ES2815353T3 - Derivados de benzodiazepina citotóxicos - Google Patents

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Michael Louis Miller
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Abstract

Un compuesto citotóxico representado por la siguiente fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde: L' se representa por la siguiente fórmula: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1); -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J(B2);or -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B3); or donde: P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos; J es un éster de N-hidroxisuccinimida, éster de N-hidroxisulfosuccinimida, éster de nitrofenilo, éster de dinitrofenilo, éster de sulfo-tetraflurofenilo y éster de pentafluorofenilo; Ra y Rb, para cada aparición, son cada uno independientemente -H, alquilo (Ci-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q, donde Q es SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; m es un número entero de 1 a 6; m' es 0 o un número entero de 1 a 6; Cy es un alquilo cíclico que tiene 5 o 6 átomos de carbono en el anillo opcionalmente sustituido con halógeno, -OH, alquilo (Ci-C3), alcoxi (Ci-C3) o haloalquilo (Ci-C3); y Zs es -H, -SRd, -C (= O) Rd1 o se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas: **(Ver fórmula)** donde: q es un número entero de 1 a 5; n' es un número entero de 2 a 6; U es -H o SO3M; M es H+, Na+ o K+; Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o se selecciona de fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo; y Rd1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; L" y L" son ambos -H; la línea doble = entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H, o un alquilo lineal o ramificado que tenga de 1 a 4 átomos de carbono, y cuando sea un enlace simple , X sea -H, Y sea -OH o - SO3M; R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' y R4' son todos -H; R6 es OMe; X' e Y' son ambos -H; A y A' son -O-; y M es H, Na+ o K+; y para cada aparición R5 es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de benzodiazepina citotóxicos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a compuestos citotóxicos novedosos y conjugados citotóxicos que comprenden estos compuestos citotóxicos y agentes de unión celular. Más específicamente, la presente invención se refiere a compuestos de benzodiazepina novedosos, derivados de estos, intermedios de estos, conjugados de estos y sales farmacéuticamente aceptables de estos, los cuales son útiles como medicamentos, en particular como agentes antiproliferativos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los derivados de benzodiazepina son compuestos útiles para tratar diversos trastornos e incluyen medicamentos tales como antiepilépticos (imidazo [2,1-b][1,3,5]benzotiadiazepinas, patente estadounidense N.° 4.444.688; patente estadounidense N.° 4.062.852), antibacterianos (pirimido[1,2-c][1,3,5]benzotiadiazepinas, GB 1476684), diuréticos e hipotensores (pirrolo(1,2-b)[1,2,5]benzotiadiazepina 5,5 dióxido, patente estadounidense N.° 3.506.646), hipolipidémicos (WO 03091232), antidepresivos (patente estadounidense N.° 3.453.266); osteoporosis (JP 2138272).
Se ha demostrado en modelos de tumores animales que los derivados de benzodiazepina, por ejemplo pirrolobenzodiazepinas (PBD), actúan como agentes antitumorales (1,2,5-benzotiadiazepina-1,1-dióxido sustituido con N-2-imidazolilalquilo, patente estadounidense N.° 6.156.746), benzo-pirido o dipirido tiadiazepina (WO 2004/069843), derivados de pirrolo [1,2-b] [1,2,5] benzotiadiazepinas y pirrolo[1,2-b][1,2,5] benzodiazepina (WO2007/015280), derivados de tomaimicina (p. ej., pirrolo[1,4]benzodiazepinas), por ejemplo los descritos en WO 00/12508, WO2005/085260, WO2007/085930 y EP 2019104. También se conoce que las benzodiazepinas afectan el crecimiento celular y la diferenciación (Kamal A., et al., Bioorg Med Chem. 15 de agosto de 2008;16(16):7804-10 (y las referencias citadas allí); Kumar R, Mini Rev Med Chem. Junio de 2003; 3(4):323-39 (y las referencias citadas allí); Bednarski J J, et al., 2004; Sutter A. P, et al., 2002; Blatt N B, et al., 2002), Kamal A. et al., Current Med. Chem., 2002; 2; 215-254, Wang J-J., J.Med. Chem., 2206; 49:1442-1449, Alley M.C. et al., Cancer Res. 2004; 64:6700-6706, Pepper C. J., Cancer Res 2004; 74:6750-6755, Thurston D.E. y Bose D.S., Chem Rev 1994; 94:433-465; y Tozuka, Z., et al., Journal of Antibiotics, (1983) 36; 1699­ 1708. La estructura general de las PBD se describe en el número de publicación estadounidense 20070072846. Las PBD difieren en el número, el tipo y la posición de los sustituyentes, en sus anillos A aromáticos y sus anillos C de pirrolo, y en el grado de saturación del anillo C. Su capacidad para formar un aducto en el ADN de reticulación y surco menor les permite interferir con el procesamiento del ADN y, por lo tanto, su potencial de uso como agentes antiproliferativos.
La primera pirrolobenzodiazepina en ingresar a la clínica, SJG-136 (NSC 694501) es un agente citotóxico potente que provoca reticulaciones entre cadenas de ADN (S.G Gregson et al., 2001, J. Med. Chem., 44: 737-748; M.C. Alley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6700-6706; J.A. Hartley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6693-6699; C. Martin et al., 2005, Biochemistry., 44: 4135-4147; S. Arnould et al., 2006, Mol. Cancer Ther., 5: 1602-1509). Los resultados de una evaluación clínica de fase I de SJG-136 reveló que este fármaco era tóxico en dosis extremadamente bajas (dosis máxima tolerada de 45 |jg/m2, y se observaron varios efectos adversos, incluso síndrome de fuga vascular, edema periférico, toxicidad en el hígado y fatiga. Se observó daño en el ADN en todas las dosis en los linfocitos circulantes (D. Hochhauser et al., 2009, Clin. Cancer Res., 15: 2140-2147). Por ende, existe la necesidad de derivados de benzodiazepina mejorados que sean menos tóxicos y aun así sigan siendo terapéuticamente activos para tratar diversos estados de enfermedad proliferativa, por ejemplo cáncer.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Los compuestos de benzodiazepina novedosos descritos en la presente y los conjugados de estos tienen sorprendentemente alta potencia contra diversas células tumorales.
Visto desde un aspecto, la invención proporciona un compuesto citotóxico como se define en la reivindicación 1.
Un objetivo de la invención es proporcionar conjugados de agentes de unión celular con los compuestos de benzodiazepina novedosos o derivados de estos de la presente invención. Estos conjugados son útiles como agentes terapéuticos, los cuales se administran específicamente a células diana y son citotóxicos.
Visto desde un segundo aspecto, la invención proporciona un conjugado como se define en la reivindicación 9.
En una realización, para los conjugados de la fórmula estructural (I'), el agente de unión celular es un anticuerpo del receptor anti-folato o un fragmento de anticuerpo de este. Más específicamente, el anticuerpo del receptor anti-folato es anticuerpo huMOV19.
En otra realización, para los conjugados de la fórmula estructural (I'), el agente de unión celular es un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de anticuerpo de este. En una realización, el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo no antagonista, incluido, por ejemplo, los anticuerpos descritos en WO2012058592. En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo no funcional, por ejemplo, ML66 humanizado. Más específicamente, el anticuerpo anti-EGFR es huML66. Visto desde un tercer aspecto, la presente invención también incluye una composición farmacéutica) que comprende los conjugados de la invención (y/o solvatos, hidratos y/o sales de estos) y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención incluye adicionalmente una composición farmacéutica que comprende los conjugados de la invención (y/o solvatos, hidratos y/o sales de estos) y un portador farmacéuticamente aceptable que además comprende un segundo agente terapéutico. Las presentes composiciones son útiles para inhibir el crecimiento celular anormal o tratar un trastorno proliferativo en un mamífero (p. ej., un ser humano). Las presentes composiciones son útiles para tratar afecciones tales como cáncer, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), rechazo de trasplante, lupus, miositis, infección, inmunodeficiencia tal como SIDA, y enfermedades inflamatorias en un mamífero (p. ej., ser humano).
Visto desde un cuarto aspecto, la invención proporciona un compuesto del primer aspecto o un conjugado del segundo aspecto para su uso como medicamento.
Visto desde un quinto aspecto, la invención proporciona un compuesto del primer aspecto o un conjugado del segundo aspecto para su uso en un procedimiento como se define en la reivindicación 21.
En esta invención se describe también un procedimiento para sintetizar y utilizar compuestos de benzodiazepina novedosos, derivados de estos y conjugados de estos para el diagnóstico o tratamiento in vitro, in situ e in vivo de células de mamíferos, organismos o afecciones patológicas asociadas.
Los compuestos de la presente invención, derivados de estos o conjugados de estos, y las composiciones que los comprenden, son útiles para tratar o disminuir la gravedad de trastornos, por ejemplo, caracterizados por crecimiento anormal de células (p. ej., cáncer). Otras aplicaciones para los compuestos y conjugados de la presente invención incluyen el tratamiento de afecciones tales como cáncer, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), rechazo de trasplante, lupus, miositis, infección, inmunodeficiencia tal como SIDA y enfermedades inflamatorias en un mamífero (p. ej., ser humano).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra afinidad de unión del conjugado huMOV19-14 en comparación con el anticuerpo huMOV19 no conjugado en células T47D.
La figura 2 muestra citotoxicidad in vitro y especificidad del conjugado huMOV19-14.
La figura 3 muestra que el conjugado huMOV19-14 presenta efecto citotóxico testigo débil en las células negativas al antígeno vecinas.
Las figuras 4A, 4B y 4C muestran citotoxicidad in vitro del conjugado huMy9-6-14 contra diversas líneas celulares. Las figuras 5A y 5B muestran que el conjugado huMy9-6-14 presenta efecto citotóxico testigo en las células negativas al antígeno vecinas.
La figura 6 muestra eficacia in vivo de los conjugados huMOV19-80 y huMOV19-90 en ratones SCID que presentan NCI-H2110.
Las figuras 7A-7D muestran perfiles de espectrometría de masas de conjugados representativos de la presente invención. La figura 8 muestra perfil de espectrometría de masas del conjugado huML66-90.
La figura 9 muestra citotoxicidad in vitro y especificidad del conjugado huML66-90.
Las figuras 10, 11 y 12 muestran citotoxicidad in vitro y especificidad del conjugado huMOV19-90.
La figura 13 muestra que el conjugado huMOV19-90 presenta efecto citotóxico testigo fuerte en las células negativas al antígeno vecinas.
La figura 14 muestra eficacia in vivo del conjugado huMOV19-90 en ratones SCID que presentan NCI-H2110.
Las figuras 15A y 15B muestran afinidad de unión del conjugado huMOV19-90 en comparación con el anticuerpo huMOV19 no conjugado en células T47D.
La figura 16 muestra perfiles de espectrometría de masas de un conjugado representativo de la presente invención. La figura 17 muestra eficacia in vivo del conjugado huML66-90 en ratones SCID que presentan NCI-H1703 NSCEC. La figura 18 muestra farmacocinética de huMOV19-90 en ratones CD-1.
Las figuras 19A y 19B muestran la estructura del conjugado huMOV19-90 (figura 19A) y un esquema para la incubación, purificación e aislamiento de catabolitos del conjugado huMOV19-90 formado en células de cáncer de cuello uterino KB in vitro (figura 19B). Los tres catabolitos identificados por EC-MS se muestran junto con la masa calculada.
La figura 20 muestra afinidad de unión del conjugado huMOV19-107 en comparación con el anticuerpo huMOV19 no conjugado en células T47D.
La figura 21 muestra citotoxicidad in vitro y especificidad de los conjugados huMOV19-90 y huMOV19-107.
La figura 22 muestra eficacia in vivo del conjugado huMOV19-90 en ratones SCID que presenta xenoinjertos NCI-H2110 NSCEC.
La figura 23 muestra eficacia in vivo del conjugado huMOV19-90 en ratones SCID que presentan xenoinjertos endometriales Hec-1b.
La figura 24 muestra eficacia in vivo del conjugado huMOV19-90 en ratones SCID que presentan xenoinjertos endometriales Ishikawa.
La figura 25 muestra eficacia in vivo del conjugado huMOV19-107 en ratones SCID que presenta xenoinjertos NCI-H2110 NSCLC.
La figura 26 muestra afinidad de unión del conjugado huCD123-6Gv4.7S3-90 en comparación con el anticuerpo no conjugado en células HNT-34.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación, se hará referencia de forma detallada a determinadas realizaciones de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y fórmulas adjuntas. Si bien la invención se describirá junto con las realizaciones enumeradas, se entenderá que no se pretende limitar la invención a tales realizaciones. Por el contrario, se pretende que la invención abarque todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que se puedan incluir dentro del alcance de la presente invención según se define en las reivindicaciones. Un experto en la técnica reconocerá varios procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, los cuales podrían utilizarse en la práctica de la presente invención. Se debe entender que cualquiera de las realizaciones descritas en la presente, incluido aquellas descritas bajo diferentes aspectos de la invención (p. ej., compuestos, moléculas enlazadoras de compuestos, conjugados, composiciones, procedimientos de preparar y utilizar) y diferentes partes de la memoria descriptiva (incluido las realizaciones descritas solo en los ejemplos) se pueden combinar con una o más realizaciones diferentes de la invención, a menos que se niegue explícitamente o sea inadecuado.
DEFINICIONES
Según se emplea en la presente, el término “agente de unión celular” o “CBA” se refiere a un compuesto que se puede unir a una célula (p. ej., en un ligando de superficie celular) o unir a un ligando asociado con la célula o próximo a esta, preferentemente de un modo específico. En determinadas realizaciones, la unión a la célula o a un ligando en la célula o cerca de esta es específica. El CBA puede incluir péptidos y no péptidos.
“Alquilo lineal o ramificado”, según se emplea en la presente, se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada saturado de uno a veinte átomos de carbono. Algunos ejemplos de alquilo incluyen metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-metil-1 -propilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1-butilo, 2-metil-1 -butilo, 1-hexilo), 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, 1-heptilo y 1-octilo. Preferentemente, el alquilo tiene de uno a diez átomos de carbono. Más preferentemente, el alquilo tiene de uno a cuatro átomos de carbono.
“Alquenilo lineal o ramificado” se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a veinte átomos de carbono con al menos un sitio de insaturación, es decir, un carbono-carbono, doble enlace, en donde el radical alquenilo incluye radicales que tienen orientaciones “cis” y “trans”, o alternativamente, orientaciones “E” y “Z”. Algunos ejemplos incluyen etilenilo o vinilo (-CH=CH2) y alilo (-CH2CH=CH2). Preferentemente, el alquenilo tiene de dos a diez átomos de carbono. Más preferentemente, el alquilo tiene de dos a cuatro átomos de carbono.
“Alquinilo lineal o ramificado” se refiere a un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado de dos a veinte átomos de carbono con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace triple carbono-carbono. Algunos ejemplos incluyen etinilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo y hexinilo. Preferentemente, el alquinilo tiene de dos a diez átomos de carbono. Más preferentemente, el alquinilo tiene de dos a cuatro átomos de carbono.
Los términos “carbociclo”, “carbocíclico” y “anillo carbocíclico” se refieren a un anillo saturado o parcialmente insaturado, no aromático, monovalente que tiene de 3 a 12 átomos de carbono como un anillo monocíclico o de 7 a 12 átomos de carbono como un anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen de 7 a 12 átomos se pueden disponer, por ejemplo, como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], y los carbociclos bicíclicos que tienen 9 o 10 átomos del anillo se pueden disponer como un sistema biciclo [5,6] o [6,6] o como sistemas puenteados como biciclo[2.2.1]heptano, biciclo[2.2.2]octano y biciclo[3.2.2]nonano. Algunos ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, ciclohexadienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo y ciclododecilo.
Los términos “alquilo cíclico” y “cicloalquilo” se pueden utilizar indistintamente. Se refieren a un radical de anillo carbocíclico saturado monovalente. Preferentemente, el alquilo cíclico es un radical de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros. Más preferentemente, el alquilo cíclico es ciclohexilo.
El término “alquenilo cíclico” se refiere a un radical de anillo carbocíclico que tiene al menos un enlace doble en la estructura del anillo.
El término “alquinilo cíclico” se refiere a un radical de anillo carbocíclico que tiene al menos un enlace triple en la estructura del anillo.
“Arilo” significa un radical hidrocarbonado aromático monovalente de 6-18 átomos de carbono derivado por la eliminación de un átomo de hidrógeno de un único átomo de carbono de un sistema de anillos aromáticos parental. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras ejemplares como “Ar”. El arilo incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático fusionado con un anillo saturado o parcialmente insaturado o un anillo heterocíclico o carbocíclico aromático. Los grupos arilo típicos incluyen radicales derivados de benceno (fenilo), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, indenilo, indanilo, 1,2-dihidronaftaleno y 1,2,3,4-tetrahidronaftilo. Preferentemente, arilo es un grupo fenilo.
Los términos "heterociclo", "heterociclilo" y "anillo heterocíclico" se utilizan de forma indistinta en la presente y hacen referencia a un radical carbocíclico saturado o parcialmente insaturado (es decir, que tiene uno o más enlaces dobles y/o triples dentro del anillo) de 3 a 18 átomos en el anillo, donde al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre, y los átomos del anillo restantes son C, en donde uno o más átomos del anillo están opcionalmente sustituidos de forma independiente con uno o más sustituyentes que se describen a continuación. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A., “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W. A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Heterociclilo" también incluye radicales donde los radicales heterociclo se encuentran fusionados con un anillo carbocíclico o heterocíclico saturado, parcialmente insaturado o aromático. Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidiniloimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanilo y azabiciclo[2.2.2]hexanilo. Los restos espiro también están incluidos dentro del alcance de esta definición. Algunos ejemplos de un grupo heterocíclico en donde se sustituyen átomos del anillo con restos de oxo (=O) son pirimidinonilo y 1,1 -dioxo-tiomorfolinilo.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de anillos de 5 o 6 miembros e incluye sistemas de anillos fusionados (al menos uno de los cuales es aromático) de 5-18 átomos que contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre. Algunos ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (incluido, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (incluido, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo y furopiridinilo.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden ser carbono (unido a carbono) o nitrógeno (unido a nitrógeno) unidos donde sea posible. A modo de ejemplo, los heteroarilos o heterociclos unidos a carbono pueden estar unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3 o 4 de un azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina.
A modo de ejemplo, los heteroarilos o heterociclos unidos a nitrógeno pueden estar unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrolo, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol o isoindolina, posición 4 de una morfolina y posición 9 de un carbazol u O-carbolina.
Los heteroátomos presentes en heteroarilo o heterociclilo incluyen formas oxidadas como NO, SO y SO2.
El término “halo” o “halógeno” se refiere a F, Cl, Br o I.
El alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo cíclico, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo descritos arriba pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes.
Si un sustituyente se describe como “sustituido”, un sustituyente no hidrógeno se encuentra en lugar de un sustituyente hidrógeno en un carbono, oxígeno, azufre o nitrógeno del sustituyente. Por lo tanto, por ejemplo, un sustituyente alquilo sustituido es un sustituyente alquilo en donde al menos un sustituyente no hidrógeno se encuentra en lugar de un sustituyente hidrógeno en el sustituyente alquilo. A modo de ilustración, el monofluoroalquilo es alquilo sustituido con un sustituyente fluoro y difluoroalquilo es alquilo sustituido con dos sustituyentes fluoro. Se debe reconocer que si hay más de una sustitución en un sustituyente, cada sustituyente no hidrógeno puede ser idéntico o diferente (a menos que se indique algo diferente).
Si un sustituyente se describe como “opcionalmente sustituido”, el sustituyente puede estar o bien (1) no sustituido o (2) sustituido. Si un carbono de un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con uno o más de una lista de sustituyentes, uno o más de los hidrógenos en el carbono (en caso de que haya) se pueden reemplazar por separado y/o junto con un sustituyente opcional seleccionado de forma independiente. Si un nitrógeno de un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con uno o más de una lista de sustituyentes, uno o más de los hidrógenos en el nitrógeno (en caso de que haya) se pueden reemplazar cada uno con un sustituyente opcional seleccionado de forma independiente. Un sustituyente ejemplar se puede describir como -NR'R'', en donde R' y R'' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, pueden formar un anillo heterocíclico. El anillo heterocíclico formado a partir de R' y R'', junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, pueden estar parcial o totalmente saturados. En una realización, el anillo heterocíclico consiste en 3 a 7 átomos. En otra realización, el anillo heterocíclico se selecciona del grupo que consiste en pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, piridilo y tiazolilo.
La presente memoria descriptiva emplea los términos “sustituyente”, “radical” y “grupo” indistintamente.
Si un grupo de sustituyentes se describen colectivamente como opcionalmente sustituidos por uno o más de una lista de sustituyentes, el grupo puede incluir: (1 ) sustituyentes no sustituibles, (2 ) sustituyentes sustituibles que no están sustituidos por los sustituyentes opcionales y/o (3) sustituyentes sustituibles que están sustituidos por uno o más de los sustituyentes opcionales.
Si un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con hasta una cantidad específica de sustituyentes no hidrógeno, dicho sustituyente puede estar (1 ) no sustituido; o (2 ) sustituido por hasta esa cantidad particular de sustituyentes no hidrógeno o por hasta la cantidad máxima de posiciones sustituibles en el sustituyente, lo que sea inferior. Por ende, por ejemplo, si un sustituyente se describe como un heteroarilo opcionalmente sustituido con hasta 3 sustituyentes no hidrógeno, entonces cualquier heteroarilo con menos de 3 posiciones sustituibles estaría opcionalmente sustituido por hasta solamente tantos sustituyentes no hidrógeno como las posiciones sustituibles que tenga el heteroarilo. Dichos sustituyentes, en los ejemplos no taxativos, se pueden seleccionar de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tenga de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo, heterociclilo, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR100, NR101R102, -NO2, -NR101COR102, -SR100, un sulfóxido representado por -SOR101, una sulfona representada por -SO2R101, un sulfonato -SO3M, un sulfato -OSO3M, una sulfonamida representada por -SO2NR101R102, ciano, un azido, -COR101, -OCOR101, -OCONR101R102 y una unidad de polietilenglicol (-CH2CH2O)nR101 en donde M es H o un catión (como Na+ o K+); R101, R102 y R103 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-CH2CH2O V R104, en donde n es un entero de 1 a 24, un arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono y un heteroarilo que tiene de 5 a 10 átomos de carbono; y R104 es H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo en los grupos representados por R100, R101, R102, R103 y R104 están opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, -OH, -CN, -NO2 y alquilo lineal o ramificado insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, los sustituyentes para el alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo cíclico, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo opcionalmente sustituido descritos arriba incluyen halógeno, -CN, -NR102R103, -CF3, -OR101, arilo, heteroarilo, heterociclilo, -SR101, -SOR101, -SO2R101 y -SO3M.
Los términos “compuesto” o “compuesto citotóxico”, “dímero citotóxico” y “compuesto de dímero citotóxico” se utilizan indistintamente. Incluyen los compuestos para los cuales se ha descrito una estructura o fórmula, o cualquier derivado de estos, en la presente invención. El término también incluye, estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros, solvatos, metabolitos, sales (p. ej., sales farmacéuticamente aceptables) y profármacos y sales de profármacos de un compuesto de todas las fórmulas descritas en la presente invención. El término también incluye cualquier solvato, hidrato y polimorfo de cualquiera de los anteriores. La mención específica de “estereoisómeros”, “isómeros geométricos”, “tautómeros”, “solvatos”, “metabolitos”, “sal”, “profármaco”, “sal de profármaco”, “conjugados”, “sal de conjugados”, “solvato”, “hidrato” o “polimorfo” en determinados aspectos de la invención descrita en la presente solicitud no se debe interpretar como una omisión intencionada de estas formas en otros aspectos de la invención en donde el término “compuesto” se utiliza sin mención de estas otras formas.
El término “conjugado”, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto descrito en la presente o un derivado del mismo que está unido a un agente de unión celular.
El término “que se puede unir a un agente de unión celular”, según se utiliza en la presente, se refiere a los compuestos descritos en la presente, o derivados de estos, que comprenden al menos un grupo de unión o un precursor de este adecuado para unir estos compuestos o derivados de estos a un agente de unión celular.
El término “precursor” de un grupo determinado se refiere a cualquier grupo que puede dar lugar a dicho grupo mediante cualquier desprotección, una modificación química o una reacción de acoplamiento.
El término “unido a un agente de unión celular” se refiere a una molécula conjugada que comprende al menos uno de los compuestos descritos en la presente (p. ej., compuestos de fórmula (I) y compuestos de fármaco-enlazador descritos en la presente), o un derivado de estos, unido a un agente de unión celular a través de un grupo de unión adecuado o un precursor de este.
El término “quiral” se refiere a moléculas que tienen la propiedad de imposibilidad de superposición de imágenes especulares, mientras que el término “aquiral” se refiere a moléculas que son superponibles con sus imágenes especulares.
El término “estereoisómero” se refiere a compuestos que tienen constitución química y conectividad idénticas, pero diferentes orientaciones de sus átomos en el espacio que no se puede interconvertir por rotación alrededor de enlaces simples.
“Diastereómero” se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, p. ej. puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución, por ejemplo, cristalización, electroforesis y cromatografía.
“Enantiómeros” se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las convenciones y definiciones estereoquímicas que se utilizan en la presente siguen, en líneas generales, lo planteado por S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y por Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos de la invención pueden contener centros quirales o asimétricos y, por lo tanto, existen en diferentes formas estereoisoméricas. Se pretende que formen parte de la presente invención todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la invención, los que incluyen de modo no taxativo diastereómeros, enantiómeros y atropisómeros, así como mezclas de estos, tales como mezclas racémicas. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de desviar el plano de luz polarizada. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S se utilizan para denotar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su centro o centros quirales. Los prefijos d y l o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de luz polarizada plana por el compuesto, donde (-) o 1 significa que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrorrotatorio. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos salvo que son imágenes especulares uno del otro. También se puede hacer referencia a un estereoisómero específico como un enantiómero y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede ocurrir donde no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos “mezcla racémica” y “racemato” se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, sin actividad óptica.
El término "tautómero" o "forma tautomérica" se refiere a isómeros estructurales de distintas energías que son interconvertibles a través de una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómeros por transferencia de protones (también conocidos como tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones a través de la migración de un protón, tal como isomerizaciones cetoenólicas e imina-enamina. Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones mediante la reorganización de algunos de los electrones de unión.
El término “profármaco”, según se emplea en la presente solicitud, se refiere a un precursor o una forma derivada de un compuesto de la invención que es capaz de activarse de forma enzimática o hidrolítica o convertirse en la forma parental más activa. Véase, p. ej., Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy,” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375­ 382, 615° Meeting Belfast (1986) y Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos incluyen profármacos que contienen ésteres, profármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen tiofosfatos, profármacos que contienen sulfatos, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por aminoácido D, profármacos glicosilados, profármacos que contienen p-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida, profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Algunos ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivar en una forma de profármaco incluyen compuestos de la invención y agentes quimioterapéuticos como los descritos arriba.
El término “profármaco” también incluye un derivado de un compuesto que se puede hidrolizar, oxidar o reaccionar de otro modo en condiciones biológicas (in vitro o in vivo) para proporcionar un compuesto de la presente invención. Los profármacos solo se pueden volver activos tras dicha reacción en condiciones biológicas o pueden tener actividad en sus formas sin reaccionar. Algunos ejemplos de profármacos contemplados incluyen análogos o derivados de compuestos de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente que comprenden restos biohidrolizables como amidas biohidrolizables, ésteres biohidrolizables, carbamatos biohidrolizables, carbonatos biohidrolizables, ureidos biohidrolizables y análogos de fosfato biohidrolizables. Otros ejemplos de profármacos incluyen derivados de compuestos de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente que comprenden restos -NO, -NO2, -ONO o -ONO2. Los profármacos se pueden preparar típicamente utilizando procedimientos conocidos, como los descritos por Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5° ed.); véase también Goodman y Gilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8° ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, “Biotransformation of Drugs.”
Una forma preferida de profármaco incluye compuestos (con o sin grupos de unión) y conjugados de la invención que comprenden un aducto formado entre un enlace imina de los compuestos/conjugados y un reactivo de reacción imina. Otra forma preferida de profármaco de la invención incluye compuestos como aquellos de fórmula (I), en donde cuando la línea doble =■= entre N y C representa un enlace simple, X es H y el compuesto se convierte en un profármaco. Un profármaco de la invención puede contener una o ambas formas de profármacos descritas en la presente (p. ej., las que contienen un aducto formado entre un enlace imina de los compuestos/conjugados y un reactivo de reacción imina y/o las que contienen un grupo saliente Y cuando X es -H).
El término “reactivo de reacción imina” se refiere a un reactivo que es capaz de reaccionar con un grupo imina. Algunos ejemplos de reactivos de reacción imina incluyen sulfitos (H2SO3, H2SO2 o una sal de HSO3 ', SO32" o HSO2" formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52" formada con un catión), mono, di, tri y tetratiofosfatos (PO3SH3 , PO2S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de PO3S3-, PO2S23", POS33" o PS43" formada con un catión), ésteres de tiofosfato RiO)2PS(ORi), RiSH, RiSOH, RSO2H, RSO3H, diversas aminas (hidroxilamina (p. ej., NH2OH), hidrazina (p. ej., NH2NH2), NH2O Ri, Ri'NH-Ri, NH2- Ri), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2, tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32- formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2" formada con un catión, como HOCH2SO2"Na+), nucleótido glicado (como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde Ri y Ri’ son cada uno independiente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj )2, -CO2H, -SO3H y -PO3H; Ri y Ri’ además pueden estar opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferentemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; más preferentemente, Rk es metilo, etilo o propilo). Preferentemente, el catión es un catión monovalente, como Na+ o K+ . Preferentemente, el reactivo de reacción imina se selecciona de sulfitos, hidroxilamina, urea e hidrazina. Más preferentemente, el reactivo de reacción imina es NaHSO3 o KHSO3.
Según se utiliza en la presente y a menos que se indique algo diferente, los términos “amida biohidrolizable”, “éster biohidrolizable”, “carbamato biohidrolizable”, “carbonato biohidrolizable”, “ureido biohidrolizable” y “análogo de fosfato biohidrolizable” significan una amida, éster, carbamato, carbonato, ureido o análogo de fosfato, respectivamente, que o bien: 1 ) no destruye la actividad biológica del compuesto y le confiere al compuesto propiedades ventajosas in vivo, como absorción, duración de la acción o inicio de la acción; o 2 ) es en sí mismo biológicamente inactivo, pero se convierte in vivo en un compuesto biológicamente activo. Algunos ejemplos de amidas biohidrolizables incluyen amidas de alquilo inferior, amidas de a-aminoácido, amidas de alcoxiacilo y amidas de alquilaminoalquilcarbonilo. Algunos ejemplos de ésteres biohidrolizables incluyen ésteres de alquilo inferior, ésteres de alcoxiaciloxi, ésteres de alquilo acilamino alquilo y ésteres de colina. Algunos ejemplos de carbamatos biohidrolizables incluyen alquilaminas inferiores, etilendiaminas sustituidas, aminoácidos, hidroxialquilaminas, aminas heterocíclicas y heteroaromáticas y aminas de poliéter. Los profármacos favorecidos particularmente y las sales de profármaco son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de la presente invención cuando dichos compuestos se administran a un mamífero.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable", tal como se emplea en la presente, hace referencia a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto de la invención. Algunas sales ejemplares incluyen las sales sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metansulfonato “mesilato”, etansulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato, pamoato (es decir, 1,1’-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), sales de metales alcalinos (p. ej., de sodio y de potasio), sales de metales alcalinotérreos (p. ej., magnesio) y sales de amonio. Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion de acetato, un ion de succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabilice la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Las instancias en que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden presentar múltiples contraiones. Por consiguiente, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
Si el compuesto de la invención es una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier procedimiento disponible en la técnica, por ejemplo, el tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanosulfónico y ácido fosfórico o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, un ácido piranosídico, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un ácido alfa hidroxi, tal como ácido cítrico o tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido ptoluenosulfónico o ácido etanosulfónico.
Si el compuesto de la invención es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, el tratamiento del ácido libre con una base orgánica o inorgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metal alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas de sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.
Según se emplea en la presente, el término “solvato” significa un compuesto que además incluye una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de disolvente como agua, isopropanol, acetona, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y diclorometano de etanolamina, 2-propanol, unidos por fuerzas intermoleculares no covalentes. Los solvatos o los hidratos de los compuestos se preparan fácilmente mediante el añadido de al menos un equivalente molar de un disolvente hidroxílico como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol o agua al compuesto para producir la solvatación o hidratación del resto imina.
Los términos “crecimiento celular anormal” y “trastorno proliferativo” se utilizan indistintamente en la presente solicitud. “Crecimiento celular anormal”, según se emplea en la presente, a menos que se indique lo contrario, se refiere al crecimiento celular que es independiente de los mecanismos reguladores normales (p. ej., pérdida de la inhibición por contacto). Esto incluye, por ejemplo, el crecimiento anormal de: (1) células tumorales (tumores) que proliferan mediante la expresión de una tirosina cinasa mutada o la sobreexpresión de una tirosina cinasa receptora; (2 ) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las cuales se produce la activación de la tirosina cinasa aberrante; (3) cualquier tumor que prolifera mediante tirosina cinasas receptoras; (4) cualquier tumor que prolifera mediante la activación de serina/treonina cinasa aberrante; y (5) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las cuales se produce la activación de la serina/treonina cinasa aberrante.
Los términos “cáncer” y “canceroso” describen o hacen referencia a la afección fisiológica en mamíferos, la que se encuentra normalmente caracterizada por el crecimiento celular no regulado. Un “tumor” comprende una o más células cancerosas y/o benignas o células precancerosas.
Un “agente terapéutico” abarca un agente biológico como un anticuerpo, un péptido, una proteína, una enzima o un agente quimioterapéutico.
Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer.
Un “metabolito” es un producto producido mediante el metabolismo en el cuerpo de un compuesto específico, un derivado de este o un conjugado de este, o una sal de este. Los metabolitos de un compuesto, un derivado de este o un conjugado de este se pueden identificar utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica y sus actividades se pueden determinar utilizando pruebas como las que se describen en la presente. Tales productos pueden ser el resultado, por ejemplo, de oxidación, hidroxilación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desesterificación y escisión enzimática del compuesto administrado. En consecuencia, la invención incluye metabolitos de compuestos, un derivado de estos o un conjugado de estos, de la invención, incluido compuestos, un derivado de estos o un conjugado de estos, producidos por un proceso que comprende poner en contacto un compuesto, un derivado de este o un conjugado de este, de la presente invención con un mamífero durante un período suficiente para producir un producto metabólico de este.
La frase “farmacéuticamente aceptable” indica que la sustancia o la composición debe ser química y/o toxicológicamente compatible con los otros ingredientes comprendidos en una formulación y/o el mamífero que se trata con estos.
El término “grupo protector” o "resto protector" se refiere a un sustituyente que comúnmente se emplea para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras hace reaccionar otros grupos funcionales en el compuesto, un derivado de este o un conjugado de este. Por ejemplo, un “grupo protector amina” o un “resto protector amino” es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad del amino en el compuesto. Estos grupos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, P. Wuts y T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, capítulo 7, J. Wiley & Sons, NJ) y se ejemplifican por carbamatos como carbamato de metilo y etilo, FMOC, carbamatos de etilo sustituidos, carbamatos escindidos por eliminación de 1,6-p (también denominada “autodestructivo”), derivados de alquilo, arilo, ureas, amidas y péptidos. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen acetilo, trifluoroacetilo, tbutoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para encontrar una descripción general de grupos protectores y su uso, véase P. G.M. Wuts y T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 2007.
El término “grupo saliente” se refiere a un grupo de resto cargado o no cargado que parte durante una sustitución o desplazamiento. Dichos grupos salientes son conocidos en la técnica e incluyen halógenos, ésteres, alcoxi, hidroxilo, tosilatos, triflatos, mesilatos, nitrilos, azida, carbamato, disulfuros, tioéteres, tioésteres y compuestos de diazonio.
El término “agente de reticulación bifuncional”, “enlazador bifuncional” o “agentes de reticulación” se refiere a agentes modificadores que poseen dos grupos reactivos; uno de los cuales es capaz de reaccionar con un agente de unión celular, mientras que el otro reacciona con el compuesto citotóxico para unir los dos restos. Dichos reticuladores bifuncionales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Isalm y Dent en Bioconjugation, capítulo 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. Nueva York, 1999). Por ejemplo, los agentes de reticulación bifuncionales que permiten la unión a través de un enlace de tioéter incluyen A/-succ¡n¡m¡d¡l-4-(N-male¡midomet¡l)-c¡clohexano-1-carbox¡lato (SMCC) para introducir grupos maleimido o con N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB) para introducir grupos yodoacetilo. Otros agentes de reticulación bifuncionales que introducen grupos maleimido o grupos haloacetilo a un agente de unión celular se conocen en la técnica (véanse las solicitudes de patente estadounidense 2008/0050310, 20050169933, disponible de Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, EUA) e incluyen bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2 , BM(PEO)3, éster de N-(p-maleimidopropiloxi)succinimida (BMPS), ácido Y-maleimidobutírico éster de N-succinimidilo (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida de ácido £-maleimidocaproico (EMCS), NHS de ácido 5-maleimidovalérico, HBVS, N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), que es un análogo de “cadena larga” de SMCC (LC-SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), hidrazida o sal HCl de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), éster de N-succinimidilo de ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), 4-(pmaleimidofenil)-butirato de N-succinimidilo (SMPB), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), éster de N-( y -maleimidobutriloxi)sulfosuccinimda (sulfo-GMBS), éster de N-( g -maleim¡docapro¡lox¡)sulfosucc¡m¡do (sulfo-EMCS), éster de N-( K -maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida (sulfo-KMUS) y 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMPB).
Los agentes de reticulación heterobifuncionales son agentes de reticulación bifuncionales que tienen dos grupos reactivos diferentes. Los agentes de reticulación heterobifuncionales que contienen un grupo N-hidroxisuccinimida reactivo a amina (grupo NHS) y un grupo hidrazina reactivo a carbonilo también se pueden utilizar para unir los compuestos citotóxicos descritos en la presente con un agente de unión celular (p. ej., un anticuerpo). Algunos ejemplos de dichos agentes de reticulación heterobifuncionales disponibles a nivel comercial incluyen hidrazona de acetona de 6-hidrazinonicotinamida de succinimidilo (SANH), clorhidrato de 4-hidrazidotereftalato de succinimidilo (SHTH) y clorhidrato de nicotinato de hidrazinio de succinimidilo (SHNH). Los conjugados que poseen un enlazador lábil al ácido también se pueden preparar utilizando un derivado de benzodiazepina que posee hidrazina de la presente invención. Algunos ejemplos de agentes de reticulación bifuncionales que se pueden utilizar incluyen benzoato de succinimidil-p-formilo (SFB) y succinimidil-pformilfenoxiacetato (SFPA).
Los agentes de reticulación bifuncionales que permiten la unión del agente de unión celular con compuestos citotóxicos mediante enlaces disulfuro se conocen en la técnica e incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) para introducir grupos ditiopiridilo. En la técnica se conocen otros agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse para introducir grupos disulfuro y se describen en las patentes estadounidenses 6.913.748, 6.716.821 y en las publicaciones de patentes estadounidenses 20090274713 y 20100129314. Alternativamente, también se pueden utilizar agentes de reticulación como 2-iminotiolano, tiolactona de homocisteína o anhídrido de S-acetilsuccínico que introducen grupos tiol.
Un “enlazador”, un “resto enlazador” o un “grupo de unión”, según se define en la presente, se refiere a un resto que conecta dos grupos, como un agente de unión celular y un compuesto citotóxico. Típicamente, el enlazador es sustancialmente inerte en las condiciones para las cuales los dos grupos que conecta están unidos. Un agente de reticulación bifuncional puede comprender dos grupos reactivos, uno en cada extremo de un resto enlazador, de modo que se pueda hacer reaccionar primero un grupo reactivo con el compuesto citotóxico para proporcionar un compuesto que tiene el resto enlazador y un segundo grupo reactivo, que después puede reaccionar con un agente de unión celular. Alternativamente, un extremo del agente de reticulación bifuncional se puede hacer reaccionar primero con el agente de unión celular para proporcionar un agente de unión celular que posee un resto enlazador y un segundo grupo reactivo, que después puede reaccionar con un compuesto citotóxico. El resto de unión puede contener un enlace químico que permite la liberación del resto citotóxico en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles al ácido, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles a peptidasa y enlaces lábiles a esterasa (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.208.020; 5.475.092; 6.441.163; 6.716.821; 6.913.748; 7.276.497; 7.276.499; 7.368.565; 7.388.026 y 7.414.073). Se prefieren los enlaces disulfuro, enlaces lábiles a peptidasa y tioéter. Se describen también en esta invención enlazadores no escindibles, como los que se describen detalladamente en la publicación estadounidense número 20050169933 o enlazadores cargados o enlazadores hidrofílicos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976.
Se describen también en esta invención los grupos enlazadores con un grupo reactivo adjunto en un extremo, tal como un éster reactivo, seleccionado entre los siguientes: -O(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX' ', -O(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4 l)p'Y”(CR24R25)q(CO)tX”,
-O(CR20R2 i)m(alkynyl)n' (CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR41)p”Y' ' (CR24R25)q(CO)tX' ', -O(CR20R21)m(piperazino)t(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -O(CR20R21)m(pyrrolo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -O(CR20R21)mA”m<CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”,
-S(CR20R21 )m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y' ' (CR24R25)q(CO)tX' ', -S(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -S(CR20R21)m(alkynyl)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -S(CR20R21)m(piperazino)t(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p''Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -S(CR20oR21)m(pyrrolo)f(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -S(CR20R21)mA”m<CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)P''Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -NR33(C=O)p'(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p'Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -NR33(C=O)p”(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y” (CR24R25)q(CO)tX”, -NR33(C=O)p”(CR20R21)m(alkynyl)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q- (CO)tX”, -NR33(C=O)p”(CR20R21)m(piperazino)f(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”, -NR33(C=0)p”(CR20R21)m(pyrrolo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q- (CO)tX”,
-NR33(C=O)p”(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q (CO)tX”,
-(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX' ', -(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y' ' (CR24R25)q(CO)tX' ',
-(CR2oR21)m(alkynyl)n' (CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR41)p”Y' ' (CR24R25)q(CO)tX' ',
-(CR2oR2 i)m(piperazino)t(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4 i)p”Y' ' (CR24R25)q(CO)tX' ', -(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y”(CR24R25)q(CO)tX”,
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y' ' (CR24R25)q(CO)tX' ',
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n”(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y” (CR24R25)q(CO)tX”,
-(CR29=N-NR30)n”(alquinilo)n'(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p-Y"(CR24R25)q '(CO)tX”,
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n-(alquinil)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p’Y"(CR24R25)q-(CO)tX",
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n’A”m-(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p’Y"(CR24R25)q(CO)tX",
en donde:
m, n, p, q, m', n', t' son enteros entre 1 y 10, o son opcionalmente 0;
t, m”, n” y p” son 0 o 1 ;
X” se selecciona de OR36, SR37, NR38R39, en donde R36, R37, R38, R39 son H, o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono y, o, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n, R37 es, opcionalmente, un grupo protector tiol cuando t = 1, COX'' forma un éster reactivo seleccionado de ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalimida, ésteres de N-hidroxi sulfo-succinimida, ésteres de para-nitrofenilo, ésteres de dinitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo y sus derivados, en donde dichos derivados facilitan la formación de enlace amida;
Y'' está ausente o se selecciona de O, S, S-S o NR32, en donde R32 tiene la misma definición que se proporcionó anteriormente para R; o
cuando Y” no es S-S y t = 0, X” se selecciona de un grupo maleimido, un grupo haloacetilo o SR37, en donde R37 tiene la misma definición que la anterior;
A” es un residuo de aminoácido o un polipéptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos;
R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26 y R27 son los mismos o diferentes, y son -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene entre 1 y 5 átomos de carbono;
R29 y R30 son los mismos o diferentes y son -H o alquilo entre 1 y 5 átomos de carbono;
R33 es -H o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene entre 1 y 12 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol R-(OCH2CH2)n-, o R33 es -COR34, -CSR34, -SOR34 o -SO2R34, en donde R34 es H o alquilo, alquenilo, alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene entre 1 y 20 átomos de carbono o una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n; y
uno de R40 y R41 es opcionalmente un grupo funcional cargado negativa o positivamente y el otro es H o alquilo, alquenilo, alquilo que tiene entre 1 y 4 átomos de carbono.
El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos de origen natural o un aminoácido de origen no natural. En una realización, el aminoácido está representada por NH2-C(Raa’Raa)-C(=O)OH, en donde Raa y Raa’ son cada uno independientemente H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo o heterociclilo, o Raa y el átomo de nitrógeno de extremo N pueden formar juntos un anillo heterocíclico (p. ej., en la prolina). El término “residuo de aminoácido” se refiere al residuo correspondiente cuando se retira un átomo de hidrógeno del extremo carboxi y/o amina del aminoácido, como -NH-C(Raa’Raa)-C(=O)O-.
El término “catión” se refiere a un ion con carga positiva. El catión puede ser monovalente (p. ej., Na+ , K+ , etc.), bivalente (p. ej., Ca2+, Mg2+ , etc.) o multivalente (p. ej., Al3+, etc.). Preferentemente, el catión es monovalente.
El término “cantidad terapéuticamente eficaz” significa la cantidad de compuesto activo o conjugado que produce la respuesta biológica deseada en un sujeto. Dicha respuesta incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se está tratando, la prevención, la inhibición o un retraso en la recurrencia de los síntomas de la enfermedad o de la propia enfermedad, un aumento en la longevidad del sujeto en comparación con la ausencia del tratamiento, o la prevención, la inhibición o el retraso en el avance de los síntomas de la enfermedad o de la propia enfermedad. Los expertos en la técnica son capaces de determinar las cantidades eficaces, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente. Se puede determinar la toxicidad y la eficacia terapéutica del compuesto I mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares y en animales experimentales. La cantidad eficaz de compuesto o conjugado de la presente invención u otro agente terapéutico que se vaya a administrar a un sujeto dependerá de la etapa, la categoría y el estado del mieloma múltiple y las características del sujeto, como la salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia al fármaco. La cantidad eficaz de compuesto o conjugado de la presente invención u otro agente terapéutico que se vaya a administrar también dependerá de la vía de administración y la forma de dosificación. La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma del compuesto activo que sean suficientes para mantener los efectos terapéuticos deseados.
COMPUESTOS CITOTÓXICOS
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a los compuestos citotóxicos de fórmula estructural (I) o una sal P farmacéuticamente aceptable del mismo, como se describe en la reivindicación 1.
J se selecciona de "Z- F N-hidroxisuccinimida J Z éster, N--hidroxi sulfosuccinimida, éster de nitrofenilo (p. ej., 2 o 4-nitrofenilo), éster de dinitrofenilo (p. ej., 2,4-dinitrofenilo), éster de sulfo-tetraflurofenilo (p. ej., 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo) y éster de pentafluorofenilo. Más específicamente, en determinadas realizaciones, J es un éster de N-hidroxisuccinimida.
En determinadas realizaciones, ambos Ra y Rb son H; Cy para las fórmulas (B2) y es ciclohexano; y R5 es H o Me; y las variables restantes son como se describió arriba en el primer aspecto. Más específicamente, m’ en las fórmulas (B2) puede ser 0 o 1.
En una realización, Zs es -H. En otra realización, Zs es -SMe o -SPy (Py es una piridina)
En aun otra realización, Zs se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
en donde U es -H o -SO3M; y las variables restantes son como se describió arriba
En determinadas realizaciones, ambos Ra y Rb son -H y R5 es H o Me; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, -(CRaRb)m- es -(CH 2)m"-C(Me2)- y m" es un entero entre 1 y 5; las variables restantes son como se describió anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I), P es un péptido que contiene entre 2 y 10 residuos de aminoácidos; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, P es un péptido que contiene entre 2 y 5 residuos de aminoácidos; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, P se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, p-Ala-Leu-Ala-Leu y Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met y Met-Ala; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala y D-Ala-D-Ala; y las variables restantes son como se describió anteriormente. En una realización específica, para la fórmula estructural (I), la línea doble =■= entre N y C representa un enlace doble; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I), R5 es -H o alquilo (C1-C3); y las variables restantes son como se describieron anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I), la línea doble ="= entre N y C representa un enlace simple o enlace doble, con la condición de que cuando es un enlace doble X está ausente e Y es -H, y cuando es un enlace simple, X es -H, Y es -OH o -S O 3M;
Ri , R2, R3, R4 , Ri ', R2 ', R3 ' y R4 ' son todos -H;
R6 es -OMe;
X' e Y' son -H;
A y A' son -O-;
M es H, Na+ o K+ ; y las variables restantes son como se describe anteriormente.
En una realización específica, el compuesto citotóxico de la presente invención se selecciona de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000024_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde:
R100 es
M es un catión farmacéuticamente aceptable
Figure imgf000024_0002
Zs es -H, -SRd, -C(=O)Rd1 o se selecciona de las fórmulas (a1)-(a15) descritas anteriormente.
En una realización más específica, Zs se selecciona de las fórmulas (a7), (a8), (a9) y (a15). En una realización más específica, Zs está representado por la fórmula (a9). Alternativamente, Zs está representado por la fórmula (a7).
En otra realización específica, Zs es -H.
En otra moda específica, Y es -S O 3M. Alternativamente, Y es -OH.
En la presente invención también se incluyen metabolitos de cualquier compuesto citotóxico o conjugados de agente de unión celular-agente citotóxico descritos en la presente.
SÍNTESIS DE COMPUESTOS CITOTÓXICOS
Los compuestos citotóxicos de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente estadounidense N.° 8.765.740 y la publicación de solicitud estadounidense N.° 2012/0238731.
En los ejemplos 1-10 se muestran procesos representativos para preparar los compuestos dímeros citotóxicos de la presente invención.
AGENTES DE UNIÓN CELULAR
La eficacia de los conjugados de la invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente de unión celular adecuado. Los agentes de unión celular pueden ser de cualquier tipo conocido actualmente, o que se conoce, incluso péptidos y no péptidos. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (por ejemplo anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, especialmente anticuerpos monoclonales), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas (por ejemplo folato etc., que se puede unir a un receptor de la superficie celular de estos, p. ej., un receptor de folato), moléculas transporte de nutrientes (por ejemplo transferrina), o cualquier otra sustancia o molécula de unión celular.
La selección del agente de unión celular adecuado es una cuestión de elección que depende parcialmente de la población celular específica que se tomará como diana, pero en muchos casos (aunque no en todos), los anticuerpos monoclonales humanos son una buena opción si hay alguno apropiado disponible. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une específicamente al antígeno CD33 (J.D. Griffin et al., Leukemia Res., 8:521 (1984)) y se puede utilizar si las células diana expresan CD33 como en la enfermedad leucemia mielógena aguda (AML).
En determinadas realizaciones, el agente de unión celular no es una proteína. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el agente de unión celular puede ser una vitamina que se une a un receptor de vitaminas, como un receptor de superficie celular. En este sentido, la vitamina A se une a la proteína de unión a retinol (RBP) para formar un complejo, este complejo a su vez se une al receptor STRA6 con afinidad alta y aumenta la absorción de vitamina A. En otro ejemplo, el ácido fólico/folato/vitamina Bg se une al receptor de folato de superficie celular (FR), por ejemplo, FRa, con afinidad alta. El ácido fólico o los anticuerpos que se unen a FRa se pueden utilizar para dirigirse al receptor de folato expresado en tumores de ovarios y de otro tipo. Además, la vitamina D y su análogo se unen al receptor de vitamina D.
En otras realizaciones, el agente de unión celular es una proteína o un polipéptido, o un compuesto que comprende una proteína o un polipéptido, incluido un anticuerpo, una proteína no anticuerpo o un polipéptido. Preferentemente, la proteína o polipéptidos comprenden uno o más residuos Lys con grupo -N H 2 de cadena lateral. Los grupos -NH2 de cadena lateral de Lys se pueden unir por enlace covalente a los reticulantes bifuncionales que, a su vez, se unen a los compuestos dímeros de la invención, conjugando así los agentes de unión celular a los compuestos dímeros de la invención. Cada agente de unión celular basado en proteína puede contener múltiples grupos -NH2 de cadena lateral de Lys disponibles para unirse a los compuestos de la invención a través de reticulantes bifuncionales.
En una realización, GM-CSF, un ligando/factor de crecimiento que se une a las células mieloides, como un agente de unión celular a células enfermas de leucemia mielógena aguda. La IL-2 que se une a células T activadas se puede usar para la prevención del rechazo de injertos en trasplantes, para la terapia y la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped y para el tratamiento de leucemia aguda de células T. Se pueden usar MSH, que se unen a melanocitos, para el tratamiento del melanoma, así como anticuerpos dirigidos hacia melanomas. Se puede utilizar el factor de crecimiento epidérmico para dirigirse a cánceres escamosos, como el de pulmón y el de cabeza y cuello. Se puede utilizar la somatostatina para dirigirse a los neuroblastomas y otros tipos de tumores. Se puede utilizar el estrógeno (o análogos del estrógeno) para dirigirse al cáncer de mama. Se puede utilizar el andrógeno (o análogos del andrógeno) para dirigirse a los testículos.
En determinadas realizaciones, el agente de unión celular puede ser una linfocina, una hormona, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias o una molécula de transporte de nutrientes.
Se describen también en esta invención, agentes de unión celular que son miméticos de anticuerpo, como una proteína de repetición de anquirina, una centirina o una adnectina/monocuerpo.
En otras realizaciones, el agente de unión celular es un anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena simple, un fragmento de anticuerpo monoclonal (o una “parte de unión al antígeno”) que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico (o una “parte de unión al antígeno”) que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo de dominio (p. ej., sdAb) o un fragmento de anticuerpo de dominio que se une específicamente a la célula diana.
En determinadas realizaciones, el agente de unión celular es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena simple humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado (o una “parte de unión al antígeno”). En una realización específica, el anticuerpo humanizado es huMy9-6 u otro anticuerpo relacionado, que se describe en las patentes estadounidenses N.° 7.342.110 y 7.557.189. En otra realización específica, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo del receptor antifolato descrito en las solicitudes provisionales estadounidenses N.° 61/307.797, 61/346.595 y 61/413.172 y la solicitud estadounidense N.° 13/033.723 (publicada como US 2012/0009181 A1).
En determinadas realizaciones, el agente de unión celular es un anticuerpo revestido, un anticuerpo de cadena simple revestido o un fragmento de anticuerpo revestido (o una “parte de unión al antígeno”) o un anticuerpo biespecífico.
En determinadas realizaciones, el agente de unión celular es un minicuerpo, un avibody, un diacuerpo, un tricuerpo, un tetracuerpo, un nanocuerpo, un procuerpo, un anticuerpo de dominio o un unicuerpo.
En otras palabras, un agente de unión celular ejemplar puede incluir un anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena simple, un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de dominio, un fragmento de anticuerpo de dominio que se une específicamente a la célula diana, un interferón (p. ej., a, p, y ), una linfocina (p. ej., IL-2, IL-3, IL-4 e IL-6), una hormona (p. ej., insulina, hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona estimulante de melanocitos (MSH) y un hormona esteroide (p. ej., andrógeno y estrógeno)), una vitamina (p. ej., folato), un factor de crecimiento (p. ej., EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF), un factor estimulante de colonias, una molécula de transporte de nutrientes (p. ej., transferrina; véase O'Keefe et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:932-937), una centirina (un andamiaje de proteínas basado en una secuencia de consenso de repeticiones de fibronectina tipo III (FN3); véase la publicación de patente estadounidense 2010/0255056, 2010/0216708 y 2011/0274623), una proteína de repetición de anquirina (p. ej., una proteína de repetición de anquirina diseñada, conocida como DARPin; véanse las publicaciones de patentes estadounidenses N.° 2004/0132028, 2009/0082274, 2011/0118146 y 2011/0224100 y, además, véase C. Zahnd et al., Cancer Res. (2010) 70:1595-1605; Zahnd et al., J. Biol. Chem. (2006) 281(46):35167-35175; y Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A., Nature Biotechnology (2005) 23:1257-1268), una proteína de repeticiones tipo anquirina o un péptido sintético (véase, p. ej., la publicación de patente estadounidense N.° 2007/0238667; la patente estadounidense N.° 7.101.675; WO 2007/147213; y WO 2007/062466), una adnectina (una proteína de andamiaje de dominio de fibronectina; véanse las publicaciones de patentes estadounidenses N.° 2007/0082365; 2008/0139791), un avibody (incluidos los diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos; véanse las publicaciones estadounidenses N.° 2008/0152586 y 2012/0171115), moléculas de redireccionamiento receptoras dobles (DART) (P.A. Moore et al., Blood, 2011; 117(17):4542-4551; Veri MC, et al., Arthritis Rheum, 30 de marzo de 2010; 62(7):1933-43; Johnson S, et al. J Mol Biol, 9 de abril de 2010;399(3):436-49), proteína supercargadas de penetración celular (Methods in Enzymol. 502, 293-319 (2012), y otras sustancias o moléculas de unión celular.
En determinadas realizaciones, el agente de unión cellular es un factor de crecimiento o un fragmento del mismo que se une a un receptor del factor de crecimiento. También se describe en esta invención una citocina o un fragmento de la misma que se une a un receptor de citocina. En determinadas realizaciones, el receptor de factor de crecimiento es un receptor de superficie celular.
En determinadas realizaciones, cuando el agente de unión celular es un anticuerpo o una parte de unión al antígeno de este (incluidos derivados de anticuerpo) o determinados miméticos de anticuerpo, el CBA se puede unir a un ligando en la célula diana, como un ligando de superficie celular, incluido los receptores de superficie celular.
Algunos antígenos o ligandos ejemplares específicos pueden incluir renina; una hormona de crecimiento (p. ej., la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina); un factor de liberación de hormona de crecimiento; una hormona paratiroidea; una hormona estimulante de la tiroides; una lipoproteína; alfa-1-antitripsina; insulina cadena A; insulina cadena B; proinsulina; una hormona estimulante del folículo; calcitonina; una hormona luteinizante; glucagón; un factor de coagulación (p. ej., factor vmc, factor IX, factor de tejido y factor de von Willebrands); y un factor anticoagulante (p. ej., proteína C); un factor natriurético atrial; un tensioactivo pulmonar; un activador plasminógeno (p. ej., una urocinasa, orina humana o activador plasminógeno de tipo tisular); bombesina; una trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; una encefalinasa; RANTES (es decir, regulada al momento de la activación normalmente expresada y secretada por linfocitos T); proteína inflamatoria de macrófago humana-1-alfa; una albúmina sérica (albúmina sérica humana); sustancia inhibidora Muelleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; un péptido asociado con la gonadotropina de ratones; una proteína microbiana (beta-lactamasa); DNasa; IgE; un antígeno asociado con el linfocito T citotóxico (p. ej., CTLA-4); inhibina; activina; un factor de crecimiento endotelial vascular; un receptor para las hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; un factor reumatoide; un factor neurotrófico (p. ej., factor neurotrófico derivado del hueso, neurotrofina-3, -4, -5 o -6), un factor de crecimiento de nervios (p. ej., NGF-p); un factor de crecimiento derivado de plaquetas; un factor de crecimiento de fibroblastos (p. ej., aFGF y bFGF); un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2; un factor de crecimiento epidérmico; un factor de crecimiento de transformación (p. ej., TGF-alfa, TGF-p1, TGF- p2, TGF-p3, TGF-p4 y TGF-p5); factor de crecimiento de tipo insulina-I y -II; des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral); una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina; melanotransferrina; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; un receptor de EphA; un receptor de EphB; un receptor de folato; FOLR1; mesotelina; cripto; una alfavbeta6; integrinas; VEGF; VEGFR; EGFR; receptor de transferrina; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; proteínas CD (p. ej., CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD123, CD134, CD137, CD138 y CD152), uno o más antígenos asociados con tumores o receptores de superficie celular (véase la publicación estadounidense N.° 2008/0171040 o la publicación estadounidense N.° 2008/0305044); eritropoyetina; un factor osteoinductivo; una inmunotoxina; una proteína morfogénica ósea; un interferón (p. ej., interferón-alfa, -beta y -gamma); un factor estimulante de colonias (p. ej., M-CSF, GM-CSF y G-CSF); interleucinas (p. ej., IL-1 a IL-10); superóxido dismutasa; un receptor de células T; una proteína de membrana superficial; un factor de aceleración del deterioro; antígenos virales (p. ej., una parte de la envoltura del VIH); una proteína de transporte, un receptor de alojamiento; una adresina; una proteína reguladora; una integrina (p. ej., CD11a, Cü11b, CD11c, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM) un antígeno asociado con tumores (p. ej., el receptor de HER2, HER3 y HER4); endoglina; c-Met; c-kit; 1GF1R; PSGR; NGEP; PSMA; PSCA; TMEFF2; LGR5; B7H4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente.
Según se emplea en la presente, el término “anticuerpo” incluye moléculas de inmunoglobulina (Ig). En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, a saber dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera, que está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL también se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR). Intercaladas con dichas regiones se encuentran las regiones marco más conservadas (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo es IgG, IgA, IgE, IgD o IgM. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4; o IgA1 o IgA2.
En determinadas realizaciones, el agente de unión celular es una “parte de unión al antígeno” de un anticuerpo monoclonal que comparte las secuencias fundamentales para la unión al antígeno con un anticuerpo (como huMy9-6 o sus anticuerpos relacionados descritos en las patentes estadounidenses N.° 7.342.110 y 7.557.189).
Según se emplea en la presente, el término “parte de unión al antígeno” de un anticuerpo (o, a veces, se denomina indistintamente “fragmentos de anticuerpo”) incluye uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que determinados fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión al antígeno de un anticuerpo. Algunos ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término “parte de unión al antígeno” de un anticuerpo incluyen (entre otros): (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1 (p. ej., un anticuerpo digerido por papaína produce tres fragmentos: dos fragmentos Fab de unión al antígeno y un fragmento Fc que no se une al antígeno); (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra (p. ej., un anticuerpo digerido por pepsina produce dos fragmentos: un fragmento F(ab')2 de unión al antígeno bivalente y un fragmento pFc' que no se une al antígeno) y su unidad monovalente F(ab') relacionada; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1 (es decir, la parte de la cadena pesada que está incluida en el Fab); (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un grupo único de un anticuerpo y el Fv unido por enlace disulfuro relacionado; (v) un fragmento dAb (anticuerpo de dominio) o sdAb (anticuerpo de dominio simple) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. En determinadas realizaciones, la parte de unión al antígeno es un sdAb (anticuerpo de dominio simple).
En determinadas realizaciones, la parte de unión al antígeno también incluye determinados derivados modificados genéticamente o recombinantes (o “anticuerpos derivados”) que también incluyen uno o más fragmentos de un anticuerpo que mantiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno además de elementos o secuencias que es posible que no se encuentren en los anticuerpos de origen natural.
Por ejemplo, si bien los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes distintos, se pueden unir usando procedimientos recombinantes estándar mediante un enlazador sintético que permite convertirlos en una cadena proteica simple donde las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); véase, p. ej., Bird et al. Science 242:423-426, 1988: y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883, 1988).
En todas las realizaciones descritas en la presente, el extremo N de un scFv puede ser un dominio VH (es decir, N-VH-VL-C) o un dominio VL (es decir, N-VL-VH-C).
Se pueden diseñar mediante modificación genética fragmentos variables de cadena simple divalentes (o bivalentes) (discFv, bi-scFv) a través de la unión de dos scFv. Esto produce una cadena peptídica única con dos regiones VH y dos regiones VL, lo que produce un scFv en tándem (tascFv). Se pueden producir de forma similar más repeticiones en tándem, como tri-scFv, mediante la unión de tres o más scFv de forma de cabeza a cola.
En determinadas realizaciones, los scFv se pueden unir a través de péptidos enlazadores que son demasiado cortos (aproximadamente cinco aminoácidos) para que las dos regiones variables se plieguen juntas, lo que fuerza a los scFv a dimerizarse y formar diacuerpos (véase, p. ej., Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Los diacuerpos pueden ser biespecíficos o monoespecíficos. Se ha demostrado que los diacuerpos tienen constantes de disociación hasta 40 veces menores que los scFv correspondientes, es decir, que tienen una afinidad mucho mayor a la diana.
Los enlazadores más cortos (uno o dos aminoácidos) provocan la formación de trímeros o los denominados triacuerpos o tricuerpos. También se han producido tetracuerpos de forma similar. Presentan una afinidad incluso mayor por sus dianas que los diacuerpos. Los diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos se denominan, a veces, colectivamente agentes de unión celular “AVIBODY™” (o “AVIBODY” para abreviar). Es decir, los AVIBODY que tienen dos, tres o cuatro regiones de unión a la diana (TBR) son conocidos como dia, tria y tetracuerpos. Véanse, por ejemplo, las publicaciones estadounidenses N.° 2008/0152586 y 2012/0171115 para obtener detalles.
Todos estos formatos se pueden componer a partir de fragmentos variables con especificidad para dos o más antígenos diferentes y en dicho caso son tipos de anticuerpos bi o multiespecíficos. Por ejemplo, determinados di-scFv en tándem biespecíficos se conocen como captadores de linfocitos T biespecíficos (BiTE).
En determinadas realizaciones, cada scFv en el scFv en tándem o diacuerpo/triacuerpo/tetracuerpo puede tener la misma especificidad de unión o diferente, y cada uno puede tener, independientemente, un VH de extremo N o VL de extremo N.
Los Fv de cadena simple (scFv) también se pueden fusionar a un resto Fc, como el resto Fc de IgG humana para obtener propiedades similares a IgG, pero, no obstante, siguen estando codificados por un único gen. Como la producción transitoria de dichas proteínas scFv-Fc en los mamíferos puede lograr fácilmente cantidades de miligramos, este formato de anticuerpo derivado es particularmente adecuado para muchas aplicaciones de investigación.
Los Fcab son fragmentos de anticuerpo modificados genéticamente a partir de la región constante de Fc de un anticuerpo. Los Fcab se pueden expresar como proteínas solubles o se pueden modificar genéticamente para volver a ser un anticuerpo de longitud completa, como IgG, para crear mAb2. Un mAb2 es un anticuerpo de longitud completa con un Fcab en lugar de la región Fc normal. Con estos sitios de unión adicionales, los anticuerpos monoclonales biespecíficos mAb2 se pueden unir a dos dianas diferentes al mismo tiempo.
En determinadas realizaciones, los derivados de anticuerpo modificados genéticamente tienen un tamaño reducido de las proteínas recombinantes derivadas de Ig de unión al antígeno (mAb de tamaño completo “miniaturizados”), producidos mediante la remoción de los dominios que se consideran no esenciales para la función. Uno de los mejores ejemplos son los SMIP.
Un componente inmunofarmacéutico de módulo pequeño o SMIP es una proteína artificial fabricada principalmente a partir de partes de anticuerpos (inmunoglobulinas) y está diseñada para utilizar como un fármaco farmacéutico. Los SMIP tienen una semivida biológica similar a la de los anticuerpos, pero son más pequeños que los anticuerpos y, por lo tanto, pueden tener mejores propiedades de penetración tisular. Los SMIP son proteínas de cadena simple que comprenden una región de unión, una región bisagra como un conector y un dominio efector. La región de unión comprende un fragmento variable de cadena simple (scFv) modificado y el resto de la proteína se puede construir a partir del Fc (como CH2 y CH3 como el dominio efector) y la región bisagra de un anticuerpo, como IgG1. Las células modificadas genéticamente producen SMIP como dímeros similares a anticuerpos que son aproximadamente 30 % más pequeños que los anticuerpos reales.
Otro ejemplo de dicho anticuerpo miniaturizado modificado genéticamente es un “unicuerpo”, en el cual la región bisagra se ha retirado de las moléculas de IgG4. Las moléculas de IgG4 son inestables y pueden intercambiar heterodímeros de cadena ligera-pesada entre sí. La eliminación de la región bisagra evita completamente el emparejamiento cadena pesada-cadena pesada y deja heterodímeros de cadena pesada/ligera monovalentes altamente específicos, manteniendo a su vez la región Fc para garantizar la estabilidad y la semivida in vivo.
Un anticuerpo de dominio simple (sdAb, incluido, entre otros, los denominados nanocuerpos por Ablynx) es un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico. Al igual que un anticuerpo completo, es capaz de unirse de forma selectiva a un antígeno específico, pero es mucho más pequeño debido a su peso molecular de solo 12-15 kDa. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de dominio simple se modifica genéticamente a partir de anticuerpos de cadena pesada (hcIgG). El primer sdAb se modificó genéticamente basándose en un hcIgG que se encuentra en los camélidos, denominado fragmentos VhH. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de dominio simple se modifica genéticamente a partir de IgNAR (“receptor de antígenos nuevo de inmunoglobulina”, véase abajo) utilizando un fragmento Vnar. Los peces cartilaginosos (como los tiburones) tienen dichos anticuerpos IgNAR de cadena pesada. En determinadas realizaciones, el sdAb se modifica genéticamente mediante la división de los dominios variables diméricos de la inmunoglobulina G común (IgG), como la de los seres humanos o los ratones, en los monómeros. En determinadas realizaciones, un nanocuerpo se deriva de un dominio variable de cadena pesada. En determinadas realizaciones, un nanocuerpo se deriva de un dominio variable de cadena ligera. En determinadas realizaciones, el sdAb se obtiene mediante el análisis de bibliotecas de secuencias de cadena pesada de dominio simple (p. ej., HC de dominio simple humana) para los aglutinantes para un antígeno diana.
Se derivan fragmentos de anticuerpo de dominio de receptor de antígenos nuevo variable simple (Vnars o dominios Vnar ) de anticuerpos de receptor de antígenos nuevo de inmunoglobulina (IgNAR) de peces cartilaginosos (p. ej., el tiburón). Al ser uno de los andamiajes de proteínas basados en inmunoglobulina conocidos más pequeños, dichas proteínas de dominio simple demuestran un tamaño y propiedades de reconocimiento de epítopo críptico favorables. Los anticuerpos IgNAR maduros consisten en homodímeros de un dominio de receptor de antígenos nuevo (Vnar) y cinco dominios de receptor de antígenos nuevos constantes (Cnar). Esta molécula es altamente estable y posee características de unión eficaces. Su estabilidad inherente se puede atribuir, probablemente, a (i) el andamiaje de Ig subyacente, que presenta una cantidad considerable de residuos expuestos a superficies hidrofílicas y cargados en comparación con los dominios VH y VL de anticuerpos convencionales que se encuentran en los anticuerpos murinos; y (ii) las características estructurales estabilizantes en los bucles de la región determinante de complementariedad (CDR) incluidos los puentes de disulfuro entre bucles y los patrones de los puentes de hidrógeno intrabucles.
Un minicuerpo es un fragmento de anticuerpo modificado genéticamente que comprende un scFv unido a un dominio CH, como el CH3y1 (dominio CH3 de IgG1) o CH4e (dominio CH4 de IgE). Por ejemplo, se ha vinculado un scFv específico para el antígeno carcinoembrionario (CEA) con el CH3y1 para crear un minicuerpo, que antes se había demostrado que presentaba un direccionamiento tumoral excelente unido con depuración rápida in vivo (Hu et al., Cáncer Res. 56:3055-3061, 1996). El scFv puede tener un VH o un VL de extremo N. La unión puede ser un péptido corto (p. ej., un enlazador de dos aminoácidos, como ValGlu) que produce un minicuerpo sin bisagra, no covalente. Alternativamente, la unión puede ser una bisagra IgG1 y un péptido enlazador GlySer que produce un minicuerpo de bisagra, covalente.
Los anticuerpos naturales son monoespecíficos, pero bivalentes, en el hecho de que expresan dos dominios de unión al antígeno idénticos. Contrariamente, en determinadas realizaciones, ciertos derivados de anticuerpos modificados genéticamente son moléculas bi o multiespecíficas que poseen dos o más dominios de unión al antígeno diferentes, cada uno con especificidad de diana diferente. Los anticuerpos biespecíficos se pueden generar mediante la fusión de dos células productoras de anticuerpos, cada una con especificidad distinta. Estos “cuadromas” produjeron múltiples especies moleculares porque las dos cadenas ligeras distintas y las dos cadenas pesadas distintas estaban libres para recombinarse en los cuadromas en configuraciones múltiples. Desde entonces, se han generado Fab biespecíficos, scFv y mAb de tamaño completo utilizando diversas tecnologías (véase arriba).
La proteína de inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD-Ig) es un tipo de IgG específica doble que se direcciona simultáneamente a dos antígenos/epítopos (DiGiammarino et al., Methods Mol Biol. 899:145-56, 2012). La molécula contiene una región Fc y regiones constantes en una configuración similar a una IgG convencional. Sin embargo, la proteína DVD-Ig es única en el hecho de que cada grupo de la molécula contiene dos dominios variables (VD). Los VD dentro de un grupo están unidos en tándem y pueden poseer diferentes especificidades de unión.
Las moléculas derivadas de anticuerpos triespecíficos también se pueden generar, por ejemplo, mediante la expresión de anticuerpos biespecíficos con dos Fab distintos y un Fc. Un ejemplo es un anti-Ep-CAM de IgG2a de ratón, cuadroma anti-CD3 de IgG2b de rata, denominado BiUII, que se cree que permite la colocalización de las células tumorales que expresan Ep-CAM, linfocitos T que expresan CD3 y macrófagos que expresan FCyRI, que potencian así las funciones coestimulante y antitumoral de las células inmunitarias.
Los procuerpos son anticuerpos monoclonales enmascarados, completamente recombinantes que permanecen inertes en el tejido sano, pero que se activan específicamente en el microambiente de enfermedad (p. ej., mediante la escisión de proteasa por una proteasa enriquecida o específica en un microambiente de enfermedad). Véase Desnoyers et al., Sci Transl Med, 5:207ra144, 2013. Se pueden utilizar técnicas de enmascaramiento similares para cualquiera de los anticuerpos o partes de unión al antígeno de estos descritos en la presente.
Un intracuerpo es un anticuerpo que se ha modificado para la localización intracelular, para trabajar dentro de la célula para unirse a un antígeno intracelular. El intracuerpo puede permanecer en el citoplasma o puede tener una señal de localización nuclear o puede tener una secuencia KDEL para el direccionamiento al ER. El intracuerpo puede ser un anticuerpo de cadena simple (scFv), dominios VL de inmunoglobulina modificada con hiperestabilidad, un anticuerpo seleccionado resistente al ambiente intracelular más reductor o expresado como una proteína de fusión con la proteína de unión a la maltosa u otras proteínas intracelulares estables. Dichas optimizaciones han mejorado la estabilidad y la estructura de los intracuerpos y pueden tener aplicabilidad general a cualquiera de los anticuerpos o partes de unión al antígeno de estos descritos en la presente.
Las partes de unión al antígeno o los anticuerpos derivados de la invención pueden tener (1) regiones CDR3 de cadena ligera y/o cadena pesada; (2) regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera y/o cadena pesada; o (3) regiones de cadena ligera y/o cadena pesada sustancialmente iguales o idénticas, en comparación con un anticuerpo a partir del cual se derivan/se modifican genéticamente. Las secuencias dentro de estas regiones pueden contener sustituciones de aminoácidos conservadoras, incluido sustituciones dentro de las regiones CDR. En determinadas realizaciones, no hay más de 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones conservadoras. En una alternativa, las partes de unión al antígeno o los anticuerpos derivados tienen una región de cadena ligera y/o una región de cadena pesada que son al menos aproximadamente el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 100 % idénticas a un anticuerpo a partir del cual se derivan/modifican genéticamente. Estas partes de unión al antígeno o anticuerpos derivados pueden tener sustancialmente la misma especificidad de unión y/o afinidad por el antígeno diana en comparación con el anticuerpo. En determinadas realizaciones, los valores de Kd y/o koff de las partes de unión al antígeno o anticuerpos derivados se encuentran dentro de 10 veces (mayor o menor), 5 veces (mayor o menor), 3 veces (mayor o menor) o 2 veces (mayor o menor) que los de un anticuerpo descrito en la presente.
En determinadas realizaciones, las partes de unión al antígeno o los anticuerpos derivados se pueden derivar/modificar genéticamente de anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos y se pueden producir de acuerdo con cualquier procedimiento reconocido en la técnica.
Las técnicas de anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes de unión celular extremadamente específicos en forma de anticuerpos monoclonales específicos. En la técnica, se conocen particularmente los procedimientos para crear anticuerpos monoclonales producidos mediante la inmunización de ratones, ratas, hámsteres o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés como la célula diana intacta, antígenos aislados de la célula diana, virus completos, virus completos atenuados y proteínas virales como las proteínas de recubrimiento viral. También se pueden utilizar células humanas sensibilizadas. Otro procedimiento para crear anticuerpos monoclonales es el uso de bibliotecas de fagos de scFv (región variable de cadena simple), específicamente scFv humano (véanse, p. ej., Griffiths et al., las patentes estadounidenses N.° 5.885.793 y 5.969.108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587). Además, también se pueden utilizar los anticuerpos revestidos descritos en la patente estadounidense N.° 5.639.641, así como los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos humanizados.
El agente de unión celular también puede ser péptidos derivados de la expresión en fagos (véase, por ejemplo, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (2011) 108(17), 6909-6914) o las técnicas de biblioteca de péptidos (véase, por ejemplo, Dane et al., Mol. Cancer. Ther. (2009) 8(5):1312-1318).
En determinadas realizaciones, el CBA de la invención también incluye un mimético de anticuerpo, como un DARPin, un aficuerpo, una afilina, una afitina, una anticalina, un avímero, un fynomer, un péptido de dominio Kunitz, un monocuerpo o una nanofitina.
Según se emplean en la presente, los términos “DARPin” y “proteína de repetición de anquirina (diseñada)” se utilizan indistintamente para hacer referencia a determinadas proteínas miméticas de anticuerpo modificadas genéticamente que típicamente presentan unión al a diana preferencial (a veces, específica). La diana puede ser una proteína, carbohidrato u otras entidades químicas y la afinidad de unión puede ser bastante alta. Las DARPin se pueden derivar de proteínas que contienen repeticiones de anquirina naturales y, preferentemente, consisten en al menos tres, generalmente, cuatro o cinco motivos de repetición de anquirina (por lo general aproximadamente 33 residuos en cada motivo de repetición de anquirina) de estas proteínas. En determinadas realizaciones, una DARPin contiene aproximadamente cuatro o cinco repeticiones, y puede tener una masa molecular de aproximadamente 14 o 18 kDa, respectivamente. Se pueden generar bibliotecas de DARPin con residuos de interacción de diana potencial aleatorizada con diversidades de más de 1012 variantes a nivel del ADN para utilizar en la seleccionar de las DARPin que se unen a las dianas deseadas (p. ej., que actúan como agonistas o antagonistas del receptor, agonistas inversos, inhibidores de enzimas o aglutinantes de proteínas diana simples) con especificidad y afinidad picomolar, utilizando diversas tecnologías como la expresión de ribosoma o la expresión en fagos de la partícula de reconocimiento de señales (SRP). Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes estadounidenses N.° 2004/0132028, 2009/0082274, 2011/0118146 y 2011/0224100, WO 02/20565 y WO 06/083275 para la preparación de DARPin y véase también C. Zahnd et al. (2010) Cancer Res., 70:1595-1605; Zahnd et al. (2006) J. Biol. Chem, 281(46):35167-35175; y Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23:1257-1268. Véase también la publicación de patente estadounidense N.° 2007/0238667; la patente estadounidense N.° 7.101.675; WO 2007/147213; y WO 2007/062466, para el péptido sintético o las proteínas de repeticiones similares a la anquirina relacionados.
Las moléculas de aficuerpo son proteínas pequeñas modificadas genéticamente para unirse a una gran cantidad de proteínas o péptidos diana con afinidad alta, imitando así a los anticuerpos monoclonales. Un aficuerpo consiste en tres hélices alfa con 58 aminoácidos y tiene una masa molar de aproximadamente 6 kDa. Se ha demostrado que soportan temperaturas altas (90 °C) o condiciones ácidas y alcalinas (pH 2,5 o pH 11) y se han obtenido aglutinantes con una afinidad que llega al intervalo subnanomolar de selecciones de bibliotecas sin tratamiento y se han obtenido aglutinantes con afinidad picomolar después de la maduración por afinidad. En determinadas realizaciones, los aficuerpos se conjugan con electrófilos débiles para unirse a las dianas de forma covalente.
Los monocuerpos (también denominados adnectinas) son proteínas miméticas de anticuerpo modificadas genéticamente capaces de unirse a antígenos. En determinadas realizaciones, los monocuerpos consisten en 94 aminoácidos y tienen una masa molecular de aproximadamente 10 kDa. Se basan en la estructura de la fibronectina humana, más específicamente en su décimo dominio tipo III extracelular, que tiene una estructura similar a los dominios variables de anticuerpo, con siete láminas beta que forman un barril y tres bucles expuestos a cada lado correspondientes a las tres regiones determinantes de complementariedad. Los monocuerpos con especificidad para diferentes proteínas se pueden diseñar mediante la modificación de los bucles BC (entre la segunda y la tercera lámina beta) y FG (entre la sexta y la séptima lámina).
Un tricuerpo es un mimético de anticuerpo de autoensamblaje diseñado basándose en la región de hélice superenrollada de extremo C de la proteína de la matriz de cartílago (CMP) de ratón y humana, que se autoensambla en un complejo trimérico paralelo. Es un ligando de direccionamiento trimérico altamente estable creado mediante la fusión de un resto de unión a la diana específico con el dominio de trimerización derivado de CMP. Las proteínas de fusión resultantes se pueden autoensamblar de forma eficaz en un homotrímero paralelo bien definido con estabilidad alta. Los análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) de los ligandos de direccionamiento triméricos demostraron una fuerza de unión a la diana significativamente mejorada en comparación con los monómeros correspondientes. Los estudios de unión celular confirmaron que dichos tricuerpos tienen fuerza de unión superior hacia sus respectivos receptores.
Una centirina es otro mimético de anticuerpo que se puede obtener utilizando una biblioteca construida sobre el marco de una secuencia de dominio FN3 de consenso (Diem et al., Protein Eng Des. Sel., 2014). Esta biblioteca emplea posiciones diversificadas dentro de la cadena C, bucle CD, cadena F y bucle FG del dominio FN3 y se pueden seleccionar variantes de la centirina de afinidad alta contra las dianas específicas.
En una realización, el agente de unión celular es un anticuerpo del receptor anti-folato. Más específicamente, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a un receptor 1 de folato humano (también conocido como receptor de folato alfa (FR-a)). Los términos "receptor 1 de folato humano", "FOLR1" o "receptor de folato alfa (FR-a)", tal como se usa en la presente, se refieren a cualquier FOLR1 humano natural, a menos que se indique lo contrario. Por lo tanto, todos estos términos se pueden referir ya sea a una secuencia de ácido nucleico o proteína tal como se indica en la presente. El término "FOLR1" comprende FOLR1 “de longitud completa” no procesado, así como también cualquier forma de FOLR1 que resulte del procesamiento dentro de la célula. El anticuerpo FOLR1 comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (SEQ ID NO: 1); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaa-iFxaa2Xaa3(SEQ ID NO: 2); y una Cd R3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 3); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 4); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (SEQ ID NO: 5); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (SEQ ID NO: 6); en donde Xaa1 se selecciona de K, Q, H y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N y R; y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. Preferentemente, la secuencia CDR2 de cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7).
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al receptor 1 de folato humano que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTA HMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 8).
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este codificado por el ADN de plásmido depositado con ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene números de depósito de ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al receptor 1 de folato humano que comprende la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISP VEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:9);o DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISP VEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQEKSGTASVVCEENNFYPREAKVQWKVDNAEQS GNSQESVTEQDSKDSTYSESSTETESKADYEKHKVYACEVTHQGESSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 10).
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al anticuerpo de este que se une específicamente al receptor 1 de folato humano que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 8, y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Preferentemente, el anticuerpo comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y la cadena ligera que tiene secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (hu FOLR1).
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este codificado por el ADN de plásmido depositado con ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene números de depósito de ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente el receptor 1 de folato humano y que comprende un dominio variable de cadena pesada al menos el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 100 % idéntico a QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTA HMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAM DYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11), y un dominio variable de cadena ligera al menos el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 100 % idéntico a DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISP VEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEI KR (SEQ ID NO: 12); o DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISP VEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEI KR (SEQ ID NO: 13).
En otra realización, el anticuerpo del receptor anti-folato es huMov19 o M9346A (véase, por ejemplo, la patente estadounidense 8.709.432, la patente estadounidense N.° 8.557.966 y WO2011106528).
En otra realización, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de anticuerpo de este. En una realización, el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo no antagonista, incluido, por ejemplo, los anticuerpos descritos en WO2012058592. En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo no funcional, por ejemplo, ML66 humanizado o EGFR-8. Más específicamente, el anticuerpo anti-EGFR es huML66.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-EGFR que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Tal como se utiliza en la presente, las secuencias con doble subrayado representan las regiones variables (es decir, región variable de cadena pesada o HCVR, y región variable de cadena ligera o LCVR) de las secuencias de cadena pesada o ligera, mientras que las secuencias en negrita representan las regiones CDR (es decir, de extremo N a extremo C, CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de las secuencias de cadena pesada o cadena ligera).
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En aun otra realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 14, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 15, y preferentemente se une específicamente a EGFR.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 14, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100% idéntica a SEQ ID NO: 15, y preferentemente que se une específicamente a EGFR.
En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR son los anticuerpos descritos en 8.790.649 y WO 2012/058588. En una realización, el anticuerpo anti-EGFR es anticuerpo huEGFR-7R.
En una realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de
OVOLVOSGAEVAKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMOWVKORPGOGEEGIGTIYPGDGDTTYTOKFOGKATLTADKSSST AYMOLSSLRSEDSAVYYCARYDAPGYAMDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAAEGGEVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:16) y una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASODINNYLAWYOHKPGKGPKEEIHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPE DIATYYCLOYDNLLYTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQEKSGTASVVCEENNFYPREAKVQWKVDNAEQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSESSTETESKADYEKHKVYACEVTHQGESSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:17), o una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de DIOMTOSPSSESASVGDRVTITCKASODINNYLAWYOHKPGKGPKEEIHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPE DIATYYGLOYDNLLYTFGOGTKEEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:18).
En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:16 y una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:17.
En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:16 y una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:18.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 16, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 17 o 18, y preferentemente se une específicamente a EGFR.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-EGFR comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 16, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 17 o 18, y preferentemente que se une específicamente a EGFR.
En otra realización, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-CD19, por ejemplos los descritos en la patente estadounidense N.° 8.435.528 y WO2004/103272. En una realización, el anticuerpo anti-CD19 comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTST AYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19) y una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYSLTISSMEP EDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:20).
En otra realización, el anticuerpo anti-CD19 es anticuerpo huB4.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD19 comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 19, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 20, y preferentemente se une específicamente a CD19.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD19 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 19, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100% idéntica a SEQ ID NO: 20, y preferentemente que se une específicamente a CD19.
En aun otra realización, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-Muc1, por ejemplo, los descritos en la patente estadounidense N.° 7.834.155, WO 2005/009369 y WO 2007/024222, incorporadas a la presente mediante esta referencia. En una realización, el anticuerpo anti-Muc1 comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de QAOLVOSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKOTPGOGLEWIGYIYPGNGATNYNOKFOGKATLTADTSSST AYMOISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGOGTLVTVSAASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAAEGCEVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:21) y una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de EIVLTOSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFOOKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCOORSSFPLTFGAGTKEELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ ESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:22).
En otra realización, el anticuerpo anti-Muc1 es anticuerpo huDS6.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-Muc1 comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 21, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 22, y preferentemente se une específicamente a Muc1.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-Muc1 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 21, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100% idéntica a SEQ ID NO: 22, y preferentemente que se une específicamente a Muc1.
En otra realización, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-CD33 o fragmento de este, por ejemplo los anticuerpos o fragmentos de estos descritos en las patentes estadounidenses N.° 7.557.189, 7.342.110, 8.119.787, 8.337.855 y WO2004/043344. En otra realización, el anticuerpo anti-CD33 es anticuerpo huMy9-6.
En una realización, el anticuerpo anti-CD33 comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de OVOLOOPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKOTPGOGLEWVGVIYPGNDDISYNOKFOGKATLTADKSSTTA YMOLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGOGTTVTVSS_ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAAEGCEVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVUHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVUDSDGSFFUYSKUTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEAUHNHYTQKSUSUSPG (SEQ ID NO:23) y una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de EIVLTOSPGSLAVSPGERVTMSCKSSOSVFFSSSOKNYUAWYOOIPGOSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT ISSVOPEDUAIYYCHOYUSSRTFGOGTKEEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQEKSGTASVVCEENNFYPREAKVQWKVDNAEQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSESSTETESKADYEKHKVYACEVTHQGESSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO:24).
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD33 comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 23, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 24, y preferentemente se une específicamente a CD33.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD33 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 23, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100% idéntica a SEQ ID NO: 24, y preferentemente que se une específicamente a CD33.
En otra realización, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-CD37 o fragmento de anticuerpo de este, por ejemplo los descritos en la patente estadounidense N.° 8.765.917 y WO 2011/112978. En una realización, el anticuerpo anti-CD37 es anticuerpo huCD37-3.
En una realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de DIOMTOSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYOOKPGKSPKELVNVATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLOP EDFGTYYCOHYWGTTWTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:25) y una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de OVOVOESGPGLVAPSOTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVROPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSOVF LKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGGLVKDYFPEPVTVSWNS GAETSGVHTFPAVEQSSGEYSESSVVTVPSSSEGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEEEGGPS VFEFPPKPKDTEMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVETVEHQDWENGK EYKCKVSNKAEPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTEPPSRDEETKNQVSETCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV EDSDGSFFEYSKETVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAEHNHYTQKSESESPG (SEQ ID NO:26), o una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de OVOVOESGPGEVAPSOTESITCTVSGFSETTSGVSWVROPPGKGEEWEGVIWGDGSTNYHSSEKSRESIKKDHSKSOV FEKENSETAADTATYYCAKGGYSLAHWGOGTEVTVSS_ASTKGPSVFPEAPSSKSTSGGTAAEGGEVKDYFPEPVTVS WNSGAETSGVHTFPAVEQSSGEYSESSVVTVPSSSEGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEEE GGPSVFEFPPKPKDTEMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVETVEHQDW ENGKEYKCKVSNKAEPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTEPPSRDEETKNQVSETCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVEDSDGSFFEYSKETVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAEHNHYTQKSESESPG (SEQ ID NO:27)
En otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:25 y una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:26.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:25 y una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:27.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 26 o 27, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 25, y preferentemente se une específicamente a CD37.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 26 o 27, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 25, y preferentemente que se une específicamente a CD37.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende una región de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de EIVLTOSPATMSASPCERVTMTCSATSSVTYMHWYOOKPGOSPKRWIYDTSNLPYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEA EDAATYYCOOWSDNPPTFGOGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO:28) y una región de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de OVOLOESGPGLLKPSOSLSLTCTVSGYSITSGFAWHWIROHPGNKLEWMGYILYSGSTVYSPSLKSRISITRDTSKNHFFL OLNSVTAADTATYYCARGYYGYGAWFAYWGOGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:29).
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende la CDR1-CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 29, y/o la CDR1-CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 28, y preferentemente se une específicamente a CD37.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada (HCVR) al menos el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 29, y/o una secuencia de región variable de cadena ligera (LCVR) al menos el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100% idéntica a SEQ ID NO: 28, y preferentemente que se une específicamente a CD37.
En aun otra realización, el anticuerpo anti-CD37 es anticuerpo huCD37-50.
CONJUGADOS DE AGENTE DE UNIÓN CELULAR-FÁRMACO
La presente invención proporciona también conjugados de agente de unión celular-fármaco que comprende un agente de unión celular unido a uno o más compuestos citotóxicos de la presente invención a través de una variedad de enlazadores como se define en la reivindicación 9.
En determinadas realizaciones, ambos Ra y Rb son H; Cy para la fórmula (B2') es ciclohexano; y R5 es H o Me; y las variables restantes son como se describió anteriormente en el Segundo aspecto. Más específicamente, m' en la fórmula (B2') puede ser 0 o 1.
En determinadas realizaciones, ambos Ra y Rb son -H y R5 es H o Me; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, -(CRaRb)m- es -(CH 2)m"-C(Me2)- y m" es un entero entre 1 y 5; las variables restantes son como se describió anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I'), P es un péptido que contiene entre 2 y 10 residuos de aminoácidos; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, P es un péptido que contiene entre 2 y 5 residuos de aminoácidos; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, P se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, p-Ala-Leu-Ala-Leu y Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En determinadas realizaciones, P es Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala y D-Ala-D-Ala; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I'), la línea doble =■= entre N y C representa un enlace doble;
y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I'), R5 es -H o alquilo (C1-C3); y las variables restantes son como se describieron anteriormente.
En una realización específica, para la fórmula estructural (I'), la línea doble ="= entre N y C representa un enlace simple o enlace doble, con la condición de que cuando es un enlace doble X está ausente e Y es -H, y cuando es un enlace simple, X es -H, Y es -OH o -S O 3M;
Ri, R2, R3, R4, Ri', R2', R3' y R4' son todos -H;
R6 es -OMe;
X' e Y' son -H;
A y A' son -O-;
M es H, Na+ o K+; y las variables restantes son como se describió anteriormente.
En una realización específica, el conjugado de la presente invención está representado por cualquiera de las siguientes fórmulas estructurales:
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o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde:
r es un entero entre 1 y 10 ; y
M es un catión farmacéuticamente aceptable (p. ej., H+, Na+ o K+).
Más específicamente, Y es -SO 3M. Alternativamente, Y es -OH.
En determinadas realizaciones, los conjugados descritos en la presente pueden comprender 1-10 compuestos citotóxicos, 2-9 compuestos citotóxicos, 3-8 compuestos citotóxicos, 4-7 compuestos citotóxicos o 5-6 compuestos citotóxicos, donde cada compuesto citotóxico comprende el grupo enlazador que enlaza el compuesto citotóxico al CBA, y cada compuesto citotóxico en el conjugado es el mismo.
En cualquiera de las realizaciones de conjugados el agente de unión celular se puede unir a células diana seleccionadas de células tumorales, células infectadas con virus, células infectadas con microorganismos, células infectadas con parásitos, células autoinmunes, células activadas, células mieloides, células T activadas, células B o melanocitos; células que expresan la CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA, o antígenos Her-2; antígenos Her-3; o células que expresan receptor del factor de crecimiento de insulinas, receptor del factor de crecimiento epidérmico y receptor de folato.
En cualquiera de las realizaciones de conjugados el agente de unión celular puede ser un anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena simple o un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo de dominio, un fragmento de anticuerpo de dominio que se une específicamente a la célula diana, una linfocina, una hormona, una vitamina, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias o una molécula de transporte de nutrientes.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo revestido, un anticuerpo de cadena simple revestido o un fragmento de anticuerpo revestido.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena simple o un fragmento de anticuerpo monoclonal de este.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena simple humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado.
En cualquiera de las realizaciones de conjugados anteriores el agente de unión celular puede ser un anticuerpo del receptor anti-folato o un fragmento de anticuerpo de este. Más específicamente, el anticuerpo del receptor anti-folato es anticuerpo huMOV19.
Alternativamente, en cualquiera de las realizaciones de conjugados anteriores el agente de unión celular puede ser un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de anticuerpo de este. En una realización, el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo no antagonista, incluido, por ejemplo, los anticuerpos descritos en WO2012058592. En otra realización, el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo no funcional, por ejemplo, ML66 humanizado. Más específicamente, el anticuerpo anti-EGFR es huML66.
La invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los conjugados descritos en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona adicionalmente un conjugado que comprende cualquiera de los compuestos en cuestión unidos a un agente de unión celular.
La invención además proporciona un compuesto del primer aspecto o un conjugado del segundo aspecto para su uso en un procedimiento para inhibir el crecimiento celular anormal o tratar un trastorno proliferativo, un trastorno autoinmune, trastorno óseo destructivo, enfermedad infecciosa, enfermedad viral, enfermedad fibrótica, trastorno neurodegenerativo, pancreatitis o enfermedad renal en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos (con o sin grupo enlazador) o los conjugados de la invención y, opcionalmente, un segundo agente quimioterapéutico.
En determinadas realizaciones, el segundo agente quimioterapéutico se administra al mamífero secuencial o consecutivamente.
En determinadas realizaciones, el procedimiento es para tratar una afección seleccionada de cáncer, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de injerto versus huésped (GVHD), rechazo de trasplante, lupus, miositis, infección e inmunodeficiencia.
En determinadas realizaciones, el procedimiento o conjugado es para tratar cáncer.
En determinadas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido. Más específicamente, el cáncer es cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cuello uterino, melanoma, cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)), cáncer de mama, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, cáncer de próstata, cáncer endometrial, linfoma (p. ej., linfoma no Hodgkin), síndrome mielodisplásico (MDS), cáncer peritoneal o leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda (AML), leucemia monocítica aguda, leucemia promielocítica, leucemia eosinofílica, leucemia linfoblástica aguda (p. ej., B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mieloide crónica (CML)).
PRODUCCIÓN DE CONJUGADOS DE AGENTE DE UNIÓN CELULAR-FÁRMACO
Para enlazar los compuestos citotóxicos o un derivado de estos de la presente invención al agente de unión celular, el compuesto citotóxico puede comprender un resto enlazador con un grupo reactivo unido a este, por ejemplo el compuesto 14 (ejemplo 1), 23 (ejemplo 2), 35 (ejemplo 3), 49 (ejemplo 4), 80 (ejemplo 5) o 90 (ejemplo 6). Estos compuestos pueden estar unidos directamente al agente de unión celular. En los ejemplos 11, 13, 15-17 y 20 se describen procesos representativos para enlazar los compuestos citotóxicos que tienen un grupo reactivo unido a estos con el agente de unión celular para producir los conjugados de agente de unión celular-agente citotóxico.
Un reactivo de reticulación bifuncional primero se puede hacer reaccionar con el compuesto citotóxico para proporcionar el compuesto que presenta un resto enlazador con un grupo reactivo unido a este (es decir, compuesto de fármacoenlazador), que luego puede reaccionar con un agente de unión celular. Alternativamente, un extremo del reactivo de reticulación bifuncional primero puede reaccionar con el agente de unión celular para proporcionar el agente de unión celular que presenta un resto enlazador con un grupo reactivo unido a este, que luego puede reaccionar con un compuesto citotóxico. El resto de unión puede contener un enlace químico que permite la liberación del resto citotóxico en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles al ácido, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles a peptidasa y enlaces lábiles a esterasa (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.208.020; 5.475.092; 6.441.163; 6.716.821; 6.913.748; 7.276.497; 7.276.499; 7.368.565; 7.388.026 y 7.414.073). Se prefieren los enlaces disulfuro, enlaces lábiles a peptidasa y tioéter. Otros enlazadores descritos en esta invención incluyen enlazadores no escindibles, como los que se describen detalladamente en la publicación estadounidense número 2005/0169933 o enlazadores cargados o enlazadores hidrofílicos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976.
Una solución de un agente de unión celular (p. ej., un anticuerpo) en amortiguador acuoso se puede incubar con un exceso molar de un agente de reticulación bifuncional, por ejemplo N-succinimidil-4-(2-pindilditio)pentanoato (SPP), N -succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), N -succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) para introducir grupos ditiopiridilo. El agente de unión celular modificado (p. ej., anticuerpo modificado) luego se hace reaccionar con el compuesto citotóxico que contiene tiol descrito en la presente, por ejemplo el compuesto 98 o 99 (ejemplos 9 y 10), para producir un conjugado de agente de unión celular-agente citotóxico unido a disulfuro de la presente invención.
En otra realización, el compuesto citotóxico que contiene tiol descrito en la presente, por ejemplo el compuesto 98 o 99, puede reaccionar con un agente de reticulación bifuncional tal como N -succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP), N -succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), N -succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) para formar un compuesto de agente citotóxico-enlazador, que luego puede reaccionar con un agente de unión celular para producir un conjugado de agente de unión celular-agente citotóxico unido a disulfuro de la presente invención. El compuesto de agente citotóxico-enlazador se puede preparar in situ sin purificación antes de la reacción con el agente de unión celular. Los ejemplos 12 y 18 describen un proceso representativo. Alternativamente, el compuesto de agente citotóxico-enlazador se puede purificar antes de la reacción con el agente de unión celular.
El conjugado de agente de unión celular-agente citotóxico se puede purificar utilizando cualquier procedimiento de purificación conocido en la técnica, por ejemplo los descritos en la patente estadounidense N.° 7.811.572 y la publicación estadounidense N.° 2006/0182750. Por ejemplo, el conjugado de agente de unión celular-agente citotóxico se puede purificar utilizando filtración de flujo tangencial, cromatografía de adsorción, filtración de adsorción, precipitación selectiva, filtración de no adsorción o combinación de estos. Preferentemente, se utiliza filtración de flujo tangencial (TFF, también llamada filtración de flujo cruzado, ultrafiltración y diafiltración), y/o resinas de cromatografía de adsorción para la purificación de los conjugados.
Alternativamente, el agente de unión celular (p. ej., un anticuerpo) se puede incubar con un exceso molar de un agente de modificación de anticuerpo tal como 2-iminotiolano, L-homocisteína tiolactona (o derivados) o N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) para introducir grupos sulfidrilo. El anticuerpo modificado luego se hace reaccionar con el agente citotóxico que contiene disulfuro adecuado para producir un conjugado de anticuerpo-agente citotóxico unido a disulfuro. El conjugado anticuerpo-agente citotóxico luego se puede purificar a través de los procedimientos descritos anteriormente. El agente de unión celular también se puede modificar para introducir restos tiol, por ejemplo los anticuerpos modificados con cisteína descritos en las patentes estadounidenses N.° 7.772485 y 7,855.275.
Una solución de un agente de unión celular (p. ej., un anticuerpo) en amortiguador acuoso se puede incubar con un exceso molar de un agente de modificación de anticuerpo tal como N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1-carboxilato para introducir grupos maleimido, o con N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB) para introducir grupos yodoacetilo. El agente de unión celular modificado (p. ej., anticuerpo modificado) luego se hace reaccionar con el agente citotóxico que contiene tiol para producir un conjugado de agente de unión celular-agente citotóxico unido a tioéter. El conjugado luego se puede purificar a través de los procedimientos descritos anteriormente.
El número de moléculas citotóxicas unidas por molécula de anticuerpo se puede determinar de forma espectrofotométrica mediante la medición de la proporción de la absorbancia en 280 nm y 330 nm. Un promedio de 1-10 compuestos citotóxicos/moléculas de anticuerpo se puede unir a través de los procedimientos descritos en la presente. El número promedio preferido de compuestos citotóxicos unidos por molécula de anticuerpo es 2-5 y el más preferido es 2,5-4,0.
En 8.765.740 y la publicación de solicitud estadounidense N.° 2012/0238731 se describen procesos representativos para preparar los conjugados de agente de unión celular-fármaco de la presente invención.
CITOTOXICIDAD DE COMPUESTOS Y CONJUGADOS
Se pueden evaluar los compuestos citotóxicos y los conjugados de agente de unión celular-fármaco de la invención en cuanto a su capacidad de suprimir la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer in vitro. Por ejemplo, se pueden utilizar líneas celulares tales como línea celular KB del carcinoma cervical humano, línea celular THP-1 de leucemia monocítica aguda humana, línea celular HL60 de leucemia promielocítica humana, línea celular HNT-34 de leucemia mieloide aguda humana, para la evaluación de citotoxicidad de estos compuestos y conjugados. Las células que se evaluarán se pueden exponer a los compuestos o los conjugados durante 1-5 días y las fracciones supervivientes de células se pueden medir en ensayos directos a través de los procedimientos conocidos. Se pueden calcular los valores de IC50 a partir de los resultados de los ensayos. Además o alternativamente, se puede utilizar un ensayo de sensibilidad de línea celular in vitro, como el que describe el Instituto Nacional del Cáncer de EUA (véase Voskoglou-Nomikos et al., 2003, Clinical Cáncer Res. 9: 42227-4239) como una de las guías para determinar los tipos de cáncer que pueden ser sensibles al tratamiento con los compuestos o conjugados de la invención.
En las figuras 2 y 4 se muestran ejemplos de potencia in vitro y especificidad diana de los conjugados de anticuerpoagente citotóxico de la presente invención. Todos los conjugados son extremadamente citotóxicos en las células cancerosas positivas del antígeno con un IC50 en el intervalo picomolar bajo. Las líneas celulares negativas del antígeno permanecen viables cuando se exponen a los mismos conjugados.
En un ejemplo, se midió la eficacia in vivo de un conjugado de agente de unión celular/agente citotóxico. Se trataron ratones SCID que poseían células tumorales NCI-H2110 con conjugados huMov19-80 y huMov19-90 y se observó una regresión tumoral significativa en múltiples dosis mientras que los ratones no tratados aumentaron los tumores rápidamente (figura 6). Se observó la actividad para el conjugado huMov19-90 en dosis tan bajas como 5 pg/kg.
COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE USO
La presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende conjugados de la invención (y/o solvatos, hidratos y/o sales de estos) y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también incluye una composición farmacéutica que comprende los conjugados de la invemción (y/o solvatos, hidratos y/o sales de estos) y un portador farmacéuticamente aceptable que además comprende un segundo agente terapéutico. Las presentes composiciones son útiles para inhibir el crecimiento celular anormal o tratar un trastorno proliferativo en un mamífero (p. ej., un ser humano). Las presentes composiciones también son útiles para tratar la depresión, la ansiedad, el estrés, las fobias, el pánico, la disforia, trastornos psiquiátricos, el dolor y enfermedades inflamatorias en un mamífero (p. ej., un ser humano).
La presente invención incluye un compuesto del primer aspecto o un conjugado del segundo aspecto para su uso en un procedimiento para inhibir el crecimiento celular anormal o tratar un trastorno proliferativo en un mamífero (p. ej., un ser humano) que comprende administrarle a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o los conjugados (y/o solvatos y sales de estos) solos o combinados con un segundo agente terapéutico.
La presente invención también proporciona un conjugado del segundo aspecto para su uso en procedimientos de tratamiento que comprenden administrarle a un sujeto que necesite el tratamiento una cantidad eficaz del conjugado.Se describe también en esta invención un procedimiento para inducir la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas que comprenden poner en contacto células diana o tejido que contiene células diana con una cantidad eficaz de un agente citotóxico que comprende cualquiera de los compuestos citotóxicos-agentes de unión celular (p. ej., dímero de indolinobenzodiazepina o oxazolidinobenzodiazepina unido a un agente de unión celular) de la presente invención, una sal o solvato de estos. Las células diana son células a las cuales el agente de unión celular se puede unir.
Si se desea, se pueden administrar otros agentes activos, como otros agentes antitumorales, junto con el conjugado.
Los portadores, diluyentes y excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son conocidos y se pueden determinar por los entendidos en la técnica según lo requiera la situación clínica.
Algunos ejemplos de portadores, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco, pH de aproximadamente 7,4, que contiene o que no contiene entre aproximadamente 1 mg/mL y 25 mg/mL de albúmina de suero humano, (2) 0,9 % de solución salina (0,9 % p/v NaCl) y (3) 5 % de (p/v) dextrosa; y también puede contener un antioxidante como triptamina y un agente estabilizante como Tween 20.
El procedimiento para inducir la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas se puede llevar a la práctica in vitro, in vivo o ex vivo.
Algunos ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente para destruir células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su trasplante para destruir los linfocitos T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD); tratamientos de cultivos celulares para destruir todas las células excepto para las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para destruir las variantes que expresan un antígeno no deseado.
Las condiciones de uso in vitro no clínicas se pueden determinar fácilmente por un entendido en la técnica.
Algunos ejemplos de uso clínico ex vivo son la remoción de células tumorales o células linfoides de la médula ósea antes del trasplante autólogo en el tratamiento del cáncer o en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o la remoción de linfocitos T y otras células linfoides de un tejido o de la médula ósea autóloga o alogénica antes del trasplante para prevenir la GVHD. El tratamiento se puede realizar del siguiente modo. Se recoge la médula ósea del paciente u otro individuo y se incuba en medio que contiene suero al cual se le añade el agente citotóxico de la invención, las concentraciones oscilan entre aproximadamente 10 |iM y aproximadamente 1 pM, durante entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37 °C. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis, se determinan fácilmente por un entendido en la técnica. Después de la incubación, se lavan las células de la médula ósea con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por vía intravenosa de acuerdo con los procedimientos conocidos. En los casos en los que el paciente recibe otro tratamiento como un ciclo de quimioterapia ablativa o irradiación corporal total entre el momento de la recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de médula tratadas se almacenan congeladas en nitrógeno líquido utilizando equipos médicos estándar.
Para el uso clínico in vivo, se suministrará el agente citotóxico de la invención como una solución o un polvo liofilizado que se evalúa en cuanto a la esterilidad y los niveles de endotoxina. A continuación se presentan algunos ejemplos de protocolos de administración de los conjugados adecuados. Los conjugados se administran semanalmente durante 4 semanas como un bolo intravenoso cada semana. Las dosis en bolo se administran en 50 a 1000 mL de solución salina normal a la cual se le puede añadir entre 5 y 10 mL de albúmina de suero humano. Las dosificaciones serán de entre 10 |ig y 2000 mg por administración, por vía intravenosa (intervalo de entre 100 ng y 20 mg/kg por día). Después de cuatro semanas de tratamiento, el paciente puede seguir recibiendo el tratamiento de forma semanal. Los protocolos clínicos específicos con respecto a la vía de administración, los excipientes, los diluyentes, las dosificaciones, los momentos, etc., se pueden determinar por los entendidos en la técnica según lo requiera la situación clínica.
Algunos ejemplos de afecciones médicas que se pueden tratar de acuerdo con los procedimientos in vivo o ex vivo de la inducción de la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas incluyen neoplasias malignas de cualquier tipo incluido, por ejemplo, el cáncer, enfermedades autoinmunitarias, como lupus sistémico, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazo de trasplantes, como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante de pulmón, rechazo de trasplante cardíaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad de injerto contra huésped; infecciones virales, como infección por CMV, infección por VIH, SIDA, etc.; e infecciones por parásitos, como giardiasis, amoebiasis, esquistosomiasis y otras, según lo determinado por un entendido en la técnica.
Las terapias contra el cáncer y sus dosificaciones, vías de administración y uso recomendado se conocen en la técnica y se han descrito en textos como Physician's Desk Reference (PDR). La p Dr describe dosificaciones de los agentes que se han utilizado en el tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosificación y las dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos mencionados anteriormente que son terapéuticamente eficaces dependerá del cáncer particular que se esté tratando, el grado de la enfermedad y otros factores conocidos para el médico entendido en la técnica y se pueden determinar por el médico. El entendido en la técnica puede revisar la PDR, utilizando uno o más de los siguientes parámetros, para determinar el régimen de dosificación y las dosificaciones de los agentes quimioterapéuticos y los conjugados que se pueden utilizar de acuerdo con los principios de la presente invención. Estos parámetros incluyen:
Índice integral
Por el fabricante
Productos (por nombre de la empresa o marca comercial del fármaco)
Índice de categoría
Índice genérico/químico (nombres comunes de fármacos que no son marcas)
Imágenes a color de los medicamentos
Información del producto coherente con el etiquetado de la FDA
Información química
Función/acción
Indicaciones y contraindicaciones
Investigación de ensayo, efectos secundarios, advertencias
ANÁLOGOS Y DERIVADOS
El entendido en la técnica de los agentes citotóxicos comprenderá fácilmente que cada uno de los agentes citotóxicos descritos en la presente se puede modificar de modo tal que el compuesto resultante aún mantenga la especificidad y/o la actividad del compuesto de partida. El entendido en la técnica también comprenderá que muchos de estos compuestos se pueden utilizar en lugar de los agentes citotóxicos descritos en la presente. Por lo tanto, los agentes citotóxicos de la presente invención incluyen análogos y derivados de los compuestos descritos en la presente.
EJEMPLOS
A continuación será ilustrada la invención mediante la referencia a ejemplos no taxativos. Los ejemplos 7, 8, 14 y 19 no son de la invención. A menos que se establezca lo contrario, todos los porcentajes, proporciones, partes, etc. son en peso. Todos los reactivos se obtuvieron de Aldrich Chemical Co., Nueva Jersey, u otras fuentes comerciales. Se adquirieron espectros resonancia magnética nuclear (1H NMR) en un instrumento Bruker400 MHz. Se adquirieron espectros de masa en un instrumento Bruker Daltonics Esquire 3000 y se adquirieron LCMS en un LC Agilent 1260 Infinity con un MS cuadrupolo simple de Agilent 6120 utilizando ionización por electroaspersión.
Los siguientes disolventes, reactivos, grupos protectores, restos y otras designaciones se pueden denominar por sus abreviaturas entre paréntesis:
Me = metilo; Et = etilo; Pr = propilo; i-Pr = isopropilo; Bu = butilo; t-Bu = terc-butilo; Ph = fenilo y Ac = acetilo AcOH o HOAc = ácido acético
ACN orCHaCN = acetonitrilo
Ala = alanina
ac.: acuoso
BH3 DMS = complejo de dimetilsulfuro borano
Bn = bencilo
Boc o BOC = terc-butoxicarbonilo
CBr4 = carbontetrabromuro
Cbz o Z = benciloxicarbonilo
DCM o CH2Cl2 = diclorometano
DCE = 1,2-dicloroetano
DMAP = 4-dimetilaminopiridina
agua DI = agua desionizada
DIBAL = hidruro de diisobutilaluminio
DIEA o DIPEA = N,N-diisopropiletilamina
DMA = N,N-dimetilacetamida
DMF = N,N-dimetilformamida
DMSO = dimetilsulfóxido
DTT = ditiotreitol
EDC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EEDQ = N-Etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina
ESI o ES = ionización por electroaspersión
EtOAc = etilacetato
Gly = glicina
g = gramos
h = hora
HATU = N,N,N'N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio hexafosfato
HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento
HOBt o HOBT = 1-hidroxibenzotriazol
LAH = hidruro de litio y aluminio
LC = cromatografía líquida
LCMS = espectrometría de masas por cromatografía líquida
min = minutos
mg = miligramos
mL = mililitros
mmol = milimoles
|jg = microgramos
|jL = microlitros
jm ol = micromoles
Me = metilo
MeOH = metanol
MeI = metilyoduro
MS = espectrometría de masas
MsCl = cloruro de metanosulfonilo (cloruro de mesilo)
Ms2O = anhídrido metanosulfónico
NaBH(OAc)3 = triacetoxiborohidruro de sodio
NHS = N-hidroxisuccinamida
NMR = espectroscopia de resonancia magnética nuclear
PPh3 = trifenilfosfina
PTLC = cromatografía de capa fina preparativa
rac = mezcla racémica
Rf = factor de retardo
RPHPLC o RP-HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
TA o ta = temperatura ambiente (ambiente, aproximadamente 25 °C)
sat. = saturado
STAB = triacetoxiborohidruro de sodio (NaBH(OAc)3)
TBSCl o TBDMSCl = cloruro de ferc-butildimetilsililo
TBS = ferc-butildimetilsililo
TCEPHCl = sal de clorhidrato de fds(2-carboxietil)fosfina
TEA = trietilamina (Et3N)
TFA = ácido trifluoroacético
THF = tetrahidrofurano
TLC = cromatografía de capa fina
Val = valina
Ejemplo 1. Síntesis de 6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-l2a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (compuesto 14)
Figure imgf000059_0001
Etapa 1: Se disolvieron Z-Gly-Gly-OH compuesto 1 (5,0 g, 18,78 mmol) y H-Gly-Of-BuHCl compuesto 2 (3,46 g, 20,66 mmol) en DMF (37,6 mL). Se agregaron EDCHCl (3,96 g, 20,66 mmol) y HOBt (2,88 g, 18,78 mmol) al matraz de reacción seguido de DIPEA (8,18 mL, 46,9 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente en Ar durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Ch, se lavó con NH4Cl sat., NaHCO3 sat. seguido de agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/DCM, gradiente, entre el 0 % y el 5 %) para proporcionar el compuesto puro 3 como un sólido blanco (6,35 g, el 89 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,18-8,13 (m, 2H), 7,48 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 7,37­ 7,36 (m, 3H), 7,34-7,32 (m, 1H), 5,04 (s, 2H), 4,09 (q, 1H, J = 5,2 Hz), 3,74 (t, 4H, J = 6,1 Hz), 3,67 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 3,17 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 1,41 (s, 9H). LCMS = 4,28 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 324,15 (M-f-Bu+H).
Figure imgf000059_0002
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 3 (6,3 g, 16,60 mmol) en MeOH (52,7 mL) y agua (2,64 mL). La mezcla de reacción se purgó con Ar y se desgasificó durante 5 min. Se agregó lentamente Pd/C (húmedo, 10 %) (0,884 g, 0,830 mmol). Luego se burbujeó en H2 de un balón durante 1 min. La reacción se agitó en un balón de H2 a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y la torta del filtro se lavó con MeOH (30 mL) y se concentró. Se agregó CH3CN (20 mL) al residuo y se concentró. Esto se repitió 2 veces más para obtener un sólido pegajoso. El residuo se suspendió en EtOAc/hexanos (2:1, 50 mL), se filtró y se enjuagó con EtOAc/hexanos (1:1, 30 mL). El sólido se secó al vacío/N2 durante 1 h para obtener el compuesto 4 como un sólido blanco (3,66 g, 90 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,21-8,18 (m, 1H), 8,12 (bs, 1H), 3,76 (bs, 2H), 3,73 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 3,13 (s, 2H), 1,93 (bs, 2H), 1,41 (s, 9H).
Figure imgf000059_0003
Etapa 3: se disolvieron amina compuesto 4 (1,0 g, 4,08 mmol) y monometiladipato (664 j L, 4,48 mmol) en DMF (13,59 mL). Se agregaron EDCHCl (860 mg, 4,48 mmol) y HOBt (624 mg, 4,08 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (1,424 mL, 8,15 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH (20 mL, 5:1) y se lavó con NH4Cl sat., NaHCO3 sat., agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (gradiente, entre el 0 % y el 20 % de MeOH/DCM) para proporcionar el compuesto puro 5 como un sólido blanco (1,5 g, el 95% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,17-8,06 (m, 3H), 3,74-3,71 (m, 6H), 3,59 (s, 3H), 2,32 (bt, 2H, J = 6,9 Hz), 2,14 (bt, 2H, J = 6,7 Hz), 1,52-1,49 (m, 4H), 1,41 (s, 9H).
Figure imgf000060_0001
Etapa 4: El compuesto 5 (1,5 g, 3,87 mmol) se agitó en TFA (5,97 mL, 77,0 mmol) y agua desionizada (300 j L) a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó CH3CN (10 mL) a la mezcla de reacción y se agitó durante 5 min. La mezcla se volvió espesa con lotes de precipitado blanco. Se agregó más CH3CN (30 mL) y se agitó adicionalmente durante 5 min. La mezcla se filtró y se secó al vacío/N2 durante 1 h para obtener el compuesto puro 6 como un sólido blanco (0,7 g, 55% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 612,56 (s, 1H), 8,16-8,06 (m, 3H), 3,73 (dt, 6H, J = 8,6, 6,1 Hz), 3,59 (s, 3H), 2,32-2,29 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 2H), 1,51 (bt, 4H, J = 3,5 Hz).
Figure imgf000060_0002
Etapa 5: Se suspendieron anilina compuesto 7 (100 mg, 0,653 mmol) y ácido compuesto 6 (227 mg, 0,685 mmol) en CH2Ch/MeOH (4,35 mL/2,2 mL) a temperatura ambiente. Se agregó EEDq (323 mg, 1,306 mmol) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se concentró y el residuo se suspendió en EtOAc (15 mL) y se filtró. Los sólidos se lavaron con EtOAc (2 x 15 mL) y se secó al vacío/N2 para obtener el compuesto 8 como un sólido blanco (260 mg, el 85 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 69,74 (s, 1H), 8,21-8,19 (m, 2H), 8,11-8,08 (m, 1H), 7,45 (s, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,17 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 4,45 (d, 4H, J = 5,6 Hz), 3,87 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 3,75 (dd, 4H, J = 5,7, 13,4 Hz), 3,58 (s, 3H), 2,31-2,27 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 2H),1,52-1,48 (m, 4H). LCMS = 0,886 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 489,3 (M+Na).
Figure imgf000060_0003
Etapa 6: se disolvieron diol compuesto 8 (260 mg, 0,557 mmol) y carbontetrabromuro (555 mg, 1,672 mmol) en DMF (5,57 mL). Se agregó trifenilfosfina (439 mg, 1,672 mmol) y la mezcla marrón se agitó en Ar a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH (10:1, 30 mL) y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/DCM, entre el 0 % y el 10 %, gradiente) para obtener el compuesto 9 como un sólido amarillo. El producto se suspendió en CH2Ch/EtOAc (1:10, 30 mL) y luego se filtró. El sólido se lavó con EtOAc y se secó al vacío/N2 para proporcionar el compuesto puro 9 como un sólido blanquecino (170 mg, el 52 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 69,95 (s, 1H), 8,25-8,20 (m, 2H), 8,12-8,10 (m, 1H), 7,65 (s, 2H), 7,22 (s, 1H), 4,68 (s, 3H), 3,89 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 3,77 (dd, 4H, J = 5,7, 7,4 Hz), 3,58 (s, 3H), 2,31-2,27 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 2H), 1,51-1,49 (m, 4H). LCMS = 3,335 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 593,2 (M+H).
Figure imgf000061_0001
Etapa 7 : Se disolvieron dibromuro compuesto 9 (109 mg, 0,184 mmol) y monómero IGN compuesto 10 (119 mg, 0,405 mmol) en DMF (1,84 mL). Se agregó carbonato de potasio (63,6 mg, 0,460 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó agua (20 mL) a la mezcla de reacción para precipitar el producto. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 5 min y luego se filtró y se secó al vacío/N2 durante 1 h. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/CH2Ch, gradiente, entre el 0 % y el 5 %) para obtener el compuesto 11 como un sólido amarillo (160 mg, el 60% de rendimiento, el 70% de pureza). LCMS = 5,240 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1019,7 (M+H).
Figure imgf000061_0002
Etapa 8: Se disolvió diimina compuesto 11 (140 mg, 0,11 mmol) en 1,2-dicloroetano (1,1 mL). Se añadió NaBH(OAc)3 (23,29 mg, 0,11 mmol) a la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se diluyó con CH2Cl2 (30 mL) y se inactivó con solución acuosa de NH4Cl sat. (15 mL). Las capas se separaron y se lavó con salmuera, se secó en Na2SO4y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante RPHPLc (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, entre el 35 % y el 55 %) para proporcionar monoimina compuesto 12 como un sólido esponjoso blanco (33 mg, el 29 % de rendimiento) y también se recuperó el material de partida compuesto 11 (25 mg). LCMS = 7,091 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1021,7 (M+H).
Figure imgf000061_0003
Etapa 9: Se disolvió metiléster compuesto 12 (33 mg, 0,029 mmol) en THF (1,09 mL) y agua (364 pL). Se agregó LiOH (6,97 mg, 0,291 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. La mezcla de reacción se diluyó con H2O (5 mL) y se acidificó con 0,5 M de HCl ac. hasta pH~4. La capa acuosa se extrajo con CH2Ch/MeOH (3:1, 3 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron en Na2SO4, se filtraron y se concentraron para obtener el compuesto bruto 13 como un sólido amarillo (29 mg, el 99% de rendimiento). LCMS = 5,356 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1007,7 (M+H).
Figure imgf000061_0004
Etapa 10: Se agregó EDCHCl (22,08 mg, 0,115 mmol) a una solución agitada de ácido compuesto 13 (29 mg, 0,023 mmol) y N-hidroxisuccinamida (21,21 mg, 0,184 mmol) en CH2Ch (2,3 mL) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 y se lavó con agua (1 x 15 mL) y salmuera (1 x 15 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó mediante RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, entre el 35 % y el 55 %). Se combinaron fracciones que contenían el producto y se liofilizaron para obtener 6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][l,4]diazepino[l,2-a]indol-9-il)oxi)metil fenil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-6-oxohexanoatode 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, compuesto 14 como un sólido esponjoso blanco (8 mg, el 31 % de rendimiento). LCMS = 5,867 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1104,7 (M+H).
Ejemplo 2. Síntesis de 4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)carbamoil)ciclohexan-carboxilato de (1r,4r)-2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, (compuesto 23)
Figure imgf000062_0001
Etapa 1: Se disolvieron amina compuesto 4 (200 mg, 0,815 mmol) y monometiléster de ácido 1,4-fransciclohexandicarboxílico compuesto 15 (182 mg, 0,978 mmol) en DMF (2,72 mL). Se agregaron EDCHCl (188 mg, 0,978 mmol) y HOBt (125 mg, 0,815 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (285 pL, 1,631 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Ch y se lavó con NH4Cl sat., NaHCO3 sat., salmuera y agua. La capa orgánica se secó en Na2SO4 y se concentró hasta un residuo pegajoso. Se agregó CH3CN (15 mL) al residuo y se concentró. Esto se repitió 2 veces más para obtener el compuesto 16 como un polvo blanco seco (300 mg, el 85 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-c/6): 88,16 (t, 1H, J = 5,9 Hz), 8,04 (dt, 2H, J = 5,6, 14,8 Hz), 3,74-3,69 (m, 6H), 3,59 (s, 3H), 2,31-2,25 (m, 1H), 2,20-2,13 (m, 1H), 1,94-1,91 (m, 2H), 1,82-1,79 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,34 (d, 3H, J = 11,7 Hz).
Figure imgf000062_0002
Etapa 2: Se agregaron TFA (1,40 mL, 18,14 mmol) y agua DI (67,8 pL) al compuesto puro 16 (300 mg, 0,726 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 3 h. Se agregó CH3CN (20 mL) a la mezcla de reacción y se concentró. Esto se repitió dos veces más para obtener el compuesto 17 como un sólido blanco (230 mg, el 89% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 88,16-8,13 (m, 1H), 8,07-8,01 (m, 2H), 3,76-3,73 (m, 4H), 3,70 (bd, 2H, J = 5,1 Hz), 3,59 (s, 3H), 2,31-2,25 (m, 1H), 2,19-2,14 (m, 1H), 1,94-1,91 (m, 2H), 1,82-1,79 (m, 2H), 1,42-1,26 (m, 4H).
Figure imgf000062_0003
Etapa 3: Se suspendieron anilina compuesto 7 (135 mg, 0,881 mmol) y ácido compuesto 17 (331 mg, 0,925 mmol) en CH2Ch/MeOH (2,9 mL/1,5 mL) a temperatura ambiente. Se agregó EEDQ (436 mg, 1,763 mmol) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se concentró y el residuo se suspendió en EtOAc (15 mL) y se filtró. Los sólidos se lavaron con EtOAc (2 x 15 mL) y se secó al vacío/N2 para obtener el compuesto 18 como un sólido blanco (330 mg, el 61% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 89,73 (s, 1H), 8,18 (dt, 2H, J = 6,0, 19,2 Hz), 8,09-8,01 (m, 2H), 7,45 (s, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,17 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 4,45 (d, 4H, J = 5,6 Hz), 3,88-3,84 (m, 3H), 3,77-3,69 (m, 8H), 3,63 (s, 2H), 3,59 (s, 6H), 2,30-2,22 (m, 2H), 2,19-2,13 (m, 2H), 1,94-1,90 (m, 4H), 1,82-1,78 )m, 4H), 1,41-1,26 (m, 8H).
Figure imgf000063_0001
Etapa 4 : Se disolvieron el compuesto 18 (330 mg, 0,536 mmol) y CBr4 (533 mg, 1,608 mmol) en DMF (5,36 mL). Se agregó PPh3 (422 mg, 1,608 mmol) a la mezcla de reacción, momento en el que la reacción se puso amarilla con una exotermia leve. La reacción se agitó en Ar durante 4 h. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Ch y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/CH2Ch, gradiente, entre el 0 % y el 10%) para obtener el compuesto 19 como un sólido blanco (234 mg, el 64% de rendimiento). LCMS = 4,453 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 617,10 (M+H).
Figure imgf000063_0002
Etapa 5 : Se preparó el compuesto 20 de forma similar al compuesto 11 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 20 como un sólido amarillo después de la purificación (264 mg, el 60 % de rendimiento). LCMS = 4,831 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 1045,20 (M+H).
Figure imgf000063_0003
Etapa 6 : Se preparó el compuesto 21 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 21 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (51 mg, el 31 % de rendimiento). LCMS = 5,127 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 1047,30 (M+H).
Figure imgf000063_0004
Etapa 7: Se disolvió metiléster compuesto 21 (48 mg, 0,046 mmol) en 1,2-dicloroetano (3,06 mL). Se agregó trimetilestananol (124 mg, 0,688 mmol) a la mezcla de reacción y se calentó a 80 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con agua (15 mL). La capa acuosa se acidificó a pH ~ 4 con 1 M de HCl. La mezcla se extrajo con CH2Ch/MeOH (10:1, 3 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El residuo bruto se tapó a través de una almohadilla corta de gel de sílice y se enjuagó con CH2Ch/MeOH (10:1, luego 5:1, 2 x 30 mL) y se concentró. Se obtuvo el ácido compuesto 22 como un sólido amarillo y se usó en el siguiente paso sin purificación adicional (48 mg, el 100 % de rendimiento). LCMS = 5,338 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1033,7 (M+H).
Figure imgf000064_0001
Etapa 8: Se preparó el compuesto 23 de forma similar al compuesto 13 en el ejemplo 1. 4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)carbamoil)ciclohexanocarboxilato de (1r,4r)-2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo, se obtuvo el compuesto 23 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (8 mg, el 19 % de rendimiento). LCMS = 6,007 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1130,8 (M+H).
Ejemplo 3. Síntesis de 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12, 12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo (compuesto 35)
Figure imgf000064_0002
Etapa 1: Se disolvieron Z-Val-OH compuesto 24 (3,0 g, 11,94 mmol) y L-Ala-OíBu compuesto 25 (1,907 g, 13,13 mmol) en DMF (23,88 mL). Se agregaron Ed C h CI (2,52 g, 13,13 mmol) y HoBt (2,011 g, 13,13 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (4,59 mL, 26,3 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche en Ar. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 y se lavó con NaHCO3 sat., NH4CI sat., agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 0 % y el 50%) para obtener el compuesto 26 como un sólido blanco (3,68 g, el 81% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCI3): 87,39-7,29 (m, 5H), 6,29 (bd, 1H, J = 6,9 Hz), 5,34 (bd, 1H, J = 8,4 Hz), 5,11 (s, 2H), 4,45 (p, 1H, J = 7,2 Hz), 4,02-3,98 (m, 1H), 2,18-2,09 (m, 1H), 1,56 (s, 9H), 1,37 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 0,98 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,93 (d, 3H, J = 6,8 Hz). LCm S = 5,571 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 323,25 (M-fBu+H).
Figure imgf000064_0003
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 26 (3,68 g, 9,72 mmol) en MeOH (30,9 mL) y agua (1,543 mL). La solución se purgó con Ar y se desgasificó durante 5 min. Se agregó lentamente Pd/C (10 %, húmedo, 0,517 g) a la mezcla de reacción. Luego se burbujeó H2 durante un minuto. Se interrumpió el burbujeo y la reacción se agitó en un balón de H2 durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y la torta del filtro se lavó la torta con MeOH (30 mL) y se concentró para obtener el compuesto 27 como un sólido blanco (2,35 g, el 99 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCI3): 87,79­ 7,77 (m, 1H), 4,50 (p, 1H, J = 7,3 Hz), 3,27 (d, 1H, J = 3,9 Hz), 2,34-2,26 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,40 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,01 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 0,86 (d, 3H, J = 6,9 Hz).
Etapa 3: Se disolvieron amina compuesto 27 (2,35 g, 9,62 mmol) y monometiladipato (1,69 g, 10,58 mmol) en DMF (32,1 mL). Se agregaron EDCHCl (1,94 g, 10,10 mmol) y HOBt (1,47 g, 9,62 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (3,36 mL, 19,24 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH (20 mL, 5:1) y se lavó con NH4Cl sat., NaHCO3 sat., agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 0 % y el 50%) para obtener el compuesto 28 como un sólido blanco (2,77 g, el 75% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 86,29 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,12 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 4,43(p, 1H, J = 7,2 Hz), 4,27 (dd, 1H, J = 6,4, 8,6 Hz), 3,66 (s, 3H), 2,35-2,31 (m, 2H), 2,26-2,23 (m, 2H), 2,12-2,03 (m, 1H), 1,70-1,63 (m, 4H), 1,46 (s, 9H), 1,36 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 0,95 (t evidente, 6H, J = 6,6 Hz).
Figure imgf000065_0001
Etapa 4: Se agregaron TFA (8,28 mL, 108,0 mmol) y agua (0,56 mL) al compuesto puro 28 (2,77 g, 7,17 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 2,5 h. Se agregó CH3CN (30 mL) a la mezcla de reacción y se concentró. Esto se repitió 2 veces más para obtener el compuesto 29 como un sólido amarillo pálido (2,0 g, el 84% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 88,11 (bs, 1H), 7,29 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 7,14 (d, 1H, 6,8 Hz), 4,58 (p, 1H, J = 7,1 Hz), 4,37 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 3,68 (s, 3H), 2,37-2,32 (m, 4H), 2,03-1,99 (m, 2H), 1,69-1,63 (m, 4H), 1,49 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 0,97 (d, 3H, J = 4,8 Hz), 0,96 (d, 3H, J = 4,8 Hz).
Figure imgf000065_0002
Etapa 5: Se suspendieron anilina compuesto 7 (150 mg, 0,98 mmol) y ácido compuesto 29 (340 mg, 1,03 mmol) en CH2Ch/MeOH (3,26 mL, 1,62 mL) a temperatura ambiente. Se agregó EEDQ (484 mg, 1,96 mmol) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se concentró y el residuo se suspendió en EtOAc/Et2O (15 mL, 15 mL) y se filtró. Los sólidos se lavaron con Et2O (2 x 15 mL) y se secó al vacío/N2 para obtener el compuesto 30 como un sólido blanco (150 mg, el 33% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 87,61 (s, 2H), 7,47 (d, 1H, J = 7,1 Hz), 7,14 (s, 1H), 6,64 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 4,82-4,75 (m, 1H), 4,45-4,40 (m, 4H), 3,64 (s, 3H), 2,36-2,27 (m, 4H), 2,16-2,07 (m, 1H), 1,68-1,59 (m, 4H), 1,47 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 0,98 (d, 3H, J = 3,6 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 4,8 Hz). LCMS = 3,073 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 466,25 (M+H).
Figure imgf000065_0003
Etapa 6 : Se disolvieron diol compuesto 30 (150 mg, 0,322 mmol) y CBr4 (321 mg, 0,967 mmol) en DMF (3222 pl). Se agregó PPh3 (254 mg, 0,967 mmol) a la mezcla de reacción, momento en el que la reacción se puso roja-rosa con una exotermia leve. La reacción se agitó en Ar durante 4 h. La mezcla de reacción se diluyó con C ^ C h y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 0 % y el 100%) para obtener el compuesto 31 como un sólido blanquecino (473 mg, el 75% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 88,19 (d, 1H, J = 6,6 Hz), 7,85 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,64 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,68 (s, 3H), 4,37 (p, 1H, J = 7,0 Hz), 4,18 (dd, 1H, J = 7,2, 8,4 Hz), 3,58 (s, 3H), 2,32-2,29 (m, 2H), 2,33-2,12 (m, 2H), 2,01-1,91 (m, 1H), 1,53-1,49 (m, 4H), 1,31 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 0,89 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,85 (d, 3H, J = 6,8 Hz). LCMS = 5,259 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 592,05 (M+H).
Figure imgf000066_0001
Etapa 7 : Se preparó el compuesto 32 de forma similar al compuesto 11 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 32 como un sólido amarillo después de la purificación (162 mg, el 57% de rendimiento, el 70 % de rendimiento). LCMS = 6,461 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1018,7 (M+H).
Figure imgf000066_0002
Etapa 8 : Se preparó el compuesto 33 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 33 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (40 mg, el 31 % de rendimiento). LCMS = 5,528 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 1020,30 (M+H).
Figure imgf000066_0003
Etapa 9 : Se preparó el compuesto 34 de forma similar al compuesto 22 en el ejemplo 2. Se obtuvo el compuesto 34 como un sólido amarillo después de tapón de sílice (38 mg, el 100% de rendimiento). LCMS = 5,211 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 1006,35 (M+H).
Figure imgf000066_0004
Etapa 10: Se preparó el compuesto 35 de forma similar al compuesto 14 en el ejemplo 1. 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12, 12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, se obtuvo el compuesto 35 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (8 mg, el 20 % de rendimiento). LCMS = 7,031 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1103,7 (M+H).
Ejemplo 4. Síntesis de 2-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)-3,6,9,12-tetraoxo-2,5,8,11-tetraazaheptadecan-17-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (compuesto 49)
Figure imgf000067_0001
Etapa 1: Se disolvió (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol compuesto 7 (5,0 g, 32,6 mmol) en THF (65,3 mL). Se agregó TBSCI (12,30 g, 82 mmol) e imidazol (6,67 g, 98 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche en Ar. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NH4Cl sat. y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 0 % y el 30%) para obtener el compuesto 37 como un aceite amarillo (13 g, el 100% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 86,71 (s, 1H), 6,60 (s, 2H), 4,65 (s, 4H), 0,94 (s, 18 H), 0,10 (s, 12 H).
Figure imgf000067_0002
Etapa 2: Se agregó Cs2CO3 (8,54 g, 26,2 mmol) a una solución agitada de anilina compuesto 37 (10 g, 26,2 mmol) en DMF (52,4 mL). Se agregó metilyoduro (1,474 mL, 23,58 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Se agregaron agua (10 mL) y EtOAc (30 mL) a la mezcla de reacción. Las capas se separaron y se extrajo con EtOAc (2x). Las capas orgánicas se lavaron con agua (4x), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 0 % y el 10%) para obtener el producto monometilado deseado compuesto 38 (3,8 g, el 37% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 86,63 (s, 1H), 6,52 (s, 2H), 4,67 (s, 4H), 2,84 (s, 3H), 0,94 (s, 18H), 0,10 (s, 12H).
Figure imgf000067_0003
Etapa 3 : Se disolvieron anilina compuesto 38 (1,0 g, 2,53 mmol) y Z-Gly-OH (0,582 g, 2,78 mmol) en DMF (8,42 mL). Se agregaron EDCHCl (1,21 g, 6,32 mmol) y d Ma P (340 mg, 2,78 mmol) a la mezcla de reacción y se calentó a 80 °C durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 sat. y agua (2x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 0 % y el 30% y el 100 %) para obtener el compuesto 39 como un sólido pegajoso amarillo (780 mg, el 53% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 87,27 (m, 6H), 6,90 (s, 2H), 4,94 (s, 2H), 4,62 (s, 4H), 3,58 (s, 2H), 3,16 (s, 3H), 0,83 (s, 18H), 0,00 (s, 12 H).
Figure imgf000067_0004
Etapa 4 : Se disolvió el compuesto 39 (1,26 g, 2,147 mmol) en MeOH (6,82 mL) y THF (6,8 mL) y la solución se purgó con N2. Se agregó Pd/C (10 %, 0,228 g, 0,215 mmol) y se burbujeó H2 durante unos minutos. La reacción se agitó en balón de H2 durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, se lavó con MeOH y se concentró para proporcionar el compuesto puro 40 (1 g, el 100 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 87,41-7,30 (m, 2H), 7,27-7,21 (m, 1H), 7,06 (s, 2H), 4,65 (s, 4H), 3,23 (s, 3H), 3,12 (s, 2H), 0,82 (s, 18H), 0,00 (s, 12H).
Figure imgf000068_0001
Etapa 5: Se disolvieron amina compuesto 40 (1,0 g, 1,988 mmol) y Z-Gly-Gly-Gly-OH (662 mg, 2,385 mmol) en DMF (6,63 mL). Se agregaron EDCHCl (457 mg, 2,385 mmol) y HOBT (304 mg, 1,988 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (694 |jL, 3,98 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 sat., salmuera y agua (2x). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/DCM, gradiente, entre el 0 % y el 10%) para obtener el compuesto 41 como una espuma pegajosa blanca (994 mg, el 71% de rendimiento).
1H NMR (400 MHz, CDCh): 87,38-7,32 (m, 7H), 7,31-7,27 (m, 2H), 7,01 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 4,74 (s, 4H), 3,97 (d, 2H, J = 4,6 Hz), 3,92 (d, 2H, J = 5,3 Hz), 3,74 (d, 2H, J = 3,7 Hz), 3,27 (s, 3H), 0,94 (s, 18H), 0,11 (s, 12H).
Figure imgf000068_0002
Etapa 6: Se suspendió el compuesto 41 (994 mg, 1,418 mmol) en MeOH (6,65 mL) y agua (443 j L) y se purgó con N2. Se agregó Pd/C (10 % húmedo, 302 mg, 0,284 mmol) y se burbujeó H2 durante unos minutos. La reacción se agitó en balón de H2 durante la noche. La solución se filtró a través de Celite, se lavó con MeOH y se concentró para obtener el compuesto puro 42 (725 mg, el 90 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 88,10-7,97 (m, 1H), 7,91-7,85 (m, 1H), 7,31-7,23 (m, 1H), 7,05 (s, 2H), 7,65 (s, 4H), 3,68-3,62 (m, 2H), 3,56-3,45 (m, 1H), 3,09 (s, 3H), 3,08-3,06 (m, 2H), 3,06-3,03 (m, 2H), 0,82 (s, 18H), 0,00 (s, 12H). LCMS = 5,574 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 567,30 (M+H).
Figure imgf000068_0003
Etapa 7: Se disolvieron amina compuesto 42 (725 mg, 1,279 mmol) y monometiladipato (246 mg, 1,535 mmol) en DMF (6,5 mL). Se agregaron EDC HCl (294 mg, 1,535 mmol) y HOBt (196 mg, 1,279 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (447 j L, 2,56 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (20 mL) y se lavó con NH4Cl sat., NaHCO3 sat., agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/DCM, gradiente, entre el 0 % y el 10%) para obtener el compuesto 43 (425 mg, el 33% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 87,30 (s, 1H), 7,01 (s, 2H), 6,89-6,85 (m, 1H), 6,75-6,72 (m, 1H), 6,41-6,40 (m, 1H), 4,73 (s, 4H), 3,98-3,96 (m, 4H), 3,74 (bd, 2H, J = 3,5 Hz), 3,66 (s, 3H), 3,27 (s, 3H), 2,33 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,28 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 0,94 (s, 18H), 0,11 (s, 12H). LCMS = 7,709 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 709,35 (M+H).
Figure imgf000068_0004
Etapa 8: Se disolvió el compuesto 43 (422 mg, 0,417 mmol) en THF (1,89 mL) y agua (189 j L). Se agregó HCl (acuoso, 5 M) (833 j L, 4,17 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 h. Se concentró la mezcla de reacción.
Se agregó ACN (~ 15 mL) al residuo y se concentró. Esto se repitió dos veces más para obtener el compuesto 44 como una espuma blanca (200 mg, el 100% de rendimiento). LCMS = 0,389 min (procedimiento de 8 min). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,09-8,04 (m, 2H), 7,93-7,90 (m, 1H), 7,30 (bs, 1H), 7,14 (s, 2H), 4,52 (s, 4H), 3,71-3,68 (m, 4H), 3,58 (s, 3H), 3,17 (bs, 3H), 2,22-2,18 (m, 2H), 2,15-2,12 (m, 2H), 1,53-1,47 (m, 4H).
Figure imgf000069_0001
Etapa 9: Se disolvieron diol compuesto 44 (110 mg, 0,229 mmol) y CBr4 (228 mg, 0,687 mmol) en DMF (2,29 mL). Se agregó PPh3 (180 mg, 0,687 mmol) a la mezcla de reacción, momento en el que la reacción se puso roja-rosa con una exotermia leve. La reacción se agitó en Ar durante 6 h. La mezcla de reacción se diluyó con C^Ch/MeOH (10:1) y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/CH2Ch, gradiente, entre el 0 % y el 10%) para obtener el compuesto 45 (30 mg, el 22% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 67,46 (bs, 1H), 7,32-7,26 (m, 2H), 7,26-7,19 (m, 2H), 6,89­ 6,85 (m, 1H), 4,60 (d, 2H, J = 3,6 Hz), 4,48 (d, 2H, J = 3,9 Hz), 3,98 (d, 4H, J = 5,1 Hz), 3,76 (bs, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,30 (bs, 3H), 2,34 (bt, 2H, J = 6,7 Hz), 2,30 (bt, 2H, J = 6,6 Hz), 1,70-1,64 (m, 4H). LCMS = 4,326 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 605,10 (M+H).
Figure imgf000069_0002
Etapa 10: Se preparó el compuesto 46 de forma similar al compuesto 11 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 46 como un sólido amarillo después de la purificación (40 mg, el 59% de rendimiento). LCMS = 4,751 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESl+): 1033,35 (M+H).
Figure imgf000069_0003
Etapa 11: Se preparó el compuesto 47 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 47 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (14 mg, el 32% de rendimiento). LCMS = 5,857 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1035,7 (M+H).
Figure imgf000069_0004
Etapa 12: Se preparó el compuesto 48 de forma similar a 22 en el ejemplo 2. Se obtuvo el compuesto 48 como un sólido amarillo después de tapón de sílice (7 mg, el 100% de rendimiento). LCMS = 4,817 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 1021,35 (M+H).
Figure imgf000070_0001
Etapa 13: Se preparó el compuesto 49 de forma similar al compuesto 14 en el ejemplo 1. 2-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4] diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6 ][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)-3,6,9,12-tetraoxo-2,5,8,11-tetraazaheptadecan-17-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-il, se obtuvo el compuesto 49 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (6,5 mg, el 74 % de rendimiento). LCMS = 5,805 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (e S i+): 1118,7 (M+H).
Ejemplo 5. Síntesis de 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (compuesto 80)
Figure imgf000070_0002
71
Etapa 1: se disolvieron ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)propanoico (5 g, 22,40 mmol) y clorhidrato de 2-aminopropanoato (R)-terc-butilo (4,48 g, 24,64 mmol) en DMF anhidro (44,8 ml). Se agregaron EDCHCl (4,72 g, 24,64 mmol), HOBt (3,43 g, 22,40 mmol) y luego DIPEA (9,75 ml, 56,0 mmol). La reacción se agitó en argón a temperatura ambiente, durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y luego se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado, agua y salmuera. La capa orgánica se secó con sulfato de sodio y se concentró. El aceite bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/acetato de etilo) para proporcionar el compuesto bruto 71 (5,6 g, el 71 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 87,39-7,34 (m, 5H), 6,54 (s, 1H) 5,28 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,47-4,43 (m, 1H), 4,48 (s, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,42-1,37 (m, 6H).
Figure imgf000070_0004
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 71 (5,6 g, 15,98 mmol) en metanol (50,7 mL) y agua (2,54 mL). La solución se purgó con argón durante cinco minutos. Se agregó lentamente paladio en carbono (húmedo, 10 %) (0,850 g, 0,799 mmol). La reacción se agitó durante la noche en una atmósfera de hidrógeno. La solución se filtró a través de Celite, se enjuagó con metanol y se concentró. El residuo se destiló de forma azeotrópica con metanol y acetonitrilo y el aceite resultante se colocó directamente en el vacío alto para proporcionar el compuesto 72 (3,57 g, el 100 % de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente etapa. 1H NMR (400 MHz, CDCla): 87,67 (s, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,54-3,49 (m, 1H), 1,48 (s, 9H), 1,40 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
Figure imgf000070_0003
Etapa 3 : el compuesto 72 (3,57 g, 16,51 mmol) y monometiladipato (2,69 mL, 18,16 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (55,0 mL). Se agregaron EDC HCl (3,48 g, 18,16 mmol) y HOBt (2,53 g, 16,51 mmol) seguido de DIPEA (5,77 mL, 33,0 mmol). Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con diclorometano/metanol (80 mL, 5:1) y se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado y salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se limpió. El compuesto se destiló de forma azeotrópica con acetonitrilo (5x), luego se bombeó en el vacío alto a 35 °C para proporcionar el compuesto 73 (5,91 g, el 100 % de rendimiento). El material bruto se tomó para la etapa siguiente sin purificación. 1H NMR (400 MHz, CDCh): 86,67 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,22 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 4,56-4,49 (m, 1H), 4,46-4,38 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 2,37-2,33 (m, 2H), 2,27-2,24 (m, 2H), 1,70 -1,68 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,40 (s, 3H), 1,38 (s, 3H).
Figure imgf000071_0001
Etapa 4: El compuesto 73 (5,91 g, 16,5 mmol) se agitó en TFA (25,4 mL, 330 mmol) y agua desionizada (1,3 mL) a temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla de reacción se concentró con acetonitrilo y se colocó en vacío alto hasta que se secó para proporcionar el compuesto bruto 74 (4,99 g, el 100 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 8 7,44 (d, 1H, J = 7,2 Hz,), 6,97 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 4,81-4,73 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,39-2,32 (m, 2H), 2,31-2,
Figure imgf000071_0002
Etapa 5 : El compuesto 74 (4,8 g, 15,88 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (101 mL) y metanol anhidro (50,4 mL). Se agregaron (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (2,316 g, 15,12 mmol) y EEDQ (7,48 g, 30,2 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente, durante la noche. El disolvente se limpió y el material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol) para proporcionar el compuesto 75 (1,65 g, el 25 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 89,68 (s, 1H), 8,29 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 8,11 (d, 1H, J = 6,4 Hz), 7,52 (s, 2H), 6,97 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,45 (s, 4H , 4,39-4,32 m, 1H, 4,28-4,21 m, 1H, 3,57 s, 3H , 2,30-2,27 m, 2H , 2,17-2,13 m, 2H , 1,54-1,45 (m, 4H) 1,30 (d,
Figure imgf000071_0003
Etapa 6 : El Compuesto 75 (0,486 g, 1,111 mmol) y tetrabromuro de carbono (1,105 g, 3,33 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (11,11 mL). Se agregó trifenilfosfina (0,874 g, 3,33 mmol) y la reacción se agitó en argón durante cuatro horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH (10:1) y se lavó con agua y salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto 76 (250 mg, el 40 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 89,82 (s, 1H), 8,38 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 8,17 (d, 1H, J = 6,0 Hz), 7,76 (s, 2H), 7,22 (s, 1H), 4,66 (s, 4H), 4,38-4,31 (m, 1H), 4,25-4,19 (m, 1H), 3,56 (s, 3H), 2,30-2,27 (m, 2H), 2,18-2,15 (m, 2H), 1,53-1,51 (m, 4H), 1,32 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,21 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
Figure imgf000071_0004
Etapa 7: Se preparó el compuesto 77 de forma similar a 11 en el ejemplo 1. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol) para proporcionar el compuesto 77 (340 mg, el 60 % de rendimiento, el 77 % de pureza). Lc MS = 5,87 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 990,6 (M 1)+.
Figure imgf000072_0001
Etapa 8 : Se preparó el compuesto 78 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. El material bruto se purificó mediante RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar el compuesto 78 (103 mg, el 30 % de rendimiento). LCMS = 6,65 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 992,7 (M 1)+.
Figure imgf000072_0002
Etapa 9 : Se preparó el compuesto 78 de forma similar a 22 en el ejemplo 2. El material bruto se pasó a través de un tapón de sílice para proporcionar el compuesto 79 (38 mg, el 55 % de rendimiento, el 75 % de pureza). LCMS = 5,83 min (procedimiento de 15 min. MS m/z : 978,6 M 1+.
Figure imgf000072_0003
Etapa 10: Se preparó el compuesto 80 de forma similar al compuesto 14 en el ejemplo 1. El material bruto se purificó mediante Rp Hp Lc (columna C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, compuesto 80 (6,5 mg, el 30% de rendimiento). LCMS = 6,53 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1075,7 (M 1)+ y 1097,7(M Na)+.
Ejemplo 6. Síntesis de 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, compuesto 90
Figure imgf000072_0004
Etapa 1: Se disolvieron ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)propanoico (5 g, 22,40 mmol) y clorhidrato de 2­ aminopropanoato (S)-terc-butilo (4,48 g, 24,64 mmol) en DMF anhidro (44,8 mL). Se agregaron EDCHCl (4,72 g, 24,64 mmol), HOBt (3,43 g, 22,40 mmol) y DIPEA (9,75 mL, 56,0 mmol). La reacción se agitó en argón a temperatura ambiente, durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y luego se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado, agua y salmuera. La capa orgánica se secó con sulfato de sodio y se concentró. El aceite bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (hexanos/acetato de etilo) para proporcionar el compuesto bruto 81 (6,7 g, el 85% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCla): 87,38-7,31 (m, 5H), 6,53-6,42 (m, 1H), 5,42-5,33 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,48-4,41 (m, 1H), 4,32-4,20 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,42 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,38 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
Figure imgf000073_0001
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 81 (6,7 g, 19,12 mmol) en metanol (60,7 mL) y agua (3,03 mL). La solución se purgó con argón durante cinco minutos. Se agregó lentamente paladio en carbono (húmedo, 10 %) (1,017 g, 0,956 mmol). La reacción se agitó durante la noche en una atmósfera de hidrógeno. La solución se filtró a través de Celite, se enjuagó con metanol y se concentró. Se destiló de forma azeotrópica con metanol y acetonitrilo y el aceite resultante se colocó directamente en el vacío alto para proporcionar el compuesto 82 (4,02 g, el 97% de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente etapa. 1H NMR (400 MHz, CDCh): 87,78-7,63 (m, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,55-3,50 (m, 1H), 1,73 (s, 2H), 1,48 (s, 9H), 1,39 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
Figure imgf000073_0002
Etapa 3: El Compuesto 82 (4,02 g, 18,59 mmol) y monometiladipato (3,03 mL, 20,45 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (62,0 mL). Se agregaron EDCHCl (3,92 g, 20,45 mmol), HOBt (2,85 g, 18,59 mmol) y DIPEA (6,49 mL, 37,2 mmol). Se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con diclorometano/metanol (150 mL, 5:1) y se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado y salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se limpió. El compuesto se destiló de forma azeotrópica con acetonitrilo (5x), luego se bombeó en el vacío alto a 35 °C para proporcionar el compuesto 83 (6,66 g, el 100% de rendimiento). El material bruto se tomó para la etapa siguiente sin purificación. 1H NMR (400 MHz, CDCla): 86,75 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 4,52-4,44 (m, 1H), 4,43-4,36 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 2,35-2,29 (m, 2H), 2,25-2,18 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,36 (t, 6H, J = 6,0 Hz).
Figure imgf000073_0003
Etapa 4: El compuesto 83 (5,91 g, 16,5 mmol) se agitó en TFA (28,6 mL, 372 mmol) y agua desionizada (1,5 mL) a temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla de reacción se concentró con acetonitrilo y se colocó en vacío alto para proporcionar el compuesto bruto 84 como un sólido pegajoso (5,88 g, el 100 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, CDCh): 87,21 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,81 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 4,69-4,60 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,40-2,33 (m, 2H), 2,31-2,24 (m, 2H), 1,72-1,63 (m, 4H), 1,51-1,45 (m, 3H), 1,42-1,37 (m, 3H).
Figure imgf000073_0004
Etapa 5: El compuesto 84 (5,6 g, 18,52 mmol) se disolvió en diclorometano anhidro (118 mL) y metanol anhidro (58,8 mL). Se agregaron (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (2,70 g, 17,64 mmol) y EEDQ (8,72 g, 35,3 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente, durante la noche. El disolvente se limpió y se agregó acetato de etilo. La suspensión resultante se filtró, se lavó con acetato de etilo y se secó al vacío/N2 para proporcionar el compuesto 85 (2,79 g, el 36 % de rendimiento).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 89,82 (s, 1H), 8,05, (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,01 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,46 (s, 2H), 6,95 (3, 1H), 5,21-5,12 (m, 2H), 4,47-4,42 (m, 4H), 4,40-4,33 (m, 1H), 4,33-4,24 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,33-2,26 (m, 2H), 2,16-2,09 (m, 2H), 1,54-1,46 (m, 4H), 1,30 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,22 (d, 3H, J = 4,4 Hz).
Figure imgf000074_0005
Etapa 6 : El Compuesto 85 (0,52 g, 1,189 mmol) y tetrabromuro de carbono (1,183 g, 3,57 mmol) se disolvieron en DMF anhidra (11,89 mL). Se agregó trifenilfosfina (0,935 g, 3,57 mmol) y la reacción se agitó en argón durante cuatro horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM/MeOH (10:1) y se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto 86 (262 mg, el 39% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 610,01 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 8,03 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,67 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,70-4,64 (m, 4H), 4,40-4,32 (m, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,34-2,26 (m, 2H), 2,18-2,10 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 4H), 1,31 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,21 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
Figure imgf000074_0001
Etapa 7 : Se preparó el compuesto 87 de forma similar al compuesto 11 en el ejemplo 1. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol) para proporcionar el compuesto 87 (336 mg, el 74% de rendimiento). LCMS = 5,91 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 990,6 (M 1)+.
Figure imgf000074_0002
Etapa 8 : Se preparó el compuesto 88 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. El material bruto se purificó mediante RPHp Lc (columna C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar el compuesto 88 (85,5 mg, el 25% de rendimiento). LCMS =6,64 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 992,6 (M 1)+.
Figure imgf000074_0003
Etapa 9 : Se preparó el compuesto 88 de forma similar a 22 en el ejemplo 2. El material bruto se pasó a través de un tapón de sílice para proporcionar el compuesto 89 (48,8 mg, el 80% de rendimiento). LCMS = 5,89 min (procedimiento de 15 min). MS m/z : 978,6 M 1+.
Figure imgf000074_0004
Etapa 10: Se preparó el compuesto 90 de forma similar a 14 en el ejemplo 1. El material bruto se purificó mediante RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13 tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, compuesto 90 (8,2 mg, el 30% de rendimiento). LCMS = 6,64 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1075,4 (M 1)+.
Ejemplo 7. Síntesis de 1-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)-1,4,7,10-tetraoxo-2,5,8,11-tetraazatetradecan-14-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (compuesto 63)
Cbz
Figure imgf000075_0001
Etapa 1: Se disolvieron Z-Gly-Gly-GIyOH compuesto 50 (1,0 g, 3,09 mmol) y p-alaninametiléster HCl (453 mg, 3,25 mmol) en DMF (12,37 mL). Se agregaron EDCHCl (623 mg, 3,25 mmol) y HOBt (497 mg, 3,25 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DIEA (1,08 mL, 6,19 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, se formó un lote de precipitado blanco. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Ch/MeOH (5:1, 30 mL) y se lavó con NaHCO3 sat., NH4Cl sat. y salmuera. La capa orgánica se puso turbia. Se agregó EtOAc (15 mL) a la capa orgánica para precipitar el producto. La mezcla se filtró y el sólido se lavó con agua (10 mL) y CH3CN (2 x 15 mL) para obtener el compuesto puro 51 como un polvo blanco (880 mg, el 70 % de rendimiento) sin purificación. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,16 (bt, 1H, J = 5,4 Hz), 8,11 (bt, 1H, J = 5,6 Hz), 7,88-7,85 (m, 1H), 7,49 (bt, 1H, J = 5,5 Hz), 7,40-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 3,74 (d, 2H, J = 5,5 Hz), 3,67 (t, 4H, J = 6,2 Hz), 3,60 (s,3H), 3,29 (q, 1H, J= 6,4 Hz), 2,47 (t, 3H, J=6,9 Hz).
Figure imgf000075_0002
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 51 (876 mg, 2,145 mmol) en MeOH (20,4 mL) y agua (1,02 mL) y se purgó con Ar. La solución se desgasificó durante 5 min. Se agregó lentamente Pd/C (10 %, húmedo con el 50 % de agua, 228 mg). Se burbujeó H2 a través de un balón durante un minuto. La reacción se agitó en un balón de H2 durante la noche. Se agregó H2O (~ 3 mL) a la mezcla de reacción para disolver todos los sólidos blancos formados. La solución luego se filtró a través de Celite y la torta del filtro se lavó con MeOH (30 mL) y se concentró. El residuo se disolvió en CH3CN (20 mL) y se concentró. Esto se repitió 2 veces más. El sólido gomoso resultante se precipitó con la adición de CH3CN (~ 15 mL). La suspensión blanca espesa se agitó durante 10 min, se filtró y se lavó con CH3CN. El sólido se secó al vacío/N2 durante 1,5 h para obtener el compuesto 52 como un sólido blanco (450 mg, 76% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,18-8,12 (m, 2H), 7,88 (t, 1H, J = 5,4 Hz), 3,75 (s, 2H), 3,65 (d, 2H, J = 5,9 Hz), 3,6 (s, 3H), 3,33-3,27 (m, 4H), 2,47 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,94 (bs, 1H).
Figure imgf000075_0003
Etapa 3: Se agregó NaOH (1,665 g, 41,6 mmol) a una solución agitada de benceno-1,3,5-tricarboxilato de trimetilo compuesto 53 (5 g, 19,82 mmol) en MeOH (66,1 mL) y agua (13,22 mL). La mezcla de reacción se sometió a reflujo en Ar durante 3 h. Se formaron lotes de precipitado blanco. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con H2O hasta que se disolvieron todos los sólidos. La mezcla se acidificó a pH ~ 2-3 con 5 N de HCl acuoso, se extrajo con EtOAc (3x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se disolvió en EtOAc caliente (50 mL) y se enfrió a temperatura ambiente lentamente. El precipitado se filtró (el precipitado era subproducto y no producto). El licor madre se concentró para obtener el compuesto 54 como un sólido blanco (3,45 g, el 78% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 613,62 (bs, 2H), 8,65 (s, 3H), 3,93 (s, 3H). LCMS = 3,209 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 244,90 (M+H).
Figure imgf000076_0001
Etapa 4: Se disolvió diácido compuesto 54 (1,0 g, 4,46 mmol) en THF (17,84 mL). La solución se enfrió a 0 °C y se agregó lentamente BH3 DMS (2 M en THF) (8,92 mL, 17,84 mmol) en Ar. La mezcla se agitó a 0 °C durante 5 min, luego se entibió a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La reacción se expuso al aire y se inactivó lentamente con MeOH, seguido de adición lenta de H2O hasta que no se observó ninguna evolución del gas. La mezcla se extrajo con EtOAc (2x) y las capas se separaron. Las capas orgánicas se lavaron con ~ 3 % H2O2 acuoso, solución de ácido cítrico ac. y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 20% y el 100%) para obtener diol compuesto 55 como un sólido blanco (385 mg, el 44% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 67,81 (s, 2H), 7,52 (s, 1H), 5,33 (bs, 2H), 4,56 (s, 4H), 3,86 (s, 3H).
Figure imgf000076_0002
Etapa 5: Se disolvió diol compuesto 55 (320 mg, 1,631 mmol) en DCM (10,9 mL) en Ar. La solución se enfrió a -5 °C y se agregó TEA (0,568 mL, 4,08 mmol), seguido de una adición lenta de MsCl (0,292 mL, 3,75 mmol), momento en el que el color se volvió inmediatamente amarillo tras la adición, luego rojo oscuro/marrón. La mezcla de reacción se agitó a -5 °C en Ar durante 1,5 h. La mezcla de reacción se inactivó con agua helada y se extrajo con EtOAc (2x). La capa orgánica se lavó con agua (2x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró para obtener el dimesilato puro compuesto 56 (435 mg, el 76 % de rendimiento).
Figure imgf000076_0003
Etapa 6: Se disolvió dimesilato compuesto 56 (435 mg, 1,11 mmol) en DMF (5,55 mL). Se agregó monómero IGN compuesto 10 (719 mg, 2,444 mmol), seguido de y K2CO3 (384 mg, 2,78 mmol) y se agitó a temperatura ambiente en Ar durante la noche. Se agregó agua (20 mL) para precipitar el producto. La suspensión se agitó durante 5 min, se filtró y se secó al vacío/N2 durante 1,5 h. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (EtOAc/hexanos, gradiente, entre el 50% y el 100%; luego el 5 % de MeOH/DCM) para obtener el compuesto 57 como un sólido amarillo (535 mg, el 64% de rendimiento, 2 etapas). LCMS = 6,973 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 749,4 (M+H).
Figure imgf000076_0004
Etapa 7 : Se disolvió el compuesto 57 (100 mg, 0,134 mmol) en DCE (1,34 mL). Se agregó trimetilestananol (362 mg, 2,003 mmol) y se calentó a 80 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con agua. La capa acuosa se acidificó a pH ~4 con 1 M HCl y se extrajo con DCM (3x), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se tapó a través de un tapón de sílice corto, se enjuagó con DCM/MeOH (10:1, 50 mL) y se concentró para obtener el compuesto 58 como un sólido amarillo pálido (100 mg, el 100 % de rendimiento). LCMS = 5,872 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 735,3 (M+H).
Figure imgf000077_0001
Etapa 8: Se disolvieron ácido compuesto 58 (80 mg, 0,087 mmol) y amina compuesto 52 (36 mg, 0,131 mmol) en DMF (871 |j L). Se agregaron EDCHCl (25 mg, 0,131 mmol) y DMAP (10,6 mg, 0,087 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Se agregó agua (4 mL) para precipitar el producto. La suspensión se agitó durante 5 min, se filtró y se secó al vacío/N2. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (MeOH/DCM, gradiente, entre el 0 % y el 20%) para obtener el compuesto 60 como un sólido amarillo (37 mg, el 43% de rendimiento). LCMS = 4,605 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 991,35 (M+H).
Figure imgf000077_0002
Etapa 9 : Se preparó el compuesto 61 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 61 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (8 mg, el 25% de rendimiento). LCMS = 5,421 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 993,7 (M+H).
Figure imgf000077_0003
Etapa 10: Se preparó el compuesto 62 de forma similar al compuesto 22 en el ejemplo 2. Se obtuvo el compuesto bruto 62 como un sólido amarillo después del taponamiento a través de un tapón de sílice corto (13 mg, el 90 % de rendimiento). LCMS = 4,693 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 979,35 (M+H).
Figure imgf000077_0004
Etapa 11: Se preparó el compuesto 63 de forma similar al compuesto 14 en el ejemplo 1. 1-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4] diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo [5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)-1,4,7,10-tetraoxo-2,5,8,11-tetraazatetradecan-14-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, se obtuvo el compuesto 63 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (4 mg, el 31 % de rendimiento). LCMS = 5,495 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1076,7 (M+H).
Ejemplo 8. Síntesis de 3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)benzamido) propanamido)propanamido)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (compuesto 70)
Figure imgf000078_0001
Etapa 1: Se disolvieron Z-L-Ala-L-Ala-OH compuesto 64 (3,0 g, 10,19 mmol) y p-alaninametiléster HCl (1,565 g, 11,21 mmol) en DMF (20,39 mL). Se agregaron Ed C h CI (2,15o g, 11,21 mmol) y HOBt (1,561 g, 10,19 mmol) seguido de DIPEA (4,44 mL, 25,5 mmol). Se agitó la reacción a temperatura ambiente en Ar durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NH4CI sat., NaHCO3 sat. y salmuera. Se agregaron hexanos a la capa orgánica, momento en el que la solución se volvió turbia con precipitado. La suspensión se agitó durante unos minutos, se filtró y se lavó con EtoAc/hexanos (3:1). El sólido se secó al vacío/N2 para obtener el compuesto 65 como un sólido blanco (3,11 g, 80% de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 67,91 (d, 2H, J = 7,0 Hz), 7,46 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 6,39-7,30 (m, 5H), 5,02 (d, 2H, J = 2,3 Hz), 4,20 (p, 1H, J = 7,2 Hz), 4,04 (p, 1H, J = 7,3 Hz), 3,59 (s, 3H), 3,30-3,22 (m, 1H), 2,45 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 1,18 (t evidente, 6H, J = 7,2 Hz). LCMS = 3,942 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (Es I+): 380,10 (M+H).
Figure imgf000078_0002
Etapa 2: Se disolvió el compuesto 65 (1,0 g, 2,64 mmol) en metanol (12,55 mL), agua (0,628 mL) y THF (2 mL). La solución se purgó con Ar y luego se desgasificó durante 5 min. Se agregó lentamente Pd/C (10 %, húmedo con el 50 % de agua, 0,140 g). Se burbujeó H2 en la solución durante un minuto y la reacción se agitó adicionalmente en un balón de H2 (1 atm) durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, se lavó con MeOH (30 mL) y se concentró. Se agregó CH3CN (15 mL) al residuo y se concentró. Esto se repitió 2 veces más para obtener el compuesto 66 como un sólido blanquecino (650 mg, el 100 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,03-7,99 (m, 2H), 4,24-4,18 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,31-3,22 (m, 5H), 2,46 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 1,17 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 1,12 (d, 3H, J = 6,9 Hz).
Figure imgf000078_0003
Etapa 3 : Se preparó el compuesto 67 de forma similar a 60 en el ejemplo 7. Se obtuvo el compuesto 67 como un sólido amarillo después de cromatografía en gel de sílice (69 mg, el 53 % de rendimiento). LCMS = 4,843 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 962,25 (M+H).
Figure imgf000078_0004
Etapa 4 : Se preparó el compuesto 68 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. Se obtuvo el compuesto 68 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (11,5 mg, el 19% de rendimiento). LCMS = 5,136 min (procedimiento de 8 min). Masa observada (ESI+): 964,35 (M+H).
Figure imgf000079_0001
Etapa 5: Se preparó el compuesto 69 de forma similar al compuesto 22 en el ejemplo 2. Se obtuvo el compuesto bruto 69 como un sólido amarillo después del taponamiento a través de un tapón de sílice corto (13 mg, el 100% de rendimiento). LCMS = 5,640 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 950,4 (M+H).
Figure imgf000079_0002
Etapa 6: Se preparó el compuesto 70 de forma similar al compuesto 14 en el ejemplo 1. 2,5-dioxopirrolidin-1-il-3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4] diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)benzamido) propanamido)propanamido) propanoato, se obtuvo el compuesto 70 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (5 mg, el 35 % de rendimiento). LCMS = 6,138 min (procedimiento de 15 min). Masa observada (ESI+): 1047,4 (M+H).
Ejemplo 9. Síntesis de ácido (12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-mercapto-4-metilpentanamido)acetamido) acetamido)acetamido)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4] diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)bencil)oxi)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-12-sulfónico (compuesto 98)
Figure imgf000079_0003
Etapa 1: se disolvieron el compuesto 4 (2,0 g, 8,15 mmol) y ácido 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanoico (1,743 g, 8,97 mmol) en DMF anhidro (27,2 mL). Se agregaron EDCHCl (1,719 g, 8,97 mmol) y HOBt (1,249 g, 8,15 mmol) seguido de DIPEA (2,85 mL, 16,31 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con diclorometano/metanol (5:1) y se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado y salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se limpió. El aceite bruto se destiló de forma azeotrópica con acetonitrilo (3x), luego se bombeó en vacío alto a 35 °C durante aproximadamente 1,5 horas para proporcionar el compuesto 91, el cual se tomó sin purificación adicional (3,44 g, el 100 % de rendimiento). 1H NMR (400 Mh z , DMSO-d6): 68,18-8,09 (m, 3H), 3,76-3,68 (m, 6H), 2,41 (s, 3H), 2,28-2,21 (m, 2H), 1,84-1,77 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,25 (s, 6H).
Figure imgf000079_0004
Etapa 2: El compuesto 91 (3,44 g, 8,15 mmol) se agitó en TFA (12,56 mL, 163 mmol) y agua desionizada (0,65 mL) a temperatura ambiente durante 3,5 horas. La reacción se diluyó con acetonitrilo y se evaporó hasta que se secó. El sólido bruto se suspendió con acetato de etilo, se filtró y se enjuagó con acetato de etilo y luego diclorometano/metanol (1 :1 ) para proporcionar el compuesto 92 (2,98 g, el 100 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 68,19-8,08 (m, 3H), 3,80-3,68 (m, 6H), 2,41 (s, 3H), 2,28-2,20 (m, 2H), 1,85-1,76 (m, 2H), 1,25 (s, 6H).
Figure imgf000080_0001
Etapa 3: El compuesto 92 (1,74 g, 4,76 mmol) se disolvió en diclorometano (30,2 mL) y metanol (15,11 mL). Se agregaron N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (2,243 g, 9,07 mmol) y (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (0,695 g, 4,53 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó y se agregó acetato de etilo. El sólido se filtró a través de Celite y se lavó con acetato de etilo y luego metanol. El filtrado se evaporó y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol) para proporcionar el compuesto 93 (569 mg, el 25 % de rendimiento). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 69,74 (s, 1H), 8,24-8,15 (m, 3H), 7,45 (s, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,17 (t, 2H, J = 5,6 Hz), 4,45 (d, 4H, J = 5,6 Hz,), 3,87 (d, 2H, J = 6,0 Hz,), 3,77 (d, 2H, J = 6,0 Hz,), 3,73 (d, 2H, J = 5,6 Hz,), 2,40 (s, 3H), 2,28-2,21 (m, 2H), 1,83 -1,76 (m, 2H), 1,24 (s, 6H).
Figure imgf000080_0002
Etapa 4: El Compuesto 93 (305 mg, 0,609 mmol) se suspendió en DCM anhidro (5,992 mL). Se agregó DMF anhidro hasta que la solución se volvió homogénea (~2,5 mL). La solución se enfrió a -10 °C en un baño de acetona/hielo seco. Se agregaron trietilamina (0,425 mL, 3,05 mmol), seguido de anhídrido metanosulfónico (274 mg, 1,523 mmol). La mezcla se agitó a -10 °C durante 1 hora. La reacción se inactivó con agua helada y se extrajo con acetato de etilo/metanol helado (20:1). La capa orgánica se lavó con agua helada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y concentró. El material bruto se secó en vacío alto para proporcionar el compuesto 94 (380 mg, el 95 % de rendimiento). LCMS = 4,2 min (procedimiento de 15 min). m S (m/z): 655,0 (M-1)-.
Figure imgf000080_0003
Etapa 5: Se preparó el compuesto 95 de forma similar al compuesto 57 en el ejemplo 7. El sólido bruto se disolvió en diclorometano/metanol (10:1), se lavó con agua y la orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El disolvente se extrajo in vacuo y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol) para proporcionar el compuesto 95 (445 mg, el 42% de rendimiento, el 54% de pureza). LCMS = 6,64 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1053,4 (M 1)+ y 1051,3 (M -1)-.
Figure imgf000080_0004
Etapa 6: Se disolvió el compuesto 95 (445 mg, 0,423 mmol) en 1,2-dicloroetano (2,82 mL). Se agitó triacitoxiborohidruro de sodio (80 mg, 0,359 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. La reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con cloruro de amonio saturado. La capa orgánica se lavó con salmuera y se secó para proporcionar una mezcla de los compuestos 95, 96 y 96a (496 mg). La mezcla bruta se disolvió en 2-propanol (39,17 mL) y agua (19,59 mL). Se agregó bisulfito de sodio (245 mg, 2,35 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas. La mezcla se congeló y liofilizó para proporcionar un sólido blanco esponjoso que se purificó mediante RPHPLC (C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar el compuesto 97 (54 mg, el 10 % de rendimiento) y el compuesto 96a (24 mg, el 5 % de rendimiento). LCMS (compuesto 97) = 4,83 min (procedimiento de 15 min) y LCMS (compuesto 96a) = 8,05 min (procedimiento de 15 min).
Figure imgf000081_0001
Etapa 7: a una solución agitada del compuesto 97 (54 mg, 0,047 mmol) en CH3CN (3,85 mL) se agregó solución amortiguadora de TCEP/pH 6,5 reacción preparada (TCEPHCl (46,7 mg), se disolvió en unas gotas de agua desionizada, seguido de goteo de bicarbonato de sodio saturado hasta pH ~ 6,5. La solución se diluyó con 0,55 mL de pH=6,5, 1 M de amortiguador de fosfato de sodio y metanol (2.75 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se congeló y se liofilizó. El sólido se purificó mediante RPHPLC (C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar ácido (12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-mercapto-4-metilpentanamido)acetamido) acetamido)acetamido)-5-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4] diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)bencil)oxi)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indole-12-sulfónico, compuesto 98 (2 mg, el 4% de rendimiento). LCMS = 4,32 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1089,3 (M -1)-.
Ejemplo 10. Síntesis de N-(2-((2-((2-((3,5-bis((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)-4-mercapto-4-metilpentanamida (compuesto 99)
Figure imgf000081_0002
Se preparó el compuesto 99 de forma similar al compuesto 98 en el ejemplo 9. N-(2-((2-((2-((3,5-bis((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)fenil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)-4-mercapto-4-metilpentanamida, se obtuvo el compuesto 99 como un sólido blanco después de la purificación de C18 (6,3 mg, el 27 % de rendimiento). LCMS = 7,26 min (procedimiento de 15 min). MS (m/z): 1033,5 (M Na)+.
Ejemplo 11. Preparación de huMOV19-14
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 8 equivalentes molares compuesto 14 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEpES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v codisolvente DMA (W,A/-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 6 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 20 horas a 4°C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 20.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3,0 de moléculas de IGN91 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.280 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 14, y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 90 % de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <0,1 % del compuesto no conjugado 14 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 0,78 mg/ml. Se encontró que el compuesto conjugado era >87 % intacto mediante análisis de chip de gel. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7A.
Ejemplo 12. Preparación de huMOV19-sulfo-SPDB-98
Una mezcla in situ que contenía concentraciones finales de 3,9 mM del compuesto 98 y 3 mM de enlazador sulfo-SPDB en un DMA que contenía 10 mM de W,W-diisopropiletilamina (DIPEA) se incubó durante 60 min antes de agregar un exceso de 20 veces del compuesto resultante 98-sulfo-SPDB-NHS a una reacción que contenía 4 mg/ml de anticuerpo huMOV19 en 15 mM de HEPES pH 8,5 (90:10 agua: DMA). La solución se dejó conjugar durante la noche a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 100 mM de glicina, 20 mM de arginina, 2% de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante la noche a 4°C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 10.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3,7 de moléculas del compuesto 98 unidas por anticuerpo (mediante SEC utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.484 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 98, y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 99% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño) y una concentración de proteína final de 0,18 mg/ml. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7A.
Ejemplo 13. Preparación de huMOV19-35
Una reacción que contenía 2,5 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 5 equivalentes molares del compuesto 35, (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v codisolvente DMA (W,W-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 6 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 8 horas a temperatura ambiente utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 10.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,9 de moléculas del compuesto 35 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.484 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para IGN128 y £280 = 201.400 cm_1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 97% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <1% del compuesto no conjugado 35 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 1,4 mg/ml. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7A.
Ejemplo 14. Preparación de huMOV19-63
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 7 equivalentes molares del compuesto 63 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v codisolvente DMA (W,W-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 6 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 20 horas a 4°C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 20.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,7 de moléculas del compuesto 63 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.280 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para IGN131 y £280 = 201.400 cm_1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 99% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <0,1% del compuesto no conjugado 63 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 1,6 mg/ml. Se encontró que el compuesto conjugado era >90% intacto mediante análisis de chip de gel. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7B.
Ejemplo 15. Preparación de huMOV19-80
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 7 equivalentes molares del compuesto 80 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v codisolvente DMA (W,W-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 6 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 20 horas a 4°C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 20.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,5 de moléculas del compuesto 80 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.280 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 80 y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 99% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <0,1% del compuesto no conjugado 80 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 2,4 mg/ml. Se encontró que el compuesto conjugado era >90% intacto mediante análisis de chip de gel.
Ejemplo 16. Preparación de huMOV19-90
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 3,9 equivalentes molares del compuesto 90 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 95:5 DMA:50 mM de succinato pH 5,5 durante 4 horas a 25 °C) en 15 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v codisolvente DMA (W,A/-dimetilacetamida) se incubó durante 4 horas a 25 °C. Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 10 mM de succinato, 50 mM de cloruro de sodio, 8,5% p/v de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 4 horas a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 30.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía una concentración de proteína final de 1,8 mg/ml y un promedio de 2,7 de moléculas del compuesto 90 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.280 cm-1M-1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para IGN152 y £280 = 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 98,3% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño); y <1,1% del compuesto no conjugado 90 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa). Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7B.
Ejemplo 17. Preparación de huMOV19-49
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 5 equivalentes molares del compuesto 49 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 10% v/v codisolvente DMA (W,A/-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 4 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 4 horas a temperatura ambiente utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 20.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,8 de moléculas del compuesto 49 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.280 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 49 y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 94% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <0,1% del compuesto no conjugado 49 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 1,5 mg/ml. Se encontró que el compuesto conjugado era >95% intacto mediante análisis de chip de gel. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7C.
Ejemplo 18. Preparación de huMOV19-sulfo-SPDB-99
Una mezcla in situ que contenía concentraciones finales de 1,95 mM del compuesto 99 y 1,5 mM de enlazador sulfo-SPDB en DMA que contenía 10 mM de W,A/-diisopropiletilamina (DIPEA) se incubó durante 20 min antes de la formación de casquetes con 4 mM de ácido maleimidopropiónico MPA. Un exceso de 6 veces del 99-sulfo-SPDB-NHS resultante se agregó a una reacción que contenía 2,5 mg/ml de anticuerpo huMOV19 en 15 mM de HEPES pH 8,5 (82:18 agua: DMA). La solución se dejó conjugar durante la noche a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 20 mM de histidina, 50 mM de cloruro de sodio, 8,5% de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante la noche a 4°C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 10.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 1,6 de moléculas del compuesto 99 unidas por anticuerpo (mediante UV/Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.484 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 99, y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 99% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño) y una concentración de proteína final de 0,59 mg/ml. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7C.
Ejemplo 19. Preparación de huMOV19-70
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 5 equivalentes molares del compuesto 70 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 10% v/v codisolvente DMA (W,A/-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 4 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 20 mM de histidina, 100 mM de arginina, 2% de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Después de la purificación, se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 18 horas a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 20.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3,0 de moléculas del compuesto 70 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.484 cm'1M'1 y £280 nm= 30.115 cm'1M'1 para el compuesto 70 y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 94% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <0,1% del compuesto no conjugado 70 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 1,3 mg/ml.
Ejemplo 20. Preparación de huMOV19-23
Una reacción que contenía 2,5 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 4 equivalentes molares del compuesto 23 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:agua) en 50 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v codisolvente DMA (W,W-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 6 horas a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 8 horas a temperatura ambiente utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 10.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,8 de moléculas del compuesto 23 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.484 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 23 y £280 nm= 201.400 cm'1M'1 para anticuerpo huMOV19), el 98% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño), <3% del compuesto no conjugado 23 (mediante precipitación de acetona, análisis HPLC de fase inversa) y una concentración de proteína final de 1,3 mg/ml. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 7D.
Ejemplo 21. Ensayo de citometría de flujo para la afinidad de unión de los conjugados huMOV19-14, huMOV19-90 y huMOV19-107
Se diluyeron 100 pl/pocillo del conjugado huMOV19-14, huMOV19-90 o huMOV19-107 o el anticuerpo huMOV19 en amortiguador FACS (1 % de BSA, 1x PBS) en una placa de 96 pocilios (Falcon, fondo redondo) en una concentración inicial de 3x 10-8 M por duplicado y se diluyeron en serie 3 veces en amortiguador FACS a 4 °C. Se cultivaron células T47D (tumor de mama humano) en RPMI-l640 (Life Technologies) complementado con 10 % de FBS inactivado con calor (Life Technologies), 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y 0,2 IU de insulina bovina/ml (Sigma), se lavaron una vez en PBS y se retiraron con versene (Life Technogies). Se resuspendieron las células T47D en medio de cultivo (véase arriba) para neutralizar la versene y se contabilizaron en un contador Coulter. Se lavaron las células dos veces en amortiguador FACS frío, se centrifugaron entre los lavados a 1200 rpm durante 5 min. Se añadieron 100 pl/ml de 2x104 células/pocillo a los pocillos que contenían el conjugado, anticuerpo o amortiguador FACS solo y se incubaron a 4 °C durante 2 h. Después de la incubación, se centrifugaron las células como antes y se lavaron una vez en 200 pl/pocillo de amortiguador FACS frío. Se tiñeron las células con 200 pl/pocillo de anticuerpo secundario Anti-Humano-IgG-FcY de cabra conjugado con FITC (los controles incluidos fueron células sin teñir y células teñidas solo con el anticuerpo secundario) durante 40 min a 4 °C, se centrifugaron y se lavaron una vez en 200 pl/pocillo de PBS-D frío. Se fijaron las células en 200 pl/pocillo de 1 % de formaldehído/PBS-D y se almacenaron a 4 °C. Después del almacenamiento, se detectó la tinción de la superficie celular del conjugado o el anticuerpo utilizando citometría de flujo en un FACS Calibur (BD Biosciences). Se graficaron las medias geométricas contra la concentración logarítmica del conjugado o el anticuerpo utilizando GraphPad Prism y se calculó el EC50 a través de un análisis de regresión logística de 4 parámetros no lineal.
El ensayo de unión se repitió para el conjugado huMOV19-90 y los datos se muestran en la figura 15B.
Tal como se muestra en la figura 1, la figura 15A, la figura 15B y la figura 20, los conjugados se unen de forma similar a la superficie de células T47D que expresan el antígeno diana que el anticuerpo no conjugado en citometría de flujo, demostrando así que la unión no se ve afectada por el proceso de conjugación.
Ejemplo 22. Ensayo de citotoxicidad para el conjugado huMOV19-14
Se diluyeron 100 pl/pocillo de conjugado huMOV19-14 en RPMI-1640 (Life Technologies) complementado con 10 % de FBS inactivado con calor (Life Technologies) y 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) en una placa de 96 pocillos (Corning, fondo plano) en concentraciones iniciales de 3,5x10-9M a 3,5 x10-8 M por triplicado y se diluyeron en serie 3 veces en el medio anterior a temperatura ambiente. Se lavaron células KB (tumor epitelial bucal), cultivadas en EMEM (ATCC) complementado con 10% de FBS inactivado con calor (Life Technologies) y 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) una vez en PBS y se retiraron con 0,05% de tripsina-EDTA (Life Technologies). Se resuspendieron las células KB en medio de cultivo (véase arriba) para neutralizar la tripsina y se contabilizaron en un contador Coulter. Se añadieron 100 pl/ml de 1x103 células/pocillo a pocillos que contenían el conjugado o medio solo y se incubaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2 durante 5 días con y sin 1 pM de anticuerpo anti-FOLR1 de bloqueo (huMOV19). El volumen total es de 200 pl/pocillo. Después de la incubación, se analizó la viabilidad celular mediante el añadido de 20 pl/pocillo de WST-8 (Dojindo) y se dejaron crecer durante 2 h. Se leyó la absorbancia en un lector de placas a 450 y 620 nm. Se restaron las absorbancias a 620 nm de las absorbancias a 450 nm. Se restó adicionalmente el fondo en los pocillos que contenían medio solo de las absorbancias corregidas y la fracción superviviente (SF) de células sin tratar se calculó en Excel. Se creó una gráfica XY de concentración de ADC (M) en función de SF utilizando Graph Pad Prism.
Tal como se muestra en la figura 2, el conjugado es altamente potente contra las células KB con un IC50 de 4x10-12 M. La adición de un exceso de anticuerpo no conjugado reduce significativamente el efecto citotóxico, lo que demuestra especificidad de antígeno.
Ejemplo 23. Ensayo de citotoxicidad no específica para los conjugados huMOV19-14 y huMOV19-90
Se diluyeron 100 pl/pocillo de huMOV19-14 o huMOV19-90 en RPMI-1640 (Life Technologies) complementado con 10 % de FBS inactivado con calor (Life Technologies), 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) y pME (Life Technologies) en una placa de 96 pocillos (Falcon, fondo redondo) en concentraciones entre 1 e-10 M y 4 e-10 M por sextuplicado. Ambas células 300.19 (ratón) con expresión de FOLR1(FR1#14) recombinante o sin vector de expresión (parental) se contaron en un contador Coulter. Se añadieron 50 pl/ml de 1000 células FR1#14/pocillo a pocillos que contenían el conjugado o medio solo, se añadieron 50 pl/ml de 2000 células parentales/pocillo a pocillos que contenían el conjugado o medio solo y ambas FR1#14 y las células parentales se añadieron juntas a pocillos que contenían el conjugado o medio solo. Se incubaron todas las placas en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2 durante 4 días. El volumen total fue de 150 pl/pocillo. Después de la incubación, se analizó la viabilidad celular mediante el añadido de 75 pl/pocillo de Cell Titer Glo (Promega) y se dejaron crecer durante 45 min. Se leyó la luminiscencia en un luminómetro y se sustrajo el fondo en los pocillos que contenían medio solo de todos los valores. Se graficó una gráfica de barras del promedio de cada tratamiento de células utilizando Graph Pad Prism.
Tal como se muestra en la figura 3, el conjugado huMOV19-14 presenta efecto citotóxico testigo débil en las células negativas al antígeno vecinas.
Tal como se muestra en la figura 13, el conjugado huMov19-90 presenta actividad de destrucción no específica fuerte.
Ejemplo 24. Ensayo de citotoxicidad in vitro para el conjugados huMy9-6-14
Se agregaron diluciones de conjugados a pocillos de placas de 96 pocillos que contenían entre 2 x 103 y 1 x 104 células por pocillo en medio de crecimiento adecuado. Se incluyeron en cada placa de ensayo pocillos de control que contenían células y el medio, pero que carecían de los compuestos de prueba, así como pocillos que contenían el medio solo. Las placas se incubaron de cuatro a seis días a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía el 6 % de CO2. Luego se agregó reactivo WST-8, 10 % v/v, (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD), a los pocillos y las placas se incubaron a 37 °C de 2 a 6 h. Luego se midió la absorbancia en un espectrofotómetro lector de placas en el modo de longitud de onda doble 450 nm/650 nm y se sustrajo la absorbancia en 650 nm (dispersión de luz no específica por células). Se calculó la fracción superviviente evidente de células en cada pocillo mediante la corrección en primer lugar para la absorbancia de fondo de medio y después dividiendo cada valor entre el promedio de los valores en los pocillos de control (células no tratadas).
Tal como se muestra en la figura 3, el conjugado es altamente potente contra diversas células cancerosas positivas del antígeno; mientras las células L-540 negativos del antígeno permanecen cuando se exponen al mismo conjugado.
Ejemplo 25. Ensayo de citotoxicidad no específica para el conjugados huMy9-6-14
SE realizaron pruebas preliminares para determinar la concentración de huMy9-6-14 que no era citotóxica para las células RADA-1 negativas del antígeno, pero destruyó todas las células KARA positivas del antígeno. Se colocaron en placas RADA-1 (500 células por pocillo) y KARA (500, 1000, 2000, 4000 células por pocillo) en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se prepararon diluciones de huMy9-6-14 en el medio de cultivo celular (medio RPMI1640 complementado con el 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor y 50 mg/L de gentamicina) y se agregaron a las células. Se incubaron las placas durante 4 días a 37 °C y se determinó la viabilidad de las células en cada pocillo utilizando reactivo WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.). Para evaluar la potencia no específica de los conjugados, se mezclaron células Ra Da -1 y células KARA en diferentes proporciones (500 células RADA-1 más ninguna célula KARA; 500 células RADA-1 más 500 células KARA; 500 células RADA-1 más 1000 células KARA; 500 células RADA-1 más 2000 células KARA; 500 células RADA-1 más 4000 células KARA) y se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Luego se agregaron 1,0e-9M o 5,0e-10M de huMy9-6-14 - las concentraciones que no eran citotóxicas para las células RADA-1 pero que destruyeron todas las células KARA - a las mezclas celulares. Se incubaron placas durante 4 días a 37 °C y se determinó la viabilidad de las células RADA-1 en cada pocillo utilizando reactivo WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.). Se midió la absorbancia en un espectrofotómetro lector de placas en el modo de longitud de onda doble 450 nm/650 nm y se sustrajo la absorbancia en 650 nm (dispersión de luz no específica por células).
Tal como se muestra en la figura 5, el conjugado presenta efecto de destrucción no específica en las células negativas del antígeno vecinas.
Ejemplo 26. Actividad antitumoral de huMOV19-80 y huMOV19-90 de dosis única contra xenoinjertos NCI-H2110 NSCLC en ratones SCID hembra
Los ratones SCID CB.17 hembra, de 6 semanas, fueron proporcionados por Charles River Laboratories. Se inocularon los ratones con 1 x 107 células tumorales de NCI-H2110 suspendidas en 0,1 ml de 50 % de matrigel/medio libre de suero mediante inyección subcutánea en el costado derecho. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3 (día 7 después de la inoculación), se aleatorizaron los animales basándose en el volumen tumoral en 5 grupos de 6 ratones cada uno. Los ratones recibieron una administración IV única de control de vehículo (0,2 ml/ratón), huMOV19-80 o huMOV19-90 en 5 y 25 pg/kg basándose en concentración de huMOV19-80 o huMOV19-90 en el día 1 (día 8 después de la inoculación). huMOV19 es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente al receptor 1 de folato (FOLR1).
Se midió el tamaño de los tumores entre dos y tres veces por semana en tres dimensiones utilizando un calibrador. Se expresó el volumen tumoral en mm3 utilizando la fórmula V = longitud x ancho x altura x 1. Se consideró que un ratón tenía una regresión parcial (PR) cuando el volumen del tumor se reducía en un 50 % o más y una regresión tumoral completa (CR) cuando no se podía detectar ningún tumor palpable. Se determinó el volumen tumoral con el software StudyLog.Se determinó la inhibición del crecimiento tumoral (valor de T/C) utilizando la siguiente fórmula: T/C (%) = volumen tumoral medio de los tratados / volumen tumoral medio de control x 100.
Se determinó el volumen tumoral simultáneamente para los grupos tratados (T) y de control de vehículo (C) cuando el volumen tumoral del control de vehículo alcanzaba un tamaño predeterminado de 1000 mm3. Se determinó el volumen tumoral medio diario de cada grupo tratado, incluidos los ratones sin tumor (0 mm3). De acuerdo con las normas NCI, un T/C < 42 % es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C <10 % se considera un nivel de actividad antitumoral alto.
Tal como se muestra en la figura 6, el conjugado huMOV19-90 es altamente activo en la dosis de 5 y de 25 pg/kg; mientras que el conjugado huMOV19-80 es altamente activo en la dosis de 25 pg/kg.
Ejemplo 27. Preparación de huML66-90
Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huML66, un anticuerpo anti-EGFR (véase WO 2012/058592) y 3,5 equivalentes molares del compuesto 90 (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 90:10 DMA:50 mM de succinato pH 5,5 durante 4 horas a 25 °C) en 15 mM de amortiguador HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico) a pH 8,5 y el 10% v/v codisolvente DMA (N,N-dimetilacetamida) se incubó durante 4 horas a 25 °C. Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 20 mM de histidina, 50 mM de cloruro de sodio, 8,5% p/v de sucrosa, 0,01 % de Tween-20, 50 pM de amortiguador de formulación de bisulfito de sodio pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante 4 horas a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 30.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía una concentración de proteína final de 0,9 mg/ml y un promedio de 2,7 de moléculas del compuesto 90 unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molares 8330 nm= 15.280 cm-1M-1 y 8280 nm= 30, 115 cm-1M-1 para el compuesto 90, y 8280 nm= 205.520 cm-1M-1 para el anticuerpo huML66); el 99,1 % de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño); y el <1 % de IGN149 no conjugado (análisis HPLC de fase inversa de columna doble). Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 8.
Ejemplo 28. Ensayos citotóxicos in vitro para el conjugado huML66-90
Se midió la capacidad del conjugado huML66-90 de inhibir el crecimiento celular utilizando ensayos de citotoxicidad in vitro. Las células diana se colocaron en placas en 1-2.000 células por pocillo en 100 pL en medio RPMI completo (RPMI-1640, 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina, el 1 % de penicilina-estreptomicina, todos reactivos de Invitrogen). Los anticuerpos se diluyeron en medio RPMI completo utilizando series de dilución de 3 veces y se agregaron 100 pL por pocillo. La concentración final típicamente osciló entre 3 x 10-8 M y 4,6 x 10-12 M. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 durante 5-6 días. Se determinó la viabilidad de las células restantes mediante ensayo WST-8 colorimétrico (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, US). WST-8 se reduce por deshidrogenasas en las células vivas a un producto de formazán naranja que es soluble en medios de cultivo tisular. La cantidad de formazán producido es directamente proporcional a la cantidad de células vivas. Se agregó WST-8 a 10 % del volumen final y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 durante un adicional de 2-4 horas. Las placas se analizaron mediante la medición de la absorbancia en 450 nm (A450) en un lector de placas multipocillos. Se sustrajo la absorbancia A450 de fondo de los pocillos con medio y WST-8 solo de todos los valores. Se calculó el porcentaje de viabilidad dividiendo el valor de cada muestra tratada por el valor promedio de pocillos con células no tratadas. Porcentaje de viabilidad = 100* (muestra tratada de A450 - A450 de fondo)/ (muestra no tratada A450 - A450 de fondo). El valor del porcentaje de viabilidad se graficó contra la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica para cada tratamiento. Se generaron curvas con respuesta a la dosis mediante regresión no lineal y se calculó el valor de EC50 de cada curva utilizando GraphPad Prism (GraphPad software, San Diego, CA).
Actividad citotóxica in vitro
Se evaluó la citotoxicidad in vitro del conjugado huML66-90 en presencia y ausencia de exceso de anticuerpo no conjugado y se comparó con la actividad de un conjugado huIgG-90 no específico en células que expresaban e Gf R y los resultados de un ensayo de citotoxicidad típico se muestran en la figura 9. El conjugado huML66-90 produjo la destrucción celular específica de células SCC-HN Detroit-562 con un valor de EC50 de 16 pM. La presencia de exceso de anticuerpo no conjugado redujo significativamente la actividad y produjo un valor de EC50 de aproximadamente 2 nM. De forma similar, el conjugado huIgG-90 sin ningún anticuerpo de control huIgG que no es de unión produjo la destrucción celular con un valor de EC50 de aproximadamente 8 nM.
Del mismo modo, el conjugado huML66-90 produjo una destrucción celular específica de las células NCI-H292 NSCLC con un valor de EC50 de 12 pM. La presencia de exceso de anticuerpo no conjugado redujo significativamente la actividad y produjo un valor de EC50 de aproximadamente 2 nM. De forma similar, el conjugado huIgG-90 sin ningún anticuerpo de control huIgG que no es de unión produjo la destrucción celular con un valor de EC50 de aproximadamente 8 nM.
De forma similar, también se observó la destrucción celular específica de células NCI-H1703.
Tabla 1.
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Ejemplo 29. Actividad citotóxica in vitro para huMOV19-90
Se diluyeron 100 pl/pocillo de conjugado huMOV19-90 en RPMI-1640 (Life Technologies) complementado con 10 % de FBS inactivado con calor (Life Technologies) y 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) en una placa de 96 pocillos (Corning, fondo plano) en concentraciones iniciales entre 3,5e-9 M y 3,5 e-8 M por triplicado y se diluyeron en serie 3 veces en el medio anterior a temperatura ambiente. Se lavaron células KB (tumor epitelial bucal), cultivadas en EMEM (ATCC) complementado con 10% de FBS inactivado con calor (Life Technologies) y 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies) una vez en PBS y se retiraron con 0,05 % de tripsina-EDTA (Life Technologies). Otras células evaluadas fueron NCI-H2110 (NSCLC) y T47D (epiteliales de mama) cultivadas en RPMI-1640 (LifeTechnologies) complementado con 10 % de FBS inactivado con calor (Life Technologies) y 0,1 mg/ml de gentamicina (Life Technologies). También se complementó el medio de T47D con 0,2 lU/ml de insulina bovina. Se resuspendieron todas las células en medio de cultivo (véase arriba) para neutralizar la tripsina y se contabilizaron utilizando un hemacitómetro. Se añadieron 100 pl/ml de 1000 células KB/pocillo o 2000 células T47D y NCI-H2110/pocillo a pocillos que contenían el conjugado o medio solo y se incubaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2 durante 5 días con y sin 1 pM de anticuerpo anti-FOLR1 de bloqueo (huMOV19). El volumen total es de 200 pl/pocillo. La concentración inicial de cada conjugado en células KB fue de 3,5e-9 M y para células T47D y NCI-H2110, la concentración inicial de cada conjugado fue de 3,5e-8 M. Después de la incubación, se analizó la viabilidad celular mediante el añadido de 20 pl/pocillo de WST-8 (Dojindo) y se dejaron crecer durante 2 h. Se leyó la absorbancia en un lector de placas a 450 y 620 nm. Se restaron las absorbancias a 620 nm de las absorbancias a 450 nm. Se restó adicionalmente el fondo en los pocillos que contenían medio solo de las absorbancias corregidas y la fracción superviviente (SF) de células sin tratar se calculó en Excel. Se creó una gráfica XY de concentración de ADC (M) en función de SF utilizando Graph Pad Prism.
Tal como se muestra en las figuras 10-12 y la tabla 2, el conjugado huMOV19-90 es altamente potente contra las células KB, las células T47 D y las células NCI-H2110. La adición de un exceso de anticuerpo no conjugado reduce significativamente el efecto citotóxico, lo que demuestra especificidad de antígeno.
Tabla 2.
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En otro experimento, se midió la capacidad de los conjugados de inhibir el crecimiento celular utilizando un ensayo de citotoxicidad in vitro basado en WST-8. Se trataron células en placas de 96 pocillos (típicamente, 1x103 por pocillo) con el conjugado en diversas concentraciones en un medios de cultivo celular adecuado con un volumen total de 0,2 ml. Se incluyeron en cada placa de ensayo pocillos de control que contenían células y el medio, pero que carecían de los compuestos de prueba, y pocillos que contenían el medio solo. Las placas se incubaron de 4 a 6 días a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía el 6 % de CO2. Luego se agregó reactivo WST-8 (10 %, volumen/volumen; Dojindo Molecular Technologies), a los pocillos y las placas se incubaron a 37 °C de 2 a 6 horas dependiendo de la línea celular. Luego, se midió la absorbancia en un espectrofotómetro lector de placas en el modo de longitud de onda doble 450 nm/620 nm y se sustrajo la absorbancia en 620 nm (dispersión de luz no específica por células). Los valores de OD450 resultantes se utilizaron para calcular fracciones supervivientes evidentes de las células utilizado GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA). Se calculó la fracción superviviente evidente de células en cada pocilio mediante la corrección en primer lugar para la absorbancia de fondo de medio y después dividiendo cada valor entre el promedio de los valores en los pocillos de control (células no tratadas). Se generaron curvas de respuesta a la dosis mediante regresión no lineal utilizando una curva sigmoidea con pendiente variable en Graph Pad Prism. Se generó IC50 (concentración inhibidora 50 %) a través del software.
Los conjugados eran activos contra las líneas celulares evaluadas Ishikawa (cáncer de endometrio), KB (cáncer de cuello uterino) y NCI-H2110 (cáncer de pulmón de células no pequeñas) como se muestra en la figura 21 y la tabla 3. La actividad de destrucción de células era dependiente de FOLR1, debido a que un exceso de anticuerpo huMOV19 no modificado (1 |j M) disminuyó considerablemente la potencia del conjugado (entre 20 y 200 veces).
Tabla 3
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Ejemplo 30. Actividad antitumoral del conjugado huMOV19-90 de dosis única contra xenoinjertos NCI-H2110 NSCLC en ratones SCID hembra
Los ratones SCID CB.17 hembra, de 6 semanas, fueron proporcionados por Charles River Laboratories. Se inocularon los ratones con 1 x 107 células tumorales de NCI-H2110 suspendidas en 0,1 ml de 50 % de matrigel/medio libre de suero mediante inyección subcutánea en el costado derecho. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3 (día 7 después de la inoculación), se aleatorizaron los animales basándose en el volumen tumoral en 4 grupos de 6 ratones cada uno. Los ratones recibieron una administración IV única de control de vehículo (0,2 ml/ratón) o huMOV19-90 en 1, 3 o 5 jg/kg basándose en la concentración del compuesto 90 en el día 1 (día 8 después de la inoculación).
Se midió el tamaño de los tumores entre dos y tres veces por semana en tres dimensiones utilizando un calibrador. Se expresó el volumen tumoral en mm3 utilizando la fórmula V = longitud x ancho x altura x 1. Se consideró que un ratón tenía una regresión parcial (PR) cuando el volumen del tumor se reducía en un 50 % o más y una regresión tumoral completa (CR) cuando no se podía detectar ningún tumor palpable. Se determinó el volumen tumoral con el software StudyLog.
Se determinó la inhibición del crecimiento tumoral (valor de T/C) utilizando la siguiente fórmula:
T/C (%) = volumen tumoral medio de los tratados / volumen tumoral medio de control x 100.
Se determinó el volumen tumoral simultáneamente para los grupos tratados (T) y de control de vehículo (C) cuando el volumen tumoral del control de vehículo alcanzaba un tamaño predeterminado de 1000 mm3. Se determinó el volumen tumoral medio diario de cada grupo tratado, incluidos los ratones sin tumor (0 mm3). De acuerdo con las normas NCI, un T/C < 42 % es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C <10 % se considera un nivel de actividad antitumoral alto. Tal como se muestra 14, el conjugado huMOV19-90 es activo en dosis de 3 jg/kg y es altamente activo en dosis de 5 jg/kg.
Ejemplo 31. Síntesis del compuesto 107
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82 100
Etapa 1: Se disolvieron el compuesto 82 (500 mg, 2,31 mmol), ácido 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanoico (449 mg, 2,31 mmol), EDCHCl (465 mg, 2,43 mmol), HOBt (354 mg, 2,31 mmol) y DIPEA (0,81 mL, 4,62 mmol) en DMF (7,7 mL) y se agitó durante la noche hasta que la reacción se completó. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con bicarbonato de sodio saturado, cloruro de amonio saturado y dos veces con agua. La capa orgánica se secó y se concentró in vacuo para proporcionar el compuesto 100 (875 mg, el 96 % de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente etapa. 1H NMR (400 MHz, DMSO): 88,15 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 8,02 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 4,26-4,33 (m, 1H), 4,03-4,12 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,18-2,22 (m, 2H), 1,76-1,80 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,24 (s, 6H), 1,24 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,19 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
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100 101
Etapa 2: se agregaron TFA (2,6 ml) y agua (0,17 ml) al compuesto puro 100 (875 mg, 2,23 mmol) y se agitó a temperatura ambiente hasta que la reacción se completó. La reacción se diluyó y se destiló de forma azeotrópica con acetonitrilo para obtener un aceite pegajoso. Luego se diluyó con acetonitrilo y agua, se congeló y se liofilizó para proporcionar el compuesto 101 (1 g, el 100 % de rendimiento) como un sólido blanquecino que se utilizó sin purificación adicional. LCMS = 3,99 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 337,0 (M 1)+.
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101
102
Etapa 3: Se disolvieron el compuesto 101 (923 mg, 1,65 mmol) y (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (240 mg, 1,57 mmol) en DMF (5,2 ml). Se agregaron EDC HCl (601 mg, 3,13 mmol) y d Ma P (96 mg, 0,78 mmol) a temperatura ambiente y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se diluyó la reacción con acetato de etilo y se lavó con agua tres veces. La capa orgánica se secó, se concentró in vacuo y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto 102 (150 mg, el 20 % de rendimiento). LCMS = 3,91 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 472,2 (M 1)+. 1H NMR (400 MHz, MeOD): 89,69 (s, 1H), 8,21 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 8,18 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,52 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 4,58 (s, 4H), 4,44-4,48 (m, 1H), 4,29-4,32 (m, 1H), 3,34 (s, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,34-2,40 (m, 2H), 1,90-1,95 (m, 2H), 1,43 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,30 (s, 6H).
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102 103
Etapa 4: Se preparó el compuesto 102 de forma similar al compuesto 94 en el ejemplo 9. El material bruto se secó en vacío alto para proporcionar el compuesto 103 (174 mgs, el 101 % de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS = 4,95 min (procedimiento de 8 min).
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Etapa 5: Se preparó el compuesto 103 de forma similar al compuesto 57 en el ejemplo 7. El sólido bruto contenía compuesto 104 (203 mg, el 44 % de rendimiento, el 60 % de pureza) que se utilizó sin purificación adicional. LCMS = 5,68 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 1024,3(M 1)+.
Figure imgf000091_0001
Etapa 6: Se preparó el compuesto 104 de forma similar al compuesto 12 en el ejemplo 1. El residuo bruto se purificó mediante RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, entre el 50% y el 65%) para proporcionar monoimina compuesto 105 como un sólido (22 mg, el 16% de rendimiento, el 90 % bruto). LCMS = 6,00 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 1027,3(M 1)+.
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Etapa 7: Se disolvió el compuesto 106 en THF (0,5 mL) y ACN (0,23 mL) en temperatura ambiente. Luego se preparó de forma similar al compuesto 98 en el ejemplo 9. La mezcla se agitó hasta completarse y luego se diluyó con DCM y agua DI. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó y se filtró. El filtrado se concentró para proporcionar el tiol bruto, el compuesto 106 (21 mg, el 100 % de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente reacción. LCMS = 5,67 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 980,4 (M 1)+.
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Etapa 8: El compuesto 106 (21 mg, 0,021 mmol) se suspendió en 2-propanol (1428 pl) y agua (714 pl). Se agregó metabisulfito de sodio (22,30 mg, 0,214 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente hasta completarse. La mezcla de reacción se diluyó con acetonitrilo/agua, se congeló y se liofilizó. El polvo blanco resultante se purificó mediante RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, entre el 20 % y el 40 %) y las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para proporcionar el compuesto 107 (5,3 mg, el 23 % de rendimiento). LCMS = 5,67 min (procedimiento de 8 min). MS (m/z): 1060,2 (M - 1)-.
Ejemplo 32. Preparación del conjugado huMOV19-sulfo-SPDB-107 (o huMOV19-107)
Una mezcla in situ que contenía concentraciones finales de 1,95 mM del compuesto 107 y 1,5 mM de enlazador sulfo-SPDB en amortiguador succinato (pH 5) : DMA (30 : 70) se incubó durante 6 h antes de la adición de un exceso de 7 veces de 107-sulfo-SPDB-NHS a una reacción que contenía 4 mg/ml de anticuerpo huMOV19 en 15 mM HEPES pH 8,5 (87:13, agua: DMA). La solución se dejó conjugar durante la noche a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el amortiguador se intercambió en 10 mM de Tris, 80 mM de NaCl, 50 uM de disulfito, el 3,5 % de sacarosa, el 0,01 % de amortiguador de formulación Tween-20 pH 7,6 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo amortiguador durante la noche a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer (ThermoScientific 10.000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,7 de moléculas del compuesto 107 unidas por anticuerpo (mediante UV/Vis y SEC utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15.484 cm'1M'1 y £280 nm= 30, 115 cm'1M'1 para el compuesto 107, y £280 nm= 201.400 cm-1M-1 para anticuerpo huMOV19), el 95% de monómero (mediante cromatografía de exclusión por tamaño) y una concentración de proteína final de 1,1 mg/ml. Los datos de espectrometría MS se muestra en la figura 16.
Ejemplo 33. Actividad antitumoral del conjugado huML66-90 de dosis única contra xenoinjertos NCI-H1703 NSCLC en ratones SCID hembra
Los ratones SCID CB.17 hembra, de 6 semanas, fueron proporcionados por Charles River Laboratories. Se inocularon los ratones con 5 x 106 células tumorales de NCI-H1703 suspendidas en 0,2 ml de 50 % de matrigel/medio libre de suero mediante inyección subcutánea en el costado derecho. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3 (día 16 después de la inoculación), se aleatorizaron los animales basándose en el volumen tumoral en 4 grupos de 6 ratones cada uno. Los ratones recibieron una administración IV única de control de vehículo (0,1 ml/ratón) o conjugado huML66-90 en 5, 20 o 50 pg/kg basándose en la concentración del compuesto 90 en el día 1 (día 17 después de la inoculación).
Se midió el tamaño de los tumores entre dos y tres veces por semana en tres dimensiones utilizando un calibrador. Se expresó el volumen tumoral en mm3 utilizando la fórmula V = longitud x ancho x altura x 1. Se consideró que un ratón tenía una regresión parcial (PR) cuando el volumen del tumor se reducía en un 50 % o más y una regresión tumoral completa (CR) cuando no se podía detectar ningún tumor palpable. Se determinó el volumen tumoral con el software StudyLog.
Se determinó la inhibición del crecimiento tumoral (valor de T/C) utilizando la siguiente fórmula:
T/C (%) = volumen tumoral medio de los tratados / volumen tumoral medio de control x 100.
Se determinó el volumen tumoral simultáneamente para los grupos tratados (T) y de control de vehículo (C) cuando el volumen tumoral del control de vehículo alcanzaba un tamaño predeterminado de 1000 mm3. Se determinó el volumen tumoral medio diario de cada grupo tratado, incluidos los ratones sin tumor (0 mm3). De acuerdo con las normas NCI, un T/C < 42 % es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C <10 % se considera un nivel de actividad antitumoral alto.
Tal como se muestra en la figura 17, el conjugado huML66-90 es altamente activo en 20 pg/kg y 50 pg/kg, con 20 pg/kg como dosis eficaz mínima (MED).
Ejemplo 34. Farmacocinética del conjugado huMov19-90 de dosis única en ratones CD-1 hembra
Los ratones CD-1 hembra, de 7 semanas, fueron proporcionados por Charles River Laboratories. Los ratones recibieron una administración IV única del conjugado huMov19-90 como una inyección en bolo intravenosa única mediante una vena lateral de la cola. Cada ratón recibió una dosis de 2,5 mg/kg en base a Ab. La dosis y el volumen inyectado se individualizaron sobre la base del peso corporal de cada ratón. Se llevaron a cabo inyecciones utilizando una jeringa de 1,0 mL equipada con un aguja calibre 27, de 1 pulgada. En el minuto 2 y 30, en las horas 2, 4 y 8, y en los días 1,2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 28 después de la administración del conjugado huMov19-90, se anestesió a los ratones mediante inhalación de isoflurano y se recogió aproximadamente 150 pL de sangre de los ratones a través del seno sanguíneo retroorbital derecho en un tubo capilar heparinizado. En cada punto de tiempo (entre 0 y 21 días), se recogió sangre de los tres ratones en un grupo. A su vez, se tomaron muestras de sangre de los grupos; de modo que los ratones en el conjunto no se le tomaron muestras de sangre más de dos veces en un período de 24 horas. En punto de tiempo final, 28 días después de la administración, todos los ratones se incluyeron para la recolección de muestras. Las muestras de sangre se centrifugaron para separar el plasma. Se transfirió 30 pl de plasma a tubos de microcentrífuga etiquetados individuales para cada muestra y punto de tiempo, y luego se almacenó y se congeló a -80 °C para permitir el análisis posterior mediante ELISA para determinar las concentraciones de Ab total (Ab no conjugado y conjugado intacto) y el conjugado intacto utilizando un anticuerpo anti-indolinobenzodiazepina.
Tal como se muestra en la figura 18, el conjugado huMov19-90 tiene depuración similar a la del anticuerpo.
Ejemplo 35. Enriquecimiento de catabolitos mediante captura por afinidad con resina de proteína A
Se cultivaron células KB con expresión del receptor a de folato (FRa) en 5 * T150 placas de cultivo tisular. Se incubó una cantidad de saturación de FRa dirigido al conjugado huMov19-90 con células KB durante 24 horas a 37 °C en una incubadora humidificada amortiguada con 5 % de CO2. Después de 24 horas, se recogió el medio que contenía catabolitos de eflujo celular y se agrupó para el siguiente ensayo.
Se unió una cantidad saturante de anticuerpo anti-indolinobenzodiazepina a una suspensión de resinas de proteína A mediante incubación durante la noche a 4 °C. Se incubó 1 mL de complejo de proteína A unida previamente/anticuerpo anti-indolinobenzodiazepina con 25 mL de medio en un rotador de extremo a extremo durante varias horas. Se centrifugaron suavemente las resinas a 1000 rpm y se decantó el sobrenadante. Las resinas de proteína-A/anticuerpo anti-indolinobenzodiazepina unidas a los catabolitos se lavaron con PBS. Se liberaron los catabolitos a la fase orgánica mediante extracción de acetona. Los catabolitos se secaron al vacío durante la noche hasta que se evaporó completamente la solución orgánica. Se reconstituyeron los catabolitos con 20 % de acetonitrilo en agua y se analizaron mediante LC/MS.
Análisis MS
Se identificaron los catabolitos celulares mediante UHPLC/MS/MS utilizando espec. de masas de alta resolución Q-Exactive (Thermo). Se utilizaron los cromatogramas iónicos extraídos (XIC) para identificar y caracterizar los catabolitos de células diana. Se identificaron todas las especies de catabolitos que contenían las firmas de masas de indolinobenzodiazepina características (286 m/z) (véase las figuras 19A y 19B).
Ejemplo 36. Actividad antitumoral de huMov19-90 de dosis única contra xenoinjertos NCI-H2110 NSCLC, xenoinjertos endometriales Hec-1b y xenoinjertos endometriales Ishikawa en ratones CB.17 SCID hembra
Los ratones SCID CB.17 hembra, de 6 semanas, fueron proporcionados por Charles River Laboratories. Se inoculó un Cohorte de ratones con 1 x 107 células tumorales de NCI-H2110 suspendidas en 0,1 ml de 50 % de matrigel/medio libre de suero mediante inyección subcutánea en el costado derecho. Se inoculó un segundo Cohorte de ratones con 1 x 107 de células tumorales Hec-1b suspendidas en 0,1 ml de medio libre de suero mediante inyección subcutánea en el costado derecho. Se inoculó un tercer Cohorte de ratones con 1 x 107 células tumorales de Ishikawa suspendidas en 0,1 ml de 50 % de matrigel/medio libre de suero mediante inyección subcutánea en el costado derecho.
Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100 mm3 (NCI-H2110 en el día 7, Hec-1b en el día 7 y Ishikawa en el día 17 después de la inoculación), se aleatorizaron los animales basándose en el volumen tumoral en grupos de 6 ratones cada uno.
Los ratones en el experimento de xenoinjerto NCI-H2110 recibieron una administración IV única de control de vehículo (0,2 ml/ratón) o huMov19-90 en 1, 3 o 5 pg/kg basándose en la concentración de fármaco en el día 1 (día 8 después de la inoculación).
Los ratones en el experimento de xenoinjerto Hec-1b recibieron una administración IV única de control de vehículo (0,2 ml/ratón) o huMov19-90 en 10 o 30 pg/kg o el conjugado de control no dirigido chKTI-90 en 30 pg/kg basándose en la concentración de fármaco en el día 1 (día 8 después de la inoculación).
Los ratones en el experimento de xenoinjerto Ishikawa recibieron una administración IV única de control de vehículo (0,2 ml/ratón) o huMov19-90 en 10 o 30 pg/kg o el conjugado de control no dirigido chKTI-90 en 30 pg/kg basándose en la concentración de fármaco en el día 1 (día 18 después de la inoculación).
Para todos los experimentos, se midió el tamaño de los tumores entre dos y tres veces por semana en tres dimensiones utilizando un calibrador. Se expresó el volumen tumoral en mm3 utilizando la fórmula V = longitud x ancho x altura x 1. Se consideró que un ratón tenía una regresión parcial (PR) cuando el volumen del tumor se reducía en un 50 % o más y una regresión tumoral completa (CR) cuando no se podía detectar ningún tumor palpable. Se determinó el volumen tumoral con el software StudyLog.
Se determinó la inhibición del crecimiento tumoral (valor de T/C) utilizando la siguiente fórmula:
T/C (%) = volumen tumoral medio de los tratados / volumen tumoral medio de control x 100.
Se determinó el volumen tumoral simultáneamente para los grupos tratados (T) y de control de vehículo (C) cuando el volumen tumoral del control de vehículo alcanzaba un tamaño predeterminado de 1000 mm3. Se determinó el volumen tumoral medio diario de cada grupo tratado, incluidos los ratones sin tumor (0 mm3). De acuerdo con las normas NCI, un T/C < 42 % es el nivel mínimo de actividad antitumoral. Un T/C <10 % se considera un nivel de actividad antitumoral alto.
Tal como se muestra en la figura 22, el conjugado huMov19-90 era inactivo en el modelo de xenoinjerto NCI-H2110 en una dosis de 1 pg/kg, activo en una dosis de 3 pg/kg con un T/C del 13 % y 1/6 PRs y altamente activo en una dosis de 5 pg/kg con un T/C del 2 %, 6/6 PRs y 4/6 CRs.
Tal como se muestra en la figura 23, el conjugado huMov19-90 era activo en el modelo de xenoinjerto Hec-1b en una dosis de 10 pg/kg con un T/C del 15% y 1/6 PRs y altamente activo en una dosis de 30 pg/kg con un T/C del 9%, 6/6 PRs y 6/6 CRs. El conjugado de control no dirigido chKTI-90 era activo en una dosis de 30 pg/kg con un T/C del 34 %.
Tal como se muestra en la figura 24, el conjugado huMov19-90 era activo en el modelo de xenoinjerto Hec-1b en una dosis de 10 pg/kg con un T/C del 27%, 6/6 pRs y 6/6 CRs y activo en una dosis de 30 pg/kg con un T/C del 15%, 6/6 PRs y 6/6 CRs. El conjugado de control no dirigido chKTI-90 era activo en una dosis de 30 pg/kg con un T/C del 24 % y 4/6 PRs.
Ejemplo 37. Actividad antitumoral de huMov19-107 de dosis única contra xenoinjertos NCI-H2110 NSCLC, en ratones CB.17 SCID hembra
Se realizó la actividad antitumoral in vivo de huMOV19-107 en ratones SCID de acuerdo con los protocolos descritos en el ejemplo 30 anterior. Tal como se muestra en la figura 25, el conjugado huMov19-107 era altamente activo en dosis de 10 pg/kg y 6/6 CRs.
Ejemplo 38. Afinidad de unión del conjugado CD123-90
Se evaluó la afinidad de unión del conjugado ADC de un anticuerpo anti-CD123 humanizado ejemplar, anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3, y se comparó con el anticuerpo no conjugado correspondiente mediante citometría de flujo utilizando células HNT-34. Las células HNT-34 (5*104 células por muestra) se incubaron con diversas concentraciones del ADC y el anticuerpo huCD123-6Gv4.7S3 no conjugado en 200 pL de amortiguador FACS (medio DMEM complementado con el 2 % de suero de cabra normal). Luego las células se sedimentaron, se lavaron dos veces y se incubaron durante 1 h con 100 pL de anticuerpo IgG de cabra antihumano conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson Laboratory). Las células se sedimentaron una vez más, se lavaron con amortiguador FACS y se suspendieron nuevamente en 200 pl de PBS que contenía formaldehído al 1 %. Las muestras se adquirieron utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillos de HTS o un citómetro de flujo de barrido FACS y se analizó utilizando CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EUA). Para cada muestra la intensidad geo promedio de fluorescencia para FL2 se calculó y se graficó con la concentración de anticuerpo en una gráfica semilogarítmica. Se generó una curva de respuesta a la dosis mediante regresión no lineal y se calculó el valor de EC50 de cada curva, que corresponde a la constante de disociación aparente (Kd) de cada anticuerpo, utilizando GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA).
Tal como se muestra en la figura 26, la conjugación solo afectó moderadamente la afinidad de unión del anticuerpo anti-CD123 ejemplar.
Ejemplo 39. Actividad citotóxica in vitro para huCD123-90
SE midió la capacidad de los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de huCD123-6, un anticuerpo anti-CD123, de destruir células que expresan CD123 en su superficie celular utilizando ensayos de citotoxicidad in vitro. Se cultivaron las líneas celulares en medio de cultivo según lo recomendado por el proveedor de las células (ATCC o DSMZ). Se añadieron las células, 2.000 a 10.000 en 100 pL del medio de cultivo a cada pocillo de placas de 96 pocillos de fondo plano. Para bloquear los receptores Fc en la superficie celular, se complementó el medio de cultivo con 100 nM de anticuerpo chKTI (un anticuerpo del mismo isotipo). Se diluyeron los conjugados en el medio de cultivo utilizando una serie de diluciones de 3 veces y se añadieron 100 pL por pocillo. Para determinar la contribución de la citotoxicidad independiente de CD123, se añadió el bloque CD123 (p. ej., 100 nM de anticuerpo chCD123-6) a algunos pocillos antes que los conjugados. Se incluyeron en cada placa de ensayo pocillos de control que contenían células y el medio, pero que carecían de los conjugados, así como pocillos que contenían el medio solo. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada punto de datos. Se incubaron las placas a 37 °C en una incubadora humidificada con 6 % de CO2 durante 4 a 7 días. Se determinó la cantidad relativa de células viables en cada pocillo utilizando el Kit de conteo de células 8 basado en WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD). Se calculó la fracción superviviente evidente de células en cada pocillo mediante la corrección en primer lugar para la absorbancia de fondo de medio y después dividiendo cada valor entre el promedio de los valores en los pocillos de control (células no tratadas). Se graficó la fracción superviviente de células contra la concentración de conjugado en gráficas semilogarítmicas.
Se utilizaron quince líneas celulares positivas de CD123 de origen diferente (AML, B-ALL, CML y NHL) en el estudio (tabla 4). La mayoría de las líneas celulares derivaron de pacientes portadores de un tumor maligno con al menos un factor de pronóstico negativo (p. ej., sobreexpresión de P-glicoproteína, sobreexpresión de EVI1, alteraciones de p53, mutación de DNMT3A, duplicación de tándem interno de FLT3). Los conjugados demostraron alta potencia en estas líneas celulares con valores de IC50 que variaban entre sub-pM y nM bajo (tabla 4).
Tabla 4. Citotoxicidad in vitro del conjugado huCD123-6-90 contra líneas celulares positivas de CD123 de origen diferente
Figure imgf000095_0001

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto citotóxico representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000131_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de estos, en donde:
L' se representa por la siguiente fórmula:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1);
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J(B2);or
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B3); or
donde:
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos;
J es un éster de N-hidroxisuccinimida, éster de N-hidroxisulfosuccinimida, éster de nitrofenilo, éster de dinitrofenilo, éster de sulfo-tetraflurofenilo y éster de pentafluorofenilo;
Ra y Rb, para cada aparición, son cada uno independientemente -H, alquilo (Ci-C3) o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q, donde Q es SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;
m es un número entero de 1 a 6;
m' es 0 o un número entero de 1 a 6;
Cy es un alquilo cíclico que tiene 5 o 6 átomos de carbono en el anillo opcionalmente sustituido con halógeno, -OH, alquilo (Ci-C3), alcoxi (Ci-C3) o haloalquilo (Ci-C3); y Zs es -H, -SRd, -C (= O) Rd1 o se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000132_0001
donde:
q es un número entero de 1 a 5;
n' es un número entero de 2 a 6;
U es -H o SO3M;
M es H+, Na+ o K+;
Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o se selecciona de fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo; y
Rd1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L" y L" son ambos -H;
la línea doble ="= entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble X esté ausente e Y sea -H, o un alquilo lineal o ramificado que tenga de 1 a 4 átomos de carbono, y cuando sea un enlace simple , X sea -H, Y sea -OH o - SO3M;
R1, R2, R3, R4, Ri', R2', R3' y R4' son todos -H;
R6 es OMe;
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son -O-; y
M es H, Na+ o K+; y
para cada aparición R5 es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde L' está representado por las siguientes fórmulas:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1 ); o
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J (B2),
opcionalmente donde ambos Ra y Rb son H; Cy para la fórmula (B2) es ciclohexano; R5 es H o Me y m' es 0 o 1.
3. El compuesto de la reivindicación 2, donde L' está representado por la formula B1.
4. El compuesto de la reivindicación 1, donde L' está representado por la siguiente formula:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B3),
opcionalmente, donde:
(i) ambos Ra y Rb son -H y R5 es H o Me, o
(ii) -(CRaRb)m- es -(C H 2)m"-C(Me2)- y m" es un entero entre 1 y 5.
5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos.
6. El compuesto de la reivindicación 5 caracterizado por que P se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, p-Ala-Leu-Ala-Leu y Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met y Met-Ala.
7. El compuesto de la reivindicación 1 caracterizado por que el compuesto se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000142_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
R-ioo
Figure imgf000142_0002
8. El compuesto de la reivindicación 7 donde el compuesto está representado por las siguientes formulas:
Figure imgf000142_0003
o
Figure imgf000143_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
9. Un conjugado que comprende un compuesto citotóxico y un agente de unión celular (CBA), en donde el compuesto citotóxico está unido de forma covalente al CBA, y en donde dicho compuesto citotóxico está representado por la siguiente fórmula:
Figure imgf000143_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, donde:
el agente de unión celular es un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla o un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula objetivo, un anticuerpo de dominio, un fragmento de anticuerpo de dominio que se une específicamente a la célula objetivo, una linfocina, una hormona, una vitamina, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias o un molécula de transporte de nutrientes;
L' se representa por la siguiente fórmula:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J' (B1');
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m-J' (B2');
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (B3'); o
donde
P es un residuo de aminoácido o un péptido que contiene entre 2 y 20 residuos de aminoácidos;
J' es -C(=O)- que está unido por enlace covalente al agente de unión celular;
Ra y Rb, para cada aparición, son cada uno independientemente -H, (Ci-C3)alquilo o un sustituyente cargado o un grupo ionizable Q; , donde Q es SO3H o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma;
m es un entero entre 1 y 6;
m' es 0 o un entero entre 1 y 6;
Cy es un alquilo cíclico que tiene 5 o 6 átomos de carbono de anillo opcionalmente sustituidos con halógeno, -OH, (C1-C3)alquilo, (C1-C3)alcoxi o halo(C1-C3)alquilo,
Zs1 se selecciona de cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000144_0001
donde:
q es un entero entre 1 y 5;
n' es un entero de 2 a 6;
U es -H o SO3M; y
M es H+, Na+o K+,
L" y L" son ambos -H;
la línea doble ~ entre N y C representa un enlace simple o un enlace doble, siempre que cuando sea un enlace doble, X esté ausente e Y sea -H, o un alquilo lineal o ramificado que tenga de 1 a 4 átomos de carbono, y cuando sea un enlace sencillo, X sea -H, Y sea -OH o - SO3M;
R1, R2, R3, R4, Ri', R2', R3'y R4' son todos -H;
R6 es -OMe;
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son -O-; y
M es H, Na+ o K+; y
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.
10. El conjugado de la reivindicación 9, donde L' está representado por las siguientes fórmulas:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J' (B1'); o
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J' (B2'),
opcionalmente donde Ra y Rb son ambos H; Cy para la fórmula B2' es ciclohexano; R5 es H o Me; y m' es 0 o 1.
11. El conjugado de la reivindicación 10, donde L' está representado por la fórmula B1.
12. El conjugado de la reivindicación 9, donde L' está representado por la siguiente fórmula:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (B3'),
opcionalmente donde:
(i) ambos Ra y Rb son -H y R5 es H o Me; o
(ii) -(CRaRb)m- es -(CH2)m"-C(Me2)- y m" es un entero entre 1 y 5.
13. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde P es un péptido que contiene de 2 a 5 residuos de aminoácidos.
14. El conjugado de la reivindicación 13 caracterizado por que P se selecciona de Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, p-Ala-Leu-Ala-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met y Met-Ala.
15. El conjugado de la reivindicación 9, donde el compuesto se selecciona de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
o una sal farmacéuticamente aceptable de estas, donde:
r es un entero entre 1 y 10.
16. El conjugado de la reivindicación 15, donde el conjugado está representado por las siguientes fórmulas:
Figure imgf000163_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.
17. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 9-16 caracterizado por que el anticuerpo es un anticuerpo revestido, un anticuerpo de cadena simple revestido o un fragmento de anticuerpo revestido; un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena simple o un fragmento de anticuerpo monoclonal de este; o el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena simple humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado; y/o el agente de unión celular es:
(i) un anticuerpo del receptor anti-folato o un fragmento de anticuerpo del mismo;
(ii) un anticuerpo anti-EGFR o un fragmento de anticuerpo del mismo;
(iii) un anticuerpo anti-CD33 o un fragmento de anticuerpo del mismo;
(iv) un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de anticuerpo del mismo;
(v) un anticuerpo anti-Mucl o un fragmento de anticuerpo del mismo; o es
(vi) un anticuerpo anti-CD37 o un fragmento de anticuerpo del mismo.
18. El conjugado de la reivindicación 17, donde:
(i) el anticuerpo del receptor anti-folato;
(1) es el anticuerpo huMOVI 9;
(2) comprende:
a) una CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO:1; una CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO:7 y una CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:3; y
b) una CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO:4; una CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO:5; y una CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:6; o
(3) comprende:
a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO:11; y
b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 90 %, el 95 %, el 99 % o el 100 % idéntica a SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:13;
(4) comprende:
a) una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11; y b) una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12 o s Eq ID NO:13; o
(5) comprende:
a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8; y
b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10;
(ii) el anticuerpo anti-EGFR:
(1) es anticuerpo huML66;
(2) comprende:
a) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14; y
b) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15;
(3) es huEGFR-7R; o
(4) comprende:
a) una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16; y b) una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:l7 o SEQ ID NO:18;
(iii) el anticuerpo anti-CD33:
(1) es anticuerpo huMy9-6; o
(2) comprende:
a) una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; y b) una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24;
(iv) el anticuerpo anti-CD19:
(1) es anticuerpo huB4; o
(2) comprende
a) una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19; y b) una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20;
(v) el anticuerpo anti-Muc1:
(1) es anticuerpo huDS6; o
(2) comprende:
a) una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21; y b) una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22;
(vi) el anticuerpo anti-CD37:
(1) es anticuerpo huCD37-3;
(2) comprende:
a) una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:27; y
b) una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25;
(3) es anticuerpo huCD37-50; o
(4) comprende:
a) una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29; y
b) una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28.
19. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 9-18 y un portador farmacéuticamente aceptable.
20. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-18 para su uso como un medicamento.
21. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9-18 para su uso en un procedimiento para inhibir el crecimiento celular anormal o tratar un trastorno proliferativo, un trastorno autoinmunitario, un trastorno óseo destructivo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, una enfermedad fibrótica, un trastorno neurodegenerativo, pancreatitis o una enfermedad renal en un mamífero, que comprende administrarle a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o el conjugado y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico, opcionalmente donde:
(i) el procedimiento es para tratar una afección seleccionada del grupo que consiste en: cáncer, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo de trasplante, lupus, miositis, infección y deficiencia inmunitaria;
(ii) el procedimiento es para tratar un cáncer;
(iii) el procedimiento es para tratar un cáncer seleccionado de cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cuello uterino, melanoma, cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de mama, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello, cáncer de próstata, cáncer endometrial, linfoma (p. ej., linfoma no Hodgkin), síndrome mielodisplásico (MDS), cáncer peritoneal o leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda (AML), leucemia monocítica aguda, leucemia promielocítica, leucemia eosinofílica, leucemia linfoblástica aguda (p. ej., B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mieloide crónica (CML)).
(iv) el procedimiento es para tratar el cáncer de leucemia mieloide aguda (AML);
(v) el procedimiento es para tratar el cáncer de ovario
(vi) el procedimiento es para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas.
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