JP2019216725A - Ｆｇｆｒ融合体 - Google Patents

Abstract

【課題】ＦＧＦＲ２ポリペプチドを含む融合ポリペプチド及びそのような融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及び対象からの試料における融合ポリペプチド又はそれをコードする遺伝子もしくはＲＮＡ配列の有無を診断する方法の提供。【解決手段】ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ＦＧＦＲ２ポリペプチド、ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド、及びＶＣＬポリペプチドは、野生型ポリペプチドの全体もしくは一部、又は野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部である、ｃＤＮＡ。【選択図】なし

Description

本発明は、線維芽細胞増殖因子受容体からのポリペプチドコード配列及び別のポリペプチドコード配列を含む融合遺伝子に関する。さらに、本発明は、上記遺伝子によってコードされている融合ポリペプチド及びこうした融合ポリペプチドコード配列のＤＮＡコピーに関する。また、本発明は、後者の融合遺伝子及びポリペプチドに基づいた診断及び治療への応用を包含する。

特定の体細胞融合遺伝子は、癌の発生及び進行の駆動体であることが知られてきた。非特許文献１。癌促進性融合遺伝子の最初の、今では古典的な例は、慢性骨髄性白血病（慢性期ＣＭＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者の９５％超に見られるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子である。ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子は、構成的活性型ＡＢＬキナーゼをコードする。慢性期ＣＭＬ患者に対する最適な最先端の治療は、積極的な臨床評価の対象であるが、ＢＣＲ／ＡＢＬチロシンキナーゼの比較的特異的な阻害剤を必要とする。現在市販されている阻害剤としては、第一世代の薬剤イマチニブ（現行の一次治療）並びに第二世代の薬剤ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ及びポナチニブが挙げられる。また、融合遺伝子は、他の血液癌においても高頻度で生じることが分かった。非特許文献２。ＥＴＶ６−ＲＵＮＸ１融合体及びＢＣＲ−ＡＢＬ１融合体は急性リンパ性白血病の２５％及び１４％において、ＲＵＮＸ１−ＥＴＯ融合体及びＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１融合体は急性骨髄性白血病の１０〜１５％において、ＩＧ＠−ＭＹＣ融合体はバーキットリンパ腫の９０〜１００％において、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ融合体は急性前骨髄球性白血病の９５％において、ＮＰＭ１−ＡＬＫ融合体及びＴＰＭ−ＡＬＫ融合体は未分化大細胞リンパ腫の７５％及び１５％において、それぞれ出現する。融合遺伝子は、これまでは血液癌において比較的高頻度で検出されたが、固形腫瘍ではそのほんのわずかに見出されるに過ぎなかった。しかしながら、最近では融合遺伝子は固形腫瘍でも高い頻度で生じることが明らかになった。非特許文献２。ＴＭＰＲＳＳ２と転写因子のＥＴＳファミリーのメンバーとの融合体が前立腺癌患者の約７０％に認められた。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体は非小細胞肺癌において、ＫＩＡＡ１５４９−ＢＲＡＦ融合体は小児神経膠腫において、ＦＧＦＲ３−ＴＡＣＣ３融合体は膠芽細胞腫において存在し得る。既知の融合遺伝子の総合リストは、例えば、非特許文献２又は非特許文献３に見られる。一部の融合体が種々の癌において生じ得ることは注目される。例として、ＴＰＭ３−ＡＬＫ融合体は未分化大細胞リンパ腫及び炎症性筋線維芽細胞性腫瘍において確認された。他のＡＬＫ融合体は非小細胞肺癌及び未分化大細胞リンパ腫において生じる。

融合体は種々のメカニズムによって癌促進性となり得る。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬの場合、ＢＣＲの相手は、二量化ドメインを形成してＡＢＬドメインの構成的二量化を引き起こすため、構成的ＡＢＬキナーゼ活性とそれによる細胞分裂の制御不良をもたらす。前立腺癌にみられるＴＭＰＲＳＳ２−ＥＴＳ融合体の場合には別のメカニズムが効果を現す。こうした融合遺伝子では、ＥＴＳ転写因子をコードする配列はアンドロゲンにより調節されるＴＭＰＲＳＳ２プロモーターの制御下に置かれ、この転写因子が過剰発現される。ＥＴＳの過剰発現により正常な前立腺上皮分化に関連する遺伝子の発現が調節不全となり、細胞増殖の制御不良がもたらされる。さらに別のメカニズムでは、ＦＧＦＲ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおいてｍｉＲＮＡ調節部位が欠落すると、ＦＧＦＲポリペプチド発現の上方調節が生じる可能性があり、その欠落はＦＧＦＲ遺伝子が別の遺伝子と融合する場合に生じる。非特許文献４。

融合遺伝子が発見され、特徴付けられると、多くの点で癌療法が進歩する。活性化チロシンキナーゼ、例えば、ＡＢＬ１、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ及びＦＧＦＲ１−３をコードする融合遺伝子を例として取りあげると、患者からの癌組織においてそのような融合遺伝子が同定されると、上記関連キナーゼに対する選択的又は特異的阻害剤の発見及び開発の刺激となる。また、融合体キナーゼ遺伝子の存在は、治療方法の選択に影響を与える。例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合体キナーゼを発現している慢性期ＣＭＬ患者に対する一次治療はＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害剤イマチニブを含む療法である。融合体キナーゼ遺伝子の発見は、癌患者からの組織におけるそのような遺伝子の存在又はそのような遺伝子の産物の発現を発見することができる診断分析を考案する基盤になる。慢性期ＣＭＬに関して論じたように、患者の腫瘍組織に融合体キナーゼ遺伝子又はその遺伝子産物が存在するとの確定診断がなされると、医師は最も適切な治療レジメンを決定することが可能になる。一般に、そのようなレジメンは、当該の融合体キナーゼの発現又は活性を阻害する組成物の投与を含むことになる。

癌（又は他の疾患）に関連する全ての融合遺伝子が現在知られていると信じる理由はない。更なる融合遺伝子が発見され特徴付けられると、その新規に発見された融合遺伝子もしくはポリペプチドに関する診断方法の開発及びその新規に発見された融合遺伝子もしくはポリペプチドの特異的阻害剤又はその融合遺伝子もしくはポリペプチドを対象にする他の薬剤の開発又は特定がなされた後に癌治療の特異性が高まると期待される。事実、例えば、特定のキナーゼ阻害剤を含む療法などの所与の治療から最大限の恩恵を受けることになる癌患者の中で、特定の亜集団を特定することが益々求められている。

Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ，Ｆ．ほか、（２００７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ７：２３３−２４５ Ａｎｎａｌａ，Ｍ．Ｊ．ほか、（２０１３年）３４０：１９２−２００ Ｓｈａｗ，Ａ．Ｔ．ほか、（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １３：７７２−７８７ Ｐａｒｋｅｒ，Ｂ．Ｃ．ほか、（２０１３年）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：８５５−８６５

本発明は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、ＦＧＦＲ２ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＶＣＬポリペプチドは、野生型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部であるｃＤＮＡに関する。融合ポリペプチド中のＦＧＦＲ２ポリペプチドは、配列番号１７、２５、２７、２９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７及び５９のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又は配列番号１７、２５、２７、２９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７及び５９のいずれかによるポリペプチドであるそれぞれの野生型ポリペプチドと１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入だけ異なる突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部とすることができる。融合ポリペプチド中のＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、配列番号２１及び６３のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部とすることができる。融合ポリペプチド中のＶＣＬポリペプチドは、配列番号１９、３３、３５及び６１のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部とすることができる。

ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、第一及び第二のポリヌクレオチドを合わせ持っている。第一のポリヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチド又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導される突然変異型ポリヌクレオチドの全体もしくは一部をコードしており、第二のポリヌクレオチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチド又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導される突然変異型ポリヌクレオチドの全体もしくは一部をコードする。特定の実施態様において、第一のポリヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部をコードし、配列番号１６、２２、２４、２６、２８、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６及び５８のいずれかのヌクレオチド配列又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部を含む。第二のポリヌクレオチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又は野生型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部をコードし、配列番号２０、３６及び６２（ＣＣＤＣ１４７）のいずれかもしくは配列番号１８、３０、３２、３４及び６０（ＶＣＬ）のいずれかのヌクレオチド配列又は１つ以上のコドン（アミノ酸をコードする三塩基組）の置換、欠失もしくは挿入によって後者のヌクレオチド配列のいずれか（即ち、配列番号２０、３６もしくは６２（ＣＣＤＣ１４７）又は配列番号１８、３０、３２、３４もしくは６０（ＶＣＬ））から誘導されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部を含む。

より特定の実施態様では、融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、完全なチロシンキナーゼドメインを含むＦＧＦＲ２ポリペプチド、及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む。チロシンキナーゼドメインは、融合ポリペプチドが検出可能なチロシンキナーゼ活性を示すことを可能にする場合に、完全とみなされる。この実施態様では、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの２つのポリヌクレオチドの一番目は、完全なチロシンキナーゼドメインを含むのに十分長いＦＧＦＲ２ポリペプチド断片をコードする。

更により特定の実施態様では、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの２つのポリヌクレオチドの第一番目はＦＧＦＲ２エクソン１〜１６、及びＦＧＦＲ２エクソン１７の一部もしくは全てを含み、２つのポリヌクレオチドの第二番目はＣＣＤＣ１４７エクソン１を欠く（即ち、エクソン２から始まる）ＣＣＤＣ１４７コード配列又はＶＣＬエクソン１〜１４を欠く（即ち、エクソン１５から始まる）ＶＣＬコード配列を含む。本発明では、エクソンのアノテーションは、融合遺伝子の各部分、即ち、ＦＧＦＲ２では配列番号１６、ＶＣＬでは配列番号１８及びＣＣＤＣ１４７では配列番号２０についてＥｎｓｅｍｂｌ ｖ４２ ａｓｓｅｍｂｌｙに見出される最長のコード転写物に基づいて行われる。

上述の実施態様のｃＤＮＡは、ヒト胆管癌から単離された遺伝子転写物から誘導することができる。

より具体的な実施態様は、配列番号１及び配列番号２のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列に関する。

また、本発明は、本発明のｃＤＮＡを有するベクターを包含し、これによりそのようなベクターは、そのベクターが適合する細胞型におけるこのｃＤＮＡ内にコードされた融合ポリペプチドの発現に役立つ発現ベクターとすることができる。また、本発明は、本発明のｃＤＮＡを有するベクターを含む任意の細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）に関する。この細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は動物細胞とすることができる。

本発明の他の実施態様は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、この融合ポリペプチドは組換えポリペプチド、生体外でもしくは異種移植体として増殖された癌細胞から単離されたポリペプチド、又はヒト胆管癌から単離（精製）されたポリペプチドである融合ポリペプチドに関する。融合ポリペプチドに含まれるＦＧＦＲ２ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＶＣＬポリペプチドは、野生型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＶＣＬポリペプチドの一部である。

特定の実施態様では、融合ポリペプチドに含まれるＦＧＦＲ２ポリペプチドは、配列番号１７、２５、２７、２９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７及び５９のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部である。融合ポリペプチドに含まれるＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、配列番号２１及び６３のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部である。融合ポリペプチドに含まれるＶＣＬポリペプチドは、配列番号１９、３３、３５及び６１のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部である。

別の実施態様は、本発明の融合ポリペプチドに結合する抗体又は抗原結合断片に関する。抗体又は抗原結合断片は、融合ポリペプチドの任意の配列を認識することができる。具体的な実施態様では、この抗体又は抗原結合断片は、両融合相手由来、即ち、ＦＧＦＲ２由来及びＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬ由来の配列からなるエピトープを認識する。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチドの遺伝子、そのような遺伝子のＲＮＡ転写物又は本発明のｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドに関する。特定の実施態様は、本発明のｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、このｃＤＮＡ又はその一部の複製を誘導することができるセンス及びアンチセンスプライマーからなるプライマー対に関する。同プライマーは、本発明の融合ポリペプチドをコードするゲノム配列又はそのＲＮＡ転写物を増幅するために用いることもできる。別の実施態様は、本発明のｃＤＮＡ、本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子又はそのような遺伝子のＲＮＡ転写物に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブに関する。別の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、生体細胞において本発明の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリダイゼーションはメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻止又は低下させる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、本発明の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡに対するｓｉＲＮＡとすることができる。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチド又はそのような融合ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはそのＲＮＡ転写物を検出するためのキットを包含する。融合ポリペプチドを検出するためのキットは、この融合ポリペプチドに結合することができる１種以上の抗体又は抗原結合断片を含むことができる。融合ポリペプチドをコードする遺伝子又は遺伝子の転写物を検出するためのキットは上述のプライマー対又はオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。

癌に罹患している対象における治療計画に用いるためのＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤であって、この対象は本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含有もしくは発現し、又はそのような融合ポリペプチドを発現する、該阻害剤も本発明の範囲内にある。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン、ＰＤ１７３０７４、パゾパニブ、ＡＺＤ４５４７、ポナチニブ、ドビチニブ、ＢＧＪ３９８、Ｅ−３８１０、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ＡＲＱ ０８７、ＬＹ２８７４４５５、ＢＡＹ１１６３８７７、ＡＳＰ５８７８、Ｅ７０９０、ＯＤＭ−２０３、ニンテダニブ、ＴＡＳ−１２０、ＰＲＮ １１０９及びＰＲＮ １３７１からなる群から選ぶことができる。より具体的には、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノンとすることができる。

また、本発明は、個別的癌治療の方法であって、本発明の融合ポリペプチドの遺伝子を含有もしくは発現している又はそのような融合ポリペプチドを発現している対象に対して、（１）ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤、（２）融合ポリペプチドを認識する抗体もしくは抗原結合断片、（３）本発明の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド又は（４）本発明の融合ポリペプチドコードするメッセンジャーＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを含む医薬組成物の投与を含む治療計画を施す工程を含む方法に関する。

診断の態様にも関係している治療方法は、（ａ）癌に罹患している対象から癌細胞又は腫瘍循環ＤＮＡを含む生検又は流体試料を採取する工程、（ｂ）この生検又は流体試料中の細胞が本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、もしくは発現し、又はそのような融合ポリペプチドを発現するかどうかを判定する工程、（ｃ）工程ｄの治療のために、融合ポリペプチドの遺伝子を含み、もしくは発現し、又は融合ポリペプチドを発現する対象を選ぶ工程及び（ｄ）選ばれた対象に対して、（１）ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤、（２）融合ポリペプチドを認識する抗体もしくは抗原結合断片、（３）本発明の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド又は（４）本発明の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを含む医薬組成物の投与を含む治療計画を施す工程を含む。

上述の治療方法に用いられるＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン、ＰＤ１７３０７４、パゾパニブ、ＡＺＤ４５４７、ポナチニブ、ドビチニブ、ＢＧＪ３９８、Ｅ−３８１０、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ＡＲＱ ０８７、ＬＹ２８７４４５５、ＢＡＹ１１６３８７７、ＡＳＰ５８７８、Ｅ７０９０、ＯＤＭ−２０３、ニンテダニブ、ＴＡＳ−１２０、ＰＲＮ １１０９及びＰＲＮ １３７１からなる群から選ぶことができる。より具体的には、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノンとすることができる。

また、本発明は、癌に罹患しているヒト対象において腫瘍を特徴付ける方法であって、対象からの癌細胞又は腫瘍循環ＤＮＡを含む生検又は流体試料のタンパク質又は核酸をアッセイして、本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子又は発現された本発明の融合ポリペプチドの有無を確認する工程を含む方法に関する。特定の実施態様では、上記癌は胆管癌である。

また、最後に、本発明は、ＦＧＦＲ阻害活性を有する化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。そのような方法は、（ａ）本発明の融合ポリペプチドを発現し、その成長が試験化合物の存在下又は非存在下においてこの発現に依存している細胞を培養し、細胞増殖のレベルを測定する工程、（ｂ）その試験化合物の存在下及び非存在下における培養細胞の増殖レベルを比較する工程並びに（ｃ）試験化合物の存在下において培養された細胞の増殖レベルが試験化合物の非存在下において培養された細胞の増殖レベルよりも低い場合に、試験化合物はＦＧＦＲ阻害活性を有すると判断する工程を含む。この方法において利用する細胞は、癌細胞、より具体的には胆管癌細胞とすることができる。

２名の患者（１名はＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合遺伝子（Ａ）を有し、他の１名はＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子を有する（Ｂ））の試料からのｃＤＮＡから増幅し、アガロースゲル電気泳動後に可視化したＰＣＲ断片を示す図である。表１に配列番号８、９〜１２、１４〜１５として列挙した増幅に用いたプライマー対：１ａ：プライマー対１６／１７、１ｂ：プライマー対１６／１８、２ａ：プライマー対１６／１９、２ｂ：プライマー対１６／２０、３ａ：プライマー対１６／２１及び３ｂ：プライマー対１６／２２。断片サイズの基準は実験レーンの左方に示した。 ２名の患者（１名はＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合遺伝子（Ａ）を有し、他の１名はＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子を有する（Ｂ））の試料からのｃＤＮＡから増幅し、アガロースゲル電気泳動後に可視化したＰＣＲ断片を示す図である。表１に配列番号８、９〜１２、１４〜１５として列挙した増幅に用いたプライマー対：１ａ：プライマー対１６／１７、１ｂ：プライマー対１６／１８、２ａ：プライマー対１６／１９、２ｂ：プライマー対１６／２０、３ａ：プライマー対１６／２１及び３ｂ：プライマー対１６／２２。断片サイズの基準は実験レーンの左方に示した。 実施例４により得られたＲａｔ２細胞並びにＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７を発現する誘導細胞プールに関するコロニー形成率（％）の結果を表すグラフ図である。 実施例４により軟寒天中単一細胞の２１日間インキュベーション後に得られたＲａｔ２細胞のコロニーの代表的な画像を示す図である（親細胞（Ａ）、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞（Ｂ）及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞（Ｃ））。 実施例４により軟寒天中単一細胞の２１日間インキュベーション後に得られたＲａｔ２細胞のコロニーの代表的な画像を示す図である（親細胞（Ａ）、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞（Ｂ）及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞（Ｃ））。 実施例４により軟寒天中単一細胞の２１日間インキュベーション後に得られたＲａｔ２細胞のコロニーの代表的な画像を示す図である（親細胞（Ａ）、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞（Ｂ）及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞（Ｃ））。 実施例５（１）によりＦＧＦＲ阻害剤の存在下にＲａｔ２細胞で得られた用量反応曲線を示す図である（親細胞（Ａ）、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞（Ｂ）及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞（Ｃ））。成長率を比較した。図４では、種々の阻害剤（Ｄ）で得られたＩＣ５０をまとめた表も示した。 実施例５（２）によりＦＧＦＲ阻害剤の存在下にＲａｔ２細胞で得られた用量反応曲線を示す図である（親細胞（Ａ）、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞（Ｂ）及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞（Ｃ））。成長率を比較した。図５では、種々の阻害剤（Ｄ）で得られたＩＣ５０をまとめた表も示した。 Ｒａｔ２細胞（群１及び２）、Ｒａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７細胞（群３及び４）並びにＲａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ細胞（群５及び６）をそれぞれ接種したマウスにおいて実施例６により測定した原発腫瘍容積を示すグラフ図である。 実施例７（１）のＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルにおいて得られた腫瘍容積（Ａ）、体重（Ｂ）及び治療最終日の腫瘍重量（Ｃ）を示すグラフ図である。データは平均±ＳＥＭとして示した。Ｐ値はマンホイットニー検定を用いてビヒクル対照との比較で算出した（括弧内は対応のないｔ−検定）。 実施例７（２）のＦＧＦＲ２−ＶＣＬ生体内モデルにおいて得られた腫瘍容積（Ａ）、体重（Ｂ）及び治療最終日の腫瘍重量（Ｃ）を示すグラフ図である。データは平均±ＳＥＭとして示した。Ｐ値はマンホイットニー検定を用いてビヒクル対照との比較及び群２及び群３間の比較で算出した（括弧内は対応のないｔ−検定）。 実施例８（１）で詳述したように、一時的に擬似的形質移入を行い、又はＦＧＦＲ２−ＶＣＬもしくはＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現構造物を形質移入し、バルガテフ（Ｖａｒｇａｔｅｆ）で短時間処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。抗ｍｙｃ抗体（α−ｍｙｃ）によりｍｙｃ標的融合ポリペプチドを検出し、抗ホスホチロシン抗体（α−ｐＹ）を検出した。 実施例８（２）で詳述したサンドイッチホスホチロシンＥＬＩＳＡにより融合ポリペプチドの自己リン酸化を定量した図９と同様な実験からの結果を示すグラフ図である。

定義
本願では、全てのゲノム配列又は配列のアノテーションのために用いた引用文献は、ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３７（ＧＲＣｈ３７）及びＥｎｓｅｍｂｌ ｖ４２ ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｆｌｉｃｅｋ，Ｐ．（２０１４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．４２：Ｄ７４９−５５、データベース版）である。

「ＦＧＦＲ」とは、線維芽細胞増殖因子受容体のファミリーの任意のメンバーのことをいう。ＦＧＦＲファミリーは受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲファミリーには４つのメンバー、即ち、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４が知られている。本発明で言及されているＦＧＦＲは、任意の起源に由来するものとすることができるが、好ましくは哺乳動物に由来、より好ましくはヒトに由来するものである。最も好ましいＦＧＦＲはＦＧＦＲ２である。ヒトＦＧＦＲ２遺伝子の染色体上の位置は１０ｑ２６である。

「ＣＣＤＣ１４７」とは、「コイルドコイルドメイン含有１４７」として知られるポリペプチドである。本発明で言及されているＣＣＤＣ１４７遺伝子又はポリペプチドは、任意の起源に由来するものとすることができるが、好ましくは哺乳動物に由来、より好ましくはヒトに由来するものである。このポリペプチドの発現は腎臓、肝臓、肺及び血液（血小板）で認められている。このヒトＣＣＤＣ１４７遺伝子の染色体上の位置は１０ｑ２５である。ＣＣＤＣ１４７が現在ＣＦＡＰ５８（ｃｉｌｉａ ａｎｄ ｆｌａｇｅｌｌａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５８）の名称でＥｎｓｅｍｂｌに掲載されていることは注目される。

「ＶＣＬ」とは、ビンキュリンのことをいう。ビンキュリンは、細胞間及び細胞マトリックス間結合に関連する細胞骨格ポリペプチドである。本発明で言及されているＶＣＬ遺伝子又はポリペプチドは、任意の起源に由来するものとすることができるが、好ましくは哺乳動物に由来、より好ましくはヒトに由来するものである。５−ヘリックス束を含むビンキュリンの尾は自己会合することが知られている。Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．（２００６年）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐ２６．００００７：Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＶＣＬ ｇｅｎｅ ｉｓ １０ｑ２２．２．を参照されたい。

ＦＧＦＲ２ヌクレオチド配列（即ち、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）に適用される「野生型」とは、完全長ポリペプチドに翻訳することができる任意の既知ＦＧＦＲ２ヌクレオチド配列、特に、配列番号１６、２２、２４、２６、２８、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６又は５８（ＥＮＳＴ０００００３５８４８７、‘３５７５５５、‘３５１９３６、‘３６０１４４、‘４５７４１６、‘３４６９９７、‘３６９０５６、‘３６９０５８、‘３６９０６１、‘３６９０５９、‘３６９０６０、‘３５６２２６、‘３３６５５３、‘４７８８５９、‘４２９３６１）のいずれかのことをいう。ＦＧＦＲ２アミノ酸配列に適用される「野生型」とは、任意の既知完全長ＦＧＦＲ２ポリペプチド配列、特に、それぞれ、配列番号１７（もしくは２３）、２５、２７、２９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７又は５９（ＥＮＳＰ０００００３５１２７６、‘３５０１６６、‘３０９８７８、‘３５３２６２、‘４１０２９４、‘２６３４５１、‘３５８０５２、‘３５８０５４、‘３５８０５７、‘３５８０５５、‘３５８０５６、‘３４８５５９、‘３３７６６５、‘４７４０１１、‘４０４２１９）のいずれかのことをいう。ＶＣＬヌクレオチド配列（即ち、野生型ＶＣＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）に適用される「野生型」とは、完全長ポリペプチドに翻訳することができる任意の既知ＶＣＬヌクレオチド配列、特に、配列番号１８、３０、３２、３４又は６０（ＥＮＳＴ０００００２１１９９８、‘３７２７５５、‘４１７６４８、‘４３６３９６）のいずれかのことをいう。ＶＣＬアミノ酸配列に適用される「野生型」とは、任意の既知完全長ＶＣＬポリペプチド配列、特に、それぞれ、配列番号１９（もしくは３１）、３３、３５又は６１（ＥＮＳＰ０００００２１１９９８、‘３６１８４１、‘４１１８８７‘４１５４８９）のいずれかのことをいう。ＣＣＤＣ１４７ヌクレオチド配列（即ち、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）に適用される「野生型」とは、完全長ポリペプチドに翻訳することができる任意の既知ＣＣＤＣ１４７ヌクレオチド配列、特に、配列番号２０、３６又は６２（ＥＮＳＴ０００００３６９７０４，‘３６９７０３）のことをいう。ＣＣＤＣ１４７アミノ酸配列に適用される「野生型」とは、任意の既知完全長ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド配列、特に、それぞれ、配列番号２１（もしくは３７）又は６３（ＥＮＳＰ０００００３５８７１８，‘３５８７１７）のことをいう。同じ文脈において、「突然変異型」とは、少なくとも１つのヌクレオチド又は１つのアミノ酸が、それぞれ、配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０もしくは６２又は配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１もしくは６３の配列のうちの１つと異なる配列のことをいう。

「ポリペプチドの一部」とは、完全長ポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分からなるポリペプチドのことをいう。

「融合ポリペプチド」とは、野生型又は突然変異型ＦＧＦＲポリペプチドの全体又は一部が「融合点」と呼ばれる位置で異なるポリペプチドの全て又は一部に融合しているポリペプチドのことをいう。本発明との具体的な関連において、この用語は、野生型又は突然変異型ＦＧＦＲポリペプチドの全体又は一部が野生型又は突然変異型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体又は一部又は野生型又は突然変異型ＶＣＬポリペプチドの全体又は一部に融合しているポリペプチドのことをいう。

「融合遺伝子」とは、融合ポリペプチドをコードする遺伝子のことをいう。融合遺伝子は、ゲノム限界点とも呼ばれる融合点をも含む。

「癌」とは、一般に、悪性新生物のことをいい、転移性でも非転移性でもよい。胃腸管及び皮膚などの上皮組織から生じる癌としては、例えば、脳腫瘍、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、膵癌、肝癌、胆管癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、大腸癌、膀胱癌及び卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。筋肉などの非上皮組織（間質）から生じる肉腫としては、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫及び血管肉腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、造血器官に由来する血液癌としては、例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む悪性リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病を含む白血病並びに多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

活性薬剤、例えば、医薬の「治療的有効量」とは、単回又は複数回投与後に、任意の薬物治療に適用できる妥当なベネフィット／リスク比で治療対象に治療効果をもたらす化合物の量を意味する。治療効果は客観的（即ち、何らかのテスト又はマーカーにより測定可能）なものでも主観的（即ち、対象が効果の兆候を示すか、効果を感じる）ものであってもよい。但し、有効量は投与経路及び他剤との同時使用の可能性によっても異なるものとする。しかしながら、本発明の組成物の１日当たりの総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるものと理解されよう。任意の特定患者に対する具体的な治療的有効量は、治療対象の疾患及び疾患の重症度、使用される具体的な活性薬剤の作用、使用される具体的な組成物、患者の年齢、体重、全般的健康、性及び食習慣、用いられる具体的な活性薬剤の投与時期、投与経路及び排泄速度、治療期間、用いられる具体的な活性薬剤との併用又は同時使用薬剤、並びに医学分野で周知されている同様な因子を含む種々因子によって決まることになる。

「医薬用として許容可能な担体」又は「医薬用として許容可能なビヒクル」という用語は、標準的な医薬用担体、溶剤、界面活性剤又はビヒクルのいずれかを包含する。好適な医薬用として許容可能なビヒクルとしては、水性ビヒクル及び非水性ビヒクルが挙げられる。標準的な医薬用担体及びその処方については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン、ペンシルベニア州（ＰＡ）、１９版、１９９５年に記載されている。

「〜に特異的に結合する」又は「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、２種のオリゴ−又はポリヌクレオチドが、所与の条件下に、又は、条件が示されていない場合には当該分野の知識に基づいて特定することができる適切な条件下で、互いに相互作用するが、任意の異なるオリゴ−又はポリヌクレオチドとは検出可能な程度には相互作用しないことを意味する。

エクソンとは、ＲＮＡスプライシングによってイントロンが除去された後の遺伝子の最終的な成熟ＲＮＡ産物内に依然として存在する遺伝子によってコードされている任意のヌクレオチド配列である。「エクソン」という用語は、遺伝子内のＤＮＡ配列並びにそれに対応する、ＲＮＡ転写物及びそれから誘導されるｃＤＮＡ内の配列の両方を意味する。本願では、エクソンの番号付けは５’非翻訳配列を含むエクソン番号１から始まる。配列番号１６、１８及び２０のｃＤＮＡが非翻訳配列を含むのに対して、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２及び配列番号６４〜７２の部分配列がポリペプチドコード配列のみを含むことは、注目される。さらに、エクソンのアノテーションが、融合遺伝子の各部分、即ち、ＦＧＦＲ２では配列番号１６、ＶＣＬでは配列番号１８及びＣＣＤＣ１４７では配列番号２０についてＥｎｓｅｍｂｌｖ ４２ ａｓｓｅｍｂｌｙに見出される最長のコード転写物に基づいて行われることも、注目される。

本明細書に用いられている「ｃＤＮＡ」とは、遺伝子転写物の部分的又は完全なコピーのことをいう。この用語は、後者のコピー、その相補体及びコピー及び相補体の両者からなる二本鎖ＤＮＡを含む意味である。

本発明は、特定のヒト癌細胞において発現されるが、正常細胞では発現されない新規な融合ポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ＦＧＦＲ２ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＶＣＬポリペプチドは、野生型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＶＣＬポリペプチドの一部であり、特許請求された融合ポリペプチドは組換えポリペプチドであり、又は生体外でもしくは異種移植体として増殖された癌細胞から単離され、又はヒト胆管癌から単離される、融合ポリペプチドに関する。配列番号を考慮に入れると、本発明は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む新規な融合ポリペプチドであって、ＦＧＦＲ２ポリペプチドは、配列番号１７、２５、２７、２９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７もしくは５９のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、配列番号２１もしくは６３のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＶＣＬポリペプチドは、配列番号１９、３３、３５もしくは６１のいずれかのアミノ酸配列を有する野性型ポリペプチドの全体もしくは一部、又はその野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部である融合ポリペプチドに関する。好ましくは、後者のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入は、融合ポリペプチド中に存在するポリペプチド配列又はポリペプチド配列の断片において１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸に影響を与える（即ち、置換、付加又は欠失する）。また、突然変異型ＦＧＦＲ２、ＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬポリペプチドは、それぞれの野生型ポリペプチド又はその断片と７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するＦＧＦＲ２、ＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬポリペプチドを包含する。最も好ましくは、突然変異型ポリペプチドは、それぞれの野生型ポリペプチド又はその断片と少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する。

あるアミノ酸配列（又はヌクレオチド配列）の別の配列に対する同一性はアルゴリズムＢＬＡＳＴを用いて求めることができる（Ｋａｒｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、９０：５８７３−７）。このアルゴリズムに基づいてＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸなどのプログラムが開発された（Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）。ＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析するために、スコアのパラメータを１００、文字列長さを１２に設定することができる。ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する際には、スコアを５０、文字列長さを３とすることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際にはデフォルトパラメータを使用することができる。そのような解析の具体的な技術は当該分野で既知である。全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイト上の情報、基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ：Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を参照されたい。

また、本発明は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、ＦＧＦＲ２ポリペプチドは、哺乳動物プロテオームにおいて特定可能なＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部、又は後者のポリペプチドと１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入だけ異なる突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、哺乳動物プロテオームにおいて特定可能なＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部、又は後者のポリペプチドと１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入だけ異なる突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部であり、ＶＣＬポリペプチドは、哺乳動物プロテオームにおいて特定可能なＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部、又は後者のポリペプチドと１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入だけ異なる突然変異型ポリペプチドの全体もしくは一部である融合ポリペプチドを包含する。

さらに、本発明は、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡなどのポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチド又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導される突然変異型ポリヌクレオチドの全体もしくは一部をコードする第一のポリヌクレオチドと、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチド又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導される突然変異型ポリヌクレオチドの全体もしくは一部をコードする第二のポリヌクレオチドとを合わせ持つ、ポリヌクレオチドに関する。配列番号を考慮に入れると、本発明は、ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）であって、ポリヌクレオチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部をコードする第一のポリヌクレオチドであって、配列番号１６、２２、２４、２６、２８、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６もしくは５８のいずれかのヌクレオチド配列、又は１つ以上のコドンの置換、欠失又は挿入によって配列番号１６、２２、２４、２６、２８、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６もしくは５８のいずれかから誘導されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部を包含する第一のポリヌクレオチドと、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部をコードする第二のポリヌクレオチドであって、配列番号２０、３６もしくは６２のいずれか、又は配列番号１８、３０、３２、３４もしくは６０のいずれかのヌクレオチド配列、又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によって配列番号２０、３６もしくは６２のいずれか、又は配列番号１８、３０、３２、３４もしくは６０のいずれかのヌクレオチド配列から誘導されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部を包含する第二のポリヌクレオチドを合わせ持つ、ポリヌクレオチドに関する。好ましくは、後者のＦＧＦＲ２、ＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬをコードするヌクレオチド配列におけるコドンの置換、欠失又は挿入は、コードされているポリペプチド又は融合ポリペプチドに存在するそのポリペプチドの断片において１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜５個のアミノ酸、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸に影響を与える（即ち、置換、付加又は欠失する）。また、本発明のポリヌクレオチドには、それぞれの野生型ポリペプチド又はその断片と７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を独立して有するＦＧＦＲ２、ＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。最も好ましくは、上記の誘導されたポリヌクレオチドは、それぞれの野生型ポリペプチド又はその断片と少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチド又はその断片をコードする。

本発明のポリヌクレオチドは任意の方法によって得ることができる。こうしたポリヌクレオチドとしては、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から調製される全てのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから誘導体化されるＤＮＡ、化学合成により調製されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅によって得られるＤＮＡ及び後者の方法の組合せによって調製されるＤＮＡが挙げられる。本発明の融合ポリペプチドをコードする非ゲノム型ポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成によって、又はゲノムＤＮＡ断片単離後の融合ポリペプチドコード領域からの介在配列の除去によって、又は当該分野で既知の方法を用いた化学合成によって得ることができる。

例を示すと、本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞又は組織から全ＲＮＡを調製することができる。全ＲＮＡは、例えば、グアニジン−イソチオシアネート法、熱フェノール法又は酸・グアニジニウムチオシアネート・フェノール・クロロホルム法によって得ることができる。メッセンジャーＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロース、ポリＵセファロースなどを用いる親和性クロマトグラフィーによって選択することができる。そのようなｍＲＮＡを鋳型として、既知の方法、例えば、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡ合成を行うことができる（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．２：１６１（１９８２年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３年）、Ｇｅｎｅ ２５：２６３（１９８３年））。第二鎖合成の後、二本鎖ｃＤＮＡをプラスミド、ファージ、コスミドなどのベクターに挿入する。次いで、得られたライブラリを適切な宿主細胞、例えば、大腸菌中に導入し、当該分野で既知の方法、例えば、コロニーハイブリダイゼーションによって本発明の融合ポリペプチドのｃＤＮＡを有するベクターの宿主細胞における有無についてスクリーニングする。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するベクターを包含する。こうしたベクターは、原核又は真核宿主細胞において自律的に複製又は増幅する限り、特に限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学技術を用いてベクターに導入することができる。ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９などの大腸菌由来のプラスミド、ｐＹＣベクター又はｐＲＳシャトルベクターなどの酵母（例えば、Ｓ．セルヴィシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来のプラスミド及びｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５又はｐＣ１９４などの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターとしては、λｇｔ１０及びλｇｔ１１などのバクテリオファージベクター及び核多角体病ウイルス、レンチウイルスを含むレトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの由来の昆虫又は動物ウイルスベクターが挙げられる。

また、本発明は、原核又は真核宿主における本発明のポリヌクレオチドの挿入及び本発明の融合ポリペプチドの発現を可能にする発現ベクターに関する。好適な発現ベクターとしては、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２（１９９０年））及びｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｄａｔａｂａｓｅ、ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ、２０１４年３月７日）が挙げられる。また、本発明の融合ポリペプチドは他のポリペプチドとの（更なる）融合体として発現させることができる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列との融合体としての融合ポリペプチドの産生にはプラスミドｐＧＥＸ４Ｔ１が好適である。また、本発明の融合ポリペプチドは、適切なベクターを用いて（例えば、ｐＭＡＬ Ｃ２ベクターを用いて）、例えば、インフルエンザの血球凝集素、免疫グロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ又はマルトース結合タンパク質との融合体として発現させることができる。また、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ほか（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４−１０）、６個のヒスチジン残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ血球凝集素断片、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰ断片、ｐ１８ ＨＩＶ断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０ Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−チューブリン断片、Ｂ−ｔａｇ、プロテインＣ断片、Ｓｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ及びＨａｌｏ Ｔａｇとの融合体などの種々のペプチドとの融合体も包含される。

当然のことながら、発現ベクターは、本発明の融合ポリペプチドのｃＤＮＡ遺伝子の効率的な転写及び翻訳に必要な全ての要素、例えば、プロモーター、転写及び翻訳エンハンサー、翻訳の開始／停止コドン、リボソーム結合部位シグナル、転写停止シグナル、ポリアデニル化部位、融合ポリペプチドの媒体（又はペリプラスム間隙）等中への分泌シグナル及び複製シグナル、を含む。さらに、ベクターは、形質転換宿主又は遺伝子増幅を示す宿主の選択を可能にするマーカー遺伝子（増幅のための遺伝子、薬剤耐性遺伝子など）を含むことができる。プロモーターとしては、例えば、大腸菌Ｔｒｐ、ｌａｃ、ｒｅｃＡ、ＩＰＬ、ｌｐｐ及びｔａｃプロモーター、酵母ＰＨ０５、ＰＧＫ、ＧＡＰ及びＡＤＨプロモーター、枯草菌ＳＬ０１、ＳＰ０２及びｐｅｎＰプロモーター並びに哺乳動物ＳＶ４０、レトロウイルス及び熱ショックプロモーターが挙げられる。マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸シンターゼ遺伝子、アデノシン脱アミノ酵素遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子、ハイグロマイシン−Ｂ−リン酸転移酵素遺伝子及びアスパラギン酸カルバミル転移酵素遺伝子が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学技術を用いて発現ベクターに導入することができる。

さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含むベクターで形質転換した組換え細胞に関する。そのように形質転換できる細胞型については特に限定はない。好ましくは、大腸菌及び動物（特に、哺乳動物）細胞である。例えば、大腸菌細胞としてはＤＨ５α、ＴＢ１及びＨＢ１０１、マウス細胞としてはＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１及びＮＩＨ３Ｔ３細胞、ラット細胞としてはＰＣ１２及びＰＣ１２ｈ、ハムスター細胞としてはＢＨＫ及びＣＨＯ、サル細胞としてはＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１及びＶｅｒｏ並びにヒト細胞としてはヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、２倍体線維芽細胞由来細胞、骨髄腫細胞及びＨｅｐＧ２細胞がある。ベクターを宿主細胞に導入する方法については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２１１０（１９７２年）；Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１（１９７９年）；Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．５６：２０９（１９７１年）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２７（１９７８年）；Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３（１９８３年）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６（１９７３年）；Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３：２１５６（１９８３年）に記載されている。

本発明の融合ポリペプチドは、すぐ先に述べたような組換え細胞、好ましくは哺乳動物
又はヒトを含む動物の細胞を培養し、こうした細胞が上記ポリペプチドを分泌することができるならば、その後、ろ過又は遠心分離により細胞及び細胞残屑を除去した培養培地を採集することによって製造することができる。次いで、融合ポリペプチドは、溶解度に基づく方法（例えば、塩析及び溶媒沈殿）、分子サイズに基づく方法（例えば、透析、限外ろ過、ゲルろ過並びにネイティブ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、電荷に基づいた方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、親和性に基づく方法（例えば、親和性クロマトグラフィー）、疎水性を利用する方法（例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー）並びにポリペプチド間の等電性差に基づく方法（例えば、等電点電気泳動）などの従来の方法によって精製することができる。

組換え細胞において産生された融合ポリペプチドが細胞質／核質又は細胞壁のある組換え細胞の周辺細胞質に蓄積している場合、細胞はろ過又は遠心分離などの方法によって採集する。適切な緩衝液に細胞を懸濁した後、細胞壁又は細胞膜をそれぞれ、超音波処理、リゾチーム処理又は冷凍融解などの方法によって破壊し、遠心分離又はろ過した後、膜又は細胞質／核質画分を得る。次いで、融合ポリペプチドをすぐ先に述べた生化学的方法によって精製する。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをも包含する。本発明のポリヌクレオチド内の配列に対して相補性であるセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの対は、このポリヌクレオチド又はその部分のＰＣＲによる増幅のためのプライマーとして有用である。本発明のポリヌクレオチドに対して相補性であるオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の長さとすることができる。好ましくは、こうしたプライマーは、少なくとも１２個の連続したヌクレオチド、より好ましくは１２〜５０個の連続したヌクレオチド、最も好ましくは１８〜３０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。一般に、そのようなオリゴヌクレオチドは、内部二次構造を持たず、４０〜６０％のＧ／Ｃ含量を有し、Ｇ／Ｃ及びＡ／Ｔに富んだドメインのバランスのとれた分布を示す。オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションの手順において用いる場合、配列の長さと共に好ましさが増す。従って、３００個を超える連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは２００個を超える連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドよりも好ましく、後者は１００個を超える連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドよりも好ましい。１００個を超える連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは５０個を超える連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドよりも好ましく、後者は２０〜５０個の連続したヌクレオチドのオリゴヌクレオチドよりも好ましい。

本発明の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列の一部分に対して相補性であるオリゴヌクレオチドも包含される。そのようなオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）として機能することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的となるｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに結合してその翻訳又は転写を阻害する。５〜７０個の連続したヌクレオチドの配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５〜１００個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも好ましい。より好ましくは、５〜５０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。さらにより好ましくは、５〜３０個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾することによって血中における安定性、消化管における分解に対する抵抗性もしくは吸収又は膜透過性を高めることができる。リン酸結合の修飾としては、１つ以上の結合のリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、非リン酸結合又はホスホノチオネート結合への変換が挙げられる。リボースは２’フルオロリボース又は２’Ｏ−メチルリボースへ変換することができる。修飾ヌクレオチド塩基としては、５−プロピニルウラシル及び２−アミノアデニンが挙げられる。一般に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡに干渉することができる長さ１０〜２５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）である（Ｂａｓｓ（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒほか（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８）。アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、ｓｉＲＮＡも化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができる。最近報告された一本鎖ｓｉＲＮＡもここに包含される（Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．ほか（２０１２年）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４；Ｙｕ，Ｄ．ほか（２０１２年）Ｃｅｌｌ １５０：８９５−９０８）。

具体的な実施態様では、ハイブリダイゼーションの手順において用いる本発明のオリゴヌクレオチド（即ち、オリゴヌクレオチドプローブとして）は、両融合相手由来、即ち、ＦＧＦＲ２由来及びＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬ由来の配列からなる領域に対して相補性である。より具体的な実施態様では、それは、融合点を含む領域に対して相補性である。別の具体的な実施態様では、本発明のポリヌクレオチド又はその一部の増幅に用いるプライマー対の一方はプライマーＦＧＦＲ２配列と同一又は相補性であるのに対し、他方のプライマーはＶＣＬ又はＣＣＤＣ１４７配列と同一又は相補性である。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチドの任意の一部に結合する抗体及び抗原結合断片に関する。本発明はいかなる特定の種類の抗体にも限定されない。本発明の抗体は、任意の哺乳動物源の、ポリクロナール又はモノクロナールな任意の抗体とすることができる。哺乳動物モノクロナール抗体、例えば、マウスモノクロナール抗体、の製造方法は、かなり以前から確立され、当業者により広く実施されている（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６）。ヒト対象への投与のための好ましい抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体である。これらは、例えば、マウスなどの哺乳動物由来の抗体とは対照的にヒト宿主免疫反応を誘発しないか誘発しにくいので、好ましい。ヒトの定常領域及び哺乳動物由来の可変領域を含むキメラ抗体の調製方法は当該分野では周知されている（Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．ほか「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １９９０年）」ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ．から英国で出版）。ヒト化抗体も同じである（特許公報：欧州特許出願公開第１２５０２３号、国際公開第９８／１３３８８号、欧州特許出願公開第２３９４００号、国際公開第９６／０２５７６号）。ヒト抗体鋳型遺伝子中に動物抗体由来相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）の配列を導入することによりヒト化抗体を直接製造する技術も報告されている。ヒト抗体を得るための公知の方法がいくつか存在する。ヒトモノクロナール抗体は、ヒトリンパ球を生体外で免疫化した後、ヒトリンパ芽球細胞株と融合させることによって製造することができる。抗体は、次に、得られた融合細胞からバイオテクノロジー手法によって産生させることができる（Ｂｏｒｒｅｂａｅｋほか（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３９９５−９）。また、ヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子の全レパートリーを有する遺伝子導入動物の免疫化から得ることができる（国際公開第２００３／１２２２７号、第９２／０３９１８号、第９４／０２６０２号、第９４／２５５８５号、第９６／３４０９６号及び第９６／３３７３５号）。別の方法では、本発明の融合ポリペプチドに対する抗体を発現するヒトＢ細胞をフローサイトメトリーなどの適切な方法を用いて選択することができる。次いで、この抗体のヌクレオチド配列を決定することができる（Ｊｉｎほか（２００９年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５：１０８８−９２；Ｓｃｈｅｉｄほか（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ ４５８：６３６−４０；Ｗｒａｍｍｅｒｔほか（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ ４５３：６６７−７２；Ｔｉｌｌｅｒほか（２００８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３２９：１１２−２４）。その後、この情報を用いて上記抗体をコードするＤＮＡ配列を得、適切な発現ベクターを構築し、この抗体をバイオテクノロジー手法によって製造することができる（国際公開第９２／０１０４７号、第９２／２０７９１号、第９３／０６２１３号、第９３／１１２３６号、第９３／１９１７２号、第９５／０１４３８号及び第９５／１５３８８号）。別の方法は、ヒト抗体のファージディスプレイライブラリのパニングを行うものであり、このライブラリでは一本鎖ヒト抗体（ヒトｓｃＦｖ）がバクテリオファージの表面にディスプレーされる。選択されたｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列の決定後、完全な抗体遺伝子を構築し、適切な産生細胞中で発現させることができる（国際公開第９２／０１０４７号、第９２／２０７９１号、第９３／０６２１３号、第９３／１１２３６号、第９３／１９１７２号、第９５／０１４３８号及び第９５／１５３８８号）。

本発明の抗体としては、ＩｇＧで表されるような２価抗体及びＩｇＭで表されるような１価抗体が挙げられる。２種の異なる抗原に結合する二重特異性抗体も包含される。また、抗体と毒性のある産物又はポリペプチドとのキメラも包含される。また、本発明の抗体としては、ミニボディなどの抗原結合断片も挙げられる。ミニボディは、通常６つのＣＤＲ配列を含む、抗体の一部分のみを含む。ミニボディの具体例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ダイアボディ及びｓｃ（Ｆｖ）２（一本鎖（Ｆｖ）２）並びにこれらの多量体が挙げられる。抗原結合分子断片の製造については、Ｃｏほか（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９６８−７６；Ｂｅｔｔｅｒ及びＨｏｒｗｉｔｚ（１９８９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ及びＳｋｅｒｒａ（１９８９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６；Ｌａｍｏｙｉ（１９８９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：６５２−６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘほか（１９８９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：６６３−６９；Ｂｉｒｄほか（１９９１年）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：１３２−７を参照されたい。ダイアボディについては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒほか（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８；特許公報：欧州特許出願公開第４０４，０９７号及び国際公開第９３／１１１６１号を参照されたい。ｓｃＦｖ抗体については、Ｈｕｓｔｏｎほか、（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３；Ｐｌｉｃｋｔｈｕｎ「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」１１３巻、Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、３５２６９−３１５頁（１９９４年）を参照されたい。Ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨ及び２つのＶＬをリンカーなどを用いて連結させることによって得られる一本鎖ミニボディである（Ｈｕｓｔｏｎほか（１９９９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１７７−８９）。また、本発明の抗体を細胞毒性薬に、例えば、リンカーを介して連結させた抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）も包含される。

具体的な実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、両融合相手由来、即ち、ＦＧＦＲ２由来及びＣＣＤＣ１４７又はＶＣＬ由来の配列からなるエピトープに結合する。別の具体的な実施態様では、これらは融合点を含むエピトープに結合する。

さらに、本発明は、患部組織が本発明の融合ポリペプチドを発現している、特に癌を含む疾患又は状態の治療に関する。治療は、治療的有効量の活性薬剤の投与計画を含むことができる。活性薬剤は、本発明の融合ポリペプチドに結合する抗体もしくは抗原結合断片、融合ポリペプチドのｍＲＮＡ（もしくは遺伝子）に向けられたアンチセンスＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ分子又はこの融合ポリペプチドのキナーゼ活性の阻害剤とすることができる。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチドに結合する抗体又は抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。例えば、抗ＦＧＦＲ２抗体としては、ＢＡＹ１１７９４７０（Ｋｏｐｉｔｚ，Ｃ．ほか（２０１４年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４（補遺１９）７４４５−Ａｂｓｔｒａｃｔ ＤＤＴ０２−０１）及びＦＰＡ１４４（Ｇｅｍｏ ＡＴ．ほか（２０１４年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（補遺１９）−Ａｂｓｔｒａｃｔ ５４４６）が挙げられる。ＦＧＦＲ２を標的としたＡＤＣとしては、ＢＡＹ１１８７９８２（Ｓｏｍｍｅｒ Ａ．ほか（２０１４年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（補遺１９）−Ａｂｓｔｒａｃｔ ４４９１）が挙げられる。後者の組成物は優先的に全身性に投与されることになるが、経鼻、経肺又は経皮送達も想定されている。上記医薬組成物は、任意の通常の毒性のない医薬用として許容可能な担体、佐剤又はビヒクルを含むことができる。場合によっては、製剤のｐＨを医薬用として許容可能な酸、塩基又は緩衝剤で調整することにより製剤化薬剤又はその送達形態の安定性を高めることができる。本明細書に用いている全身性という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入法を含む。

注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁剤は、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて既知の技術によって処方することができる。また、滅菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液のように、毒性のない全身性投与用に許容可能な希釈剤又は溶剤を用いた滅菌注射用液剤、懸濁剤又は乳剤とすることができる。用いることができる上記許容可能なビヒクル又は溶剤には水、リンゲル液Ｕ．Ｓ．Ｐ及び生理食塩液がある。さらに、滅菌不揮発性油が溶剤もしくは懸濁化媒体として従来から用いられている。このために、合成モノ−もしくはジ−グリセリドなどの無刺激不揮発性油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射剤の調製に用いられる。注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介したろ過により、又は使用の前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体に溶解又は分散させることができる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を添合することにより滅菌することができる。

抗原結合分子を含む医薬用組成物の用量は、例えば、１回の投与当たり０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇとすることができる。或いは、その累積用量は、例えば、１対象当たり０．００１〜１００，０００ｍｇとすることができる。しかしながら、本発明は、上記の数値によって限定されない。その用量及び投与方法は、対象の体重、年齢、症状などによって異なる。当業者は上記の因子を考慮して適切な用量及び投与方法を設定することができる。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに向けられたアンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物に関する。具体的な実施態様では、アンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子は、両方の融合相手由来、即ち、ＦＧＦＲ２由来及びＣＣＤＣ１４７もしくはＶＣＬ由来の配列からなる配列に、又はさらに特異的に融合点を含む配列に向けられている。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物については、例えば、欧州特許第１１４４６２３号及び１２１４９４５号並びに米国特許第８’５４６’１４３号に記載されている。同じ原理が、アンチセンスＲＮＡ又は最近になって発見された一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓ ｓＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｓｉＲＮＡ）にも関係するように採用されている（Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｒ．ほか（２００８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：４１５８−７１；Ｌｉｍａほか（２０１２年）；Ｙｕほか（２０１２年））。

ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣及び局所（口腔及び舌下）投与を含む経口又は全身性経路を含むが、これらに限定されない、当該分野で既知の任意の手段によって投与することができる。好ましい実施態様では、上記医薬組成物は、静脈内又は腹腔内注入又は注射によって投与する。

経口投与の場合、上記のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、通常、錠剤もしくはカプセル剤、散剤もしくは顆粒剤又は水溶液もしくは懸濁液とすることになる。経口用の錠剤は、医薬用として許容可能な不活性希釈剤などの賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤及び防腐剤と混合した有効成分を含むことができる。好適な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム並びにラクトースが挙げられ、トウモロコシデンプン及びアルギン酸は好適な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンを挙げることができ、滑沢剤は、もし存在させる場合、通常、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクとすることになる。必要に応じて、錠剤は、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの物質でコーティングして胃腸管における吸収を遅らせることができる。経口用のカプセル剤としては、有効成分を固体希釈剤と混合させた硬質ゼラチンカプセル及び有効成分を水又はピーナッツ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などの油類と混合させた軟ゼラチンカプセルが挙げられる。

筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内使用の場合、上記のｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、通常、適切なｐＨ及び等張性に緩衝した滅菌水性溶液又は懸濁液とすることになる。好適な水性ビヒクルとしては、リンゲル液及び等張食塩水が挙げられる。好ましい実施態様では、上記担体はもっぱら水性緩衝液からなる。これに関連して、「もっぱら」とは、目的とする遺伝子を発現する細胞においてｄｓＲＮＡの取り込みに影響し、又はこれを媒介する恐れのある助剤又は封入物質が存在しないことを意味する。培養細胞中にｄｓＲＮＡを効率的に導入するのに顕微注入、リポ移入、ウイルス、ウイロイド、カプシド、カプソイド又は他の助剤が必要とされる可能性があるが、生体内におけるｄｓＲＮＡの取り込みにはこれらの方法及び作用物質は必要とされない。アンチセンスＲＮＡ及びｓｓ ｓｉＲＮＡも同じであることが認められている（Ｊｕｌｉａｎｏほか（２００８年）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．及びＭｏｎｔｅｙｓ，Ａ．Ｍ．（２０１２年）Ｃｅｌｌ １５０：８７３−５）。

水性懸濁液の形態でｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及びトラガカントゴムなどの懸濁化剤並びにレシチンなどの湿潤剤を含むことができる。水性懸濁液のための防腐剤としては、エチル及びｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。

また、ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物としては、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤などの、身体からの迅速な除去に対してｄｓＲＮＡを保護するカプセル剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者には明らかであろう。好適なポリマー材料は、例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から得ることができる。また、リポソーム懸濁液も医薬用として許容可能な担体として用いることができる。こうした懸濁液は、例えば、全文引用により本明細書に組み込まれている米国特許第４，５２２，８１１号、国際公開第９１／０６３０９号及び欧州特許出願公開第４３０７５号に記載されている、当業者には既知の方法に従って調製することができる。

さらに、本発明は、本発明の融合ポリペプチドのＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性の阻害剤を含む医薬組成物に関する。ＦＧＦＲキナーゼ活性の任意の阻害剤を用いることができる。阻害剤としては、国際公開第２０１１／０１６５２８号に記載されている阻害性アミノピラゾール誘導体及びその医薬用として許容可能な塩、特に５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンヅイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン（ＣＡＳ １２６５２２９−２５−１、本明細書では化合物Ａと称す）が挙げられる。さらに、阻害剤として、ＰＤ１７３０７４（Ｍｏｈａｍｍａｄｉほか（１９９８年）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：５８９６−９０４）、パゾパニブ（Ｈａｒｒｉｓほか（２００９年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１：４６３２−４０；Ｋｅｉｓｎｅｒ及びＳｈａｈ（２０１１年）Ｄｒｕｇｓ ７１：４４３−５４）、ＡＺＤ４５４７（Ｇａｖｉｎｅほか（２０１２年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２：２０４５−５６）、ポナチニブ（もしくはＡＰ２４５３４）（Ｈｕａｎｇほか（２０１０年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５３：４７０１−１９）、ドビチニブ（Ｔｒｕｄｅｌほか（２００５年）Ｂｌｏｏｄ １０５：２９４１−８；Ｍａｎほか（２０１４年）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１８：１４３−５５）、ＢＧＪ３９８（Ｇｕａｇｎａｎｏほか（２０１１年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５４：７０６６−８３）、ルシタニブ（Ｌｕｃｉｔａｎｉｂ）としても知られるＥ−３８１０（Ｂｅｌｌｏほか（２０１１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：１３９６−４０５）、ＪＮＪ−４２７５６４９３（Ｓｑｕｉｒｅｓほか（２００８年）ＡＡＣＲ Ａｂｓｔｒａｃｔ １５４５）、ＡＲＱ０８７（Ｙｕほか（２０１１年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１（補遺１）３６７１）、ＬＹ２８７４４５５（Ｚｈａｏ ＧほかＭｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２０１１年）１１月号：１０（１１）：２２００−１０）、ＢＡＹ１１６３８７７（Ｈｅｒｏｕｌｔほか（２０１４年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７４（補遺１９）−Ａｂｓｔｒａｃｔ １７３９）、ＡＳＰ５８７８（日本癌学会第７３回年次大会（７３ｒｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（２０１４年）−アブストラクト／ポスター１４１１）、Ｅ７０９０（渡辺（宮野）沙里（Ｓａｏｒｉ Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍｉｙａｎｏ）ほか（２０１５年）ＡＡＣＲ Ａｂｓｔｒａｃｔ ７７０）、ＯＤＭ−２０３（Ｈｏｌｍｓｔｒｏｅｍ Ｔほか、２６ｔｈ ＥＮＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（２０１４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０（Ｓ６）：１４２−Ａｂｓｔｒａｃｔ ４３２）、ニンテダニブ（Ｒｏｔｈ ＧＪほか、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１５年）２月１２日号５８（３）：１０５３−６３）、ＴＡＳ−１２０（落岩（Ｏｃｈｉｉｗａ）・Ｈ．ほか（２０１３年）ＡＡＣＲ、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．１２（１１補遺）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ２７０）並びにＰＲＮ１１０９及びＰＲＮ１３７１（両剤共、Ｐｈａｎ ＶＴ．ほか、２６ｔｈ ＥＮＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（２０１４年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５０（Ｓ６）：１５７−Ａｂｓｔｒａｃｔ ４８３）が挙げられる。

特に好ましい阻害剤は化合物Ａである。

ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性の阻害剤（以下では「医薬」と称することもある）を含む本発明の医薬組成物は、経口的に、全身性に、吸入噴霧により、局所的に、直腸内に、鼻腔内に、舌下に、膣内に又は埋め込みリザーバにより投与、好ましくは経口投与又は注射により投与することができる。こうした医薬組成物は、任意の従来の毒性のない医薬用として許容可能な担体、佐剤又はビヒクルを含むことができる。場合によっては、上記製剤のｐＨを医薬用として許容可能な酸、塩基又は緩衝剤で調整することにより製剤化化合物又はその送達形態の安定性を高めることができる。本明細書に用いている全身性という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入法を含む。

経口投与用液状剤型としては、医薬用として許容可能な乳濁液、微細乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。医薬に加えて、液状剤型は、当該分野でよく用いられる不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル及びにこれらの混合物などの溶解補助剤並びに乳化剤を含むことができる。不活性希釈剤の他に、上記経口用組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤などの佐剤、甘味剤、矯味矯臭剤並びに芳香剤も含むことができる。

注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁剤は、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて既知の技術に従い処方することができる。また、上記滅菌注射用製剤は、例えば、ブタンジオールの溶液のような、毒性のない全身性投与に許容可能な希釈剤又は溶剤を用いた滅菌注射用液剤、懸濁剤又は乳剤とすることができる。使用できる許容可能なビヒクル及び溶剤にはリンゲル液Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張食塩水がある。さらに、滅菌不揮発性油は、従来から溶剤又は懸濁化媒体として用いられている。このために、合成モノ−もしくはジ−グリセリドなどの無刺激不揮発性油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射剤の調製に用いられる。

注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介したろ過により、又は使用の前に滅菌水又は他の滅菌注射用媒体に溶解又は分散させることができる滅菌固体組成物の形態で医薬を添合することにより滅菌することができる。

医薬の効果を延長させるために、皮下又は筋肉内注射後の医薬の吸収を遅くすることがしばしば望まれる。これは、水に難溶性の結晶性又は無形性物質の液体懸濁液を用いることで成し遂げることができる。そのとき、医薬の吸収速度は、その溶解速度によって決まり、これは結晶の大きさ及び結晶形態によって決まる可能性がある。或いは、全身性に投与した薬剤型態の吸収の遅延はその医薬を油状ビヒクルに溶解又は懸濁することで成し遂げられる。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に医薬のマイクロカプセルマトリックスを形成させることにより作製される。ポリマーに対する医薬の比率及び用いる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。また、注射用デポー製剤は、体内組織に適合するリポソームまたは微細乳濁液中に医薬を閉じ込めることによっても調製される。

直腸または膣内投与用の組成物は、カカオバター、ポリエチレングリコール又は坐剤用ワックスなどの、室温では固体であるが体温では液体であるために、直腸腔内または膣腔内で融解して活性化合物を放出する、非刺激性の適切な賦形剤又は担体と医薬とを混合することによって調製することができる坐剤であることが好ましい。

経口投与用の固形剤型としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。そのような固形剤型では、医薬は、少なくとも１種の不活性な、医薬用として許容可能な賦形剤又は担体、例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム及び／又はａ）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアラビアゴム、ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、ｆ）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、ｈ）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土及び／又はｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びこれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、剤型は、緩衝剤も含むことができる。

また、類似のタイプの固体組成物は、例えば、ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟ゼラチンカプセル及び硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることができる。

錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固形剤型は、腸溶性コーティング及び医薬製剤分野においてよく知られている他のコーティングなどのコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらは、必要に応じて乳白剤を含むことができ、また、これらが有効成分（単数又は複数）を、単独に又は優先的に、腸管の特定の部分に、必要に応じて遅延された方式で放出する組成物とすることもできる。用いることができる包埋組成物としては、例えば、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。

医薬の局所又は経皮投与のための剤型としては、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤又は貼布剤が挙げられる。医薬は、医薬用として許容可能な担体及び、必要に応じて任意の必要とされる防腐剤又は緩衝剤と滅菌条件下で混合する。眼用製剤、点耳剤、眼軟膏剤、散剤及び液剤も本発明の範囲内にあると想定されている。

軟膏剤、ペースト、クリーム剤及びゲル剤は、医薬のほかに、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、でんぷん、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛又はこれらの混合物などの賦形剤を含むことができる。

散剤及びスプレー剤は、医薬のほかに、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末又はこれらの物質の混合物などの賦形剤を含むことができる。スプレー剤は、さらに、クロロフルオロ炭化水素などの通例の高圧ガス又はヒドロフルオロアルカン、Ｃ３−Ｃ６軽質飽和炭化水素、ジメチルエーテルなどの環境により優しい高圧ガスを含むことができる。

経皮貼布剤には、医薬の体への制御された送達をもたらす追加の利点がある。そのような剤型は、医薬を適切な媒体に溶解又は調合することによって作製することができる。また、吸収促進剤を用いて医薬が皮膚を通過する流れを高めることもできる。その速度は、速度制御膜を設けるか、その化合物をポリマーマトリクス又はゲル中に分散させることによって制御することができる。

肺送達の場合、本発明の医薬組成物を製剤化し、患者に対し、固体又は液体粒子の形態で直接投与、例えば、吸入により呼吸器系に投与する。本発明を実施するために調製された医薬の固体又は液体粒子形態は、呼吸域の粒子、即ち、吸入により口及び喉頭を通り、肺の気管支及び肺胞に入るのに十分小さなサイズの粒子を含む。エアロゾル化された治療剤、特にエアロゾル化抗生物質の送達については当該分野で既知である（例えば、ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒほかの米国特許第５，７６７，０６８号、Ｓｍｉｔｈほかの米国特許第５，５０８，２６９号及び国際公開第９８／４３６５０号参照。これらは全て引用により本明細書に組み込まれている。）。また、抗生物質の肺送達についての検討は、引用により本明細書に組み込まれている米国特許第６，０１４，９６９号に見られる。

全体として、本発明による治療計画は、そのような治療を必要としているヒト対象に１日当たり０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇの医薬（即ち、ＦＧＦＲチロシンキナーゼ活性の阻害剤）を１回又は複数回用量で投与することを含む。１回用量の組成物は１日用量を構成するためにそのような量又はその約数を含むことができる。

例えば、上記医薬は、４〜１２０時間ごとに、又はその特定の医薬の必要量に応じて、注射により、又は静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内もしくは皮下に、又は経口的、口腔内、鼻腔内、経粘膜的、点眼剤では局所的に、又は吸入により投与することができる。本明細書の方法は、有効量の医薬又はその医薬を含む医薬組成物を投与して所望の、又は謳われている効果を達成することを想定している。一般に、この医薬組成物は、１日１〜６回或いは持続注入で投与されることになる。そのような投与は、長期又は救急治療として行うことができる。医薬用として許容可能な賦形剤又は担体と組み合わせて単回投与形態とすることができる医薬の量は、特定の投与様式によって、或いは治療する対象によって異なることになる。標準的な製剤は医薬を５〜９５（ｗ／ｗ）％含むことになる。或いは、そのような製剤は医薬を２０（ｗ／ｗ）％〜９５（ｗ／ｗ）％含むことができる。上記の用量より低いか高い用量が必要なことがある。任意の特定対象のための具体的な投与及び治療計画は、使用する具体的な医薬の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性、食習慣、投与時期、排泄速度、薬剤併用、疾患、状態又は症状の重症度及び経過、対象のその疾患、状態又は症状に罹患しやすい素質、及び治療する医師の判断を含む種々の因子によって決まることになる。

また、本発明は、ヒト又は動物の対象からの試料、例えば、腫瘍組織、正常組織及び癌もしくは正常細胞又は腫瘍循環ＤＮＡを含む種々の体液標本（血液、血清、尿、唾液など）において本発明の融合ポリペプチド又はこの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法に関する。

一般に、本発明の融合ポリペプチドは、上記対象からの試料を上記抗体又は抗原結合断片の１つと接触させ、次いで、反応生成物の有無を検出することによって検出することができる。この反応生成物を検出する工程は、任意の適切な免疫アッセイ法を用いて実施することができる。

本発明に従って行う免疫アッセイ法は、均一アッセイ法又は不均一アッセイ法とすることができる。均一アッセイ法では、免疫学的反応は、通常、上記特異的融合ポリペプチド抗体又は抗原結合断片、標識被分析物及び対象とする試料を必要とする。この標識から発生するシグナルは、標識被分析物への上記抗体／抗原結合断片の結合時に、直接的又は間接的に修飾される。上記免疫学的反応及びその程度の検出は、共に均一溶液中で行うことができる。用いることができる免疫化学的標識としては、フリーラジカル、放射性同位体、蛍光色素、バクテリオファージ又は補酵素が挙げられる。

不均一アッセイ法では、反応物は、通常、上記試料、上記抗体／抗原結合断片及び検出可能シグナルをもたらす手段である。上述のような試料を用いることができる。その抗体／抗原結合断片は、（プロテインＡアガロース、プロテインＧアガロース、ラテックス、ポリスチレン、磁性もしくは常磁性ビーズなどの）ビーズ、プレート又はスライドなどの支持体上に固定化し、液相にその抗原を含む疑いのある標本と接触させることができる。次いで、この支持体を液相から分離し、支持体相又は液体相をそのようなシグナルをもたらす手段を用いて検出可能シグナルについて調べる。このシグナルは、試料中の被分析物の存在に関係づけられる。検出可能シグナルをもたらす手段としては、放射性標識、蛍光標識又は酵素標識の使用が挙げられる。例えば、検出対象の抗原が第二の結合部位を含む場合、その部位に結合する抗体を検出可能な基に結合させ、分離工程の前に液相反応溶液に添加することができる。上記固体支持体上のこの検出可能な基の存在は、上記試験試料中にその抗原が存在することを示している。適切な免疫アッセイ法の例としては、免疫ブロット法、免疫沈降法、免疫蛍光測定法、化学発光法、電気化学発光法又は酵素結合免疫アッセイ法がある。

当業者であれば、本明細書に開示した方法を実施するのに有用であり得る数多くの具体的な免疫アッセイフォーマット及びそれらの変形に精通しているであろう。一般的には、Ｅ．Ｍａｇｇｉｏ、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（１９８０年）（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、フロリダ州）を参照されたい。また、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」という名称のＳｋｏｌｄほかの米国特許第４，７２７，０２２号、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｓ」という名称のＦｏｒｒｅｓｔほかの米国特許第４，６５９，６７８号、「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称のＤａｖｉｄほかの米国特許第４，３７６，１１０号、「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｓｓａｙｓ」という名称のＬｉｔｍａｎほかの米国特許第４，２７５，１４９号、「Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ」という名称のＭａｇｇｉｏほかの米国特許第４，２３３，４０２号及び「Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ ａｓ Ｌａｂｅｌ」という名称のＢｏｇｕｓｌａｓｋｉほかの米国特許第４，２３０，７９７号についても参照されたい。

抗体は、受動的結合などの既知の技術に従って診断アッセイに適した固体支持体（例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧアガロースなどのビーズ、ミクロスフェア、プレート、又はラテックスもしくはポリスチレンなどの材料で形成されたウェル）に結合させることができる。本明細書に記載の抗体は、さらに、既知の技術に従って放射性標識（例えば、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファダーゼ）及び蛍光標識（例えば、フルオレセイン、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、緑色蛍光タンパク質）などの検出可能な標識又は基に結合させることができる。

対象からの試料における本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子又はｍＲＮＡの有無は、例えば、対象から採集した試料（腫瘍組織、正常組織及び癌もしくは正常細胞又は循環核酸を含む各種体液標本（血液、血清、尿、唾液など））において本発明の上記各種オリゴヌクレオチド（一対のオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブなど）並びにｍＲＮＡ、ｍＲＮＡを鋳型として作製したｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを用いる従来の方法によって調べ、明らかにすることができる。そのような遺伝子分析法としては、例えば、ノーザンブロット法及び下記に挙げる数多くの方法が挙げられる：

（１）ポリヌクレオチド利用の検出方法（即ち、米国特許第５，３１０，６２５号、第５，３２２，７７０号、第５，５６１，０５８号、第５，６４１，８６４号及び第５，６９３，５１７号参照；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ、Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ及びＪ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ編、「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（１９９５年）、５８−６８頁、中に掲載のＭｙｅｒｓ及びＳｉｇｕａ、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ：Ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」も参照。ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ （ｉ．ｅ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｂｙ ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、（フォスターシティ、カリフォルニア州）；Ｓａｎｇｅｒほか（１９７７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７参照）。

（２）増幅に基づいた同定方法（即ち、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号；「ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９９年）Ｉｎｎｉｓほか編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ； 「ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」（１９９５年）、Ｉｎｎｉｓほか編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（１９９０年）Ｉｎｎｉｓほか編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ；及び「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９８９年）Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州参照）。

（３）リガーゼ連鎖反応（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ（１９８８年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９；ｔｈｅ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ（Ｗａｌｋｅｒほか（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：１６９１−１６９６；及び米国特許第５，４５５，１６６号）；並びに米国特許第５，４３７，９９０号、第５，４０９，８１８号及び第５，３９９，４９１号に記載の方法を含むいくつかの転写利用の増幅システム；転写増幅システム（ＴＡＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｋｗｏｈほか（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）；並びに自家持続配列複製法（３ＳＲ：ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕｅｔｅｌｌｉほか（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８及び国際公開第１９９２／０８８００号）。

（４）配列特異的増幅又はプライマー伸長法（即ち、米国特許第５，１３７，８０６号、５，５９５，８９０号、５，６３９，６１１号及び４，８５１，３３１号）。

（５）動的ＰＣＲ法（即ち、樋口ほか（１９９２年）バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１０：４１３−４１７；樋口ほか（１９９３年）バイオ／テクノロジー１１：１０２６−１０３０；樋口及びＷａｔｓｏｎ、「ＰＣＲの応用」、上記文献第１６章；米国特許第５，９９４，０５６号；欧州特許出願公開第４８７，２１８号及び第５１２，３３４号）。

（６）相補性の程度が異なる野生型遺伝子又は転写物及び融合遺伝子又は転写物間の融合領域におけるプローブ及び核酸配列間に形成されたハイブリダイゼーション二本鎖の安定性の差に依存するプローブ利用の方法（即ち、Ｃｏｎｎｅｒほか（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２７８−２８及び米国特許第５，４６８，６１３号、第５，６０４，０９９号、第５，３１０，８９３号、第５，４５１，５１２号、第５，４６８，６１３号及び第５，６０４，０９９号）。

（７）ｃＤＮＡライブラリの大規模並列配列決定に基づいた方法。例示的方法が実施例３の下に開示されている。

国際公開第０３／０４８３７７号において詳しく説明されているように、本発明の融合遺伝子の発現量は実時間ＰＣＲによって検出することが好ましい。

また、本発明は、本発明の融合ポリペプチド又はそのような融合ポリペプチドをコードする遺伝子及び転写物の存在を検出するためのキットをも包含する。本発明の検出キットは、本発明の融合ポリペプチドに結合する上述の抗体又は抗原結合断片を含むことができる。また、こうしたキットは上記の各免疫アッセイの目的に応じて、各種の検出試薬（酵素、基質など）及び取扱説明書を含むことができる。本発明の他の検出キットは、本発明の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、このｍＲＮＡを鋳型として作製されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズする本発明の上記各種オリゴヌクレオチド（一対のオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブなど）を含むことができる。こうしたキットは、さらに、用いる正確な遺伝子分析方法に応じて、各種試薬（酵素、他のオリゴヌクレオチド、核酸、反応緩衝液など）及び取扱説明書を含むことができる。

本発明の融合ポリペプチドの発見は、新規な診断及び治療方法の基礎となる。本発明の融合ポリペプチドは、癌増殖の駆動体として働くものと思われる。従って、対象から得られた生検もしくは流体材料中の本発明の融合ポリペプチドの存在又は本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはその転写物の存在は、その対象の癌増殖の発症に対する感受性又はその対象における癌増殖の未検出の存在に対する感受性の増大を示すものと思われる。従って、本発明は、対象の癌に対する感受性又は以前には未検出であった癌の存在を測定する方法であって、（ａ）組織試料又は流体試料（血液、血清、尿、唾液など）を得る工程、（ｂ）上記の方法及びキットを用いて対象の組織もしくは流体試料において本発明の融合ポリペプチドの存在又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を測定する工程、並びに（ｃ）上記融合ポリペプチド又はその融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の確実な確認に基づいて癌に対する感受性の増大又は癌の存在の可能性を明らかにする工程を含む方法も包含する。

対象からの腫瘍試料における本発明の融合ポリペプチド又は本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはその転写物の存在は、患者の腫瘍増殖が上記融合ポリペプチドのＦＧＦＲキナーゼ活性の効果的な阻害又はその融合ポリペプチドの除去をもたらす治療により阻害されることになることを示すものと思われる。従って、本発明は、個別的癌治療の方法であって、（ａ）癌に罹患しているか癌性腫瘍の可能性を示している対象から癌細胞を含む生検材料を採取する工程、（ｂ）本明細書に記載されている方法及びキットを用い、その生検材料中の細胞が本発明の融合ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはそのような遺伝子の転写物を含むか、又はその融合ポリペプチドを発現しているかどうかを測定する工程、（ｃ）生検材料が工程ｄの治療ために融合ポリペプチドの遺伝子を含むか発現することを明らかにできる可能性のある対象を選択する工程並びに（ｄ）選択した対象をＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物の投与を含む治療計画に付す工程を含む方法にも関する。或いは、上記医薬組成物は、上記融合ポリペプチドに結合する抗体又は抗原結合断片を含むことができ、その生化学的機能を阻害し、又はその排除（もしくは標的細胞全体の免疫系媒介性排除）をもたらす。さらに他の（工程ａ〜ｃを共有する）関連方法では、工程ｄは、上記融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを標的とし、その翻訳を阻害し、もしくは低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、又は上記融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに向けられ、このｍＲＮＡの切断及びその後の排除を引き起こすｓｉＲＮＡを含む医薬組成物の投与を含む。このような方法の具体的な実施態様では、上記抗体又は抗原結合断片は、両方の（即ち、ＦＧＦＲ２由来及びＣＣＤＣ１４７もしくはＶＣＬ由来の）融合相手からの配列を含む上記融合ポリペプチドの配列、又はさらに具体的には、上記融合点を含む配列を標的としている。そのような方法の他の具体的な実施態様では、上記ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、両方の（即ち、ＦＧＦＲ２由来及びＣＣＤＣ１４７もしくはＶＣＬ由来の）融合相手からの配列を含む上記融合ポリペプチドの配列、又はさらに具体的には、上記融合点を含む配列を標的としている。

本明細書で他に示さない限り、本明細書の値の範囲の列挙は、その範囲の範疇のそれぞれ別の値を個別に言及する手短な方法として役立つことを単に目的とし、それぞれ個々の値は、それが本明細書に個別に列挙されているが如く本明細書中に組み込まれている。特に断らない限り、本明細書に示した全ての正確な値は対応する近似値の代表的なものである（例えば、特定の因子又は測定に関して示された全ての正確な例示的値は、適切な場合、「約」によって修飾された対応する近似測定値をも示すと見なすことができる）。

本明細書で示す任意およびすべての実施例、または例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、単に本発明に対する理解を促すことを目的とするものであり、特に断らない限り、本発明の範囲に制限を課すわけではない。

本明細書における特許文献の引用及び援用は、便宜上のためにのみなされたものであり、このような特許文献の有効性、特許性、及び／又は法的強制力について見解を示すものではない。１つの要素又は諸要素への言及などの用語を用いた本発明の態様又は実施態様についての本明細書中の説明は、特に断らない限り、又は明らかに文脈と矛盾しない限り、その特定の要素又は諸要素「からなる」、「から本質的になる」又は「実質的に含む」本発明の類似の態様又は実施態様への支持を示すものである（例えば、特定の要素を含むものとして本明細書で説明した組成物は、特に断らない限り、又は明らかに文脈と矛盾しない限り、その特定の要素からなる組成物をも説明するものと理解するべきである）。

本発明は、準拠法の許す範囲で最大限に本明細書に提示した態様又は特許請求の範囲に記載の技術内容の修正及び均等物をすべて含む。

各個々の刊行物又は特許文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されたかのように、本明細書で引用した全ての刊行物および特許文献は、その全体が本明細書中に参考として援用されている。

これまで本発明について、理解し易くするために説明および実施例によって少し詳しく述べてきたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなくこれに特定の変更および修正をおこなうことができることは、本発明の教示内容からして当業者には容易に理解されよう。

実施例１：本発明の融合遺伝子の同定
（１）全ＲＮＡの抽出
Ｒｏｃｈｅの高純度ＦＦＰＥＴ ＲＮＡ単離キット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＦＦＰＥＴ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（製品番号０６６５０７７５００１）をメーカーの取扱説明書に従って用い、ヒト胆管癌の生検材料から得られたホルマリン固定パラフィン包埋組織からの厚さ１０μｍの２枚のマクロ切断切片から全ＲＮＡを抽出した。その手順には、ＳＤＳを補充したＲｏｃｈｅ自社開発のＲＮＡ組織溶解緩衝液を用いる脱パラフィン化組織の溶解及びプロテインキナーゼＫとのインキュベーションが含まれた。カオトロピック塩の存在下に、上記ＲＮＡをハイピュアフィルターチューブ（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｕｂｅ）のガラス繊維に特異的に結合させた。結合ＲＮＡは、ＤＮアーゼと共にインキュベーションし、一連の迅速な洗浄・脱水工程で精製した後、水に溶出させた。ＲＮＡ濃度は、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ ８１、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州０２４５４、米国）を用いて吸光度により測定した。

（２）ＤＮＡライブラリの調製
ＡｒｃｈｅｒＤｘ（現Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）により作製されたＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＦＧＦＲ融合検出（ＦＧＦＲ Ｆｕｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）キットを用い、５００ｎｇの投入ＲＮＡから始めてＤＮＡライブラリを調製した。この検出キットは、ＡＬＫ−、ＲＥＴ−及びＲＯＳ１−特異的プライマーをヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３に特異的なプライマーと交換する以外は、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により市販されているＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォームのＡｒｃｈｅｒ（商標）ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１融合検出ｖ１（製品番号ＡＫ０００１−８）と同様である。このＡｒｃｈｅｒＤＸ融合検出キットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、５２００ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｗａｙ 、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２２、米国）によるターゲットシーケンシングのためのライブラリを作成するためにアンカード・マルチプレックスＰＣＲ（ＡＭＰ：ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）（商標）及び温度安定性試薬を用いる。ライブラリは、メーカーの取扱説明書に従って調製した。

各バーコードを付したライブラリの濃度を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ番号ＫＫ４８２４用カッパ・バイオシステムズ・ライブラリ定量キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ウィルミントン、マサチューセッツ州）をメーカーの取扱説明書に従って用い、ＰＣＲにより測定した。バーコード付きライブラリを等モル濃度でプールし、各１０ｐＭでＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ卓上型シーケンサーにロードし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｖ２（３００サイクル）試薬キット（ＭＳ−１０２−２００２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州）及びＮｅｘｔｅｒａワークフローケミストリーを用いて配列決定を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａの１５％ＰｈｉＸコントロールｖ３（ＦＣ−１１０−３００１）をライブラリプールに１０ｐＭで添加して配列決定用対照とした。

（３）配列決定結果の解析
配列リードはカットアダプト（ｃｕｔａｄａｐｔ）を用いて３’末端でアダプター配列を除去した（Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．（２０１１年）ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ １７：１０−１２）。次いで、長さが２０ヌクレオチドを超えるリード配列を、ボウタイ（ｂｏｗｔｉｅ）（Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ほか（２００９年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：Ｒ２５）及びトップハット（ｔｏｐｈａｔ）（Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ほか、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５：１１０５−１１）を用いてヒトゲノム配列（ゲノム・リファレンス・コンソーシアム・ヒトゲノム・ビルド３７（ＧＲＣｈ３７：Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３７））上にマッピングした。２箇所を上回る領域に位置するリードは捨て、残りをＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子（Ｆｌｉｃｅｋ，．ほか（２０１４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：Ｄ７４９−５５、データベース版）にアノテーションした。

第二工程では、長さが７５ヌクレオチドを超えるマッピングされていないリードを同一の長さの３つの部分に分割し、左端及び右端部分を上記ゲノム上に上記と同じ方法を用いて別々にマッピングした後、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子にアノテーションした。

融合配列は、２つの異なる遺伝子（１つはＦＧＦＲ遺伝子である）上にマッピングされた（ペアエンドシーケンシングからの）両リードを有する配列、又は分割後の２つの異なる遺伝子（１つはＦＧＦＲ遺伝子である）にアノテーションされたマッピングされていないリード（単数又は複数）を有する配列であると確認された。各融合体のコンセンサス配列は、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ（Ｌａｒｋｉｎ，Ｍ．Ａ．ほか（２００７年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２３：２９４７−２９４８）を用いて融合配列からの全てのリードの多重アラインメントから生成された。（配列番号１及び２参照）

全てのデータ処理工程はＲ３．０．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）及びバイオコンダクター（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）パッケージ（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｃ．ほか（２００４年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：Ｒ８０）を用いて行った。

配列番号１及び２の融合遺伝子配列並びに配列番号３及び４の誘導ポリペプチド配列は上述した試行から得られたものである。後者のポリヌクレオチド配列に基づいて、実施例２で説明する特徴付け実験に用いたＰＣＲプライマーを設計した。

実施例２：本発明の融合遺伝子の特徴付け
ＲＮＡ試料（各７００ｎｇ）（実施例１のセクション（１）に記載した２つの腫瘍生検材料から調製）を６５℃で５分間変性させた後、ロシュ・トランスクリプター第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）（製品番号０４ ８９６ ８６６ ００１；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）を用い、最終容量を２０μＬとしてランダム６量体プライマーにより逆転写させた。逆転写は以下のサイクリング条件で実施した：２５℃１０分間、５５℃３０分間及び８５℃５分間。

ＰＣＲ増幅は、１０倍希釈ｃＤＮＡを２μＬ、各順方向及び逆方向プライマー（表１）を０．３μＭ並びにロッシュ・ファストスタートＰＣＲマスター（Ｒｏｃｈｅ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ）１×（製品番号０４ ７１０ ４４４ ００１；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＧ）を含む２０μＬの反応容量で実施した。サイクリング条件は以下の通りとした：９５℃で４分間１サイクルの後、９５℃で３０分間、５０℃で３０秒間及び７２℃で１分間４０サイクル及び７２℃で７分間１サイクル。ＰＣＲ産物は、ロンザ・フラッシュゲルＤＮＡカセット（Ｌｏｎｚａ ＦｌａｓｈＧｅｌ ＤＮＡ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）２．２％アガロースゲル（製品番号５７０３１；Ｌｏｎｚａ Ｌｔｄ．、Ｂａｓｅｌ、スイス）で分離した。

この解析の結果は、図１に示した染色前ゲルから収集することができる。上記２つの腫瘍生検材料のうちの１つから調製したｃＤＮＡの増幅により、上記２つの逆方向プライマーのどちらがＰＣＲに用いられるかによって、それぞれ、約８９及び１１４ｂｐの予測長さを有するＦＧＦＲ２−ＶＣＬ増幅産物が得られた。ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７増幅産物は検出されなかった。もう一方の腫瘍生検材料から調製したｃＤＮＡの増幅では、２つの逆方向プライマーのどちらがＰＣＲに用いられるかによって、それぞれ、約９３及び１３２ｂｐの予測長さを有するＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７増幅産物が得られた。ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ増幅産物は検出されなかった。増幅産物のアリコートを、キアゲン・ミンエルート（ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（２８００４）をメーカーの取扱説明書に従って用いて、精製し、Ｓａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒほか（１９７５年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．９４：４４１−８）を用いて配列決定した。結果は表２に示した。

プライマー対４２ａ／２０及び１６／２９（表１及び３参照）を用いたＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合遺伝子転写物の場合に（それぞれ、約４００及び３００ｂｐの）より大きなＰＣＲ増幅産物が得られた。これらの産物の配列はサンガー法を用いて決定した。決定したヌクレオチド配列は配列番号５として示した。誘導したポリペプチド断片の配列は配列番号６である。

実施例３：腫瘍生検材料においてＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７を検出するための診断方法
（１）生検試料及びＲＮＡ調製
先ず、当該分野でよく知られている方法を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋した固形腫瘍の臨床標本から１０ミクロンスライドを調製する。ヘマトキシリン及びエオシン染色後、組織の腫瘍部分をマクロ切断し、高純度ＦＦＰＥ ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号＃０６ ６５０ ７７５ ００１）をメーカーの取扱説明書に従って用いて全ＲＮＡ抽出に付す。ＲＮＡ量は、ナノドロップ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８１ Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ、、ウォルサム、マサチューセッツ州０２４５４、米国）を用いて評価する。

（２）配列決定
ＡｒｃｈｅｒＤＸ ＮＧＳライブラリ調製キット（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｓｕｉｔｅ ４０７Ｊ、１００ Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州０１９１０、米国）をメーカーの取扱説明書に従って用いて５００ｎｇの全ＲＮＡから１００〜３００ｂｐ配列からなるＦＧＦＲ２を標的とするｃＤＮＡライブラリを調製する。基本的には、野生型ＦＧＦＲ２に特異的なプライマーを用いて対応する配列を含むＲＮＡ配列を選択する。こうしたライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、５２００ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｗａｙ、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２２、米国）をメーカーの取扱説明書に従って用いて５０〜１５０ｂｐのペアエンドシーケンシングに供する。

（３）ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子の検出
得られたリードをＦＧＦＲ２転写物の既知の部分配列（そのチロシンキナーゼドメインの３’末端で始まり、転写物の３’末端で終わる）とアラインメントさせる。そのような部分配列は、配列番号６４〜６７及び７２で示される。ＢＬＡＳＴなどの配列アラインメントソフトウェアを用いることができる。アラインメント長さは、１８に等しいかそれ以上とする必要がある。得られるアラインメントが相補鎖に対するものである場合は、そのリードの相補配列は、最初のリードではなく更なる解析について考慮する必要がある。

上記ＦＧＦＲ２の部分配列にマッチしないリードは捨てるべきである。リードがどのＦＧＦＲ２部分配列にもマッチしない場合、融合の検出は不確かであると見なされるべきである。

ＦＧＦＲ２部分配列との各アラインメントについて、このアラインメントの３’末端に対応するリードのヌクレオチド位置をＮと名付ける。次いで、位置Ｎ＋１〜Ｎ＋１８に対応するリードの部分配列を抽出する。リードがこの部分配列を含まない場合、このアラインメントは捨てる。次に、位置Ｎ＋１〜Ｎ＋１８に対応する１８塩基の部分配列を、開始コドンで始まり、最も遠位のオリゴマー形成ドメインをコードする配列の初めで終わるＶＣＬ及びＣＣＤＣ１４７転写物の部分配列とアラインメントさせる。そのような部分配列は配列番号６８〜７１で示される。

ＶＣＬ又はＣＣＤＣ１４７転写物の部分配列に対して位置Ｎ＋１〜Ｎ＋１８に相当する１８−塩基のストレッチにわたり５箇所以下のミスマッチ、好ましくは３〜４箇所以下のミスマッチ、より好ましくは１〜２箇所以下のミスマッチを有する、最も好ましくはミスマッチを有しないリードが確認されれば、腫瘍標本は、それぞれ、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ又はＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子について陽性であると見なされる。どのリードについてもそのようなアラインメントが認められない場合には、その腫瘍標本はＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子について陰性であると見なされる。

実施例４：生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）発癌性
（１）融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞プールの確立
ｐＥｘｏＩＮ２をベースとした発現プラスミドＥｘｏＩＮ２−ＦＧＦＲ２＿ＣＣＤＣ１４７及びｐＥｘｏＩＮ２−ＦＧＦＲ２＿ＶＣＬを用いて、それぞれ、ＦＧＦＲ２＿ＣＣＤＣ１４７融合体又はＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合体を安定的に発現する安定Ｒａｔ２細胞プールを作製した。ｐＥｘｏＩＮ２はＴｒｅｎｚｙｍｅ（ドイツ）から入手した。後者の発現プラスミドは電気穿孔法（ＬＯＮＺＡヌクレオフェクタ−ＩＩデバイス（ＬＯＮＺＡ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ）／プログラム［Ｘ−００５］、溶液Ｒ）によってＲａｔ２細胞に導入した。形質導入後２４時間に、安定な発現細胞プールを得るために１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを細胞に作用させた。本実施例に用いたＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７配列は、ＦＧＦＲ２部分の配列番号１６（核酸番号１〜２５７４）及びＣＣＤＣ１４７部分の配列番号２０（核酸番号１５６〜核酸番号３３１３）で構成された。使用したＦＧＦＲ２−ＶＣＬ配列は、ＦＧＦＲ２部分の配列番号１６（核酸番号１〜２５７４）及びＶＣＬ部分の配列番号１８（核酸番号２１１７〜核酸番号５４８２）で構成された。

（２）安定な発現細胞プールの足場非依存性増殖特性の評価
単一細胞懸濁液をアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いて調製し、選択用抗生物質を含まない０．４％軟寒天上層中６ウェル皿に適切な細胞数を播種する（播種密度（ウェル当たり細胞数）：１０，０００、３，０００、１，０００、３００、１００及び３０）。コロニー形成のために、皿を５％ＣＯ_２環境中、３７℃でインキュベーションした。２１日間のインキュベーション後、１０％（ｖ／ｖ）酢酸及び１０％（ｖ／ｖ）メタノールの水溶液を用いて固定し、クリスタルバイオレット（０．０１％（ｗ／ｖ）水溶液）で染色した。コロニー形成率は、軟寒天中２１日間のインキュベーション後に認められたコロニー数と播種細胞数との間の比率として求めた。コロニー形成率の結果は図２に示した。

ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞では、高いコロニー形成率（約５０％）を示す強いコロニー形成が認められた。ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞のコロニー形成率は、親のＲａｔ２細胞よりも低かったが、親のＲａｔ２細胞株のコロニーサイズはＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞株に比し、小さかった（図３）。

実施例５：ＦＧＦＲ２阻害剤に対する生体外感受性
（１）ＦＡＣＳを用いた細胞増殖アッセイ
播種（２５０００個の細胞／ウェル）後２４時間に、実施例４によって得られたＲａｔ２細胞（親細胞又はＦＧＦＲ２−ＶＣＬもしくはＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合ポリペプチドを発現する細胞）ＦＧＦＲ阻害剤を添加し、これらの培養物をこうした阻害剤の存在下にさらに７２時間インキュベーションした。インキュベーション期間の最後に、ＦＡＣＳによって細胞をカウントした。ＩＣ５０値は、Ｓ字形反応（勾配変化のある法面）曲線適合を用いるグラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ）６で算出した。阻害剤には選択的ＦＧＦＲ阻害剤化合物Ａ、ＢＧＪ３９８及びＡＺＤ４５４７並びに多標的キナーゼ阻害剤ポナチニブを使用した。

ＦＡＣＳ分析から、上記融合ポリペプチド発現細胞の増殖は調べた全てのＦＧＦＲ阻害剤によって阻害されることが明らかとなった（図４）。多標的キナーゼ阻害剤ポナチニブもその大きく、かつ非特異的な活性スペクトルによって親細胞の増殖を阻害した。Ｒａｔ２親細胞、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞では、化合物Ａについて、それぞれ、１０２４ｎＭ超、２２７．１ｎＭ及び１４．７ｎＭの相対的ＩＣ５０が得られた。

従って、上記の結果から、本発明のいずれかの融合体（ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ又はＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７）を発現する細胞は生体外でＦＧＦＲ選択的阻害剤に感受性であるのに対して、親細胞は多標的キナーゼ阻害剤に対してのみ感受性であることが分かる。

（２）セルタイターグロ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ）を用いた細胞増殖アッセイ
実施例４によって得られたＲａｔ２細胞（親細胞又はＦＧＦＲ２−ＶＣＬもしくはＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合ポリペプチド発現細胞）をこのアッセイに用いた。９６ウェルプレートに細胞を播種し、ＦＧＦＲ阻害剤の添加前に２４時間培養した（上記セクション（１）と同じ）。さらに７２時間培養した後、発光プレートリーダーを用いた細胞内ＡＴＰ含量の測定（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ）によって細胞増殖を分析した。Ｒａｔ２親細胞、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞では化合物Ａについて、それぞれ、３０００ｎＭ超、０．５３ｎＭ及び７３．４ｎＭの相対的ＩＣ５０が得られた。用量反応曲線及びＩＣ５０のまとめを図５に示した。

このように、ＦＧＦＲ選択的阻害剤は、ＦＧＦＲ２融合体（ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７）を収容する両細胞株の増殖の強力な阻害を示したのに対して、親細胞はＦＧＦＲ選択的阻害剤の影響を受けなかった。

実施例６：生体内発癌性
Ｒａｔ２細胞（実施例４によって得られた親細胞又はＦＧＦＲ２−ＶＣＬもしくはＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合ポリペプチド発現細胞）の生体外発癌性について、５〜６週齢の雌性ＮＭＲＩヌードマウスの皮下腫瘍モデルにおいて生体内評価を行った。この研究は、各群５匹の動物を含む６つの実験群で構成された。５×１０^６及び１×１０^６個のＲａｔ２親細胞（群１及び２）、Ｒａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７細胞（群３及び４）並びにＲａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ細胞（群５及び６）をそれぞれ、０日目に皮下移植した。全ての群の動物体重は、この研究過程で連続的に増加した。原発腫瘍の容積は、キャリパ測定によって週に２回測定した。腫瘍容積は、式Ｗ^２×Ｌ／２（Ｌ＝長さ及びＷ＝腫瘍の垂直幅、Ｌ＞Ｗ）に従って算出した。結果は図６に示した（データは平均±ＳＥＭで示されている）。

Ｒａｔ２親細胞（対照）の場合、接種サイズとは関係なく、原発腫瘍の増殖は認められなかった。Ｒａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７細胞の場合、２８日目頃に始まる実質的な腫瘍増殖を認めることができ、多数の細胞（５×１０^６個）を移植された動物ほど、速い腫瘍増殖を示した。Ｒａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ細胞（群５及び６）の場合、移植後１０日頃から始まる腫瘍増殖が認められた。腫瘍増殖が速いため、群５（５×１０^６個）は２１日目に、群６（１×１０^６個）は２８日目に倫理的な理由（腫瘍負荷）で屠殺しなければならなかった。従って、いずれかのＦＧＦＲ２構築体（ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ又はＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７）を発現する腫瘍は、雌性ＮＭＲＩヌードマウスにおいて生体内発癌性であることが示された。

実施例７：ＦＧＦＲ阻害剤への生体内感受性
（１）ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合体
０日目に、５×１０^６個のＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現Ｒａｔ２細胞のＰＢＳ（１００μｌ）溶液を５〜６週齢雌性ＮＭＲＩヌードマウス（１群６匹）の左脇腹に皮下移植した。確立された腫瘍（Ｄ２５、平均腫瘍容積＝１３５ｍｍ^３）を有するマウスに、化合物Ａ（３０又は６０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回連続１４日間経口投与した。原発腫瘍のサイズはキャリパリングによって週２回測定した。動物は治療の最終日に屠殺し、剖検時に腫瘍重量を測定した。

化合物Ａは、ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現モデルの生体内で強い抗腫瘍効力を示した（図７Ａ）。化合物Ａは、調べた２用量（３０及び６０ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍増殖を阻害したが、体重には有意な影響は認められなかった（パネルＢ）。データは平均±ＳＥＭで示されている。Ｐ値は、マンホイットニー検定（括弧内は対応のないｔ検定）によりビヒクル対照との比較で算出した。

このように、３０及び６０ｍｇ／ｋｇを１４日間連日投与したＦＧＦＲの選択的阻害剤化合物Ａは、雌性ＮＭＲＩヌードマウスの皮下移植Ｒａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７腫瘍モデルにおいて、（両用量で同等の）高度に有意な生体内抗腫瘍効力を示した。

（２）ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合体
０日目に、１×１０^６個のＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現Ｒａｔ２細胞のＰＢＳ（１００μｌ）溶液を５〜６週齢雌性ＮＭＲＩヌードマウス（１群６匹）の左脇腹に皮下移植した。確立された腫瘍（Ｄ１５、平均腫瘍容積＝１８８ｍｍ^３）を有するマウスに、化合物Ａ（３０又は６０ｍｇ／ｋｇ）を１日１回連続１４日間経口投与した。原発腫瘍のサイズはキャリパリングによって週２回測定した。動物は治療の最終日に屠殺し、剖検時に腫瘍重量を測定した。

ＦＧＦＲの選択的阻害剤化合物Ａは、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現モデルの生体内で強い抗腫瘍効力を示した（図８Ａ）。化合物Ａは、体重に有意な影響を与えることなく腫瘍増殖を阻害した（パネルＢ）。データは平均±ＳＥＭで示されている。Ｐ値は、マンホイットニー検定（括弧内は対応のないｔ検定）によりビヒクル対照との比較並びに群２及び３の間で算出した。

このように、３０及び６０ｍｇ／ｋｇを１４日間連日投与したＦＧＦＲの選択的阻害剤化合物Ａは、雌性ＮＭＲＩヌードマウスの皮下移植Ｒａｔ２−ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７腫瘍モデルにおいて、高度に有意で用量依存性の生体内抗腫瘍効力を示した。６０ｍｇ／ｋｇ処置群では腫瘍の静止状態が認められた。

実施例８：ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ／ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７自己リン酸化の機能分析
本実施例では、以下の配列を用いた：ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子は、ＦＧＦＲ２部分では配列番号１６（核酸番号１〜２５７４）及びＣＣＤＣ１４７部分では配列番号２０（核酸番号１５６〜核酸番号３３１３）で構成され、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合遺伝子は、ＦＧＦＲ２部分では配列番号１６（核酸番号１〜２５７４）及びＶＣＬ部分では配列番号１８（核酸番号２１１７〜核酸番号５４８２）で構成された。

（１）ウエスタンブロット法によって評価された、一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦＲ２融合遺伝子の自己リン酸化
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃ末端二重ｍｙｃ−ｔａｇ伸長を追加したＦＧＦＲ２−ＶＣＬ又はＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子を含む発現プラスミドで一過性に形質移入した。陰性対照として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を擬似的に形質移入した。細胞を０．１％ ＤＭＳＯ、１Ｅ−０．５Ｍバルガテフ又は１Ｅ−０．５Ｍ化合物Ａで９０分間処理した。処理後、これら融合ポリペプチドの発現及び自己リン酸化をウエスタンブロット法により分析した。ｍｙｃｔａｇ融合ポリペプチド（ｍｙｃ ｔａｇｇｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）の発現は抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（α−ｍｙｃ）を用いて測定し、リン酸化分析は抗リン酸化チロシン抗体ｐＹ９９（α−ｐＹ）を用いて行った。結果は図９に示した。ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞はいずれも、リガンド非依存性の高レベルのＦＧＦＲリン酸化を示している。この自己リン酸化は、ＦＧＦＲ選択的阻害剤化合物Ａ又は選択性のより低い阻害剤バルガテフを作用させると、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ発現細胞では実質的に低下し、ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞では幾分よりわずかに低下するようである。

（２）ＥＬＩＳＡにより測定した、一過性に形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの自己リン酸化
擬似的に形質移入した（対照）、又は発現可能なＦＧＦＲ２−ＶＣＬもしくはＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子で一過性に形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を０．１％ＤＭＳＯ、１Ｅ−０．５Ｍバルガテフ又は１Ｅ−０．５Ｍ化合物Ａで９０分間処理した。処理後、これらのＦＧＦＲ２融合ポリペプチドの自己リン酸化をサンドイッチホスホチロシンＥＬＩＳＡを用いて分析した。各条件で２回ずつ実施した。各条件での光学密度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）値を図１０に示した。

ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７発現細胞はいずれも、リガンド非依存性の高レベルのＦＧＦＲリン酸化を示しており、それらのレベルはＦＧＦＲ選択的阻害剤化合物Ａ又は選択性のより低い阻害剤バルガテフによって減少している。

実施例９：ｍＲＮＡのデジタル検出により腫瘍生検材料中のＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合体を検出するための診断方法
実施例１（１）と同様に、ヒト胆管癌のＦＦＰＥ試料から全ＲＮＡを抽出した。試料当たり５００ｎｇの全ＲＮＡを用い、エヌカウンター遺伝子発現アッセイ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）プロトコルをメーカー（ｗｗｗ．ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍ）の取扱説明書に従って使用して分析した。このエヌカウンターアッセイは、各遺伝子の発現量がｃＤＮＡの合成及び増幅を必要とせずに、カウントにより相対的に測定できるように、溶液中の標的分子に直接ハイブリダイズする標的特異的な色分けされたプローブを用いた、対象とするｍＲＮＡ分子の直接的デジタル検出に基づくものである。各プローブは、バーコードを有する５０塩基のレポータプローブ部分、及び過剰のプローブを洗い流した後のデータ収集（カウント）用ストレプトアビジン被覆エヌカウンターカートリッジへの標的／プローブ複合体の固定化を可能にするビオチン分子を有する５０塩基の捕捉プローブ部分によって構成される。

本発明の各融合遺伝子に関して、プローブをナノストリング（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）（カスタムコードセット（Ｃｕｓｔｏｍ ＣｏｄｅＳｅｔ））によって設計、合成し、次いで、エヌカウンター分析システムにおける試料処理のためのすぐに使えるエヌカウンター・マスターキット（Ｍａｓｔｅｒ Ｋｉｔ）の中に全ての消耗品及び試薬と共に入れた。ナノストリングによって形成されるプローブの設計に用いられる標的配列を表４に示した（捕捉プローブ及びレポータプローブの詳細は知られていない）。

得られたカウント値は、バックグラウンド補正し、これまでに報告（Ｂｅａｕｍｅほか（２０１１年）Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８４：３２７−３３４）された最も安定なハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。結果は表５に示した。

このように、ｉＣＣＡ ＦＦＰＥ試料＃１がＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７遺伝子融合体を収容していること、及びｉＣＣＡ ＦＦＰＥ試料＃２がＦＧＦＲ２−ＶＣＬ遺伝子融合体を収容していることを明らかにすることができた。ｉＣＣＡ ＦＦＰＥ試料＃１の場合、ＦＧＦＲ２−ＶＣＬに関する１２９という正規化値は非特異的ハイブリダイゼーション及び構成バックグラウンドノイズに由来することが（両融合体に有効なプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって）明らかとなった。

実施例１０：ＤＮＡを用いて腫瘍生検材料中のＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合体を検出するための診断方法
（１）生検試料及びＤＮＡ調製
ヒト胆管癌の生検材料から得られたホルマリン固定パラフィン包埋組織からの厚さ１０μｍのマクロ切断切片から全ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出はＦＦＰＥ ＤＮＡ単離キット（ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて実施した。

（２）配列決定
融合体は、Ｄｕｎｃａｖａｇｅほか（Ｄｕｎｃａｖａｇｅほか、Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．２０１２年６月号；２５（６）：７９５−８０４）によって報告された、ＶＣＬ及びＣＣＤＣ１４７遺伝子用捕捉プローブを用いた捕捉強化ＤＮＡ配列決定法（ｃａｐｔｕｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって検出する。ゲノムＤＮＡの（長さ約２５０〜５００ｂｐの断片への）断片化の後、断片化ＤＮＡを末端修復し、メーカーのプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）に従ってアダプターに結合させる。次いで、配列決定ライブラリをメーカーの取扱説明書（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州、米国）に従って捕捉プローブとハイブリダイズさせる。次に、上記強化ＤＮＡを、上記アダプターを標的とするユニバーサルプライマーを用いて増幅する。次に、ＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、５２００ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｗａｙ、サンディエゴ、カリフォルニア州９２１２２、米国）をメーカーの取扱説明書に従って用いて５０〜１５０ｂｐのペアエンドシーケンシングに供する。

（３）ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子の検出
ＦＧＦＲ２−ＶＣＬ及びＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合遺伝子の検出を実施例３（３）と同様に実施する。

Claims (32)

1. ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、前記ＦＧＦＲ２ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部、又は前記野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部であり、前記ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部、又は前記野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部であり、前記ＶＣＬポリペプチドは、野生型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部、又は前記野生型ポリペプチドに対して１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部である、ｃＤＮＡ。
2. ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチド又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導される突然変異型ポリヌクレオチドの全体もしくは一部をコードする第一のポリヌクレオチドと、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチド又は１つ以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入によってそれから誘導される突然変異型ポリヌクレオチドの全体もしくは一部をコードする第二のポリヌクレオチドとを合わせ持つ、ｃＤＮＡ。
3. 前記ＦＧＦＲ２ポリペプチドは完全なチロシンキナーゼドメインを含む、請求項１又は２に記載のｃＤＮＡ。
4. 前記第一のポリヌクレオチドはＦＧＦＲ２エクソン１〜１６及びＦＧＦＲ２エクソン１７の一部もしくは全部を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、ＦＧＦＲ２−ＣＣＤＣ１４７融合体の場合、ＣＣＤＣ１４７エクソン１を欠き、又はＦＧＦＲ２−ＶＣＬ融合体の場合、ＶＣＬエクソン１〜１４を欠く、請求項２に記載のｃＤＮＡ。
5. 前記ｃＤＮＡは、ヒト胆管癌から単離された遺伝子転写物に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｃＤＮＡ。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃＤＮＡを有するベクター。
7. 前記ベクターは発現ベクターである、請求項６に記載のベクター。
8. 請求項６又は請求項７に記載のベクターを形質導入した原核又は真核細胞。
9. 前記細胞は大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞である、請求項８に記載の細胞。
10. 前記細胞は哺乳動物細胞である、請求項８に記載の細胞。
11. 配列番号１のポリヌクレオチド配列。
12. 配列番号２のポリヌクレオチド配列。
13. ＦＧＦＲ２ポリペプチド及びＣＣＤＣ１４７ポリペプチド又はＶＣＬポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記ＦＧＦＲ２ポリペプチドは、野生型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部、又は前記野生型ポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＦＧＦＲ２ポリペプチドの全体もしくは一部であり、前記ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドは、野生型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部、又は前記野生型ポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＣＣＤＣ１４７ポリペプチドの全体もしくは一部であり、前記ＶＣＬポリペプチドは、野生型ＶＣＬポリペプチドの全体もしくは一部、又は前記野生型ポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは挿入を有する突然変異型ＶＣＬポリペプチドの一部であり、前記融合ポリペプチドは、組換えポリペプチドであり、又は生体外でもしくは異種移植体として増殖された癌細胞から単離され、又はヒト胆管癌から単離される、融合ポリペプチド。
14. 請求項１に記載の融合ポリペプチドに結合する抗体又は抗原結合断片。
15. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、前記ｃＤＮＡ又はその一部の複製を誘導することができるセンス及びアンチセンスプライマーからなるプライマー対。
16. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のｃＤＮＡ又は請求項１に記載の融合ポリペプチドの遺伝子又はこの遺伝子の転写物に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブ。
17. 生体細胞において請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記ハイブリダイズは前記メッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻止又は低下させる効果を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
18. 請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ。
19. 請求項１に記載の融合ポリペプチドを検出するためのキットであって、前記融合ポリペプチドに結合することができる１種以上の抗体又は抗原結合断片を含む、キット。
20. 請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする遺伝子又は遺伝子の転写物を検出するためのキットであって、請求項１５に記載のプライマー対又は請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む、キット。
21. 癌に罹患している対象における治療計画に用いるためのＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤であって、前記対象は請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含有もしくは発現し、又は請求項１に記載の融合ポリペプチドを発現する、ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤。
22. 前記ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤は５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン、ＰＤ１７３０７４、パゾパニブ、ＡＺＤ４５４７、ポナチニブ、ドビチニブ、ＢＧＪ３９８、Ｅ−３８１０、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ＡＲＱ ０８７、ＬＹ２８７４４５５、ＢＡＹ１１６３８７７、ＡＳＰ５８７８、Ｅ７０９０、ＯＤＭ−２０３、ニンテダニブ、ＴＡＳ−１２０、ＰＲＮ １１０９及びＰＲＮ １３７１からなる群から選ばれる、請求項２１に記載の阻害剤。
23. 前記ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤は５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノンである、請求項２１に記載の阻害剤。
24. 個別的癌治療の方法であって、請求項１に記載の融合ポリペプチドの遺伝子を含有もしくは発現している又は請求項１に記載の融合ポリペプチドを発現している対象に対して、（１）ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤、（２）請求項１４に記載の抗体もしくは抗原結合断片、（３）請求項１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は（４）請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物の投与を含む治療計画を施す工程を含む、方法。
25. 個別的癌治療の方法であって、
    （ａ）癌に罹患している対象から癌細胞又は腫瘍循環ＤＮＡを含む生検又は流体試料を採取する工程、
    （ｂ）前記生検又は流体試料中の細胞が請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含有もしくは発現し、又は請求項１に記載の融合ポリペプチドを発現しているかどうかを判定する工程、
    （ｃ）工程ｄの治療のために、前記融合ポリペプチドの遺伝子を含有もしくは発現し、又は前記融合ポリペプチドを発現している前記対象を選ぶ工程、及び
    （ｄ）前記選ばれた対象に対して、（１）ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤、（２）請求項１４に記載の抗体もしくは抗原結合断片、（３）請求項１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は（４）請求項１８に記載のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物の投与を含む治療計画を施す工程
    を含む、方法。
26. 前記ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤は５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン、ＰＤ１７３０７４、パゾパニブ、ＡＺＤ４５４７、ポナチニブ、ドビチニブ、ＢＧＪ３９８、Ｅ−３８１０、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ＡＲＱ ０８７、ＬＹ２８７４４５５、ＢＡＹ１１６３８７７、ＡＳＰ５８７８、Ｅ７０９０、ＯＤＭ−２０３、ニンテダニブ、ＴＡＳ−１２０、ＰＲＮ １１０９及びＰＲＮ １３７１からなる群から選ばれる、請求項２４又は２５に記載の方法。
27. 前記ＦＧＦＲキナーゼ活性の阻害剤は５−アミノ−１−（２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−５−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−（１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノンである、請求項２４又は２５に記載の方法。
28. 癌に罹患しているヒト対象において腫瘍を特徴付ける方法であって、前記対象からの癌細胞又は腫瘍循環ＤＮＡを含む生検又は流体試料のタンパク質又は核酸をアッセイして、請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする遺伝子又は発現された請求項１に記載の融合ポリペプチドの有無を確認する工程を含む方法。
29. 前記癌は胆管癌である請求項２８に記載の方法。
30. ＦＧＦＲ阻害活性を有する化合物を同定するための方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の融合ポリペプチドを発現し、成長が試験化合物の存在下又は非存在下においてこの発現に依存している細胞を培養し、細胞増殖のレベルを測定する工程、
    （ｂ）前記試験化合物の存在下及び非存在下における前記培養細胞の増殖レベルを比較する工程、並びに
    （ｃ）前記試験化合物の存在下において培養された前記細胞の増殖レベルが前記試験化合物の非存在下において培養された前記細胞の増殖レベルよりも低い場合に、前記試験化合物はＦＧＦＲ阻害活性を有すると判断する工程
    を含む、方法。
31. 前記細胞は癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記癌細胞は胆管癌細胞である、請求項３０に記載の方法。