診断方法および治療方法を特徴とする。さらに、本発明はリゾチームポリペプチドとTP−17ポリペプチドまたはTP−17様ポリペプチドとの結合を増強または減弱させるための方法および組成物を提供する。
梅毒はTreponema pallidum(下でまた「Tp」とも呼ぶ)感染に起因する疾患である。梅毒の診断は一般に、例えば梅毒トレポネーマ血球凝集反応試験(TPHA)、梅毒トレポネーマ蛍光抗体吸収試験(FTA−ABS)および/または梅毒トレポネーマ運動抑制試験(TPI)、ならびに酵素結合免疫吸着法(ELISA)およびウェスタンブロット系を用いた、血中における抗Tp抗体のイムノアッセイによってなされる。これらの試験はTpまたはTp由来の抗原調製物(例えばTp抗原であるTp15、Tp17およびTp47)と反応する抗体を検出する。TPI試験は、Tpの運動性を阻害する、患者の血清中の補体活性化抗体の量の顕微鏡観察評価に関連する。この試験はコストが高いために一般に診断として用いられない。TPHA試験は、患者の血清抗体と、Tp超音波処理抗原が結合した赤血球との凝集に関連する。FTA−ABS試験は、患者の血清中の特異的抗体が、固体支持体に付着されたTpへ結合することを蛍光標識された二次抗体を介して検出するための間接的な免疫蛍光顕微鏡観察に関連する。これらのアッセイは広く用いられているが、体液中のTp抗体レベルが極めて低い場合に、早期の感染または低レベルの感染を検出するために必要な感度を欠く。
本発明は病原体の感染の検出および処置のための組成物および方法を提供する。本発明は概して、Treponema pallidumのポリペプチドであるTp17が宿主によって生産される抗菌ペプチドであるリゾチームに結合し、そしてリゾチームの抗菌活性を阻害するという発見に関連する。リゾチームに対するTp17の結合部位およびTp17に対するリゾチームの結合部位が同定された。関連するタンパク質と、リゾチームの結合および阻害に必要なTp17配列との比較は、単純ヘルペスウイルスを含む多くの異なる病原体にわたって保存されたコンセンサス配列に結合するリゾチームの同定を提供し、このことは、リゾチームに結合するTP17関連ポリペプチドが宿主免疫応答を阻害するための一般的な機構を提供することを示唆した。したがって、本発明はまた、TP17結合を阻害するまたは不安定化する変異を含む変異リゾチームポリペプチドの同定も提供する。このようなポリペプチドまたはその断片は、病原体感染の予防または処置に有用である。さらに、本発明はTp17−リゾチーム複合体に結合する抗体の検出に基づいた、改良された診断アッセイを提供する。
本発明はまた、例えば以下のような項目を提供する。
(項目1)
少なくとも、アミノ酸配列Xaa n Pro His Xaa n (配列番号1)を含むリゾチーム結合モチーフを含む、実質的に純粋なTp17様ポリペプチドのフラグメントであって、該配列において、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつnは少なくとも1であり、そして、該フラグメントは、リゾチームポリペプチドに結合し得、そして、該モチーフは、CKPHDC(配列番号24)ではない、フラグメント。
(項目2)
前記フラグメントが、Tp17様ポリペプチドの約4アミノ酸と約200アミノ酸との間である、項目1に記載のフラグメント。
(項目3)
前記フラグメントが、Tp17様ポリペプチドの約100未満のアミノ酸である、項目2に記載のフラグメント。
(項目4)
前記フラグメントが、約30アミノ酸長未満である、項目2に記載のフラグメント。
(項目5)
前記ポリペプチドが、リゾチームの酵素活性を実質的に阻害し得る、項目1に記載のフラグメント。
(項目6)
前記ポリペプチドが、リゾチームの抗細菌活性を実質的に阻害し得る、項目1に記載のフラグメント。
(項目7)
前記モチーフが、アミノ酸コンセンサス配列CS1:Cys Xaa 1 Xaa 2 Xaa 3 Pro His Xaa 4 Xaa 5 Xaa 6 Xaa 7 Xaa 8 Xaa 9
Xaa 10 Xaa 11 Xaa 12 Xaa 13 Cys(配列番号2)を含み、該配列において、Xaa 1 、Xaa 2 、Xaa 3 、Xaa 4 、Xaa 5 、Xaa 6 、Xaa 7 、Xaa 8 、Xaa 9 、Xaa 10 、Xaa 11 、Xaa 12 、またはXaa 13 は任意のアミノ酸であるか、存在しないか、またはペプチド結合である、項目1に記載のフラグメント。
(項目8)
以下:
Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、Yersinia pestis、Shigella flexnerii、Treponema denticola、Vibrio cholerae、Vibrio vulnificus、Vibrio parahemolyticus、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Enterococcus faecalis、Bordetella bronchiseptica、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Helicobacter hepaticus、Helicobacter pylori、Salmonella typhimurium、Ralstonia solanacearum、Xanthomonas campestris、Pseudomonas syringae、Pasteurella multocida、Brucella melitensis、Brucella suis、Porphyromonas gingivalis、重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、Toxoplasma gondii、Trypanozoma spp.、Gardnerella vaginalis、Mycobacterium avium、Mycobacterium leprae、Mycobacterium paratuberculosis、Mycobacterium tuberculosis、Campylobacter jejuni、Helicobacter spp.、Agrobacterium tumefaciens、Moraxella catarrhalis、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae、Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyii、Propionibacterium acnes、Listeria monocytogenes、単純疱疹ウイルス2型、インフルエンザウイルス、タカリベウイルス、ブルータングウイルス、Bacteroides thetaiotaomicron、Coxiella burnetti、 Legionella pneumophila、Salmonella typhi、チンパンジーサイトメガロウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、デング熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、西ナイルウイルス、トリインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、LdMNPV、Plasmodium falciparum、Plasmodium ovale、Eimeria tenella、Eimeria acervulina、Giardia lamblia、Plasmodium yoelii、およびAnopheles gambiaeによって運ばれる病原体、からなる群より選択される病原体に由来する、項目1に記載のフラグメント。
(項目9)
前記モチーフが、アミノ酸コンセンサス配列CS2:Xaa 1 Xaa 2 Pro His Xaa 3 Xaa 4 (配列番号3)を含み、該配列において、Xaa 1 は、Cys、Lys、Val、Alaであるか、または存在せず;Xaa 2 は、Ala、CysまたはLysであり;Xaa 3 は、Ala、AspまたはGluであり、そして、Xaa 4 は、Cys、GlyまたはLysである、項目1に記載のフラグメント。
(項目10)
前記モチーフが、CCPHAG(配列番号4)、VCPHAG(配列番号5)、VAPHDC(配列番号6)、KAPHDK(配列番号7)、VKPHDG(配列番号8);KKPHAK(配列番号9)、KAPHEK(配列番号10)、KKPHAC(配列番号11)、VAPHAG(配列番号12)、VKPHAK(配列番号13)、VKPHAC(配列番号14)、VAPHEG(配列番号15)、VKPHEK(配列番号16)、VCPHEK(配列番号17)、CKPHAG(配列番号18)、ACPHAG(配列番号19)、またはKCPHDC(配列番号20)、VKPHDK(配列番号21)、KKPHAG(配列番号22)、およびCAPHEK(配列番号23)からなる群より選択される、項目9に記載のフラグメント。
(項目11)
前記モチーフが、アミノ酸コンセンサス配列CS3:Xaa Cys Pro His Ala Gly(配列番号25)を含み、該配列において、Xaaは、CysまたはValである、項目1に記載のフラグメント。
(項目12)
前記モチーフが、固体支持体に固定されている、項目1〜9のいずれか1項に記載のフラグメント。
(項目13)
前記フラグメントが、検出可能なラベルに連結されている、項目1〜10のいずれか1項に記載のフラグメント。
(項目14)
項目1〜9のいずれか1項に記載のフラグメントをコードする、実質的に純粋な核酸分子。
(項目15)
項目14の核酸分子を含む、ベクター。
(項目16)
項目15のベクターを含む、宿主細胞。
(項目17)
変異型リゾチームポリペプチドとTp17様ポリペプチドとの間の結合を低減させる、少なくとも1種のアミノ酸変異を含む、実質的に純粋な変異型リゾチームポリペプチドであって、該変異型リゾチームポリペプチドは、対応する野生型リゾチームポリペプチドの抗細菌活性の少なくとも50%を保持する、実質的に純粋な変異型リゾチーム。
(項目18)
前記変異が、前記変異型リゾチームポリペプチドとTp17様ポリペプチドとの間の結合を、野生型のリゾチームポリペプチドの結合に対して少なくとも5%低減させる、項目17に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記変異が、前記対応する野生型ポリペプチドにおいて表面電荷に影響を与える、項目17に記載のポリペプチド。
(項目20)
前記変異が、Tp17様ポリペプチドと接する野生型リゾチームポリペプチドの、正に荷電したアミノ酸残基、負に荷電したアミノ酸残基、または疎水性アミノ酸残基にある、項目17に記載のポリペプチド。
(項目21)
ヒトリゾチームのLys19、Arg23、Lys51、Gly55、Asn57、Arg131、Asn132およびArg133、ならびに、他の種における対応する位置からなる群より選択されるアミノ酸位置のうち少なくとも1つの変異を含む、項目17に記載のポリペプチド。
(項目22)
項目17〜21のいずれか1項に記載のリゾチームポリペプチドをコードする、実質的に純粋な核酸分子。
(項目23)
項目22の核酸分子を含む、ベクター。
(項目24)
項目23のベクターを含む、宿主細胞。
(項目25)
実質的に純粋なTp17様ポリペプチドおよび実質的に純粋なリゾチームポリペプチドを含有する組成物であって、該Tp17様ポリペプチドは、Ivyポリペプチドではない、組成物。
(項目26)
前記リゾチームポリペプチドおよび前記Tp17様ポリペプチドが、約0.001と約1,000,000との間の分子比で存在する、項目25に記載の組成物。
(項目27)
さらに、キャリア粒子を含有する、項目25に記載の組成物。
(項目28)
前記キャリア粒子が、赤血球、ポリペプチド凝集粒子、ポリマー粒子、無機粒子、常磁性粒子および酵母細胞からなる群より選択される、項目27に記載の組成物。
(項目29)
前記Tp17様ポリペプチドが、配列:Cys Xaa 1 Xaa 2 Xaa 3 Pro
His Xaa 4 Xaa 5 Xaa 6 Xaa 7 Xaa 8 Xaa 9 Xaa 10 Xaa 11 Xaa 12 Xaa 13 Cys(配列番号2)を含み、該配列において、Xaa 1 、Xaa 2 、Xaa 3 、Xaa 4 、Xaa 5 、Xaa 6 、Xaa 7 、Xaa 8 、Xaa 9 、Xaa 10 、Xaa 11 、Xaa 12 またはXaa 13 は、任意のアミノ酸であるか、または存在しない、項目25に記載の組成物。
(項目30)
前記Tp17様ポリペプチドが、CCPHAG(配列番号4)、VCPHAG(配列番号5)、VAPHDC(配列番号6)、KAPHDK(配列番号7)、VKPHDG(配列番号8);KKPHAK(配列番号9)、KAPHEK(配列番号10)、KKPHAC(配列番号11)、VAPHAG(配列番号12)、VKPHAK(配列番号13)、VKPHAC(配列番号14)、VAPHEG(配列番号15)、VKPHEK(配列番号16)、VCPHEK(配列番号17)、CKPHAG(配列番号18)、ACPHAG(配列番号19)、KCPHDC(配列番号20)、VKPHDK(配列番号21)、KKPHAG(配列番号22)およびCAPHEK(配列番号23)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目29に記載の組成物。
(項目31)
前記リゾチームポリペプチドが、以下のアミノ酸配列:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Ser Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asp Tyr Gly Xaa Xaa Gln Ile Asn Xaa Xaa Xaa Trp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa(配列番号28)
を含み、該配列において、Xaaは、任意のアミノ酸であるか、または存在しない、項目25に記載の組成物。
(項目32)
前記Tp17様ポリペプチドは、細菌、ウイルス、寄生虫、プラスミド、プリオン、マイコプラズマおよび糸状菌因子からなる群より選択される病原体に由来する、項目31に記載の組成物。
(項目33)
前記Tp17様ポリペプチドは、Treponema pallidumに由来する、項目25に記載の組成物。
(項目34)
前記Tp17様ポリペプチドは、生物学的サンプルから単離される、項目25に記載の組成物。
(項目35)
前記Tp17様ポリペプチドは、組換えポリペプチドである、項目25に記載の組成物。
(項目36)
前記Tp17様ポリペプチドは、親和性タグに融合される、項目25に記載の組成物。
(項目37)
前記Tp17様ポリペプチド、および/または、前記リゾチームポリペプチドが、固体支持体に固定されている、項目25に記載の組成物。
(項目38)
前記リゾチームポリペプチドが、ヒトリゾチームポリペプチドに由来する配列を含む、項目25に記載の組成物。
(項目39)
被験体において病原体に対する免疫応答を検出するための方法であって、該方法は、以下:
(a)該被験体に由来する生物学的サンプルを、外来性のリゾチームおよびTp17様ポリペプチドと接触させる工程;ならびに
(b)該Tp17様ポリペプチド、またはTp17様ポリペプチド−リゾチームポリペプチド複合体に結合する抗体を検出する工程
を包含する、方法。
(項目40)
病原体に対する免疫応答を検出するための診断アッセイの感度を高めるための方法であって、該方法は、該診断アッセイにリゾチームポリペプチドを添加する工程を包含し、該リゾチームポリペプチドの添加が、該アッセイの感度を少なくとも5%増加させる、方法。
(項目41)
前記診断アッセイが、凝集アッセイである、項目39または40に記載の方法。
(項目42)
前記リゾチームポリペプチドが、前記生物学的サンプルとの接触の前、接触の間、または接触後に、前記Tp17様ポリペプチドと接触される、項目39または40に記載の方法。
(項目43)
前記Tp17様ポリペプチドが組み換え型である、項目39または40に記載の方法。
(項目44)
前記リゾチームポリペプチドが組み換え型である、項目39または40に記載の方法。
(項目45)
前記リゾチームポリペプチドが、ヒトに由来する、項目39または40に記載の方法。
(項目46)
前記病原体が、細菌、ウイルス、寄生虫、プラスミド、プリオン、マイコプラズマおよび糸状菌因子からなる群より選択される、項目39または40に記載の方法。
(項目47)
前記病原体が、Treponema pallidumである、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記Tp17様ポリペプチドまたは前記リゾチームポリペプチドが、親和性タグに融合されている、項目39または40に記載の方法。
(項目49)
前記Tp17様ポリペプチドまたは前記リゾチームポリペプチドが、固体支持体に固定されている、項目39または40に記載の方法。
(項目50)
前記アッセイが、イムノアッセイを含む、項目39または40に記載の方法。
(項目51)
前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫凝集アッセイ、ラジオイムノアッセイ、濁度アッセイ、比濁分析アッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイ、化学発光アッセイおよび蛍光アッセイからなる群より選択される、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、涙液、唾液、痰、鼻腔液、耳液、生殖液、乳液、乳汁、初乳、胎盤液、汗、滑液、腹水、胃腸液、滲出液、濾出液、胸水、心膜液、羊水、脳脊髄液、胆汁、胃液、精液、糞便物質、上気道液、腹水、炎症部位から回収した流体、プールされた堆積部位から回収された流体(fluidharvested from a pooled collection site)、気管支洗浄液(bronchiallavage)、尿、生検物質、房水、反芻動物の噴門洞からの物質、有核細胞サンプル、粘膜表面に付随するあらゆる流体、毛髪および皮膚からなる群より選択される、項目39または40に記載の方法。
(項目53)
梅毒の診断に使用される、項目39または40に記載の方法。
(項目54)
病原体に対する免疫応答を検出するためのキットであって、Tp17様ポリペプチドおよびリゾチームポリペプチドを含む、キット。
(項目55)
サンプルにおいて病原体を検出するためのキットであって、配列番号28を含む標識されたリゾチームポリペプチドを含む、キット。
(項目56)
前記Tp17様ポリペプチドまたは前記リゾチームポリペプチドが、固体支持体に結合されている、項目54または55に記載のキット。
(項目57)
前記固体支持体が、樹脂、ゲル、ビーズ、ウェル、カラム、チップ、膜、マトリックス、プレートおよびフィルタデバイスからなる群より選択される、項目54または55に記載のキット。
(項目58)
リゾチームの抗細菌活性を増加させる候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、該候補化合物の存在下で、リゾチームポリペプチドと、リゾチーム結合モチーフを含むポリペプチドとの間の結合の低減を検出する工程を包含する、方法。
(項目59)
前記候補化合物が、ヒトリゾチームのGlu53に対応する触媒性グルタミン酸に対するリゾチーム結合モチーフの結合を低減する、項目58に記載の方法。
(項目60)
増加した抗細菌活性を有する変異型リゾチームポリペプチドを同定するための方法であって、該方法は、以下:
(a)野生型のリゾチーム配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも1つの変異を含むリゾチームポリペプチドを提供する工程;および
(b)該変異型リゾチームポリペプチドとTp17様ポリペプチドとの間の結合の低減を検出する工程
を包含する、方法。
(項目61)
病原体感染の処置または予防を必要とする被験体において、病原体感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、アミノ酸変異を含む変異型リゾチームポリペプチドの有効量を被験体に投与する工程を包含し、該変異は、該リゾチームポリペプチドとTp17様ポリペプチドとの間の結合を低減する、方法。
(項目62)
病原体感染の処置または予防を必要とする被験体において、病原体感染を処置または予防するための方法であって、該方法は、アミノ酸変異を含む変異型Tp17様ポリペプチドの有効量を被験体に投与する工程を包含し、該変異型Tp17様ポリペプチドの投与は、病原体により発現されるTp17様ポリペプチドと内在性のリゾチームポリペプチドとの間の結合を低減する、方法。
(項目63)
免疫応答の増加を必要とする被験体において免疫応答を増加するワクチンであって、該組成物は、単純疱疹ウイルス2型に由来するgJ糖タンパク質およびgD糖タンパク質のうち少なくとも一方を含有する、ワクチン。
(項目64)
免疫応答の増加を必要とする被験体において免疫応答を増加するワクチンであって、該組成物は、は、リゾチーム結合ポリペプチドを含有する、ワクチン。
(項目65)
免疫応答の増加を必要とする被験体において免疫応答を増加するワクチンであって、該組成物は、リゾチームポリペプチド、およびリゾチーム結合モチーフを含むポリペプチドを含有する、ワクチン。
(項目66)
被験体において単純疱疹ウイルス2型感染を診断する方法であって、該方法は、該被験体に由来するサンプルにおいて、gJタンパク質リゾチーム結合モチーフの存在を検出する工程を包含する、方法。
(項目67)
サンプルにおいてリゾチーム酵素活性を低減するための方法であって、該方法は、サンプルを、Tp17様ポリペプチドに、該ポリペプチドの該リゾチームへの結合を可能にする条件下で接触させる工程を包含し、該Tp17様ポリペプチドは、Ivyタンパク質を含まない、方法。
(項目68)
被験体においてリゾチーム酵素活性を低減するための方法であって、該方法は、該被験体に、Tp17様ポリペプチドまたはそのフラグメントの有効量を投与する工程を包含する、方法。
(項目69)
前記ポリペプチドが、Treponema pallidum P17ポリペプチドである、項目67または68に記載の方法。
(項目70)
癌、アルツハイマー病、腎性アミロイドーシス、白血病、クローン病およびアレルギーからなる群より選択される疾患を処置または予防するために使用される、項目67または68に記載の方法。
(項目71)
APP様ポリペプチド、および実質的に純粋なリゾチームポリペプチドを含有する、組成物。
(項目72)
被験体において、アルツハイマー病を診断する方法であって、該方法は、該被験体に由来するサンプルにおいて、APP様ポリペプチドとリゾチームポリペプチドとの間の複合体の存在、または、このような複合体に結合する抗体の存在を検出する工程を包含する、方法。
(項目73)
APP様ポリペプチドとリゾチームポリペプチドとの間の結合を調節する候補化合物を同定するための方法であって、該方法は、該候補化合物の存在下で、Tp17様ポリペプチドと該リゾチームポリペプチドとの間の結合の低減を検出する工程を包含する、方法。
(項目74)
受精能の調節を必要とする被験体において、受精能を調節するための方法であって、該方法は、Tp17様ポリペプチドの有効量を該被験体に投与する工程を包含し、該変異型Tp17様ポリペプチドの投与は、卵細胞表面における内在性SLLP1ポリペプチドと、同族レセプターとの間の結合を低減し、その結果、該被験体の受精能が調節される、方法。
(項目75)
受精プロセスの間のSLLP1結合を妨害するTp17様ポリペプチドを含有する、避妊用組成物。
(項目76)
バクテリオファージT4リゾチームおよびパパインまたはバシトラシンの少なくとも有効量を含有する、抗菌薬として使用するための薬学的組成物。
(項目77)
バクテリオファージT4リゾチーム、パパインおよびバシトラシンを含有する、項目76に記載の薬学的組成物。
(項目78)
被験体における病原体感染を処置する方法であって、該方法は、病原体感染を有すると診断された被験体に、バクテリオファージT4リゾチーム、およびパパインまたはバシトラシンを含有する薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
(項目79)
TP17様ポリペプチドとリゾチームポリペプチドとの間の複合体に特異的に結合する、実質的に純粋な抗体。
(項目80)
前記リゾチームポリペプチドが、ヒト由来である、項目79に記載の実質的に純粋な抗体。
一般に、本発明は、病原体(例えばTreponema pallidum)の感染を有する被験体の検出および処置に関連する組成物および方法を特徴とする。下により詳細に記載するように、本発明は、病原体により発現されるポリペプチドであるTp17が、宿主により発現される抗菌ポリペプチドであるリゾチームと結合してこれを阻害することの発見に部分的に基づく。多くの病原体がTp17関連タンパク質を発現するので、宿主の免疫応答を阻害するこの方法は、多数の病原体に渡って保存されるようである。したがって、本発明はこの知見に基づく病原体感染の処置または予防の方法を提供する。さらに、本発明は、Tp17−リゾチーム複合体へ結合する抗体の検出に基づく改善された診断アッセイを提供する。
(Treponema pallidum P17様ポリペプチド)
本発明の組成物および方法は、Treponema pallidum P17(Tp17)ポリペプチド(Genbank登録番号P29722;配列番号31)およびTp17様ポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、図1A、図1Bおよび図2に図示されるように特定の構造的類似性(本明細書中でひとまとめにして「Tp17様ポリペプチド」と呼ばれる)および/または機能的な類似(例えば、リゾチームへの結合能力、あるいはリゾチームの酵素活性または抗菌活性を阻害する能力)を共有する。Tp17ポリペプチド(配列番号31)の少なくとも1つの領域および可能性のある2つの領域がリゾチームと結合する:アミノ酸部位28〜33のポリペプチド配列VCPHAG(配列番号5)およびアミノ酸部位114〜119のポリペプチド配列KAPHEK(配列番号10)。図1Aおよび図2は、多数の細菌種、ウイルス種、寄生生物種および哺乳動物種に由来する例示的なTp17様ポリペプチドのアラインメントをその登録番号と共に提供する。特に、図2に示されるアラインメントは、進化的に保存されたコンセンサス配列であるXaan Pro His Xaanを同定し、これは全てのTP17様ポリペプチドに共通する。
リゾチームは細菌の細胞壁の加水分解を引き起こす。これは一般に粘膜表面に接触する流体および他の体液において見受けられ、そして細菌の感染に対する防御機構を構成する。この酵素は、N−アセチルムラミン酸の炭素番号1とN−アセチル−D−グルコサミンの炭素番号4との間のグリコシド結合を切断する。インビボにおいて、これらの2つの炭水化物は重合されて細胞壁の多糖を形成する。リゾチームは、4つの保存されたジスルフィド結合を有する、複数ドメインの混合したαおよびβ折り畳み構造を有する。
本発明はまた、ホモログ、変異体および誘導体を含む、Tp17様ポリペプチドまたはリゾチームポリペプチドの精製改変体または組換え改変体を提供する。いくつかの例において、組換え変異ポリペプチドは、天然のTp17様ポリペプチドまたはリゾチームポリペプチドと比較して組換えポリペプチドの生物学的活性を阻害する特異的変異(例えば、ミスセンス変異、挿入、欠失、またはナンセンス変異)を含む。特に有利なTp17様変異ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの親和性と等しいかまたはそれを越える親和性でリゾチームに結合するが、リゾチームの抗菌活性(例えば、病原体に発現される多糖を切断する能力)は阻害できない。このようなTp17様変異ポリペプチドは、病原体の感染の処置または予防に有用である。
本発明はまた、サンプルにおける抗病原体抗体の改良された検出(例えば、病原体感染の診断として)のための方法および組成物を提供する。このような診断方法の例は特に梅毒に関連し得るが、当業者はこのような方法がTp17様ポリペプチドを産生する実質的に任意の病原体に対する免疫応答を検出するために一般的に有用であることを理解する。本発明の診断方法は、とりわけリゾチームを含む試薬を用いたサンプル中における抗病原体抗体の検出を包含する。実施例8は、抗Tp17様ポリペプチド抗体についての例示的な梅毒アッセイの記載を提供する。上の方法および他の方法が、下記でさらに詳細に考察される。
本発明は、細菌性病原体(例えば、Treponema pallidum、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida、Yersinia pestis、Shigella flexnerii、Treponema denticola、Vibrio cholerae、Vibrio vulnificus、Vibrio parahemolyticus、Chlamydia pneumoniae、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus mutans、Streptococcus pyogenes、Enterococcus faecalis、Bordetella bronchiseptica、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Helicobacter hepaticus、Salmonella typhimurium、Ralstonia solanacearum、Xanthomonas campestris、Pseudomonas syringae、Pasteurella multocida、Brucella melitensis、Brucella suis、Mycobacterium tuberculosis、Campylobacter jejuni、Helicobacter類、およびAgrobacterium tumefaciens、Moraxella catarrhalis、Neisseria meningitidis、Neisseria gonorrhoeae、Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyii、Propionobacterium acnes、Listeria monocytogenes)の存在、これらによる感染、またはこれらに対する免疫応答(例えば、体液性免疫応答)を示すサンプルにおける抗病原体抗体の検出のための組成物および方法を提供する。さらに、この組成物はウイルス性病原体(例えば、コクサッキーウイルス、2型単純ヘルペスウイルス、A型インフルエンザウイルス、TACARIBEウイルス、ブルータングウイルス、チンパンジーサイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、ヒトパピローマウイルス、デング熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、口蹄疫ウイルス(HMD)、ヒト免疫不全ウイルス、風疹ウイルス、およびLdMNPV)の存在、これらによる感染、またはこれらに対する免疫応答(例えば、体液性免疫応答)を検出するために用いられる。さらに、この組成物は寄生生物(例えば、Plasmodium falciparum、Plasmodium ovale、Eimeria tenella、Eimeria acervulina、Giardia lamblia、Plasmodium yoeliiおよびAnopheles gambiaeによって運ばれる病原体)の存在、これらによる感染、またはこれらに対する免疫応答(例えば、体液性免疫応答)を検出するために用いられる。さらに、この組成物はパラ結核菌、エボラウイルス、リフトバレー熱ウイルス、重症急性呼吸器症候群(SARS)ウイルス、痘瘡ウイルス、Bacillus anthracis、Leishmania類、マイコプラズマ、リケッチア、真菌または酵母の存在、これらによる感染、またはこれらに対する免疫応答(例えば、体液性免疫応答)を検出するために用いられる。このような抗体は、例えばTp17様ポリペプチド、リゾチームポリペプチド、Tp17様ポリペプチド/リゾチームポリペプチド複合体、またはそれらの断片に結合する抗体を検出するアッセイによって同定される。
別の局面において、本発明は、サンプルをTp17様ポリペプチドまたはその断片に接触させることによってサンプル中のリゾチーム活性を減少させるための組成物および方法を提供し、ここで、このTp17様ポリペプチドはサンプル中のリゾチームに結合してリゾチーム活性を阻害する。この処置は、リゾチームの不活性化または中和を必要とする任意のサンプル(例えば、ヒトへの投与のための薬学的流体の調製、細胞培養物流体、食物、薬物、水、あるいは他の摂食のための流体または因子、インプラント、移植片、あるいはリゾチームが望ましくないまたは有害である任意の他の調製物)にとって有用である。本発明の組成物および方法は、例えば給水の小規模または大規模な処理に適する。この組成物および方法は、リゾチームの汚染が無いと考えられる材料、またはリゾチーム活性の阻害が望まれる物質(例えば、生物学的サンプル、培養容器、キュベット、綿棒、臨床的診断装置またはアッセイ物質、医療用装置、細胞培養物、咽喉吸引物、脳脊髄液(cerebospinal fluid)サンプルまたは血液培養(hemoculture))のリゾチームを阻害するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、このTp17様ポリペプチドまたはリゾチーム結合断片は固体支持体に固定され、そしてサンプル中に存在するリゾチームはTP17様ポリペプチドに結合される。
Tp17様ポリペプチド上のリゾチーム結合モチーフの同定はまた、動物(例えば、哺乳動物、鳥類または魚類)におけるリゾチーム活性の阻害、不活性化または中和のための組成物および方法(例えば、ワクチンを含む治療的なものまたは予防的なもの)を提供する。リゾチーム結合モチーフを含むTp17様ポリペプチドは、Tp17様ポリペプチドのリゾチームへの結合をブロックするために用いられ得る。それゆえ本発明は、効果的な量のTp17様ポリペプチドを投与することによって動物におけるリゾチーム活性を減少させる方法を提供する。このような方法は、疾患(例えば、癌、感染性疾患、炎症疾患、アルツハイマー病、アミロイド腎症、白血病、クローン病およびアレルギー)の処置または予防に用いられ得る。
本発明の組成物および方法はまた、サンプルにおける病原体の検出のために用いられ得る。Tp17様ポリペプチドに結合し得るリガンドを含む組成物(例えばリゾチームポリペプチド、またはリゾチーム結合に競合し得る分子)が用いられ得る。あるいは、このリガンドはモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても、Tp17様ポリペプチドに結合するFab断片であってもよい。
本発明の組成物および方法は、Tp17様ポリペプチド、リゾチームおよびそのリガンド(ligand therefore)のうちの少なくとも1つを含む診断キットまたは治療キットに包含され得る。Tp17様ポリペプチドまたはリゾチームポリペプチドの投与、アッセイまたは精製に必要または有用な試薬(例えば、反応容器(例えば、固体支持体、樹脂、ビーズ、ウェル、チップ、カラム、ゲル、膜およびフィルターデバイスを含む)、コントロール標準または使用説明書)がまたこのキットに含まれ得る。このような診断キットまたは治療キットは、病原体感染(例えば、梅毒またはヘルペス)の診断または処置、あるいはアルツハイマー病のために有用である。
本発明のTp17様ポリペプチドまたはその断片は、リゾチームポリペプチド(例えば、固体支持体(例えば、カラム)に連結された)を用いたアフィニティクロマトグラフィーにおける使用のためのアフィニティタグとして有用である。それゆえ本発明は、第二のポリペプチド配列にペプチド結合で連結された第一のポリペプチド配列を含む組換え融合タンパク質(例えば、Tp17融合タンパク質)を提供し、ここで第一のポリペプチド配列はTp17様ポリペプチドを含み、そして第二のポリペプチド配列は目的のアミノ酸配列を含む。1つの実施形態において、第一のポリペプチド配列は第二のポリペプチド配列に天然には連結されない。このTp17様ポリペプチドは、目的のポリペプチドをリゾチームアフィニティカラムに結合させるために用いられる精製カセットとして作用する。この精製カセットは分子の任意の部分(例えば、目的のポリペプチドのN末端またはC末端)に位置し得る。あるいは、この精製カセットはN末端とC末端との間に位置し得る。この組換え融合ポリペプチドは、第一のポリペプチド配列をペプチド結合によって第二ポリペプチド配列に連結することで調製され、ここで第一のポリペプチド配列はTp17様ポリペプチド精製カセットを含み、そして第二のポリペプチド配列は目的のアミノ酸配列を含む。次いでこのTp17融合タンパク質は、Tp17様ポリペプチドのリゾチームとの結合を許容する条件下において、Tp17融合タンパク質を含むサンプルをリゾチームと接触させることで、目的のポリペプチドを精製するための方法において用いられる。次いで形成された複合体は洗浄され、そしてこのTp17融合タンパク質はリゾチームから溶離され、そして目的のタンパク質が当該分野で周知の方法に従ってこの精製カセットから単離され得る。1つの実施形態において、このTP17様ポリペプチド断片は、少なくともリゾチーム結合コンセンサス配列(例えば、配列番号1)を含む5、10、15、20、25、50、75または100アミノ酸の断片である。
リゾチームポリペプチドは、変異の存在に起因して少なくともいくつかのTp17様ポリペプチドに結合しない(例えば、リゾチーム機能の阻害)ことが提供される。これらの変異は、リゾチームの触媒作用活性に影響しない残基を標的とされる。このような変化されたリゾチームポリペプチドは標準の方法(例えば、本明細書中で記載される、部位特異的変異誘発またはランダムな変異誘発)によって作製される。このようなリゾチームは、Tp17様ポリペプチドによる阻害の回避に有用であり、そして病原体感染の予防または処置に用いられ得る。本発明はまた、Tp17様ポリペプチドに結合し得ない効果的な量のリゾチームポリペプチドを投与することによって病原体感染を阻害するための方法を提供する。
上に記載されるように、Tp17様ポリペプチドのリゾチームポリペプチドへの結合は、リゾチームの抗菌活性を阻害し得る。この知見に基づき、本発明の組成物は、Tp17様ポリペプチドとリゾチームポリペプチドとの間の結合を増強するまたは減弱させる候補化合物の同定のための、このような候補化合物のハイスループットかつ低コストなスクリーニングのために有用である。かなり多数の方法が、Tp17様ポリペプチドおよびリゾチームポリペプチドの結合を調節する新たな候補化合物の同定のためのスクリーニングアッセイを行うために、本発明によって利用可能であり、そして企図される。
一般に、Tp17様ポリペプチドのリゾチームポリペプチドへの結合を調節し得る化合物は、天然の産物もしくは合成(もしくは半合成)抽出物の双方の大きなライブラリー、または化学物質ライブラリーから、あるいはポリペプチドまたは核酸ライブラリーから、当該分野で公知の方法に従って同定される。薬物の発見および開発の分野における当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング手順に重大ではないことを理解する。スクリーニングで用いられる化合物は公知の化合物(例えば、他の疾患または障害について用いられる公知の治療)を含み得る。あるいは、実質的に任意の数の未知の化学的抽出物または化合物が、本明細書に記載される方法を用いてスクリーニングされ得る。このような抽出物または化合物の例としては、植物に基づく抽出物、真菌に基づく抽出物、原核生物に基づく抽出物、または動物に基づく抽出物、発酵ブロス、および合成的化合物、ならびに現存の化合物の改変体が挙げられるが、これらに限定されない。多数の方法がまた、かなり多数の化学的化合物(糖類に基づく化合物、脂質に基づく化合物、ペプチドに基づく化合物、および核酸に基づく化合物が挙げられるが、これらに限定されない)のランダムな合成または指向的な合成(例えば、半合成または全体的な合成)をきたすために利用可能である。合成的化合物のライブラリーは、Brandon Associates(Merrimack、N.H.)およびAldrich Chemical(Milwaukee、Wis.)から市販される。あるいは、細菌抽出物、カビ抽出物、植物抽出物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが多数の供給源(Biotics(Sussex、UK)、Xenova(Slough、UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce、Fla.)、およびPharmaMar,U.S.A.(Cambridge、Mass.)が挙げられる)から市販される。さらに、天然におよび合成的に生成されたライブラリーは、必要に応じて、当該分野で公知の方法に従って(例えば、標準的な抽出および分画方法によって)生成される。さらに、必要に応じて、任意のライブラリーまたは化合物が、標準の化学的、物理的、または生化学的方法を用いて容易に改変される。
本発明のイムノアッセイにおける使用に適切なモノクローナル抗体は、差次的な結合アッセイを用いて、その抗体がTp17様ポリペプチド、リゾチーム、Tp17様ポリペプチド−リゾチーム複合体、または他の目的の抗原に特異的であり、そして関連するタンパク質との間に交差反応性を示さないか、または限定された交差反応性しか示さないことを確実にすることで、標準のハイブリドーマ方法によって調製され得る。あるいは、適切なモノクローナル抗体は、抗体操作方法(例えばファージディスプレイ)を用いて調製され得る。抗体ファージディスプレイライブラリーから高度に特異的な抗体を取得する方法は当該分野で公知であり、そしていくつかのファージ抗体ライブラリーが、例えばMorphoSys(Martinsried、Germany)、Cambridge Antibody Technology(Cambridge、UK)、およびDyax(Cambridge、MA)から市販される。適切なファージディスプレイ方法は、例えば、米国特許第6,300,064号および同第5,969,108号に記載され、これらの文献はその全体が本明細書で参考として援用される。また、例えば「Antibody Engineering」McCaffertyら(編)(IRL Press 1996)およびその参考文献も参照のこと。ファージディスプレイ抗体方法は、FabまたはscFv形式における抗体のライブラリーを使用し得る。一旦、抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子がファージ抗体から回収されると、任意の適切な形式の抗体が調製され得る(例えば、抗体全体、Fab、scFvなど)。
多数のイムノアッセイのうちのいずれもが、本発明の方法の実施において用いられ得る。例えば、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、凝集アッセイ、ラジオイムノアッセイ、濁度アッセイ、比濁分析アッセイ、免疫クロマトグラフィー、化学発光アッセイ、および蛍光アッセイ。このようなアッセイは当該分野で周知であり、そして本明細書中に詳細に記載される(Andreottiら(2003)Biotechniques 35:850−859)。
本発明の組成物および方法のうちの任意のものを用いて分析または処理されるサンプルは、体サンプル(例えば、血液、血清、血漿、涙、唾液、鼻流体、痰、耳流体、生殖流体、乳房流体、初乳、乳、胎盤流体、汗(perspirate)、滑液、腹水、脳脊髄液、胆汁、胃液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸膜液、心膜流体、精液、糞便物質、上気道流体、腹膜流体、炎症または他の免疫応答の部位から収集された流体、プールされた収集部位から収集された流体、気管支洗浄、尿、眼房水、生検物質、反芻動物の噴門洞由来の物質、有核細胞サンプル、粘膜表面に関連する流体)を含み得る。あるいは、本発明に従う組成物および方法は、乾燥細胞サンプル(例えば、毛髪または皮膚)、あるいは目的の遺伝子または抗体が発現されるか沈着される、任意の組織の生検サンプルに対して行われ得る。
本明細書中で言及される場合、「サンプル」とはまた、リゾチームまたはTp17様ポリペプチドを含むことが疑われ得るか、あるいはさもなければ、リゾチームまたはTp17様ポリペプチドもしくはそれらに対する抗体の存在に関する試験または処理が必要な、任意の診断サンプル、実験的サンプルまたは臨床サンプル(例えば、培養管、キュベット、綿棒、医療用機器(例えば、手術用機器))を意味する。サンプルはまた、細胞培養物または流体培養物(例えば、咽喉吸引物、脳脊髄液サンプル、血液培養)であり得る。サンプルは1病原体調製物(例えば、細菌調製物、ウイルス調製物、寄生生物調製物、プラスミド調製物、マイコプラズマ調製物、糸状菌因子(例えば、カビ、酵母)調製物、またはプリオン調製物)であってもよい。サンプルは、液体因子または固体因子(例えば、食物、薬物、移植物、移植片、組織培養培地または細胞培養培地、水サンプル、あるいは滅菌が望まれるかまたは必要な、他の溶液、試薬または装置)であり得る。
リゾチームとの結合についてTp17様ポリペプチドと競合するTp17様ポリペプチドのインヒビターが、被験体(例えば、哺乳動物(例えば、ヒト))に投与され、リゾチームとのTp17様ポリペプチドの結合を阻害するために、その結果、リゾチームは病原体因子に対抗することができる。あるいは、Tp17様ポリペプチドによる感染阻害に対して非感受性の変異リゾチームが、投与され得る。
本発明は、例えば、病原体ペプチドの調製または試験のための細胞を必要とし得る。培養された一次動物細胞株または培養された永続的な動物細胞株または培養された一次細菌細胞株または培養された永続的な細菌細胞株は、流体サンプルと同じ被験体に由来するか、別の個体に由来する一次細胞(単球、滑膜細胞、線維芽細胞、および内皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない)であっても;一定範囲の組織起源および器官起源に由来する永続的な細胞株(American Tissue Type Collectionのような、公共アクセス貯蔵所から利用可能な細胞株が挙げられるが、これに限定されない)であっても;あるいは「プロモーター読み出し」構築物で安定にトランスフェクトされた、一次細胞株または永続的な細胞株であってもよい。
E.coli由来の組換えT.pallidum Tp17抗原(GST−Tp17またはTp17−HISの精製に関連して、タンパク質が再生的にTp17と共精製した。この「混入物」タンパク質は、14kDaの分子量を有し、そして抗Tp17ポリクローナル血清とは反応しなかった。この「混入物」タンパク質を、以下に記載するようにニワトリリゾチームとして同定した。
pGEX2T−Tp17(Akinsら(1993)Infect.Immun.61:1202−1210)(図6)を含む組換えE.coli DH5αを、100μg/mlのアンピシリン(Roche Diagnostics、Barcelona、Spain)を含む2×YTブロス(Sambrookら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版、Chris Nolan(編)Cold Spring Harbor Press.)内で、5リットル発酵槽にて増殖させた。この培養物を、0.3mMのIPTG(Roche Diagnostics、Mannheim、Germany)で4時間誘導した。細胞を収集し、そして、プロテアーゼインヒビターカクテル(細胞ペースト1gあたり1ml、Sigma−Aldrich、Madrid、Spain)および0.5mg/mlのニワトリリゾチーム(Sigma−Aldrich、Madrid、Spain)を含む、50mMのTris(pH8.0)、85mMのNaCl、2mMのEDTA、1%のポリオキシエチレン10トリデシルエーテル中に再懸濁した。50分間のインキュベートの後、細胞を超音波処理し、そして28,000gで遠心分離した。組換えGST−Tp17を、イオン交換クロマトグラフィー(Q Sepharose XL、Amersham Biosciences、Cerdanyola、Spain)によって上清から精製した。フロースルーを、グルタチオンアフィニティクロマトグラフィー(glutathione sepharose FF、Amersham、Cerdanyola、Spain)によってさらに精製した。100mMの還元グルタチオン緩衝液を用いて、GST−Tp17を溶出した。収集された画分を、ゲル電気泳動によって分析した。別の精製プロセスを、同じプロトコールの後にリゾチームを使用することなく行った。
成熟Tp17タンパク質コード配列(NCBI登録番号P29722において寄託されるTp17配列の残基23〜残基156を含む)をコードする遺伝子配列を、pProExHT−Tp17(Norgard博士、University of Dallas、Texas、USA)ベクターをテンプレートとして用いて、PCR増幅した。PCR増幅は、Expand High Fidelity PCRシステムキット(Roche Diagnostics、Mannheim、Germany)およびオリゴヌクレオチドP17−NdeI(
上記のクロマトグラフィー画分およびタンパク質分子量マーカー(See Blue Plus IITM、Invitrogen、Barcelona、Spain)を、Sambrookら(1989)に記載されたように2つの同一の15%SDS−PAGEゲルを通して、電気泳動的に分離した。引き続いて、1つのゲルをCoomasie Brilliant Blue R250(Merck、Darhmstadt、Germany)で染色し、総タンパク質を検出した。図8Aに示すように、Tp17精製タンパク質に対応する画分において2つの主要なバンド(14kDaおよび17kDa)を認めた。もう一方のゲルにおけるタンパク質を、供給源に推奨されるようにImmobilonTM P PVDF膜(Millipore Corp.、Bedford、Massachusetts)に電気移行させた。次いでこの膜を、PBSと、0.05%w/vのTweenと10%w/vの乾燥した脱脂スキムミルク(PBST)とを含む5mlのBlottoTM(BioRad、Hercules、California)中で、室温(18〜22℃)にて1時間インキュベートした。次いで、この膜を以下のように処理した:(1)PBSTによる10分間の洗浄3回、(2)1/200にBlottoTMで希釈した、梅毒を有する患者に由来するヒト血清10mlの存在下での、室温(18〜22℃)における1時間のインキュベート、(3)PBSTによる10分間の洗浄3回、(4)PBST中に1/2000に希釈した、アルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗ヒトポリクローナル抗体(BioRad、Hercules、California、USA)10mlとの、室温での1時間のインキュベート、(5)PBSTによる10分間の洗浄3回、および(6)発色するまでの、NBT/BCIPアルカリホスファターゼ色素生産性基質(Sigma−Aldrich、Madrid、Spain)5mlとの最後のインキュベート。図8Bに示すように、このアッセイは17kDaタンパク質(Tp17−HIS)へのヒトIgGの結合を検出するが、しかし14kDaタンパク質への結合は検出しない。
精製Tp17−HISを混入物タンパク質(14kDa)と共に含む上記のクロマトグラフィー画分およびタンパク質分子量マーカー(SeeBlue Plus IITM、Invitrogen SA、Barcelona、Spain)を、Sambrookら(1989)に記載されるように、15%SDS−PAGEゲルを通して電気泳動的に分離した。引き続いて、ゲル中のタンパク質を、供給業者の指針を用いてImmobilonTM P PVDF膜(Millipore Corp.、Bedford、MA)に電気移行した。この膜をCoomasie Brilliant Blue R250で染色し、そして2つのバンドを切り取って、そして配列決定分析のために乾燥した。自動エドマン分解によるN末端分析を、PTH−アミノ酸分析機を有するBeckman LF3000シークエンサー(System Gold、Beckman Coulter、Fullerton、California)にて行った。
17kDaタンパク質について、NH2−VS(C)TTV−COOH(配列番号35)
14kDaタンパク質について、NH2−KVFGR(C)ELAA−COOH(配列番号36)であった。
T.pallidum 17kDa(Tp17)タンパク質抗原がニワトリリゾチームと共精製するというこの知見は、両方のタンパク質の間の直接的な物理的相互作用を強く示唆した。この仮説を試験するために、ファーウェスタンブロットリゾチーム−タンパク質相互作用アッセイを行った。このアッセイは図5に要約され、そして一般に以下の3つの工程を包含する:(1)膜上への精製されたリゾチームの固定化工程;(2)この膜を、リゾチームに直接結合しそうなリガンドでプロービングする工程;および(3)結合したリゾチーム−リガンドの免疫検出工程。詳細な実験手順を以下に示す。
精製されたニワトリ卵白リゾチームおよびヒト母乳リゾチームを、Sigma−Aldrich(Madrid、Spain)から購入した。精製されたリゾチーム1μg、5μg、および10μgを含む2つのシリーズのアリコート画分、ならびにタンパク質分子量マーカー(SeeBlue Plus IITM、Invitrogen SA、Barcelona、Spain)を、供給業者(Invitrogen)に推奨される条件下にて、4〜12%SDS−PAGEゲルを通して電気泳動的に分離した。次いで、このゲルをSambrookら(1989)に記載されるような、ウェスタンブロットのために当該分野で公知の方法に従って処理し、そしてこのタンパク質をImmobilonTM P PVDF膜(Millipore Corp.、Bedford、Massachusetts)に電気移行した。PVDF膜上に固定化されたリゾチームの存在を、ポンソーS染色(Sigma−Aldrich、Madrid、Spain)を用いて1分間染色することによって評価し、次いで脱イオン水により5分間激しく洗浄することによって脱色した。この膜を2つに分けた。それぞれの部分は、タンパク質ラダー、および3種の量のニワトリリゾチームまたはヒトリゾチーム(レーンごとに、1μg、5μgおよび10μg)を含んだ。次いでそれぞれの膜を、(TBST−ミルクを作るために)5%(重量/体積)の脱脂スキム乾燥SVELTESSETMミルク(NESTLE、ESPANA、Barcelona、Spain)を補充し、5mlのTBST(10mlのTris−HCl pH8.0、150mMのNaCl、0.05%重量/体積のTween 20TM)中で、4℃にて16時間インキュベートした。次いでこの膜を別々に以下のように処理した:(1)10mlのTBSTによる1分間の洗浄3回、(2)100mg/mlのGST−Tp17融合タンパク質(Akinら(1993))またはコントロールタンパク質であるGST−Tp47(Hsuら(1989)Infect.Immun.57:196−203;Weigelら(1992)Infect.Immun.60:1568−1576)10mlの存在下における、室温(18〜22℃)での1時間のインキュベート、(3)5mlのTBSTによる10分間の洗浄3回、(4)TBST−ミルクで1/7500に希釈した抗GSTポリクローナルヤギ血清(Amersham Biosciences、Cerdanyola、Spain)10mlとの室温での30分間のインキュベート、(5)5mlのTBSTによる室温での10分間の洗浄3回、(6)TBST−ミルクで1/5000に希釈した、アルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗ヤギポリクローナル血清(Dako A/S、Glostrup、Denmark)10mlとの室温における1時間のインキュベート、(7)5mlのTBSTによる10分間の洗浄3回、および(8)発色するまでの、ニトロブルーテトラゾリウム/ブロモクロロインドリルホスフェートアルカリホスファターゼ色素生産性基質(NBT/BCIP)(Sigma−Aldrich、Madrid、Spain)5mlとの3分間のインキュベート。
リゾチームは、粘膜表面および生物学的流体中に見受けられる、良く特徴付けられた抗菌因子である。リゾチームの強力なアセチル−ムラミダーゼ酵素活性に起因して、リゾチームは、細胞壁のペプチドグリカンを加水分解し得、それによって多くの病原性細菌を殺す。Tp17とヒトリゾチームとの間の強力な結合は、この結合がリゾチームの抗菌活性を変化させ得ることを示唆した。この仮説は、(i)T.pallidumが粘膜病原体であるという知見、および(ii)T.pallidumは、その感染生活環全体を通して、生態学的適所においてヒトリゾチームと接触するという知見と一致する。
典型的な100μlの反応物は、25μlのリゾチーム溶液(ニワトリリゾチームについては10ユニット、またはヒトリゾチームについては50ユニットを、脱イオン水に溶解した)、25μlの試験タンパク質溶液、および50μlのフルオレセイン標識Micrococcus lysodeikticus(50μg/ml)懸濁液からなった。この反応物を、37℃にて45分間インキュベートした。KC juniorデータ取得ソフトウェア(Bio TEK Instruments、Winoosky、Vermont)を備える、蛍光マルチウェルプレートリーダーモデルFLx800(Bio TEK instruments、Winoosky、Vermont)を用いて、蛍光を測定した(λexc.=485nm;λemi.=520nm)。各々の実験点を、3つの独立したウェルの読み取りに対応する平均値および標準偏差として表した。50μlの脱イオン水を含むウェル、および50μlのフルオレセイン標識Micrococcus lysodeikticus懸濁液を含むウェルを、ブランクとして用いた。試験タンパク質の2倍連続希釈物を用いて、試験タンパク質の濃度を、83.5μg/ウェルから1.3μg/ウェルまで変化させた。
リゾチームに対するT.pallidum Tp17の結合、およびリゾチームアセチルムラミダーゼ活性の阻害に関与するポリペプチド領域を同定するために、リゾチームに結合しそしてそのアセチルムラミダーゼ活性を阻害することが過去に記載されたポリペプチドについて、生物学的データベースを検索した。キーワードとして用語「リゾチーム」および用語「インヒビター」を用いた、国立保険研究所のPubMedデータベースを通した検索から、Ivy(脊椎動物リゾチームのインヒビターを意味する)と名づけられるEscherichia coliタンパク質を同定した。このIvyは、ヒトリゾチームおよびニワトリリゾチームの両方に結合し、それらのアセチルムラミダーゼ活性を阻害することが報告されている(Monchoisら(2001)J.Biol.Chem.276:18437−18441)。このタンパク質は、(i)成熟Tp17(15kDaの成熟ポリペプチド)と、大きさが類似し(14kDaの成熟ポリペプチド)、そして(ii)ニワトリリゾチームと複合体化したIvyの結晶構造が、Research Collabroation for Structural Bioinformatics(RCSB)におけるタンパク質データバンクPDBにおいて、登録番号1GPQとして利用可能であるので、興味深かった。しかし、図11Aに表されるように、このIvyタンパク質は、Tp17と21%未満のアミノ酸配列同一性しか共有せず、そして、ポリペプチド配列アラインメントからは、明白なペプチドモチーフは推論出来なかった。このIvy/ニワトリリゾチームの三次元結晶構造を、両方の分子間の境界面に位置する残基について調べた。Cn3D三次元分子構造ビューアーを用いて、Ivyとニワトリリゾチームとの間の分子相互作用を分析した。以下の実施例において、全ての番号付けは、以下のNCBI登録番号として記録されたデータを参照し、そしてそのデータに対応する:ニワトリリゾチームについてP00698、ヒトリゾチームについてNP_000230、E.coli IvyについてP45502、およびT.pallidum Tp17についてP29722。
実施例4は、ペプチドII配列NH2−CKPHDCG−COOH(配列番号38)が、ニワトリリゾチームへ結合し、その酵素活性を阻害するために必要であることを実証する。Tp17ポリペプチド配列の詳細な試験により、ニワトリおよびヒト両方のリゾチームの結合および阻害をおそらく媒介する2つの候補配列が同定された。これらの配列は、Tp17_pep1およびTp17_pep2といわれ、ともに、以下に列挙される:
Tp17_pep1:NH2−29C P H A G K A K A E K V E C42−COOH(配列番号41)
Tp17_pep2:NH2−114K A P H E K E120−COOH(配列番号42)。
(a)XnPHXn(配列番号1)(ここでXnは、少なくとも1つのアミノ酸である)(b)CX1X2X3PHX4X5X6X7X8X9X10X11X12X13C(配列番号2)(ここでX1〜X13は、任意のアミノ酸であるか、アミノ酸がないかまたはペプチド結合である)
(c)X1CPHAG(配列番号25)(ここでX1は、CまたはVである)。
E.coli IvyおよびT.pallidum Tp17が共有するペプチド配列保存性が全体的に低いとすると、以前に検出されなかったリゾチーム結合モチーフは、おそらく、他の病原性生物のゲノム中に存在していた。この仮定を検証するために、実施例5において規定されるコンセンサス配列を使用して、ScanPrositeアルゴリズム(http://us.expasy.org/tools/scanprosite/)を使用して、タンパク質データベース(Swiss−Prot、TrEMBL、TrEMBLnewおよびPDB)を調べた。図1A、図1B、および図2は、コンセンサス配列内でフィットするペプチドの拡がりを含むタンパク質が、多くのヒトおよび動物の病原体中に存在したことを例示する。
タンパク質−タンパク質相互作用が、構造的相補性および物理化学的相補性に依存していることは、広く認識されている。タンパク質表面の不規則性および局所的不均質性は、リガンドとの特異的結合および会合を可能にし、四次構造の形成の基礎を提供する。1つのタンパク質表面と別のタンパク質表面との間のフィットは、それらの形状に依存するだけではない。それは、一緒に複合体を維持している弱い物理化学的結合:共有結合、水素結合、塩橋、長距離の静電相互作用およびファンデルワールス相互作用に及ぶ。この相補性の特性は、タンパク質と低分子との間、またはタンパク質と別の種の高分子との間であろうと、普遍的である(Petskoら(2003))。
これらの高い等電点(pI)に起因して、ヒトリゾチーム(理論的pI=9.28)およびニワトリリゾチーム(理論的pI=9.32)は、pH3〜pH7の間に含まれる生理学的値のpHで、強い正電荷を示す。全ての公知のリゾチームインヒビターは、低いpI値を有する。例えば、E.coli由来の成熟Ivyタンパク質(Monchoisら(2001)J.Biol.Chem.276:18437−18441)(pI=5.51)およびP.aeruginosa由来の成熟Ivyタンパク質(pI=5.69)、ならびにS.pneumoniae由来の成熟Sicタンパク質(Fernie−Kingら(2002)Infect.Immun.70:4908−4916)(pI=4.39)は、生理学的pHで負に荷電している。リゾチーム/インヒビター接触領域に存在する正に荷電したリゾチーム残基は、変異誘発のための魅力的な標的であると仮説を立てた。負に荷電した接触領域を有するリゾチーム変異体を生成することは、そのインヒビターの結合を妨げる静電反発力を生成し得る。これらの変異は、リゾチームの触媒性残基に影響を及ぼさなかったので、病原体によって阻害されない、活性なリゾチーム変異体を生じるようである。
QuikChange(登録商標)部位指向性変異誘発キットを用いて、供給元(Stratagene,La Jolla,CA)により推奨されるガイドラインに従って、変異を導入する。簡潔には、QuikChange(登録商標)部位指向性変異誘発キットを、点変異を作製し、アミノ酸を変え、単一もしくは複数のアミノ酸を欠失もしくは挿入するために使用する。QuikChange(登録商標)部位指向性変異誘発法を、PfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼおよび温度サイクラーを用いて行う。PfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼは、高忠実度で変異オリゴヌクレオチドプライマーを置換せずにプラスミド鎖の両方を複製する。その基本的な手順は、目的の挿入物を有するスーパーコイルド二本鎖DNA(dsDNA)ベクター、および望ましい変異を含む2種類の合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。このオリゴヌクレオチドプライマーは、各々、ベクターの反対側の鎖に相補的であり、PfuTurbo DNAポリメラーゼによる温度サイクリングの間に伸長される。このオリゴヌクレオチドプライマーの組み込みは、互い違いの(staggered)ニックを含む変異プラスミドを生成する。温度サイクリングの後に、この生成物を、DpnIで処理する。このDpnIエンドヌクレアーゼ(標的配列:5’−Gm 6 ATC−3’)は、メチル化DNAおよびヘミメチル化DNAに特異的であり、これを使用して、親DNAテンプレートを消化し、変異を含む合成DNAを選択する。ほとんど全てのE.coli株から単離されるDNAを、damメチル化し、よって、DpnI消化しやすくする。次いで、望ましい変異を含む、このニック形成したベクターDNAを、XL1−Blueスーパーコンピテント細胞(supercompetent cell)に形質転換する。この方法を行うために必要な少量の出発DNAテンプレート、高忠実度のPfuTurbo DNAポリメラーゼ、および低サーマルサイクル数は、全て、反応の間の高変異効率およびランダム変異誘発生成の可能性の減少に寄与する。
ツーハイブリッドシステムは、多くの真核生物転写アクチベーターが、2つの物理的に別個の分子ドメイン:DNA結合ドメイン(DNA−BD)および活性化ドメイン(AD)からなるという所見に基づく。このDNA−BDは、特定のプロモーター配列に結合し、このADは、RNAポリメラーゼII複合体を、選択可能表現型/スクリーニング可能表現型を付与する下流遺伝子を転写するように指向する。これらドメインは、独立したモジュールとして作用する:いずれも単独では転写を活性化できないが、各ドメインは、他方のタンパク質に融合されると機能し続ける。適切な市販の系としては、直ぐ使用できるBacterioMatch(登録商標)II ツーハイブリッドシステム(Stratagene,La Jolla,CA)またはBD MatchmakerOシステム(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)が挙げられる。
実施例3は、インビトロで、T.pallidumの17kDaタンパク質であるTp17がニワトリリゾチームおよびヒトリゾチームに強く結合し、この両方のリゾチームの抗菌活性を強く阻害することを実証する。以下の実験は、これらの結合および阻害の相互作用がまた、T.pallidumによるヒト粘膜表面の感染の間にインビボで生じることを実証する。リゾチームへのTp17結合の結果として、新たなエピトープがおそらく形成され、免疫系に曝される。梅毒患者は、図4に示されるように、Tp17エピトープに対する免疫応答、およびTp17−リゾチーム複合体によって共有されるエピトープまたはさらにリゾチーム単独に対する免疫応答を惹起させ得る。このことを検証するために、ヒトリゾチームまたはニワトリリゾチームを、その複合体に対して生成される抗体を検出するために、梅毒診断アッセイに使用される血球凝集試薬に添加し、それによりこのアッセイの感度を改善した。梅毒アッセイの感度の上昇により、ヒトリゾチームに特異的であったことが観察された。
リゾチーム/1μg Tp17を維持するために十分なニワトリリゾチームまたはヒトリゾチームの量を、以下のように調製した血球凝集試薬(Biokit SA,Llica d’Amunt,Spain)に添加した。ニワトリ赤血球を、以前に記載されるように(Herbertら(1979)Passive Haemagglutination With Special Reference to the Tanned Cell Technique. Handbook of Experimental Immunology(vol.1),pgs 20.1−22.20(DMWeir(編) Blackwell Scientific Publications(Oxford));Stefenら(1951)J.Exp.Med.93:107−120;Hirata(1968)J.Immunol.100:641−46))、タンニン酸処理し(tanned)、固定し、GST−Tp17(40μg/ml)でコーティングした。GST−Tp17コーティングした固定ニワトリ赤血球(5ml)のバッチ1つに、精製鶏卵卵白リゾチーム(100μg/μl)を6μl補充した。GST−Tp17コーティングした固定ニワトリ赤血球の別のバッチ(1ml)に、120μlのヒト乳汁リゾチーム(1μg/μl)を補充した。感作させた赤血球の両方のロットを、マグネチックスターラーで室温で30分間ホモジナイズした。次いで、各ロットの感度を、他の市販の血球凝集試薬では境界線上の応答を与えると特徴づけられたヒト梅毒血清のセットを用いて、血球凝集反応を行うことにより評価した。
ヒト乳汁は、天然のヒトリゾチーム供給源である。しかし、以下に起因して、この体液からリゾチームを精製することは面倒である:(i)その量が少ないこと、(ii)定期的かつ再現性のある供給物を確保することが困難であること、(iii)非検出病原体での考えられる汚染、ならびに(iv)社会的考慮事項および倫理上の考慮事項。従って、ヒトリゾチームの組換え供給源は、工業規模で使用するために好ましい。天然のヒト乳汁由来リゾチームおよびトランスジェニックイネ由来の組換えヒトリゾチーム両方の効力を試験した。
梅毒スクリーニングは、酵素結合免疫吸着法(ELISA)キットを用いて慣用的に行われている。これらのキットは、マイクロタイタープレートのウェルに固定したT.pallidum抗原への抗梅毒抗体の結合を検出する。そのプレートへの抗梅毒抗体の結合の検出は、通常、ヒトFc抗体鎖に対する酵素標識抗血清(第2世代キット)または酵素標識T.pallidum抗原(第3世代キット)のいずれかによって行われる。
この研究において使用される全ての試薬は、市販のBioelisa Syphilis 3.0検出キット(Biokit S.A.,Llica d’Amunt,Spain)により提供される。使用されるプロトコルは、キットのパッケージ挿入物において推奨されるものである。簡潔には、血清サンプルまたは血漿サンプルを、マイクロタイタープレートのウェルに添加する。T.pallidumに特異的な抗体がサンプル中に存在する場合、その抗体は、ウェルを覆う抗原と安定な複合体を形成する。洗浄して非結合物質を除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたウサギ結合体化抗ヒトIgGおよび抗ヒトIgMを添加し、抗原/抗体複合体が存在する場合、その結合体は、複合体に結合する。2回目の洗浄の後に、色素原を含む酵素基質溶液を添加する。この溶液は、サンプルが陽性である場合は、青色を発色させる。この青色は、硫酸で反応をブロックした後に黄色に変化する。色の強度は、サンプル中の抗T.pallidum抗体濃度に比例する。陰性サンプルを含むウェルは、無色のままである。
この研究において使用される全ての試薬は、市販のBioelisa Syphilis 3.0検出キット(Biokit S.A.,Llica d’Amunt,Spain)により提供される。使用されるプロトコルは、キットのパッケージ挿入物において推奨されるものである。簡潔には、T.pallidumタンパク質(例えば、組換えTp15抗原、組換えTp17抗原または組換えTp47抗原)でコーティングしたマイクロタイタープレートのウェル中で試験標本をインキュベートすることによって試験を行う。サンプル中に存在する特異的IgG抗体およびIgM抗体は、固相抗原に結合する。その後、ウェルを洗浄して、残りの試験サンプルを除去し、酵素ペルオキシダーゼと結合体化したT.pallidum抗原を添加する。この結合体は、捕獲された特異的抗体に結合する。さらに洗浄して、非結合物質を除去した後に、酵素基質および色素原の溶液を添加する。この溶液は、サンプルが抗T.pallidum抗体を含む場合に、青色を発色する。この青色は、硫酸で反応をブロックした後に黄色に変化する。色の強度は、サンプル中の抗T.pallidum抗体濃度に比例する。
第2世代のELISA形式に関して、組換えヒトリゾチーム(Ventria Bioscience,Ventura,CA)を、2.86μg/mlで、Bioelisa Syphilis 3.0 ELISAプレートに添加した。第3世代キットに関しては、組換えヒトリゾチームを、サンプル希釈緩衝液(10.8μg/mlの濃度で)または結合体希釈緩衝液(1.08μg/mlの濃度で)のいずれかに添加した。
ヒトリゾチーム/Tp17タンパク質複合体は、非常に抗原性が高く、上記のように、診断アッセイにおいて有用である。精製ヒトリゾチーム/Tp17複合体の単離は、構造研究(例えば、タンパク質結晶化およびX線回折を介する原子構造の決定)の能力を促進する。以下に記載される実験手順を用いて、mg量の精製ヒトリゾチーム/Tp17−HIS複合体を得た。
精製Tp17−Hisタンパク質(実施例1に記載されるように得た)を、単量体および二量体を他の凝集形態から分離するために、ゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製した(図22)。100mlのSuperose 12 HRを充填したHR 16/50カラム(1.6cm直径×60cm高;Amersham Biosciences,Cerdanyola,Spain)を、2カラム容量のゲル濾過緩衝液(Tris 20mM NaCl 300mM,pH8.0)で平衡化した。次いで、8mgのTp17−HIS融合タンパク質を含む2mlサンプルを注入し、圧力0.70MPaの定圧下、流速1〜1.25ml/分でクロマトグラフィーを行った。Tp17−HIS単量体およびTp17−HIS二量体に対応する画分(1.5ml)を、3回の連続クロマトグラフィー運転から回収し、次いで、8mlのTp17−HIS単量体画分および6mlのTp17−HIS二量体画分にプールした。
組換えヒトリゾチーム(Ventria Bioscience,Sacramento,CA,USAから市販されている)は、図23に示されるアッセイ結果によって示されるように、非常に均質な単量体タンパク質からなった。
図24において示されるように、ヒトリゾチーム/Tp17複合体を、会合していない単量体から、上記のように、Superose 12 HR 16/50ゲルによるゲル濾過で分離した。Tp17−HIS/ヒトリゾチームピークに対応する画分を回収し、10kDaカットオフを有するCentricon Plus 20 (UFC2LGC08,The Millipore Corporation,Bedford,MA,USA)デバイスを用いて濃縮した。3カラム容量(10ml)のTris−HCl 10mM,NaCl 50mM(pH8.0)で洗浄することによって、遠心分離濾過の間に緩衝液を交換した。Tp17−His単量体/ヒトリゾチームおよびTp17−His二量体/ヒトリゾチームの最終サンプルを、それぞれ、1.62mg/mlおよび1.57mg/mlで回収した。最終タンパク質回収率は、Tp17−His単量体/ヒトリゾチーム複合体については60%であり、Tp17−His二量体/ヒトリゾチーム複合体については44%であった。
Tp17およびTp17様タンパク質は、ヒトリゾチームに結合する能力を共有している。この所見に基づいて、病原性生物からの総タンパク質抽出物中のTp17様タンパク質の検出を提供する一般的な方法を考案した。一実施形態において、検出可能なマーカーと結合体化したヒトリゾチームを、タンパク質サンプルに混合する。リゾチームの結合は、サンプル中のTp17様ポリペプチドを同定する。
ヒトリゾチーム−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、総容量3.5mlの炭酸緩衝液(炭酸ナトリウム/−炭酸水素ナトリウム 50mM,pH9.55)中で、9.72mgの組換えヒトリゾチーム(159−53LZ−90P;Ventria Bioscience,Sacramento,CA,USA)と13.6mgの活性化ペルオキシダーゼ(POD)(1.428.861;Roche,Mannheim,Germany)とを混合することにより、生成した。この結合反応を、30分ごとに手動で攪拌しながら、水浴中で25℃で2時間行った。この反応を、364μlのトリエタノールアミン2M(108379;Merck,Darmstadt,Germany)、および脱イオン水中4mg/mlの濃度の水素化ホウ素ナトリウム(45,288−2;Sigma Aldrich Chemie,Steinheim,Germany)455μlを、連続して添加することにより終了させた。得られた溶液を、15分間手動で攪拌し、次いで、2〜8℃で30分間インキュベートした。次いで、227μlのトリエタノールアミン2Mを添加し、その混合物を、2〜8℃で2時間インキュベートした。次に、91μlのグリシン1M(104201;Merck,Darmstadt,Germany)を添加し、その溶液を、15時間、TSG緩衝液(Tris−HCl 20mM、NaCl 150mM、グリシン 10mM、pH7.5)に対して透析した。次いで、この溶液を、30分間15,000gで遠心分離することによって透明にした。4.5mlの上清を回収した。500μlのBSA(Pentex Miles Inc.,Kankakee,IL,USA;TSG緩衝液(Tris−HCl)中10% 重量/容量)および25μlのマーシオレート(merthiolate)−硫酸ゲンタマイシンを、結合体に添加した。マーシオレート−硫酸ゲンタマイシンを、25mgの硫酸ゲンタマイシン(22191 E1;Jescuder,Terrassa,Spain)および400mgのチメロサール(T−5125 Sigma,Saint Louis,MO,USA)を、8.0mlのウシ胎仔血清中に溶かすことによって調製した。次いで、このpHを、水酸化ナトリウム(5M)でpH8.0に調節した。次いで、Millex GV 0.22μmフィルタ(SLGV R04 NL;The Millipore Corporation,Bedford,MA,USA)を通してこの結合体を滅菌濾過し、使用時まで、2〜8℃で遮光保存した。
2〜20μgの病原体由来タンパク質を含む15μlサンプルを、5μlのNuPAGE(登録商標)LDS充填緩衝液(4×)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)と混合し、直ぐに、NuPAGE(登録商標)MES SDS泳動緩衝液(1×)(NP0002;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用して、4〜12% NuPAGE(登録商標)Novex Bis−Trisポリアクリルアミドゲル(NPO323BOX;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)で分離した。印加された電圧は、35分間165ボルト一定である。タンパク質を移動させた後、ゲルを回収し、電気転写緩衝液(ET緩衝液:25mM Tris、192mM グリシン、10% メタノール、pH調節なし)中で15分間インキュベートした。この分離されたゲル上のタンパク質を、次いで、電気泳動的にIMMOBILON(登録商標)P膜(IPVH00010;The Millipore Corporation,Bedford,MA,USA)に転写した。この膜を、メタノールで1回すすぎ、脱イオン水で2回すすぐことにより準備した。電気泳動的転写を行うために、印加した電圧を、1時間、65ボルトに一定して保持した。
電気転移の後、膜を、22°Cで1時間、5%(重量/容量)のSVELTESSE(登録商標)スキムミルク(Nestle Espanya,Barcelona,Spain)によって補填したTBST(Tris−HCl 10mM pH8.0、NaCl 150mM、Tween 20)中でインキュベートする。次に、この膜をTBSTでリンスし、そして次に、1/5000希釈のHuLYS−HRP結合体を含むTBST−ミルク中、22°Cで1時間インキュベートする。インキュベーションの後、この膜を、TBST中で3回洗浄する。次いで、この膜を10mlの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)(T0565;SIGMA−ALDRICH Inc.、Saint−louis、MO、USA)中に浸漬することによって免疫染色を達成し、タンパク質を可視化する。ポジティブコントロールとして、17kDaで移動し、そしてIvyに対応する単一バンドが、Escherichia coli BL21(DE3)細胞抽出物中で検出される。
グラム陽性細菌は、外膜を欠き、そして培養培地に厚いペプチドグリカン層を広げる。結果として、これら細菌は、グラム陰性細菌よりリゾチーム殺傷に対しより感受性であるようである。従って、本発明者らは、ヒト病原体であるグラム陽性細菌がリゾチームインヒビターを所有すると仮定した。外膜の不在に起因して、これらインヒビターは、細菌培養培地中に存在し得る。以下に説明されるように、本発明者らは、8株の臨床的に関連するグラム陽性細菌種(Enterococcus faecalis CECT184株、Enterococcus faecium ATCC10541株、Staphylococcus aureus ATCC11632株、Staphylococcus epidermidis ATCC12228株、Streptococcus pneumoniae ATCC49619株、Streptococcus pyogenes CECT598株、Streptococcus agalactiae CIP105451株、およびPropionibacterium acnes NMR−GF株)からの培養培地中のリゾチームインヒビターの存在についてアッセイした。
Tp17タンパク質およびTp17様タンパク質は、多くのヒト病原体および動物病原体(例えば、ウイルス、細菌、真菌および原生動物)によって発現される。HuLYS/Tp17様タンパク質複合体の形成および/またはその安定性を妨害する薬物は、被験体中で病原体感染を防ぐか、またはこれを処置するために用いられ得る有望な抗微生物候補化合物である。このような抗微生物分子を単離するために、インビトロスクリーニング試験が、以下のように考案された。この試験が、生物学的抽出物および化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングのために有用であることは、当業者に明らかである。図27に示されるように、例示の方法は、以下の工程を含む:
(試薬の調製)
PBS 10×を、29gのNa2HPO4/12H2O、2gのKH2PO4および80gのNaClを1リットルの蒸留した発熱性物質なしの水に溶解し、そしてpHを水酸化ナトリウム(10M)でpH6.8に調節することによって調製した。BSA−グリシン溶液を、10gのBSA(81−003;Pentex Miles Inc.、Kankakee、USA)、7.5gのグリシン(500190;Merck、Darmstadt、Germany)および1gのアジ化ナトリウム(6688;Merck、Darmstadt、Germany)を1リットルの蒸留水(MilliQグレード、The Millipore Corporation、Bedford、MA、USA)中に溶解することによって調製した。得られた溶液のpHを、NaOH(10M)でpH7.4にした。ELISA洗浄緩衝液10×、TMB発色基質およびTMB希釈緩衝液は、市販される(BioELISA ANTI−HBS 96ウェルキット、3000−1101;biokit SA、Llica d’Amunt、Spain)。ELISAサンプル希釈緩衝液は、BioELISA Syphilis 3.0(3000−1148;biokit SA、Llica d’Amunt、Spain)から得た。
実施例1に記載のように産生された、精製GST−Tp17タンパク質を、PBS 1×中に0.4μg/mlの濃度で再懸濁し、そしてその溶液の150μlを、96ウェルのマイクロタイタープレート(MaxiSorpO LockwellO;NUNC、Roskilde、Denmark)中に分与し、そして室温(22°C)で16時間インキュベートした。次に、100μlのBSA−グリシン溶液を添加し、そして22°Cで1時間インキュベートした。これらウェルを、次いで吸引により空にし、そして直ちに、200μlのBSA−スクロースで満たした。インキュベーションを22℃で1時間30分間実施した。各ウェルの液体内容物を注意深く吸引し、そしてこれらプレートを、次いで、気密なプラスチックバッグ中に詰める前に、乾燥室(15%相対湿度)中で3時間風乾した。
100μlの候補化合物(ELISAサンプル希釈緩衝液中10ng/ml〜10mg/mlの範囲の濃度で溶解)を、マイクロウェルに添加し、そして15分間37°Cでインキュベートする。ELISAサンプル希釈緩衝液中に1/20.000で希釈されたHuLYS−PODの50μlを、ウェルに添加し、そしてさらなる15分の間インキュベートする。これらウェルを次いで、洗浄緩衝液で4回洗浄した。
次いで、基質希釈緩衝液中に希釈された100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ(POD)発色基質を各ウェルに添加し、そして30分後に100μlのH2SO4 2Mを添加した後発色を停止する。この実験では、候補化合物なしでインキュベートされた3つのウェルの平均吸光度が、100%値に規格化される。HuLYS−PODの結合を、少なくとも40%、50%、60%、75%、85%、95%、またはそれ以上低減し得る分子または生物学的抽出物は、規格化された値と比較して単一チャネルにおける個々の減少によって証明されるように、「ヒット」候補と考えられる。好ましくは、結合は、候補化合物と接触されなかったコントロールウェルに対して85%減少される。
ニワトリリゾチームは、細菌およびウイルスの両方に対して活性な潜在的抗微生物酵素である。リゾチームを活性薬剤として含む市販の調製物は、制限されないで、LIZIPAINA(登録商標)(Boehringer Ingelheim、San Cugat del Valles、Spain)およびLISOZIMA CHIESI(CHIESI ESPANYA SA、Barcelona、Spain)を含む。Tp17タンパク質は、精製されたニワトリリゾチームの酵素的抗細菌活性をインビトロで阻害することが示されたので、本発明者らは、Tp17がまた、LIZIPAINA(登録商標)およびLISOZIMA CHIESIの抗細菌活性を阻害し得ると仮定した。この仮説を試験するために、LIZIPAINA(登録商標)(1錠剤あたり5mgのニワトリリゾチームを含む)およびLISOZIMA CHIESI(1錠剤あたり250mgのニワトリリゾチームを含む)の各々の薬物の1錠剤を、脱イオン水(The Millipore Corporation、Bedford、MA、USA)中に再懸濁し、リゾチーム濃度を4μg/mlに調節した。次いで、これらのサンプルを、GST−Tp17またはTp17−HISいずれかの増加する量の不在下または存在下でインキュベートした。この実験では、ニワトリリゾチームとその同族インヒビターとの間のモル比を、GST−Tp17については1:5〜1:50、そしてTp17−HISについては1:16〜1:160で変化させた。20°Cで5分間のインキュベーションの後、これらサンプルを、EnzCheck(登録商標)リゾチームアッセイキット(E−22013;Molecular Probes Inc.、Eugene、OR、USA)を用い、供給者のガイドラインによって推奨されるように、リゾチーム酵素的活性についてアッセイした。
Tp17タンパク質およびTp17様タンパク質の阻害に抵抗し得るリゾチームの検索において、本発明者らは、市販のrリゾチームO(71110−5;Novagen(登録商標)MerckKGaA、Darmstadt、Germany)を試験した。rリゾチームOは、E.coli細胞の溶解のために推奨される高度に精製された組換えリゾチームである。この酵素は、細菌細胞壁中のN−アセチルムラミド結合の加水分解を触媒する。rリゾチーム溶液(1.700.000U/mg)の比活性は、鶏卵卵白リゾチームのそれより250倍より大きく、そしてそれ故、E.coli溶解を達成するために必要な酵素はより少ない。さらに、rリゾチームOは、タンパク質および核酸抽出試薬のNovagenの方針に適合する生理学的pH(6.0〜8.0)で最適に活性である。
Tp17と広範な配列類似性を共有するタンパク質(例えば、図1を参照のこと)の中で、本発明者らは、ヒトβアミロイド前駆体タンパク質(β−APP)を同定した。このタンパク質は、重要な医療的および診断的目的である。なぜなら、それは、アルツハイマー病の間にアミロイド沈着の生成に関与しているからである。図30に示されるように、本発明者らは、Ivyタンパク質ファミリー、Tp17、および3つのスプライシングアイソフォームβ−APP(APP770、APP751およびAPP695)のメンバーによって共有される良好に保存されたペプチドモチーフを発見した。手動で実施した複数アラインメントは、本発明者らが、これらすべてのペプチド配列を、以下のコンセンサスの下にグループ分けすることを可能にした:
CX(1,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C(配列番号178)
このコンセンサスでは、C、K、R、H、A、G、E、D、QおよびNは、それぞれ、システイン、リジン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、およびアスパラギンに対する1文字アミノ酸コードに対応する。記法規則は、PROSITEデータベース中で用いられるものである。このコンセンサスはまた、以下のように表され得る:
CysXaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Cys(配列番号177)
ここで、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4およびXaa5は、任意のアミノ酸または存在せず、Xaa6は、アミノ酸K、RまたはHであり、Xaa7は、AまたはGであり、Xaa8は、K、R、またはHであり、Xaa9およびXaa10は、任意のアミノ酸または存在せず、Xaa11は、アミノ酸KまたはRであり、Xaa12は、任意のアミノ酸または存在せず、そしてXaa13は、アミノ酸E、D、QまたはNである。
図32に示されるように、β−APP中で同定されたリゾチーム結合部位は、このタンパク質の極度のN末端にあり、そして残基92〜116にまたがる。アイソフォームAPP751(751アミノ酸長)は、例示のAPP様ポリペプチドである。この図から得られる結論はまた、アイソフォームAPP695およびAPP770についてもまた真実である。アミノ酸数は、Genbank受託番号NP_958816の下で受託されたβ−APP配列中のアミノ酸位置に言及している。このリゾチーム結合部位は、残基92〜116の間に位置している。詳細には、本発明者らは、sAPPαと呼ばれる、β−APP誘導体のより長いフラグメント、およびsAPPα(304−612)と呼ばれるより短いフラグメントを用いた。sAPPαおよびsAPPα(304−612)の両方は、APP695アイソフォームから由来し、そして結果として、クニッツプロテアーゼインヒビタードメイン(APP770およびAPP751中の残基289〜342)を欠いている。
ペプチド配列データベース(Swissprot & TrEMBL)を、図30中に規定されるCX(1,5)[KRH][AG][KRH]X(0,2)[KR]X(0,1)[EDQN]C(配列番号178)コンセンサス配列を共有するタンパク質についてサーチした。この配列を有するとして同定された、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質および真核生物タンパク質を図34Aおよび34Bに示す。これらのタンパク質は、Tp17様/huLYSタンパク質複合体の形成を妨害するようである新規な治療標的および免疫原性組成物を提示する。さらに、huLYSと複合体化されたこれらタンパク質は、ヒト疾患、動物疾患および植物疾患の診断のための魅力的なマーカーを提示し得る。
Tp17のH31およびHis104がhuLYS阻害に寄与したか否かを決定するために、本発明者らは、GST−Tp17をコードする遺伝子(図35A)の部位特異的変異誘発を実施した。このH31AおよびHis104A GST−Tp17変異体ポペプチドは、QuickChange(登録商標)部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、CA、USA)を用いて、pGEX2T−Tp17プラスミドベクター中に2つのヌクレオチド変化を導入することにより生成した。この目的のための変異誘発オリゴヌクレオチドは、Fw_CPAAG(5’−CCG TGT GTC CGG CCG CCG GGA AGG C−3’)(配列番号298)およびBw_CPAAG(5’−GCC TTC CCG GCG GCC GGA CAC ACG G−3’)(配列番号:299)およびオリゴヌクレオチドFw_KPAE(5’−AAT CGA AGG CAC CGG CCG AGA AAG AGC TGT ACG−3’)(配列番号:300)およびBw_KPAE(5’−CGT ACA GCT CTT TCT CGG CCG GTG CCT TCG ATT−3’)(配列番号:301)は、別個に変性pGEX2T−Tp17にアニールされ、そしてPfu Turbo DNA ポリメラーゼを用いて供給者によって推奨される条件下で伸長された。非メチル化DNAテンプレートは、DpnI消化によって除去され、そして得られる消化混合物を用いてXL−1 Blue(登録商標)スーパーコンピテント細胞を形質転換した。変異体プラスミドは、得られるPCRアンプリコンを制限酵素マッピングすることにより選択した。H31A変異の存在は、完全長の変異したTp17遺伝子を配列決定することにより確認した。次いで、H31AまたはHis104A変異を保持する変異体GST−Tp17を、実施例1に記載のように作製および精製した。リゾチーム阻害アッセイを以下に記載のように実施した。
ニワトリ型リゾチーム様すなわち従来型(C型)リゾチーム様の独特な非細菌溶解性タンパク質であるSLLP1が、ヒト精子のアクロソーム中に存在する(Mandelら、Biol Reprod.68:1525〜37,2003)。通常、C型リゾチームは、細菌溶解性であり、そしてこれは、β−1,4グリコシド結合によって連結されたN−アセチルグルコサミンに結合し得る。すべてがシステインを含むその不変残基のうちのほとんど(20個中17個)が、SLLP1において保存されているが、C−リゾチームにおいて保存される2つの触媒残基E35およびD52が、SLLP1においてはそれぞれTおよびNで置換されて、T122およびN139となっている。Mandalらは、アクロソーム反応の後、SLLP1が、卵黄周囲腔内、透明帯の孔内、および卵丘層内で、卵オリゴ糖残基N−アセチルグルコサミン(これは、卵の原形質膜を覆う、細胞外マトリックス中に存在する)の潜在的レセプターであり得ると、仮説を立てた。
本発明は、本発明の精神からも本質的特徴からも逸脱することなく、他の具体的な形態で実施され得る。上記の発明の任意の局面および特徴が、合わせられ得る。従って、上記の実施形態は、すべてに点において、本明細書中に記載される発明を限定するのではなく、例示するものであると考えられるべきである。従って、本発明の範囲は、上記の説明によって示されるのではなく、添付される特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲と等価である意味および範囲内におけるすべての変更が、本発明に包含される。
本出願において引用されるすべての刊行物および特許文献は、個々の刊行物または特許文献の各々の内容があたかも本明細書中に援用された場合と同じ程度まで、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。
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- 本明細書中に記載の発明。
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