CN116157412A - 与寡聚脂多糖结合蛋白有关的用途、方法和产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供并描述了寡聚蛋白作为结合剂用于结合脂多糖(LPS)的用途，所述寡聚蛋白具有包含至少两个单体肽的卷曲螺旋结构，其中每个所述的单体肽可以相同或不同，能够形成α‑螺旋，并且包含至少一个与SEQ ID NO:1的七肽重复序列具有至少60％的序列同一性的核心序列。本发明还提供并描述了结合、检测和去除LPS的方法，以及包含所述寡聚蛋白的产品。

Description

与寡聚脂多糖结合蛋白有关的用途、方法和产品

技术领域

本发明描述的是具有卷曲螺旋结构的寡聚蛋白作为结合剂用于结合脂多糖(LPS)的用途。本发明还描述了结合、检测和去除LPS的方法，以及包含所述寡聚蛋白的产品。

背景技术

脂多糖，也称为内毒素(术语“LPS”和“内毒素”在本文中可互换使用)，是革兰氏阴性菌外膜的基本成分。它们由三种结构成分组成：脂质A部分；核心寡糖；以及O-抗原。脂质A组分包含两个具有四个O-连接的和两个N-连接的酰基链的磷酸葡萄糖胺分子，其包埋在细菌的外膜中，从而将LPS固定在细菌膜中。核心寡糖(COS)是由多种糖组成的非重复结构，通过糖苷键与脂质A相连。最后，所述O-抗原是由4至40个四糖单体重复结构单元组成的聚合物，平均存在30个重复(Peterson和McGroarty，1985)。所述O-抗原在脂质A的另一端与COS的倒数第二个糖相连，尽管在某些形式的LPS中O-抗原是不存在的。缺乏O-抗原的LPS传统上被称为“粗糙”LPS，与野生型“光滑”LPS相反(Hitchcock等，1986)。

LPS的脂质A组分和与其最邻近的糖在革兰氏阴性细菌物种中高度保守，而其余的核心寡糖和O-抗原则明显不太保守，并且可以在细菌物种之间甚至在血清型之间变化(Bertani和Ruiz，2018)。

内毒素对动物，特别是对人类具有极大的毒性，这是由于脂质A具有激活toll样受体4的倾向，从而诱导极端的免疫反应，在低至1μg每kg体重的剂量下，可引起败血症和中毒性休克。由于革兰氏阴性菌在生物环境中无处不在，内毒素是药物、疫苗、实验室设备和试剂生产中常见的杂质。考虑到与内毒素污染相关的潜在健康影响，在使用前尽可能地去除任何可能存在于人用产品中的内毒素是至关重要的。

目前有各种去除内毒素的方法和产品。对于实验室应用，这些包括填充有与一种或多种内毒素结合分子连接的树脂的旋转柱过滤器或流动柱。可以将样品加到这些过滤器或柱子上，内毒素结合分子将结合任何存在的内毒素，从而将它们从样品中除去。可用于这些产品的已知内毒素结合分子包括脂质A结合抗生素多粘菌素B和多聚赖氨酸聚合物，它们通过静电相互作用结合内毒素。然而，这些目前可获得的内毒素结合分子存在问题。据报道，多粘菌素B仅在微摩尔范围内具有结合亲和力，这取决于所讨论的细菌菌株，这使其不适合结合样品中的低浓度内毒素并从中去除。同时，多聚赖氨酸带高度正电荷，因此以非特异性方式与脂质A和核心寡糖的带负电荷的磷酸基团相互作用。因此，这种作用机制不适用于所有pH值或所有LPS类型。此外，它还可以与样品中可能存在的其他带负电荷的分子相互作用，从而去除这些分子。

其他方法包括离子交换色谱法。这通常在制药工业中用于药物产品的纯化，并且通常依赖于带负电荷的LPS和带正电荷的固定配体之间的静电相互作用。然而，使用离子交换色谱从高电荷样品中去除内毒素可能是有问题的。例如，如果样品中含有高度正电荷的颗粒，这些颗粒将与固定的配体竞争捕获LPS。相反，如果样品含有高度负电荷(非LPS)颗粒，这些颗粒将与LPS竞争结合到固定的配体上。在这两种情况下，这些不需要的反应降低了LPS去除的效率。支撑离子交换色谱方法的静电相互作用也可能在具有高离子强度的样品中被破坏，因此这些方法并不适用于所有情况。

除了从样品中去除内毒素之外，还希望能够检测内毒素，以便治疗产品、装置、试剂等可被认证为“不含内毒素”，因此可安全用于治疗应用。在这方面，目前检测内毒素最常用的方法是鲎变形细胞溶解物(Limulus amebocyte lysate，LAL)试验。美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)批准LAL试验用于检测医疗和治疗产品中的内毒素，检测范围浓度低至1皮摩尔(0.1EU/mL)。该试验使用鲎属(Limulus)鲎血液中的变形细胞溶解物，其中含有蛋白质和酶的复杂混合物。特别地，LAL试验是基于酶“(鲎凝血)C因子”(通常简称为C因子)的活性，其在LPS结合时被触发。C因子是一种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶，它激活下游酶促反应的复杂级联，最终提供LPS存在的迹象。然而，这种反应级联也可以被β-葡聚糖激活，β-葡聚糖通常存在于一系列细菌、真菌和植物中。因此，β-葡聚糖可能会在LAL试验中导致假阳性结果。此外，变形细胞溶解物的生产非常昂贵，并且目前的生产方法不可持续。

鲎的过度捕捞导致了开发内毒素检测替代方法的呼声。已经开发了一种类似的试验，其使用重组表达的C因子来切割生色底物，从而能够更直接地检测LPS。但由于其成分复杂，价格还是偏高。

此外，C因子的活性很容易被破坏，例如由于温度或pH值的变化，变性化合物如有机溶剂、尿素或强力去污剂，以及常规蛋白酶抑制剂。不同C因子制剂之间也可能存在批次间差异。这使得这种酶很难使用，也意味着依赖于C因子的LAL试验所获得的结果通常不是特别一致或可重复的。

LPS测定中影响所有检测方法的另一个问题是LPS聚集的倾向。本领域已知内毒素分子倾向于在水溶液中形成聚集体。溶液中阳离子(特别是二价阳离子，如Ca²⁺和Mg²⁺)的存在以及去污剂的存在会增加这种聚集，去污剂可以在LPS周围形成胶束。这种聚集具有减少溶液中可测量的LPS量的效果，因此限制了低浓度LPS的检测。这种效应被称为“脂多糖遮蔽(LPS masking)”，可由多种不同的物质引起。例如，在血液样品中，有许多化合物可以遮蔽LPS，如LPS结合蛋白、抗LPS抗体和二价阳离子。此外，来自不同细菌来源的内毒素分子可具有不同的分子量，并可表现出不同的聚集行为，这在测量来自不同来源的相同浓度的LPS时会导致不同的结果。因此，提供可用于去除或检测LPS的改进的LPS结合剂可能具有应用前景。

发明概述

本发明人开发了一种新的LPS结合剂，其形式为具有α-螺旋卷曲螺旋结构的寡聚蛋白。

本发明公开的新LPS结合剂基于可在酵母转录因子GCN4中发现的α-螺旋卷曲螺旋结构，其中蛋白质的短C-末端伸展形成高度稳定的二聚卷曲螺旋结构，称为亮氨酸拉链。

因此，在第一个方面，本发明提供了寡聚蛋白作为结合剂用于结合脂多糖(LPS)的用途，所述寡聚蛋白具有包含至少两个单体肽的卷曲螺旋结构，其中每个所述的单体肽可以相同或不同，能够形成α-螺旋，并且包含至少一个与SEQ ID NO:1的七肽(heptad)重复序列具有至少60％的序列同一性的核心序列。

与包含两亲性α-螺旋(或α-螺旋链)或由其组成的卷曲螺旋蛋白的特征一致，寡聚卷曲螺旋蛋白具有疏水核心。疏水核心包含在疏水核心结构中彼此相对的疏水性残基。

因此，特别地，肽单体的核心序列可以包括至少3个七肽基序a-b-c-d-e-f-g或其变体，每个变体包括不超过1个对七肽基序的插入或缺失。此外，在一个实施方案中，对应于七肽基序或其变体的位置a和d的至少50％的氨基酸残基为疏水性残基。在另一个实施方案中，对应于七肽基序或其变体的位置a和d的至少75％的氨基酸残基为疏水性残基。

因此，在该方面的一个实施方案中，本文提供了寡聚蛋白作为结合剂用于结合脂多糖(LPS)的用途，所述寡聚蛋白具有包括至少2个单体肽的卷曲螺旋结构，其中每个所述的单体肽可以相同或不同，能够形成α-螺旋，并包括至少一个与SEQ ID NO:1的七肽重复序列具有至少60％序列同一性的核心序列，其中核心序列包括至少3个七肽基序a-b-c-d-e-f-g或其变体，每个变体包括不超过1个对七肽基序的插入或缺失，其中对应于七肽基序或其变体的位置a和d的至少50％的氨基酸残基为疏水性残基。

卷曲核心蛋白疏水核心的氨基酸残基的组成不需要完全或仅仅是疏水性残基，并且可以存在其他残基，包括亲水性残基，例如极性残基。因此，在某些实施方案中，对应于七肽基序或其变体的位置a和d的至少52.5％、55％、60％、62.5％、70％或75％的氨基酸残基为疏水性残基。

在第二个方面，本发明提供了一种结合LPS的方法，所述方法包括将LPS或含有LPS的样品与本发明定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白与LPS结合，形成蛋白-脂多糖复合物。

在一个实施方案中，所述方法为体外方法。

在第三个方面，本发明提供了一种如本发明定义的作为结合剂用于结合LPS的用途或用于如本发明定义的结合LPS的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)如本发明所定义的寡聚蛋白；和

(ii)至少一种非变性洗涤剂。

本发明的用途和方法可用于检测和/或去除样品中的LPS。

由于其能够以高亲和力结合多种内毒素，本发明的寡聚蛋白适用于多种应用，包括内毒素结合、检测和去除。在这点上，本发明的寡聚蛋白可以固定在固体基质上。例如，可以将寡聚蛋白固定在用于柱或过滤器(例如旋转柱过滤器或流动柱)的树脂上，以如上文所述的内毒素去除方法结合并去除存在于所述过滤器或柱上的样品中的内毒素。寡聚蛋白也可用于内毒素检测系统，既可检测给定样品中内毒素的存在，也可证明未检测到内毒素的样品、试剂、产品等不含内毒素。在这点上，寡聚蛋白可以以与第二种成分的偶联物或融合物的形式提供，例如与检测部分的偶联物，或与合适的融合配体的融合蛋白，以促进内毒素的检测。

在第四个方面，本发明提供了包含固定在固体基质上的本发明定义的寡聚蛋白的产品。

如上所述，应当理解，本发明定义的寡聚蛋白通过脂质A组分与LPS相互作用。因此，在第五个方面，本发明提供了本发明定义的寡聚蛋白作为结合剂用于结合LPS的脂质A的用途。

类似地，在第六个方面，本发明提供了结合LPS的脂质A的方法，所述方法包括将脂质A或含有脂质A的样品与本发明定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白质结合脂质A，形成蛋白-脂多糖复合物。

在第七个方面，本发明提供了一种如本发明定义的作为结合剂用于结合脂质A的用途或者用于如本发明定义的结合脂质A的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)如本发明所定义的寡聚蛋白；和

(ii)至少一种非变性洗涤剂。

本发明所述的寡聚蛋白提供了一种可选择的结合LPS的结合剂。在一个实施方案中，本发明的公开内容提供了改进的用于LPS的结合剂。

本发明的LPS结合剂有许多优点。此外，可以看出它解决了上述与已知的LPS结合和检测方法相关的许多问题。

就LPS测定而言，本发明所述的寡聚蛋白消除了使用从鲎收获的昂贵溶解物的需要，并避免了与使用依赖于使用C因子的LPS测定方法相关的一致性和可重复性问题，例如LAL试验及其重组变体。

此外，本发明所述的寡聚蛋白能够溶解LPS聚集体。因此，寡聚蛋白可以减轻LPS遮蔽并有效增加包含这种LPS聚集体的样品中LPS的可测量浓度。这能检测样品中低浓度的LPS。

本发明所述的寡聚蛋白包含相对较短的肽序列，因此在一些实施方案中，它可以合成产生，不需要任何生物表达系统。

发明详述

本文公开的寡聚蛋白具有寡聚α-螺旋卷曲螺旋结构。卷曲螺旋是普遍存在的蛋白质元件，由缠绕成超螺旋束的两个或多个两亲性α-螺旋组成(Lupas和Gruber，2005)。两亲性α-螺旋卷曲螺旋的一个关键特征是重复的七肽基序a-b-c-d-e-f-g，其中位置a和d主要由疏水性残基占据，而位置b、c、e、f和g主要由亲水性残基占据。α-螺旋每圈包含3.6个残基，这意味着重复的七肽基序将位置a和d的残基置于螺旋结构同一面。这有助于形成高度稳定的超螺旋，其中疏水性残基在所谓的疏水核心中彼此面对，而亲水性残基面向外。应当注意，尽管卷曲螺旋蛋白的疏水核心通常主要包含疏水性残基，但核心结构中的所有残基不必都是疏水的，并且卷曲螺旋蛋白已知可包含位于核心结构中的其它残基，例如极性残基，但其仍能保留卷曲螺旋结构。

本发明中的寡聚蛋白基于蛋白质GCN4的亮氨酸拉链序列的变体，称为GCN4-pIL，其中GCN4-p‘ad’是指存在于七肽基序中位置a和d的氨基酸。已证明，通过突变存在于位置a和d的疏水核心残基，特别是通过改变存在于这些位置的亮氨酸和异亮氨酸残基的比例，有可能将蛋白质结构的优选寡聚状态从二聚体改变为三聚体(GCN4-pII)和四聚体(GCN4-pLI)(Harbury等，1993；Delano和Brünger，1994)。

这些卷曲螺旋元件的稳定性和它们形成寡聚体的倾向导致了使用GCN4卷曲螺旋结构作为嵌合延伸(即融合配体)来诱导寡聚化和稳定融合蛋白中的寡聚结构，以及增加这些蛋白的溶解性。在这方面，本发明人最初打算研究LPS和属于三聚体自体转运粘附素SadA的两个结构域之间推定的相互作用。为了研究这种蛋白质，制备了两种SadA构建体，K9和K14(见下面的实施例1)，这两种构建体都通过侧翼GCN4-pII片段稳定。然而，令人惊讶地发现，用于稳定SadA构建体的GCN4-pII衔接子显示出对LPS的极高亲和力，K_D在纳摩尔范围内。

根据这一偶然发现，本发明人开发了一种基于GCN4-pII蛋白的具有卷曲螺旋结构的寡聚蛋白，其能够用作结合LPS的结合剂。进一步的实验表明，这种蛋白与LPS之间的相互作用是通过该蛋白与LPS的脂质A组分结合而发生的。如上所述，脂质A组分的结构在革兰氏阴性细菌物种中是高度保守的，因此本发明的寡聚蛋白被认为能够以极高的亲和力结合广泛的细菌内毒素。此外，本发明的寡聚蛋白可以在典型的表达系统中重组过表达，并且可以从包涵体中纯化，而不与任何天然存在的内毒素相互作用，这能实现大规模、可持续和有成本效益的的生产。

本文所述的寡聚蛋白包含至少2个单体肽。这些单体肽代表单独的亚单位，作为一个整体，组成寡聚蛋白。每个单体都能够形成α螺旋。单体可以作为独立的肽提供，即独立的肽链或链，它们相互作用形成寡聚蛋白。在这样的一个实施方案中，所述单体肽因此可以被认为是蛋白质的单个亚单位，即独立的单体肽单位。因此，在一些实施方案中，寡聚蛋白中的每个α-螺旋可以被认为对应于单独的单体。

在其他实施方案中，单体肽可以连接在一起。因此，单体肽可以通过连接序列连接或链接。在这样的一个实施方案中，寡聚蛋白就其一级结构或序列而言具有单链形式，尽管单体肽当然相互作用形成一个寡聚卷曲螺旋结构，其可以被看作具有“多条链”相互作用以形成卷曲螺旋结构。在这样的一个实施方案中，单体肽可以被视为单链蛋白质序列的结构域。更具体地，寡聚蛋白可以被视为具有由单体肽结构域组成的3D结构。

每个单体肽包含至少一个核心序列，其与SEQ ID NO:1的七肽重复序列具有至少60％的序列同一性。SEQ ID NO:1代表模型肽GCN4-pII序列的变体，其基于GCN4蛋白C-末端二聚化基序的序列，并且包含重复的七肽基序a-b-c-d-e-f-g，在基序的位置a和d存在异亮氨酸残基，如下所示。在一些实施方案中，所述核心序列可以与SEQ ID NO:1具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述核心序列可以包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1的序列组成。

序列同一性可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定，例如使用利用具有可变pamfactor的FASTA pep-cmp的SWISS-PROT蛋白质序列数据库，缺口产生罚分设为12.0，缺口延伸罚分设为4.0，以及2个氨基酸的窗口。用于确定氨基酸序列同一性的其他程序包括威斯康星大学遗传学计算机组(Genetics Computer Group，GCG)第10版软件包的BestFit程序。该程序使用Smith和Waterman的局部同源算法，默认值为：缺口产生罚分-8，缺口延伸罚分＝2，平均匹配＝2.912，平均错配＝-2.003。在一个实施方案中，所述比较在全长的核心序列上进行。

SEQ ID NO:1:

可以看出，SEQ ID NO:1包含a-b-c-d-e-f-g七肽基序的多重重复。如上所述，a和d残基为I。然而，如下文将更详细讨论的，它们可以改变，并且在一个实施方案中，它们可以为I或L，或其衍生物，或为其它疏水性残基。如上所述，不是七肽基序中所有的a和d残基都需要为疏水的。有足够的疏水性残基形成寡聚卷曲螺旋结构就满足了。这可能取决于周围序列，以及单体肽序列中存在的其他残基。

在一个实施方案中，每个单体肽的核心序列包含至少3个七肽基序a-b-c-d-e-f-g或其变体。尽管七肽基序通常被写成a-b-c-d-e-f-g，但实际上并不要求核心序列中的七肽重复序列从位置a开始。位置a在位置g之后基序重复，因此七肽基序可以在任何位置开始，只要它以连续的顺序包含所有7个位置a-b-c-d-e-f-g。因此，例如，基序d-e-f-g-a-b-c是有效的七肽基序。

在一些实施方案中，所述核心序列可包含七肽基序a-b-c-d-e-f-g的一个或多个变体，其中每个变体包含不超过一个对七肽基序的插入或缺失。这些包含一个插入或缺失的七肽基序a-b-c-d-e-f-g的变体统称为“变体基序”。在本文中，术语“插入”和“缺失”分别指在七肽基序上添加单个残基，以及从七肽基序上去除单个残基。

插入或缺失可在七肽基序内的任何位置进行，包括七肽基序的任一端。例如，考虑将残基X插入基序a-b-c-d-e-f-g，得到的基序可以是X-a-b-c-d-e-f-g、a-X-b-c-d-e-f-g、a-b-X-c-d-e-f-g等。重要的是，可以看出基序中剩余位置的标记保持不变。这适用于插入和缺失的情况。因此，例如如果位置b的残基缺失，剩余的基序将包含序列a-c-d-e-f-g。

多个连续残基的插入或缺失不被认为是一个插入或缺失。因此，每个核心序列中存在的至少三个七肽基序或变体基序不得含有比存在的变体基序总数更多的七肽基序a-b-c-d-e-f-g的插入和缺失。在核心序列中彼此相邻的插入或缺失只有在它们位于连续变体基序的相邻末端，并且每个连续变体基序仅包含一个插入或缺失时才是允许的。在这种情况下，相邻的插入/缺失可以被看作是两个独立变体基序中两个独立插入/缺失的产物。

在一些实施方案中，所述核心序列包含至少4个七肽或变体基序。在一些实施方案中，核心序列包含3至5个七肽或变体基序。例如，核心序列可以包含3、4或5个七肽或变体基序。在一些实施方案中，核心序列可以包含至少3个七肽基序，并且没有变体基序。在其他实施方案中，核心序列可以包含至少3个变体基序，并且没有七肽基序。此外，核心序列可以包含至少3个七肽基序和变体基序的任何组合，并且这些七肽基序和变体基序可以以任何顺序排列。

如上所述，卷曲螺旋蛋白结构取决于每个α螺旋中存在的重复七肽基序内疏水性残基的协调排列。每个α螺旋内的疏水性残基在确定的位置使得它们主要存在于该α螺旋的单面上。换句话说，每个α螺旋内的残基排列成使得该α螺旋一面上的残基主要是疏水的。这使得寡聚蛋白中每个α螺旋的疏水面在蛋白质结构的中心形成稳定的疏水核心。在七肽基序的每个重复中，疏水性残基同时存在于位置a和位置d并不重要，但通常这些位置的大部分被疏水性残基占据。为了便于本发明定义寡聚卷曲螺旋蛋白的这种结构，在一个实施方案中，在核心序列内，对应于七肽基序或其变体的位置a和d的至少50％的氨基酸残基是疏水性残基。如上面的示意所示，SEQ ID NO:1中七肽基序的位置a和d由序列的位置4、8、11、15、18、22、25和29表示。因此可以看出，作为另一种定义，在对应于SEQ ID NO:1的位置4、8、11、15、18、22、25和29的位置，至少50％的氨基酸残基是疏水性残基。因此，在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的七肽重复序列中的8个位置“a”或“d”中至少有4个是疏水性残基。

更具体地，对应于SEQ ID NO:1的七肽重复序列中七肽基序位置a和d的至少52.5％、55％、60％、62.5％或70％的氨基酸残基是疏水的。然而，在一个代表性实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的七肽重复序列中七肽基序的位置a和d的至少75％的氨基酸残基是疏水的。因此，在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的七肽重复序列中的8个位置“a”或“d”中至少有6个是疏水性残基。

作为代表性的例子，在SEQ ID NO:1的序列中，至少4、5、6或7个a或d残基，或者对应于SEQ ID NO:1的位置4、8、11、15、18、22、25和29可以是疏水性残基。

基于对卷曲螺旋蛋白结构和序列的知识，进行序列修饰是在本领域技术人员的常规技能范围内的，包括相对于七肽基序中的其它位置替换位置a和d的残基，以获得基于SEQID NO:1的修饰或变体肽的卷曲螺旋结构。

本文所用的术语“疏水性残基”包括本领域公认或鉴定为疏水的任何氨基酸残基。这种氨基酸包括下列蛋白源氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。然而，在一个实施方案中，疏水性残基选自氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，或它们的化学衍生物。在另一个实施方案中，疏水性残基选自：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸，以及这些氨基酸的化学衍生物。核心序列中存在的疏水性残基也可以包括非常规疏水氨基酸，即具有不由标准遗传密码编码的侧链的疏水氨基酸。特别地，包括这些氨基酸的氟代衍生物，例如氟异亮氨酸和氟亮氨酸。其他已知的衍生物包括硒代衍生物，例如硒甲硫氨酸。这种非常规疏水氨基酸的更多例子，包括上述常规疏水氨基酸的D-氨基酸变体(其中包括D-氨基酸，所有的氨基酸都可以是D-氨基酸)，L-N甲基氨基酸变体、D-α甲基氨基酸变体和D-N-甲基氨基酸变体列于下表1中。

表1

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在一些实施方案中，对应于七肽基序或其变体的位置a和d的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸残基是疏水性残基。换句话说，在对应于SEQ ID NO:1的位置4、8、11、15、18、22、25和29上，至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸残基是疏水性残基。

在一些实施方案中，对应于七肽基序或其变体的位置a和d的氨基酸残基100％是疏水性残基。换句话说，对应于SEQ ID NO:1的位置4、8、11、15、18、22、25和29的氨基酸残基100％是疏水性残基。

核心序列中的疏水性残基可以全部相同，也可以互不相同。在一些实施方案中，七肽或变体基序中的每个疏水性残基独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸，及它们的化学衍生物，包括它们的氟代衍生物组成的组。在一个实施方案中，七肽或变体基序中的每个疏水性残基独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸，及它们的化学衍生物，包括它们的氟代衍生物或硒代衍生物组成的组。在一个实施方案中，七肽或变体基序中的每个疏水性残基独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸，及它们的化学衍生物例如氟亮氨酸和氟异亮氨酸组成的组。

在一些实施方案中，七肽或变体基序中至少50％的疏水性残基是异亮氨酸或氟异亮氨酸。在一些实施方案中，七肽或变体基序中至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的疏水性残基是异亮氨酸或氟异亮氨酸。在一些实施方案中，七肽或变体基序中100％的疏水性残基是异亮氨酸或氟异亮氨酸。

不形成卷曲螺旋结构疏水核心部分的残基，即位置b、c、e、f和g的残基，通常更靠近蛋白质表面，因此暴露于环境中。这些残基的特性并不重要，它们是可变的。在一些实施方案中，对应于位置b、c、e、f和g的至少50％的氨基酸残基为极性残基。在一些实施方案中，对应于位置b、c、e、f和g的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸残基为极性残基。在一些实施方案中，对应于位置b、c、e、f和g的100％的氨基酸残基为极性残基。

本发明所用的术语“极性残基”包括本领域公认或鉴定为极性的任何氨基酸残基。这包括带电荷的氨基酸。极性氨基酸残基可以选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和这些氨基酸的化学衍生物的氨基酸残基。在一个实施方案中，极性氨基酸残基可以选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸的氨基酸残基。此外，核心序列中存在的极性残基也可以包括非常规的极性氨基酸，即具有不由标准遗传密码编码的侧链的极性氨基酸。这种非常规极性氨基酸的例子，包括上文定义的常规极性氨基酸的D氨基酸变体、酰胺电子等排体(amide isostere)变体(例如N-甲基酰胺(N-methyl amide)、逆-反酰胺(retro-inverse amide)、硫代酰胺(thioamide)、硫代酯(thioester)、膦酸酯(phosphonate)、酮亚甲基(ketomethylene)、羟亚甲基(hydroxymethylene)、氟乙烯基(fluorovinyl)、(E)-乙烯基((E)-vinyl)、亚甲基氨基(methyleneamino)、亚甲硫基(methylenethio)或烷烃(alkane)))、L-N甲基氨基酸变体、D-α甲基氨基酸变体和D-N-甲基氨基酸变体，列于下表2中。如上所述，当使用D-氨基酸时，单体肽中的所有氨基酸都可以是D-氨基酸。

表2

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虽然七肽基序中疏水和极性氨基酸的一致排列是卷曲螺旋蛋白结构的原因，但关于残基位置的一般规则不是不变的。因此，正如不是对应于核心序列七肽或变体基序中位置a或d的每个残基都必须是疏水性的，类似地，不是对应于核心序列七肽或变体基序中位置b、c、e、f或g的每个残基都必须是极性的。在一些实施例中，对应于位置b、c、e、f和g的至少5％的氨基酸残基可以是脂肪族残基。在一些实施方案中，对应于位置b、c、e、f和g的至少10％或至少15％的氨基酸残基可以是脂肪族残基。

本文使用的术语“脂肪族残基”包括氨基酸甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸，以及这些氨基酸的化学衍生物，特别是其氟衍生物，包括氟亮氨酸和氟异亮氨酸。此外，存在于核心序列中的脂肪族残基也可以包括非常规脂肪族氨基酸，即具有不由标准遗传密码编码的侧链的脂肪族氨基酸，例如D氨基酸变体，以及其它非常规脂肪族氨基酸。

核心序列可以包含如上所定义的特定百分比的极性残基和如上所定义的特定百分比的脂肪族残基。例如，在一些实施方案中，对应于位置b、c、e、f和g的至少50％(或更高，如上所定义)的氨基酸残基可以是极性残基，对应于位置b、c、e、f和g的至少5％(或更高，如上所定义)的氨基酸残基可以是脂肪族残基极性残基。然而，这不是必需的，并且如上所述，是可变的。

在一些实施方案中，如本发明所定义，核心序列的一侧或两侧可以有侧翼(flanking)氨基酸序列。如果核心序列两侧都有侧翼，则核心序列一侧的侧翼序列可以与核心序列另一侧的侧翼序列相同或不同。侧翼序列可以形成或不形成寡聚蛋白的卷曲螺旋结构的一部分。因此，侧翼序列可以有助于单体肽的α-螺旋结构或成为其一部分，和/或可以有助于或形成卷曲螺旋结构的一部分，或者它可以是单体肽序列的独立部分。侧翼序列可用于执行各种功能，或赋予寡聚蛋白一种特性。例如，它可用于延伸单体肽的七肽重复序列，帮助单体肽的寡聚化，连接单体肽(例如在单链构建体中)，或为寡聚蛋白提供单独的功能部分。

侧翼序列的长度并不重要，它可以根据需要和预期，或者侧翼序列的性质和/或其目的而变化。它可以是例如1至300个氨基酸，例如2、3、4、5、6或7中的任何一个至270、250、240、230、220、210或200个氨基酸中的任何一个。这些范围仅作为示例给出，对侧翼序列的长度没有限制。在一些实施方案中，实践中侧翼序列可以多达170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个氨基酸。在一些实施方案中，优选短侧翼序列，例如多达20、15、12、10、8、7或6个。

因此，在一些实施方案中，侧翼序列可以包含一个或多个七肽基序，和/或其一个或多个部分。在本文中，七肽基序的一部分可以包括1、2、3、4或5个残基，它们构成七肽基序的连续部分。在一些实施方案中，侧翼序列中的七肽基序对应于SEQ ID NO:1中发现的七肽基序，或与其具有至少60％(例如至少70％、80％、90％)序列同一性的序列中的七肽基序，条件是对应于七肽基序的位置a和d的至少一个氨基酸残基是疏水性残基。在一些实施方案中，侧翼序列可包含SEQ ID NO:1或其部分，或与其具有至少60％(例如至少70％、80％、90％)序列同一性的序列。此外，在这样的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的七肽基序或其变体的位置a和d的至少50％(例如至少75％)的氨基酸残基是疏水性残基。

当侧翼序列包含一个或多个七肽基序或其一个或多个部分时，它可以被视为核心序列七肽基序的延续。因此，形成寡聚蛋白卷曲螺旋结构一部分的单体蛋白质的α-螺旋可以延伸到核心序列末端之外。

在一些实施方案中，核心序列的七肽基序和侧翼序列的七肽基序是连续的。也就是说，侧翼序列的第一个残基(即紧邻核心序列末端的残基)对应于七肽基序的位置，该位置在相邻核心序列末端残基的对应位置之后。以这种方式，重复的七肽基序a-b-c-d-e-f-g被保留，在核心序列的七肽基序和侧翼序列的七肽基序之间没有缺口。

在其它实施方案中，侧翼序列可以包含一个或多个与核心序列的七肽基序不完全连续的七肽基序，即在核心序列中的七肽重复和侧翼序列中的七肽重复之间可以有一个或多个残基，它们不构成连续重复的七肽基序的一部分。

在一些实施方案中，核心序列和侧翼序列可以排列成使得每个单体肽不包含多于8个七肽基序重复。在一些实施例中，单体肽不包含多于7个重复、多于6个重复或多于5个重复的七肽基序。换句话说，寡聚蛋白的单体肽可以包含多达8、7、6或5个七肽重复。

在一些实施方案中，单体肽的侧翼序列可能不完全与核心序列形成连续的α-螺旋，因此可能不完全是寡聚肽的卷曲螺旋结构的一部分。

在一些实施方案中，本发明定义的寡聚蛋白可以是具有一个或多个附加成分(component)或部分(moiety)的偶联物或融合物的形式。如下文将更详细阐述的，寡聚蛋白可以是与检测部分、寡聚化部分或固定部分，或者实际上任何期望的成分或部分，例如功能或结构成分或部分的偶联物的形式。偶联的部分可以具有任何化学或物理性质，例如小分子或大分子。寡聚蛋白可以是具有融合配体的融合蛋白的形式。因此，检测或固定或其它附加部分在性质上可以是蛋白质，即它可以是也可以不是多肽成分(本文使用的术语“多肽”包括任何肽、多肽或蛋白质，无论长度如何)。寡聚化部分可以是多肽。此外，寡聚蛋白可以固定在固体基质上。因此，在一些实施方案中，一个或多个附加成分可以是检测部分、寡聚部分、固定部分或融合配体。

在一些实施方案中，与寡聚蛋白偶联或融合的一个或多个附加成分可以在构成寡聚蛋白的一个或多个单体肽内形成侧翼序列的全部或部分。在其他实施方案中，偶联部分可以是独立的成分(即独立于寡聚蛋白或其单体肽)。

应当理解，侧翼序列中附加成分的存在可以补充或替代同一侧翼序列中一个或多个七肽基序的存在。也就是说，给定的侧翼序列可以包含一个或多个七肽基序或其部分，以及一个或多个附加成分。当侧翼序列包含一个或多个七肽基序或其部分，以及一个或多个附加成分时，侧翼序列可以排列成使得一个或多个七肽基序或其部分比一个或多个附加成分更接近核心序列。

在一些实施方案中，寡聚蛋白是具有单一附加成分的融合物或偶联物的形式。附加成分可以形成一个单体肽内侧翼序列的全部或部分。或者，寡聚蛋白可以是具有2个或更多附加成分的融合物或偶联物的形式。在一些实施方案中，附加成分可以形成相同单体肽内相同侧翼序列的全部或部分。在一些实施方案中，单个单体肽可以包含核心序列，其两侧为侧翼序列，其中每个侧翼序列包含一个或多个附加成分。此外，本文定义的寡聚蛋白可以包含多个单体肽，每个单体肽以任何上述排列方式包含一个或多个附加成分。

在具有寡聚化部分的偶联物形式的寡聚蛋白的情况下，寡聚化部分可以由几个寡聚化序列组成，其中每个单体肽包含一个寡聚化序列。因此，寡聚蛋白可以由至少2个单体肽组成，其中每个单体肽在侧翼序列中包含寡聚化序列。

当单体肽相互接触时，本发明公开的寡聚蛋白的卷曲螺旋结构可以自发形成。或者，寡聚体结构的形成可能需要一个“触发器(trigger)”来克服动力学障碍并将单体肽聚集在一起。此外，在一些实施例中，可能有必要稳定蛋白质的寡聚卷曲螺旋结构。寡聚卷曲螺旋结构的这种起始和稳定可以通过寡聚化序列来实现。寡聚化序列是能够寡聚化的蛋白质序列，即与自身的其他拷贝相互作用以形成寡聚体。应当理解，寡聚化是协同性的，也就是说，当较大蛋白质的特定部分能够容易且稳定地寡聚化时，这有助于在蛋白质结构的剩余部分中诱导寡聚化，否则这种寡聚化不会发生。例如，粘附蛋白的头部结构域，如YadA头部结构域，在本领域中已知能够诱导卷曲螺旋结构的形成，否则这些结构将不够稳定而不能形成。GCN4蛋白也以类似方式用于稳定三聚体自体转运粘附素(Hartmann等，2012)。因此，该结构域或本领域已知的其它等同结构域可用作寡聚化序列。如上所述，当寡聚蛋白与寡聚化部分偶联时，寡聚蛋白中的每个单体肽可能包含寡聚化序列。

另外或可选地，在一些实施方案中，卷曲螺旋结构的起始和稳定可以通过将单体肽连接在一起来完成。

尽管本发明定义的单体肽在某种程度上可以被认为是独立的，但是在一些实施方案中，本文公开的寡聚蛋白中的2个或更多个单体肽可以连接在一起。因此，侧翼序列可以包含一个或多个连接序列。这可以是一个或多个七肽基序或其部分以及侧翼序列中可能包含的一个或多个附加成分的补充或替代。应当理解，侧翼序列可以包含七肽基序和/或其部分、一个或多个附加成分和/或一个或多个连接序列的任意组合。

连接序列能够将一个单体肽连接到另一个单体肽上，从而在寡聚蛋白的至少一部分内形成单个肽链。当两个单体肽通过连接序列连接在一起时，可以认为其中一个单体肽(即第一个单体肽)包含含有完整连接序列的侧翼序列，其直接连接到另一个单体肽的核心序列上(即第二个单体肽在核心序列的末端没有侧翼序列)。或者，可以认为两个单体肽之间的连接一部分由第一个单体肽的侧翼序列组成，一部分由第二个单体肽的侧翼序列组成(即其中两个单体肽都包含含有连接序列的侧翼序列)。

当单体肽中包含连接序列以将单体肽连接在一起时，两个单体肽之间的侧翼序列不包含任何除连接序列和任选的七肽重复基序或其部分之外的序列可能是方便的。然而，连接的单体肽的链任一端的侧翼序列可以包含附加序列(例如，如上所述)。换句话说，在这种连接的，例如单链构建体中，寡聚蛋白可以是具有附加部分的偶联物的形式。换句话说，附加部分可以不是单体肽的一部分，但是可以与其偶联。

连接序列可以具有可变的长度和/或序列。可以理解的是，连接序列必须足够长，以使由单体肽形成的螺旋聚集成卷曲螺旋。然而，对于连接序列的最大长度可能没有功能限制。因此，连接序列的长度可以是至少2个残基，例如长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30个残基。

在其它实施方案中，例如，连接序列可以包含2-60个残基，更特别地5-55、10-50、15-45或20-40个残基。在一个实施方案中，连接序列可以包含2-50、3-40、4-30、5-20或6-15个残基。连接序列中存在的残基的性质并不重要。它们可以是任何氨基酸，例如中性氨基酸或脂肪族氨基酸，或者它们可以是极性的或带电荷的或形成结构的，例如脯氨酸。在一个实施方案中，连接序列是柔性连接序列。可以使用的不同柔性连接序列是已知的，并且在本领域中被广泛描述。通过代表性的例子，连接序列中至少70％的氨基酸可以选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸，或它们的衍生物。在一些实施例中，是富含甘氨酸或富含甘氨酸-丝氨酸的连接序列。

如上所述，每个单体肽包含至少一个核心序列。在一些实施方案中，一个或多个单体肽可以包含2个或多个核心序列，它们可以彼此相同或不同。如上所述，每个核心序列的一侧或两侧可以有侧翼序列。当核心序列两侧都有侧翼时，两个侧翼序列可以相同或不同。因此，每个单体肽可以包含2个或多个核心序列，其中每个核心序列的一侧或两侧都有侧翼序列。因此，当单体肽包含2个或更多个核心序列时，应当理解为，对于每个核心序列，它可以进一步包含多达2个侧翼序列。因此，包含2个核心序列的单体肽可以包含多达4个侧翼序列。例如，单体肽可以排列为：F-C-F-F-C-F，其中F代表侧翼序列，C代表核心序列。

在一些实施方案中，单体肽可包含排列为F-C-F-C-F的2个核心序列和3个侧翼序列。在其它实施方案中，单体肽可包含排列为F-C-C-F的2个核心序列和2个侧翼序列。在其它实施方案中，单体肽可包含排列为C-C-F的2个核心序列和单个侧翼序列。在一些实施方案中，单体肽可包含排列为F-C-F的两侧侧面有侧翼序列的单个核心序列；或者可包含单个核心序列和单个侧翼序列。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以仅包含一个包含侧翼序列的单体肽。在一些实施方案中，寡聚蛋白中的每个单体肽仅由一个核心序列组成。

本发明定义的每个核心序列与包含30个残基的SEQ ID NO:1具有至少60％的同一性，因此应该理解每个核心序列可以具有18至42个残基的长度。在一些实施例中，单体肽中的核心序列可具有19-41个残基的长度，例如20-40、21-39、22-38、23-37、24-36、25-35、26-34、27-33、28-32或29-31个残基。在一些实施方案中，核心序列可以包含30个残基。可能有一个以上的核心序列。每个核心序列的一侧或两侧可以有侧翼序列。如上所述，所述侧翼序列可以包含一个或多个七肽基序或其部分、一个或多个附加成分和/或一个或多个连接序列。因此，在一些实施方案中，单体肽整体可能明显长于核心序列。在一些实施方案中，单体肽可以包含24-1000个残基，例如24-900、24-800、24-700、24-600、24-600、24-500、24-400、24-300、24-250、24-200、24-150、24-100、24-75、24-50或24-40个残基。

本发明定义的寡聚蛋白具有包含至少2个单体肽的卷曲螺旋结构。如上所述，寡聚蛋白基于GCN4转录因子的C-末端延伸。野生型GCN4的C末端序列形成二聚体卷曲螺旋结构，即包含2个单体肽的结构。然而，已经观察到，通过改变单个单体肽中七肽基序内位置a和d的残基，可以改变蛋白质整体的寡聚状态，从而形成三聚体或四聚体结构。在一些实施方案中，寡聚蛋白是二聚体、三聚体或四聚体，即寡聚蛋白包含2、3或4个单体肽。在优选的实施方案中，寡聚蛋白是三聚体。

寡聚蛋白中的每个单体肽可以相同或不同。这不仅包括核心序列的序列，还包括一个或多个侧翼序列(及其序列)的存在或缺失。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以包含2个或更多个具有相同核心序列的单体肽。在一些实施例中，寡聚蛋白质可包含2个或更多个完全相同的单体肽。在一些实施方案中，寡聚蛋白中的所有单体肽可以是相同的。虽然不要求寡聚蛋白中的单体肽彼此相同，但优选单体肽之间仅存在最小的差异。

在一些实施方案中，寡聚蛋白质中的每个单体肽可以作为单独的肽链提供。在这种情况下，每个单体肽可以被视为寡聚蛋白复合物的物理上独立的亚单位。或者，在一些实施例中，2个或更多个单体肽可以连接在一起。如上所述，单个单体肽可以通过一个或多个连接序列连接在一起形成单个肽链，即第一个单体肽的一端连接到第二个单体肽的一端。在一些实施例中，所有单体肽可以连接成单个肽链。在这种情况下，单体肽可以被认为是单链多结构域蛋白质构建体的独立结构域。

单体肽可以另外或可选地通过化学交联连接在一起，其形式为单体肽之间的一个或多个化学交联。本领域已知许多方法用于在单个肽之间形成共价键以将它们连接在一起，并且可以使用任何合适的这种化学交联方法将寡聚蛋白内的2个或多个单体肽连接在一起。例如，2个或多个单体肽可以通过单体肽中特定半胱氨酸残基之间的一个或多个二硫键连接。或者，它们可以通过使用交联剂如甲醛随机连接，该交联剂能够促进与单体肽中存在的赖氨酸残基形成共价键。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以包含以单个肽链的形式和/或通过化学交联连接在一起的单体肽，以及在单独的肽链上提供并且未连接的一些单体的组合。

本发明公开的寡聚蛋白可以合成产生，例如通过连接氨基酸或更小的合成产生的肽，或通过编码所述蛋白质或其一个或多个单体肽的核酸分子的重组表达。这种核酸分子可以通过本领域已知的任何合适的方法合成产生。因此，寡聚蛋白可以是重组的或合成的或人工的寡聚蛋白。

本发明定义的寡聚蛋白作为结合LPS的结合剂提供。如上所述，脂多糖是所有革兰氏阴性菌外膜中不可或缺的成分。然而，并不是所有的革兰氏阴性菌在其外膜中都有完全相同的脂多糖。如本发明所用，术语“LPS”或术语“内毒素”(如上所述，可与“LPS”互换使用)，是指存在于革兰氏阴性菌外膜中的任何脂多糖。

有利的是，本发明定义的寡聚蛋白能够以极高的亲和力结合LPS。这种高亲和力使寡聚蛋白有效地结合LPS，甚至当LPS以非常低的浓度存在时，使得LPS可以被检测和/或去除。在一些实施方案中，寡聚蛋白以纳摩尔或皮摩尔范围或更低的K_D与LPS结合。例如，在一些实施方案中，寡聚蛋白以10nM或更小的K_D结合LPS，例如5nM或更小、1000pM或更小、750pM或更小、500pM或更小、250pM或更小、100pM或更小、50pM或更小、10pM或更小、5pM或更小、1pM或更小、或500fM或更小。因此，本文定义的寡聚肽可能能够检测样品中的LPS，其中其以至少100pM的浓度存在。在一些实施方案中，寡聚蛋白能够检测样品中以至少75pM的浓度存在的LPS，更特别地以至少50pM、至少25pM、至少10pM、至少5pM、至少3pM、至少1pM、至少750fM、至少500fM、至少250fM或至少100fM的浓度存在。

不希望被理论所束缚，本发明人相信本发明定义的寡聚蛋白与LPS的结合依赖于蛋白质整体的卷曲螺旋结构，以及LPS与蛋白质内各个残基之间的相互作用。在这方面，认为寡聚蛋白中带正电荷的残基的存在可能有助于增加结合的亲和力。同样，不希望被理论所束缚，假设带正电荷的残基可能参与了与LPS脂质A区带负电荷的磷酸基团的静电相互作用。因此，在一些实施方案中，寡聚蛋白在单体肽的核心序列内包含总共至少6个阳离子残基。在一些实施例中，寡聚蛋白可在单体肽的核心序列内包含总共至少7个阳离子残基，例如至少8个、至少9个、至少10个、至少12个或至少15个阳离子残基。

本文使用的术语“阳离子残基”包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸和任何非遗传编码或修饰的氨基酸残基，其在pH 7.0时携带正电荷。合适的非遗传编码或修饰的阳离子残基包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸的类似物，例如同型赖氨酸(homolysine)、鸟氨酸(ornithine)、二氨基丁酸(diaminobutyric acid,)、二氨基庚二酸(diaminopimelic acid)、二氨基丙酸(diamionpropionic acid)、同型精氨酸(homoarginine)、三甲基赖氨酸(trimethylysine)、三甲基鸟氨酸(trimethylornithine)、4-氨基哌啶-4-羧酸(4-aminopiperidine-4-carboxylic acid)、4-氨基-1-氨基酰胺基哌啶-4-羧酸(4-amino-1-carbamimidoylpiperidine-4-carboxylic acid)和4-胍基苯丙氨酸(4-guanidinophenylalanine)。

前述阳离子残基可以存在于单个单体肽的至少一个核心序列中，或者它们可以分布在寡聚蛋白中多个单体肽的核心序列中。在一些实施方案中，每个单体肽在核心序列中包含至少2个阳离子残基。在一些实施例中，每个单体肽在核心序列内包含至少3个、至少4个或至少5个阳离子残基。

如上所述，寡聚蛋白通过脂质A组分与LPS相互作用，因此本发明还提供了如本文所定义的寡聚蛋白作为结合剂用于结合脂质A的用途。本发明所用术语“脂质A”是指LPS的脂质A组分，其包含由β-1，6键连接的两个磷酸葡萄糖胺糖分子，同时具有四个O-连接的和两个N-连接的酰基链，其能够与革兰氏阴性菌的外膜相互作用。

在一些实施方案中，如上所述，本发明定义的寡聚蛋白可以是与一个或多个附加成分或部分的偶联物或融合物的形式。特别地，寡聚蛋白可以与检测部分或固定部分偶联。附加部分可以是多肽的形式，因此寡聚蛋白可以是具有融合配体的融合蛋白的形式。融合配体是融合蛋白中独立于寡聚蛋白的多肽成分。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以固定在固体基质上。

寡聚蛋白可以与任何合适的检测部分偶联，即能够提供可被检测的信号的任何部分。检测部分可以被认为是标记，并且可以是直接或间接可检测的。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以与可直接检测的检测部分偶联。可直接检测的部分是指无需使用附加试剂即可直接检测的部分。例如，可直接检测的合适的检测部分可包括荧光分子(例如荧光蛋白或有机荧光团)、比色部分(例如有色分子或纳米颗粒)、颗粒(例如金或银颗粒)、量子点、放射性同位素标记、化学发光分子等。特别地，任何分光光度或光谱可检测的标记可以用于直接可检测的部分。可检测的标记可以通过颜色来区分，但是任何其他参数，例如大小、电荷等也可能会被用到。

可间接检测的部分是通过使用一个或多个附加试剂可检测的部分，例如，其中该部分是由两种或多种成分组成的信号产生系统的成员。例如，检测部分可以包括能够催化反应产生可检测信号(例如颜色变化)的反应的酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)。因此，当检测部分与酶的底物接触时，反应将进行并产生可检测的信号。

寡聚蛋白可以是具有融合配体的融合蛋白的形式。在一些实施方案中，融合配体可以是可检测部分，即具有可检测部分的偶联物形式的寡聚蛋白可以被认为等同于具有可检测融合配体的融合蛋白形式的寡聚蛋白。然而，寡聚蛋白可以是具有融合配体而不是可检测部分的融合蛋白的形式。原则上，融合配体可以是任何多肽，只要寡聚蛋白仍然能够作为结合LPS的结合剂。

在一些实施方案中，寡聚蛋白可以固定在固体基质(即固相或固体支持物)上。这种固定可以以任何方便的方式实现。因此，根据选择，固定的方式或手段和固体基质可以选自本领域公知的和文献中描述的任何数量的固定手段和固体基质。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以与固定部分偶联以促进固定。固定部分可以直接结合到固体基质上(例如化学交联)。例如，在一些实施方案中，固定部分可以包含半胱氨酸残基，其能够以二硫键的形式偶联到底物上的半胱氨酸残基上。在一些实施方案中，固定部分可以通过连接基团或通过一个或多个中间结合基团更间接地结合到基质上。在一些实施方案中，固定部分可以是例如亲和结合配体，例如生物素或半抗原，其能够与其结合配体结合，即同源结合配体，例如链霉亲和素或抗体，其提供在固体基质上。因此，寡聚蛋白通过固定部分可以共价或非共价连接到固体基质上。该连接可以是可逆的(例如可裂解的)或不可逆的连接。在一些实施方案中，该连接可以被酶促、化学或光切割，例如该连接可以是光敏连接。

在一些实施方案中，寡聚蛋白和固体底物之间的相互作用必须足够强以能进行洗涤步骤，即寡聚蛋白质和固体底物之间的相互作用不会被洗涤步骤破坏(显著破坏)。例如，在一个实施方案中，在每个洗涤步骤中，少于5％的寡聚蛋白从固体基质中被去除或洗脱。在一个实施方案中，在每个洗涤步骤中，少于4、3、2、1、0.5或0.1％的寡聚蛋白从固体基质中被去除或洗脱。

固体基质可以是目前广泛用于或建议用于固定化、分离等的任何众所周知的基质或基体。它们可以是颗粒(例如，可以是磁性的、顺磁性的或非磁性的珠子)、薄片、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管、载玻片、阵列、芯片或微量滴定条、管、板或孔等形式。

在一些实施方案中，寡聚蛋白被固定在珠子或树脂上，或固定在孔或容器内部或上面，或固定在柱子或过滤材料上，或固定在检测装置的表面上。

基质可以由玻璃、二氧化硅、乳胶、磷灰石或聚合材料制成。在某些情况下，具有高表面积的材料可能特别合适。这种基质可以具有不规则的表面，并且可以是例如多孔的或颗粒状的，例如颗粒、纤维、网、烧结物或筛。颗粒材料，例如珠子，由于其更大的结合能力，是有用的，特别是聚合物珠子。应当理解地，这些珠子可以以本领域已知的任何合适的排列提供。例如，珠子可以填充到柱子中，例如过滤柱。

方便地，根据本发明使用的颗粒状固体基质可以包含球形珠。珠子的尺寸不是关键的，但是它们可以例如达到至少1μm的直径。在一个实施方案中，珠子可以具有至少2μm的直径。在一个实施例中，珠子可以具有不超过10μm的最大直径，例如不超过6μm。单分散颗粒，即尺寸基本均匀的颗粒(例如尺寸的直径标准偏差小于5％)具有提供非常统一的反应再现性的优点。代表性的单分散聚合物颗粒可以通过US-A-4336173中描述的技术生产。

在一些实施例中，固体基质可以是树脂，例如淀粉酶树脂。树脂可以以任何合适的形式提供，例如旋转柱过滤器或流动柱。在一些实施方案中，寡聚蛋白可以固定在孔或容器内部或上面，例如多孔板。

在一些实施方案中，寡聚蛋白可以固定在检测装置的表面上，例如芯片或微阵列。在这点上，寡聚蛋白可以形成能够结合并检测LPS的捕获阵列或生物传感器。在一些实施例中，寡聚蛋白可以固定在表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)芯片上。能够测量对应于靶与固定的捕获蛋白结合的信号的生物传感器在本领域中是众所周知的，并且本发明定义的寡聚蛋白可以以任何这样的合适排列提供。

因此，可以看出，使用本发明定义的寡聚蛋白作为结合剂用于结合LPS的用途可以包括使用寡聚蛋白来检测和/或去除样品中的LPS。

因此，本发明定义和描述的寡聚蛋白的用途尤其包括体外用途，即LPS在体外被结合、检测或去除。

在这方面，本发明提供了一种结合LPS的方法，所述方法包括将LPS或含有LPS的样品与本发明定义的寡聚蛋白接触，以使该蛋白与LPS结合，形成蛋白-脂多糖复合物。应当理解，上述关于用于结合LPS的寡聚蛋白的公开内容同样适用于涉及相同寡聚蛋白的结合LPS的方法。

在一个实施方案中，所述方法为体外方法。

本发明使用的术语“样品”包括任何可能含有LPS或可能被LPS污染的样品，或可能需要测试的样品。这包括来自患者或更一般的受试者的临床样品、环境样品和待检测内毒素污染的产品样品。来自患者的临床样本可以是任何体液或组织样本，例如血液样本、淋巴样本、唾液样本、尿液样本、粪便样本、脑脊液样本或取自患者的任何其他合适的生物样本。在优选的实施方案中，临床样本是血液样本。

待检测内毒素污染的产品样品可以是来源于任何怀疑被内毒素污染的产品的样品，特别是任何用于人消费或与人相互作用的产品。例如，这包括来自制药和医疗行业的产品，如试剂、医疗器械、设备、耗材、药品、疫苗等。同样，样品也可以来自食品和饮料工业的产品，或来自环境样品，如饮用水、地下水等。

在一个实施方案中，样品可以是包含待测试产品一部分的液体样品，尽管它也可以是来自产品表面的样品，其中需要测试固体产品(如医疗器械)，或表面(如手术室或另一无菌环境中的表面)的内毒素污染。这可以包括例如从产品表面取得的拭子或洗涤物。

在一些实施方案中，结合LPS的方法是检测样品中LPS存在的方法，其中所述方法包括：

(a)使样品与本发明定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白与LPS结合形成蛋白-脂多糖复合物；和

(b)检测蛋白-脂多糖复合物的存在。

在一些实施方案中，结合LPS的方法可以是检测怀疑含有革兰氏阴性菌的样品中革兰氏阴性菌存在的方法，其中所述方法包括：

(a)将样品与本发明定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白结合革兰氏阴性菌外膜中的LPS，形成蛋白-脂多糖复合物；和

(b)检测蛋白-脂多糖复合物的存在。

应当理解地，检测蛋白-脂多糖复合物的步骤可以通过本领域已知的任何合适的方法进行。蛋白-脂多糖复合物可以直接或间接检测。根据样品与寡聚蛋白接触的方法，可以选择检测蛋白-脂多糖复合物的合适方法。

如上所述，使样品与寡聚蛋白接触的步骤可以包括将样品施加到已经固定了寡聚蛋白的基质上，其中基质被排列成使得样品与寡聚蛋白的结合可以被测量。在一些实施方案中，例如，寡聚蛋白可以固定在如上所述的检测装置的表面上，例如SPR芯片或另一种合适的生物传感器，其能够检测样品和寡聚蛋白之间的相互作用。因此，将样品与寡聚蛋白接触的步骤可以包括将样品施加到已经固定了寡聚蛋白的固体基质上。

在其他实施方案中，例如，寡聚蛋白可以固定在多孔板的孔中，以便形成LPS试验。这种试验在本领域是众所周知的；当将样品施加到包含固定的寡聚蛋白的平板上时，样品中存在的任何LPS将被寡聚蛋白结合，样品中的其它成分可以被洗掉。因此，使样品与寡聚蛋白接触的步骤可以包括将样品施加到已经固定了寡聚蛋白的多孔板上。此外，检测样品中LPS存在的方法可以进一步包括在检测步骤之前洗涤蛋白-脂多糖复合物的步骤，以除去样品中未结合的组分，并因此提高方法的准确性。这种洗涤步骤的合适试剂和方案是本领域众所周知的。然后保留在平板中的蛋白-脂多糖复合物可以用任何合适的能够结合LPS的检测部分来检测。检测部分可以直接或间接检测。如下文更详细概述的，本发明人采用了最初由Schmidt et al,2016报道的沙门氏菌噬菌体的尾钉蛋白的ELISA类似试验(ELITA)来检测LPS。该试验使用能够结合LPS并包含N-末端链霉标记(StrepTag)和链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶的尾钉蛋白来检测蛋白-脂多糖复合物。当将酶底物2,2’-叠氮基-双3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid，ABTS)加入平板时，诱导了可检测的颜色变化。因此，可以看出，检测蛋白-脂多糖复合物存在的步骤可以包括将蛋白-脂多糖复合物与检测部分接触，该检测部分能够结合LPS并且包含能够催化产生可检测信号的反应的酶，并且与合适的底物接触以诱导这种可检测信号。

在一些实施方案中，寡聚蛋白可以是包含检测部分本身的偶联物的形式，如上所述。因此，可以通过检测与寡聚蛋白偶联的检测部分的信号来检测蛋白-脂多糖复合物。这可以通过适于检测来自所考虑的检测部分的信号的任何方法来完成，例如使用荧光显微镜来观察与寡聚蛋白偶联的荧光标记。

在一些实施方案中，结合LPS的方法是从样品中去除LPS的方法，其中该方法包括：

(a)将样品与本发明定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白与LPS结合，形成蛋白-脂多糖复合物；和

(b)从样品中分离蛋白-脂多糖复合物。

同样，应当理解，从样品中分离蛋白-脂多糖复合物的步骤可以通过本领域已知的任何合适的方法来完成，并且这将取决于样品与寡聚蛋白接触的方式。

在一些实施方案中，寡聚蛋白可以固定在固体基质上，因此使样品与寡聚蛋白接触的步骤可以包括将样品施加到已经固定了寡聚蛋白的固体基质上。如上所述，寡聚蛋白可以固定在本领域已知的任何合适的基质上。特别地，固体基质可以是颗粒(例如珠子)、滤器或柱子的形式。同样，使用这种基质从样品中分离结合的靶分子的合适试剂和方案是本领域众所周知的。

如上所述，寡聚蛋白可以固定在珠子上，珠子可以是磁性的。这里使用的术语“磁性”是指当置于磁场中时，基质能够被赋予磁矩，因此在该磁场的作用下是可移动的。换句话说，一旦复合物形成，包含磁性颗粒的基质可以通过磁性聚集容易地除去，这提供了从样品中分离蛋白-脂多糖复合物的快速、简单和有效的方法。

例如，在另一个实施方案中，寡聚蛋白可以固定在填充到柱子中的树脂上。在该例子中，当样品与寡聚蛋白接触时，即当样品被施加到柱子上时，LPS将被寡聚蛋白结合并保留在柱中，样品的其余部分将流过柱。在一些实施方案中，该方法可以包括使样品与寡聚蛋白接触的多个步骤，以确保所有的LPS都被结合，即样品可以被施加到柱上几次。此外，该方法可以包括在分离步骤之前洗涤蛋白-脂多糖复合物的步骤，以避免从样品中无意中去除LPS以外的其它成分，即可以用合适的试剂洗涤柱子。

当结合LPS、检测样品中LPS的存在或从样品中去除LPS时，优选参与结合、检测或去除的试剂，特别是寡聚蛋白，可以重复使用。因此，本发明公开的方法可以进一步包括将蛋白-脂多糖复合物与至少一种非变性去污剂接触的步骤，以便从寡聚蛋白中除去LPS，即破坏蛋白-脂多糖复合物，使得寡聚蛋白可以被再利用。

在这方面，本发明提供了本发明定义的作为LPS结合剂的用途或用于本发明定义的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)如本发明所定义的寡聚蛋白；和

(ii)至少一种非变性洗涤剂。

非变性洗涤剂是本领域众所周知的，技术人员可以使用任何合适的非变性洗涤剂。例如，所述至少一种非变性洗涤剂可以选自非离子、阴离子、阳离子或两性离子洗涤剂，或其任意组合。在这点上，所述至少一种非变性去污剂可以具有选自线性聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)基团、聚山梨醇酯(polysorbate)基团、β-糖苷糖(beta-glycosidic sugar)基团、N-甲基葡糖胺(N-methylglucamine)基团、N-氧化物(N-oxide)基团、二甲基铵-1-丙磺酸酯(dimethylammonium-1-propanesulfonate)基团、羧酸(carboxylic acid)基团、硫酸(sulfate)基团或季胺(quaternary amine)基团的头基。所述至少一种非变性洗涤剂可选自CHAPS、两性洗涤剂3-12、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、triton X-100，或其任意组合。在一些实施例中，所述至少一种非变性去污剂可以是非变性去污剂的混合物。在一些实施方案中，所述非变性去污剂混合物包含CHAPS、两性洗涤剂3-12、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和triton X-100，或由其组成。

应当理解，洗涤剂应当以足以破坏蛋白-脂多糖复合物的浓度存在，但浓度不能高到使寡聚蛋白的功能永久受损。在一些实施方案中，洗涤剂可以以至少0.1％(w/w)或0.1％(v/v)的总浓度存在，即所有存在的洗涤剂的浓度。在一些实施方案中，洗涤剂的浓度可以是至少0.15％(w/w)或至少0.15％(v/v)，例如至少0.2％(w/w)或至少0.2％(v/v)，至少0.25％(w/w)或至少0.25％(v/v)，或至少0.5％(w/w)或至少0.5％(v/v)。在一个实施方案中，所述至少一种非变性去污剂包含0.05％(w/w)CHAPS、0.05％(w/w)两性洗涤剂3-12、0.05％(v/v)Tween 80、0.05％(v/v)Tween 20和0.05％(v/v)triton X-100的组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含固定在固体基质上的寡聚蛋白的产品，其中寡聚蛋白如本发明所定义。固体基质可以是本发明公开的任何固体基质。也就是说，上面关于寡聚蛋白用途的公开内容，其中寡聚蛋白固定在固体基质上，同样适用于包含固定在固体基质上的寡聚蛋白的产品。在这方面，固体基质可以是薄片、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管、载玻片、阵列、芯片、微量滴定条、管、板或孔。特别地，寡聚蛋白可以固定在检测装置的表面，例如SPR芯片或生物传感器。

从上面的公开内容可以看出，本发明所述的寡聚蛋白提供了结合LPS的替代结合剂，这可以解决结合和检测LPS的已知方法的许多问题。特别地，本发明所述的寡聚蛋白能够溶解LPS聚集体。因此，寡聚蛋白可以减少由聚集引起的LPS遮蔽的影响，并因此有效地增加样品中LPS的可测量浓度。因此，这种寡聚蛋白支持一种能够检测低浓度LPS的LPS测定方法。

此外，这种检测方法避免了与LAL试验相关的问题，例如昂贵且不可持续的变形细胞溶解物的收获。此外，该方法还避免了与使用C因子相关的任何潜在问题，这些问题也可能存在于LAL试验的重组变体中。

附图说明

现将参考以下附图在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明：

图1显示了改编自PDB-ID 2YO0的GCN4-pII三聚体的结构(Hartmann等人，2012)。(A)侧视图。(B)正视图，位置a和d的核心异亮氨酸残基为绿色。

图2显示了LPS一般结构的示意图，基于鼠伤寒沙门氏菌的LPS。脂质A部分(嵌入部分)由嵌入外膜的两个磷酸葡萄糖胺和四个O-连接和两个N-连接的酰基链组成。核心寡糖(COS)通过糖苷键与脂质A相连，O-抗原与倒数第二个COS糖相连。O-抗原由4-40个重复单位的四糖重复组成，平均30个重复(Peterson和McGroarty，1985)。脂质A和两个邻近的3-脱氧-D-甘露糖-辛-2-酮酸(3-Deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid，KDO)糖在革兰氏阴性物种中高度保守，而其余的COS和O-抗原分别在细菌物种和血清型中保守。

图3显示了将不同的LPS组分注射到固定的K9-GCN4-PII后的SPR结合曲线。垂直线表示注射的开始和结束。(A)显示注射了完整的LPS。(B)显示注射了缺乏O-抗原的粗糙型LPS。(C)显示注射了除了两个近端KDO之外，缺乏所有的糖的深度粗糙型LPS。(D)显示注射了缺乏脂质A的LPS多糖。

图4显示了对于图3中测试的每种LPS组分，注射结束时配体摩尔浓度标准化的SPR差值图。

图5显示了LPS与两个含GCN4的构建体K9-His(左)和K14-His(右)的ELITA结合曲线。

图6显示了放大倍数为4k(左)和8k(右)的单独LPS(上)和具有GCN4-pII的LPS(下)的TEM图像。

图7显示了产生的构建体的示意图。源自SadA的构建体最初由Alvarez等人(Alvarez et al.,2008)和Hartman等人(Hartmann et al.,2012)描述。andreinlvpas构建体最初由Deiss等人描述((Deiss et al.,2014)。GCN4构建体由GenScript(GenScriptBiotech Corp)合成。

图8显示了固定的K9与不同鼠伤寒沙门氏菌LPS组分的SPR Fc1、Fc2和Fc1-F2曲线。(A)与光滑型LPS。(B)与粗糙型LPS。(C)与深度粗糙型LPS。(D)与LPS衍生的多糖。

图9显示了固定的K14与不同鼠伤寒沙门氏菌LPS组分的SPR Fc1、Fc2和Fc1-F2曲线。(A)与光滑型LPS。(B)与粗糙型LPS。(C)与深度粗糙型LPS。(D)与LPS衍生的多糖。

图10显示了固定的K3(Fc1通道)和K3-His(Fc2通道)与不同鼠伤寒沙门氏菌LPS组分的SPR Fc1、Fc2和Fc1-F2比较曲线。(A)与光滑型LPS。(B)与粗糙型LPS。(C)与深度粗糙型LPS。(D)与LPS衍生的多糖。

图11显示了K9和K14的ELITA实验的绝对值(上图)以及设置和阴性对照(下图)。SadA＝沙门氏菌组分K9或K14。BSA＝牛血清白蛋白。TSP＝噬菌体尾钉蛋白。ST-HRP＝链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶。

图12显示了单独的GCN4-pII和有LPS存在下的CD光谱。可以看出，在与LPS结合之前和之后，GCN4-pII的二级结构组成变化很小。

图13显示了LAL试验的结果图，其证明了添加有0.5EU/mL LPS的浓度在10至0.1μM范围内的GCN4-pII的遮蔽效应。在1μM GCN4-pII处观察到最佳遮蔽，其中遮蔽效应为总信号的89％。

图14显示了GCN4-pII的2D·¹H-¹H·TOCSY NMR谱的指纹区域。所有29个预期的自旋系统都得到很好的分离和分配，没有峰分裂的迹象，表明样品在溶液中是同质的。

图15显示了使用生物素化LPS进行检测的基于GCN4-pII的ELISA的结果图。

图16显示了使用与图15的试验相同的样品的LAL试验的结果图。

图17显示了比较基于GCN4-pII的ELISA和LAL试验的结果的图。

图18显示了各种LPS类型和作为对照的PBS-E(运行缓冲液)的SPR结合曲线。

图19显示了实施例5中使用的LPS变体的系统发育分布。该图改编自Bern和Goldberg，2005。

实施例

方法

蛋白质的表达和纯化

侧翼为GCN4衔接子的沙门氏菌粘附素A(SadA)构建体(如图7所示)如前所述产生(Alvarez等人，2008；Hartmann等人，2012)。将转化的BL21-Gold(DE3)在2L ZYP-5052自诱导培养基(Studier，2005)中生长，并在OD600＝0.6时通过添加200ng/mL脱水四环素(AHTC)诱导过表达，随后在30℃下表达过夜。将细胞以6000×g(Beckman JLA 8.1000转子)沉淀30分钟，并重新悬浮于20mL包含200μL无-EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Merck)和DNase I的Tris/HCl pH 7.4，40mM NaCl，5mM MgCl₂中。重悬之后，用French press裂解细胞，将所得裂解物稀释在50mL平衡缓冲液(20mM Tris/HCl pH 7.9，5M盐酸胍，0.5M NaCl，10％甘油)中，并在室温下搅拌孵育1小时，随后以75,000×g(Beckman Ti 70转子)离心1小时以除去任何未溶解的颗粒。将所得溶液上样到用平衡缓冲液预平衡的20mL Ni Sepharose excel柱(GE Life Sciences)上。施加样品后，用4倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱，并用0-100％梯度洗脱缓冲液(20mM Tris/HCl，pH 7.5，5M盐酸胍，0.5M NaCl，10％甘油，500mM咪唑)洗脱。通过SDS-PAGE分析洗脱的片段，含有目标蛋白质的片段被合并，并用2L重折叠缓冲液(20mMMOPS pH 7.4，350mM NaCl，10％甘油)两次过夜透析对其进行重折叠。

脂多糖的生产和纯化

通过将单个细菌菌落(参见下表3中所用的菌株)接种至20mL溶源性肉汤(lysogeny broth，LB)并在37℃生长过夜的预培养物，来产生LPS。

表3

将预培养物接种至2L的带挡板烧瓶中，并在摇床上于37℃生长过夜，获得6×1L的培养物。通过以6000×g(Beckman JLA 8.1000转子)离心30分钟收获细菌。根据LPS的类型，进一步的纯化遵循两种不同的方法。

按照Galanos等人(Galanos，Lüderitz和Westphal，1969)描述的实验方案，使用苯酚-氯仿-石油醚提取，纯化粗糙型LPS。收获后，用40mL乙醇洗涤细菌沉淀3次，用丙酮洗涤1次，然后在通风处放置过夜。使用研钵和研杵将干燥的颗粒均质化，并溶解在40ml 90％(W/V)液体苯酚、氯仿和石油醚的混合物中，比例为2:5:8。在摇床上孵育1小时后，未溶解的物质在4200×g下沉淀15分钟，收集上清液。置于通风处4小时除去氯仿和石油醚或直到苯酚开始结晶。通过加热至40℃使溶液重悬，并在搅拌下滴加水(3×5滴)，直到LPS沉淀。将LPS以4200×g沉淀15分钟，并向上清液中加入更多的水以收集任何残留的LPS。用10mL 80％(W/V)苯酚洗涤沉淀两次，并在以100 000×g(Beckman，MLA-50转子)离心1小时之前溶于20mL milliQ水中。将最终的沉淀溶于50mL MilliQ水中，冻干得到纯LPS。

按照Darveau等人(Darveau和Hancock，1983)描述的实验方案纯化光滑型LPS。将细菌洗涤两次，重悬于40mL 10mM Tris-HCl pH 8.0，2mM MgCl₂中，用弗氏压碎器(frenchpress)裂解，随后用超声波破碎。将所得悬浮液与200μg/mL DNase I、50μg/mL RNase A在37℃下搅拌孵育过夜。向15mL悬浮液中加入5mL 0.5M EDTA的10mM Tris-HCL pH 8.0溶液、2.5mL 20％ SDS的10mM Tris-HCl pH 8.0溶液和2.5mL 10mM Tris-HCl pH 8.0溶液，并通过超声处理进一步破碎LPS胶束。溶液在20℃下以39 000×g(Sorval，SS-34转子)离心30分钟，沉淀未溶解的细胞成分，上清液冷冻并冻干。将冻干的粗提取物溶解在少量水中，LPS用2倍体积的冰冷乙醇和0.375M MgCl₂在-40℃下沉淀过夜。将沉淀的LPS在4℃下以11 000×g(Sorvall，SLA-3000转子)离心15分钟，并将所得沉淀在65℃下在相同体积的90％(W/V)苯酚中搅拌重悬30分钟。将混合物以4000×g离心10分钟以加速相的分离。收集水相，用水再次萃取苯酚相。合并水相，用1/4体积的氯仿提取苯酚。将水相置于通风处过夜以蒸发任何残留的有机溶剂，并使用500MWCO透析膜以MQ-水透析3天。将透析过的LPS冷冻并冻干以产生纯LPS。

通过tri cine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳控制分离的LPS产物的纯度(Marolda等人，2006)。

O-抗原多糖的制备

多糖是从野生型鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(光滑)脂多糖中分离出来的，其方法是对连接脂质A和近端KDO糖的糖苷键进行弱酸水解(Raetz和Whitfield，2002a)。将4-5mg/mL鼠伤寒沙门氏菌LPS溶解在10％乙酸中，并在100℃下孵育1小时。通过在4℃下以10 000×g离心30分钟从溶液中除去产生的脂质A，将含有多糖的上清液冷冻并冻干过夜。

酶联免疫吸附试验(ELITA)

Schmidt等人(Schmidt et al.,2016)首次使用完整细菌描述了ELITA试验。本发明修改了试验方法，使其适用于Nunc MaxiSorp 96孔平孔板中的纯化蛋白(如图11所示)。孔中充满在PBS缓冲液中孵育过夜的100μL 10μg/mL的K9-His或K14-His。在用含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS进行2小时封闭步骤后，加入100μL范围从200μg/mL至0.0023μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌LPS稀释液作为结合配体，并孵育1小时。在孔最终与100μL 1:10 000链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(IBA，

)一起孵育1小时之前，加入100μL具有N-末端Strep-/>

II(IBA)的P22尾钉蛋白(P22TSP)1小时，并与2,2’-叠氮基-双3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS，Sigma-Aldrich)一起显色30-60分钟，并使用平板读数器在407nm处读数。在上述每个步骤之间，用含0.1％ BSA的150μL PBS缓冲液洗涤孔3次(在这些实验中省略了Tween-20，因为它干扰试验)。从每个平均信号中减去平均背景信号(0μg/mL LPS)，通过将三次重复的单个标准偏差与正交/>

基线相加来计算误差传播，其中δQ是总和Q的组合的不确定度。剂量-响应曲线和解离常数K_D通过将数据曲线拟合到希尔方程来计算，如下：

/>

其中Y表示被占据的受体结合位点的比例，Ymax表示最大结合，[L]表示游离配体的浓度，n表示结合位点的数量。尽管每个构建体携带两个GCN4-PII基序，但n被视为等于1，因为它们位于蛋白质的相对端，因此不期望它们有协同作用。光滑鼠伤寒沙门氏菌LPS的平均分子量计算为22kDa，假设报道的平均30个O-抗原重复多糖结构(Peterson和McGroarty，1985；Raetz和Whitfield，2002b；Schmidt等人，2016)。

表面等离子体共振实验(实施例1至3)

所有的SPR实验都是在Reichert 2SPR系统上使用PBS-E(PBS pH 7.4+5mM EDTA)运行缓冲液在环境温度下进行的。将蛋白质在pH 4.5的20mM乙酸钠缓冲液中稀释至50μg/mL，并使用NHS-EDC胺连接(Fischer，2010)固定到CMD200传感器芯片(XantecBioanalytics，Duesseldorf，德国)上，达到2000–9000μRIU的响应。在对不同的参考化合物(乙醇胺、BSA、酪蛋白和脱脂奶)进行比较后(Péterfi等人，2000年)，乙醇胺被选为所有实验中参考通道的标准包层。

所有配体通过挤压在运行缓冲液中溶解至1mg/mL(通过70℃的100μm过滤器21次)。实验以50μL/min的流速进行，重复三次。每个样品都注入测量通道和参考通道90秒，然后解离300秒。通过注射再生缓冲液(0.05％(w/w)CHAPS、0.05％(w/w)两性洗涤剂3-12、0.05％(v/v)tween 80、0.05％(v/v)tween 20和0.05％(v/v)triton X-100)2×30秒使芯片再生(Andersson，Areskoug和Hardenborg，1999)。将测量数据导出至TraceDrawer(RidgeView instruments lab)进行处理，并使用Origin(OriginLab corporation)生成最终曲线。使用下面的公式：

将每个构建体的信号标准化为K9，其中S是标准化的信号S0

表面等离子体共振实验(实施例4和5)

在环境温度下，使用PBS-E(PBS pH 7.4+5mM EDTA)运行缓冲液，在NicoyaOpenSPR系统上进行SPR实验。将SadA K9在pH 4.5的10mM乙酸钠缓冲液中稀释至50μg/mL，并使用NHS-EDC胺连接(Fischer，2010)固定至羧基传感器(OpenSPR)以获得700RU的响应。

所有配体通过挤压在运行缓冲液中溶解至1mg/mL(通过70℃的100μm过滤器21次)。实验以35μL/min的流速进行，重复三次。每个样品都注入测量通道和参考通道125s，然后解离300s。通过注射再生缓冲液(0.05％(w/w)CHAPS、0.05％(w/w)两性洗涤剂3-12、0.05％(v/v)Tween 80、0.05％(v/v)Tween 20和0.05％(v/v)Triton X-100)125s使芯片再生(Andersson等，1999)。将测量数据导出至TraceDrawer(RidgeView instruments lab)进行处理，并使用Origin(OriginLab corporation)生成最终图形。

电子显微镜

将样品粘附在测量网格上，用1％乙酸铀酰染色1分钟，并包埋在1.8％甲基纤维素/0.4％乙酸铀酰中。使用Olympus Quemesa相机在80kV下在Philips CM100透射电子显微镜中记录图像。

鲎变形细胞溶解物(LAL)试验

使用LAL试验(Pierce，Thermofisher)测试GCN4-PII对LPS的遮蔽效应。GCN4-PII浓度范围为200μg/mL–20pg/mL，添加0.5内毒素单位每mL LPS(EU/mL)，并按照提供的方案进行实验开发。

圆二色谱

使用Jasco J-810分光旋光计(Jasco International Co)记录光谱。使用1.0cm路径长度的石英比色皿进行测量。每个样品在190-250nm范围内扫描五次，扫描速率为50nm/分钟，带宽为0.5nm。在10mM Tris pH 7.4中，在37℃下，以0、0.5、1、3和9的GCN4-pII与LPS比率记录光谱。使用K2D2计算肽的近似α-螺旋含量。

核磁共振(NMR)光谱学

用于分配的NMR实验在Bel-Art^TM SP Scienceware^TM 5mm O.D.的薄壁精密(ThinWalled Precision)NMR管中进行，该管包含在50mM NaCl、7％ D2O和0.2mM 4,4-二甲基-4-硅戊烷磺酸(DSS)中的450μL 1.5mM合成FMet-GCN4-PII(Genscript，中国)。在308K下在配备有5mm 1H/13C/15N冷冻探针的Bruker Avance II 600MHz NMR光谱仪上获得光谱。DSS用作内部化学位移标准，13C和15N使用(Wishart等人，1995)中所述的频率比作为参考。收集以下光谱用于分配：13C-1H-HSQC，15N-1H-HSQC，1H-1H COSY，1H-1H TOCSY，使用60和80ms的混合时间，以及1H-1H NOESY使用80和100ms的混合时间。使用Topspin 4.0处理所有光谱，使用CARA 1.9.1挑选峰(Keller，2004)。

基于生物素化-脂多糖(B-LPS)的酶联免疫吸附试验

通过在4℃下在PBS缓冲液(Cold spring harbor)中孵育100μl 10μg/mL SadA K9过夜来包被黑色96孔Greiner微孔板。第二天通过孵育150μL含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS来封闭孔。加入4ng/mL至0.06ng/mL范围内的100μL生物素化-LPS稀释液作为结合配体，并孵育1小时。用150μL PBS+0.1％ BSA洗涤平板3次。100μL 1:10 000链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(IBA)处理1小时后，用QuantaRed荧光基质(Thermo)显色15分钟，在Ex:550nm，Em:610nm读取荧光。

实验方案：

1.通过加入100μL 10μg/mL SadA片段溶液来包被96孔黑色Greiner/NuncMaxisorp板，在4℃放置过夜。

2.空孔，用150μL含5％BSA的PBS封闭2小时。

3.用150μL含0.1％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次

4.空孔，加入100μL生物素化-LPS稀释液。

5.用150μL含0.1％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次

6.加入100μL链霉亲和素偶联的HRP(IBA)(在PBS+0.35M NaCl，50mM MgSO₄，0.1％BSA中1:20,000稀释)60分钟

7.用150μL PBS+0.35M NaCl、50mM MgSO₄、0.1％BSA洗涤4次，然后用PBS+0.1％BSA洗涤一次。

8.与Quantared HRP基质一起孵育，15分钟后淬灭。

9.在Ex:550nm，Em:610nm读取荧光。

按照供应商的说明制备所有基质。当从信号中减去背景时，通过将重复的单个标准偏差与正交基线

相加来计算误差传播，其中δQ是总和Q的组合的不确定度。误差线代表一个标准偏差。/>

实施例1–GCN4-PII结合脂质A

旨在研究脂多糖和属于三聚体自体转运粘附素SadA的两个结构域之间推定的相互作用。使用两个早期描述的SadA构建体(Alvarez等人，2008；Hartmann等人，2012)K9和K14，两者都通过侧翼GCN4-PII片段稳定。K9或K14共价连接到SPR芯片上，并注射各种LPS组分。图2提供了LPS结构的示意图，以供参考。

注射光滑型LPS立即产生响应，在注射结束时接近稳定状态(图3的a)。在随后的解离阶段，信号保持在平稳状态，表明没有解离率。注射粗糙型和深度粗糙型LPS变体(图3的b和c)显示了相似的结合曲线，除了在解离阶段信号略有增加，而纯化的多糖没有显示结合特征(图3的d)。

结果显示，所有含有脂质A部分的变体都与GCN4-PII强烈结合，但纯多糖没有，因此将相互作用定位于脂质A部分。然而，缺乏解离率(off-rate)和脂多糖在溶液中形成聚集体的倾向(Sasaki和White，2008；Richter等人，2011)，意味着相互作用的潜在生物物理特征复杂，意味着结果只能定性解释。据认为，注射LPS的粗糙型和深度粗糙型变体后信号的增加与每个变体中存在的糖残基数量成反比。特别是，与具有较长糖部分的LPS相比，深度粗糙型LPS具有显著更高的疏水/亲水比，保持更大、更少流体的形态(Richter等人，2011)。因此，注射后的信号增加被解释为由于与光滑型变体相比，较慢的重组和深度粗糙聚集体的分解。

使用6×His-标签纯化构建体，由于非特异性结合，该标签在纯化过程中具有内毒素消耗作用(Mack等人，2014)。为了评估His-标签对结合的影响，比较了两个GCN4-pII侧翼的SadA构建体，它们除了His-标签之外是相同的(K3和K3-His)。这些曲线彼此之间以及与之前的构建体之间几乎完全相同，表明His-标签对结合没有影响(图10)。

再生溶液的选择有助于确定GCN4-PII之间的相互作用的性质是疏水的、静电的还是两者的组合。在实验之前测试合适的再生缓冲液的过程中，发现1M NaCl没有效果，而总计为0.3％的非变性去污剂混合物在不到60秒内再生样品。这表明在相互作用中涉及强疏水因子。

实施例2-GNC4-PII以高亲和力结合

SPR结果不适用于测定GCN4-pII/LPS相互作用的结合动力学。为了定量亲和力，使用纯化的蛋白质代替完整细菌，对之前(Schmidt等人，2016)描述的ELISA类似的尾钉蛋白(ELITA)试验进行了修改。除了用识别LPS O-抗原的噬菌体尾钉蛋白替换抗体之外，该试验与传统ELISA相似(图11)。结果显示，两种构建体在较低的pM范围内表现出极高的结合亲和力(图5)，这与SPR实验中观察到的零解离率一致。这种设置证明是有利的，因为它能使用低于光滑型LPS临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)的LPS浓度，否则会使解释复杂化(Yu等人，2006；Sasaki和White，2008)。然而，由于LPS倾向于在封闭前包被微量滴定孔，因此不可能建立间接的配体-受体相互作用。

实施例3-GCN4-pII溶解LPS聚集体

观察到向LPS中添加GCN4-PII导致LPS聚集体出现可见的分解。这是通过使用透射电子显微镜比较不同GCN4-pII比率下的粗糙型LPS结构来研究的(图6)。实验之前，使用LAL遮蔽试验(Schwarz等人，2017年)、圆二色谱和NMR证实合成的GCN4-pII与LPS结合，并在结合时保留其α-螺旋结构。NMR光谱证实所述肽以同质的α-螺旋状态存在(图14)，在LPS结合时保留(图12)，并且在1μM的GCN4-pII浓度下对LPS显示出至少89％的中和效应(结合)(图13)。

使用TEM观察到粗糙型LPS形成管状胶束，其半径约为10nm，长度范围可达数百nm(图6，上图)，正如之前使用冷冻-EM所报导的(Richter等人，2011；Broeker等人，2018)。与等摩尔GCN4-PII孵育后，胶束结构完全消失，留下偶见的聚集体，可能是由肽-LPS复合物的轻微聚集引起的(图6，下图)。

结果讨论(实施例1至3)

发明人最初着手研究三聚体SadA结构域与LPS之间的推定相互作用。然而，结果显示，用来稳定构建体的GCN4-pII衔接子对LPS显示出极高的亲和力。有趣的是，K_D在皮摩尔范围内的GCN4-pII的亲和力比人LPS免疫受体TLR4(141μM)、CD14(74nM)、MD-2(2.33μM)和LPS结合蛋白(3.5nM)高3-5个数量级。用GCN4-pII获得的解离常数也比多粘菌素B(48μM)高1-6个数量级，甚至比以最高可实现亲和力为目标而专门设计的肽抗体高1-6个数量级。此外，与上述几种结合配体相反，已表明GCN4-pII对脂质A具有特异性。证明使用洗涤剂时，这种相互作用是可逆的，GCN4-pII很容易溶解溶液中的LPS聚集体，表明这种相互作用在很大程度上是疏水的。据已知，这是关于三聚卷曲螺旋基序结合LPS的首次报告。早先报告的含有GCN4-pII的晶体结构(Hartmann等人，2012)表明，属于核心异亮氨酸的γ2和δ碳从核心突出，沿卷曲螺旋凹槽形成疏水表面。可以相信，一条或多条脂质A酰基链可以沿着这些凹槽排列，形成极强的相互作用，这一模型也解释了GCN4-pII如何分解LPS聚集体。然而，GCN4-pII也有一个阳离子残基的C-末端碎片，这些也可能有助于相互作用。

实施例4–基于ELISA的GCN4-pII的灵敏度

本实验的目的是表明，原则上如GCN4-PII的寡聚蛋白与LPS的结合，可以以与LAL试验以相同或相似的灵敏度检测LPS的量。如在前述实施例中，使用了基于SadA的构建体，特别是上述的K9构建体。

为了确保试验的完全重现性，灵敏度实验在最终优化条件下重复进行了4次。为了抵消边缘效应，仅使用内部随机孔。唯一的例外是A3:A10，保留给最高浓度的样品。随后用LAL试验检测相同的样品进行比较。结果中仅包含一个重复。

在基于GCN4-pII的ELISA中使用生物素化-脂多糖(B-LPS)进行检测(图15)，在0.06–1ng/mL LPS浓度范围内观察到线性信号响应，这意味着该试验可以持续检测到最低稀释度(0.06ng/mL)的B-LPS。

还进行了LAL试验进行比较。LAL试验中使用的LPS浓度范围为0.01–0.1EU/mL。产生清晰信号的最低稀释度为0.13ng/mL(图16)，这意味着基于GNC4-pII的实验具有与LAL试验相当的灵敏度。两种试验结果的比较如图17所示。

实施例5–GCN4-pII和LPS之间结合的稳健性

为了研究GCN4-pII和不同LPS类型之间结合的稳健性，使用SPR来检查从各种病原体和变形菌收集的广泛选择的LPS变体(表4)。简而言之，使用基于EDC-NHS的胺连接将K9固定到SPR芯片上的羧基基质上。注射0.5mg/mL不同类型的LPS，重复三次，以观察信号。

表4

在早期的工作中，发明人比较了来源于γ-变形菌，即肠道沙门氏菌、鸭沙门氏菌和大肠杆菌BL21的LPS的结合。注射LPS立即产生响应，接近注射结束时达到稳定状态。在随后的解离阶段，信号保持在平稳状态，表明没有可测量的解离率。尽管不同的曲线具有非常相似的形状，但最终响应(μRIU)在它们之间有所不同，与每个LPS分子的糖部分的量成反比。这意味着粗糙LPS类型(缺乏O-抗原)通常比它们对应的光滑LPS(具有O-抗原重复)显示明显更强的信号。由于所有LPS类型都以相同的重量浓度(mg/mL)注射，响应的差异可能反映了高分子量变体的较低摩尔浓度。

在当前工作中检查的LPS类型的结合曲线(图18)都具有相似的结合曲线，没有解离率，表明具有强结合性。鼠伤寒沙门氏菌WaaL LPS是一种粗糙型，预计在注射后会产生中等程度的高响应。乳糖奈瑟球菌(N.lactamica)和汉赛巴尔通体(B.henselae)都是较大的粗糙型变体，预计产生与WaaL相同范围的响应，然而，乳糖奈瑟球菌响应的反应几乎是WaaL的两倍，这可以通过对核心糖的大量唾液酸修饰来解释。霍乱弧菌(V.cholerae)具有粗糙型和低分子量光滑型脂多糖的混合物。因此，具有WaaL信号的1/3左右的响应是在预期之内的。牙龈卟啉单胞菌LPS的响应较低，表明是中到大的光滑LPS类型。商业获得的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)LPS附带的文件没有对菌株或变体命名，因此重量必须通过SDS-PAGE确认。

总之，GCN4-pII与所有被测试的LPS类型结合。

结果讨论(实施例4和5)

LAL试验使用鲎血液中的酶级联(Lee，2007)，鲎对低量的LPS高度敏感。在直接比较中使用LAL试验，我们能够显示GCN4-pII肽能够以LAL试验几乎检测不到的浓度结合生物素化的LPS，并且当使用常规检测方法检测与荧光酶底物偶联的生物素时，这种结合仍然产生可见的信号。重要的是，这种检测方法适用于不同的缓冲液背景，也适用于可注射药物背景。我们已经实现了0.01EU/mL LPS的灵敏度，这与LAL试验相当，并且我们的数据表明，使用我们的ELISA类似试验，例如通过微调洗涤缓冲液条件，可以实现甚至更高的灵敏度。

使用了来自变形菌不同分支的LPS变体，从α-变形菌到γ-变形菌，以及来自拟杆菌门(Bacteroidetes)(图19)。选择包括肠道病原体(霍乱弧菌，沙门氏菌属，大肠杆菌，Vibrio cholerae，Salmonella spp.，Escherichia coli)、细胞内病原体(汉赛巴尔通体，Bartonella henselae)和口腔病原体(牙龈卟啉单胞菌，Porphyromonas gingivalis)，以及共生细菌(乳糖奈瑟球菌，Neisseria lactamica)。所用的物种之一已知具有不引起强烈免疫反应的LPS变体(汉赛巴尔通体，Bartonella henselae)(

等人，2004)。

沙门氏菌属(Salmonella spp.)位于埃希氏菌属(Escherichia)中，在图19所示的树中没有单独显示。巴尔通体(Bartonella spp.)最接近展示的布鲁氏菌(Brucella)，牙龈卟啉单胞菌是该图中拟杆菌门(Bacteroides)的一部分。此外，厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和螺旋体门(Spirochaetes)的大类没有LPS作为其膜成分的一部分。

总的来说，使用SPR，我们能够显示所有使用的LPS变体都与GCN4-pII肽强烈结合。虽然在结合的“结合率(on-rate)”上有明显的差异，但是对于任何LPS变体都没有可检测的“解离率(off-rate)”，这表明该肽可以以相似的方式检测所有这些变体(尽管在结合动力学上有轻微的差异)。

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SEQUENCE LISTING

<110> 奥斯陆大学

<120> 与寡聚脂多糖结合蛋白有关的用途、方法和产品

<130> 27.11.148506/01

<150> GB 2009730.9

<151> 2020-06-25

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 七肽重复序列

<400> 1

Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr

1 5 10 15

His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Lys

20 25 30

Claims (33)

1.一种寡聚蛋白作为结合剂用于结合脂多糖(LPS)的用途，所述寡聚蛋白具有包含至少两个单体肽的卷曲螺旋结构，其特征在于，每个所述的单体肽可以相同或不同，能够形成α-螺旋，并包含至少一个与SEQ ID NO:1的七肽重复序列具有至少60％的序列同一性的核心序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核心序列包括至少3个七肽基序a-b-c-d-e-f-g或其变体，每个变体包括不超过1个对所述七肽基序的插入或缺失。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，对应于所述七肽基序或其变体的位置a和d的至少50％的氨基酸残基为疏水性残基。

4.如权利要求1至3任一项所述的用途，其特征在于，所述核心序列的一侧或两侧为侧翼氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述侧翼序列包含一个或多个七肽基序，和/或其一个或多个部分；优选地，其中所述侧翼序列中的七肽基序对应于SEQ ID NO:1中的七肽基序，或为与SEQ ID NO:1中的七肽基序具有至少80％序列同一性且所述七肽基序中的氨基酸残基a和d中的至少一个为疏水性残基的序列。

6.如权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述侧翼序列包含SEQ ID NO:1或其一部分，或与其具有至少50％序列同一性的序列，其中对应于SEQ ID NO:1的所述七肽基序或其变体的位置a和d的至少50％的氨基酸残基为疏水性残基。

7.如权利要求3至6任一项所述的用途，其中所述侧翼序列包含一个或多个连接序列。

8.如权利要求1至7任一项所述的用途，其特征在于，所述单体肽各自包含两条或多条核心序列，所述核心序列可以相同也可以不同。

9.如权利要求1至8任一项所述的用途，其中所述寡聚蛋白为二聚体、三聚体或四聚体。

10.如权利要求1至9任一项所述的用途，其中所述寡聚蛋白为三聚体。

11.如权利要求1至10任一项所述的用途，其中所述单体肽作为单独的链提供。

12.如权利要求1至10任一项所述的用途，其中所述单体肽连接在一起。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述单体肽连接成单链或其中所述单体肽通过一个或多个化学交联连接。

14.如权利要求1至13任一项所述的用途，其中所述七肽基序或其变体中的每个疏水性残基独立地选自由亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸，及其化学衍生物组成的组。

15.如权利要求14所述的用途，其中每个疏水性残基独立地选自亮氨酸和异亮氨酸，或其化学衍生物。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述化学衍生物为氟亮氨酸或氟异亮氨酸。

17.如权利要求1至16任一项所述的用途，其中至少50％的疏水性残基为异亮氨酸或氟代异亮氨酸。

18.如权利要求1至17任一项所述的用途，其中：

(i)至少50％对应于所述七肽重复或其变体中b、c、e、f和g位置的氨基酸残基是极性残基；和/或

(ii)至少5％对应于所述七肽重复或其变体中b、c、e、f和g位置的氨基酸残基是脂肪族残基。

19.如权利要求1至18任一项所述的用途，其中每个单体肽包含18至40个氨基酸。

20.如权利要求1至19任一项所述的用途，其中每个单体肽在所述核心序列内包含至少4个阳离子氨基酸。

21.如权利要求1至20任一项所述的用途，其中所述寡聚蛋白以纳摩尔或更低尺寸范围内的K_D结合LPS。

22.如权利要求1至21任一项所述的用途，其中所述寡聚蛋白为：

(i)以与一个或多个附加成分的偶联物或融合物的形式；

(ii)固定在固体基质上；或者

(iii)偶联到可直接检测的检测部分。

23.如权利要求22所述的用途，其中：

(i)所述蛋白与检测部分、寡聚化部分或固定部分偶联，或呈具有融合配体的融合蛋白形式；

(ii)所述蛋白被固定在珠子或树脂上，或固定在孔或容器内部或上面，或固定在柱子或过滤材料上，或固定在检测装置的表面上；或者

(iii)所述检测部分为分光光度法或光谱法可检测的标记。

24.如权利要求23中任一项所述的用途，其中所述寡聚蛋白的用途包括检测和/或去除样品中的LPS。

25.一种结合LPS的方法，所述方法包括将LPS或含有LPS的样品与如权利要求1至23任一项所定义的寡聚蛋白接触，使蛋白与LPS结合形成蛋白-脂多糖复合物。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述方法进一步包括检测样品中LPS的存在，所述方法包括：

(a)使样品与如权利要求1至23任一项所定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白与LPS结合形成蛋白-脂多糖复合物；

(b)检测蛋白-脂多糖复合物的存在。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述方法进一步包括从样品中去除LPS，所述方法包括：

(a)使样品与如权利要求1至23任一项所定义的寡聚蛋白接触，以使蛋白与LPS结合形成蛋白-脂多糖复合物；

(b)从样品中分离肽-脂多糖复合物。

28.如权利要求25至27任一项所述的方法，其中所述寡聚蛋白呈包含可检测标记的偶联物的形式和/或其中所述寡聚蛋白被固定在固体基质上。

29.如权利要求25至28任一项所述的方法，其中，所述样品为来自患者的临床样品或用于检测内毒素污染的产品样品。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述样本为血液样本，或源自血液样本的样本。

31.一种试剂盒，所述试剂盒包括；

(i)如权利要求1至17任一项所定义的寡聚蛋白；和

(ii)至少一种非变性洗涤剂。

32.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于如权利要求1至24中任一项所述的用途，或用于如权利要求25至30任一项所述的方法中。

33.一种包含固定在固体基质上的寡聚蛋白的产品，其中所述寡聚蛋白如权利要求1至21任一项所定义。

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