KR20170134978A - 클라미디아 수이스의 검출을 위한 방법 및 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항원 결정기(antigenic determinant)로서 GTKDASID 및/또는 or SQQSSIAS의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 사용하여 대상에서 클라미디아 수이스(Chlamydia suis) 감염을 검출하고 진단하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

클라미디아 수이스의 검출을 위한 방법 및 펩타이드

본 발명은 대상에서 클라미디아 수이스(Chlamydia suis) 감염을 검출하고 진단하기 위한 방법 및 이를 위한 진단 키트에 관한 것이다.

클라미디아세아에(Chlamydiaceae) 종은 잘 알려진 병원균이며, 동물과 인간 모두에서 다양한 증상을 일으킨다(Longbottom and Coulter 2003). 클라미디아 아보르투스(C. abortus) 및 클라미디아 프시타시(C. Psittaci)의 문서로 충분히 입증된 인수공통체 가능성(zoonotic potential) 외에, 최근에서야 몇몇 연구가 인간의 눈으로부터의 C. 수이스 균주의 분리를 보고하였다(Dean et al . 2013b; De Puysseleyr et al . 2014a). 인수공통 C. 수이스 감염의 원인은 이 박테리아의 유일한 동물 숙주인 돼지이다. C. 수이스가 가장 널리 퍼진 클라미디아 종으로 간주되지만, 클라미디아 페코룸(C. pecorum), 클라미디아 아보르투스(C. abortus) 및 클라미디아 프시타시(C. psittaci)에 의해 돼지도 감염될 수 있다(Schautteet and Vanrompay 2011b). 돼지의 클라미디아 감염은 증상과 항상 관련이 있는 것은 아니지만, 만약 그런 경우, 관절염, 심막염, 다발성 장막염, 폐렴, 결막염, 장염, 설사 및 번식 장애로 인한 중요한 경제적 손실을 초래한다(Zahn et al . 1995; Andersen and Rogers 1998; Eggemann et al . 2000). 진단된 감염은 일반적으로 테트라사이클린 항생제로 치료되지만, 테트라사이클린 내성 C. 수이스 균주가 점점 더 많이 출현하고 있다(Andersen and Rogers 1998; Schautteet et al . 2010; Di Francesco et al . 2011; Borel et al . 2012; Schautteet et al . 2013). 클라미디아 종 간의 항생제 내성 유전자의 생체외 전달은 Suchland 등에 의해 입증된다(Suchla nd et al . 2009). 이러한 발견은 C. 수이스의 가능한 인수공통 특징과 관련된 또 다른 관심사를 제기한다. 인간 개인의 테트라사이클린 내성(Tc^R) C. 수이스 및 계통 발생학적으로 밀접하게 관련된 인간 병원균 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis)의 동시 감염은 내성 유전자의 전달 및 Tc^R C. 트라코마티스 균주의 출현을 위한 이상적인 환경을 조성한다. 다중 내성 균주의 생성을 피하기 위해, C. 수이스의 역학(epidemiology) 및 감염 생물학(infection biology)에 대한 포괄적인 지식이 필요하다. C. 수이스 특이적인 분자 검사(De Puysseleyr et al . 2014b; Lis et al . 2014)를 개발하고 이러한 분석을 이용하여 인간 위험 개체군에서 C. 수이스의 존재를 검사(De Puysseleyr et al . 2014a)하기 위한 노력이 최근에 이루어졌다. 그러나, 동물 또는 인간의 시료에서 살아있는 C. 수이스 박테리아의 검출은 이 미생물의 현존하는 감염의 존재에 대한 어떠한 정보도 제공하지 못한다. 항-C. 수이스 항체의 존재를 검출하기 위한 혈청학적 검사는 실제로 면역 반응의 존재 및 그에 따른 감염을 증명할 수 있다. 불행히도, C. 수이스 특이적인 혈청 진단에 대한 분석은 현재 가능하지 않다.

클라미디아 항원 또는 항-클라미디아 항체를 표적으로 하는 수많은 혈청학적 분석이 공개되었다(Sachse et al ., 2009). 표면 노출 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)(Wittenbrink et al . 1991), 지질다당류(LPS)의 구조를 나타내는 trisaccharide alphaKdo(2-->4)alphaKdo(2-->4)alphaKdo (Kdo, 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulopyranosonic acid)를 포함하는 합성 신당 접합체(neoglycoconjugate)(Brade et al ., 2000) 및 주요 외측 막 단백질(major outer membrane protein, MOMP)(Vanrompay et al . 2004; Medac, Wedel, Germany), 다형성 외측 막 단백질(polymorphic outer membrane proteins, Pmps)(Longbottom et al . 2001; Longbottom et al . 2002) 또는 전체 기본 소체(elementary body, EB) 제제(Di Francesco et al . 2006)로부터의 전장 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체 검출을 기반으로 하는 분석이 민감도와 특이성 측면에서 다양한 성공의 정도로 개발되었다. 그러나, 경우에 따라서는, 클라미디아 종 간의 교차 반응성이 결과의 해석을 방해할 수 있다(Donati et al ., 2009). Hoelzle 등은 C. 수이스, C. 아보르투스 및 C. 페코룸의 전장 재조합 MOMP 단백질이 감염성 클라미디아 종을 확인하기 위한 ELISA 분석에서 적합함을 입증하였다(Hoelzle et al ., 2004). 그러나, 지금까지, 이 방법은 본 분야의 동물에서는 더 이상 입증되지 않았다. 또한, Pmp90의 재조합 단백질 단편이 C. 아보르투스 감염의 혈청학적 진단에 성공적으로 사용되었다(Longbottom et al ., 2001). Pmps는 중요한 독성 인자로 간주되며 여러 연구에서 면역 반응의 유도(Grimwood and Stephens 1999; Niessner et al 2003, Wehrl et al 2004) 및 방어 면역(Cevenini et al . 1991)을 입증하였다. Tan 등은(2009) Pmps가 C. 트라코마티스 감염 환자에서 다양한 혈청학적 반응을 유도한다는 것을 입증하였다. 그러나, 성별 및 임상 결과와 관련된 Pmp 아형 특이적 항체 반응성의 강도 및 특이성의 차이가 관찰되었다. 이는 Pmp 유전자 군이 항원 변이의 메커니즘의 토대를 형성함을 나타낸다. C. 아보르투스의 PmpD 단백질은 실험적으로 감염된 암양(ewe)의 혈청을 사용하여 주요 항원으로 인식되었다. 또한, 이 연구에서 MOMP 단백질과 전위된 액틴 모집 단백질(translocated actin recruitment protein, Tarp)이 반응성 단백질로 확인되었다(Marques et al ., 2010; Forsbach-Birk et al ., 2013). Tarp 단백질은 또한 C. 트라코마티스에 감염된 사람의 항체에 의해 우세하게 인식된다(Wang et al ., 2009).

항-C. 수이스 항체의 특이적 검출은 돼지와 인간에서 현존하는 감염에 대한 증거를 제공할 수 있는데, 이는 이 미생물의 인수공통 전이의 연구에서 필수적인 인자이다. 불행히도, 현재까지 민감한 C. 수이스 특이적 분석법은 동물 또는 인간의 혈청 진단에 이용 가능하지 않으며 C. 수이스의 주요 반응 항원을 확인하는 연구는 오늘날까지 공개되지 않았다. 실제로, 돼지에서의 혈청 유병률(seroprevalence) 연구는 LPS, MOMP 및 전체 EB 제제에 대한 항체의 검출을 근거로 하며, 다른 클라미디아 종 또는 다른 병원체에 대한 항체와의 혈청 교차 반응이 발생한다(Schautteet and Vanrompay 2011).

따라서, 대상에서 클라미디아 수이스의 검출 또는 진단에 유용한 항원 펩타이드(antigenic peptide)에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명은 특히 혈청 진단학적 용도를 위한 C. 수이스 특이적 항원 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 키트를 포함한다.

따라서, 본 발명의 일 실시형태는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진 펩타이드에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 대략 7 개 내지 30 개의 아미노산 길이이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 대상에서 클라미디아 수이스 감염을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 환자에서 클라미디아 수이스의 존재를 검출하기 위한 방법을 포함하며, 이 방법은,

- 대상의 생물학적 시료를 제공하는 단계, 및

- 서열번호 1로 표시되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 대략 7 개 내지 30 개의 아미노산 길이의 펩타이드 및/또는 서열번호 2로 표시되는 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 대략 7 개 내지 30 개의 아미노산 길이의 펩타이드에 대한 항체의 존재에 대해 시료를 분석하는 단계를 포함하고,

하나 또는 둘 모두의 펩타이드에 대한 항체의 존재는 대상에서 클라미디아 수이스의 존재를 나타낸다.

본 발명의 이 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 다음 단계 중 하나 또는 모두를 포함한다:

- 본원에 개시된 펩타이드(들)가 부착되는 표면이 제공되는 단계;

- 대상에서 수득된 혈액 또는 다른 (유체) 시료를, 에피토프에 대한 항체의 특이적 결합을 허용하는 조건 하에서, 선택적으로 무관한 성분의 제거 이후, 표면과 접촉시키는 단계;

- 항체-펩타이드 복합체를 검출하고 및/또는 결합된 항체의 양을 결정하는 단계;

- 선택적으로, 표면과 상호 작용하지 않는 임의의 시료 성분을 제거하기 위해 제 1 및 제 2 단계 사이에 세척 단계가 삽입되는 단계. 또 다른 세척 단계는 제 2 접촉 단계 이후에 그리고 결정 단계 이전에 수행될 수 있다.

바람직하게, 생물학적 시료는 포유동물, 특히 인간 또는 돼지의 것이다.

특정 실시형태에서, 항체의 검출은 ELISA와 같은 면역 분석법을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 시험되는 생물학적 시료는 도말(smear) 또는 체액, 바람직하게는 점막 분비물 또는 혈액, 특히 혈청이다.

진단은 질병의 초기 단계, 치료 도중뿐만 아니라 감염의 제거 이후에 가능하다. 또한 펩타이드는 백신화된 대상을 감염된 대상과 구별하는데 유용할 수 있다(DIVA 원칙). 본 발명의 또 다른 실시형태는 특히 본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한, 즉 대상에서 C. 수이스의 존재를 검출하기 위한, 클라미디아 수이스 항원 펩타이드 및 이들 펩타이드를 포함하는 키트에 관한 것이다. 바람직하게, 테스트 키트는 ELISA용이다.

본 발명은 또한 대상에서 C. 수이스 감염의 진단을 위한 펩타이드(들) 또는 키트의 용도, 및 상기 펩타이드(들) 또는 키트를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용된 단수 형태는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 단수 및 복수를 모두 포함한다. 본원에서 사용된 "~으로 구성되는", "~으로 구성되다" 및 "~으로 이루어지는"이라는 용어는 "포함하는", "포함하다" 또는 "함유하는", "함유하다"와 동의어이며 포괄적이거나 제한이 없으며 추가적인, 인용되지 않은 부재, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 매개 변수, 양, 일시적인 지속 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용된 "대략"이라는 용어는 개시된 발명에서 수행하기에 적합한 한 특정 값의 ±20% 이하, 바람직하게는 ±10% 이하, 더욱 바람직하게는 ±5% 이하의 변화를 포함하는 것을 의미한다. 수식어 "대략"이 의미하는 값 그 자체는 구체적으로 그리고 바람직하게 개시되는 것으로 이해해야 한다. 한 그룹의 구성원에서 하나 이상의 또는 적어도 하나의 구성원(들)과 같은 "하나 이상의"또는 "적어도 하나의"라는 용어가 그 자체로 명백할지라도, 추가적인 예시로서, 이 용어는 그 중에서도 특히 상기 구성원 중의 임의의 하나, 또는 상기 구성원 중의 임의의 둘 이상에 대한 언급, 예를 들어, 상기 구성원 중 임의의 >3, >4, >5, >6 또는 >7 등 및 상기 모든 구성원 모두까지에 대한 언급을 포함한다. 본 명세서에서 구체적으로 언급되고 인용된 모든 참고 문헌 및 교시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하여 본 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가 지침에 의해, 용어 정의가 본 발명의 교시를 더 잘 이해하기 위해 포함된다. 다음의 구절에서, 본 발명의 다양한 양태가 더욱 상세하게 정의된다. 이렇게 정의된 각각의 양태는 명확하게 반대되는 경우를 제외하고는 임의의 다른 양태 또는 양태들과 결합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 지시되는 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 지시되는 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다. 본 명세서 전체에서 "일 실시형태"또는 "실시형태"에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다.

본 발명은 대상에서 클라미디아 수이스 감염을 진단 또는 검출하기 위한 펩타이드, 키트 및 방법에 관한 것이다. 방법은 클라미디아 수이스의 주요 외측 막 단백질(MOMP) 및/또는 다형성 막 단백질 C(pmpC)로부터 유래된 면역 반응성 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체의 검출을 기반으로 한다.

동물성 클라미디아 감염에서의 항체의 검출은 임상적 질병의 확인 또는 감염의 유무의 확인, 감염의 유행을 추정하기 위한 역학적 조사의 수행 또는 예방 접종 후 면역 상태의 결정과 같은 다수의 목적을 갖는다.

C. 수이스와 C. 트라코마티스는 계통 발생학적으로 밀접하게 관련되어 있으며 C. 수이스 서열 정보의 이용 가능성이 제한되어 있기 때문에 특정 항원의 선별은 다소 복잡하다. 따라서, 본 발명은 다른 병원균에 대한 교차-반응을 최소화하기 위한 8-아미노산 펩타이드 항원의 동정에 초점을 두었다. C. 수이스 전위된 액틴 모집 인단백질(translocated actin-recruiting phosphoprotein, Tarp) 및 다형성 막 단백질(Pmp)의 인-실리코(in silico) 분석은 두 균주의 서열을 기반으로 하였으며 생체외 스크리닝은 세 가지의 다른 균주의 혈청을 이용하여 수행하였다. 방법론은 사용된 모든 C. 수이스 균주에 대한 대표적인 항원인 펩타이드를 스크리닝하고 실험적으로 생성된 양성 및 음성 대조군 혈청을 사용하여 추가 시험을 위해 세 가지 펩타이드(하나의 Tarp, 하나의 PmpC, 및 하나의 MOM P)의 선별로 이어졌다. 확인된 MOM P 및 PmpC 펩타이드 항원이 특히 돼지에서 C. 수이스의 혈청 진단에 유용하다는 것을 본 발명에서 처음 입증하였다.

따라서, 본 발명은 항체에 의해 특이적으로 인식되는 C. 수이스의 MOM P 및 PmpC로부터 유래된 에피토프에 관한 것이다. 특히, 상기 에피토프는 서열번호 1(GTKDASI D) 또는 서열번호 2(SOOSSIAS)로 표시되는 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 에피토프를 포함하는 펩타이드, 특히 면역 반응성 펩타이드에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "면역 반응성 펩타이드"또는 "펩타이드 항원"은 6 개, 7 개 또는 8 개 및 최대 35 개 또는 40 개 아미노산 잔기 길이와 같은 적어도 대략 7 개 아미노산 잔기의 (폴리)펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드는 일반적으로 대략 7 개 내지 30 개의 아미노산 길이, 이들 사이의 모든 정수를 포함하여, 특히 대략 8 개 내지 25 개의 아미노산, 특히 대략 8 개 내지 20 개의 아미노산, 및 심지어 대략 8 개 내지 15 개의 아미노산 길이를 포함한다. 본원에 개시된 면역 반응성 펩타이드는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 및 이의 용도를 포함한다. 본 발명의 펩타이드는 단독으로 또는 바람직하게는 조합으로 사용될 수 있다.

본원에서 정의된 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산의 치환 및/또는 결실이 반응성 및/또는 특이성의 과도한 감소 없이 이루어질 수 있음을 숙련자는 인식할 것이다. 본 발명의 펩타이드 또는 에피토프와 기능적으로 동등하지만, 비-자연 발생, 변형 및/또는 합성일 수 있는 특정 아미노산 잔기를 함유하는 이러한 변이체는, 이들이 C. 수이스에 특이적인 항체에 의해 인식되는 경우 본 발명의 범위에 있다. 숙련자는, 예를 들어, 단일 아미노산 치환을 포함하는 에피토프 유사체의 항체 결합능이 적합한 스캐닝 기술을 사용하여 결정될 수 있다는 것을 알 것이다. 일 실시형태에서, 펩타이드는 담체와의 접합을 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 화학적 결합 방법이 말단 시스테인을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

"실질적으로 동일한" 서열(선택적으로 "변이체"라 함)은 본원에서 논의된 바와 같은 하나 이상의 보존적 치환에 의해서만 또는 아미노산 분자의 생물학적 기능을 파괴하지 않는 서열의 위치에 위치하는 하나 이상의 비-보존적 치환, 결실, 또는 삽입에 의해서 참조 서열과는 다른 아미노산 서열이다. 이러한 서열은, 예를 들어, FASTA를 사용하여 비교를 위해 사용된 서열에 대해 아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서 75% 내지 99%, 또는 더욱 일반적으로는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 또는 95%, 또는 96%, 97%, 98% 또는 99%까지 동일한 임의의 정수일 수 있다. 폴리펩타이드의 경우, 비교 서열의 길이는 적어도 5 개, 10 개 또는 15 개의 아미노산 및 20 개, 25 개, 30 개 또는 40 개 아미노산(이들 사이의 모든 정수를 포함함)일 수 있다. 서열 동일성은 공개적으로 이용 가능한 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 국립 의학 도서관에서 입수 가능한 BLAST 소프트웨어)를 사용하여 용이하게 측정될 수 있다.

대안적으로, 변이체는 상기 펩타이드 서열 중 하나를 변형시키고, 예를 들어 본원에 기재된 대표적인 절차를 사용하여 변형된 펩타이드의 항원 특성, 이차 구조 및/또는 수치요법 특성을 평가함으로써 확인될 수 있다. "보존적 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어 본 기술 분야의 숙련자가 펩타이드의 특성이 실질적으로 변하지 않을 것으로 기대할 수 있는 것이다. 일반적으로, 다음 아미노산 군은 보존적 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 특정 실시형태에서, 실질적으로 동일한 서열은 클라미디아 수이스 균주 또는 분리물(isolate)로부터 유도된다.

본 발명의 MOMP 및/또는 pmpC 유래 펩타이드 또는 에피토프에 대한 항체의 존재의 확인은 C. 수이스 감염을 나타낸다. 더욱 구체적으로, 대상에서 상기 항체의 존재는 과거(감염이 제거됨), 초기 또는 후기 감염을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드(들)에 대한 항체의 검출은, 백신 항원이 본 발명의 펩타이드와 구체적으로 상이한 경우, 백신-유도된 항체 및 현장 균주에 대한 항체("DIVA"는 감염된 동물과 백신화된 동물의 구별(Differentiating Infected from Vaccinated Animals)을 나타냄)에 유용할 수 있다. 이러한 마커 분석은 백신에 존재하지 않는 이들 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체를 검출할 수 있다. 따라서, 자연적으로 감염된 동물은 백신화된 동물들에서 검출될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 C. 수이스 감염을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,

a) 생물학적 시료를, 항체/펩타이드 복합체의 형성에 충분한 시간 동안 및 조건 하에, 선택적으로 고체상에 코팅된 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 항체/펩타이드 복합체를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 복합체의 존재는 상기 생물학적 시료에서 클라미디아 수이스 항체의 존재를 나타내고,

항체의 존재는 C. 수이스 감염을 나타낸다.

본 발명의 일 실시형태에서, 방법은 생체외 방법이다. 특정 실시형태에서, 검출될 항체는 IgA, IgM 및/또는 IgG 유형이다. 따라서, 클라미디아 수이스에 대한 생물학적 시료에서의 항체의 정성적 및 정량적 검출이 가능하며, 과거(IgM/IgG), 급성, 최근(IgM) 및/또는 만성(IgG) 감염의 진단 및/또는 구별을 지원하기 위해 권장된다.

특히, 본 발명의 펩타이드에 대한 항체의 존재를 결정하는 것이 C. 수이스 감염의 특이적인 진단을 가능하게 한다는 것을 본원에서 입증한다. 오늘까지, C. 수이스 감염에 대한 진단 검사는 이용 가능하지 않다. "대상"이란 용어는 인간 또는 다른 포유동물, 특히 암퇘지, 수퇘지, 및 새끼 돼지를 포함하는 돼지를 의미한다.

본원에 사용된 "생물학적 시료"라는 용어는 대상으로부터 추출되고, 처리되지 않고, 처리되고, 분리되며 농축될 수 있는 시료를 의미한다. 적합하게, 생물학적 시료는 대상의 신체의 임의의 부분에서 선택되지만, 생물학적 시료는 체액, 바람직하게는 점막 면봉 또는 점막 세척액과 같은 혈액 또는 점막 분비물인 것이 특히 바람직하다. 신체의 점막 표면은 가스 교환(폐), 음식 흡수(장), 감각 활동(눈, 코, 입, 및 목) 및 생식(자궁 및 질)에서의 생리적 활동으로 인해 신체의 내부에 대해 얇고 투과성인 장벽이 있다. 특히, 생물학적 시료는 진단될 대상의 혈청이다.

본원에 사용된 "진단하는"이란 용어는 대상이 소정의 질병, 장애 또는 질환을 앓았거나 앓고 있는지 여부를 숙련자가 평가하고 결정할 수 있는 방법을 의미한다. 숙련자는 하나 이상의 진단 지표, 즉, 항체를 기반으로 진단을 하며, 이의 양(존재 또는 부재 포함)은 질환의 존재, 중증도 또는 부재에 대한 지표이다. 또한, 본 발명의 펩타이드는, 백신 항원이 본원에 개시된 펩타이드와 (실질적으로) 상이한 경우, 감염된 대상을 백신화된 대상과 구별할 수 있는 신뢰할 수 있는 분석법(DIVA 분석법)을 개발하는데 특히 유용하다.

본원에서 사용된 "측정하는" 또는 "분석하는"이란 용어는 개체에서 유래한 시료 내의 각각의 항체의 정성적 또는 정량적 농도 수준을 포함하여, 이의 존재, 부재, 분량, 레벨 또는 양을 평가하는 것을 의미한다.

본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 시료에서 항체의 존재를 검출, 결정 또는 분석하는 단계는 본원에 개시된 펩타이드 항원 또는 에피토프에 대해 항체를 결합하는 단계 및 이어서 생물학적 시료로부터 분리된 항체의 결합 이벤트 또는 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 체액과 같은 시료에서 펩타이드 결합 항체를 검출하기 위해 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 고려되는 방법은 비-제한적인 예로서, 크로마토그래피, 질량 분석법(및 이들의 조합), 효소 분석법, 전기영동 및 효소 면역 분석법(Enzyme Immuno Assay, EIA), 방사 면역 분석법(Radio Immuno Assay, RIA), 면역블로팅(Immunoblotting), 효소 결합 면역 흡착 분석법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 화학 발광 면역 분석법(ChemiLuminescent Immuno Assay, CLIA), 복제된 효소 공여자 면역 분석법(Cloned Enzyme Donor Immunoassay, CEDIA), 화학 발광 미세입자 면역 분석법(Chemiluminescent Microparticle Immunoassay, CMIA), 미세입자 효소 면역 분석법(Microparticle Enzyme Immunoassay, MEIA), 형광 편광 면역 분석법(Fluorescence Polarization Immunoassay, FPIA), 금으로 표지되고, 광학적으로 독출되는 신속한 면역 분석법(Gold-Labeled, Optically read, Rapid Immunoassay, GLORIA), 마이크로어레이 분석법, 완전 자동 또는 로봇 면역 분석법 및 라텍스 응집 분석법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체 기반 분석법이다.

면역 복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건 하에 그리고 충분한 기간 동안 생물학적 시료를 펩타이드와 접촉시키는 단계는 일반적으로 시료에 조성물을 첨가하고, 항체가 제공된 항체와 면역 복합체를 형성하기에 충분히 긴 시간 동안 혼합물을 배양하는 단계이다. 상기 펩타이드 항체 혼합물은 공지된 수단과 방법에 의해 검출될 수 있다. 즉, 펩타이드 항체의 면역 복합체 형성의 검출은 수많은 방법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 임의의 방사성, 형광성, 생물학적 또는 효소 태그 또는 본 기술 분야의 표준 사용 라벨과 같은 라벨 또는 마커의 검출을 기반으로 한다. 물론, 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 이차 항체 또는 비오틴(biotine)/아비딘(avidine)(스트렙타비딘(streptavidine)) 리간드 결합 배열과 같은 이차 결합 리간드의 사용을 통해 추가적인 장점을 발견할 수 있다.

전형적인 예로서, 검출 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다. 제 1 단계에서, 생물학적 시료가 접촉되고, 고정화된 포획(또는 코트) 시약, 즉 본 발명의 펩타이드(들)로 배양된다. 고정화는 통상적으로, 비-수용성 매트릭스 또는 표면으로의 흡착 또는 비-공유 또는 공유 결합(예를 들어, 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 가교를 사용하여, 예를 들어, 질산 및 환원제로, 또는 이후에, 예를 들어, 면역 침강에 의해 지지체의 사전 활성화를 이용하거나 이용하지 않고)에 의해, 분석 절차 이전에 포획 시약을 불용화함으로써 달성된다.

고정화에 사용되는 고체상은, 예를 들어, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태인 지지체를 포함하는, 본질적으로 비-수용성이고 면역 분석법에 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 담체일 수 있다. 일반적으로 사용되는 지지체의 예는 소형 시트, 세파덱스(Sephadex), 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드, 및 96- 또는 384-웰 마이크로티터 플레이트를 포함하는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로 제조된 분석 플레이트 또는 시험관뿐만 아니라 여과지, 아가로스, 가교-결합된 덱스트란 및 그 밖의 다당류와 같은 미립자 물질을 포함한다. 대안적으로, 브롬화 시안-활성화 탄수화물 및 반응성 기질과 같은 반응성 비-수용성 매트릭스가 포획 시약 고정화에 적합하게 사용된다. 일 실시형태에서, 고정화된 펩타이드(들)는 마이크로티터 플레이트 상에 코팅되고, 특히 사용되는 바람직한 고체상은 한 번에 여러 시료를 분석하는데 사용될 수 있는 다중-웰 마이크로티터 플레이트, 예를 들어, 마이크로 테스트 96- 또는 384-웰 ELISA 플레이트이다.

고체상은 위에서 정의된 바와 같은 포획 시약으로 코팅되며, 이는 원하는 대로 비-공유 또는 공유 상호 작용 또는 물리적 연결에 의해 연결될 수 있다. 특정 실시형태에서, 펩타이드는 N-말단 아세틸기를 함유하고 여분의 시스테인의 혼입을 통해 폴리에틸렌 핀에 부착된 C-말단이다. 공유 결합인 경우, 플레이트 또는 다른 고체상은 본 기술 분야에 널리 공지된 조건 하에서, 예를 들어, 상온에서 1 시간 동안 포획 시약과 함께 가교제로 배양된다. 포획 시약을 고체상 기질에 부착시키기 위해 일반적으로 사용되는 가교제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시-숙신이미드 에스테르, 동종이작용성 이미도에스테르(homobifunctional imidoester) 및 이작용성 말레이미드(bifunctional maleimide)를 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)-디티오]프로-피오이미-데이트(methyl-3-[(p-azidophenyl)-dithio]pro-pioimi-date)와 같은 유도제는 빛의 존재 하에서 교차 결합을 형성할 수 있는 광 활성화 가능한(photoactivatable) 중간체를 생성한다.

이어서, 코팅된 플레이트는 일반적으로, 유리 리간드가 플레이트 웰 상의 과잉 부위에 원하지 않게 결합하는 것을 방지하기 위해, 결합 부위에 비특이적으로 결합하고 이를 포화시키는 차단제로 처리된다. 이를 위한 적절한 차단제의 예는 젤라틴, 소 혈청 알부민, 난 알부민, 카세인 및 탈지 우유를 포함한다. 차단 처리는 일반적으로 주위 온도의 조건 하에서 대략 1 시간 내지 4 시간, 바람직하게는 대략 1 시간 내지 3 시간 동안, 또는 하룻밤 동안 이루어진다. 코팅 및 차단 이후, 분석될 생물학적 시료를 적절하게 희석하여 고정화된 상에 첨가한다. 포획 시약의 최종 농도는 일반적으로 관심 범위에 대한 분석의 민감도를 최대화하기 위해 경험적으로 결정된다. 시료 및 고정화된 포획 시약의 배양 조건은 분석의 민감도를 최대화하고 해리를 최소화하기 위해 선택된다. 바람직하게, 배양은 대략 0℃ 내지 대략 40℃, 바람직하게는 대략 20℃ 내지 37℃에 이르는 매우 일정한 온도에서 수행된다. 배양 시간은 주로 온도에 달려 있으며, 일반적으로 둔감한 분석을 피하기 위해 대략 10 시간을 넘지 않는다. 바람직하게, 배양 시간은 결합을 최대화하기 위해 대략 0.5 시간 내지 3 시간, 더욱 바람직하게는 1.5 시간 내지 3 시간이다.

이 단계에서, 배양 혼합물의 pH는 일반적으로 대략 4 내지 9.5의 범위, 바람직하게는 대략 6 내지 9의 범위, 더욱 바람직하게는 대략 7 내지 8이며, 가장 바람직하게 분석(ELISA) 희석액의 pH는 pH 7.4이다. 배양 완충액의 pH는 유의한 수준의 특이적 결합을 유지하도록 선택된다. 에피토프에 대한 항체의 특이적 결합을 허용하는 다양한 완충액이 사용될 수 있으며, 일반적으로 생리학적 pH 및 이온 강도에서 수성 완충계(buffer system) 또는 수용액을 포함한다. 이러한 완충액은 비-제한적인 예로, 탄산염 완충액, 인산 완충 식염수, 인산나트륨 완충계, Tris/HCl 완충액, 글리신 완충액 또는 아세테이트 완충액이다. 완충액의 pH는 5 내지 10의 범위여야 한다. 염화나트륨 또는 동등한 염을 사용하여 0 내지 250 mmol/l 사이에서 염의 농도가 정의된다. 완충액은 불필요한 상호 작용을 피하기 위해 최대 1 M 농도의 높은 염의 농도로 보충될 수 있다. 사용되는 특정 완충액은 본 발명에 중요하지 않지만, 개별 분석에서 하나의 완충액이 다른 완충액보다 선호될 수 있다.

선택적인 추가의 단계에서, 생물학적 시료는 포획되지 않은 분자를 제거하기 위해 고정화된 포획 시약으로부터 (바람직하게는 세척에 의해) 분리된다. 세척에 사용되는 용액은 일반적으로 대략 6 내지 9의 바람직한 pH 범위를 갖는, 배양 단계에 대해 상기한 고려 사항 및 완충액을 사용하여 결정된 pH를 갖는 완충액("세척 완충액")이다. 세척은 세 번 이상 이루어질 수 있다. 세척 온도는 일반적으로 냉장 온도에서부터 적당한 온도까지이며, 분석 기간 동안 일정한 온도, 일반적으로 대략 0℃ 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 대략 4℃ 내지 30℃로 유지된다. 예를 들어, 세척 완충액은 세척 전에 저장소 내에 4℃에서 얼음에 배치될 수 있으며, 플레이트 세척기가 이 단계에 활용될 수 있다.

다음 단계에서, 고정화된 포획 시약은 바람직하게 대략 20℃ 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 대략 20℃ 내지 37℃의 온도에서 검출 가능한 항체와 접촉되며, 이들 둘의 접촉을 위한 정확한 온도 및 시간은 주로 사용된 검출 수단에 의존한다. 예를 들어, 스트렙타비딘-페록시다아제 및 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘이 검출 수단으로 사용되는 경우, 예를 들어, 일 실시형태에서, 신호를 최대로 증폭하도록 접촉이 수행된다(예를 들어, 대략 1 시간 이상). 이 항체는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 검출 가능한 항체는 다클론 또는 단클론 항체일 수 있다. 또한 검출 가능한 항체는 직접 검출될 수 있고, 일 실시형태에서는 비색 표지(colorimetric label)를 가지며, 또 다른 실시형태에서는, 형광 측정 표지(fluorimetric label)를 갖는다. 더욱 바람직하게, 검출 가능한 항체는 비오티닐화되고(biotinylated), 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-페록시다아제 및 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘이다. 검출 수단의 판독은 형광 측정 방식 또는 비색 측정 방식일 수 있다.

방법의 최종 단계에서, 이제 포획 시약에 결합된 항체의 수준이 검출 가능한 항체에 대한 검출 수단을 사용하여 측정된다.

특정 실시형태에서, 본원에 개시된 펩타이드는 담체 또는 고체상에 침착되고 혈액, 혈청, 혈장 또는 점막 분비물 또는 도말과 같은 다른 항체 함유 체액에 노출된다. 결과적으로, 이렇게 제조된 조성물은 특정 펩타이드에 대한 대상의 항원 반응을 확인 및/또는 특성화하고, 선택적으로 예를 들어 급성 감염, 최근 일차 감염, 후기 감염, 지속성 또는 만성 감염과 같은 반응의 종류뿐만 아니라 치료 효능 등을 평가하기 위해 이용될 수 있다.

알칼리 조건에서 마이크로플레이트의 폴리스티렌 표면에 수동 흡착을 통한 직접 코팅은 전장 단백질에 비해 펩타이드 항원에 대해 덜 효율적이다. 그럼에도 불구하고, 펩타이드-덱스트란 접합체의 합성(Bocher et al . 1997), 스트렙타비딘-비오티닐화 펩타이드계(Ivanov et al. 1992)의 사용, 폴리에틸렌 핀의 플라스틱에 결합된 펩타이드 또는 포획 항체(샌드위치 ELISA)의 사용과 같은 여러 기술적 해결책이 이러한 코팅 문제를 해결하기 위해 개발되었다. 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 고려되는 진단 분석은 ELISA(플레이트-기반 또는 고체상; 샌드위치 또는 비-샌드위치), pinELISA, 경쟁적 ELISA, 항-이디오타입 항체, 직접 형광 항체(direct fluorescent antibody, DFA) 검사법 등을 포함하는 수많은 공지된 방식을 기반으로 하며, 알려진 모든 비색 측정계 및 광도 측정(예를 들어, 형광, 발광 등) 또는 방사성 반응이 사용하기에 적합한 것으로 간주된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 펩타이드 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 조성물, 키트 또는 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 키트는 키트를 사용하는 방법에 대한 설명서를 포함한다. 바람직한 실시형태에서 상기 테스트 키트는 ELISA용이다.

일반적으로, 키트는 본원에 개시된 펩타이드 중 하나 또는 둘 모두를, 선택적으로는 다른 펩타이드 또는 단백질과의 조합으로, 예를 들어, 마이크로티터 플레이트, 멤브레인, 비드, 딥 스틱 등과 같은 고체 지지체에 선택적으로 결합된 적합한 용기(들) 내에서 포함할 것이다. 대안적으로, 지지체는 키트의 개별 요소로서 제공될 수 있다.

선택적으로, 본 발명에 따른 키트는 본원에 개시된 펩타이드(들) 외에 항체, 항체 단편 등일 수 있는 항체에 대한 검출제(detection agent)를 더 포함한다. 필요한 경우, 키트는 기질 및 항체일 수 있는 검출 작용제에 대한 표지로서 사용되는 효소와의 반응을 허용하는 추가 수단을 더 포함한다. 키트의 검출제는 주어진 검출제, 특히 검출 항체와 관련되거나 결합되는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 이차 결합 리간드와 관련되거나 결합되는 검출 가능한 표지가 또한 고려된다. 검출 가능한 표지는 염료, 발광 또는 형광 분자, 비오틴, 방사성 표지 또는 효소를 포함한다. 적합한 표지의 전형적인 예는 로다민(rhodamine), 플루오레세인(fluorescein), 녹색 형광 단백질 또는 적절한 효소에 대한 예로서 루시퍼라제(luciferase) 또는 알칼라인 포스파타제 및 양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase)와 같은 일반적으로 공지된 형광 분자를 포함한다.

선택적으로, 키트는 키트를 사용할 때 얻어진 결과를 확인하기 위한 양성 및 음성 대조군을 더 포함한다. 키트의 구성 성분은 수성 매질 또는 동결 건조된 형태로 포장될 수 있으며, 또한 키트는 검출을 수행할 수 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 또한, 테스트 키트는 키트 사용을 위한 설명서를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 C. 수이스 감염을 진단 또는 검출하기 위한 방법에서의 본원에 개시된 펩타이드(들) 또는 키트의 용도에 관한 것이다. 일반적으로, 사용은 체외에서 이루어진다. 펩타이드는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있고, 조합은 본원에 기재된 방법에서 동시 사용, 별도 사용 또는 순차적 사용일 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 펩타이드(들)를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 자동화 합성기의 사용에 의한 것과 같은 표준 합성 화학 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 펩타이드는 더 긴 폴리펩타이드로부터 제조될 수 있으며, 이 폴리펩타이드는 일반적으로 펩타이드의 서열을 포함한다. 펩타이드는 예를 들어 프로테아제(protease)를 사용하여 폴리펩타이드를 가수 분해함으로써, 또는 폴리펩타이드를 물리적으로 절단함으로써 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있다. 펩타이드는 또한 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함하는 공정으로 제조될 수 있다. 발현된 폴리펩타이드는 추가로 가공되어 본 발명의 펩타이드를 생성할 수 있다. 따라서, 펩타이드는 펩타이드의 발현 또는 펩타이드가 제조될 수 있는 폴리펩타이드의 발현을 제공하는 조건 하에서 발현 벡터로 형질 전환되거나 형질 감염된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 공정으로 제조될 수 있다.

개시된 주제에 따른 방법, 조성물 및 결과를 예시하기 위해 다음의 실시예가 아래에 제시된다. 이들 실시예는 본원에 개시된 주제의 모든 양태를 포함하는 것이 아니라 대표적인 방법, 조성물 및 결과를 설명하기 위한 것이다. 이들 실시예는 본 기술 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명의 등가물 및 변형을 배제하려는 것은 아니다.

실시예

본 연구는 보건, 먹이 사슬 안전 및 환경에 관한 연방 공공 서비스의 자금 지원을 받았다.

1. 재료 및 방법

박테리아 균주

4 주령의 새끼 돼지에서 실험용 혈청을 생성하기 위해 다음의 균주가 사용되었다: C. 수이스 균주인 S45, R19 및 H7; C. 아보르투스(S26/3); C. 프시타시(98AV2129); C. 페코룸(1710S). 표준 방법론에 따라 시클로헥시미드(cycloheximide)로 처리된 McCoy 세포에서 박테리아를 성장시켰다. 클라미디아균문(Chlamydiae)은 초음파 처리 전에 동결과 해동을 통해 감염된 단일층에서 방출되었다(Bransonic 12, BIOM EDevice, San Pablo, CA, USA). 세포 배양 수확물을 10 분간 원심 분리(1000×g, 4℃)한 후 클라미디아균문을 45 분 동안 초원심분리에 의해 농축시켰다(50,000×g, 4℃). 박테리아를 2 ml 수크로스 인산염 글루탐산염 완충액(sucrose phosphate glutamate, SPG, 218 mM 수크로스, 38 mM KH2P04, 7 mM K2HP04, 5 mM L-글루탐산)에 재현탁시키고 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

돼지 혈청

사용된 혈청은 감염되지 않은 돼지, 자연적으로 감염된 돼지 및 실험적으로 감염되고/면역화된 돼지로부터 유래하였다. 4 주령의 SPF 돼지의 실험적 감염을 위해, 10⁶ 개의 박테리아를 사용하여 에어로졸로 경구 및 질내 경로를 통해 새끼 돼지를 감염시켰다. 두 마리의 돼지를 C. 수이스 참조 균주 S45에 감염시켰다. 또한, C. 수이스 균주 H7 및 R19, C. 아보르투스 S26/3 균주 및 C. 프시타시 98AV2129 균주 각각에 대해 한 마리 돼지를 감염시켰다. 돼지는 감염 4 주 후에 안락사시켰다.

4 주령의 SPF 새끼 돼지의 면역화를 위해, 10⁶ 개의 박테리아(C. 아보르투스 균주 S26/3 또는 C. 페코룸 1710S)를 동등 부피의 완전 프로이드 보조제(complete Freund’s adjuvant, CFA(Sigma, Diegem, Belgium)와 혼합하고, 피하 주사 하였다. 2 주 후, 불완전 프로이드 보조제(Sigma, Diegem, Belgium)를 사용하여 항체 생산을 증가시키기 위해 면역화를 반복하였다. 부스터 면역 3 주 후에 돼지를 안락사시키고 혈액을 채취하였다. 사용된 음성 대조군 혈청은 4 주령의 SPF 새끼 돼지에서 수득하였다. 자연적으로 감염된 돼지는 벨기에 돼지 도축장에서 샘플링하였다. 여덟 곳의 다른 농장에서 나온 83 마리의 동물에서 혈액 및 직장 면봉을 수집하였다. 샘플링된 돼지의 건강 상태 또는 항생제 치료에 관한 정보는 입수할 수 없었다. PCR 분석을 위해 면봉을 -80℃에서 DNA/RNA 안정화 완충액(Roche, Belgium, Belgium)에 보관하였다. DNA 추출은 G-spin Total DNA Extraction Mini Kit(Goffin Molecular Biotechnologies, Beek, The Netherlands)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 생성된 DNA 추출물을 C. 수이스 특이적 실시간 PCR(De Puysseleyr et al . 2014b)을 사용하여 분석하여, 샘플링된 돼지에서 C. 수이스의 존재를 확인하였다. 또한, 4 주령의 SPF 새끼 돼지에서 나온 10 개 한 세트의 혈청을 음성 대조군 혈청으로 사용하였다.

모든 혈액 시료를 상온에서 밤새 배양하였다. 혈청을 채취하고 56℃에서 30 분 동안 가열하여 비활성화시키고 배경 판독을 줄이기 위해 카올린을 처리하였다(Novak et al ., 1993). 4 부피의 카올린 현탁액(PBS 중 25%(w/v), pH 7.4)을 1 부피의 혈청에 첨가하고 상온에서 30 분 동안 배양하였다. 시료를 원심분리(5500×g, 10 분)하고 상등액을 -20℃에서 보관하였다.

모든 혈청은 C. 트라코마티스 재조합 MOMP(CT rMOMP ELISA)를 항원으로 사용하여 직접 ELISA에서 항-MOMP 항체의 존재에 대해 시험하였다(Schautteet et al ., 2011). 이 테스트는 과(family)-특이적 에피토프가 MOMP의 보존된 영역에 위치하기 때문에 과-특이적 MOMP 항체의 검출을 가능하게 한다(Stephens et al ., 1998). 양성 컷-오프 값은 음성 대조군 돼지 혈청의 OD-값의 평균에 표준 편차의 두 배를 더한 값으로 계산하였다.

C. 수이스 MD56 게놈에서의 Pmp 서열의 동정

추정되는 C. 수이스 Pmp 서열은 Hidden Markov Models(HMMs)을 사용하여 MD56 게놈에서 추출하였다. 이들 HMM은 7 개의 서열 분석된 C. 프시타시 게놈(CallO, 6BC, RD1, 01DC11, 02DC15, 08DC60 및 C1998)으로부터 수동으로 큐레이트된(curated) pmps로 구성된 서열의 종자 집합(seed set)을 사용하여 구성하였다. 개별 클러스탈 정렬은 종자 집합 내의 각각의 pmp 과에서 독립적으로 실행하였고 수동으로 검토하여 트리밍이 필요 없다고 결론을 내렸다. 각각의 pmp 과에 대해 별도의 모델을 생성하기 위해 HMMER 패키지(Finn et al . 2011)의 hmmbuild 도구를 사용하였다. 결과를 검토하였고 아과(sub-family) 특이적 모델을 생성할 수 있도록 서열을 하위 종자로 분할하였다. 모든 HMM은 다시 HMMER 패키지(hmmsearch)를 사용하여 더 큰 집합의 C. 프시타시 및 C. 카비아에(C. caviae) 서열에 대해 검증하였다.

펩타이드의 선별

PMP C

C. 수이스 특이적 항원을 전달하기 위한 최상의 후보 물질인 Pmp 단백질을 결정하기 위해, C. 수이스 MD56의 9 개 Pmp 단백질의 아미노산 서열을 참조 균주 A/Har-13 및 L2/434(C. 트라코마티스)의 서열과 비교하였다. 기본 매개 변수를 사용하여 다중 서열 정렬을 구성하기 위해 클러스탈 오메가(Clustal Omega) 프로그램을 사용하였다(Thompson et al . 1997). Pepscan Systems(Lelystad, The Netherlands)에 의해 제조된 152 개의 합성 펩타이드의 제조를 위한 주형으로 9 개의 영역(표 1)을 선별하였다. 펩타이드는 길이가 8 개의 아미노산 잔기이고, 6 개의 잔기가 중첩되어 있다. 모든 펩타이드는 N-말단 아세틸기를 포함하고, 여분의 시스테인을 핀당 100 μg의 양으로 혼입시킴으로써 폴리에틸렌 핀에 C-말단 결합시켰다. 펩타이드로 코팅된 핀은 '96-웰 포맷'으로 폴리에틸렌 담체 상에 조립하였다. 이는 96-웰 마이크로플레이트에서 ELISA 분석을 위한 핀의 사용을 가능하게 한다('pinELISA'라고 함).

MOMP 및 Tarp

아미노산 서열 정렬을 사용한 C. 수이스 특이적 영역의 동정은, 특정 면역원성 펩타이드의 선별을 위해, 확인된 서열의 에피토프 예측과 조합하였다. 정렬은 기본 매개 변수를 사용하여 클러스탈 오메가 프로그램으로 구성하였다(Thompson et al. 1997). MOMP와 Tarp 정렬을 생성하는데 사용된 균주를 표 2에 열거하였다.

확인된 C. 수이스 특이적 영역의 B-세포 에피토프 예측은 면역 에피토프 데이터베이스 분석 자원(Immune Epitope Database Analysis Resource(IEDB) 분석 자원)에 의해 제공된 도구를 사용하여 수행하였다. 이 제공자는 단백질 서열(Chou and Fasman Beta-Turn (Chou and Fasman 1978), Emini surface Accessibility (Emini et al . 1985), Karplus and Schulz Flexibility (Karplus and Schulz 1985), Kolaskar and Tongaonkar Antigenicity (Kolaskar and Tongaonkar 1990), Parker Hydrophilicity (Parker et al. 1986) 및 Bepipred Linear Epitope prediction (Larsen et al. 2006))로부터의 선형 에피토프의 예측을 위한 6 개의 툴 모음을 제공한다.

핀 ELISA

실험용 혈청

차단 완충액(0.1% Tween 20 및 5% BSA가 보충된 0.01 M PBS* [7.5 mM Na2HP04, 145 mM NaCl, 3.25 mM NaH2P04.2H20, pH=7.2])을 사용하여 상온(RT)에서 100 rpm으로 핀을 차단하였다. 이어서, 핀을 세 번 세척하였다(세척 완충액 [0.01 M PBS*, 0.1% Tween 20], 10 분, 100 rpm). 혈청을 희석 완충액(0.01 M PBS*, 3% BSA, 0.1% Tween 20)으로 희석하고 4℃에서 100 rpm으로 밤새 배양하였다. 또 다른 세척 단계 이후, 다클론 HRP 접합 항-돼지 IgG(H+L) 항체(Bethyl Laboratories, Montgomery, USA)의 1000배 희석액에서 핀을 상온에서 100 rpm으로 1 시간 동안 배양하였다. 최종 세척 단계 이후, 과산화수소 및 ABTS 기질(KPL, Gaithersburg, Maryland, USA)을 첨가하여 405 nm에서의 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 측정 이후 결합된 항체를 벗겨내면 핀 펩타이드를 재사용할 수 있다. 따라서, 분해 완충액(0.1 M Na2HP04.2H20, 35mM SDS, 0.1% 2-메르캅토-에탄올; pH 7.2)에서 핀을 1 시간 동안 초음파 처리(70℃, 40 kHz)한 후 초순수한 물에서 30 분 동안 초음파 처리하였다. 이후, 핀 펩타이드를 -20℃에서 보관하였다.

핀 ELISA에서 사용하기 위해, 실험용 혈청을 CT rMOMP ELISA에서 양성 컷-오프 값을 초과하는데 필요한 최소 농도로 희석시켰다. 따라서, 배경 판독으로 인한 위양성 결과를 줄이기 위해 모든 실험용 혈청을 거의 동일한 항-클라미디아 항체 농도로 사용하였다.

데이터의 해석

실험용 혈청에서 얻어진 모든 데이터를 음성 대조군 혈청의 값을 사용하여 배경 신호에 대해 보정하였다. C. 수이스 특이적인 면역원성 항원을 찾기 위해, 항-C 수이스 실험용 혈청에 대한 높은 OD 값 및 C. 아보르투스, C. 프시타시 또는 C. 페코룸으로 감염되고/면역화된 동물의 혈청에 대한 낮은 OD 값으로 펩타이드를 선별하였다.

현장 혈청

핀 ELISA 프로토콜을 약간 변경하여 SPF 새끼 돼지와 다 자란 돼지(도축장)를 샘플링하여 얻은 '현장 혈청(field serum)'을 검사하였다. 차단 단계는 밤새 배양으로 확장하였고, 혈장은 4℃에서 밤새 하는 대신 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 모든 현장 혈청을 1/100과 1/500의 두 가지 희석 비율로 검사하였다. 양성 컷-오프 값은 음성 대조군 돼지의 OD 값의 평균에 표준 편차의 두 배를 더한 값으로 계산하였고, 0.5로 나타났다.

2. 결과

C. 수이스 특이적 펩타이드의 인- 실리코 선별

Pmps

C. 수이스 특이적 서열을 찾기 위해 C. 수이스 MD56의 9 개 Pmp 서열을 C. 트라코마티스 A/HAR-13 및 L2/434/Bu 균주의 Pmp 서열과 비교하였다. 전체 서열 상동성은 PmpC를 제외하고 70% 내지 80% 사이에서 다양하였고, 58%의 유사성을 보였다. 낮은 서열 상동성은 부분적으로 C. 수이스 특이적 인서트의 존재로 인한 것이다. 또한, PmpC 코딩 유전자는 C. 아보르투스, C. 프시타시 및 C. 페코룸 참조 게놈에 존재하지 않았다. 따라서, PmpC는 특정 항원의 선별을 위한 최상의 Pmp 후보로 간주되었다. C. 트라코마티스에 비해 가장 높은 다양성을 갖는 C. 수이스 서열을 찾기 위해 아미노산 서열 정렬을 사용하였다. 9 개의 'C. 수이스 특이적 영역'은 추가의 생체외 특이성 시험을 위해 중첩 핀 펩타이드(8 개 아미노산 길이 및 하나의 6 개 아미노산 중첩)로 정리되었다(표 1). PmpC 유래 펩타이드는 C. 트라코마티스 음성 인간뿐만 아니라 돼지의 혈청 진단에 유용하다.

표 1. 선별된 9 개의 ' C. 수이스 특이적' 영역의 아미노산 서열 및 위치.

M D56 균주의 PmpC 단백질은 2141 개의 아미노산을 포함하고 있다.

MOMP

PmpC에 대해 사용된 접근법과 유사하게, 정렬을 사용하여 C. 수이스 특이 영역에 대해 아미노산 서열을 검색하였다. 고려된 C. 수이스 균주(표 2) 간의 쌍별 MOM P 서열 유사성은 76%에서 100%까지 다양하였다. 예상대로, C. 수이스는 대부분 C. 트라코마티스와 관련된 모든 종에서 관찰되었으며 64%에서 86% 사이의 상동성 백분율을 보였다. 5 개의 고려된 클라미디아 종에 대한 전체 서열 유사성은 59에서 85%까지 다양하였다.

다중 서열 정렬은 고려된 C. 수이스 균주 간에 보존되고 높은 농도의 C. 수이스 특이적 아미노산 잔기를 포함하는 52 개 아미노산 영역(잔기 247 내지 299)의 선별을 가능하게 하였다. 인-실리코 에피토프 예측은 돼지에서 발생하는 클라미디아 종에서 C. 수이스를 구별할 수 있는 3 개의 C. 수이스 특이적 아미노산(밑줄 친 부분)을 포함하는 8-잔기 MOM P 펩타이드(GTKDASID; 서열번호 1)의 동정을 가능하게 하였다. 그러나, 모든 이용 가능한 C. 수이스 서열에서 C. 트라코마티스를 구별하기 위해 MOM P 펩타이드 항원을 선별하는 것은 실행 불가능하였다. 따라서, MOM P 펩타이드는 돼지의 혈청 진단에서만 유용하다. PMPC 펩타이드뿐만 아니라, 이 MOM P 펩타이드는 추가의 생체외 특이성 검사를 위해 핀 ELISA 포맷으로 pepscan(Leiystad, The Netherlands)에서 구입하였다.

표 2: MOMP 및 Tarp 단백질에서 C. 수이스 특이적 영역을 동정하기 위해 아미노산 서열 정렬을 구축하는데 사용된 클라미디아 균주의 개요.

Tarp

이용 가능한 158 개의 C. 트라코마티스 Tarp 서열의 정렬은 91 내지 100% 범위의 쌍 별 서열 동일성을 갖는 높은 서열 보존을 나타낸다. C. 수이스 S45 Tarp와 C. 트라코마티스를 비교할 때, 대체로 서열의 60%가 동일하다. C. 페코룸, C. 프시 타시 및 C. 아보르투스 Tarp 서열은 C. 수이스 및 C. 트라코마티스에 대해 대체로 33%의 서열 유사성을 보였다. 에피토프 예측과 결합된 단백질 서열 정렬의 결과는 서열 'GSSTPTAS'(서열번호 12, 842 잔기 단백질의 아미노산 잔기 417 내지 424)를 갖는 8-아미노산 펩타이드의 선별을 가능하게 하였다.

PmpC 펩타이드의 생체외 선별

실험용 혈청 희석 비율의 최적화

핀 ELISA에서 사용하기 위한 실험용 혈청의 최적의 희석 비율은 CT rMOMP ELISA에서 2 배 희석 계열의 분석에 의해 결정되었다. 얻어진 최적의 희석 비율은 1/3.5 내지 1/896 범위였다. 더욱 상세한 결과는 표 3에 나타나 있다.

실험용 혈청을 이용한 PmpC 펩타이드 ELISA

152 개의 PmpC 펩타이드를 실험용 혈청과 함께 C. 수이스에 대한 민감도와 특이성에 대해 스크리닝하였다. C. 수이스 항혈청에 대한 최대 OD 값 및 C. 아보르 투스, C. 프시타시 및 C. 페코룸 항혈청에 대한 최소 OD 값을 근거로 서열 SQQSSIAS(서열번호 2)를 갖는 하나의 펩타이드를 선별하였다.

표 3. C. 트라코마티스 rMOMP ELISA 의 결과를 기반으로 한 실험용 혈청의 최적의 희석 비율.

*: 돼지 면역화 이후 얻은 혈청; #: 감염 후 얻은 혈청

실험용 혈청을 이용한 MOMP 와 Tarp 펩타이드의 특이성 시험

두 가지 펩타이드 모두는 C. 아보르투스, C. 페코룸 및 C. 프시타시 항혈청에 대한 교차 반응을 나타내지 않았다. 또한, 모든 C. 수이스 항혈청은 컷-오프(0.5)를 초과하는 OD-값으로 MOMP에 명백하게 반응하였다. 그러나, Tarp 펩타이드의 경우, C. 수이스 S45_I 및 R19 항혈청의 OD 값은 컷-오프에 도달하지 않았다. 따라서, Tarp 펩타이드는 면역원성 항원 물질로서 더 이상 간주되지 않고 추가 실험에서 제거되었다.

MOMP 및 PmpC 펩타이드 항원의 확인

현장 혈청의 분자적 특성화

도축장에서 샘플링한 현장 혈청을 두 가지 검사를 사용하여 분자적으로 특성화하였다. 샘플링된 돼지에서의 C. 수이스 박테리아의 존재는 C. 수이스 특이적 실시간 PCR을 사용하여 직장 면봉의 검사에 의해 검출되었다. 박테리아 DNA는 83 개의 면봉 중 69 개에서 검출되었다. 또한, 항-클라미디아 항체를 검출하기 위해, 모든 혈청을 CT rMOM P ELISA를 사용하여 1/100로 희석하여 분석하였다. 83 개의 혈청 시료 중 68 개가 양성이었다. 이러한 결과에 따라, 도축장에서 채취한 현장 시료 세트는 세 그룹으로 나누었다: A 그룹은 실시간 PCR 및 CT rMOM P ELISA 모두에서 양성이었던 돼지에서 유래된 64 개의 혈청으로 구성되었으며, B 그룹은 9 개의 혈청을 포함하였고 그룹 B1과 B2로 세분되었다. 그룹 B의 4 개의 혈청을 PCR 음성 돼지에서 샘플링하였고 CT rMOM P ELISA에서 명확한 반응을 보였다. PCR 양성 돼지에서 샘플링한 B2 그룹의 5 개 혈청은 CT rMOM P ELISA에서 반응을 나타내지 않았다. C 그룹은 두 가지 검사 모두에서 10 개의 혈청 음성을 포함하였다.

핀 ELISA

그룹 A, 그룹 B 및 그룹 C의 혈청을 사용하여 항-C. 수이스 항체의 검출에 사용하기 위해 선별된 펩타이드의 성능을 확인하였다. 10 마리의 SPF 동물의 혈청을 포함하는 추가 그룹(D)은 여분의 음성 대조군으로 사용하였다. 모든 현장 시료를 1/100 및 1/500로 희석하여 시험하였다. 그러나, 100 배 희석물의 OD 값의 대부분은 사용된 기술의 상한 검출 한계에 도달하였는데, 아마도 부분적으로 배경 판독에 기인한 것일 수도 있다. 따라서, 현장 시료는 후속 실험에서 500 배 희석하여 시험하였다. 컷-오프 값은 0.5로 계산되었다.

음성 대조군 C 및 D의 모든 혈청은 MOM P 및 PmpC 펩타이드 ELISA에서 음성이었다. 양성 대조군 A의 64 혈청 중 50에서, PmpC 및 MOM P 펩타이드 모두에 대한 항체가 입증되었다. 12 개의 혈청은 항-PmpC 펩타이드 항체를 함유하였지만, 항-MOM P 펩타이드 항체는 함유하지 않았다. 두 가지 잔여 혈청은 후보 항원 모두에 대해 반응을 나타내지 않았다. 그룹 B1의 모든 혈청은 MOM P 및 PmpC 펩타이드에 대해 명확한 반응을 보였다. 실제로, 항체가 존재하기 때문에 이는 이전의 감염을 가리키고 있지만, 박테리아는 입증될 수 없다. 그룹 B2의 (5 개 중) 3 개의 혈청에 대해서, 항-PmpC 항체만이 입증되었다. 나머지 (5 개 중) 2 개의 혈청은 후보 펩타이드 모두에 대해 반응을 나타내지 않았다. 이러한 관찰은 CT rMOM P ELISA의 위양성 결과에 기인할 수 있다. 결국, 전장 단백질을 항원으로 사용할 때 다른 병원균과의 교차 반응이 일반적이다(Schautteet and Vanrompay 2011). CT rMOM P ELISA는 과-특이적 분석법이기 때문에 다른 클라미디아 종의 감염에 반응하여 생성된 항체도 검출된다. 실제로, 클라미디아 종의 혼합 감염은 돼지에서 정기적으로 발생한다(Szeredi et al ., 1996; Hoelzle et al ., 2000).

표 4는 현장 혈청의 얻어진 결과를 요약한 것이다.

표 4. 83 개 현장 혈청에 대한 C. 수이스 의 실시간 PCR , CT rMOMP ELISA 및 C. 수이스 의 POMP C 및 MOMP 펩타이드 ELISA 의 분석 결과.

NP: 수행되지 않음; 평균 OD 및 관련된 표준 편차의 값은 괄호 안에 각각 나타나 있다.

결론

실험용 혈청 및 분자적으로 특성화된 현장 혈청의 분석은 돼지의 C. 수이스의 혈청 진단에 사용하기 위한 MOM P 및 PmpC 펩타이드 항원의 적합성을 입증하였다. 또한, PmpC 펩타이드는 MOMP 단편과 비교하여 더욱 민감한 것으로 나타났다.

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SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITEIT GENT <120> A method for the detection of Chlamydia suis <130> P2015/008PCT <150> EP15160478.2 <151> 2015-03-24 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 1 Gly Thr Lys Asp Ala Ser Ile Asp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 2 Ser Gln Gln Ser Ser Ile Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 3 Ser Phe Ser Asn Ile Ser Glu Glu Ile Gln Glu Pro Ser Ser Thr Pro 1 5 10 15 Glu Gln Glu Glu Asn Glu Glu Thr Asp Glu Asp Ser Ser Leu Asp Ser 20 25 30 Arg Asn Thr Glu Glu Thr Pro Pro Ser Pro Ser Ser Glu Thr Gln Glu 35 40 45 Asp Asp 50 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 4 Gln Pro Gln Asn Asn Ala Ile Ala Leu Arg Ser Phe Leu Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Gln Thr Glu Thr 20 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 5 Gly Ala Ile Leu Gly Glu Ser Thr Val Thr Ile Thr Gly Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Thr Phe Ser Lys Asn Ala Val Lys Val Thr Phe Val Asp Lys Ser 20 25 30 Glu Thr Gln Asn Pro Ser Gly Gly Ser Gly Thr Gly Asp Ser Ser Asp 35 40 45 Ser Ser Glu Ala Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Asn Asp Ser Ala Asn 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Gly Asp Ser Asn Gly Val Ser Ala Ala Ala Gln Ala 65 70 75 80 Ala Ala Phe Ser Arg Phe Leu Ser Ala Ser Thr Ser Thr Asp Pro Gln 85 90 95 Pro Gly Glu Ala Glu Asn Thr Asp Ser Thr Leu Asn Val Lys Leu Gly 100 105 110 Cys Gly Gly Gly Ile Tyr Ser Lys 115 120 <210> 6 <211> 50 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 6 Pro Thr Asp Gln Glu Gln Gly Ser Gln Gly Thr Glu Gln Asp Ser Gln 1 5 10 15 Glu Gly Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ser Gln Glu Ser Ala Thr Asn Ser 20 25 30 Ala Ser Ser Gln Gln Ser Ser Ile Ala Ser Ala Arg Leu Thr Gln Leu 35 40 45 Ser Leu 50 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 7 Gly Gly Gly Ser Ser Ser Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Thr Thr Glu 1 5 10 15 Val Ile Lys Pro Val Val Gly Arg Gly Gly Ala Val Tyr Thr 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 8 Gly Asn Gly Gln Asp Gln Glu Gln Pro Gly Ala Glu Gly Gly Ala Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Ser Asn Ala Asp Ser Gly Gln Glu Val Thr Gly 20 25 30 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 9 Val Arg Ser Ser Ser Glu Asp Arg Ala Gln Glu Ala Gly Ser Asp Ser 1 5 10 15 Thr Pro Ser Ser 20 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 10 Glu Gly Asp Ser Glu Ser Ala Glu Ala Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 11 Ala Ile Gly Leu Val Ala Gly Ala Ile Pro Ala Asp Asn Asn Ser Val 1 5 10 15 Thr Ala Thr Val Ser Asp Ser Gly Thr Pro Ser Thr Thr Pro 20 25 30 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Chlamydia suis <400> 12 Gly Ser Ser Thr Pro Thr Ala Ser 1 5

Claims (16)

1. 대상에서 클라미디아 수이스(Chlamydia suis) 항체를 검출하기 위한 생체외 방법으로서,
   - 대상의 생물학적 시료를 제공하는 단계, 및
   - 서열번호 1(GTKDASID)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 8 개 내지 30 개의 아미노산 길이의 펩타이드 또는 이 서열과 적어도 78% 동일한 서열, 및/또는 서열번호 2(SOOSSIAS)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 8 개 내지 30 개의 아미노산 길이의 펩타이드 또는 이 서열과 적어도 75% 동일한 서열에 대한 항체의 존재에 대해 시료를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   하나 또는 둘 모두의 펩타이드에 대한 항체의 존재는 대상에서 과거, 초기 또는 후기의 클라미디아 수이스 감염을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   대상의 생물학적 시료는 체액, 바람직하게는 점막 분비물 또는 혈액, 특히 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   검출된 항체는 IgA, IgM 및/또는 IgG 유형인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   대상은 포유동물, 특히 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   항체의 존재는 면역 분석법(immunoassay), 특히 면역 형광(immunofluorescence, IF) 분석법, 방사 면역 분석법(radioimmunoassay, RIA), 효소 면역 분석법(enzyme immunoassay, EIA 또는 ELISA), 효소 표지 면역 블롯 분석법(Enzyme labeled immunoblot assay)(LIA, 웨스턴 블롯(Western blot), 블롯 스팟(blot spot), 및 재조합 면역 블롯 분석법(recombinant immunoblot assay)), 또는 발광(생체 발광(bioluminescence) 및 화학 발광(chemiluminescence))의 사용에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   면역 분석법은 효소 면역 흡착 분석법(enzyme immunosorbent assay, ELISA)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 서열번호 1(GTKDASID) 또는 서열번호 2(SOOSSIAS)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이 서열과 적어도 75% 동일한 서열을 포함하는 8 개 내지 30 아미노산 길이의 분리된 펩타이드.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 펩타이드는 항원 펩타이드(antigenic peptide)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 이 서열과 적어도 75% 동일한 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
    
11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 하나 또는 둘 모두의 펩타이드를 포함하는, 클라미디아 수이스 감염의 진단에 사용하기 위한 키트로서, 상기 펩타이드(들)는 고체 지지체 상에서 고정화되는 것을 특징으로 하는 키트.
    
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 키트는 면역 분석법, 특히 ELISA용인 것을 특징으로 하는 키트.
    
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 키트는 DIVA 분석용인 것을 특징으로 하는 키트.
    
14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 키트 또는 하나 이상의 펩타이드의 용도.
    
15. 백신화된 대상을 자연적으로 감염된 대상과 구별하기 위한, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 방법, 하나 이상의 펩타이드 또는 키트의 용도.
    
16. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 키트를 제조하기 위한 방법.