RS60751B1 - Citotoksični derivati benzodiazepina - Google Patents

Citotoksični derivati benzodiazepina

Info

Publication number
RS60751B1
RS60751B1 RS20201000A RSP20201000A RS60751B1 RS 60751 B1 RS60751 B1 RS 60751B1 RS 20201000 A RS20201000 A RS 20201000A RS P20201000 A RSP20201000 A RS P20201000A RS 60751 B1 RS60751 B1 RS 60751B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
ala
compound
val
amino acid
Prior art date
Application number
RS20201000A
Other languages
English (en)
Inventor
Ravi V J Chari
Michael Louis Miller
Manami Shizuka
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54140691&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60751(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of RS60751B1 publication Critical patent/RS60751B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nova citotoksična jedinjenja, i citotoksične konjugate koji sadrže ova citotoksična jedinjenja i agense koji se vezuju za ćelije. Prezicnije, ovaj pronalazak se odnosi na nova jedinjenja benzodiazepina, njihove derivate, njihove intermedijere, njihove konjugate, i njihove farmaceutski prihvatljive soli, koji su korisni kao medikamenti, posebno kao anti-proliferativni agensi.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Derivati benzodiazepina su korisna jedinjenja za lečenje različitih poremećaja, i uključuju medikamente kao što su antiepileptici (imidazo [2,1-b] [1,3,5] benzotiadiazepini, S.A.D. patent br. 4,444,688; S.A.D. patent br. 4,062,852), antibakterijali (pirimido[1,2-c] [1,3,5]benzotiadiazepini, GB 1476684), diuretici i hipotenzivi (pirolo(1,2-b)[1,2,5] benzotiadiazepin 5,5 dioksid, S.A.D. patent br. 3,506,646), hipolipidemici (WO 03091232), antidepresivi (S.A.D. patent br.3,453,266); osteoporotici (JP 2138272).
[0003] Pokazano je na modelima tumora životinja da derivati benzodiazepina, kao što su pirolobenzodiazepini (PBD), deluju kao antitumorski agensi (N-2-imidazolil alkil supstituisan 1,2,5-benzotiadiazepin-1,1-dioksid, S.A.D. patent br. 6,156,746), benzopirido ili dipirido tiadiazepin (WO 2004/069843), pirolo [1,2-b][1,2,5] benzotiadiazepini i derivati pirolo [1,2-b][1,2,5] benzodiazepina (WO2007/015280), derivati tomaimicina (npr. pirolo [1,4]benzodiazepini), kao što su oni opisani u WO 00/12508, WO2005/085260, WO2007/085930, i EP 2019104. Za benzodiazepine se takođe zna da utiču na ćelijski rast i diferencijaciju (Kamal A., et al., Bioorg Med Chem. 2008 Aug 15;16(16):7804-10 (i u njemu citirane reference); Kumar R, Mini Rev Med Chem.2003 Jun; 3(4):323-39 (i u njemu citirane reference); Bednarski J J, et al., 2004; Sutter A. P, et al., 2002; Blatt N B, et al., 2002), Kamal A. et al., Current Med. Chem., 2002; 2; 215-254, Wang J-J., J.Med. Chem., 2206; 49:1442-1449, Alley M.C. et al., Cancer Res. 2004; 64:6700-6706, Pepper C. J., Cancer Res 2004; 74:6750-6755, Thurston D.E. i Bose D.S., Chem Rev 1994; 94:433-465; i Tozuka, Z., et al., Journal of Antibiotics, (1983) 36; 1699-1708. U S.A.D. publikaciji broj 20070072846 opisana je opšta struktura PBD-a. PBD-i se razlikuju u broju, tipu i poziciji supstituenata, u oba njihova aromatična A prstena i pirolo C prstena, i u stepenu zasićenosti C prstena. Njihova sposobnost da formiraju adukt u malom žlebu i umrežavaju DNK omogućava im da ometaju obradu DNK, otuda i njihov potencijal za upotrebu kao antiproliferativnih agenasa.
[0004] Prvi pirolobenzodiazepin koji je ušao u kliničku upotrebu, SJG-136 (NSC 694501) je potentan citotoksični agens koji uzrokuje inter-lančano umrežavanje DNK (S.G Gregson et al., 2001, J. Med. Chem., 44: 737-748; M.C. Alley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6700-6706; J.A. Hartley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6693-6699; C. Martin et al., 2005, Biochemistry., 44: 4135-4147; S. Arnould et al., 2006, Mol. Cancer Ther., 5: 1602-1509). Rezultati I faze kliničke evaluacije SJG-136 otkrili su da je ovaj lek bio toksičan u ekstremno malim dozama (maksimalna tolerisana doza od 45 μg/m<2>), i zapaženo je nekoliko štetnih efekta, uključujući sindrom vaskularnog curenja, periferni edem, toksičnost jetre i umor. Oštećenje DNK je primećeno u svim dozama u cirkulišućim limfocitima (D. Hochhauser et al., 2009, Clin. Cancer Res., 15: 2140-2147). Stoga, postoji potreba za poboljšanim derivatima benzodiazepina koji su manje toksični a ipak terapijski aktivni za lečenje različitih stanja proliferativnih bolesti, kao što je kancer.
SAŽETAK PRONALASKA
[0005] Ovde opisana nova jedinjenja benzodiazepina i njihovi konjugati imaju iznenađujuće visoku potenciju protiv različitih tumorskih ćelija.
[0006] Gledano sa jednog aspekta, pronalazak obezbeđuje citotoksično jedinjenje kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.
[0007] Cilj pronalaska je da obezbedi konjugate agenasa koji se vezuju za ćeliju sa novim jedinjenjima benzodiazepina ili njihovim derivatima predmetnog pronalaska. Ovi konjugati su korisni kao terapijski agensi, koji se isporučuju specifično ciljnim ćelijama i citotoksični su.
[0008] Gledano sa drugog aspekta, pronalazak obezbeđuje konjugat kao što je definisano u patentnom zahtevu 9.
[0009] U jednom primeru izvođenja, za konjugate strukturne formule (I'), agens koji se vezuje za ćeliju je anti-folatni receptor antitelo ili njegov fragment antitela. Preciznije, anti-folatni receptor antitelo je huMOV19 antitelo.
[0010] U drugom primeru izvođenja, za konjugate strukturne formule (I'), agens koji se vezuje za ćeliju je anti-EGFR antitelo ili njegov fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je neantagonističko antitelo, uključujući, na primer, antitela opisana u WO2012058592. U drugom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je nefunkcionalno antitelo, na primer, humanizovano ML66. Preciznije, anti-EGFR antitelo je huML66.
[0011] Gledano sa trećeg aspekta, predmetni pronalazak takođe uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugate pronalaska (i/ili njihove solvate, hidrate i/ili soli) i farmaceutski prihvatljiv nosač. Predmetni pronalazak pored toga uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugate pronalaska (i/ili njihove solvate, hidrate i/ili soli), i farmaceutski prihvatljiv nosač, koji dodatno sadrži drugi terapijski agens. Predmetne kompozicije su korisne za inhibiciju abnormalnog ćelijskog rasta ili lečenje proliferativnog poremećaja kod sisara (npr. čoveka). Predmetne kompozicije su korisne za lečenje stanja kao što su kancer, reumatoidni artritis, multipla skleroza, bolest graft protiv domaćina (GVHD), odbacivanje transplanta, lupus, miozitis, infekcija, imunska deficijencija kao što je AIDS, i inflamatorne bolesti kod sisara (npr. čoveka).
[0012] Gledano sa četvrtog aspekta, pronalazak obezbeđuje jedinjenje prvog aspekta ili konjugat drugog aspekta za upotrebu kao medikament.
[0013] Gledano sa petog aspekta, pronalazak obezbeđuje jedinjenje prvog aspekta ili konjugat drugog aspekta za upotrebu u postupku kao što je definisano u patentnom zahtevu 21.
[0014] Ovde je takođe objavljen postupak sintetisanja i upotrebe novih jedinjenja benzodiazepina, njihovih derivata, i njihovih konjugata za in vitro, in situ, i in vivo dijagnozu ili lečenje ćelija sisara, organizama, ili povezanih patoloških stanja.
[0015] Jedinjenja pronalaska, njihovi derivati, ili njihovi konjugati, i kompozicije koje ih sadrže, su korisni za lečenje ili smanjenje ozbiljnosti poremećaja, kao što su oni okarakterisani abnormalnim ćelijskim rastom (npr. kancer). Ostale primene za jedinjenja i konjugate ovog pronalaska uključuju lečenje stanja kao što su kancer, reumatoidni artritis, multipla skleroza, bolest graft protiv domaćina (GVHD), odbacivanje transplanta, lupus, miozitis, infekcija, imunska deficijencija kao što je AIDS i inflamatorne bolesti kod sisara (npr. čoveka).
KRATAK OPIS SLIKA
[0016]
SL. 1 prikazuje afinitet vezivanja huMOV19-14 konjugata u poređenju sa nekonjugovanim antitelom huMOV19 za T47D ćelije.
SL. 2 prikazuje in vitro citotoksičnost i specifičnost huMOV19-14 konjugata.
SL. 3 prikazuje da huMOV19-14 konjugat pokazuje slab citotoksični efekat posmatrača na susedne antigen-negativne ćelije.
SL. 4A, 4B i 4C prikazuju in vitro citotoksičnost huMy9-6-14 konjugata prema različitim ćelijskim linijama.
SL. 5A i 5B prikazuju da huMy9-6-14 konjugat pokazuje citotoksični efekat posmatrača na susedne antigen-negativne ćelije.
SL. 6 prikazuje in vivo efikasnost huMOV19-80 i huMOV19-90 konjugata kod SCID miševa koji nose NCI-H2110.
SL. 7A-7D prikazuju profile masene spektrometrije reprezentativnih konjugata predmetnog pronalaska.
SL. 8 prikazuje profil masene spektrometrije huML66-90 konjugata.
SL. 9 prikazuje in vitro citotoksičnost i specifičnost huML66-90 konjugata.
SL. 10, 11 i 12 prikazuju in vitro citotoksičnost i specifičnost huMOV19-90 konjugata. SL. 13 prikazuje da huMOV19-90 konjugat pokazuje jak citotoksični efekat posmatrača na susedne antigen-negativne ćelije.
SL. 14 prikazuje in vivo efikasnost huMOV19-90 konjugata kod SCID miševa koji nose NCI-H2110.
SL. 15A i 15B prikazuju afinitet vezivanja huMOV19-90 konjugata u poređenju sa nekonjugovanim antitelom huMOV19 za T47D ćelije.
SL. 16 prikazuje profile masene spektrometrije reprezentativnih konjugata predmetnog pronalaska.
SL. 17 prikazuje in vivo efikasnost huML66-90 konjugata kod SCID miševa koji nose NCI-H1703 NSCLC.
SL. 18 prikazuje farmakokinetiku huMOV19-90 kod CD-1 miševa.
SL. 19A i 19B prikazuju strukturu huMOV19-90 konjugata (SL. 19A), i šemu za inkubaciju, prečišćavanje, i izolaciju katabolita iz huMOV19-90 konjugata formiranih in vitro u KB ćelijama kancera grlića materice (SL. 19B). Tri katabolita identifikovana pomoću LC-MS prikazana su zajedno sa izračunatom masom.
SL. 20 prikazuje afinitet vezivanja huMOV19-107 konjugata u poređenju sa nekonjugovanim antitelom huMOV19 za T47D ćelije.
SL. 21 prikazuje in vitro citotoksičnost i specifičnost huMOV19-90 i huMOV19-107 konjugata.
SL. 22 prikazuje in vivo efikasnost huMOV19-90 konjugata kod SCID miševa koji nose NCI-H2110 NSCLC ksenografte.
SL. 23 prikazuje in vivo efikasnost huMOV19-90 konjugata kod SCID miševa koji nose hec-1b endometrijalne ksenografte.
SL. 24 prikazuje in vivo efikasnost huMOV19-90 konjugata kod SCID miševa koji nose Ishikawa endometrijalne ksenografte.
SL. 25 prikazuje in vivo efikasnost huMOV19-107 konjugata kod SCID miševa koji nose NCI-H2110 NSCLC ksenografte.
SL. 26 prikazuje afinitet vezivanja huCD123-6Gv4.7S3-90 konjugata u poređenju sa nekonjugovanim antitelom za HNT-34 ćelije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Sada će se detaljno napraviti pozivanje na određene primere izvođenja pronalaska, čiji su primeri ilustrovani u pratećim strukturama i formulama. Dok će pronalazak biti opisan zajedno sa nabrojanim primerima izvođenja, razumeće se da oni nisu namenjeni da ograniče pronalazak na te primere izvođenja. Naprotiv, pronalazak je namenjen da obuhvati sve alternative, modifikacije, i ekvivalente koji mogu biti uključeni u obim predmetnog pronalaska kao što je definisano patentnim zahtevima. Stručnjak u ovoj oblasti prepoznaće mnoge postupke i materijale slične ili ekvivalentne onima koji su ovde opisani, koji bi se mogli upotrebljavati u praksi predmetnog pronalaska.
[0018] Treba razumeti da bilo koji od ovde opisanih primera izvođenja, uključujući one opisane pod različitim aspektima pronalaska (npr. jedinjenja, jedinjenje-linker molekuli, konjugati, kompozicije, postupci pravljenja i upotrebe) i različitim delovima specifikacije (uključujući primere izvođenja koji su opisani samo u Primerima) mogu biti kombinovani sa jednim ili više drugih primera izvođenja pronalaska, osim ukoliko je to izričito osporeno ili nepodesno.
DEFINICIJE
[0019] Kao što se ovde upotrebljava, termin "agens koji se vezuje za ćeliju" ili "CBA" označava jedinjenje koje može da se vezuje za ćeliju (npr. za ligand na ćelijskoj površini) ili da se vezuje za ligand koji je povezan sa ćelijom ili je u njenoj blizini, poželjno na specifičan način. U određenim primerima izvođenja, vezivanje za ćeliju ili ligand na ćeliji ili u njenoj blizini je specifično. CBA može da uključuje peptide i ne-peptide.
[0020] "Linearni ili granati alkil" kao što se ovde upotrebljava označava monovalentni ugljovodonični radikal zasićenog linearnog ili granatog lanca od jednog do dvadeset atoma ugljenika. Primeri alkila uključuju metil, etil, 1-propil, 2-propil, 1-butil, 2-metil-1-propil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil, 2-metil-2-propil, 1-pentil, 2-pentil 3-pentil, 2-metil-2-butil, 3-metil-2-butil, 3-metil-1-butil, 2-metil-1-butil, 1-heksil), 2-heksil, 3-heksil, 2-metil-2-pentil, 3-metil-2-pentil, 4-metil-2-pentil, 3-metil-3-pentil, 2-metil-3-pentil, 2,3-dimetil-2-butil, 3,3-dimetil-2-butil, 1-heptil, i 1-oktil. Poželjno, alkil ima jedan do deset atoma ugljenika. Poželjnije, alkil ima jedan do četiri atoma ugljenika.
[0021] "Linearni ili granati alkenil" označava monovalentni ugljovodonični radikal linearnog ili granatog lanca od dva do dvadeset atoma ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenosti, tj. dvostruka veza ugljenik-ugljenik, pri čemu alkenil radikal uključuje radikale koji imaju "cis" i "trans" orijentacije, ili alternativno, "E" i "Z" orijentacije. Primeri uključuju etilenil ili vinil (-CH=CH2), i alil (-CH2CH=CH2). Poželjno, alkenil ima dva do deset atoma ugljenika. Poželjnije, alkil ima dva do četiri atoma ugljenika.
[0022] "Linearni ili granati alkinil" označava monovalentni ugljovodonični radikal linearnog ili granatog lanca od dva do dvadeset atoma ugljenika sa najmanje jednim mestom nezasićenosti, tj. trostruka veza ugljenik-ugljenik. Primeri uključuju etinil, propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, 2-pentinil, 3-pentinil, i heksinil. Poželjno, alkinil ima dva do deset atoma ugljenika.
[0023] Termin "karbocikl", "karbociklil" i "karbociklični prsten" označava monovalentni nearomatični, zasićen ili delimično nezasićen prsten koji ima 3 do 12 atoma ugljenika kao monociklični prsten ili 7 do 12 atoma ugljenika kao biciklični prsten. Biciklični karbocikli koji imaju 7 do 12 atoma mogu biti uređeni, na primer, kao biciklo [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistem, i biciklični karbocikli koji imaju 9 ili 10 atoma u prstenu mogu biti uređeni kao biciklo [5,6] ili [6,6] sistem, ili kao premošteni sistemi kao što su biciklo[2.2.1]heptan, biciklo[2.2.2]oktan i biciklo[3.2.2]nonan. Primeri monocikličnih karbocikala uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, 1-ciklopent-1-enil, 1-ciklopent-2-enil, 1-ciklopent-3-enil, cikloheksil, 1-cikloheks-1-enil, 1-cikloheks-2-enil, 1-cikloheks-3-enil, cikloheksadienil, cikloheptil, ciklooktil, ciklononil, ciklodecil, cikloundecil, i ciklododecil.
[0024] Termini "ciklični alkil" i "cikloalkil" mogu se upotrebljavati naizmenično. Oni označavaju monovalentni radikal zasićenog karbocikličnog prstena. Poželjno, ciklični alkil je radikal sa 3 do 7 članova monocikličnog prstena. Poželjnije, ciklični alkil je cikloheksil.
[0025] Termin "ciklični alkenil" označava radikal karbocikličnog prstena koji ima najmanje jednu dvostruku vezu u strukturi prstena.
[0026] Termin "ciklični alkinil" označava radikal karbocikličnog prstena koji ima najmanje jednu trostruku vezu u strukturi prstena.
[0027] "Aril" znači monovalentni aromatični ugljovodonični radikal od 6-18 atoma ugljenika izveden uklanjanjem jednog atoma vodonika sa jednog atoma ugljenika iz sistema roditeljskog aromatičnog prstena. Neke aril grupe predstavljene su u primernim strukturama kao "Ar". Aril uključuje biciklične radikale koji sadrže aromatični prsten fuzionisan na zasićeni, delimično nezasićeni prsten, ili aromatični karbociklični ili heterociklični prsten. Tipične aril grupe uključuju radikale izvedene iz benzena (fenil), supstituisane benzene, naftalen, antracen, indenil, indanil, 1,2-dihidronaftalen, i 1,2,3,4-tetrahidronaftil. Poželjno, aril je fenil grupa.
[0028] Termini "heterocikl", "heterociklil", i "heterociklični prsten" ovde se upotrebljavaju naizmenično i označavaju zasićen ili delimično nezasićen (tj. koji ima jednu ili više dvostrukih i/ili trostrukih veza unutar prstena) karbociklični radikal od 3 do 18 atoma u prstenu u kom je najmanje jedan atom u prstenu heteroatom odabran od azota, kiseonika, fosfora, i sumpora, preostali atomi u prstenu su C, gde su jedan ili više atoma u prstenu opciono supstituisani nezavisno sa jednim ili više supstituenata opisanih ispod. Heterocikl može biti monocikl koji ima 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika i 1 do 4 heteroatoma odabranih od N, O, P, i S) ili bicikl koji ima 7 do 10 članova prstena (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 6 heteroatoma odabranih od N, O, P, i S), na primer: biciklo [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistem. Heterocikli su opisani u Paquette, Leo A .; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), posebno u poglavljima 1, 3, 4, 6, 7, i 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 do danas), posebno sveske 13, 14, 16, 19, i 28; i J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Heterociklil" takođe uključuje radikale gde su heterocikl radikali fuzionisani sa zasićenim, delimično nezasićenim prstenom, ili aromatičnim karbocikličnim ili heterocikličnim prstenom. Primeri heterocikličnih prstenova uključuju pirolidinil, tetrahidrofuranil, dihidrofuranil, tetrahidrotienil, tetrahidropiranil, dihidropiranil, tetrahidrotiopiranil, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioksanil, piperazinil, homopiperazinil, azetidinil, oksetanil, tietanil, homopiperidinil, oksepenil, tiepanil, oksazepinil, diazepinil, tiazepinil, 2-pirolinil, 3-pirolinil, indolinil, 2H-piranil, 4H-piranil, dioksanil, 1,3-dioksolanil, pirazolinil, ditianil, ditiolanil, dihidropiranil, dihidrotienil, dihidrofuranil, pirazolidinilimidazolinil, imidazolidinil, 3-azabiciko[3.1.0]heksanil, 3-azabiciklo[4.1.0]heptanil, i azabiciklo[2.2.2]heksanil. Spiro delovi su takođe uključeni u obim ove definicije. Primeri heterociklične grupe u kojoj su atomi u prstenu supstituisani sa okso (=O) delovima su pirimidinonil i 1,1-diokso-tiomorfolinil.
[0029] Termin "heteroaril" označava monovalentni aromatični radikal 5- ili 6-članih prstenova, i uključuje fuzionisane sisteme prstenova (od kojih je najmanje jedan aromatičan) od 5-18 atoma, koji sadrži jedan ili više heteroatoma nezavisno odabranih od azota, kiseonika, i sumpora. Primeri heteroaril grupa su piridinil (uključujući, na primer, 2- hidroksipiridinil), imidazolil, imidazopiridinil, pirimidinil (uključujući, na primer, 4-hidrokipirimidinil), pirazolil, triazolil, pirazinil, tetrazolil, furil, tienil, izoksazolil, tiazolil, oksazolil, izotiazolil, pirolil, kvinolinil, izokvinolinil, indolil, benzimidazolil, benzofuranil, cinolinil, indazolil, indolizinil, ftalazinil, piridazinil, triazinil, izoindolil, pteridinil, purinil, oksadiazolil, triazolil, tiadiazolil, furazanil, benzofurazanil, benzotiofenil, benzotiazolil, benzoksazolil, kvinazolinil, kvinoksalinil, naftiridinil, i furopiridinil.
[0030] Heterociklične ili heteroaril grupe mogu biti prikačene na ugljenik (povezane sa ugljenikom) ili azot (povezane sa azotom) gde je to moguće. Putem primera, heterocikli ili heteroarili vezani za ugljenik mogu biti vezani na poziciji 2, 3, 4, 5, ili 6 piridina, poziciji 3, 4, 5, ili 6 piridazina, poziciji 2, 4, 5, ili 6 pirimidina, poziciji 2, 3, 5, ili 6 pirazina, poziciji 2, 3, 4, ili 5 furana, tetrahidrofurana, tiofurana, tiofena, pirola ili tetrahidropirola, poziciji 2, 4, ili 5 oksazola, imidazola ili tiazola, poziciji 3, 4, ili 5 izoksazola, pirazola, ili izotiazola, poziciji 2 ili 3 aziridina, poziciji 2, 3, ili 4 azetidina, poziciji 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 kvinolina ili poziciji 1, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 izokvinolina.
[0031] Putem primera, heterocikli ili heteroarili vezani za azot mogu biti vezani na poziciji 1 aziridina, azetidina, pirola, pirolidina, 2-pirolina, 3-pirolina, imidazola, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazola, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indola, indolina, 1H-indazola, poziciji 2 izoindola, ili izoindolina, poziciji 4 morfolina, i poziciji 9 karbazola, ili O-karbolina.
[0032] Heteroatomi prisutni u heteroarilu ili heterociklilu uključuju oksidovane oblike kao što su NO, SO i SO2.
[0033] Termin "halo" ili "halogen" označava F, Cl, Br ili I.
[0034] Alkil, alkenil, alkinil, ciklični alkil, ciklični alkenil, ciklični alkinil, karbociklil, aril, heterociklil i heteroaril opisani iznad mogu biti opciono supstituisani sa još jednim (npr. 2, 3, 4, 5, 6 ili više) supstituentom.
[0035] Ukoliko je supstituent opisan kao "supstituisan", supstituent koji nije vodonik je na mestu vodonik supstituenta na ugljeniku, kiseoniku, sumporu ili azotu supstituenta. Stoga, na primer, supstituisani alkil supstituent je alkil supstituent pri čemu je najmanje jedan supstituent koji nije vodonik na mestu vodonik supstituenta na alkil supstituentu. Za ilustraciju, monofluoroalkil je alkil supstituisan sa fluoro supstituentom, a difluoroalkil je alkil supstituisana sa dva fluoro supstituenta. Treba razumeti da ukoliko na supstituentu postoji više od jedne supstitucije, svaki supstituent koji nije vodonik može biti identičan ili različit (osim ukoliko nije drugačije navedeno).
[0036] Ukoliko je supstituent opisan kao "opciono supstituisan", supstituent može biti ili (1) nesupstituisan, ili (2) supstituisan. Ukoliko je ugljenik supstituenta opisan kao opciono supstituisan sa jednim ili više sa liste supstituenata, jedan ili više vodonika na ugljeniku (do koliko ih ima) mogu odvojeno i/ili zajedno biti zamenjeni sa nezavisno odabranim opcionim supstituentom. Ukoliko je azot supstituenta opisan kao opciono supstituisan sa jednim ili više sa liste supstituenata, jedan ili više vodonika na azotu (do koliko ih ima) može svaki biti zamenjen sa nezavisno odabranim opcionim supstituentom. Jedan primerni supstituent može se prikazati kao -NR'R", pri čemu R' i R" zajedno sa atomom azota na koji su prikačeni mogu formirati heterociklični prsten. Heterociklički prsten koji se formira od R' i R" zajedno sa atomom azota na koji su oni prikačeni može biti delimično ili potpuno zasićen. U jednom primeru izvođenja, heterociklični prsten se sastoji od 3 do 7 atoma. U drugom primeru izvođenja, heterociklični prsten je odabran iz grupe koja se sastoji od pirolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, tetrazolila, izoksazolila, piridila i tiazolila.
[0037] Ova specifikacija upotrebljava termine "supstituent", "radikal", i "grupa" naizmenično.
[0038] Ukoliko je grupa supstituenata zajednički opisana kao opciono supstituisana jednim ili više sa liste supstituenata, grupa može uključivati: (1) supstituente koji se ne mogu supstituisati, (2) supstituente koji se mogu supstituisati koji nisu supstituisani opcionim supstituentima i/ili (3) supstituente koji se mogu supstituisati koji su supstituisani jednim ili više opcionih supstituenata.
[0039] Ukoliko je supstituent opisan kao opciono supstituisan sa do određenog broja supstituenata koji nisu vodonik, taj supstituent može biti ili (1) nesupstituisan; ili (2) supstituisan do određenog broja supstituenata koji nisu vodonik ili do maksimalnog broja
1
pozicija na supstituentu koje se mogu supstituisati, šta god da je manje. Stoga, na primer, ukoliko je supstituent opisan kao heteroaril opciono supstituisan sa do 3 supstituenta koji nisu vodonik, onda bi bilo koji heteroaril sa manje od 3 pozicije koje se mogu supstituisati bio opciono supstituisan sa do najviše samo onoliko supstituenta koji nisu vodonik koliko heteroaril ima pozicija koje se mogu supstituisati. Takvi supstituenti, u neograničavajućim primerima, mogu biti odabrani od linearnog, granatog ili cikličnog alkila, alkenila ili alkinila koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, arila, heteroarila, heterociklila, halogena, guanidinijuma [-NH(C=NH)NH2], -OR<100>, NR<101>R<102>, -NO2, -NR<101>COR<102>, -SR<100>, sulfoksida predstavljenog sa -SOR<101>, sulfona predstavljenog sa -SO2R<101>, sulfonata -SO3M, sulfata -OSO3M, sulfonamida predstavljenog sa -SO2NR<101>R<102>, cijano, azido, -COR<101>, -OCOR<101>, -OCONR<101>R<102>i jedinice polietilen glikola (-CH2CH2O)nR<101>pri čemu M je H ili katjon (kao što su Na<+>ili K<+>); R<101>, R<102>i R<103>su svaki nezavisno odabrani od H, linearnog, granatog ili cikličnog alkila, alkenila ili alkinila koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika, jedinice polietilen glikola (-CH2CH2O)n-R<104>, pri čemu je n ceo broj od 1 do 24, arila koji ima od 6 do 10 atoma ugljenika, heterocikličnog prstena koji ima od 3 do 10 atoma ugljenika i heteroarila koji ima 5 do 10 atoma ugljenika; i R<104>je H ili linearni ili granati alkil koji ima 1 do 4 atoma ugljenika, pri čemu su alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril i heterociklil u grupama predstavljenim sa R<100>, R<101>, R<102>, R<103>i R<104>opciono supstituisani sa jednim ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6 ili više) supstituenata nezavisno odabranim od halogena, -OH, -CN, -NO2i nesupstituisanog linearnog ili granatog alkila koji ima 1 do 4 atoma ugljenika. Poželjno, supstituenti za opciono supstituisani alkil, alkenil, alkinil, ciklični alkil, ciklični alkenil, ciklični alkinil, karbociklil, aril, heterociklil i heteroaril koji su opisani iznad uključuju halogen, -CN, -NR<102>R<103>, -CF3, -OR<101>, aril, heteroaril, heterociklil, -SR<101>, -SOR<101>, -SO2R<101>i -SO3M.
[0040] Termini "jedinjenje" ili "citotoksično jedinjenje", "citotoksični dimer" i "citotoksično dimerno jedinjenje" se upotrebljavaju naizmenično. Oni su namenjeni da uključuju jedinjenja za koje je struktura ili formula ili bilo koji njihov derivat objavljen u predmetnom pronalasku. Termin takođe uključuje stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere, solvate, metabolite, soli (npr. farmaceutski prihvatljive soli) i prolekove, i soli proleka jedinjenja od svih formula objavljenih u predmetnom pronalasku. Termin takođe uključuje bilo koje solvate, hidrate, i polimorfe bilo čega od gore navedenog. Specifično navođenje "stereoizomera", "geometrijskih izomera", "tautomera", "solvata", "metabolita", "soli", "proleka", "soli proleka", "konjugata", "konjugatnih soli", "solvata", "hidrata", ili "polimorfa" u određenim aspektima pronalaska koji su opisani u ovoj prijavi ne treba da se tumače kao namerno izostavljanje ovih oblika u drugim aspektima pronalaska gde se termin "jedinjenje" upotrebljava bez navođenja ovih drugih oblika.
[0041] Termin "konjugat" kao što se ovde upotrebljava označava ovde opisano jedinjenje ili njegov derivat koje je povezano sa agensom koji se vezuje za ćeliju.
[0042] Termin "koji se može povezati sa agensom koji se vezuje za ćeliju" kao što se ovde upotrebljava označava jedinjenja koja su ovde opisana ili njihove derivate koja sadrže najmanje jednu vezujuću grupu ili njen prekursor pogodan za vezivanje ovih jedinjenja ili njihovih derivata sa agensom koji se vezuje za ćeliju.
[0043] Termin "prekursor" date grupe označava bilo koju grupu koja može dovesti do te grupe bilo kojom deprotekcijom, hemijskom modifikacijom, ili reakcijom kuplovanja.
[0044] Termin "povezan sa agensom koji se vezuje za ćeliju" označava konjugatni molekul koji sadrži najmanje jedno od jedinjenja koja su ovde opisana (npr. jedinjenja formule (I) i jedinjenja lek-linker koja su ovde opisana), ili njihove derivate vezane za agens koji se vezuje za ćeliju preko pogodne povezujuće grupe ili njenog prekursora.
[0045] Termin "hiralni" označava molekule koji imaju svojstvo nepoklapanja sa likom u ogledalu, dok termin "ahiralni" označava molekule koji se mogu poklopiti sa svojim likom u ogledalu.
[0046] Termin "stereoizomer" označava jedinjenja koja imaju identičnu hemijsku konstituciju i konektivnost, ali različite orijentacije svojih atoma u prostoru koje se ne mogu interkonvertovati rotacijom oko jednostrukih veza.
[0047] "Diastereomer" označava stereoizomer sa dva ili više hiralnih centara i čiji molekuli nisu lik u ogledalu jedan drugom. Diastereomeri imaju različita fizička svojstva, npr. tačke topljenja, tačke ključanja, spektralna svojstva, i reaktivnost. Smeše diastereomera se mogu odvojiti analitičkim procedurama pod visokom rezolucijom kao što su kristalizacija, elektroforeza i hromatografija.
[0048] "Enantiomeri" označavaju dva stereoizomera jedinjenja koja se međusobno ne mogu poklopiti sa likom u ogledalu onog drugog.
[0049] Ovde upotrebljavane stereohemijske definicije i konvencije uglavnom slede S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; i Eliel, E. i Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Jedinjenja pronalaska mogu da sadrže asimetrične ili hiralne centre, i zato postoje u različitim stereoizomernim oblicima. Predviđeno je da svi stereoizomerni oblici jedinjenja pronalaska, uključujući, ali neograničavajući se na, diastereomere, enantiomere i atropizomere, kao i njihove smeše, kao što su racemske smeše, čine deo predmetnog pronalaska. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj. imaju sposobnost da rotiraju ravan polarizovane svetlosti. U opisu optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S, se upotrebljavaju za označavanje apsolutne konfiguracije molekula oko njegovog(ih) hiralnog(ih) centra(ara). Prefiksi d i l ili (+) i (-) se koriste da označe znak rotacije ravni polarizovane svetlosti od strane jedinjenja, pri čemu (-) ili l znači da je jedinjenje levorotatorno. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d je dekstrorotatorno. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični osim što su oni lik u ogledalu jedan drugom. Specifični stereoizomer se takođe može označiti kao enantiomer, i smeša takvih izomera se često naziva enantiomerna smeša. Mešavina enantiomera od 50:50 se označava kao racemska smeša ili racemat, koji se može pojaviti tamo gde nije došlo do stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili postupku. Termini "racemska smeša" i "racemat" označavaju ekvimolarnu smešu dve enantiomerne vrste, lišenu optičke aktivnosti.
[0050] Termin "tautomer" ili "tautomerni oblik" označava strukturne izomere različitih energija koji su inter-konvertibilni preko niskoenergetske barijere. Na primer, protonski tautomeri (poznati i kao prototropni tautomeri) uključuju interkonverzije putem migracije protona, kao što su keto-enol i imin-enamin izomerizacije. Valentni tautomeri uključuju interkonverzije pomoću reorganizacije nekih vezujućih elektrona.
[0051] Termin "prolek" kao što se upotrebljava u ovoj prijavi označava prekursor ili derivatni oblik jedinjenja pronalaska koji je sposoban da se enzimski ili hidrolitički aktivira ili konvertuje u aktivniji roditeljski oblik. Videti, npr. Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) i Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Prolekovi uključuju prolekove koji sadrže estar, prolekove koji sadrže fosfat, prolekove koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sulfat, prolekove koji sadrže peptide, prolekove modifikovanih D-amino-kiselina, glikozilovane prolekove, prolekove koji sadrže β-laktam, prolekove koji sadrže opciono supstituisan fenoksiacetamid, prolekove koji sadrže opciono supstituisan fenilacetamid, 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridin prolekove koji se mogu konvertovati u aktivniji lek bez citotoksičnosti. Primeri citotoksičnih lekova koji se mogu izvesti u oblik proleka uključuju jedinjenja pronalaska i hemioterapijske agense kao što je opisano iznad.
[0052] Termin "prolek" takođe podrazumeva da uključuje derivat jedinjenja koje može da hidrolizuje, oksiduje, ili na neki drugi način reaguje pod biološkim uslovima (in vitro ili in vivo) kako bi se obezbedilo jedinjenje ovog pronalaska. Prolekovi mogu postati aktivni samo posle takve reakcije pod biološkim uslovima, ili mogu imati aktivnost kao neizreagovani
1
oblici. Primeri zamišljenih prolekova uključuju analoge ili derivate jedinjenja bilo koje od ovde objavljenih formula koji sadrže biohidrolizujuće delove kao što su biohidrolizujući amidi, biohidrolizujući estri, biohidrolizujući karbamati, biohidrolizujući karbonati, biohidrolizujući ureidi, i biohidrolizirajući analozi fosfata. Ostali primeri prolekova uključuju derivate jedinjenja bilo koje od ovde objavljenih formula koje sadrže -NO, -NO2, -ONO, ili -ONO2delove. Prolekovi se tipično mogu pripremiti upotrebom dobro poznatih postupaka, kao što su oni opisani u Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff, ed., 5th ed); videti takođe Goodman and Gilman’s, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8th ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs".
[0053] Jedan poželjni oblik proleka uključuje jedinjenja (sa ili bez ikakvih linker grupa) i konjugate pronalaska koji sadrže adukt formiran između imino veze jedinjenja/konjugata i imino reaktivnog reagensa. Drugi poželjni oblik proleka pronalaska uključuje jedinjenja kao što su ona formule (I), pri čemu kada dvostruka linija između N i C predstavlja jednostruku vezu, X je H, i jedinjenje postaje prolek. Prolek pronalaska može sadržati jedan ili oba oblika prolekova koji su ovde opisani (npr. koji sadrže adukt formiran između imino veze jedinjenja/konjugata i imino reaktivnog reagensa, i/ili koji sadrže Y odlazeću grupu kada je X -H).
[0054] Termin "imino reaktivni reagens" označava reagens koji je sposoban da reaguje sa imino grupom. Primeri imino reaktivnog reagensa uključuju sulfite (H2SO3, H2SO2ili so HSO3-, SO3<2->ili HSO2<->formiranu sa katjonom), metabisulfit (H2S2O5ili so S2O5<2->formiranu sa katjonom), mono, di, tri, i tetra- tiofosfate (PO3SH3, PO2S2H3, POS3H3, PS4H3ili so PO3S3-, PO2S2<3->, POS3<3->ili PS4<3->formiranu sa katjonom), tio fosfatne estre ((R<i>O)2PS(OR<i>), R<i>SH, R<i>SOH, R<i>SO2H, R<i>SO3H), različite amine (hidroksil amin (npr. NH2OH), hidrazin (npr. NH2NH2), NH2O-R<i>, R<i'>NH-R<i>, NH2-R<i>), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2<,>tiosulfat (H2S2O3ili so S2O3<2->formiranu sa katjonom), ditionit (H2S2O4ili so S2O4<2->formiranu sa katjonom), fosforoditioat (P(=S)(OR<k>)(SH)(OH) ili njegovu so formiranu sa katjonom), hidroksaminska kiselina (R<k>C(=O)NHOH ili so formiranu sa katjonom), hidrazid (R<k>CONHNH2), formaldehid sulfoksilat (HOCH2SO2H ili so HOCH2SO2-formiranu sa katjonom, kao što je HOCH2SO2-Na<+>), glikozilovane nukleotide (kao što je GDP-manoza), fludarabin ili njihovu smešu, pri čemu su R<i>i R<i'>svaki nezavisno linearni ili granati alkil koji ima 1 do 10 atoma ugljenika i supstituisan je sa najmanje jednim supstituentom odabranim od -N(R<j>)2, -CO2H, -SO3H, i -PO3H; R<i>i R<i'>se dalje mogu opciono supstituisati supstituentom za alkil koji je opisan ovde; R<j>je linearni ili granati alkil koji ima 1 do 6 atoma ugljenika; i R<k>je linearan, granati ili ciklični alkil, alkenil ili alkinil koji ima 1 do 10 atoma ugljenika, aril, heterociklil ili heteroaril (poželjno, R<k>je linearni ili granati alkil koji ima 1 do 4 atoma ugljenika; poželjnije, R<k>je metil, etil ili propil). Poželjno, katjon je monovalentni katjon, kao što je Na<+>ili K<+>. Poželjno, imino reaktivni reagens je odabran od sulfita, hidroksil amina, uree i hidrazina. Poželjnije, imino reaktivni reagens je NaHSO3ili KHSO3.
[0055] Kao što se ovde upotrebljava i ukoliko nije drugačije naznačeno, termini "biohidrolizujući amid", "biohidrolizujući estar" "biohidrolizujući karbamat", "biohidrolizujući karbonat", "biohidrolizujući ureid" i " biohidrolizujući analog fosfata" znače amid, estar, karbamat, karbonat, ureid, ili analog fosfata, respektivno, koji bilo: 1) ne uništava biološku aktivnost jedinjenja i daje tom jedinjenju korisna svojstva in vivo, kao što su unos, trajanje delovanja ili početak delovanja; ili 2) je sam po sebi biološki neaktivan, ali se konvertuje in vivo u biološki aktivno jedinjenje. Primeri biohidrolizujućih amida uključuju niže alkil amide, α-amino-kiselinske amide, alkoksiacil amide, i alkilaminoalkilkarbonil amide. Primeri biohidrolizujućih estara uključuju niže alkil estre, alkoksiaciloksi estre, alkil acilamino alkil estre, i holin estre. Primeri biohidrolizujućih karbamata uključuju niže alkilamine, supstituisane etilendiamine, amino-kiseline, hidroksialkilamine, heterociklične i heteroaromatične amine, i polieter amine. Posebno su povoljni oni prolekovi i soli proleka koji povećavaju bioraspoloživost jedinjenja ovog pronalaska kada se takva jedinjenja primenjuju sisaru.
[0056] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" kao što se ovde upotrebljava, označava farmaceutski prihvatljive organske ili neorganske soli jedinjenja pronalaska. Primerne soli uključuju sulfat, citrat, acetat, oksalat, hlorid, bromid, jodid, nitrat, bisulfat, fosfat, kiseli fosfat, izonikotinat, laktat, salicilat, kiseli citrat, tartarat, oleat, tanat, pantotenat, bitartarat, askorbat, sukcinat, maleat, gentisinat, fumarat, glukonat, glukuronat, saharat, format, benzoat, glutamat, metansulfonat "mezilat", etansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat, pamoat (tj.
1,1'-metilen-bis-(2-hidroksi-3-naftoat)) soli, soli alkalnih metala (npr. natrijum i kalijum), soli zemnoalkalnih metala (npr. magnezijum), i amonijum soli. Farmaceutski prihvatljiva so može da obuhvata uključivanje drugog molekula kao što je acetatni jon, sukcinatni jon ili drugi kontra jon. Kontra jon može biti bilo koji organski ili neorganski deo koji stabiliše naelektrisanje roditeljskog jedinjenja. Osim toga, farmaceutski prihvatljiva so može imati više od jednog naelektrisanog atoma u svojoj strukturi. Primeri gde je više naelektrisanih atoma deo farmaceutski prihvatljive soli mogu imati više kontra jona. Otuda, farmaceutski prihvatljiva so može imati jedan ili više naelektrisanih atoma i/ili jedan ili više kontra jona.
1
[0057] Ukoliko je jedinjenje pronalaska baza, željena farmaceutski prihvatljiva so može biti pripremljena bilo kojim pogodnim postupkom dostupnim u struci, na primer, tretiranjem slobodne baze neorganskom kiselinom, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, metansulfonska kiselina, i fosforna kiselina, ili organskom kiselinom, kao što su sirćetna kiselina, maleinska kiselina, jantarna kiselina, bademova kiselina, fumarna kiselina, malonska kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, glikolna kiselina, salicilna kiselina, piranozidilna kiselina, kao što su glukuronska kiselina ili galakturonska kiselina, alfa hidroksi kiselina, kao što su limunska kiselina ili vinska kiselina, amino-kiselina, kao što su asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina, aromatična kiselina, kao što su benzoična kiselina ili cimetna kiselina, sulfonska kiselina, kao što su ptoluensulfonska kiselina ili etansulfonska kiselina.
[0058] Ukoliko je jedinjenje pronalaska kiselina, željena farmaceutski prihvatljiva so može biti pripremljena bilo kojim pogodnim postupkom, na primer, tretiranjem slobodne kiseline neorganskom ili organskom bazom, kao što je amin (primarni, sekundarni ili tercijarni), hidroksid alkalnog metala ili hidroksid zemnoalkalnog metala. Ilustrativni primeri pogodnih soli uključuju organske soli izvedene iz amino-kiselina, kao što su glicin i arginin, amonijak, primarni, sekundarni, i tercijarni amini, i ciklični amini, kao što su piperidin, morfolin i piperazin, i neorganske soli izvedene iz natrijuma, kalcijuma, kalijuma, magnezijuma, mangana, gvožđa, bakra, cinka, aluminijuma i litijuma.
[0059] Kao što se ovde upotrebljava, termin "solvat" znači jedinjenje koje dodatno uključuje stehiometrijsku ili nestehiometrijsku količinu rastvarača, kao što su voda, izopropanol, aceton, etanol, metanol, DMSO, etil acetat, sirćetna kiselina, i etanolamin dihlorometan, ili 2-propanol, vezanu nekovalentnim intermolekularnim silama. Solvati ili hidrati jedinjenja se lako pripremaju dodavanjem najmanje jednog molarnog ekvivalenta hidroksilnog rastvarača, kao što su metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol ili voda u jedinjenje što rezultuje solvacijom ili hidratacijom imino dela.
[0060] Termini "abnormalni ćelijski rast " i "proliferativni poremećaj" upotrebljavaju se naizmenično u ovoj prijavi. "Abnormalni ćelijski rast", kao što se ovde upotrebljava, ukoliko nije drugačije naznačeno, označava ćelijski rast koji je nezavisan od normalnih regulatornih mehanizama (npr. gubitak kontaktne inhibicije). Ovo uključuje, na primer, abnormalni rast: (1) ćelija tumora (tumori) koje proliferišu pomoću ekspresije mutirane tirozin kinaze ili prekomerne ekspresije receptora tirozin kinaze; (2) benignih i malignih ćelija drugih proliferativnih bolesti u kojima dolazi do aktivacije aberantne tirozin kinaze; (3) bilo kojih tumora koji proliferišu pomoću receptora tirozin kinaze; (4) bilo kojih tumora koji
1
proliferišu pomoću aktivacije aberantne serin/treonin kinaze; i (5) benignih i malignih ćelija drugih proliferativnih bolesti u kojima dolazi do aktivacije aberantne serin/treonin kinaze.
[0061] Termini "kancer" i "kancerski" označavaju ili opisuju fiziološko stanje kod sisara tipično okarakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. "Tumor" sadrži jednu ili više kancerskih ćelija, i/ili benigne ili pre-kancerske ćelije.
[0062] "Terapijski agens" obuhvata i biološki agens kao što su antitelo, peptid, protein, enzim ili hemioterapijski agens.
[0063] "Hemioterapijski agens" je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju kancera.
[0064] "Metabolit" je proizvod proizveden putem metabolizma određenog jedinjenja u telu, njegov derivat, ili njegov konjugat, ili njegova so. Metaboliti jedinjenja, njihovi derivati, ili njihovi konjugati, mogu se identifikovati upotrebom rutinskih tehnika poznatih u struci i odrediti njihove aktivnosti upotrebom testova kao što su oni ovde opisani. Takvi proizvodi mogu rezultirati na primer iz oksidacije, hidroksilacije, redukcije, hidrolize, amidacije, deamidacije, estrifikacije, deestrifikacije, i enzimskog isecanja primenjenog jedinjenja. U skladu sa tim, pronalazak uključuje metabolite jedinjenja pronalaska, njihove derivate ili njihove konjugate, uključujući jedinjenja, njihove derivate, ili njihove konjugate, proizvedene postupkom koji sadrži dovođenje u kontakt jedinjenja, njegovog derivata, ili njegovog konjugata, ovog pronalaska sa sisarom tokom perioda vremena dovoljnog da se dobije prinos njihovog metaboličkog proizvoda.
[0065] Fraza "farmaceutski prihvatljiv" ukazuje da supstanca ili kompozicija mora biti kompatibilna hemijski i/ili toksikološki, sa ostalim sastojcima koje sadrži formulacija, i/ili sisarom koji se njom tretira.
[0066] Termin "zaštitna grupa" ili "zaštitni deo" označava supstituent koji se uobičajeno koristi da blokira ili štiti određenu funkcionalnost dok reaguju druge funkcionalne grupe na jedinjenju, njegovom derivatu, ili njegovom konjugatu. Na primer, "amin-zaštitna grupa" ili "amino-zaštitna grupa" je supstituent prikačen za amino grupu koji blokira ili štiti amino funkcionalnost u jedinjenju. Takve grupe su dobro poznate u struci (videti na primer P. Wuts i T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, poglavlje 7, J. Wiley & Sons, NJ) i njihovi primeri su karbamati kao što su metil i etil karbamat, FMOC, supstituisani etil karbamati, karbamati isečeni 1,6-β-eliminacijom (takođe se nazivaju "samo-imolativni"), uree, amidi, peptidi, alkil i aril derivati. Pogodne amino-zaštitne grupe uključuju acetil, trifluoroacetil, t-butoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBZ) i 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc). Za uopšteni opis zaštitnih grupa i njihovu upotrebu,
1
videti P.G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007.
[0067] Termin "odlazeća grupa" označava grupu naelektrisanog ili nenaelektrisanog dela koja odlazi tokom supstitucije ili premeštanja. Takve odlazeće grupe su dobro poznate u struci i uključuju halogene, estre, alkoksi, hidroksil, tozilate, triflate, mezilate, nitrile, azide, karbamate, disulfide, tioestre, tioetre i diazonijum jedinjenja.
[0068] Termin "bifunkcionalni agens za umrežavanje", "bifunkcionalni linker" ili "agens za umrežavanje" označava modifikujuće agense koji poseduju dve reaktivne grupe; od kojih je jedna sposobna da reaguje sa agensom koji se vezuje za ćeliju, dok druga reaguje sa citotoksičnim jedinjenjem da poveže dva dela zajedno. Takvi bifunkcionalni umreživači su dobro poznati u struci (videti, na primer, Isalm i Dent u Bioconjugation poglavlju 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999). Na primer, bifunkcionalni agensi za umrežavanje koji omogućavaju povezivanje putem tioetarske veze uključuju N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat (SMCC) da introdukuje maleimido grupe, ili N-sukcinimidil-4-(jodoacetil)-aminobenzoat (SIAB) da introdukuje jodoacetil grupe. Ostali bifunkcionalni agensi za umrežavanje koji introdukuju maleimido grupe ili haloacetil grupe na agens koji se vezuje za ćeliju dobro su poznati u struci (videti S.A.D. patentne prijave 2008/0050310, 20050169933, dostupne od kompanije Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, SAD) i uključuju bis-maleimidopolietilenglikol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, N-(β-maleimidopropiloksi)sukcinimid estar (BMPS), N-sukcinimidil estar γ-maleimidobuterne kiseline (GMBS), N-hidroksisukcinimid estar εmaleimidokapronske kiseline (EMCS), 5-maleimidovalerijansku kiselinu NHS, HBVS, N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat), koji je analog "dugog lanca" SMCC (LC-SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS), hidrazid ili HCl so 4-(4-N-maleimidofenil)-buterne kiseline (MPBH), N-sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat (SBAP), N-sukcinimidil jodocetat (SIA), N-sukcinimidil estar κmaleimidoundekanoične kiseline (KMUA), N-sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirat (SMPB), sukcinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)heksanoat (SMPH), sukcinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoat (SVSB), ditiobis-maleimidoetan (DTME), 1,4-bis-maleimidobutan (BMB), 1,4-bis-maleimidil-2,3-dihidroksibutan (BMDB), bis-maleimidoheksan (BMH), bismaleimidoetan (BMOE), sulfosukcinimidil 4-(N-maleimido-metil)cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC), sulfosukcinimidil(4-jodo-acetil)aminobenzoat (sulfo-SIAB), mmaleimidobenzoil-N-hidroksisulfosukcinimid estar (sulfo-MBS), N-(γmaleimidobutriloksi)sulfosukcinimid estar (sulfo-GMBS), N-(ε-
1
maleimidokaproiloksi)sulfosukcimido estar (sulfo-EMCS), N-(κmaleimidoundekanoiloksi)sulfosukcinimid estar (sulfo-KMUS), i sulfosukcinimidil 4-(pmaleimidofenil)butirat (sulfo-SMPB).
[0069] Heterobifunkcionalni agensi za umrežavanje su bifunkcionalni agensi za umrežavanje koji imaju dve različite reaktivne grupe. Heterobifunkcionalni agensi za umrežavanje koji sadrže i amin-reaktivnu N-hidroksisukcinimidnu grupu (NHS grupa) i karbonil-reaktivnu hidrazinsku grupu mogu se takođe upotrebljavati za povezivanje citotoksičnih jedinjenja koja su ovde opisana sa agensom koji se vezuje za ćeliju (npr. antitelo). Primeri takvih komercijalno dostupnih heterobifunkcionalnih agenasa za umrežavanje uključuju sukcinimidil 6-hidrazinonikotinamid aceton hidrazon (SANH), sukcinimidil 4-hidrazidotereftalat hidrohlorid (SHTH) i sukcinimidil hidrazinijum nikotinat hidrohlorid (SHNH). Konjugati koji nose vezu koja je labilna na dejstvo kiseline takođe se mogu pripremiti upotrebom derivata benzodiazepina koji nosi hidrazin predmetnog pronalaska. Primeri bifunkcionalnih agenasa za umrežavanje koji se mogu upotrebljavati uključuju sukcinimidil-p-formil benzoat (SFB) i sukcinimidil-p-formilfenoksiacetat (SFPA).
[0070] Bifunkcionalni agensi za umrežavanje koji omogućavaju povezivanje agensa koji se vezuje za ćeliju sa citotoksičnim jedinjenjima putem disulfidnih veza su poznati u struci i uključuju N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoat (SPP), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)butanoat (SPDB), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoat (sulfo-SPDB) da introdukuju ditiopiridilne grupe. Ostali bifunkcionalni agensi za umrežavanje koji se mogu upotrebljavati da introdukuju disulfidne grupe su poznati u struci i objavljeni u S.A.D. patentima 6,913,748, 6,716,821 i S.A.D. patentnim publikacijama 20090274713 i 20100129314. Alternativno, agensi za umrežavanje kao što su 2-iminotiolan, homocistein tiolakton ili S-acetilsukcinski anhidrid koji introdukuju tiolne grupe takođe se mogu upotrebljavati.
[0071] "Linker", "linker deo" ili "povezujuća grupa" kao što je ovde definisano označava deo koji zajedno spaja dve grupe, kao što su agens koji se vezuje za ćeliju i citotoksično jedinjenje. Tipično, linker je suštinski inertan pod uslovima u kojima su dve grupe koje spaja povezane. Bifunkcionalni agens za umrežavanje može da sadrži dve reaktivne grupe, jednu na svakom kraju linker dela, tako da jedna reaktivna grupa može prvo da reaguje sa citotoksičnim jedinjenjem da obezbedi jedinjenje koje nosi linker deo i drugu reaktivnu grupu, koja zatim može reagovati sa agensom koji se vezuje za ćeliju. Alternativno, jedan kraj bifunkcionalnog agensa za umrežavanje može prvo da reaguje sa agensom koji se vezuje za ćeliju da obezbedi agens koji se vezuje za ćeliju koji nosi linker deo i drugu reaktivnu grupu,
1
koja zatim može reagovati sa citotoksičnim jedinjenjem. Linker deo može da sadrži hemijsku vezu koja omogućava oslobađanje citotoksičnog dela na određenom mestu. Pogodne hemijske veze su dobro poznate u struci i uključuju disulfidne veze, tioetarske veze, veze koje su labilne na dejstvo kiseline, veze koje su fotolabilne, veze koje su labilne na dejstvo peptidaze i veze koje su labilne na dejstvo esteraze (videti na primer S.A.D. patente 5,208,020; 5,475,092; 6,441,163; 6,716,821; 6,913,748; 7,276,497; 7,276,499; 7,368,565; 7,388,026 i 7,414,073). Poželjne su disulfidne veze, veze koje su labilne na dejstvo tioetra i peptidaze. Ovde su takođe objavljeni linkeri koji se ne mogu isecati, kao što su oni opisani koji su detaljno opisani u S.A.D. publikaciji broj 20050169933, ili naelektrisani linkeri ili hidrofilni linkeri i opisani su u US 2009/0274713, US 2010/01293140 i WO 2009/134976.
[0072] Ovde su takođe objavljene i povezujuće grupe sa reaktivnom grupom koja je prikačena na jednom kraju, kao što je reaktivni estar, odabrane od sledećih:
-O(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -O(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -O(CR20R21)m(alkinil)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -O(CR20R21)m(piperazino)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -O(CR20R21)m(pirolo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -O(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR20R21)m(alkinil)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR20R21)m(piperazino)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR20R21)m(pirolo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -NR33(C=O)p"(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -NR33(C=O)p"(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y" (CR24R25)q(CO)tX", -NR33(C=O)p"(CR20R21)m(alkinil)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q-(CO)tX" , -NR33(C=O)p"(CR20R21)m(piperazino)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX" , -NR33(C=O)p"(CR20R21)m(pirolo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q-(CO)tX",
2
-NR33(C=O)p"(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX",
-(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR20R21)m(alkinil)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR20R21)m(piperazino)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y" (CR24R25)q(CO)tX",
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(alkinil)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y" (CR24R25)q-(CO)tX",
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"A"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX",
pri čemu:
m, n, p, q, m', n', t' su ceo broj od 1 do 10, ili su opciono 0;
t, m", n", i p" su 0 ili 1;
X" je odabran od OR36, SR37, NR38R39, pri čemu su R36, R37, R38, R39H, ili linearni, granati ili ciklični alkil, alkenil ili alkinil koji ima od 1 do 20 atoma ugljenika i, ili, jedinica polietilen glikola -(OCH2CH2)n, R37, opciono, je tiol zaštitna grupa kada t=1, COX" formira reaktivni estar odabran od N-hidroksisukcinimidnih estara, N-hidroksiftalimidnih estara, N-hidroksi sulfosukcinimidnih estara, para-nitrofenil estara, dinitrofenil estara, pentafluorofenil estara i njihovih derivata, pri čemu navedeni derivati olakšavaju stvaranje amidnih veza;
Y" je odsutan ili je odabran od O, S, S-S ili NR32, pri čemu R32ima istu definiciju kao što je data iznad za R; ili kada Y" nije S-S i t = 0, X" je odabran od maleimido grupe, haloacetil grupe ili SR37, pri čemu R37ima istu definiciju kao iznad;
A" je amino-kiselinski ostatak ili polipeptid koji sadrži između 2 do 20 aminokiselinskih ostataka;
R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, i R27su isti ili različiti i oni su -H ili linearni ili granati alkil koji ima od 1 do 5 atoma ugljenika;
R29i R30su isti ili različiti i oni su -H ili alkil od 1 do 5 atoma ugljenika;
R33je -H ili linearni, granati ili ciklični alkil, alkenil ili alkinil koji ima od 1 do 12 atoma ugljenika, jedinica polietilen glikola R-(OCH2CH2)n-, ili R33je -COR34, -CSR34, -SOR34, ili -SO2R34, pri čemu je R34H ili linearni, granati ili ciklični alkil, alkenil ili alkinil koji ima od 1 do 20 atoma ugljenika ili, jedinica polietilen glikola -(OCH2CH2)n;
i jedan od R40i R41je opciono negativno ili pozitivno naelektrisana funkcionalna grupa i drugi je H ili alkil, alkenil, alkinil koji ima 1 do 4 atoma ugljenika.
[0073] Termin "amino-kiselina" označava amino-kiseline koje se javljaju u prirodi ili amino-kiseline koje se ne javljaju u prirodi. U jednom primeru izvođenja, amino-kiselina je predstavljena pomoću NH2-C(R<aa'>R<aa>)-C(=O)OH, pri čemu su R<aa>i R<aa'>svaki nezavisno H, opciono supstituisani linearni, granati ili ciklični alkil, alkenil ili alkinil koji ima 1 do 10 atoma ugljenika, aril, heteroaril ili heterociklil, ili R<aa>i N-terminusni atom azota mogu zajedno da formiraju heterociklički prsten (npr. kao u prolinu). Termin "amino-kiselinski ostatak" označava odgovarajući ostatak kada se jedan atom vodonika ukloni sa amino i/ili karboksi kraja amino-kiseline, kao što je -NH-C(R<aa'>R<aa>)-C(=O)O-.
[0074] Termin "katjon" označava jon sa pozitivnim naelektrisanjem. Katjon može biti monovalentan (npr. Na<+>, K<+>itd.), bivalentan (npr. Ca<2+>, Mg<2+>itd.) ili multivalentan (npr. Al<3+>itd.). Poželjno, katjon je monovalentan.
[0075] Termin "terapijski efikasna količina" znači ona količina aktivnog jedinjenja ili konjugata koja stvara željeni biološki odgovor kod subjekta. Takav odgovor uključuje ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja koji se leči, prevenciju, inhibiciju ili odlaganje ponovnog javljanja simptoma bolesti ili same bolesti, povećanje dugovečnosti subjekta u poređenju sa odsustvom lečenja, ili prevencije, inhibicije ili odlaganja u napredovanju simptoma bolesti ili same bolesti. Određivanje efikasne količine je unutar sposobnosti osoba iskusnih u struci, naročito u svetlu detaljne objave koja je ovde obezbeđena. Toksičnost i terapijska efikasnost jedinjenja I može se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama i kod eksperimentalnih životinja. Efikasna količina jedinjenja ili konjugata predmetnog pronalaska ili drugog terapijskog agensa koje će se primeniti subjektu će zavisiti od stadijuma, kategorije i statusa multiplog mijeloma i karakteristika subjekta, kao što su opšte zdravstveno stanje, starost, pol, telesna težina i tolerancija na lekove. Efikasna količina jedinjenja ili konjugata predmetnog pronalaska ili drugog terapijskog agensa koje će se primeniti takođe će zavisiti od načina primene i oblika doziranja. Dozna količina i interval se mogu podesiti individualno kako bi se obezbedili nivoi aktivnog jedinjenja u plazmi koji su dovoljni za održavanje željenih terapijskih efekata.
CITOTOKSIČNA JEDINJENJA
[0076] U prvom aspektu, predmetni pronalazak je usmeren na citotoksična jedinjenja strukturne formule (I) ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, kao što je opisano u patentnom zahtevu 1.
[0077] J je odabran od N-hidroksisukcinimidnog estra, N-hidroksi sulfosukcinimidnog estra, nitrofenil (npr. 2 ili 4-nitrofenil) estra, dinitrofenil (npr. 2,4-dinitrofenil) estra, sulfotetraflurofenil (npr. 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenil) estra, i pentafluorofenil estra. Preciznije, u određenim primerima izvođenja, J je N-hidroksisukcinimidni estar.
[0078] U određenim primerima izvođenja, Rai Rbsu oba H; Cy za formulu (B2) je cikloheksan; i R5je H ili Me; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad u prvom aspektu. Preciznije, m’ u formuli (B2) može biti 0 ili 1.
[0079] U jednom primeru izvođenja, Z<s>je -H. U drugom primeru izvođenja, Z<s>je -SMe ili -SPy (Py je piridil).
[0080] U još jednom primeru izvođenja, Z<s>je odabran od bilo koje od sledećih formula:
2
Ċ
ili
pri čemu je U -H ili -SO3M; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0081] U određenim primerima izvođenja, Rai Rbsu oba -H i R5je H ili Me; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0082] U određenim primerima izvođenja, -(CRaRb)m- je -(CH2)m"-C(Me2)- i m" je ceo broj od 1 do 5; preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0083] U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I), P je peptid koji sadrži 2 do 10 amino-kiselinskih ostataka; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0084] U određenim primerima izvođenja, P je peptid koji sadrži 2 do 5 amino-kiselinskih ostataka; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0085] U određenim primerima izvođenja, P je odabran od Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N<9>-tozil-Arg, Phe-N<9>-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu i Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, i Met-Ala; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0086] U određenim primerima izvođenja, P je Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, i D-Ala-D-Ala; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I), dvostruka linija između N i C predstavlja dvostruku vezu; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0087] U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I), R5je -H ili (C1-C3)alkil; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0088] U specifičnim primerima izvođenja, za strukturnu formulu (I), dvostruka linija između N i C predstavlja jednostruku vezu ili dvostruku vezu, pod uslovom da kada je dvostruka veza X je odsutan i Y je -H, i kada je jednostruka veza, X je -H, Y je -OH ili -SO3M;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' i R4' su svi -H;
R6je -OMe;
X' i Y' su oba -H;
A i A' su -O-;
M je H, Na<+>ili K<+>; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0089] U specifičnom primeru izvođenja, citotoksično jedinjenje predmetnog pronalaska je odabrano od sledećih formula:
2
�
�
�
�
�
�
�
ili
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu:
R100je -OH, -OMe ili
M je farmaceutski prihvatljiv katjon (npr. H<+>, Na<+>or K<+>);
Z<s>je -H, -SR<d>, -C(=O)R<d1>ili je odabran od formula (a1)-(a15) opisanih iznad.
[0090] U specifičnijem primeru izvođenja, Z<s>je odabran od formula (a7), (a8), (a9) i (a15). U još specifičnijem primeru izvođenja, Z<s>je predstavljen formulom (a9). Alternativno, Z<s>je predstavljen formulom (a7).
[0091] U drugom specifičnom primeru izvođenja, Z<s>je -H.
[0092] U drugom specifičnom primeru izvođenja, Y je -SO3M. Alternativno, Y je -OH.
[0093] U predmetni pronalazak takođe su uključeni metaboliti bilo kog citotoksičnog jedinjenja ili konjugata agensa koji se vezuje za ćeliju-citotoksičnog agensa koji su opisani ovde.
SINTEZA CITOTOKSIČNIH JEDINJENJA
[0094] Citotoksična jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se pripremiti u skladu sa postupcima opisanim u S.A.D. patentu br. 8,765,740 i S.A.D. prijavnoj publikaciji br.
2012/0238731.
[0095] Reprezentativni postupci za pripremanje citotoksičnih dimernih jedinjenja predmetnog pronalaska prikazani su u Primerima 1-10.
AGENSI KOJI SE VEZUJU ZA ĆELIJU
[0096] Efikasnost konjugata pronalaska kao terapijskih agenasa zavisi od pažljivog izbora odgovarajućeg agensa koji se vezuje za ćeliju. Agensi koji se vezuju za ćeliju mogu biti bilo koje vrste trenutno poznate, ili one koja postaje poznata, uključujući peptide i ne-peptide. Uopšteno, oni mogu biti antitela (kao što su poliklonalna antitela i monoklonalna antitela, posebno monoklonalna antitela), limfokini, hormoni, faktori rasta, vitamini (kao što su folat itd. koji se mogu vezati za svoj receptor na ćelijskoj površini, npr. folatni receptor), molekuli za transport hranljivih materija (kao što je transferin), ili bilo koji drugi molekul ili supstanca koja se vezuje za ćeliju.
[0097] Odabir odgovarajućeg agensa koji se vezuje za ćeliju je pitanje izbora koji delom zavisi od određene populacije ćelija koja će biti ciljana, ali u mnogim (ali ne svim) slučajevima, humana monoklonalna antitela su dobar izbor ukoliko je odgovarajuće dostupno. Na primer, monoklonalno antitelo MY9 je murinsko IgG1antitelo koje se specifično vezuje za CD33 antigen (J.D. Griffin et al., Leukemia Res., 8:521 (1984)), i može se upotrebljavati ukoliko ciljne ćelije eksprimiraju CD33 kao kod bolesti akutne mijelogene leukemije (AML).
[0098] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju nije protein. Na primer, u određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju može biti vitamin koji se vezuje za receptor za vitamin, kao što je receptor na ćelijskoj površini. U tom smislu, vitamin A se vezuje za retinol-vezujući protein (RBP) kako bi napravio kompleks, a kompleks se zauzvrat vezuje za STRA6 receptor sa visokim afinitetom i povećava unos vitamina A. U drugom primeru, folna kiselina/folat/vitamin B9se vezuje za folatni receptor (FR) na ćelijskoj površini, na primer, FRα, sa visokim afinitetom. Folna kiselina ili antitela koja se vezuju za FRα mogu se upotrebljavati za ciljanje folatnog receptora koji se eksprimira na tumoru jajnika i drugim tumorima. Pored toga, vitamin D i njegov analog se vezuju za receptor za vitamin D.
[0099] U drugim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je protein ili polipeptid, ili jedinjenje koje sadrži protein ili polipeptid, uključujući antitelo, protein koji nije antitelo ili polipeptid. Poželjno, protein ili polipeptidi sadrže jedan ili više Lys ostataka sa -NH2 grupom bočnog lanca. -NH2 grupe bočnog lanca Lys mogu biti kovalentno povezane sa bifunkcionalnim umreživačima, koji su zauzvrat povezani sa dimernim jedinjenjima pronalaska, stoga konjugujući agense koji se vezuju za ćeliju sa dimernim jedinjenjima pronalaska. Svaki agens koji se vezuje za ćeliju koji je na bazi proteina može da sadrži višestruke -NH2 grupe bočnog lanca Lys dostupne za povezivanje jedinjenja pronalaska preko bifunkcionalnih umreživača.
[0100] U jednom primeru izvođenja, GM-CSF, ligand/faktor rasta koji se vezuje za mijeloidne ćelije može se upotrebljavati kao agens koji se vezuje za ćeliju za bolesne ćelije iz akutne mijelogene leukemije. IL-2 koji se vezuje za aktivirane T-ćelije može se upotrebljavati za prevenciju odbacivanja transplantiranog grafta, za terapiju i prevenciju bolesti graft protiv domaćina, i za lečenje akutne T-ćelijske leukemije. MSH, koji se vezuje za melanocite, može se upotrebljavati za lečenje melanoma, kao što mogu i antitela usmerena prema melanomima. Epidermalni faktor rasta se može upotrebljavati za ciljanje pločastih kancera, kao što su pluća i glave i vrata. Somatostatin se može upotrebljavati za ciljanje neuroblastoma i drugih tipova tumora. Estrogeni (ili analozi estrogena) mogu se upotrebljavati za ciljanje kancera dojke. Androgen (ili analozi androgena) mogu se upotrebljavati za ciljanje testisa.
[0101] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju može biti limfokin, hormon, faktor rasta, faktor stimulacije kolonija, ili molekul za transport hranljivih materija.
[0102] Ovde su takođe objavljeni agensi koji se vezuju za ćeliju koji su mimetici antitela, kao što je protein sa ankirinskim ponovkom, centirin, ili adnektin/monotelo.
[0103] U drugim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je antitelo, jednolančano antitelo, fragment antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, monoklonalno antitelo, jednolančano monoklonalno antitelo, fragment monoklonalnog antitela (ili "antigen-vezujući deo") koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, himerno antitelo, fragment himernog antitela (ili "antigen-vezujući deo") koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, domen antitelo (npr. sdAb) ili fragment domen antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju.
[0104] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je humanizovano antitelo, humanizovano jednolančano antitelo, ili fragment humanizovanog antitela (ili "antigen-vezujući deo"). U specifičnom primeru izvođenja, humanizovano antitelo je huMy9-6 ili drugo srodno antitelo, koje je opisano u S.A.D. patentima br. 7,342,110 i 7,557,189. U drugom specifičnom primeru izvođenja, humanizovano antitelo je anti-folatni receptor antitelo opisano u S.A.D. privremenim prijavama br. 61/307,797, 61/346,595, i 61/413,172 i S.A.D. prijavi br.13/033,723 (objavljenoj kao US 2012/0009181 A1).
[0105] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je antitelo sa izmenjenom površinom, jednolančano antitelo sa izmenjenom površinom, fragment antitela sa izmenjenom površinom (ili "antigen-vezujući deo"), ili bispecifično antitelo.
[0106] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je minitelo, avitelo, diatelo, tritelo, tetratelo, nanotelo, protelo, domen antitelo, ili unitelo.
[0107] Drugim rečima, primerni agens koji se vezuje za ćeliju može da uključuje antitelo, jednolančano antitelo, fragment antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, monoklonalno antitelo, jednolančano monoklonalno antitelo, fragment monoklonalnog antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, himerno antitelo, fragment himernog antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, bispecifično antitelo, domen antitelo, fragment domen antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, interferon (npr. α, β, γ), limfokin (npr. IL-2, IL-3, IL-4, i IL-6), hormon (npr. insulin, tireotropin oslobađajući hormon (TRH), hormon koji stimuliše melanocite (MSH), i steroidni hormon (npr. androgen i estrogen)), vitamin (npr. folat), faktor rasta (npr. EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF), faktor stimulacije kolonija, molekul za transport hranljivih materija (npr. transferin; videti O'Keefe et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:932-937), centirin (proteinska skela zasnovana na konsenzus sekvenci ponovaka fibronektina tipa III (FN3); videti S.A.D. patentne publikacije 2010/0255056, 2010/0216708 i 2011/0274623), protein sa ankirinskim ponovkom (npr. dizajnirani protein sa ankirinskim ponovkom, poznat kao DARPin; videti S.A.D. patentne publikacije br.
2004/0132028, 2009/0082274, 2011/0118146, i 2011/0224100, i takođe videti C. Zahnd et al., Cancer Res. (2010) 70:1595-1605; Zahnd et al., J. Biol. Chem. (2006) 281(46):35167-35175; i Binz, H. K., Amstutz, P. i Pluckthun, A., Nature Biotechnology (2005) 23:1257-1268), protein sa ankirinu-sličnim ponovkom ili sintetički peptid (videti npr. S.A.D. patentnu publikaciju br. 2007/0238667; S.A.D. patent br. 7,101,675; WO 2007/147213; i WO 2007/062466), adnektin (protein skele od domena fibronektina; videti S.A.D. patentne publikacije br.2007/0082365; 2008/0139791), avitelo (uključujući diatela, triatela, i tetratela; videti S.A.D. publikacije br. 2008/0152586 i 2012/0171115), molekule ponovnog ciljanja dvostrukog receptora (DART) (P.A. Moore et al., Blood, 2011; 117(17):4542-4551; Veri MC, et al., Arthritis Rheum, 2010, Mar 30; 62(7):1933-43; Johnson S et al. J Mol Biol, 2010, apr.
9; 399(3):436-49), supernaelektrisane proteine koji prodiru u ćeliju (Methods in Enzymol.
502, 293-319 (2012), i druge molekule ili supstance koje se vezuju za ćeliju.
[0108] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je faktor rasta ili njegov fragment koji se vezuje za receptor faktora rast. Ovde je takođe opisan citokin ili njegov fragment koji se vezuje za receptor citokina. U određenim primerima izvođenja, receptor faktora rasta je receptor na ćelijskoj površini.
[0109] U određenim primerima izvođenja, pri čemu je agens koji se vezuje za ćeliju antitelo ili njegov antigen-vezujući deo (uključujući derivate antitela), ili određeni mimetici antitela, CBA se može vezati za ligand na ciljnoj ćeliji, kao što je ligand na ćelijskoj površini, uključujući receptore na ćelijskoj površini.
[0110] Specifični primerni antigeni ili ligandi mogu uključivati renin; hormon rasta (npr. humani hormon rasta i goveđi hormon rasta); oslobađajući faktor hormona rasta; paratiroidni hormon; tireostimulirajući hormon; lipoprotein; alfa-1-antitripsin; lanac A insulina; lanac B insulina; proinsulin; folikulostimulirajući hormon; kalcitonin; luteinizirajući hormon; glukagon; faktor zgrušavanja (npr. faktor vmc, faktor IX, tkivni faktor i von Vilebrandov (von Willebrands) faktor); faktor protiv zgrušavanja (npr. protein C); atrijalni natriuretički faktor; surfaktant pluća; aktivator plazminogena (npr. urokinaza, humani urin ili aktivator plazminogena tkivnog tipa); bombesin; trombin; hemopoetski faktor rasta; faktor nekroze tumora-alfa i -beta; enkefalinazu; RANTES (tj. normalno T-ćelijski eksprimiran i sekretovan regulisan nakon aktivacije); humani makrofagni inflamatorni protein-1-alfa; albumin seruma (humani albumin seruma); Muellerian-inhibirajuću supstancu; lanac A relaksina; lanac B relaksina; prorelaksin; mišji peptid povezan sa gonadotropinom; mikrobijalni protein (betalaktamaza); DNazu; IgE; antigen povezan sa citotoksičnim T-limfocitima (npr. CTLA-4); inhibin; aktivin; faktor rasta vaskularnog endotela; receptor za hormone ili faktore rasta; protein A ili D; reumatoidni faktor; neurotrofični faktor (npr. neurotrofični faktor izveden iz kosti, neurotrofin-3, -4, -5, ili -6), faktor rasta nerva (npr. NGF-β); faktor rasta izveden iz krvnih pločica; faktor rasta fibroblasta (npr. aFGF i bFGF); receptor 2 za faktor rasta fibroblasta; epidermalni faktor rasta; transformirajući faktor rasta (npr. TGF-alfa, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, i TGF-β5); insulinu-sličan faktor rasta-I i -II; des(1-3)-IGF-I (IGF-I mozga); vezujući protein za insulinu-sličan faktor rasta; melanotransferin; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; EphA receptor; EphB receptor; folatni receptor; FOLR1; mezotelin; kripto; alfavbeta6; integrine; VEGF; VEGFR; EGFR; transferinski receptor; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; CD proteine (npr. CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD123, CD134, CD137, CD138, i CD152), jedan ili više antigena povezanih sa tumorom ili receptorima na ćelijskoj površini (videti S.A.D. publikaciju br. 2008/0171040 ili S.A.D. publikaciju br. 2008/0305044); eritropoetin; osteoinduktivni faktor; imunotoksin; protein morfogeneze kostiju; interferon (npr. interferonalfa, -beta, i -gama); faktor stimulacije kolonija (npr. M-CSF, GM-CSF, i G-CSF); interleukine (npr. IL-1 do IL-10); superoksid dismutazu; T-ćelijski receptor; protein površine membrane; faktor ubrzavanja propadanja; virusne antigene (npr. deo HIV omotača); transportni protein, receptor za navođenje; adresin; regulatorni protein; integrin (npr. CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4, i VCAM); antigen povezan sa tumorom (npr. HER2, HER3 i HER4 receptor); endoglin; c-Met; c-kit; 1GF1R; PSGR; NGEP; PSMA; PSCA; TMEFF2; LGR5; B7H4; i fragmente bilo kog od polipeptida nabrojanih iznad.
[0111] Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitelo" uključuje molekule imunoglobulina (Ig). U određenim primerima izvođenja, antitelo je antitelo pune dužine koje sadrži četiri polipeptidna lanca, naime dva teška lanca (HC) i dva laka lanca (LC) međusobno spojena disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2, i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca, koji se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se mogu dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR). Isprekidani takvim regionima su konzerviraniji regioni okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od aminoterminusa do karboksi-terminusa sledećem redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.
4
[0112] U određenim primerima izvođenja, antitelo je IgG, IgA, IgE, IgD, ili IgM. U određenim primerima izvođenja, antitelo je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4; ili IgA1 ili IgA2.
[0113] U određenim primerima izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je "antigen-vezujući deo" monoklonalnog antitela, koji deli sekvence kritične za vezivanje antigena sa antitelom (kao što je huMy9-6 ili njegova srodna antitela opisana u S.A.D. pat. br. 7,342,110 i 7,557,189).
[0114] Kao što se ovde upotrebljava, termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili ponekad naizmenično označen kao "fragmenti antitela"), uključuje jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazano je da antigenvezujuću funkciju antitela mogu obavljati određeni fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih unutar termina "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (bez ograničenja): (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena (npr. antitelo degradovano papainom daje tri fragmenta: dva antigen-vezujuća Fab fragmenta, i jedan Fc fragment koji se ne vezuje za antigen); (ii) F(ab ́)2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba (npr. antitelo degradovano pepsinom daje dva fragmenta: bivalentni antigen-vezujući F(ab ́)2fragment, i pFc ́ fragment koji se ne vezuje za antigen) i njemu srodnu F(ab') monovalentnu jedinicu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena (tj. onog dela teškog lanca koji je uključen u Fab); (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne grane antitela, i srodni Fv povezan disulfidom; (v) dAb (domen antitelo) ili sdAb (antitelo sa jednim domenom) fragment (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), koji se sastoji se od VH domena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). U određenim primerima izvođenja, antigen-vezujući deo je sdAb (antitelo sa jednim domenom).
[0115] U određenim primerima izvođenja, antigen-vezujući deo takođe uključuje određene projektovane ili rekombinantne derivate (ili "derivate antitela") koji takođe uključuju jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen, pored elemenata ili sekvenci koji se ne mogu pronaći u antitelima koja postoje u prirodi.
[0116] Na primer, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni se mogu spojiti, upotrebom standardnih rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni sparuju kako bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti, npr. Bird et al. Science 242:423-426, 1988: i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988).
[0117] U svim ovde opisanim primerima izvođenja, N-terminus scFv može biti VH domen (tj. N-VH-VL-C), ili VL domen (tj. N-VL-VH-C).
[0118] Divalentni (ili bivalentni) jednolančani varijabilni fragmenti (di-scFv, bi-scFv) mogu biti projektovani povezivanjem dva scFv. Ovo stvara jedan peptidni lanac sa dva VH i dva VL regiona, dajući tandem scFv (tascFv). Više tandem ponovaka, kao što je tri-scFv, mogu se na sličan način proizvesti povezivanjem tri ili više scFv na glava-za-rep način.
[0119] U određenim primerima izvođenja, scFv se mogu povezati preko linker peptida koji su prekratki (oko pet amino-kiselina) da se dva varijabilna regiona saviju zajedno, prisiljavajući scFv da dimerizuju, i formiraju diatela (videti, npr. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Diatela mogu biti bispecifična ili monospecifična. Pokazano je da diatela imaju konstante disocijacije do 40 puta niže od odgovarajućih scFv, tj. imaju mnogo viši afinitet prema cilju.
[0120] Još kraći linkeri (jedna ili dve amino-kiseline) dovode do stvaranja trimera, ili takozvanih triatela ili tritela. Tetratela su takođe proizvedena na sličan način. Ona pokazuju još viši afinitet prema svojim ciljevima od diatela. Diatela, triatela, i tetratela se ponekad kolektivno nazivaju "AVIBODY™" agensi koji se vezuju za ćeliju (ili ukratko "AVITELA"). To jest, AVITELO koje ima dva, tri ili četiri regiona za vezivanje cilja (TBR) uobičajeno su poznata kao Dia-, Tria- i Tetratela. Videti, na primer, S.A.D. publikacije br. 2008/0152586 i 2012/0171115 za detalje.
[0121] Svi ovi formati mogu biti sastavljeni od varijabilnih fragmenata sa specifičnošću za dva ili više različita antigena, u tom slučaju oni su vrste bi- ili multi-specifičnih antitela. Na primer, određeni bispecifični tandem di-scFv poznati su kao bi-specifični pokretači T-ćelije (BiTE).
[0122] U određenim primerima izvođanja, svaki scFv u tandem scFv ili diatelu/triatelu/ tetratelu može imati istu ili različitu specifičnost vezivanja, i svaki može nezavisno imati N-terminalni VH ili N-terminalni VL.
[0123] Jednolančani Fv (scFv) takođe se može fuzionisati sa Fc delom, kao što je Fc deo humanog IgG kako bi se dobila svojstva slična IgG, ali ipak ih još uvek kodira jedan gen. Kako prolazna proizvodnja ovakvih scFv-Fc proteina kod sisara može lako postići količine od miligrama, ovaj derivatni oblik antitela je posebno pogodan za mnoge istraživačke primene.
[0124] Fcab su fragmenti antitela projektovani iz Fc konstantnog regiona antitela. Fcab mogu biti eksprimirani kao solubilni proteini, ili mogu biti projektovani nazad u antitelo pune dužine, kao što je IgG, kako bi se stvorio mAb2. mAb2 je antitelo pune dužine sa Fcab umesto normalnog Fc regiona. Sa ovim dodatnim vezujućim mestima, mAb2 bispecifična monoklonalna antitela mogu istovremeno da se vezuju za dva različita cilja.
[0125] U određenim primerima izvođenja, projektovani derivati antitela imaju redukovanu veličinu antigen-vezujućih rekombinantnih proteina izvedenih iz Ig ("minijaturizovana" mAb pune veličine), proizvedenu uklanjanjem domena za koje se smatra da nisu bitni za funkciju. Jedan od najboljih primera su SMIP-ovi.
[0126] Mali modularni imunofarmaceutik, ili SMIP (Small modular immunopharmaceutical), je veštački protein koji je u velikoj meri izgrađen od delova antitela (imunoglobulini), i namenjen je za upotrebu kao farmaceutski lek. SMIP-ovi imaju sličan biološki poluživot kao antitela, ali su manji od antitela i stoga mogu imati bolja svojstva prodiranja u tkivo. SMIP-ovi su jednolančani proteini koji sadrže jedan vezujući region, jedan region zgloba kao konektor, i jedan efektorski domen. Vezujući region sadrži modifikovani jednolančani varijabilni fragment (scFv), i ostatak proteina se može konstruisati iz Fc (kao što je CH2, i CH3 kao efektorski domen) i regiona zgloba antitela, kao što je IgG1. Genetički modifikovane ćelije proizvode SMIP-ove kao dimere slične antitelu koji su oko 30% manji od stvarnih antitela.
[0127] Drugi primer takvog projektovanog minijaturizovanog antitela je "unitelo", u kome je uklonjen region zgloba iz IgG4 molekula. IgG4 molekuli su nestabilni i mogu da razmenjuju heterodimere lakog-teškog lanca jedan sa drugim. Delecija regiona zgloba u potpunosti sprečava sparivanje teškog lanca sa teškim lancem, ostavljajući visoko specifične monovalentne lake/teške heterodimere, pri tome zadržavajući Fc region kako bi se osigurala stabilnost i poluživot in vivo.
[0128] Antitelo sa jednim domenom (sdAb), uključujući, ali ne ograničavajući se na ona koje Ablynx naziva nanotelo) je fragment antitela koji se sastoji od jednog monomernog varijabilnog domena antitela. Kao i celo antitelo, i ono se može selektivno vezivati za specifični antigen, ali je mnogo manje zbog svoje molekulske mase od samo 12-15 kDa. U određenim primerima izvođenja, antitelo sa jednim domenom je projektovano iz antitela teškog lanca (hcIgG). Prvo takvo sdAb je projektovano na osnovu hcIgG koji se nalazi u kamelidama, koji se nazivaju VHH fragmenti. U određenim primerima izvođenja, antitelo sa jednim domenom je projektovano iz IgNAR ("novi antigen receptor imunoglobulin", videti ispod) upotrebom VNARfragmenta. Hrskavičave ribe (kao što je ajkula) imaju takva IgNAR antitela teškog lanca. U određenim primerima izvođenja, sdAb je projektovano razdvajanjem dimernih varijabilnih domena iz uobičajenog imunoglobulina G (IgG), kao što su oni od ljudi ili miševa, u monomere. U određenim primerima izvođenja, nanotelo je izvedeno iz
4
varijabilnog domena teškog lanca. U određenim primerima izvođenja, nanotelo je izvedeno iz varijabilnog domena lakog lanca. U određenim primerima izvođenja, sdAb je dobijeno pregledom biblioteka sekvenci teških lanaca sa jednim domenom (npr. humani HC sa jednim domenom) za bajndere za ciljni antigen.
[0129] Fragmenti antitela sa jednim varijabilnim domenom novog antigen receptora (VNAR, ili VNAR domeni) izvedeni su iz antitela novog antigen receptor imunoglobulina (IgNAR) hrskavičave ribe (npr. ajkule). Pošto su jedni od najmanjih poznatih proteinskih skela zasnovanih na imunoglobulinu, takvi proteini sa jednim domenom pokazuju povoljnu veličinu i svojstva prepoznavanja kriptičnog epitopa. Zrela IgNAR antitela se sastoje od homodimera jednog varijabilnog novog antigen receptor (VNAR) domena i pet konstantnih novih antigen receptor (CNAR) domena. Ovaj molekul je veoma stabilan, i poseduje efikasne karakteristike vezivanja. Njegova inherentna stabilnost verovatno se može pripisati i (i) osnovnoj Ig skeli, koja prezentuje značajan broj naelektrisanih i hidrofilnih ostataka izloženih na površini u poređenju s konvencionalnim VH i VL domenima antitela koji se nalaze u antitelima murina; i (ii) stabilizovanju strukturnih karakteristika u petljama regiona koji određuju komplementarnost (CDR) uključujući disulfidne mostove između petlji, i obrasce vodoničnih veza unutar petlje.
[0130] Minitelo je projektovan fragment antitela koji sadrži scFv povezan sa CH domenom, kao što je CH3γl (CH3 domen IgG1) ili CH4ε (CH4 domen IgE). Na primer, scFv specifičan za karcinoembrionski antigen (CEA) je povezan sa CH3γil kako bi se stvorilo minitelo, za koje je prethodno pokazano da poseduje odlično ciljno delovanje na tumor u kombinaciji sa brzim klirensom in vivo (Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996). ScFv može imati N-terminalni VH ili VL. Veza može biti kratak peptid (npr. linker sa dve amino-kiseline, kao što je ValGlu) što rezultira u nekovalentnom minitelu bez zgloba. Alternativno, veza može biti IgG1 zglob i GlySer linker peptid koji proizvodi kovalentno minitelo sa zglobom.
[0131] Prirodna antitela su monospecifična, ali bivalentna, po tome što eksprimiraju dva identična antigen-vezujuća domena. Suprotno tome, u određenim primerima izvođenja, određeni projektovani derivati antitela su bi- ili multistruko-specifični molekuli koji poseduju dva ili više različitih antigen-vezujućih domena, svaki sa različitom ciljnom specifičnošću. Bispecifična antitela se mogu stvoriti fuzijom dve ćelije koje proizvode antitela, svako sa osobitom specifičnošću. Ovi "kvadromi" su proizveli višestruke molekularne vrste, pošto su dva osobita laka lanca i dva osobita teška lanca bila slobodna da se rekombinuju u kvadromima u više konfiguracija. Od tada su bispecifični Fab, scFv i mAb pune veličine generisani upotrebom različitih tehnologija (videti iznad).
[0132] Protein imunoglobulina sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig) je vrsta dvostruko-specifičnog IgG koji istovremeno cilja dva antigena/epitopa (DiGiammarino et al., Methods Mol Biol. 899:145-56, 2012). Molekul sadrži Fc region i konstantni regioni su u konfiguraciji sličnoj konvencionalnom IgG. Međutim, protein DVD-Ig je jedinstven u tome što svaka grana molekula sadrži dva varijabilna domena (VD). VD unutar grane povezani su u tandemu i mogu da poseduju različite specifičnosti vezivanja.
[0133] Molekuli trispecifičnih derivata antitela mogu se takođe stvoriti, na primer, ekspresijom bispecifičnih antitela sa dva različita Fab i Fc. Jedan primer je mišji IgG2a anti-Ep-CAM, pacovski IgG2b anti-CD3 kvadrom, nazvan BiUII, za koji se misli da dozvoljava kolokalizaciju tumorskih ćelija koje eksprimiraju Ep-CAM, T-ćelija koje eksprimiraju CD3, i makrofaga koji eksprimiraju FCγRI, čime potenciraju kostimulatorne i antitumorske funkcije imunskih ćelija.
[0134] Protela su potpuno rekombinantna, maskirana monoklonalna antitela koja ostaju inertna u zdravom tkivu, ali su aktivirana specifično u bolesnom mikrookruženju (npr. isecanjem proteazom od strane mikrookruženja koje je obogaćeno proteazom ili specifično za bolest). Videti Desnoyers et al., Sci Transl Med 5:207ra144, 2013. Slične tehnike maskiranja mogu se upotrebljavati za bilo koje od ovde opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih delova.
[0135] Intratelo je antitelo koje je modifikovano za unutarćelijsku lokalizaciju, da radi unutar ćelije da se vezuje za unutarćelijski antigen. Intratelo može ostati u citoplazmi, ili može imati signal za nukleusnu lokalizaciju, ili može imati KDEL sekvencu za ciljno delovanje na ER. Intratelo može biti jednolančano antitelo (scFv), modifikovani VL domeni sa hiperstabilnošću imunoglobulina, izabrano antitelo otporno na jače redukujuće unutarćelijsko okruženje, ili eksprimirano kao fuzioni protein sa proteinom koji se vezuje za maltozu ili drugi stabilni unutarćelijski proteini. Takve optimizacije su poboljšale stabilnost i strukturu intratela, i mogu imati opštu primenljivost na bilo koje od ovde opisanih antitela ili njihovih antigenvezujućih delova.
[0136] Antigen-vezujući delovi ili derivati antitela pronalaska mogu imati suštinski iste ili identične (1) regione lakog lanca i/ili CDR3 teškog lanca; (2) regione lakog lanca i/ili CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca; ili (3) regione lakog lanca i/ili teškog lanca, u poređenju sa antitelom iz kog su izvedeni/projektovani. Sekvence unutar ovih regiona mogu sadržati konzervativne supstitucije amino-kiselina, uključujući supstitucije unutar CDR regiona. U određenim primerima izvođenja, nema više od 1, 2, 3, 4, ili 5 konzervativnih supstitucija. Alternativno, antigen-vezujući delovi ili derivati antitela imaju region lakog lanca i/ili region
4
teškog lanca koji je najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičan antitelu iz koga su izvedeni/projektovani. Ovi antigen-vezujući delovi ili derivati antitela mogu imati suštinski istu specifičnost vezivanja i/ili afinitet za ciljni antigen u poređenju sa antitelom. U određenim primerima izvođenja, Kdi/ili Koffvrednosti antigen-vezujućih delova ili derivata antitela su unutar 10 puta (ili viša ili niža), 5 puta (ili viša ili niža), 3 puta (ili viša ili niža), ili 2 puta (ili viša ili niža) od ovde opisanog antitela.
[0137] U određenim primerima izvođenja, antigen-vezujući delovi ili derivati antitela mogu se izvesti/projektovati iz potpuno humanih antitela, humanizovanih antitela, ili himernih antitela, i mogu se proizvesti u skladu sa bilo kojim postupcima priznatim u struci.
[0138] Tehnike monoklonalnih antitela omogućavaju proizvodnju ekstremno specifičnih agenasa koji se vezuju za ćeliju u obliku specifičnih monoklonalnih antitela. U struci su posebno dobro poznate tehnike za kreiranje monoklonalnih antitela proizvedenih imunizacijom miševa, pacova, hrčaka ili bilo kog drugog sisara antigenom od interesa, kao što je intaktna ciljna ćelija, antigeni izolovani iz ciljne ćelije, celokupan virus, atenuirani celokupni virus, i virusni proteini kao što su proteini virusnog omotača. Takođe se mogu upotrebljavati i sensitizovane humane ćelije. Drugi postupak kreiranja monoklonalnih antitela je upotreba biblioteka faga scFv (jednolančani varijabilni region), specifično humanog scFv (videti npr. Griffiths et al., S.A.D. patenti br. 5,885,793 i 5,969,108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587). Pored toga, antitela sa izmenjenom površinom objavljena u S.A.D. patentu br. 5,639,641 takođe se mogu upotrebljavati, kao što mogu i himerna antitela i humanizovana antitela.
[0139] Agens koji se vezuje za ćeliju mogu takođe biti peptidi koji su izvedeni iz displej faga (videti, na primer, Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108(17), 6909-6914) ili tehnika biblioteka peptida (videti, na primer, Dane et al., Mol. Cancer. Ther. (2009) 8(5):1312-1318).
[0140] U određenim primerima izvođenja, CBA pronalaska takođe uključuje mimetik antitela, kao što je DARPin, afitelo, afilin, afitin, antikalin, avimer, finomer, peptid sa Kunitz domenom, monotelo, ili nanofitin.
[0141] Kao što se ovde upotrebljava, termini "DARPin" i "(dizajnirani) protein sa ankinrinskim ponovkom" upotrebljavaju se naizmenično da označe određene genetički projektovane proteine mimetike antitela koji tipično pokazuju preferencijalno (ponekad specifično) vezivanje za cilj. Cilj može biti protein, ugljeni hidrat, ili drugi hemijski entiteti, i afinitet vezivanja može biti prilično visok. DARPin-i mogu biti izvedeni iz prirodnih proteina koji sadrže ankirinski ponovak, i poželjno se sastoje od najmanje tri, obično četiri ili pet
4
motiva ankirinskih ponovaka (tipično oko 33 ostatka u svakom motiva ankinrinskog ponovka) ovih proteina. U određenim primerima izvođenja, DARPin sadrži oko četiri ili pet ponovaka, i može imati molekulsku masu od oko 14 ili 18 kDa, respektivno. Na DNK nivou mogu se stvoriti biblioteke DARPin-a sa nasumičnim ostacima potencijalnih ciljnih interakcija sa raznolikostima od preko 10<12>varijanti, za upotrebu u odabiru DARPin-a koji se vezuju za željene ciljeve (npr. delujući kao agonisti ili antagonisti receptora, inverzni agonisti, inhibitori enzima, ili jednostavni bajnderi koji se vezuju za ciljni protein) sa pikomolarnim afinitetom i specifičnošću, upotrebljavajući različite tehnologije kao što su displej ribozoma ili displeja fag parikula za prepoznavanje signala (SRP). Videti, na primer, S.A.D. patentne publikacije br. 2004/0132028, 2009/0082274, 2011/0118146, i 2011/0224100, WO 02/20565 i WO 06/083275 za pripremu DARPin, i takođe videti C. Zahnd et al. (2010) Cancer Res., 70:1595-1605; Zahnd et al. (2006) J. Biol. Chem., 281 (46):35167-35175; i Binz, H. K., Amstutz, P. i Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23:1257-1268. Takođe videti S.A.D. patentnu publikaciju br. 2007/0238667; S.A.D. patent br. 7,101,675; WO 2007/147213; i WO 2007/062466, za srodni protein ili sintetički peptid sa ankirinu-sličnim ponovcima.
[0142] Molekuli afitela su mali proteini projektovani da se vezuju za veliki broj ciljnih proteina ili peptida sa visokim afinitetom, stoga imitirajući monoklonalna antitela. Afitelo se sastoji od tri alfa heliksa sa 58 amino-kiselina i ima molekulsku masu od oko 6 kDa. Pokazano je da podnose visoke temperature (90 °C) ili kisele i alkalne uslove (pH 2,5 ili pH 11), i bajnderi sa afinitetom smanjenim na sub-nanomolarni opseg su dobijeni od odabranih naivnih biblioteka, i bajnderi sa pikomolarnim afinitetom su dobijeni posle sazrevanja afiniteta. U određenim primerima izvođenja, afitela su konjugovana sa slabim elektrofilima radi kovalentnog vezivanja za ciljeve.
[0143] Monotela (takođe poznata i kao adnektini) su genetički projektovani proteini mimetici antitela koji su sposobni da se vezuju za antigene. U određenim primerima izvođenja, monotela se sastoje od 94 amino-kiseline i imaju molekulsku masu od oko 10 kDa. Ona se zasnivaju na strukturi humanog fibronektina, preciznije na njegovom desetom domenu vanćelijskog tipa III, koji ima strukturu sličnu varijabilnim domenima antitela, sa sedam beta ploča koje čine burence i tri izložene petlje sa svake strane koje odgovaraju trima regionima koji određuju komplementarnost. Monotela sa specifičnošću za različite proteine mogu se skrojiti modifikovanjem petlje BC (između druge i treće beta ploče) i FG (između šeste i sedme ploče).
[0144] Tritelo je mimetik antitelo koje se samo-asemblira dizajnirano na osnovu zavijenog zavojnog C-terminalnog regiona mišjeg i humanog proteina matriksa hrskavice (CMP), koji
4
se samo-asemblira u paralelni trimerni kompleks. Ono je vrlo stabilni trimerni ligand koji ciljno deluje kreiran fuzionisanjem specifičnog cilj-vezujućeg dela sa domenom trimerizacije izvedenim iz CMP. Rezultirajući fuzioni proteini mogu se efikasno samo-asemblirati u dobro definisan paralelni homotrimer visoke stabilnosti. Analiza rezonancije površinskog plazmonq (SPR) trimernih liganda koji ciljno deluju pokazuje značajno povećanu jačinu vezivanja za cilj u poređenju sa odgovarajućim monomerima. Studije ćelijskog vezivanja potvrdile su da takva tritela imaju superiornu snagu vezivanja prema svojim respektivnim receptorima.
[0145] Centirin je još jedno mimetik antitelo koji se može dobiti upotrebom biblioteke izgrađene na regionu okvira sekvence konsenzus FN3 domena (Diem et al., Protein Eng Des Sel., 2014). Ova biblioteka koristi diverzifikovane pozicije unutar C-lanca, CD-petlje, F-lanca i FG-petlje FN3 domena, i varijante centirina sa visokim afinitetom mogu se odabrati prema specifičnim ciljevima.
[0146] U jednom primeru izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je anti-folatni receptor antitelo. Preciznije, anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1 (takođe poznat kao folatni receptor alfa (FR-α)). Termini "humani folatni receptor 1", "FOLR1" ili " folatni receptor alfa (FR-α)", kao što se ovde upotrebljavaju, označavaju bilo koji nativni humani FOLR1, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Stoga, svi ovi termini mogu označavati bilo protein ili sekvencu nukleinske kiseline kao što je ovde naznačeno. Termin "FOLR1" obuhvata neobrađeni FOLR1 "pune dužine", kao i bilo koji oblik FOLR1 koji rezultuje obradom unutar ćelije. FOLR1 antitelo sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GYFMN (SEQ ID NO: 1); CDR2 teškog lanca koji sadrži RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO: 2); i CDR3 teškog lanca koji sadrži YDGSRAMDY (SEQ ID NO: 3); i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 lakog lanca koji sadrži RASNLEA (SEQ ID NO: 5); i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQSREYPYT (SEQ ID NO: 6); pri čemu je Xaa1odabran od K, Q, H, i R; Xaa2je odabran od Q, H, N, i R; i Xaa3je odabran od G, E, T, S, A, i V. Poželjno, sekvenca CDR2 teškog lanca sadrži RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7).
[0147] U drugom primeru izvođenja, anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1 koji sadrži teški lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu
4
[0148] U drugom primeru izvođenja, anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran plazmidnom DNK deponovanom u ATCC-u 7. aprila, 2010 i ima ATCC depozitni br. PTA-10772 i PTA-10773 ili 10774.
[0149] U drugom primeru izvođenja, anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1 koji sadrži laki lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu
[0150] U drugom primeru izvođenja anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1 koji sadrži teški lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, i laki lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10. Poželjno, antitelo sadrži teški
4
lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 i laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 (hu FOLR1).
[0151] U drugom primeru izvođenja, anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment kodiran plazmidom DNK deponovanom u ATCC-u 7. aprila, 2010 i ima ATCC depozitni br. PTA-10772 i PTA-10773 ili 10774.
[0152] U drugom primeru izvođenja, anti-folatni receptor antitelo je humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani folatni receptor 1, i sadrži varijabilni domen teškog lanca najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičan sa QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS (SEQ ID NO: 11), i varijabilni domen lakog lanca najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičan sa
ili
[0153] U drugom primeru izvođenja, anti-folatni receptor antitelo je huMov19 ili M9346A (videti, na primer, S.A.D. patent 8,709,432, S.A.D. patent br.8,557,966, i WO2011106528).
[0154] U drugom primeru izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je anti-EGFR antitelo ili njegov fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je neantagonističko antitelo, uključujući, na primer, antitela opisana u WO2012058592. U drugom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je nefunkcionalno antitelo, na primer, humanizovano ML66 ili EGFR-8. Preciznije, anti-EGFR antitelo je huML66.
[0155] U još jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. Kao što se ovde upotrebljava, sekvence podvučene dvostrukom linijom predstavljaju varijabilne regione (tj. varijabilni region teškog lanca ili HCVR, i varijabilni region lakog lanca ili LCVR) sekvenci teškog ili lakog lanca, dok podebljane sekvence predstavljaju CDR regione (tj. od N-terminalnih do C-terminalnih, CDR1, CDR2, i CDR3, respektivno, sekvenci teškog lanca ili lakog lanca).
[0156] U još jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 14, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 15, i poželjno specifično se vezuje za EGFR.
[0157] U još jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 14, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 15, i poželjno specifično se vezuje za EGFR.
[0158] U drugom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo su antitela opisana u 8,790,649 i WO 2012/058588. U jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je huEGFR-7R antitelo.
[0159] U jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu QVQLVQSGAEVAKPGASVKLSCK ASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLECIGTIYPGDGDTTYTQKFQGKATLTADKSSST AYMQLSSLRSEDSAVYYCARYDAPGYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:16) i region lakog lanca
1
imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDINNYLAWYQHKPGKGPKLLIHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPED IATYYCLQYDNLLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:17), ili region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu
[0160] U drugom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:16 i region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:17.
[0161] U drugom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:16 i region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO:18.
[0162] U još jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 16, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 17 ili 18, i poželjno specifično se vezuje za EGFR.
[0163] U još jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 16, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 17 ili 18, i poželjno specifično se vezuje za EGFR.
[0164] U drugom primeru izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je anti-CD 19 antitelo, kao što su ona opisana u S.A.D. patentu br. 8,435,528 i WO2004/103272. U jednom primeru izvođenja, anti-CD 19 antitelo sadrži region teškog lanca imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEID PSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYY YAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT
2
VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:19) i region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu
[0165] U drugom primeru izvođenja, anti-CD19 antitelo je huB4 antitelo.
[0166] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD19 antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 19, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 20, i poželjno specifično se vezuje za CD19.
[0167] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD19 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 19, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 20, i poželjno specifično se vezuje za CD19.
[0168] U još jednom primeru izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je anti-Muc1 antitelo, kao što su ona opisana u S.A.D. patentu br.7,834,155, WO 2005/009369 i WO 2007/024222. U jednom primeru izvođenja, anti-Muc1 antitelo sadrži region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIY PGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFA YWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:21) i region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu
[0169] U drugom primeru izvođenja, anti-Muc1 antitelo je huDS6 antitelo.
[0170] U još jednom primeru izvođenja, anti-Muc1 antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 21, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 22, i poželjno specifično se vezuje za Muc1.
[0171] U još jednom primeru izvođenja, anti-Muc1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 21, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 22, i poželjno specifično se vezuje za Muc1.
[0172] U drugom primeru izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je anti-CD33 antitelo ili njegov fragment, kao što su antitela ili njihovi fragmenti opisani u S.A.D. patentima br.
7,557,189, 7,342,110, 8,119,787 i 8,337,855 i WO2004/043344. U drugom primeru izvođenja, anti-CD33 antitelo je huMy9-6 antitelo.
[0173] U jednom primeru izvođenja, anti-CD33 antitelo sadrži region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYP GNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYF DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:23), i region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu
4
[0174] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD33 antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 23, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 24, i poželjno specifično se vezuje za CD33.
[0175] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD33 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 23, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 24, i poželjno specifično se vezuje za CD33.
[0176] U drugom primeru izvođenja, agens koji se vezuje za ćeliju je anti-CD37 antitelo ili njegov fragment, kao što su ona opisana u S.A.D. patentu br. 8,765,917 i WO 2011/112978. U jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo je huCD37-3 antitelo.
[0177] U jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu DIQMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYQQKPGKSPKLLVNVATNL ADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQPEDFGTYYCQHYWGTTWTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:25) i region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWG DGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:26), ili region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu
[0178] U drugom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 25 i region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 26.
[0179] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 25 i region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 27.
[0180] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 26 ili 27, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanac SEQ ID NO: 25, i poželjno specifično se vezuje za CD37.
[0181] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 26 ili 27, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 25, i poželjno specifično se vezuje za CD37.
[0182] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži region lakog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu EIVLTQSPATMSASPGERVTMTCSATSSVTYMHWYQQKPGQSPKRWIYDTSNL PYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSDNPPTFGQGTKLEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:28) i region teškog lanca imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu
[0183] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži CDR1-CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 29, i/ili CDR1-CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 28, i poželjno specifično se vezuje za CD37.
[0184] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 29, i/ili sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) najmanje oko 90%, 95%, 97%, 99%, ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 28, i poželjno specifično se vezuje za CD37.
[0185] U još jednom primeru izvođenja, anti-CD37 antitelo je huCD37-50 antitelo.
AGENS KOJI SE VEZUJE ZA ĆELIJU-LEK KONJUGATI
[0186] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje konjugate agens koji se vezuje za ćeliju-lek koji sadrže agens koji se vezuje za ćeliju povezan sa jednim ili više citotoksičnih jedinjenja predmetnog pronalaska putem različitih linkera kao što je definisano u patentnom zahtevu 9.
[0187] U određenim primerima izvođenja, Rai Rbsu oba H; Cy za formulu (B2') je cikloheksan; i R5je H ili Me; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad u drugom aspektu. Preciznije, m' u formuli (B2') može biti 0 ili 1.
[0188] U određenim primerima izvođenja, Rai Rbsu oba -H i R5je H ili Me; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0189] U određenim primerima izvođenja, -(CRaRb)m- je -(CH2)m"-C(Me2)- i m" je ceo broj od 1 do 5; preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0190] U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I'), P je peptid koji sadrži 2 do 10 amino-kiselinskih ostataka; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0191] U određenim primerima izvođenja, P je peptid koji sadrži 2 do 5 amino-kiselinskih ostataka; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0192] U određenim primerima izvođenja, P je odabran od Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N<9>-tozil-Arg, Phe-N<9>-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu i Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0193] U određenim primerima izvođenja, P je Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, i D-Ala-D-Ala; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0194] U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I'), dvostruka linija između N i C predstavlja dvostruku vezu; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0195] U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I'), R5je -H ili (C1-C3)alkil; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0196] U specifičnom primeru izvođenja, za strukturnu formulu (I'), dvostruka linija između N i C predstavlja jednostruku vezu ili dvostruku vezu, pod uslovom da kada je dvostruka veza X je odsutan i Y je -H, i kada je jednostruka veza, X je -H, Y je -OH ili -SO3M;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' i R4' su svi -H;
R6je -OMe;
X' i Y' su oba -H;
A i A' su -O-;
M je H, Na<+>ili K<+>; i preostale promenljive su kao što je opisano iznad.
[0197] U specifičnom primeru izvođenja, konjugat predmetnog pronalaska je predstavljen bilo kojim od sledećih strukturnih formula:
�
�
�
�
�
�
ili
ili
ili njihovom farmaceutski prihvatljivom solju, pri čemu:
r je ceo broj od 1 do 10; i
M je farmaceutski prihvatljiv katjon (npr. H<+>, Na<+>ili K<+>).
Specifičnije, Y je -SO3M. Alternativno Y je -OH.
[0198] U određenim primerima izvođenja, ovde opisani konjugati mogu da sadrže 1-10 citotoksičnih jedinjenja, 2-9 citotoksičnih jedinjenja, 3-8 citotoksičnih jedinjenja, 4-7 citotoksičnih jedinjenja, ili 5-6 citotoksičnih jedinjenja, svako citotoksično jedinjenje sadrži povezujuću grupu koja povezuje citotoksično jedinjenje sa CBA, i svako citotoksično jedinjenje na konjugatu je isto.
[0199] U bilo kom primeru izvođenja konjugata, agens koji se vezuje za ćeliju može se vezati za ciljne ćelije odabrane od ćelija tumora, ćelija inficiranih virusom, ćelija inficiranih mikroorganizmom, ćelija inficiranih parazitom, autoimunskih ćelija, aktiviranih ćelija, mijeloidnih ćelija, aktiviranih T-ćelija, B ćelija, ili melanocita; ćelija koje eksprimiraju CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA, ili Her-2 antigene; Her-3 antigene; ili ćelija koje eksprimiraju receptor faktora rasta insulina, receptor epidermalnog faktora rasta, i folatni receptor.
[0200] U bilo kom primeru izvođenja konjugata, agens koji se vezuje za ćeliju može biti antitelo, jednolančano antitelo, fragment antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, monoklonalno antitelo, jednolančano monoklonalno antitelo, ili fragment monoklonalnog antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, himerno antitelo, fragment himernog antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, domen antitelo, fragment domen antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, limfokin, hormon, vitamin, faktor rasta, faktor stimulacije kolonija, ili molekul za transport hranljivih materija.
[0201] Antitelo može biti antitelo sa izmenjenom površinom, jednolančano antitelo sa izmenjenom površinom, ili fragment antitela sa izmenjenom površinom.
[0202] Antitelo može biti monoklonalno antitelo, jednolančano monoklonalno antitelo, ili njegov fragment monoklonalnog antitela.
[0203] Antitelo može biti humanizovano antitelo, jednolančano humanizovano antitelo, ili fragment humanizovanog antitela.
[0204] U bilo kom primeru izvođenja konjugata iznad, agens koji se vezuje za ćeliju može biti anti-folatni receptor antitelo ili njegov fragment antitela. Specifičnije, anti-folatni receptor antitelo je huMOV19 antitelo.
[0205] Alternativno, u bilo kom primeru izvođenja konjugata iznad, agens koji se vezuje za ćeliju može biti anti-EGFR antitelo ili njegov fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je neantagonističko antitelo, uključujući, na primer, antitela opisana u WO2012058592. U drugom primeru izvođenja, anti-EGFR antitelo je nefunkcionalno antitelo, na primer, humanizovano ML66. Specifičnije, anti-EGFR antitelo je huML66.
[0206] Pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koji od ovde opisanih konjugata, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0207] Pronalazak pored toga obezbeđuje konjugat koji sadrži bilo koje od predmetnih jedinjenja koja su povezana sa agensom koji se vezuje za ćeliju.
[0208] Pronalazak dodatno obezbeđuje jedinjenje prvog aspekta ili konjugat drugog aspekta za upotrebu u postupku inhibicije abnormalnog ćelijskog rasta ili lečenju proliferativnog poremećaja, autoimunskog poremećaja, destruktivnog poremećaja kosti, infektivne bolesti, virusne bolesti, fibrotične bolesti, neurodegenerativnog poremećaja, pankreatitisa ili bolesti bubrega kod sisara, koji sadrži primenu sisaru terapijski efikasne količine bilo kog od jedinjenja (sa ili bez bilo koje linker grupe) ili konjugata pronalaska i, opciono, drugog hemioterapijskog agensa.
[0209] U određenim primerima izvođenja, drugi hemioterapijski agens se primenjuje sisaru sekvencijalno ili uzastopno.
[0210] U određenim primerima izvođenja, postupak je za lečenje stanja odabranog od kancera, reumatoidnog artritisa, multipla skleroze, bolesti graft protiv domaćina (GVHD), odbacivanja transplanta, lupusa, miozitisa, infekcije, i imunske deficijencije.
[0211] U određenim primerima izvođenja, postupak ili konjugat je za lečenje kancera.
[0212] U određenim primerima izvođenja, kancer je hematološki kancer ili čvrsti tumor. Preciznije, kancer je kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer grlića materice, melanom, kancer pluća (npr. nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC)), kancer dojke, kancer pločastih ćelija glave i vrata, kancer prostate, kancer endometrijuma, limfom (npr. ne-Hočkinov limfom), mijelodisplastični sindrom (MDS), peritonealni kancer, ili leukemija (npr. akutna mijeloidna leukemija (AML), akutna monocitna leukemija, promijelocitna leukemija, eozinofilna leukemija, akutna limfoblastna leukemija (npr. B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL) i hronična mijeloidna leukemija (CML)).
PROIZVODNJA AGENS KOJI SE VEZUJE ZA ĆELIJU-LEK KONJUGATA
[0213] Kako bi se povezala citotoksična jedinjenja ili njihovi derivati predmetnog pronalaska sa agensom koji se vezuje za ćeliju, citotoksično jedinjenje može da sadrži povezujući deo sa reaktivnom grupom koja je vezana za njega, kao jedinjenje 14 (Primer 1), 23 (Primer 2), 35 (Primer 3), 49 (Primer 4), 80 (Primer 5), ili 90 (Primer 6). Ova jedinjenja mogu biti direktno povezana sa agensom koji se vezuje za ćeliju. Reprezentativni postupci za povezivanje citotoksičnih jedinjenja koja imaju reaktivnu grupu koja je vezana za njih sa agensom koji se vezuje za ćeliju kako bi proizveli konjugate agens koji se vezuje za ćeliju-citotiksični agens opisani su u Primerima 11, 13, 15-17 i 20.
[0214] Bifunkcionalni reagens za umrežavanje može prvo da reaguje sa citotoksičnim jedinjenjem da obezbedi jedinjenje koje nosi povezujući deo sa jednom reaktivnom grupom koja je vezana za njega (tj. jedinjenje lek-linker), koje zatim može reagovati sa agensom koji se vezuje za ćeliju. Alternativno, jedan kraj bifunkcionalnog reagensa za umrežavanje može prvo da reaguje sa agensom koji se vezuje za ćeliju da obezbedi agens koji se vezuje za ćeliju koji nosi povezujući deo sa jednom reaktivnom grupom koja je vezana za njega, koji zatim može da reaguje sa citotoksičnim jedinjenjem. Povezujući deo može da sadrži hemijsku vezu koja omogućava oslobađanje citotoksičnog dela na određenom mestu. Pogodne hemijske veze su dobro poznate u struci i uključuju disulfidne veze, tioetarske veze, veze labilne na dejstvo kiseline, fotolabilne veze, veze labilne na dejstvo peptidaze i veze labilne na dejstvo esteraze (videti na primer S.A.D. patente 5,208,020; 5,475,092; 6,441,163; 6,716,821; 6,913,748; 7,276,497; 7,276,499; 7,368,565; 7,388,026 i 7,414,073). Poželjne su disulfidne veze, tioetarske i veze labilne na dejstvo peptidaze. Drugi ovde objavljeni linkeri uključuju linkere koji se ne mogu isecati, kao što su oni detaljno opisani u S.A.D. publikaciji broj 2005/0169933, ili naelektrisane linkere ili hidrofilne linkere i opisani su u US 2009/0274713, US 2010/01293140 i WO 2009/134976.
[0215] Rastvor agensa koji se vezuje za ćeliju (npr. antitelo) u vodenom puferu može se inkubirati sa molarnim viškom bifunkcionalnog agensa za umrežavanje, kao što je Nsukcinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoat (SPP), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)butanoat (SPDB), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoat (sulfo-SPDB) da introdukuje ditiopiridil grupe. Modifikovani agens koji se vezuje za ćeliju (npr. modifikovano antitelo) tada reaguje sa ovde opisanim citotoksičnim jedinjenjem koje sadrži tiol, kao što je jedinjenje 98 ili 99 (Primeri 9 i 10), kako bi se proizveo disulfidno-povezan agens koji se vezuje za ćeliju-citotoksični agens konjugat predmetnog pronalaska.
[0216] U drugom primeru izvođenja, ovde opisano citotoksično jedinjenje koje sadrži tiol, kao što je jedinjenje 98 ili 99 može da reaguje sa bifunkcionalnim agensom za umrežavanje, kao što su N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoat (SPP), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)butanoat (SPDB), N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoat (sulfo-SPDB) da se formira jedinjenje citotoksični agens-linker, koje zatim može reagovati sa agensom koji se vezuje za ćeliju kako bi se proizveo disulfidno-povezani agens koji se vezuje za ćelijucitotoksični agens konjugat predmetnog pronalaska. Jedinjenje citotoksični agens-linker može se pripremiti in situ bez prečišćavanja pre reagovanja sa agensom koji se vezuje za ćeliju. Reprezentativni postupak je opisan u Primerima 12 i 18. Alternativno, jedinjenje citotoksični agens-linker može se prečistiti pre reagovanja sa agensom koji se vezuje za ćeliju.
[0217] Agens koji se vezuje za ćeliju-citotoksični agens konjugat se može prečistiti upotrebom bilo kog postupka prečišćavanja poznatog u struci, kao što su oni opisani u S.A.D. patentu br. 7,811,572 i S.A.D. publikaciji br. 2006/0182750. Na primer, agens koji se vezuje za ćeliju-citotoksični agens konjugat se može prečistiti upotrebom tangencijalne protočne filtracije, adsorptivne hromatografije, adsorptivne filtracije, selektivne precipitacije, neapsorptivne filtracije ili njihovom kombinacijom. Poželjno, tangencijalna protočna filtracija (TFF, poznata i kao filtracija poprečnog protoka, ultrafiltracija i diafiltracija) i/ili smole adsorptivne hromatografije upotrebljavaju se za prečišćavanje konjugata.
[0218] Alternativno, agens koji se vezuje za ćeliju (npr. antitelo) može se inkubirati sa molarnim viškom agensa koji modifikuje antitelo kao što su 2-iminotiolan, L-homocistein tiolakton (ili derivati), ili N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA) da introdukuje sulfhidrilne grupe. Modifikovano antitelo tada reaguje sa odgovarajućim citotoksičnim agensom koji sadrži disulfid, kako bi se proizveo disulfidno-povezan antitelo-citotoksični agens konjugat. Antitelo-citotoksični agens konjugat se zatim može prečistiti postupcima opisanim iznad. Agens koji se vezuje za ćeliju takođe se može projektovati da introdukuje tiolne delove, kao što su antitela cistein-projektovana antitela objavljena u S.A.D. patentima br. 7,772485 i 7,855,275.
[0219] Rastvor agensa koji se vezuje za ćeliju (npr. antitelo) u vodenom puferu može se inkubirati sa molarnim viškom agensa koji modifikuje antitelo, kao što su N-sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat da introdukuje maleimido grupe, ili sa N-sukcinimidil-4-(jodoacetil)-aminobenzoatom (SIAB) da introdukuje jodoacetil grupe. Modifikovani agens koji se vezuje za ćeliju (npr. modifikovano antitelo) tada reaguje sa citotoksičnim agensom koji sadrži tiol kako bi se proizveo tioetarski-povezan agens koji se vezuje za ćeliju-citotoksični agens konjugat. Konjugat se zatim može prečistiti postupcima opisanim iznad.
[0220] Broj citotoksičnih molekula vezanih po molekulu antitela može se odrediti spektrofotometrijski merenjem odnosa apsorbance na 280 nm i 330 nm. Prosečno 1-10 citotoksičnih jedinjenja/molekulu(ima) antitela može se povezati ovde opisanim postupcima. Poželjan prosečan broj povezanih citotoksičnih jedinjenja po molekulu antitela je 2-5, a najpoželjniji je 2,5-4,0.
[0221] Reprezentativni postupci za pripremu agens koji se vezuje za ćeliju-lek konjugata predmetnog pronalaska su opisani u 8,765,740 i S.A.D. prijavnoj publikaciji br.
2012/0238731.
CITOTOKSIČNOST JEDINJENJA I KONJUGATA
[0222] Citotoksična jedinjenja i agens koji se vezuje za ćeliju-lek konjugati pronalaska mogu se proceniti za njihovu sposobnost suzbijanja proliferacije različitih ćelijskih linija kancera in vitro. Na primer, ćelijske linije kao što su ćelijska linija KB humanog cervikalnog karcinoma, ćelijska linija THP-1 humane akutne monocitne leukemije, ćelijska linija HL60 humane promijeloidne leukemije, ćelijska linija HNT-34 humane akutne mijeloidne leukemije, mogu se upotrebljavati za procenu citotoksičnosti ovih jedinjenja i konjugata. Ćelije koje se procenjuju mogu biti izložene jedinjenjima ili konjugatima 1-5 dana i preživele frakcije ćelija mere se u direktnim testovima pomoću poznatih postupaka. IC50vrednosti mogu se zatim izračunati na osnovu rezultata testova. Alternativno ili pored toga, in vitro pregled osetljivosti ćelijskih linija, kao što je onaj koji je opisao Nacionalni institut za kancer S.A.D. (videti Voskoglou-Nomikos et al., 2003, Clinical Cancer Res.9: 42227-4239) može se upotrebljavati kao jedan od vodiča za određivanje tipova kancera koji mogu biti osetljivi na lečenje jedinjenjima ili konjugatima pronalaska.
[0223] Primeri in vitro potencije i ciljne specifičnosti antitelo-citotoksični agens konjugata predmetnog pronalaska prikazani su na SL. 2 i 4. Svi konjugati su izuzetno citotoksični na
1
antigen pozitivne ćelije kancera sa IC50u niskom pikomolarnom opsegu. Antigen negativne ćelijske linije ostaju vijabilne kada su izložene istim konjugatima.
[0224] U jednom primeru, izmerena je in vivo efikasnost agens koji se vezuje za ćeliju/citotoksični agens konjugata. SCID miševi koji nose NCI-H2110 tumorske ćelije tretirani su huMov19-80 i huMov 19-90 konjugatima i značajna regresija tumora je primećena kod višestrukih doza dok su kod netretirani miševa tumori brzo rasli (SL. 6). Aktivnost za huMov19-90 konjugat primećena je na tako niskim dozama kao što je 5 μg/kg.
KOMPOZICIJE I POSTUPCI UPOTREBE
[0225] Predmetni pronalazak uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugate pronalaska (i/ili njihove solvate, hidrate i/ili soli) i farmaceutski prihvatljiv nosač. Predmetni pronalazak takođe uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugate pronalaska (i/ili njihovih solvate, hidrate i/ili soli) i farmaceutski prihvatljiv nosač, koja dodatno sadrži drugi terapijski agens. Predmetne kompozicije su korisne za inhibiciju abnormalnog ćelijskog rasta ili lečenje proliferativnog poremećaja kod sisara (npr. čoveka). Predmetne kompozicije su takođe korisne za lečenje depresije, anksioznosti, stresa, fobija, panike, disforije, psihijatrijskih poremećaja, bola, i inflamatornih bolesti kod sisara (npr. čoveka).
Predmetni pronalazak uključuje jedinjenje prvog aspekta ili konjugat drugog aspekta za upotrebu u postupku inhibicije abnormalnog ćelijskog rasta ili lečenja proliferativnog poremećaja kod sisara (npr. čoveka) koji sadrži primenu navedenom sisaru terapijski efikasne količine jedinjenja ili konjugata (i/ili njihovih solvata i soli) samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom.
[0226] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje konjugat drugog aspekta za upotrebu u postupcima lečenja koji sadrže primenu subjektu kome je potrebno lečenje efikasne količine konjugata.
[0227] Ovde je takođe objavljen postupak za indukciju ćelijske smrti kod odabranih ćelijskih populacija koji sadrži dovođenje u kontakt ciljnih ćelija ili tkiva koje sadrži ciljne ćelije sa efikasnom količinom citotoksičnog agensa koji sadrži bilo koji od citotoksično jedinjenjeagenasa koji se vezuju za ćeliju (npr. indolinobenzodiazepin ili oksazolidinobenzodiazepin dimer povezani sa agensom koji se vezuje za ćeliju) predmetnog pronalaska, njihovu so ili solvat. Ciljne ćelije su ćelije za koje se može vezati agens koji se vezuje za ćeliju.
[0228] Po želji, drugi aktivni agensi, kao što su drugi anti-tumorski agensi, mogu se primeniti zajedno sa konjugatom.
2
[0229] Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači, razblaživači, i ekscipijenti su dobro poznati i mogu se odrediti od strane onih koji imaju prosečne veštine u struci kao što to nalaže klinička situacija.
[0230] Primeri pogodnih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenata uključuju: (1) Dulbekov (Dulbecco’s) fosfatom puferisan fiziološki rastvor, pH oko 7.4, koji sadrži ili ne sadrži oko 1 mg/ml do 25 mg/ml humanog albumina seruma, (2) 0,9% fiziološki rastvor (0,9% tež./zapr. NaCl), i (3) 5% (tež./zapr.) dekstrozu; i može takođe da sadrži antioksidans kao što je triptamin i stabilizirajući agens kao što je Tween 20.
[0231] Postupak indukovanja ćelijske smrti kod odabranih ćelijskih populacija može se praktikovati in vitro, in vivo, ili ex vivo.
[0232] Primeri in vitro upotreba uključuju tretmane autologne kostne srži pre njene transplantacije u istog pacijenta u cilju ubijanja bolesnih ili malignih ćelija; tretmane kostne srži pre njene transplantacije u cilju ubijanja kompetentnih T ćelija i sprečavanja bolesti graft protiv domaćina (GVHD); tretmane ćelijskih kultura u cilju ubijanja svih ćelija osim željenih varijanti koje ne eksprimiraju ciljni antigen; ili da ubiju varijante koje eksprimiraju neželjeni antigen.
[0233] Uslove nekliničke in vitro upotrebe lako će odrediti onaj koji ima prosečnu veštinu u struci.
[0234] Primeri kliničke ex vivo upotrebe su za uklanjanje tumorskih ćelija ili limfoidnih ćelija iz kostne srži pre autolognih transplantacija u lečenju kancera ili u lečenju autoimunske bolesti, ili za uklanjanje T ćelija i drugih limfoidnih ćelija iz autologne ili alogene kostne srži ili tkiva pre transplantacije u cilju sprečavanja GVHD. Lečenje može biti izvršeno na sledeći način. Kostna srž se sakuplja od pacijenta ili druge jedinke i zatim se inkubira u medijumu koji sadrži serum kome je dodat citotoksični agens pronalaska, koncentracije su u opsegu od oko 10 μM do 1 pM, tokom oko 30 minuta do oko 48 sati na oko 37 °C. Tačne uslove koncentracije i vremena inkubacije, tj. dozu, lako određuje onaj koji ima prosečnu veštinu u struci. Posle inkubacije ćelije kostne srži se ispiraju medijumom koji sadrži serum i vraćaju se pacijentu intravenski u skladu sa poznatim postupcima. U okolnostima gde pacijent prima drugo lečenje kao što je kurs ablativne hemioterapije ili zračenje celog tela između vremena sakupljanja srži i ponovne infuzije tretiranih ćelija, tretirane ćelije srži se čuvaju zamrznute u tečnom azotu upotrebom standardne medicinske opreme.
[0235] Za kliničku in vivo upotrebu, citotoksični agens pronalaska biće obezbeđen kao rastvor ili liofilizovani prah koji su testirani na sterilnost i na nivoe endotoksina. Primeri pogodnih protokola primene konjugata su kako sledi. Konjugati se daju nedeljno tokom 4 nedelje kao intravenski bolus svake nedelje. Doze bolusa se daju u 50 do 1000 ml normalnog fiziološkog rastvora u koji se može dodati 5 do 10 ml albumina humanog seruma. Doze će biti 10 μg do 2000 mg po primeni, intravenski (opseg od 100 ng do 20 mg/kg dnevno). Posle četiri nedelje lečenja, pacijent može da nastavi da prima lečenje na nedeljnoj osnovi. Specifične kliničke protokole u vezi sa putem primene, ekscipijentima, razblaživačima, dozama, vremenima, itd. može odrediti onaj koji ima prosečne veštine u struci kao što to nalaže klinička situacija.
[0236] Primeri medicinskih stanja koja se mogu lečiti u skladu sa in vivo ili ex vivo postupcima indukovanja ćelijske smrti u odabranim ćelijskim populacijama uključuju malignitet bilo koje vrste, uključujući, na primer, kancer, autoimunske bolesti, kao što su sistemski lupus, reumatoidni artritis, i multipla skleroza; odbacivanje grafta, kao što je odbacivanje transplanta bubrega, odbacivanje transplanta jetre, odbacivanje transplanta pluća, odbacivanje srčanog transplanta, i odbacivanje transplantata kostne srži; bolest graft protiv domaćina; virusne infekcije, kao što su CMV infekcija, HIV infekcija, AIDS, itd.; i infekcije parazitima, kao što su gijardijaza, amebijaza, šistosomijaza, i druge kao što je određeno od strane onog koji ima prosečne veštine u struci.
[0237] Terapije kancera i njihove doze, putevi primene i preporučena upotreba su poznati u struci i opisani su u takvoj literaturi kao Physician's Desk Reference (PDR). PDR objavljuje doze agenasa koji se upotrebljavaju u lečenju različitih kancera. Režim doziranja i doze ovih prethodno pomenutih hemioterapijskih lekova koji su terapijski efikasni zavisiće od određenog kancera koji se leči, stepena bolesti i drugih faktora poznatih lekaru veštom u struci i može ih odrediti lekar. Onaj koji je vešt u struci može pregledati PDR, upotrebom jednog ili više od sledećih parametara, da odredi režim doziranja i doze hemioterapijskih agenasa i konjugata koji se mogu upotrebljavati u skladu sa učenjima ovog pronalaska. Ovi parametri uključuju:
Sveobuhvatni indeks
Po proizvođaču
Proizvode (po nazivu kompanije ili nazivu leka koji je zaštićen žigom)
Indeks kategorija
Generički/hemijski indeks (uobičajeni nazivi lekova koji nisu zaštićeni žigom)
Kolor slike medikamenata
Informacije o proizvodu, u skladu sa FDA označavanjem
Hemijske informacije
Funkciju/delovanje
4
Indikacije i kontraindikacije
Probno istraživanje, nuspojave, upozorenja
ANALOZI I DERIVATI
[0238] Onaj koji je vešt u struci citotoksičnih agenasa lako će razumeti da se svaki od citotoksičnih agenasa opisanih ovde može modifikovati na takav način da rezultujuće jedinjenje i dalje zadržava specifičnost i/ili aktivnost početnog jedinjenje. Vešt stručnjak će takođe razumeti da se mnoga od ovih jedinjenja mogu upotrebljavati umesto citotoksičnih agenasa opisanih ovde. Stoga, citotoksični agensi predmetnog pronalaska uključuju analoge i derivate jedinjenja koja su ovde opisana.
PRIMERI
[0239] Pronalazak će sada biti ilustrovan pozivanjem na neograničavajuće primere. Primeri 7, 8, 14 i 19 nisu iz pronalaska. Ukoliko nije drugačije navedeno, svi procenti, odnosi, delovi itd. su po težini. Svi reagensi su nabavljeni od kompanije Aldrich Chemical Co., New Jersey, ili drugih komercijalnih izvora. Spektri nuklearne magnetne rezonance (<1>H NMR) dobijeni su na Bruker 400 MHz instrumentu. Maseni spektri su dobijeni na Bruker Daltonics Esquire 3000 instrumentu i LCMS su dobijeni na Agilent 1260 Infinity LC sa Agilent 6120 single quadropole MS upotrebom elektrosprej jonizacije.
[0240] Sledeći rastvarači, reagensi, zaštitne grupe, delovi i druge oznake mogu biti označeni njihovim skraćenicama u zagradama:
Me = metil; Et = etil; Pr = propil; i-Pr = izopropil; Bu = butil; t-Bu = terc-butil; Ph = fenil, i Ac = acetil
AcOH ili HOAc = sirćetna kiselina
ACN ili CH3CN = acetonitril
Ala = alanin
aq = vodeno
BH3·DMS = boran dimetilsulfid kompleks
Bn = benzil
Boc ili BOC = terc-butoksikarbonil
CBr4= karbontetrabromid
Cbz ili Z = benziloksikarbonil
DCM ili CH2Cl2= dihlorometan
DCE = 1,2-dihloroetan
DMAP = 4-dimetilaminopiridin
DI voda = dejonizovana voda
DIBAL = diizobutilaluminijum hidrid
DIEA ili DIPEA = N,N-diizopropiletilamin
DMA = N,N-dimetilacetamid
DMF = N,N-dimetilformamid
DMSO = dimetil sulfoksid
DTT = ditiotreitol
EDC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid
EEDQ = N-etoksikarbonil-2-etoksi-1,2-dihidrokvinolin
ESI ili ES = elektrosprej jonizacija
EtOAc = etilacetat
Gly = glicin
g = grami
h = sat
HATU = N,N,N'N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronijum heksafosfat HPLC = tečna hromatografija visokih performansi
HOBt ili HOBT = 1-hidroksibenzotriazol
LAH = litijum aluminijum hidrid
LC = tečna hromatografija
LCMS = tečna hromatografija sa masenom spektrometrijom
min = minuti
mg = miligrami
ml = mililitri
mmol = milimoli
μg = mikrogrami
μL = mikrolitri
μmol = mikromoli
Me = metil
MeOH = metanol
MeI = metiljodid
MS = masena spektrometrija
MsCl = metansulfonil hlorid (mezil hlorid)
Ms2O = metansulfonski anhidrid
NaBH(OAc)3= natrijum triacetoksiborohidrid
NHS = N-hidroksisukcinamid
NMR = nuklearna magnetno rezonantna spektroskopija
PPh3= trifenilfosfin
PTLC = preparativna tankoslojna hromatografija
rac = racemska smeša
Rf= faktor retardacije
RPHPLC ili RP-HPLC = tečna hromarografija visokih performansi na reverznoj fazi RT ili rt = sobna temperatura (okolna, oko 25 °C)
sat ili sat’d = zasićen
STAB = natrijum triacetoksiborohidrid (NaBH(OAc)3)
TBSCl ili TBDMSCl = terc-butildimetilsilil-hlorid
TBS = terc-butildimetilsilil
TCEP·HCl = tris(2-karboksietil)fosfin hidrohloridna so
TEA = trietilamin (Et3N)
TFA = trifluorosirćetna kiselina
THF = tetrahidrofuran
TLC = tankoslojna hromatografija
Val = valin
Primer 1. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-6-oksoheksanoata (jedinjenje 14)
[0241]
Korak 1: Z-Gly-Gly-OH jedinjenje 1 (5,0 g, 18,78 mmol) i H-Gly-Ot-Bu·HCl jedinjenje 2 (3,46 g, 20,66 mmol) rastvorena su u DMF (37,6 ml). EDC·HCl (3,96 g, 20,66 mmol) i HOBt (2,88 g, 18,78 mmol) su dodati u reakcionu bocu, zatim je dodat DIPEA (8,18 ml, 46,9 mmol). Reakcija je mešana na rt pod Ar preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2, isprana sa sat’d NH4Cl, sat’d NaHCO3, i zatim vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatogafijom na silika gelu (MeOH/DCM, gradijent, 0% do 5%) da se dobije čisto jedinjenje 3 kao bela čvrsta supstanca (6,35 g, 89% prinos).
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,18-8,13 (m, 2H), 7,48 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 7,37-7,36 (m, 3H), 7,34-7,32 (m, 1H), 5,04 (s, 2H), 4,09 (q, 1H, J = 5,2 Hz), 3,74 (t, 4H, J = 6,1 Hz), 3,67 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 3,17 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 1,41 (s, 9H). LCMS = 4,28 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 324,15 (M-t-Bu+H).
Korak 2: Jedinjenje 3 (6,3 g, 16,60 mmol) je rastvoreno u MeOH (52,7 ml) i vodi (2,64 ml). Reakciona smeša je pročišćena sa Ar i oslobođena gasa tokom 5 min. Polako je dodavan Pd/C (vlažan, 10%) (0,884 g, 0,830 mmol). Zatim je propuštan u H2iz balona tokom 1 min. Reakcija je mešana pod balonom H2na rt preko noći. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i filter kolač je ispran sa MeOH (30 ml) i koncentrovan. U ostatak je dodat CH3CN (20 ml) i koncentrovan. Ovo je ponovljeno još dva puta kako bi se dobila lepljiva čvrsta supstanca. Ostatak je skašen u EtOAc/heksani (2:1, 50 ml) i filtriran i ispran sa EtOAc/heksani (1:1, 30 ml). Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom/N2tokom 1 h da se dobije jedinjenje 4 kao bela čvrsta supstanca (3,66 g, prinos 90%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,21-8,18 (m, 1H), 8,12 (bs, 1H), 3,76 (bs, 2H), 3,73 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 3,13 (s, 2H), 1,93 (bs, 2H), 1,41 (s, 9H).
Korak 3: Amin jedinjenje 4 (1,0 g, 4,08 mmol) i mono metiladipat (664 μL, 4,48 mmol) su rastvoreni u DMF (13,59 ml). EDC·HCl (860 mg, 4,48 mmol) i HOBt (624 mg, 4,08 mmol) su dodati u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (1,424 ml, 8,15 mmol). Reakcija je mešana na rt preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa DCM/MeOH (20 ml, 5:1) i isprana sa sat’d NH4Cl, sat’d NaHCO3, vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatogafijom na silika gelu (gradijent, 0% do 20% MeOH/DCM) da se dobije čisto jedinjenje 5 kao bela čvrsta supstanca (1,5 g, prinos 95%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,17-8,06 (m, 3H), 3,74-3,71 (m, 6H), 3,59 (s, 3H), 2,32 (bt, 2H, J = 6,9 Hz), 2,14 (bt, 2H, J = 6,7 Hz), 1,52-1,49 (m, 4H), 1,41 (s, 9H).
Korak 4: Jedinjenje 5 (1,5 g, 3,87 mmol) je mešano u TFA (5,97 ml, 77,0 mmol) i dejonizovanoj vodi (300 μl) na rt preko noći. CH3CN (10 ml) je dodat u reakcionu smešu i mešano je tokom 5 min. Smeša je postala gusta sa puno belog taloga. Dodato je još CH3CN (30 ml) i dodatno je mešano tokom 5 min. Smeša je filtrirana i osušena pod vakuumom/N2tokom 1 h da se dobije čisto jedinjenje 6 kao bela čvrsta supstanca (0,7 g, prinos 55%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12,56 (s, 1H), 8,16-8,06 (m, 3H), 3,73 (dt, 6H, J = 8,6, 6,1 Hz), 3,59 (s, 3H), 2,32-2,29 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 2H), 1,51 (bt, 4H, J = 3,5 Hz).
Korak 5: Anilin jedinjenje 7 (100 mg, 0,653 mmol) i kiselo jedinjenje 6 (227 mg, 0,685 mmol) su suspendovana u CH2Cl2/MeOH (4,35 ml/2,2 ml) na rt. Dodat je EEDQ (323 mg, 1,306 mmol) i reakcija je mešana na rt preko noći. Rastvarač je koncentrovan i ostatak je skašen u EtOAc (15 ml) i filtriran. Čvrste supstance su isprane sa EtOAc (2 x 15 ml) i osušene pod vakuumom/N2da se dobije jedinjenje 8 kao bela čvrsta supstanca (260 mg, 85% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,74 (s, 1H), 8,21-8,19 (m, 2H), 8,11-8,08 (m, 1H), 7,45 (s, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,17 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 4,45 (d, 4H, J = 5,6 Hz), 3,87 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 3,75 (dd, 4H, J = 5,7, 13,4 Hz), 3,58 (s, 3H), 2,31-2,27 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 2H), 1,52-1,48 (m, 4H). LCMS = 0,886 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 489,3 (M+Na).
Korak 6: Diol jedinjenje 8 (260 mg, 0,557 mmol) i karbontetrabromid (555 mg, 1,672 mmol) su rastvoreni u DMF (5,57 ml). Dodat je trifenilfosfin (439 mg, 1,672 mmol) i smeđa smeša je mešana pod Ar na rt tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa DCM/MeOH (10:1, 30 ml) i isprana vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatogafijom na silika gelu (MeOH/DCM, 0% do 10%, gradijent) da se dobije jedinjenje 9 kao žuta čvrsta supstanca. Proizvod je skašen u CH2Cl2/EtOAc (1:10, 30 ml) i zatim filtriran. Čvrsta supstanca je isprana sa EtOAc i osušena pod vakuumom/N2da se dobije čisto jedinjenje 9 kao prljavo-bela čvrsta supstanca (170 mg, 52% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,95 (s, 1H), 8,25-8,20 (m, 2H), 8,12-8,10 (m, 1H), 7,65 (s, 2H), 7,22 (s, 1H), 4,68 (s, 3H), 3,89 (d , 2H, J = 5,8 Hz), 3,77 (dd, 4H, J = 5,7, 7,4 Hz), 3,58 (s, 3H), 2,31-2,27 (m, 2H), 2,16-2,13 (m, 2H), 1,51-1,49 (m, 4H) . LCMS = 3,335 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 593,2 (M+H).
Korak 7: Dibromid jedinjenje 9 (109 mg, 0,184 mmol) i IGN monomer jedinjenje 10 (119 mg, 0,405 mmol) su rastvorena u DMF (1,84 ml). Dodat je kalijum karbonat (63,6 mg, 0,460 mmol) i mešano je na rt preko noći. U reakcionu smešu je dodata voda (20 ml) da se proizvod istaloži. Kaša je mešana na rt tokom 5 min i zatim je filtrirana i osušena pod vakuumom/N2tokom 1 h. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (MeOH/CH2Cl2, gradijent, 0% do 5%) da se dobije jedinjenje 11 kao žuta čvrsta supstanca (160 mg, 60% prinos, 70% čistoća). LCMS = 5,240 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1019,7 (M+H).
Korak 8: Diimin jedinjenje 11 (140 mg, 0,11 mmol) je rastvoreno u 1,2-dihloroetanu (1,1 ml). NaBH(OAc)3(23,29 mg, 0,11 mmol) je dodat u reakcionu smešu i mešano je na rt tokom 1 h. Reakcija je razblažena sa CH2Cl2(30 ml) i ugašena je sa sat’d aq rastvorom NH4Cl (15 ml). Slojevi su razdvojeni i isprani slanim rastvorom, osušeni preko Na2SO4i koncentrovani. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću RPHPLC (C18 kolona, CH3CN/H2O, gradijent, 35% do 55%) za prinos mono imin jedinjenja 12 kao bele pahuljaste čvrste supstance (33 mg, 29% prinos) i jedinjenje 11 polaznog materijala je takođe izdvojeno (25 mg). LCMS = 7,091 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1021,7 (M+H).
Korak 9: Metilestar jedinjenje 12 (33 mg, 0,029 mmol) je rastvoreno u THF (1,09 ml) i vodi (364 μL). LiOH (6,97 mg, 0,291 mmol) je dodat i reakcija je mešana na rt tokom 1,5 h. Reakciona smeša je razblažena sa H2O (5 ml) i zakišeljena sa 0,5 M aq HCl do pH~4. Vodeni sloj je ekstrahovan sa CH-2Cl2/MeOH (3:1, 3 x 20 ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani da se dobije sirovo jedinjenje 13 kao žuta čvrsta supstanca (29 mg, 99% prinos). LCMS = 5,356 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1007,7 (M+H).
1
Korak 10: EDC·HCl (22,08 mg, 0,115 mmol) je dodat u mešani rastvor kiselog jedinjenja 13 (29 mg, 0,023 mmol) i N-hidroksisukcinamida (21,21 mg, 0,184 mmol) u CH2Cl2(2,3 ml) na rt. Reakciona smeša je mešana tokom 2 h. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2i isprana je vodom (1 x 15 ml) i slanim rastvorom (1 x 15 ml). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću RPHPLC (C18 kolona, CH3CN/H2O, gradijent, 35% do 55%). Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane i liofilizovane da se dobije 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-6-oksoheksanoat, jedinjenje 14 kao bela pahuljasta čvrsta supstanca (8 mg, 31% prinos). LCMS = 5,867 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1104,7 (M+H).
Primer 2. Sinteza (1r,4r)-2,5-dioksopirolidin-1-il 4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil) fenil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)karbamoil)cikloheksankarboksilata, (jedinjenje 23)
[0242]
Korak 1: Amin jedinjenje 4 (200 mg, 0,815 mmol) i monometilestar 1,4-transcikloheksandikarboksilne kiseline jedinjenje 15 (182 mg, 0,978 mmol) rastvorena su u DMF (2,72 ml). EDC·HCl (188 mg, 0,978 mmol) i HOBt (125 mg, 0,815 mmol) su
2
dodati u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (285 μL, 1,631 mmol). Smeša je mešana na rt preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2i isprana sa sat’d NH4Cl, sat’d NaHCO3, slanim rastvorom, i vodom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4i koncentrovan do lepljivog ostatka. CH3CN (15 ml) je dodat u ostatak i koncentrovan. Ovo je ponovljeno još 2 puta da se dobije jedinjenje 16 kao suvi beli prah (300 mg, 85% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,16 (t, 1H, J = 5,9 Hz), 8,04 (dt, 2H, J = 5,6, 14,8 Hz), 3,74-3,69 (m, 6H), 3,59 (s, 3H), 2,31-2,25 (m, 1H), 2,20-2,13 (m, 1H), 1,94-1,91 (m, 2H), 1,82-1,79 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,34 (d, 3H, J = 11,7 Hz).
Korak 2: TFA (1,40 ml, 18,14 mmol) i DI voda (67,8 μL) su dodati u čisto jedinjenje 16 (300 mg, 0,726 mmol) na rt i mešani tokom 3 h. CH3CN (20 ml) je dodat u reakcionu smešu i koncentrovan. Ovo je ponovljeno još dva puta da se dobije jedinjenje 17 kao bela čvrsta supstanca (230 mg, 89% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,16-8,13 (m, 1H), 8,07-8,01 (m, 2H), 3,76-3,73 (m, 4H), 3,70 (bd, 2H, J = 5,1 Hz), 3,59 (s, 3H ), 2,31-2,25 (m, 1H), 2,19-2,14 (m, 1H), 1,94-1,91 (m, 2H), 1,82-1,79 (m, 2H), 1,42-1,26 (m, 4H).
Korak 3: Anilin jedinjenje 7 (135 mg, 0,881 mmol) i kiselo jedinjenje 17 (331 mg, 0,925 mmol) su suspendovana u CH2Cl2/MeOH (2,9 ml/1,5 ml) na rt. Dodat je EEDQ (436 mg, 1,763 mmol) i reakcija je mešana na rt preko noći. Rastvarač je koncentrovan i ostatak je skašen u EtOAc (15 ml) i filtriran. Čvrste supstance su isprane sa EtOAc (2 x 15 ml) i osušene pod vakuumom/N2da se dobije jedinjenje 18 kao bela čvrsta supstanca (330 mg, 61% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,73 (s, 1H), 8,18 (dt, 2H, J = 6,0, 19,2 Hz), 8,09-8,01 (m, 2H), 7,45 (s, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,17 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 4,45 (d, 4H, J = 5,6 Hz), 3,88-3,84 (m, 3H), 3,77-3,69 (m, 8H), 3,63 (s, 2H), 3,59 (s, 6H), 2,30-2,22 (m, 2H), 2,19-2,13 (m, 2H), 1,94-1,90 (m, 4H), 1,82-1,78 (m, 4H), 1,41-1,26 (m, 8H).
Korak 4: Jedinjenje 18 (330 mg, 0,536 mmol) i CBr4(533 mg, 1,608 mmol) su rastvoreni u DMF (5,36 ml). Kada je PPh3(422 mg, 1.608 mmol) dodat u reakcionu smešu, reakcija je postala žuta sa blagom egzotermijom. Reakcija je mešana pod Ar tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2i isprana je vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4i koncentrovan. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (MeOH/CH2Cl2, gradijent, 0% do 10%) da se dobije jedinjenje 19 kao bela čvrsta supstanca (234 mg, 64% prinos). LCMS = 4,453 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 617,10 (M+H).
Korak 5: Jedinjenje 20 je pripremljeno slično kao jedinjenje 11 u Primeru 1. Jedinjenje 20 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle prečišćavanja (264 mg, 60% prinos). LCMS = 4,831 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 1045,20 (M+H).
4
Korak 6: Jedinjenje 21 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Jedinjenje 21 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (51 mg, 31% prinos). LCMS = 5,127 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 1047,30 (M+H).
Korak 7: Metilestar jedinjenje 21 (48 mg, 0,046 mmol) je rastvoreno u 1,2-dihloroetanu (3,06 ml). Trimetilstananol (124 mg, 0,688 mmol) je dodat u reakcionu smešu i zagrevana je na 80 °C preko noći. Reakciona smeša je ohlađena do rt i razblažena vodom (15 ml). Vodeni sloj je zakišeljen na pH ~ 4 sa 1 M HCl. Smeša je ekstrahovana sa CH2Cl2/MeOH (10:1, 3 x 20 ml). Kombinovani organski slojevi su isprani slanim rastvorom i osušeni preko Na2SO4i koncentrovani. Sirovi ostatak je proteran kroz kratko jastuče silika gela i ispran sa CH2Cl2/MeOH (10:1, zatim 5:1, 2 x 30 ml) i koncentrovan. Kiselo jedinjenje 22 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca i upotrebljeno je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (48 mg, 100% prinos). LCMS = 5,338 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1033,7 (M+H).
Korak 8: Jedinjenje 23 je pripremljeno slično kao jedinjenje 13 u Primeru 1. (1r,4r)-2,5-dioksopirolidin-1-il 4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil) fenil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)karbamoil)cikloheksan karboksilat, jedinjenje 23 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (8 mg, 19% prinos). LCMS = 6,007 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1130,8 (M+H).
Primer 3. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12, 12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)amino)-6-oksoheksanoata (jedinjenje 35)
[0243]
Korak 1: Z-Val-OH jedinjenje 24 (3,0 g, 11,94 mmol) i L-Ala-OtBu jedinjenje 25 (1,907 g, 13,13 mmol) su rastvorena u DMF (23,88 ml). EDC·HCl (2,52 g, 13,13 mmol) i HOBt (2,011 g, 13,13 mmol) su dodati u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (4,59 ml, 26,3 mmol). Reakcija je mešana reakcija na rt preko noći pod Ar. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2i isprana je sa sat’d NaHCO3, sat’d NH4Cl, vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 0% do 50%) da se dobije jedinjenje 26 kao bela čvrsta supstanca (3,68 g, 81% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,39-7,29 (m, 5H), 6,29 (bd, 1H, J = 6,9 Hz), 5,34 (bd, 1H, J = 8,4 Hz), 5,11 (s, 2H), 4,45 (p, 1H, J = 7,2 Hz), 4,02-3,98 (m, 1H), 2,18-2,09 (m, 1H), 1,56 (s, 9H), 1,37 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 0,98 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,93 (d, 3H, J = 6,8 Hz). LCMS = 5,571 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 323,25 (M-tBu+H).
Korak 2: Jedinjenje 26 (3,68 g, 9,72 mmol) je rastvoreno u MeOH (30,9 ml) i vodi (1,543 ml). Rastvor je pročišćen sa Ar i oslobođen gasa tokom 5 min. Polako je dodavan Pd/C (10%, vlažan, 0,517 g) u reakcionu smešu. H2je zatim propuštan tokom minuta. Propuštanje je prekinuto i reakcija je zatim mešana pod H2balonom preko noći.
Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i filter kolač je ispran sa MeOH (30 ml) i koncentrovan da se dobije jedinjenje 27 kao bela čvrsta supstanca (2,35 g, 99% prinos).
<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,79-7,77 (m, 1H), 4,50 (p, 1H, J = 7,3 Hz), 3,27 (d, 1H, J = 3,9 Hz), 2,34-2,26 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,40 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,01 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 0,86 (d, 3H, J = 6,9 Hz).
Korak 3: Amin jedinjenje 27 (2,35 g, 9,62 mmol) i mono metiladipat (1,69 g, 10,58 mmol) su rastvoreni u DMF (32,1 ml). EDC·HCl (1,94 g, 10,10 mmol) i HOBt (1,47 g, 9,62 mmol) su dodati u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (3,36 ml, 19,24 mmol). Reakcija je mešana na rt preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa DCM/MeOH (20 ml, 5:1) i isprana sa sat’d NH4Cl, sat’d NaHCO3, vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatogafijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 0% do 50%) da se dobije jedinjenje 28 kao bela čvrsta supstanca (2,77 g, 75% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6,29 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 6,12 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 4,43 (p, 1H, J = 7,2 Hz), 4,27 (dd, 1H, J = 6,4, 8,6 Hz), 3,66 (s, 3H), 2,35-2,31 (m, 2H), 2,26-2,23 (m, 2H), 2,12-2,03 (m, 1H), 1,70-1,63 (m, 4H), 1,46 (s, 9H), 1,36 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 0,95 (očigledno t, 6H, J = 6,6 Hz).
Korak 4: TFA (8,28 ml, 108,0 mmol) i voda (0,56 ml) su dodati u čisto jedinjenje 28 (2,77 g, 7,17 mmol) na rt i mešani tokom 2,5 h. CH3CN (30 ml) je dodat u reakcionu smešu i koncentrovan. Ovo je ponovljeno još 2 puta da se dobije jedinjenje 29 kao bledo žuta čvrsta supstanca (2,0 g, 84%prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8,11 (bs, 1H), 7,29 (d, 1H, J = 8,9 Hz), 7,14 (d, 1H, 6,8 Hz), 4,58 (p, 1H, J = 7,1 Hz), 4,37 (t, 1H, J = 8,7 Hz), 3,68 (s, 3H), 2,37-2,32 (m, 4H), 2,03-1,99 (m, 2H), 1,69-1,63 (m, 4H), 1,49 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 0,97 (d, 3H, J = 4,8 Hz), 0,96 (d, 3H, J = 4,8 Hz).
Korak 5: Anilin jedinjenje 7 (150 mg, 0,98 mmol) i kiselo jedinjenje 29 (340 mg, 1,03 mmol) su suspendovana u CH2Cl2/MeOH (3,26 ml, 1,62 ml) na rt. Dodat je EEDQ (484 mg, 1,96 mmol) i reakcija je mešana na rt preko noći. Rastvarač je koncentrovan i ostatak je skašen u EtOAc/Et2O (15 ml, 15 ml) i filtriran. Čvrste supstance su isprane sa Et2O (2 x 15 ml) i osušene pod vakuumom/N2da se dobije jedinjenje 30 kao bela čvrsta supstanca (150 mg, 33% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,61 (s, 2H), 7,47 (d, 1H, J = 7,1 Hz), 7,14 (s, 1H), 6,64 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 4,82-4,75 (m, 1H), 4,45-4,40 (m, 4H), 3,64 (s, 3H), 2,36-2,27 (m, 4H), 2,16-2,07 (m, 1H), 1,68-1,59 (m, 4H), 1,47 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 0,98 (d, 3H, J = 3,6 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 4,8 Hz). LCMS = 3,073 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 466,25 (M+H).
Korak 6: Diol jedinjenje 30 (150 mg, 0,322 mmol) i CBr4(321 mg, 0,967 mmol) su rastvoreni u DMF (3222 μl). Kada je PPh3(254 mg, 0,967 mmol) dodat u reakcionu smešu, reakcija je postala crveno-ružičasta sa blagom egzotermijom. Reakcija je mešana pod Ar tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2i isprana je vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4i koncentrovan. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 0% do 100%) da se dobije jedinjenje 31 kao prljavo-bela čvrsta supstanca (473 mg, 75% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,19 (d, 1H, J = 6,6 Hz), 7,85 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,64 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,68 (s, 3H), 4,37 (p, 1H, J = 7,0 Hz), 4,18 (dd, 1H, J = 7,2, 8,4 Hz), 3,58 (s, 3H), 2,32-2,29 (m, 2H), 2,33-2,12 (m, 2H), 2,01-1,91 (m, 1H), 1,53-1,49 (m, 4H), 1,31 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 0,89 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,85 (d, 3H, J = 6,8 Hz). LCMS = 5,259 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 592,05 (M+H).
Korak 7: Jedinjenje 32 je pripremljeno slično kao jedinjenje 11 u Primeru 1. Jedinjenje 32 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle prečišćavanja (162 mg, 57% prinos, 70% čistoća). LCMS = 6,461 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1018,7 (M+H).
Korak 8: Jedinjenje 33 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Jedinjenje 33 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (40 mg, 31% prinos). LCMS = 5,528 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 1020,30 (M+H).
Korak 9: Jedinjenje 34 je pripremljeno slično kao jedinjenje 22 u Primeru 2. Jedinjenje 34 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle silika čepa (38 mg, 100% prinos). LCMS = 5,211 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 1006,35 (M+H).
Korak 10: Jedinjenje 35 je pripremljeno slično kao jedinjenje 14 u Primeru 1. 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)amino)-6-oksoheksanoat, jedinjenje 35 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (8 mg, 20% prinos). LCMS = 7,031 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1103,7 (M+H).
Primer 4. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il2-(3-(((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-(((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil) -3,6,9,12-tetraokso-2,5,8,11-tetraazaheptadekan-17-oata (jedinjenje 49)
[0244]
Korak 1: (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol jedinjenje 7 (5,0 g, 32,6 mmol) je rastvoreno u THF (65,3 ml). Dodati su TBSCl (12,30 g, 82 mmol) i imidazol (6,67 g, 98 mmol) i mešani na rt preko noći pod Ar. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i isprana sa sat’d NH4Cl i slanim rastvorom, osušena preko Na2SO4i koncentrovana. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 0% do 30%) da se dobije jedinjenje 37 kao žuto ulje (13 g, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6,71 (s, 1H), 6,60 (s, 2H), 4,65 (s, 4H), 0,94 (s, 18 H), 0,10 (s, 12 H).
1
Korak 2: Cs2CO3(8,54 g, 26,2 mmol) je dodat u mešani rastvor anilin jedinjenja 37 (10 g, 26,2 mmol) u DMF (52,4 ml). Dodat je metiljodid (1,474 ml, 23,58 mmol) i reakcija je mešana na rt tokom 3 h. Voda (10 ml) i EtOAc (30 ml) su dodati u reakcionu smešu. Slojevi su razdvojeni i ekstrahovani sa EtOAc (2x). Organski slojevi su isprani vodom (4x), osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 0% do 10%) da se dobije željeni mono-metilovani proizvod jedinjenje 38 (3,8 g, 37% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6,63 (s, 1H), 6,52 (s, 2H), 4,67 (s, 4H), 2,84 (s, 3H), 0,94 (s, 18H), 0,10 (s, 12H).
Korak 3: Anilin jedinjenje 38 (1,0 g, 2,53 mmol) i Z-Gly-OH (0,582 g, 2,78 mmol) su rastvoreni u DMF (8,42 ml). EDC·HCl (1,21 g, 6,32 mmol) i DMAP (340 mg, 2,78 mmol) su dodati u reakcionu smešu i zagrevani na 80 °C preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i isprana sat’d NaHCO3i vodom (2x), osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana. Sirovi ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 0% do 30% do 100%) da se dobije jedinjenje 39 kao žuta lepljiva čvrsta supstanca (780 mg, 53% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,27 (m, 6H), 6,90 (s, 2H), 4,94 (s, 2H), 4,62 (s, 4H), 3,58 (s, 2H), 3,16 (s, 3H), 0,83 (s, 18H), 0,00 (s, 12 H).
Korak 4: Jedinjenje 39 (1,26 g, 2,147 mmol) je rastvoreno u MeOH (6,82 ml) i THF (6,8 ml) i rastvor je pročišćen sa N2. Dodat je Pd/C (10%, 0,228 g, 0,215 mmol) i H2je propušten tokom nekoliko minuta. Reakcija je mešana pod H2balonom preko noći. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa MeOH i koncentrovana dajući čisto
1 1
jedinjenje 40 (1 g, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,41-7,30 (m, 2H), 7,27-7,21 (m, 1H), 7,06 (s, 2H), 4,65 (s, 4H), 3,23 (s, 3H), 3,12 (s, 2H), 0,82 (s, 18H), 0,00 (s, 12H).
Korak 5: Amin jedinjenje 40 (1,0 g, 1,988 mmol) i Z-Gly-Gly-Gly-OH (662 mg, 2,385 mmol) su rastvoreni u DMF (6,63 ml). EDC·HCl (457 mg, 2,385 mmol) i HOBT (304 mg, 1,988 mmol) su dodati u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (694 μL, 3,98 mmol). Reakcija je mešana na rt preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i isprana sa sat’d NaHCO3, slanim rastvorom i vodom (2x). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (MeOH/DCM, gradijent, 0% do 10%) da se dobije jedinjenje 41 kao bela lepljiva pena (994 mg, 71% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,38-7,32 (m, 7H), 7,31-7,27 (m, 2H), 7,01 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 4,74 (s, 4H), 3,97 (d, 2H, J = 4,6 Hz), 3,92 (d, 2H, J = 5,3 Hz), 3,74 (d, 2H, J = 3,7 Hz), 3,27 (s, 3H), 0,94 (s, 18H), 0,11 (s, 12H).
Korak 6: Jedinjenje 41 (994 mg, 1,418 mmol) je suspendovano u MeOH (6,65 ml) i vodi (443 μl) i pročišćeno sa N2. Dodat je Pd/C (10% vlažan, 302 mg, 0,284 mmol) i H2je propušten tokom nekoliko minuta. Reakcija je mešana pod H2balonom preko noći. Rastvor je filtriran kroz celit i ispran sa MeOH i koncentrovan da se dobije čisto jedinjenje 42 (725 mg, 90% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,10-7,97 (m, 1H), 7,91-7,85 (m, 1H), 7,31-7,23 (m, 1H), 7,05 (s, 2H), 7,65 (s, 4H), 3,68-3,62 (m, 2H), 3,56-3,45 (m, 1H), 3,09 (s, 3H), 3,08-3,06 (m, 2H), 3,06-3,03 (m, 2H), 0,82 (s,
1 2
18H), 0,00 (s, 12H). LCMS = 5,574 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 567,30 (M+H).
Korak 7: Amin jedinjenje 42 (725 mg, 1,279 mmol) i mono metiladipat (246 mg, 1,535 mmol) su rastvoreni u DMF (6,5 ml). EDC·HCl (294 mg, 1,535 mmol) i HOBt (196 mg, 1,279 mmol) su dodati u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (447 μL, 2,56 mmol). Reakcija je mešana na rt preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (20 ml) i isprana sa sat’d NH4Cl, sat’d NaHCO3, vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatogafijom na silika gelu (MeOH/DCM, gradijent, 0% do 10%) da se dobije jedinjenje 43 (425 mg, 33% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,30 (s, 1H), 7,01 (s, 2H), 6,89-6,85 (m, 1H), 6,75-6,72 (m, 1H), 6,41-6,40 (m, 1H), 4,73 (s, 4H), 3,98-3,96 (m, 4H), 3,74 (bd, 2H, J = 3,5 Hz), 3,66 (s, 3H), 3,27 (s, 3H), 2,33 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,28 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 0,94 (s, 18H), 0,11 (s, 12H). LCMS = 7,709 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 709,35 (M+H).
Korak 8: Jedinjenje 43 (422 mg, 0,417 mmol) je rastvoreno u THF (1,89 ml) i vodi (189 μL). Dodata je HCl (vodena, 5 M)(833 μL, 4,17 mmol) i reakcija je mešana na rt tokom 2,5 h. Reakciona smeša je koncentrovana. Ostatku je dodat ACN (~ 15 ml) i koncentrovan je. Ovo je ponovljeno još dva puta da se dobije jedinjenje 44 kao bela pena (200 mg, 100% prinos). LCMS = 0,389 min (postupak od 8 min).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,09-8,04 (m, 2H), 7,93-7,90 (m, 1H), 7,30 (bs, 1H), 7,14 (s, 2H), 4,52 (s, 4H), 3,71-3,68 (m, 4H), 3,58 (s, 3H), 3,17 (bs, 3H), 2,22-2,18 (m, 2H), 2,15-2,12 (m, 2H), 1,53-1,47 (m, 4H).
1
Korak 9: Diol jedinjenje 44 (110 mg, 0,229 mmol) i CBr4(228 mg, 0,687 mmol) su rastvoreni u DMF (2,29 ml). Kada je PPh3(180 mg, 0,687 mmol) dodat u reakcionu smešu, reakcija je postala crveno-ružičasta sa blagom egzotermijom. Reakcija je mešana pod Ar tokom 6 h. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2/MeOH (10:1) i isprana je vodom i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko Na2SO4i koncentrovan. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (MeOH/CH2Cl2, gradijent, 0% do 10%) da se dobije jedinjenje 45 (30 mg, 22% prinos).
<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,46 (bs, 1H), 7,32-7,26 (m, 2H), 7,26-7,19 (m, 2H), 6,89-6,85 (m, 1H), 4,60 (d, 2H, J = 3,6 Hz), 4,48 (d, 2H, J = 3,9 Hz), 3,98 (d, 4H, J = 5,1 Hz), 3,76 (bs, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,30 (bs, 3H), 2,34 (bt, 2H, J = 6,7 Hz), 2,30 (bt, 2H, J = 6,6 Hz), 1,70-1,64 (m, 4H). LCMS = 4,326 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 605,10 (M+H).
Korak 10: Jedinjenje 46 je pripremljeno slično kao jedinjenje 11 u Primeru 1. Jedinjenje 46 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle prečišćavanja (40 mg, 59% prinos). LCMS = 4,751 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 1033,35 (M+H).
Korak 11: Jedinjenje 47 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Jedinjenje 47 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (14 mg,
1 4
32% prinos). LCMS = 5,857 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1035,7 (M+H).
Korak 12: Jedinjenje 48 je pripremljeno slično kao 22 u Primeru 2. Jedinjenje 48 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle silika čepa (7 mg, 100% prinos). LCMS = 4,817 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 1021,35 (M+H).
Korak 13: Jedinjenje 49 je pripremljeno slično kao jedinjenje 14 u Primeru 1. 2,5-dioksopirolidin-1-il2-(3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)-3,6,9,12-tetraokso-2,5,8,11-tetraazaheptadekan-17-oat, jedinjenje 49 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (6,5 mg, 74% prinos). LCMS = 5,805 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1118,7 (M+H).
Primer 5. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((R)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-6-oksoheksanoata (jedinjenje 80)
[0245]
1
Korak 1: (S)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)propanska kiselina (5 g, 22,40 mmol) i (R)-terc-butil 2-aminopropanoat hidrohlorid (4,48 g, 24,64 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (44,8 ml). Dodati su EDC·HCl (4,72 g, 24,64 mmol), HOBt (3,43 g, 22,40 mmol), i zatim DIPEA (9,75 ml, 56,0 mmol). Reakcija je mešana pod argonom na sobnoj temperaturi, preko noći. Reakciona smeša je razblažena dihlorometanom i zatim isprana zasićenim amonijum hloridom, zasićenim natrijum bikarbonatom, vodom, i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan. Sirovo ulje je prečišćeno hromatografijom na silika gelu (heksani/etil acetat) za prinos jedinjenja 71 (5,6 g, 71% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,39-7,34 (m, 5H), 6,54 (s, 1H) 5,28 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,47-4.43 (m, 1H), 4,48 (s, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,42-1,37 (m, 6H).
Korak 2: Jedinjenje 71 (5,6 g, 15,98 mmol) je rastvoreno u metanolu (50,7 ml) i vodi (2,54 ml). Rastvor je pročišćen argonom tokom pet minuta. Polako je dodavan paladijum na ugljeniku (vlažan, 10%) (0,850 g, 0,799 mmol). Reakcija je mešana preko noći pod atmosferom vodonika. Rastvor je filtriran kroz celit, ispran metanolom i koncentrovan. Ostatak je azeotropiran metanolom i acetonitrilom i rezultujuće ulje je smešteno direktno u visok vakuum dajući jedinjenje 72 (3,57 g, 100% prinos) koje je direktno upotrebljeno u sledećem koraku.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,67 (s, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,54-3,49 (m, 1H), 1,48 (s, 9H), 1,40 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
1
Korak 3: Jedinjenje 72 (3,57 g, 16,51 mmol) i mono metiladipat (2,69 ml, 18,16 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (55,0 ml). Dodati su EDC·HCl (3,48 g, 18,16 mmol) i HOBt (2,53 g, 16,51 mmol), zatim je dodat DIPEA (5,77 ml, 33,0 mmol). Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena dihlorometanom/metanolom (80 ml, 5:1) i isprana zasićenim amonijum hloridom, zasićenim natrijum bikarbonatom, i slanim rastvorom. Osušen je preko natrijum sulfata, filtriran i skinut. Jedinjenje je azeotropirano acetonitrilom (5x), zatim je ispumpano u visokom vakuumu na 35 °C dajući jedinjenje 73 (5,91 g, 100% prinos). Sirov materijal je prenet na sledeći korak bez prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6,67 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,22 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 4,56-4,49 (m, 1H), 4,46-4,38 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 2,37-2,33 (m, 2H), 2,27-2,24 (m, 2H), 1,70-1,68 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,40 (s, 3H), 1,38 (s, 3H).
Korak 4: Jedinjenje 73 (5,91 g, 16,5 mmol) je mešano u TFA (25,4 ml, 330 mmol) i dejonizovanoj vodi (1,3 ml) na sobnoj temperaturi tokom tri sata. Reakciona smeša je koncentrovana acetonitrilom i postavljena u visoki vakuum dok se nije osušila dajući sirovo jedinjenje 74 (4,99 g, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,44 (d, 1H, J = 7,2 Hz,), 6,97 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 4,81-4,73 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,39-2,32 (m, 2H ), 2,31-2,23 (m, 2H), 1,70-1,61 (m, 4H), 1,48 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,40 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
Korak 5: Jedinjenje 74 (4,8 g, 15,88 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom dihlorometanu (101 ml) i anhidrovanom metanolu (50,4 ml). Dodati su (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (2,316 g, 15,12 mmol) i EEDQ (7,48 g, 30.2 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi, preko noći. Rastvarač je skinut i sirov materijal prečišćen hromatografijom na silika gelu (dihlorometan/metanol) dajući jedinjenje 75
1
(1,65 g, 25% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,68 (s, 1H), 8,29 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 8,11 (d, 1H, J = 6,4 Hz), 7,52 (s, 2H), 6,97 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,45 (s, 4H), 4,39-4,32 (m, 1H), 4,28-4,21 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 2,30-2,27 (m, 2H), 2,17-2,13 (m, 2H), 1,54-1,45 (m, 4H) 1,30 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,20 (d, 3H, J = 7,2 Hz). MS (m/z): 460,2 (M Na)<+>.
Korak 6: Jedinjenje 75 (0,486 g, 1,111 mmol) i ugljenik tetrabromid (1,105 g, 3,33 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (11,11 ml). Dodat je trifenilfosfin (0,874 g, 3,33 mmol) i reakcija je mešana pod argonom tokom četiri sata. Reakciona smeša je razblažena sa DCM/MeOH (10:1) i isprana vodom i slanim rastvorom. Ona je osušena preko natrijum sulfata, filtrirana, i koncentrovana. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na silika gelu (DCM/MeOH) dajući jedinjenje 76 (250 mg, 40% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,82 (s, 1H), 8,38 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 8,17 (d, 1H, J = 6,0 Hz), 7,76 (s, 2H), 7,22 (s, 1H), 4,66 (s, 4H), 4,38-4,31 (m, 1H), 4,25-4,19 (m, 1H), 3,56 (s, 3H), 2,30-2,27 (m, 2H), 2,18-2,15 (m, 2H), 1,53-1,51 (m, 4H), 1,32 (d, 3H, J = 7,2 Hz ), 1,21 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
Korak 7: Jedinjenje 77 je pripremljeno slično kao 11 u Primeru 1. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na silika gelu (dihlorometan/metanol) dajući jedinjenje 77 (340 mg, 60% prinos, 77% čistoća). LCMS = 5,87 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 990,6 (M 1)<+>.
1
Korak 8: Jedinjenje 78 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Sirovi materijal je prečišćen putem RPHPLC (C18 kolona, acetonitril/voda) dajući jedinjenje 78 (103 mg, 30% prinos). LCMS = 6,65 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 992,7 (M 1)<+>.
Korak 9: Jedinjenje 78 je pripremljeno slično kao 22 u Primeru 2. Sirovi materijal je propušten kroz silika čep dajući jedinjenje 79 (38 mg, 55% prinos, 75% čistoće). LCMS = 5,83 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 978,6 (M 1)<+>.
Korak 10: Jedinjenje 80 je pripremljeno slično kao jedinjenje 14 u Primeru 1. Sirovi materijal je prečišćen putem RPHPLC (C18 kolona, acetonitril/voda) dajući 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso)-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((R)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-6-oksoheksanoat, jedinjenje 80 (6,5 mg, 30% prinos). LCMS = 6,53 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 1075,7 (M 1)<+>i 1097,7 (M Na)<+>.
1
Primer 6. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((R)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-6-oksoheksanoata, jedinjenja 90
[0246]
Korak 1: (S)-2-(((benziloksi)karbonil)amino)propanska kiselina (5 g, 22,40 mmol) i (S)-terc-butil 2-aminopropanoat hidrohlorid (4,48 g, 24,64 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (44,8 ml). Dodati su EDC·HCl (4,72 g, 24,64 mmol), HOBt (3,43 g, 22,40 mmol), i DIPEA (9,75 ml, 56,0 mmol). Reakcija je mešana pod argonom, na sobnoj temperaturi, preko noći. Reakciona smeša je razblažena dihlorometanom i zatim isprana zasićenim amonijum hloridom, zasićenim natrijum bikarbonatom, vodom, i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko natrijuma sulfata i koncentrovan. Sirovo ulje je prečišćeno hromatografijom na silika gelu (heksani/etil acetat) da se dobije jedinjenje 81 (6,7 g, 85% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,38-7,31 (m, 5H), 6,53-6,42 (m, 1H), 5,42-5,33 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,48-4,41 (m, 1H), 4,32-4,20 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,42 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,38 (d , 3H, J = 7,2 Hz).
Korak 2: Jedinjenje 81 (6,7 g, 19,12 mmol) je rastvoreno u metanolu (60,7 ml) i vodi (3,03 ml). Rastvor je pročišćen argonom tokom pet minuta. Polako je dodavan paladijum na ugljeniku (vlažan, 10%) (1,017 g, 0,956 mmol). Reakcija je mešana preko noći pod atmosferom vodonika. Rastvor je filtriran kroz celit, ispran metanolom i koncentrovan. Azeotropirano je metanolom i acetonitrilom i rezultujuće ulje je smešteno direktno u visoki vakuum dajući jedinjenje 82 (4,02 g, 97% prinos) koje je direktno upotrebljeno u sledećem koraku.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,78-7,63 (m,
11
1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,55-3,50 (m, 1H), 1,73 (s, 2H), 1,48 (s, 9H), 1,39 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
Korak 3: Jedinjenje 82 (4,02 g, 18,59 mmol) i mono metiladipat (3,03 ml, 20,45 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (62,0 ml). Dodati su EDC·HCl (3,92 g, 20,45 mmol), HOBt (2,85 g, 18,59 mmol), i DIPEA (6,49 ml, 37,2 mmol). Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena dihlormetanom/metanolom (150 ml, 5:1) i isprana zasićenim amonijum hloridom, zasićenim natrijum bikarbonatom, i slanim rastvorom. Osušen je preko natrijum sulfata, filtriran i skinut. Jedinjenje je azeotropirano acetonitrilom (5x), zatim je ispumpano u visokom vakuumu na 35 °C dajući jedinjenje 83 (6,66 g, 100% prinos). Sirovi materijal je prenet na sledeći korak bez prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6,75 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,44 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 4,52-4,44 (m, 1H), 4,43-4,36 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 2,35-2,29 (m, 2H), 2,25-2,18 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,36 (t, 6H, J = 6,0 Hz).
Korak 4: Jedinjenje 83 (5,91 g, 16,5 mmol) je mešano u TFA (28,6 ml, 372 mmol) i dejonizovanoj vodi (1,5 ml) na sobnoj temperaturi tokom tri sata. Reakciona smeša je koncentrovana acetonitrilom i postavljena u visoki vakuum, dajući sirovo jedinjenje 84 kao lepljivu čvrstu supstancu (5,88 g, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7,21 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,81 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 4,69-4,60 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,40-2,33 (m, 2H), 2,31-2,24 (m, 2H), 1,72-1,63 (m, 4H), 1,51-1,45 (m, 3H), 1,42-1,37 (m, 3H).
Korak 5: Jedinjenje 84 (5,6 g, 18,52 mmol) je rastvoreno u anhidrovanom dihlorometanu (118 ml) i anhidrovanom metanolu (58,8 ml). Dodati su (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (2,70 g, 17,64 mmol) i EEDQ (8,72 g, 35,3 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi, preko noći. Rastvarač je skinut i dodat je etil acetat. Rezultujuća kaša je filtrirana, isprana etil acetatom i osušena pod vakuumom/N2dajući jedinjenje 85 (2,79 g, 36% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,82 (s, 1H), 8,05, (d, 1H, J = 9,2 Hz), 8,01 (d, 1H, J = 7,2 Hz), 7,46 (s, 2H), 6,95 (3, 1H), 5,21-5,12 (m, 2H), 4,47-4,42 (m, 4H), 4,40-4,33 (m, 1H), 4,33-4,24 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,33-2,26 (m, 2H), 2,16-2,09 (m, 2H), 1,54-1,46 (m, 4H), 1,30 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,22 (d, 3H, J = 4,4 Hz).
Korak 6: Jedinjenje 85 (0,52 g, 1,189 mmol) i ugljenik tetrabromid (1,183 g, 3,57 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (11,89 ml). Dodat je trifenilfosfin (0,935 g, 3,57 mmol) i reakcija je mešana pod argononom tokom četiri sata. Reakciona smeša je razblažena sa DCM/MeOH (10:1) i isprana vodom i slanim rastvorom, osušena preko natrijum sulfata, filtrirana, i koncentrovana. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na silika gelu (DCM/MeOH) dajući jedinjenje 86 (262 mg, 39% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,01 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 8,03 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,67 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,70-4,64 (m, 4H), 4,40-4,32 (m, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,34-2,26 (m, 2H), 2,18-2,10 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 4H), 1,31 (d, 3H, J = 7,2 Hz ), 1,21 (d, 3H, J = 7,2 Hz).
Korak 7: Jedinjenje 87 je pripremljeno slično kao jedinjenje 11 u Primeru 1. Sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na silika gelu (dihlorometan/metanol) dajući jedinjenje 87 (336 mg, 74% prinos). LCMS = 5,91 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 990,6 (M 1)<+>.
Korak 8: Jedinjenje 88 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Sirovi materijal je prečišćen putem RPHPLC (C18 kolona, acetonitril/voda) dajući jedinjenje 88 (85,5 mg, 25% prinos). LCMS = 6,64 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 992,6 (M 1)<+>.
Korak 9: Jedinjenje 88 je pripremljeno slično kao 22 u Primeru 2. Sirovi materijal je propušten kroz silika čep dajući jedinjenje 89 (48,8 mg, 80% prinos). LCMS = 5,89 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 978,6 (M 1)<+>.
Korak 10: Jedinjenje 90 je pripremljeno slično kao 14 u Primeru 1. Sirovi materijal je prečišćen putem RPHPLC (C18 kolona, acetonitril/voda) dajući 2,5-dioksopirolidin-1-il 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((R)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-1-
11
oksopropan-2-il)amino)-1-oksopropan-2-il)amino)-6-oksoheksanoat, jedinjenje 90 (8,2 mg, 30% prinos). LCMS = 6,64 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 1075,4 (M 1)<+>.
Primer 7. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il 1-(3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)-1,4,7,10-tetraokso-2,5,8,11-tetraazatetradekan-14-oata (jedinjenje 63)
[0247]
Korak 1: Z-Gly-Gly-GlyOH jedinjenje 50 (1,0 g, 3,09 mmol) i β-alanin metilestar·HCl (453 mg, 3,25 mmol) su rastvoreni u DMF (12,37 ml). Dodati su EDC·HCl (623 mg, 3,25 mmol) i HOBt (497 mg, 3,25 mmol) u reakcionu smešu, zatim je dodat DIEA (1,08 ml, 6,19 mmol). Reakcija je mešana na rt preko noći. Sledeći dan, formiralo se puno belog taloga. Reakciona smeša je razblažena sa CH2Cl2/MeOH (5:1, 30 ml) i isprana sa sat’d NaHCO3, sat’d NH4Cl i slanim rastvorom. Organski sloj je postao mutan. Organskom sloju je dodat EtOAc (15 ml) za taloženje proizvoda. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je isprana vodom (10 ml) i CH3CN (2 x 15 ml) da se dobije čisto jedinjenje 51 kao beli prah (880 mg, 70% prinos) bez prečišćavanja.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,16 (bt, 1H, J = 5,4 Hz), 8,11 (bt, 1H, J = 5,6 Hz), 7,88-7,85 (m, 1H), 7,49 (bt, 1H, J = 5,5 Hz), 7,40-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 3,74 (d, 2H, J = 5,5 Hz), 3,67 (t, 4H, J = 6,2 Hz), 3,60 (s, 3H), 3,29 (q, 1H, J = 6,4 Hz), 2,47 (t, 3H, J = 6,9 Hz).
Korak 2: Jedinjenje 51 (876 mg, 2,145 mmol) je rastvoreno u MeOH (20,4 ml) i vodi (1,02 ml) i pročišćeno sa Ar. Rastvor je oslobođen gasa tokom 5 min. Polako je dodavan Pd/C (10%, vlažan sa 50% vode, 228 mg). H2je propuštan kroz balon tokom minuta. Reakcija je mešana pod H2balonom preko noći. Dodata je H2O (∼ 3 ml) u reakcionu smešu kako bi se rastvorila sva formirana bela čvrsta supstanca. Rastvor je zatim filtriran kroz celit i filter kolač je ispran sa MeOH (30 ml) i koncentrovan. Ostatak je rastvoren u CH3CN (20 ml) i koncentrovan. Ovo je ponovljeno još dva puta. Rezultujuća gumasta čvrsta supstanca je istaložena sa dodatkom CH3CN (~ 15 ml). Gusta bela kaša je mešana tokom 10 min, filtrirana i isprana sa CH3CN. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom/N2tokom 1,5 h, da se dobije jedinjenje 52 kao bela čvrsta supstanca (450 mg, 76% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,18-8,12 (m, 2H), 7,88 (t, 1H, J = 5,4 Hz), 3,75 (s, 2H), 3,65 (d, 2H, J = 5,9 Hz), 3,6 (s, 3H), 3,33-3,27 (m, 4H), 2,47 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,94 (bs, 1H).
Korak 3: NaOH (1,665 g, 41,6 mmol) je dodat u mešani rastvor trimetil benzen-1,3,5-trikarboksilat jedinjenje 53 (5 g, 19,82 mmol) u MeOH (66,1 ml) i vodi (13,22 ml). Reakciona smeša je refluksirana pod Ar tokom 3 h. Formiralo se puno belog taloga. Rastvor je ohlađen do rt i razblažen sa H2O sve dok sva čvrsta supstanca nije rastvorena. Smeša je zakišeljena na pH ∼ 2-3 sa vodenom 5 N HCl, ekstrahovana sa EtOAc (3x), osušena preko Na2SO4, filtrirana i koncentrovana. Sirovi proizvod je rastvoren u vrućem EtOAc (50 ml) i polako ohlađen do rt. Talog je filtriran (talog je nusproizvod, a ne proizvod). Matična tečnost je koncentrovana da se dobije jedinjenje 54 kao bela čvrsta supstanca (3,45 g, 78% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13,62 (bs, 2H), 8,65 (s, 3H), 3,93 (s, 3H). LCMS = 3,209 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 244,90 (M+H).
Korak 4: Diacid jedinjenje 54 (1,0 g, 4,46 mmol) je rastvoreno u THF (17,84 ml). Rastvor je ohlađen do 0 °C i BH3·DMS (2 M u THF) (8,92 ml, 17,84 mmol) je polako
11
dodavan pod Ar. Reakcija je mešana na 0 °C tokom 5 min, zatim je zagrevana do rt i mešana preko noći. Reakcija je izložena vazduhu i polako je ugašena sa MeOH, zatim je polako dodavana H2O dok nije primećen prestanak razvijanja gasa. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2x) i slojevi su razdvojeni. Organski slojevi su isprani vodenim ∼ 3% H2O2, aq. rastvorom limunske kiseline i slanim rastvorom, osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 20% do 100%) da se dobije diol jedinjenje 55 kao bela čvrsta supstanca (385 mg, 44% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,81 (s, 2H), 7,52 (s, 1H), 5,33 (bs, 2H), 4,56 (s, 4H), 3,86 (s, 3H).
Korak 5: Diol jedinjenje 55 (320 mg, 1,631 mmol) je rastvoreno u DCM (10,9 ml) pod Ar. Rastvor je ohlađen na -5 °C i dodat je TEA (0,568 ml, 4,08 mmol), zatim je polako dodavan MsCl (0,292 ml, 3,75 mmol), kada je boja odmah po dodavanju postala žuta, zatim tamno crvena/smeđa. Reakciona smeša je mešana na -5 °C pod Ar tokom 1,5 h. Reakciona smeša je ugašena ledenom vodom i ekstrahovana sa EtOAc (2x). Organski sloj je ispran vodom (2x), osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan da se dobije sirovo dimezilat jedinjenje 56 (435 mg, 76% prinos).
Korak 6: Dimezilat jedinjenje 56 (435 mg, 1,11 mmol) je rastvoreno u DMF (5,55 ml). Dodato je IGN monomer jedinjenje 10 (719 mg, 2,444 mmol), zatimje dodat K2CO3(384 mg, 2,78 mmol) i mešano na rt pod Ar preko noći. Dodata je voda (20 ml) da se proizvod istaloži. Kaša je mešana tokom 5 min, filtrirana i osušena pod vakuumom/N2tokom 1,5 h. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (EtOAc/heksani, gradijent, 50% do 100%; zatim 5% MeOH/DCM) da se dobije
11
jedinjenje 57 kao žuta čvrsta supstanca (535 mg, 64% prinos, 2 koraka). LCMS = 6,973 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 749,4 (M+H).
Korak 7: Jedinjenje 57 (100 mg, 0,134 mmol) je rastvoreno u DCE (1,34 ml). Dodat je trimetilstananol (362 mg, 2,003 mmol) i zagrevan na 80 °C preko noći. Reakciona smeša je ohlađena do rt i razblažena vodom. Vodeni sloj je zakišeljen na pH ~ 4 sa 1 M HCl i ekstrahovan sa DCM (3x), osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan. Sirovi proizvod je proteran kroz kratki silika čep i ispran sa DCM/MeOH (10:1, 50 ml) i koncentrovan da se dobije jedinjenje 58 kao bledo-žuta čvrsta supstanca (100 mg, 100% prinos). LCMS = 5,872 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 735,3 (M+H).
Korak 8: Kiselo jedinjenje 58 (80 mg, 0,087 mmol) i amin jedinjenje 52 (36 mg, 0,131 mmol) su rastvorena u DMF (871 μL). Dodati su EDC·HCl (25 mg, 0,131 mmol) i DMAP (10,6 mg, 0,087 mmol) i mešani na rt tokom 4 h. Dodata je voda (4 ml) da se proizvod istaloži. Kaša je mešana tokom 5 min, filtrirana i sušena pod vakuumom/N2. Sirovi ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (MeOH/DCM, gradijent, 0% do 20%) da se dobije jedinjenje 60 kao žuta čvrsta supstanca (37 mg, 43% prinos). LCMS = 4,605 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 991,35 (M+H).
11
Korak 9: Jedinjenje 61 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Jedinjenje 61 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (8 mg, 25% prinos). LCMS = 5,421 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 993,7 (M+H).
Korak 10: Jedinjenje 62 je pripremljeno slično kao jedinjenje 22 u Primeru 2. Sirovo jedinjenje 62 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle proterivanja kroz kratki silika čep (13 mg, 90% prinos). LCMS = 4,693 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 979,35 (M+H).
Korak 11: Jedinjenje 63 je pripremljeno slično kao jedinjenje 14 u Primeru 1. 2,5-dioksopirolidin-1-il1-(3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)-1,4,7,10-tetraokso-2,5,8,11-tetraazatetradekan-14-oat, jedinjenje 63 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (4 mg, 31% prinos). LCMS = 5,495 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1076,7 (M+H).
Primer 8. Sinteza 2,5-dioksopirolidin-1-il3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)benzamido)propanamido)propanamido)propanoata (jedinjenje 70)
[0248]
11
Korak 1: Z-L-Ala-L-Ala-OH jedinjenje 64 (3,0 g, 10,19 mmol) i β-alanin metilestar·HCl (1,565 g, 11,21 mmol) su rastvoreni u DMF (20,39 ml). Dodati su EDC·HCl (2,150 g, 11,21 mmol) i HOBt (1,561 g, 10,19 mmol), zatim je dodat DIPEA (4,44 ml, 25,5 mmol). Reakcija je mešana na rt pod Ar preko noći. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc i isprana sa sat’d NH4Cl, sat’d NaHCO3i slanim rastvorom. Kada su organskom sloju dodati heksani, rastvor je postao mutan sa talogom. Kaša je mešana tokom nekoliko minuta, filtrirana i isprane su čvrste supstance sa EtOAc/heksani (3:1). Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom/N2da se dobije čisto jedinjenje 65 kao bela čvrsta supstanca (3,11 g, 80% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,91 (d, 2H, J = 7,0 Hz), 7,46 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 6,39-7,30 (m, 5H), 5,02 (d, 2H, J = 2,3 Hz), 4,20 (p, 1H, J = 7,2 Hz), 4,04 (p, 1H, J = 7,3 Hz), 3,59 (s, 3H), 3,30-3,22 (m, 1H), 2,45 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 1,18 (očigledno t, 6H, J = 7,2 Hz), LCMS = 3,942 min (postupak od 8 min), Uočena masa (ESI<+>): 380,10 (M+H).
Korak 2: Jedinjenje 65 (1,0 g, 2,64 mmol) je rastvoreno u metanolu (12,55 ml), vodi (0,628 ml) i THF (2 ml). Rastvor je pročišćen sa Ar i zatim oslobođen gasa tokom 5 min. Polako je dodavan Pd/C (10%, vlažan sa 50% vode, 0,140 g). H2je propuštan u rastvor tokom minuta i reakcija je dodatno mešana pod H2balonom (1 atm) preko noći. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa MeOH (30 ml) i koncentrovana. U ostatak je dodat CH3CN (15 ml) i koncentrovan. To je ponovljeno još dva puta da se dobije jedinjenje 66 kao prljavo-bela čvrsta supstanca (650 mg, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,03-7,99 (m, 2H), 4,24-4,18 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,31-3,22 (m, 5H), 2,46 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 1,17 (d, 3H, J = 7,0 Hz), 1,12 (d, 3H, J = 6,9 Hz).
11
Korak 3: Jedinjenje 67 je pripremljeno slično kao 60 u Primeru 7. Jedinjenje 67 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle fleš hromatografije na silika gelu (69 mg, 53% prinos). LCMS = 4,843 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 962,25 (M+H).
Korak 4: Jedinjenje 68 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Jedinjenje 68 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (11,5 mg, 19% prinos). LCMS = 5,136 min (postupak od 8 min). Uočena masa (ESI<+>): 964,35 (M+H).
Korak 5: Jedinjenje 69 je pripremljeno slično kao jedinjenje 22 u Primeru 2. Sirovo jedinjenje 69 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca posle proterivanja kroz kratki silika čep (13 mg, 100% prinos). LCMS = 5,640 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 950,4 (M+H).
12
Korak 6: Jedinjenje 70 je pripremljeno slično kao jedinjenje 14 u Primeru 1. 2,5-dioksopirolidin-1-il-3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)benzamido)propanamido)propanamido)propanoat, jedinjenje 70 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (5 mg, 35% prinos). LCMS = 6,138 min (postupak od 15 min). Uočena masa (ESI<+>): 1047,4 (M+H).
Primer 9. Sinteza (12S, 12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-merkapto-4-metilpentanamido)acetamido)acetamido)acetamido)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)benzil)oksi)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-12-sulfonske kiseline (jedinjenje 98)
[0249]
Korak 1: Jedinjenje 4 (2,0 g, 8,15 mmol) i 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanska kiselina (1,743 g, 8,97 mmol) su rastvoreni u anhidrovanom DMF (27,2 ml). Dodati su EDC·HCl (1,719 g, 8,97 mmol) i HOBt (1,249 g, 8,15 mmol), zatim je dodat DIPEA (2,85 ml, 16,31 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je razblažena dihlorometanom/metanolom (5:1) i isprana zasićenim amonijum hloridom, zasićenim natrijum bikarbonatom, i slanim rastvorom. Osušena je preko natrijum sulfata, filtrirana i skinuta. Sirovo ulje je azeotropirano acetonitrilom (3x), zatim je ispumpano u visoki vac na 35 °C tokom oko 1,5 sata dajući jedinjenje 91, koje je preuzeto bez daljeg prečišćavanja (3,44 g, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,18-8,09 (m, 3H), 3,76-3,68 (m, 6H), 2,41 (s, 3H), 2,28-2,21 (m, 2H), 1,84-1,77 (m, 2H), 1,41 (s, 9H), 1,25 (s, 6H).
Korak 2: Jedinjenje 91 (3,44 g, 8,15 mmol) je mešano u TFA (12,56 ml, 163 mmol) i dejonizovanoj vodi (0,65 ml) na sobnoj temperaturi tokom 3,5 sata. Reakcija je razblažena acetonitrilom i uparena dok se nije osušila. Sirova čvrsta supstanca je skašena etil acetatom, filtrirana i isprana etil acetatom i zatim dihlorometanom/metanolom (1:1) dajući jedinjenje 92 (2,98 g, 100% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,19-8,08 (m, 3H), 3,80-3,68 (m, 6H), 2,41 (s, 3H), 2,28-2,20 (m, 2H), 1,85-1,76 (m, 2H), 1,25 (s, 6H).
Korak 3: Jedinjenje 92 (1,74 g, 4,76 mmol) je rastvoreno u dihlorometanu (30,2 ml) i metanolu (15,11 ml). Dodati su N-etoksikarbonil-2-etoksi-1,2-dihidrokvinolin (2,243 g, 9,07 mmol) i (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (0,695 g, 4,53 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarač je uklonjen i dodat je etil acetat. Čvrsta supstanca je filtrirana kroz celit i isprana etil acetatom, i zatim metanolom. Filtrat je uparen i prečišćen hromatografijom na silika gelu (dihlorometan/metanol) dajući jedinjenje 93 (569 mg, 25% prinos).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9,74 (s, 1H), 8,24-8,15 (m, 3H), 7,45 (s, 2H), 6,96 (s, 1H), 5,17 (t, 2H, J = 5,6 Hz), 4,45 (d, 4H, J = 5,6 Hz,), 3,87 (d, 2H, J = 6,0 Hz,), 3,77 (d, 2H, J = 6,0 Hz,), 3,73 (d, 2H, J = 5,6 Hz,), 2,40 (s, 3H), 2,28-2,21 (m, 2H), 1,83-1,76 (m, 2H), 1,24 (s, 6H).
Korak 4: Jedinjenje 93 (305 mg, 0,609 mmol) je suspendovano u anhidrovanom DCM (5,992 ml). Anhidrovani DMF je dodavan sve dok rastvor nije postao homogen (~2,5 ml). Rastvor je ohlađen do -10 °C u kupci aceton/suvi led. Dodat je trietilamin (0,425 ml, 3,05 mmol), i zatim je dodat metansulfonski anhidrid (274 mg, 1,523 mmol). Smeša je mešana na -10 °C tokom 1 sata. Reakcija je ugašena ledenom vodom i ekstrahovana hladnim etil acetatom/metanolom (20:1). Organski sloj je ispran ledenom vodom i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan. Sirovi materijal je osušen u visokom vakuumu dajući jedinjenje 94 (380 mg, 95% prinos). LCMS = 4,2 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 655,0 (M-1)-.
Korak 5: Jedinjenje 95 je pripremljeno slično kao jedinjenje 57 u Primeru 7. Sirova čvrsta supstanca je rastvorena u dihlorometanu/metanolu (10:1) isprana vodom i organski je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je uklonjen in vacuo i prečišćen hromatografijom na silika gelu (dihlorometan/metanol) dajući jedinjenje 95 (445 mg, 42% prinos, 54% čistoća). LCMS = 6,64 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 1053,4 (M 1)<+>i 1051,3 (M -1)-.
Korak 6: Jedinjenje 95 (445 mg, 0,423 mmol) je rastvoreno u 1,2-dihloroetanu (2,82 ml). Dodat je natrijum triacitoksiborohidrid (80 mg, 0,359 mmol) na sobnoj temperaturi i mešan tokom 1 sata. Reakcija je razblažena dihlorometanom i isprana zasićenim amonijum hloridom. Organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen dajući smešu jedinjenja 95, 96, i 96a (496 mg). Ova sirova smeša je rastvorena u 2-propanolu (39,17 ml) i vodi (19,59 ml). Dodat je natrijum bisulfit (245 mg, 2,35 mmol) i mešano je na sobnoj temperaturi tokom 3,5 sata. Smeša je zamrznuta i liofilizovana dajući belu
12
pahuljastu čvrstu supstancu koja je prečišćena pomoću RPHPLC (C18, acetonitril/voda) dajući jedinjenje 97 (54 mg, 10% prinos) i jedinjenje 96a (24 mg, 5% prinos). LCMS (jedinjenje 97) = 4,83 min (postupak od 15 min) i LCMS (jedinjenje 96a) = 8,05 min (postupak od 15 min).
Korak 7: U mešani rastvor jedinjenja 97 (54 mg, 0,047 mmol) u CH3CN (3,85 ml) dodat je sveže pripremljen TCEP/pH 6,5 puferski rastvor (TCEP·HCl (46,7 mg) je rastvoren u nekoliko kapi dejonizovane vode, zatim je dodat zasićeni natrijum bikarbonat kap po kap do pH ∼ 6,5. Rastvor je razblažen sa 0,55 ml pH = 6,5, 1 M natrijum fosfatnog pufera) i metanol (2,75 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 sata zatim zamrznuta i liofilizovana. Čvrsta supstanca je prečišćena pomoću RPHPLC (C18, acetonitril/voda) dajući (12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-merkapto-4-metilpentanamido)acetamido)acetamido)acetamido)-5-((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)benzil)oksi)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-12-sulfonsku kiselinu, jedinjenje 98 (2 mg, 4% prinos). LCMS = 4,32 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 1089,3 (M-l)-.
Primer 10. Sinteza N-(2-((2-((2-((3,5-bis((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)-4-merkapto-4-metilpentanamida (jedinjenje 99)
[0250]
[0251] Jedinjenje 99 je pripremljeno slično kao jedinjenje 98 u Primeru 9. N-(2-((2-((2-((3,5-bis((((S)-8-metoksi-6-okso-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oksi)metil)fenil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)amino)-2-oksoetil)-4-merkapto-4-metilpentanamid, jedinjenje 99 je dobijeno kao bela čvrsta supstanca posle C18 prečišćavanja (6,3 mg, 27% prinos). LCMS = 7,26 min (postupak od 15 min). MS (m/z): 1033,5 (M+Na)<+>.
Primer 11. Pripremanje huMOV19-14
[0252] Reakciji koja sadrži 2,0 mg/ml huMOV19 antitela i 8 molarnih ekvivalenata jedinjenja 14 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 15% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 6 sati na 25 °C.
[0253] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 250 mM glicin, 10 mM histidin, 1% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum-bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 20 sati na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 20.000 MWCO).
[0254] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 3,0 IGN91 molekula povezana po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.280 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 14, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 90% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <0,1% nekonjugovanog jedinjenja 14 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi), i krajnju koncentraciju proteina od 0,78 mg/ml. Analizom gel čipa utvrđeno je da je konjugovano antitelo > 87% intaktno. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.7A.
Primer 12. Pripremanje huMOV19-sulfo-SPDB-98
[0255] In situ mešavina koja sadrži krajnje koncentracije od 3,9 mM jedinjenja 98 i 3 mM sulfo-SPDB linkera u DMA koji sadrži 10 mM N,N-diizopropiletil amina (DIPEA) je inkubirana tokom 60 min pre dodavanja 20 puta u višku rezultujućeg jedinjenja 98-sulfo-SPDB-NHS u reakciju koja sadrži 4 mg/ml huMOV19 antitela u 15 mM HEPES pH 8,5 (90:10 voda:DMA). Rastvoru je omogućeno da konjuguje preko noći na 25 °C.
[0256] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 100 mM arginin, 20 mM histidin, 2% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2
12
upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu preko noći na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 10.000 MWCO).
[0257] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 3,7 molekula jedinjenja 98 povezanih po antitelu (pomoću SEC upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.484 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 98, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 99% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), i krajnju koncentraciju proteina od 0,18 mg/ml. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.7A.
Primer 13. Pripremanje huMOV19-35
[0258] Reakciji koja sadrži 2,5 mg/ml huMOV19 antitela i 5 molarnih ekvivalenata jedinjenja 35, (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 15% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 6 sati na 25 °C.
[0259] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 250 mM glicin, 10 mM histidin, 1% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 8 sati na sobnoj temperaturi koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 10.000 MWCO).
[0260] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 2,9 molekula jedinjenja 35 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330
nm= 15.484 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za IGN128, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 97% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <1% nekonjugovanog jedinjenja 35 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi) i krajnju koncentraciju proteina od 1,4 mg/ml. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL. 7A.
Primer 14. Pripremanje huMOV19-63
[0261] Reakciji koja sadrži 2,0 mg/ml huMOV19 antitela i 7 molarnih ekvivalenata jedinjenja 63 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 15% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 6 sati na 25 °C.
12
[0262] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 250 mM glicin, 10 mM histidin, 1% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 20 sati na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 20.000 MWCO).
[0263] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 2,7 molekula jedinjenja 63 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330
nm= 15.280 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za IGN131, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 99% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <0,1% nekonjugovanog jedinjenja 63 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi) i krajnju koncentraciju proteina od 1,6 mg/ml. Analizom gel čipa utvrđeno je da je konjugovano antitelo > 90% intaktno. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.7B.
Primer 15. Pripremanje huMOV19-80
[0264] Reakciji koja sadrži 2,0 mg/ml huMOV19 antitela i 7 molarnih ekvivalenata jedinjenja 80 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 15% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 6 sati na 25 °C.
[0265] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 250 mM glicin, 10 mM histidin, 1% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 20 sati na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 20.000 MWCO).
[0266] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 2,5 molekula jedinjenja 80 povezana po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.280 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 80, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 99% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <0,1% nekonjugovanog jedinjenja 80 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi) i krajnju koncentraciju proteina od 2,4 mg/ml. Analizom gel čipa utvrđeno je da je konjugovano antitelo > 90% intaktno.
Primer 16. Pripremanje huMOV19-90
12
[0267] Reakcija koja sadrži 2,0 mg/ml huMOV19 antitela i 3,9 molarnih ekvivalenata jedinjenja 90 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 95:5 DMA:50 mM sukcinat pH 5,5 tokom 4 sata na 25 °C) u 15 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 15% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču inkubirana je tokom 4 sata na 25 °C. Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 10 mM sukcinat, 50 mM natrijum hlorid, 8,5% tež./zapr. saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit pH 6,2 formulaciju pufera upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 4 sata na sobnoj temperaturi i zatim preko noći na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 30.000 MWCO).
[0268] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima krajnju koncentraciju proteina od 1,8 mg/ml i prosečno 2,7 molekula jedinjenja 90 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.280 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za IGN152, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 98,3% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije); i <1,1% nekonjugovanog jedinjenja 90 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi). Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.
7B.
Primer 17. Pripremanje huMOV19-49
[0269] Reakciji koja sadrži 2,0 mg/ml huMOV19 antitela i 5 molarnih ekvivalenata jedinjenja 49 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 10% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 4 sata na 25 °C.
[0270] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 250 mM glicin, 10 mM histidin, 1% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 4 sata na sobnoj temperaturi koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 20.000 MWCO).
[0271] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 2,8 molekula jedinjenja 49 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330
nm= 15.280 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 49, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 94% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <0,1% nekonjugovanog jedinjenja 49 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj
12
fazi) i krajnju koncentraciju proteina od 1,5 mg/ml. Analizom gel čipa utvrđeno je da je konjugovano antitelo >95% intaktno. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.7C.
Primer 18. Pripremanje huMOV19-sulfo-SPDB-99
[0272] In situ mešavina koja sadrži krajnje koncentracije od 1,95 mM jedinjenja 99 i 1,5 mM sulfo-SPDB linkera u DMA koji sadrži 10 mM N,N-diizopropiletil amina (DIPEA) je inkubirana tokom 20 min pre stavljanja kape sa 4 mM maleimido-propanskom kiselinom MPA. 6 puta u višku rezultujućeg jedinjenja 99-sulfo-SPDB-NHS dodato je u reakciju koja sadrži 2,5 mg/ml huMOV19 antitela u 15 mM HEPES pH 8,5 (82:18 voda:DMA). Rastvoru je omogućeno da konjuguje preko noći na 25 °C.
[0273] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 20 mM histidin, 50 mM natrijum hlorid, 8,5% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu preko noći na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 10.000 MWCO).
[0274] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 1,6 molekula jedinjenja 99 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330
nm= 15.484 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 99, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 99% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), i krajnju koncentraciju proteina od 0,59 mg/ml. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.7C.
Primer 19. Pripremanje huMOV19-70
[0275] Reakciji koja sadrži 2,0 mg/ml huMOV19 antitela i 5 molarnih ekvivalenata jedinjenja 70 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 10% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 4 sata na 25 °C.
[0276] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 20 mM histidin, 100 mM arginin, 2% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Posle prečišćavanja, dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 18 sati na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 20.000 MWCO).
12
[0277] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 3,0 molekula jedinjenja 70 povezana po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.484 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 70, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 94% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <0,1% nekonjugovanog jedinjenja 70 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi) i krajnju koncentraciju proteina od 1,3 mg/ml.
Primer 20. Pripremanje huMOV19-23
[0278] Reakciji koja sadrži 2,5 mg/ml huMOV19 antitela i 4 molarna ekvivalenta jedinjenja 23 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:voda) u 50 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 15% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču omogućeno je da konjuguje tokom 6 sati na 25 °C.
[0279] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 250 mM glicin, 10 mM histidin, 1% saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit formulaciju pufera pH 6,2 upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 8 sati na sobnoj temperaturi koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 10.000 MWCO).
[0280] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 2,8 molekula jedinjenja 23 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330
nm= 15.484 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 23, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 98% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), <3% nekonjugovanog jedinjenja 23 (pomoću taloženja acetonom, analizom HPLC na reverznoj fazi) i krajnju koncentraciju proteina od 1,3 mg/ml. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL. 7D.
Primer 21. Test protočne citometrije za afinitet vezivanja huMOV19-14, huMOV19-90 i huMOV19-107 konjugata
[0281] 100 μl/bunariću huMOV19-14, huMOV19-90 ili huMOV19-107 konjugata ili huMOV19 antitela razblaženo je u FACS puferu (1% BSA, 1x PBS) u ploči sa 96 bunarića (Falcon, zaobljeno dno) na početnu koncentraciju od 3 x 10<-8>M u duplikatu i serijski razblaženo 3 puta u FACS puferu na 4 °C. T47D ćelije (humani tumor dojke) uzgajane u RPMI-1640 (Life Technologies) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS
1
(Life Technologies), 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies) i 0,2 IU goveđeg insulina/ml (Sigma), isprane su jednom u PBS i uklonjene versenom (Life Technogies). T47D ćelije su resuspendovane u medijumu za rast (videti iznad) kako bi se neutralizovao versen i brojane su na Coulter brojaču. Ćelije su zatim isprane dva puta hladnim FACS puferom, centrifugirane između ispiranja na 1200 rpm tokom 5 minuta. 100 μl/ml 2x10<4>ćelija/bunariću je dodato u bunariće koji sadrže konjugat, antitelo ili samo FACS pufer i inkubirane na 4 °C tokom 2 sata. Posle inkubacije, ćelije su centrifugirane kao ranije i isprane jednom u 200 μl/bunariću hladnog FACS pufera. Ćelije su bile zatim obojene sa 200 μl/bunariću FITC-konjugovanog kozjeg anti humanog-IgG-Fcy sekundarnog antitela (uključene kontrole su neobojene ćelije i one obojene samo sekundarnim antitelom) tokom 40 min na 4 °C, centrifugirane i isprane jednom u 200 μl/bunariću hladnog PBS-D. Ćelije su fiksirane u 200 μl/bunariću 1% formaldehida/PBS-D i čuvane na 4 °C. Posle skladištenja, obojenje ćelijske površine konjugata ili antitela detektovano je upotrebom protočne citotometrije na FACS Calibur (BD Biosciences). Geometrijske srednje vrednosti prikazane su u grafičkom formatu prema log koncentraciji konjugata ili antitela upotrebom GraphPad Prism i izračunat je EC50nelinearnom logističkom regresionom analizom sa 4 parametra.
[0282] Test vezivanja je ponovljen za huMOV19-90 konjugat i podaci su prikazani na SL.
15B.
[0283] Kao što je prikazano na SL. 1, SL.15A, SL. 15B i SL.20, konjugati se vezuju slično za površinu T47D ćelija koje eksprimiraju ciljni antigen kao nekonjugovano antitelo u protočnoj citotometriji, pokazujući tako da vezivanje nije pogođeno postupkom konjugacije.
Primer 22. Test citotoksičnosti za huMOV19-14 konjugat
[0284] 100 μl/bunariću huMOV19-14 konjugata je razblaženo u RPMI-1640 (Life Technologies) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS (Life Technologies), 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies) u ploči sa 96 bunarića (Corning, ravno dno) na početne koncentracije od 3,5x10<-9>M do 3,5x10<-8>M u triplikatu i serijski razblaženo 3 puta u medijumu iznad na temperaturi okoline. KB ćelije (tumor bukalnog epitela) uzgajane u EMEM (ATCC) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS (Life Technologies) i 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies) isprane su jednom u PBS i uklonjene sa 0,05% tripsin-EDTA (Life Technologies). KB ćelije su resuspendovane u medijumu za rast (videti iznad) kako bi se neutralizovao tripsin i brojane su na Coulter brojaču. 100 μl/ml 1x10<3>ćelija/bunariću je dodato u bunariće koji sadrže konjugat ili samo
1 1
medijum i inkubirano u inkubatoru na 37 °C sa 5% CO2tokom 5 dana sa i bez 1 μM blokirajućeg anti-FOLR1 antitela (huMOV19). Ukupna zapremina je 200 μl/bunariću. Posle inkubacije, vijabilnost ćelija je analizirana dodavanjem 20 μl/bunariću WST-8 (Dojindo) i omogućeno je da se razvija tokom 2 sata. Apsorbanca je očitana na čitaču ploča na 450 i 620 nm. Apsorbance na 620 nm su oduzete od apsorbanci na 450 nm. Pozadina u bunarićima koji sadrže samo medijum dodatno je oduzeta od korigovanih apsorbanci i preživela frakcija (SF -surviving fraction) netretiranih ćelija je izračunata u Excel-u. XY grafikon ADC koncentracije (M) vs. SF kreiran je upotrebom Graph Pad Prism.
[0285] Kao što je prikazano na SL.2, konjugat je visoko potentan prema KB ćelijama sa IC50od 4x10<-12>M. Dodavanje viška nekonjugovanog antitela značajno smanjuje citotoksični efekat, demonstrirajući specifičnost za antigen.
Primer 23. Test citotoksičnosti prema posmatraču za huMOV19-14 i huMOV19-90 konjugate
[0286] 100 μl/bunariću huMOV19-14 ili huMOV19-90 je razblaženo u RPMI-1640 (Life Technologies) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS (Life Technologies), 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies) i βME (Life Technologies) u ploči sa 96 bunarića (Falcon, zaobljeno dno) na koncentracije između 1 e-10 M do 4 e-10 M u šestoplikatu. I 300.19 ćelije (miš) koje eksprimiraju rekombinantni FOLR1 (FR1#14) ili bez ekspresionog vektora (roditeljske) su brojane na Coulter brojaču. 50 μl/ml 1000 FR1#14 ćelija/bunariću je dodato u bunariće koji sadrže konjugat ili samo medijum, 50 μl/ml 2000 roditeljskih ćelija/bunariću je dodato u bunariće koji sadrže konjugat ili samo medijum i obe i FR1#14 i roditeljske ćelije su dodate zajedno u bunariće koji sadrže konjugat ili samo medijum. Sve ploče su inkubirane u inkubatoru na 37 °C sa 5% CO2tokom 4 dana. Ukupna zapremina je 150 μl/bunariću. Posle inkubacije, ćelijska vijabilnost je analizirana dodavanjem 75 μl po bunariću Cell Titer Glo (Promega) i omogućeno je da se razvija tokom 45 min. Luminescencija je očitana na luminometru i pozadina u bunarićima koji sadrže samo medijum oduzeta je od svih vrednosti. Bar grafikon proseka svakog tretmana ćelija bio je prikazan grafičkim putem upotrebom Graph Pad Prism.
[0287] Kao što je prikazano na SL. 3, huMOV19-14 konjugat pokazuje slab citotoksični efekat posmatrača na susedne antigen-negativne ćelije.
[0288] Kao što je prikazano na SL. 13, huMOV19-90 konjugat pokazuje jaku aktivnost ubijanja posmatrača.
1 2
Primer 24. In vitro test citotoksičnosti za huMy9-6-14 konjugat
[0289] Razblaženja konjugata dodata su u bunariće ploča sa 96 bunarića koji sadrže 2 x 10<3>do 1 x 10<4>ćelija po bunariću u odgovarajućem medijumu za rast. Kontrolni bunarići koji sadrže ćelije i medijum ali im nedostaju test jedinjenja, i bunarići koji sadrže samo medijum, bili su uključeni u svaku testnu ploču. Ploče su inkubirane tokom četiri do šest dana na 37 °C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 6% CO2. WST-8 reagens, 10% zapr./zapr. (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD), je zatim dodat u bunariće, i ploče su inkubirane na 37 °C tokom 2 do 6 h. Zatim je izmerena apsorbanca na spektrofotometru za očitavanje ploča u režimu dualne talasne dužine 450 nm/650 nm, i oduzeta je apsorbanca na 650 nm (nespecifično rasipanje svetlosti od strane ćelija). Očigledna preživela frakcija ćelija u svakom bunariću izračunata je prvo korekcijom za pozadinsku apsorbancu medijuma, i zatim deljenjem svake vrednosti sa prosekom vrednosti u kontrolnim bunarićima (netretirane ćelije).
[0290] Kao što je prikazano na SL. 3, konjugat je visoko potentan protiv raznih antigenpozitivnih ćelija kancera; dok antigen negativne L-540 ćelije ostaju vijabilne kada su izložene istom konjugatu.
Primer 25. Test citotoksičnosti prema posmatraču za huMy9-6-14 konjugat
[0291] Preliminarni testovi su urađeni kako bi se odredila koncentracija huMy9-6-14 koja nije citotoksična za antigen-negativne RADA-1 ćelije, ali je ubila sve antigen-pozitivne KARA ćelije. RADA-1 (500 ćelija po bunariću) i KARA (500, 1000, 2000, 4000 ćelija po bunariću) je zasejano u ploče sa 96 bunarića sa zaobljenim dnom. Pripremljena su razblaženja huMy9-6-14 u medijumu za ćelijsku kulturu (RPMI1640 medijum koji je suplementiran sa 10% toplotom-inaktiviranim fetalnim goveđim serumom i 50 mg/L gentamicina) i dodata su ćelijama. Ploče su inkubirane tokom 4 dana na 37 °C, i vijabilnost ćelija u svakom bunariću je određena upotrebom WST-8 reagensa (Dojindo Molecular Technologies, Inc.). kako bi se testirala potentnost prema posmatraču konjugata, RADA-1 i KARA ćelije su mešane zajedno u različitim odnosima (500 RADA-1 ćelija plus 0 KARA ćelija; 500 RADA-1 ćelija plus 500 KARA ćelija; 500 RADA-1 ćelija plus 1000 KARA ćelija; 500 RADA-1 ćelija plus 2000 KARA ćelija; 500 RADA-1 ćelija plus 4000 KARA ćelija), i zasejane u ploče sa sa 96 bunarića zaobljenim dnom. Zatim su 1,0e-9M ili 5,0e-10M huMy9-6-14 - koncentracije koje nisu citotoksične za RADA-1 ćelije, ali su ubile sve KARA ćelije - dodate smešama ćelija.
1
Ploče su inkubirane tokom 4 dana na 37 °C, i vijabilnost RADA-1 ćelija u svakom bunariću je određena upotrebom WST-8 reagensa (Dojindo Molecular Technologies, Inc.). Apsorbanca je izmerena na spektrofotometru za očitavanje ploča u režimu dualne talasne dužine 450 nm/650 nm, i oduzeta je apsorbanca na 650 nm (nespecifično rasipanje svetlosti od strane ćelija).
[0292] Kao što je prikazano na SL. 5, konjugat pokazuje jaku aktivnost ubijanja posmatrača na susedne antigen-negativne ćelije.
Primer 26. Antitumorska aktivnost jedne doze huMOV19-80 i huMOV19-90 prema NCI-H2110 NSCLC ksenograftima kod ženki SCID miševa
[0293] Ženke CB.17 SCID miševa, stare 6 nedelja, dobijene su iz Charles River Laboratories. Miševi su inokulirani sa 1 x 10<7>NCI-H2110 tumorskih ćelija suspendovanih u 0,1 ml 50% matrigel/medijum bez seruma subkutanom injekcijom u desni bok. Kada su zapremine tumora dostigle približno 100 mm<3>(dan 7 posle inokulacije), životinje su nasumično podeljene na osnovu zapremine tumora u 5 grupa, svaka od po 6 miševa. Miševi su dobili jednu IV primenu nosač kontrole (0,2 ml/mišu), huMOV19-80 ili huMOV19-90 pri 5 i 25 μg/kg na osnovu koncentracije huMOV19-80 ili huMOV19-90 na dan 1 (dan 8 posle inokulacije). huMOV19 je humanizovano monoklonalno antitelo koje se selektivno vezuje za folatni receptor 1 (FOLR1).
[0294] Veličina tumora merena je dva do tri puta nedeljno u tri dimenzije upotrebom kalipera. Zapremina tumora izražena je u mm<3>upotrebom formule V = dužina x širina x visina x 1⁄2. Smatralo se da miš ima delimičnu regresija (PR) kada je zapremina tumora smanjena za 50% ili više, potpunu regresiju tumora (CR) kada se nije mogao otkriti tumor koji se može opipati. Zapremina tumora određena je StudyLog softverom. Inhibicija rasta tumora (T/C vrednost) određena je upotrebom sledeće formule: T/C (%) = medijana zapremine tumora tretiranih / medijana zapremine tumora kontrole x 100.
[0295] Zapremina tumora određena je istovremeno za tretirane (T) i nosač kontrolne (C) grupe kada je zapremina tumora nosač kontrole dostigla unapred određenu veličinu od 1000 mm<3>. Određena je dnevna medijana zapremine tumora svake tretirane grupe, uključujući miševe bez tumora (0 mm<3>). U skladu sa NCI standardima, T/C ≤ 42% je minimalan nivo anti-tumorske aktivnosti. T/C <10% se smatra visokim nivoom anti-tumorske aktivnosti.
[0296] Kao što je prikazano na SL.6, huMOV19-90 konjugat je visoko aktivan i u dozi od 5 i u dozi od 25 μg/kg; dok je huMOV19-80 konjugat visoko aktivan u dozi od 25 μg/kg.
1 4
Primer 27. Pripremanje huML66-90
[0297] Reakcija koja sadrži 2,0 mg/ml huML66 antitela, anti-EGFR antitelo (videti WO 2012/058592) i 3,5 molarnih ekvivalenata jedinjenja 90 (prethodno tretirano sa 5 puta u višku natrijum bisulfita u 90:10 DMA:50 mM sukcinata pH 5,5 tokom 4 sata na 25 °C) u 15 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina) pH 8,5 puferu i 10% zapr./zapr. DMA (N,N-dimetilacetamid) korastvaraču inkubirana je tokom 4 sata na 25 °C. Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 20 mM histidin, 50 mM natrijum hlorid, 8,5% tež./zapr. saharoza, 0,01% Tween-20, 50 μM natrijum bisulfit pH 6,2 formulaciju pufera upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu tokom 4 sata na sobnoj temperaturi i zatim preko noći na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 30.000 MWCO).
[0298] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima krajnju koncentraciju proteina od 0,9 mg/ml i prosečno 2,7 molekula jedinjenja 90 povezanih po antitelu (pomoću UV-Vis upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.280 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 90, i ε280 nm= 205.520 cm<-1>M<-1>za huML66 antitelo), 99,1% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije); i <1% nekonjugovanog IGN149 (dvostruka kolona, analizom HPLC na reverznoj fazi). Podaci MS spektrometrije prikazani su na Sl.8.
Primer 28. In vitro citotoksični testovi za huML66-90 konjugat
[0299] Sposobnost huML66-90 konjugata da inhibira ćelijski rast merena je upotrebom testova in vitro citotoksičnosti. Ciljne ćelije su zasejane po 1-2.000 ćelija po bunariću u 100 μL u kompletnom RPMI medijumu (RPMI-1640, 10% fetalni goveđi serum, 2 mM glutamin, 1% penicilin-streptomicin, svi reagensi iz Invitrogena). Antitela su razblažena u kompletnom RPMI medijumu upotrebom trostruke serije razblaženja i 100 μl je dodato po bunariću. Krajnja koncentracija je tipično u opsegu od 3 x 10<-8>M do 4,6 x 10<-12>M. Ćelije su inkubirane na 37 °C u vlažnom 5% CO2inkubatoru tokom 5-6 dana. Vijabilnost preostalih ćelija je određena kolorimetrijskim WST-8 testom (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD, SAD). WST-8 je redukovan od strane dehidrogenaza u živim ćelijama do narandžastog formazan proizvoda koji je rastvorljiv u medijumu za kulturu tkiva. Količina proizvedenog formazana direktno je proporcionalna broju živih ćelija. WST-8 je dodat u 10% krajnje zapremine i ploče su inkubirane na 37 °C u vlažnom 5% CO2inkubatoru tokom dodatna 2-4
1
sata. Ploče su analizirane merenjem apsorbance na 450 nm (A450) u čitaču ploča sa više bunarića. Pozadinska A450 apsorbanca bunarića sa medijumom i samo WST-8 je oduzeta od svih vrednosti. Procenat vijabilnosti je izračunat tako što je podeljena vrednost svakog tretiranog uzorka sa prosečnom vrednošću bunarića sa netretiranim ćelijama. Procenat vijabilnosti = 100* (A450 tretiranog uzorka - A450 pozadine)/(A450 netretiranog uzorka -A450 pozadine). Vrednost procenta vijabilnosti je prikazana u grafičkom formatu prema koncentraciji antitela u polu-log prikazu za svaki tretman. Krive doza-odgovor generisane su nelinearnom regresijom i EC50vrednost svake krive izračunata je upotrebom GraphPad Prism (GraphPad software, San Diego, CA). In vitro citotoksična aktivnost
[0300] In vitro citotoksičnost huML66-90 konjugata je procenjena u prisustvu i odsustvu viška nekonjugovanog antitela i upoređena sa aktivnošću nespecifičnog huIgG-90 konjugata u ćelijama koje eksprimiraju EGFR i rezultati iz tipičnog testa citotoksičnosti su prikazani na SL. 9. huML66-90 konjugat je rezultirao specifičnim ćelijskim ubijanjem Detroit-562 SCC-HN ćelija sa EC50vrednošću od 16 pM. Prisustvo viška nekonjugovanog antitela značajno je smanjilo aktivnost i rezultiralo je EC50vrednošću od približno 2 nM. Slično tome, huIgG-90 konjugat sa nevezujućim huIgG kontrolnim antitelom rezultirao je ćelijskim ubijanjem sa EC50vrednošću od približno 8 nM.
[0301] Nalik tome, huML66-90 konjugat rezultirao je specifičnim ćelijskim ubijanjem NCI-H292 NSCLC ćelija sa EC50vrednošću od 12 pM. Prisustvo viška nekonjugovanog antitela značajno je smanjilo aktivnost i rezultiralo je EC50vrednošću od približno 2 nM. Slično, huIgG-90 konjugat sa nevezujućim huIgG kontrolnim antitelom rezultirao je ćelijskim ubijanjem sa EC50vrednošću od približno 8 nM.
[0302] Slično, takođe je primećeno specifično ćelijsko ubijanje NCI-H1703 ćelija.
Tabela 1.
1
Primer 29. In vitro citotoksična aktivnost za huMOV19-90
[0303] 100 μl/bunariću huMOV19-90 konjugata je svaki razblažen u RPMI-1640 (Life Technologies) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS (Life Technologies) i 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies) u ploči sa 96 bunarića (Corning, ravno dno) na početne koncentracije od 3,5e-9 M i do 3,5 e-8 M u triplikatu i serijski razblažen tri puta u medijumu iznad na temperaturi okoline. KB ćelije (tumor bukalnog epitela), uzgajane u EMEM (ATCC) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS (Life Technologies) i 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies), isprane su jednom u PBS i uklonjene sa 0,05% tripsin-EDTA (Life Technogies). Druge testirane ćelije bile su NCI-H2110 (NSCLC) i T47D (epitelne dojke) uzgajane u RPMI-1640 (LifeTechnologies) koji je suplementiran sa toplotom-inaktiviranim 10% FBS (Life Technologies) i 0,1 mg/ml gentamicina (Life Technologies). T47D medijum je takođe dopunjen sa 0,2 IU/ml goveđeg insulina. Sve ćelije su resuspendovane u medijumu za rast (videti iznad) kako bi se neutralizovao tripsin i prebrojane su pomoću hemacitometra. 100 μl/ml 1000 KB ćelija/bunariću ili 2000 T47D i NCI-H2110 ćelija/bunariću je dodato u bunariće koji sadrže konjugat ili samo medijum i inkubirane su u inkubatoru na 37 °C sa 5% CO2tokom 5 dana sa i bez 1 μM blokirajućeg anti-FOLR1 antitela (huMOV19). Ukupna zapremina je 200 μl/bunariću. Početna koncentracija svakog konjugata na KB ćelijama je bila 3,5e-9 M i za T47D i NCI-H2110 ćelije, početna koncentracija svakog konjugata je bila 3,5e-8 M. Posle inkubacije, vijabilnost ćelija je analizirana dodavanjem 20 μl/bunariću WST-8 (Dojindo) i omogućeno je da se razvija tokom 2 sata. Apsorbanca je očitana na čitaču ploča na 450 i 620 nm. Apsorbance na 620 nm oduzete su od apsorbanci na 450 nm. Pozadina u bunarićima koji sadrže samo medijum dodatno je oduzeta od korigovanih apsorbanci i preživela frakcija (SF) netretiranih ćelija je izračunata u Excel-u. XY grafikon ADC koncentracije (M) vs. SF kreiran je upotrebom Graph Pad Prism.
[0304] Kao što je prikazano na SL. 10-12 i Tabeli 2, huMOV19-90 konjugat je visoko potentan prema KB ćelijama, T47D ćelijama i NCI-H2110 ćelijama. Dodavanje viška nekonjugovanog antitela značajno smanjuje citotoksični efekat, demonstrirajući specifičnost za antigen.
Tabela 2.
1
[0305] U drugom eksperimentu, sposobnost konjugata da inhibiraju ćelijski rast merena je upotrebom in vitro testa citotoksičnosti zasnovanog na WST-8. Ćelije u pločama sa 96 bunarića (tipično, 1x10<3>po bunariću) tretirane su konjugatom na različitim koncentracijama u odgovarajućem medijumu za ćelijsku kulturu sa ukupnom zapreminom 0,2 ml. Kontrolni bunarići koji sadrže ćelije i medijum ali im nedostaju test jedinjenja, i bunarići koji sadrže samo medijum, bili su uključeni u svaku testnu ploču. Ploče su inkubirane tokom 4 do 6 dana na 37 °C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 6% CO2. WST-8 reagens (10%, zapremina/zapremina; Dojindo Molecular Technologies) je zatim dodat u bunariće, i ploče su inkubirane na 37 °C tokom 2 do 6 sati u zavisnosti od ćelijske linije. Zatim je izmerena apsorbanca na spektrofotometru za očitavanje ploča u režimu dualne talasne dužine 450 nm/620nm, i oduzeta je apsorbanca na 620 nm (nespecifično rasipanje svetlosti od strane ćelija). Rezutujuće OD450vrednosti korišćene su za izračunavanje očiglednih preživelih frakcija ćelija upotrebom GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA). Očigledna preživela frakcija ćelija u svakom bunariću izračunata je prvo korekcijom za pozadinsku apsorbancu medijuma i zatim deljenjem svake vrednosti sa prosekom vrednosti u kontrolnim bunarićima (netretirane ćelije). Krive doza-odgovor generisane su nelinearnom regresijom upotrebom sigmoidne krive podešene sa promenljivim nagibom u Graph Pad Prism. IC50(inhibitorna koncentracija 50%) je generisana softverom.
[0306] Konjugati su bili aktivni prema testiranim ćelijskim linijama Ishikawa (kancer endometrijuma), KB (kancer grlića materice) i NCI-H2110 (nesitnoćelijski karcinom pluća) kao što je prikazano na SL. 21 i Tabeli 3. Aktivnost ubijanja ćelija bila je FOLR1-zavisna, pošto je višak nemodifikovanog huMOV19 antitela (1 μM) znatno smanjio potenciju konjugata (od 20 do 200 puta).
Tabela 3.
1
Primer 30. Antitumorska aktivnost jedne doze huMOV19-90 konjugata prema NCI-H2110 NSCLC ksenograftima kod ženki SCID miševa
[0307] Ženke CB.17 SCID miševa, stare 6 nedelja, dobijene su iz Charles River Laboratories. Miševi su inokulirani sa 1 x 10<7>NCI-H2110 tumorskih ćelija suspendovanih u 0,1 ml 50% matrigel/medijum bez seruma subkutanom injekcijom u desni bok. Kada su zapremine tumora dostigle približno 100 mm<3>(dan 7 posle inokulacije), životinje su nasumično podeljene na osnovu zapremine tumora u 4 grupe, svaka sa po 6 miševa. Miševi su dobili jednu IV primenu nosač kontrole (0,2 ml/mišu) ili huMOV19-90 pri 1, 3 ili 5 μg/kg na osnovu koncentracije jedinjenja 90 na dan 1 (dan 8 posle inokulacije).
[0308] Veličina tumora merena je dva do tri puta nedeljno u tri dimenzije upotrebom kalipera. Zapremina tumora izražena je u mm<3>upotrebom formule V = dužina x širina x visina x 1⁄2. Smatralo se da miš ima delimičnu regresiju (PR) kada je zapremina tumora smanjena za 50% ili više, potpunu regresiju tumora (CR) kada se nije mogao otkriti tumor koji se može opipati. Zapremina tumora određena je StudyLog softverom.
[0309] Inhibicija rasta tumora (T/C vrednost) određena je upotrebom sledeće formule:
T/C (%) = Medijana zapremine tumora tretiranih / Medijana zapremine tumora kontrole x 100.
Zapremina tumora određena je istovremeno za tretirane (T) i nosač kontrolne (C) grupe kada je zapremina tumora nosač kontrole dostigla unapred određenu veličinu od 1000 mm<3>. Određena je dnevna medijana zapremine tumora svake tretirane grupe, uključujući miševe bez
1
tumora (0 mm<3>). U skladu sa NCI standardima, T/C ≤ 42% je minimalan nivo anti-tumorske aktivnosti. T/C <10% se smatra visokim nivoom anti-tumorske aktivnosti.
[0310] Kao što je prikazano na SL.14, huMOV19-90 konjugat je aktivan u dozi od 3 μg/kg i visoko je aktivan u dozi od 5 μg/kg.
Primer 31. Sinteza jedinjenja 107
[0311]
Korak 1: Jedinjenje 82 (500 mg, 2,31 mmol), 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanska kiselina (449 mg, 2,31 mmol), EDC·HCl (465 mg, 2,43 mmol), HOBt (354 mg, 2,31 mmol) i DIPEA (0,81 ml, 4,62 mmol) su rastvoreni u DMF (7,7 ml) i mešani preko noći dok reakcija nije završena. Reakcija je razblažena etil acetatom i isprana zasićenim natrijum bikarbonatom, zasićenim amonijum hloridom, i dva puta vodom. Organski je osušen i koncentrovan in vacuo dajući jedinjenje 100 (875 mg, 96% prinos) koje je direktno upotrebljeno u sledećem koraku.<1>H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8,15 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 8,02 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 4,26-4,33 (m, 1H), 4,03-4,12 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,18-2,22 (m, 2H), 1,76-1,80 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,24 (s, 6H), 1,24 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,19 (d, 3H, J = 7,2 Hz),
Korak 2: TFA (2,6 ml) i voda (0,17 ml) su dodati u čisto jedinjenje 100 (875 mg, 2,23 mmol) i mešani na sobnoj temperaturi dok reakcija nije završena. Reakcija je razblažena i azeotropirana acetonitrilom da se dobije lepljivo ulje. Zatim je razblažena acetonitrilom i vodom, zamrznuta i liofilizovana dajući jedinjenje 101 (1 g, 100% prinos) kao prljavo-belu čvrstu supstancu koja se upotrebljava bez daljeg prečišćavanja. LCMS = 3,99 min (postupak od 8 min). MS (m/z): 337,0 (M 1)<+>.
14
Korak 3: Jedinjenje 101 (923 mg, 1,65 mmol) i (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (240 mg, 1,57 mmol) su rastvoreni u DMF (5,2 ml). EDC·HCl (601 mg, 3,13 mmol) i DMAP (96 mg, 0,78 mmol) su dodati na sobnoj temperaturi i reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija je razblažena etil acetatom i isprana vodom tri puta. Organski sloj je osušen, koncentrovan in vacuo i prečišćen hromatografijom na silika gelu (DCM/MeOH) dajući jedinjenje 102 (150 mg, 20% prinos). LCMS = 3,91 min (postupak od 8 min). MS (m/z): 472,2 (M 1)<+>.<1>H NMR (400 MHz, MeOD): δ 9,69 (s, 1H), 8,21 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 8,18 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,52 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 4,58 (s, 4H), 4,44-4,48 (m, 1H), 4,29-4,32 (m, 1H), 3,34 (s, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,34-2,40 (m, 2H), 1,90-1,95 (m, 2H), 1,43 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,30 (s, 6H).
Korak 4: Jedinjenje 102 je pripremljeno slično kao jedinjenje 94 u Primeru 9. Sirovi materijal je osušen u visokom vakuumu dajući jedinjenje 103 (174 mg, 101% prinos) koje je upotrebljeno direktno u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. LCMS = 4,95 min (postupak od 8 min).
Korak 5: Jedinjenje 103 je pripremljeno slično kao jedinjenje 57 u Primeru 7. Sirova čvrsta supstanca sadrži jedinjenje 104 (203 mg, 44% prinos, 60% čistoća) koje se upotrebljava bez daljeg prečišćavanja. LCMS = 5,68 min (postupak od 8 min). MS (m/z): 1024,3 (M 1)<+>.
Korak 6: Jedinjenje 104 je pripremljeno slično kao jedinjenje 12 u Primeru 1. Sirovi ostatak je prečišćen pomoću RPHPLC (C18 kolona, CH3CN/H2O, gradijent, 50% do 65%) za prinos mono imin jedinjenja 105 kao čvrste supstance (22 mg, 16% prinos, 90% čistoće). LCMS = 6,00 min (postupak od 8 min). MS (m/z): 1027,3 (M 1)<+>.
Korak 7: Jedinjenje 106 je rastvoreno u THF (0,5 ml) i ACN (0,23 ml) na sobnoj temperaturi. Zatim je pripremljeno slično kao jedinjenje 98 u Primeru 9. Smeša je mešana do završetka i zatim razblažena sa DCM i DI vodom. Organski sloj je ispran slanim rastvorom, osušen i filtriran. Filtrat je koncentrovan dajući sirovi tiol, jedinjenje 106 (21 mg, 100% prinos) koje je upotrebljeno direktno u sledećoj reakciji. LCMS = 5,67 min (postupak od 8 min). MS (m/z): 980,4 (M 1)<+>.
Korak 8: Jedinjenje 106 (21 mg, 0,021 mmol) je suspendovano u 2-propanolu (1428 μl) i vodi (714 μl). Dodat je natrijum metabisulfit (22,30 mg, 0,214 mmol) i reakcija je mešana na sobnoj temperaturi do završetka. Reakciona smeša je razblažena acetonitrilom/vodom, zamrznuta i liofilizovana. Rezultujući beli prah je prečišćen pomoću RPHPLC (C18 kolona, CH3CN/H2O, gradijent, 20% do 40%) i željene frakcije su sakupljene i liofilizovane dajući jedinjenje 107 (5,3 mg, 23% prinos). LCMS = 5,67 min (postupak od 8 min). MS (m/z): 1060,2 (M - 1)-.
Primer 32. Pripremanje huMOV19-sulfo-SPDB-107 (ili huMOV19-107) konjugata
[0312] In situ mešavina koja sadrži krajnje koncentracije od 1,95 mM jedinjenja 107 i 1,5 mM sulfo-SPDB linkera u sukcinatnom puferu (pH 5):DMA (30:70) inkubirana je tokom 6 h pre dodavanja 7 puta u višku 107-sulfo-SPDB-NHS u reakciju koja sadrži 4 mg/ml huMOV19 antitela u 15 mM HEPES pH 8,5 (87:13, voda:DMA). Rastvoru je omogućeno da konjuguje preko noći na 25 °C.
[0313] Posle reakcije, konjugat je prečišćen i pufer je zamenjen za 10 mM Tris, 80 mM NaCl, 50 uM bisulfit, 3,5% saharoza, 0,01% Tween-20 formulaciju pufera pH 7,6, upotrebljavajući NAP kolone za uklanjanje soli (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Dijaliza je izvedena u istom puferu preko noći na 4 °C koristeći Slide-a-Lyzer kasete za dijalizu (ThermoScientific 10.000 MWCO).
[0314] Utvrđeno je da prečišćeni konjugat ima prosečno 2,7 molekula jedinjenja 107 povezanih po antitelu (pomoću UV/Vis i SEC upotrebom molarnih ekstinkcionih koeficijenata ε330 nm= 15.484 cm<-1>M<-1>i ε280 nm= 30.115 cm<-1>M<-1>za jedinjenje 107, i ε280 nm= 201.400 cm<-1>M<-1>za huMOV19 antitelo), 95% monomera (pomoću ekskluzione hromatografije), i krajnju koncentraciju proteina od 1,1 mg/ml. Podaci MS spektrometrije prikazani su na SL.16.
Primer 33. Antitumorska aktivnost jedne doze huML66-90 konjugata prema NCI-H1703 NSCLC ksenograftima kod ženki SCID miševa
[0315] Ženke CB.17 SCID miševa, stare 6 nedelja, dobijene su iz Charles River Laboratories. Miševi su inokulirani sa 5 x 10<6>NCI-H1703 tumorskih ćelija suspendovanih u 0,2 ml 50% matrigel/medijum bez seruma subkutanom injekcijom u desni bok. Kada su zapremine tumora dostigle približno 100 mm<3>(dan 16 posle inokulacije), životinje su nasumično podeljene na osnovu zapremine tumora u 4 grupe, svaka sa po 6 miševa. Miševi su dobili jednu IV primenu nosač kontrole (0,1 ml/mišu) ili huML66-90 konjugata pri 5, 20 ili 50 μg/kg na osnovu koncentracije jedinjenja 90 na dan 1 (dan 17 posle inokulacije).
[0316] Veličina tumora merena je dva do tri puta nedeljno u tri dimenzije upotrebom kalipera. Zapremina tumora izražena je u mm<3>upotrebom formule V = dužina x širina x visina x 1⁄2.
14
Smatralo se da miš ima delimičnu regresiju (PR) kada je zapremina tumora smanjena za 50% ili više, potpunu regresiju tumora (CR) kada se nije mogao otkriti tumor koji se može opipati. Zapremina tumora određena je StudyLog softverom.
[0317] Inhibicija rasta tumora (T/C vrednost) određena je upotrebom sledeće formule:
T/C (%) = Medijana zapremine tumora tretiranih / Medijana zapremine tumora kontrole x 100.
Zapremina tumora određena je istovremeno za tretirane (T) i nosač kontrolne (C) grupe kada je zapremina tumor nosač kontrole dostigla unapred određenu veličinu od 1000 mm<3>. Određena je dnevna medijana zapremine tumora svake tretirane grupe, uključujući miševe bez tumora (0 mm<3>). U skladu sa NCI standardima, T/C ≤ 42% je minimalan nivo anti-tumorske aktivnosti. T/C <10% se smatra visokim nivoom anti-tumorske aktivnosti.
[0318] Kao što je prikazano na SL.17, huML66-90 konjugat je visoko aktivan pri 20 μg/kg i 50 μg/kg, sa 20 μg/kg kao minimalno efikasnom dozom (MED).
Primer 34. Farmakokinetika jedne doze huMOV19-90 konjugata kod ženki CD-1 miševa
[0319] Ženke CD-1 miševa, stare 7 nedelja, dobijene su iz Charles River Laboratories. Miševi su dobili jednu IV primenu huMov19-90 konjugata kao jednu intravensku bolus injekciju putem lateralne repne vene. Svaki miš primio je dozu od 2,5 mg/kg na osnovu Ab. Doza i injektirana zapremina su individualizovane na osnovu telesne težine svakog miša. Injekcije su izvedene upotrebom šprica od 1,0 ml sa iglom sa otvorom 27, od 1⁄2 inča. U 2 i 30 min, i u 2, 4 i 8 sati, i u 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 i 28 dana posle primene huMov19-90 konjugata, miševi su anestezirani inhalacijom izoflurana, i približno 150 μl krvi je sakupljeno od miševa putem desnog retro-orbitalnog krvnog sinusa u heparinizovanu kapilarnu tubu. U svakoj vremenskoj tački (od 0 do 21 dana) krv je sakupljana od sva tri miša u jednoj grupi. Grupama je uzimana krv naizmenično; tako da miševima iz seta nije uzimana krv više od dva puta u periodu od 24 sata. U krajnjoj vremenskoj tački, 28 dana posle primene, svi miševi su bili uključeni u kolekciju uzorka. Uzorci krvi su centrifugirani kako bi se odvojila plazma. 30 μl plazme je preneto u pojedinačno označene tube za mikrocentrifugu za svaki uzorak i vremensku tačku, i zatim su čuvane zamrznute na -80 °C kako bi se omogućila naknadna analiza pomoću ELISA za određivanje koncentracija ukupnog Ab (i nekonjugovanog Ab i intaktnog konjugata) i intaktnog konjugata upotrebom anti-indolinobenzodiazepin antitela.
[0320] Kao što je prikazano na Sl. 18, huMov19-90 konjugat ima sličan klirens onom od antitela.
Primer 35. Obogaćivenje katabolitima afinitetnim zadržavanjem sa protein A smolom
[0321] KB ćelije koje eksprimiraju folatni receptor α (FRα) uzgajane su u 5 x T150 pločama za kulturu tkiva. Zasićujuća količina huMov19-90 konjugata koji ciljno deluje na FRα inkubirana je sa KB ćelijama tokom 24 sata na 37 °C u vlažnom inkubatoru puferisano sa 5% CO2. Posle 24 sata, medijumi koji sadrže katabolite proistekle iz ćelije su sakupljeni i pulirani za sledeći test.
[0322] Zasićujuća količina anti-indolinobenzodiazepin antitela bila je vezana za kašu protein A smola pomoću inkubacije preko noći na 4 °C. 1 ml prethodno vezanog protein A/antiindolinobenzodiazepin antitelo kompleksa je inkubiran sa 25 ml medijuma na kraj-do-kraja rotatoru tokom nekoliko sati. Smole su nežno centrifugirane na 1000 rpm, i supernatant je dekantovan. Protein-A/anti-indolinobenzodiazepin antitelo smole vezane za katabolite su isprane sa PBS. Kataboliti su otpušteni u organsku fazu ekstrakcijom acetonom. Kataboliti su osušeni u vakuumu preko noći sve dok organski rastvor nije potpuno uparen. Kataboliti su rekonstituisani sa 20% acetonitrilom u vodi, i analizirani pomoću LC/MS.
MS analiza
[0323] Ćelijski kataboliti su identifikovani pomoću UHPLC/MS/MS upotrebom Q-Exactive high resolution mass spec (Thermo). Ekstrahovani jonski hromatogrami (XIC) su upotrebljeni za identifikaciju i karakterizaciju katabolita ciljnih ćelija. Identifikovane su sve vrste katabolita koje sadrže karakteristične masene potpise indolinobenzodiazepina (286 m/z) (videti SL.19A i 19B).
Primer 36. Antitumorska aktivnost jedne doze huMOV19-90 prema NCI-H2110 NSCLC ksenograftima, Hec-1b endometrijalnim ksenograftima i Ishikawa endometrijalnim ksenograftima kod ženki CB.17 SCID miševa
14
[0324] Ženke CB.17 SCID miševa, stare 6 nedelja, dobijene su iz Charles River Laboratories. Jedna kohorta miševa inokulirana je sa 1 x 10<7>NCI-H2110 tumorskih ćelija suspendovanih u 0,1 ml 50% matrigel/medijum bez seruma subkutanom injekcijom u desni bok. Druga kohorta miševa inokulirana je sa 1 x 10<7>Hec-1b tumorskih ćelija suspendovanih u 0,1 ml medijuma bez seruma subkutanom injekcijom u desni bok. Treća kohorta miševa inokulirana je sa 1 x 10<7>Ishikawa tumorskih ćelija suspendovanih u 0,1 ml 50% matrigel/medijum bez seruma subkutanom injekcijom u desni bok.
[0325] Kada su zapremine tumora dostigle približno 100 mm<3>(NCI-H2110 na dan 7, Hec-1b na dan 7, i Ishikawa na dan 17 posle inokulacije) životinje su nasumično podeljene na osnovu zapremine tumora u grupe, svaka sa po 6 miševa.
[0326] Miševi u eksperimentu sa NCI-H2110 ksenograftom dobili su jednu IV primenu nosač kontrole (0,2 ml/mišu) ili huMov19-90 pri 1, 3, ili 5 μg/kg na osnovu koncentracije leka na dan 1 (dan 8 posle inokulacije).
[0327] Miševi u eksperimentu sa Hec-1b ksenograftom dobili su jednu IV primenu nosač kontrole (0,2 ml/mišu) ili huMov19-90 pri 10 ili 30 μg/kg ili kontrolni konjugat bez ciljnog delovanja chKTI-90 pri 30 μg/kg na osnovu koncentracije leka na dan 1 (dan 8 posle inokulacije).
[0328] Miševi u eksperimentu sa Ishikawa ksenograftom dobili su jednu IV primenu nosač kontrole (0,2 ml/mišu) ili huMov19-90 pri 10 ili 30 μg/kg ili kontrolni konjugat bez ciljnog delovanja chKTI-90 pri 30 μg/kg na osnovu koncentracije leka na dan 1 (dan 18 posle inokulacije).
[0329] Za sve eksperimente, veličina tumora je merena dva do tri puta nedeljno u tri dimenzije upotrebom kalipera. Zapremina tumora izražena je u mm<3>upotrebom formule V = dužina x širina x visina x 1⁄2. Smatralo se da miš ima delimičnu regresiju (PR) kada je zapremina tumora smanjena za 50% ili više, potpunu regresiju tumora (CR) kada se nije mogao otkriti tumor koji se može opipati. Zapremina tumora određena je StudyLog softverom.
[0330] Inhibicija rasta tumora (T/C vrednost) određena je upotrebom sledeće formule:
T/C (%) = Medijana zapremine tumora tretiranih / Medijana zapremine tumora kontrole x 100.
[0331] Zapremina tumora određena je istovremeno za tretirane (T) i nosač kontrolne (C) grupe kada je zapremina tumora nosač kontrole dostigla unapred određenu veličinu od 1000
14
mm<3>. Određena je dnevna medijana zapremine tumora svake tretirane grupe, uključujući miševe bez tumora (0 mm<3>). U skladu sa NCI standardima, T/C ≤ 42% je minimalan nivo anti-tumorske aktivnosti. T/C <10% se smatra visokim nivoom anti-tumorske aktivnosti.
[0332] Kao što je prikazano na SL.22, huMov19-90 konjugat je bio neaktivan u NCI-H2110 ksenograft modelu u dozi od 1 μg/kg, aktivan u dozi od 3 μg/kg sa T/C od 13% i 1/6 PR i visoko aktivan u dozi od 5 μg/kg sa T/C od 2%, 6/6 PR i 4/6 CR.
[0333] Kao što je prikazano na SL. 23, huMov19-90 konjugat je bio aktivan u Hec-1b ksenograft modelu u dozi od 10 μg/kg sa T/C od 15% i 1/6 PR i visoko aktivan u dozi od 30 μg/kg sa T/C od 9%, 6/6 PR i 6/6 CR. Kontrolni konjugat bez ciljnog delovanja chKTI-90 bio je aktivan u dozi od 30 μg/kg sa T/C od 34%.
[0334] Kao što je prikazano na SL. 24, huMov19-90 konjugat bio je aktivan u Ishikawa ksenograft modelu u dozi od 10 μg/kg sa T/C od 27%, 6/6 PR i 6/6 CR i aktivan u dozi od 30 μg/kg sa T/C od 15%, 6/6 PR i 6/6 CR. Kontrolni konjugat bez ciljnog delovanja chKTI-90 bio je aktivan u dozi od 30 μg/kg sa T/C od 24% i 4/6 PR.
Primer 37. Antitumorska aktivnost jedne doze huMOV19-107 prema NCI-H2110 NSCLC ksenograftima, kod ženki CB.17 SCID miševa
[0335] In vivo antitumorska aktivnost huMOV19-107 kod SCID miševa sprovedena je u skladu sa protokolima opisanim u Primeru 30 iznad. Kao što je prikazano na SL. 25, huMov19-107 konjugat bio je visoko aktivan u dozi od 10 μg/kg i 6/6 CR.
Primer 38. Afinitet vezivanja CD123-90 konjugata
[0336] Afinitet vezivanja ADC konjugata primernog humanizovanog anti-CD 123 antitela, huCD123-6Gv4.7S3 antitela, testiran je i upoređen sa odgovarajućim nekonjugovanim antitelom protočnom citometrijom upotrebom HNT-34 ćelija. HNT-34 ćelije (5x10<4>ćelija po uzorku) inkubirane su sa različitim koncentracijama ADC i nekonjugovanog huCD123-6Gv4.7S3 antitela u 200 μL FACS pufera (DMEM medijum koji je suplementiran sa 2% normalnim kozjim serumom). Ćelije su zatim peletirane, isprane dva puta i inkubirane tokom 1 sata sa 100 μl fikoeritrin (PE)-konjugovanog kozjeg anti-humanog IgG antitela (Jackson Laboratory). Ćelije su ponovo peletirane, isprane FACS puferom i resuspendovane u 200 μL PBS koji sadrži 1% formaldehid. Uzorci su stečeni upotrebom FACSCalibur protočnog citometra sa HTS multiwell samplerom, ili FACS array protočnog citometra, i analizirani
14
upotrebom CellQuest Pro (sve iz BD Biosciences, San Diego, SAD). Za svaki uzorak izračunat je geosrednji intenzitet fluorescencije za FL2 i prikazan u grafičkom formatu u odnosu prema koncentraciji antitela u polu-log prikazu. Kriva doza-odgovor generisana je nelinearnom regresijom i EC50 vrednost svake krive, koja odgovara očiglednoj konstanti disocijacije (Kd) svakog antitela, izračunata je upotrebom GraphPad Prism v4 (GraphPad software, San Diego, CA).
[0337] Kao što je prikazano na SL. 26, konjugacija je samo umereno uticala na afinitet vezivanja primernog anti-CD 123 antitela.
Primer 39. In vitro citotoksična aktivnost za huCD123-90
[0338] Sposobnost antitelo-lek konjugata (ADC) huCD123-6, anti-CD123 antitela, da ubije ćelije koje eksprimiraju CD123 na svojoj ćelijskoj površini merena je upotrebom in vitro testova citotoksičnosti. Ćelijske linije su uzgajane u medijumu za kulturu koji preporučuje dobavljač ćelija (ATCC ili DSMZ). Ćelije, 2.000 do 10.000 u 100 μl medijuma za kulturu, dodate su u svaki bunarić ploče sa 96 bunarića sa ravnim dnom. Za blokiranje Fc receptora na ćelijskoj površini, medijum za kulturu je dopunjen sa 100 nM chKTI antitelom (antitelo istog izotipa). Konjugati su razblaženi u medijumu za kulturu upotrebom serije 3 puta razblaženja i dodato je 100 μl po bunariću. Kako bi se odredio doprinos CD123-nezavisne citotoksičnosti, CD123 blok (npr. 100 nM chCD123-6 antitela) je dodat u neke bunariće pre konjugata. Kontrolni bunarići koji sadrže ćelije i medijum ali im nedostaju konjugati, kao i bunarići koji sadrže samo medijum, uključeni su u svaku testnu ploču. Testovi su izvedeni u triplikatu za svaku tačku podataka. Ploče su inkubirane na 37 °C u vlažnom 6% CO2inkubatoru tokom 4 do 7 dana. Zatim je relativni broj vijabilnih ćelija u svakom bunariću određen upotrebom Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Rockville, MD) zasnovanog na WST-8. Očigledna preživela frakcija ćelija u svakom bunariću izračunata je prvo korekcijom za pozadinsku apsorbancu medijuma, i zatim deljenjem svake vrednosti sa prosekom vrednosti u kontrolnim bunarićima (netretirane ćelije). Preživela frakcija ćelija prikazana je u grafičkom formatu prema koncentraciji konjugata u polu-log prikazima.
[0339] U studiji je upotrebljeno petnaest CD123-pozitivnih ćelijskih linija različitog porekla (AML, B-ALL, CML i NHL) (Tabela 4). Većina ćelijskih linija je poreklom od pacijenata koji nose malignitet sa najmanje jednim negativnim prognostičkim faktorom (npr. prekomerna ekspresija P-glikoproteina, prekomerna ekspresija EVI1, p53 alteracije, DNMT3A mutacija, FLT3 interna tandem duplikacija). Konjugati su demonstrirali visoku
14
potenciju na ovim ćelijskim linijama sa IC50 vrednostima u opsegu od sub-pM do nisko nM (Tabela 4).
Tabela 4. In vitro citotoksičnost huCD123-6-90 konjugata prema CD123-pozitivnim ćeliskim linijama različitog porekla
14
1
11
12
1
14
1
�
1
1
1
1
11
12
�
14
1
�
1
1
1
�
11
12
�
14
1
�
1
1
1
�
11
12
�
14
1
�
�

Claims (22)

  1. Patentni zahtevi 1. Citotoksično jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: L' je predstavljen sledećom formulom: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1); -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-J (B2); ili -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Z<s>(B3); ili pri čemu: P je amino-kiselinski ostatak ili peptid koji sadrži između 2 do 20 aminokiselinskih ostataka; J je N-hidroksisukcinimid estar, N-hidroksi sulfosukcinimid estar, nitrofenil estar, dinitrofenil estar, sulfo-tetraflurofenil estar, i pentafluorofenil estar; Rai Rb, za svako pojavljivanje, su svaki nezavisno -H, (C1-C3)alkil ili naelektrisani supstituent ili grupa koja se može jonizovati Q, pri čemu je Q SO3H ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; m je ceo broj od 1 do 6; m' je 0 ili ceo broj od 1 do 6; Cy je ciklični alkil koji ima 5 ili 6 atoma ugljenika u prstenu opciono supstituisanih halogenom, -OH, (C1-C3)alkilom, (C1-C3)alkoksijem, ili halo(C1-C3)alkilom; i Z<s>je -H, -SR<d>, -C(=O)R<d1>ili je odabran od bilo koje od sledećih formula:
    1
    pri čemu: q je ceo broj od 1 do 5; n' je ceo broj od 2 do 6; U je -H ili SO3M; M je H<+>, Na<+>ili K<+>; R<d>je linearni ili granati alkil koji ima 1 do 6 atoma ugljenika ili je odabran od fenila, nitrofenila, dinitrofenila, karboksinitrofenila, piridila ili nitropiridila; i R<d1>je linearni ili granati alkil koji ima 1 do 6 atoma ugljenika; 1 L" i Lꞌ" su oba -H; dvostruka linija između N i C predstavlja jednostruku vezu ili dvostruku vezu, pod uslovom da kada je dvostruka veza X je odsutan i Y je -H, ili linearni ili granati alkil koji ima 1 do 4 atoma ugljenika, i kada je jednostruka veza, X je -H, Y je -OH ili -SO3M; R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' i R4' su svi -H; R6je -OMe; X' i Y' su oba -H; A i A' su -O-; i M je H, Na<+>ili K<+>; i R5za svako pojavljivanje je nezavisno -H ili opciono supstituisani linearni ili granati alkil koji ima 1 do 10 atoma ugljenika.
  2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je Lꞌ predstavljen sledećim formulama: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1); ili -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-J (B2); opciono pri čemu su Rai Rboba H; Cy za formulu (B2) je cikloheksan; R5je H ili Me, i m ꞌ je 0 ili 1.
  3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je Lꞌ predstavljen formulom B1.
  4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je Lꞌ predstavljen sledećom formulom: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Z<s>(B3); opciono pri čemu: 1 1 (i) Rai Rbsu oba -H i R5je H ili Me; ili (ii) -(CRaRb)m- je -(CH2)m"-C(Me2)- i m" je ceo broj od 1 do 5.
  5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time što je P peptid koji sadrži 2 do 5 amino-kiselinskih ostataka.
  6. 6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što je P odabran od Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N<9>-tozil-Arg, Phe-N<9>-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu i Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, i Met-Ala.
  7. 7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je jedinjenje odabrano od bilo koje od sledećih formula:
    1 2
    �
    ��
    �
    �
    �
    �
    �
    �
    21
    ili
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: R100je -OH, -OMe ili
  8. 8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što je jedinjenje predstavljeno sledećim formulama: 2 2
    ili
    ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju.
  9. 9. Konjugat koji sadrži citotoksično jedinjenje i agens koji se vezuje za ćeliju (CBA), naznačen time što je citotoksično jedinjenje kovalentno povezano sa CBA, i pri čemu je navedeno citotoksično jedinjenje predstavljeno sledećom formulom:
    ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, pri čemu: 2 agens koji se vezuje za ćeliju je antitelo, jednolančano antitelo, fragment antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, monoklonalno antitelo, jednolančano monoklonalno antitelo, ili fragment monoklonalnog antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, himerno antitelo, fragment himernog antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, domen antitelo, fragment domen antitela koji se specifično vezuje za ciljnu ćeliju, limfokin, hormon, vitamin, faktor rasta, faktor stimulacije kolonija, ili molekul za transport hranljivih materija; L' je predstavljen sledećom formulom: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-Jꞌ (B1ꞌ); -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-Jꞌ (B2ꞌ); -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Z<s1>(B3ꞌ); ili pri čemu: P je amino-kiselinski ostatak ili peptid koji sadrži između 2 do 20 aminokiselinskih ostataka; Jꞌ je -C(=O)- koji je kovalentno povezan sa agensom koji se vezuje za ćeliju; Rai Rb, za svako pojavljivanje, su svaki nezavisno -H, (C1-C3)alkil ili naelektrisani supstituent ili grupa koja se može jonizovati Q, pri čemu je Q SO3H ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; m je ceo broj od 1 do 6; m' je 0 ili ceo broj od 1 do 6; Cy je ciklični alkil koji ima 5 ili 6 atoma ugljenika u prstenu opciono supstituisanih halogenom, -OH, (C1-C3)alkilom, (C1-C3)alkoksijem, ili halo(C1-C3)alkilom; Z<s1>je odabran od bilo koje od sledećih formula: 2 4
    �
    pri čemu: q je ceo broj od 1 do 5; n' je ceo broj od 2 do 6; U je -H ili SO3M; i M je H<+>, Na<+>ili K<+>; L" i Lꞌ" su oba -H; dvostruka linija između N i C predstavlja jednostruku vezu ili dvostruku vezu, pod uslovom da kada je dvostruka veza X je odsutan i Y je -H, ili linearni ili granati alkil koji ima 1 do 4 atoma ugljenika, i kada je jednostruka veza, X je -H, Y je -OH ili -SO3M; R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' i R4' su svi -H; R6je -OMe; X' i Y' su oba -H; A i A' su -O-; i M je H, Na<+>ili K<+>; i R5za svako pojavljivanje je nezavisno -H ili opciono supstituisani linearni ili granati alkil koji ima 1 do 10 atoma ugljenika.
  10. 10. Konjugat prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je Lꞌ predstavljen sledećim formulama: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-Jꞌ (B1ꞌ); ili 2 -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m-Jꞌ (B2ꞌ); opciono pri čemu su Rai Rboba H; Cy za formulu (B2ꞌ) je cikloheksan; R5je H ili Me; i m ꞌ je 0 ili 1.
  11. 11. Konjugat prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je Lꞌ predstavljen formulom B1ꞌ.
  12. 12. Konjugat prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je Lꞌ predstavljen sledećom formulom: -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Z<s1>(B3ꞌ), opciono pri čemu: (i) Rai Rbsu oba -H i R5je H ili Me; ili (ii) -(CRaRb)m- je -(CH2)m"-C(Me2)- i m" je ceo broj od 1 do 5.
  13. 13. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 9-12, naznačen time što je P peptid koji sadrži 2 do 5 amino-kiselinskih ostataka.
  14. 14. Konjugat prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što je P odabran od Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N<9>-tozil-Arg, Phe-N<9>-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, i Met-Ala.
  15. 15. Konjugat prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je jedinjenje odabrano od bilo koje od sledećih formula: 2
    �
    �
    21
    21
    21
    21
    21
    21
    21
    22
    22
    ili
    ili 22
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: r je ceo broj od 1 do 10.
  16. 16. Konjugat prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što je konjugat predstavljen sledećim formulama:
    ili 22
    ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju.
  17. 17. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 9-16, naznačen time što je antitelo antitelo sa izmenjenom površinom, jednolančano antitelo sa izmenjenom površinom, ili fragment antitela sa izmenjenom površinom; monoklonalno antitelo, fragment jednolančanog monoklonalnog antitela, ili njegov fragment monoklonalnog antitela; ili humanizovano antitelo, humanizovano jednolančano antitelo ili fragment humanizovanog antitela; i/ili agens koji se vezuje za ćeliju je: (i) anti-folatni receptor antitelo ili njegov fragment antitela; (ii) anti-EGFR antitelo ili njegov fragment antitela; (iii) anti-CD33 antitelo ili njegov fragment antitela; (iv) anti-CD19 antitelo ili njegov fragment antitela; (v) anti-Muc1 antitelo ili njegov fragment antitela; ili je (vi) anti-CD37 antitelo ili njegov fragment antitela.
  18. 18. Konjugat prema patentnom zahtevu 17, naznačen time što: (i) anti-folatni receptor antitelo: (1) je huMOV19 antitelo; 22 (2) sadrži: a) CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 1; CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 7 i CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 3; i b) CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 4; CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 5; i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 6; ili (3) sadrži: a) varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima amino-kiselinsku sekvencu najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 11; i b) varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima amino-kiselinsku sekvencu najmanje oko 90%, 95%, 99% ili 100% identičnu sa SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 13; (4) sadrži: a) varijabilni region teškog lanca koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11; i b) varijabilni region lakog lanca koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 13; ili (5) sadrži: a) teški lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8; i b) laki lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10; (ii) anti-EGFR antitelo: (1) je huML66 antitelo; (2) sadrži: 22 a) teški lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14; i b) laki lanac koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15; (3) je huEGFR-7R; ili (4) sadrži: a) teški lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16; i b) laki lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 18; (iii) anti-CD33 antitelo: (1) je huMy9-6 antitelo; ili (2) sadrži: a) teški lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23; i b) laki lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24; (iv) anti-CD19 antitelo: (1) je huB4 antitelo; ili (2) sadrži: a) teški lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i b) laki lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20; (v) anti-Muc1 antitelo: (1) je huDS6 antitelo; ili 22 (2) sadrži: a) teški lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; i b) laki lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; (vi) anti-CD37 antitelo: (1) je huCD37-3 antitelo; (2) sadrži: a) teški lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 27; i b) laki lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25; (3) je huCD37-50 antitelo; ili (4) sadrži: a) teški lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; i b) laki lanac imunoglobulina koji ima amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
  19. 19. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 9-18 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  20. 20. Jedinjenje kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-8 ili konjugat kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 9-18 za upotrebu kao medikament.
  21. 21. Jedinjenje kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-8 ili konjugat kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 9-18 za upotrebu u postupku inhibicije abnormalnog ćelijskog rasta ili lečenju proliferativnog poremećaja, autoimunskog 2 poremećaja, destruktivnog poremećaja kosti, infektivne bolesti, virusne bolesti, fibrotične bolesti, neurodegenerativnog poremećaja, pankreatitisa ili bolesti bubrega kod sisara, koja sadrži primenu navedenom sisaru terapijski efikasne količine jedinjenja ili konjugata, i opciono, hemioterapijskog agensa, opciono naznačena time što: (i) postupak je za lečenje stanja odabranog iz grupe koja se sastoji od: kancera, reumatoidnog artritisa, multipla skleroze, bolesti graft protiv domaćina (GVHD), odbacivanja transplanta, lupusa, miozitisa, infekcije, i imunske deficijencije; (ii) postupak je za lečenje kancera; (iii) postupak je za lečenje kancera odabranog od kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera grlića materice, melanoma, kancera pluća (npr. nesitnoćelijski kancer pluća), kancera dojke, karcinoma pločastih ćelija glave i vrata, kancera prostate, kancera endometrijuma, limfoma (npr. ne-Hočkinov limfom), mijelodisplastičnog sindroma (MDS), peritonealnog kancera, ili leukemije (npr. akutna mijeloidna leukemija (AML), akutna monocitna leukemija, promijelocitna leukemija, eozinofilna leukemija, akutna limfoblastna leukemija (npr.
  22. B-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), i hronična mijeloidna leukemija (CML)); (iv) postupak je za lečenje akutne mijeloidne leukemije (AML); (v) postupak je za lečenje kancera jajnika; ili (vi) postupak je za lečenje nesitnoćelijskog kancera pluća. 2 1
RS20201000A 2014-09-03 2015-09-02 Citotoksični derivati benzodiazepina RS60751B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462045248P 2014-09-03 2014-09-03
US201462087040P 2014-12-03 2014-12-03
US201562149370P 2015-04-17 2015-04-17
US201562164305P 2015-05-20 2015-05-20
EP15763739.8A EP3189056B1 (en) 2014-09-03 2015-09-02 Cytotoxic benzodiazepine derivatives
PCT/US2015/048059 WO2016036801A1 (en) 2014-09-03 2015-09-02 Cytotoxic benzodiazepine derivatives

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60751B1 true RS60751B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=54140691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201000A RS60751B1 (sr) 2014-09-03 2015-09-02 Citotoksični derivati benzodiazepina

Country Status (33)

Country Link
US (5) US9669102B2 (sr)
EP (2) EP3778601A1 (sr)
JP (4) JP6606545B2 (sr)
KR (2) KR20240023671A (sr)
CN (2) CN106604927B (sr)
AU (3) AU2015311987B2 (sr)
BR (1) BR112017002963A2 (sr)
CA (1) CA2959630A1 (sr)
CL (1) CL2017000507A1 (sr)
CO (1) CO2017003011A2 (sr)
CR (1) CR20170111A (sr)
CY (1) CY1123325T1 (sr)
DK (1) DK3189056T3 (sr)
DO (1) DOP2017000053A (sr)
EA (1) EA034138B1 (sr)
EC (1) ECSP17020133A (sr)
ES (1) ES2815353T3 (sr)
HU (1) HUE051002T2 (sr)
IL (4) IL250712B (sr)
LT (1) LT3189056T (sr)
MA (1) MA54254A (sr)
MX (1) MX2017002758A (sr)
PE (1) PE20170775A1 (sr)
PH (1) PH12017500358A1 (sr)
PL (1) PL3189056T3 (sr)
PT (1) PT3189056T (sr)
RS (1) RS60751B1 (sr)
SG (2) SG10201901824UA (sr)
SI (1) SI3189056T1 (sr)
SM (1) SMT202000449T1 (sr)
TN (1) TN2017000070A1 (sr)
TW (4) TWI819474B (sr)
WO (1) WO2016036801A1 (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2958882A1 (en) * 2014-09-02 2016-03-10 Immunogen, Inc. Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
MX2017002758A (es) 2014-09-03 2017-10-20 Immunogen Inc Derivados de benzodiazepina citotoxicos.
KR20240063203A (ko) 2015-06-29 2024-05-09 이뮤노젠 아이엔씨 항-cd123 항체 및 이들의 접합체와 유도체
EP3325483B1 (en) * 2015-07-21 2019-10-02 ImmunoGen, Inc. Methods of preparing cytotoxic benzodiazepine derivatives
JP2019501139A (ja) 2015-11-25 2019-01-17 イミュノジェン・インコーポレーテッド 医薬製剤及びその使用
KR20180115687A (ko) * 2016-02-05 2018-10-23 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 Gcc-표적 항체-약물 콘주게이트
CN116813690A (zh) 2016-11-23 2023-09-29 伊缪诺金公司 苯并二氮䓬衍生物的选择性磺化
EP3558391B1 (en) 2016-12-23 2022-02-02 Immunogen, Inc. Immunoconjugates targeting adam9 and methods of use thereof
TW201825515A (zh) 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
WO2018183494A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Immunogen, Inc. Cd19-targeting antibody-drug conjugates
MA51510A (fr) 2017-04-20 2020-11-11 Immunogen Inc Procédés de préparation de dérivés d'indolinobenzodiazépine
WO2019104289A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
EP3727463A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 Mersana Therapeutics, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody conjugates
TWI897855B (zh) 2018-10-26 2025-09-21 美商免疫遺傳股份有限公司 Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
TW202102270A (zh) * 2019-03-21 2021-01-16 美商伊繆諾金公司 製備細胞結合劑-藥物結合物之方法
BR112021017350A2 (pt) * 2019-03-27 2021-11-16 Daiichi Sankyo Co Ltd Combinação de conjugado de anticorpo-derivado de pirrolobenzodiazepina e inibidor de parp
US20220306751A1 (en) 2019-09-13 2022-09-29 Mythic Therapeutics, Inc. Antigen-binding protein constructs and uses thereof
CN119486758A (zh) 2022-06-30 2025-02-18 东丽株式会社 癌的治疗和/或预防用药物组合物
WO2024222841A1 (zh) * 2023-04-27 2024-10-31 石药集团巨石生物制药有限公司 一种抗体药物偶联物

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3453266A (en) 1966-03-14 1969-07-01 American Home Prod 1,2,5-benzothiadiazepine 1,1-dioxides
US3506646A (en) 1966-06-27 1970-04-14 American Home Prod Process for the preparation of 7h-pyrido (1,2-b)(1,2,5)benzothiadiazepine 5,5 - dioxides and pyrrolo(1,2-b)(1,2,5)benzothiadiazepine 5,5-dioxides
US3875162A (en) 1973-07-26 1975-04-01 Squibb & Sons Inc Certain 6H-pyrimido{8 1,2-c{9 {8 1,3,5{9 benzothiadiaza compounds
US4003905A (en) 1974-12-11 1977-01-18 E. R. Squibb & Sons, Inc. Diels-alder adducts of benzdiazepines
US4444688A (en) 1981-05-11 1984-04-24 Ciba-Geigy Corporation Imidazobenzothiadiazepines
JP2920385B2 (ja) 1988-08-18 1999-07-19 武田薬品工業株式会社 １，２，５‐ベンゾチアジアゼピン誘導体，その製造法および用途
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
DE69231123T2 (de) 1992-03-25 2001-02-15 Immunogen Inc Konjugaten von Zell-bindender Mittel und Derivaten von CC-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US20080152586A1 (en) 1992-09-25 2008-06-26 Avipep Pty Limited High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
JP2002501721A (ja) 1997-08-01 2002-01-22 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト 多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ
US6156746A (en) 1998-08-25 2000-12-05 Bristol-Myers Squibb Company 1,2,5-benzothiadiazepine-1,1-dioxides with n-2 imidazolylalkyl substituents
ATE240334T1 (de) 1998-08-27 2003-05-15 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
JP2003514903A (ja) 1999-11-24 2003-04-22 イムノージェン インコーポレーテッド タキサンを含有する細胞傷害薬とその治療への利用
JP5291279B2 (ja) 2000-09-08 2013-09-18 ウニヴェルジテート・チューリッヒ 反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
GB0209467D0 (en) 2002-04-25 2002-06-05 Astrazeneca Ab Chemical compounds
JP2005539009A (ja) 2002-08-02 2005-12-22 イミュノジェン・インコーポレーテッド 新規の効力のあるタキサンを含む細胞毒性物質、および、それらの治療用途
ATE499116T1 (de) 2002-08-16 2011-03-15 Immunogen Inc Vernetzer mit hoher reaktivität und löslichkeit und ihre verwendung bei der herstellung von konjugaten für die gezielte abgabe von kleinmolekularen arzneimitteln
KR20050059332A (ko) 2002-11-07 2005-06-17 이뮤노젠 아이엔씨 항-씨디33 항체와 이를 이용한 급성 골수성 백혈병의치료방법
FR2850654A1 (fr) 2003-02-03 2004-08-06 Servier Lab Nouveaux derives d'azepines tricycliques, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
EP3524611B1 (en) 2003-05-20 2020-12-30 ImmunoGen, Inc. Improved cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7834155B2 (en) 2003-07-21 2010-11-16 Immunogen Inc. CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
HRP20110302T1 (hr) 2003-07-21 2011-06-30 Immunogen Ca6 antigen-specifični citotoksični konjugat i postupci za njegovu uporabu
US7511032B2 (en) 2003-10-22 2009-03-31 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
JP5166861B2 (ja) 2004-03-09 2013-03-21 スピロゲン リミティッド ピロロベンゾジアゼピン
EP3225633B1 (en) 2004-05-21 2020-03-25 The UAB Research Foundation Variable lymphocyte receptors, related polypeptides and nucleic acids, and uses thereof
CA2567520A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Maytansinoid-antibody conjugates
EP3088004B1 (en) 2004-09-23 2018-03-28 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CA2587589A1 (en) 2004-11-29 2006-06-22 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
WO2006086733A2 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Immunogen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
DK1902131T3 (da) 2005-07-08 2010-03-01 Univ Zuerich Fag-display under anvendelse af cotranslational translokation af fusionspolypeptider
US7772485B2 (en) 2005-07-14 2010-08-10 Konarka Technologies, Inc. Polymers with low band gaps and high charge mobility
ITRM20050416A1 (it) 2005-08-03 2007-02-04 Uni Degli Studi Di Roma Tor Vergata Derivati delle benzodiazepine e loro usi in campo medico.
MX2008002607A (es) 2005-08-22 2008-03-19 Immunogen Inc Un conjugado citotoxico ca6 antigeno-especifico y metodos para utilizar el mismo.
NZ595430A (en) 2005-08-24 2013-05-31 Immunogen Inc Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
WO2007062466A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
PT1813614E (pt) 2006-01-25 2012-01-09 Sanofi Sa Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina
EP1996612A4 (en) 2006-03-03 2010-10-20 Univ Kingston COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
US8524865B2 (en) 2006-05-30 2013-09-03 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
AU2007262666B2 (en) 2006-06-22 2013-09-12 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
DK2019104T3 (da) 2007-07-19 2013-12-16 Sanofi Sa Cytotoksiske midler, der omfatter nye tomaymycinderivater, og terapeutisk anvendelse deraf
JP2010539915A (ja) 2007-09-24 2010-12-24 ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ 設計されたアルマジロリピートタンパク質
CN104524592B (zh) 2008-04-30 2018-06-05 伊缪诺金公司 交联剂和它们的用途
CN102083461B (zh) 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
RS55218B1 (sr) 2008-10-31 2017-02-28 Janssen Biotech Inc Kompozicije fibronektin tip iii skalno baziranih domena, metode i upotrebe
CN102365021B (zh) 2009-02-05 2015-07-15 伊缪诺金公司 新型苯并二氮杂*衍生物
MX2011008566A (es) 2009-02-12 2011-11-29 Janssen Biotech Inc Composiciones supercontigo basadas en el dominio de fibronectina tipo iii, metodos y usos.
FR2947269B1 (fr) * 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
EP2516462B1 (en) 2009-12-23 2015-05-06 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
SMT201700139T1 (it) 2010-02-24 2017-05-08 Immunogen Inc Immunoconiugati contro il recettore 1 del folato e relativi usi
MY177062A (en) 2010-03-12 2020-09-03 Debiopharm Int Sa Cd37-binding molecules and immunoconjugates thereof
RU2767543C2 (ru) 2010-04-30 2022-03-17 Янссен Байотек, Инк. Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения
CN103328505B (zh) 2010-10-29 2015-12-02 伊缪诺金公司 非拮抗性egfr结合分子及其免疫偶联物
EP2632490A4 (en) 2010-10-29 2014-10-22 Immunogen Inc NOVEL MOLECULES BINDING TO THE EGF RECEPTOR AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF
SMT201900181T1 (it) 2011-02-15 2019-05-10 Immunogen Inc Metodi di preparazione di coniugati
CN114441757A (zh) 2011-04-01 2022-05-06 伊缪诺金公司 用于增加folr1癌症治疗的功效的方法
WO2014031566A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
AU2013340449B2 (en) * 2012-11-05 2017-11-30 Pfizer Inc. Spliceostatin analogs
MX2017002758A (es) 2014-09-03 2017-10-20 Immunogen Inc Derivados de benzodiazepina citotoxicos.
SG11201701565PA (en) * 2014-09-03 2017-03-30 Immunogen Inc Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents

Also Published As

Publication number Publication date
PT3189056T (pt) 2020-09-04
TWI697493B (zh) 2020-07-01
TWI757759B (zh) 2022-03-11
EP3189056A1 (en) 2017-07-12
PE20170775A1 (es) 2017-07-04
MA54254A (fr) 2021-09-22
US20170340748A1 (en) 2017-11-30
EA201790446A1 (ru) 2017-07-31
ECSP17020133A (es) 2018-02-28
MX2017002758A (es) 2017-10-20
IL250712B (en) 2020-04-30
DK3189056T3 (da) 2020-09-14
CO2017003011A2 (es) 2017-07-11
AU2020227006A1 (en) 2020-09-24
US10722588B2 (en) 2020-07-28
US20190269786A1 (en) 2019-09-05
JP2020075912A (ja) 2020-05-21
IL274114A (en) 2020-06-30
TW202222802A (zh) 2022-06-16
HUE051002T2 (hu) 2021-01-28
US9669102B2 (en) 2017-06-06
CN116514903A (zh) 2023-08-01
JP2021042234A (ja) 2021-03-18
JP6606545B2 (ja) 2019-11-13
IL250712A0 (en) 2017-08-31
AU2022202418B2 (en) 2024-06-06
AU2022202418A1 (en) 2022-05-19
US20200405870A1 (en) 2020-12-31
US20160082114A1 (en) 2016-03-24
US10238751B2 (en) 2019-03-26
CR20170111A (es) 2017-05-23
ES2815353T3 (es) 2021-03-29
BR112017002963A2 (pt) 2019-07-16
JP2017527563A (ja) 2017-09-21
EA034138B1 (ru) 2020-01-09
SMT202000449T1 (it) 2020-09-10
KR20170063670A (ko) 2017-06-08
DOP2017000053A (es) 2017-05-31
CN106604927B (zh) 2022-08-09
JP7132311B2 (ja) 2022-09-06
TW202037596A (zh) 2020-10-16
CA2959630A1 (en) 2016-03-10
AU2015311987B2 (en) 2020-06-04
TW201613929A (en) 2016-04-16
TW202417447A (zh) 2024-05-01
KR20240023671A (ko) 2024-02-22
WO2016036801A1 (en) 2016-03-10
IL291598A (en) 2022-05-01
JP2022166293A (ja) 2022-11-01
CN106604927A (zh) 2017-04-26
EP3778601A1 (en) 2021-02-17
IL281317B (en) 2022-04-01
SG10201901824UA (en) 2019-03-28
US20230233697A1 (en) 2023-07-27
EP3189056B1 (en) 2020-06-10
TWI819474B (zh) 2023-10-21
US11116845B2 (en) 2021-09-14
JP6802340B2 (ja) 2020-12-16
SG11201701455SA (en) 2017-03-30
SI3189056T1 (sl) 2020-10-30
KR102632830B1 (ko) 2024-02-02
CL2017000507A1 (es) 2017-11-03
PL3189056T3 (pl) 2020-11-02
AU2015311987A1 (en) 2017-03-09
TN2017000070A1 (en) 2018-07-04
PH12017500358A1 (en) 2017-07-17
AU2020227006B2 (en) 2022-05-12
LT3189056T (lt) 2020-09-25
CY1123325T1 (el) 2021-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7132311B2 (ja) 細胞障害性ベンゾジアゼピン誘導体
US9974867B2 (en) Cytotoxic benzodiazepine derivatives
HK40046012A (en) Cytotoxic benzodiazepine derivatives
HK1236943B (en) Cytotoxic benzodiazepine derivatives
HK1236943A1 (en) Cytotoxic benzodiazepine derivatives
EA039619B1 (ru) Способ получения индолинобензодиазепиновых соединений