KR20160138494A - Fgfr 융합물 - Google Patents

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히로아키 다나카
코린 물롱
앤 바슬린 슈섹스
제롬 보이칙
클라우디아 아르메니세
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데비오팜 인터네셔날 에스 에이
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Abstract

본 발명은 FGFR2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드 및 이러한 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체로부터의 샘플에서 융합 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 유전자 또는 RNA 서열의 존재 진단 방법뿐만 아니라 이후 진단에 의해 지시되는 종양의 치료 방법을 포괄한다.

Description

FGFR 융합물{FGFR FUSIONS}
본 발명은 섬유아세포 성장 인자 수용체 및 또 다른 폴리펩타이드-코딩 서열로부터의 폴리펩타이드-코딩 서열을 포함하는 융합 유전자에 관한 것이다. 이는 또한 유전자에 의해 인코딩되는 융합 폴리펩타이드뿐만 아니라 융합 폴리펩타이드-코딩 서열의 DNA 사본에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이후 융합 유전자 및 폴리펩타이드에 기반하는 진단적 및 치료적 적용을 포괄한다.
일정한 체세포 융합 유전자는 암 개시 및 진행의 유도인자로 알려져 있다[Mittelman, F., et al. (2007) Nature Reviews Cancer 7: 233-245]. 암-촉진 융합 유전자의 현재는 전통적인, 최초의 예는 만성 골수성 백혈병(만성-상 CML) 환자의 95% 초과에서 발견되는 BCR - ABL1 융합 유전자이다. BCR - ABL1 유전자는 ABL 키나아제의 항상적인 활성 형태를 인코딩한다. 만성-상 CML 환자에 대한 최적 제1 선 치료는 적극적인 임상 평가의 대상이지만, BCR/ABL 티로신 키나아제의 상대적으로 특이적인 저해제가 관여된다. 현재 시판되는 저해제에는 1세대 약물 이마티닙(현재의 제1선 치료) 및 2세대 약물 닐로티닙, 다사티닙, 보수티닙 및 포나티닙이 포함된다. 융합 유전자는 또한 다른 혈액 암에서 높은 빈도로 일어나는 것으로 확인되었다[Annala, M.J., et al. (2013) Cancer Lett. 340: 192-200]. ETV6-RUNX1 및 BCR-ABL1 융합물은 각각 급성 림프구성 백혈병의 25% 및 14%에서 나타나며, RUNX1-ETO 및 CBFB-MYH11 융합물은 급성 골수성 백혈병의 10-15%에서 나타나고, IG@-MYC 융합물은 버키트 림프종의 90-100%에서 나타나고, PML-RARA 융합물은 급성 전골수구성 백혈병의 95%에서 나타나고, NPM1-ALK 및 TPM-ALK 융합물은 각각 역형성 큰세포 림프종의 75% 및 15%에서 나타난다. 융합 유전자는 역사적으로 혈액 암에서 상대적으로 높은 빈도로 검출되었으나, 이들은 고형 암에서는 작은 분율로만 확인되었다. 그러나 보다 최근에는 융합 유전자가 고형 암에서도 상승된 빈도로 일어날 수 있음이 명확해졌다[Annala et al. (2013)]. TMPRSS2 및 전사 인자 ETS 패밀리의 구성원의 융합물은 전립선암 환자의 약 70%에서 확인되었다. EML4-ALK 융합물은 비-소세포 폐암에 존재할 수 있으며, KIAA1549-BRAF 융합물은 소아 교종에 그리고 FGFR3-TACC3 융합물은 교모세포종에 존재할 수 있다. 공지된 융합 유전자의 통합 목록은, 예컨대 [Annala et al. 또는 Shaw, A.T. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13: 772-787]에서 확인된다. 일부 융합물은 상이한 암에서 일어날 수 있음이 주지된다. 하나의 예로서, TPM3-ALK 융합물은 역형성 큰세포 림프종 및 염증성 근섬유모세포 종양에서 확인되었다. 다른 ALK 융합물은 비-소세포 폐암뿐만 아니라 역형성 큰세포 림프종에서 일어난다.
융합물은 상이한 기전에 의해 암-촉진성일 수 있다. 예를 들어 BCR-ABL의 경우, BCR 파트너는 이량체화 도메인을 제공하여 ABL 도메인의 항상적 이량체화를 유도하고, 이는 항상적 ABL 키나아제 활성, 및 결과적으로 제어되지 않는 세포 분열을 유도한다. 대안적 기전은 전립선암에서 확인되는 TMPRSS2-ETS 융합물의 경우에 해당한다. 이들 융합 유전자에서, ETS 전사 인자에 대해 코딩하는 서열은 안드로겐-조절되는 TMPRSS2 프로모터의 제어 하에 놓여서 전사 인자가 과발현되도록 유도한다. 과발현된 ETS는 정상 전립선 상피 분화와 연관된 유전자 발현의 조절에서 이상을 일으키며 제어되지 않는 세포 증식을 유도한다. 또 다른 기전에서, FGFR 폴리펩타이드 발현의 상향-조절은 FGFR mRNA의 3' UTR에서 miRNA 조절 부위의 손실로 야기되며, 이 손실은 FGFR 유전자가 또 다른 유전자와 융합하는 경우에 일어난다[Parker, B.C. et al. (2013) J. Clin. Invest. 123: 855-865].
융합 유전자의 발견 및 특성규명은 암 치료법을 여러 방식으로 진보시킨다. 예컨대 ABL1, ALK, ROS1, RET 및 FGFR1-3과 같은, 활성화된 티로신 키나아제를 인코딩하는 융합 유전자를 예로 들어 보면, 환자로부터 암성 조직에서 이러한 융합 유전자의 확인은 관련 키나아제에 대해 유도되는 선택적이거나 특이적인 저해제의 발견 및 개발의 동기를 부여한다. 융합 키나아제 유전자의 존재는 또한 치료적 접근의 선택에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, BCR-ABL1 융합 키나아제를 발현하는 만성-상 CML 환자에 대한 제1선 치료는 BCR-ABL 키나아제 저해제 이마티닙을 포함하는 방식이다. 융합 키나아제 유전자의 발견은 암 환자로부터의 조직에서 이러한 유전자의 존재 또는 이러한 유전자 산물의 발현을 발견할 수 있는 진단 검정을 고안하기 위한 기초를 제공한다. 만성-상 CML에 대해 논의된 바와 같이, 환자의 종양 조직에서 융합 키나아제 유전자 또는 이들의 유전자 산물의 존재의 양성 진단은 의사가 가장 적절한 치료법 방식을 결정할 수 있도록 할 것이다. 전형적으로, 이러한 방식에는 해당 융합 키나아제의 발현 또는 활성을 저해하는 조성물의 투여가 포함될 것이다.
현재 암(또는 다른 질환)에 관련된 모든 융합 유전자가 알려져 있다고 믿을만한 이유는 존재하지 않는다. 추가적인 융합 유전자의 발견 및 특성규명은 새로 발견된 융합 유전자 또는 폴리펩타이드에 대한 진단 방법의 개발 및 새로 발견된 융합 유전자 또는 폴리펩타이드의 특이적 저해제 또는 융합 유전자 또는 폴리펩타이드에 대한 다른 제제의 개발 또는 확인에 이어 암 치료의 특이성을 증가시킬 것으로 예상된다. 사실 상, 암 환자 중에서, 예를 들어 특정한 키나아제 저해제가 관여되는 치료법과 같은 주어진 치료에 대해 가장 큰 이익을 얻을 특정 하위집단을 확인할 필요성이 증가하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA에 관한 것이며, 여기서 FGFR2 폴리펩타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이며; CCDC147 폴리펩타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; VCL 폴리펩타이드는 야생형 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이다. 융합 폴리펩타이드에서 FGFR2 폴리펩타이드는 서열번호 17, 25, 27, 29, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 서열번호 17, 25, 27, 29, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드인 각각의 야생형 폴리펩타이드로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 상이한 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부일 수 있다. 융합 폴리펩타이드에서 CCDC147 폴리펩타이드는 서열번호 21 및 63 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부일 수 있다. 융합 폴리펩타이드에서 VCL 폴리펩타이드는 서열번호 19, 33, 35 및 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부일 수 있다.
FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA는 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 조합한다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하며; 제2 폴리뉴클레오타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 인코딩한다. 특정한 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하며, 서열번호 16, 22, 24, 26, 28, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 및 58 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열, 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 포함된다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드 또는 야생형 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하며, 서열번호 20, 36 및 62 중 어느 하나(CCDC147) 또는 서열번호 18, 30, 32, 34 및 60 중 어느 하나(VCL)의 뉴클레오타이드 서열, 또는 하나 이상의 코돈(아미노산-코딩 뉴클레오타이드 삼중자)의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 임의의 후자의 뉴클레오타이드 서열(즉, 서열번호 20, 36 또는 6(CCDC147), 또는 서열번호 18, 30, 32, 34 또는 60(VCL))로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 포함된다.
보다 특정한 구현예에서, 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA는 전체 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함한다. 티로신 키나아제 도메인은 융합 폴리펩타이드가 검출 가능한 티로신 키나아제 활성을 나타낼 수 있도록 하는 경우, 전체로 간주된다. 상기 구현예에서, FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA의 첫 번째 두 폴리뉴클레오타이드는 전체 티로신 키나아제 도메인을 포함하기 위해 충분히 긴 FGFR2 폴리펩타이드 단편을 인코딩한다.
보다 특정한 구현예에서, FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA의 첫 번째 두 폴리뉴클레오타이드는 FGFR2 엑손 1-16 및 FGFR2 엑손 17의 일부 또는 전부를 함유하며, 두 번째 두 폴리뉴클레오타이드는 CCDC147 엑손 1이 없는(또는 엑손 2부터 시작하는) CCDC147-코딩 서열 또는 VCL 엑손 1-14가 없는(또는 엑손 15부터 시작하는) VCL-코딩 서열을 함유한다. 본 발명에서, 엑손 주석은 융합 유전자의 각 부분에 대해 Ensembl v42 어셈블리에서 확인되는 가장 긴 코딩 전사체, 즉 FGFR2에 대해 서열번호 16, VCL에 대해 서열번호 18 및 CCDC147에 대해 서열번호 20을 기준으로 수행된다.
상기 언급된 구현예의 cDNA는 인간 쓸개관암종에서 단리된 유전자 전사체로부터 유도될 수 있다.
보다 구체적인 구현예는 서열번호 1 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드(cDNA) 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 cDNA를 수반하는 벡터를 포괄하며, 이러한 벡터는 벡터가 채택되는 세포형에서 cDNA에서 인코딩되는 융합 폴리펩타이드의 발현을 뒷받침하는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 cDNA를 수반하는 벡터를 함유하는 임의의 세포(예로, 원핵생물 또는 진핵생물)에 관한 것이다. 상기 세포는 E.콜라이 또는 포유류 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이며, 이 융합 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드, 시험관내 증식하는 암 세포로부터 또는 이종이식편으로 단리된 폴리펩타이드, 또는 인간 쓸개관암종에서 단리된(정제된) 폴리펩타이드이다. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 FGFR2 폴리펩타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이며; CCDC147 폴리펩타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; VCL 폴리펩타이드는 야생형 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 VCL 폴리펩타이드의 일부이다. 특정한 구현예에서, 융합 폴리펩타이드에 포함되는 FGFR2 폴리펩타이드는 서열번호 17, 25, 27, 29, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 및 59 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이다. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 CCDC147 폴리펩타이드는 서열번호 21 및 63 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이다. 융합 폴리펩타이드에 포함되는 VCL 폴리펩타이드는 서열번호 19, 33, 35 및 61 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이다.
추가 구현예는 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이다. 항체 또는 항원-결합 단편은 융합 폴리펩타이드의 임의의 서열을 인식할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 두 융합 파트너로부터의, 즉 FGFR2로부터 및 CCDC147 또는 VCL로부터의 서열로 이루어진 에피토프를 인식한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자, 이러한 유전자의 RNA 전사체 또는 본 발명의 cDNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 특정 구현예는 센스 및 안티센스 프라이머로 구성된 프라이머 페어에 대한 것이며, 이 프라이머들은 본 발명의 cDNA에 특이적으로 혼성화하고 cDNA 또는 이들의 일부의 복제를 지시할 수 있다. 동일한 프라이머들은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 게놈 서열 또는 이들의 RNA 전사체를 증폭하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 구현예는 본 발명의 cDNA, 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 이러한 유전자의 RNA 전사체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 살아있는 세포에서 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 혼성화는 메신저 RNA의 번역을 방지하거나 감소시킨다. 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 대한 siRNA일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 이러한 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 그 RNA 전사체를 검출하기 위한 키트를 포괄한다. 융합 폴리펩타이드를 검출하기 위한 키트는 융합 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 전사체를 검출하기 위한 키트는 상술된 프라이머 페어 또는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 포함할 수 있다.
암을 앓는 대상체에서 치료 방식에 사용하기 위한 FGFR 키나아제 활성 저해제도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 여기서 상기 대상체는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 함유 또는 발현하거나 이러한 융합 폴리펩타이드를 발현한다. FGFR 키나아제 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온, PD173074, Pazopanib, AZD4547, Ponatinib, Dovitinib, BGJ398, E-3810, JNJ-42756493, ARQ 087, LY2874455, BAY1163877, ASP5878, E7090, ODM-203, Nintedanib, TAS-120, PRN 1109 및 PRN 1371로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, FGFR 키나아제 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온일 수 있다.
본 발명은 또한 (1) FGFR 키나아제 활성 저해제, (2) 융합 폴리펩타이드를 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편, (3) 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 (4) 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 대한 siRNA를 포함하는 약학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 방식으로 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자를 함유 또는 발현하거나 이러한 융합 폴리펩타이드를 발현하는 대상체를 처리하는 것을 포함하는, 맞춤화된 암 치료법 방법에 대한 것이다.
또한 진단 측면에 대한 치료법 방법은 (a) 암을 앓는 대상체로부터 암 세포 또는 종양 순환 DNA를 함유하는 생검 또는 유체 샘플을 취하는 단계; (b) 생검 또는 유체 샘플 내 세포가 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 함유 또는 발현하는지 또는 이러한 융합 폴리펩타이드를 발현하는지 여부를 결정하는 단계; (c) 단계 d의 치료를 위해, 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자를 함유 또는 발현하거나 융합 폴리펩타이드를 발현하는 대상체를 선택하는 단계; 및 (d) (1) FGFR 키나아제 활성 저해제, (2) 융합 폴리펩타이드를 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편, (3) 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 (4) 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 대한 siRNA를 포함하는 약학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 방식으로 선택된 대상체를 처리하는 단계를 포함한다.
상술된 치료법 방법에서 사용되는 FGFR 키나아제 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온, PD173074, Pazopanib, AZD4547, Ponatinib, Dovitinib, BGJ398, E-3810, JNJ-42756493, ARQ 087, LY2874455, BAY1163877, ASP5878, E7090, ODM-203, Nintedanib, TAS-120, PRN 1109 및 PRN 1371로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, FGFR 키나아제 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온일 수 있다.
본 발명은 또한 대상체로부터 암 세포 또는 종양 순환 DNA를 함유하는 생검 또는 유체 샘플의 단백질 또는 핵산을 검정하여 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 본 발명의 발현된 융합 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 인간 대상체에서 종양의 특성규명 방법에 대한 것이다. 특정한 구현예에서, 암은 쓸개관암종이다.
마지막으로, 본 발명은 또한 FGFR 저해 활성을 갖는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 (a) 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 발현하고 그 성장이 상기 발현에 의존하는 세포를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 배양하고, 세포 증식 수준을 결정하는 단계; (b) 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 배양된 세포의 증식 수준을 비교하는 단계; 및 (c) 시험 화합물의 존재 하에 배양된 세포의 증식 수준이 시험 화합물의 부재 하에 배양된 세포의 수준보다 낮은 경우, 시험 화합물이 FGFR 저해 활성을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함한다. 본 방법에서 이용되는 세포는 암 세포, 보다 구체적으로 쓸개관암종 세포일 수 있다.
도 1은 두 상이한 환자의 샘플로부터의 cDNA에서 증폭된 PCR 단편을 나타내며, 그 중 한 명은 FGFR2-VCL 융합 유전자를 가지고(A) 다른 한 명은 FGFR2-CCDC147 융합 유전자를 가지며(B), 아가로오스 겔 전기영동 후 가시화하였다. 표 1 및 서열번호 8, 9-12, 14-15)에 열거된 증폭을 위해 사용된 프라이머 페어: 1a: 프라이머 페어 16/17, 1b: 프라이머 페어 16/18, 2a: 프라이머 페어 16/19, 2b: 프라이머 페어 16/20, 3a: 프라이머 페어 16/21, 및 3b: 프라이머 페어 16/22. 단편 크기 표준을 실험 레인 왼쪽에 나타낸다.
도 2는 Rat2 세포 및 실시예 4에 따라 수득된 FGFR2-VCL 및 FGFR2-CCDC147을 발현하는 유도된 세포 풀에 대한 접종 효율(%) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 4에 따라 연질 한천에서 단일 세포의 21일 인큐베이션 후 수득된 Rat2 세포 콜로니의 대표 이미지를 나타낸다: 모체 세포(A), FGFR2-VCL 발현 세포(B) 및 FGFR2-CCDC147 발현 세포(C).
도 4는 실시예 5(1)에 따라 FGFR 저해제의 존재 하에 Rat2 세포로 수득된 용량 반응 곡선을 나타낸다: 모체 세포(A), FGFR2-VCL-발현 세포(B) 및 FGFR2-CCDC147-발현 세포(C). 성장 속도를 비교하였다. 도 4는 또한 상이한 저해제(D)로 수득된 IC50을 요약하는 표를 나타낸다.
도 5는 실시예 5(2)에 따라 FGFR 저해제의 존재 하에 Rat2 세포로 수득된 용량 반응 곡선을 나타낸다: 모체 세포(A), FGFR2-VCL-발현 세포(B) 및 FGFR2-CCDC147-발현 세포(C). 성장 속도를 비교하였다. 도 4는 또한 상이한 저해제(D)로 수득된 IC50을 요약하는 표를 나타낸다.
도 6은 각각 Rat2 세포(그룹 1 및 2), Rat2-FGFR2-CCDC147 세포(그룹 3 및 4) 및 Rat2-FGFR2-VCL 세포(그룹 5 및 6)가 접종된 마우스에서 실시예 6에 따라 측정된 일차 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다.
도 7은 실시예 7(1)의 생체내 모델에서 FGFR2-CCDC147에서 수득되는 종양 부피(A), 체중(B) 및 치료 마지막 날의 종양 중량(C)을 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. P-값은 만 휘트니 시험을 이용해서 비히클 대조군에 대비하여 계산되었다(괄호 안은 페어링되지 않은 t-테스트).
도 8은 실시예 7(2)의 생체내 모델에서 FGFR2-VCL에서 수득되는 종양 부피(A), 체중(B) 및 치료 마지막 날의 종양 중량(C)을 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. P-값은 만 휘트니 시험을 이용해서 비히클 대조군에 대비하여 그룹 2 및 3 간에 계산되었다(괄호 안은 페어링되지 않은 t-테스트).
도 9는 실시예 8(1)에 기재된 바와 같이 일시적으로 모의-전달감염되거나 FGFR2-VCL 또는 FGFR-CCDC147 발현 구축물로 전달감염되고, Vargatef, 화합물 A 또는 비히클로 짧게 처리된 HEK293T 세포의 웨스턴 블롯 분석이다. 항-myc 항체(α-myc)는 myc-태그된 융합 폴리펩타이드를 검출하였고, 항-포스포티로신 항체(α-pY)는 융합 폴리펩타이드의 인산화를 검출하였다.
도 10은 도 9에서와 유사한 실험으로부터의 결과를 보고하는 그래프이며, 여기서 융합 폴리펩타이드의 자가인산화는 실시예 8(2)에 상세히 나타낸 바와 같이 샌드위치 포스포티로신 ELISA에 의해 정량되었다. 광학 밀도 데이터를 나타낸다.
정의:
본 출원에서, 모든 게놈 서열 또는 서열 주석을 위해 이용된 참고문헌은 하기이다: [the Genome Reference Consortium Human Build 37 (GRCh37) and Ensembl v42 assembly (Flicek, P. et al. (2014) Nucleic Acids. Res. 42; D749-55, Database issue)].
"FGFR"은 섬유아세포 성장 인자 수용체 패밀리의 임의의 구성원을 나타낸다. FGFR 패밀리는 수용체 티로신 키나아제 패밀리의 구성원이다. FGFR 패밀리의 4 구성원, 즉 FGFR1, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4가 공지되어 있다. 본 발명에서 언급되는 FGFR은 임의의 기원에서 유래될 수 있지만, 바람직하게는 포유류 유래, 보다 바람직하게는 인간 유래이다. 가장 바람직한 FGFR은 FGFR2이다. 인간 FGFR2 유전자의 염색체 위치는 10q26이다.
"CCDC147"은 "147 함유 코일을 이룬 코일 도메인"으로 알려져 있는 폴리펩타이드를 나타낸다. 본 발명에서 언급되는 CCDC147 유전자 또는 폴리펩타이드는 임의의 기원에서 유래될 수 있지만, 바람직하게는 포유류 유래, 보다 바람직하게는 인간 유래이다. 폴리펩타이드의 발현은 신장, 간, 폐 및 혈액(혈소판)에서 관찰되었다. 인간 CCDC147 유전자의 염색체 위치는 10q25.1이다. CCDC147은 이제 명칭 CFAP58(섬모 및 편모 연관 단백질 58) 하에 Ensembl에 나타남이 주지된다.
"VCL"은 빈쿨린을 나타낸다. 빈쿨린은 세포-세포 및 세포-기질 접합부와 연관된 세포골격 폴리펩타이드이다. 본 발명에서 언급되는 VCL 유전자 또는 폴리펩타이드는 임의의 기원에서 유래될 수 있지만, 바람직하게는 포유류 유래, 보다 바람직하게는 인간 유래이다. 5 개-나선 번들을 함유하는 빈쿨린의 꼬리부분은 자가-연합하는 것으로 알려져 있다. [Campbell, S. (2006) Abstract: P26.00007]을 참고하라: 인간 VCL 유전자의 염색체 위치는 10q22.2이다.
FGFR2 뉴클레오타이드 서열(즉, 야생형 FGFR2 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열)에 적용되는 "야생형"은 전장 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 임의의 공지된 FGFR2 뉴클레오타이드 서열, 특히 임의의 서열번호 16, 22, 24, 26, 28, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 또는 58(ENST00000358487, '357555, '351936, '360144, '457416, '346997, '369056, '369058, '369061, '369059, '369060, '356226, '336553, '478859, '429361)을 나타낸다. FGFR2 아미노산 서열에 적용되는 "야생형"은 임의의 공지된 전장 FGFR2 폴리펩타이드 서열, 특히 임의의 서열번호 17(또는 23), 25, 27, 29, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59(ENSP00000351276, '350166, '309878, '353262, '410294, '263451, '358052, '358054, '358057, '358055, '358056, '348559, '337665, '474011, '404219)를 각각 나타낸다. VCL 뉴클레오타이드 서열(즉, 야생형 VCL 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열)에 적용되는 "야생형"은 전장 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 임의의 공지된 VCL 뉴클레오타이드 서열, 특히 임의의 서열번호 18, 30, 32, 34 또는 60(ENST00000211998, '372755, '417648, '436396)을 나타낸다. VCL 아미노산 서열에 적용되는 "야생형"은 임의의 공지된 전장 VCL 폴리펩타이드 서열, 특히 임의의 서열번호 19(또는 31), 33, 35 또는 61(ENSP00000211998, '361841, '411887, '415489)을 각각 나타낸다. CCDC147 뉴클레오타이드 서열(즉, 야생형 CCDC147 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열)에 적용되는 "야생형"은 전장 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 임의의 공지된 CCDC147 뉴클레오타이드 서열, 특히 서열번호 20, 36 또는 62(ENST00000369704, '369703)를 나타낸다. CCDC147 아미노산 서열에 적용되는 "야생형"은 임의의 공지된 전장 CCDC147 폴리펩타이드 서열, 특히 서열번호 21(또는 37) 또는 63(ENSP00000358718, '358717)을 각각 나타낸다. 동일한 맥락에서, "돌연변이체"는 서열번호 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 또는 62, 또는 서열번호 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 또는 63 각각의 서열 중 하나로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 하나의 아미노산이 상이한 서열을 나타낸다.
"폴리펩타이드의 일부"는 전장 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 임의 부분으로 구성된 폴리펩타이드를 나타낸다.
"융합 폴리펩타이드"는 야생형 또는 돌연변이체 FGFR 폴리펩타이드의 전부 또는 일부가 "융합 지점"으로 불리는 위치에서 상이한 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 융합된 폴리펩타이드를 나타낸다. 본 발명의 특정한 맥락에서, 본 용어는 야생형 또는 돌연변이체 FGFR 폴리펩타이드의 전부 또는 일부가 야생형 또는 돌연변이체 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부 또는 야생형 또는 돌연변이체 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 융합된 폴리펩타이드를 나타낸다.
"융합 유전자"는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 나타낸다. 융합 유전자는 또한, 게놈 구분점으로도 불리는 융합 지점을 포함한다.
"암"은 일반적으로 악성 신생물을 나타내며, 이는 전이성 또는 비-전이성일 수 있다. 예를 들면, 상피 조직, 예컨대 위장관 및 피부에서 발생하는 암의 비제한적 예에는 뇌 종양, 피부암, 두부 및 경부 암, 식도암, 폐암, 위암, 십이지장암, 유방암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체의 암, 췌장암, 간암, 쓸개관암종, 쓸개암, 결장직장암, 결장암, 방광암, 및 난소암이 포함된다. 비상피 조직(기질), 예컨대 근육에서 발생하는 육종의 비제한적 예에는 골육종, 연골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 지질육종 및 혈관육종이 포함된다. 추가로, 조혈 기관에서 유래되는 혈액 암의 비제한적 예에는 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 악성 림프종, 급성 골수구성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 급성 림프계 백혈병, 만성 림프계 백혈병을 포함하는 백혈병 및 다발성 골수종이 포함된다.
활성 제제, 예로 약물 성분의 "치료적 유효량"은 단회 또는 다회 투여 후, 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 유익/위험 비로 치료받는 대상체에 치료 효과를 부여하는 화합물의 양을 의미한다. 치료 효과는 객관적(즉, 일부 시험 또는 마커에 의해 측정가능함) 또는 주관적(즉, 대상체가 효과의 표시 또는 느낌을 제공함)일 수 있다. 그러나, 유효 용량이 또한 투여 경로뿐만 아니라 다른 제제와의 병용 가능성에 따라 변할 것임이 이해된다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 1일 사용은 철저한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효 용량 수준은 치료받는 장애 및 장애의 중증도; 채용되는 특정 활성 제제의 활성; 채용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시점, 투여 경로 및 채용되는 특정 활성 제제의 배출 속도; 치료 기간; 채용되는 특정 활성 제제와의 조합으로 또는 동시적으로 사용되는 약물; 등 의학 분야에 널리 공지된 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용 가능한 비히클"은 임의의 표준 약학 담체, 용매, 계면활성제, 또는 비히클을 포괄한다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 비히클에는 수성 비히클 및 비-수성 비히클이 포함된다. 표준 약학 담체 및 이들의 제형은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed. 1995]에 기재된다.
"에 특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적으로 혼성화하는"은 두 올리고- 또는 폴리-뉴클레오타이드가 서로 상호작용하지만 주어진 조건 하에서, 또는 조건이 주어지지 않은 경우에는 당분야의 지식에 근거하여 확인될 수 있는 적절한 조건 하에서, 임의의 상이한 올리고- 또는 폴리-뉴클레오타이드와는 검출 가능하게 상호작용하지 않음을 의미한다.
엑손은 인트론이 RNA 스플라이싱에 의해 제거된 후 해당 유전자의 최종 성숙 RNA 산물 내에 남아 존재하는 유전자에 의해 인코딩되는 임의의 뉴클레오타이드 서열이다. 용어 "엑손"은 유전자 내의 DNA 서열 및 RNA 전사체 및 이로부터 유래된 cDNA 내의 해당 서열을 모두 나타낸다. 본 출원의 목적을 위해, 엑손의 넘버링은 5' 미번역 서열을 함유하는 엑손 번호 1부터 시작한다. 서열번호 16, 18 및 20의 cDNA에는 미번역 서열이 포함되는 반면, 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62뿐만 아니라 서열번호 64-72의 하위서열은 폴리펩타이드-코딩 서열만을 함유함이 주지된다. 또한 액손 주석은 융합 유전자의 각 부분에 대해 Ensembl v42 어셈블리에서 확인되는 최장 코딩 전사체, 즉 FGFR2에 대해 서열번호 16, VCL에 대해 서열번호 18 및 CCDC147에 대해 서열번호 20의 기준에서 수행됨이 주지된다.
본원에서 이용되는 "cDNA"는 유전자 전사체의 부분적 또는 전체적 사본을 나타낸다. 본 용어는 후자의 사본, 그 상보체뿐만 아니라 사본 및 상보체 둘 다로 구성되는 이중쇄 DNA를 포괄하려는 것이다.
본 발명은 정상 세포에서가 아닌 일정한 인간 암 세포에서 발현되는 신규한 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이는 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 FGFR2 폴리펩타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; CCDC147 폴리펩타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; VCL 폴리펩타이드는 야생형 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 VCL 폴리펩타이드의 일부이며, 여기서 청구되는 융합 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이거나, 시험관내에서 증식되는 암 세포로부터 또는 이종이식편으로서 단리되거나, 인간 쓸개관암종으로부터 단리된다. 서열번호를 고려하여, 본 발명은 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 신규한 융합 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 FGFR2 폴리펩타이드는 임의의 서열번호 17, 25, 27, 29, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; CCDC147 폴리펩타이드는 서열번호 21 또는 63의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; VCL 폴리펩타이드는 임의의 서열번호 19, 33, 35 또는 61의 아미노산 서열을 갖는 야생형 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이다. 바람직하게는, 후자의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 융합 폴리펩타이드에 존재하는 폴리펩타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열의 단편에서 1-10개 아미노산, 보다 바람직하게는 1-5개 아미노산, 가장 바람직하게는 1-2개 아미노산에 영향을 미친다(즉, 치환하거나, 부가하거나, 결실시킨다). 돌연변이체 FGFR2, CCDC147 또는 VCL 폴리펩타이드는 또한 각각의 야생형 폴리펩타이드 또는 이들의 단편과 70% 이상 동일성, 바람직하게는 80% 이상 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일성을 갖는 FGFR2, CCDC147 또는 VCL 폴리펩타이드를 포괄한다. 가장 바람직하게는, 돌연변이체 폴리펩타이드는 각각의 야생형 폴리펩타이드 또는 이들의 단편과 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
서로에 대한 아미노산 서열(또는 뉴클레오타이드 서열)의 동일성은 알고리즘 BLAST를 이용해서 결정될 수 있다[Karin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7]. 프로그램, 예컨대 BLASTN 및 BLASTX는 상기 알고리즘에 기반하여 개발되었다[Altschul. Et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10]. BLASTN에 따라 뉴클레오타이드 서열을 분석하기 위해, 스코어에 대한 파라미터는 100으로, 워드길이(wordlength)는 12로 설정될 수 있다. BLASTX를 이용하여 아미노산 서열을 분석하는 경우, 스코어는 50으로, 워드길이는 3으로 설정될 수 있다. 기본 파라미터는 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우 이용될 수 있다. 이러한 분석을 위한 구체적 기법은 당분야에 공지되어 있다. National Center for Biotechnology Information(NCBI), Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)의 웹사이트에 대한 정보를 참조한다.
본 발명은 또한 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포괄하며, 여기서 FGFR2 폴리펩타이드는 포유류 동물 프로테옴에서 확인 가능한 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 후자의 폴리펩타이드와 상이한 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이며; CCDC147 폴리펩타이드는 포유류 동물 프로테옴에서 확인 가능한 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 후자의 폴리펩타이드와 상이한 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이며; VCL 폴리펩타이드는 포유류 동물 프로테옴에서 확인 가능한 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 후자의 폴리펩타이드와 상이한 돌연변이체 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이다.
본 발명은 추가로 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이는 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 cDNA에 관한 것이며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드; 및 야생형 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드를 조합한다. 서열번호를 고려하면, 본 발명은 FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(cDNA)에 관한 것이며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드(상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 임의의 서열번호 16, 22, 24, 26, 28, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 또는 58의 뉴클레오타이드 서열, 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 임의의 서열번호 16, 22, 24, 26, 28, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 또는 58로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 포괄함); 및 야생형 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드(제2 폴리뉴클레오타이드는 임의의 서열번호 20, 36 또는 62, 또는 임의의 서열번호 18, 30, 32, 34 또는 60의 뉴클레오타이드 서열, 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 임의의 서열번호 20, 36 또는 62, 또는 임의의 서열번호 18, 30, 32, 34 또는 60의 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 포괄함)를 조합한다. 바람직하게는, 후자의 FGFR2, CCDC147 또는 VCL을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 내 코돈의 치환, 결실 또는 삽입은 융합 폴리펩타이드에 존재하는 인코딩된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 단편에서 1-10개 아미노산, 보다 바람직하게는 1-5개 아미노산, 가장 바람직하게는 1-2개 아미노산에 영향을 미친다(즉, 치환하거나, 부가하거나, 결실시킨다). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에는 또한 독립적으로 각각의 야생형 폴리펩타이드 또는 이들의 단편과 70% 이상 동일성, 바람직하게는 80% 이상 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일성을 갖는 FGFR2, CCDC147 또는 VCL 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 가장 바람직하게는, 유도된 폴리뉴클레오타이드는 각각의 야생형 폴리펩타이드 또는 이들의 단편과 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 또는 이들의 단편을 인코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 이들에는, 예컨대 메신저 RNA(mRNAs)로부터 제조되는 모든 cDNA, 게놈 DNA로부터 유도체화되는 DNA, 화학적 합성에 의해 제조되는 DNA, RNA 또는 DNA 주형으로부터 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 수득되는 DNA뿐만 아니라 후자의 방법의 조합에 의해 제조되는 DNA도 포함된다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 비-게놈-유형 폴리뉴클레오타이드는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA로부터 cDNA의 합성에 의해, 게놈 DNA 단편의 단리에 이은 융합 폴리펩타이드-코딩 영역 내 개재 서열의 제거에 의해, 또는 당분야에 공지된 방법을 이용하는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.
하나의 예를 제공하기 위해, 전체 RNA는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포 또는 조직으로부터 제조될 수 있다. 전체 RNA는, 예로 구아니딘-이소티오시아네이트 방법, 고온 페놀 방법 또는 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법에 의해 수득될 수 있다. 메신저 RNA는 올리고(dT) 셀룰로오스, 폴리U 세파로오스 등 상에서의 친화도 크로마토그래피에 의해 선택될 수 있다. 주형으로서 이러한 mRNA를 이용하여, cDNA 합성이 공지된 방법을 이용하여, 예로 역전사효소 반응을 이용하여 수행될 수 있다[Mol. Cell. Biol. 2: 161 (1982); Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983); Gene 25: 263 (1983)]. 제2 가닥 합성에 이어, 이중쇄 cDNA가 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지, 코스미드 등 내로 삽입된다. 이어서 생성 라이브러리가 적절한 숙주 세포, 예로 E. 콜라이 내로 도입되고, 당분야에 공지된 방법, 예로 콜로니 혼성화를 이용해서 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 대한 cDNA를 수반하는 벡터의 숙주 세포 내 존재에 대해 스크리닝된다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 수반하는 벡터를 포괄한다. 본 벡터는 이들이 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 자가 복제 또는 증폭하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 표준 분자 생물학 기법을 이용해서 벡터 내로 도입될 수 있다. 벡터에는 E. 콜라이-유래 플라스미드, 예컨대 pBR322, pBR325, pUC12. pUC13, pUC19, 효모(예로, S. 세레비시애)-유래 플라스미드, 예컨대 pYC 벡터 또는 pRS 셔틀 벡터, 및 바실러스 서브틸리스-유래 플라스미드, 예컨대 pUB110, pTP5 또는 pC194가 포함된다. 바이러스 벡터에는 박테리오파지 벡터, 예컨대 λgt10 및 λgt11, 그리고 핵 다면체형성 바이러스, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 등으로부터 유도된 곤충 또는 동물 바이러스 벡터가 포함된다.
본 발명은 또한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 삽입 및 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 발현 벡터에 관한 것이다. 적합한 발현 벡터에는 pEF-BOS(Nucleic acids Res. 18: 5322 (1990)) 및 pME18S-FL(Addgene 플라스미드 저장 데이터베이스, www.addgene.org, March 7, 2014)이 포함된다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 또한 다른 폴리펩타이드와의 (추가) 융합물로서 발현될 수 있다. 플라스미드 pGEX4T1은 글루타치온 S-트랜스퍼라아제 서열과의 융합물로서 융합 폴리펩타이드의 생산을 위해 적합하다. 적절한 벡터를 이용하여, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 또한, 예로 인플루엔자 헤마글루티닌, 면역글로불린 불변 영역, β-갈락토시다아제, 또는 말토오스-결합 단백질과의 융합물로서(예로, pMAL C2 벡터를 이용해서) 발현될 수 있다. 다양한 펩타이드와의 융합물, 예컨대 FLAG(Hopp, T.P. et al. (1988) BioTechnology 6: 1204-10), 6개의 히스티딘 잔기로 구성되는 6 x His, 10 x His, 인플루엔자 헤마글루티닌 단편, 인간 c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18 HIV의 단편, T7-태그, HSV-태그, E-태그, SV40 T 항원의 단편, Ick 태그, α-튜불린의 단편, B-태그, 단백질 C의 단편, Stag, StrepTag 및 HaloTag와의 융합물이 또한 포괄된다.
발현 벡터는 프로모터, 전사 및 번역 인핸서, 번역을 위한 시작/정지 코돈, 리보솜 결합 부위 신호, 전사 종료 신호, 폴리아데닐화 부위, 배지(또는 원형질막 주위 공간) 내로 융합 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 등과 같은 요소를 포함하는, 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 대한 cDNA 유전자의 효율적인 전사 및 번역을 위해서 뿐만 아니라 복제를 위해서 필요한 모든 요소를 함유하는 것이 이해된다. 또한, 벡터는 형질전환된 숙주 또는 유전자 증폭을 포함하는 숙주의 선택을 가능케 하는 마커 유전자(증폭용 유전자, 약물 내성 유전자 등)를 함유할 수 있다. 예시적인 프로모터에는 E. 콜라이 Trp, lac, recA, lPL, Ipp 및 tac 프로모터, 효모 PH05, PGK, GAP 및 ADH 프로모터, B. 서브틸리스 SL01, SP02 및 penP 프로모터 및 포유류 SV40, 레트로바이러스 및 열 충격 프로모터가 포함된다. 예시적인 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자, 티미딘 키나아제 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 글루타메이트 합성효소 유전자, 아데노신 데아미나아제 유전자, 오르니틴 데카르복실라아제 유전자, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라아제 유전자, 및 아스파르테이트 트랜스카르바밀라아제 유전자가 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 표준 분자 생물학 기법을 이용해서 발현 벡터 내로 도입될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 수반하는 발현 벡터를 포함하는 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다. 이렇게 형질전환될 수 있는 세포 유형에 대해서 특정한 제한은 없다. E. 콜라이 및 특정한 포유류를 포함하는 동물 세포가 바람직하다. E. 콜라이 세포의 예는 DH5α, TB1 및 HB101이며, 마우스 세포의 예는 COP, L, C127, Sp2/0, NS-1 및 NIH3T3 세포이고, 래트 세포의 예는 PC12 및 PC12h이고, 햄스터 세포의 예는 BHK 및 CHO이고, 원숭이 세포의 예는 COS1. COS3, COS7, CV1 및 Vero이고, 인간 세포의 예는 HeLa 세포, 이배체 섬유아세포-유래 세포, 골수종 세포 및 HepG2 세포이다. 숙주 세포 내로 벡터를 도입하기 위한 방법은 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 (1972); Mol. Gen. Genet. 168: 111 (1979); J. Mol. Biol. 56: 209 (1971); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1927 (1978); J. Bacteriol. 153: 163 (1983); Virology 52: 456 (1973); Mol. Cell. Biol. 3: 2156 (1983)]에 기재되었다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 바람직하게는 포유류 동물 또는 인간 세포를 포함하는 동물이고, 세포가 폴리펩타이드를 분비할 수 있는 한, 바로 앞에 기재된 바와 같이 재조합 세포를 배양한 후 배양 배지를 수집하고 이로부터 세포 및 세포 파편이 여과 또는 원심분리에 의해 제거됨으로써 생산될 수 있다. 이어서 융합 폴리펩타이드는 종래 방법, 예컨대 용해도에 기반하는 방법, 예로 염석 및 용매 침전, 분자 크기에 기반하는 방법, 예로 투석, 초여과, 겔 여과 및 천연 및 SDS-PAGE, 전하에 기반하는 방법, 예로 이온 교환 크로마토그래피 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 친화도-기반 방법, 예로 친화도 컬럼 크로마토그래피, 소수성을 이용하는 방법, 예로 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 및 폴리펩타이드 간 등전점 차이에 기반하는 방법, 예로 등전 초점 조절에 의해 정제될 수 있다.
재조합 세포에서 생산되는 융합 폴리펩타이드가 세포질/핵질에 또는 벽이 있는 재조합 세포의 세포질막 주위에 축적되는 경우, 세포는 여과 또는 원심분리와 같은 방법에 의해 수집된다. 적절한 완충액 중 세포의 현탁 후, 세포벽 또는 세포막이 각각 초음파 처리, 라이소자임 처리 또는 냉동용해와 같은 방법에 의해 파괴되고, 막 또는 세포질/핵질 분획이 원심분리 또는 여과 후에 수득된다. 이어서 융합 폴리펩타이드는 바로 앞에 기재된 생화학적 방법에 의해 정제된다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포괄한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내의 서열과 상보적인 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 페어는 PCR에 의해 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 일부의 증폭을 위한 프라이머로서 유용하다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 임의의 길이일 수 있다. 바람직하게는, 이들은 적어도 12개의 연속 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 12-50개의 연속 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 18-30개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 전형적으로, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 내부 2차 구조를 갖지 않으며, 40 내지 60%의 G/C 함량을 갖고, G/C 및 A/T 풍부 도메인의 밸런스가 잡힌 분포를 갖는다. 올리고뉴클레오타이드가 혼성화 절차에서 이용되는 경우, 이들의 서열 길이가 길수록 선호된다. 따라서, 300개를 초과하는 연속 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드가 200개를 초과하는 연속 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드보다 바람직하며, 이는 100개를 초과하는 연속 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드보다 바람직하다. 100개를 초과하는 연속 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드는 50개를 초과하는 연속 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드보다 바람직하고, 이는 20 내지 50개의 연속 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드보다 바람직하다.
또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA 서열의 일부와 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 포괄된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 소형 간섭 RNA(siRNAs)로서 기능할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 mRNA 또는 게놈 DNA에 결합하며, 이들의 번역 또는 전사를 각각 저해한다. 5-70개의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 5-100개의 연속 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드보다 바람직하며: 5-50개의 연속 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드가 보다 바람직하다. 5-30개의 연속 뉴클레오타이드를 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 더욱 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이들의 혈중 안정성, 분해에 대한 내성 또는 소화관 내 흡수 또는 막 투과성을 증강시키기 위해 개질될 수 있다. 포스페이트 결합의 개질에는 하나 이상의 결합의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로아미데이트, 비-포스페이트 결합 또는 포스포노티오네이트 결합으로의 전환이 포함된다. 리보오스는 2'-플루오로리보오스 또는 2'-O-메틸리보오스로 전환될 수 있다. 개질된 뉴클레오타이드 염기에는 5-프로피닐우라실 및 2-아미노아데닌이 포함된다. siRNA는 전형적으로 RNA 간섭이 가능한 10-25개 뉴클레오타이드 길이의 이중쇄 RNA(dsRNAs)이다[Bass (2001) Nature 411: 428-429; Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-98]. 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 마찬가지로, siRNA도 화학적으로 개질된 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 보다 최근에 기재된 단일쇄 siRNA도 본원에 포괄된다[Lima, W.F. et al. (2012) Cell 150: 883-894; Yu, D. et al. (2012) Cell 150: 895-908].
특정 구현예에서, 혼성화 절차에서(즉, 올리고뉴클레오타이드 탐침으로서) 이용되는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 두 융합 파트너로부터의, 즉 FGFR2로부터 그리고 CCDC147 또는 VCL로부터의 서열로 이루어지는 영역과 상보적이다. 보다 구체적인 구현예에서, 이는 융합 지점을 포함하는 영역과 상보적이다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 일부의 증폭을 위해 이용되는 프라이머 페어의 하나의 프라이머는 FGFR2 서열과 동일하거나 상보적인 반면, 다른 프라이머는 VCL 또는 CCDC147 서열과 동일하거나 상보적이다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 임의의 일부에 결합하는 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 임의의 특정 유형의 항체에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 임의의 포유류 원천에서 유래되고 폴리클로날 또는 모노클로날인 임의의 항체일 수 있다. 포유류 모노클로날 항체, 예로 마우스 모노클로날 항체의 생산 방법은 오랫동안 확립되어 왔으며, 당분야 숙련가에 의해 널리 실시된다[Kohler and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73: 3-46]. 인간 대상체에 대한 투여를 위해 바람직한 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체이다. 이들은, 예로 포유류 동물, 예컨대 마우스로부터의 항체와는 대비되어, 인간 숙주 면역 반응을 야기하지 않거나 덜 야기하기 때문에 바람직하다. 인간 불변 영역 및 포유류 동물로부터의 가변 영역을 함유하는 키메라 항체의 제조 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다[Carl, A.K. et al. "Therapeutic monoclonal antibody", published in the U.K. by McMillan Publishers LTD., 1990]. 이는 인간화된 항체에 있어서도 마찬가지이다. 특허 공보 EP 125023; WO 96/02576; WO 98/13388; EP 239400; WO 96/02576. 동물 항체 유전자로부터의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 인간 항체 주형 유전자에 도입하여 인간화된 항체를 직접 생산하는 기법도 기재되었다. 인간 항체를 수득하기 위해 몇몇 널리 공지된 접근이 존재한다. 인간 모노클로날 항체는 인간 림프구의 시험관내 면역화에 이어 인간 림프모세포종 세포주에 대한 융합에 의해 생산될 수 있다. 이어서 항체는 생물공학적 방법에 의해 생성 융합 세포로부터 생산될 수 있다[Borrebaek et al. (1988) Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: 3995-9]. 인간 항체는 또한 인간 항체 유전자의 전체 레퍼토리를 수반하는 트랜스제닉 동물의 면역화로부터 수득될 수 있다. 국제 공보 번호 WO 2003/12227; WO 92/03918; WO 94/02602; WO 94/25585; WO 96/34096 및 WO 96/33735. 또 다른 접근에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 대한 항체를 발현하는 인간 B 세포는 적합한 접근, 예컨대 유세포 측정을 이용해서 선택될 수 있다. 이어서 항체의 뉴클레오타이드 서열이 결정될 수 있다[Jin et al. (2009) Nat. Med. 15: 1088-92; Scheid et al. (2009) Nature 458: 636-40; Wrammert et al. (2008) Nature 453: 667-72; Tiller et al. (2008) J. Immunol. Meth. 329: 112-24]. 이후 상기 정보는 항체를 인코딩하는 DNA 서열을 수득하고, 적절한 발현 벡터를 구축하고, 생물공학적 방법에 의해 항체를 생산하기 위해 이용된다. 국제 공보 번호 WO 92/01047; WO 92/20791; WO 93/06213; WO 93/11236; WO 93/19172; WO 95/01438 및 WO 95/15388. 또 다른 접근에는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 패닝이 관여되며, 여기서 단일쇄 인간 항체(인간 scFv)는 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이된다. 선택된 scFv를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 결정에 이어, 전체 항체 유전자가 적합한 생산체 세포에서 구축되고 발현될 수 있다. 국제 공보 번호 WO 92/01047; WO 92/20791; WO 93/06213; WO 93/11236; WO 93/19172; WO 95/01438 및 WO 95/15388.
본 발명의 항체에는 IgG에 의해 대표되는 2가 항체뿐만 아니라 IgM에 의해 대표되는 1가 항체가 포함된다. 두 상이한 항원에 결합하는 이중 특이적 항체도 포괄된다. 또한 항체 및 독성 산물 또는 폴리펩타이드의 키메라가 포괄된다. 본 발명의 항체에는 또한 항원-결합 단편, 예컨대 미니바디가 포함된다. 미니바디는 전형적으로 6개의 CDR 서열이 포함되는 항체의 일부만을 포함한다. 미니바디의 구체예에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(단일쇄 Fv), 디아바디, 및 sc(Fv)2(단일쇄 (Fv)2), 및 이들의 다량체가 포함된다. 항원 결합 분자 단편의 생산에 대해서는, [Co et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better and Horwitz (1989) Meth. Enzymol. 178: 476-96; Plueckthun and Skerra (1989) Meth. Enzymol. 178: 476-96; Lamoyi (1989) Meth. Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1989) Meth. Enzymol. 121: 663-69; Bird et al. (1991) TIBTECH 9: 132-7]을 참고하라. 디아바디에 대해서는 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; 특허 공보 EP 404,097 및 WO 93/11161]을 참고하라. scFv 항체에 대해서는 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5879-83; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 35 269-315 (1994)]를 참고하라. sc(Fv)2는 2개의 VH 및 2개의 VL을 링커 등을 이용해서 연결하여 생산되는 단일쇄 미니바디이다(Hudson et al. (1999) J Immunol. Methods 231: 177-89). 또한 항체-약물 콘주게이트(ADC)가 포괄되며, 여기서 본 발명의 항체는 세포독성 제제에, 예로 링커를 통해 연결된다.
구체적 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 두 융합 파트너로부터의, 즉 FGFR2부터 및 CCDC147 또는 VCL부터의 서열로 이루어진 에피토프에 결합한다. 추가적인 구체적 구현예에서, 이들은 융합 지점을 포함하는 에피토프에 결합한다.
본 발명은 추가로 명백히 암을 포함하는 질환 또는 상태의 치료에 관한 것이며, 여기서 이환 조직은 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 발현한다. 치료에는 치료적 유효량의 활성 제제의 투여 방식이 관여될 수 있다. 활성 제제는 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 융합 폴리펩타이드 mRNA(또는 유전자)에 대한 안티센스 RNA 또는 siRNA 분자 또는 융합 폴리펩타이드의 키나아제 활성 저해제일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물에 대한 것이다. 예를 들어, 항-FGFR2 항체에는 BAY1179470(Kopitz C. et al. (2014) Cancer Res 74 (Suppl. 19) 7445 - Abstract DDT02-01) 및 FPA144(Gemo AT. et al. (2014) Cancer Res 74 (Suppl. 19) - Abstract 5446)가 포함된다. FGFR2에 대한 ADC에는 BAY1187982(Sommer A. et al. (2014) Cancer Res. 74 (Suppl. 19) - Abstract 4491)가 포함된다. 후자의 조성물은 우선적으로는 비경구 투여될 것이지만, 경비강, 경폐 또는 경피 전달도 고려된다. 약학적 조성물은 임의의 통상적인 비독성의 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트 또는 비히클을 함유할 수 있다. 일부 경우, 제형물의 pH는 제형화된 제제 또는 그 전달 형태의 안정성을 증강시키기 위해 약학적으로 허용 가능한 산, 염기 또는 완충제로 조정될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 비경구에는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 수강내, 척수내, 병소내 및 두개내 주사 또는 주입 기법이 포함된다.
주사제 제조물, 예를 들어, 멸균 주사제 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 수화제 및 현탁화제를 이용해서 공지된 분야에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사제 제조물은 또한 비독성의 비경구로 허용 가능한 희석제 또는 용매 중, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 용액으로서의 멸균 주사제 용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 채용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액(U.S.P.) 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액이 있다. 또한, 멸균, 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 채용된다. 상기 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 배합 고정유가 채용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 주사제 제조물에서 이용된다. 주사제 제형물은, 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사제 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균화제를 포함시킴으로써 멸균화될 수 있다.
항원-결합 분자를 함유하는 약학적 조성물의 용량은, 예를 들어 각각의 투여에 있어서 0.01 내지 30 mg/kg일 수 있다. 대안적으로, 누적 용량은, 예를 들어 대상체 당 0.001 내지 100,000 mg일 수 있다. 그러나, 본 발명은 상술된 수치값에 제한되지 않는다. 용량 및 투여 방법은 대상체의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변한다. 당분야 숙련가는 상술된 요인을 고려하여 적절한 용량 및 투여 방법을 설정할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA에 대한 안티센스 RNA 또는 siRNA 분자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적 구현예에서, 안티센스 RNA 또는 siRNA 분자는 두 융합 파트너로부터의, 즉 FGFR2로부터 및 CCDC147 또는 VCL로부터의 서열로 이루어진 서열, 또는 더욱 구체적으로 융합 지점을 포괄하는 서열에 대한 것이다. dsRNA를 함유하는 약학적 조성물은, 예로 EP 특허 번호 1144623 및 1214945, 및 US 특허 번호 8'546'143에 기재되었다. 동일한 원리가 또한 안티센스 RNA 또는 보다 최근에 발견된 단일쇄 siRNA(ss siRNAs)에 관해 적용된다[Juliano, R. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36: 4158-71; Lima et al. (2012); Yu et al. (2012)].
dsRNA를 함유하는 약학적 조성물은 비제한적으로 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 직장, 질 및 국소(구강 및 설하) 투여를 포함하는 경구 또는 비경구를 포함하는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내 또는 복강내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
경구 투여에 있어서, dsRNA를 함유하는 약학적 조성물은 일반적으로 정제 또는 캡슐, 분말 또는 과립, 또는 수성 용액 또는 현탁액일 것이다. 경구 사용을 위한 정제에는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 혼합된 활성 성분이 포함될 수 있다. 적합한 불활성 희석제에는 나트륨 및 칼슘 카보네이트, 나트륨 및 칼슘 포스페이트, 및 락토오스가 포함되는 반면, 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제에는 전분 및 젤라틴이 포함될 수 있는 반면, 존재하는 경우, 윤활제는 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 것이다. 원하는 경우, 정제는 위장관내 흡수를 지연시키기 위해 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다. 경구 사용을 위한 캡슐에는 활성 성분이 고체 희석제와 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐 및 활성 성분이 물 또는 오일, 예컨대 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐이 포함된다.
근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 사용을 위해, dsRNA를 함유하는 약학적 조성물은 일반적으로 적절한 pH 및 등장성으로 완충된 멸균 수성 용액 또는 현탁액의 형태일 것이다. 적합한 수성 비히클에는 링거액 및 등장성 나트륨 클로라이드가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 담체는 배타적으로 수성 완충제로 구성된다. 상기 맥락에서, "배타적으로"는 표적 유전자를 발현하는 세포에서 dsRNA의 섭취에 영향을 미치거나 이를 매개할 수 있는 보조제 또는 캡슐화 성분이 존재하지 않음을 의미한다. dsRNA를 세포 배양물 내로 효율적으로 도입하기 위해 마이크로주사, 리포펙션, 바이러스, 바이로이드, 캡시드, 캡소이드 또는 다른 보조제가 필요할 수 있지만, 이들 방법 및 제제는 생체내 dsRNA의 섭취를 위해 필요하지 않다. 안티센스 RNA 및 ss siRNA에 대해서도 동일하게 해당됨이 관찰된다[Juliano et al. (2008); Davidson, B.L. & Monteys, A.M. (2012) Cell 150: 873-5].
수성 현탁액 형태로 dsRNA를 함유하는 약학적 조성물에는 현탁화제, 예컨대 셀룰로오스 유도체, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈 및 트래거캔스 고무, 그리고 수화제, 예컨대 레시틴이 포함될 수 있다. 수성 현탁액을 위해 적합한 보존제에는 에틸 및 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트가 포함된다.
dsRNA를 함유하는 약학적 조성물에는 또한 신체로부터의 신속한 제거에 대해 dsRNA를 보호하는 캡슐화된 제형물, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제형물이 포함된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이러한 제형물의 제조 방법은 당분야 숙련가에게 자명할 것이다. 적합한 중합체 물질은, 예로 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.에서 수득될 수 있다. 리포좀 현탁액은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당분야 숙련가에게 공지된 방법, 예를 들어 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 번호 4,522,811; 국제 특허 공보 WO 91/06309; 및 유럽 특허 공보 EP-A-43075에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 FGFR 티로신 키나아제 활성 저해제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. FGFR 키나아제 활성의 임의의 저해제가 채용될 수 있다. 저해제에는 국제 특허 공보 WO 2011/016528에 기재된 저해성 아미노피라졸 유도체 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 특히 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온(CAS 1265229-25-1, 본원에서 화합물 A로 언급됨)이 포함된다. 이들에는 추가로 저해제 PD173074(Mohammadi et al. (1998) EMBO J. 17: 5896-904), Pazopanib(Harris et al. (2009) J. Med. Chem. 51: 4632-40; Keisner and Shah (2011) Drugs 71: 443-54), AZD4547(Gavine et al. (2012) Cancer Res. 72: 2045-56), Ponatinib(또는 AP24534)(Huang et al. (2010) J. Med. Chem. 53: 4701-19), Dovitinib(Trudel et al. (2005) Blood 105: 2941-8; Man et al. (2014) J. Cell. Mol. Med. 18: 143-55), BGJ398(Guagnano et al. (2011) J. Med. Chem. 54: 7066-83), Lucitanib으로도 알려져 있는 E-3810(Bello et al. (2011) Cancer Res. 71: 1396-405), JNJ-42756493(Squires et al. (2008) AACR Abstract 1545), ARQ 087(Yu et al. (2011) Cancer Res. 71 (Suppl. 1) 3671), LY2874455(Zhao G et al. Mol Cancer Ther. (2011) Nov;10(11):2200-10), BAY1163877(Heroult et al. (2014) Cancer Res. 74 (Suppl. 19) - Abstract 1739), ASP5878(73rd Annual Meeting of the Japanese Cancer Association (2014) - Abstract/Poster 1411), E7090(Saori Watanabe Miyano et al. (2015) AACR Abstract 770), ODM-203(Holmstroem T. et al. 26th ENA Symposium (2014) Eur. J. Cancer 50(S6):142 - Abstract 432), Nintedanib(Roth GJ et al. J Med Chem. (2015) Feb 12;58(3):1053-63), TAS-120(Ochiiwa, H. et al. (2013) AACR; Mol. Cancer Ther. 12(11 Suppl) Abstract A270), PRN 1109 및 PRN 1371(둘 다: Phan VT. et al. 26th ENA Symposium (2014) Eur. J. Cancer 50(S6):157 - Abstract 483)이 포함된다.
특히 바람직한 저해제는 화합물 A이다.
FGFR 티로신 키나아제 활성 저해제(또한 "약물 성분"으로 아래에서 언급됨)를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이에 의해, 국소, 직장, 비강, 구강, 질 또는 이식된 저장소를 통해, 바람직하게는 경구 투여 또는 주사에 의한 투여에 의해 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 임의의 통상적인 비독성의 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트 또는 비히클을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, 제형물의 pH는 제형화된 화합물 또는 그 전달 형태의 안정성을 증강시키기 위해 약학적으로 허용 가능한 산, 염기 또는 완충제로 조정될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 비경구에는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 수강내, 척수내, 병소내 및 두개내 주사 또는 주입 기법이 포함된다.
경구 투여용 액체 투여형 형태에는 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서가 포함된다. 약물 성분에 부가하여, 액체 투여형 형태는 당분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제에 덧붙여서, 경구 조성물에는 또한 아쥬반트, 예컨대 수화제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제 및 향료제가 포함될 수 있다.
주사제 제조물, 예를 들어 멸균 주사제 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 수화제 및 현탁화제를 이용해서 공지된 분야에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사제 제조물은 또한 비독성의 비경구 허용 가능한 희석제 또는 용매 중 멸균 주사제 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 용액으로서 있을 수 있다. 채용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액(U.S.P.) 및 등장성 나트륨 클로라이드 용액이 있다. 또한, 멸균, 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 채용된다. 상기 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 배합 고정유가 채용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 주사제의 제조에서 사용된다.
주사제 제형물은, 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사제 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균화제를 포함시킴으로써 멸균화될 수 있다.
약물 성분의 효과를 연장하기 위해, 종종 피하 또는 근육내 주사로부터 약물 성분의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 불량한 수용해도를 갖는 결정형 또는 무정형 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이어서 약물 성분의 흡수 속도는 그 용해 속도에 의존하며, 이는 다시 결정 크기 및 결정형 형태에 의존할 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 비히클 중 약물 성분의 용해 또는 현탁에 의해 달성된다. 주사제 데팟 형태는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜라이드 중 약물 성분의 마이크로캡슐화 기질을 형성함으로써 제조된다. 약물 성분 대 중합체의 비 및 채용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 데팟 주사제 제형물은 또한 약물 성분을 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼 중에 트랩핑하여 제조된다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 바람직하게는 약물 성분을 적합한 비자극 부형제 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 상온에서 고체이지만 체온에서 액체이며, 이에 따라 직장 또는 질 강에서 용융되어 활성 화합물을 방출하는 좌약 왁스와 혼합하여 제조될 수 있는 좌약이다.
경구 투여용 고체 투여형 형태에는 캡슐, 정제, 알약, 분말 및 과립이 포함된다. 이러한 고체 투여형 형태에서, 약물 성분은 적어도 하나의 불활성, 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 및/또는: a) 충전제 또는 연장제, 예컨대 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산, b) 결합제, 예를 들어 카복시 메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스 및 아카시아, c) 습윤제, 예컨대 글리세롤, d) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 일정한 실리케이트 및 나트륨 카보네이트, e) 용액 완화제, 예컨대 파라핀, f) 흡수 가속화제, 예컨대 사차 암모늄 화합물, g) 수화제, 예컨대 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및/또는 i) 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 투여형 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토오스 또는 유당과 같은 부형제뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 채용될 수 있다.
정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여형 형태는 코팅 및 셸, 예컨대 장용 코팅 및 약학 제형 분야에 널리 공지된 다른 코팅과 함께 제조될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있고, 또한 이들이 장관의 일정 부분에서만 또는 선호하며, 선택적으로는 지연되는 방식으로, 활성 성분(들)을 방출하는 조성물일 수 있다. 이용될 수 있는 구현 조성의 예에는 중합체성 성분 및 왁스가 포함된다.
약물 성분의 국소 또는 경피 투여용 투여형 형태에는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치가 포함된다. 약물 성분은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 필요할 수 있는 임의의 필요한 보존제 또는 완충제와 멸균 조건 하에 혼합된다. 안과 제형물, 점비제, 눈 연고, 분말 및 용액도 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 약물 성분에 부가하여, 부형제, 예컨대 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 아연 옥사이드, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 약물 성분에 부가하여, 부형제, 예컨대 락토오스, 활석, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 성분의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가적으로 통상적인 추진제, 예컨대 클로로플루오로하이드로카본 또는 환경 친화적인 추진제, 예컨대 하이드로플루오로알칸, C3-C6 경성 포화 탄화수소, 디메틸 에테르 등을 함유할 수 있다.
경피 패치는 신체에 약물 성분의 조절되는 전달을 제공하는 추가 이점을 갖는다. 이러한 투여형 형태는 적절한 매질 중에 약물 성분을 용해시키거나 분산시켜 제조될 수 있다. 흡수 증강제는 또한 피부를 통한 약물 성분의 흐름을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 속도는 속도-조절 막을 제공함으로써 또는 중합체 기질 또는 겔 중에 화합물을 분산시킴으로써 조절될 수 있다.
폐 전달을 위해, 본 발명의 약학적 조성물은 직접 투여, 예로 호흡계 내로의 흡입에 의해 고체 또는 액체 미립자로 제형화되고 환자에게 투여된다. 본 발명을 실시하기 위해 제조된 약물 성분의 고체 또는 액체 미립자 형태에는 호흡 가능한 크기의 입자; 즉, 흡기 시 입 및 후두를 통해 폐의 기관지 및 폐포 내로 통과하기 위한 충분히 작은 크기의 입자가 포함된다. 에어로졸화된 치료제, 특히 에어로졸화된 항생제의 전달은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어, 그 전부가 본원에 참조로 포함되는 US 특허 번호 5,767,068(VanDevanter et al.), US 특허 번호 5,508,269(Smith et al), 및 국제 특허 공보 WO 98/43650을 참고하라). 항생체의 폐 전달의 논의는 본원에 참조로 포함된 US 특허 번호 6,014,969에서도 확인된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 치료 방식은 이러한 치료를 필요로 하는 인간 대상체에 대해 단회 또는 다회 용량으로 1일 0.1 mg 내지 1000 mg의 약물 성분(즉, FGFR 티로신 키나아제 활성 저해제)의 투여를 포함한다. 단회 용량 조성물은 1일 용량을 채우기 위해 이러한 양 또는 이들의 분할량을 함유할 수 있다.
약물 성분은, 예를 들어 4 내지 120 시간마다 또는 특정한 약물 성분의 요건에 따라, 주사에 의해, 정맥내, 동맥내, 피내, 복강내, 근육내, 또는 피하; 또는 경구, 구강, 비강, 경점막, 국소, 안과 제조물로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 본원에서의 방법은 원하거나 언급되는 효과를 달성하기 위한 유효량의 약물 성분 또는 약물 성분을 포함하는 약학적 조성물의 투여를 고려한다. 전형적으로, 약학적 조성물은 하루 1 내지 6 회, 또는 대안적으로 연속 주입으로 투여될 것이다. 이러한 투여는 만성 또는 급성 치료법으로서 이용될 수 있다. 단회 투여형 형태를 생성하기 위해 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체와 조합될 수 있는 약물 성분의 양은 특정 투여 방식에 따라 그리고 가능하게는 치료받는 대상체에 따라 변할 것이다. 전형적인 제조물은 5% 내지 95%의 약물 성분(w/w)을 함유할 것이다. 대안적으로, 이러한 제조물은 20% 내지 80%의 약물 성분을 함유할 수 있다. 상기 언급된 것보다 낮거나 높은 용량이 필요할 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대한 구체적 투여형 및 치료 방식은 채용되는 특정 약물 성분의 활성, 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합, 질환의 중증도 및 경과, 상태 또는 증상, 질환, 상태 또는 증상에 대한 대상체의 소인, 및 치료의의 판단을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다.
본 발명은 또한 인간 또는 동물 대상체로부터의 샘플, 예로 종양 조직, 정상 조직 및 암 또는 정상 세포 또는 종양 순환 DNA를 함유하는 다양한 체액 표본(혈액, 혈청, 소변, 타액 등)에서 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 전형적으로 대상체로부터의 샘플을 하나의 상술된 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시킨 뒤 반응 산물의 존재 또는 부재를 검출함으로써 검출될 수 있다. 반응 산물의 검출 단계는 임의의 적합한 면역검정으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 수행되는 면역검정은 동종성 검정 또는 이종성 검정일 수 있다. 동종성 검정에서, 면역학적 반응에는 일반적으로 특정한 융합 폴리펩타이드 항체 또는 항원-결합 단편, 표지된 분석물질 및 관심 샘플이 관여된다. 표지로부터 생성되는 신호는 표지된 분석물질에 대한 항체/항원-결합 단편의 결합 시 직접적으로 또는 간접적으로 개질된다. 면역학적 반응 및 이들의 검출 정도는 모두 동종성 용액에서 수행될 수 있다. 채용될 수 있는 면역화학적 표지에는 자유 라디칼, 방사선 동위원소, 형광 염료, 효소, 박테리오파지 또는 조효소가 포함된다.
이종성 검정 접근에서, 시약은 보통 샘플, 항체/항원-결합 단편, 및 검출 가능한 신호를 생성하기 위한 수단이다. 상술된 바와 같은 샘플이 이용될 수 있다. 항체/항원-결합 단편은 지지체, 예컨대 비드(예컨대 단백질 A 아가로오스, 단백질 G 아가로오스, 라텍스, 폴리스티렌, 자성 또는 상자성 비드), 플레이트 또는 슬라이드 상에 고정되고, 액상 중 항원을 함유하는 것으로 추정되는 표본과 접촉될 수 있다. 이어서 지지체가 액상과 분리되고, 지지체상 또는 액상이 이러한 신호를 생성하기 위한 수단을 채용하여 검출 가능한 신호에 대해 조사된다. 신호는 샘플 중 분석물질의 존재에 관련된다. 검출 가능한 신호를 생성하기 위한 수단에는 방사활성 표지, 형광 표지, 또는 효소 표지의 사용이 포함된다. 예를 들어, 검출될 항원이 제2 결합 부위를 함유하는 경우, 그 부위에 결합하는 항체가 검출 가능한 기에 콘주게이션되고 분리 단계 전에 액상 반응 용액에 첨가될 수 있다. 고체 지지체 상의 검출 가능한 기의 존재는 시험 샘플 중 항원의 존재를 시사한다. 적합한 면역검정의 예는 면역블롯팅, 면역침전, 면역형광 방법, 화학발광 방법, 전기화학발광 또는 효소-연관된 면역검정이다.
당분야 숙련가는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 유용할 수 있는 여러 특이적 면역검정 포맷 및 이들의 변형에 친숙할 것이다. 일반적으로, [E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.)]를 참고하라; 또한 "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application" 표제의 US 특허 번호 4,727,022(Skold et al.), "Immunoassay of Antigens" 표제의 US 특허 번호 4,659,678(Forrest et al.), "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies" 표제의 US 특허 번호 4,376,110(David et al.), "Macromolecular Environment Control in Specific Receptor Assays" 표제의 US 특허 번호 4,275,149(Litman et al.), "Reagents and Method Employing Channeling" 표제의 US 특허 번호 4,233,402(Maggio et al.) 및 "Heterogenous Specific Binding Assay Employing a Coenzyme as Label" 표제의 US 특허 번호 4,230,797(Boguslaski et al.)을 참고하라.
항체는 공지된 기법, 예컨대 수동 결합에 따라, 진단 검정을 위해 적합한 고체 지지체(예로, 비드, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G 아가로오스, 마이크로스피어, 플레이트, 슬라이드 또는 웰, 예컨대 라텍스 또는 폴리스티렌과 같은 물질로 형성된 것)에 콘주게이션될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체는 마찬가지로 공지된 기법에 따라 검출 가능한 표지 또는 기, 예컨대 방사선 표지(예로, 35S, 125I, 131I), 효소 표지(예로, 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제), 및 형광 표지(예로, 플루오레신, Alexa, 녹색 형광 단백질)에 콘주게이션될 수 있다.
대상체로부터의 샘플 중 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 mRNA의 존재 또는 부재는, 예를 들어 대상체로부터 수집된 샘플(종양 조직, 정상 조직 및 암 또는 정상 세포 또는 순환 핵산을 함유하는 다양한 체액 표본(혈액, 혈청, 소변, 타액 등)) 중 본 발명의 상술된 다양한 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 프라이머 페어, 올리고뉴클레오타이드 탐침 등) 및 mRNA, mRNA를 주형으로 이용하여 제조된 cDNA, 게놈 DNA 등을 이용하는 통상적 방법에 의해 시험되고 결정될 수 있다. 이러한 유전자 분석 방법에는, 예를 들어 노던 블롯팅뿐만 아니라 하기 열거된 수많은 기법이 포함된다:
(1) 폴리뉴클레오타이드-기반 검출 방법(즉, US 특허 번호 5,310,625, 5,322,770, 5,561,058, 5,641,864, 및 5,693,517 참고; 또한 [Myers and Sigua, Amplification of RNA: High-temperature reverse transcription and DNA amplification with Thermus thermophilus DNA polymerase. In: M.A. Innis, D.H. Gelfand and J.J. Sninsky, Eds., PCR Strategies, Academic Press, San Diego (1995), pp. 58-68] 참고, DNA 서열분석 방법(즉, PE Biosystems(Foster City, CA)에 의한 서열분석 방법; [Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467] 참고).
(2) 증폭-기반 확인 방법(즉, US 특허 번호 4,683,195, 4,683,202 및 4,965,188; [PCR Applications (1999) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego; PCR Strategies (1995) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego; PCR Protocols (1990) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego; 및 PCR Technology (1989) Erlich, ed., Stockton Press, New York, NY] 참고).
(3) 리가아제 연쇄 반응(Wu and Wallace (1988) Genomics 4: 560-569); 가닥 변위 검정(Walker et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 및 Nucleic Acids Res. 20: 1691-1696; 및 US 특허 번호 5,455,166 참고); 그리고 US 특허 번호 5,437,990; 5,409,818; 및 5,399,491에 기재된 방법을 포함하는 몇몇 전사-기반 증폭 방법; 전사 증폭 시스템(TAS)(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 1173-1177); 및 자가-지속 서열 복제(3SR)(Guetelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 1874-1878 및 WO 1992/08800).
(4) 서열-특이적 증폭 또는 프라이머 연장 방법(즉, US 특허 번호 5,137,806; 5,595,890; 5,639,611 및 4,851,331).
(5) 역학적 PCR 방법(즉, Higuchi et al. (1992) Bio/Technology 10: 413-417; Higuchi et al. (1993) Bio/Technology 11: 1026-1030; Higuchi and Watson, in PCR Applications, 상기 문헌, chapter 16; US 특허 번호 5,994,056; EP 특허 공보 487,218 및 512,334).
(6) 상보성 정도가 상이한 야생형 유전자 또는 전사체 및 융합 유전자 또는 전사체 간 융합 영역 내 핵산 서열 및 탐침 간에 형성되는 혼성화 듀플렉스의 안정성 차이에 의존하는 탐침-기반 방법(즉, Conner et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278-282 및 US 특허 번호 5,468,613; 5,604,099; 5,310,893; 5,451,512; 5,468,613 및 5,604,099).
(7) cDNA 라이브러리의 대량 병령 서열분석에 기반하는 방법. 예시적 방법이 실시예 3 하에 개시된다.
바람직하게는, 본 발명의 융합 유전자의 발현 수준은, 국제 특허 공보 WO 03/048377에 추가 기재된 바와 같이, 실시간 PCR에 의해 검출된다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 이러한 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 및 전사체의 존재를 검출하기 위한 키트를 포괄한다. 본 발명의 검출 키트는 본 발명의 융합 폴리펩타이드에 결합하는 상술된 항체 또는 항원-결합 단편을 함유할 수 있다. 키트는 또한, 상술된 각각의 면역검정의 목적에 따라, 다양한 검출 시약(효소, 기질 등) 및 지침 매뉴얼을 함유할 수 있다. 본 발명의 다른 검출 키트는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA, 주형으로서 mRNA를 이용해서 제조된 cDNA 또는 게놈 DNA에 혼성화하는 본 발명의 상술된 다양한 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 프라이머 페어, 올리고뉴클레오타이드 탐침 등)를 함유할 수 있다. 키트는 추가로, 채용되는 정확한 유전자 분석 방법에 따라 , 다양한 시약(효소, 다른 올리고뉴클레오타이드, 핵산, 반응 완충제 등) 및 지침 매뉴얼을 함유할 수 있다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드의 발견은 새로운 진단 및 치료 방법에 대한 기초를 제공한다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 암 성장의 유발인자로서 기능할 가능성이 있다. 따라서, 대상체로부터 수득된 생검 또는 유체 물질 중 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 존재 또는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 그 전사체의 존재는 대상체가 암성 성장을 발생시킬 증가된 감수성 또는 대상체에서 암성 성장의 검출되지 않은 존재의 표시인 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 대상체의 암에 대한 감수성 또는 이전에 검출되지 않은 암의 존재를 결정하는 방법을 포괄한다: (a) 시험될 대상체로부터 조직 샘플 또는 유체 샘플(혈액, 혈청, 소변, 타액 등)을 수득하는 단계, (b) 상술된 방법 및 키트를 사용하여 대상체의 조직 또는 유체 샘플 중 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재를 결정하는 단계, 및 (c) 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드에 대해 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 양성 확인에 기반하여 암에 대해 증가된 감수성 또는 암의 존재 가능성을 결정하는 단계.
대상체로부터의 종양 샘플 중 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 그 전사체의 존재는 환자의 종양 성장이 융합 폴리펩타이드의 FGFR 키나아제 활성의 효과적인 저해 또는 융합 폴리펩타이드의 제거를 일으키는 치료법에 의해 저해될 것임을 표시하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는 맞춤화된 암 치료법 방법에 관한 것이다: (a) 암을 앓고 있거나 잠재적으로 암성인 종양을 나타내는 대상체로부터 암 세포 함유 생검을 취하는 단계, (b) 본원에 기재된 방법 및 키트를 이용해서, 생검 중의 세포가 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 이러한 유전자의 전사체를 함유하거나 융합 폴리펩타이드를 발현하는지 여부를 결정하는 단계, (c) 그 생검이 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자를 함유하거나 이를 발현하는 것으로 결정될 수 있는 대상체를 단계 d의 치료를 위해 선택하는 단계; 및 (d) FGFR 키나아제 저해제를 포함하는 약학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 방식으로 선택된 대상체를 처리하는 단계. 대안적으로, 약학적 조성물은 융합 폴리펩타이드에 결합하고 그 생화학적 기능을 손상시키거나 그 제거(또는 전체 표적 세포의 면역계-매개 제거)를 일으키는 항체 또는 항원-결합 단편을 함유할 수 있다. 다른 관련 방법에서(단계 a-c를 공유함), 단계 (d)에는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA를 표적으로 하여 그 번역을 저해하거나 손상시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물, 또는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA에 대해 유도되어 mRNA의 절단 및 그 후속 제거를 유도하는 siRNA를 포함하는 약학적 조성물의 투여가 관여된다. 이러한 방법의 구체적 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 두 융합 파트너로부터의, 즉 FGFR2로부터 및 CCDC147 또는 VCL로부터의 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 서열, 또는 더욱 구체적으로는 융합 지점을 포함하는 서열에 대한 것이다. 이러한 방법의 다른 구체적인 구현예에서, RNA 또는 siRNA는 두 융합 파트너로부터의, 즉 FGFR2로부터 및 CCDC147 또는 VCL로부터의 서열을 포함하는 융합 유전자의 서열, 또는 더욱 구체적으로는 융합 지점을 포함하는 서열에 대한 것이다.
본원에서 값의 범위의 언급은 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 그 범위 내에 속하는 각각의 개발 값을 개별적으로 언급하는 단축 방법으로서 작용하기 위한 것이며, 각각의 개별 값은 이것이 본원에서 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로 명세서 내에 포함된다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 제공되는 모든 정확한 값은 대응하는 근사값을 표시한다(예로, 특정한 요인 또는 측정에 대해 제공되는 모든 정확한 예시값은 또한 적절한 경우, "약"으로 수식되는, 대응하는 근사 측정을 제공하는 것으로 간주될 수 있다).
본원에서 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적 언어(예로, "예컨대")의 이용은 단순히 본 발명을 더 잘 나타내기 위한 것이며, 달리 나타내지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 부여하지 않는다.
본원에서 특허 문헌의 인용 및 포함은 단지 편의를 위해 수행되며, 이러한 특허 문헌의 유효성, 특허성 및/또는 실시 가능성에 대한 임의의 관점을 반영하지 않는다. 요소 또는 요소들에 대한 언급과 같은 용어를 이용하는 본 발명의 임의의 측면 또는 구현예의 본원에서의 기재는 달리 언급되거나 문맥상 명확히 금기되지 않는 한, 특정 요소 또는 요소들"로 구성되는", 이들"로 본질적으로 구성되는" 또는 이들"을 실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 측면 또는 구현예에 대한 뒷받침을 제공하려는 것이다(예로, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에 기재된 조성물은 달리 언급되거나 문맥상 명확히 금기되지 않는 한, 그 요소로 구성된 조성물을 설명하는 것으로도 이해되어야 한다).
본 발명에는 준거법에 의해 허용되는 최대 범위까지 본원에 제공된 청구범위 및 측면에서 언급되는 요지 대상의 모든 개질 및 균등부가 포함된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 공보 및 특허 문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 문헌이 참조로 포함되는 것이 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 마찬가지로, 이들의 전문이 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 이해의 명확성 목적을 위해 예시 및 예로서 일부 상세히 기재되었으나, 본 발명의 교시의 견지에서 당업자에게는 일정한 변화 및 개질이 첨부된 청구범위의 정수 또는 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있음이 쉽게 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 융합 유전자의 확인
(1) 전체 RNA 추출
전체 RNA를 제조업체의 지침에 따라 Roch의 High Pure FFPET RNA 단리 키트(제품 번호 06650775001)를 이용해서 인간 쓸개관암종의 생검으로부터 수득한 포르말린-고정, 파라핀-포매 조직으로부터 2개의 매크로-절제된 10 ㎛ 두께 섹션에서 추출하였다. 본 절차에는 SDS가 보강된 Roche의 전용 RNA 조직 용해 완충제 및 프로티나아제 K와의 인큐베이션을 이용한 탈파라핀화된 조직의 용해가 관여되었다. 무질서유발 염의 존재 하에, RNA는 High Pure Filter Tube의 유리 섬유에 특이적으로 결합하였다. 결합한 RNA를 DNase와 함께 인큐베이션하고, 일련의 신속 세척-및-회전 단계로 정제한 뒤 물로 용출하였다. NanoDrop 분광측정계(Thermo Fischer Scientific, 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454 USA)를 이용한 흡광도에 의해 RNA 농도를 결정하였다.
(2) DNA 라이브러리 제조
ArcherDx(현재는 Enzymatics Inc., Beverly, MA)에서 어셈블리된 Illumina®을 위한 FGFR 융합물 검출 키트를 이용해서 500 ng의 입력 RNA로부터 시작해서 DNA 라이브러리를 제조하였다. 상기 검출 키트는 ALK-, RET- 및 ROS1-특이적 프라이머가 인간 FGFR1, FGFR2 및 FGFR3에 특이적인 프라이머로 대체된 것을 제외하고, Enzymatics(제품 번호 AK0001-8)에서 시판되는 Illumina® 플랫폼을 위한 Archer™ ALK, RET, ROS1 융합물 검출 v1과 유사하다. ArcherDx 융합물 검출 키트는 Illumina® MiSeq 장비(Illumina, 5200 Illumina Way, San Diego, CA 92122 USA) 상에서 표적화된 서열분석을 위한 라이브러리를 생성하기 위해 부착된 멀티플렉스 PCR(AMP™) 및 온도-안정형 시약을 이용한다. 제조업체의 지침에 따라 라이브러리를 제조하였다.
각각의 바-코드화된 라이브러리의 농도를 제조업체의 지침에 따라 Illumina no. KK4824(Kapa Biosystems, Inc., Wilmington, MA)를 위한 Kapa Biosystems 라이브러리 정량 키트를 이용해서 PCR에 의해 결정하였다. 바-코드화된 라이브러리를 등몰 농도로 풀링하고, 각각 10 pM로 IlluminaR MiSeq 데스크탑 서열분석기 상에 로딩하고, Illumina MiSeq v2(300 사이클) 시약 키트(MS-102-2002, Illumina Inc., San Diego, CA) 및 Nextera 워크플로우 화학을 이용하여 서열분석하였다. 서열분석 대조군으로 작용하도록 Illumina의 15% PhiX 대조군 v3(FC-110-3001)을 라이브러리 풀에 10 pM로 첨가하였다.
(3) 서열분석 결과의 분석
서열 판독치에서 cutadapt(Martin, M. (2011) EMBnet.journal 17: 10-12)를 이용하여 3'-말단에서 어댑터 서열을 제거하였다. 이어서 20 개 뉴클레오타이드 길이를 초과하는 판독 서열을 bowtie(Langmead. B. et al. (2009). Genome Biology 10: R25) 및 tophat(Trapnell, C. et al. (2009) Bioinformatics 25: 1105-11)을 이용해서 인간 게놈 서열 상에 맵핑하였다(Genome Reference Consortium Human Build 37(GRCh37)). 2 개를 초과하는 위치에 맵핑되는 판독치는 버리고, 나머지를 Ensembl 유전자에 주석을 달았다(Flicek, P. et al. (2014) Nucleic Acids. Res. 42; D749-55, Database issue).
제2 단계에서, 75개 뉴클레오타이드 길이를 초과하는 맵핑되지 않은 판독치를 동일한 길이의 3개 부분으로 분할하고, 왼쪽 및 오른쪽 외부 부분을 상기와 동일한 방법을 이용하여 게놈 상에 별도로 맵핑한 뒤 Ensembl 유전자에 주석을 달았다.
융합 서열은 두 상이한 유전자(하나는 FGFR 유전자임) 상에 맵핑된 두 판독치를 모두 갖는 서열(페어링한-말단 서열분석으로부터) 또는 분할 후 두 상이한 유전자(하나는 FGFR 유전자임)에 주석이 달린 맵핑되지 않은 판독치(들)를 갖는 서열로서 확인되었다. 각 융합물의 공통 서열을 Clustal W(Larkin, M.A. et al. (2007) Bioinformatics, 23, 2947-2948)로 융합 서열로부터 모든 판독치의 다중 정렬로부터 생성하였다(서열번호 1 및 2 참고).
모든 데이터 가공 단계는 R 3.0.2(http://www.r-project.org/) 및 Bioconductor 패키지(Gentleman, R.C. et al. (2004) Genome Biology 5: R80)를 이용하여 수행하였다.
서열번호 1 및 2에서의 융합 유전자 서열 및 서열번호 3 및 4에서의 유도된 폴리펩타이드 서열은 상술된 노력으로 얻어졌다. 후자의 폴리뉴클레오타이드 서열에 기반하여, 실시예 2 하에 기재된 특성규명 실험에서 이용한 PCR 프라이머를 설계하였다.
실시예 2: 본 발명의 융합 유전자의 특성규명
RNA 샘플(각각 700 ng) (실시예 1의 섹션 (1)에 기재된 바와 같이 두 종양 생검으로부터 제조됨)을 5분 동안 65℃에서 변성시킨 뒤, Roche Transcriptor 제1 쇄 cDNA 합성 키트(제품 번호 04 896 866 001; Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland)를 이용해서 최종 부피 20 ㎕로 무작위 헥사머 프라이머를 이용해서 역전사시켰다. 역전사는 하기 사이클링 조건으로 수행하였다: 10분 동안 25℃, 30분 동안 55℃ 및 5분 동안 85℃.
2 ㎕의 10배 희석된 cDNA, 0.3 μM의 각각의 전방 및 후방 프라이머(표 1) 및 Roche FastStart PCR Master 1x(제품 번호 04 710 444 001; Roche Diagnostics AG)를 함유하는 20 ㎕ 반응 부피 중에 PCR 증폭을 수행하였다. 사이클링 조건은 하기와 같았다: 4분 동안 95℃에서 1 사이클, 이어서 30초 동안 95℃, 30초 동안 50℃ 및 1분 동안 72℃에서 40 사이클, 및 7분 동안 72℃에서 1 사이클. PCR 산물을 Lonza FlashGel DNA 카세트 2.2% 아가로오스 겔(제품 번호 57031; Lonza Ltd., Basel, Switzerland) 상에서 분리하였다.
PCR 증폭에서 이용된 전방 및 후방 프라이머. 프라이머3 소프트웨어(Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)를 이용해서 서열번호 1-2의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 프라이머를 설계하였다.
코드 서열번호 프라이머 이름 서열(5'→3')
프라이머 16 8 FGFR2_전방 CAGAGACCAACGTTCAAGCA
프라이머 17 9 FGFR2_후방1 GGTTGGCTGAGGTCCAAGTA
프라이머 18 10 FGFR2_후방2 TCTTGTGTCAGGGTAACTAGGTGA
프라이머 19 11 VCL_후방_1 AGCTTGATTTCCAGGGTTCC
프라이머 20 12 VCL_후방_2 AAGATACGAGCAGCCGAGAC
프라이머 21 14 CCDC147_후방1 TTCCAGGACTTGCTTTCCAC
프라이머 22 15 CCDC147_후방2 TCCCTGAAAATCTCTTTCCATT
상기 분석 결과는 도 1에 나타낸 사전-염색된 겔로부터 얻을 수 있다. 두 종양 생검 중 하나로부터 제조된 cDNA의 증폭은 두 후방 프라이머 중 PCR을 위해 사용된 것에 따라, 각각 약 89 및 114 bp의 예측 길이를 갖는 FGFR2-VCL 증폭 산물을 산출하였다. FGFR2-CCDC147 증폭 산물은 검출되지 않았다. 다른 종양 생검으로부터 제조된 cDNA의 증폭은 두 후방 프라이머 중 PCR을 위해 사용된 것에 따라, 각각 약 93 및 132 bp의 예측 길이를 갖는 FGFR2-CCDC147 증폭 산물을 생성하였다. FGFR2-VCL 증폭 산물은 검출되지 않았다. 증폭 산물의 분취물을 제조업체의 지침에 따라 QIAgen MinElute PCR 정제 키트(28004)를 이용해서 정제하고, Sanger 방법(Sanger et al. (1975) J. Mol. Biol. 94: 441-8)을 이용해서 서열분석하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
PCR 증폭 산물의 뉴클레오타이드 서열 분석. FGFR2-코딩 서열의 최-3' 뉴클레오타이드를 진하게 밑줄쳐 나타낸다.
서열분석 프 라이머 융합물 서열번호 서열분석 결과(5'→3')
16 FGFR2-VCL 73
Figure pct00001
19 FGFR2-VCL 74
Figure pct00002
16 FGFR2-CCDC147 75
Figure pct00003
22 FGFR2-CCDC147 76
Figure pct00004
16 천연 FGFR2 77
Figure pct00005
18 천연 FGFR2 78
Figure pct00006
프라이머 페어 42a/20 및 16/29을 이용하여 FGFR2-VCL 융합 유전자 전사체에 대해 더 큰 PCR 증폭 산물(각각 약 400 및 300 bp)을 수득하였다(표 1 및 3 참고). 이들 산물을 Sanger 방법을 이용해서 서열분석하였다. 결정된 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 5로 나타낸다; 유도된 폴리펩타이드 단편 서열은 서열번호 6이다.
PCR 증폭에서 이용되는 추가적인 전방 및 후방 프라이머
코드 서열번호 프라이머 명칭 서열(5'→3')
프라이머 42a 7 FGFR2 전방 GACTTTGGACTCGCCAGAGA
프라이머 29 13 VCL_후방 CCAGCAACCAGCATCTGAG
실시예 3: 종양 생검에서 FGFR2 - VCL 및 FGFR2 - CCDC147 융합물을 검출하기 위한 진단 방법
(1) 생검 샘플 및 RNA 제조
먼저 10-마이크론 슬라이드를 당분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 고형암의 포르말린-고정, 파라핀-포매 임상 표본으로부터 제조한다. 헤마톡실린 및 에오신 염색 후, 조직의 종양 부분을 매크로-절제하고, 제조업체의 지침에 따라 High Pure FFPE RNA 단리 키트(Roche, 카탈로그 번호 #06 650 775 001)를 이용해서 전체 RNA 추출을 거친다. RNA 양을 NanoDrop 분광측정계(Thermo Fischer Scientific, 81 Wyman Street, Waltham, MA 02454 USA)를 이용하여 평가한다.
(2) 서열분석
100-300bp 서열로 이루어진 FGFR2-표적화된 cDNA 라이브러리를 제조업체의 지침에 따라 ArcherDx NGS 라이브러리 제조 키트(Enzymatics, Suite 407J, 100 Cummings Center, Beverly, MA 01910, USA)를 이용하여 500 ng의 전체 RNA로부터 제조한다. 기본적으로, 야생형 FGFR2에 특이적인 프라이머를 이용해서 대응 서열을 함유하는 RNA 서열을 선택한다. 라이브러리를 제조업체의 지침에 따라 Illumina® MiSeq 장비(Illumina, 5200 Illumina Way, San Diego, CA 92122 USA)를 이용해서 50-150-bp 단편의 페어링된-말단 서열분석을 거친다.
(3) FGFR2 - VCL 및 FGFR2 - CCDC147 융합 유전자의 검출
수득한 판독치를 티로신 키나아제 도메인의 3' 말단에서 시작하여 전사체의 3' 말단에서 끝나는 FGFR2 전사체의 공지된 하위서열과 정렬한다. 이러한 하위서열이 서열번호 64-67 및 72에 제공된다. 서열 정렬 소프트웨어, 예컨대 BLAST를 이용할 수 있다. 정렬 길이는 18 이상이어야 한다. 상보쇄와의 정렬이 수득된 경우, 판독치의 상보적 서열이 초기 판독치 대신 추가 분석을 위해 고려되어야 한다.
FGFR2 하위서열에 매칭되지 않는 판독치는 폐기되어야 한다. 판독치가 임의의 FGFR2 하위서열에 매칭되지 않는 경우, 융합물 검출은 결론이 나지 않은 것으로 간주되어야 한다.
FGFR2 하위서열을 이용하는 각각의 정렬에 있어서, 정렬의 3' 말단에 대응하는 판독치의 뉴클레오타이드 위치는 N으로 명명된다. 이어서 위치 N+1 내지 N+18에 대응하는 판독치 하위서열이 추출된다. 판독치가 상기 하위서열을 함유하지 않는 경우, 정렬은 폐기된다. 이어서 위치 N+1 내지 N+18에 대응하는 18-염기 하위서열이 시작 코돈부터 시작하여 가장 원위의 올리고머화 도메인을 인코딩하는 서열 시작부에서 끝나는 VCL 및 CCDC147 전사체의 하위서열과 정렬된다. 이러한 하위서열이 서열번호 68-71에 제공된다.
위치 N+1 내지 N+18에 대응하는 18-염기 연신부에 걸쳐 VCL 또는 CCDC147 전사체 각각의 하위서열과 5개 이하의 미스매치, 바람직하게는 3-4개 이하의 미스매치, 보다 바람직하게는 1-2개 이하의 미스매치를 갖는, 가장 바람직하게는 미스매치를 갖지 않는 판독치가 확인되는 경우, 종양 표본은 FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 융합 유전자에 대해 양성인 것으로 간주된다. 이러한 정렬이 임의 판독치에 대해서 관찰되지 않는 경우, 종양 표본은 FGFR2-VCL 및 FGFR2-CCDC147 융합 유전자에 대해 음성인 것으로 간주된다.
실시예 4: 시험관내 종양형성성
(1) 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포 풀의 구축
FGFR2-CCDC147 또는 FGFR2-VCL 융합물을 각각 안정적으로 발현하는 안정한 Rat2 세포 풀을 pExoIN2-기반 발현 플라스미드 ExoIN2-FGFR2_CCDC147 및 pExoIN2-FGFR2_VCL을 이용하여 생성하였다. pExoIN2를 Trenzyme(Germany)으로부터 수득하였다. 후자의 발현 플라스미드를 전기천공(LONZA Nucleofector II 장치/프로그램 [X-005], 솔루션 R)에 의해 Rat2 세포 내로 도입하였다. 24h 형질도입-후, 세포에 1.5 ㎍/mL 퓨로마이신을 처리하여 안정한 발현체 세포 풀을 유도하였다. 본 실시예에서 이용된 FGFR2-CCDC147 서열은 FGFR2 부분(핵산 1 내지 핵산 2574)에 대해 서열번호 16 및 CCDC147 부분(핵산 156 내지 핵산 3313)에 대해 서열번호 20으로 이루어졌다. 이용된 FGFR2-VCL 서열은 FGFR2 부분(핵산 1 내지 핵산 2574)에 대해 서열번호 16 및 VCL 부분(핵산 2117 내지 핵산 5482)에 대해 서열번호 18로 이루어졌다.
(2) 안정한 발현체 세포 풀의 부착-비의존적 성장 특성의 평가
단일 세포 현탁액을 Accutase(GE Healthcare Europe GmbH)를 이용해서 제조하고 적절한 세포 수가 선택 항생제 없이 0.4% 연질-한천 상층에서 6웰 디쉬에 접종되도록 희석하였다(접종 밀도(세포/웰): 10.000, 3.000, 1.000, 300, 100 및 30). 콜로니 형성을 위해 디쉬를 37℃에서 5% CO2 환경에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 21일 후, 콜로니를 H2O 중 10%(v/v) 아세트산 및 10%(v/v) 메탄올을 이용해서 고정하고, 크리스탈 바이올렛(H2O 중 0,01%(w/v))으로 염색하였다. 접종 효율을 연질 한천에서 21일 인큐베이션 후 관찰되는 콜로니의 수 및 접종된 세포의 수 간 비로서 결정하였다. 접종 효율 결과를 도 2에 나타낸다.
FGFR2-VCL 발현 세포에 있어서, 고 접종 효율(대략 50%)을 나타내는 강력한 콜로니 형성이 관찰되었다. FGFR2-CCDC147 발현 세포의 접종 효율은 모체 Rat2 세포의 효율보다 낮았지만, 모체 Rat2 세포주의 콜로니 크기는 FGFR2-VCL 및 FGFR2-CCDC147 발현 세포주의 크기에 비해 더 작았다(도 3).
실시예 5: FGFR 저해제에 대한 시험관내 감도
(1) FACS를 이용한 세포 증식 검정
접종(25000개 세포/웰) 24h 후, 실시예 4에 따라 수득되는 Rat2 세포(모체 세포 또는 FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포)에 FGFR 저해제를 첨가하고, 배양물을 저해제의 존재 하에 다시 72h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 말기에, 세포를 FACS에 의해 계수하였다. IC50 값을 시그마형 반응(가변 경사) 곡선 핏팅을 이용해서 Graphpad Prism 6에서 계산하였다. 이용된 저해제는 선택적 FGFR 저해제 화합물 A, BGJ398 및 AZD4547뿐만 아니라 다중-키나아제 저해제 Ponatinib이었다.
FACS 분석은 융합 폴리펩타이드-발현 세포의 증식이 시험된 모든 FGFR 저해제에 의해 저해됨을 드러내었다(도 4). 다중-키나아제 저해제 Ponatinib은 또한 그 크고 비특이적인 활성 스펙트럼으로 인해 모체 세포의 세포 증식을 저해하였다. 1024 nM, 227.1 nM 및 14.7 nM 초과의 상대 IC50이 Rat2 모체 세포, FGFR2-VCL 발현 세포 및 FGFR2-CCDC147 발현 세포 각각에서 화합물 A에 대해 수득되었다.
따라서, 상기 결과는 본 발명의 어느 한 융합물(FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 각각)을 발현하는 세포가 시험관내 FGFR 선택적 저해제에 대해 민감한 반면, 모체 세포는 다중-키나아제 저해제에만 민감함을 나타낸다.
(2) Cell Titer Glo를 이용한 세포 증식 검정
실시예 4에 따라 수득되는 Rat2 세포(모체 세포 또는 FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포)를 상기 검정에서 이용하였다. 세포를 96웰 플레이트에 접종하고, FGFR 저해제(상기 섹션 (1)에서와 동일함)의 첨가 전에 24h 동안 배양하였다. 추가 72h 인큐베이션 후, 세포 성장을 발광 플레이트 판독기를 이용해서 세포 ATP 함량의 결정에 의해 분석하였다(Cell Titer Glo; Promega). 3000 nM, 0.53 nM 및 73.4 nM 초과의 상대 IC50이 Rat2 모체 세포, FGFR2-VCL 발현 세포 및 FGFR2-CCDC147 발현 세포 각각에서 화합물 A에 대해 수득되었다. 용량 반응 곡선 및 IC50의 요약을 도 5에 나타낸다.
따라서, FGFR 선택적 저해제는 FGFR2 융합물을 보유하는 두 세포주(FGFR2-VCL 및 FGFR2-CCDC147 각각) 증식의 강력한 저해를 나타낸 반면, 모체 세포는 FGFR 선택적 저해제에 의해 영향받지 않았다.
실시예 6: 생체내 종양형성성
Rat2 세포(모체 세포 또는 실시예 4에 따라 수득되는, FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 융합 폴리펩타이드를 발현하는 세포)의 생체내 종양형성성을 5-6주령 암컷 NMRI 누드 마우스에서의 피하 종양 모델에서 생체내 평가하였다. 본 연구는 각각 5마리 동물을 함유하는 6개 실험군으로 구성되었다. 각각 5x106 및 1x106 Rat2 모체 세포(그룹 1 및 2), Rat2-FGFR2-CCDC147 세포(그룹 3 및 4) 및 Rat2-FGFR2-VCL 세포(그룹 5 및 6)을 0일째에 피하 이식하였다. 모든 그룹의 동물 체중은 연구 과정 동안 연속적으로 증가하였다. 일차 종양 부피를 캘리퍼 측정에 의해 주 2회 결정하였다. 종양 부피를 식 W2xL/2(L=길이 및 W=종양의 수직 폭, L>W)에 따라 계산하였다. 결과를 도 6에 나타낸다(데이터는 평균±SEM으로 표시된다).
Rat2 모체 세포(대조군)의 경우, 접종물 크기와 무관하게 일차 종양 성장은 관찰할 수 없었다. Rat2-FGFR2-CCDC147 세포의 경우, 28일 경부터 시작해서 실질적 종양 성장을 관찰할 수 있었고, 더 많은 수의 이식 세포(5x106)를 수여받은 동물이 더 빠른 종양 성장을 나타내었다. Rat2-FGFR2-VCL 세포(그룹 5 및 6)의 경우, 종양 성장을 이식 후 10일 경부터 시작하여 관찰하였다. 빠른 종양 성장으로 인해, 그룹 5(5x106 세포)는 21일째에 그리고 그룹 6(1x106 세포)은 28일째에 윤리적 이유로(종양 부담) 사망처리해야 했다. 따라서 FGFR2 융합 구축물(FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147)을 발현하는 종양은 암컷 NMRI 누드 마우스에서 생체내 종양형성성인 것으로 나타났다.
실시예 7: FGFR 저해제에 대한 생체내 감도
(1) FGFR2 - CCDC147 융합물
0일째에, 100 ㎕ PBS 중 5x106 FGFR2-CCDC147-발현 Rat2 세포를 5-6주령 암컷 NMRI 누드 마우스(6마리 동물의 그룹 크기)의 왼쪽 넙적다리 내로 피하 이식하였다. 화합물 A를 종양이 구축된 마우스(D25, 평균 종양 부피 = 135 mm3)에서 연속 14일 동안 매일 1회 경구 투여하였다(30 또는 60 mg/kg). 일차 종양 크기를 캘리퍼 측정에 의해 주 2회 측정하였다. 동물을 치료 마지막 날에 사망처리하고 검시 시 종양을 측량하였다.
화합물 A는 FGFR2-CCDC147 발현 모델에서 생체내 강력한 항종양 효능을 나타내었다(도 7A). 화합물 A는 두 시험 용량(30 및 60 mg/kg)에서 종양 성장을 저해한 반면, 체중에 대한 유의미한 효과는 관찰되지 않았다(패널 B). 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. P-값은 만 휘트니 시험을 이용해서 비히클 대조군에 대비하여 계산되었다(괄호 안은 페어링되지 않은 t-테스트).
따라서, 30 및 60 mg/kg으로 연속 14일 동안 매일 투여된 FGFR 선택적 저해제 화합물 A는 생체내 암컷 NMRI 누드 마우스에서의 피하 이식된 Rat2-FGFR2-CCDC147 종양 모델에서 매우 유의미한 항종양 효능(두 용량에서 필적함)을 나타내었다.
(2) FGFR2 - VCL 융합물
0일째에, 100 ㎕ PBS 중 1x106 FGFR2-VCL 발현 Rat2 세포를 5-6주령 암컷 NMRI 누드 마우스(6마리 동물의 그룹 크기)의 왼쪽 넙적다리 내로 피하 이식하였다. 화합물 A를 종양이 구축된 마우스(D15, 평균 종양 부피 = 188 mm3)에서 연속 14일 동안 매일 1회 경구 투여하였다(30 또는 60 mg/kg). 일차 종양 크기를 캘리퍼 측정에 의해 주 2회 측정하였다. 동물을 치료 마지막 날에 사망처리하고 검시 시 종양을 측량하였다.
FGFR 선택적 저해제 화합물 A는 FGFR2-VCL 발현 모델에서 생체내 강력한 항종양 효능을 나타내었다(도 8A). 화합물 A는 체중에 대해 유의미하게 영향을 미치지 않으면서 종양 성장을 저해하였다(패널 B). 데이터는 평균±SEM으로 표시된다. P-값은 만 휘트니 시험을 이용해서 비히클 대조군에 대비하여 그룹 2 및 3 간에 계산되었다(괄호 안은 페어링되지 않은 t-테스트).
따라서, 30 및 60 mg/kg으로 연속 14일 동안 매일 경구 투여된 FGFR 선택적 저해제 화합물 A는 생체내 암컷 NMRI 누드 마우스에서의 피하 이식된 Rat2-FGFR2-VCL 종양 모델에서 매우 유의미하고 용량 의존적인 항종양 효능을 나타내었다. 60 mg/kg-처리군에 있어서 종양 정지가 관찰되었다.
실시예 8: FGFR2 - VCL / FGFR2 - CCDC147 자가인산화의 기능적 분석
상기 실시예에서, 하기 서열을 이용하였다: FGFR2-CCDC147 융합 유전자는 FGFR2 부분(핵산 1 내지 핵산 2574)에 대해 서열번호 16 및 CCDC147 부분(핵산 156 내지 핵산 3313)에 대해 서열번호 20으로 이루어졌으며; FGFR2-VCL 융합 유전자는 FGFR2 부분(핵산 1 내지 핵산 2574)에 대해 서열번호 16 및 VCL 부분(핵산 2117 내지 핵산 5482)에 대해 서열번호 18로 이루어졌다.
(1) 웨스턴 블롯에 의해 평가된 일시적으로 전달감염된 HEK293T 세포에서의 FGFR2 융합 폴리펩타이드의 자가인산화
HEK293T 세포를 FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 융합 유전자를 함유하는 발현 플라스미드로 일시적으로 전달감염시켰고, 이 유전자들은 C-말단 이중 myc-태그 신장부로 보강되었다. 음성 대조군으로서, HEK293T 세포를 모의-전달감염시켰다. 세포를 90분 동안 0.1% DMSO, 1E-05 M Vargatef 또는 1E-05 M 화합물 A로 처리하였다. 처리 후, 융합 폴리펩타이드의 발현 및 자가인산화를 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. myc-태그화된 융합 폴리펩타이드의 발현을 항-myc 항체 9E10(α-myc)을 이용해서 결정하고, 인산화 분석을 항-포스포-티로신 항체 pY99(α-pY)로 수행하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. FGFR2-VCL- 및 FGFR2-CCDC147-발현 세포는 모두 리간드-독립적인 고수준의 FGFR 인산화를 나타낸다. 상기 자가인산화는 FGFR 선택적 저해제 화합물 A 또는 덜 선택적인 저해제 Vargatef에 대한 노출 시 FGFR2-VCL-발현 세포에서 실질적으로, 그리고 FGFR2-CCDC147-발현 세포에서는 다소 적은 수준으로 감소되어 나타난다.
(2) ELISA에 의해 측정된 일시적으로 전달감염된 HEK293T 세포에서의 FGFR2 융합 폴리펩타이드의 자가인산화
발현 가능한 FGFR2-VCL 또는 FGFR2-CCDC147 융합 유전자로 일시적으로 전달감염되거나 모의-전달감염된(대조군) HEK293T 세포를 90분 동안 0.1% DMSO, 1E-05 M Vargatef 또는 1E-05 M 화합물 A로 처리하였다. 처리 후, FGFR2 융합 폴리펩타이드의 자가인산화를 샌드위치 포스포티로신 ELISA를 이용하여 분석하였다. 각각의 조건을 2회씩 수행하였다 각 조건의 평균 광학 밀도(OD) 값을 도 10에 나타낸다.
FGFR2-VCL- 및 FGFR2-CCDC147-발현 세포는 모두 리간드-독립적인 고수준의 FGFR 인산화를 나타내며, 그 수준은 FGFR 선택적 저해제 화합물 A 또는 덜 선택적인 저해제 Vargatef에 의해 감소된다.
실시예 9: mRNA의 디지털 검출을 이용해서 종양 생검에서 FGFR2 - VCL 및 FGFR2-CCDC147 융합물을 검출하기 위한 진단 방법
전체 RNA를 실시예 1(1)에 기재된 바와 같이 인간 쓸개관암종의 FFPE 샘플로부터 추출하였다. 500 ng의 전체 RNA를 샘플 별로 이용하고, 제조업체의 지침에 따라(www.nanostring.com) nCounter 유전자 발현 검정 프로토콜을 이용해서 분석하였다. nCounter 검정은 용액 중 표적 분자와 직접 혼성화하는 표적-특이적, 컬러-코드화된 탐침을 이용하는 관심 mRNA 분자의 직접적인 디지털 검출에 기반하여, cDNA 합성 및 증폭이 필요 없이, 계수 별로 상대적 방식으로 각각의 유전자의 발현 수준이 측정한다. 각각의 탐침은 표적/탐침 복합체가 과도한 탐침의 세척 후 데이터 수집(계수)을 위한 스트렙타비딘-코팅된 nCounter Cartridge에 고정되도록 하는 바이오틴 분자를 수반하는 50개 염기의 포획 탐침 부분 및 바코드를 수반하는 50개 염기의 리포터 탐침 부분에 의해 구축된다.
본 발명의 각각의 융합 유전자에 있어서, NanoString(Custom CodeSet)에 의해 탐침을 설계하고 합성한 뒤, nCounter 분석 시스템에서 샘플 가공을 위해 사용 준비된 nCounter Master 키트에서 모든 소모품 및 시약과 함께 삽입하였다. NanoString에 의해 제공되는 탐침 설계를 위해 이용된 표적 서열을 표 4에 나타낸다(포획 탐침 및 리포터 탐침의 상세내용은 알려져 있지 않음).
nCounter 검정에서 탐침 설계를 위해 이용된 표적 서열.
유전자 식별자 표적 서열
FGFR2-CCDC147 AGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGAAAAGGGTGGAAAGCAAGTCCTGGAAGAATCTGCATTTGAAGAAATGGA
FGFR2-VCL AGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGTGGTCTCGGCTGCTCGTATCTTACTTAGGAACCCTGGAAATCAAGCTGC
수득된 계수값을 배경 수정하고, 전술된 바와 같이 가장 안정한 하우스키핑 유전자에 대해 정상화하였다(Beaume, et al. (2011) J Microbiol Methods 84: 327-334). 결과를 표 5에 나타낸다.
간내 쓸개관암종(iCCA) 샘플에서 본 발명의 두 융합 유전자에 대해 수득된 정상화된 값
대상체 식별자 융합물 명칭
FGFR2-VCL FGFR2-CCDC147
iCCA FFPE 대상체 #1 129 4652
iCCA FFPE 대상체 #2 66204 1
따라서 iCCA FFPE 샘플 #1은 FGFR2-CCDC147 유전자 융합물을 보유하고 iCCA FFPE 샘플 #2는 FGFR2-VCL 유전자 융합물을 보유하는 것을 결정할 수 있었다. iCCA FFPE 샘플 #1에 있어서, FGFR2-VCL에 관한 129의 정상화된 값은 비특이적 혼성화로부터 생성되고 배경 노이즈를 구성하는 것으로 결정되었다(두 융합물에 대해 검증된 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해).
실시예 10: DNA를 이용하여 종양 생검에서 FGFR2 - VCL 및 FGFR2 - CCDC147 융합물을 검출하기 위한 진단 방법
(1) 생검 샘플 및 DNA 제조
인간 쓸개관암종의 생검으로부터 수득한 포르말린-고정, 파라핀-포매 조직으로부터의 매크로-절제된 10 ㎛ 두께 섹션에서 전체 DNA를 추출한다. DNA 추출을 FFPE DNA 단리 키트를 이용해서 수행한다.
(2) 서열분석
Duncavage 등(Duncavage et al. Mod Pathol. 2012 Jun;25(6):795-804)에 의해 기재된 바와 같이 VCL 및 CCDC147 유전자에 대한 포획 탐침을 이용해서 포획-농축된 DNA 서열분석에 의해 융합물을 검출한다. 게놈 DNA의 단편화(약 250 내지 500 bp 길이의 단편으로) 후, 제조업체의 프로토콜(Illumina, San Diego, CA, USA)에 따라 단편화된 DNA의 말단을 수선하고, 어댑터에 결찰한다. 이어서 서열분석 라이브러리를 제조업체의 지침(Agencourt Bioscience, Beverly, MA, USA)에 따라 포획 탐침과 혼성화한다. 그 뒤, 농축된 DNA를 어댑터를 표적화하는 범용 프라이머를 이용해서 증폭한다. DNA를 제조업체의 지침에 따라 Illumina® MiSeq 장비(Illumina, 5200 Illumina Way, San Diego, CA 92122 USA)를 이용해서 50-150-bp 단편의 페어링된-말단 서열분석을 거친다.
(3) FGFR2 - VCL 및 FGFR2 - CCDC147 융합 유전자의 검출
FGFR2-VCL 및 FGFR2-CCDC147 융합 유전자의 검출을 실시예 3(3)에 기재된 바와 같이 수행한다.
<110> DEBIOPHARM INTERNATIONAL S.A. <120> FGFR fusions <130> 2016-FPA-7733 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 176 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (1)..(72) <223> FGFR2 exon 17 <220> <221> exon <222> (73)..(176) <223> VCL exon 15 <400> 1 ccctcccaga gaccaacgtt caagcagttg gtagaagact tggatcgaat tctcactctc 60 acaaccaatg aggtggtctc ggctgctcgt atcttactta ggaaccctgg aaatcaagct 120 gcttatgaac attttgagac catgaagaac cagtggatcg ataatgttga aaaaat 176 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (1)..(71) <223> FGFR2 exon 17 <220> <221> exon <222> (72)..(200) <223> CCDC147 exon 2 <400> 2 cctcccagag accaacgttc aagcagttgg tagaagactt ggatcgaatt ctcactctca 60 caaccaatga ggaaaagggt ggaaagcaag tcctggaaga atctgcattt gaagaaatgg 120 aaagagattt tcagggagtt ctccatgaac tttctggaga caaaagtttg gaaaaatttc 180 ggattgaata tgagaggctt 200 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(24) <223> FGFR2 POLYPEPTIDE <220> <221> DOMAIN <222> (25)..(58) <223> VCL POLYPEPTIDE <400> 3 Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg 1 5 10 15 Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu Val Val Ser Ala Ala Arg Ile Leu 20 25 30 Leu Arg Asn Pro Gly Asn Gln Ala Ala Tyr Glu His Phe Glu Thr Met 35 40 45 Lys Asn Gln Trp Ile Asp Asn Val Glu Lys 50 55 <210> 4 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(24) <223> FGFR2 POLYPEPTIDE <220> <221> DOMAIN <222> (25)..(66) <223> CCDC147 POLYPEPTIDE <400> 4 Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Glu Asp Leu Asp Arg Ile 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu Glu Lys Gly Gly Lys Gln Val Leu Glu 20 25 30 Glu Ser Ala Phe Glu Glu Met Glu Arg Asp Phe Gln Gly Val Leu His 35 40 45 Glu Leu Ser Gly Asp Lys Ser Leu Glu Lys Phe Arg Ile Glu Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu 65 <210> 5 <211> 603 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (1)..(370) <223> FGFR2 exon 17 <220> <221> exon <222> (371)..(603) <223> VCL exon 15 <400> 5 ctttggactc gccagagata tcaacaatat agactattac aaaaagacca ccaatgggcg 60 gcttccagtc aagtggatgg ctccagaagc cctgtttgat agagtataca ctcatcagag 120 tgatgtctgg tccttcgggg tgttaatgtg ggagatcttc actttagggg gctcgcccta 180 cccagggatt cccgtggagg aactttttaa gctgctgaag gaaggacaca gaatggataa 240 gccagccaac tgcaccaacg aactgtacat gatgatgagg gactgttggc atgcagtgcc 300 ctcccagaga ccaacgttca agcagttggt agaagacttg gatcgaattc tcactctcac 360 aaccaatgag gtggtctcgg ctgctcgtat cttacttagg aaccctggaa atcaagctgc 420 ttatgaacat tttgagacca tgaagaacca gtggatcgat aatgttgaaa aaatgacagg 480 gctggtggac gaagccattg ataccaaatc tctgttggat gcttcagaag aagcaattaa 540 aaaagacctg gacaagtgca aggtagctat ggccaacatt cagcctcaga tgctggttgc 600 tgg 603 <210> 6 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(123) <223> FGFR2 POLYPEPTIDE <220> <221> DOMAIN <222> (124)..(200) <223> VCL POLYPEPTIDE <400> 6 Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Asn Asn Ile Asp Tyr Tyr Lys Lys Thr 1 5 10 15 Thr Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asp Arg Val Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu 35 40 45 Met Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Ile Pro 50 55 60 Val Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Met Asp Lys 65 70 75 80 Pro Ala Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met Met Arg Asp Cys Trp 85 90 95 His Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Glu Asp 100 105 110 Leu Asp Arg Ile Leu Thr Leu Thr Thr Asn Glu Val Val Ser Ala Ala 115 120 125 Arg Ile Leu Leu Arg Asn Pro Gly Asn Gln Ala Ala Tyr Glu His Phe 130 135 140 Glu Thr Met Lys Asn Gln Trp Ile Asp Asn Val Glu Lys Met Thr Gly 145 150 155 160 Leu Val Asp Glu Ala Ile Asp Thr Lys Ser Leu Leu Asp Ala Ser Glu 165 170 175 Glu Ala Ile Lys Lys Asp Leu Asp Lys Cys Lys Val Ala Met Ala Asn 180 185 190 Ile Gln Pro Gln Met Leu Val Ala 195 200 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gactttggac tcgccagaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cagagaccaa cgttcaagca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggttggctga ggtccaagta 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tcttgtgtca gggtaactag gtga 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agcttgattt ccagggttcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 aagatacgag cagccgagac 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ccagcaacca gcatctgag 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ttccaggact tgctttccac 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tccctgaaaa tctctttcca tt 22 <210> 16 <211> 4255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 cccaaggacc actcttctgc gtttggagtt gctccccgca accccgggct cgtcgctttc 60 tccatcccga cccacgcggg gcgcggggac aacacaggtc gcggaggagc gttgccattc 120 aagtgactgc agcagcagcg gcagcgcctc ggttcctgag cccaccgcag gctgaaggca 180 ttgcgcgtag tccatgcccg tagaggaagt gtgcagatgg gattaacgtc cacatggaga 240 tatggaagag gaccggggat tggtaccgta accatggtca gctggggtcg tttcatctgc 300 ctggtcgtgg tcaccatggc aaccttgtcc ctggcccggc cctccttcag tttagttgag 360 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<223> R = G or A (dbSNP entry rs767809) <220> <221> variation <222> (2814) <223> S = C or G (dbSNP entry rs2131956) <400> 68 atgccagtgt ttcatacgcg cacgatcgag agcatcctgg agccggtggc acagcagatc 60 tcccacctgg tgataatgca cgaggagggc gaggtggacg gcaaagccat tcctgacctc 120 accgcgcccg tggccgccgt gcaggcggcc gtcagcaacc tcgtccgggt tggaaaagag 180 actgttcaaa ccactgagga tcagattttg aagagagata tgccaccagc atttattaag 240 gttgagaatg cttgcaccaa gcttgtccag gcagctcaga tgcttcagtc agacccttac 300 tcagtgcctg ctcgagatta tctaattgat gggtcaaggg gcatcctctc tggaacatca 360 gacctgctcc ttaccttcga tgaggctgag gtccgtaaaa ttattagagt ttgcaaagga 420 attttggaat atcttacagt ggcagaggtg gtggagacta tggaagattt ggtcacttac 480 acaaagaatc ttgggccagg aatgactaag atggccaaga tgattgacga gagacagcag 540 gagctcactc accaggagca ccgagtgatg ttggtgaact cgatgaacac cgtgaaagag 600 ttgctgccag ttctcatttc agctatgaag atttttgtaa caactaaaaa ctcaaaaaac 660 caaggcatag aggaagcttt aaaaaatcgc aattttactg tagaaaaaat gagtgctgaa 720 attaatgaga taattcgtgt gttacaactc acctcttggg atgaagatgc ctgggccagc 780 aaggacactg aagccatgaa gagagcattg gcctccatag actccaaact gaaccaggcc 840 aaaggttggc tccgtgaccc tagtgcctcc ccaggggatg ctggtgagca ggccatcaga 900 cagatcttag atgaagctgg aaaagttggt gaactctgtg caggcaaaga acgcagggag 960 attctgggaa cttgcaaaat gctagggcag atgactgatc aagtggctga cctccgtgcc 1020 agaggacaag gatcctcacc ggtggccatg cagaaagctc agcaggtatc tcagggtctg 1080 gatgtgctca cagcaaaagt ggaaaatgca gctcgcaagc tggaagccat gaccaactca 1140 aagcagagca ttgcaaagaa gatcgatgct gctcagaact ggcttgcaga tccaaatggt 1200 ggaccggaag gagaagagca gattcgaggt gctttggctg aagctcggaa aatagcagaa 1260 ttatgtgatg atcctaaaga aagagatgac attctacgtt cccttgggga aatatctgct 1320 ctgacttcta aattagcaga tctacgaaga caggggaaag gagattctcc agaggctcga 1380 gccttggcca aacaggtggc cacggccctg cagaacctgc agaccaaaac caaccgggct 1440 gtggccaaca gcagaccggc caaagcagct gtacaccttg agggcaagat tgagcaagca 1500 cagcggtgga ttgataatcc cacagtggat gaccgtggag tcggtcaggc tgccatccgg 1560 gggcttgtgg ccgaagggca tcgtctggct aatgttatga tggggcctta tcggcaagat 1620 cttctcgcca agtgtgaccg agtggaccag ctgacagccc agctggctga cctggctgcc 1680 agaggggaag gggagagtcc tcaggcacga gcacttgcat ctcagctcca agactcctta 1740 aaggatctaa aagctcggat gcaggaggcc atgactcagg aagtgtcaga tgttttcagc 1800 gataccacaa ctcccatcaa gctgttggca gtggcagcca cggcgcctcc tgatgcgcct 1860 aacagggaag aggtatttga tgagagggca gctaactttg aaaaccattc aggaaagctt 1920 ggtgctacgg ccgagaaggc ggctgcggtt ggtactgcta ataaatcaac agtggaaggc 1980 attcaggcct cagtgaagac ggcccgagaa ctcacacccc aggtggtctc ggctgctcgt 2040 atcttactta ggaaccctgg aaatcaagct gcttatgaac attttgagac catgaagaac 2100 cagtggatcg ataatgttga aaaaatgaca gggctggtgg acgaagccat tgataccaaa 2160 tctctgttgg atgcttcaga agaagcaatt aaaaaagacc tggacaagtg caaggtagct 2220 atggccaaca ttcagcctca gatgctggtt gctggggcaa ccagtattgc tcgtcgggcc 2280 aaccggatcc tgctggtggc taagagggag gtggagaatt ccgaggatcc caagttccgt 2340 gaggctgtga aagctgcctc tgatgaattg agcaaaacca tctccccrat ggtgatggat 2400 gcaaaagctg tggctggaaa catttccgac cctggactgc aaaagagctt cctggactca 2460 ggatatcgga tcctgggagc tgtggccaag gtcagagaag ccttccaacc tcaggagcct 2520 gacttcccgc cgcctccacc agaccttgaa caactccgac taacagatga gcttgctcct 2580 cccaaaccac ctctgcctga aggtgaggtc cctccaccta ggcctccacc accagaggaa 2640 aaggatgaag agttccctga gcagaaggcc ggggaggtga ttaaccagcc aatgatgatg 2700 gctgccagac agctccatga tgaagctcgc aaatggtcca gcaagccggg catcccagcc 2760 gctgaggtgg gtataggtgt tgtagctgag gcagatgcgg ccgatgctgc tggsttccct 2820 gtcccccctg acatggaaga cgattacgaa cctgagctgc tgttaatgcc atccaatcag 2880 ccggtcaacc agcccattct ggccgcggct cagtccttgc atcgggaagc taccaagtgg 2940 tctagtaagg gcaatgacat cattgcagca gccaagcgca tggctctgct gatggctgag 3000 atgtctcggc tggtaagagg gggcagtggt accaagcggg cactcattca gtgtgccaag 3060 gacatcgcca aggcctcaga tgaggtgact cggttggcca aggaggttgc caagcagtgc 3120 acagataaac ggattagaac caacctctta caggtatgtg agcgaatccc aaccataagc 3180 acccagctca aaatcctgtc cacagtgaag gccaccatgc tgggccggac caacatcagt 3240 gatgaggagt ctgagcaggc cacagagatg ctggttcaca atgcccagaa cctcatgcag 3300 tctg 3304 <210> 69 <211> 3100 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (2388) <223> R = A or G (dbSNP entry rs767809) <400> 69 atgccagtgt ttcatacgcg cacgatcgag agcatcctgg agccggtggc acagcagatc 60 tcccacctgg tgataatgca cgaggagggc gaggtggacg gcaaagccat tcctgacctc 120 accgcgcccg tggccgccgt gcaggcggcc gtcagcaacc tcgtccgggt tggaaaagag 180 actgttcaaa ccactgagga tcagattttg aagagagata tgccaccagc atttattaag 240 gttgagaatg cttgcaccaa gcttgtccag gcagctcaga tgcttcagtc agacccttac 300 tcagtgcctg ctcgagatta tctaattgat gggtcaaggg gcatcctctc tggaacatca 360 gacctgctcc ttaccttcga tgaggctgag gtccgtaaaa ttattagagt ttgcaaagga 420 attttggaat atcttacagt ggcagaggtg gtggagacta tggaagattt ggtcacttac 480 acaaagaatc ttgggccagg aatgactaag atggccaaga tgattgacga gagacagcag 540 gagctcactc accaggagca ccgagtgatg ttggtgaact cgatgaacac cgtgaaagag 600 ttgctgccag ttctcatttc agctatgaag atttttgtaa caactaaaaa ctcaaaaaac 660 caaggcatag aggaagcttt aaaaaatcgc aattttactg tagaaaaaat gagtgctgaa 720 attaatgaga taattcgtgt gttacaactc acctcttggg atgaagatgc ctgggccagc 780 aaggacactg aagccatgaa gagagcattg gcctccatag actccaaact gaaccaggcc 840 aaaggttggc tccgtgaccc tagtgcctcc ccaggggatg ctggtgagca ggccatcaga 900 cagatcttag atgaagctgg aaaagttggt gaactctgtg caggcaaaga acgcagggag 960 attctgggaa cttgcaaaat gctagggcag atgactgatc aagtggctga cctccgtgcc 1020 agaggacaag gatcctcacc ggtggccatg cagaaagctc agcaggtatc tcagggtctg 1080 gatgtgctca cagcaaaagt ggaaaatgca gctcgcaagc tggaagccat gaccaactca 1140 aagcagagca ttgcaaagaa gatcgatgct gctcagaact ggcttgcaga tccaaatggt 1200 ggaccggaag gagaagagca gattcgaggt gctttggctg aagctcggaa aatagcagaa 1260 ttatgtgatg atcctaaaga aagagatgac attctacgtt cccttgggga aatatctgct 1320 ctgacttcta aattagcaga tctacgaaga caggggaaag gagattctcc agaggctcga 1380 gccttggcca aacaggtggc cacggccctg cagaacctgc agaccaaaac caaccgggct 1440 gtggccaaca gcagaccggc caaagcagct gtacaccttg agggcaagat tgagcaagca 1500 cagcggtgga ttgataatcc cacagtggat gaccgtggag tcggtcaggc tgccatccgg 1560 gggcttgtgg ccgaagggca tcgtctggct aatgttatga tggggcctta tcggcaagat 1620 cttctcgcca agtgtgaccg agtggaccag ctgacagccc agctggctga cctggctgcc 1680 agaggggaag gggagagtcc tcaggcacga gcacttgcat ctcagctcca agactcctta 1740 aaggatctaa aagctcggat gcaggaggcc atgactcagg aagtgtcaga tgttttcagc 1800 gataccacaa ctcccatcaa gctgttggca gtggcagcca cggcgcctcc tgatgcgcct 1860 aacagggaag aggtatttga tgagagggca gctaactttg aaaaccattc aggaaagctt 1920 ggtgctacgg ccgagaaggc ggctgcggtt ggtactgcta ataaatcaac agtggaaggc 1980 attcaggcct cagtgaagac ggcccgagaa ctcacacccc aggtggtctc ggctgctcgt 2040 atcttactta ggaaccctgg aaatcaagct gcttatgaac attttgagac catgaagaac 2100 cagtggatcg ataatgttga aaaaatgaca gggctggtgg acgaagccat tgataccaaa 2160 tctctgttgg atgcttcaga agaagcaatt aaaaaagacc tggacaagtg caaggtagct 2220 atggccaaca ttcagcctca gatgctggtt gctggggcaa ccagtattgc tcgtcgggcc 2280 aaccggatcc tgctggtggc taagagggag gtggagaatt ccgaggatcc caagttccgt 2340 gaggctgtga aagctgcctc tgatgaattg agcaaaacca tctccccrat ggtgatggat 2400 gcaaaagctg tggctggaaa catttccgac cctggactgc aaaagagctt cctggactca 2460 ggatatcgga tcctgggagc tgtggccaag gtcagagaag ccttccaacc tcaggagcct 2520 gacttcccgc cgcctccacc agaccttgaa caactccgac taacagatga gcttgctcct 2580 cccaaaccac ctctgcctga aggtgaggtc cctccaccta ggcctccacc accagaggaa 2640 aaggatgaag agttccctga gcagaaggcc ggggaggtga ttaaccagcc aatgatgatg 2700 gctgccagac agctccatga tgaagctcgc aaatggtcca gcaagggcaa tgacatcatt 2760 gcagcagcca agcgcatggc tctgctgatg gctgagatgt ctcggctggt aagagggggc 2820 agtggtacca agcgggcact cattcagtgt gccaaggaca tcgccaaggc ctcagatgag 2880 gtgactcggt tggccaagga ggttgccaag cagtgcacag ataaacggat tagaaccaac 2940 ctcttacagg tatgtgagcg aatcccaacc ataagcaccc agctcaaaat cctgtccaca 3000 gtgaaggcca ccatgctggg ccggaccaac atcagtgatg aggagtctga gcaggccaca 3060 gagatgctgg ttcacaatgc ccagaacctc atgcagtctg 3100 <210> 70 <211> 883 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 atgccagtgt ttcatacgcg cacgatcgag agcatcctgg agccggtggc acagcagatc 60 tcccacctgg tgataatgca cgaggagggc gaggtggacg gcaaagccat tcctgacctc 120 accgcgcccg tggccgccgt gcaggcggcc gtcagcaacc tcgtccgggt tggaaaagag 180 actgttcaaa ccactgagga tcagattttg aagagagata tgccaccagc atttattaag 240 gttgagaatg cttgcaccaa gcttgtccag gcagctcaga tgcttcagtc agacccttac 300 tcagtgcctg ctcgagatta tctaattgat gggtcaaggg gcatcctctc tggaacatca 360 gacctgctcc ttaccttcga tgaggctgag gtccctccac ctaggcctcc accaccagag 420 gaaaaggatg aagagttccc tgagcagaag gccggggagg tgattaacca gccaatgatg 480 atggctgcca gacagctcca tgatgaagct cgcaaatggt ccagcaaggg caatgacatc 540 attgcagcag ccaagcgcat ggctctgctg atggctgaga tgtctcggct ggtaagaggg 600 ggcagtggta ccaagcgggc actcattcag tgtgccaagg acatcgccaa ggcctcagat 660 gaggtgactc ggttggccaa ggaggttgcc aagcagtgca cagataaacg gattagaacc 720 aacctcttac aggtatgtga gcgaatccca accataagca cccagctcaa aatcctgtcc 780 acagtgaagg ccaccatgct gggccggacc aacatcagtg atgaggagtc tgagcaggcc 840 acagagatgc tggttcacaa tgcccagaac ctcatgcagt ctg 883 <210> 71 <211> 2359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 atggctgagg aaaagggtgg aaagcaagtc ctggaagaat ctgcatttga agaaatggaa 60 agagattttc agggagttct ccatgaactt tctggagaca aaagtttgga aaaatttcgg 120 attgaatatg agaggcttca tgctgtcatg aaaaagtctt atgacaatga aaagcgtctg 180 atggccaaat gcagagagct aaatgcagag attgtagtga attctgcgaa ggtcgccact 240 gcccttaagc tctctcagga tgatcagacc accattgcat ccctaaagaa ggaaattgaa 300 aaggcctgga agatggtgga ctcagcctat gacaaagagc agaaggccaa ggagacgatt 360 cttgctctga aagaggaaat agtgaacctg accaaactag tggagcaggg gtctggactg 420 tcaatggacc agcatagcaa catccgagat ttactgaggt tcaaagaaga agtgacaaag 480 gagagagacc agctcttatc agaagtggta aaattacgag aatccctagc tcagaccact 540 gaacagcagc aggaaacaga gcgatcaaaa gaggaggctg aacatgccat cagtcagttc 600 caacaagaaa tccagcaacg tcagaacgaa gcttcccggg agttccggaa gaaggaaaaa 660 ctagagaaag agctcaagca gattcaggca gacatggaca gcaggcagac agaaataaaa 720 gccctgcagc agtatgtgca gaagagcaag gaggagcttc agaagctgga gcagcagctg 780 aaggagcaga agatattgaa tgagagagct gcaaaggaac tcgagcaatt tcagatgaga 840 aatgctaaac ttcagcaaga gaatgaacag cacagtttgg tctgtgagca gctatcccag 900 gaaaaccaac agaaggcgtt ggagctcaaa gccaaagagg aagaagtcca tcaaatgcgc 960 cttgacatcg ggaagctcaa caaaatcaga gaacaaattc ataagaaatt gcaccacacc 1020 gaagatcaaa aggcagaagt cgaacagcac aaagaaaccc taaaaaatca gattgtggga 1080 ttagagagag aggtagaggc ttcaaagaaa caagcagaac ttgacagaaa ggcaatggac 1140 gagcttctaa gagaaaggga catactaaat aagaacatgc ttaaggcggt caatgcgacc 1200 cagaagcaga cagacttggt aaagctccat gaacaagcca agaggaacct ggagggagaa 1260 atccagaact acaaggatga ggctcagaag cagagaaaga tcatctttca tctggaaaag 1320 gagcgtgacc ggtacatcaa ccaagccagt gaccttacgc aaaaggtcct tatgaacatg 1380 gaagacataa aagttcgtga aacacagatt tttgactaca ggaaaaaaat agctgaatca 1440 gagattaaat taaaacagca acagaaccta tatgaagctg tgagatcaga cagaaatctg 1500 tatagcaaaa atctggttga ggctcaggat gaaataacag atatgaagag aaagttaaag 1560 attatgatcc atcaggtaga tgagctgaaa gaagacatct ctgccaaaga gtccgcactt 1620 gtgaagctgc acctggaaca gcagcgaata gaaaaggaaa aggaaacatt gaaggctgag 1680 ctgcagaagc tgagacaaca agccctggag acaaaacact ttattgaaaa gcaagaagct 1740 gaagagagaa aactcctgcg aataattgct gaggctgacg gggagaggtt gagacagaag 1800 aaggaattag accaggtcat cagtgagaga gatatcctgg ggtctcagct tgttcggcgc 1860 aatgatgagt tagctttgct ctatgagaag atcaagatcc aacagtctgt gctgaataaa 1920 ggggagagcc agtacaacca gaggttggag gacatgagaa tcctcagact tgagatcaag 1980 aagcttcgcc gggaaaaggg gattcttgcc aggagtatgg ctaatgttga agaactcaga 2040 caggagtttt ttcacatgca aagagaattg ttgaaggaga ggacacgctg ccgagccctg 2100 gaggaggagc tggagaatcc cctgaatgtg cacagatgga ggaagctcga ggccagcgac 2160 cccaatgcat atgagctgat acagaaaatt cacaccctgc agaagcgtct catcagcaag 2220 actgaagagg tggttgaaaa agagctgctc ctccaggaaa aggagaaact ctacatggaa 2280 ctaaagcacg tcttggcccg ccagcctgga cctgaggctg cggaacagct gaagctgtac 2340 cgacgcacgc tgcatgaca 2359 <210> 72 <211> 32 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 caagcagttg gtagaagact tggatcgaat tc 32 <210> 73 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 caaccaatga ggtggtctcg gctgctcgta tcttacttag gaaccctgga aatcaagctg 60 a 61 <210> 74 <211> 67 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (66) <223> n means ambiguous base calling <400> 74 ttggttgtga gagtgagaat tcgatccaag tcttctacca actgcttgaa cgttggtctc 60 tgaagnc 67 <210> 75 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 ccaatgagga aaagggtgga aagcaagtcc tggaagaatc tgcatttgaa gaaatggaaa 60 gagattttca gggaaact 78 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n means ambiguous base calling <400> 76 gtgagagtga ganttcgatc caagtcttct accaactgct tgaacgttgg tctctgaagt 60 60 <210> 77 <211> 71 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (71) <223> n means ambiguous base calling <400> 77 aatgaggaat acttggacct cagccaacct ctcgaacagt attcacctag ttaccctgac 60 acaagaagaa n 71 <210> 78 <211> 73 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 ttcctcattg gttgtgagag tgagaattcg atccaagtct tctaccaact gcttgaacgt 60 tggtctctga aca 73 <210> 79 <211> 100 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 agcagttggt agaagacttg gatcgaattc tcactctcac aaccaatgag gtggtctcgg 60 ctgctcgtat cttacttagg aaccctggaa atcaagctgc 100 <210> 80 <211> 100 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 agcagttggt agaagacttg gatcgaattc tcactctcac aaccaatgag gaaaagggtg 60 gaaagcaagt cctggaagaa tctgcatttg aagaaatgga 100

Claims (32)

  1. FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA로서, 상기 FGFR2 폴리펩타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; 상기 CCDC147 폴리펩타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이며; 상기 VCL 폴리펩타이드는 야생형 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부인 cDNA.
  2. FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA로서, 상기 cDNA는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드; 및 야생형 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 이들로부터 유도된 돌연변이체 폴리뉴클레오타이드를 조합하는 cDNA.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 FGFR2 폴리펩타이드는 전체 티로신 키나아제 도메인을 포함하는 cDNA.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 FGFR2 엑손 1-16 및 FGFR2 엑손 17의 일부 또는 전부를 함유하고, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드는 FGFR2-CCDC147 융합물인 경우에 CCDC147 엑손 1이 없거나 FGFR2-VCL 융합물인 경우에 VCL 엑손 1-14가 없는 cDNA.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 cDNA는 인간 쓸개관암종으로부터 단리된 유전자 전사체로부터 유도되는 cDNA.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 cDNA를 수반하는 벡터.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 벡터는 발현 벡터인 벡터.
  8. 청구항 6 또는 청구항 7의 벡터로 형질도입된 원핵생물 또는 진핵생물 세포.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 세포는 E. 콜라이 세포인 세포.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 세포는 포유류 세포인 세포.
  11. 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열.
  12. 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열.
  13. FGFR2 폴리펩타이드 및 CCDC147 폴리펩타이드 또는 VCL 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드로서, 상기 FGFR2 폴리펩타이드는 야생형 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 FGFR2 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이고; 상기 CCDC147 폴리펩타이드는 야생형 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 CCDC147 폴리펩타이드의 전부 또는 일부이며; 상기 VCL 폴리펩타이드는 야생형 VCL 폴리펩타이드의 전부 또는 일부, 또는 야생형 폴리펩타이드에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 VCL 폴리펩타이드의 일부이고; 상기 융합 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이고, 시험관내 증식되는 암 세포로부터 또는 이종이식편으로서 단리되거나, 인간 쓸개관암종으로부터 단리되는 융합 폴리펩타이드.
  14. 청구항 1의 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편.
  15. 센스 및 안티센스 프라이머로 이루어지는 프라이머 페어로서, 프라이머가 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 cDNA와 특이적으로 혼성화할 수 있고 cDNA 또는 이들의 일부의 복제를 지시할 수 있는 프라이머 페어.
  16. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 cDNA, 청구항 1의 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자 또는 상기 유전자의 전사체와 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침.
  17. 청구항 1의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA와 살아있는 세포에서 혼성화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서, 혼성화가 메신저 RNA의 번역을 예방하거나 감소시키는 효과를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  18. 청구항 1의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 메신저 RNA에 대한 siRNA.
  19. 청구항 1의 융합 폴리펩타이드를 검출하기 위한 키트로서, 상기 융합 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 키트.
  20. 청구항 1의 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 유전자의 전사체를 검출하기 위한 키트로서, 청구항 15에 따른 프라이머 페어 또는 청구항 16에 따른 올리고뉴클레오타이드 탐침을 포함하는 키트.
  21. 암을 앓는 대상체에서의 치료 방식에서 사용하기 위한 FGFR 키나아제 활성 저해제로서, 상기 대상체가 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 함유하거나 발현하거나, 또는 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 발현하는 저해제.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 FGFR 키나아제 활성 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온, PD173074, Pazopanib, AZD4547, Ponatinib, Dovitinib, BGJ398, E-3810, JNJ-42756493, ARQ 087, LY2874455, BAY1163877, ASP5878, E7090, ODM-203, Nintedanib, TAS-120, PRN 1109 및 PRN 1371로 이루어진 군으로부터 선택되는 저해제.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 FGFR 키나아제 활성 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온인 저해제.
  24. 맞춤화된 암 치료법 방법으로서, 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자를 함유하거나 발현하거나, 또는 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 발현하는 대상체를 (1) FGFR 키나아제 활성 저해제, (2) 청구항 14에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, (3) 청구항 17에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 (4) 청구항 18에 따른 siRNA를 포함하는 약학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 방식으로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 맞춤화된 암 치료법 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 암을 앓는 대상체로부터 암 세포 또는 종양 순환 DNA를 함유하는 생검 또는 유체 샘플을 취하는 단계;
    (b) 생검 또는 유체 샘플 내 세포가 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 함유하거나 발현하는지 또는 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 발현하는지를 결정하는 단계;
    (c) 융합 폴리펩타이드에 대한 유전자를 함유하거나 발현하는 또는 융합 폴리펩타이드를 발현하는 대상체를 단계 d의 치료를 위해 선택하는 단계; 및
    (d) (1) FGFR 키나아제 활성 저해제, (2) 청구항 14에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, (3) 청구항 17에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 (4) 청구항 18에 따른 siRNA를 포함하는 약학적 조성물의 투여를 포함하는 치료 방식으로 선택된 대상체를 처리하는 단계.
  26. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
    상기 FGFR 키나아제 활성 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온, PD173074, Pazopanib, AZD4547, Ponatinib, Dovitinib, BGJ398, E-3810, JNJ-42756493, ARQ 087, LY2874455, BAY1163877, ASP5878, E7090, ODM-203, Nintedanib, TAS-120, PRN 1109 및 PRN 1371로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
    상기 FGFR 키나아제 활성 저해제는 5-아미노-1-(2-메틸-1H-벤즈이미다졸-5-일)-1H-피라졸-4-일]-(1H-인돌-2-일)-메탄온인 방법.
  28. 암을 앓는 인간 대상체에서 종양의 특성규명 방법으로서, 상기 대상체로부터 암 세포 또는 종양 순환 DNA를 함유하는 생검 또는 유체 샘플의 단백질 또는 핵산을 검정하여 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자 또는 청구항 1에 따른 발현된 융합 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 암은 쓸개관암종인 방법.
  30. 하기 단계를 포함하는 FGFR 저해 활성을 갖는 화합물의 동정 방법:
    (a) 청구항 1에 따른 융합 폴리펩타이드를 발현하고 그 성장이 상기 발현에 의존하는 세포를 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 배양하고, 세포 증식 수준을 결정하는 단계;
    (b) 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 배양된 세포의 증식 수준을 비교하는 단계; 및
    (c) 시험 화합물의 존재 하에 배양된 세포의 증식 수준이 시험 화합물의 부재 하에 배양된 세포의 증식 수준보다 낮은 경우 시험 화합물이 FGFR 저해 활성을 갖는 것으로 판단하는 단계.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 세포는 암 세포인 방법.
  32. 청구항 30에 있어서,
    상기 암 세포는 쓸개관암종 세포인 방법.
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