TW202208401A - 與寡聚脂多醣結合蛋白質相關之用途、方法及產物 - Google Patents

Abstract

本文提供並描述寡聚蛋白質作為結合劑結合至脂多醣(LPS)之用途，該寡聚蛋白質具有包含至少兩個單體肽之捲曲螺旋結構，其中每個單體肽可以相同或不同，能夠形成α-螺旋且包含至少一個與SEQ ID NO.1之七肽重複序列具有至少60%序列一致性的核心序列。本文亦提供並描述結合、偵測及移除LPS之方法，以及包含該寡聚蛋白質之產物。

Description

與寡聚脂多醣結合蛋白質相關之用途、方法及產物

本文描述具有捲曲螺旋結構之寡聚蛋白質作為結合劑結合至脂多醣(LPS)之用途。本文亦描述結合、偵測及移除LPS之方法，以及包含該寡聚蛋白質之產物。

脂多醣，又稱為內毒素(術語「LPS」與「內毒素」在本文中可互換地使用)係革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)之外膜的必要組分。其係由三個結構組分構成：脂質A部分；核心寡醣；及O-抗原。脂質A組分包含具有四個O-連接之醯基鏈及兩個N-連接之醯基鏈的兩個磷酸葡糖胺分子，該等分子嵌入細菌外膜中並因此將LPS錨定至細菌膜中。核心寡醣(COS)係一種由多種糖構成的非重複結構，且經由糖苷鍵連接至脂質A。最後，O-抗原係由在4個至40個單元之間之四糖單體重複結構構成的聚合物，其中存在平均30個重複結構(Peterson及McGroarty, 1985)。O-抗原連接至在脂質A之相對端處的COS之倒數第二個糖，不過在LPS之一些形式中，不存在O-抗原。缺乏O-抗原之LPS傳統上稱為『粗糙(rough)』LPS，與野生型『光滑(smooth)』LPS相對(Hitchcock等人, 1986)。

LPS之脂質A組分及與其最接近之糖在革蘭氏陰性細菌物種間高度保守，而其餘的核心寡糖及O-抗原保守性明顯較低，且可在各細菌物種之間且甚至在各血清型之間變化(Bertani及Ruiz, 2018)。

由於脂質A有活化鐸樣受體(toll-like receptor) 4且因此誘導極端免疫反應之傾向，其可能在低至每公斤體重1 µg之劑量下引起敗血症及中毒性休克，故內毒素對於動物，特別是人類毒性極大。歸因於生物環境中革蘭氏陰性細菌之全在(omnipresence)，內毒素成為製造藥品、疫苗以及實驗室設備及試劑中之常見雜質。鑒於與內毒素污染相關聯之潛在健康影響，在使用之前儘可能地移除欲用於人類消費之產物中可能存在的任何內毒素至關重要。

目前有多種用於內毒素移除之方法及產物可用。對於實驗室使用，此等方法及產物包括裝填有樹脂之旋轉柱過濾器或流動式管柱，該樹脂連接至一或多個內毒素結合分子。樣本可施加至此等過濾器或管柱，且內毒素結合分子將結合至存在之任何內毒素，由此將其自樣本移除。已知可用於此等產物中之內毒素結合分子包括脂質A結合之抗生素多黏菌素B及聚離胺酸聚合物，該等聚離胺酸聚合物經由靜電相互作用結合內毒素。然而，此等目前可得到的內毒素結合分子存在一些問題。取決於所討論之細菌菌株，多黏菌素B具有報導的僅在微莫耳濃度範圍內之結合親和力，使其不適合結合至及移除樣本中之低濃度內毒素。同時，聚離胺酸具有極高正電荷，且因此與脂質A之帶負電磷酸根及核心寡醣之糖以一種非特異性方式相互作用。因此，此作用機制不適合於在所有pH值下使用或不適合用於所有LPS類型。另外，其亦可能與樣本中可能存在之其他帶負電分子相互作用，且因此移除該等帶負電分子。

其他方法包括離子交換層析法。此法在醫藥行業中常用於純化醫藥產品，且通常依賴於帶負電之LPS與帶正電之固定配體之間的靜電相互作用。然而，使用離子交換層析法移除帶大量電荷之樣本中的內毒素可能存在問題。舉例而言，若樣本含有帶大量正電之粒子，則此等粒子將與固定之配體競爭捕捉LPS。相反地，若樣本含有帶大量負電(非LPS)之粒子，則此等粒子將與LPS競爭結合至固定之配體。在兩種情況下，此等不想要的反應會降低LPS移除之效率。作為離子交換層析法之基礎的靜電相互作用在具有高離子強度之樣本中亦可能受到破壞，且因此，此等方法不適於所有情形。

除移除樣本中之內毒素外，亦希望能夠偵測內毒素，由此可證明治療產物、裝置、試劑等為「不含內毒素」的，且因此可安全地用於治療應用。就此而言，當前最常用的偵測內毒素之方法係鱟變形細胞溶菌液(Limulus amebocyte lysate，LAL)分析。LAL分析被FDA及EFSA批准用於偵測醫療產品及治療產品中之內毒素，且其偵測範圍低至1皮莫耳濃度(0.1 EU/mL)之濃度。此分析使用在鱟(Limulus )屬馬蹄蟹血液中發現的變形細胞之溶菌液，其含有蛋白質及酶之複雜混合物。確切地說，LAL分析係基於在LPS結合後觸發之酶「(鱟凝血)因子C」(通常簡稱為因子C)的活性。因子C係一種胰蛋白酶型絲胺酸蛋白酶，其活化下游酶反應之複雜級聯，最終提供LPS存在之指示。不過，此反應級聯亦可經β-葡聚糖活化，β-葡聚糖通常在多種細菌、真菌及植物中發現。因此，β-葡聚糖會在LAL分析中引起假陽性結果。另外，變形細胞溶菌液的製造極其昂貴，且當前的製造方法係不可持續的。

馬蹄蟹之過度捕撈使得需要開發用於內毒素偵測之替代方法。已開發出類似的分析，該分析使用重組表現之因子C來裂解發色受質，由此允許更直接地偵測LPS。然而，歸因於組成之複雜性，價格仍極高。

另外，因子C之活性可例如因溫度或pH之變化、變性化合物諸如有機溶劑、脲或強清潔劑以及習知蛋白酶抑制劑而容易地破壞。不同因子C製劑之間亦會存在批次間變化。此使得該酶難以發揮作用，且意味著利用依賴於因子C之LAL分析獲得的結果通常並非特別一致或可再現的。

LPS偵測中影響所有偵測方法的另一個問題係LPS聚集之傾向。此項技術中已知，內毒素分子往往會在水溶液中形成聚集物。此聚集因溶液中陽離子(特別是二價陽離子，諸如Ca²⁺ 及Mg²⁺ )的存在以及可在LPS周圍形成微胞之清潔劑的存在而增加。此聚集具有減少溶液中可量測之LPS之量的作用，且因此抑制低濃度LPS之偵測。此作用稱為「LPS遮蔽(LPS masking)」，且可由眾多不同的試劑引起。舉例而言，在血液樣本中，有許多化合物可遮蔽LPS，諸如LPS結合蛋白質、抗LPS抗體及二價陽離子。此外，來自不同細菌源之內毒素分子可具有不同分子量，且可展現不同的聚集行為，由此當量測相同濃度的來自不同源之LPS時，得到不同的結果。因此，提供可用於移除或偵測LPS的改良之LPS結合劑可為有用的。

本發明者已開發出一種新穎LPS結合劑，其呈具有α-螺旋捲曲螺旋結構之寡聚蛋白質形式。

本文所揭示之新LPS結合劑係基於可在酵母轉錄因子GCN4中發現之α-螺旋捲曲螺旋結構，其中該蛋白質之短C末端伸長段形成非常穩定的二聚體捲曲螺旋結構，稱為白胺酸拉鏈。

因此，在第一態樣中，本文提供寡聚蛋白質作為結合劑結合至脂多醣(LPS)之用途，該寡聚蛋白質具有包含至少2個單體肽之捲曲螺旋結構，其中每個單體肽可以相同或不同，能夠形成α-螺旋且包含至少一個與SEQ ID NO.1之七肽重複序列具有至少60%序列一致性的核心序列。

與包含兩親性α-螺旋(或α-螺旋股)或由其構成之捲曲螺旋蛋白質的特有特徵一致，寡聚捲曲螺旋蛋白質具有疏水性核心。該疏水性核心包含在疏水性核心結構中面向彼此之疏水性殘基。

因此，確切地說，肽單體之核心序列可包含至少3個七肽模體a-b-c-d-e-f-g或其變異體，每個變異體包含對該七肽模體之不超過1個插入或缺失。另外，在一個實施例中，至少50%的對應於七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。在另一個實施例中，至少75%的對應於七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。

因此，在此態樣之一個實施例中，本文提供寡聚蛋白質作為結合劑結合至脂多醣(LPS)之用途，該寡聚蛋白質具有包含至少2個單體肽之捲曲螺旋結構，其中每個單體肽可以相同或不同，能夠形成α-螺旋且包含至少一個與SEQ ID NO.1之七肽重複序列具有至少60%序列一致性的核心序列，其中該核心序列包含至少3個七肽模體a-b-c-d-e-f-g，或其變異體，每個變異體包含對該七肽模體之不超過1個插入或缺失，其中至少50%的對應於該等七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。

捲曲核心蛋白之疏水性核心的胺基酸殘基組成不必完全或僅僅為疏水性殘基，且可存在其他殘基，包括親水性殘基，例如極性殘基。因此，在某些實施例中，至少52.5、55、60、62.5、70或75%的對應於該等七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。

在第二態樣中，本文提供一種結合LPS之方法，該方法包含使該LPS或含有LPS之樣本與如本文所定義寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS形成蛋白質-脂多醣複合物。

在一個實施例中，該方法係活體外方法。

在第三態樣中，本文提供一種套組，其用作結合至如本文所定義之LPS的結合劑或用於結合如本文所定義之LPS的方法中，該套組包含： (i)如本文所定義之寡聚蛋白質；及 (ii)至少一種非變性清潔劑。

本文中之用途及方法可用於偵測樣本中之LPS及/或自樣本移除LPS。

歸因於以高親和力結合至眾多內毒素之能力，本發明之寡聚蛋白質適用於涉及內毒素結合、偵測及移除之多種應用。就此而言，本發明之寡聚蛋白質可固定於固體基底上。寡聚蛋白質可例如固定於用於管柱或過濾器，例如旋轉柱過濾器或流動式管柱中之樹脂上，以結合至並移除施加至該過濾器或管柱上之樣本中的內毒素，如在以上所概述之內毒素移除方法中。寡聚蛋白質亦可用於內毒素偵測系統中，以偵測給定樣本中內毒素之存在，以及在未偵測到內毒素情況下，證明樣本、試劑、產物等為不含內毒素的。就此而言，寡聚蛋白質可以與第二組分之結合物或融合物形式，諸如呈與偵測部分體之結合物，或與適合融合搭配物之融合蛋白質形式提供，以促進內毒素之偵測。

在第四態樣中，本文提供一種產物，其包含固定於固體基底上的如本文所定義之寡聚蛋白質。

如上所指出，應理解，如本文所定義之寡聚蛋白質經由脂質A組分與LPS相互作用。因此，在第五態樣中，本文提供如本文所定義之寡聚蛋白質作為結合劑結合至LPS之脂質A的用途。

類似地，在第六態樣中，本文提供一種結合LPS之脂質A的方法，該方法包含使該脂質A或含有脂質A之樣本與如本文所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該脂質A形成蛋白質-脂多醣複合物。

在第七態樣中，本文提供一種套組，其用作結合至如本文所定義之脂質A的結合劑或用於結合如本文所定義之脂質A的方法中，該套組包含： (i)如本文所定義之寡聚蛋白質；及 (ii)至少一種非變性清潔劑。

本文所描述之寡聚蛋白質提供用於結合至LPS之替代性結合劑。在一個實施例中，本文中之揭示內容提供一種改良的LPS結合劑。

本文中之LPS結合劑具有許多優勢。此外，可看出其解決以上概述的與已知之LPS結合及偵測方法相關聯之多個問題。

就LPS偵測而言，本文所描述之寡聚蛋白質不需要使用自馬蹄蟹收集之昂貴溶解產物，且避免與依賴於使用因子C之LPS偵測方法諸如LAL分析及其重組變異體的使用相關聯之一致性及再現性問題。

此外，本文所描述之寡聚蛋白質能夠溶解LPS聚集物。因此，寡聚蛋白質可減少LPS遮蔽且有效地增加包含該等LPS聚集物之樣本中LPS之可量測濃度。此允許偵測樣本中低濃度之LPS。

本文所描述之寡聚蛋白質包含相對較短的肽序列，且因此在一些實施例中，其可以合成方式製造，無需任何生物表現系統。

本文所揭示之寡聚蛋白質具有寡聚α-螺旋捲曲螺旋結構。捲曲螺旋係由捲繞成超螺旋束的兩個或多於兩個兩親性α-螺旋組成的普遍存在之蛋白質元件(Lupas及Gruber, 2005)。兩親性α-螺旋捲曲螺旋之關鍵特徵係重複七肽模體a-b-c-d-e-f-g，其中位置a及d主要被疏水性殘基佔據，且位置b、c、e、f及g主要被親水性殘基佔據。α-螺旋包含每個轉角3.6個殘基，意味著重複七肽模體將該等殘基置於螺旋結構同一面上的位置a及d中。此促進高穩定性超螺旋之形成，其中疏水性殘基面朝彼此，稱為疏水性核心，而親水性殘基面向外。應注意，儘管捲曲螺旋蛋白質之疏水性核心通常主要包含疏水性殘基，但核心結構中之所有殘基不必均為疏水性的，且已知捲曲螺旋蛋白質可包含位於核心結構中之其他殘基，例如極性殘基，而其仍然能夠保持捲曲螺旋結構。

本文中之寡聚蛋白質係基於蛋白質GCN4之白胺酸拉鏈序列的變異體，稱為GCN4-pIL，其中GCN4-p『ad』係指存在於七肽模體中之位置a及d處的胺基酸。已展示，藉由使存在於位置a及d處之疏水性核心殘基突變，特別是藉由變化存在於此等位置處之白胺酸及異白胺酸殘基的比率，可將蛋白質結構之較佳寡聚狀態自二聚體變為三聚體(GCN4-pII)及四聚體(GCN4-pLI)(Harbury等人, 1993；Delano及Brünger, 1994)。

此等捲曲螺旋元件之穩定性及其形成寡聚物之傾向使得使用GCN4捲曲螺旋結構作為嵌合延伸部(亦即，融合搭配物)以誘導寡聚化並使融合蛋白質之寡聚結構穩定，且增加該等蛋白質之溶解性。就此而言，本發明者最初意欲研究推定的LPS與屬於三聚體自轉運黏附素SadA之兩個域之間的相互作用。為了研究此蛋白質，製備出兩個SadA構築體，即K9及K14 (參見以下實例1)，該兩個構築體藉由側接GCN4-pII區段而穩定。然而，意外地發現，用於使SadA構築體穩定的GCN4-pII轉接子對LPS展示出極高的親和力，其K_D 在奈莫耳濃度範圍內。

在此偶然發現之研究結果之後，本發明者已開發出一種基於GCN4-pII蛋白質的具有捲曲螺旋結構之寡聚蛋白質，其能夠用作結合劑結合至LPS。進一步實驗揭露，此蛋白質與LPS之間之相互作用係經由該蛋白質與LPS之脂質A組分之結合發生。如上所指出，脂質A組分之結構在革蘭氏陰性細菌物種間高度保守，且因此，應理解，本發明之寡聚蛋白質能夠以極高親和力結合至眾多細菌內毒素。另外，本發明之寡聚蛋白質可在典型表現系統中以重組方式過度表現且可在不與任何天然存在之內毒素相互作用的情況下自包涵體純化，由此允許大規模、可持續且有成本效益的製造。

本文所描述之寡聚蛋白質包含至少2個單體肽。此等單體肽表示整體構成寡聚蛋白質之個別次單元。每個單體均能夠形成α-螺旋。就獨立肽鏈或股而言，該等單體可作為獨立肽提供，其一起相互作用而形成寡聚蛋白質。因此，在此類實施例中，肽單體可被視為蛋白質之個別次單元，亦即，獨立的單體肽單元。因此，在一些實施例中，寡聚蛋白質中之每個α-螺旋可視為對應於獨立單體。

在其他實施例中，單體肽可連接在一起。因此，單體肽可藉由連接子序列連接或連結。在此類實施例中，就一級結構或序列而言，寡聚蛋白質具有單鏈型式，但當然，單體肽相互作用而形成寡聚捲曲螺旋結構，可看出該結構具有相互作用形成捲曲螺旋結構的「股」。在此類實施例中，單體肽可被視為單鏈蛋白質序列之域。更確切地說，可看出寡聚蛋白質具有由單體肽域構成之3D結構。

每個單體肽包含至少一個核心序列，其與SEQ ID NO:1之七肽重複序列具有至少60%序列一致性。SEQ ID NO:1表示模型肽GCN4-pII之序列的變異體，其係基於來自GCN4蛋白質C末端中之二聚化模體的序列，且包含重複七肽模體a-b-c-d-e-f-g，其中異白胺酸殘基存在於該模體中之位置a及d處，如下文所示。在一些實施例中，核心序列可與SEQ ID NO:1具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，核心序列可包含SEQ ID NO:1之序列或由該序列組成。

序列一致性可藉由此項技術中已知之任何適合手段測定，例如使用SWISS-PROT蛋白質序列資料庫，使用FASTA pep-cmp，利用可變之pamfactor，以及設定為12.0之空位產生罰分及設定為4.0之空位延伸罰分，及2個胺基酸之窗測定。用於測定胺基酸序列一致性之其他程式包括來自威斯康辛大學(University of Wisconsin)之Genetics Computer Group(GCG)第10版套裝軟體之BestFit程式。該程式使用Smith及Waterman之局部同源性演算法，利用以下預設值：空位產生罰分-8，空位延伸罰分=2，平均匹配數=2.912，平均錯配數=-2.003。在一個實施例中，該比較係在核心序列之全長內進行。

可以看出，SEQ ID NO:1包含a-b-c-d-e-f-g七肽模體之多個重複。如上文所描繪，a及d殘基係I。然而，如下文更詳細地論述，其可變化，且在一個實施例中，其可為I或L，或其衍生物，或其他疏水性殘基。如上所指出，並非七肽模體中的所有a及d殘基皆需為疏水性的。存在足夠疏水性殘基用於形成寡聚捲曲螺旋結構足以。此可取決於序列背景，以及存在於單體肽之序列中的其他殘基。

在一個實施例中，每個單體肽之核心序列包含至少3個七肽模體a-b-c-d-e-f-g，或其變異體。儘管七肽模體習知地書寫為a-b-c-d-e-f-g，但實際上，核心序列中之七肽重複序列不需要以位置a開始。該模體以位置a在位置g之後重複，且因此七肽模體可在任何位置處開始，只要其包含呈連續次序的全部7個位置a-b-c-d-e-f-g即可。因此，模體d-e-f-g-a-b-c係例如有效的七肽模體。

在一些實施例中，核心序列可包含七肽模體a-b-c-d-e-f-g之一或多個變異體，其中每個變異體包含對該七肽模體之不超過一個插入或缺失。此等包含插入或缺失的七肽模體a-b-c-d-e-f-g之變異體統稱為「變異體模體」。在此情形中，術語「插入」及「缺失」分別係指將單一殘基添加至該七肽模體中及自該七肽模體移除單一殘基。

插入或缺失可在七肽模體內之任何位置處進行，包括該七肽模體之任一端處。舉例而言，考慮到將殘基X插入模體a-b-c-d-e-f-g中，所得模體可為X-a-b-c-d-e-f-g、a-X-b-c-d-e-f-g、a-b-X-c-d-e-f-g等。重要的是，可以看出，該模體內其餘位置之標記保持不變。此適用於插入及缺失兩種情形。因此，若例如在位置b處之殘基缺失，則其餘模體將包含序列a-c-d-e-f-g。

多個連續殘基之插入或缺失不被視為一個插入或缺失。因此，相較於存在之變異體模體的總數，各核心序列中存在之至少三個七肽模體或變異體模體不必含有較多的對七肽模體a-b-c-d-e-f-g之插入及缺失。若插入或缺失係在連續變異體模體之相鄰端處，且若連續變異體模體各自僅包含一個插入或缺失，則僅容許在核心序列中彼此相鄰之插入或缺失。在此類情況下，可以看出，相鄰插入/缺失係兩個獨立變異體模體中兩個獨立插入/缺失之產物。

在一些實施例中，核心序列包含至少4個七肽或變異體模體。在一些實施例中，核心序列包含3至5個七肽或變異體模體。舉例而言，核心序列可包含3、4或5個七肽或變異體模體。在一些實施例中，核心序列可包含至少3個七肽模體，且無變異體模體。在其他實施例中，核心序列可包含至少3個變異體模體，且無七肽模體。另外，核心序列可包含至少3個七肽模體及變異體模體之任何組合，且此等七肽及變異體模體可按任何次序佈置。

如上文所論述，捲曲螺旋蛋白質結構取決於各α螺旋中存在之重複七肽模體內疏水性殘基之協同佈置。各α螺旋內之疏水性殘基定位成使其主要呈現在該α螺旋之單一面上。替代地，各α螺旋內之殘基係佈置成使得呈現於該α螺旋之一面上的殘基主要為疏水性的。此允許寡聚蛋白質中各α螺旋之疏水面在蛋白質結構之中心中形成穩定疏水性核心。疏水性殘基存在於七肽模體之每個重複序列內的位置a及位置d處並非必需的，但通常，此等位置之絕大部分被疏水性殘基佔據。為了促進本文所定義之寡聚捲曲螺旋蛋白質中之此結構，在一個實施例中，在核心序列內，至少50%的對應於七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。如以上示意圖中所示，SEQ ID NO:1中之七肽模體的位置a及d係由該序列之位置4、8、11、15、18、22、25及29表示。因此，可以看出，作為替代定義，至少50%的在對應於SEQ ID NO.1之位置4、8、11、15、18、22、25及29之位置處的胺基酸殘基係疏水性殘基。因此，在一個實施例中，SEQ ID NO.1之七肽重複序列中8個「a」或「d」位置中之至少4個係疏水性殘基。

更確切地說，至少52.5%、55%、60%、62.5%或70%的對應於SEQ ID NO.1之七肽重複序列中七肽模體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性的。然而，在一個代表性實施例中，至少75%的對應於SEQ ID NO.1之七肽重複序列中七肽模體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性的。因此，在一個實施例中，SEQ ID NO.1之七肽重複序列中8個「a」或「d」位置中之至少6個係疏水性殘基。

藉助於代表性實例，在SEQ ID NO.1之序列中，至少4個、5個、6個或7個a或d殘基或對應於SEQ ID NO.1之位置4、8、11、15、18、22、25及29之位置可為疏水性殘基。

基於捲曲螺旋蛋白質結構及序列之知識，進行序列修飾將在熟習此項技術者之常規技能範圍內，包括相對於七肽模體中其他位置，在位置a及d處之殘基的取代，由此基於SEQ ID NO.1之經修飾或變異體肽獲得捲曲螺旋結構。

如本文所使用，術語「疏水性殘基」包括此項技術中識別或鑑別為疏水性的任何胺基酸殘基。該等胺基酸包括以下蛋白質胺基酸：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸及甘胺酸。然而，在一個實施例中，疏水性殘基係選自胺基酸白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸或其化學衍生物。在另一個實施例中，疏水性殘基係選自：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸及甲硫胺酸，以及此等胺基酸之化學衍生物。核心序列中存在之疏水性殘基亦可包括非習知疏水性胺基酸，亦即，具有並非由標準遺傳密碼編碼之側鏈的疏水性胺基酸。確切地說，包括此等胺基酸之氟代衍生物，諸如氟代異白胺酸及氟代白胺酸。其他已知衍生物包括硒代衍生物，例如硒代甲硫胺酸。此類非習知疏水性胺基酸之其他實例，包括如以上所定義之習知疏水性胺基酸的D-胺基酸變異體(其中包括D-胺基酸，所有胺基酸均可為D-胺基酸)、L-N甲基胺基酸變異體、D-α甲基胺基酸變異體及D-N-甲基胺基酸變異體，列於下表1中。 表1 ________________________________________________________________________ 非習知胺基酸                        密碼                  非習知胺基酸                           密碼 ________________________________________________________________________ α-胺基丁酸                            Abu                   L-N-甲基丙胺酸                                                                          Nmala α-胺基-α-甲基丁酸酯           Mgabu               L-N-甲基異白胺酸                                                                      Nmile 胺基環丙烷-甲酸酯              Cpro                  L-N-甲基白胺酸                                                                          Nmleu L-N-甲基纈胺酸                                                                          Nmval 胺基異丁酸                            Aib                    L-N-甲基乙基甘胺酸                                                                  Nmetg 胺基降𦯉基-甲酸酯              Norb                  L-N-甲基甲硫胺酸                                                                      Nmmet L-N-甲基正纈胺酸                                                                      Nmnva α-甲基-γ-胺基丁酸酯            Mgabu               L-N-甲基正白胺酸                                                                      Nmnle γ-胺基丁酸                            Gabu                 L-N-甲基-三級丁基甘胺酸                                                           Nmtbug 環己基丙胺酸                        Chexa                青黴胺                                                                                          Pen 環戊基丙胺酸                        Cpen                  α-甲基環己基丙胺酸                                                                   Mchexa D-丙胺酸                               Dal                    α-甲基-胺基異丁酸酯                                                                 Maib D-纈胺酸                               Dval                  α-萘基丙胺酸                                                                               Anap D-白胺酸                               Dleu                  α-甲基環戊基丙胺酸                                                                   Mcpen D-異白胺酸                           Dile                   α-甲基-α-萘基丙胺酸                                                                  Manap D-甲硫胺酸                           Dmet                 α-甲基青黴胺                                                                               Mpen N-環丙基甘胺酸                   Ncpro                L-正白胺酸                                                                                  Nle N-環丁基甘胺酸                   Ncbut                L-正纈胺酸                                                                                  Nva N-環己基甘胺酸                   Nchex                L-甲基乙基甘胺酸                                                                      Metg N-環庚基甘胺酸                   Nchep                L-三級丁基甘胺酸                                                                      Tbug N-環辛基甘胺酸                   Ncoct                L-乙基甘胺酸                           Etg N-環癸基甘胺酸                   Ncdec                L-α-甲基正白胺酸                                                                       Mnle N-環十一烷基甘胺酸           Ncund               L-α-甲基丙胺酸                                                                           Mala N-環十二烷基甘胺酸           Ncdod               L-α-甲基-三級丁基甘胺酸                                                           Mtbug N-(2,2-二苯基乙基)甘胺酸  Nbhm                L-α-甲基異白胺酸                                                                       Mile N-甲基青黴胺                       Nmpen              L-α-甲基白胺酸                                                                           Mleu N-甲基環己基丙胺酸           Nmchexa           L-α-甲基甲硫胺酸                                                                       Mmet N-甲基環戊基丙胺酸           Nmcpen            L-α-甲基正纈胺酸                                                                       Mnva N-甲基甘胺酸                       Nala                  L-α-甲基纈胺酸                                                                           Mval N-(1-甲基丙基)甘胺酸         Nile                   N-(1-甲基乙基)甘胺酸                                                                Nval N-(2-甲基丙基)甘胺酸         Nleu N-(3,3-二苯基丙基)甘胺酸  Nbhe N-(2-甲基硫乙基)甘胺酸     Nmet D-α-甲基丙胺酸                    Dmala D-α-甲基異白胺酸                Dmile D-α-甲基白胺酸                    Dmleu D-α-甲基甲硫胺酸                Dmmet D-N-甲基丙胺酸                   Dnmala D-N-甲基異白胺酸               Dnmile D-N-甲基白胺酸                   Dnmleu D-N-甲基甲硫胺酸               Dnmmet D-N-甲基纈胺酸                   Dnmval N-苯甲基甘胺酸                   Nphe N-甲基a-萘基丙胺酸            Nmanap N-甲基胺基異丁酸酯           Nmaib

在一些實施例中，至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的對應於該等七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。如替代性表述的，至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的在對應於SEQ ID NO.1之位置4、8、11、15、18、22、25及29之位置處的胺基酸殘基係疏水性殘基。

在一些實施例中，100%的對應於七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。如替代性表述的，100%的在對應於SEQ ID NO.1之位置4、8、11、15、18、22、25及29之位置處的胺基酸殘基係疏水性殘基。

核心序列內之疏水性殘基可皆相同，或其可彼此不同。在一些實施例中，七肽或變異體模體中之每個疏水性殘基獨立地選自由以下組成之群：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸及其化學衍生物，包括其氟代衍生物。在一個實施例中，七肽或變異體模體中之每個疏水性殘基獨立地選自由以下組成之群：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸及其化學衍生物，包括其氟代衍生物或硒代衍生物。在一個實施例中，七肽或變異體模體中之每個疏水性殘基獨立地選自由以下組成之群：白胺酸、異白胺酸及其化學衍生物，例如氟代白胺酸及氟代異白胺酸。

在一些實施例中，七肽或變異體模體中至少50%之疏水性殘基係異白胺酸或氟代異白胺酸。在一些實施例中，七肽或變異體模體中至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%之疏水性殘基係異白胺酸或氟代異白胺酸。在一些實施例中，七肽或變異體模體中100%之疏水性殘基係異白胺酸或氟代異白胺酸。

不形成捲曲螺旋結構之疏水性核心之一部分的殘基，亦即，在位置b、c、e、f及g處之殘基一般更接近蛋白質之表面，且因此暴露於環境。此等殘基之身分並不重要且其可變化。在一些實施例中，至少50%的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基係極性殘基。在一些實施例中，至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基係極性殘基。在一些實施例中，100%的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基係極性殘基。

如本文所使用，術語「極性殘基」包括此項技術中識別或鑑別為極性的任何胺基酸殘基。此包括帶電胺基酸。極性胺基酸殘基可選自胺基酸絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸、甲硫胺酸及此等胺基酸之化學衍生物的殘基。在一個實施例中，極性胺基酸殘基可選自胺基酸絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、酪胺酸之殘基。此外，核心序列中存在之極性殘基亦可包括非習知極性胺基酸，亦即，具有並非由標準遺傳密碼編碼之側鏈的極性胺基酸。此類非習知極性胺基酸之實例，包括如以上所定義之習知極性胺基酸的D胺基酸變異體、醯胺電子等排體變異體(諸如N-甲基醯胺、逆-反醯胺、硫代醯胺、硫酯、膦酸酯、酮基亞甲基、羥基亞甲基、氟代乙烯基、(E)-乙烯基、亞甲基胺基、亞甲基硫基或烷烴)、L-N甲基胺基酸變異體、D-α甲基胺基酸變異體及D-N-甲基胺基酸變異體，列於下表2中。如上所指出，在使用D-胺基酸時，單體肽中之所有胺基酸均可為D-胺基酸。 表2 ________________________________________________________________________ 非習知胺基酸                        密碼                       非習知胺基酸                      密碼 ________________________________________________________________________ L-N-甲基精胺酸                    Nmarg                    D-α-甲基蘇胺酸                                                                      Dmthr N-(4-胺基丁基)甘胺酸         Nglu                       D-α-甲基絲胺酸                                                                      Dmser L-N-甲基天冬醯胺                Nmasn                   D-α-甲基酪胺酸                                                                      Dmty L-N-甲基天冬胺酸                Nmasp                   N-(2-胺基乙基)甘胺酸                                                           Naeg L-N-甲基麩醯胺酸                Nmgln                    N-(3-胺基丙基)甘胺酸                                                           Norn L-N-甲基麩胺酸                    Nmglu                    N-胺基-α-甲基丁酸酯                                                            Nmaabu L-N-甲基組胺酸                    Nmhis                    N-(咪唑基乙基))甘胺酸                                                           Nhis L-N-甲基離胺酸                    Nmlys                    N-(對羥基苯基)甘胺酸                                                           Nhtyr L-N-甲基鳥胺酸                    Nmorn                   N-(3-胍基丙基)甘胺酸                                                           Narg L-N-甲基蘇胺酸                    Nmthr                    N-(1-羥基乙基)甘胺酸                                                           Nthr L-N-甲基酪胺酸                    Nmtyr                    N-(羥基乙基))甘胺酸                                                             Nser L-N-甲基絲胺酸                    Nmser                    N-(2-羧基乙基)甘胺酸                                                           Nglu D-精胺酸                               Darg                       D-N-甲基精胺酸                                                                     Dnmarg D-天冬胺酸                           Dasp                       D-N-甲基天冬醯胺                                                                 Dnmasn D-麩醯胺酸                           Dgln                       D-N-甲基天冬胺酸                                                                 Dnmasp D-麩胺酸                               Dglu                       D-N-甲基麩醯胺酸                                                                 Dnmgln D-組胺酸                               Dhis                       D-N-甲基麩胺酸                                                                     Dnmglu D-離胺酸                               Dlys                       D-N-甲基組胺酸                                                                     Dnmhis D-鳥胺酸                               Dorn                       D-N-甲基離胺酸                                                                     Dnmlys D-絲胺酸                               Dser                       D-N-甲基鳥胺酸                                                                     Dnmorn D-蘇胺酸                               Dthr                       D-N-甲基絲胺酸                                                                     Dnmser D-酪胺酸                               Dtyr                       D-N-甲基酪胺酸                                                                     Dnmtyr D-α-甲基精胺酸                    Dmarg                    D-N-甲基蘇胺酸                                                                     Dnmthr D-α-甲基天冬醯胺                Dmasn                   L-α-甲基精胺酸                                                                      Marg D-α-甲基天冬胺酸                Dmasp                   L-α-甲基天冬醯胺                                                                  Masn D-α-甲基麩醯胺酸                Dmgln                    L-α-甲基麩胺酸                                                                      Mglu D-α-甲基組胺酸                    Dmhis                    L-α-甲基離胺酸                                                                      Mlys D-α-甲基離胺酸                    Dmlys                    L-α-甲基鳥胺酸                                                                      Morn D-α-甲基鳥胺酸                    Dmorn                   L-α-甲基蘇胺酸                                                                      Mthr L-α-甲基絲胺酸                    Mser L-α-甲基天冬胺酸                Masp L-α-甲基麩醯胺酸                Mgln L-α-甲基組胺酸                    Mhis L-α-甲基酪胺酸                    Mtyr N-(N-(2,2-二苯基乙基)         Nnbhm 胺甲醯基甲基)甘胺酸 N-(N-(3,3-二苯基丙基)         Nnbhe 胺甲醯基甲基)甘胺酸 1-羧基-1-(2,2-二苯基-          Nmbc 乙基胺基)環丙烷 L-O-甲基絲胺酸                    Omser L-O-甲基高絲胺酸                Omhse

儘管七肽模體內疏水性及極性胺基酸之一致佈置引起捲曲螺旋蛋白質結構，但關於殘基位置之一般規則並非不可變化的。因此，正如並非對應於核心序列之七肽或變異體模體內位置a或d的每個殘基均必須為疏水性的，類似地，並非對應於核心序列之七肽或變異體模體內位置b、c、e、f或g之每個殘基均必須為極性的。在一些實施例中，至少5%的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基可為脂族殘基。在一些實施例中，至少10%或至少15%的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基可為脂族殘基。

如本文所使用，術語「脂族殘基」包括胺基酸甘胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸，以及此等胺基酸之化學衍生物，特別是其氟代衍生物，包括氟代白胺酸及氟代異白胺酸。此外，核心序列中存在之脂族殘基亦可包括非習知脂族胺基酸，亦即，具有並非由標準遺傳密碼編碼之側鏈的脂族胺基酸，諸如D胺基酸變異體，及其他非習知脂族胺基酸。

核心序列可包含特定百分比的如上文所定義之極性殘基，及特定百分比的如上文所定義之脂族殘基。舉例而言，在一些實施例中，至少50% (或更高百分比，如上文所定義)的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基可為極性殘基，且至少5% (或更高百分比，如上文所定義)的對應於位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基可為脂族殘基極性殘基。然而，此並非必需的，且如上所指出，其可變化。

在一些實施例中，本文所定義之核心序列可在一側或兩側上側接有側接胺基酸序列。若核心序列在兩側上側接，則在核心序列一側上之側接序列可與在核心序列另一側上之側接序列相同或不同。側接序列可形成或可不形成寡聚蛋白質捲曲螺旋結構之一部分。因此，側接序列可促成單體肽之α-螺旋結構或作為單體肽之α-螺旋結構的一部分，及/或可另外促成捲曲螺旋結構或形成捲曲螺旋結構之一部分，或其可為單體肽序列之獨立部分。側接序列可用於執行各種功能，或賦予寡聚蛋白質特性。舉例而言，其可用於延伸單體肽之七肽重複序列，幫助單體肽之寡聚化，連接單體肽(例如在單鏈構築體內)，或將獨立功能部分提供至寡聚蛋白質。

側接序列之長度並不重要且其可根據需要及希望，或側接序列之性質及/或其目的而變化。其可例如為1至300個胺基酸，例如2、3、4、5、6或7個中之任一個至270、250、240、230、220、210或200個中之任一個的胺基酸。此等範圍僅作為舉例給出，且對側接序列之長度並無限制。在一些實施例中，實際上，側接序列可為至多170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10個胺基酸。在一些實施例中，短側接序列較佳，例如至多20、15、12、10、8、7或6個。

因此，在一些實施例中，側接序列可包含一或多個七肽模體，及/或其一或多個部分。在此情形中，七肽模體之一部分可包括1、2、3、4或5個殘基，其構成七肽模體之連續部分。在一些實施例中，側接序列中之七肽模體對應於如在SEQ ID NO.1中或在與其具有至少60% (例如至少70%、80%、90%)序列一致性之序列中所發現的七肽模體，其限制條件為，對應於七肽模體之位置a及d之胺基酸殘基中的至少一個係疏水性殘基。在一些實施例中，側接序列可包含SEQ ID NO.1或其一部分，或與其具有至少60% (例如至少70%、80%、90%)序列一致性之序列。另外，在此類實施例中，至少50% (例如至少75%)的對應於SEQ ID NO.1之七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。

當側接序列包含一或多個七肽模體或其一或多個部分時，其可視為核心序列之七肽模體的延續部分。因此，形成寡聚蛋白質捲曲螺旋結構之一部分的單體蛋白質之α-螺旋可延伸超出核心序列之一端。

在一些實施例中，核心序列之七肽模體及側接序列之七肽模體係連續的。亦即，側接序列之第一個殘基(亦即，緊鄰核心序列一端之殘基)對應於七肽模體中在對應於核心序列相鄰末端殘基之位置之後的位置。以此方式，重複七肽模體a-b-c-d-e-f-g保持，且在核心序列之七肽模體與側接序列之七肽模體之間無空位。

在其他實施例中，側接序列可包含一或多個七肽模體，其與核心序列之七肽模體並非完全連續的，亦即，在核心序列中之七肽重複序列與側接序列中之七肽重複序列之間可存在一或多個殘基，該一或多個殘基並不形成連續重複七肽模體之一部分。

在一些實施例中，核心序列及側接序列可佈置成使得每個單體肽不包含七肽模體之超過8個重複。在一些實施例中，單體肽不包含該七肽模體之超過7個重複、超過6個重複或超過5個重複。換言之，寡聚蛋白質之單體肽可包含至多8、7、6或5個七肽重複序列。

在一些實施例中，單體肽之側接序列不能與核心序列完全形成連續α-螺旋，且因此，不能完全作為寡聚肽捲曲螺旋結構之一部分。

在一些實施例中，本文所定義之寡聚蛋白質可呈與一或多個額外組分或部分之結合物或融合物形式。如下文更詳細地陳述，寡聚蛋白質可呈與偵測部分體、寡聚化部分體或固定化部分體，或實際上任何所希望之組分或部分，例如功能性或結構組分或部分之結合物形式。結合之部分可具有任何化學或物理性質，例如小分子或巨分子。寡聚蛋白質可呈與融合搭配物之融合蛋白質形式。因此，偵測或固定或其他額外部分本質上可為蛋白質，亦即，其可為或可不為多肽組分(術語「多肽」在本文中用於包括任何肽、多肽或蛋白質，不管長度如何)。寡聚化部分體可為多肽。此外，寡聚蛋白質亦可固定於固體基底上。因此，在一些實施例中，該一或多個額外組分可為偵測部分體、寡聚化部分體、固定化部分體或融合搭配物。

在一些實施例中，寡聚蛋白質所結合或融合之一或多個額外組分可形成構成該寡聚蛋白質之一或多個單體肽內的側接序列之全部或一部分。在其他實施例中，結合部分可為獨立組分(亦即，與寡聚蛋白質或其單體肽分開)。

應理解，側接序列內額外組分之存在可作為同一側接序列中一或多個七肽模體之存在的補充或替代。亦即，給定側接序列可包含一或多個七肽模體或其部分，及 一或多個額外組分。在側接序列包含一或多個七肽模體或其部分及 一或多個額外組分之情況下，側接序列可佈置成使得該一或多個七肽模體或其部分比該一或多個額外組分更接近核心序列。

在一些實施例中，寡聚蛋白質呈與單一額外組分之融合物或結合物形式。該額外組分可形成一個單體肽內之側接序列的全部或一部分。替代地，寡聚蛋白質可呈與2個或多於2個額外組分之融合物或結合物形式。在一些實施例中，該等額外組分可形成同一單體肽內同一側接序列之全部或一部分。在一些實施例中，單一單體肽可包含在兩側上側接有側接序列之核心序列，其中每個側接序列包含一或多個額外組分。另外，本文所定義之寡聚蛋白質可包含呈以上所陳述之佈置中之任一種的多個單體肽，其各自包含一或多個額外組分。

在寡聚蛋白質呈與寡聚化部分體之結合物形式的情況下，寡聚化部分體可由若干寡聚化序列構成，其中每個單體肽包含寡聚化序列。因此，寡聚蛋白質可包含至少2個單體肽，其中每個單體肽在側接序列中包含寡聚化序列。

當使單體肽彼此接觸時，可自發地形成本文所揭示之寡聚蛋白質的捲曲螺旋結構。替代地，寡聚結構之形成可能需要『觸發器』以克服動力學障礙及使單體肽結合在一起。另外，在一些實施例中，可能需要使蛋白質之寡聚捲曲螺旋結構穩定。此寡聚捲曲螺旋結構之起始及穩定可藉由寡聚化序列達成。寡聚化序列係能夠寡聚化，亦即與自身之其他複本相互作用以便形成寡聚物之蛋白質序列。應理解，寡聚化係協作進行的，亦即，在較大蛋白質之特定部分能夠容易地且穩定地寡聚化之情況下，此可幫助在蛋白質結構之其餘部分中誘導寡聚化，否則該寡聚化將不會發生。舉例而言，此項技術中已知黏附蛋白質之頭部域，諸如YadA頭部域能夠誘導形成捲曲螺旋結構，否則該等結構將不能足夠穩定地形成。GCN4蛋白質亦以類似方式使用以使三聚體自轉運黏附素穩定(Hartmann等人, 2012)。因此，此域或此項技術中已知之其他等效域可用作寡聚序列。如上所指出，當寡聚蛋白質與寡聚化部分體結合時，寡聚蛋白質內之每個單體肽可包含寡聚化序列。

另外或替代地，在一些實施例中，捲曲螺旋結構之起始及穩定化可藉由將單體肽連接在一起進行。

儘管本文所定義之單體肽在一定程度上可視為分離的，但在一些實施例中，在本文所揭示之寡聚蛋白質內的2個或多於2個單體肽可連接在一起。因此，側接序列可包含一或多個連接子序列。此可作為一或多個七肽模體或其部分及一或多個可包含在側接序列中之額外組分的補充或替代。應理解，側接序列可包含七肽模體及/或其部分、一或多個額外組分及/或一或多個連接子序列之任何組合。

連接子序列能夠將一個單體肽連接至另一個單體肽，以便在寡聚蛋白質之至少一部分內形成單一肽鏈。在兩個單體肽經由連接序列連接在一起之情況下，可認為一個單體肽(亦即，第一單體肽)包括含有完整連接子序列之側接序列，該側接序列直接地接合至另一個單體肽之核心序列(亦即，不含在核心序列之該端具有側接序列的第二單體肽)。替代地，在兩個單體肽之間之連接可視為部分由第一單體肽之側接序列及部分由第二單體肽之側接序列構成(亦即，其中兩個單體肽包括含連接子序列之側接序列)。

在單體肽中包括連接子序列以將該等單體肽連接在一起之情況下，兩個單體肽之間之側接序列不含除連接子序列及視情況存在之七肽重複模體或其部分外的任何物質可為適宜的。然而，在一連串連接之單體肽之任一端處的側接序列可包含額外序列(例如，如上文所論述)。如替代性表述的，在此類連接之例如單鏈構築體中，寡聚蛋白質可呈與額外部分之結合物形式。換言之，該額外部分可不為單體肽之一部分，但可與其結合。

連接子序列可具有不同長度及/或序列。應理解，連接子序列必須具有足夠長度以允許由單體肽連在一起形成捲曲螺旋而形成螺旋。然而，對連接子序列之最大長度並無功能限制。因此，連接子序列可為至少2個殘基長，諸如至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30個殘基長。

在其他實施例中，例如，連接子序列可包含2-60個殘基，更確切地說，5-55個、10-50個、15-45個或20-40個殘基。在一個實施例中，連接子序列可包含2-50個、3-40個、4-30個、5-20個或6-15個殘基。連接子序列中存在之殘基的性質並不重要。其可為任何胺基酸，例如中性胺基酸或脂族胺基酸，或替代地，其可為極性的或帶電的或形成結構的，例如脯胺酸。在一個實施例中，連接子序列係可撓性連接子序列。可使用之不同可撓性連接子係此項技術中已知的且有廣泛描述。藉助於代表性實例，連接子序列中至少70%之胺基酸可選自甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、組胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸或其衍生物。在一些實施例中，連接子係富含甘胺酸或富含甘胺酸-絲胺酸之序列。

如上文所定義，每個單體肽包含至少一個核心序列。在一些實施例中，一或多個單體肽可包含2個或多於2個核心序列，該等核心序列可彼此相同或不同。如上文所闡述，每個核心序列可在一側或兩側上側接有側接序列。當核心序列在兩側上側接時，該兩個側接序列可相同或不同。因此，每個單體肽可包含2個或多於2個核心序列，其中每個核心序列在一側或兩側上側接有側接序列。因此，在單體肽包含2個或多於2個核心序列之情況下，應理解，對於每個核心序列，其可進一步包含至多2個側接序列。因此，包含2個核心序列之單體肽可包含至多4個側接序列。舉例而言，單體肽可如下佈置：F-C-F-F-C-F，其中F表示側接序列且C表示核心序列。

在一些實施例中，單體肽可包含呈以下佈置之2個核心序列及3個側接序列：F-C-F-C-F。在其他實施例中，單體肽可包含呈以下佈置之2個核心序列及2個側接序列：F-C-C-F。在其他實施例中，單體肽可包含呈以下佈置之2個核心序列及單一側接序列：C-C-F。在一些實施例中，單體肽可包含呈以下佈置的在兩側上側接有側接序列之單一核心序列：F-C-F；或單一核心序列及單一側接序列。在一些實施例中，寡聚蛋白質可僅包含一個包含側接序列之單體肽。在一些實施例中，寡聚蛋白質中之單體肽各自僅由一個核心序列組成。

本文所定義之每個核心序列與SEQ ID NO:1具有至少60%一致性，其包含30個殘基，且因此應理解，每個核心序列之長度可為18至42個殘基。在一些實施例中，單體肽中核心序列之長度可為19-41個殘基，諸如20-40個、21-39個、22-38個、23-37個、24-36個、25-35個、26-34個、27-33個、28-32個或29-31個殘基。在一些實施例中，核心序列可包含30個殘基。可存在多於一個核心序列。每個核心序列可在一側或兩側上側接有側接序列。如上所指出，該側接序列可包含一或多個七肽模體或其部分、一或多個額外組分及/或一或多個連接子序列。因此，在一些實施例中，單體肽整體可明顯長於核心序列。在一些實施例中，單體肽可包含24-1000個殘基，諸如24-900個、24-800個、24-700個、24-600個、24-600個、24-500個、24-400個、24-300個、24-250個、24-200個、24-150個、24-100個、24-75個、24-50個或24-40個殘基。

本文所定義之寡聚蛋白質具有包含至少2個單體肽之捲曲螺旋結構。如上所指出，寡聚蛋白質係基於GCN4轉錄因子之C末端伸長段。野生型C末端GCN4序列形成二聚體捲曲螺旋結構，亦即，包含2個單體肽之結構。然而，已觀察到，藉由變化在個別單體肽中之七肽模體內位置a及d處之殘基，蛋白質之寡聚狀態整體可改變，以便形成三聚體或四聚體結構。在一些實施例中，寡聚蛋白質係二聚體、三聚體或四聚體，亦即，寡聚蛋白質包含2、3或4個單體肽。在一個較佳實施例中，寡聚蛋白質係三聚體。

在寡聚蛋白質內之每個單體肽可以相同或不同。此不僅包括核心序列之序列，而且亦存在或不存在一或多個側接序列(及其序列)。在一些實施例中，寡聚蛋白質可包含2個或多於2個具有一致核心序列之單體肽。在一些實施例中，寡聚蛋白質可包含2個或多於2個完全一致之單體肽。在一些實施例中，寡聚蛋白質中之所有單體肽可為一致的。儘管不需要寡聚蛋白質內之單體肽彼此一致，但較佳地，在各單體肽之間僅存在極少變化。

在一些實施例中，寡聚蛋白質內之每個單體肽可作為獨立肽鏈提供。在此情況下，可以看出每個單體肽係寡聚蛋白質複合物之物理上分開的次單元。替代地，在一些實施例中，可將2個或多於2個單體肽連接在一起。如上文所概述，個別單體肽可藉由一或多個連接子序列連接在一起成為單一肽鏈，亦即，其中第一單體肽之一端連接至第二單體肽之一端。在一些實施例中，所有單體肽可連接形成單一肽鏈。在此情況下，單體肽可視為單鏈、多域蛋白質構築體之獨立域。

另外或替代地，單體肽可經由化學交聯，以在單體肽之間之一或多個化學交聯形式連接在一起。此項技術中已知多種用於在個別肽之間形成共價鍵以將其連接在一起的方法，且可採用任何適合的此類化學交聯方法將寡聚蛋白質內之2個或多於2個單體肽連接在一起。舉例而言，可經由單體肽中特定半胱胺酸殘基之間之一或多個二硫鍵連接2個或多於2個單體肽。替代地，其可藉由使用交聯劑，諸如甲醛隨機連接，該交聯劑能夠促進與單體肽中存在之離胺酸殘基之共價鍵的形成。在一些實施例中，寡聚蛋白質可包含以單一肽鏈形式及/或經由化學交聯連接在一起之單體肽與提供於獨立肽鏈上且未連接之一些單體的組合。

本文所揭示之寡聚蛋白質可以合成方式產生，例如藉由連接胺基酸或較小的合成產生之肽，或藉由重組表現編碼該蛋白質或其一或多個單體肽之核酸分子產生。此類核酸分子可藉由此項技術中已知之任何適合的手段，以合成方式產生。因此，寡聚蛋白質可為重組或合成的或人工寡聚蛋白質。

本文所定義之寡聚蛋白質係作為結合劑提供以結合至LPS。如上所指出，脂多醣係所有革蘭氏陰性細菌之外膜中的整體組分。然而，並非所有革蘭氏陰性細菌均在其外膜中具有完全相同的脂多醣。如本文所使用，術語「LPS」，或術語「內毒素」(如上所指出，其可與「LPS」互換使用)係指存在於革蘭氏陰性細菌之外膜中的任何脂多醣。

有利的是，本文所定義之寡聚蛋白質能夠以極高親和力結合至LPS。此高親和力允許寡聚蛋白質即使在以極低濃度存在時，亦有效地結合LPS，由此可偵測及/或移除LPS。在一些實施例中，寡聚蛋白質以在奈莫耳濃度或皮莫耳濃度範圍內或更低之K_D 結合至LPS。舉例而言，在一些實施例中，寡聚蛋白質結合至LPS之K_D 係10 nM或更低，諸如5 nM或更低、1000 pM或更低、750 pM或更低、500 pM或更低、250 pM或更低、100 pM或更低、50 pM或更低、10 pM或更低、5 pM或更低、1 pM或更低、或500 fM或更低。因此，本文所定義之寡聚肽能夠偵測樣本中之LPS，其中其存在濃度為至少100 pM。在一些實施例中，寡聚蛋白質能夠偵測樣本中之LPS，其中其存在濃度為至少75 pM，更確切地說，其濃度為至少50 pM、至少25 pM、至少10 pM、至少5 pM、至少3 pM、至少1 pM、至少750、至少500 fM、至少250 fM或至少100 fM。

不希望受理論所束縛，本發明者咸信，本文所定義之寡聚蛋白質與LPS之結合依賴於蛋白質整體之捲曲螺旋結構，以及LPS與該蛋白質內個別殘基之間的相互作用。就此而言，認為寡聚蛋白質內帶正電殘基之存在可有助於增加結合親和力。此外，不希望受理論所束縛，假設帶正電殘基可涉及與LPS之脂質A區中帶負電磷酸根之靜電相互作用。因此，在一些實施例中，寡聚蛋白質在單體肽之核心序列內包含總計至少6個陽離子性殘基。在一些實施例中，寡聚蛋白質可在單體肽之核心序列內包含總計至少7個陽離子性殘基，諸如至少8個、至少9個、至少10個、至少12個或至少15個陽離子性殘基。

如本文所使用，術語「陽離子性殘基」包括在pH 7.0下攜帶正電荷之離胺酸、精胺酸、組胺酸及任何非基因編碼或經修飾之胺基酸殘基。適合非基因編碼或經修飾之陽離子性殘基包括離胺酸、精胺酸及組胺酸之類似物，諸如高離胺酸、鳥胺酸、二胺基丁酸、二胺庚二酸、二胺基丙酸、高精胺酸、三甲基離胺酸、三甲基鳥胺酸、4-胺基哌啶-4-甲酸、4-胺基-1-胺基甲醯胺基哌啶-4-甲酸及4-胍基苯丙胺酸。

前述陽離子性殘基可存在於單一單體肽之至少一個核心序列內，或其可散佈於寡聚蛋白質中多個單體肽之核心序列中。在一些實施例中，每個單體肽在核心序列中包含至少2個陽離子性殘基。在一些實施例中，每個單體肽在核心序列內包含至少3個、至少4個或至少5個陽離子性殘基。

如上文所論述，寡聚蛋白質經由脂質A組分與LPS相互作用，且因此，本文亦提供如本文所定義之寡聚蛋白質作為結合劑結合至脂質A之用途。如本文所使用，術語「脂質A」係指LPS之脂質A組分，其包含藉由β-1,6鍵聯接合之兩個磷酸葡糖胺糖分子，該等分子一起具有四個O-連接之醯基鏈及兩個N-連接之醯基鏈，能夠與革蘭氏陰性細菌之外膜相互作用。

在一些實施例中，如上所指出，本文所定義之寡聚蛋白質可呈與一或多個額外組分或部分之結合物或融合物形式。確切地說，寡聚蛋白質可與偵測部分體或固定化部分體結合。額外部分可呈多肽形式，且因此，寡聚蛋白質可呈與融合搭配物之融合蛋白質形式。融合搭配物係與寡聚蛋白質之融合蛋白質中的獨立多肽組分。在一些實施例中，寡聚蛋白質可固定於固體基底上。

寡聚蛋白質可與任何適合的偵測部分體，亦即能夠提供可偵測信號之任何部分結合。偵測部分體可視為標記，且可直接地或間接地偵測。在一些實施例中，寡聚蛋白質可與可直接偵測之偵測部分體結合。可直接偵測之部分係可在不使用額外試劑情況下直接偵測之部分。舉例而言，可直接偵測之適合偵測部分體可包括螢光分子(例如螢光蛋白質或有機螢光團)、比色部分(例如有色分子或奈米粒子)、粒子(例如金或銀粒子)、量子點、放射性同位素標記、化學發光分子及類似物。確切地說，任何可以分光光度法或光譜偵測之標記可用於可直接偵測之部分中。可偵測標記可藉由顏色區分，但亦可使用任何其他參數，例如大小、電荷等。

可間接偵測之部分係可藉由採用一或多種額外試劑偵測之部分，例如其中該部分係由兩種或多於兩種組分構成之信號產生系統的成員。舉例而言，偵測部分體可包含能夠催化產生可偵測信號，諸如顏色變化之反應的酶，諸如辣根過氧化酶(HRP)。因此，當使偵測部分體與酶受質接觸時，將發生反應且將產生可偵測信號。

寡聚蛋白質可呈與融合搭配物之融合蛋白質形式。在一些實施例中，融合搭配物可為可偵測部分體，亦即，呈與可偵測部分體之結合物形式的寡聚蛋白質可視為等效於呈與可偵測融合搭配物之融合蛋白質形式的寡聚蛋白質。然而，寡聚蛋白質可呈與除可偵測部分體外之融合搭配物之融合蛋白質形式。原則上，融合搭配物可為任何多肽，只要該寡聚蛋白質仍能夠充當結合劑結合至LPS即可。

在一些實施例中，寡聚蛋白質可固定於固體基底(亦即，固相或固體載體)上。此固定可藉由任何適宜方式實現。因此，固定之方式或手段及固體基底可根據選擇，自此項技術中廣泛已知且在文獻中描述之多種固定手段及固體基底選出。在一些實施例中，寡聚蛋白質可與固定化部分體結合以促進固定。固定化部分體可直接結合至固體基底(例如化學交聯)。在一些實施例中，例如，固定化部分體可包含半胱胺酸殘基，其能夠與基底上之半胱胺酸殘基以二硫橋形式偶合。在一些實施例中，固定化部分體可藉助於連接基團或藉由一或多個中間結合基團較間接地結合至基底。在一些實施例中，固定化部分體可為例如能夠結合至固體基底上提供之其結合搭配物，亦即同源結合搭配物，例如抗生蛋白鏈菌素或抗體的親和力結合搭配物，例如生物素或半抗原。因此，寡聚蛋白質經由固定化部分體可共價或非共價連接至固體基底。鍵聯可為可逆(例如可裂解)或不可逆鍵聯。在一些實施例中，鍵聯可以酶方式、以化學方式或用光裂解，例如，該鍵聯可為光敏性鍵聯。

在一些實施例中，寡聚蛋白質與固體基底之間之相互作用必須足夠穩健以允許洗滌步驟，亦即，寡聚蛋白質與固體基底之間之相互作用不會被洗滌步驟破壞(明顯破壞)。舉例而言，在一個實施例中，每個洗滌步驟自固體基底移除或溶離不到5%之寡聚蛋白質。在一個實施例中，每個洗滌步驟自固體基底移除或溶離不到4、3、2、1、0.5或0.1%之寡聚蛋白質。

固體基底可為當前廣泛用於或建議用於固定、分離等之熟知基底或基質中之任一種。此等基底可呈粒子(例如磁性、順磁性或非磁性珠粒)、薄片、凝膠、過濾器、膜、纖維、毛細管、載片、陣列、晶片或微量滴定條、管、盤或孔等形式。

在一些實施例中，寡聚蛋白質係固定於珠粒或樹脂上，或固定於孔或容器、或管柱或過濾材料之中或之上，或固定於偵測裝置之表面上。

該基底可由玻璃、二氧化矽、乳膠、磷灰石或聚合材料製成。在一些情況下，具有高表面積之材料可為特別適合的。該等基底可具有不規則表面，且可例如為多孔或顆粒狀的，例如粒子、纖維、絲網、燒結物或篩網。顆粒狀材料，例如珠粒，特別是聚合物珠粒因其較大的結合容量而有用。應理解，此等珠粒可呈此項技術中已知之任何適合佈置提供。舉例而言，珠粒可裝填至管柱，諸如過濾管柱中。

適宜地，根據本發明使用之顆粒狀固體基底可包含球形珠粒。珠粒之大小並不重要，但其可例如具有大約至少1 μm直徑。在一個實施例中，珠粒之直徑可為至少2 μm。在一個實施例中，珠粒之最大直徑可不超過10 μm，且例如不超過6 μm。單分散性粒子，亦即大小實質上均一(例如大小具有小於5%之直徑標準差)之粒子的優勢在於，其提供極其均一的反應再現性。代表性單分散性聚合物粒子可藉由US-A-4336173中所描述之技術製造。

在一些實施例中，固體基底可為樹脂，諸如直鏈澱粉樹脂。樹脂可以任何適合之形式提供，諸如旋轉柱過濾器或流動式管柱。在一些實施例中，寡聚蛋白質可固定於孔或容器，諸如多孔盤之中或之上。

在一些實施例中，寡聚蛋白質可固定於偵測裝置，諸如晶片或微陣列之表面上。就此而言，寡聚蛋白質可形成能夠結合至且偵測LPS之捕捉陣列或生物感測器。在一些實施例中，寡聚蛋白質可固定於表面電漿子共振(SPR)晶片上。能夠量測對應於目標與固定之捕捉蛋白質之結合之信號的生物感測器係此項技術中熟知的，且本文所定義之寡聚蛋白質可以任何此類適合之佈置提供。

因此，可以看出，本文所定義之寡聚蛋白質作為結合劑結合至LPS的用途可包含寡聚蛋白質偵測樣本中之LPS及/或自樣本移除LPS的用途。

因此，本文所定義及描述之寡聚蛋白質的用途尤其包括活體外用途，亦即，在活體外結合、偵測或移除LPS。

就此而言，本文提供一種結合LPS之方法，該方法包含使該LPS或含有LPS之樣本與如本文所定義寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS形成蛋白質-脂多醣複合物。應理解，以上關於用於結合LPS之寡聚蛋白質的揭示內容同等地適用於涉及同一寡聚蛋白質的結合LPS之方法。

在一個實施例中，該方法係活體外方法。

如本文所使用，術語「樣本」包括可含有或可混雜有LPS或可能希望測試之任何樣本。此包括來源於患者或個體之臨床樣本，更一般而言環境樣本，及擬測試內毒素污染之產物的樣本。來源於患者之臨床樣本可為任何體液或組織樣本，例如血液樣本、淋巴樣本、唾液樣本、尿液樣本、糞便樣本、腦脊髓液樣本或自患者獲取的任何其他適當生物樣本。在一個較佳實施例中，臨床樣本係血液樣本。

擬測試內毒素污染之產物的樣本可為來源於疑似混雜有內毒素之任何產物，且尤其是欲用於人類消費或與人類相互作用之任何此類產物的樣本。此包括例如來自醫藥及醫療行業之產物，諸如試劑、醫療裝置、設備、消耗品、藥品、疫苗等。類似地，樣本亦可來源於食品及飲料行業之產物，或來源於環境樣本，諸如飲用水、地下水等。

在一個實施例中，樣本可為包含擬測試內毒素污染之產物之一部分的液體樣本，不過，其亦可為來源於產物之表面之樣本，其中希望測試固體產物，諸如醫療裝置，或表面，諸如手術室或另一無菌環境中之表面。此可包括例如自產物之表面獲取的拭子或洗滌液。

在一些實施例中，結合LPS之方法係偵測樣本中LPS之存在的方法，其中該方法包含： (a)    使該樣本與如本文所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS形成蛋白質-脂多醣複合物；及 (b)    偵測蛋白質-脂多醣複合物之存在。

在一些實施例中，結合LPS之方法可為偵測疑似含有革蘭氏陰性細菌之樣本中革蘭氏陰性細菌之存在的方法，其中該方法包含： (a)    使該樣本與如本文所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該革蘭氏陰性細菌之外膜中的LPS以形成蛋白質-脂多醣複合物；及 (b)    偵測蛋白質-脂多醣複合物之存在。

應理解，偵測該蛋白質-脂多醣複合物之步驟可藉由此項技術中已知之任何適合手段進行。蛋白質-脂多醣複合物可直接地或間接地偵測。取決於樣本與寡聚蛋白質接觸之方法，可選擇偵測蛋白質-脂多醣複合物之適當方法。

使樣本與寡聚蛋白質接觸之步驟可涉及將樣本施加至如上文所概述的固定有寡聚蛋白質之基底上，其中該基底係佈置成可以量測該樣本與該寡聚蛋白質之結合。在一些實施例中，例如，寡聚蛋白質可固定於如上文所概述的能夠偵測樣本與寡聚蛋白質之間之相互作用的偵測裝置之表面上，諸如SPR晶片或另一適合生物感測器之表面上。因此，使樣本與寡聚蛋白質接觸之步驟可涉及將樣本施加至上面固定有寡聚蛋白質之固體基底上。

在其他實施例中，例如，寡聚蛋白質可固定於多孔盤之孔中以便形成LPS分析。該等分析係此項技術中熟知；當將樣本施加至包含固定之寡聚蛋白質的盤上時，樣本中存在之任何LPS將被寡聚蛋白質結合，且樣本中之其他組分可被洗掉。因此，使樣本與寡聚蛋白質接觸之步驟可涉及將樣本施加至上面固定有寡聚蛋白質之多孔盤上。另外，偵測樣本中LPS之存在的方法可進一步包含在偵測步驟前，洗滌蛋白質-脂多醣複合物之步驟，以便移除樣本中未結合之組分，且因此改良該方法之準確性。適合該等洗滌步驟之試劑及方案係此項技術中熟知。接著，可使用能夠結合至LPS的任何適合之偵測部分體偵測保留在盤中之蛋白質-脂多醣複合物。偵測部分體可直接地或間接地偵測。如下文更詳細地概述，本發明者擷用最初由Schmidt等人, 2016所報導的使用沙門氏菌屬(Salmonella )噬菌體之尾刺蛋白質(tailspike protein)的ELISA樣分析(ELITA)來偵測LPS。此分析使用尾刺蛋白質偵測蛋白質-脂多醣複合物，該尾刺蛋白質能夠結合至LPS且包含N末端StrepTag及抗生蛋白鏈菌素結合之辣根過氧化酶。當將酶受質2,2'-次偶氮基-雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)添加至盤時，誘導可偵測之顏色變化。因此，可以看出，偵測蛋白質-脂多醣複合物之存在的步驟可包含使蛋白質-脂多醣複合物與能夠結合至LPS且包含能夠催化產生可偵測信號之反應之酶的偵測部分體及與適當基底接觸以誘導此類可偵測信號。

在一些實施例中，寡聚蛋白質可呈包含偵測部分體本身之結合物形式，如上文所概述。因此，蛋白質-脂多醣複合物可藉由偵測來自與寡聚蛋白質結合之偵測部分體的信號偵測。此可藉由適合於偵測來自所討論之偵測部分體之信號的任何方法，例如使用螢光顯微法觀察與寡聚蛋白質結合之螢光標記進行。

在一些實施例中，結合LPS之方法係自樣本移除LPS之方法，其中該方法包含： (a)    使該樣本與如本文所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS形成蛋白質-脂多醣複合物；及 (b)    自該樣本分離出該蛋白質-脂多醣複合物。

另外，應理解，自樣本中分離出蛋白質-脂多醣複合物之步驟可藉由此項技術中已知之任何適合手段進行，且此將取決於樣本與寡聚蛋白質接觸之方式。

在一些實施例中，寡聚蛋白質可固定於固體基底上，且因此，使樣本與寡聚蛋白質接觸之步驟可包含將樣本施加至上面固定有寡聚蛋白質之固體基底上。如上所指出，寡聚蛋白質可固定於此項技術中已知之任何適合基底上。確切地說，固體基底可呈粒子(例如珠粒)、過濾器或管柱形式。另外，使用此類基底自樣本分離結合之目標分子的適合試劑及方案係此項技術中熟知的。

如上所指出，寡聚蛋白質可固定至磁性珠粒上。如本文所使用，術語「磁性」意思指，當置放於磁場中時，基底能夠被賦予磁矩，且因此可在該磁場作用下移位。換言之，包含磁性粒子之基底可藉由磁性聚集容易地移除，由此提供在形成複合物之後，立即自樣本分離出蛋白質-脂多醣複合物的一種快速、簡單且高效之方式。

在另一個實施例中，例如，寡聚蛋白質可固定於裝填至管柱中之樹脂上。在此實例中，當樣本與寡聚蛋白質接觸時，亦即，當將樣本施加至管柱時，LPS將被寡聚蛋白質結合且保留在管柱中，且樣本之其餘部分將流過管柱。在一些實施例中，該方法可包含多個使樣本與寡聚蛋白質接觸之步驟，以便確保所有LPS均被結合，亦即，可將樣本施加至管柱上若干次。此外，該方法可包含在分離步驟之前，洗滌蛋白質-脂多醣複合物之步驟，以避免無意地移除樣本中除LPS外之其他組分，亦即，該管柱可用適當試劑洗滌。

當結合LPS、偵測樣本中LPS之存在或自樣本移除LPS時，若涉及該結合、偵測或移除之試劑，特別是寡聚蛋白質可再使用，則係有利的。因此，本文所揭示之方法可進一步包含以下步驟：使蛋白質-脂多醣複合物與至少一種非變性清潔劑接觸，以便自寡聚蛋白質移除LPS，亦即，破壞蛋白質-脂多醣複合物，由此使寡聚蛋白質可再使用。

就此而言，本文提供一種用作如本文所定義之LPS之結合劑或用於本文所定義之方法中的套組，該套組包含： (i)如本文所定義之寡聚蛋白質；及 (ii)至少一種非變性清潔劑。

非變性清潔劑係此項技術中熟知的，且技術人員可使用任何適合的非變性清潔劑。舉例而言，該至少一種非變性清潔劑可選自非離子型、陰離子型、陽離子型或兩性離子型清潔劑，或其任何組合。就此而言，該至少一種非變性清潔劑可具有選自以下之頭基：線性聚乙二醇(PEG)基團、聚山梨醇酯基團、β-糖苷糖基團、N-甲基還原葡糖胺基團、N-氧化物基團、二甲銨-1-丙烷磺酸鹽基團、羧酸基團、硫酸酯基團或四級胺基團。該至少一種非變性清潔劑可選自CHAPS、兩性清潔劑(zwittergent) 3-12、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、triton X-100或其任何組合。在一些實施例中，該至少一種非變性清潔劑可為非變性清潔劑之混合物。在一些實施例中，非變性清潔劑之混合物包含CHAPS、兩性清潔劑3-12、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20及triton X-100，或由其組成。

應理解，清潔劑應以足夠濃度存在以破壞蛋白質-脂多醣複合物，而非以持久性減弱寡聚蛋白質之功能的高濃度存在。在一些實施例中，清潔劑可以至少0.1% (w/w)或0.1% (v/v)之總濃度，亦即存在之所有清潔劑之濃度存在。在一些實施例中，清潔劑之濃度可為至少0.15% (w/w)或至少0.15% (v/v)，諸如至少0.2% (w/w)或至少0.2% (v/v)、至少0.25% (w/w)或至少0.25% (v/v)，或至少0.5%  (w/w)或至少0.5%(v/v)。在一個實施例中，該至少一種非變性清潔劑包含0.05% (w/w) CHAPS、0.05%(w/w)兩性清潔劑3-12、0.05% (v/v) tween 80、0.05% (v/v)tween 20及0.05% (v/v) triton X-100之組合。

在另一個實施例中，本文提供一種產物，其包含固定於固體基底上之寡聚蛋白質，其中該寡聚蛋白質如本文所定義。該固體基底可為本文所揭示之任何固體基底。亦即，以上關於寡聚蛋白質之用途的揭示內容，其中寡聚蛋白質固定於固體基底上，同等地適用於包含固定於固體基底上之寡聚蛋白質之產物的情形。就此而言，固體基底可為薄片、凝膠、過濾器、膜、纖維、毛細管、載片、陣列、晶片、微量滴定條、管、盤或孔。確切地說，寡聚蛋白質可固定於偵測裝置之表面上，諸如SPR晶片或生物感測器之表面上。

自以上揭示內容可見，本文所描述之寡聚蛋白質提供用於結合LPS之替代性結合劑，由此可解決已知用於結合及偵測LPS之方法的多個問題。確切地說，本文所描述之寡聚蛋白質能夠溶解LPS聚集物。因此，寡聚蛋白質可減小由聚集引起之LPS遮蔽的影響，且因此有效地增加樣本中LPS之可量測濃度。因此，此寡聚蛋白質支持一種偵測LPS之方法，該方法能夠偵測低濃度之LPS。

此外，此偵測方法避免與LAL分析相關之問題，諸如變形細胞溶菌液之昂貴且不可持續的收集。另外，此方法亦避免與使用因子C相關聯之任何潛在問題，其亦可存在於LAL分析之重組變異體中。

實例 方法 蛋白質之表現及純化

如先前所描述(Alvarez等人, 2008；Hartmann等人, 2012)，製造側接GCN4轉接子之沙門氏菌黏附素A (SadA)構築體(如圖7中所示)。使轉型之BL21-Gold(DE3)在2 L之ZYP-5052自誘導培養基(Studier, 2005)中生長，並藉由在OD600=0.6下添加200 ng/mL脫水四環素(anhydrotetracycline，AHTC)，隨後在30℃下表現隔夜來誘導過度表現。將細胞以6000×g沈澱(Beckman JLA 8.1000轉子)，保持30分鐘，並使其再懸浮於含有200 µL不含EDTA之蛋白酶抑制劑混合液(Merck)及脫氧核糖核酸酶I之20 mL Tris/HCl pH 7.4、40 mM NaCl、5 mM MgCl2中。再懸浮後，藉由法式壓碎機(French press)溶解細胞並將所得溶解產物稀釋於50 mL平衡緩衝液(20 mM Tris/HCl pH 7.9、5 M鹽酸胍、0.5 M NaCl、10%甘油)中，並在攪拌下，在室溫下培育1小時，隨後以75 000×g離心(Beckman Ti 70轉子) 1小時以移除任何未溶解的顆粒。將所得溶液裝載至用平衡緩衝液預平衡之20 mL Ni Sepharose excel管柱(GE Life Sciences)上。在施加樣本後，用4管柱體積平衡緩衝液洗滌管柱並使用0-100%梯度溶離緩衝液(20 mM Tris/HCl pH 7.5、5 M鹽酸胍、0.5 M NaCl、10%甘油、500 mM咪唑)溶離。藉由SDS-PAGE分析溶離份，並彙集含有感興趣蛋白質之溶離份且藉由針對2 L再摺疊緩衝液(20 mM MOPS pH 7.4、350 mM NaCl、10%甘油)透析兩次隔夜進行再摺疊。

LPS 產生及純化 藉由接種20 mL來自單一細菌集落(關於所用菌株，參見下表3)之溶源性培養液(lysogeny broth，LB)預培養物並使其在37℃下生長隔夜，產生LPS。表 3

菌株	LPS 名稱	類型	註釋
大腸桿菌BL21	BL21 LPS	粗糙	缺乏O-抗原之常用實驗室菌株
鴨沙門氏菌 (S.anatum )	鴨沙門氏菌LPS	光滑	確切結構未知
鼠傷寒沙門桿菌	光滑LPS	光滑
鼠傷寒沙門桿菌 ΔwaaC ( ΔLPS)	WaaC LPS	粗糙	缺失庚糖基轉移酶WaaC，該酶負責將庚醣轉移至LPS-前驅物之Kdo部分
鼠傷寒沙門桿菌 ΔwaaJ	WaaJ LPS	粗糙	缺失糖基轉移酶WaaJ，該酶負責將倒數第二個葡萄糖轉移至核心-寡聚LPS
鼠傷寒沙門桿菌 ΔwaaL	WaaL LPS	粗糙	缺失WaaL連接酶，該酶負責將O-抗原連接至核心-寡醣

在2 L帶擋板之燒瓶中，接種來自該預培養物之6×1 L培養物並在37℃下，使其在振盪器上生長隔夜。藉由以6000×g離心(Beckman JLA 8.1000轉子) 30分鐘來收集細菌。取決於LPS之類型，進一步純化遵循兩種不同的方法。

遵循Galanos等人(Galanos, Lüderitz及Westphal, 1969)所描述之方案，使用苯酚-氯仿-石油醚萃取來純化粗糙LPS。收集之後，將細菌沈澱物用40 mL乙醇洗滌3次並用丙酮洗滌一次，接著在空氣流下保持隔夜。使用研缽及研杵將乾燥之沈澱物均質化並將其溶解於40 ml 2:5:8比率的90%(W/V)液體苯酚、氯仿及石油醚之混合物中。在振盪器上培育一小時之後，將未溶解之材料以4200×g沈澱15分鐘並收集上清液。在空氣流下移除氯仿及石油醚，持續4小時或直至苯酚開始結晶。藉由將溶液加熱至40℃，使其再懸浮，並在攪拌下，逐滴添加(3×5滴)水，直至LPS沈澱。將LPS以4200×g沈澱15分鐘，且再將水添加至上清液中以收集任何殘餘LPS。用10 mL 80% (W/V)苯酚洗滌沈澱物兩次，並將其溶解於20 mL milliQ-水中，隨後以100 000×g離心(Beckman, MLA-50轉子)一小時。將最終沈澱物溶解於50 mL MilliQ-水中並凍乾，得到純LPS。

遵循Darveau等人(Darveau及Hancock, 1983)所描述之方案純化光滑LPS。將細菌洗滌兩次且再懸浮於40 mL之10 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM MgCl2中，並藉由法式壓碎機溶解，隨後藉由音波處理再次破壞。在37℃下，在攪拌下，將所得懸浮液與200 µg/mL脫氧核糖核酸酶I、50 µg/mL核糖核酸酶A一起培育隔夜。向15 mL懸浮液中添加5 mL於10 mM Tris-HCL pH 8.0中之0.5 M EDTA、2.5 mL於10 mM Tris-HCl pH 8.0中之20% SDS及2.5 mL之10 mM Tris-HCl pH 8.0，並藉由音波處理進一步破壞LPS微胞。在20℃下，將溶液以39 000×g離心(Sorval, SS-34轉子) 30分鐘以使未溶解之細胞組分沈澱，將上清液冷凍並凍乾。將凍乾之粗萃取物溶解於少量水中，並在-40℃下，用2體積冰冷的乙醇及0.375 M MgCl2使LPS沈澱隔夜。在4℃下，將沈澱之LPS以11 000×g離心(Sorvall, SLA-3000轉子) 15分鐘，並在65℃下，在攪拌下使所得沈澱物再懸浮於相同體積的90% (W/V)苯酚中，保持30分鐘。將混合物以4000×g離心10分鐘以加速相分離。收集水相，且再次用水萃取苯酚相。將彙集之水相彙集在一起，並使用¼體積之氯仿萃取苯酚。將水相在空氣流下置放隔夜以蒸發任何殘餘的有機溶劑，並使用500 MWCO透析膜針對MQ-水透析3天。將經透析之LPS冷凍並凍乾，得到純LPS。

藉由麥黃酮-SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(Marolda等人, 2006)控制分離之LPS產物的純度。

製備 O- 抗原多醣 藉由弱酸水解將脂質A連結至近端KDO糖之糖苷鍵，自野生型鼠傷寒沙門桿菌(光滑) LPS分離出多醣(Raetz及Whitfield, 2002a)。將4-5 mg/mL鼠傷寒沙門桿菌LPS溶解於10%乙酸中並在100℃下培育1小時。藉由在4℃下以10 000×g離心30分鐘，將所得脂質A自溶液移除，將含有多醣之上清液冷凍並凍乾隔夜。

ELISA 樣尾刺吸附 (ELISA-like tailspike adsorption ， ELITA) 分析 ELITA分析最先由Schmidt等人(Schmidt等人, 2016)使用全細菌描述。此處，吾人修改該分析以用於在Nunc MaxiSorp 96孔平孔盤中之經純化蛋白質(如圖11中所示)。藉由將該等孔與100 µl於PBS緩衝液中之10 µg/mL K9-His或K14-His一起培育隔夜來使其飽和。在用含2%牛血清白蛋白(BSA)之PBS進行2小時之阻斷步驟之後，添加100 µL範圍自200 µg/mL至0.0023 µg/mL之鼠傷寒沙門桿菌LPS的稀釋液作為結合搭配物並培育1小時。添加100 µL具有N末端Strep-tag®II(IBA)之P22尾刺蛋白質(P22TSP)，保持一小時，隨後將該等孔最終與100 µL之1:10 000 StrepTactin結合之辣根過氧化酶(IBA, Göttingen)一起培育一小時，並用2,2'-次偶氮基-雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，Sigma-Aldrich)顯色30-60分鐘，且使用盤讀取器在407 nm下讀取。在以上各步驟之間用150 µL含有0.1% BSA之PBS緩衝液洗滌該等孔3次(Tween-20因干擾分析而在此等實驗中省去)。自每一平均信號減去平均背景信號(0 µg/mL LPS)，藉由將三次重複之個別標準差與正交基線相加來計算誤差之傳播

，其中

係總和Q之組合的不確定性。藉由將資料曲線擬合至如下希爾公式(Hill equation)來計算劑量-反應曲線及解離常數K_D ：

，其中Y表示被佔據之受體結合位點的分數，Y_max 表示最大結合，[L]表示游離配體之濃度，且n表示結合位點之數量。儘管每個構築體攜帶兩個GCN4-PII模體，但將n視為等於1，因為該等模體位於蛋白質之相對端處，且因此預期其不會協作。假定如所報導的(Peterson及McGroarty, 1985；Raetz及Whitfield, 2002b；Schmidt等人, 2016)，平均有30個O-抗原重複多醣結構，則計算出光滑鼠傷寒沙門桿菌LPS之平均分子量為22 kDa。

表面電漿子共振實驗 ( 實例 1 至 3) 所有SPR實驗均在Reichert 2SPR系統上，在環境溫度下使用PBS-E (PBS pH 7.4+5 mM EDTA)操作緩衝液進行。將蛋白質在20 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.5中稀釋至50 µg/mL並使用NHS-EDC胺偶合(Fischer, 2010)將其固定至CMD200感測器晶片(Xantec Bioanalics, Duesseldorf, Germany)上達到2000-9 000 µRIU之反應。在比較不同參考化合物(乙醇胺、BSA、酪蛋白及脫脂乳)(Péterfi等人, 2000)之後，選擇乙醇胺作為所有實驗之參考通道的標準塗料。

藉由擠出(21次在70℃下通過100 µm過濾器)，將所有配體溶解於操作緩衝液中達到1 mg/mL。一式三份，以50 µL/min流動速率執行實驗。將各樣本注射於量測及參考通道上，保持90秒，隨後進行300秒解離。藉由2×30秒注射再生緩衝液(0.05% (w/w) CHAPS、0.05% (w/w)兩性清潔劑3-12、0.05% (v/v) tween 80、0.05% (v/v) tween 20及0.05% (v/v) triton X-100)使晶片再生(Andersson, Areskoug及Hardenborg, 1999)。將量測資料輸出至TraceDrawer (RidgeView儀器實驗室)進行處理，且使用Origin (OriginLab corporation)生成最終曲線。使用下式將各構築體之信號針對K9正規化：

，其中S係正規化信號S0

表面電漿子共振實驗 ( 實例 4 及 5) SPR實驗係在Nicoya OpenSPR系統上，在環境溫度下使用PBS-E (PBS pH 7.4+5 mM EDTA)操作緩衝液進行。將SadA K9稀釋於10 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.5中達到50 µg/mL並使用NHS-EDC胺偶合(Fischer, 2010)固定至Carboxyl Sensor(OpenSPR)上達到700 RU之反應。

藉由擠出(21次在70℃下通過100 µm過濾器)，將所有配體溶解於操作緩衝液中達到1 mg/mL。一式三份，以35 µL/min流動速率執行實驗。將各樣本注射於量測及參考通道上，保持125秒，隨後進行300秒解離。藉由125秒注射再生緩衝液(0.05% (w/w) CHAPS、0.05% (w/w)兩性清潔劑3-12、0.05% (v/v) Tween 80、0.05% (v/v) Tween 20及0.05% (v/v) Triton X-100)使晶片再生(Andersson等人, 1999)。將量測資料輸出至TraceDrawer (RidgeView儀器實驗室)進行處理，且使用Origin (OriginLab corporation)生成最終曲線。

電子顯微術 將樣本黏附至量測網格，用1%醋酸鈾染色一分鐘，並包埋於1.8%甲基纖維素/0.4%醋酸鈾中。在Philips CM100穿透式電子顯微鏡中，使用Olympus Quemesa攝像機，在80 kV下記錄圖像。

鱟阿米巴樣細胞溶解產物 (LAL) 分析 使用LAL分析(Pierce, Thermofisher)測試GCN4-PII對LPS之遮蔽效應。向濃度範圍在200 µg/mL-20 pg/mL內之GCN4-PII中摻加0.5個內毒素單元/毫升LPS(EU/mL)，並開展以下所提供之方案。

圓二色性 使用Jasco J-810分光偏振計(Jasco International Co)記錄光譜。使用1.0 cm路徑長度之石英比色管進行量測。在190至250 nm範圍內，用50 nm/min掃描速率及0.5 nm之頻寬掃描各樣本五次。在37℃下，在10 mM Tris pH 7.4中0、0.5、1、3及9之GCN4-pII比LPS比率下記錄光譜。使用K2D2計算肽之近似α-螺旋含量。

核磁共振 (NMR) 光譜法 在含有450 µL於50 mM NaCl、7% D2O及0.2 mM 4,4-二甲基-4-矽戊烷-磺酸(DSS)中之1.5 mM合成FMet-GCN4-PII (Genscript, China)的Bel-Art™ SP Scienceware™ 5mm O.D.薄壁精密NMR管中進行NMR實驗用於分配。在308 K下，在裝備有5 mm 1H/13C/15N-低溫探針之Bruker Avance II 600 MHz NMR光譜儀上獲取光譜。使用DSS作為內部化學位移標準，且使用如所描述(Wishart等人, 1995)之頻率比參照13C及15N。收集以下光譜用於分配：13C-1H-HSQC、15N-1H-HSQC、1H-1H COSY、1H-1H TOCSY，使用60及80 ms之混合時間；以及1H-1H NOESY，使用80及100 ms之混合時間。使用Topspin 4.0處理所有光譜，且使用CARA 1.9.1 (Keller, 2004)選取峰。

基於生物素 -LPS(B-LPS) 之 ELISA 在4℃下，藉由將100 µl於PBS緩衝液(Cold spring harbor)中之10 µg/mL SadA K9培育隔夜來塗佈黑色96孔Greiner微量盤。次日，藉由培育150 µL於PBS中之2%牛血清白蛋白(BSA)來阻斷各孔。添加100 µL範圍在4 ng/mL至0.06 ng/mL內之生物素化LPS稀釋液作為結合搭配物且培育1小時。用150 µL PBS+0.1% BSA洗滌盤3次。添加100 µL之1:10 000 StrepTactin結合之辣根過氧化酶(IBA)一小時，並用QuantaRed螢光受質(Thermo)顯色15分鐘，且在Ex：550 nm、Em：610 nm下讀取螢光。

方案： 1. 藉由添加100 µL之10 µg/mL SadA片段溶液塗佈96孔黑色Greiner/Nunc Maxisorp盤，在4℃下保持隔夜。 2. 空孔，用150 µL於PBS中之5% BSA阻斷2小時。 3. 用150 µL於PBS中之0.1% BSA洗滌3次。 4. 空孔，添加100 µL生物素化LPS稀釋液。 5. 用150 µL於PBS中之0.1% BSA洗滌3次。 6. 添加100 µL Strep-Tactin結合之HRP (IBA)(1:20,000稀釋於PBS+0.35 M NaCl、50 mM MgSO4、0.1% BSA)中，保持60分鐘。 7. 用150 µL PBS+0.35 M NaCl、50 mM MgSO4、0.1% BSA洗滌4次，且接著用PBS+0.1% BSA洗滌一次。 8. 與Quantared HRP受質一起培育，15分鐘之後淬滅。 9. 在Ex：550 nm、Em：610 nm下讀取螢光。

所有受質均遵循供應商之說明書製備。將背景自信號減去，藉由將各重複之個別標準差與正交基線相加來計算誤差之傳播(δQ=√(δa² +δb² +⋯+δz² )，其中δQ係總和Q之組合的不確定性。誤差條表示一個標準差。

實例 1 - GCN4-PII 結合脂質 A 意欲研究推定的LPS與屬於三聚體自轉運黏附素SadA之兩個域之間的相互作用。使用兩個先前描述之SadA構築體(Alvarez等人, 2008；Hartmann等人, 2012)，即K9及K14，兩者皆藉由側接GCN4-PII區段而穩定。將K9或K14共價連接至SPR-晶片，並注射各種LPS組分。LPS結構之示意型式提供於圖2中以供參考。

注射光滑LPS立即產生反應，該反應在即將結束注射之際接近穩態(圖3a)。在接下來的解離階段期間，信號保持在平穩階段，指示不存在解離速率。除在解離期間信號出現微小增加外，注射粗糙及深層粗糙LPS變異體(圖3b及圖3c)顯示類似的結合曲線，而純化之多醣未顯示結合特徵(圖3d)。

結果顯示，含有脂質A部分之所有變異體較強結合至GCN4-PII，但純多醣則不結合，由此將相互作用侷限於脂質A部分。然而，不存在解離速率及LPS在溶液中形成聚集物之傾向(Sasaki及White, 2008；Richter等人, 2011)意謂該相互作用複雜的潛在生物物理學特徵，且意味著結果只能定性地解釋。咸信在注射粗糙及深層粗糙LPS變異體之後信號的增加與各變異體中存在之糖殘基的數量成反比。詳言之，相較於具有較長糖部分之LPS(Richter等人, 2011)，深層粗糙LPS具有明顯較高的疏水性與親水性比率，呈現較大、較少流動之形態。因此，在注射之後的信號增加解釋為歸因於相較於光滑變異體，較慢的重組以及深層粗糙聚集物分解。

使用6×His標籤純化構築體，其涉及在純化期間由於非特異性結合而具有內毒素耗盡作用(Mack等人, 2014)。為評價His標籤對結合之影響，比較除His標籤之外其他一致的兩個GCN4-pII側接之SadA構築體(K3及K3-His)。此等構築體產生彼此及與先前構築體幾乎一致的曲線，顯示His標籤對結合不具有影響(圖10)。

考慮GCN4-PII之間相互作用之性質係疏水性、靜電抑或兩者的組合。再生溶液之選擇幫助確定此問題。在實驗之前測試適合再生緩衝液之方法中，發現1 M NaCl不具有作用，而合計0.3%的非變性清潔劑之混合物在不到60秒內使樣本再生。此指示該相互作用中涉及較強疏水性因子。

實例 2 - GNC4-PII 以 高親和力結合 SPR結果不適於測定GCN4-pII/LPS相互作用之結合動力學。為了定量親和力，藉由使用純化蛋白質代替全細菌來修改先前所描述(Schmidt等人, 2016)之ELISA樣尾刺吸附(ELITA)分析。該分析類似於傳統ELISA，不過抗體經識別LPS之O-抗原的噬菌體尾刺蛋白質置換(圖11)。結果顯示，兩個構築體在較低pM範圍內展現極高結合親和力(圖5)，此與在SPR實驗中觀察到的零解離速率一致。此設置證明為有利的，因為其允許使用低於光滑LPS之臨界微胞濃度(CMC)之LPS濃度，否則會使解釋複雜化(Yu等人, 2006；Sasaki及White, 2008)。然而，歸因於LPS在阻斷之前塗佈微量滴定孔之傾向，間接配體-受體相互作用設置係不可行的。

實例 3 - GCN4-pII 溶解 LPS 聚集物 據觀察，將GCN4-PII添加至LPS中引起LPS聚集物之明顯分解。此係藉由使用穿透式電子顯微術比較在不同GCN4-pII比率下粗糙LPS之結構進行研究(圖6)。在實驗之前，使用LAL遮蔽分析(Schwarz等人, 2017)、圓二色性及NMR證實，合成GCN4-pII結合LPS且在結合後，保留其α-螺旋結構。NMR光譜證實，肽以同源α-螺旋狀態存在(圖14)，該狀態在LPS結合後仍保留(圖12)，且在1 µM之GCN4-pII濃度下對LPS顯示至少89%中和作用(結合)(圖13)。

如先前用低溫-EM所報導(Richter等人, 2011；Broeker等人, 2018)，用TEM觀察到粗糙LPS形成半徑為約10 nm且長度在至多數百奈米範圍內之管狀微胞(圖6，頂圖)。在與等莫耳濃度GCN4-PII一起培育之後，微胞結構完全消失，留下偶然存在之聚集物，此很可能由肽-LPS複合物之少量聚集引起(圖6，底圖)。

結果論述 ( 實例 1 至 3) 吾人最初開始研究推定的三聚體SadA域與LPS之間之相互作用。然而，結果顯示，用於使構築體穩定之GCN4-pII轉接子對LPS展示極高親和力。有趣的是，K_D 在皮莫耳濃度範圍內的GCN4-pII之親和力比人類LPS免疫受體TLR4 (141 µM)、CD14 (74 nM)、MD-2 (2.33 µM)及LPS結合蛋白質(3.5 nM)高3-5個數量級。利用GCN4-pII獲得的解離常數亦比對多黏菌素B (48 µM)，且甚至是專門設計的旨在獲得最高親和力之肽avibody之解離常數高1-6個數量級。另外，相對於以上所提及之若干結合搭配物，吾人顯示GCN4-pII對脂質A具有特異性。吾人展示，使用清潔劑，此相互作用係可逆的，且GCN4-pII易於將LPS聚集物溶解於溶液中，指示該相互作用主要為疏水性的。就吾人所知，此係首次報導的結合LPS之三聚體捲曲螺旋模體。含有先前報導(Hartmann等人, 2012)之晶體結構的GCN4-pII顯示，屬於核心異白胺酸之γ₂ 及δ-碳自核心伸出，沿捲曲螺旋凹槽形成疏水性表面。可設想，一或多個脂質A醯基鏈可沿此等凹槽對齊而形成極強相互作用，此模型亦解釋GCN4-pII如何分解LPS聚集物。然而，GCN4-pII亦具有陽離子性殘基形成之C末端補丁(patch)，且此等殘基亦可促成相互作用。

實例 4 - 基於 GCN4-pII 之 ELISA 的 靈敏度 本實驗旨在顯示，原則上，如此處利用GCN4-PII所顯示，寡聚蛋白質與LPS之結合可以與LAL分析相等或類似的靈敏度偵測LPS量。如先前實例中所述，使用基於SadA之構築體，特別是以上描述之K9構築體。

為確保分析之完整再現性，在最終最佳化條件下，以4次重複進行靈敏度實驗。為了抵消邊緣效應，僅使用內部隨機化孔。唯一例外狀況為A3:A10，其被保留用於最高濃度樣本。隨後，用LAL分析量測相同樣本以供比較。結果中僅包括一次重複實驗。

在使用生物素化LPS (B-LPS)之基於GCN4-pII之ELISA進行偵測(圖15)時，在0.06-1 ng/mL LPS濃度範圍內觀察到線性信號反應，意味著該分析可一致地偵測低至最低稀釋濃度(0.06 ng/mL)的B-LPS。

亦進行LAL分析以供比較。LAL分析中使用之LPS的濃度範圍係0.01-0.1 EU/mL。產生明顯信號之最低稀釋濃度係0.13 ng/mL(圖16)，意味著基於GNC4-pII之分析具有與LAL分析相當的靈敏度。兩種分析之結果比較顯示於圖17中。

實例 5 - GCN4-pII 與 LPS 之間結合的穩健性 為研究GCN4-pII與不同LPS類型之間結合的穩健性，使用SPR檢查自各種病原體及變形菌門(proteobacteria)收集之LPS變異體的廣泛選擇(表4)。簡而言之，使用基於EDC-NHS之胺偶合將K9固定於SPR晶片上之羧基基質。一式三份，注射0.5 mg/mL之不同LPS類型以觀察信號。表 4

類型	候選物	類型	註釋
α-變形菌	漢賽巴爾通體(B. henselae )	粗糙	漢賽巴爾通體LPS係少數已知非熱解性LPS類型之一(Chenoweth等人, 2004)。
β-變形菌	乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica )	粗糙	奈瑟氏菌屬細菌攜帶LPS樣分子，稱為脂寡醣(LOS)。LOS在結構上與經典LPS極其類似，但很少與O-抗原一起出現(Moran等人, 1996)。
γ-變形菌	大腸桿菌BL21 、腸沙門氏菌(S.enterica )、鴨沙門氏菌	-	先前顯示結合若干物種。
類桿菌門	牙齦吡咯單胞菌(Porphyromonas gingivalis )	光滑	確切結構未知，很可能為光滑變異體。
不常見LPS	霍亂弧菌(V.cholerae )	粗糙	霍亂弧菌LPS具有不常見的脂質A醯化模式，且在Kdo2-糖上不存在磷酸酯基(Reidl及Klose, 2002)。

在先前的工作中，吾人比較來源於γ-變形菌，即腸沙門氏菌、鴨沙門氏菌及大腸桿菌BL21 之LPS的結合。注射LPS立即產生反應，該反應在即將結束注射之際接近穩態。在接下來的解離階段期間，信號保持在平穩階段，指示不存在可量測之解離速率。儘管不同曲線具有極類似的形狀，但最終反應(µRIU)在其間變化，且與每個LPS分子的糖部分之量呈反相關。此意味著，相較於LPS光滑對應物(具有O-抗原重複序列)，粗糙LPS類型(缺乏O-抗原)通常產生明顯較強的信號。由於所有LPS類型均以相同的重量濃度(mg/mL)注射，但反應之差異很可能反映高分子量變異體之較低莫耳濃度。

在當前工作中檢查的LPS類型之結合曲線(圖18)均共有類似的結合曲線且無解離速率，指示強結合。鼠傷寒沙門桿菌WaaL LPS係一種粗糙類型，預期在注射時產生適度地高反應。乳糖奈瑟氏菌及漢賽巴爾通體均為較大的粗糙變異體，預期在與WaaL相同之範圍內產生反應，不過，乳糖奈瑟氏菌產生較大變異體幾乎兩倍的反應，此可藉由對核心糖之大量唾液酸修飾說明。霍亂弧菌具有粗糙LPS及低分子量光滑LPS之混合物。因此，約為WaaL信號之1/3的反應並非出人意料的。牙齦吡咯單胞菌(P. gingivalis ) LPS具有低反應，表明中等至較大的光滑LPS類型。與商業上獲得的牙齦吡咯單胞菌LPS一起提供之文件未命名菌株或變異體，因此重量必須藉由SDS-PAGE確認。

總之，GCN4-pII結合至測試的所有LPS類型。

結果之論述 ( 實例 4 及 5) LAL分析使用對較低量LPS具有高靈敏度的馬蹄蟹(Lee, 2007)之血液中的酶級聯。使用LAL分析進行直接比較能夠顯示，GCN4-pII肽可以幾乎不能用LAL分析偵測之濃度結合生物素化LPS，且當對與螢光酶受質偶合之生物素使用常規偵測方法時，此結合仍產生明顯信號。重要的是，此偵測方法可用於不同緩衝液背景以及可注射藥物背景中。吾人已實現0.01 EU/mL LPS之靈敏度，與LAL分析相當，且資料表明，利用ELISA樣分析，例如藉由微調洗滌緩衝液條件可實現甚至更高的靈敏度。

吾人使用來自範圍自α-變形菌至γ-變形菌之變形菌門的不同分枝系，以及來自類桿菌門之LPS變異體(圖19)。選擇涵蓋腸道病原菌(霍亂弧菌、沙門氏菌屬細菌、大腸桿菌)、細胞內病原體(漢賽巴爾通體)及口腔病原體(牙齦吡咯單胞菌)以及共生細菌(乳糖奈瑟氏菌)。已知一種所使用之物種具有不會引起強免疫反應之LPS變異體(漢賽巴爾通體)(Zähringer等人, 2004)。

沙門氏菌屬細菌與埃希氏菌屬一起定位，且在圖19中所示之樹中未分開展示。亦應注意，巴爾通體屬細菌最接近所展示之布氏桿菌(Brucella )，且出於此圖之目的，牙齦吡咯單胞菌係類桿菌屬之一部分。另外，厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)及螺旋體門(Spirochaetes)之較大群不具有LPS作為其膜組分之一部分。

總體而言，使用SPR能夠顯示，使用的所有LPS變異體均較強地結合至GCN4-pII肽。儘管結合之「締合速率」存在明顯差異，但對任何LPS變異體均無可偵測之「解離速率」，表明肽可以類似方式偵測所有此等變異體(儘管結合動力學存在微小差異)。

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現將參照以下附圖，在以下非限制性實例中更詳細地描述本發明：圖 1 顯示自PDB-ID 2YO0(Hartmann等人, 2012)改編之GCN4-pII三聚體的結構。(A)側視圖。(B)正視圖，其中位置a及d中的核心異白胺酸殘基呈綠色。圖 2 顯示基於鼠傷寒沙門桿菌(S. typhimurium )之LPS的LPS之通式結構的示意形式。脂質A部分(插圖)由嵌入外膜中的具有四個O-連接之醯基鏈及兩個N-連接之醯基鏈的兩個磷酸葡糖胺組成。核心寡醣(COS)經由糖苷鍵連接至脂質A，且O-抗原連接至倒數第二個COS糖。O-抗原由在4個與40個重複單元之間變化的四糖重複序列組成，具有平均30個重複序列(Peterson及McGroarty, 1985)。脂質A及兩個近端3-脫氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)糖在革蘭氏陰性物種間高度保守，而其餘COS及O-抗原分別在細菌物種及血清型間保守。圖 3 顯示在將不同LPS組分注射至固定之K9-GCN4-PII之後的SPR結合曲線。豎直線指示注射之開始及結束。(A)顯示全部LPS之注射。(B)顯示缺乏O-抗原之粗糙LPS的注射。(C)顯示除兩個近端KDO外缺乏所有糖的深層粗糙LPS之注射。(D)顯示缺乏脂質A之LPS多醣的注射。圖 4 顯示對於圖3中測試之每種LPS組分，在注射結束時針對配體之莫耳濃度正規化的SPR差值之圖。圖 5 顯示LPS與兩個含GCN4構築體K9-His(左圖)及K14-His(右圖)之ELITA結合曲線。圖 6 顯示在4k(左圖)及8k(右圖)放大倍率下單獨LPS(頂圖)及具有GCN4-pII之LPS(底圖)的TEM圖像。圖 7 顯示所產生之構築體的示意性概述。來源於SadA之構築體最初描述於Alvarez等人(Alvarez等人, 2008)及Hartman等人(Hartmann等人, 2012)中。andreinlvpas構築體最初描述於Deiss等人(Deiss等人, 2014)中。GCN4構築體係由GenScript(GenScript Biotech Corp)合成。圖 8 顯示利用不同鼠傷寒沙門桿菌LPS組分的固定之K9之SPR Fc1、Fc2及Fc1-F2曲線。(A)係利用光滑LPS。(B)係利用粗糙LPS。(C)係利用深層粗糙LPS。(D)係利用來源於LPS之多醣。圖 9 顯示利用不同鼠傷寒沙門桿菌LPS組分的固定之K14之SPR Fc1、Fc2及Fc1-F2曲線。(A)係利用光滑LPS。(B)係利用粗糙LPS。(C)係利用深層粗糙LPS。(D)係利用來源於LPS之多醣。圖 10 顯示利用不同鼠傷寒沙門桿菌LPS組分的固定之K3 (Fc1通道)及K3-His (Fc2通道)的SPR Fc1、Fc2及Fc1-F2比較曲線。(A)係利用光滑LPS。(B)係利用粗糙LPS。(C)係利用深層粗糙LPS。(D)係利用來源於LPS之多醣。圖 11 顯示利用K9及K14之ELITA實驗的絕對值(頂圖)以及設置及陰性對照(底圖)。SadA=沙門氏菌屬組分K9或K14。BSA=牛血清白蛋白。TSP=噬菌體尾刺蛋白質。ST-HRP=streptactin結合之辣根過氧化酶。圖 12 顯示單獨及在LPS存在下之GCN4-pII的CD光譜。可以看出，在結合至LPS之前及之後，GCN4-pII之二級結構組成存在極小變化。圖 13 顯示LAL分析之結果的圖，展示在外加0.5 EU /mL LPS下，濃度在10至0.1 µM範圍內之GCN4-pII的遮蔽效應。在1 µM GCN4-pII下觀察到最佳遮蔽，其中遮蔽效應係總信號之89%。圖 14 顯示GCN4-pII之2D¹ H-¹ H TOCSY NMR光譜之指紋區(fingerprint region)。所有29個預期之旋轉系統均得到充分解析且為可分配的，無峰分裂之跡象，表明樣本在溶液中係均質的。圖 15 顯示使用生物素化LPS偵測的基於GCN4-pII之ELISA之結果的圖。圖 16 顯示使用與圖15之分析中相同之樣本的LAL分析之結果的圖。圖 17 顯示比較基於GCN4-pII之ELISA與LAL分析之結果的圖。圖 18 顯示各種LPS類型及作為對照的操作緩衝液PBS-E之SPR結合曲線。圖 19 顯示實例5中使用之LPS變異體的系統發生分佈。此圖改編自Bern及Goldberg, 2005。

Claims (33)

1. 一種寡聚蛋白質作為結合劑結合至脂多醣(LPS)之用途，該寡聚蛋白質具有包含至少兩個單體肽之捲曲螺旋結構，其中每個單體肽可以相同或不同，能夠形成α-螺旋且包含至少一個與SEQ ID NO.1之七肽重複序列具有至少60%序列一致性的核心序列。
2. 如請求項1之用途，其中該核心序列包含至少3個七肽模體a-b-c-d-e-f-g或其變異體，每個變異體包含對該七肽模體之不超過1個插入或缺失。
3. 如請求項1或請求項2之用途，其中至少50%的對應於該等七肽模體或其變異體之位置a及d之胺基酸殘基係疏水性殘基。
4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該核心序列在一側或兩側上側接有側接胺基酸序列。
5. 如請求項4之用途，其中該側接序列包含一或多個七肽模體，及/或其一或多個部分，較佳地其中該側接序列中之七肽模體對應於如在SEQ ID NO.1中，或在與其具有至少80%序列一致性之序列中所發現之七肽模體，其限制條件為，該七肽模體中之胺基酸殘基a及d中的至少一個係疏水性殘基。
6. 如請求項4或5之用途，其中該側接序列包含SEQ ID NO.1或其部分，或與其具有至少50%序列一致性之序列，其中至少50%的對應於SEQ ID NO.1之七肽模體或其變異體之位置a及d的胺基酸殘基係疏水性殘基。
7. 如請求項3至6中任一項之用途，其中該側接序列包含一或多個連接子序列。
8. 如請求項1至7中任一項之用途，其中該等單體肽各自包含兩個或多於兩個核心序列，其中該等核心序列可以相同或不同。
9. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該寡聚蛋白質係二聚體、三聚體或四聚體。
10. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該寡聚蛋白質係三聚體。
11. 如請求項1至10中任一項之用途，其中該等單體肽係呈獨立鏈提供。
12. 如請求項1至10中任一項之用途，其中該等單體肽連接在一起。
13. 如請求項12之用途，其中該等單體肽連接成單一鏈或其中該等單體肽藉由一或多個化學交聯連接。
14. 如請求項1至13中任一項之用途，其中該等七肽模體或其變異體中之每個疏水性殘基獨立地選自由以下組成之群：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸及其化學衍生物。
15. 如請求項14之用途，其中每個疏水性殘基獨立地選自白胺酸及異白胺酸，或其化學衍生物。
16. 如請求項15之用途，其中該等化學衍生物係氟代白胺酸或氟代異白胺酸。
17. 如請求項1至16中任一項之用途，其中該等疏水性殘基中之至少50%係異白胺酸或氟代異白胺酸。
18. 如請求項1至17中任一項之用途，其中： (i)至少50%的對應於該等七肽重複序列或其變異體中位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基係極性殘基；及/或 (ii)至少5%的對應於該等七肽重複序列或其變異體中位置b、c、e、f及g之胺基酸殘基係脂族殘基。
19. 如請求項1至18中任一項之用途，其中每個單體肽包含18至40個胺基酸。
20. 如請求項1至19中任一項之用途，其中每個單體肽在該核心序列內包含至少4個陽離子性胺基酸。
21. 如請求項1至20中任一項之用途，其中該寡聚蛋白質以在奈莫耳濃度或更低大小範圍內之K_D 結合至LPS。
22. 如請求項1至21中任一項之用途，其中該寡聚蛋白質係： (i)呈與一或多種額外組分之結合物或融合物形式； (ii)固定於固體基底上；或 (iii)結合至直接可偵測之偵測部分體。
23. 如請求項22之用途，其中： (i)該蛋白質與偵測部分體、寡聚化部分體或固定化部分體結合，或呈與融合搭配物之融合蛋白質形式； (ii)該蛋白質係固定於珠粒或樹脂上，或固定於孔或容器、或管柱或過濾材料之中或之上，或固定於偵測裝置之表面上；或 (iii)該偵測部分體係分光光度法或光譜法可偵測之標記。
24. 如請求項23中任一項之用途，其中該寡聚蛋白質之用途包含偵測樣本中之LPS及/或自樣本移除LPS。
25. 一種結合LPS之方法，該方法包含使該LPS或含有LPS之樣本與如請求項1至23中任一項中所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS，形成蛋白質-脂多醣複合物。
26. 如請求項25之方法，其中該方法進一步包含偵測樣本中LPS之存在，該方法包含： (a)使該樣本與如請求項1至23中任一項中所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS，形成蛋白質-脂多醣複合物； (b)偵測蛋白質-脂多醣複合物之存在。
27. 如請求項25之方法，其中該方法進一步包含自樣本移除LPS，該方法包含： (a)使該樣本與如請求項1至23中任一項中所定義之寡聚蛋白質接觸，以允許該蛋白質結合至該LPS，形成蛋白質-脂多醣複合物； (b)自該樣本分離出該肽-脂多醣複合物。
28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該寡聚蛋白質呈包含可偵測標記之結合物形式及/或其中該寡聚蛋白質係固定於固體基底上。
29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中該樣本係來源於患者之臨床樣本或用於測試內毒素污染之產物的樣本。
30. 如請求項29之方法，其中該樣本係血液樣本，或來源於血液樣本之樣本。
31. 一種套組，其包含： (i)如請求項1至17中任一項中所定義之寡聚蛋白質；及 (ii)至少一種非變性清潔劑。
32. 如請求項31之套組，其中該套組係用於如請求項1至24中任一項之用途或用於如請求項25至30中任一項之方法中。
33. 一種產物，其包含固定於固體基底上的寡聚蛋白質，其中該寡聚蛋白質如請求項1至21中任一項中所定義。

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