KR20050004076A - 암의 평가 및 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 환자의 유전자 발현 프로파일 및/또는 분자 표식을 분석하여 환자가 파르네실 트랜스퍼라제 저해제(farnesyl transferase inhibitor; FTI), 및 선택적으로 다른 치료제를 이용한 치료에 반응할지를 측정함을 포함하는, 환자의 암, 바람직하게는 혈액 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 환자의 치료를 모니터링하고, 치료 과정을 선택하는데 유용하다. FTI 치료에 반응하여 조절되는 유전자가 제공되어, 프로파일의 공식화에 사용된다.

Description

암의 평가 및 치료 방법{METHODS FOR ASSESSING AND TREATING CANCER}
본 발명은 분자 마커의 검출 및/또는 유전자 발현 분석에 기초한 암의 진단,예방 및 치료에 관한 것이다.
암에 연루된 Ras와 같은 일부 분자는 세포의 원형질 막의 내부 소편과 상호작용하기 위해서는 파르네실화 트랜스퍼라제 효소에 의해 파르네실화되고 상기 분자는 다양한 신호화 경로에 관여된다. 그러나, Ras는 프레닐화된 CAAX 박스를 갖는 것으로 암에 연루된 유일한 단백질은 아니다. 파르네실 트랜스퍼라제 저해제(FTI)는 다양한 단백질의 C-말단 CAAX 주지(motif)로의 탄소 파르네실 잔기의 공유 결합을 억제하는 치료제이다. 이들은 암 및 증식성 질환, 예를 들어 혈액학적 악성종양의 치료에 유용하다. 혈액학적 악성종양, 예를 들어 백혈병, 임파종증, 및 골수종(예를 들어, 급성 골수양성 백혈병; AML)은 FTI에 의해 가장 유리하게 어드레싱될 수 있는 질환에 포함된다. 또한, 유방암 및 교아종과 같은 고형 종양은 FTI에 의해 치료될 수도 있다.
많은 치료 처방 계획의 경우에 해당되는 바와 같이, 일부 환자는 FTI에 의한 치료에 반응하지만, 다른 환자는 반응하지 않는다. 여기에 반응하지 않은 것 같은 환자에게 치료를 처방하는 것은 바람직하지 않다. 따라서, 약물이 투여되기 전에 이러한 치료에 대해 환자가 반응할지 여부를 예상하여 비-반응자에게는 불필요하게 치료하지 않고 약물에 의해 좋은 기회를 갖는 환자는 적절하게 치료하고 모니터링하는 것이 유용할 것이다. 추가로, 치료에 반응하는 사람들중에도 반응 정도를 다양하게 구별할 수 있다. FTI가 아닌 치료제에 의한 치료 또는 FIT에 부가적으로 치료제를 사용하는 치료가 FTI에 반응하지 않은 환자 또는 FTI에 대한 반응도가 요구되는 것 이하인 환자에게 유리할 수 있다.
본 발명은 환자의 유전자 발현 프로파일 및/또는 분자 표식을 분석하여 환자가 FTI 및 선택적으로 다른 치료제를 이용한 치료에 반응할지를 측정함을 포함하는, 환자의 암, 바람직하게는 혈액 종양을 치료하는 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 높은 CD33 항원 발현 및 낮은 CD33 항원 발현을 갖는 환자의 카프란-메이어(Kaplan-Meier) 분석법의 그래프이다.
도 2는 높은 아세포 총수 및 낮은 아세포 총수를 갖는 환자의 카프란-메이어 분석의 그래프이다.
도 3a는 임상적인 반응 분류자를 사용한 환자의 카프란-메이어 생존 분석의 그래프이다.
도 3b는 환자를 분류하기 위해서 oncoLBC 유전자 발현을 사용한 환자의 카프란-메이어 생존 분석의 그래프이다.
도 3c는 환자를 분류하기 위해서 oncoLBC 및 AHR 유전자 발현을 사용한 환자의 카프란-메이어 생존 분석의 그래프이다.
본 발명은 FTI에 의한 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서, 분자 마커의 존재 또는 부재는 환자가 FTI에 대해 반응할 것 같은지 여부에 대한 결정요인이다. 환자가 반응할 것 같은 경우에, 환자는 FTI에 의해 치료된다. 환자가 FTI에 의한 치료에 반응하지 않을 것 같은 경우에는, 상기 치료는 보유될 수 있다. 본 발명의 한가지 양태에서, FTI 반응을 예언하는 일련의 유전자에 대해 유전자 발현 프로파일이 수득된다. 본 발명의 다른 양태에서, 분자 마커의 존재 및 유전자 발현 프로파일이 조합되어 사용되어 FTI 치료에 대한 반응의 가능성을 결정한다. 본 발명의 다른 양태에서, 발현 프로파일은 백혈병성 아세포의 총수 및/또는 백혈병성 세포 항원 발현과 조합하여 사용하여 FTI 치료에 대한 반응 가능성을 결정한다. 본 발명의 다른 양태에서, 분석시험에서 사용된 샘플은 골수에서 채취한다.
본 발명의 다른 양태에서, FTI에 의한 치료에 대해 암 환자를 모니터링하되, 여기서 환자의 유전자 발현 프로파일 및/또는 분자 마커의 존재를 분석하여 FTI에 대해 환자가 반응하는지 여부를 결정하고, 환자가 요구되는 양상으로 반응할 것 같은 경우, 환자를 FTI에 의해 치료한다.
본 발명의 다른 양태에서, 유전자 발현 프로파일이 FTI 반응자의 구체적인 유전자 지시자중 1종 이상을 조절하는 것으로 나타나는 경우, 환자를 치료한다.
본 발명의 다른 양태에서, 유전자 발현 프로파일이 FTI 반응자의 구체적인 유전자 지시자 1종 이상을 조절하는 것으로 나타내고 골수 아세포 총수가 0 내지 60%이거나 CD33 세포 표면 항원중 양성 발현을 나타내는 세포가 60% 미만으로 존재하고/하거나 CD34 세포 표면 항원중 양성 발현을 하는 세포가 10% 미만으로 존재하는 경우, 환자를 치료한다.
본 발명의 다른 양태에서, 분자 마커는 lbc 종양유전자, AHR, DKFZp667G2110, IDS, GPR105, TEM6, TNFSF13, SVIL, KIAA0680, FRAG1, DKFZp566B213, KIAA1036, BTG3, MAPK81P3, ARHH, NPTX2중 1종 이상이다. 마커는 또한 전술한 1종 이상의 성분과 조합된 형태의 OPN3 및/또는 IL3RA일 수도 있다.
본 발명의 다른 양태에서, FTI는 퀴놀린 또는 퀴놀린 유도체이다.
본 발명의 다른 양태에서, FTI는 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논)이다.
상기 방법을 수행하는데 사용되는 제품 또한 본 발명의 양태에다. 이러한 제품은 유전자 발현 프로파일 또는 이들의 표시장치(representation)를 들 수 있다. 이러한 표시장치는 컴퓨터 판독성 매체에 고정될 수 있다. 본 발명에 따른 다른 제품은 본 발명의 유전자 발현 프로파일을 측정하는데 사용되는 핵산 배열 및 다른 핵산 검출 기법를 수행하기 위한 장치 및 구성요소이다.
키트 또한 본 발명의 양태이다. 이러한 키트는 FTI 치료에 대해 비-반응자로부터 반응자를 구별하는 분자 마커의 존재 및/또는 유전자 발현을 검출하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 암 환자를 치료하는 방법은 FTI, 및 MAPK/ERK 신호전달 경로, TGFβ, WNT, Rho 또는 세포사멸 경로를 조절하는 치료제 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 환자는 FTI 및 타이로신 키나제 저해제, MEK 키나제 저해제, PI3 키나제 저해제, MAP 키나제 저해제, 세포사멸 조절자 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 치료제 조성물에 의해 치료된다.
본 발명의 다른 양태에서, 환자의 분자 마커의 존재 또는 부재 및/또는 유전자 발현 프로파일을 분석하여 환자가 FTI 및 다른 약물의 조합물의 형태로부터 이로울 수 있는지 여부를 결정한다. 그다음, 환자는 이러한 조합물로 치료하거나, 환자가 FTI에 반응할 것 같지 않은 경우에는 환자는 타이로신 키나제 저해제, MEK 키나제 저해제, PI3K 키나제 저해제, MAP 키나제 저해제, 세포사멸 조절자 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것과 같은 다른 약물로 치료된다.
본 발명의 다른 양태에서, 환자의 분자 마커의 존재 및/또는 유전자 발현 프로파일을 분석하여, 환자가 FTI와 다른 형태의 치료와 조합하여 이로울 수 있는지 여부를 결정한다. 그다음, 환자는 이러한 조합으로 치료하거나, 환자가 FTI에 대해 반응할 것 같지 않은 경우, 환자는 FTI를 포함하지 않은 다른 치료법에 의해 치료된다.
본 명세서에서 지칭하는 치료제는 FTI이다. 이들은 여러가지 형태로 작용하지만, 암 및 증식성 질환에 연루된 단백질의 파르네실화를 방해하거나 감소시키는 필수적인 억제 기능을 공유한다. 바람직하게는, FTI는 유방암 및 교아종과 같은 고형 종양의 치료를 표시하는 것이다. 보다 바람직하게는, FTI는 백혈병, 임파종증, 및 골수종과 같은 혈액학적 악성종양의 치료를 표시하는 것이다. 가장 바람직하게는, FTI는 AML, 골수이형성 증후군(MDS), 만성 골수양성 백혈병(CML), 만성 골수단핵세포성(myelomonocytic) 백혈병(CMML) 및 다중 골수성(MM)에서의 용도를 위해 고려된다. 혈액학적 악성종양의 경우에, FTI에 반응하는 환자는 FTI에 의해 치료한 후에 골수에서 50% 초과의 아세포의 감소가 관찰되는 환자이다. 고형 종양의 경우, FTI에 반응하는 환자는 이들의 종양의 성장이 멈추는 환자이다. 고형 종양을 갖는 환자에서의 반응은 종양학에서 일반적으로 사용되는 것으로 RECIST(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 기준에 따라 선택적으로 평가될 수 있다.
다양한 FTI가 본 발명의 범주에 속하는 바, 이들의 예를 들어 브라운(Brown) 등에게 허여된 미국특허 제 5,976,851 호, 안토니(Anthony) 등에게 허여된 미국특허 제 5,972,984 호; 드솔름(deSolms)에게 허여된 미국특허 제 5,972,966 호; 딘스무어(Dinsmore) 등에게 허여된 제 5,968,965 호; 베네트(Venet) 등에게 허여된 미국특허 제 5,968,952 호; 베네트 등에게 허여된 미국특허 제 6,187,786 호; 베네트 등에게 허여된 미국특허 제 6,169,096 호; 베네트 등에게 허여된 미국특허 제 6,037,350 호; 안기바우드(Angibaud) 등에게 허여된 미국특허 제 6,177,432 호; 그래함(Graham) 등에게 허여된 미국특허 제 5,965,578 호; 셉티(Septi) 등에게 허여된 미국특허 제 5,965,539 호; 아폰소(Afonso) 등에게 허여된 미국특허 제 5,958,939 호; 안토니(Anthony) 등에게 허여된 미국특허 제 5,939,557 호; 콘메르콘(Commercon) 등에게 허여된 미국특허 제 5,936,097 호; 안토니 등에게 허여된 미국특허 제 5,891,889 호; 바우딘(Baudin) 등에게 허여된 미국특허 제 5,889,053 호; 안토니 등에게 허여된 미국특허 제 5,880,140 호; 디솔름에게 허여된 미국특허 제 5,872,135 호; 드솔름에게 허여된 미국특허 제 5,869,682 호; 바우도인(Baudoin)에게 허여된 미국특허 제 5,861,529 호; 그라함 등에게 허여된 미국특허 제 5,859,015 호; 클렉(Clerc)에게 허여된 미국특허 제 5,856,439 호; 안토니 등에게 허여된 미국특허 제 5,856,326 호; 그라함 등에게 허여된 미국특허 제 5,852,010 호; 마르스테(Marsters) 등에게 허여된 미국특허 제 5,843,941 호; 돌(Doll)에게 허여된 미국특허 제 5,807,852 호; 딘스모어(Dinsmore) 등에게 허여된 미국특허 제 5,780,492 호; 동(Dong) 등에게 허여된 미국특허 제 5,773,455 호; 킴(Kim) 등에게 허여된 미국특허 제 5,767,274 호; 안토니 등에게 허여된 미국특허 제 5,756,528 호; 바우도인 등에게 허여된 미국특허 제 5,750,567 호; 비샵(Bishop) 등에게 허여된 미국특허 제 5,721,236 호; 돌 등에게 허여된 미국특허 제 5,700,806 호; 안토니 등에게 허여된 미국특허 제 5,661,161 호; 셉티 등에게 허여된 미국특허 제 5,602,098 호; 브레슬린 등에게 허여된 미국특허 제 5,585,359 호; 시카론(Ciccarone) 등에게 허여된 미국특허 제 5,578,629 호; 시카론 등에게 허여된 미국특허 제 5,534,537 호; 마르스터(Marsters) 등에게 허여된미국특허 제 5,532,359 호; 파텔(Patel) 등에게 허여된 미국특허 제 5,523,430 호; 드솔름 등에게 허여된 미국특허 제 5,504,212 호; 드솔름 등에게 허여된 미국특허 제 5,491,164 호; 브라운 등에게 허여된 미국특허 제 5,420,245 호; 및 그라함 등에게 허여된 미국특허 제 5,238,922 호에 기술되어 있고, 이들은 각각 본원에서 참고문헌으로 인용된다. 비-펩티드 결합성, 소위 "소분자" 치료제가 바람직하다. 보다 바람직한 FTI는 하기와 같은 퀴놀린 또는 퀴놀린 유도체이다:
7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일메틸]-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온,
7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일메틸]-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온,
8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-1,2-다이하이드로-4H-피롤[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온 및
8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온.
가장 바람직한 FTI는 (+)거울상 이성질체로서 베넷(Venet)에 의한 미국특허 제 6,420,387 호에 기술된 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논)이다.
또다른 바람직한 FTI는 WO 제 01/98302 호에 기술된 (-)-5-(3-클로로페닐)-α-(4-클로로페닐)-α-(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)테트라졸로[1,5-a]퀸아졸린-7-메탄아민 및 그의 약학적으로 허용가능한 산 부감 염이다.
다른 유용한 FTI는 알그라빈(즉, WO 제 98/28303 호에 기술된 1(R)-10-에폭시-5(S),7(S)-구아이아-3(4), 11(13)-다이엔-6,12-올리드; WO 제 99/45912 호에 기술된 페릴일 알콜; 미국특허 제 5874442 호에 기술된 SCH-66336, 즉 (+)-(R)-4-[2-[4-(3,10-다이브로모-8-클로로-5,6-다이하이드로-11H-벤조[5,6]사이클로헵타[1,2-b]피리딘-11-일)피페리딘-1-일]-2-옥소에틸]피페리딘-1-카복시아미드; WO 제 00/01691 호에 기술된 L778123, 즉 1-(3-클로로페닐)-4[1-(4-시아노벤질)-5-이미다졸일메틸]-2-피페라진온; WO 제 94/10138 호에 기술된 화합물 2(S)-[2(S)-[2(R)-아미노-3-머갑토]프로필아미노-3(S)-메틸]-펜틸옥시-3-페닐프로피오닐-메티오닌 술폰; 및 WO 제 97/30992 호에 기술된 BMS 214662, 즉 (R)-2,3,4,5-테트라하이드로-1-(1H-이미다졸-4-일메틸)-3-(페닐메틸)-4-(2-티에닐술포닐)-1H-1,4-벤조디아자핀-7-카보니트릴; 미국특허 제 5,747,498 호에 기술된 CP 609754, 즉 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀸아졸린아민; 및 WO 제 00/12499 호에 기술된 6-[아미노-(4-클로로-페닐)-(3-메틸-3H-이미다졸-4-일)-메틸]-4-(3-에티닐-페닐)-1-메틸-1H-퀸올린-2-온을 포함한다:
게놈내에서 단백질 또는 펩티드("유전자")를 발현하는 잠재성을 갖는 핵산 서열의 존재는 단백질 또는 펩티드가 제공된 세포에서 발현 여부를 결정하지 않는다. 단백질 또는 펩티드 또는 전사 RNA를 발현할 수 있는 유전자를 제공 여부가 실시되고, 이러한 발현 또는 전사가 발생하는 범위에서 모두 발현하는 것은 다양한 복합 요소에 의해서 결정된다. 그러나, 유전자 발현 분석은 약물 또는 다른 약학 제제의 도입과 같은 주어진 자극에 세포적 반응에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 유전자가 활성 또는 불활성화되는 정도의 상대적인 지시자는 유전자 발현 개요에서 관찰할 수 있다. 일부 경우, 분자 마커의 존재는 자체적으로 또는 유전자 발현 정보를 사용하여 치료 효율에 대해 유용한 정보를 제공할 수 있다. 유전자 발현 개요 및 본 발명의 분자 지시자는 FTI 치료에 의해 이점을 얻거나 환자가 약물 또는 치료에 이로운 반응을 작게 보이거나 보이지 않는 경우 환자의 FTI 처리가 배제되는 환자를 진단 및 치료하는데 사용된다.
혈액학적 악성종양을 포함하는 암은 전형적으로 다양한 유전자에 돌연변이에서 유발된다. 동일한 형태의 암은 동일한 유형의 암을 갖는 또다른 환자의 것과는 상이한 하나 이상의 변이의 결과로서 유발되거나 동시에 유발된다. 종종 동일한 암을 진행하는 다중 분자 베이스가 존재함은 환자에 영향을 끼치는 일부의 치료가 동일 유형의 암을 앓고 있는 다른 환자에게 반드시 동일한 영향을 끼치는 것은 아닌 관찰결과와 일치하는 것이다. 또한, 진단적 관점에서, 구체적 변이, 예를 들어 전좌, 결실 또는 SNP의 존재는 밀접한 관계일 수 있다. 일부 경우, 분자적 마커 자체가 진단, 예후 또는 치료 반응 결정을 위한 유용한 지시자이다. 특히, 분자 변이가 실제 치료 반응과 관련될 수 있기 때문이다. 본 발명에서 lbc 종양유전자가 없는 암(임파계 미분화 분리 종양유전자)은 FTI 처리에 반응한다. 따라서 이유전자의 발현, 유전자의 발현의 결여 및 그의 존재 또는 부재는 구체적으로 상기 기술된 처리 이전의 FTI 처리에 대한 저항성을 예측하는데 유용하다.
lbc 종양유전자(서열번호 2)는 염색체 7q에서 유래한 관련되지 않은 서열을 갖는 염색체 15q상에 lbc 원-종양유전자(서열번호 23 내지 27)와의 융합에서 유래하는 키메라(kimera)이다. 서열의 C-말단에 원-종양유전자의 절단은 형질전화 능력을 얻은 유전자를 초래한다. 이 절단은 또한 전좌와 다른 기전에서 유래한다. 예를 들어, 이상한 스프라이싱은 C-말단 절단을 갖는 RNA 전사체를 유도할 수 있다. 유전자는 mRNA 및 단백질(서열번호 29, 인간 LBC 단백질, 유전자 은행 도달번호 GI: 29791897)을 포함하는 많은 발현 산물을 갖는다. lbc 종양유전자가 기능하는 정확한 방식이 완전히 이해되지 않았을 때 골격 근육, 심장, 폐, 정소, 난소, 소장 및 조혈 세포를 포함하는 조직의 범위에 존재할 수 있는 것이 명백하다. 종양유전자가 밝혀질 수 있는(없는 것을 제외하고) 조직에서 유래한 종양의 치료는 본 발명의 범주에 포함된다.
유전자 절단의 산물이고 이것이 인식할 수 있는 발현 산물을 생성하기 때문에 본 발명의 분석을 구성하는데 이용할 수 있는 큰 유연성이 있다. 유전자의 부재 또는 그의 산물이 사용될 뿐만 아니라 이 유전자의 조절된 발현의 결실일 수 있다. 따라서, 유전자 발현 개요는 이 유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자의 부재 또는 변화가 혈액학적 악성종양, 특히 바람직하게는 백혈병, 가장 바람직하게는 AML에서 FTI 처리 반응의 지시자로서 사용된다.
분자 표지자로서 lbc 종양유전자의 동정이 진행되는 경우 검출을 위한 임의의 적당한 방법을 사용할 수 있다. 분자 마커의 존재는 FTI 처리를 위한 불량한 예후를 표시하고 그의 부재가 그런 처리에 반응의 더 우수함을 표시한다. lbc 종양유전자의 존재를 검출하기에 유용한 방법은 알려진 돌연변이 유전자 또는 제한없이 단일 가닥 구조 다양성 기술, 화학적 및 열 변성 기울기 분석, 화학 및 효소학적 절단 방법, 질량 분광법, RFLP 및 대립유전자 특정 증폭, 방사성 PCR, 비드-기초 및 마이크로어레이 분석, ELISA, 웨스턴, FACS, 항체-기초 기술, 메틸레이션-기초 PCR 및 SNP 검출을 포함하는 알려진 돌연변이 유전자 또는 서열을 검출하기 위한 임의의 방법을 포함한다.
lbc 종양유전자의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 가장 바람직한 방법은 PCR이다. 이 방법에서, 세포는 보통 시료 제조 방법에 따라서 환자로부터 처음으로 수득된다. 종양이 혈액학적인 경우 단순 말초 혈액 시료 또는 골수 시료가 바람직하다. 이어서, RNA는 흔히 사용되는 방법 및 하기의 보강된 방법에 따라 추출된다. 목적 서열을, 예를 들어 ABI 텍맨(Taqman) 완충액 내에 250nM의 프라이머 및 250nM의 텍맨 프로브를 사용하여 증폭한다. 열 순환은 50℃에서 2분간, 95℃에서 10분간 수행하고 다음에 50회 동안 95℃에서 15분 및 62℃에서 1분간 반복진행한다. 프라이머 및 프로브의 예를 하기 표 1에 기재한다.
이 기술은 시료내에 존재하고 LBC 전사체의 양을 측정한다. 측정된 양은 동일 시료를 내인성 대조 유전자, 예를 들어 HPRT을 증폭시키는데 사용하여 유사한 RT-PCR 실험을 진행하여 표준화할 수 있다.
LBC 종양유전자의 부재 또는 존재를 검출하기 위한 또다른 방법은 RNA 전사체의 길이 분석이다. LBC 종양유전자가 3' 전위를 갖기 때문에 전사체 길이가 LBC 원-종양유전자 전사체보다 더 짧다. 이 끝점이 진단에 선호된다. 전사체의 크기를 진단하기 위해서 원- 및 종양형성 LBC 전사체 모두에 유사한 전방향 프라이머를 RNA 전사체의 보편적인 폴리 A 말단에 유사한 역방향 프라이머와 함께 결합하여 사용한다(예를 들어, 상기 표 1로부터 LBC 전방향 프라이머). 바람직하게는, 초기 cDNA 합성은 폴리 A 서열의 동일한 3'서열 말단에 부가적으로 혼입하여 PCR 반응을 위해 부가적 특이성을 부여한다.
게놈의 전위가 측정된다면 게놈 DNA가 표준 기술 및 lbc 종양형성 유전자에 특이적으로 사용되는 PCR 프라이머를 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 종양유전자 및 원LBC 유전자 모두에서 유사한 전방향 프라이머는 상기 기술된 바와 같이 폴리A 서열과 결합하여 사용할 수 있다.
다르게는, 역방향 프라이머가 3'-전위 서열에 유사할 수 있다. 정보판독은 종양유전자가 원종양유전자 또는 종양LBC-특이 증폭체의 존재 또는 부재보다 더 짧은 산물과 일치하는 증폭체의 크기이다.
세포의 종양유전자 상태에 대한 분석은 또한 면역조직학적 분석(IHC)과 같은기법을 이용하여 진단목적으로 정상/비정상 조직분배를 측정할 수 있다. 예를 들어, lbc 단백질에 대한 항체가 면역조직학에 의한 연구용으로 준비된 신선 냉동되고 포르말린 정착된 파라핀 엠베딩된 조직 블록과 함께 사용될 수 있다. 각각의 조직 블록은 50mg의 잔여 "쇄분된" 종양으로 구성될 수 있다.
요약하면, 냉동된 절개부는 소형의 플라스틱 캡슐 중의 PBS에서 50mg의 냉동된 쇄분된 종양을 실온에서 재수화시키고; 입자를 원심분리에 의해 펠렛팅시키며; 그것들을 점성의 엠베딩된 매질(OCT)에서 재현탁시키고; 캡슐을 역전시키고 원심분리에 의해 재차 펠렛팅시키며; -70℃ 아이소펜탄에서 스냅-냉동(snap-freezing)시키고; 플라스틱 캡슐을 절단하고 조직의 냉동된 실린더를 제거하며; 냉동미세절단기 박절기 척(cryostat microtome chuck) 위에 조직 실린더를 고정시키고; 무손상 종양세포를 함유하는 25 내지 50개의 연속적인 절개부를 절단함으로써 준비될 수 있다.
영구적 절개부는 50mg의 샘플을 플라스틱 마이크로퓨쥐 관(microfuge tube)에서 재수화시키고; 세척/펠렛팅을 실행하며; 온화한 2.5% 한천 속에 재현탁시키고; 펠렛팅시키며; 빙수 속에서 냉각시켜 상기 한천을 경화시키고; 상기 관으로부터 조직/한천 블록을 제거하며; 상기 블록을 파라핀 중에 침윤시키며 엠베딩시키고; 50개 이하의 연속적인 영구 절개부를 절단하는 것을 포함하는 유사한 방법에 의해 준비될 수 있다.
면역조직학적 분석에 있어서 절개부에는 PBS 또는 기타 블록킹 시약 중의 3% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 블로킹 용액을 오버레이(overlay)한다. 블로킹 시약은 비특이적 혈청 또는 건조 우유를 포함한다. 블로킹 처리는 실온에서 1시간동안 진행시킨다. 항 lbc 단백질 항체를 3% BSA, 0.1% TRITON X.TM.-100, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 1:100의 비율로 함유하는 PBS 완충액으로 희석시킨다. 일반적으로, 4℃에서 16시간동안 샘플 절개부에 항체 용액을 오버레이한다. 기간 및 온도조건은 선택된 항체 및 시험된 물질에 따라 변할 수 있다. 최적의 조건은 임상적으로 결정될 수 있다. 이어서 항체 처리된 절개부를 각각 PBS 중에서 15분동안 3회 세척하여 미결합 항체를 제거한 다음, 3% BSA를 함유하는 PBS 및 제 2 항체를 1:2000의 희석비로 오버레이한다. 제 2 항체를 색소 효소 예를 들어 홍당무 과산화효소, 알칼리성 인산화효소, 플로오레세인 아이소-티오시아네이트, 또는 기타 적당한 효소와 커플링시킬 수 있다. 또한, 제 2 항체는 바이오틴(biotin)과 콘쥬게이트되거나 발색단 표지된 아비딘과 함께 사용될 수 있다.
lbc 종양유전자의 존재를 검출하기 위한 또다른 예시적 방법은 제자리 부합(in situ hybridization)을 통해서이다. 일반적으로 제자리 부합은 (1) 피분석 조직 또는 생물학적 구조의 정착; (2) 표적 DNA의 접근성을 증가시키고 비특이적 결합을 감소시키는 생물학적 구조의 예비부합 처리; (3) 생물학적 구조 또는 조직에서의 핵산에 대한 핵산의 혼합물의 부합; (4) 부합시에 결합되지 않은 핵산 분절을 제거하는 후속 부합 세척; 및 (5) 부합된 핵산 분절의 검출을 포함한다. 상기 단계들 및 사용을 위한 조건 각각에서 사용된 시약은 특정한 적용에 따라 변한다.
이러한 경우에 있어서 (염색체 반점에서) lbc 종양유전자로 부합시킬 수 있는 하나 이상의 검출가능한 핵산을 포함하는 부합 용액을 부합 조건하에서 세포와 접촉시킨다. 이어서, 부합을 검출하고 정상 또는 대조 세포로부터의 예비결정된 부합 패턴과 비교한다. 바람직하게는 프로브(probe)는 알파-중심 프로브이다. 이러한 프로브는 다수의 공급처(예: Visys Inc., Downers Grove, IL)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 바람직한 양태에 있어서 부합 용액은 키메라(예: 15q24-25)를 구성하는 서열의 전위에 상응하는 염색체 상의 영역에 대해 특이적인 다수의 프로브를 함유한다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합한 부합 프로토콜은 예를 들어 다음 문헌에 기술되어 있다[Albertson(1984) EMBO J. 3: 1227-1234; Pinkel(1988)vProc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142; EPO Pub. No. 430,402; Methods in Molecualr Biology, Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, NJ.(1994), etc.]. 특히 바람직한 한 양태에 있어서 문헌, 즉 [Pinkel et al.(1998) Nature Genetics 20:207-211)] 또는 [Kallioniemi(1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:5321-5325(1992)]의 방법이 사용된다. 부합조건을 최적화하는 방법은 익히 공지되어 있다[참조: Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier, N.Y.].
바람직한 양태에 있어서 배경 신호는 비특이적 결합을 감소시키는 부합도중 세제(예: C-TAB) 또는 블로킹 시약(예: 혈청 DNA, cot-1 DNA 등)을 사용함으로써 감소된다. 특히 바람직한 양태에 있어서 부합은 약 0.1 내지 약 0.5mg/ml DNA(예:cot-1 DNA)의 존재하에서 실행된다.
프로브는 합성적으로 또는 생물학적 숙주에서 성장시키는 것을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 준비될 수 있다. 합성법은 올리고누클레오티드, 리보프로브 및 PCR을 포함한다.
프로브는 당해분야 공지의 방법에 의해 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 프로브를 표지하는 방법은 랜덤 시동(random priming), 말단 표지, PCR 및 새김눈번역(nick translation)을 포함한다. 효소적 표지는 핵산 폴리머라제, 3개의 표지되지 않은 누클레오티드의 존재하에서 실행되며, 어느 하나가 직접적으로 표지되는 제 4의 누클레오티드는 표지를 부탁시키기 위한 연결자 팔(linker arm)을 함유하거나 표지된 결합 분자가 결합할 수 있는 합텐 또는 다른 분자에 부착된다. 적당한 직접적 표지는 방사활성 표지 예를 들어32P,3H 및35S, 및 비방사활성 표지 예를 들어 플로오레세인, 텍사스 레드(Texas Red), AMCA 블루, 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 로다민(rhodamine) 등의 형광 마커; 가시광으로 검출될 수 있는 사이아닌 염료; 효소 등을 포함한다. 표지는 또한 비설파이트 매개된 아미노전이에 의해 또는 올리고누클레오티드 합성도중 직접적으로 DNA 프로브 내로 화학적으로 혼입될 수 있다.
형광 마커는 프로브로 혼입된 활성화된 연결자 팔을 갖는 누클레오티드에 용이하게 부착될 수 있다. 프로브는 위에서 개시된 방법에 의해, 합텐 또는 다른 분자 예를 들어 바이오틴 또는 딕옥시게닌에 공유적으로 연결된 누클레오티드를 혼입시킴으로써 및 합텐 또는 다른 분자를 향하게 한 표지된 항체를 사용하거나 바이오틴의 경우에는 검출가능한 표지와 콘쥬게이트된 아비딘으로 샌드위치 부합을 실행함으로써 간접적으로 표지될 수 있다. 항체 및 아비딘은 형광 마커 또는 효소적 마커 예를 들어 알칼리성 인산화효소 또는 홍당무 과산화효소와 콘쥬게이트되어 그것들을 검출가능하게 할 수 있다. 콘쥬게이트된 아비딘 및 항체는 다음과 같은 공급처[Vector Laboratories(Burlingame, Calif) 및 Boehringer Mannheim (Indianapolis, Ind.)으로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
효소는 효소에 기질을 제공하는 것에 의한 착색 반응을 통해 검출될 수 있다. 다양한 기질의 존재하에서는 그 반응에 의해 상이한 색상이 생성되며, 이들 생삭은 다중 프로브를 따로따로 검출하도록 가시화될 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 기질이 사용될 수 있다. 알칼리성 인산화효소용으로 바람직한 기재는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸리움(NBT)를 포함한다. 홍당무 과산화효소용으로 바람직한 기질은 다이아미노벤조에이트(DAB)이다.
본 발명의 제자리 부합법에 사용하기 적당한 형광 표지된 프로브는 바람직하게는 150 내지 500 누클레오티드 길이의 범위이다. 프로브는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA이다.
세포에 대해 검출가능한 프로브의 부합은 0.1 내지 500mg/.mu.l, 바람직하게는 5 내지 250mg/.mu.l의 프로브 농도로 실행된다. 부합 혼합물은 바람직하게는 포름아미드와 같은 변성제를 함유하게 된다. 일반적으로, 부합은 25 내지 45℃,보다 바람직하게는 32 내지 40℃, 가장 바람직하게는 37 내지 38℃에서 수행된다. 부합에 필요한 시간은 약 0.25 내지 96시간, 보다 바람직하게는 1 내지 72시간, 가장 바람직하게는 4 내지 24시간이다. 부합시간은 hnRNP 결합 단백질, 트라이알킬 암모늄 염, 락탐 등의 촉진제를 함유할 수 있는 프로브 농도 및 부합 용액 함량을 기준으로 변하게 된다. 이어서 슬라이드를 포름아미드 등의 변성제를 함유하고 염화나트륨의 농도를 감소시키는 용액으로 또는 미결합 또는 부조화된 프로브를 제거시키는 임의의 용액 속에서 세척한다.
염의 온도 및 농도는 원하는 부합의 수렴능에 따라 변하게 된다. 에를 들어 고 수렴성 세척은 42 내지 68℃에서 수행될 수 있는 반면, 중간 수렴성은 37 내지 55℃의 범위일 수 있으며 저 수렴성은 30 내지 37℃일 수 있다. 고 수렴성 세척을 위한 염 농도는 0.5 내지 1배의 SSC(0.15M NaCl, 0.015M Na 시트르산염) 인 반면, 중간 수렴성은 1 내지 4배 SSC이고 저 수렴성은 2 내지 6배 SSC일 수 있다.
검출 배양단계는, 필요에 따라, 바람직하게는 23 내지 42℃, 보다 바람직하게는 25 내지 38℃, 가장 바람직하게는 37 내지 38℃에서 습실에서 수행되어야 한다. 표지된 시약은 바람직하게는 소혈청 알브민, 무지방 건조 우유 등의 블로킹 시약을 함유하는 용액 중에 희석되어야 한다. 희석비율은 1:10 내지 1:10,000, 보다 바람직하게는 1:50 내지 1:5,000, 가장 바람직하게는 1:100 내지 1:1,000의 범위일 수 있다. 슬라이드 또는 다른 고체 지지체는 과잉의 시약을 제거할 수 있도록 각 배양단계에서 세척되어야 한다.
이어서 슬라이드를 위치시키고 가시적으로 검출가능한 마커의 경우에는 현미경으로 방사활성 마커의 경우에는 자가방사그래픽 필름에 노출시킴으로써 분석을 행한다. 형광 마커의 경우에 있어서 슬라이드는 바람직하게는 음영방지 시약을 함유하는 용액 속에 위치기키고 형광현미경을 사용하여 분석을 행한다. 다중의 핵이 향상된 검출 정확도로 검사될 수 있다.
또한, lbc 종양유전자 돌연변이가 발생하였는지 여부를 결정하기 위해 lbc 종양유전자의 발현 산물에 대한 분석법도 또한 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 분석법은 면역 분석법이다. 가장 간단하고 단적인 의미에서 면역분석법은 결합 분석법이다. 특정한 바람직한 면역 분석법은 당해 분야에 공지된 다양한 유형의 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 및 RIA(radioimmunoassay)이다. 조직 단면을 사용한 면역조직화학적 검출도 또한 특히 유용하다.
하나의 예시적인 ELISA에서는, 폴리스티렌 마이크로역가 플레이트내의 웰과 같은 단백질 친화성을 나타내는 선택된 표면상에 항-lbc 종양유전자 단백질 특이적 항체를 고정시킨다. 이어서, 임상 샘플과 같은, 목적하는 항원을 함유하는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 결합시키고 세척하여 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거한 후, 결합된 항원을 검출할 수 있다. 일반적으로 검출은 검출가능한 표지에 연결된, 목적하는 항원에 특이적인 또 다른 항체를 첨가함으로써 달성된다. 이러한 유형의 ELISA는 간단한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 목적하는 항원에 특이적인 제 2 항체를 첨가한 후, 제 2 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제 3 항체를 첨가함으로써 달성되는데, 이 때 제 3 항체는 검출가능한 표지에 연결된다.
ELISA 기법의 변형법이 널리 공지되어 있다. 하나의 이러한 변형법에서는목적하는 항원을 함유하는 샘플을 웰 표면상에 고정시킨 후, 본 발명의 항체와 접촉시킨다. 결합 및 적당한 세척 후, 결합된 면역 복합체를 검출한다. 초기의 항원 특이적 항체가 검출가능한 표지에 연결되는 경우, 면역 복합체가 직접 검출될 수 있다. 또한, 면역 복합체는 제 1 항원 특이적 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 제 2 항체를 사용하여 검출될 수도 있고, 이 때 제 2 항체는 검출가능한 표지에 연결된다.
공지된 양의 표지된 항원 또는 항체와의 결합을 위해 시험 샘플이 경합하는 경합적 ELISA도 또한 가능하다. 미지의 샘플중의 반응성 종의 양은 코팅된 웰을 사용한 항온처리 전 또는 도중에 샘플을 기지의 표지된 종과 혼합함으로써 측정된다. 샘플내 반응성 종의 존재는 웰과의 결합에 이용가능한 표지된 종의 양을 감소시켜 궁극적 신호를 감소시키는 작용을 한다.
항원 또는 항체는 또한, 예를 들어 플레이트, 비드, 딥스틱(dipstick), 멤브레인 또는 컬럼 매트릭스 형태의 고체 지지체에 연결될 수 있고, 고정된 항원 또는 항체에 피분석 샘플이 적용된다. 플레이트를 항원 또는 항체로 코팅할 때는 일반적으로 플레이트의 웰을 하룻밤 또는 특정 기간 동안 항원 또는 항체의 용액과 함께 항온처리한다. 이어서, 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 이어서, 웰의 나머지 이용가능한 표면을 비특이적 단백질로 "코팅"하는데, 상기 단백질은 시험 항혈청에 대해 항원적으로 중성이다. 이들은 소 혈청 알부민(BSA), 카세인 및 우유 분말 용액을 포함한다. 코팅은 고정화 표면상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 할 수 있고, 따라서 고정화 표면상의 항혈청의비특이적 결합에 의해 야기되는 백그라운드를 감소시킨다.
ELISA에서는 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 통상적이다. 따라서, 항원 또는 항체를 웰에 결합시키고, 비반응성 물질로 코팅하여 백그라운드를 감소시키고, 세척하여 비결합된 물질을 제거한 후, 면역 복합체(항원/항체)를 허용하기에 효과적인 조건하에서 고정화 표면을 임상적 또는 생물학적 피시험 샘플과 접촉시킨다. 이는 항원 및 항체를 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 및 인산염 완충 염수(PBS)/트윈(Tween)과 같은 용액으로 희석시킴을 포함할 수 있다. 이들 첨가 약물도 또한 비특이적 백그라운드의 감소에 도움을 주는 경향이 있다. 그래서, 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 또는 2차 결합 리간드 또는 항체와 함께 표지된 3차 항체 또는 제 3 결합 리간드를 필요로 한다.
ELISA에서의 모든 항온처리 단계 이후에, 접촉된 표면을 세척하여 비복합체화된 물질을 제거한다. 세척은 PBS/트윈 용액 또는 붕산염 완충액을 사용한 세척을 종종 포함한다. 시험 샘플과 최초 결합된 물질 사이의 특이적 면역 복합체를 형성하고 후속적으로 세척한 후, 미량의 면역 복합체라도 그 발생을 측정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제 2 또는 제 3 항체는 결합된 표지를 가져 검출을 가능하게 할 것이다. 바람직하게는, 이는 적당한 발색 물질과 함께 항온처리될 때 색 전개를 하게 되는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들어 추가의 면역 복합체 형성을 발전시키는데 유리한 조건하에서 일정 시간 동안 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 하이드로겐 퍼옥시다제 접합된 항체와 제 1 또는 제 2 면역 복합체를 접촉 및 항온처리, 예를 들어 PBS-트윈과 같은 PBS 함유 용액중 실온에서 2시간 동안 항온처리하는 것이 요구될 것이다.
표지된 항원과 함께 항온처리하고 후속적으로 세척하여 비결합된 물질을 제거한 후, 예를 들어 우레아 및 브로모크레솔 퍼플과 같은 발색 물질 및 H2O2(퍼옥시다제가 효소 표지로서 사용되는 경우)와 함께 항온처리하여 표지의 양을 정량화한다. 그 다음, 정량화는 예를 들어 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 색 생성의 정도를 측정함으로써 이루어진다. 다르게는, 표지는 화학발광 표지일 수도 있다. 이러한 표지의 사용은 미국특허 제 5,310,687 호, 제 5,238,808 호 및 제 5,221,605 호에 기술되어 있다.
FTI에 대한 반응을 측정하기 위해 유전자 발현을 검출하는 본 발명의 실시태양에서는 유전자 발현 포트폴리오의 사용이 가장 바람직하다. 유전자 포트폴리오는 유전자에 관해 수득된 발현 정보가 진단, 예후 또는 치료의 선택과 같은 임상적으로 적절한 판단을 하기 위한 기초를 제공하도록 분류된 유전자 세트이다. 이 경우, 유전자 발현 포트폴리오는 암 환자에서의 FTI 사용에 관한 치료학적 결정을 하는데 도움을 주도록 만들어진다.
하나 이상의 다른 유전자(이의 차별적인 발현은 FTI 치료에 대한 반응의 가능성을 나타낸다)와 함께 유전자 발현 프로필의 일부로서 lbc 종양유전자의 발현을 검출하는 것이 가장 바람직하다. 이러한 양태의 본 발명에서는 유전자 발현 프로필이 lbc 종양유전자(AKAP13으로도 지칭됨)로 구성된다. 다음 유전자중 하나 이상도 또한 사용될 수 있는데, 이는 lbc 종양유전자와 조합하여 사용되는 것이 가장 바람직하다: AHR, DKFZp667G2110, IDS, OPN3, GPR105, TEM6, TNFSF13, SVIL, IL3RA, KIAA0680, FRAG1, DKFZp566B213, KIAA1036, BTG3, MAPK8IP3, ARHH, NPTX2(서열번호 1 및 3 내지 18). OPN3 및 IL3RA는 하나 이상의 다른 유전자와 조합하여 사용되고, 바람직하게는 프로필은 2개 이상의 임의의 유전자를 포함한다. 가장 바람직한 유전자 발현 프로필은 lbc 종양유전자 및 AHR의 차별적인 발현을 검출한다. 전술한 유전자의 스플라이스 변이체와 같은 변이체도 또한 본원에 유용하다.
유전자 발현 프로필(적절한 생물학적 경로의 해석에 이르는데 사용되는 것들을 포함함)을 확립하기 위한 바람직한 방법은 단백질 또는 펩티드를 코딩하거나 RNA를 전사할 수 있는 유전자에 의해 생성되는 RNA의 양을 측정함을 포함한다. 이는 역전사 PCR(RT-PCR), 경합적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 차별적 디스플레이 RT-PCR, 노던 블롯(Northern Blot) 분석 및 기타 관련된 시험에 의해 가장 잘 달성된다. 개별적인 PCR 반응을 사용하여 이들 기법을 수행하는 것이 가능하지만, 카피 mRNA로부터 생성된 카피 RNA(cRNA) 또는 카피 DNA(cDNA)를 증폭시키고 이를 마이크로어레이를 통해 분석하는 것이 종종 바람직하다. 다수의 상이한 배열 형태 및 이의 제조 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들어 미국특허 제 5,445,934 호, 제 5,532,128 호, 제 5,556,752 호, 제 5,242,974 호, 제 5,384,261 호, 제 5,405,783 호, 제 5,412,087 호, 제 5,424,186 호, 제 5,429,807 호, 제 5,436,327 호, 제 5,472,672 호, 제 5,527,681 호, 제 5,529,756 호, 제 5,545,531호, 제 5,554,501 호, 제 5,561,071 호, 제 5,571,639 호, 제 5,593,839 호, 제 5,599,695 호, 제 5,624,711 호, 제 5,658,734 호 및 제 5,700,637 호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.
마이크로어레이 기술은 수천 유전자의 정상 상태의 mRNA 농도 측정을 동시에 가능하게 함으로써, 세포 생물학에 미치는 FTI의 영향 및 이러한 영향의 분석에 기초한 가능한 치료 효과를 확인하기 위한 유력한 수단을 제공한다. 2가지의 마이크로어레이 기술이 현재 널리 사용되고 있다. 첫번째 것은 cDNA 배열이고, 두번째 것은 올리고뉴클레오티드 배열이다. 이들 칩의 구성에 차이가 존재하지만, 본질적으로 모든 다운스트림 데이터 분석 및 출력은 동일하다. 전형적으로 이들 분석의 결과는 마이크로어레이상의 기지의 위치에서 핵산 서열에 혼성화되는 샘플로부터 cDNA 서열을 검출하는데 사용되는 표지된 프로브로부터 받은 신호의 강도 측정값이다. 전형적으로, 상기 신호의 강도는 샘플 세포에서 발현된 cDNA의 양 및 따라서 mRNA의 양에 비례한다. 다수의 이러한 기법이 이용가능하고 유용하다. 유전자 발현을 측정하기 위한 바람직한 방법은 린슬레이(Linsley) 등에게 허여된 미국특허 제 6,271,002 호, 프렌드(Friend) 등에게 허여된 미국특허 제 6,218,122 호, 펙(Peck) 등에게 허여된 미국특허 제 6,218,114 호 및 왕(Wang) 등에게 허여된 미국특허 제 6,004,755 호에서 찾을 수 있고, 이들 각각의 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.
발현 수준의 분석은 상기 강도를 비교함으로써 수행된다. 이는 시험 샘플에서의 유전자 발현 강도 대 대조군 샘플에서의 유전자 발현 강도의 비율 행렬을 만듦으로써 가장 잘 수행된다. 예를 들어, 약물로 처리된 조직으로부터의 유전자 발현 강도를, 약물로 처리되지 않은 동일한 조직으로부터 생성된 발현 강도와 비교할 수 있다. 이들 발현 강도의 비율은 시험 샘플과 대조군 샘플 사이의 유전자 발현의 배수 변화(fold-change)를 나타낸다.
유전자 발현 프로필은 또한 다수의 방법으로 표시될 수 있다. 통상적인 방법은 비율 행렬을 그래픽 덴도그램(graphical dendogram)으로 배열하는 것인데, 이 때 열은 시험 샘플을 나타내고 행은 유전자를 나타낸다. 데이터는 유사한 발현 프로필을 갖는 유전자가 서로 가깝도록 배열된다. 각 유전자에 대한 발현 비율은 색으로서 가시화된다. 예를 들어, 1 미만의 비율(하향 조절을 나타냄)은 스펙트럼의 청색 부분에 나타날 수 있고, 1보다 큰 비율(상향 조절을 나타냄)은 스텍트럼의 적색 부분에 색으로서 나타날 수 있다. 실리콘 제네틱스 인코포레이티드(Silicon Genetics, Inc.)제 "젠스프린트(GENESPRINT) 및 파텍 인코포레이트(Partek, Inc.)제 "디스커버리(DISCOVERY)" 및 "인퍼(INFER)" 소프트웨어를 비롯한 시판중인 컴퓨터 소프트웨어 프로그램이 이러한 데이터를 표시하는데 이용가능하다.
전술된 바와 같은 유전자 발현의 평가에서 추론되는 바와 같이 차별적으로 발현된 유전자는 FTI로 치료된 후 병든 세포에서, 또는 치료 전에 반응자 대 비-반응자에서 상향(up) 조절 또는 하향(down) 조절된다. 상향 조절 및 하향 조절은 일정 기준선에 대한 유전자의 발현량에 검출 가능한 차이(측정을 위해 사용된 시스템에서 노이즈의 기여 범위를 넘어선)가 발견됨을 의미하는 상대적인 용어이다. 이 경우, 기준선은 미치료된 병든 세포의 측정된 유전자 발현이다. 이후 치료된 병든세포중의 관심 유전자를 동일한 측정 방법을 사용하여 기준선 수준에 비해 상향 또는 하향 조절한다. 바람직하게는 상향 및 하향 조절 수준은 혼성화 마이크로어레이 검침의 강도 측정의 배수 변화를 기준으로 구별된다. 1.5 배수 차가 상기 구별을 짓는데 바람직하다. 즉, 유전자가 치료된 병든 세포 대 미치료된 병든 세포에 대해 차별적으로 발현된다고 말하려면, 치료된 세포는 미치료된 세포보다 약 1.5배 크거나, 1.5배 작은 강도를 수득하는 것으로 밝혀져야 한다. 1.7 배수 차가 더욱 바람직하며 유전자 발현 측정에서 2 이상의 배수 차가 가장 바람직하다.
본 발명의 한 방법은 한 사람이 치료제의 사용에 반응하기 쉬운지를 결정하기 위해 다양한 유전자에 대한 유전자 발현 프로필을 비교하는 것을 포함한다. 반응자를 비-반응자로부터 구분하는 유전자 발현 프로필을 확립한 후, 각각의 유전자 발현 프로필을 후술하는 컴퓨터 판독가능 매체와 같은 매체에 고정시킨다. 이후, 병든 세포(AML의 경우 조혈 아세포)를 함유하는 환자 샘플을 수득한다. 가장 바람직하게는, 샘플은 골수이고 환자가 약물로 치료되기 전에 관례적인 방법에 따라 환자의 흉골 또는 장골 크레스트(crest)로부터 추출된다. 바람직하게는 골수 흡인물을 관례적인 방법을 사용하여 백혈병 아세포가 풍부해지도록 처리한다. 이후 병든 환자 세포로부터 샘플 RNA를 수득하고 증폭시키고, 적절한 포트폴리오에서의 유전자에 대해 유전자 발현 프로필을 바람직하게는(큰 유전자 포트폴리오의 경우) 마이크로-배열틀 통해 수득한다. 이후 샘플의 발현 프로필을 이전에 반응자 및 비-반응자로서 결정한 것들과 비교한다. 샘플 발현 패턴이 FTI 반응자 발현 패턴과 일치하는 경우 FTI로 치료함이 지시될 수 있다(대항하는 의료적 고려 없이). 샘플발현 패턴이 FTI 비-반응자 발현 패턴과 일치하는 경우 FTI로 치료함은 지시되지 않는다. 단일 유전자, 림프 모구성 발증 종양유전자(oncoLBC, 서열번호 2)가 사용될 때와 같이 포트폴리오에서 적은 수의 유전자가 사용될 경우, 단순 핵산 증폭 및 검출 스킴(scheme)이 유전자의 조정을 측정하는 가장 바람직한 방법이다. 이러한 경우, 당업자에게 공지된 PCR, NASBA, 롤링 사이클, LCR 및 기타 증폭 스킴이 사용될 수 있으며 PCR이 가장 바람직하다. 포트폴리오가 다수의 유전자를 포함하거나 다양한 다른 유전자의 발현을 측정하는 것이 바람직한 경우, 전술된 바와 같은 마이크로어레이의 강도 측정을 기본으로 발현 패턴을 평가하는 것이 바람직하다.
유사한 방식으로, 유전자 발현 프로필 분석은 치료 반응을 감시하도록 수행될 수 있다. 이 방법의 한 측면에서, 전술된 바와 같은 유전자 발현 분석을 FTI로 치료된 환자에 대해 치료의 전 과정에 걸친 다양한 기간에 수행한다. 유전자 발현 패턴이 반응자와 일치하는 경우, 환자의 치료는 계속된다. 그렇지 않은 경우, 티로신 키나제 저해제, 투여량의 변화, 또는 FTI 치료의 제거와 같은 추가의 치료법과 같이 환자의 치료를 변경한다. 상기 분석은 검출가능한 임상적 징후 이전에 또는 다르게는 모호한 임상적 징후에 직면하여 중재 및 치료 조정을 가능하게 한다.
본 발명의 분자 마커에 대해서는, 진찰 용도로 다수의 다른 형식 및 접근 방법이 가능하다. 게놈 영역의 메틸화는 유전자 발현 수준에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 유전자 촉진자 영역의 초메틸화(hypermethylation)는 구성적으로 유전자 발현을 하향-조절하며, 여기서 초메틸화는 정상상태 mRNA 수준의 증가를 야기할 수 있다. 이러하므로, 약물 반응을 예보하는 유전자와 연관된 메틸화된 영역의 검출은 유전자 발현 수준을 진단하는 양자택일적 방법으로서 사용될 수 있다. 상기 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 다르게는, 촉진자 영역에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphism)(SNP)은 또한 유전자의 전사 활성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 당업자에게 공지된 방법에 의한 상기 SNP의 검출은 또한 반응자와 비-반응자 사이에 차별적으로 발현된 유전자를 검출하는 진단으로서 사용될 수 있다.
반응자와 비-반응자 사이의 구별은 또한 치료 전에 존재하는 골수 백혈병 아세포의 비율 및/또는 CD33 및/또는 CD34와 같은 세포 표면 항원의 존재의 추가적인 검정으로 유리하게 이루어질 수 있다. CD33 및 CD34 표면 항원의 낮은 발현은 FTI 치료에 대한 증가된 반응 경향을 지시한다. 이는 상기 항원을 발현하는 샘플중의 세포의 %로 가장 편리하게 측정되며, 반응자는 상기 세포의 약 60% 이하가 CD33을 발현하며 약 15% 이하가 CD34를 발현한다. CD33을 발현하는 세포의 %가 60%를 초과하고 CD34를 발현하는 세포의 %가 15%를 초과한다는 것은 환자가 FTI 치료에 대해 아마도 비-반응자라는 것을 지시한다. 또한, 아세포인 세포의 %가 약 60% 미만인 전술한 바와 같이 취한 샘플은 아마도 FTI 치료에 대해 반응하며, 상기 %를 초과하는 아세포 개수를 갖는 것은 그렇지 않다. CD33+, CD34+ 및 아세포 개수의 % 결정은 임의의 잘 공지된 방법에 따라 수행되며 대부분의 임상 실험실에서 수행되는 표준 병리학 시험 및 제제를 사용하여 가장 효율적으로 수행된다.
본 발명의 제품은 질병을 치료, 진단, 예지, 스테이징(staging), 및 달리 평가하는데 유용한 유전자 발현 프로필을 나타내는 것이다. 바람직하게는 상기 제품은 컴퓨터 판독가능 매체(자기, 광학 등)와 같이 자동으로 판독할 수 있는 매체로 환원될 수 있다. 상기 제품은 또한 상기 매체중의 유전자 발현 프로필을 평가하기 위한 지침서(instruction)를 포함한다. 예를 들어, 상기 제품은 전술된 유전자의 포트폴리오의 유전자 발현 프로필을 비교하기 위한 컴퓨터 지침서를 갖는 CD ROM을 포함할 수 있다. 상기 제품은 또한 환자 샘플로부터의 유전자 발현 데이터와 비교될 수 있도록 하는 디지털적으로 기록된 유전자 발현 프로필을 가질 수 있다. 다르게는, 프로필은 상이한 표상적(representational) 포맷으로 기록될 수 있다. 상기 언급된 파텍 인코포레이티드(Partek, Inc.)의 "디스커버리(DISCOVERY)" 및 "인퍼(INFER)"에 통합된 것과 같은 클러스터링 알고리즘이 상기 데이터의 시각화를 최선으로 보조할 수 있다.
본 발명에 따른 추가의 제품은 전술된 검정을 수행하기 위한 키트이다. 이러한 키트 각각은 바람직하게는 인간 또는 기계로 판독가능한 형태의 지침서 및 기술된 검정 유형을 위한 전형적인 시약을 포함한다. 이들은 예를 들어 본 발명의 유전자 발현 프로필을 식별하도록 구성된 전술된 바와 같은 핵산 검정(예컨대 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 검정)을 포함할 수 있다. 이들은 또한 예를 들어 역 전사효소, 역 전사효소 프라이머, 상응하는 PCR 프라이머 세트, 열안정성 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제, 및 적합한 검출 시약, 예컨대(한정되지는 않음) 전갈형(scorpion) 검침, 형광 5'뉴클레아제 검정용 검침, 분자 비콘(beacon) 프로브, 이중으로 꼬인 DNA에 특정한 단일 염료 프라이머 또는 형광 염료, 예컨대 에티듐 브로마이드를 포함하는 핵산 증폭 및 검출을 수행하는데 사용되는 시약을 함유할수 있다. 표면 항원 검출용 키트는 착색 물질을 함유하거나 완충액, 항-항원적 항체, 검출 효소 및 기질, 예를 들어 호스 라디쉬 퍼옥시다제(Horse Radish Peroxidase) 또는 바이오틴-아비딘(biotin-avidin)계 시약과 같은 성분을 포함하는 항체 기본 케이스이다. 아세포 검출용 키트 성분은 일반적으로 유동 세포계산(cytometry), 아세포 응착 검정, 및 다른 통상적으로 실행되는 아세포 검정을 수행하기 위한 시약을 포함한다.
2002년 10월 30일자로 "백혈병 평가 및 치료 방법(METHODS FOR ASSESSING AND TREATING LEUKEMIA)"라는 명칭으로 출원된 본 발명자들의 계류중인 출원(일련번호 제 10/283975호)에 기술된 바와 같이, 바람직한 FTI 이외에, 본 발명의 바람직한 약물은 MAPK/ERK 신호 경로, TGFβ, WNT 또는 세포소멸 경로를 조절하는 것이다. 이들은 티로신 키나제 저해제, MEK 키나제 저해제, P13K 키나제 저해제, MAP 키나제 저해제, 세포소멸 조정제 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들중에서 가장 바람직한 예시적인 약물은 노바티스(Norvatis)의 "글리벡(GLEEVEC)" 티로신 키나제 저해제, U-0126 MAP 키나제 저해제, PD-098059 MAP 키나제 저해제, SB-203580 MAP 키나제 저해제, 및 안티센스, 리보자임, 및 DNA자임, Bcl-XL, 및 항-세포소멸제이다. 다른 유용한 약물의 예는 미국특허 제 6,306,897 호의 칼라놀라이드(calanolide), 미국특허 제 6,284,764 호의 치환된 바이사이클릭, 미국특허 제 6,133,305 호의 인돌린 및 미국특허 제 6,271,210 호의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
FTI는 또한 예를 들어 백금 배위 화합물, 예컨대 시스플라틴 또는 카보플라틴, 탁세인 화합물, 예컨대 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 캄프토테신 화합물, 예컨대 이리노테칸 또는 토포테칸, 항종양 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈, 항종양 뉴클레오사이드 유도체, 예를 들어 5-플루오로유라실, 겜시타빈 또는 카페시타빈, 질소 머스타드 또는 니트로소유레아 알킬화제, 예를 들어 사이클로포스파마이드, 클로람뷰실, 카무스틴 또는 로무스틴, 항종양 안트라사이클린 유도체, 예를 들어 다우노루비신, 독소루비신 또는 이다루비신; HER2 항체, 예를 들어 트라스트주맙; 및 항종양 포도필로톡신 유도체, 예를 들어 에토포사이드 또는 테니포사이드; 및 에스트로겐 수용체 길항제 또는 선택성 에스트로겐 수용체 조정제를 포함하는 항에스트로겐제, 바람직하게는 타목시펜, 또는 다르게는 토레미펜, 드롤록시펜, 파슬로덱스 및 랄록시펜, 또는 아로마타제 저해제, 예컨대 엑세메스테인, 아나스트로졸, 레트라졸 및 보로졸로부터 선택된 다른 통상적인 항암제와 조합되어 사용될 수 있다.
FTI는 조사와 관련하여 상기한 바와 같이 환자에게 투여될 수 있으며, 이러한 치료는 파르네실 트랜스퍼라제 저해제가, 예를 들어 국제특허 공개공보 WO 00/01411 호에 기재된 바와 같은 래디오센시타이저로서 작용함에 따라 특히 유익할 수 있으며 이러한 조사의 치료 효과를 증강시키게 된다. 조사는 오늘날 통상 사용되는 선형가속기 또는 방사성핵종에 의해 방출하는 이온화 방사선, 특히 감마 방사선을 의미한다. 방사성핵종에 의한 종양의 조사는 외부적 또는 내부적일 수 있다.
바람직하게는, 파르네실 트랜스퍼라제 저해제의 투여는 종양의 조사 이전 한 달, 구체적으로는 10일 또는 1주까지 시작된다. 또한, 종양의 조사를 분류하고 첫번째와 마지막 조사 기간 사이 간격으로 파르네실 트랜스퍼라제 저해제의 투여를 유지하는데 유리하다. 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제의 양, 조사의 투여량 및 조사 투여량의 중단은 종양의 유형, 그의 위치, 화학 또는 방사선요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 파라미터에 따라 변할 것이며, 궁극적으로 이는 의사 및 방사선 의사에 의해 각 개개인의 경우에 따라 결정된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 암 요법은, 종양이 살고 있는 호스트에 대해, 종양 부근에서 상기 호스트에 방사선을 투여하기 전, 동안 또는 이후에 본 발명에 따른 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제를 방사선-센시타이징 효과량으로 투여함을 포함한다.
지적한 바와 같이, 본 발명의 약물은 유전자 요법 또는 안티센스 요법 또는 RNA 간섭과 관련하여 치료적일 수 있다. mRNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 세포내에 도입되어 mRNA의 해독을 방해함에 따라 mRNA를 유전자 암호화하는 기능을 방해할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자 발현을 방해하는 것은, 예를 들어 본원에 참조로 인용되고 있는 슈트라찬(Strachan) 및 리드(Read)의 문헌 "Human Molecular Genetics, 1996"에 기재되어 있다.
이들 안티센스 분자는 DNA, DNA의 안정한 유도체, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트, RNA, RNA의 안정한 유도체, 예를 들어 2'-O-알킬RNA, 또는 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드 모방체일 수 있다. 안티센스 분자는 현미주사, 리포좀 캡슐화에 의해 또는 안티센스 서열을 갖는 벡터로부터의 발현에 의해 세포내로 도입될 수 있다.
유전자 요법의 경우, 해당 유전자는 수용자 호스트 세포의 감염에 의해 치유적 DNA의 전달을 매개하는 바이러스 벡터내로 결찰될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아바이러스, 폴리오 바이러스 등을 포함한다. 다르게는, 치유적 DNA는 리간드-DNA 공액 또는 아데노바이러스-리간드-DNA 공액, 리포펙션(lipofection) 멤브레인 융합 또는 직접 현미 주사를 이용한 수용체-매개된 표적 DNA 전달을 비롯한 비-바이러스 기법에 의한 유전자 요법을 위해 세포내로 전달될 수 있다. 이들 절차 및 그의 변경법은 생체외 뿐 아니라 생체내 유전자 요법에도 적합하다. 유전자를 사용하는데 적합한 유전자 요법의 분자적 방법론에 대한 프로토콜은 문헌 "Gene Therapy Protocols, edited by Paul D. Robbins, Human press, Totawa NJ, 1996"에 기재되어 있다.
FTI는 폐암(예를 들어, 샘암종 및 비-소세포 폐암 포함), 췌장암(예를 들어, 췌장 암종, 예를 들어 외분비 췌장 암종), 결장암(예를 들어, 결장직장암종, 예를 들어 결장 샘암종 및 결장 샘종), 진행된 병변을 비롯한 전립선암, 림프 계열의 조혈 종양(예를 들어, 급성 림프모구백혈병, B-세포 림프종, 버키트 림프종), 골수성 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)), 갑상샘소포 암, 골수형성이상 증후군(MDS), 중간엽 기원 종양(예를 들어, 섬유육종 및 횡문근육종), 흑생종, 기형암종, 신경아세포종, 신경교아종, 피부의 양성종양(예를 들어, 각질가시세포종), 유방 암종(예를 들어, 진행된 유방암), 신장 암종, 난소 암종, 방광 암종 및 표피 암종을 비롯한 여러 유형의 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약물을 포함하는 약학적으로 유용한 조성물은 공지된 방법에 따라, 예를 들어 약학적으로 허용가능한 담체의 혼합물에 의해 조제될 수 있다. 이러한 담체 및 조제 방법의 예는 레밍턴(Remington)의 약학 문헌에서 찾아볼 수 있다. 효과적인 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 조성물을 형성하기 위해서는 이러한 조성물이 효과량의 약물을 함유할 것이다. 약물의 효과량은 개개인의 상태, 몸무게, 성별 및 나이와 같은 다양한 요인에 따라 변할 수 있다. 기타 요인으로는 투여 방식을 들 수 있다. 약학 조성물은 다양한 경로, 예를 들어 피하, 국소, 경구 및 근육내를 통해 개개인에게 제공될 수 있다.
본 발명의 약물은 약물의 기본 분자의 화학적 유도체를 포함한다. 즉, 이들은 통상 기본 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 기본 분자의 용해성, 반감기, 흡수성 등을 개선시킬 수 있다. 다르게는, 잔기는 기본 분자의 원치않는 부작용을 감쇠하거나 기본 분자의 독성을 감소시킬 수 있다. 이러한 잔기의 예는 레밍턴 약학 문헌 등의 여러 문헌에 기재되어 있다.
본원에 개시된 방법에 따라 확인된 화합물은 어떠한 강한 독성도 최소화시키면서 최적의 억제 또는 활성을 얻기 위해 관례적 시험에 의해 한정된 적절한 투여량으로 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 다른 약물의 동시 투여 또는 순차적 투여도 바람직할 수 있다.
본 발명의 약물은 투여에 통상적인 비히클로 다양한 치료적 투여 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약물은 정제, 캡슐(각각 지효성 및 서방성 제제 포함), 환약, 분말, 과립, 일렉시르(elixir), 팅크제, 용액, 현탁액, 시럽 및 유화액과 같은 경구 투여 형태로, 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 마찬가지로, 이들은 또한 정맥내(환약 및 주사 모두), 복막내, 피하, 혈관 폐색이 있거나 없는 국소적으로, 또는 근육내 형태로 투여될 수 있으며, 이들 모두는 약학 분야의 숙련자에게 익히 공지되어 있는 형태를 사용한다. 효과적이지만 비-독성적인 양의 요구되는 화합물을 조정제로 사용할 수 있다.
제품의 1일 투여량은 환자 한 명 당 0.01 내지 1000mg/일로 광범위하게 변할 수 있다. 경구 투여의 경우, 조성물은 바람직하게는 치료되는 환자에 대한 사용량의 징후적인 조정을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0 및 50.0mg의 활성 성분을 함유하는 선이 그어져 있거나(scored) 그어 있지 않은(unscored) 정제의 형태로 제공된다. 효과량의 약물은 대개 1일에 체중 1kg 당 약 0.0001mg 내지 약 100mg의 투여 수준으로 공급된다. 상기 범위는 더욱 구체적으로는 1일에 체중 1kg 당 약 0.001mg 내지 10mg이다. 투여량은 요구되는 효과를 달성하기 위해 조합되는 경우 조정된다. 한편, 이들 다양한 제제의 투여량은 독립적으로 최적화되고 조합되어 어느 제제든 단독으로 사용되는 경우보다 더욱더 병의 상태를 감소시키는 상승 효과를 달성할 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 사용된 화합물 또는 조정제는 단일 1일 투여량으로 투여될 수 있거나, 또는 전체 1일 투여량은 하루에 2, 3 또는 4번의 분할 투여량으로 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물 또는 조정제는 적합한 비강내 비히클의 국소적인 사용을 통한 비강내 형태로, 또는 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지된 경피성 스킨 패치 형태를 사용하는 경피 경로를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여되기 위해서는 투여량 투여는 물론 투여 섭생 전반에 걸쳐간헐적이기 보다는 연속적일 것이다.
하나 이상의 활성 약물과의 조합 치료를 위해, 활성 제제가 개별 투여 제제인 경우, 활성 약물은 동시적으로 투여될 수 있거나 각각 별도로 엇갈리게 투여될 수 있다.
본 발명에서 화합물 또는 조정제를 사용하는 투여 섭생은 환자의 유형, 종, 나이, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료될 징후의 심각성; 투여 경로; 환자의 재생 및 간장 기능; 및 사용된 특정 약물을 비롯한 여러 요인에 따라 선택될 수 있다. 숙련된 의사 또는 수의사는 징후의 진행을 방지하거나 대항하거나 저지하는데 요구되는 약물의 효과량을 쉽게 결정하여 처방할 수 있다. 독성 없이 효능을 주는 범위내의 약물 농도를 달성하는 최적의 처방은 표적 부위에 대한 약물 유용성의 동태학에 기초한 섭생을 요한다. 이는 약물의 분포, 평형 및 제거의 고려를 포함한다.
본 발명의 약물은 활성 성분을 형성할 수 있고 전형적으로는 의도된 투여 형태, 즉 경구 정제, 캡슐, 일렉시르, 시럽 및 기타의 형태에 관해 적합하게 선택된 적합한 약학 희석액, 부형제 또는 담체(본원에서 "담체" 물질로서 총괄적으로 지칭됨)와의 혼합물로 전형적으로 투여된다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐의 형태로의 경구 투여를 위해, 활성 약물 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구의 비-독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 더욱이, 요구되거나 필요하다면 적합한 결합제, 윤활제, 분해제 및 착색제가 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예를 들어 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성검, 예를 들어 아카시아, 트래거캔스 또는 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이들 투여 형태에 사용된 윤활제는 나트륨 올리에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 클로라이드 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 분해제는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 크산탄 검 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
액체 형태용으로, 활성 약물 성분은, 예를 들어 트라가캔스, 아카시아, 메틸-셀룰로즈 등의 합성 및 천연 검과 같은 적당하게 풍미된 현탁제 또는 분산제와 조합될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분산제는 글리세린 등을 포함한다. 비경구 투여용으로, 멸균 현탁액 및 용액이 바람직하다. 내정맥 투여를 목적으로 하는 경우, 적당한 보존제를 일반적으로 함유하는 등장성 제제를 사용한다.
또한 본 발명의 약물은 작은 단층(unilamellar) 소포(vesicle), 큰 단층 소포 및 다층(multilamellar) 소포와 같은 리포좀 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 다양한 인지질, 예를 들어 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티틸콜린으로부터 형성될 수 있다.
또한 본 발명의 약물은 화합물 분자와 결합되는 단클론성 항체를 개별적 담체로서 사용하여 전달될 수 있다. 또한 본 발명의 약물은 표적성 약물 담체로서의 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 이런 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메타크릴-아미드페놀, 폴리하이드록시-에틸아스파타미드페놀 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드폴리라이신을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약물은 약물의 제어 방출의 수행에 유용한 생분해성 중합체 부류, 예를 들어 폴리라트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리다이하이드로-피란, 폴리사이아노아크릴레이트 및 가교결합되거나 양쪽성인 하이드로겔의 블록 공중합체와 결합될 수 있다.
경구 투여용으로, 캡슐, 정제 또는 볼러스(bolus) 형태로 투여될 수 있거나, 다르게는 음식과 혼합될 수 있다. 캡슐, 정제 및 볼러스는 전분, 활석, 마그네슘 스테아레이트 또는 다이칼슘 포스페이트와 같은 적당한 담체 비히클과 활성 성분을 조합하여 구성된다. 이런 단위 투여 형태는 희석제, 충전제, 붕해제 및/또는 결합제를 포함하는 적당한 미세 분말 불활성 성분과 활성 성분을 실질적으로 혼합하여 제조되어 균일한 혼합물이 수득된다. 불활성 성분은 약물과 반응하지 않고 치료받는 동물에 비독성인 것이다. 적당한 불활성 성분은 전분, 락토스, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 식물성 검 및 오일 등을 포함한다. 이런 제제는 치료받는 동물의 크기 및 유형과 감염 심각성과 같은 많은 인자에 좌우되는 매우 다양한 양의 활성 및 비활성 성분을 함유할 수 있다. 활성 성분은 또한 음식과 화합물을 단순히 혼합하거나 음식 표면에 화합물을 입혀서 투여될 수 있다.
다르게는, 화합물 또는 모듈레이터는 불활성 액체 담체에 용해된 활성 성분으로 구성된 제제의 주사를 통해 비경구적으로 투여될 수 있다. 주사는 근육내, 인트라루미날(intraruminal), 기관지내 또는 피하 주사일 수 있다. 주사용 제제는 적당한 불활성 액체 담체와 혼합된 활성 성분으로 구성된다. 허용가능한 액체 담체는 땅콩유, 면실유 및 참기름 등과 같은 식물성 오일뿐만 아니라솔케탈(solketal) 및 글리세롤 포르말 등과 같은 유기 용매를 포함한다. 다르게는, 수성 비경구 제제가 또한 사용될 수 있다. 식물성 오일이 바람직한 액체 담체이다. 제제는 활성 성분을 액체 담체에 용해 또는 현탁시켜, 최종 제제가 0.005 내지 10중량%의 활성 성분을 함유하도록 제조된다.
본 발명은 또한 다음의 비제한적 실시예에 의해 설명된다.
실시예
비예측적 실시예에서, 600mg의 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페틸)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논)(자르네스트라(Zarnestra)로 불림)을, AML의 각 28일 주기 중 최초 21일 동안 하루에 2회씩 600 mg의 경구 투여량으로 개시하여 AML 환자에게 투여하였다. 환자들을 두 개의 코호트(cohort), 즉 재발된 AML을 갖은 환자 및 난치성 AML을 갖은 환자로 기록하였다. 총 257 명의 환자(이중, 135명은 재발성이고 117명은 난치성임)를 치료하였다.
자르네스트라 치료에 대한 반응은 표 2에 도시된 바와 같이, 객관적 반응(CR, CRp 또는 PR)을 갖는 환자, 또는 안정성 질병 및 중앙 리뷰 또는 임상 사이트에 의해 측정되는 항-백혈병 활성(백혈병 아세포가 50%를 초과하여 감소)을 보이는 환자로서 정의된다. 항-백혈병 활성은 5% 미만의 임의의 골수 아세포 개수(count) 또는 골수 아세포의 50% 이상의 감소로서 정의된다.
실시예 1
마이크로어레이 분석
자르네스트라 FTI(활성 성분, (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페틸)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논))으로 치료받기 전후에 동의한 환자로부터 골수 샘플을 수집하고, PBS로 희석하고, 피콜(Ficoll)-다이아트리조에이트(1.077g/ml)으로 원심분리시켰다. 백혈구를 PBS로 2회 세척하고, 10% DMSO를 포함하는 FBS에서 재현탁시키고, 즉시 -80℃에서 냉각시켰다. 샘플을 37℃에서 녹이고, 5분에 걸쳐 20% FBS를 포함하는 10X 체적의 RPMI를 적가하였다. 세포를 10분 동안 500g에서 원심분리시키고, 2mM EDTA 및 0.5 BSA를 포함하는 10ml PBS에서 재현탁시켰다. 그 후 샘플을 70μM 필터(벡톤 디킨슨 랩웨어사, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)를 통과시켜 세포 클럼프를 모두 제거하였다. 세포 생존능력을 트리판 블루 염료 배타(exclusion) 분석에 의해 측정하였다. 녹을 때의 골수 샘플의 평균 생존 능력은 35%(0 내지 96%의 범위)이었다. 존재하는 생존 세포 수가 비교적 적기 때문에, 샘플은 골수세포로 보다 더 풍부해지지 않았다. 약 2×105세포를 CD33-FITC 및 CD 34-PE 항체(벡톤 디킨슨 바이오사이언시스 파밍엔, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 이중 표지하고, FACS 분석을 실시하였다.
RN이지 키트(RNeasy Kit, 퀴아겐, 미국 캘리포니아주 산타 클라리타 소재)를 이용하여 총 RNA를 세포 샘플로부터 추출하였다. 어피메트릭스(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 프로토콜을 이용하여 cDNA 및 cRNA의 합성을 실시하였다. 수개의 샘플에 대해서 수득되는 RNA가 1㎍ 미만이기 때문에, 2 라운드의 선형 증폭을 실시하였다. 혼성화를 위해, 40mM 트리스-아세테이트, pH 8.1, 100mM 칼륨 아세테이트 및 30mM 마그네슘 아세테이트에서 35분 동안 94℃에서 배양시켜 11㎍의 cRNA를 랜덤하게 단편화시켰다. 60rpm으로 설정된 로티세리(rotisserie) 오븐 중에서, 45℃에서 16시간 동안 U133A 어레이에서 단편화된 cRNA를 혼성화시켰다. 혼성화 후, 어레이를 세척(트리톤 X-100(0.005%)를 함유하는 6×SSPE 및 0.5×SSPE로 세척)하고, 스트렙트아비딘-파이코에리트린(SAPE; 분자 프로브스, 오리건주 유진)으로 염색하였다. 결합된 표지된 프로브의 정량을 아길렌트 G2500A 진어레이(GeneArray) 스캐너(아길렌트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 이용하여 실시하였다.
각 어레이에 대한 총 형광 강도를 600의 단일값에 대하여 측정하였다. 칩 효율을 신호 대 노이즈 비(생(raw) 평균 신호/노이즈)를 계산하여 정량하였다. 신호-대-노이즈 비가 5 미만인 경우, 칩을 추가 분석에서 제거하였다. 칩의 10% 이상 "존재"하는 것으로 불릴 경우에만, 유전자는 추가적 분석에 포함되었다. 이런 컷-오프에 따라서 약 12,000 어피매트릭스 프로브 세트가 남았다. 유전자 발현 데이터의 품질은 주성분 분석에 기초한 아웃라이어(outlier)의 규명 및 유전자 강도의 정규 분포의 분석에 의해 추가로 제어되었다.
환자 반응과 환자 공-변량(co-variate)의 관계, 돌연변이 상태, CD33 및 CD34 항원 발현, 백혈병 아세포 개수 및 유전자 발현을 규명하기 위해 카이(Chi) 제곱 검정 및 스튜던츠 t-검정을 사용하였다. 높은 민감도로 반응을 예측할 수 있는 유전자를 규명하기 위해, 백분위수(percentile) 분석을 사용하였다. 예를 들어, 비반응자의 적어도 40%와 비교되는 모든 반응자(responder)에서 상승- 또는 하강-조절된 유전자를 규명하였다. 투-테일드(two-tailed) 스튜던츠 t-검정(불균등 변형)에 기초한 유의한 p-값(p < 0.05)을 보이지 않은 유전자는 제거되었다. 최상위(top) 유전자의 예상값을 리브-원-아웃 교차 확인법(leave-one-out cross validation method)에 의해 분석하였다. 여기서, 데이터 세트에서 한 샘플을 제거하고, 마커를 12,000 유전자로부터 재선택하였다. 그 후 이 유전자의 예상값을 빠진(left-out) 샘플에 대해서 선형 판별식 분석을 이용하여 시험하였다. 민감도는 트루(true) 양성 + 폴스(false) 음성의 합에 의해 나누어진 트루 양성의 수로서 계산되었다. 특이성(specificity)은 트루 음성 및 폴스 양성의 합에 의해 나누어진 트루 음성의 수로서 계산되었다. 양성 예상값은 트루 양성 및 폴스 양성의 합에 의해 나누어진 트루 양성의 수로서 계산되었다. 음성 예상값은 폴스 음성 및 트루 음성의 합에 의해 나누어진 트루 음성의 수로서 계산되었다.
환자 생존 결과와 각 파라미터(유전자 또는 아세포 개수)의 관련성을 사정하기 위해 단변량 콕스 비례 위험 모델(univariate cox proportional hazard model)을 사용하였다. 콕스 모델에서의 각 파라미터의 계수 평가치로써 이런 관련성의 강도를 측정한다. 비반응자로부터 반응자를 구별시키는 각 분류자(classifier)는 다음과 같이 정의되었다:
b1*x1 + b2*x2 + b3*x3 + ...
상기 식에서, b1, b2, b3는 콕스 모델로부터 얻은 계수 평가치이고, x2, x2, x3은 표준화된 파라미터 값(아세포 개수 또는 유전자 발현 값의 log10)이다.
수용자 조작 곡선(ROC)을 90% 이상의 감수성을 필요로 하는 각 분류자들을 위한 적합한 역치를 선택하는데 이용하였다. ROC 진단으로 각 파라미터에 대한 감수성 및 특이성을 산정하였다. 또한, 유전자 마커를 먼저 29개의 무작위 선택된 표본의 훈련 집합(training set)을 사용하여 열등한 결과로부터 우수한 결과를 계층화하는 능력에 따라 분류하였다. 이어서, 각 유전자의 예측률을 나머지 29개의 표본에 대해 시험하였다. 이것으로 가장 강한 예측률을 갖는 유전자를 검증하였다.
실시예 2
백혈병 세포 항원 발현
백혈병 아세포는 표면 항원 CD33 및 CD34를 발현하는 것으로 알려져 있다. 환자의 골수 백혈병 세포의 95% 및 55%가 각각 CD33 및 CD34에 양성이었다. 각 표본에서 항원을 발현하는 세포의 평균 퍼센트는 CD34에 대해 13% 및 CD33에 대해 43%이었다. 카이제곱 분석을 항원 발현의 수준 및 환자 결과 사이의 상관 관계를 조사하기 위하여 수행하였다. 15% 및 60%의 판단 기준치를 각각 CD34 및 CD33 수준을 위하여 선택하였다. CD33 및 CD34의 낮은 발현(세포 집단의 약 15% 미만이 CD34에 대해 양성 및 세포 집단의 약 60% 미만이 CD33에 대해 양성임)이 상표명 자르네스트라(Zarnestra)에 대한 환자의 반응과 상관 관계(각각 p=0.137, p=0.052)를 나타내었다. 두 항원의 높은 발현(세포 집단의 약 15% 이상이 CD34에 대해 양성 및 세포 집단의 약 60% 이상이 CD33에 대해 양성임)이 또한 높은 아세포의 수와 양성 상관 관계를 가졌다. 또한, 카프란 메이어 분석이 낮은 전체 생존율과 관련된 높은 CD33 발현을 나타내었다(도 1).
실시예 3
백혈병 아세포 수 분석
CD33 및 CD34 항원 발현의 분석은 백혈병 아세포의 수준이 환자의 반응과 상관성이 있음을 제시하였다. 자리의 평균값 및 DCL 아세포 수를 계산하고 아세포의 수가 AML 환자에서 환자의 반응과 관련되는지 조사하기 위하여 스튜던트(Student)의 t-검정을 수행하였다. 전체 199명의 평가가능한 환자로부터 24명이 CR, CRp, PR 또는 SD를 가졌고, 아세포의 퍼센트는 환자의 결과와 의미있는 상관 관계를 가졌다(p=0.0006). 반응자는 진행성 질병을 갖는 사람들(평균 51%)보다 적은 수의 아세포(평균 34%)를 가졌다. 24명의 총 반응자(SD를 가지는 것으로 규정됨) 중 단지 1명이 60%보다 높은 아세포 수를 가졌다. 또한, 모든 평가가능한 환자에 대한카이제곱 분석에서도 높은 아세포 수 및 치료에 대한 내성 간에 의미있는 상관성(χ2=9.53)을 발견하였다.
카프란 메이어 분석에서는 낮은 수준의 아세포 수(<60%)를 갖는 환자들이 높은 아세포 수를 갖는 환자들보다 상당히 우수한 전체 생존율을 가지는 것을 발견하였다(도 2). 이러한 분석들은 약 60%보다 높은 아세포 수를 가지는 환자들이 상표명 자르네스트라에 대해 반응하지 않을 것을 나타내었다.
실시예 4
반응자 및 비-반응자 간에 상이하게 발현된 유전자의 검증
골수 표본을 유전자 발현 분석을 위하여 약물 처치하기 전 80명의 환자로부터 얻었다. 80개 기준선 표본 중, 14개는 평가할 수 없는 환자들로부터 얻어진 것이므로 분석에서 제외하였다. 표본은 골수 세포(myeloid cell)가 풍부하였고, 메신저 RNA(유전자 특이성 단백질을 암호화하는 분자)로 가공된 후 아피메트릭스(Affymetrix) U133A 유전자 칩으로 혼성화되었다. 66개의 표본 중 58개가 U133A 칩으로 혼성화된 후 추가의 품질 제어 평가를 통과하였다. 유전자 발현 데이터를 임상 정보와 통합하고 높은 수준의 감수성을 갖는 비-반응자로부터 반응자를 분류할 수 있는 유전자를 검증하기 위하여 회고 분석(retrospective analysis)을 수행하였다. 몇몇 유전자 마커를 상표명 자르네스트라에 대한 반응을 예측하는데 유용한 것으로 확인하였다(표 3). 임파 아세포 발증(lymphoid blast crisis) 종양유전자(oncoLBC)의 경우, 이러한 유전자의 예측률을 리브-원-아웃 교차 검증을 이용하여 데이터 세트로 산정하였다(표 3). LBC 종양유전자의 발현 수준은 반 이상의 비-반응자를 제거한 반면 모든 임상적으로 검증된 반응자를 포착할 수 있었다.
생존 분석은 LBC 종양유전자 발현(도 3A, p=0.00841)에 기초하여 반응자로 분류된 환자들이 임상 데이터(도 3B, p=0.0827)를 이용한 환자 분류를 상당히 능가하는 것을 나타내었다. 이것은 증가된 전체 생존율을 갖는 비-반응자 하위집단을 확인하는 LBC 종양유전자 마커에 기인한다. 콕스(Cox) 위험 모델에 기초하여, LBC 종양유전자 및 제 2 유전자 마커, 아릴 탄화수소 수용체(AHR)의 결합은 특이성 및 양성 예측률을 각각 75% 및 56%로 증가시켰다(도 3C). 이러한 결과는 LBC 종양유전자 단독 또는 AHR 유전자와의 결합을 이용하는 것이 상표명 자르네스트라 처치에 대한 반응을 예측하는데 유효한 배열을 제시하는 것을 나타내었다.
마커로서 LBC 종양유전자 및 아릴 탄화수소 수용체(AHR)를 이용한 리브-원-아웃 교차 검증 또한 수행하였다. 최고 감수성 및 특이성을 검증하기 위하여 판단 기준치를 이용하는 경우, PPV 및 감수성은 동일하게 유지되었다. 다른 유전자 조합의 리브-원-아웃 교차 검정 결과를 표 5에 나타내었다. 이것은 마커의 조합이이러한 방법의 예측률을 개선할 수 있음을 설명한다.
또한, LBC 및 AHR 분류자를 이용한 환자의 분류는 LBC 종양유전자 또는 임상적 반응 정의의 이용에 비해 2개의 환자 집단간 생존 시간의 중앙치에 유사한 차이를 나타내었다(도 4C). 이러한 결과는 LBC 종양유전자 단독, 또는 AHR 유전자와의 결합을 이용하는 것이 본 데이터 세트에서 자르네스트라에 대한 반응을 예측하기 위한 유효한 생체 마커로서 이용될 수 있음을 나타내었다.
콕스 위험 모델을 우수한 생존자로부터 열등한 생존자를 분류하는데 있어 마커의 다른 조합을 분석하는데 이용하였다(표 6). 여기서, 51명의 환자로부터의 데이터를 이용하였는데, 이는 오직 상기 수의 환자 표본이 측정된 CD33 및 CD34 항원 수준을 가졌기 때문이다. 90% 이상의 감수성을 적합한 마커용 판단 기준치를 측정하는데 사용하였다. 복합 마커의 이용은 두 생존 그룹의 생존 시간 중앙치에서 차이를 개선시킬 수 있다.
실시예 5
항체(예측)
lbc 종양유전자-유도된 펩티드를 합성하고, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌에 결합시킨 후, 폴리클론 항체의 생산을 위한 래빗을 면역시키는데 사용하였다. 혈청을 대응되는 펩티드에 대한 반응성에 대해 엘리사(ELISA)로 시험하고, 양성 배치를 친화성-정제하였다. 정제된 항체는 조직 부위에 에피톱(epitope)을 가지는 펩티드를 명확하게 검출하였다. 이것을 대응되는 펩티드를 항체와 동시에 첨가한 경우 신호의 완전한 소멸로 확인하였다. 면역 조직 화학에 우수하게 작용하는 이러한 폴리클론 항체에 부가하여, 단클론 항체로 천연 배수가 생성된 단백질을 검출할 수 있었다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 천연 배수 및 번역 후 변형을 확실히 하기위해 포유류 세포에서 생산된 정제된 항원을 생성하였다. 항원,lbc 종양유전자 단백질-IgG 불변부 융합 단백질을 마우스 골수 세포에 발현시키고, 단백질을 Fc부를 베이트(beit)로 이용하여 정제하였다. 이러한 정제된 항원을 C-말단 폴리클론 항체에 의한 웨스턴 블롯(Western blot)에서 확인하였다. 항원을 IbG 불변부 대신에 lbc 펩티드에 대해 반응하는 항체를 생산하는 양성 클론으로부터 선택함으로써 lbc 펩티드에 대한 마우스 단클론 항체를 생성하는데 이용하였다.
lbc 종양유전자의 임상적 검증을 위한 키트는 이러한 항체 및 유사 항체를 사용하여 쉽게 보편화될 수 있다. 이러한 키트는 lbc 펩티드 검증에 관한 항체(즉, lbc 종양유전자), 적합한 확인 시약(예; 효소, 라벨 등), 및 (선택적으로) 상기 키트의 임상적 적용에 유용한 다른 시약(예; 희석 완충제, 안정화제, 및 다른 전형적으로 이러한 분석에 이용되는 물질)을 포함한다.
실시예 6
즉석 혼성화(예측)
포르말린 고정 파라핀 삽입 조직 시료를 5 내지 7㎛의 두께 박편으로 절단하고, 실레인 코팅 유리 슬라이드에 올리고, 37℃에서 밤새 배양하고 65℃에서 30분간 배양한 후 자일렌중에서 10분간 탈파라핀화를 2회 실시한다. 그후 시료를 농도구배 에탄올 용액(100 내지 70%)를 통하여 탈수하고, 인산염 완충 식염수(PBS pH 7.0)중 5분간 2회 헹구고, PBS중 0.1mol/L 글리신으로 5분간 2회 처리하고, PBS중 0.3%의 트리톤(Triton) X-100으로 15분간 침투시킨다. 박편을 37℃에서 30분간 핀란드 헬싱키 소재의 핀자임즈(Finnzymes)사의 단백질 가수분해 효소 K(㎍/ml, TE 완충액중; 100mmol/L 트리스(Tris)-HCl, 50mmol/L EDTA, pH 8.0)로 처리하고, 4℃에서 5분간 PBS중 3%의 파라포름알데하이드에서 후고정하고, PBS중에서 2회 헹군다. 0.25%(v/v) 아세트산 무수물, 100mmol/L의 트라이에탄올아민, pH 8.0중 5분간 2회 슬라이드를 적심으로써 양전하를 차단한다. 슬라이드를 37℃에서 10분간 4×SSC, 50%(v/v)의 탈이온 포름아마이드중에서 평형을 유지하였다.
미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐(Invitrogen)사의 TA 클로닝 키트를 사용하여 PCR-증폭 0.4kb lbc 종양유전자 cDNA 삽입물을 pCR-II 벡터에 결합함으로써 탐침을 제조한다. 적당한 벡터 구조물(각각, 3'에서 5' 방향 또는 5'에서 3' 방향)을 일직선화함으로써 lbc 종양유전자 안티센스 또는 센스 RNA 탐침을 위한 주형을 생성한다. 베링거-만하임(Beohringer-Mannheim)사의 RNA 표지 키트를 사용하여 시험관내 전사에 의한 디곡시제닌 표지된 RNA 탐침을 생성한다. 파마시아(Pharmacia)사의 1×덴하트(Denhart's) 용액(0.2g/L 피콜(Ficoll) 유형 400), 0.2g/L의 폴리비닐피롤리돈, 시그마(Sigma)사의 0.2g/L의 소 혈청 알부민(분획 V), 40%의 포름아마이드, 10%의 덱스트란 설페이트, 4×SCC, 10mmol/L 디티오트레이톨, 1mg/mL의 효모 tRNA, 1mg/mL의 청어 정자 DNA 및 300ng/mL의 디곡시제닌 표지된 RNA 탐침을 함유하는 혼성화 혼합물을 사용하여 45℃에서 하룻밤동안 혼성화를 실시한다. 혼성화후, 조직 박편을 2×SCC중 37℃에서 5분간 2회 세척하고 60%의 포름아마이드, 0.2×SCC에서 15분간 1회 세척하고, 실온에서 2×SCC중 5분간의 헹구기를 2회 실시하고 100mmol/L 트리스-HCl, pH 8.0, 150mmol/L NaCl중 10분간의 세척을 2회 실시한다. 베링거-만하임사의 1:250 알칼리 인산염-결합 양 항디곡시제닌 fab 절편을 사용하여 신호 검출을 실시한다. 박편을 베링거-만하임사의NBT/BCIP 원액과 1.5시간동안 배양하여 신호를 가시화한다.
암 환자의 종양 형성 세포에서 발견되는 lbc 종양유전자-양성 세포는 FTI에 대한 반응이 있음직하지 않음을 의미한다.
실시예 7
면역조직화학(예측)
면역조직화학 검출 및 lbc 종양유전자의 국재화를 위하여 lbc 종양유전자의 C-말단 펩타이드에 대한 친화성-정제 폴리클론 항체를 사용한다. 포르말린 고정 및 파라핀 삽입된 정상 및 종양 조직의 4개의 ㎛ 박편을 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사의 APES인 3-아미노프로필-트리에톡시-실레인으로 코팅된 슬라이드 위에 올려 놓는다. 박편을 탈파라핀화하고 농도구배 에탄올중에서 재수화하고 실온에서 30분간 메탄올성 과산화수소(순수 메탄올중 0.5%의 과산화수소)로 처리하여 내인성 퍼옥시데이즈 활성을 차단한다. 항원 회복을 마이크로파 오븐(650W)에서 5분간 2회 실시한다. 미국 캘리포니아주 버링게임 소재의 벡터 연구소의 벡타스태인(Vectastain)인 엘리트(Elite) ABC 키트를 사용하여 면역퍼옥시데이즈 염색을 한다. 1:2000의 최적의 희석액에서 lbc 펩타이드 항체를 사용한다. 바이오티닐화 제 2 항체 및 퍼옥시데이즈 표지된 아비딘-비오틴 착물을 30분간 박편상에서 배양한다. 희석액을 PBS(pH 7.2)에서 제조하고, 모든 배양은 실온에서 습한 챔버에서 실시한다. 다른 염색 단계 사이에 슬라이드를 PBS로 3회 헹군다. 퍼옥시데이즈 염색은 실온에서 15분간 시그마사의 3-아미노-9-에틸카바졸 용액(0.03%의 과산화수소, pH 5.0을 함유하는 0.05M 아세테이트 완충액중0.2mg/ml)으로 처리하여 가시화된다. 최종적으로, 박편을 메이어(Mayer's) 헤마톡실린으로 가볍게 대비염색하고 BDH사의 아쿠아마운트(Auamount)인 수용성 마운팅 매질을 가한다. 대조 실험에서 제 1 항체는 정상 토끼 혈청의 IgG 분획으로 치환되거나 제 1 항체는 lbc 펩타이드에 미리 흡수시켰다. 이러한 염색은 세포의 하위군중 lbc 종양유전자의 존재를 나타낸다.
실시예 8
효소 면역측정법(예측)
lbc 단백질 또는 lbc 종양유전자 관련 특정 펩타이드에 대하여 면역측정을 준비한다. 결장 종양 표본의 소화물을 포함하는 항원 표준물질(면역퍼옥시데이즈 염색에 의하여 항원을 함유하는 것으로 나타남)을 사용한다. AML 환자로부터의 인간 백혈구 세포를 사용한다. 표본을 4℃에서 0.2%(w/v) 소듐 데옥시콜레이트를 함유하는, 10mM의 트리스 완충액, pH 7.4의 10용적중에 넣어 균질화한다. 균질 현탁액을 신속하게 37℃로 하고 다음의 시약(최종 농도)을 교반하면서 첨가한다: 시그마사의 1mM 시스테인, 시그마사의 1mM EDTA 및 미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재의 베링거-만하임사의 파파인(0.8단위/ml). 5분후, 시그마사의 5mM 요오도아세트아마이드의 첨가로 소화를 중단한다. 균질 현탁액을 4℃에서 1시간동안 100,000×g에서 원심분리한 후, 각 10mM의 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 아미노카프로산을 함유하는 10mM의 트리스/0.9% NaCl 용액 완충액(pH 7.4)으로 투석을 실시한다. 균질 현탁액을 0.5mg의 단백질/mi의 농도에서 소량씩 냉동한다.
lbc 단백질 또는 펩타이드를 측정하는 면역측정 과정중 생성되는 용량 반응곡선은 100ng 내지 100㎍/ml의 항원 투입 범위에서 직선형을 나타낸다. 혈청 분석에서, 그 범위는 1ng 내지 1000ng/ml인데, 이는 시료가 분석 전 10배 희석되기 때문이다.
상기 실시예에서 기술한 항체의 고체상 제조는 파마시아사의 CNBr-활성화 세파로스(Sephrose)를 사용하여 이루어진다. 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 그랜드 아일랜드 바이올로지컬 캄파니(Grand Island Biological Co.)의 Nunc I 면역 평판인 마이크로타이터 평판을 4℃에서 18시간동안 50mM의 탄산-중탄산 완충액, pH 9.6중 항체(200㎕/웰)로 코팅한다. 항체 용액의 제거후, 200㎕의 분석 완충액[1%(v/v)의 토끼 혈청 및 1%(w/v)의 소 알부민을 함유하는 PBS]의 첨가로 플라스틱상의 잔여 단백질 결합 부위를 차단한다. 실온에서 1시간의 배양후, 코팅한 평판을 분석 과정에 즉시 사용한다.
분석의 실시를 위하여, 분석 완충액에 희석된 200㎕의 시료를 37℃에서 1 내지 5시간동안 가한다. 분석 완충액을 사용하여 3회 세척후, 시그마사의 양고추냉이 퍼옥시데이즈(유형 VI)에 공유 결합된 200㎕의 항체를 37℃에서 1.5시간동안 각각의 웰에 가한다. 결합물을 10%(v/v) 쥐 혈청을 함유하는 PBS 1ml당 면역글로불린 0.5㎍의 농도로 희석한다. 상기와 같은 세척 과정후, 1웰당 200㎕의 기질을 실온에서 0.5시간동안 가한다. 기질 용액은 pH 5.0 시트르산염 완충액 1ml당 o-페닐렌디아민 0.4mg 및 0.003%의 과산화수소를 함유한다. 2N의 황산 50㎕의 첨가로 반응을 중단하고, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재의 피셔 사이언티픽 캄파니(Fisher Scientific company)의 효소 분석 평판 판독기를 사용하여 488nM에서 흡광도를 모니터링한다.
결합된 효소 결합물의 백분율을 하기 수학식 1에 따라 계산한다:
상기 식에서,
B는 시료의 흡광도이고,
Bt는 최대 흡광도이고,
B0는 공검체(blank)의 흡광도이다.
각 분석은 분석 완충액중 표준 소화물 및 26배 희석된 혈청을 사용하여 3회 반복 실시된다. 관련 단백질 및 비면역 토끼 혈청에 대한 항체를 포함하여, 고체상의 여러 항체 시약을 대체함으로써, 면역측정법의 선택성을 검토한다. 고체상 항체중 상기 실시예에 따라 제조한 항체만이 높은 희석도에서 항원에 결합한다.
정상 대조 개체와 양성 및 악성 혈액학적 질환을 갖는 환자에 대하여 혈청 lbc 단백질의 수준을 검출한다.
명백히 건강한 개체로부터 얻은 혈청은 lbc 단백질을 보이지 않는다. 시료의 5%만이 검출 한계에서 혈청 항원을 보이고, 이 값은 상승된 혈청 수준에 대한 컷오프로서 선택된다. 컷오프 미만의 암 환자는 FTI로의 치료에 좋은 반응을 나타낼 것이다.
본 발명을 통해 환자의 치료를 모니터링하고, 치료 과정을 선택하는데 유용하고, FTI 치료에 반응하여 조절되는 유전자가 제공되어, 프로파일의 공식화에 사용되는, 환자의 유전자 발현 프로파일 및/또는 분자 표식을 분석하여 환자가 파르네실 트랜스퍼라제 저해제(farnesyl transferase inhibitor; FTI), 및 선택적으로 다른 치료제를 이용한 치료에 반응할지를 측정함을 포함하는, 환자의 암, 바람직하게는 혈액 종양을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Veridex LLC RAPONI, MITCH <120> METHODS FOR ASSESSING AND TREATING CANCER <130> ADS5001 <160> 28 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5496 <212> DNA <213> Human <400> 1 attcagccgg tgcgcgcggc ggcgggaggc agtggctggg gagtcccgtc gacgctctgt 60 tccgagagcg tgccccggac cgccagctca gaacaggggc agccgtgtag ccgaacggaa 120 gctgggagca gccgggactg gtggcccgcg cccgagctcc gcaggcggga agcaccctgg 180 atttgggaag tcccgggagc agcgcggcgg cacctccctc acccaagggg ccgcggcgac 240 ggtcacgggg cgcggcgcca ccgtgagcga cccaggccag gattctaaat agacggccca 300 ggctcctcct ccgcccgggc cgcctcacct gcgggcattg ccgcgccgcc tccgccggtg 360 tagacggcac ctgcgccgcc ttgctcgcgg gtctccgccc ctcgcccacc ctcactgcgc 420 caggcccagg cagctcacct gtactggcgc gggctgcgga agcctgcgtg agccgaggcg 480 ttgaggcgcg gcgcccacgc cactgtcccg agaggacgca ggtggagcgg gcgcggcttc 540 gcggaacccg gcgccggccg ccgcagtggt cccagcctac accgggttcc ggggacccgg 600 ccgccagtgc ccggggagta gccgccgccg tcggctgggc accatgaaca gcagcagcgc 660 caacatcacc tacgccagtc gcaagcggcg 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ggctgccttt cacaaatcag tgtcaagata 2400 gtactgcatt agttatttgt ggggcttatg gtgttttatg gttttgtttt gtcttgttta 2460 aagaggggcc caggagttgg atagttttat gttgccatga ttaaaaacaa ctattagaaa 2520 aagcaaacat ctgaaacttt ggacatatca cttcctcttt ctctctcttt tttttttttt 2580 ttttgagata gagtcttgct ctgtcgccca ggctggagtg caatggtgca atctcggctc 2640 actgcaacct gcatctcctg ggttgaagcg attctcctgc cttagcctcc caagtagctg 2700 ggaatacagg cacatgccac cacaccctgc tgcttttttg tgtgttttag tagagacggg 2760 gtttcaccat gttgcccagg ctggtcttga actcctgagc tcaggcaatc cacccgcctc 2820 agcctcccaa agtgctagga ttacaggcgt gagccactgt gcccggccac ttcctctctt 2880 tgggccttaa cttccttgtc tttaatagga gggaattggc cagctttaat ttttttttgt 2940 actgtcagtg tactggtaaa ttttctgttg cacaaaattg ctcaagcagt gctaacaaag 3000 gccaaaccaa atttgaacac ttgaggaagg aaatacatat taaaaccaca atgagatatc 3060 attacacatt tatcataatg gctaagatga agaataccaa gtgctggcaa agatgaagaa 3120 catatcatat gttgcttgta ggaatgcaaa atgtataacc actctagaaa tatttggcag 3180 tttcttgtaa agttaaacat acacttagcg 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240 gcctgtgata tcaccggatc cagttcatcc accgatgaca cggcttcact ggaccgacat 300 tcttctcatg gcagtgatgt gtctctctcc cagattttaa agccaaacag gtcaagagat 360 cggcaaagcc ttgatggatt ctacagccat gggatgggag ctgagggtcg agaaagtgag 420 agtgagcctg ctgacccagg cgacgtggag gaggaggaga tggacagtat cactgaagtg 480 cctgcaaact gctctgtcct aaggagctcc atgcgctctc tttctccctt ccggaggcac 540 agctgggggc ctgggaaaaa tgcagccagc gatgcagaaa tgaaccaccg gagttcaatg 600 cgagttcttg gggatgttgt caggagacct cccattcata ggagaagttt cagtctagaa 660 ggcttgacag gaggagctgg tgtcggaaac aagccatcct catctctaga agtaagctct 720 gcaaatgccg aagagctcag acacccattc agtggtgagg aacgggttga ctctttggtg 780 tcactttcag aagaggatct ggagtcagac cagagagaac ataggatgtt tgatcagcag 840 atatgtcaca gatctaagca gcagggattt aattactgta catcagccat ttcctctcca 900 ttgacaaaat ccatctcatt aatgacaatc agccatcctg gattggacaa ttcacggccc 960 ttccacagta ccttccacaa taccagtgct aatctgactg agagtataac agaagagaac 1020 tataatttcc tgccacatag cccctccaag aaagattctg aatggaagag tggaacaaaa 1080 gtcagtcgta cattcagcta catcaagaat aaaatgtcta gcagcaagaa gagcaaagaa 1140 aaggaaaaag aaaaagataa gattaaggag aaggagaaag attctaaaga caaggagaaa 1200 gataagaaga ctgtcaacgg gcacactttc agttccattc ctgttgtggg tcccatcagc 1260 tgtagccagt gtatgaagcc cttcaccaac aaagatgcct atacttgtgc aaattgcagt 1320 gcttttgtcc acaaaggctg ccgagaaagt ctagcctcct gtgcaaaggt caaaatgaag 1380 cagcccaaag ggagccttca ggcacatgac acatcatcac tgcccacggt cattatgaga 1440 aacaagccct cacagcccaa ggagcgtcct cggtccgcag tcctcctggt ggatgaaacc 1500 gctaccaccc caatatttgc caatagacga tcccagcaga gtgtctcgct ctccaaaagt 1560 gtctccatac agaacattac tggagttggc aatgatgaga acatgtcaaa cacctggaaa 1620 ttcctgtctc attcaacaga ctcactaaat aaaatcagca aggtcaatga gtcaacagaa 1680 tcacttactg atgagggagt aggtacagac atgaatgaag gacaactact gggagacttt 1740 gagattgagt ccaaacagct ggaagcagag tcttggagtc ggataataga cagcaagttt 1800 ctaaaacagc aaaagaaaga tgtggtcaaa cggcaagaag taatatatga gttgatgcag 1860 acagagtttc atcatgtccg cactctcaag atcatgagtg gtgtgtacag ccaggggatg 1920 atggcggatc tgctttttga gcagcagatg gatgaaaagc tgttcccctg tttggatgag 1980 ctgatcagta tccatagcca attcttccag aggattctgg agcggaagaa ggagtctctg 2040 gtggataaaa gtgaaaagaa ctttctcatc aagaggatag gggatgtgct tgtaaatcag 2100 ttttcaggtg agaatgcaga acgtttaaag aagacatatg gcaagttttg tgggcaacat 2160 aaccagtctg taaactactt caaagacctt tatgccaagg ataagcgttt tcaagccttt 2220 gtaaagaaga agatgagcag ttcagttgtt agaaggcttg gaattccaga gtgcatattg 2280 cttgtaactc agcggattac caagtaccca gttttattcc aaagaatatt gcagtgtacc 2340 aaagacaatg aagtggagca ggaagatcta gcacagtcct tgagcctggt gaaggatgtg 2400 attggagctg tagacagcaa agtggcaagt tatgaaaaga aagtgcgtct caatgagatt 2460 tatacaaaga cagatagcaa gtcaatcatg aggatgaaga gtggtcagat gtttgccaag 2520 gaagatttga aacggaagaa gcttgtacgt gatgggagtg tgtttctgaa gaatgcagca 2580 ggaaggttga aagaggttca agcagttctt ctcactgaca ttttagtttt ccttcaagaa 2640 aaagaccaga agtacatctt tgcatcattg gaccagaagt caacagtgat ctctttaaag 2700 aagctgattg tgagagaagt ggcacatgag gagaaaggtt tattcctgat cagcatgggg 2760 atgacagatc cagagatggt agaagtccat gccagctcca aagaggaacg aaacagctgg 2820 attcagatca ttcaggacac aatcaacacc ctgaacagag atgaagatga aggaattcct 2880 agtgagaatg aggaagaaaa gaaaatgttg gacaccagag cccgagaatt aaaagaacaa 2940 cttcaccaga aggaccaaaa aatcctactc ttgttggaag agaaggagat gattttccgg 3000 gacatggctg agtgcagcac ccctctccca gaggattgct ccccaacaca tagccctaga 3060 gttctcttcc gctccaacac agaagaggct ctcaaaggag gacctttaat gaaaagtgca 3120 ataaatgagg tggagatcct tcagggtttg gtgagtggaa atctgggagg cacacttggg 3180 ccgactgtca gcagccccat tgagcaagat gtggtcagtc ccgtttccct gccccggaga 3240 gcagagacct ttggaggatt tgacagccat cagatgaatg cttcaaaagg aggcgagaag 3300 gaagagggag gtgatggcca agatcttagg agaacggaat cagatagtgg cctaaaaaag 3360 ggtggaaatg ctaacctggt atttatgctt aaaagaaaca gtgagcaggt tgtccagagc 3420 gttgttcatc tctacgagct cctcagcgct ctgcagggtg tggtgctgca gcaggacagc 3480 tacattgagg accagaaact ggtgctgagc gagagggcgc tcactcgcag cttgtcccgc 3540 ccgagctccc tcattgagca ggagaagcag cgcagcctgg agaagcagcg ccaggacctg 3600 gccaacctgc agaagcagca ggcccagtac ctcgaggaga agcgcaggcg cgagcgtgag 3660 tgggaagctc gtgagaggga gctgcgggac gggaggccct cctggcccag cgcgaggagg 3720 aggtgcagca ggggcagcag gacctggaaa aggagcggga ggagctccag cagaagaagg 3780 gcacatagcc agtatgacct ggagcgactg cgtgctgccc agaaacagct tgagagggaa 3840 caggagcacg tgcgccggga ggcagagcgg ctcagccagc ggcagacaga acgggacctg 3900 tgtcaggttt cccatccaca taccaagctg atgaggatcc catcgttctt ccccagtcct 3960 gaggagcccc cctcgccatc tgcaccttcc atagccaaat cagggtcatt ggactcagaa 4020 ctttcagtgt ccccaaaaag gaacagcatc tctcggacac acaaagataa ggggcctttt 4080 cacatactga gttcaaccag ccagacaaac aaaggaccag aagggcagag ccaggcccct 4140 gcgtccacct ctgcctctac ccgcctgttt gggttaacaa agccaaagga aaagaaggag 4200 aaaaaaaaga agaacaaaac cagccgctct cagcccggtg atggtcccgc gtcagaagta 4260 tcagcagagg gtgaagagat cttctgctga 4290 <210> 28 <211> 424 <212> PRT <213> Human <400> 28 Met Ser Asn Thr Trp Lys Phe Leu Ser His Ser Thr Asp Ser Leu Asn 1 5 10 15 Lys Ile Ser Lys Val Asn Glu Ser Thr Glu Ser Leu Thr Asp Glu Gly 20 25 30 Thr Asp Met Asn Glu Gly Gln Leu Leu Gly Asp Phe Glu Ile Glu Ser 35 40 45 Lys Gln Leu Glu Ala Glu Ser Trp Ser Arg Ile Ile Asp Ser Lys Phe 50 55 60 Leu Lys Gln Gln Lys Lys Asp Val Val Lys Arg Gln Glu Val Ile Tyr 65 70 75 80 Glu Leu Met Gln Thr Glu Phe His His Val Arg Thr Leu Lys Ile Met 85 90 95 Ser Gly Val Tyr Ser Gln Gly Met Met Ala Asp Leu Leu Phe Glu Gln 100 105 110 Gln Met Val Glu Lys Leu Phe Pro Cys Leu Asp Glu Leu Ile Ser Ile 115 120 125 His Ser Gln Phe Phe Gln Arg Ile Leu Glu Arg Lys Lys Glu Ser Leu 130 135 140 Val Asp Lys Ser Glu Lys Asn Phe Leu Ile Lys Arg Ile Gly Asp Val 145 150 155 160 Leu Val Asn Gln Phe Ser Gly Glu Asn Ala Glu Arg Leu Lys Lys Thr 165 170 175 Tyr Gly Lys Phe Cys Gly Gln His Asn Gln Ser Val Asn Tyr Phe Lys 180 185 190 Asp Leu Tyr Ala Lys Asp Lys Arg Phe Gln Ala Phe Val Lys Lys Lys 195 200 205 Met Ser Ser Ser Val Val Arg Arg Leu Gly Ile Pro Glu Cys Ile Leu 210 215 220 Leu Val Thr Gln Arg Ile Thr Lys Tyr Pro Val Leu Phe Gln Arg Ile 225 230 235 240 Leu Gln Cys Thr Lys Asp Asn Glu Val Glu Gln Glu Asp Leu Ala Gln 245 250 255 Ser Leu Ser Leu Val Lys Asp Val Ile Gly Ala Val Asp Ser Lys Val 260 265 270 Ala Ser Tyr Glu Lys Lys Val Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Thr Lys Thr 275 280 285 Asp Ser Lys Ser Ile Met Arg Met Lys Ser Gly Gln Met Phe Ala Lys 290 295 300 Glu Asp Leu Lys Arg Lys Lys Leu Val Arg Asp Gly Ser Val Phe Leu 305 310 315 320 Lys Asn Ala Ala Gly Arg Leu Lys Glu Val Gln Ala Val Leu Leu Thr 325 330 335 Asp Ile Leu Val Phe Leu Gln Glu Lys Asp Gln Lys Tyr Ile Phe Ala 340 345 350 Ser Leu Asp Gln Lys Ser Thr Val Ile Ser Leu Lys Lys Leu Ile Val 355 360 365 Arg Glu Val Ala His Glu Glu Lys Gly Leu Phe Leu Ile Ser Met Gly 370 375 380 Met Thr Asp Pro Glu Met Val Glu Val His Ala Ser Ser Lys Glu Glu 385 390 395 400 Arg Asn Ser Trp Ile Gln Ile Ile Gln Asp Thr Ile Asn Thr Leu Ser 405 410 415 Gly Asn Gly Trp Arg Cys Phe Asn 420

Claims (47)

  1. lbc 종양유전자의 존재 또는 발현을 분석함으로써 환자가 파르네실 트랜스퍼라제 저해제(FTI)를 이용한 치료에 반응할지의 여부를 측정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    FTI의 존재 하에서 상이하게 조절되는 유전자의 발현 분석을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    lbc 종양유전자에 추가하여 하나 초과의 유전자의 발현을 분석하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    유전자가 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    lbc 종양유전자가 존재하지 않거나 발현되지 않는 것으로 측정된 환자를 FTI를 이용하여 치료하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    lbc 종양유전자가 존재하거나 발현되는 것으로 측정된 환자를 FTI가 아닌 다른 약물을 이용하여 치료하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    FTI에 대한 반응을 측정하는데 사용되는 환자의 시료가 CD33 및 CD34로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 항원을 포함하는지의 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    표면 항원을 갖는 세포의 존재가 FTI 치료에 대한 반응의 예후인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    아세포를 포함하는, FTI에 대한 반응을 측정하는데 사용되는 환자의 시료중에서 세포의 비율을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    시료중의 아세포가 60% 미만으로 존재하는 것이 FTI에 대한 반응의 예후인 방법.
  11. lbc 종양유전자의 존재 또는 발현을 분석함으로써 FTI를 이용하여 치료되는 환자의 치료를 모니터링하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    FTI의 존재 하에서 상이하게 조절되는 유전자의 발현의 분석을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    lbc 종양유전자에 추가하여 하나 초과의 유전자의 발현을 분석하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    유전자가 서열번호 1 및 서열번호 3 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서,
    lbc 종양유전자가 존재하지 않거나 발현되지 않는 것으로 측정된 환자를 FTI에 반응하는 환자로 처리하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서,
    FTI에 대한 반응을 측정하는데 사용되는 환자의 시료가 CD33 및 CD34로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 항원을 포함하는지의 여부를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    15% 미만의 CD33 또는 60% 미만의 CD34를 포함하는 표면 항원을 갖는 세포의 존재가 FTI 치료에 대한 반응을 나타내는 것인 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    표면 항원을 갖는 세포가 존재하지 않는 것이 FTI 치료에 대한 반응을 나타내는 것인 방법.
  19. 제 11 항에 있어서,
    아세포를 포함하는, FTI에 대한 반응을 측정하는데 사용되는 환자의 시료중 세포의 비율을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    시료 중에 60% 이하의 아세포가 존재하는 것이 FTI에 대한 반응을 나타내는 것인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    시료 중에 60% 초과의 아세포가 존재하는 것이 FTI에 대한 비-반응성을 나타내는 것인 방법.
  22. 제 11 항에 있어서,
    lbc 종양유전자가 양이 감소하지 않고 존재하거나 발현되는 것으로 측정된 환자를 FTI에 반응하지 않는 것으로 처리하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서,
    FTI가 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논인 방법.
  24. 제 11 항에 있어서,
    FTI가 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논인 방법.
  25. a) 환자의 lbc 종양유전자의 존재 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하여 환자가 FTI를 이용한 치료에 반응할지의 여부를 측정하는 단계; 및
    b) 분석 결과 환자가 반응할 것으로 나타나는 경우 환자를 FTI로 치료하는 단계
    를 포함하는 환자의 치료 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    하나 초과의 유전자의 발현을 분석하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    FTI가 퀴놀린 및 퀴놀린 유도체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    FTI가
    7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일메틸]-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온;
    7-(3-클로로페닐)-9-[(4-클로로페닐)-1H-이미다졸-1-일메틸]-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온;
    8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)-메틸]-6-(3-클로로페닐)-1,2-다이하이드로-4H-피롤로[3,2,1-ij]퀴놀린-4-온;
    8-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-6-(3-클로로페닐)-2,3-다이하이드로-1H,5H-벤조[ij]퀴놀리진-5-온; 및
    (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논
    으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    FTI가 (R)-6-[아미노(4-클로로페닐)(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)메틸]-4-(3-클로로페닐)-1-메틸-2(1H)-퀴놀리논인 방법.
  30. 제 26 항에 있어서,
    유전자가 서열번호 1 내지 18의 서열을 갖는 하나 이상의 핵산 서열에 상응하는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서,
    치료가 FTI 및 다른 치료 조성물의 투여를 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    다른 치료 조성물이 MAPK/ERK 신호전달 경로, TGFβ, WNT, Rho 또는 세포사멸 경로를 조절하는 방법.
  33. 제 31 항에 있어서,
    다른 치료 조성물이 타이로신 키나제 저해제, MEK 키나제 저해제, PI3 키나제 저해제, MAP 키나제 저해제, 세포사멸 조절자 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  34. FTI 반응을 나타내는 환자의 유전자 발현 프로파일을 측정하는데 이용되는 FTI를 포함하는 매질을 이용하여 환자의 치료 효율을 평가하기 위한 제품.
  35. 제 34 항에 있어서,
    유전자 발현 프로파일이 서열번호 1 내지 18의 하나 이상의 핵산 서열에 상응하는 유전자 군에서 수득되는 제품.
  36. 제 34 항에 있어서,
    매질에 고정된 유전자 발현 프로파일의 설명서를 포함하는 제품.
  37. FTI 처리에 대한 반응을 측정하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  38. 제 37 항에 있어서,
    시약이 lbc 종양유전자의 존재 또는 발현을 검출하기 위한 것인 키트.
  39. 제 38 항에 있어서,
    시약이 서열번호 1 내지 18 및 이들의 변이체로 구성된 군에서 선택된 유전자의 발현을 검출하기 위한 것인 키트.
  40. 제 37 항에 있어서,
    CD33 및 CD34로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 항원을 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
  41. 제 37 항에 있어서,
    아세포를 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
  42. 제 37 항에 있어서,
    시약이 PCR 프라이머를 포함하는 키트.
  43. 제 43 항에 있어서,
    프로브를 추가로 포함하는 키트.
  44. lbc 종양유전자가 존재하지 않거나 발현되지 않는 것으로 측정되었거나 나중에 측정되는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조용으로서의 FTI의 용도.
  45. lbc 종양유전자의 존재 또는 발현에 대해 후속적으로 모니터링되는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조용으로서의 FTI의 용도.
  46. 환자의 시료를 분석하여 lbc 종양유전자의 존재 또는 발현을 측정하기 위한 진단 키트.
  47. 환자에서 lbc 종양유전자의 존재 또는 유전자 발현 프로파일을 측정하여 환자가 FTI를 이용한 치료에 반응할지의 여부를 측정하기 위한 수단; 및
    분석 결과 환자가 반응할 것으로 나타나면 환자의 치료학적 처리를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 FTI의 사용
    을 포함하는 환자를 치료하기 위한 조합물.
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