KR20060048684A - 암의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

암, 바람직하게는 혈액 종양 환자를 치료하는 방법은 환자의 유전자 발현 프로필 및/또는 분자 표지를 분석하여 환자가 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI), 및 선택적으로 다른 치료제에 의한 치료에 반응하기 쉬운지 여부를 결정함을 포함한다. 상기 방법은 또한 환자의 치료를 모니터하고 치료 과정을 선택하는데 유용하다. FTI 치료에 대해 변조된 유전자가 제공되며 상기 유전자는 프로필을 형식화하는데 사용된다.

Description

암의 진단 및 치료 방법{METHODS FOR ASSESSING AND TREATING CANCER}
도 1은 높고 낮은 CD33 항원 발현을 나타내는 환자의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 높고 낮은 모세포 수를 나타내는 환자의 카플란-마이어 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 임상 반응 분류자를 이용한 환자의 카플란-마이어 생존율 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 3b는 환자를 분류하기 위해 종양유발LBC 유전자 발현을 이용한 환자의 카플란-마이어 생존율 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 3c는 환자를 분류하기 위해 종양유발LBC 및 AHR 유전자 발현을 이용한 환자의 카플란-마이어 생존율 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 예측 표지의 최소 조합을 동정한 결과를 나타낸 것이다. 패널 A에서 LOOCV는 100%의 민감도를 이용하여 수행하였다. 1 내지 19개의 유전자를 함유하는 독립적 분류자를 시험하였다. 야기된 오류율을 플롯팅하였다. 패널 B는 반응자(R) 및 무반응자(NR)에 대한 분류자로서 3-유전자 기호를 이용하여 수행한 LOOCV로부터 작성된 2x2 표를 나타낸다. 패널 C는 3-유전자 분류자로부터 야기된 스코어를 나타낸 것이다. p-값은 반응군 사이의 유전자 발현에 상당한 차이를 나타낸다. 패널 D는 반응자 및 무반응자로서 3-유전자 기호에 의해 분류된 환자에 수행된 카플란-마이어 곡선을 나타낸 것이다. 평균 생존 시간도 또한 나타내었다.
도 5는 반응자 및 무반응자로서 3-유전자 기호에 의해 분류된 환자에서 수행된 카플란-마이어 분석 결과를 나타낸 것이다. 임상적으로 무반응자로 정의되었지만 3-유전자 기호를 이용하여 반응자로 분류된 환자의 생존 곡선을 나타내었다. 평균 생존 시간도 또한 나타내었다.
본 출원은 2003년 7월 1일자로 출원된 미국 특허출원 제 10/611,446 호의 일부 계속 출원이며 상기 출원에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 분자 표지의 검출 및/또는 유전자 발현 분석을 기초로 하는 암의 진단, 예측 및 치료에 관한 것이다.
암에 관련되는 Ras와 같은 일부 분자들은 세포의 혈장 막의 내부 소엽과 상호작용하고 다양한 신호 경로에 수반되기 위해서는 파네실 트랜스퍼라제 효소에 의해 파네실화되어야 한다. 그러나, Ras는 암에 관련되는 유일한 단백질은 아니다. 파네실 트랜스퍼라제 억제제(farnesyl transferase inhibitor, FTI)는 탄소 파네실 잔기가 단백질의 C-말단 CAAX 모티프에 공유 결합되는 것을 억제하는 치료제이다. 이들은 혈액 종양과 같은 암 및 증식성 질환 치료에 유용성을 갖는다. 백혈병, 림 프종 및 골수종(예를 들면, 급성 골수성 백혈병; AML)과 같은 혈액 종양이 FTI에 의해 가장 유리하게 처리될 수 있는 질환에 속한다. 유방암 및 교모세포종과 같은 고형 종양도 또한 FTI로 치료될 수 있다.
많은 치료 요법의 경우에서 그러하듯이, 일부 환자들은 FTI에 의한 치료에 반응하고 어떤 환자들은 그렇지 않다. 치료에 반응할 것 같지 않은 환자에게 그 치료를 처방하는 것은 바람직하지 않다. 따라서, 무반응자가 불필요하게 치료받지 않고 약물로부터 이익을 얻을 가장 좋은 기회를 가진 환자들이 적절히 치료되고 모니터되도록, 약물이 투여되기 전에 환자가 상기 치료에 어떻게 반응하는 지를 예상할 수 있을 지를 아는 것은 유익할 것이다. 또한, 치료에 반응하는 환자들 중에서, 반응도가 다양할 수 있다. FTI 이외의 다른 치료제를 사용한 치료 또는 FTI에 더하여 치료제를 사용한 치료가, FTI에 반응하지 않는 환자들 또는 FTI 단독에 대한 반응이 바람직한 수준 미만인 환자들에 유리할 수 있다.
본 발명의 목적은 유전자 발현 프로필 및/또는 분자 표지를 분석함으로써 환자가 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)에 의한 치료에 반응할 것인지를 예측하여 FTI로 암 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 FTI로 암 환자를 치료하는 방법이다. 상기 한 방법에서, 분자 표 지의 존재 또는 부재가 환자가 FTI에 반응할 것인지 여부를 결정한다. 환자가 반응할 것 같은 경우 환자를 FTI로 치료한다. 환자가 FTI에 의한 치료에 반응할 것 같지 않은 경우, 치료는 보류될 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, FTI 반응을 예측하는 유전자 조합에 대해 유전자 발현 프로필을 수득한다. 본 발명의 또 다른 태양에서는, FTI 치료에 대한 반응 가능성을 결정하기 위해 분자 표지의 존재와 유전자 발현 프로필을 함께 이용한다. 본 발명의 또 다른 태양에서, FTI 치료에 대한 반응 가능성을 결정하기 위해 발현 프로필을 백혈병 모세포수 및/또는 백혈병 세포 항원 발현과 함께 이용한다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 분석 샘플은 골수에서 얻는다.
본 발명의 또 다른 태양으로, 암 환자를 FTI에 의한 치료에 대해 모니터하는데, 이때 환자가 FTI에 반응하는지, 및 이들이 바람직한 방식으로 반응할 것 같은 경우 환자를 FTI로 치료하는지 여부를 결정하기 위해 환자의 유전자 발현 프로필 및/또는 분자 표지의 존재를 분석한다.
본 발명의 또 다른 태양으로, 유전자 발현 프로필이 FTI 반응자를 나타내는 하나 이상의 특정 유전자의 변조를 나타내는 경우, 환자를 치료한다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 유전자 발현 프로필이 FTI 반응자를 나타내는 하나 이상의 특정 유전자의 변조, 및 0 내지 60%의 골수 모세포수, 또는 60% 미만의, CD33 세포 표면 항원의 양성 발현을 갖는 세포의 존재 및/또는 10% 미만의, CD34 세포 표면 항원의 양성 발현을 갖는 세포의 존재를 나타내는 경우, 환자를 치료한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 분자 표지는 다음 중 하나 이상이다: LBC 종양유전자, AHR, MINA53, IDS, GPR105, TEM6, TNFSF13, SVIL, C6orf56, FRAG1, GOSR1, KIAA1036, BTG3, MAPK8IP3, LILRB3, ARHH 및 NPTX2. 표지는 또한 상기 언급한 표지 중 하나 이상과 함께 OPN3 및/또는 IL3RA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, FTI는 퀴놀린 또는 퀴놀린 유도체이다. 본 발명의 또 다른 태양에서, FTI는 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논이다.
상기 방법을 실시하는데 이용되는 제품도 또한 본 발명의 한 태양이다. 상기 제품은 유전자 발현 프로필 또는 그 설명서를 포함한다. 설명서는 컴퓨터 판독 매체에 준비될 수 있다. 본 발명에 따른 다른 제품은 본 발명의 유전자 발현 프로필을 결정하기 위해 사용되는 핵산 배열, 및 다른 핵산 검출 기술을 실시하기 위한 장치 및 구성요소들을 포함한다.
키트도 또한 본 발명의 한 태양이다. 상기 키트는 FTI 치료에 대한 무반응자로부터 반응자를 구별하는 유전자의 발현 및/또는 분자 표지의 존재를 검출하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 사용법을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 암 환자를 치료하는 방법은 FTI, 및 MAPK/ERK 신호 경로, TGFβ, WNT, Rho 또는 세포사멸 경로를 변조시키는 치료 조성물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 환자를 FTI, 및 티로신 키나제 억제제, MEK 키나제 억제제, PI3K 키나제 억제제, MAP 키나제 억제제, 세포사멸 조절제 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 치료 조성물로 치료한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 환자의 유전자 발현 프로필 및/또는 분자 표지의 존재 또는 부재를 분석하여 환자가 FTI 및 또 다른 약물의 혼합물로부터 이익을 얻을 것인지 여부를 결정한다. 그 다음, 환자를 상기 혼합물로 처리하거나, 또는 환자가 FTI에 반응할 것 같지 않으면, 환자는 티로신 키나제 억제제, MEK 키나제 억제제, PI3K 키나제 억제제, MAP 키나제 억제제, 세포사멸 조절제 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것과 같은 또 다른 약물로 치료한다.
본 발명의 또 다른 태양에서는, 환자의 유전자 발현 프로필 및/또는 분자 표지의 존재를 분석하여 환자가 FTI와 또 다른 형태의 치료의 조합으로부터 이익을 얻을 것인지 여부를 결정한다. 그 다음, 환자를 상기 조합으로 치료하거나, 또는 환자가 FTI에 반응할 것 같지 않은 경우, FTI를 포함하지 않는 또 다른 치료법으로 환자를 치료한다.
본 명세서에 언급된 치료제는 FTI이다. 이들은 여러 형태를 가지지만, 암 및 증식성 질환에 관련된 단백질의 파네실화를 방해하거나 감소시키는 필수적인 억제 기능을 공유한다. 바람직하게는, FTI는 교모세포종 및 유방암과 같은 고형 종양의 치료를 위해 처방된다. 보다 바람직하게는, FTI는 백혈병, 림프종 및 골수종과 같은 혈액 종양의 치료에 처방된다. 가장 바람직하게는, FTI는 AML, 척수이형 증후군(MDS), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단구성 백혈병(CMML) 및 다발성 골수종(MM)에 사용하기 위해 고려된다. 혈액 종양의 경우, FTI에 반응하는 환자는 FTI로 치료한 후 골수에서 모세포의 50% 이상이 감소됨을 보이는 환자이다. 고형 종양에서, FTI에 반응하는 환자는 그 종양이 성장을 정지한 환자이다. 고형 종양을 가진 환자에서의 반응은 대안적으로 종양학에서 통상적으로 사용되는 용어인 RECIST(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, 고형 종양에서의 반응 평가 기준) 기준에 따라 측정할 수 있다.
많은 FTI가 본 발명의 범위에 포함되며, 각각 본원에 참고로 인용된 하기의 미국 특허들에 기술된 것들이 포함된다: 브라운(Brown) 등의 제 5,976,851 호; 안토니(Anthony) 등의 제 5,972,984 호; 드 솔름스(deSolms)의 제 5,972,966 호; 딘스모어(Dinsmore) 등의 제 5,968,965 호; 베넷(Venet) 등의 제 5,968,952 호; 베넷 등의 제 6,187,786 호; 베넷 등의 제 6,169,096 호; 베넷 등의 제 6,037,350 호; 앙기바우드(Angibaud) 등의 제 6,177,432 호; 그라함(Graham) 등의 제 5,965,578 호; 셉티(Sebti) 등의 제 5,965,539 호; 아폰소(Afonso) 등의 제 5,958,939 호; 안토니 등의 제 5,939,557 호; 코머콘(Commercon) 등의 제 5,936,097 호; 안토니 등의 제 5,891,889 호; 바우딘(Baudin) 등의 제 5,889,053 호; 안토니의 제 5,880,140 호; 드 솔름스의 제 5,872,135 호; 드 솔름스의 제 5,869,682 호; 바우도인의 제 5,861,529 호; 그라함 등의 제 5,859,015 호; 클러크(Clerc)의 제 5,856,439 호; 안토니 등의 제 5,856,326 호; 그라함 등의 제 5,852,010 호; 마스터스(Marsters) 등의 제 5,843,941 호; 돌(Doll)의 제 5,807,852 호; 딘스모어 등의 제 5,780,492 호; 동(Dong) 등의 제 5,773,455 호; 킴(Kim) 등의 제 5,767,274 호; 안토니 등의 제 5,756,528 호; 바우도인 등의 제 5,750,567 호; 비샵(Bishop) 등의 제 5,721,236 호; 돌 등의 제 5,700,806 호; 안토니 등의 제 5,661,161 호; 셉티 등의 제 5,602,098 호; 브레슬린(Breslin) 등의 제 5,585,359 호; 시카론(Ciccarone) 등의 제 5,578,629 호; 시카론 등의 제 5,534,537 호; 마스터스 등의 제 5,532,359 호; 파텔(Patel) 등의 제 5,523,430 호; 드 솔름스 등의 제 5,504,212 호; 드 솔름스 등의 제 5,491,164 호; 브라운 등의 제 5,420,245 호; 및 그라함 등의 제 5,238,922 호.
비-펩타이드성, 소위 "소분자" 치료제가 바람직하다. 보다 바람직한 FTI는 다음과 같은 퀴놀린 또는 퀴놀린 유도체이다:
7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일)메틸]-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온,
7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일)메틸]-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온,
8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온, 및
8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온.
가장 바람직한 FTI는 (+) 거울상이성체로서 베넷 등의 미국 특허 제 6,420,387 호에 기술된 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논이다.
또 다른 바람직한 FTI는 WO 01/98302 호에 기술된 (-)-5-(3-클로로페닐)-α-(4-클로로페닐)-α-(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)테트라졸로[1,5-a]퀴나졸린-7-메테인 아민 및 그의 약학적으로 허용되는 산 부가염이다.
다른 유용한 FTI로는 아글라빈(Arglabin), 즉, 1(R)-10-에폭시-5(S),7(S)-구아이아-3(4),11(13)-다이엔-6,12-올라이드(WO 98/28303 호); 페릴릴 알콜(WO 99/45912 호); SCH-66363, 즉, (+)-(R)-4-[2-[4-(3,10-다이브로모-8-클로로-5,6-다이하이드로-11H-벤조[5,6]사이클로헵타[1,2-b]피리딘-11-일)피페리딘-1-일]-2-옥소에틸]피페리딘-1-카복스아마이드(미국 특허 제 5874442 호); L778123, 즉, 1-(3-클로로페닐)-4-[1-(4-사이아노벤질)-5-이미다졸릴메틸]-2-피페라지논(WO 00/01691 호); 화합물 2(S)-[2(S)-[2(R)-아미노-3-머캅토]프로필아미노-3(S)-메틸]-펜틸옥시-3-페닐프로피오닐-메티오닌 설폰(WO 94/10138 호); BMS 214662, 즉, (R)-2,3,4,5-테트라하이드로-1-(1H-이미다졸-4-일메틸)-3-(페닐메틸)-4-(2-티에닐설포닐)-1H-1,4-벤조다이아자핀-7-카보나이트릴(WO 97/30992 호); CP 609754, 즉, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민(미국 특허 제 5,747,498 호); 및 6-[아미노-(4-클로로페닐)-(3-메틸-3H-이미다졸-4-일)-메틸]-4-(3-에티닐-페닐)-1-메틸-1H-퀴놀린-2-온(WO 00/12499 호):
Figure 112005034962520-PAT00001
게놈 내에 단백질 또는 펩타이드를 발현할 가능성을 갖는 핵산 서열의 유일한 존재("유전자")는 단백질 또는 펩타이드가 해당 세포에서 발현되는지 여부를 결 정하지 못한다. 단백질 또는 펩타이드를 발현하거나 또는 RNA를 전사할 수 있는 해당 유전자가 그렇게 할 수 있는지 여부, 및 상기 발현 또는 전사가 어느 정도로 일어나는지는 다양한 복합적 요인들에 의해 결정된다. 그럼에도 불구하고, 유전자 발현을 분석하면 약물 또는 다른 치료제의 도입과 같은 주어진 자극에 대한 세포 반응에 대해 유용한 정보를 얻을 수 있다. 어떤 유전자가 활성이거나 불활성인 정도의 상대적 징후는 상기 유전자 발현 프로필에서 찾을 수 있다. 몇몇 경우에서, 분자 표지의 존재는, 그것만으로, 또는 유전자 발현 정보를 이용함과 함께, 치료 효율에 대한 유용한 정보를 또한 제공할 수 있다. 본 발명의 유전자 발현 프로필 및 분자 표지는, FTI 치료로부터 이익을 얻을 것 같은 환자를 확인하고 치료하거나, 또는 환자가 약물 또는 치료에 이로운 반응을 거의 또는 전혀 경험하지 못할 것 같은 FTI 치료로부터 환자를 배제하는데 이용된다.
혈액 종양을 포함하여, 암은 전형적으로 다양한 유전자의 돌연변이로부터 일어난다. 동일한 유형의 암은 동일한 유형의 암을 가진 또 다른 환자와 상이한 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 또는 그와 동시에 일어날 수 있다. 동일한 암의 기초가 되는 다수의 분자 염기가 종종 존재한다는 사실은 한 환자에게 영향을 미치는 몇몇 치료가 동일 유형의 암을 가진 또 다른 환자에게 반드시 동일하게 영향을 미치지는 않는다는 관찰과 일치한다. 또한, 진단의 관점에서, 전위, 결실 또는 SNP와 같은 특정 돌연변이의 존재는 강력한 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 경우에서, 상기 분자 표지는 자체로 진단, 예측 또는 치료 반응 결정에 유용한 지표이다. 이것은 분자 돌연변이가 특정 치료에 대한 반응과 관련될 수 있는 경우 특히 그러하 다. 본 발명에서, LBC(급성기 림프종) 종양유전자(AKAP13으로도 또한 알려짐, 서열 번호: 2)의 부재와 동시에 일어나는 암은 FTI 치료에 반응한다. 그러므로, 상기 유전자의 발현, 유전자 발현의 결여 및 그의 존재 또는 부재는 상기 치료를 실제로 처방하기 전에 FTI 치료에 대한 내성을 예측하는데 유용하다.
LBC 종양유전자는 염색체 7q에서 비롯된 비관련 서열을 갖는 염색체 15q 상의 LBC 원종양유전자(서열 번호: 23 - 27)의 융합으로부터 유래된 키메라이다. 상기 서열의 C-말단에서의 원종양유전자의 절단으로 인해 유전자가 형질전환 능력을 수득하게 된다. 상기 절단은 또한 전위 이외의 다른 메카니즘으로부터 일어날 수도 있다. 예를 들면, 이상 접합은 C-말단이 절단된 RNA 전사체를 야기할 수 있다. 유전자는 mRNA 및 단백질(서열 번호: 28, 인간 LBC 단백질, 유전자은행 기탁 번호(Genbank Accession number) GI: 29791897)을 포함하여 다수의 발현 산물을 갖는다. LBC 종양유전자가 작용하는 정확한 방식은 완전히 이해되지 않고 있지만, LBC 종양유전자가 골격근, 심장, 폐, 전립선, 난소, 소장 및 조혈 세포를 포함한 일련의 조직에 존재할 수 있음은 명백하다. 종양유전자가 드러날 수 있는(드러나지는 않은) 조직에서 발생되는 암의 치료는 본 발명의 범위에 포함된다.
유전자는 절단의 산물이며 인지가능한 발현 산물을 생성하므로 본 발명의 분석을 형식화하는데 유효한 많은 융통성이 있다. 유전자 또는 그 산물의 부재를 이용할 수 있을 뿐 아니라, 상기 유전자의 변조된 발현의 검출도 또한 이용할 수 있다. 따라서, 유전자 발현 프로필은 상기 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 유전자의 부재 또는 변조는 혈액 종양에서, 보다 바람직하게는 백혈병에서, 가장 바람직하게는 AML에서 FTI 치료 반응의 지표로서 이용된다.
임의의 적합한 검출 방법을 이용하여 분자 표지로서 LBC 종양유전자를 식별할 수 있다. 분자 표지의 존재는 FTI에 의한 치료에 대한 예측이 불충분함을 나타내며, 그 부재는 상기 치료에 대한 반응의 가능성이 보다 큼을 나타낸다. LBC 종양유전자의 존재를 검출하기에 유용한 방법은, 제한없이, 단일 가닥 구조 다형성 기술, 화학적 및 열적 변성 구배 분석, 화학적 및 효소적 분열 방법, 질량 분광법, RFLP 및 대립유전자 특이적 증폭, 비율측정 PCR, 비이드-기본 및 미세배열-기본 시스템, 및 동소 하이브리드화, 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분석 및 미세배열 분석, ELISA, 웨스턴(Western), 형광 활성화 세포 분류(FACS), 항체-기본 기술, 메틸화-기본 PCR 및 SNP 검출을 포함하여, 알고 있는 돌연변이체 유전자 또는 서열을 검출하기 위한 임의의 방법을 포함한다.
LBC 종양유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 가장 바람직한 방법은 PCR에 의한 것이다. 상기 방법에서는, 통상적인 샘플 제조 방법에 따라 환자로부터 세포를 먼저 수득한다. 종양이 혈액성인 경우, 단순 말초혈 샘플 또는 골수 샘플이 바람직하다. 그다음, 잘 허용된 절차에 따라 RNA를 추출하고 다음과 같이 증폭시킨다. 표적 서열은, 예를 들면, ABI 태크맨(TaqMan, 등록상표) 완충액 중의 250nM의 프라이머 및 250nM의 태크맨(등록상표) 프로브를 이용하여 증폭시킨다. 열 주기는 50 ℃에서 2 분간, 95 ℃에서 10 분간 수행한 후, 95 ℃에서 15 분간 및 62 ℃에서 1 분간의 50 주기를 수행한다. 프라이머 및 프로브의 예는 표 1에 나타내었다.
상기 기술은 샘플 중에 존재하는 LBC 전사체의 양을 측정한다. 측정량은 동 일한 샘플을 사용하여 HPRT와 같은 내인성 대조용 유전자를 증폭시키는 유사한 RT-PCR 실험을 실행함으로써 표준화할 수 있다.
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LBC 종양유전자의 존재 또는 부재를 결정하는 또 다른 방법은 RNA 전사체의 길이를 분석하는 것이다. LBC 종양유전자는 3' 전위를 가지므로, 전사체 길이는 LBC 원종양유전자 전사체보다 더 짧을 것이다. 상기 종점은 진단에 유리하다. 전사체 크기를 진단하기 위해 원종양 및 종양유발 LBC 전사체 둘 다에 상동성인 정방향 프라이머(예를 들면, 상기 표 1의 LBC 정방향 프라이머)를 RNA 전사체의 보편적인 폴리A 꼬리에 상동성인 역방향 프라이머와 함께 사용한다. 바람직하게, 초기 cDNA 합성은 폴리A 서열의 추가의 단일 서열 tag 3'를 혼입하여 PCR 반응에 대한 추가의 특이성을 제공할 것이다.
게놈성 전위가 측정되면, 게놈성 DNA는 표준 기술 및 LBC 종양유전자에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 분리될 것이다. 예를 들면, 종양유발 및 원종양 LBC 유전자에 상동성인 정방향 프라이머를 전술한 바와 같은 폴리A 서열과 함께 사용할 수 있다. 또는, 역방향 프라이머는 3' 전위된 서열에 상동성일 수 있다. 판독물은 종양유전자의 존재가 원종양유전자보다 짧은 산물과 일치하는 증폭물의 크기이거나, 또는 종양유발LBC-특이적 증폭의 존재 또는 부재일 것이다.
세포의 LBC 종양유전자 상태에 대한 분석은 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis, IHC)과 같은 기술을 이용하여 진단 목적으로 정상/비정상 조직 분포를 측정할 수 있다. 예를 들면, LBC 단백질에 대한 항체를 IHC에 의한 연구를 위해 준비한 신선-냉동, 및 포르말린-고정된, 파라핀-함침 조직 블록 둘 다와 함께 사용할 수 있다. 각각의 조직 블록은 50 ㎎의 잔류 "분쇄된" 종양으로 이루어질 수 있다.
간략하게, 냉동-절편은, 실온에서 소형 플라스틱 캡슐에 포스페이트 완충된 식염수(PBS)에 냉동 분쇄한 종양 50 ng를 재수화시키고; 원심분리에 의해 입자들을 펠릿화하고; 이들을 점성 함침 매질(OCT)에 재현탁하고; 캡슐을 뒤집고 다시 원심분리하여 펠릿화하고; -70 ℃의 아이소펜테인중에서 순간-냉동시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고 냉동된 조직 원통을 꺼내고; 조직 원통을 저온조 마이크로톰 척(cryostat microtome chuck) 위에 고정시키고; 손상되지 않은 종양 세포를 함유하는 25 내지 50개의 연속 절편을 절단함으로써 제조할 수 있다.
영구-절편은 플라스틱 마이크로퓨즈(microfuge) 시험관에 50 ㎎ 샘플을 재수화시키고; 펠릿화하고; 4 시간동안 10% 포르말린에 재현탁하여 고정시키고; 세척/펠릿화하고; 따뜻한 2.5% 아가에 재현탁하고; 펠릿화하고; 빙수에서 냉각시켜 아가를 경화시키고; 시험관으로부터 조직/아가 블록을 꺼내고; 블록을 파라핀에 침윤 및 함침시키고; 50개 이하의 연속 영구 절편을 절단함을 포함하는 유사한 방법에 의해 준비할 수 있다.
IHC 분석의 경우, 절편들은 PBS 중의 3% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 다른 차단 시약을 함유하는 차단 용액으로 덮을 수 있다. 차단 시약으로는 비-특이 혈청 또는 분유가 포함된다. 차단은 실온에서 1 시간동안 진행한다. 항-LBC 단백질 항체를 3% BSA, 0.1% 트리톤X(TritonX, 등록상표)-100 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 함유하는 PBS 완충액으로 1:100의 비로 희석한다. 샘플 절편들은 일반적으로 4 ℃에서 16 시간동안 항체 용액으로 덮는다. 기간 및 온도 조건은 선택된 항체 및 시험된 물질에 따라 달라질 수 있다. 최적 조건은 실험적으로 결정된다. 이어서, 항체 처리된 절편들을 PBS 중에서 각각 15 분간 3회 세척하여 미결합 항체를 제거한 다음, 3% BSA 및 2차 항체를 함유하는 PBS로 1:2000의 희석률로 덮는다. 2차 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 플루오레신 아이소-티오사이아네이트 또는 기타 적합한 효소와 같은 색소형성 효소에 결합될 수 있다. 또는, 2차 항체는 바이오틴에 접합되어 발색단-표지된 아비딘과 함께 사용될 수 있다.
LBC 종양유전자의 존재를 검출하는 또 다른 대표적인 방법은 동소 하이브리드화에 의한 것이다. 일반적으로, 동소 하이브리드화는 다음의 주요 단계를 포함한다: (1) 분석될 조직 또는 생물학적 구조물의 고정; (2) 표적 DNA의 접근성을 증가시키고 비특이적 결합을 감소시키기 위한 생물학적 구조물의 예비하이브리드화 처리; (3) 생물학적 구조물 또는 조직 중의 핵산에 대한 핵산 혼합물의 하이브리드화; (4) 하이브리드화에서 결합되지 않은 핵산 단편들을 제거하기 위한 하이브리드화후 세척; 및 (5) 하이브리드화 핵산 단편의 검출. 상기 단계 각각에 사용된 시약 및 사용하기 위한 조건들은 특정 용도에 따라 달라진다.
이 경우에서, LBC 종양유전자에 하이브리드화될 수 있는(그의 염색체 위치에서) 하나 이상의 검출가능한 핵산 프로브를 포함하는 하이브리드화 용액을 하이브리드화 조건하에서 세포와 접촉시킨다. 그 다음, 임의의 하이브리드화를 검출하고 정상세포 또는 대조용 세포로부터의 예정된 하이브리드화 패턴과 비교한다. 바람직하게는, 프로브는 알파-동원체 프로브이다. 상기 프로브는 다수의 공급처(예를 들면, 일리노이주 다우너스 그로브 소재의 바이시스 인코포레이티드(Visys Inc.))로부터 상업적으로 이용가능하게 제조될 수 있다. 바람직한 태양에서, 하이브리드화 용액은 키메라(예를 들면, 15q24-25)를 구성하는 서열의 전위에 상응하는 염색체 상의 영역에 특이적인 다수의 프로브를 함유한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 하이브리드화 프로토콜은, 예를 들면, 문헌 [Albertson, EMBO J., 3:1227-1234, 1984; Pinkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9138-9142, 1988; EPO Pub. No. 430,402; and Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1994] 등에 기술되어 있다. 특히 바람직한 한 태양에서, 문헌 [Pinkel et al., Nature Genetics, 20:207-211, 1998] 또는 문헌 [Kallioniemi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5321-5325, 1992]의 하이브리드화 프로토콜을 이용한다. 하이브리드화 조건을 최적화하는 방법은 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier, NY] 참조).
바람직한 태양으로, 비-특이적 결합을 감소시키기 위해 하이브리드화동안 세제(예를 들면, C-TAB) 또는 차단 시약(예를 들면, 정액 DNA, cot-1 DNA 등)을 사용하여 배경 신호를 감소시킨다. 바람직하게는, 하이브리드화는 약 0.1 내지 약 0.5 ㎎/㎖ DNA(예를 들면, cot-1 DNA)의 존재하에 수행한다.
프로브는 합성 방법 또는 생물학적 숙주에서 성장시키는 방법을 포함하여, 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 합성 방법은 올리고뉴클레오티드 합성, 리보프로브 및 PCR을 포함한다.
프로브는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 검출가능한 표지로 표지화할 수 있다. 프로브를 표지화하는 방법은 무작위 초회항원자극, 말단 표지화, PCR 및 틈 번역(nick translation)을 포함한다. 효소적 표지화는 핵산 폴리머라제, 3개의 비표지 뉴클레오티드, 및 직접 표지화되거나 표지에 결합되기 위한 링커 팔을 함유하거나 또는 합텐 또는 표지화된 결합 분자가 결합될 수 있는 기타 분자에 결합되는 4번째 뉴클레오티드의 존재하에 수행된다. 적합한 직접 표지는 32P, 3H 및 35S와 같은 방사성 표지, 및 형광 표지, 예를 들면, 플루오레신, 텍사스 레드(Texas Red), AMCA 블루, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 로다민 등과 같은 비-방사성 표지; 가시광선으로 검출가능한 사이아닌 염료; 효소 등을 포함한다. 표지는 또한 바이설파이트-매개된 아민교환에 의해 또는 올리고뉴클레이티드 합성동안 직접 DNA 프로브에 화학적으로 혼입될 수 있다.
형광성 표지는 프로브내에 혼입된 활성화된 링커 팔을 갖는 뉴클레오티드에 용이하게 결합될 수 있다. 전술한 방법에 의해, 합텐, 또는 바이오틴 또는 디곡시제닌과 같은 다른 분자에 공유 결합된 뉴클레오티드를 혼입하고, 상기 합텐 또는 다른 분자로 유도되는 표지된 항체와, 또는 바이오틴의 경우 검출가능한 표지에 접합된 아비딘과 샌드위치 하이브리드화를 수행함으로써 프로브를 간접적으로 표지화할 수 있다. 항체 및 아비딘은 형광성 표지, 또는 알칼리 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 표지와 접합되어 검출가능하게 될 수 있다. 접합된 아비딘 및 항체는 벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories, 캘리포니아주 벌링에임 소재) 및 베링거 만하임(Boehringer Mannheim, 인디애나주 인디애나폴리스 소재)과 같은 회사에서 상업적으로 시판한다.
효소는 효소에 대한 기질을 제공함으로써 비색 반응을 통해 검출될 수 있다. 다양한 기질의 존재하에, 상기 반응에 의해 상이한 색을 생성하고, 이들 색을 가시화시켜 다수의 프로브를 별도로 검출할 수 있다. 당해 분야에 공지된 어떤 기질도 사용할 수 있다. 알칼리 포스파타제에 바람직한 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP) 및 나이트로 블루 테트라졸륨(NBT)을 포함한다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 바람직한 기질은 다이아미노벤조에이트(DAB)이다.
본 발명의 동소 하이브리드화 방법에 사용하기에 적합한 형광 표지된 프로브는 바람직하게는 150 내지 500 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 프로브는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다.
세포에 검출가능한 프로브를 하이브리드화하는 것은 0.1 내지 500 ng/㎕, 바람직하게는 5 내지 250 ng/㎕의 프로브 농도를 사용하여 수행한다. 하이브리드화 혼합물은 바람직하게는 폼아마이드와 같은 변성제를 함유할 것이다. 일반적으로, 하이브리드화는 25 내지 45 ℃, 보다 바람직하게는 32 내지 40 ℃, 가장 바람직하게는 37 내지 38 ℃에서 수행한다. 하이브리드화에 필요한 시간은 약 0.25 내지 96 시간, 보다 바람직하게는 1 내지 72 시간, 가장 바람직하게는 4 내지 24 시간이다. 하이브리드화 시간은 프로브 농도, 및 촉진제, 예를 들면, hnRNP 결합 단백질, 트라이알킬 암모늄염, 락탐 등을 함유할 수 있는 하이브리드화 용액 내용물을 근거로 달라질 것이다. 이어서, 슬라이드를 폼아마이드와 같은 변성제, 및 감소되는 농도의 염화나트륨을 함유하는 용액, 또는 미결합 및 잘못 결합된 프로브를 제거하는 임의의 용액으로 세척한다.
염의 온도 및 농도는 목적하는 하이브리드화의 엄정성에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 매우 엄정한 세척은 42 내지 68 ℃에서 수행할 수 있지만, 중간 정도의 엄정성은 37 내지 55 ℃의 범위일 수 있으며, 낮은 엄정성은 30 내지 37 ℃의 범위일 수 있다. 매우 엄정한 세척을 위한 염 농도는 0.5 내지 1배의 SSC(0.15M NaCl, 0.015M Na 시트레이트)일 수 있지만, 중간 정도의 엄정성은 1 내지 4배일 수 있고 낮은 엄정성은 2 내지 6배의 SSC일 수 있다.
검출 배양 단계는, 필요한 경우, 바람직하게는 23 내지 42 ℃, 보다 바람직하게는 25 내지 38 ℃, 가장 바람직하게는 37 내지 38 ℃의 가습 챔버에서 수행해야 한다. 표지화된 시약은 바람직하게는 BSA, 탈지 분유 등과 같은 차단 시약을 함유하는 용액으로 희석해야 한다. 희석률은 1:10 내지 1:10,000, 보다 바람직하게는 1:50 내지 1:5,000, 가장 바람직하게는 1:100 내지 1:1,000의 범위일 수 있다. 슬라이드 또는 다른 고체 지지체는 각 배양 단계 사이에 세척하여 과량의 시약을 제거해야 한다.
그 다음, 슬라이드를 설치하고 가시선 검출가능한 표지의 경우 현미경 검사에 의해, 또는 방사성 표지의 경우 자동방사선사진 필름에 노출시켜 분석한다. 형광성 표지의 경우, 슬라이드는 바람직하게는 퇴색 방지 시약을 함유하는 용액 중에 설치하고, 형광 현미경을 사용하여 분석한다. 증가된 검출 정확도를 위해 다수의 핵산을 시험할 수 있다.
또한, LBC 종양유전자의 발현 산물에 대한 분석법은 또한 LBC 종양유전자 돌연변이가 일어났는지 여부를 측정하는데 이용할 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 분석법은 면역분석법이다. 면역분석법은 그의 가장 간단하고 직접적인 의미로, 결합 분석법이다. 특정의 바람직한 면역분석법은 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 유형의 효소 결합된 면역흡착 분석법(immunosorbent assay, ELISA) 및 방사성면역분석법(radioimmunoassay, RIA)이다. 조직 절편을 사용한 IHC 검출도 또한 특히 유용하다.
하나의 대표적인 ELISA에서는, 항-종양유발LBC 단백질-특이적 항체를 폴리스타이렌 마이크로 플레이트(microtiter plate)의 웰과 같은 단백질 친화도를 나타내는 선택된 표면위에 고정화시킨다. 그 다음, 임상 샘플과 같은 목적 항원을 함유하는 시험 조성물을 웰에 가한다. 결합시키고 세척하여 비-특이적 결합된 면역 착체를 제거한 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 검출은 일반적으로 검출가능한 표지에 결합된, 목적 항원에 특이적인 또 다른 항체를 가하여 달성된다. 상기 유형의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 목적 항원에 특이적인 제 2 항체를 가한 후 제 2 항체에 결합 친화도를 갖는, 검출가능한 표지에 결합된 제 3의 항체를 가하여 이루어질 수 있다.
ELISA 기술의 변형 방법도 공지되어 있다. 그러한 변형 중 하나로, 목적 항원을 함유하는 샘플을 웰 표면 위에 고정화시킨 다음 본 발명의 항체와 접촉시킨다. 결합 및 적절한 세척 후에, 결합된 면역 착체를 검출한다. 초기 항원 특이적 항체가 검출가능한 표지에 결합되는 경우, 면역 착체를 직접 검출할 수 있다. 다시, 면역 착체는 1차 항원 특이적 항체에 결합 친화도를 갖는, 검출가능한 표지에 결합된 제 2 항원을 이용하여 검출할 수 있다.
시험 샘플이 알고 있는 양의 표지된 항원 또는 항체와 결합을 완료하는 경쟁적 ELISA도 또한 가능하다. 미지의 샘플 중 반응성 종의 양은, 코팅된 웰을 사용하여 배양하기 전이나 배양중에 알고있는 표지된 종과 샘플을 혼합함으로써 측정한다. 샘플 중의 반응성 종의 존재는 웰에 결합하기 위해 이용가능한 표지된 종의 양을 감소시키는 작용을 하므로 최종 신호를 감소시킨다.
항원 또는 항체는 또한 고체 지지체, 예를 들면, 플레이트, 비이드, 계량봉, 막 또는 컬럼 매트릭스에 결합될 수 있으며, 분석될 샘플이 고정화된 항원 또는 항체에 적용될 수 있다. 플레이트를 항원 또는 항체로 코팅하는데 있어, 일반적으로 항원 또는 항체의 용액을 갖는 플레이트의 웰을 밤새 또는 특정 기간동안 배양할 것이다. 그 다음, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 이어서, 웰의 임의의 남은 이용가능한 표면을 시험 항혈청에 대해 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"한다. 이들은 BSA, 카세인 및 분유 용액을 포함한다. 코팅으로 인해 고정화 표면 위의 비특이적 흡착 부위의 차단이 가능하므로 표면 위의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기된 배경을 감소시킨다.
ELISA에서, 직접적인 절차보다 2차 또는 3차 검출 수단을 이용하는 것이 통상적이다. 따라서, 항원 또는 항체를 웰에 결합시키고, 비-반응성 물질로 코팅하여 배경을 감소시키고, 세척하여 미결합 물질을 제거한 후, 고정화 표면을 면역 착체(항원/항체)를 제공하기에 효과적인 조건하에서 시험될 임상 또는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 이것은 항원 및 항체를 BSA, 소 감마 글로뷸린(BGG) 및 PBS/트윈(Tween)과 같은 용액으로 희석함을 포함한다. 상기 약제들은 또한 비특이적 배경의 감소를 촉진하는 경향이 있다. 이어서, 면역 착체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 하거나, 또는 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
ELISA에서 모든 배양 단계 후에, 비-착화 물질을 제거하기 위해 접촉된 표면을 세척한다. 세척은 종종 PBS/트윈 또는 보레이트 완충액의 용액으로 세척함을 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질간의 특이적 면역 착체가 형성되고 이어서 세척한 후에, 소량의 면역 착체의 발생도 측정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제 2 또는 제 3의 항체는 검출을 가능하게 하는 결합된 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 상기 표지는 적절한 색소형성 기질과 함께 배양시 발색을 야기할 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 접촉 및 제 1 또는 제 2 면역 착체를 유레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리 포스파타제 또는 하이드로겐 퍼옥시다제-접합 항체와 함께 추가 면역 착체 생성의 진행에 유리한 시간동안 유리한 조건하에서 배양, 예를 들면, PBS-트윈과 같은 PBS-함유 용액에서 실온에서 2 시간동안 배양한다.
표지된 항체와 함께 배양하고 이어서 세척하여 미결합 물질을 제거한 후, 예를 들면, 효소 표지로서 퍼옥시다제의 경우, 유레아 및 브르모크레졸 퍼플 및 H2O2와 같은 색소형성 기질과 함께 배양하여 표지의 양을 정량한다. 이어서, 정량화는, 예를 들면, 가시선 스펙트럼 분광계를 사용하여 색 형성 정도를 측정하여 달성된다. 또는, 표지는 화학발광성 표지일 수 있다. 상기 표지의 용도는 미국 특허 제 5,310,687, 5,238,808 및 5,221,605 호에 기술되어 있다.
FTI에 대한 반응을 측정하기 위해 유전자 발현을 검출하는 본 발명의 태양에서, 유전자 발현 포트폴리오를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 유전자의 포트폴리오는 그들에 대해 수득된 발현 정보가 진단, 예측 또는 치료 선택과 같은 임상적으로 타당한 판단을 내리기 위한 기준을 제공하도록 분류된 유전자의 조합이다. 이 경우, 유전자 발현 포트폴리오는 암 환자에서 FTI의 사용에 관한 치료적 결정을 용이하게 내리도록 형성될 수 있다.
차별적 발현이 FTI 치료에 대한 반응 가능성을 나타내는 하나 이상의 다른 유전자들과 함께 유전자 발현 프로필의 일부로서 LBC 종양유전자의 발현을 검출하는 것이 가장 바람직하다. 하나 이상의 하기의 유전자들을 또한, 가장 바람직하게는 LBC 종양유전자와 함께, 사용할 수 있다: AHR, MINA53, IDS, OPN3, GPR105, TEM6, TNFSF13, SVIL, IL3RA, C6orf56, FRAG1, GOSR1, KIAA1036, BTG3, MAPK8IP3, LILRB3, ARHH, NPTX2(서열 번호: 1, 3 내지 18 및 29). OPN3 및 IL3RA는 하나 이상의 다른 유전자와 함께 사용하며, 바람직하게, 프로필은 둘 이상의 임의의 상기 유전자를 포함한다. 가장 바람직한 유전자 발현 프로필은 LBC 종양유전자와 AHR의 차별적 발현을 검출한다. 세 유전자의 바람직한 조합은 LBC, AHR 및 MINA53이다. 상기 유전자들의 접합 변이체와 같은 변이체도 또한 상기 용도에 유용하다.
유전자 발현 프로필을 확립하는 바람직한 방법(타당한 생물학적 경로의 설명에 도달하기 위해 이용되는 방법 포함)은 단백질 또는 펩타이드를 암호화하거나 또는 RNA를 전사할 수 있는 유전자에 의해 생성된 RNA의 양을 측정함을 포함한다. 이것은 역 전사 PCR(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 차별 표시 RT-PCR, 노던 블롯(Northern Blot) 분석 및 기타 관련된 시험들에 의해 가장 잘 달성된다. 개별적 PCR 반응을 이용하여 상기 기술들을 수행하는 것이 가능하지만, mRNA로부터 생성된 복제 DNA(cDNA) 또는 복제 RNA(cRNA)를 증폭하고 미세배열에 의해 분석하는 것이 종종 바람직하다. 다수의 상이한 배열 형태 및 제조 방법은 당해 분야의 기술을 가진 자들에게 공지되어 있으며, 본원에 참고로 인용된 다음과 같은 미국 특허들에 기술되어 있다: 5,445,934; 5,532,128; 5,556,752; 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,599,695; 5,624,711; 5,658,734; 및 5,700,637 호.
미세배열 기술은 수천의 유전자의 정상-상태 mRNA 수준을 동시에 측정할 수 있게 함으로써 세포 생물학에 대한 FTI의 효과를 확인하기 위한 강력한 도구 및 상기 효과의 분석을 기초로 한 치료의 가능한 효과를 제공할 수 있게 한다. 두가지 미세배열 기술이 현재 널리 사용되고 있다. 첫 번째는 cDNA 배열이고 두 번째는 올리고뉴클레오티드 배열이다. 이들 칩의 구성에는 차이가 존재하지만, 필수적으로 모든 하류 데이터 분석 및 산출물은 동일하다. 이들 분석의 산물은 전형적으로 미세배열 상의 알고 있는 위치에서 핵산 서열에 하이브리드화되는 샘플로부터 cDNA 서열을 검출하기 위해 사용되는 표지된 프로브로부터 수용된 신호의 강도의 측정이다. 전형적으로, 신호 강도는 샘플 세포에서 발현된 cDNA 량, 및 따라서 mRNA 량에 비례한다. 다수의 상기 기술이 이용가능하며 유용하다. 바람직한 방법은 각각 본원에 참고로 인용된 린슬리(Linsley) 등의 미국 특허 제 6,271,002 호; 프렌드(Friend) 등의 제 6,218,122 호; 펙(Peck) 등의 제 6,218,114 호; 및 왕(Wang) 등의 제 6,004,755 호에서 찾을 수 있다.
발현 수준의 분석은 상기 강도를 비교함으로써 수행된다. 상기 비교는 시험 샘플에서의 유전자 발현 강도 대 대조용 샘플에서의 유전자 발현 강도의 비 행렬을 작성함으로써 가장 잘 이루어진다. 예를 들면, 약물로 처리된 조직으로부터의 유전자 발현 강도는 약물로 치료하지 않은 동일 조직으로부터 발생된 발현 강도와 비교할 수 있다. 상기 발현 강도의 비는 시험 샘플과 대조 샘플 사이의 유전자 발현에서의 배율-변화를 나타낸다.
유전자 발현 프로필은 또한 여러 방법으로 표현될 수 있다. 일반적인 방법은 비 행렬을 그래프식 덴드로그램으로 배열하는 것으로, 이때 열은 시험 샘플을 나타내고 행은 유전자를 나타낸다. 데이터는 유사한 발현 프로필을 갖는 유전자가 서로에 근접하도록 배열된다. 각 유전자에 대한 발현 비는 색으로 가시화한다. 예를 들면, 1 미만의 비(하향-조절을 나타냄)는 스펙트럼의 청색 부분에서 나타날 수 있는 반면, 1보다 큰 비(상향-조절을 나타냄)는 스펙트럼의 적색 부분에서 색으로 나타날 수 있다. 실리콘 제네틱스, 인코포레이티드(Silicon Genetics, Inc.)의 "진스프린트(GENESPRINT)" 및 파르텍, 인코포레이티드(Partek, Inc.)의 "디스커버리(DISCOVERY)" 및 "인퍼(INFER)"를 포함하여, 상업적으로 시판하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 상기 데이터를 표시하는데 이용가능하다.
차별적으로 발현된 유전자는, 전술한 유전자 발현의 평가에 의해 추정되듯이, FTI에 의한 치료후 병에 걸린 세포에서, 또는 치료전에 반응자 대 무반응자에서 상향 조절되거나 하향 조절된다. 상향 조절 및 하향 조절은 일부 기준선에 대한 유전자의 발현량에 검출가능한 차이(측정하기 위해 사용되는 시스템의 잡음에 의한 것 이상)가 발견됨을 의미하는 상대적인 용어들이다. 이 경우, 기준선은 미처리된 병에 걸린 세포의 측정된 유전자 발현이다. 이어서, 치료된 병에 걸리 세포에서 문제의 유전자를 동일한 측정 방법을 이용하여 기준선 수준에 대해 상향 또는 하향 조절한다. 바람직하게, 상향 및 하향 조절의 수준은 하이브리드화 미세배열 프로브의 강도 측정치의 배율 변화를 기준으로 구별된다. 상기 구별을 짓기 위해 1.5배 차이가 바람직하다. 즉, 유전자가 치료된 병에 걸린 세포 대 미치료된 병에 걸린 세포에서 차별적으로 발현된다고 말하기에 앞서, 치료된 세포는 미치료된 세포보다 1.5배 이상, 또는 1.5배 미만의 강도를 제공하는 것으로 나타난다. 1.7배 차이가 보다 바람직하며, 유전자 발현 측청치에서 2배 이상의 차이가 가장 바람직하다.
본 발명의 한 방법은 사람이 치료제의 사용에 반응할 것인지 여부를 결정하기 위해 다양한 유전자에 대한 유전자 발현 프로필을 비교함을 포함한다. 무반응자와 반응자를 구별하는 유전자 발현 프로필이 확립되면, 각각의 유전자 발현 프로필을 하기에 기술하는 바와 같은 컴퓨터 판독 매체와 같은 매체에 기록한다. 그 다음, 병에 걸린 세포(예를 들면, AML의 경우 조혈 모세포)를 함유하는 환자 샘플을 수득한다. 가장 바람직하게는, 샘플은 골수 샘플로서 환자를 약물로 치료하기 전에 통상적인 방법에 따라 환자의 흉골 또는 장골 능선에서 추출한다. 바람직하게, 골수 흡출물은 통상적인 방법을 이용하여 백혈병 모세포가 많아지도록 처리한다. 그 다음, 병에 걸린 환자의 세포로부터 샘플 RNA를 수득하고 증폭시키고, 바람직하게는(거대 유전자 포트폴리오의 경우) 미세배열에 의해, 적절한 포트폴리오의 유전자에 대해 유전자 발현 프로필을 수득한다. 그 다음, 샘플의 발현 프로필을 반응자 및 무반응자로서 미리 결정된 것들과 비교한다. 샘플 발현 패턴이 FTI 반응자 발현 패턴과 일치하면, FTI에 의한 치료를 지시할 수 있다(상쇄되는 의료적 고려사항이 없는 경우). 샘플 발현 패턴이 FTI 무반응자의 발현 패턴과 일치하면, FTI에 의한 치료는 지시되지 않을 것이다. 단일 유전자, LBC 종양유전자를 사용할 때와 같이 소수의 유전자를 포트폴리오에 사용하는 경우, 간단한 핵산 증폭 및 검출 방법이 유전자 변조를 측정하는 가장 바람직한 방법이다. 그러한 경우, 숙련된 전문가에게 공지되어 있는 PCR, NASBA, 회전환, LCR 및 기타 증폭 방법을 이용할 수 있으며, PCR이 가장 바람직하다. 포트폴리오가 다수의 유전자를 포함하거나, 많은 다른 유전자의 발현을 측정하는 것이 바람직한 경우, 전술한 바와 같은 미세배열의 강도 측정을 기준으로 발현 패턴을 평가하는 것이 바람직하다.
유사한 방식으로, 유전자 발현 프로필 분석은 치료 반응을 모니터하기 위해 수행될 수 있다. 상기 방법의 한 태양에서, 전술한 바와 같은 유전자 발현 분석은 치료 과정 전체에 걸쳐 다양한 시기에 FTI로 치료한 환자에게 수행한다. 유전자 발현 패턴이 반응자와 일치하면, 환자의 치료를 지속한다. 그렇지 않다면, 티로신 키나제 억제제와 같은 추가 치료제를 사용하거나, 투여량을 변화하거나 또는 FTI 치료를 배제하는 것과 같이 환자의 치료를 변경한다. 상기 분석은 검출가능한 임상 징후에 앞서 또는 다른 분명치않은 임상 징후에도 불구하고 간섭 및 치료 조정을 허용한다.
본 발명의 분자 표지와 관련하여, 다수의 다른 형식 및 접근방법을 진단 용도로 이용할 수 있다. 게놈 영역들의 메틸화는 유전자 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 유전자 프로모터 영역의 과메틸화는 유전자 발현을 조직적으로 하향-조절할 수 있는 반면, 저메틸화는 정상-상태 mRNA 수준에 증가를 야기할 수 있다. 따라서, 약물 반응을 예측하는 유전자에 결합된 메틸화 영역의 검출은 유전자 발현 수준을 진단하는 대안적 방법으로 이용될 수 있다. 상기 방법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 또는, 프로모터 영역에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)도 또한 유전자의 전사 활성에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 방법에 의해 상기 SNP를 검출하는 것도 또한 반응자와 무반응자 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 검출하기 위한 진단으로 이용될 수 있다.
반응자와 무반응자 사이의 구별은 또한 치료 전에 존재하는 골수 백혈병 모세포의 비율, 및/또는 CD33 및/또는 CD34와 같은 세포 표면 항원의 존재의 추가 분석을 이용하여 유리하게 이루어질 수 있다. CD33 및 CD34 표면 항원의 저 발현은 FTI 치료에 대한 증가된 반응 가능성을 나타낸다. 이것은 가장 편리하게는 상기 항원을 발현하는 샘플 중의 세포의 퍼센트로서 측정되며, 반응자는 CD33을 발현하는 상기 세포 약 60% 이하 및 CD34를 발현하는 상기 세포 약 15% 이하를 갖는다. CD33을 발현하는 상기 세포의 비율이 60%를 초과하거나 CD34 항원을 발현하는 세포가 15%를 초과하는 비율은 환자가 FTI 치료에 무반응자일 것임을 나타낸다. 또한, 모세포인 세포의 비율이 약 60% 미만인 전술한 바와 같이 취한 샘플은 FTI 치료에 반응할 것인 반면, 상기 비율을 초과하는 모세포 수를 갖는 샘플은 그렇지 않다. CD33＋, CD34＋ 및 모세포수의 퍼센트 측정은 임의의 공지된 방법에 따라 수행하며, 가장 효과적으로는 대부분의 임상 실험실에서 수행되는 표준 병리학적 시험 및 조직표본을 이용하여 수행한다.
본 발명의 제품은 질환을 치료, 진단, 예측, 시기결정 및 달리 평가하는데 유용한 유전자 발현 프로필의 설명서이다. 바람직하게는, 이들은 컴퓨터 판독 매체(자기, 광학 매체 등)와 같이 자동적으로 판독될 수 있는 매체로 옮긴다. 상기 제품은 또한 상기 매체중의 유전자 발현 프로필을 평가하는 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 제품은 전술한 유전자들의 포트폴리오의 유전자 발현 프로필을 비교하기 위한 컴퓨터 설명서를 갖는 CD 롬을 포함할 수 있다. 상기 제품은 또한 환자 샘플로부터의 유전자 발현 데이터와 비교할 수 있도록 그 안에 디지털로 기록된 유전자 발현 프로필을 가질 수 있다. 또는, 상기 프로필은 상이한 표현 형식으로 기록될 수 있다. 상기에서 언급한 파르텍, 인코포레이티드의 "디스커버리" 및 "인퍼" 소프트웨어에 삽입된 것과 같은 균주군생성 알고리듬이 상기 데이터의 가시화를 가장 잘 촉진할 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 제품은 전술한 분석을 수행하기 위한 키트이다. 각각의 상기 키트는 바람직하게는 인간 또는 기계 판독 형태의 설명서, 및 기술한 분석 유형에 전형적인 시약을 포함한다. 이들은, 예를 들면, 본 발명의 유전자 발현 프로필을 식별하도록 구성된, 전술한 바와 같은 핵산 배열(예를 들면, cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 배열)을 포함할 수 있다. 이들은 또한, 예를 들면, 역 전사효소, 역 전사효소 프라이머, 상응하는 PCR 프라이머 세트, 열안정성 DNA 폴리머라제, 예를 들면, Taq 폴리머라제, 및 적당한 검출 시약(들), 예를 들면, 제한 없이, 전갈 프로브, 형광성 프로브 분석용 프로브, 분자 표지 프로브, 단일 염료 프라이머 또는 이중 가닥 DNA에 특이적인 형광 염료, 예를 들면, 에티듐 브로마이드를 포함하여, 핵산 증폭 및 검출을 수행하기 위해 사용되는 시약을 함유할 수 있다. 표면 항원을 검출하기 위한 키트는 염색 물질을 함유하거나, 또는 완충액, 항-항원성 항체, 검출 효소 및 기질, 예를 들면, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 바이오틴-아비딘계 시약과 같은 성분들을 포함함을 기본으로 하는 항체이다. 모세포를 검출하기 위한 키트 구성요소는 일반적으로 흘림세포계측법, 모세포 접합 분석 및 기타 일반적으로 실행되는 모세포 분석을 수행하기 위한 시약을 포함한다.
백혈병의 진단 및 치료 방법(METHODS FOR ASSESSING AND TREATING LEUKEMIA)이란 발명의 명칭을 가지고 2002년 10월 30일자로 출원된 본 발명자의 계류중인 출원(출원 번호 10/283,975 호)에 기술된 바와 같이, 바람직한 FTI 이외에, 본 발명의 바람직한 약물은 MAPK/ERK 신호 경로, TGFβ, WNT 또는 세포사멸 경로를 변조시키는 것들이다. 이들로는, 제한 없이, 티로신 키나제 억제제, MEK 키나제 억제제, P13K 키나제 억제제, MAP 키나제 억제제, 세포사멸 변조제 및 그의 혼합물이 포함된다. 이들 중에서 가장 바람직한 대표적인 약물은 노바티스(Novartis)의 "글리벡(GLEEVEC)" 티로신 키나제 억제제, U-0126 MAP 키나제 억제제, PD-098059 MAP 키나제 억제제, SB-203580 MAP 키나제 억제제 및 안티센스, 리보자임 및 DNA자임, Bcl-XL 및 항-세포사멸제이다. 다른 유용한 약물의 예로는, 제한 없이, 미국 특허 제 6,306,897 호의 칼라놀라이드; 미국 특허 제 6,284,764 호의 치환된 바이사이클릭; 미국 특허 제 6,133,305 호의 인돌린; 및 미국 특허 제 6,271,210 호의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
FTI는 또한, 예를 들면, 다음에서 선택된 다른 통상적인 항암제와 함께 사용될 수 있다: 백금 배위 화합물, 예를 들어, 시스플라틴 또는 카보플라틴, 탁세인 화합물, 예를 들면, 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 캄프토테신 화합물, 예를 들면, 이리노테칸 또는 토포테칸, 항-종양 빈카 알칼로이드, 예를 들면, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 빈오렐빈, 항-종양 뉴클레오시드 유도체, 예를 들면, 5-플로오로유라실, 겜시타빈 또는 카페시타빈, 질소 머스터드 또는 나이트로소유레아 알킬화제, 예를 들면, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 카뮤스틴 또는 로뮤스틴, 항-종양 안트라사이클린 유도체, 예를 들면, 다우노루비신, 독소루비신 또는 이다루비신; HER2 항체, 예를 들면, 트라스츠맙; 및 항-종양 포도필로톡신 유도체, 예를 들면, 에토포시드 또는 테니포시드; 및 에스트로겐 수용체 길항물질 또는 선택적 에스트로겐 수용체 변조제를 포함한 항에스트로겐제, 바람직하게는 타목시펜, 또는 양자택일적으로 토레미펜, 드롤옥시펜, 파슬로덱스 및 랄옥시펜, 또는 아로마타제 억제제, 예를 들면, 엑세메스테인, 아나스트로졸, 레트라졸 및 보로졸.
FTI는 방사선조사와 함께 전술한 바와 같은 환자에게 투여될 수 있다; 상기 치료는 FTI가, 예를 들면, WO 00/01411 호에 기술된 바와 같이 방사성민감제로 작용하여 상기 방사선조사의 치료 효과를 증대시킬 수 있기 때문에 특히 유리할 수 있다. 방사선조사는 이온화 방사선, 특히 선형 가속제에 의해 또는 현재 통상적으로 사용되는 방사선핵종에 의해 방출되는 감마 방사선을 의미한다. 방사선핵종에 의한 종양의 방사선조사는 외부적이거나 내부적일 수 있다.
바람직하게, FTI 투여는 종양의 방사선조사 전 1 개월 이하, 특히 10 일 또는 1 주일 이하에 개시된다. 또한, 종양의 방사선조사를 나누어 첫 번째 및 마지막 방사선조사 기간 사이에 FTI 투여를 유지하는 것이 유리하다. FTI의 양, 방사선조사 용량 및 방사선조사 용량의 간헐성은 종양의 유형, 그 위치, 화학 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 파라미터에 따라 달라질 것이며, 궁극적으로 각각의 개별적 경우에서 의사 및 방사선전문의가 결정할 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 암 치료는 또한, 종양을 가진 숙주에 있어 상기 숙주에게 종양 부근에 방사선을 투여하기 전, 투여하는 중 또는 투여한 후에 본 발명에 따라 방사선-증감 효과량의 FTI를 투여함을 포함한다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 약물은 유전자 치료 또는 안티센스 치료 또는 RNA 간섭에 관한 치료제일 수 있다. mRNA 서열에 상보성인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입하여 mRNA의 번역을 차단함으로써 mRNA를 암호화하는 유전자의 기능을 차단할 수 있다. 유전자 발현을 차단하기 위한 올리고뉴클레오티드의 사용은, 예를 들면, 본원에 참고로 인용된 문헌 [Strachan and Read, Human Molecular Genetics, 1996]에 기술되어 있다.
상기 안티센스 분자들은 DNA, DNA의 안정한 유도체, 예를 들면, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트, RNA, RNA의 안정한 유도체, 예를 들면, 2'-O-알킬RNA, 또는 기타 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 안티센스 분자는 미세주입, 리포솜 캡슐화에 의해, 또는 안티센스 서열을 갖는 벡터로부터 발현시킴으로써 세포내에 도입될 수 있다.
유전자 요법의 경우, 해당 유전자를, 수용체 숙주 세포의 감염에 의해 치료 DNA의 전이를 매개하는 바이러스 벡터에 접합시킬 수 있다. 적합한 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 폴리오 바이러스 등이 포함된다. 또는, 치료용 DNA는, 리간드-DNA 접합체 또는 아데노바이러스-리간드-DNA 접합체, 리포펙션(lipofection) 막 융합 또는 직접적 미세주입을 이용한 수용체-매개 표적 DNA 전이를 포함한 비-바이러스 기술에 의해 유전자 요법을 위한 세포내로 전이될 수 있다. 상기 절차 및 그 변형은 생체외 및 생체내 유전자 치료에 적합하다. 유전자와 함께 이용하기에 적합한 유전자 치료의 분자 방법론용 프로토콜은 [Gene Therapy Protocols, edited by Paul D. Robbins, Human press, Totowa NJ, 1996]에 기술되어 있다.
FTI는, 폐암(예를 들면, 아데노암종, 및 비-소세포 폐암 포함), 췌장암(예를 들면, 외분비선 췌장 암종과 같은 췌장 암종), 결장암(예를 들면, 결장직장 암종, 예를 들면, 결정 아데노암종 및 결장 선종), 진행성 질환을 포함한 전립선암, 림프 계열의 조혈 종양(예를 들면, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종), 골수성 백혈병(예를 들면, AML), 갑상선 소포암, 척수이형 증후군(MDS), 간엽 유래 종양(예를 들면, 섬유육종 및 횡문근육종), 흑색종, 기형육종, 신경모세포종, 교종, 피부의 양성 종양(예를 들면, 각질가시세포종), 유방암종(예를 들면, 진행성 유방암), 신장암종, 난소암종, 방광암종 및 표피암종을 포함하여 다양한 유형의 암을 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 약물을 포함하는 약학적으로 유용한 조성물은 공지된 방법에 따라, 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체의 혼합물에 의해 제형화될 수 있다. 상기 담체 및 제형화 방법의 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다. 효과적인 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 조성물을 생성하기 위해, 상기 조성물은 효과량의 약물을 함유할 것이다. 약물의 효과량은 개개인의 상태, 체중, 성별 및 연령과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 다른 요인으로는 투여 방식이 포함된다. 약학 조성물은 피하, 국소, 경구 및 근육내와 같은 다양한 경로에 의해 개개인에 제공될 수 있다.
본 발명의 약물은 약물의 기본 분자의 화학적 유도체를 포함한다. 즉, 이들은 정상적으로 기본 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 잔기를 함유할 수 있다. 상기 잔기는 기본 분자의 용해도, 반감기, 흡수성 등을 개선할 수 있다. 또는, 상기 잔기는 기본 분자의 바람직하지 않은 부작용을 경감시키거나 또는 기본 분자의 독성을 감소시킬 수 있다. 상기 잔기의 예는 다양한 교재, 예를 들면, [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다.
본원에 개시된 방법에 따라 확인된 화합물은, 임의의 잠재적인 독성을 최소화하면서 최적 억제 또는 활성을 수득하기 위해, 통상적인 시험에 의해 결정된 적절한 투여량으로 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 다른 약제들의 공-투여 또는 연속 투여도 바람직할 수 있다.
본 발명의 약물은 통상적인 투여용 비히클 중에 매우 다양한 치료 투여형으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 약물은 정제, 캡슐(방출 시간 조절 및 서방성 제형 포함), 환제, 분말, 과립, 엘릭시르제, 팅크제, 용액, 현탁액, 시럽 및 유화액으로서 경구 투여형으로 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 마찬가지로, 이들은 또한 정맥내(거환 및 주입 둘 다), 복강내, 피하, 폐색하에 또는 폐색없이 국소로, 또는 근육내 형태로 투여될 수 있는데, 모든 사용 형태는 약학 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 효과적이지만 독성이 없는 양의 목적 화합물을 변조제로 사용할 수 있다.
생성물의 일일 투여량은 하루에 환자당 0.01 내지 1,000 ㎎으로 광범위하게 달라질 수 있다. 경구 투여시, 조성물은 바람직하게는 치료될 환자에 대한 투여량의 증상 조정을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0 및 50.0 ㎎의 활성 성분을 함유하는 분할선이 있거나 없는 정제의 형태로 제공된다. 효과량의 약물은 통상적으로 하루에 약 0.0001 내지 약 100 ㎎/㎏ 체중의 투여 수준으로 공급된다. 상기 범위는 보다 특히는 하루에 약 0.001 내지 10 ㎎/㎏ 체중이다. 목적 효과를 달성하기 위해 혼합될 때 상기 투여량은 조정된다. 다른 한편으로, 이들 다양한 약제들의 투여량은 독립적으로 최적화되고 합하여져, 약제가 단독으로 사용되는 경우보다 병상이 더 많이 감소되는 상승적인 결과를 달성할 수 있다.
유리하게, 본 발명에 사용된 화합물 또는 변조제는 단일 일일 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 일일 투여량은 하루에 2, 3 또는 4회의 분할 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 대한 화합물 또는 변조제는 적당한 비강내 비히클의 국소 사용에 의해 비강내 형태로, 또는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 경피 패치의 형태로 경피적 경로로 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여되기 위해, 투여량 투여는 투여량 섭생 전체에 걸쳐 간헐적이지 않고 연속적임은 물론이다.
하나보다 많은 활성 약제와의 복합 치료의 경우, 활성 약제가 별도의 투여 제형으로 존재할 때, 활성 약제를 동시에 투여할 수 있거나, 또는 이들은 각각 따로따로 엇갈린 시간에 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 변조제를 사용하는 투여량 섭생법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의료 상태; 치료될 질환의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간장 기능; 및 사용된 특정 약물을 포함한 다양한 요인들에 따라 선택된다. 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 질병의 진행을 예방, 역전 또는 억제하는데 필요한 약물의 효과량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 독성없이 효과를 제공하는 범위이내의 약물의 농도를 달성하는데 최적 정밀도는 표적 부위에 약물의 이용가능성의 동력학을 기준으로 한 섭생법을 필요로 한다. 이것은 약물의 분포, 평형 및 배제를 고려함을 수반한다.
본 발명의 약물은 활성 성분을 생성할 수 있으며, 전형적으로 의도한 투여형, 즉, 경구용 정제, 캡슐, 엘릭시르제, 시럽 등에 대해 통상적인 약학 관행에 따라 적절히 선택된 적합한 약학적 희석제, 부형체 또는 담체(본원에서 총칭적으로 "담체" 물질로 지칭)와 함께 투여된다.
예를 들면, 정제 또는 캡슐 형태로 경구 투여하는 경우, 활성 약물 성분은 약학적으로 허용되는 경구용 무독성 불활성 담체, 예를 들면, 에탄올, 글리세롤, 물 등과 혼합될 수 있다. 또한, 바람직하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제도 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적합한 결합제로는, 제한없이, 전분, 젤라틴, 천연 당, 예를 들면, 글루코스 또는 β-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 고무, 예를 들면, 아카시아, 트라가칸트 또는 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글라이콜, 왁스 등이 포함된다. 상기 투여형에 사용되는 윤활제로는, 제한없이, 나트륨 올리에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨 등이 포함된다. 붕해제로는, 제한없이, 전분, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 잔탄 고무 등이 포함된다.
액체 형태의 경우, 활성 약물 성분을 적절히 풍미된 현탁제 또는 분산제, 예를 들면, 합성 및 천연 고무, 예를 들면, 트라가칸트, 아카시아, 메틸셀룰로스 등에 혼합될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분산제로는 글리세린 등이 포함된다. 비경구 투여의 경우, 멸균 현탁액 및 용액이 바람직하다. 정맥내 투여가 바람직한 경우, 일반적으로 적합한 방부제를 함유하는 등장성 제제를 사용한다.
본 발명의 약물은 또한 리포솜 전달 시스템의 형태, 예를 들면, 소형 단일층 소낭, 거대 단일층 소낭 및 다층 소낭의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 다양한 인지질, 예를 들면, 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로부터 생성될 수 있다.
본 발명의 약물은 또한 화합물이 커플링되는 개별적 담체로서 단클론성 항체를 사용하여 전달될 수 있다. 약물은 또한 표적성 약물 담체로서 가용성 중합체와 커플링될 수 있다. 상기 중합체로는 폴리비닐-피롤리돈, 파이란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메타크릴-아마이드페놀, 폴리하이드록시-에틸아스파타미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸-엔옥사이드폴리라이신이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물은 약물의 조절된 방출을 달성하는데 유용한 생분해성 중합체 부류, 예를 들면, 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 뷰티르산, 폴리오쏘에스터, 폴리아세탈, 폴리다이하이드로-파이란, 폴리사이아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교결합되거나 양쪽성 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
경구 투여의 경우, 약물은 캡슐, 정제 또는 거환 형태로 투여될 수 있거나, 또는 이들은 식사와 혼합될 수 있다. 캡슐, 정제 및 거환은 적절한 담체 비히클, 예를 들면, 전분, 활석, 마그네슘 스테아레이트 또는 인산이칼슘과 함께 활성 성분으로 이루어진다. 이들 단위 투여형은 균일한 혼합물이 수득되도록 활성 성분을, 희석제, 충전제, 붕해제 및/또는 결합제를 포함하여 적당한 미분된 불활성 성분들과 밀접하게 혼합하여 제조한다. 불활성 성분은 약물과 반응하지 않으며 치료되는 동물에게 무독성인 것이다. 적합한 불활성 성분들로는 전분, 락토스, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 식물성 고무 및 오일 등이 포함된다. 이들 제형은 치료될 동물 종의 크기 및 유형 및 감염의 유형 및 중증도와 같은 많은 요인들에 따라 광범위하게 변하는 양의 활성 및 불활성 성분들을 함유할 수 있다. 활성 성분은 또한 화합물을 사료와 간단히 혼합하거나 또는 화합물을 사료 표면에 적용함으로써 투여될 수 있다.
화합물 또는 변조제는 달리 불활성 액체 담체에 용해된 활성 성분으로 이루어진 제형의 주사에 의해 비경구로 투여될 수 있다. 주사는 근육내, 관내, 기관내 또는 피하일 수 있다. 주사용 제형은 적절한 불활성 액체 담체와 혼합된 활성 성분으로 이루어진다. 허용되는 액체 담체로는 식물성유, 예를 들면, 낙화생유, 면실유, 호마유 등, 및 유기 용매, 예를 들면, 솔케탈, 글리세롤 포르말 등이 포함된다. 대안으로, 수성 비경구 제형도 또한 사용할 수 있다. 식물성유가 바람직한 액체 담체이다. 제형은 활성 성분을 액체 담체에, 최종 제형이 0.005 내지 10 중량%의 활성 성분을 함유하도록 용해 또는 현탁시켜 제조한다.
본 발명은 하기의 비제한 실시예로 더 예시한다.
실시예
비예측성 실시예로, AML 환자에게 600 ㎎의 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논)(자네스트라(Zarnestra, 등록상표)로 지칭)을 600 ㎎의 출발 경구 용량으로 AML에서 각각 28일 주기 중 처음 21일동안 하루에 2회 투여하였다. 대상자는 두 무리, AML이 재발된 무리와 불응성 AML을 갖는 무리로 등록하였다. 총 257명의 환자(135명의 재발환자 및 117명의 불응환자)를 치료하였다.
자네스트라 치료에 대한 반응은 표 2에 나타낸 바와 같은 목적 반응(CR, CRp, 또는 PR)을 나타내는 환자, 또는 중추 검사 또는 임상 부위에 의해 측정할 때 안정한 질환 및 항-백혈병 활성(백혈병 모세포의 50% 이상의 감소)을 나타내는 환자로서 정의한다. 항-백혈병 활성은 5% 미만의 임의의 골수 모세포수 또는 골수 모세포의 절반 이상의 감소로 정의한다.
Figure 112005034962520-PAT00003
실시예 1: 미세배열 분석
자네스트라(등록상표) FTI(활성 성분, (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논)로 치료하기 전과 후 둘 다에 동의한 환자들로부터 골수 샘플을 수거하고, PBS로 희석하고 피콜(Ficoll)-다이아트리조에이트(1.077 g/㎖)와 함께 원심분리하였다. 백혈구 세포를 PBS로 2회 세척하고, 10% DMSO를 갖는 FBS에 재현탁하고 즉시 -80 ℃로 냉동하였다. 샘플을 37 ℃에서 해동하고 20% FBS와 함께 10배 부피의 RPMI를 5 분에 걸쳐 적가하였다. 세포를 500g에서 10 분간 원심분리하고 2mM EDTA 및 0.5% BSA를 갖는 10 ㎖ PBS에 재현탁하였다. 이어서, 샘플을 70 μM 필터(벡톤 디킨슨 랩웨어(Becton Dickinson Labware, 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재)에 통과시켜 임의의 세포 덩어리를 제거하였다. 세포 생존율을 트립판 블루 염색 배제 분석법으로 측정하였다. 해동시 골수 샘플의 평균 생존율은 35%이었다(0 내지 96% 범위). 샘플에 존재하는 비교적 소수의 생존 세포로 인해, 샘플은 골수종 세포가 더 많아지지 않았다. 약 2 x 105 세포를 CD33-FITC 및 CD34-PE 항체(벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈 파밍겐(Becton Dickinson Biosciences Pharmingen), 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 이중 표지화하고 FACS 분석을 수행하였다.
RN이지 키트(RNeasy Kit, 키아겐(Qiagen), 캘리포니아주 산타 클라리타 소재)를 사용하여 세포 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. cDNA 및 cRNA의 합성은 아피메트릭스(Affymetrix, 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 프로토콜에 따라 수행하였다. 여러 샘플에 대한 RNA 수율이 1 ㎍ 미만이었기 때문에 2회의 1차 증폭을 수행하였다. 하이브리드화를 위해, 11 ㎍의 cRNA를 94 ℃에서 40mM 트리스-아세테이트(pH 8.1), 100mM 칼륨 아세테이트 및 30mM 마그네슘 아세테이트 중에서 35 분간 배양하여 무작위로 단편화하였다. 단편화된 cRNA를 60 rpm으로 고정시킨 로티세리(rotisserie) 오븐에서 45 ℃에서 16 시간동안 U133A 배열에 하이브리드화하였다. 하이브리드화 후에, 배열을 세척(트리톤(Triton) X-100(0.005%)을 함유하는 6 x SSPE 및 0.5 x SSPE로)하고, 스트렙트아비딘-피코에리트린(SAPE; 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 오리건주 유겐 소재)으로 염색하였다. 결합된 표지된 프로브의 정량화는 에이질런트(Agilent) G2500A 진어레이(GeneArray) 스캐너(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 캘리포니아주 팔로 알토 수재)를 이용하여 수행하였다.
각 배열에 대한 총 형광 강도는 600의 균일 값으로 축척하였다. 칩 성능은 신호 대 잡음 비(원래의 평균 신호/잡음)를 계산하여 정량하였다. 칩의 신호-대-잡음 비가 5 미만인 경우 추가의 분석으로부터 칩을 배제하였다. 유전자가 10% 이상의 칩에 "존재"한다고 하는 경우 추가의 분석에는 유전자만 포함시켰다. 약 12,000 아피메트릭스 프로브 세트가 상기 컷오프 후에 남았다. 유전자 발현 데이터의 질은 원칙적 성분 분석을 기준으로 특이체를 확인하고 유전자 강도의 정상적 분포를 분석함으로써 더 조절하였다.
카이 제곱 검정 및 스튜던트(Student's) t-시험을 이용하여 환자 반응과 환자 공-변이체, 돌연변이 상태, CD33 및 CD34 항원 발원, 백혈병 모세포수, 및 유전자 발현 사이의 상관관계를 확인하였다. 높은 민감도하에 반응을 예측할 수 있는 유전자를 확인하기 위해, 백분위수 분석을 이용하였다. 예를 들면, 40% 이상의 무반응자에 비해 모든 반응자에서 상향- 또는 하향-조절된 유전자가 확인되었다. 양쪽-꼬리 스튜던트 t-시험(동등하지 않은 변화)을 기준으로 의미있는 p-값(P<0.05)을 나타내지 않는 유전자는 제거하였다. 상부 유전자(들)의 예측율은 리브-원-아웃(leave-one-out) 교차 검증 방법으로 분석하였다. 이때, 하나의 샘플을 데이터 조합에서 배제하고 12,000개의 유전자로부터 표지를 재선택하였다. 그 다음, 상기 유전자의 예측율을 선형 판별 분석을 이용하여 배제시킨(left-out) 샘플에 시험하였다. 민감도는 진양성(true positive)을 진양성과 위음성(false negative)을 더한 합으로 나눈 수로 산출하였다. 특이도는 진음성을 진음성과 위양성의 합으로 나눈 수로 산출하였다. 양성 예측율은 진양성을 진양성과 위양성의 합으로 나눈 수로 산출하였다. 음성 예측율은 진음성을 위음성과 진음성의 합으로 나눈 수로 산출하였다.
각각의 파라미터(유전자 또는 모세포수)와 환자 생존 결과와의 관련을 평가하기 위해 단일변량 콕스 비례 위험 모델을 이용하였다. 콕스 모델로부터 각 파라미터의 평가율은 상기 관련 정도의 척도이다. 하나보다 많은 유전자를 사용한 경우, 다중변량 위험 모델을 이용하였다. 반응자와 무반응자를 구별하는 분류자는 다음과 같이 정의하였다:
b1*x1 ＋ b2*x2 ＋ b3*x3 ＋
상기에서, b1, b2, b3는 콕스 모델에서의 평가율이고, x1, x2, x3는 표준화된 파라미터 값(모세포수 또는 유전자 발현 값의 log10)이다.
반응자 작용 곡선(receiver operating curve, ROC)을 이용하여 90% 이상의 민감도를 필요로 하는 각 분류자에 대한 적절한 역치를 선택하였다. ROC 진단법은 각 파라미터에 대한 민감도 및 특이도를 계산한다. 또한, 유전자 표지를 먼저 그들의 능력에 대해 분류하여 29개의 무작위 선택된 샘플의 시험용 세트를 이용하여 불량한 결과로부터 우수한 결과를 등급별로 분류하였다. 그 다음, 각 유전자의 예측율을 남은 29개 샘플에 시험하였다. 이로써 가장 강한 예측율을 갖는 유전자를 확인하였다.
실시예 2: 백혈병 세포 항원 발현
백혈병 모세포는 표면 항원 CD33 및 CD34를 발현하는 것으로 알려져 있다. 환자 골수 백혈병 세포의 95% 및 55%가 CD33 및 CD34 각각에 대해 양성이었다. 각 샘플에서 항원을 발현하는 세포의 평균 퍼센트는 CD34에 대해 13% 및 CD33에 대해 43%이었다. 카이 제곱 분석을 수행하여 항원 발현 수준과 환자 결과 사이의 상관관계를 조사하였다. 15% 및 60%의 컷오프를 CD34 및 CD33 수준 각각에 대해 선택하였다. CD33 및 CD34의 낮은 발현(CD34의 경우 세포 개체군의 약 15% 미만에서 양성 및 CD33의 경우 세포 개체군의 약 60% 미만에서 양성)은 자네스트라(등록상표)에 대한 환자 반응과 상관되었다(각각 p=0.137, p=0.052). 두 항원 모두의 높은 발현(CD34의 경우 세포 개체군의 약 15% 이상에서 양성 및 CD33의 경우 세포 개체군의 약 60% 미만에서 양성)은 또한 높은 모세포수와 절대적으로 상관되었다. 카플란 마이어 분석 결과 또한 높은 CD33 발현은 불량한 전체 생존율과 상관되는 것으로 나타났다(도 1).
실시예 3: 백혈병 모세포수 분석
CD33 및 CD34 항원 발현의 분석 결과 백혈병 모세포의 수준은 환자 반응과 상관됨을 시사하였다. 부위 및 DCL 모세포 수 측정치의 평균 값을 계산하고, 스튜던트 t-시험을 수행하여 모세포수가 AML 환자에서 환자 반응과 상관되는지를 조사하였다. 24 명이 CR, CRp, PR 또는 SD를 갖는 총 199 명의 평가가능한 환자로부터, 모세포의 비율이 환자 결과와 상당히 상관되었다(p=0.0006). 반응자들은 진행성 질환을 가진 환자들보다(평균 51%) 적은 수의 모세포(평균 34%)를 가졌다. 24 명의 총 반응자(SD를 갖는 것으로 정의) 중 한 명만이 60%보다 높은 모세포수를 나타내었다. 모든 평가가능한 환자들에 대한 카이-제곱 분석 결과 높은 모세포수와 치료에 대한 내성 간에 상당한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(χ2=9.53).
카플란-마이어 분석 결과 낮은 수준의 모세포수(<60%)를 갖는 환자가 높은 모세포수를 갖는 환자보다 전체 생존율이 훨씬 더 좋은 것으로 밝혀졌다(도 2). 이러한 분석들은 대략 60%보다 높은 모세포수를 갖는 환자가 자네스트라(등록상표)에 반응하지 않을 것임을 나타낸다.
실시예 4: 반응자와 무반응자 사이에 차별적으로 발현되는 유전자의 동정
약물 치료 전에 80 명의 환자로부터 유전자 발현 분석용 골수 샘플을 수득하였다. 80개의 기준선 샘플 중에서, 14개의 샘플이 비-평가가능한 환자로부터 수득한 것이라 분석에서 제하였다. 샘플을 골수종 세포를 증가시키고, 메신저 RNA(유전자-특이적 단백질을 암호화하는 분자)에 대해 처리하고 아피메트릭스(Affymetrix) U133A 유전자 칩에 하이브리드화시켰다. 66개 샘플 중 58개를 U133A 칩에 하이브리드화시킨 후 추가의 질 대조 측정을 수행하였다. 유전자 발현 데이터를 임상 정보와 통합하고 앞의 분석들을 수행하여 높은 수준의 민감도를 갖는 무반응자로부터 반응자를 분류할 수 있는 유전자를 동정하였다. 자네스트라(등록상표)에 대한 반응을 예측하는데 유용한 여러 유전자 표지를 동정하였다(표 3). LBC 종양유전자(종양유발 LBC)의 경우, 상기 유전자의 예측율을 리브-원-아웃(leave-one-out) 교차 검정을 이용하여 데이터세트에 대해 계산하였다(표 3). 종양유발LBC 유전자 발현 수준은 무반응자의 절반을 배제하면서 임상적으로 확인된 반응자 모두를 포착할 수 있었다.
Figure 112005034962520-PAT00004
Figure 112005034962520-PAT00005
생존율 분석 결과 종양유발LBC 발현을 근거로 반응자로 분류된 환자(도 3A, p=0.00841)는 임상 데이터를 이용한 환자 분류(도 3B, p=0.0827)보다 상당히 우수한 것으로 나타났다. 이것은 증가된 전체 생존율을 갖는 무반응자의 부분집합을 확인시키는 종양유발LBC 표지에 기인하는 것이다. 콕스 위험 모델을 근거로, 종양유발LBC와 제 2의 유전자 표지인 아릴 하이드로카본 수용체(AHR)를 혼합하면 특이도 및 양성 예측율이 각각 75% 및 56%로 증가되었다(도 3C). 상기 결과는 종양유발LBC를 단독으로 사용하거나 또는 AHR 유전자와 함께 사용하면 자네스트라(등록상표) 치료에 대한 반응을 예측하기 위한 효과적인 배열이 제공됨을 나타내었다.
종양유발LBC 및 표지로서 AHR을 이용한 리브-원-아웃 교차 검증도 또한 수행하였다. 최고의 민감도 및 최상의 특이도를 확인하기 위해 컷-오프를 이용하는 경우, PPV 및 민감도는 동일하게 유지되었다. 다른 유전자 조합들의 리브-원-아웃 교차 검증의 결과를 표 5에 나타내었다. 이것은 표지 조합이 상기 방법의 예측율을 향상시킬 수 있음을 예시한다.
Figure 112005034962520-PAT00006
또한, LBC 및 AHR 분류자를 사용한 환자의 구별은 종양유발LBC 유전자 EH는 임상 반응 정의를 사용한 것과 비교하여 두 환자 집단 사이에 평균 생존 시간에 유사한 차이를 나타내었다(도 4C). 상기 결과는 종양유발LBC를 단독으로 또는 AHR 유전자와 함께 사용하여 현재의 데이터세트에서 자네스트라에 대한 반응을 예측하기 위한 효과적인 생체표지로 사용할 수 있음을 나타내었다.
콕스 위험 모델을 이용하여 우수한 생존자로부터 불량한 생존자를 구별하는데 있어 다른 표지 조합을 분석하였다(표 6). 이때, 51명의 환자로부터 얻은 데이터를 사용하였는데, 그 이유는 상기 숫자의 환자 샘플만이 측정된 CD33 및 CD34 항원 수준을 나타내었다. 90%보다 큰 민감도는 표지에 적절한 컷-오프를 결정하는데 이용하였다. 다수의 표지를 사용하면 두 생존 군의 평균 생존 시간에 있어서의 차이를 개선할 수 있다.
Figure 112005034962520-PAT00007
실시예 5: 반응자와 무반응자 사이에 차별적으로 발현되는 유전자의 동정(반복 분석)
모든 반응자와 40% 이상의 무반응자 사이에서 차별적으로 발현되는 또 다른 유전자를 동정하기 위해 유전자 발현 데이터를 이용하여 감시 분석을 수행하였다. 상기 기준은 가능한 최고 수준의 민감도하에 티피파닙(Tipifarnib)에 대한 반응을 예측할 수 있는 유전자를 동정하기 위해 선택되었다. 반응자와 무반응자(표 7 및 8)를 구별할 수 있고 t-시험에서 의미있는 p-값(p<0.05)을 제공한 총 19개의 유전자를 동정하였다. 흥미롭게, 상기 유전자는 신호 변환, 세포사멸, 세포 증식, 종양형성 및 잠재적으로 FTI 생물학에 수반되는 유전자들을 포함한다(ARHH, LBC 및 IL3RA).
Figure 112005034962520-PAT00008
Figure 112005034962520-PAT00009
실시예 6: 3개 유전자 표지의 최소 조합의 동정
LBC 단독에 비해 향상된 정확도하에 티피파닙에 대한 반응을 예측할 수 있는 유전자 표지들의 후보 조합을 동정하기 위해, LOOCV를 사용하여 최적 유전자 수를 결정하였다. t-시험 p-값을 기준으로 증가하는 수의 유전자로 분류자를 구축하고, 반응을 예측하는 민감도를 100%로 유지하면서 LOOCV를 이용하여 상기 분류자들의 오류율을 계산하였다(도 4A). 3-유전자 분류자(LBC, AHR 및 MINA53 포함)가 최저의 오류율하에 반응을 예측할 수 있는 것으로 밝혀졌다(도 4A). 이것은 또한 다섯 개씩 빼버리는(leave-five-out) 교차 검증을 수행하는 경우에도 나타났다. 보다 많은 유전자를 첨가하는 경우, 오류율이 증가하여 추가의 유전자가 분류자에 잡음을 도입하였음을 나타낸다. 3-유전자 분류자의 경우, LOOCV는 74%의 전체 진단 정확도 하에 86%의 민감도 및 70%의 특이도를 나타내었다(도 4B). 각 환자에서 3개 유전자에 대한 발현 값을 합하여 도 4C에 나타내었다.
카플란-마이어 분석 결과 다시 예측 반응자 군과 무반응자 군 사이의 생존율에 상당한 차이를 나타내었다(도 4D). 또한, 부정확하게 분류된 무반응자를 정확하게 분류된 무반응자와 비교한 경우, 잘못분류된 무반응자가 더 우수한 전체 생존율을 나타내었다(도 5). 이것은 유전자 신호가 임상적 기준에 의해서는 관찰될 수 없는 치료에 대한 반응 수준을 예측할 수 있음을 시사한다. 또는, 이것은 유전자 신호로 FTI 치료에 대한 반응을 예측하게 하여 예측율을 제공하게 한다. 미처리 환자에서 수행된 추가의 분석을 이용하여 유전자 발현 신호와 예후 사이의 관계를 측정할 수 있다.
실시예 7: 항체(예측성)
LBC 종양유전자-유도된 펩타이드를 합성하고, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모사이아닌에 결합시키고, 단클론성 항체의 생성을 위해 토끼를 면역화시키는데 이용하였다. 혈청을 ELISA로 상응하는 펩타이드에 대한 반응성에 대해 시험하고, 양성 배치를 친화도-정제하였다. 정제한 항체는 조직 절편에서 에피토프를 갖는 펩타이드를 특이적으로 검출한다. 이것은 상응하는 펩타이드를 항체와 동시에 가하는 경우 신호의 완전한 소멸에 의해 입증된다. IHC에서 적절히 작용하는 상기 다클론성 항체 이외에, 천연 폴딩상태의 단백질을 검출할 수 있는 단클론성 항체를 생성한다. 단클론성 항체를 생성하기 위해, 천연 폴딩 및 번역후 변형을 확보하도록 포유동물 세포에서 생성된 정제한 항원을 생성한다. 항원, 즉 LBC 종양유발 단백질-IgG 상존 부분 융합 단백질을 마우스 골수 세포에서 발현시키고, 상기 단백질을 유인물로서 Fc 부분을 이용하여 정제한다. 상기 정제된 항원은 C-말단 다클론성 항체에 의해 웨스턴 블롯에서 확인한다. 상기 항원은 양성 클론들 중에서 IgG 상존 부분 대신 LBC 펩타이드에 대해 반응하는 항체를 생성하는 클론들을 선별함으로써 LBC 펩타이드에 대한 마우스 단클론성 항체를 생성하는데 이용한다.
LBC 종양유전자의 임상적 동정을 위한 키트는 상기 항체 및 유사 항체들을 사용하여 용이하게 형성될 수 있다. 상기 키트는 LBC 펩타이드 동정(및 따라서 LBC 종양유전자)에 관한 항체, 적절한 지시제 시약(예를 들면, 효소, 표지 등), 및 (선택적으로) 상기 키트의 임상 적용에 유용한 다른 시약, 예를 들면, 희석 완충액, 안정화제 및 상기 분석에 전형적으로 사용되는 다른 물질을 포함한다.
실시예 8: 동소 하이브리드화(예측성)
포르말린 고정된 파라핀 함침 조직 샘플을 5 내지 7 ㎛ 두께 절편으로 절단하고, 실레인 코팅된 유리 슬라이드 위에 장착하고, 37 ℃에서 밤새 및 65 ℃에서 30 분간 배양한 후 자일렌 중에서 10 분간 2회 탈파라핀화시킨다. 그 다음, 샘플을 단계적으로 연속되는 에탄올 용액(100 내지 70%)을 통해 재수화시키고, PBS(pH 7.0)로 5 분간 2회 세정하고, PBS 중의 0.1 몰/ℓ 글라이신으로 5 분간 2회 처리하고, PBS 중의 0.3% 트리톤 X-100으로 15 분간 투과시킨다. 절편을 37 ℃에서 30 분간 프로테이나제 K(핀자임(Finnzymes), 핀란드 헬싱키 소재) 처리(㎍/㎖, TE 완충액중; 100 밀리몰/ℓ 트리스-HCl, 50 밀리몰/ℓ EDTA, pH 8.0)한 후, 4 ℃에서 PBS 중의 3% 파라포름알데하이드 중에서 5 분간 후고정시키고 PBS로 2회 세정한다. 슬라이드를 0.25%(v/v) 아세트산 무수물, 100 밀리몰/ℓ의 트라이에탄올아민(pH 8.0) 중에 5 분간 2회 침지시켜 양성 전하를 차단한다. 슬라이드를 37 ℃에서 4xSSC, 50%(v/v) 탈이온화 폼아마이드중에서 10 분간 평형화시킨다.
PCR-증폭된 0.4 kb LBC 종양유전자 cDNA 삽입물을 TA 클로닝 키트(인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 pCR-II 벡터에 접합시켜 프로브를 제조한다. 적절한 벡터 구성물을 선형화시켜(3'에서 5' 방향 또는 5'에서 3' 방향 각각으로) LBC 종양유전자 안티센스 또는 센스 RNA 프로브에 대한 주형을 생성한다. RNA 표지된 키트(베링거-만하임)를 사용하여 시험관내 전사에 의해 디곡시제닌 표지된 RNA 프로브를 생성한다. 1x덴하르트(Denhardt) 용액(0.2 g/ℓ 피콜(Ficoll) 타입 400, 파마시아(Pharmacia)), 0.2 g/ℓ 폴리비닐피롤리돈, 0.2 g/ℓ BSA(분획 V; 시그마(Sigma)), 40% 폼아마이드, 10% 덱스트란 설페이트, 4xSSC, 10 밀리몰/ℓ 다이티오트레이놀, 1 ㎎/㎖ 효모 tRNA, 1 ㎎/㎖ 청어 정액 DNA 및 300 ng/㎖ 디곡시제닌-표지된 RNA 프로브를 함유하는 하이브리드화 혼합물을 이용하여 45 ℃에서 밤새 하이브리드화를 수행한다. 하이드리브화 후에, 조직 절편을 37 ℃에서 2xSSC에서 5 분간 2회 및 60% 폼아마이드, 0.2xSSC에서 15 분간 1회 세척한 다음, 실온에서 2xSSC에서 5 분간 2회 세정하고, 100 밀리몰/ℓ 트리스-HCl(pH 8.0), 150 밀리몰/ℓ NaCl에서 10 분간 2회 세척한다. 신호 검출은 1:250 알칼리 포스파타제-접합 양 항디곡시제닌 Fab 단편(베링거 만하임)을 사용하여 수행한다. 신호는 절편들을 NBT/BCIP 원액(베링거 만하임)과 함께 1.5 시간동안 배양함으로써 가시화된다.
암 환자의 발암성 세포에서 나타나는 LBC 종양유전자-양성 세포는 FTI에 대한 반응이 가망없음을 나타낸다.
실시예 9: 면역조직화학(예측성)
LBC 종양유전자의 C-말단 펩타이드에 대한 친화도-정제된 다클론성 항체를 IHC 검출 및 LBC 종양유전자의 정위에 이용한다. 포르말린-고정되고 파라핀 함침된 정상 및 종양 조직으로부터의 4 ㎛의 절편을 3-아미노프로필-트라이에톡시-실레인(APES, 시그마, 미저리주 세인트 루이스 소재) 코팅된 슬라이드 위에 장착한다. 절편을 탈파라핀화하고 단계적 농도의 에탄올로 재수화시키고 실온에서 메탄올 퍼옥사이드(무수 메탄올 중의 0.5% 과산화수소)로 30 분간 처리하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단한다. 항원 회복은 마이크로파 오븐에서 5 분간 2회 수행한다(650W).
엘라이트(Elite) ABC 키트(벡타스테인(Vectastain), 벡터 래버러토리즈, 캘리포니아주 벌링에임 소재)를 면역퍼옥시다제 염색에 사용한다. LBC 펩타이드 항체는 1:2000의 최적 희석률로 사용한다. 바이오틴화된 제 2 항체 및 퍼옥시다제-표지된 아비딘-바이오틴 착체를 둘 다 30 분간 절편상에서 배양한다. 희석은 PBS(pH 7.2)에서 수행하며, 모든 배양은 실온에서 가습 챔버에서 수행한다. 상이한 염색 단계 사이에, 슬라이드를 PBS로 3회 세정한다. 퍼옥시다제 염색은 실온에서 3-아미노-9-에틸카바졸(시그마) 용액(0.03% 과산화수소를 함유하는 0.05M 아세테이트 완충액 중의 0.2 ㎎/㎖, pH 5.0)으로 15 분간 가시화시킨다. 최종적으로, 절편을 메이어(Mayer)의 헤마톡시린으로 살짝 대조염색하고 수성 혼입 매질(아쿠아마운트(Aquamount), BDH)로 혼입한다. 대조 실험으로, 1차 항체를 정상 토끼 혈청의 IgG 분획으로 대체하거나 또는 1차 항체를 LBC 펩타이드로 예비흡착시켰다. 상기 염색은 세포의 부분집합에서의 LBC 종양유전자의 존재를 나타낸다.
실시예 10: 효소 면역분석(예측성)
LBC 단백질, 또는 LBC 종양유전자에 관련된 특징적인 펩타이드에 대한 면역분석물을 제조한다. 결장 종양 시편의 분해물을 포함하는 항원 표준물(면역퍼옥시다제 염색에 의해 항원을 함유하는 것으로 나타남)을 사용한다. AML 환자로부터 인간 백혈구 세포를 얻는다. 시편을 모으고 4 ℃에서 0.2%(w/v) 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 10mM 트리스 완충액(pH 7.4) 10 부피중에서 균질화시킨다. 균질액을 신속하게 37 ℃로 만들고 다음 시약들(최종 농도)을 교반하면서 가한다: 1mM 시스테인(시그마), 1mM EDTA(시그마) 및 파파인(0.8 단위/㎖)(베링거-만하임, 인디애나주 인디애나폴리스 소재). 5 분후에, 5mM 요오도아세트아마이드(시그마)를 가하여 분해를 중단한다. 균질액을 4 ℃에서 1 시간동안 100,000 x g로 원심분리한 후, 각각 10mM의 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 아미노카프로산을 함유하는 10mM 트리스/0.9% NaCl 용액 완충액(pH 7.4)에 대해 광범위하게 투석한다. 균질액을 0.5 ㎎ 단백질/㎖의 농도로 소 분취량으로 냉동시킨다.
LBC 단백질 또는 펩타이드를 측정하는 면역분석 절차를 위해 제작되는 용량 반응 곡선은 100 ng 내지 100 ㎍/㎖의 항원 유입량 사이의 선형성을 입증한다. 혈청 분석을 위해, 범위는 1 내지 1000 ng/㎖인데, 그 이유는 상기 샘플들은 분석 전에 10배 희석되기 때문이다.
상기 실시예에 기술된 항체들의 고체-상 제제는 CNBr-활성화된 세파로스(Sepharose, 파마시아)를 이용하여 제조한다. 마이크로플레이트(Nunc I Immunoplates; 그랜드 아일랜드 바이올로지컬 캄파니(Grand Island Biological Co.), 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)를 4 ℃에서 50mM 카보네이트-바이카보네이트 완충액(pH 9.6) 중의 항체(200 ㎕/웰)로 18 시간동안 코팅한다. 항체 용액을 제거한 후, 플라스틱 상의 잔류 단백질 결합 부위를 200 ㎕의 분석용 완충액[1%(v/v) 토끼 혈청 및 1%(w/v) 소 알부민을 함유하는 PBS]을 첨가하여 차단한다. 실온에서 1 시간동안 배양한 후, 코팅된 플레이트를 분석 절차에 바로 사용한다.
분석을 수행하기 위해, 분석용 완충액에 희석시킨 200 ㎕의 샘플을 37 ℃에서 1 내지 5 시간동안 적용한다. 분석용 완충액을 사용하여 3회 세척한 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(시그마, VI형)에 공유 결합된 200 ㎕의 항체를 37 ℃에서 1.5 시간동안 각각의 웰에 적용한다. 10%(v/v) 뮤린 혈청을 함유하는 PBS ㎖ 당 0.5 ㎍의 면역글로뷸린의 농도로 접합체를 희석한다. 상기와 같은 세척 절차 후에, 웰 당 200 ㎕의 기질을 실온에서 0.5 시간동안 적용한다. 기질 용액은 시트레이트 완충액(pH 5.0) ㎖ 당 0.4 ㎎의 o-페닐렌다이아민, 및 0.003% 과산화수소를 함유한다. 50 ㎕의 2N 황산을 가하여 반응을 중단하고, 효소 분석용 플레이트 판독기(피셔 사이언티픽 캄파니(Fisher Scientific Co.), 펜실바니아주 피츠버그 소재)를 사용하여 488 nM에서 흡광도를 모니터한다.
결합된 효소 접합체의 퍼센트는 하기 식으로 계산한다:
(B-B0)(Bt-B0)(100)
상기에서, B는 샘플의 흡광도이고, Bt는 최대 흡광도이며, B0는 블랭크의 흡광도이다. 각 분석은 표준 분해물 및 분석용 완충액에 26-배 희석된 혈청 샘플을 사용하여 3조로 수행한다. 면역분석 민감도는 항체를 포함하여 고체상의 다양한 항체 시약들을 비관련 단백질 및 비-면역성 토끼 혈청으로 대체함으로써 조사한다. 고체상 항체들 중에서, 상기 실시예에 따라 제조된 항체만이 항원에 높은 희석율로 결합한다.
혈청 LBC 단백질의 수준은 정상적인 대조 대상, 즉 양성 및 악성 혈액 질환을 갖는 환자에 대해 검출한다.
명백하게 건강한 개개인으로부터 수득된 혈청은 LBC 단백질을 나타내지 않는다. 샘플 중의 5% 만이 검출 한께 이상으로 혈청 항원을 발현시키며, 이 값은 증가되는 혈청 수준에 대한 컷오프로서 선택된다. 컷오프 미만의 암 환자는 FTI에 의한 치료에 반응할 것이다.
환자의 유전자 발현 프로필 및/또는 분자 표지를 분석함으로써 환자가 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI) 및 선택적으로 다른 치료법에 의한 치료에 반응할 것인지 여부를 결정하여 암 환자를 치료하는 본 발명의 방법은 환자의 치료를 모니터하고 치료 과정을 선택하는데 유용하다.
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gtattgggga cagatcagag tttgcatggt gagaatttat 660 atgatctaca aacacacttt aagtttgtga tatttctact ttttttttaa tggggctact 720 tttctatggt catcatattc aggtcttcca cagaggctgc gtaaatctta gaattactgt 780 aggaaagtgg cctcaatggc atctcttcta ggttcttcaa ttgagctgtt aagcatgttg 840 ttgcagcgaa atgaccctag ggattaccca aggagagtgg cacgtcacct tcctgtgggt 900 ctggatttca gatttgatct ctcaagtgta gaaagtgaca cgctcttcat gaggagagta 960 gcagagttac tttttggtgt ttaatgatca aagacatggt tttcattatt gtattctgaa 1020 gttctctaaa gatagcctgg aagtgaagga gaggaaagat tgggcagtga gtgggaggag 1080 catgagaaca gggtgtgctc tgagaaacca cacacttcct taaccaggtt agtgtcactc 1140 ttactgactt tatctgttgg ccctccctat gagagttcac tgaagaaagg actttttgtt 1200 tgttttttgt ttttttttga gaacgggctt tcactcttgt agtccaggct ggagtgcagt 1260 ggcatgatct cggctcactg cagcctccac ctcctgggtt caggtgattc tgctgcctca 1320 gcctcccaaa tagctgggat tacaggcatg taccaccatg cctagcaaat tttttttttt 1380 ttttaattag agacagggtt tcaccgtgtt agtcaggctg gtctcgaact cctgacctca 1440 ggtaatctac ccacctcggc ctcccaaagt 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gatgggcctt aatacctcta gctcctccta 2340 tttctgtatt gatacaggaa tgtttattct ggctgccttt cacaaatcag tgtcaagata 2400 gtactgcatt agttatttgt ggggcttatg gtgttttatg gttttgtttt gtcttgttta 2460 aagaggggcc caggagttgg atagttttat gttgccatga ttaaaaacaa ctattagaaa 2520 aagcaaacat ctgaaacttt ggacatatca cttcctcttt ctctctcttt tttttttttt 2580 ttttgagata gagtcttgct ctgtcgccca ggctggagtg caatggtgca atctcggctc 2640 actgcaacct gcatctcctg ggttgaagcg attctcctgc cttagcctcc caagtagctg 2700 ggaatacagg cacatgccac cacaccctgc tgcttttttg tgtgttttag tagagacggg 2760 gtttcaccat gttgcccagg ctggtcttga actcctgagc tcaggcaatc cacccgcctc 2820 agcctcccaa agtgctagga ttacaggcgt gagccactgt gcccggccac ttcctctctt 2880 tgggccttaa cttccttgtc tttaatagga gggaattggc cagctttaat ttttttttgt 2940 actgtcagtg tactggtaaa ttttctgttg cacaaaattg ctcaagcagt gctaacaaag 3000 gccaaaccaa atttgaacac ttgaggaagg aaatacatat taaaaccaca atgagatatc 3060 attacacatt tatcataatg gctaagatga agaataccaa gtgctggcaa agatgaagaa 3120 catatcatat gttgcttgta ggaatgcaaa atgtataacc actctagaaa tatttggcag 3180 tttcttgtaa agttaaacat acacttagcg tatgacccag taatcccact tttgggtgtt 3240 tatcctagag aaatgaaaat ctgtagtcac caaaaagtct gtgcacagac gtgctcatag 3300 taatgttatt cataatcttc aaaaactgga aataacccag atttccctca ctgagtgaat 3360 acagaagcac actataatat atccatacag tggaatacta ctcagcaata aaaagaagca 3420 aactgttgac atgtgcaaca acttggatgt gttttaaatg cattatgcgg gaaaatgaag 3480 tcagtttcca aaggttccat actatgtgat tctatttata tgatattctg gaagatgcaa 3540 aattatagaa aaagagaaca gatgagtagt tgctaggggc tgggagtggg ggaagtctga 3600 ctggaaagag gtatcatgag ggaattcttt gggttgttgg agttgttttg tcttgttcgt 3660 ggtggtggct gtaagaatct atgcatgtgt taaaactcat aggagtgtac atcccctaaa 3720 ggtgaatttt attgtacata tatttaaaat aataaaataa caaaaaaaaa aaaaaaa 3777 <210> 27 <211> 4290 <212> DNA <213> Human <400> 27 atgttgtata taaaccgaga aaactggtgt acaatagagc catgccctga tgcagcatct 60 cttctggctt ccaagcagag cccagaatgt gagaacttcc tggatgttgg actgggcaga 120 gagtgtacct caaaacaagg tgtacttaaa agagaatctg ggagtgattc tgacctcttt 180 cactcaccca gtgatgacat ggacagcatc atcttcccaa agccagagga agagcatttg 240 gcctgtgata tcaccggatc cagttcatcc accgatgaca cggcttcact ggaccgacat 300 tcttctcatg gcagtgatgt gtctctctcc cagattttaa agccaaacag gtcaagagat 360 cggcaaagcc ttgatggatt ctacagccat gggatgggag ctgagggtcg agaaagtgag 420 agtgagcctg ctgacccagg cgacgtggag gaggaggaga tggacagtat cactgaagtg 480 cctgcaaact gctctgtcct aaggagctcc atgcgctctc tttctccctt ccggaggcac 540 agctgggggc ctgggaaaaa tgcagccagc gatgcagaaa tgaaccaccg gagttcaatg 600 cgagttcttg gggatgttgt caggagacct cccattcata ggagaagttt cagtctagaa 660 ggcttgacag gaggagctgg tgtcggaaac aagccatcct catctctaga agtaagctct 720 gcaaatgccg aagagctcag acacccattc agtggtgagg aacgggttga ctctttggtg 780 tcactttcag aagaggatct ggagtcagac cagagagaac ataggatgtt tgatcagcag 840 atatgtcaca gatctaagca gcagggattt aattactgta catcagccat ttcctctcca 900 ttgacaaaat ccatctcatt aatgacaatc agccatcctg gattggacaa ttcacggccc 960 ttccacagta ccttccacaa taccagtgct aatctgactg agagtataac agaagagaac 1020 tataatttcc tgccacatag cccctccaag aaagattctg aatggaagag tggaacaaaa 1080 gtcagtcgta cattcagcta catcaagaat aaaatgtcta gcagcaagaa gagcaaagaa 1140 aaggaaaaag aaaaagataa gattaaggag aaggagaaag attctaaaga caaggagaaa 1200 gataagaaga ctgtcaacgg gcacactttc agttccattc ctgttgtggg tcccatcagc 1260 tgtagccagt gtatgaagcc cttcaccaac aaagatgcct atacttgtgc aaattgcagt 1320 gcttttgtcc acaaaggctg ccgagaaagt ctagcctcct gtgcaaaggt caaaatgaag 1380 cagcccaaag ggagccttca ggcacatgac acatcatcac tgcccacggt cattatgaga 1440 aacaagccct cacagcccaa ggagcgtcct cggtccgcag tcctcctggt ggatgaaacc 1500 gctaccaccc caatatttgc caatagacga tcccagcaga gtgtctcgct ctccaaaagt 1560 gtctccatac agaacattac tggagttggc aatgatgaga acatgtcaaa cacctggaaa 1620 ttcctgtctc attcaacaga ctcactaaat aaaatcagca aggtcaatga gtcaacagaa 1680 tcacttactg atgagggagt aggtacagac atgaatgaag gacaactact gggagacttt 1740 gagattgagt ccaaacagct ggaagcagag tcttggagtc ggataataga cagcaagttt 1800 ctaaaacagc aaaagaaaga tgtggtcaaa cggcaagaag taatatatga gttgatgcag 1860 acagagtttc atcatgtccg cactctcaag atcatgagtg gtgtgtacag ccaggggatg 1920 atggcggatc tgctttttga gcagcagatg gatgaaaagc tgttcccctg tttggatgag 1980 ctgatcagta tccatagcca attcttccag aggattctgg agcggaagaa ggagtctctg 2040 gtggataaaa gtgaaaagaa ctttctcatc aagaggatag gggatgtgct tgtaaatcag 2100 ttttcaggtg agaatgcaga acgtttaaag aagacatatg gcaagttttg tgggcaacat 2160 aaccagtctg taaactactt caaagacctt tatgccaagg ataagcgttt tcaagccttt 2220 gtaaagaaga agatgagcag ttcagttgtt agaaggcttg gaattccaga gtgcatattg 2280 cttgtaactc agcggattac caagtaccca gttttattcc aaagaatatt gcagtgtacc 2340 aaagacaatg aagtggagca ggaagatcta gcacagtcct tgagcctggt gaaggatgtg 2400 attggagctg tagacagcaa agtggcaagt tatgaaaaga aagtgcgtct caatgagatt 2460 tatacaaaga cagatagcaa gtcaatcatg aggatgaaga gtggtcagat gtttgccaag 2520 gaagatttga aacggaagaa gcttgtacgt gatgggagtg tgtttctgaa gaatgcagca 2580 ggaaggttga aagaggttca agcagttctt ctcactgaca ttttagtttt ccttcaagaa 2640 aaagaccaga agtacatctt tgcatcattg gaccagaagt caacagtgat ctctttaaag 2700 aagctgattg tgagagaagt ggcacatgag gagaaaggtt tattcctgat cagcatgggg 2760 atgacagatc cagagatggt agaagtccat gccagctcca aagaggaacg aaacagctgg 2820 attcagatca ttcaggacac aatcaacacc ctgaacagag atgaagatga aggaattcct 2880 agtgagaatg aggaagaaaa gaaaatgttg gacaccagag cccgagaatt aaaagaacaa 2940 cttcaccaga aggaccaaaa aatcctactc ttgttggaag agaaggagat gattttccgg 3000 gacatggctg agtgcagcac ccctctccca gaggattgct ccccaacaca tagccctaga 3060 gttctcttcc gctccaacac agaagaggct ctcaaaggag gacctttaat gaaaagtgca 3120 ataaatgagg tggagatcct tcagggtttg gtgagtggaa atctgggagg cacacttggg 3180 ccgactgtca gcagccccat tgagcaagat gtggtcagtc ccgtttccct gccccggaga 3240 gcagagacct ttggaggatt tgacagccat cagatgaatg cttcaaaagg aggcgagaag 3300 gaagagggag gtgatggcca agatcttagg agaacggaat cagatagtgg cctaaaaaag 3360 ggtggaaatg ctaacctggt atttatgctt aaaagaaaca gtgagcaggt tgtccagagc 3420 gttgttcatc tctacgagct cctcagcgct ctgcagggtg tggtgctgca gcaggacagc 3480 tacattgagg accagaaact ggtgctgagc gagagggcgc tcactcgcag cttgtcccgc 3540 ccgagctccc tcattgagca ggagaagcag cgcagcctgg agaagcagcg ccaggacctg 3600 gccaacctgc agaagcagca ggcccagtac ctcgaggaga agcgcaggcg cgagcgtgag 3660 tgggaagctc gtgagaggga gctgcgggac gggaggccct cctggcccag cgcgaggagg 3720 aggtgcagca ggggcagcag gacctggaaa aggagcggga ggagctccag cagaagaagg 3780 gcacatagcc agtatgacct ggagcgactg cgtgctgccc agaaacagct tgagagggaa 3840 caggagcacg tgcgccggga ggcagagcgg ctcagccagc ggcagacaga acgggacctg 3900 tgtcaggttt cccatccaca taccaagctg atgaggatcc catcgttctt ccccagtcct 3960 gaggagcccc cctcgccatc tgcaccttcc atagccaaat cagggtcatt ggactcagaa 4020 ctttcagtgt ccccaaaaag gaacagcatc tctcggacac acaaagataa ggggcctttt 4080 cacatactga gttcaaccag ccagacaaac aaaggaccag aagggcagag ccaggcccct 4140 gcgtccacct ctgcctctac ccgcctgttt gggttaacaa agccaaagga aaagaaggag 4200 aaaaaaaaga agaacaaaac cagccgctct cagcccggtg atggtcccgc gtcagaagta 4260 tcagcagagg gtgaagagat cttctgctga 4290 <210> 28 <211> 424 <212> PRT <213> Human <400> 28 Met Ser Asn Thr Trp Lys Phe Leu Ser His Ser Thr Asp Ser Leu Asn 1 5 10 15 Lys Ile Ser Lys Val Asn Glu Ser Thr Glu Ser Leu Thr Asp Glu Gly 20 25 30 Thr Asp Met Asn Glu Gly Gln Leu Leu Gly Asp Phe Glu Ile Glu Ser 35 40 45 Lys Gln Leu Glu Ala Glu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Asp Ser Lys Phe 50 55 60 Leu Lys Gln Gln Lys Lys Asp Val Val Lys Arg Gln Glu Val Ile Tyr 65 70 75 80 Glu Leu Met Gln Thr Glu Phe His His Val Arg Thr Leu Lys Ile Met 85 90 95 Ser Gly Val Tyr Ser Gln Gly Met Met Ala Asp Leu Leu Phe Glu Gln 100 105 110 Gln Met Val Glu Lys Leu Phe Pro Cys Leu Asp Glu Leu Ile Ser Ile 115 120 125 His Ser Gln Phe Phe Gln Arg Ile Leu Glu Arg Lys Lys Glu Ser Leu 130 135 140 Val Asp Lys Ser Glu Lys Asn Phe Leu Ile Lys Arg Ile Gly Asp Val 145 150 155 160 Leu Val Asn Gln Phe Ser Gly Glu Asn Ala Glu Arg Leu Lys Lys Thr 165 170 175 Tyr Gly Lys Phe Cys Gly Gln His Asn Gln Ser Val Asn Tyr Phe Lys 180 185 190 Asp Leu Tyr Ala Lys Asp Lys Arg Phe Gln Ala Phe Val Lys Lys Lys 195 200 205 Met Ser Ser Ser Val Val Arg Arg Leu Gly Ile Pro Glu Cys Ile Leu 210 215 220 Leu Val Thr Gln Arg Ile Thr Lys Tyr Pro Val Leu Phe Gln Arg Ile 225 230 235 240 Leu Gln Cys Thr Lys Asp Asn Glu Val Glu Gln Glu Asp Leu Ala Gln 245 250 255 Ser Leu Ser Leu Val Lys Asp Val Ile Gly Ala Val Asp Ser Lys Val 260 265 270 Ala Ser Tyr Glu Lys Lys Val Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Thr Lys Thr 275 280 285 Asp Ser Lys Ser Ile Met Arg Met Lys Ser Gly Gln Met Phe Ala Lys 290 295 300 Glu Asp Leu Lys Arg Lys Lys Leu Val Arg Asp Gly Ser Val Phe Leu 305 310 315 320 Lys Asn Ala Ala Gly Arg Leu Lys Glu Val Gln Ala Val Leu Leu Thr 325 330 335 Asp Ile Leu Val Phe Leu Gln Glu Lys Asp Gln Lys Tyr Ile Phe Ala 340 345 350 Ser Leu Asp Gln Lys Ser Thr Val Ile Ser Leu Lys Lys Leu Ile Val 355 360 365 Arg Glu Val Ala His Glu Glu Lys Gly Leu Phe Leu Ile Ser Met Gly 370 375 380 Met Thr Asp Pro Glu Met Val Glu Val His Ala Ser Ser Lys Glu Glu 385 390 395 400 Arg Asn Ser Trp Ile Gln Ile Ile Gln Asp Thr Ile Asn Thr Leu Ser 405 410 415 Gly Asn Gly Trp Arg Cys Phe Asn 420 <210> 29 <211> 2170 <212> DNA <213> Human <400> 29 ctgagggctc atccctctgc agagcgcggg gtcaccggga ggagacgcca tgacgcccgc 60 cctcacagcc ctgctctgcc ttgggctgag tctgggcccc aggacccgcg tgcaggcagg 120 gcccttcccc aaacccaccc tctgggctga gccaggctct gtgatcagct gggggagccc 180 cgtgaccatc tggtgtcagg ggagcctgga ggcccaggag taccgactgg ataaagaggg 240 aagcccagag cccttggaca gaaataaccc actggaaccc aagaacaagg ccagattctc 300 catcccatcc atgacagagc accatgcggg gagataccgc tgccactatt acagctctgc 360 aggctggtca gagcccagcg accccctgga gctggtgatg acaggattct acaacaaacc 420 caccctctca gccctgccca gccctgtggt ggcctcaggg gggaatatga ccctccgatg 480 tggctcacag aagggatatc accattttgt tctgatgaag gaaggagaac accagctccc 540 ccggaccctg gactcacagc agctccacag tggggggttc caggccctgt tccctgtggg 600 ccccgtgaac cccagccaca ggtggaggtt cacatgctat tactattata tgaacacccc 660 ccaggtgtgg tcccacccca gtgaccccct ggagattctg ccctcaggcg tgtctaggaa 720 gccctccctc ctgaccctgc agggccctgt cctggcccct gggcagagcc tgaccctcca 780 gtgtggctct gatgtcggct acgacagatt tgttctgtat aaggaggggg aacgtgactt 840 cctccagcgc cctggccagc agccccaggc tgggctctcc caggccaact tcaccctggg 900 ccctgtgagc ccctcccacg ggggccagta caggtgctat ggtgcacaca acctctcctc 960 cgagtggtcg gcccccagcg accccctgaa catcctgatg gcaggacaga tctatgacac 1020 cgtctccctg tcagcacagc cgggccccac agtggcctca ggagagaacg tgaccctgct 1080 gtgtcagtca tggtggcagt ttgacacttt ccttctgacc aaagaagggg cagcccatcc 1140 cccactgcgt ctgagatcaa tgtacggagc tcataagtac caggctgaat tccccatgag 1200 tcctgtgacc tcagcccacg cggggaccta caggtgctac ggctcataca gctccaaccc 1260 ccacctgctg tctttcccca gtgagcccct ggaactcatg gtctcaggac actctggagg 1320 ctccagcctc ccacccacag ggccgccctc cacacctggt ctgggaagat acctggaggt 1380 tttgattggg gtctcggtgg ccttcgtcct gctgctcttc ctcctcctct tcctcctcct 1440 ccgacgtcag cgtcacagca aacacaggac atctgaccag agaaagactg atttccagcg 1500 tcctgcaggg gctgcggaga cagagcccaa ggacaggggc ctgctgagga ggtccagccc 1560 agctgctgac gtccaggaag aaaacctcta tgctgccgtg aaggacacac agtctgagga 1620 cagggtggag ctggacagtc agagcccaca cgatgaagac ccccaggcag tgacgtatgc 1680 cccggtgaaa cactccagtc ctaggagaga aatggcctct cctccctcct cactgtctgg 1740 ggaattcctg gacacaaagg acagacaggt ggaagaggac aggcagatgg acactgaggc 1800 tgctgcatct gaagcctccc aggatgtgac ctacgcccag ctgcacagct tgacccttag 1860 acggaaggca actgagcctc ctccatccca ggaaggggaa cctccagctg agcccagcat 1920 ctacgccact ctggccatcc actagcccgg ggggtacgca gaccccacac tcagcagaag 1980 gagactcagg actgctgaag gcacgggagc tgcccccagt ggacaccagt gaaccccagt 2040 cagcctggac ccctaacaca gaccatgagg agacgctggg aacttgtggg actcacctga 2100 ctcaaagatg actaatatcg tcccattttg gaaataaagc aacagacttc tcaacaatca 2160 atgagttaat 2170

Claims (52)

  1. LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 존재 또는 발현을 분석함으로써 환자가 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)에 의한 치료에 반응할 것인지를 결정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    FTI의 존재하에 차별적으로 변조되는 유전자의 발현을 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    분석이 LBC 종양유전자 이외에 하나보다 많은 유전자의 발현에 대한 것인 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1, 3 내지 18 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1 및/또는 3인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    LBC 종양유전자가 존재하지 않거나 발현되지 않는 것으로 결정된 환자를 FTI로 치 료하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    LBC 종양유전자가 존재하거나 발현되는 것으로 결정된 환자를 FTI가 아닌 다른 약제로 치료하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    FTI에 대한 반응을 결정하기 위해 사용되는 환자 샘플이 CD33 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 세포 표면 항원을 포함하는 지를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    표면 항원을 갖는 세포의 존재가 FTI 치료에 대한 반응을 나타내는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    모세포를 포함하는, FTI에 대한 반응을 결정하기 위해 사용되는 환자 샘플 중의 세포의 비율을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    샘플 중 60% 미만의 모세포의 존재가 FTI에 대한 반응을 나타내는 방법.
  12. LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 존재 또는 발현을 분석함으로써 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)에 의해 치료되는 환자의 치료를 모니터하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    FTI의 존재하에 차별적으로 변조되는 유전자의 발현을 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    분석이 LBC 종양유전자 이외에 하나보다 많은 유전자의 발현에 대한 것인 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1, 3 내지 18 및 29로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1 및/또는 3인 방법.
  17. 제 12 항에 있어서,
    LBC 종양유전자가 존재하지 않거나 발현되지 않는 것으로 결정된 환자를 FTI에 반응하는 환자로서 치료하는 방법.
  18. 제 12 항에 있어서,
    FTI에 대한 반응을 결정하기 위해 사용되는 환자 샘플이 CD33 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 세포 표면 항원을 포함하는 지를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    CD33의 경우 15% 미만 또는 CD34의 경우 60% 미만으로 상기 표면 항원을 포함하는 세포의 존재가 FTI 치료에 대한 반응을 나타내는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    표면 항원을 갖는 세포의 부재가 FTI 치료에 대한 반응을 나타내는 방법.
  21. 제 12 항에 있어서,
    모세포를 포함하는, FTI에 대한 반응을 결정하기 위해 사용되는 환자 샘플 중의 세포의 비율을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    샘플 중 60% 이하의 모세포의 존재가 FTI에 대한 반응을 나타내는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    샘플 중 60%보다 많은 모세포의 존재가 FTI에 대한 무반응을 나타내는 방법.
  24. 제 12 항에 있어서,
    LBC 종양유전자가 존재하거나 양이 감소되지 않고 발현되는 것으로 결정된 환자를 FTI에 반응하지 않는 환자로서 치료하는 방법.
  25. 제 12 항에 있어서,
    FTI가 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논인 방법.
  26. 제 12 항에 있어서,
    FTI가 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논인 방법.
  27. (a) 환자가 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)에 의한 치료에 반응할 것인지를 결정하기 위해 상기 환자에서 LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 유전자 발현 프로필 또는 존재를 분석하고;
    (b) 상기 분석이 환자가 반응할 것을 나타내는 경우 환자를 FTI로 치료함을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    분석이 하나보다 많은 유전자의 발현에 대한 것인 방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    FTI가 퀴놀린 또는 퀴놀린 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    FTI가 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 방법:
    7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일)메틸]-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온,
    7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일)메틸]-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온,
    8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온,
    8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온, 및
    (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논.
  31. 제 30 항에 있어서,
    FTI가 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논인 방법.
  32. 제 28 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1 내지 18 및 29를 갖는 하나 이상의 핵산 서열과 상관되는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1 및/또는 3인 방법.
  34. 제 27 항에 있어서,
    치료가 FTI 및 또 다른 치료 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    또 다른 치료 조성물이 MAPK/ERK 신호 경로, TGFβ, WNT, Rho 또는 세포사멸 경로를 변조시키는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서,
    또 다른 조성물이 티로신 키나제 억제제, MEK 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, MAP 키나제 억제제, 세포사멸 변조제 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  37. FTI 반응을 나타내는 환자 유전자 발현 프로필을 결정하는 매체를 포함하는, 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)로 환자를 치료하는 효율을 평가하기 위한 제품.
  38. 제 37 항에 있어서,
    유전자 발현 프로필이 서열 번호: 1 내지 18 및 29의 하나보다 많은 핵산 서열에 상관되는 유전자 군으로부터 수득되는 제품.
  39. 제 37 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1 및/또는 2 및/또는 3인 제품.
  40. 제 37 항에 있어서,
    매체에 기록된 유전자 발현 프로필의 설명을 포함하는 제품.
  41. 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI) 치료에 대한 반응을 측정하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  42. 제 41 항에 있어서,
    시약이 LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 존재 또는 발현을 검출하기 위한 것인 키트.
  43. 제 42 항에 있어서,
    시약이 서열 번호: 1, 3 내지 18 및 29 및 그의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 유전자의 발현을 검출하기 위한 것인 키트.
  44. 제 43 항에 있어서,
    유전자가 서열 번호: 1 및/또는 3인 키트.
  45. 제 41 항에 있어서,
    CD 33 및 CD34로 이루어진 군에서 선택된 세포 표면 항원을 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
  46. 제 41 항에 있어서,
    모세포를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
  47. 제 41 항에 있어서,
    시약이 PCR 프라이머를 포함하는 키트.
  48. 제 47 항에 있어서,
    프로브를 추가로 포함하는 키트.
  49. LBC 종양유전자(서열 번호: 2)가 존재하지 않거나 발현되지 않는 것으로 결정되었거나 또는 후속으로 결정되는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)의 용도.
  50. LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 존재 또는 발현에 대해 후속으로 모니터되는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)의 용도.
  51. 환자로부터의 샘플을 분석하여 LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 존재 또는 발현을 측정하기 위한 진단 키트.
  52. 환자가 파네실 트랜스퍼라제 억제제(FTI)에 의한 치료에 반응할 것인지를 측정하기 위해 상기 환자에서 LBC 종양유전자(서열 번호: 2)의 유전자 발현 프로필 또는 존재를 측정하기 위한 수단; 및
    분석이 환자가 반응할 것을 나타내는 경우 상기 환자를 치료하기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 FTI의 용도를 포함하는,
    환자를 치료하기 위한 복합 방법.
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