MX2012012441A

MX2012012441A - Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidermico (egfr) y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2012012441A
Application number: MX2012012441A
Authority: MX
Inventors: Michael Feldhaus; Raghida Bukhalid; Anne King; Neeraj Kohli; Eric Krauland; Ulrik Nielsen
Original assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2013-02-26
Also published as: AU2011248088A1; US20110287002A1; IL222657A; SG185366A1; KR20130060223A; US9044460B2; CN103189073A; US20150368361A1; ZA201207919B; EP2566512A1; IL222657A0; CA2798273A1; RU2012151823A; WO2011140254A1; AU2011248088B2; JP2013533211A; CN105153307A; CN103189073B; US20160002339A1

Abstract

Se describen anticuerpos anti-EGFR, composiciones terapéuticas que comprenden combinaciones de anticuerpos anti-EGFR, así como métodos para usar dichos anticuerpos y composiciones para tratar trastornos relacionados con EFGR (v.gr., cánceres).

Description

ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGFR) Y USOS DE LOS MISMOS Antecedentes El sistema inmune natural ha evolucionado para producir anticuerpos para la neutralización eficiente de los agentes patógenos. Las preparaciones de anticuerpos naturales aislados a partir de animales inmunizados son policlonales en origen, y exhiben inmunodominancia en comparación con los anticuerpos individuales, que están restringidos a uno o unos pocos epítopos de un antígeno particular. Los anticuerpos neutralizantes son capaces de bloquear una función biológica del antígeno al que se unen. Las mezclas de anticuerpos neutralizantes pueden lograr una neutralización que es mayor que la de cualquier anticuerpo individual en la mezcla.

Estos resultados se han logrado mediante la combinación de dos o más anticuerpos neutralizantes contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico, EGFR (ErbB l ). Los anticuerpos que se unen e inhiben al EGFR han demostrado que proporcionan beneficios útiles contra el cáncer y son de gran valor médico y comercial. Las combinaciones particulares de pares de anticuerpos anti-EGFR antagonistas pero no competitivos, resultaron en la regulación decreciente del EGFR lo que fue más rápido y más efectivo que la aplicación de cualquier anticuerpo solo (Friedman y otros (2005) PNAS 102: 1915-1920). La combinación de dos anticuerpos anti-EGFR competitivos cruzados (es decir, competitivos entre sí por la unión al antígeno) demostró ser no sinérgica. Es posible que la unión de una pluralidad de anticuerpos a epítopes de EGFR distintos forme enrejados de receptores acomplejados en las superficies celulares, lo que conduce a la intemalización y degradación más eficiente que las obtenidas con anticuerpos que se dirigen a un único epítopo. Se reportó además que la combinación de un par particular de anticuerpos anti-receptor EGFR resulta en una actividad aditiva y en algunos casos sinérgica, antitumoral in vivo (Perera y otros (2005) Clin Cáncer Res 1 1 :6390-6399). El anticuerpo monoclonal 806 combinado con el anticuerpo antagonista 528, levantado contra el mutante de2-7 EGFR, mostró actividad anti-tumoral significativamente mayor en un modelo de xenoinjerto de glioma que en el tratamiento con anticuerpo solo. Se demostró que el mecanismo de la actividad antitumoral sinérgica se asocia con la rápida regulación decreciente del EGFR, que no se indujo por el tratamiento con los anticuerpos individuales. Del mismo modo, la fosforilación de EGFR se redujo en gran medida en presencia de otro par de anticuerpos anti-EGFR, cetuximab y EMD55900 (Kamat y otros (2008) Cáncer Biol Ther 7:726-33).

Ciertas combinaciones de anticuerpos dirigidos al receptor relacionado, ErbB2, también demostraron que funcionan en sinergia (Friedman y otros (2005). El trastuzumab en combinación con pertuzumab inhiben la supervivencia de las células de cáncer de mama BT474 a dosis en las que los anticuerpos individuales son inefectivos (Nahta y otros (2004) Cáncer Res 64:2343-2346). En otro estudio tres anticuerpos no competitivos anti-ErbB2 demostraron la destrucción in vitro de células BT474 mucho más eficiente en combinación que individualmente y se obtuvieron resultados similares en un modelo de xenoinjerto BT474 in vivo (Spiridon y otros (2002) Clin Cáncer Res 8: 1699-701).

Se reportó otra evidencia de que la combinación de más de un anticuerpo puede mejorar el efecto supresor del crecimiento (por ejemplo, citotóxico) de los anticuerpos en las células humorales. Por ejemplo, se combinaron los anticuerpos monoclonales contra el antígeno del tumor 17-1A, se estudió la lisis celular tumoral, y se encontró que los anticuerpos monoclonales, así como las combinaciones de los anticuerpos competitivos fueron inefectivos, mientras que las combinaciones de dos o más anticuerpos no competitivos resultaron en la lisis celular tumoral completa.

Por consiguiente, aún se necesitan los enfoques y métodos adicionales para producir la acción combinatoria a fin de aumentar la capacidad de respuesta de los tumores a las combinaciones de anticuerpos anti-EGFR, incluyendo combinaciones que aumentan la inhibición de la señalización y las combinaciones que proporcionan resultados citostáticos o citotóxicos más efectivos.

Sumario En la presente descripción se proporcionan nuevos anticuerpos monoclonales que se unen a EGFR e inhiben diversas funciones del EGFR. Estos anticuerpos, cuando se combinan entre sí o con otros anticuerpos anti-receptor ErbB (por ejemplo, otros anticuerpos anti-EGFR), son capaces de exhibir un efecto terapéutico sinérgico o aditivo en comparación con la administración de cada anticuerpo solo. Estos anticuerpos, particularmente cuando se administran en combinaciones como se proporcionan en la presente, son útiles para tratar una variedad de trastornos (por ejemplo, cánceres) asociados con la señalización celular mediada por EGFR. En consecuencia, también se proporcionan en la presente combinaciones de nuevos anticuerpos monoclonales que se unen a EGFR e inhiben varias funciones EGFR. También se proporcionan los usos de estos anticuerpos para fines diagnósticos y terapéuticos, como son los usos de las combinaciones de anticuerpos descritos en la presente.

En una modalidad, se proporcionan anticuerpos monoclonales que se unen a EGFR y las combinaciones de tales anticuerpos. Estos anticuerpos y combinaciones exhiben una o más de las siguientes propiedades: (a) inhibición de la fosforilación de ER o AKT, por ejemplo, la fosforilación de AKT o ERX dependiente de EGFR, medida en un ensayo basado en células; (b) inhibición del crecimiento de las células que expresan EGFR; (c) inhibición de la unión del ligando EGF de EGFR (por ejemplo la inhibición de la unión de uno o más ligandos que se unen a EGFR, incluyendo EGF, el factor de crecimiento transformante (TGF), o anfiregulina; (d) inhibición de la dimerización a EGFR, o (e) regulación decreciente de EGFR en la superficie celular (por ejemplo, por internalización y el reciclado del receptor, y/o internalización y degradación del receptor).

En una modalidad particular, los anticuerpos (es decir, cuando se combinan se unen a etopos no solapantes, como se determinó usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, BIACORE) o FACS, u otros ensayos similares. En otra modalidad particular, los anticuerpos proporcionan aditiva o sinérgicamente al menos una de las propiedades funcionales descritas anteriormente, es decir, (a) la inhibición de la fosforilación de ERK o AKT, por ejemplo, la fosforilación de AKT o ERK EGFR-dependiente, como se mide en un ensayo basado en células; (b) inhibición del crecimiento de las células que expresan EGFR; (c) inhibición de la unión del ligando al EGFR (por ejemplo, inhibición de la unión de uno o más ligandos que se unen a EGFR, incluyendo el EGF, el factor de crecimiento transformante (TGF), o anfiregulina); (d) inhibición de la dimerización a EGFR, o (e) regulación decreciente de EGFR en la superficie celular (por ejemplo, por internalización y el reciclado del receptor, y/o internalización y degradación del receptor).

En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales individuales inhiben las acciones de los ligandos de EGFR, que todavía no compiten de forma cruzada (es decir, se unen a epítopos distintos).

En particular los anticuerpos monoclonales anti-EGFR proporcionados en la presente incluyen los que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: l-1 1 o una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 12-17 y 19-22. Los anticuerpos proporcionados en la presente incluyen además los que comprenden una región variable de la cadena pesada y ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos: * TABLA I Cadena ligera Cadena pesada va sec. con núm. de ident.:9 y sec. con núm. de ident.:20; vb sec. con núm. de ident.: 10 y sec. con núm. de ident.:21 ; ve sec. con núm. de ident.: l l y sec. con núm. de ident.:22; vd sec. con núm. de ident.: l y sec. con núm. de ident.: 12; ve sec. con núm. de ident.:2 y sec. con núm. de ident.: 13; vf sec. con núm. de ident.:3 y sec. con núm. de ident.: 14; vg sec. con núm. de ident.:4 y sec. con núm. de ident: 15; vh sec. con núm. de ident.:5 y sec. con núm. de ident: 16; vi sec. con núm. de ident.:6 y sec. con núm. de ident.: 17; j sec. con núm. de ident.:8 y sec. con núm. de ident.: 19.

* Nombre de los anticuerpos, es decir, va, vb, ve, etc.

Los anticuerpos que se unen al mismo epítopo en EGFR como cualquiera de los anticuerpos que se exponen en la Tabla I se contemplan además para usar en las combinaciones de anticuerpo descritas en la presente descripción.

Otros anticuerpos particulares en la presente descripción incluyen los que comprenden las siguientes secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada y ligera, (cada dos números de dígito en esta Tabla II representa una sec. con núm. de ident.: como se expone en las Tablas VI y VII más abajo).

** TABLA II Cadena ligera (sec. con núm. de ident:) Cadena pesada (sec. con núm. de ident:) CDR3 CDR2 CDRl CDR3 CDR2 CDRl ca 34 30 29 49 45 48; cb 37 36 35 51 45 50; ce 38 36 35 52 45 48; cd 31 30 29 55 54 53; ce 32 30 29 55 o 56 54 53; cf 33 30 29 56 54 53; ** TABLA 11 Cadembg(M (sec. connúrn. deidenL:) Cadena pesada (sec. con núm. de ictent:) CDR3 CDR2 CDR1 CDR3 CDR2 CDR1 cg 25 24 23 41 40 39; ch 26 24 23 42 40 39; ci 27 24 23 43 40 39; cj 28 24 23 46 45 44; ck 28 24 23 47 45 44. ** hombre de los anticuerpos, es decir, ca, cb, ce, etc.

Los anticuerpos que se unen al mismo epítopo en EGFR como cualquiera de los anticuerpos que se exponen en la Tabla 2 se contemplan además para usar en las combinaciones de anticuerpo descritas en la presente descripción.

También la presente invención abarca los anticuerpos monoclonales que se unen a los mismos epítopos o los solapantes por cualquiera de los anticuerpos particulares descritos en la presente a continuación.

Los anticuerpos descritos en la presente incluyen todas las formas conocidas de anticuerpos y otras armazones proteicas con propiedades similares a un anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífíco, un inmunoconjugado, un anticuerpo quimérico o una armazón proteica con propiedades similares a un anticuerpo, tales como repeticiones de fibronectina o anquirina. El anticuerpo también puede ser un Fab, Fab'2, ScFv, AFICUERPO, nanocuerpo, o un anticuerpo de dominio. El anticuerpo puede tener además cualquier isotipo, incluyendo cualquiera de los siguientes isotipos: IgGl , IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl , IgA2, IgAsec, IgD, e IgE. Se prefiren los anticuerpos IgG.

Las combinaciones ilustrativas de dos anticuerpos (de aquí en adelante "par" o "pares") que se proporcionan en la presente descripción, incluyen: ***Nombre del par de anticuerpo Como se expone en las tablas anteriores, un anticuerpo nombrado se considera que es un anticuerpo que competirá con él mismo. Además se contemplan los pares de anticuerpos que compiten por la unión al EGFR con, o se unen a los mismos epítopos en EGFR que los pares de anticuerpos que se exponen en la Tabla III.

Las combinaciones ilustrativas de tres o más anticuerpos incluyen cada par designado a- x inmediatamente arriba en conjunto con un tercer anticuerpo no presente en el par particular y seleccionado de cd, ce, cf, cg, ch, ci, cj, y ck e incluye además cada combinación binaria designada anteriormente as y, z, aa, ab, ac, ad, ae, ag, ah, ai, aj, ak, al ,am , ao, ap, aq, ar, as, at, au ,ó av en conjunto con un tercer anticuerpo no presente en el par particular y seleccionado de vd, ve, vf, vg, vh, vi, y vj.

Las combinaciones ilustrativas de tres anticuerpos (de aquí en adelante "trío" o "tríos") proporcionadas en la presente descripción incluyen además los nombrados en la Tabla IV y Tabla V más abajo, así como los tríos que comprende, para cada trío nombrado en la Tabla IV y Tabla V, más abajo, cada uno de los anticuerpos que compite por la unión al EGFR con cada uno de los anticuerpos de ese trío nombrado. Los anticuerpos descritos en la presente descripción se categorizaron en grupos, o "bins" basado en experimentos de unión de competencia, y se describen en correspondencia en los Ejemplos y Figuras. Los anticuerpos del Binl compiten todos entre si por la unión al dominio extracelular de EGFR, los anticuerpos Bin2 compiten todos entre si por la unión al dominio extracelular de EGFR, y los anticuerpos Bin3 compiten todos entre si por la unión al dominio extracelular de EGFR. Sin embargo, los anticuerpos Binl no compiten con los anticuerpos Bin 2 o los anticuerpos Bin 3 por la unión al dominio extracelular de EGFR, los anticuerpos Bin2 no compiten con los anticuerpos Bin 1 o anticuerpos Bin 3 por la unión al dominio extracelular de EGFR, y los anticuerpos Bin3 no compiten con los anticuerpos Bin 1 o anticuerpos Bin 2 por la unión al dominio extracelular de EGFR. Así, cada Bin corresponde a un epítopo diferente al cual los anticuerpos en ese Bin se unirán. Los anticuerpos Bin 1 , Bin2, y Bin3 se refieren en las Tablas IV y V más abajo como "1er anticuerpo," "3er anticuerpo," y "2do anticuerpo," respectivamente.

Como se expone en las Tablas I-V anteriores, un anticuerpo nombrado se considera que es un anticuerpo que competirá con él mismo por la unión a EGFR.

Además la invención abarca los tríos de anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epitopo en EGFR como, cualquiera de los tríos de anticuerpos que se exponen en la Tabla IV anteriormente.

Como se expone en la Tabla IV, los anticuerpos Bin l incluyen los anticuerpos va, vb and ve (como se define en la Tabla I) y los anticuerpos ca, cb y ce (como se define en la Tabla II). Los anticuerpos Bin2 incluyen los anticuerpos vd, ve, vf, vg y vh (como se define en la Tabla I) y los anticuerpos cd, ce y cf (como se define en la Tabla II). Los anticuerpos Bin3 incluyen los anticuerpos vi y vj (como se define en la Tabla I) y los anticuerpos cg, ch, ci, cj y ck (como se define en la Tabla II).

Además se proporcionan composiciones de pares de anticuerpos anti-EGFR (dos anticuerpos, o dúo de anticuerpos), en las cuales un anticuerpo del par compite por la unión con, o se une al mismo epitopo que, un anticuerpo Binl como se define en la presente, y el segundo anticuerpo del par compite por la unión con, o se une al mismo epitopo que, un anticuerpo Bin2 como se define en la presente. Así, en una modalidad, se proporciona una composición de un par de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epitopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de va, vb y ve o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de ca, cb y ce y (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vd, ve, vf, vg y vh o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cd, ce y cf.

Se proporcionan además composiciones de pares de anticuerpos anti-EGFR (dos anticuerpos, o dúo de anticuerpos), en las cuales un anticuerpo del par compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Binl como se define en la presente, y el segundo anticuerpo del par compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin3 como se define en la presente. Así, en una modalidad, se proporciona una composición de un par de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de va, vb y ve o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de ca, cb y ce y (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vi y vj o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cg, ch, ci, cj y ck.

Se proporcionan además composiciones de pares de anticuerpos anti-EGFR (dos anticuerpos, o dúo de anticuerpos), en las cuales un anticuerpo del par compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin2 como se define en la presente, y el segundo anticuerpo del par compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin3 como se define en la presente. Así, en una modalidad, se proporciona una composición de un par de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vd, ve, vf, vg y vh o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cd, ce y cf y (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vi y vj o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cg, ch, ci, cj y ck.

Se proporcionan además composiciones de trios de anticuerpos anti-EGFR (tres anticuerpos, o triplete de anticuerpos), en las cuales un anticuerpo del trio compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin l como se define en la presente, un segundo anticuerpo del trío compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin2 como se define en la presente, y un tercer anticuerpo del trío compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin3 como se define en la presente. Así, en una modalidad, se proporciona una composición de un trío de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de va, vb y ve o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de ca, cb y ce; (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vd, ve, vf, vg y vh o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cd, ce y cf; y (iii) el tercer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vi y vj o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cg, ch, ci, cj y ck.

Por ejemplo, se proporciona una composición que comprende un trío de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ca (que comprende las CDR de cadena pesada 1 , 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 29, 30 y 34, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 48, 45 y 49, respectivamente); (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cd (que comprende las CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 29, 30 y 31 , respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 53, 54 y 55, respectivamente); y (iii) el tercer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ch (que comprende las CDR de cadena pesada 1 , 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 23, 24 y 26, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 39, 40 y 42, respectivamente). La combinación del trío de anticuerpos ca, cd y ch se describe además en la presente como el trío de anticuerpos 4c que se expone en la Tabla IV.

En las siguientes Tablas VI y VII, las secuencias de aminoácido de CDR se exponen inmediatamente arriba a las sec. con núms. de ident. correspondientes en cada columna, mientras que las secuencias variables de cadena pesada y ligera completas correspondientes se indican por la sec. con núm. de ident. en la fila precedente en la columna a mano izquierda.

TABLA VII Cadena ligera CDR 1 CDR 2 CDR 3 Sec. con núm. de ident.: Sec. con núm. de ident.: Sec. con núm. de 48 45 ident.: 52 Las composiciones contempladas pueden incluir además, o se pueden preparar para uso como un medicamento en la terapia de combinación con, un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente contra el cáncer adicional. Un "agente contra el cáncer" es un fármaco usado para tratar tumores, cánceres, rumores malignos, y similares. El tratamiento farmacológico (por ejemplo, con las composiciones de anticuerpos descritas en la presente) se puede administrar sin otro tratamiento, o en combinación con otros tratamientos tales como cirugía, terapia de calor o radiación (por ejemplo, con radiación ionizante). Varias clases de agentes contra el cáncer se pueden usar en el tratamiento del cáncer, dependiendo de la naturaleza del órgano o tejido implicado. Por ejemplo, los cánceres de mama son comúnmente estimulados por los estrógenos, y se pueden tratar con fármacos que inactivan las hormonas sexuales. De manera similar, el cáncer de próstata puede ser tratado con medicamentos que inactivan los andrógenos. Los agentes contra el cáncer para el uso en combinación con composiciones de anticuerpos descritas en la presente incluyen, entre otros, los enumerados en el ANEXO A, que no se deben interpretar como limitantes. Se pueden administrar uno o más agentes contra el cáncer ya sea simultáneamente o antes o después de la administración de una composición de anticuerpo descrita en la presente. Las composiciones de anticuerpo descritas en la presente se pueden administrar secuencialmente o junto con el agente contra el cáncer adicional, por ejemplo, un agente contra el cáncer descrito en el ANEXO A, a continuación.

Se proporcionan también los métodos de selección de combinaciones particulares de los anticuerpos. En una modalidad, tales métodos incluyen la selección de anticuerpos anti-EGFR que tienen una IC50 y/o IC90 en particular con respecto a una actividad o función de EGFR (por ejemplo, una IC90 mejor que de 80 nM - por ejemplo, una IC90 de 70 nM o inferior - para la inhibición de la señalización mediada por EGFR). Tales anticuerpos se pueden administrar en combinación (por ejemplo, juntos) o secuencialmente. En otra modalidad, el método incluye la etapa adicional de selección de combinaciones de anticuerpos que no compiten entre sí por la unión a EGFR. Los criterios de selección adicionales incluyen al menos una de las siguientes propiedades: (i) inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR en un modelo de xenoinjerto in vivo; (ii) inhibición de un ligando de EGFR que se une a EGFR in vitro; (iii) inhibición de la dimerización del EGFR in vitro; o (iv) regulación decreciente de EGFR en las superficies celulares in vitro.

Se contemplan también los kits que comprenden uno o más anticuerpos o la composición según la invención, opcionalmente, contenido dentro de un único frasco y/o con instrucciones para el uso en el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad asociada con EGFR, tales como cánceres. Dichos kits pueden comprender la composición de anticuerpo en forma de dosificación unitaria, tal como en un frasco de dosis única o una jeringa de dosis única pre-cargada.

Los anticuerpos y las composiciones descritos en la presente se pueden usar en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico, en particular las aplicaciones oncológicas. Por consiguiente, en otro aspecto, se proporcionan en la presente los métodos para inhibir la actividad de EGFR en un sujeto mediante la administración de uno o más anticuerpos o composiciones descritas en la presente en una cantidad suficiente para inhibir la actividad mediada por EGFR. Las indicaciones terapéuticas particulares que se pueden tratar incluyen, por ejemplo, los cánceres de órganos o tejidos tales como, la piel, cerebro y sistema nervioso central, de cabeza y cuello, esófago, estómago, colon, recto, ano, hígado, páncreas, el conducto biliar, la vesícula biliar, pulmón o bronquios, mama, ovario, útero, cuello uterino, vagina, testículos, las células germinales, próstata, riñon, uréter, vejiga urinaria, adrenal, pituitaria, tiroides, hueso, músculo u otros tejidos conectivos, leucemia, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin y linfoma no de Hodgkin.

Los anticuerpos de los descritos en la presente también se puede usar para diagnosticar o pronosticar enfermedades (por ejemplo, cáncer) asociadas con EGFR, por ejemplo, poniendo en contacto uno o más anticuerpos, anticuerpos pares o tríos de anticuerpos descritos en la presente (por ejemplo, ex vivo o in vivo) con células del sujeto, y medir el nivel de unión a EGFR en las células, en donde los niveles anormalmente altos de la unión a EGFR indican que el sujeto tiene un cáncer asociado a EGFR.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras Figura 1 : Secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables compuestas por la sec. con núm. de ident. l, sec. con núm. de ident.:2, sec. con núm. de ident.:3, sec. con núm. de ident.:4, y sec. con núm. de ident.:5. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. La secuencia que se extiende del extremo de FR3 hasta el comienzo de la región JH comprende CDR3. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región pesada constante.

Figura 2: Secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables que comprenden la sec. con núm. de ident. : 1 , sec. con núm. de ident. :2, sec. con núm. de ident.:3, sec. con núm. de ident.:4, y sec. con núm. de ident. :5. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. La secuencia que se extiende del extremo de FR3 hasta el comienzo de la región JH comprende CDR3. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región pesada constante.

Figura 3: Secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables que comprenden la sec. con núm. de ident.:6, sec. con núm. de ident.:7, sec. con núm. de ident.:8 y sec. con núm. de ident.:9. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. La secuencia que se extiende del extremo de FR3 hasta el comienzo de la región JH comprende CDR3. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región pesada constante.

Figura 4: Secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables que comprenden la sec. con núm. de ident.:6, sec. con núm. de ident.:7, sec. con núm. de ident.:8 y sec. con núm. de ident. :9. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. La secuencia que se extiende del extremo de FR3 hasta el comienzo de la región JH comprende CDR3. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región pesada constante.

Figura 5: Secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables que comprenden la sec. con núm. de ident.:10 y sec. con núm. de ident. : 1 1. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. La secuencia que se extiende del extremo de FR3 hasta el comienzo de la región JH comprende CDR3. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región pesada constante.

Figura 6: Secuencias de aminoácidos de las regiones pesadas variables que comprenden la sec. con núm. de ident.: 10 y sec. con núm. de ident.: l l . Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones de CDR según la base de datos de IMGT. La secuencia que se extiende del extremo de FR3 hasta el comienzo de la región JH comprende CDR3. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región pesada constante.

Figura 7: Secuencias de aminoácidos de las regiones ligeras variables (V kappa) que comprenden la sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13, y sec. con núm. de ident.: 14. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 8: Secuencias de aminoácidos para las regiones ligeras variables que comprenden la sec. con núm. de ident.: 12, sec. con núm. de ident.: 13 y sec. con núm. de ident.: 14. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 9: Secuencias de aminoácidos para las regiones ligeras variables que comprenden la sec. con núm. de ident. :20 y sec. con núm. de ident. :22. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 10: Secuencias de aminoácidos para las regiones variables ligeras que comprenden la sec. con núm. de ident.:20 y sec. con núm. de ident.:22. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 1 1 : Secuencias de aminoácidos de las regiones ligeras variables que comprende la sec. con núm. de ident. :21. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 12: Secuencias de aminoácidos de las regiones ligeras variables que comprende la sec. con núm. de ident. :21. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 13: Secuencias de aminoácidos para las regiones variables que comprenden la secuencia la sec. con núm. de ident.: 15 y sec. con núm. de ident.: 16. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 14: Secuencias de aminoácidos de las regiones ligeras variables que comprenden la sec. con núm. de ident.:15 y sec. con núm. de ident.: 16. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 15: Secuencias de aminoácidos de las regiones ligeras variables que comprenden la sec. con núm. de ident.:17 y sec. con núm. de ident.: 19. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos IMGT. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figura 16: Secuencias de aminoácidos de las regiones variables ligeras que comprenden la sec. con núm. de ident.: 17 y sec. con núm. de ident.: 19. Las secuencias están demarcadas para mostrar las posiciones CDR según la base de datos Vbase. Se expone además la secuencia de aminoácidos de la región ligera constante.

Figuras 17A-D: Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-EGFR mediante ELISA directo y resonancia de plasmón superficial. Las Figuras 17A-17C son gráficos que muestran los resultados de los ensayos ELISA con el tipo silvestre (Figura 17A), con el epítopo mutante Bin 1 (Figura 17B) o con el epítopo mutante Bin 3 (Figura 17C) con el dominio extracelular de EGFR (EGFR-ECD) como reactivo de captura. El eje x denota la concentración de anticuerpo y el eje y denota unidades relativas de luminiscencia (RLU). La Figura 17D es el resultado de un ensayo de resonancia de plasmón superficial que demuestra que la unión de los anticuerpos por el Bin 1, 2 y 3 se unen al dominio extracelular de EGFR con epítopos distintos, no solapantes. El anticuerpo ch (Bin3) se conjugó a la superficie de un chip BIACORE. Se inyectó EGFR-ECD de tipo silvestre (0.5 µ?) seguido por inyecciones secuenciales de anticuerpos cd (Bin2), cb (Binl), y ch (Bin3), el mismo anticuerpo conjugado en el chip como un control. El resultado se representa como un sensorgrama en el que el eje x denota tiempo de (segundos) y el eje y denota las unidades de respuesta BIACORE (RU).

Figuras 18A-C: inhibición de la señalización fosfo-ERK por combinaciones de dos anticuerpos anti-EGFR con epítopos no solapantes. Las células A431 se incubaron durante 2 h con las combinaciones equimolares indicadas de anticuerpos Bin 1 + Bin 3 (Figuras 18A y 18B) o Bin 1 + Bin 2 (Figura 18C) y los Usados celulares analizados por ELISA fosfo-ERK. El eje x denota la concentración de anticuerpo y el eje y denota la amplitud de la actividad de fosfo-ERK, normalizado a la amplitud de la observada en el control +del ligando EGF. Las líneas continuas representan un ajuste logístico del parámetro cinco a los datos de cada combinación. La tabla debajo de cada gráfico contiene la potencia (actividad de la fracción fosfo-ERK a concentraciones de saturación de anticuerpo), valor de IC50, y valor IC90 para cada combinación, tal como se calcula a partir de la función logística usada para ajustar los datos.

Figuras 19A-B: inhibición de señalización fosfo-ERK por combinaciones de dos o tres anticuerpos anti-EGFR con epítopos no solapantes. Las células A431 se trataron con la combinación equimolar triple de anticuerpos Binl , Bin 2 y Bin 3 (Figura 19A). La combinación del dúo de anticuerpos (Bin 1) y cd (Bin 2) se comparó después con el anticuerpo anti-EGFR conocido cetuximab (Figura 19B) y mostró ser más efectivo en la reducción de fosfo-ERK que este anticuerpo conocido en la técnica. Los experimentos se realizaron y los datos se representan gráficamente como en la Figura 18.

Figuras 20A-D: inhibición de la señalización fosfo-ERK por combinaciones equimolares y no equimolares de dos anticuerpos anti-EGFR con epítopos no solapantes. Las células A431 se trataron con diversas proporciones (en µg/ml) de pares de anticuerpos cb y cd (Figura 20A), cb y ch (Figura 20B), cb y ci (Figura 20C) y ca y cd (Figura 20D). Los experimentos se realizaron y los datos se representan gráficamente como en la Figura 18.

Figura 21 : Los datos de inhibición de la señalización de fosfo- ERK de las Figuras 20A-D se representan en un mapa de calor en el que el eje x (columnas) indica la concentración de anticuerpo, el eje y (filas) denota los pares de anticuerpos combinados en las proporciones indicadas, y el eje z (en el plano) denota la fracción de la actividad fosfo-ERK en escala de grises. El mapa de color del eje z representa la alta actividad fosfo-ERK en blanco, bajo actividad en negro, y las actividades intermedias en tonos de gris. Los valores de muestra son independientemente normalizados a la media del control + del ligando EGF en la placa de ELISA en el que se analizaron y los valores medios de los controles (+ / -) del ligando EGF a través de las placas se indican en la parte superior izquierda.

Figuras 22A-C: Inhibición de la señalización del receptor fosfo- EGF y fosfo-ERK por las combinaciones individuales y por parejas de los anticuerpos Bin 1+Bin 2 o Bin 1 + Bin 3 y comparaciones con otros anticuerpos conocidos anti-EGFR, como cetuximab, nimotuzumab y zalutumumab. La Figura 22A muestra la inhibición de la activación de ERK por los anticuerpos Binl / 2 cb y cd. La Figura 22B muestra la inhibición de la activación del EGFR por los anticuerpos Bin 1/2 y cd. La Figura 22C muestra la inhibición de la activación de ERK por los anticuerpos Bin 1/3 cb y ch. Los experimentos se realizaron y los datos se representan gráficamente como en la Figura 18.

Las Figuras 23A-D son cuatro gráficos que muestran los resultados de los ensayos de viabilidad celular de luminiscencia de CTG para las células tratadas con pares o tríos de mAb Binl/Bin2/Bin3 con y sin EGF. La Figura 23 A muestra los resultados del ensayo CTG para las células H1975 tratadas con anticuerpos Bin 1/3 ca y ch. La Figura 23B muestra los resultados del ensayo CTG para las células H1975 tratadas con los anticuerpos Binl/2 ca y cd. La Figura 23C (H1975 células) y 23D (células A431 ) muestra los resultados del ensayo CTG para las células tratadas con el trío de anticuerpos Bin 1/2/3 ca + cd + ch. Los controles incluyen células tratadas con medios que contienen 1 % de suero fetal de ternero (1% FCS) y las células tratadas con medio libre de suero (SFM).

Las Figuras 24A-B son dos gráficos que muestran la inhibición del crecimiento del tumor por los pares de anticuerpos cb con anticuerpo ca + cd + o cb + ch o ca +ch en el modelo de xenoinjertos de tumor en ratón usando la línea celular de tumor epidermoide A431 (Figura 24A) y la línea de células tumorales NSCLC (células de cáncer no microcítico de pulmón) H 1975 (Figura 24B). Los ejes X representan días después de la implantación y los ejes Y representan el tamaño del tumor en mm3.

La Figura 25 es un gráfico de los resultados del análisis de la citometría de flujo (FACS) que muestra la inhibición de ligando biotinilado EGF que se une a las células A431 por anticuerpos ca, cf, ch o solo cb (a una concentración de 2 µ?), en comparación con el cetuximab o ligando EGF solo. El eje Y indica el índice de fluorescencia media (MFI) y el eje x denota las concentraciones variables del ligando biotinilado EGF humano (en nM). El anticuerpo ch mostró cierta inhibición de la unión de EGF, el anticuerpo cf mostró una inhibición esencialmente completa de la unión de EGF a una concentración 20 nM de EGF, y ca y cb mostraron una inhibición esencialmente completa de la unión de EGF a una concentración de 200 nM de EGF.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones Los términos "EGFR", "ErbBl," y "receptor de EGF" se usan indistintamente en la presente para referirse a la proteína del EGFR humano; ver la entrada de UniProtKB / Swiss-Prot P00533 (sec. con núm. de ident.:58).

El término "inhibición" como se usa en la presente, se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica, incluyendo el bloqueo completo de la actividad. Por ejemplo, "inhibición" puede referirse a una decrecimiento estadísticamente considerable de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o aproximadamente 100% en la actividad biológica.

La inhibición de la fosforilación, como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir estadísticamente significativamente la fosforilación de un sustrato de la proteína con respecto a la señalización en ausencia del anticuerpo (control). Como es conocido en la técnica, las vías de señalización intracelular incluyen, por ejemplo, las vías defosfoinositida 3'-quinasa/Akt (PI3 /Akt / PTEN o "AKT") y/o proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK/ERK o "ERK"). Como se conoce además en la técnica, la señalización mediada por EGFR puede medirse por el ensayo del nivel de fosforilación del sustrato (por ejemplo, la fosforilación o ninguna fosforilación de AKT y/o ERK). Por consiguiente, en una modalidad, las combinaciones de anticuerpos anti-EGFR y las composiciones proporcionan una inhibición estadísticamente significativa del nivel de fosforilación de una o ambas AKT y ERK por lo menos el 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o aproximadamente el 100% en relación con el nivel de fosforilación de AKT y/o de ERK en ausencia de dicho anticuerpo (control). Tal señalización mediada por EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden una proteína en una cascada celular que involucra al EGFR, por ejemplo, ELISA, Western, o métodos múltiples, como Luminex®.

La frase "inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR," tal como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir estadísticamente significativamente el crecimiento de una célula que expresa EGFR en relación al crecimiento de la célula en ausencia del anticuerpo (control) o bien in vivo o in viíro. En una modalidad, el crecimiento de una célula que expresa EGFR (por ejemplo, una célula de cáncer) se puede reducir por lo menos el 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%) , o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o aproximadamente el 100%) cuando las células se ponen en contacto con una composición de anticuerpo de la combinación descrita en la presente, en relación con el crecimiento medido en la ausencia de la composición de anticuerpos de combinación (control). El crecimiento celular se puede ensayar usando técnicas reconocidas en la técnica que miden la tasa de división celular, la fracción de células dentro de una población de células que experimentan división celular, y/o la tasa de la pérdida de células de una población celular debido a la diferenciación terminal o la muerte celular (por ejemplo, usando un ensayo luminiscente del título celular o la incorporación de timidina).

La frase "inhibición de un ligando EGFR que se une a EGFR", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir significativamente la unión de un ligando de EGFR a su receptor, EGFR, en relación con el ligando de EGFR que se une en ausencia de el anticuerpo (control). Esto significa que, en presencia del anticuerpo, la cantidad del ligando de EGFR que se une a EGFR con respecto a un control (sin anticuerpo), se disminuye significativamente. La cantidad de un ligando de EGFR que se une a EGFR puede disminuirse en presencia de una composición o combinación de anticuerpo descrita en la presente descripción en al menos 10%, o al menos 20%>, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o aproximadamente 100%) en relación con la cantidad en ausencia del anticuerpo (control). Una disminución en la unión del ligando de EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden el nivel de unión del ligando de EGFR marcado (por ejemplo, EGF radiomarcado o betacelulina radiomarcada) a células que expresan EGFR en presencia o ausencia del anticuerpo (control).

La frase "inhibición de la dimerización EGFR", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir significativamente la dimerización EGFR (apareamiento con otro receptor ErbB para formar homodímeros, por ejemplo, apareamiento ErbB 1 / ErbB 1, o heterodímeros, por ejemplo, apareamiento ErbB 1 / ErbB3) con respecto a la dimerización del EGFR en ausencia de anticuerpo (control). En una modalidad, la dimerización del EGFR puede reducirse al menos 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70 %, o al menos 80%, o al menos 90%, o aproximadamente el 100% cuando las células que expresan EGFR se ponen en contacto con una composición de anticuerpo o combinación descrita en la presente, en relación a la dimerización del EGFR medida en ausencia de anticuerpo (control). Una disminución en la dimerización del EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden el nivel de la dimerización del EGFR en presencia o ausencia del anticuerpo (control).

La frase "regulación descendente de la expresión de EGFR", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de un anticuerpo para disminuir estadísticamente significativamente la expresión de EGFR en una superficie celular, por ejemplo, mediante el aumento de la internalización de EGFR en relación a la expresión de EGFR en ausencia del anticuerpo (control). En una modalidad, la expresión de EGFR puede disminuirse en al menos 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o aproximadamente 100% cuando las células que expresan el EGFR se ponen en contacto con una composición o combinación de anticuerpo proporcionada en la presente, en relación a la expresión de EGFR en la superficie de la célula medida en ausencia del anticuerpo (control). La regulación decreciente de la expresión de EGFR en una superficie celular incluye, por ejemplo, un aumento de la internalización/reciclaje del receptor, y/o un aumento de la internalización/degradación del receptor. Un aumento de la internalización de EGFR se puede medir usando técnicas reconocidas en la técnica que miden el nivel de la internalización de EGFR en la presencia o ausencia del anticuerpo (control).

Con respecto a las combinaciones de anticuerpos EGFR (descritos en la presente), los términos "aditivo" o "aditividad", como se usa en la presente, se refieren a la actividad de dos o más anticuerpos en donde su actividad combinada (con relación a una función particular, por ejemplo, la inhibición de crecimiento celular) es igual a la suma de sus actividades individuales.

Esto es, la suma de las actividades de dos o más anticuerpos que se proporcionan en la presente, cuando actúan individualmente sobre una célula que expresa EGFR, es aproximadamente equivalente al efecto combinado de los mismos anticuerpos que actúan juntos en la misma célula. En una modalidad, el efecto aditivo se mide con respecto a cualquiera de las propiedades se discutidas anteriormente (por ejemplo, la inhibición de la fosforilación de ERK o AKT, la inhibición del crecimiento de las células que expresan EGFR, etc.) Las palabras "sinergia" o "sinérgico", como se usa en la presente, se refieren a la actividad de dos o más anticuerpos en donde su actividad combinada (con relación a una función particular, por ejemplo, la inhibición del crecimiento celular) es mayor que el efecto aditivo esperado de sus actividades individuales. Por ejemplo, el efecto aditivo esperado se puede definir de acuerdo con criterios de independencia de Bliss. De conformidad con los criterios de Bliss, el efecto de dos o más fármacos (por ejemplo, anticuerpos) es igual a la suma de los efectos de los fármacos individuales menos la multiplicación de los efectos de los fármacos individuales: E12 = E1 + E2 - E1 *E2 donde El es el % de inhibición por el fármaco 1, E2 es el % de inhibición por el fármaco 2, y E12 es el % de inhibición esperada por la combinación.

El efecto sinérgico se puede aplicar a cualquiera de las propiedades discutidas en la presente (por ejemplo, la inhibición de la fosforilación de AKT o de ERK EGFR-dependiente, la inhibición del crecimiento de las células que expresan EGFR, etc.). En una modalidad particular, se alcanza al menos 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, o un incremento mayor en la actividad de los anticuerpos combinados con relación al efecto aditivo de sus actividades individual.

El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina", como se usa indistintamente en la presente, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (porción de unión al antígeno) o los cognados de cadena simple de los mismos. Un "anticuerpo" comprende al menos una cadena pesada (H) y una cadena ligera (L). En las IgG de origen natural, por ejemplo, estas cadenas pesadas y ligeras están interconectadas por enlaces disulfúro y existen dos cadenas apareadas pesadas y ligeras, estos también dos inter-conectadas por enlaces disulfúro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y V|_ pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR) o regiones de unión (J) (JH o JL en las cadenas pesada y ligera, respectivamente). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR tres FR y un dominio de J, dispuestas desde el extremo amino terminal al carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, J. Las regiones variables de las cadenas pesada y las cadenas ligeras se unen a un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos del huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) o factores humorales tales como el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento. Así, uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, EGFR) se pueden usar en las combinaciones descritas en la presente. Se demostró que los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión denotados como una porción de unión al antígeno o un fragmento de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (ii) un fragmento F (ab')2> un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH 1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un dAb incluyendo dominios VH y VL, (vi) un fragmento dAb (Ward y otros (1989) Nalure 341, 544-546), que consiste en un dominio VH , (vii) un dAb que consiste en un VH o un dominio VL, y (viii) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) o (ix) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que permite que se elaboren como una cadena de proteínas sencilla en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (tal como una cadena sencilla similar de un fragmento de inmunoglobulina que se conoce como una cadena sencilla Fv (scFv). Dichos anticuerpos de cadena sencilla son abarcados además por el término "anticuerpo". Los fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la materia, y los fragmentos se tamizan por utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno se pueden producir por técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los fragmentos de unión al antígeno (incluyendo scFv) de dichas inmunoglobulinas también son abarcados por el término "Anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, y se dirigen contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que típicamente incluyen diferentes anticuerpos, dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando cualquier técnica reconocida en la técnica y los descritos en la presente, tales como, por ejemplo, un procedimiento de hibridoma, un animal transgénico, métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,816,567), o el uso de genotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,388,088 y la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 09/856,907 (Pub. de la Sol Int. (publicación de patente de los Estados Unidos núm. WO 00/31246). Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados y pueden ser naturales o producirse de forma recombinante.

El término "anticuerpo recombinante", se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal {por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosomal para los genes de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de inmunoglobulina humana) o un hibridoma preparado del mismo, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una genoteca combinatoria recombinante de anticuerpos (por ejemplo, que contienen secuencias de anticuerpo humano) usando la presentación en fagos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el empalme de las secuencias de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de inmunoglobulinas humanas) a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos recombinantes pueden tener regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se puede someter a mutagénesis in vitro y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con las secuencias VH y de VL de la linea germinal humana, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de anticuerpos de línea germinal humana in vivo.

El término "inmunoglobulina quimérica" o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes derivan de una segunda especie. Las inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos se pueden construir, por ejemplo, mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de gen de inmunoglobulina pertenecientes a diferentes especies.

El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco y las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana como se describe, por ejemplo, por Kabat y otros (ver Kabat, y otros (1991) Sequences of protei s of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación NIH núm. 91-3242). Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de línea germinal humanas de inmunoglobulina. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no pretende incluir los anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias marco humanas.

El anticuerpo humano puede tener al menos uno o más aminoácidos sustituidos con un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido de una actividad mejorada que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Típicamente, el anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones sustituidas con residuos de aminoácidos que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una modalidad particular, estas sustituciones están dentro de las regiones CDR como se describe en detalle a continuación.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que incluye al menos una cadena de anticuerpo humanizada (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). El término "cadena de anticuerpo humanizado" (es decir, una "cadena ligera de inmunoglobulina humanizada") se refiere a una cadena de anticuerpo (es decir, una cadena ligera o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región de marco variable sustancialmente de un anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, dos CDR, o tres CDR) sustancialmente procedentes de un anticuerpo no humano, y además incluye regiones constantes (por ejemplo, una región constante o parte de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferentemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada).

"Aislado", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo o combinación de dos, tres o cuatro anticuerpos que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, una composición aislada de los anticuerpos ca, c , y ch, cada uno de los cuales se unen específicamente al EGFR, está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos del EGFR). Además, un anticuerpo aislado es típicamente sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" con diferentes especificidades de unión al EGFR se combinan in en una composición bien definida.

Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificado por los genes de la región constante de cadena pesada. En algunas modalidades, una composición de anticuerpos monoclonales proporcionada en la presente comprende solamente anticuerpos del isotipo IgGl . En otras modalidades, una composición de anticuerpos monoclonales proporcionada en la presente comprende solamente anticuerpos del isotipo IgG2. En otras modalidades, una composición de anticuerpos monoclonales proporcionada en la presente comprende anticuerpos de dos otros isotipos diferentes.

Un "antígeno" es una entidad (por ejemplo, una entidad proteica o peptídica) a la que se une un anticuerpo. En varias modalidades de la presente invención, un antígeno es EGF. En una modalidad particular de acuerdo con la invención, un antígeno es EGFR humano.

En consecuencia, las combinaciones de anticuerpos que se unen a epítopos sobre EGFR también están abarcadas por la presente descripción que comprenden toda o una porción de los epítopos reconocidos por los anticuerpos específicos de las combinaciones descritas en la presente. En otra modalidad, se proporcionan los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con los anticuerpos descritos en la presente. Los anticuerpos que compiten y los anticuerpos que reconocen el mismo o un epítopo solapado se pueden identificar usando las técnicas de rutina, tales como un inmunoensayo, por ejemplo, mediante la demostración de la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se puede determinar usando un ensayo tal como se describe en los Ejemplos más abajo.

Los términos "unión específica", "se une específicamente", "unión selectiva", y "se une selectivamente", significan que un anticuerpo muestra afinidad apreciable por un antígeno particular o un epítopo y, en general, no presenta reactividad cruzada significativa con otros antígenos y epítopos. La unión "apreciable" o preferente incluye la unión con una KD de 106, 107, 108, 109, o 1010 M"' o mejor. La KD de la interacción antígeno anticuerpo (la constante de afinidad) indica la concentración del 50% de las moléculas de anticuerpo y antígeno unidos juntos. Por lo tanto, a una concentración fija adecuada de antígeno, el 50% de un anticuerpo de afinidad superior (es decir, más fuerte) se unirá a las moléculas de antígeno a una concentración de anticuerpos más baja de lo que se requiere para lograr el mismo porcentaje de unión con un anticuerpo de afinidad más baja. Así, un valor inferior de KD indica una afinidad superior (más fuerte). Como se usa en la presente, "mejores" afinidades son afinidades más fuertes, y son de menor valor numérico que sus comparadores, con una KD de 107M"' que es de menor valor numérico y por lo tanto representa una mejor afinidad que una KD de 106M"' . Se prefieren generalmente las mejores afinidades (es decir, con un valor de ¾ inferior y por lo tanto más fuerte) que 107M"', preferentemente mejor que 108M"' . También se contemplan los valores intermedios a los establecidos en la presente, y una afinidad de unión preferente se puede indicar como un intervalo de afinidades, por ejemplo las afinidades de unión preferentes para los anticuerpos anti-EGFR descritos en la presente son, 106 a 1012 M'1, preferentemente 107 a 10'' M más preferentemente 10 a 10 M" . Un anticuerpo que "no presenta reactividad cruzada significativa" es uno que no se unirá apreciablemente a un antígeno diana desactivado (por ejemplo, una proteína no-EGFR). Por ejemplo, en una modalidad, un anticuerpo que se une específicamente al EGFR exhibirá por lo menos dos, y preferentemente tres, o cuatro o más órdenes de magnitud de mejor afinidad de unión (es decir, la unión que exhiben dos, tres, o cuatro o más órdenes de magnitud de menor valor de KD) para EGFR que para moléculas ErbB distintos de ErbB 1 (EGFR) o para proteínas o péptidos no ErbB. La unión específica o selectiva se puede determinar de acuerdo a cualquier medio reconocido en la técnica para determinar tal unión, incluyendo, por ejemplo, de acuerdo con el análisis de Scatchard y/o los ensayos de unión competitiva (competencia) como se describe en la presente.

El término "KD,", como se usa en la presente, se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una determinada interacción anticuerpo-antígeno o la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se une a un antígeno (por ejemplo, EGFR) con una afinidad (KD) de 100 nM o mejor (es decir, o menos) (por ejemplo, 90 n , 80 nM, 70 nM, 60 nm, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, o ? ? ?? ? menos), como se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie, un ensayo de unión celular, o un ensayo de diálisis de equilibrio. En una modalidad particular, un anticuerpo se une a EGFR con una afinidad (como se representa por la constante de disociación KD) de 8 nM o mejor (por ejemplo, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 2 nM, 1.5 nM, 1.4 nM, 1.3 nM, 1.2 nM, 1.1 nM, InM o inferior), medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular. En otras modalidades, un anticuerpo se une a un antígeno (por ejemplo, EGFR) con una afinidad (KD) de aproximadamente menos 10"7 M, tal como aproximadamente menos de 10"8 M, 10"9 M o ??-10 M o incluso menor cuando se determina por la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 usando EGFR recombinante como el analito y el anticuerpo como ligando, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Otros métodos para determinar la Q incluyen el equilibrio de unión a las células vivas que expresan EGFR a través de la citometría de flujo (FACS) o en solución usando la tecnología KinExA®.

El término "Koff", como se usa en la presente, se refiere a la constante de velocidad de desactivado para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

Los términos "IC50" e "IC90", como se usan en la presente, se refieren a la medida de la efectividad de un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR) en la inhibición de una función biológica o bioquímica (por ejemplo, la función o la actividad de EGFR) del 50% y 90%, respectivamente. Por ejemplo, IC50 indica la cantidad de un anticuerpo anti-EGFR necesaria para inhibir la mitad de la actividad de EGFR (por ejemplo, el crecimiento de una célula que expresa EGFR). Esto es, la mitad de la máxima (50%) concentración inhibitoria (IC) de un anticuerpo anti-EGFR (50% IC, o IC50). Según la FDA, IC50 representa la concentración de un fármaco que se requiere para el 50% de la inhibición in vitro. La IC50 e IC90 se pueden determinar mediante técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, mediante la construcción de una curva de dosis-respuesta y el examen del efecto de diferentes concentraciones del antagonista (es decir, el anticuerpo anti-EGFR) sobre la reversión de la actividad de EGFR.

Como se usa en la presente, "patrón de glicosilación" se define como el patrón de unidades de carbohidrato que están unidas covaientemente a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina.

El término "molécula de ácido nucleico", como se usa en la presente, incluye moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena simple o de cadena doble, pero preferentemente es ADN de doble cadena.

El término "molécula de ácido nucleico aislada", como se usa en la presente en referencia a los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, VH, VL, CDR3), se refiere a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que están esencialmente libres de otras secuencias genómicas de nucleótidos, por ejemplo, aquellos que codifican anticuerpos que se unen a antígenos distintos del EGFR, cuyas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano.

El término "modificar" o "modificación", como se usa en la presente, se refiere a los cambios en uno o más aminoácidos de los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos. El cambio se puede producir por la adición, sustitución o eliminación de un aminoácido en una o más posiciones. El cambio se puede producir usando técnicas conocidas, tales como mutagénesis por PCR. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo o una porción de unión al antígeno del mismo identificado usando los métodos de la invención se pueden modificar, para así modificar la afinidad de unión del anticuerpo o de la porción de unión al antígeno de la misma a EGFR.

Se proporcionan las "sustituciones de aminoácidos conservativas" en las secuencias de los anticuerpos, es decir, las modificaciones de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos, que no anula la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, al antígeno, es decir, EGFR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen la sustitución de un aminoácido en una clase por un aminoácido de la misma clase, donde una clase se define por las propiedades fisicoquímicas comunes de la cadena lateral de aminoácidos y las frecuencias de alta sustitución en proteínas homologas encontradas en la naturaleza, tal como se determina, por ejemplo, por una matriz de intercambio de frecuencia Dayhoff o matriz BLOSUM estándar. Se categorizaron seis clases generales de cadenas laterales de aminoácido e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (lie, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro residuo de clase III tal como Asn, Gln, o Glu, es una sustitución conservativa. Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-EGFR se reemplaza preferentemente con otro residuo de aminoácido de la misma clase. Los métodos de identificación de las sustituciones conservativas de nucleótidos y de aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno son bien conocidos en la técnica.

El término "sustitución de aminoácidos no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase con un aminoácido de otra clase; por ejemplo, la sustitución de una Ala, un residuo de clase II, con un residuo de clase III tal como Asp, Asn, Glu, o Gln.

Alternativamente, en otra modalidad, las mutaciones (conservativa o no conservativa) se pueden introducir al azar a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación del anticuerpo anti-EGFR, tal como por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-EGFR modificados resultantes se pueden seleccionar por la actividad de unión.

Una "secuencia consenso" es una secuencia formada a partir de los aminoácidos que ocurren más frecuentemente (o nucleótidos) en una familia de secuencias relacionadas. En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que ocurre con más frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos se producen con la misma frecuencia, puede incluirse en la secuencia consenso. Un "marco consenso" de una inmunoglobulina se refiere a una región de marco en la secuencia consenso de inmunoglobulina. Igualmente, la secuencia consenso para las CDR se puede derivar por la alineación óptima de las secuencias de aminoácidos de CDR de anticuerpos de EGFR de la presente invención.

Para los ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean óptimamente y se comparan, son idénticos, con las correspondientes inserciones o deleciones de nucleótidos, en al menos aproximadamente 80% de los nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 90% a 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente 98% a 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectiva, a la complementaria de la hebra.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "representado sustancialmente puro" cuando se purifica lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, incluyendo el tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica.

Las composiciones de ácidos nucleicos, aunque a menudo comprenden una secuencia nativa (excepto para sitios de restricción modificados y similares), ya sea a partir de ADNc genómico, o alternativamente mezclas de los mismos se puede mutar, de acuerdo con las técnicas estándar para proporcionar secuencias de genes alterados. Para las secuencias codificadoras, estas mutaciones, pueden modificar la secuencia de aminoácidos codificada según se desee. En particular, se contemplan las secuencias de ADN sustancialmente homologas a los nativos, V, D, J, constantes, interruptores y otras dichas secuencias descritas en la presente.

El término "unido operativamente" se refiere a una secuencia de ácido nucleico colocada en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o guía secretora está operablemente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operablemente unido a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operablemente unido a una secuencia codificante si se posiciona para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se realiza por ligación en los sitios de restricción convenientes. Si esos sitios no existes, los adaptadores o enlazadores del oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional. Un ácido nucleico está "operablemente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o un activador está unido operativamente a la secuencia codificadora si este afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, unido operativamente significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Para las secuencias de cambio, unidas operativamente indica que las secuencias son capaces de efectuar recombinación de cambio.

El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una mlolécula de pacido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al cual se une. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un lazo de ADN bicatenario circular en el cual los segmentos de ADN adicional pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la que se introducen (por ejemplo, los vectores de bacterias que tiene un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedero a la introducción en la célula hospedera, y por lo tanto se replica junto con el genoma del hospedero. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Dichos vectores se refieren en la presente descripción como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). Generalmente, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos. Los términos, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente. Sin embargo, otras formas de vectores de expresión, tal como vectores virales {por ejemplo, retrovirus defectivo de replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes se contemplan también.

El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en la presente, se refiere a una célula en la que se introdujo un vector de expresión recombinante. Se entenderá que dichos términos se refieren no solamente a una célula sujeto particular sino también a la progenie de esa célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones venideras ya sea debido a una mutación o influencias del medio ambiente, la progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula madre, pero todavía están incluidas dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente.

Los términos "tratan", "tratar" y "tratamiento", como se usa en la presente, se refieren a las medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de "tratamiento" emplean la administración a un sujeto, un anticuerpo o un par o trío de anticuerpo descritos en la presente, por ejemplo, un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno asociado con la señalización dependiente de EGFR o predispuesto a tener dicha enfermedad o trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno o enfermedad recurrente o trastorno, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.

El término "enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR," o "trastorno asociado con la señalización dependiente de EGFR ", como se usa en la presente, incluye los estados de enfermedad y/o los síntomas asociados con un estado de enfermedad, donde se encuentran el aumento de los niveles de EGFR y/o activación de las cascadas celulares que involucran al EGFR. El término "enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR," también incluye los estados de enfermedad y/o síntomas asociados con la activación de otras vías de señalización del EGFR. En general, el término "enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR ", se refiere a cualquier trastorno, la aparición, la progresión, o la persistencia de los síntomas los cuales requieren la participación del EGFR. Los ejemplos de trastornos mediados por EGFR incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, el cáncer.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más concretos de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gástrico, cáncer pancreático, tumores de células gliales tales como glioblastoma y neurofíbromatosis, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga , hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, melanoma, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñon, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello. En una modalidad particular, un cáncer tratado o diagnosticado usando los métodos descritos en la presente se seleccionan de melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma renal, cáncer de colon/gastrointestinal, cáncer de pulmón, y cáncer de próstata.

El término "cantidad efectiva", como se usa en la presente, se refiere a aquella cantidad de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a EGFR, que es suficiente para efectuar el tratamiento, pronóstico o diagnóstico de una enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR, tal como se describe en la presente, cuando se administra a un sujeto. Las cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos en este documento, cuando se usa solo o en combinación, variará dependiendo de la actividad relativa de los anticuerpos y las combinaciones (por ejemplo, en inhibir el crecimiento celular) y en función del sujeto y el estado de enfermedad a tratar, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la condición de la enfermedad, la forma de administración y similares, que puede ser determinada fácilmente por un experto normal en la técnica. Las dosificaciones para administración pueden estar en el intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 1 ng a aproximadamente 10,000 mg, aproximadamente 5 ng a aproximadamente 9,500 mg, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 9,000 mg, aproximadamente 20 ng a aproximadamente 8,500 mg, aproximadamente 30 ng a aproximadamente 7,500 mg, aproximadamente 40 ng a aproximadamente 7,000 mg, aproximadamente 50 ng a aproximadamente 6,500 mg, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 6,000 mg, aproximadamente 200 ng a aproximadamente 5,500 mg, aproximadamente 300 ng a aproximadamente 5,000 mg, aproximadamente 400 ng a aproximadamente 4,500 mg, aproximadamente 500 ng a aproximadamente 4,000 mg, aproximadamente 1 µg a aproximadamente 3,500 mg, aproximadamente 5 µg a aproximadamente 3,000 mg, aproximadamente 10 µg a aproximadamente 2,600 mg, aproximadamente 20 g a aproximadamente 2,575 mg, aproximadamente 30 µg a aproximadamente 2,550 mg, aproximadamente 40 µg a aproximadamente 2,500 mg, aproximadamente 50 µg a aproximadamente 2,475 mg, aproximadamente 100 µg a aproximadamente 2,450 mg, aproximadamente 200 µg a aproximadamente 2,425 mg, aproximadamente 300 µg a aproximadamente 2,000, aproximadamente 400 µg a aproximadamente 1 , 175 mg, aproximadamente 500 µg a aproximadamente 1 , 150 mg, aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 1,125 mg, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 , 100 mg, aproximadamente 1.25 mg a aproximadamente 1 ,075 mg, aproximadamente 1.5 mg a aproximadamente 1 ,050 mg, aproximadamente 2.0 mg a aproximadamente 1,025 mg, aproximadamente 2.5 mg a aproximadamente 1 ,000 mg, aproximadamente 3.0 mg a aproximadamente 975 mg, aproximadamente 3.5 mg a aproximadamente 950 mg, aproximadamente 4.0 mg a aproximadamente 925 mg, aproximadamente 4.5 mg a aproximadamente 900 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 875 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 850 mg, aproximadamente 20 mg a aproximadamente 825 mg, aproximadamente 30 mg a aproximadamente 800 mg, aproximadamente 40 mg a aproximadamente 775 mg, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 750 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 725 mg, aproximadamente 200 mg a aproximadamente 700 mg, aproximadamente 300 mg a aproximadamente 675 mg, aproximadamente 400 mg a aproximadamente 650 mg, aproximadamente 500 mg, o aproximadamente 525 mg a aproximadamente 625 mg, de un anticuerpo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad efectiva es además una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial (es decir, efectos secundarios) de un anticuerpo se minimizan y/o sopesan por los efectos beneficiosos.

El término "agente terapéutico" abarca cualquier y todos los compuestos que tienen una capacidad para disminuir o inhibir la gravedad de los síntomas de una enfermedad o trastorno, o aumentar la frecuencia y/o duración de los períodos libres de síntomas o de reducción de los síntomas en una enfermedad o trastorno, o inhibir o evitar impedimentos o discapacidad debido a una aflicción de enfermedad o trastorno, o inhibir o retrasar la progresión de una enfermedad o trastorno, o inhibir o retrasar la aparición de una enfermedad o trastorno o inhibir o prevenir la infección en una enfermedad o trastorno infeccioso. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos incluyen moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, biológicos manipulados de manera recombinante, compuestos de AR i, inhibidores de tirosina cinasa, y anticuerpos comerciales. En ciertas modalidades, inhibidores de tirosina cinasa incluyen, por ejemplo, uno o más de erlotinib, gefitinib, y lapatinib, que son productos farmacéuticos comercializados actualmente. Los anticuerpos anti-EGFR farmacéuticos comercialmente disponibles incluyen cetuximab y panitumumab. Otros anticuerpos anti-EGFR farmacéuticos incluyen zalutumumab, nimotuzumab, y matuzumab, que están en desarrollo.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

El término "sujeto" incluye cualquier mamífero, por ejemplo, un primate. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente pueden usarse para tratar un sujeto que tiene cáncer. En una realización particular, el sujeto es un ser humano.

El término "muestra" se refiere al tejido, fluido corporal, o una célula (o una fracción de cualquiera de los anteriores) tomada de un paciente o un sujeto. Normalmente, el tejido o célula se retirará del paciente, pero se contempla también el diagnóstico in vivo. En el caso de un tumor sólido, se puede tomar una muestra de tejido de un tumor extirpado quirúrgicamente y prepararse para la prueba por técnicas convencionales. En el caso de linfomas y leucemias, los linfocitos, las células leucémicas, o los tejidos linfáticos se pueden obtener (por ejemplo, las células leucémicas de la sangre) y preparar adecuadamente. Otras muestras, incluyendo la orina, lágrimas, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, heces, esputo, extractos celulares, etc. también pueden ser útiles para cánceres particulares.

Varios aspectos de la descripción se describen en más detalle en las siguientes subsecciones.

II. Métodos para producir anticuerpos (i) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando una variedad de técnicas conocidas, tales como la técnica estándar de hibridación de células somáticas, la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B, o las técnicas de presentación en levaduras o fagos usando genotecas de genes de anticuerpos humanos. En modalidades particulares, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales completamente humanos.

Por consiguiente, en una modalidad, se usa un método de hibridoma para producir un anticuerpo que se une a EGFR. En este método, un ratón u otro animal huésped apropiado puede ser inmunizado con un antígeno adecuado para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno usado para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. El medio de cultivo en el que las células de hibridoma están creciendo se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se probó para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y cultivar por métodos estándar. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, D-MEM o medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electro foresis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

En otra modalidad, los anticuerpos que se unen al EGFR pueden aislarse a partir de genotecas de anticuerpo generadas usando técnicas bien conocidas como las descritas en, por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571 ,698 de Ladner y otros; patentes de Estados Unidos núms. 5,427,908 y 5,580,717 de Dower ^ otros; patentes de Estados Unidos núms. 5,969, 108 y 6, 172,197 de McCafferty y otros; y patentes de Estados Unidos núms. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731 ; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 de Griffiths ^ otros. Adicionalmente, también pueden ser usados la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por intercambio de las cadenas, así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir genotecas de fagos muy grandes. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 09/856,907 (Pub. de la Sol Int. del PCT. núm. WO 00/31246) En una modalidad particular, el anticuerpo monoclonal que se une a EGFR se produce usando la presentación en fagos. Esta técnica implica la generación de una genoteca de Fab humano que tiene una combinación única de secuencias de inmunoglobulinas aisladas a partir de donantes humanos y que tiene diversidad sintética en la cadena pesada CDR que se genera. La genoteca se investiga después respecto a los Fab que se unen a EGFR.

En aún otra modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el EGFR pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón (ver por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661 ,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas de Lonberg y Kay; patente de Estados Unidos núm. 5,545,807 de Surani y otros; publicaciones PCT núms. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la publicación PCT núm. WO 01/14424 de Korman y otros).

En otra modalidad, los anticuerpos humanos se puede levantar usando un ratón que porta las secuencias de inmunoglobulina humana en los transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana (ver, por ejemplo, la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida y otros).

Más aún, sistemas transgénicos alternativos de animales que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y pueden usarse para levantar los anticuerpos anti-EGFR. Por ejemplo, un sistema transgénico alternativo referido como el Xenomouse (Abgenix, Inc.) puede usarse; dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 5,939,598; 6,075,181; 6,1 14,598; 6, 150,584 y 6,162,963 de Kucherlapati y otros Además, los sistemas alternativos de animales transcromosómicos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se puede usar para levantar anticuerpos anti-EGFR. Por ejemplo, se pueden usar los ratones que llevan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana y un trancromosoma de cadena ligera humana. Además, las vacas que portan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera se han descrito en la técnica y se puede usar para levantar anticuerpos anti-EGFR.

En aún otra modalidad, los anticuerpos se pueden preparar usando una planta transgénica y/o células de plantas cultivadas (tales como, por ejemplo, tabaco, maíz y lenteja de agua) que producen tales anticuerpos. Por ejemplo, hojas de tabaco transgénico que expresan anticuerpos se pueden usar para producir tales anticuerpos, por ejemplo, usando un promotor inducible. Además, el maíz transgénico se puede usar para expresar tales anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos. Los anticuerpos también pueden ser producidos en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas, incluyendo porciones de anticuerpo, tales como anticuerpos de cadena sencilla (scFv), por ejemplo, usando semillas de tabaco y tubérculos de patata.

La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales (o porciones de los mismos) que se unen a EGFR preparados usando cualquier técnica incluyendo las descritas en la presente, se puede determinar mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA ). La afinidad de unión de un anticuerpo monoclonal o porción del mismo también se puede determinar por análisis de Scatchard.

En ciertas modalidades, un anticuerpo EGFR producido usando cualquiera de los métodos mencionados anteriormente puede ser además alterado u optimizado para lograr una especificidad de unión deseada y/o afinidad usando técnicas reconocidas en la técnica, tales como las descritas en la presente.

En una modalidad, las secuencias parciales de anticuerpos derivadas de un anticuerpo de EGFR se pueden usar para producir anticuerpos estructural y funcionalmente relacionados. Por ejemplo, los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se encuentran en las cadenas pesada y ligera de seis regiones de las cadenas determinantes de la complementariedad (CDR). Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos presentes en la naturaleza mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico de origen natural injertado en secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes. Tales secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal.

Así, una o más características estructurales de un anticuerpo anti-EGFR, tales como las CDR, se puede usar para crear anticuerpos anti-EGFR estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional deseada, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de las células que expresan EGFR.

En una modalidad particular, una o más regiones CDR seleccionadas de la sec. con núm. de ident.: 23-56 se combinan recombinantemente con regiones marco humanas conocidas y las CDR para crear anticuerpos anti-EGFR adicionales, por ingeniería recombinante. Las regiones marco variables de cadena pesada y ligera pueden derivarse de las mismas secuencias de anticuerpos o de unas diferentes.

Es bien conocido en la técnica que los dominios CDR3 de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de la unión de un anticuerpo por un antígeno. Por consiguiente, en ciertas modalidades, se generan anticuerpos que incluyen los CDR3 de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos particulares descritos en la presente. Los anticuerpos pueden incluir además las CDRl y/o CDR2 de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos descritos en la presente.

Las regiones CDR 1, 2, y/o 3 de los anticuerpos modificados descritos anteriormente pueden comprender la(s) secuencia(s) exacta(s) de aminoácidos como las descritas en la presente. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que alguna desviación de las secuencias CDR exactas puede ser posible, en particular para las secuencias CDR l y CDR2, que pueden tolerar más variación que las secuencias CDR3 sin alterar la especificidad del epítopo (tales desviaciones son, por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos). En consecuencia, en otra modalidad, el anticuerpo manipulado puede estar compuesto por una o más CDR1 y CDR2 que son, por ejemplo, 90%, 95%, 98%, 99% ó 99.5% idénticas a las CDR correspondientes de un anticuerpo nombrado en la presente descripción.

En otra modalidad, uno o más residuos de una CDR se pueden alterar para modificar la unión para lograr una tasa de unión más favorecida. Usando esta estrategia, se puede lograr un anticuerpo que tiene afinidad de unión ultra alta de, por ejemplo, 1010 M"1 o más. Las técnicas de maduración de la afinidad, bien conocidas en la técnica y las descritas en la presente, se pueden usar para alterar la(s) región(es) CDR seguido por la selección de las moléculas unidas resultantes para el cambio deseado en la unión. En consecuencia, como se alteran la(s) CDR(s), los cambios en la afinidad de unión, así como la inmunogenicidad se pueden monitorear y anotarse de manera que se logra un anticuerpo optimizado para la mejor unión combinada y baja inmunogenicidad.

Las modificaciones también se pueden realizar dentro de una o más regiones marco o de unión de las regiones variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, tanto tiempo como la afinidad de unión al antígeno después de estas modificaciones sea mejor que 106 M"' .

En otra modalidad, el anticuerpo se modifica adicionalmente con respecto a la función efectora, a fin de aumentar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo el residuo de cisteína (s) se puede introducir en la región Fe, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro intracatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede haber mejorado la capacidad de internalización y/o la muerte celular mediada por el complemento aumentada y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también se pueden preparar usando reticuladores heterobifuncionales. Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga dos regiones de Fe y con ello han mejorado la lisis de complemento y las capacidades de la ADCC.

También se proporcionan anticuerpos biespecíficos e inmunoconjugados, como se discute más abajo. (ii Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos en la presente incluyen al menos dos especificidades de unión para EGFR que se unen preferentemente a epítopos no solapantes o no competitivos. Tales anticuerpos biespecíficos pueden incluir especificidades de unión adicionales, por ejemplo, una tercera especificidad de unión a EGFR y/o una especificidad de unión para otro receptor ErbB (por ejemplo, ErbB3) u otro antígeno, tal como el producto de un oncogén. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F (ab')2).

Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, WO 051 17973 y WO 06091209). Por ejemplo, la producción de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se puede basar en la coexpresión de dos pares de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes. También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos han sido producidos usando cremalleras de leucina. También se ha informado otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de una sola cadena Fv (sFv).

En una modalidad particular, el anticuerpo biespecífico comprende un primer anticuerpo (o su porción de unión) que se une a EGFR derivatizado o enlazado a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar un molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. Un anticuerpo puede derivatizarse o enlazarse a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas diana; tales moléculas multiespecíficas también se pretende estén abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se usa en la presente. Para crear una molécula biespecífica, un anticuerpo descrito en la presente puede estar funcionalmente relacionado (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido o mimético de unión, de tal manera que resulta en una molécula biespecífica.

En consecuencia, se contemplan las moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para EGFR y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una modalidad particular, el segundo epítopo diana es un receptor Fe, por ejemplo, Fc*RI (CD64) humano o un receptor humano Fea (CD89). Por lo tanto, también se proporcionan las moléculas biespecíficas capaces de unirse tanto a Fc*R, FcaR o FcsR que expresan células efectoras (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)), y a células diana que expresan EGFR. Estas moléculas biespecíficas EGFR dianas que expresan las células efectora y desencadenan las actividades de células efectoras mediadas por el receptor Fe, tales como fagocitosis de células que expresan un EGFR, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), liberación de citoquinas, o generación de anión superóxido.

En una modalidad, las moléculas biespecíficas comprenden como una especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o una cadena simple de Fv. El anticuerpo también puede ser una cadena ligera o un dímero de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como Fv o un constructo de cadena simple como se describe en Ladner y oíros patente de Estados Unidos núm. 4,946,778.

Las moléculas biespecíficas se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR y anti-EGFR, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, una variedad de agentes de acoplamiento o reticulación pueden usarse para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetilo-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohaxano-1 -carboxilato (sulfo-SMCC). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, estos pueden conjugarse a través de enlaces sulfhidrilo del C-terminal de las regiones bisagra de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferente, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.

Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica puede ser una molécula de cadena simple que comprende un anticuerpo de cadena simple y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena simple que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena simple. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en la patente de Estados Unidos número 5,260,203; patente de Estados Unidos número 5,455,030; patente de Estados Unidos número 4,881 ,175; patente de Estados Unidos número 5, 132,405; patente de Estados Unidos número 5,091 ,513; patente de Estados Unidos número 5,476,786; patente de Estados Unidos número 5,013,653; patente de Estados Unidos número 5,258,498; y patente de Estados Unidos número 5,482,858.

La unión de las moléculas biespecífícas a sus dianas específicas puede confirmarse mediante, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), el análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o ensayo de transferencia tipo Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos anticuerpo-proteína de interés particular empleando un reactivo marcado {por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de anticuerpo FcR se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos FcR-anticuerpo. Alternativamente, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente y usado en un radioinmunoensayo (RIA). El isótopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador ? o un contador de centelleo o por autorradiografía. (iii) Inmunoconjugados Los inmunoconjugados proporcionados en la presente se pueden formar por la conjugación de los anticuerpos descritos en la presente a otro agente terapéutico. Los agentes adecuados incluyen, por ejemplo, un agente citotóxico (por ejemplo, un agente quimioterapéutico), una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), y/o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados se describieron anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii , proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionuclidos están disponibles para producción de anticuerpos anti-EGFR radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212 Bi, 1 , I, 131 In, 90Y y 186 Re.

Los inmunoconjugados pueden prepararse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetilo adipimidato HCL), ésteres activos (tal como disuccinimidil suberato), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (talcomo bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tal como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminepentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ilustrativo para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo (ver, por ejemplo, W094/1 1026).

III. Métodos para la detección de anticuerpos Con posterioridad a la producción de anticuerpos estos pueden ser examinados para diversas propiedades, tales como las descritas en la presente, usando una variedad de ensayos que son bien conocidos en la materia.

En una modalidad, los anticuerpos se seleccionan (por ejemplo, por citometría de flujo o ELISA) para la unión a EGFR usando, por ejemplo, EGFR purificado y/o células que expresan EGFR, tales como las células A431. Los epítopos unidos por los anticuerpos anti-EGFR pueden además determinarse y compararse, por ejemplo, para identificar anticuerpos que no compiten (por ejemplo, anticuerpos que se unen a diferentes epítopos), así como anticuerpos que compiten por la unión y/o se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes.

Los anticuerpos competitivos (como los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con cualquiera de los anticuerpos identificados en las Tablas I y II, anteriores) y los anticuerpos no competitivos se pueden identificar usando técnicas de rutina. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear (o no bloquear) la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tales como el EGFR. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competencia tipo sándwich; EIA directo en fase sólida de biotina-avidina; ensayo directo de marcado en fase sólida; ensayo directo de marcado en fase sólida tipo sandwich; RIA directo en fase sólida marcado con I125; EIA directo en fase sólida biotina-avidina y RIA directo marcado. La técnica de resonancia de plasmón superficial se expone en los Materiales y Métodos de los Ejemplos y en el Ejemplo 2, a continuación, también se puede usar ventajosamente para este propósito. Típicamente, dicho ensayo implica el uso del antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan cualquiera de éstos, una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Por lo general, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Generalmente, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común al menos en un 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.

Otras técnicas de selección para determinar el epítopo unido por los anticuerpos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, análisis de rayos X de cristales de antígeno: complejos de anticuerpo, que proporciona una resolución atómica del epítopo. Otros métodos de seguimiento de la unión del anticuerpo a fragmentos del antígeno o variantes mutadas del antígeno donde la pérdida de la unión debido a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia del antígeno se considera una indicación de un componente de epítopo. Además, también se pueden usar los métodos combinatorios computacionales para mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés de afinidad a péptidos cortos específicos aislado partir de genotecas combinatorias de péptidos de presentación de fago. Los péptidos se consideran entonces como pistas para la definición del epítopo correspondiente a los anticuerpos utilizados para seleccionar la genoteca del péptido. Para el mapeo de epítopos, los algoritmos de cálculo también se han desarrollado los que se han demostrado para mapear epítopos discontinuos conformacionales.

En otra modalidad, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-EGFR que no compiten) se examinan para detectar la capacidad de unirse a epítopos expuestos tras la unión al ligando, por ejemplo, EGF (es decir, no inhiben la unión de los ligandos de unión de EGFR a EGFR). Tales anticuerpos se pueden identificar mediante, por ejemplo, poner en contacto células que expresan EGFR (por ejemplo, células A431) con un ligando de EGFR marcado (por ejemplo, EGF radiomarcado o biotinilado) en ausencia (control) o presencia del anticuerpo anti-EGFR. Si el anticuerpo no inhibe la unión de EGF a EGFR, entonces se observará una disminución estadísticamente significativa en la cantidad de marcador recuperado, respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo. Alternativamente, si el anticuerpo inhibe la unión de EGF a EGFR, después se observará una disminución estadísticamente significativa en la cantidad de marcador recuperado, respecto a la cantidad en ausencia del anticuerpo.

Los anticuerpos también se pueden seleccionar (ensayar) por su afinidad de unión. Esto puede hacerse, por ejemplo, usando un ensayo de resonancia de plasmón, por ejemplo, como se describe más abajo.

Los anticuerpos también se pueden seleccionar por su capacidad para inhibir la señalización a través de EGFR usando ensayos de señalización, como por ejemplo, los descritos en la presente. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la fosforilación del ligando EGFR mediada por EGFR se puede evaluar mediante el tratamiento de las células que expresan EGFR con un ligando de EGFR (por ejemplo, EGF) en presencia y ausencia del anticuerpo. Las células se pueden lisar, los lisados brutos se centrifugan para eliminar el material insoluble, y se mide la fosforilación de EGFR, por ejemplo, mediante transferencia tipo Western seguido por el sondeo con un anticuerpo anti-fosfotirosina.

Alternativamente, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la señalización aguas abajo a través de EGFR se puede medir por ensayos de quinasa para sustratos conocidos de EGFR, tales como, por ejemplo, AKT y/o de ERK, seguido de la estimulación de EGFR por el ligando de EGF. Por ejemplo, las células que expresan EGFR pueden ser estimuladas con el ligando EGF y se incuban con un anticuerpo candidato. Los lisados celulares posteriormente preparados a partir de tales células se pueden inmunoprecipitar con un anticuerpo para un sustrato de EGFR (o una proteína en una vía celular que implica EGFR), tales como, un anticuerpo anti-AKT, y se ensayan para la actividad quinasa (por ejemplo, actividad quinasa de AKT) utilizando métodos reconocidos en la técnica. Una disminución o desaparición completa del nivel o de la actividad (por ejemplo, actividad de la quinasa) de un sustrato de EGFR o proteína en una vía que implica EGFR en presencia del anticuerpo, en relación con el nivel o la actividad en ausencia del anticuerpo es indicativo de un anticuerpo que inhibe la señalización de EGFR.

Los anticuerpos que reducen los niveles de EGFR en la superficie celular se pueden identificar por su capacidad para regular por disminución o inhibir la expresión de EGFR en las células tumorales. En ciertas modalidades, los anticuerpos disminuyen a EGFR en la superficie celular por inducción de la internalización (o endocitosis en aumento) de EGFR (por ejemplo, por internalización y el reciclado del receptor y/o internalización y degradación del receptor). Para probar esto, EGFR puede ser biotinilado y el número de moléculas de EGFR en la superficie celular se puede determinar fácilmente, por ejemplo, mediante la medición de la cantidad de biotina en una monocapa de células en cultivo en presencia o ausencia de un anticuerpo, seguido de inmunoprecipitación de EGFR y la exploración con estreptavidina. Una disminución en la detección de EGFR biotinilado con el tiempo en la presencia de un anticuerpo es indicativo de un anticuerpo que disminuye los niveles de EGFR en la superficie celular.

Los anticuerpos y las combinaciones de anticuerpos también se pueden ensayar por su capacidad para inhibir el crecimiento de células que expresan EGFR (ya sea ¡n vivo o in viíro), tales como células tumorales, utilizando técnicas reconocidas en la técnica, incluyendo el ensayo de células Glow Titer descrito en los ejemplos siguientes y el ensayo de incorporación con timidina marcada con tritio. Los anticuerpos también se pueden examinar por la capacidad de inhibir el crecimiento de esferoides de células que expresan EGFR. Esto se puede hacer mediante el uso de un ensayo que aproxima a las condiciones del crecimiento de un tumor en desarrollo como se describe en la presente.

En otra modalidad, las combinaciones de anticuerpos anti-EGFR se examinan para detectar los valores IC50 y/o IC90 relativos a la inhibición de una actividad de EGFR o función particular, tales como la señalización mediada por EGFR (por ejemplo, medida por ELISA, Western, o métodos múltiples, tales como Luminex®. Las combinaciones de anticuerpos, cada una de los cuales posee un valor particularmente deseado de IC50 y/o IC90 (por ejemplo, se puede seleccionar una IC90 de aproximadamente 80 nM para inhibir la señalización de EGFR). En una modalidad, la combinación tiene un mayor que valor de IC50 o IC90 de un anticuerpo de referencia conocido (por ejemplo, cetuximab). En otra modalidad, la combinación tiene una IC50 o IC90 aditiva (es decir, la suma de las actividades de los anticuerpos, de la acción individual en una célula que expresa EGFR, es aproximadamente equivalente al efecto combinado de los mismos anticuerpos que actúan juntos en la misma célula). En otra modalidad, la combinación tiene un IC50 o IC90 sinérgico (es decir, la suma de los efectos de los anticuerpos, al actuar individualmente sobre una célula que expresa EGFR, es menor que el efecto combinado de los mismos anticuerpos actuando juntos en la misma célula).

IV. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, en la presente descripción se proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales formulados juntos con un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composiciones incluyen una combinación de múltiples (por ejemplo, dos o más) anticuerpos aislados que se unen a diferentes epítopos en EGFR. Tales anticuerpos tienen preferentemente un efecto aditivo o sinérgico con respecto a la inhibición de una actividad de EGFR o función en particular, tal como la señalización mediada por EGFR.

Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífíca, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Las composiciones se pueden administrar solas o en terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición proporcionada en la presente con al menos uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los agentes contra el cáncer descritos en la presente. Las composiciones también se pueden administrar en combinación con radioterapia y/o cirugía. Las combinaciones particulares de anticuerpos anti-EGFR también se pueden administrar por separado o secuencialmente, con o sin agentes terapéuticos adicionales.

Las composiciones se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Los anticuerpos pueden prepararse con portadores que protegerán los anticuerpos contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos, y sistemas de entrega microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno y acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por aquellos con experiencia en la materia.

Para administrar las composiciones por determinadas vías de administración, puede ser necesario recubrir los constituyentes, por ejemplo, los anticuerpos, con, o co-administrar las composiciones con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse a un sujeto en un portador adecuado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes aceptables incluyen la solución salina y soluciones tampón acuosas. Los liposomas incluyen las emulsiones agua-en-aceite-en-agua CGF, así como liposomas convencionales.

Los portadoress aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencionales sean incompatibles con los anticuerpos, su uso en las composiciones proporcionadas en la presente se contempla. Constituyentes activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El portador puede ser un medio de dispersión o solvente que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. Incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina puede provocar la absorción prolongada de las composiciones inyectables.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de los anticuerpos monoclonales en la cantidad requerida en un solvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por microfiltración con esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los anticuerpos en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y liofílización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución estéril previamente filtrada de éste.

Los regímenes de dosificación se ajustaron para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, un solo bolo puede administrarse, varias dosis divididas pueden administrarse en el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos humanos pueden administrarse una o dos veces por semana por inyección subcutánea o una o dos veces al mes por inyección subcutánea.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y por la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se usa en la presente descripción se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias proporcionadas en la presente descripción se dictaron por y directamente dependientes de (a) las características únicas de los anticuerpos y el efecto terapéutico particular a alcanzarse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para componer tales anticuerpos para el tratamiento de sensibilidad en los individuos. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfíto sódico, sulfíto sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, nasal, tópica (que incluye bucal y sublingual), rectal, y parenteral. La administración parenteral es la ruta de administración más común para las composiciones terapéuticas que comprenden anticuerpos. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitarias y se puede preparar por cualquiera de los métodos conocidos en la materia de farmacia. La cantidad de anticuerpos que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única variará en dependencia del sujeto tratado y el modo particular de administración. Esta cantidad de anticuerpos será generalmente una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Generalmente, fuera del cien por ciento, esta cantidad estará en el intervalo de aproximadamente 0.001 por ciento a aproximadamente noventa por ciento del anticuerpo por masa, preferentemente de aproximadamente 0.005 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, con la máxima preferencia de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente 30 por ciento.

Las frases "administración parenteral" y "parenteralmente administrado" como se usa en la presente significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitarse a, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutáneo, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subarachnoide, intraespinal, epidural y intrasternal. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuoso adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente descripción incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones pueden contener además adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Los ejemplos particulares de adyuvantes que se conocen bien en la técnica incluyen, por ejemplo, adyuvantes inorgánicos (tales como sales de aluminio, por ejemplo, fosfato alumínico e hidróxido alumínico), adyuvantes orgánicos (por ejemplo, escualeno), adyuvantes a base de aceite, virosomas (por ejemplo, virosomas que contienen una hemaglutinina de unión a la membrana y neuraminidasa derivada del virus de influenza).

La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse por procedimientos de esterilización y por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, y similares. Puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Adicionalmente, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de uno o más agentes que retardan la absorción tales como monoestearato alumínico o gelatina.

Cuando las composiciones se administran como productos farmacéuticos, a los humanos y animales, estas se pueden administrar solas o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.001 a 90% (con mayor preferencia, 0.005 a 70%, tal como 0.01 a 30%) del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, las composiciones proporcionadas en la presente, se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y pueden ser formuladas en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los niveles reales de dosificación de los anticuerpos en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectivo para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, la composición, y el modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares empleadas, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente a tratar, y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Un médico o veterinario de experiencia ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los anticuerpos a niveles inferiores a las necesarias para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que el efecto deseado se logre. En general, una dosis diaria adecuada de las composiciones proporcionadas en la presente será la cantidad de los anticuerpos que es la dosis efectiva más baja para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Es preferente que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferentemente administrado proximal al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria efectiva de la composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas separadas en intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. Aunque es posible administrar los anticuerpos solos, se prefiere administrar los anticuerpos como una formulación (composición).

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, los descritos en las patentes de Estados Unidos núms. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, 4,596,556, 4,487,603, 4,486, 194, 4,447,233, 4,447,224, 4,439,196, y 4,475,196.

En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales se pueden formular para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los anticuerpos terapéuticos atraviesen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricar liposomas, ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4,522,81 1 ; 5,374,548; 5,399,331 ; 5,891,468; 6,056,973; 6,210,707, 6,224,903; 6,316,024; 7, 122,202; 7,135, 177; y 7,507,407 y la publicación de la patente de Estados Unidos 20070116753. Los liposomas pueden comprender uno o más fracciones que se unen a y/o se transportan selectivamente en células u órganos específicos, lo que mejora la entrega selectiva de fármacos.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tríos de anticuerpos anti-EGFR, esto es la composición que comprende tres diferentes anticuerpos anti-EGFR, preferentemente tres anticuerpos diferentes que no compiten de forma cruzada entre sí por la unión a EGFR y/o se unen a diferentes epítopos unos de otros en EGFR. Además de los tres anticuerpos, estas composiciones farmacéuticas pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable y/u otro excipiente (s) tales como los descritos en detalle anteriormente. La composición farmacéutica se puede suministrar en un solo recipiente que contiene los tres anticuerpos o, alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un envase que comprende tres recipientes diferentes, cada uno que contiene uno de los tres diferentes anticuerpos anti-EGFR (así como un portador farmacéuticamente aceptable y/u otro excipiente (s) como se describió anteriormente).

Por ejemplo la invención proporciona composiciones farmacéuticas de trios de anticuerpos anti-EGFR (tres anticuerpos, o triplete de anticuerpos), en las cuales un anticuerpo del trío compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin l como se define en la presente, un segundo anticuerpo del trío compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin2 como se define en la presente, y un tercer anticuerpo del trío compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo Bin3 como se define en la presente. Así, en una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica de un trío de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de va, vb y ve o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de ca, cb y ce; (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vd, ve, vf, vg y vh o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cd, ce y cf; y (iii) el tercer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de vi y vj o un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cg, ch, ci, cj y ck.

Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un trío de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ca (que comprende las CDR de cadena pesada 1 , 2 y 3 que se exponen en las secs. con núms. de ident.: 29, 30 y 34, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 que se exponen en las secs. con núms. de ident.: 48, 45 y 49, respectivamente); (ii) el segundo anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cd (que comprende las CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 que se exponen en las secs. con núms. de ident.: 29, 30 y 31, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1 , 2 y 3 que se exponen en las secs. con núms. de ident.: 53, 54 y 55, respectivamente); y (iii) el tercer anticuerpo compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ch (que comprende las CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 que se exponen en las secs. con núms. de ident.: 23, 24 y 26, respectivamente, y las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 39, 40 y 42, respectivamente). La combinación del trío de anticuerpos ca, cf y ch se describe además en la presente como el trío de anticuerpos 4c que se expone en la Tabla IV.

La invención también proporciona el uso de los tríos anteriormente descritos de anticuerpos anti-EGFR en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR. La invención también proporciona el uso de los tríos anteriormente descritos de anticuerpos anti-EGFR en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, tal como un cáncer que expresa EGFR, tal como un cáncer que incluye, pero no se limita a, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma renal, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello glioblastoma, el cáncer de próstata y otros tumores sólidos y/o metastásicos.

V. Métodos para usar los anticuerpos Se proporcionan además métodos para usar los anticuerpos que se unen al EGFR en una variedad de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas ex vivo e in vivo que involucran la señalización dependiente de EGFR, incluyendo una variedad de cánceres.

Por consiguiente, en una modalidad, se proporciona un método para tratar una enfermedad asociada con la señalización dependiente de EGFR mediante la administración de un anticuerpo a un sujeto o preferentemente una combinación de anticuerpos proporcionados en la presente en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad. Las enfermedades adecuadas incluyen, por ejemplo, una variedad de cánceres incluyendo, pero sin limitarse a, melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma renal, cáncer gastrointestinal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, el cáncer de próstata y otros rumores sólidos y/o metastásicos.

El anticuerpo se puede administrar solo o con otro agente terapéutico que actúa en conjunto con o sinérgicamente con el anticuerpo para tratar la enfermedad asociada con la señalización mediada por EGFR. Tales agentes terapéuticos incluyen aquellos descritos en la presente, por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, biológicos recombinantemente modificados, compuestos de ARNi, inhibidores de tirosina quinasa, y anticuerpos comerciales, así como agentes anticancerosos {por ejemplo, citotoxinas, agentes quimioterapéuticos, pequeñas moléculas y radiación).

También se proporcionan los kits que comprenden uno o más anticuerpos anti-EGFR, opcionalmente contenidos en un único frasco, e incluyen, por ejemplo, instrucciones de uso en el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad asociada con la regulación positiva de EGFR y/o la señalización dependiente de EGFR. Los kits pueden incluir una etiqueta que indica el uso pretendido de los contenidos del kit. El término etiqueta incluye cualquier escritura, materiales de mercado o material grabado suministrado en o con el kit, o que de otra manera acompaña al kit.

Otras modalidades se describen en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos Materiales y métodos para los Ejemplos 1-5 A lo largo de los Ejemplos 1 a 5, los siguientes materiales y métodos se usan a menos que se indique lo contrario.

En general, a menos que se indique de cualquier otra forma, se usan las técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), y técnicas estándar de preparación de polipéptido.

Líneas celulares Todas las líneas celulares que se usarán en los experimentos descritos más abajo se obtuvieron del Instituto Nacional del Cáncer o ATCC.

Líneas celulares: A431 -carcinoma epidermoide OVCAR-3 - cáncer de ovario Du 145 - carcinoma de próstata ADRr - carcinoma de mama Pulverización de células tumorales Un criopulverizador (COVARIS Inc.) se usa para la pulverización de los tumores. Los tumores se almacenan en bolsas especiales (previamente pesadas antes de la adición del tumor) y se colocan en nitrógeno líquido, durante el manejo de ellas. Para tumores pequeños, se añade primeramente a la bolsa que contiene el tumor 200 µ? del tampón de lisis, se congelan en nitrógeno líquido y después se pulverizan para mejorar la recuperación del tumor de la bolsa. Los tumores pulverizados se transfieren a tubos Eppendorf de 2 mi y se colocan en nitrógeno líquido hasta estar listos para su posterior procesamiento.

Lisis de las células tumorales Los tumores se lisan en tampón de lisis suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. El tampón de lisis se añade a las alícuotas tumorales en una concentración final de aproximadamente 62.5 mg/ml. Las muestras tumorales se homogeneizan mediante agitación en vórtex durante 30 segundos y se incuban en hielo durante aproximadamente 30 min. Los Usados se centrifugan durante aproximadamente 10 min en columnas QIASHREDDER de Qiagen para la homogenización adicional de las muestras. Los lisados aclarados se dividieron en alícuotas en tubos frescos para su posterior procesamiento.

Ensayo BCA El Ensayo de BCA (Pierce) se realiza siguiendo el protocolo del fabricante en todas las muestras tumorales. La concentración de proteína total (en mg/ml) de cada muestra de tumor se usa más tarde en la normalización de los resultados del ELISA.

Ensayo ELISA Todos los reactivos de ELISA para las pruebas ELISA totales y fosfo-EGFR se compraron a R & D Systems como kits Duoset. Las placas de alta afinidad GREINER de 96 pocilios (Cat. # 675077; GREINER BIO-ONE, Monroe, NC) se recubren con 50 µ? de un anticuerpo y se incuban durante la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, las placas se lavan 3 veces con 1000 µ?/pocillo en un lavador de placas BIOTEK con PBST (0.05% de Tween-20). Las placas se bloquean posteriormente durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con 2% de BSA en PBS. Las placas se lavan 3 veces con 1000 µ?/pocillo en el lavador de placas BIOTEK con PBST (0.05% de Tween-20). Se usan aproximadamente 50 µ? de los lisados celulares y los estándares diluidos en tampón de lisis 50% y 1% de BSA en los duplicados para su posterior procesamiento. Las muestras se incuban durante 2 horas a 4°C con agitación y se lavan 3 veces con 1000 µ?/pocillo en el lavador de placas BIOTEK con PBST (PBS con 0.05% de Tween-20). Se añade aproximadamente 50 µ? de un anticuerpo de detección diluido en BSA al 2%, PBST y se incuba durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. Para el fosfo-EGFR, el anticuerpo de detección se conjuga directamente con la peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces con 1000 µ?/pocillo en el lavador de placas BIOTEK con PBST (0.05% de Tween-20). Se añade aproximadamente 50 µ? de estreptavidina-HRP y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente (excepto para pErbB3). Las placas se lavan 3 veces con 1000 µ?/pocillo en el lavador de placas BIOTEK con PBST (0.05% de Tween-20). Se añade aproximadamente de 50 µ? del sustrato ELISA SuperSignal PICO y la placa se lee usando un lector de placas Fusión. Los datos se analizaron usando Excel. Las muestras por duplicado se promedian y las barras de error se usan para representar la desviación estándar entre las dos repeticiones.

Inhibición de la señalización de AKT y/o ERK La señalización mediada por EGFR a través de AKT o ERK se mide usando técnicas reconocidas en la técnica usando ensayos de quinasa para tales proteínas. Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos núm. 2010-0056761.

Ensayo de dimerización del EGFR Para medir el grado de la homodimerización de EGFR en las células, se usan los ensayos de co-precipitación usando dos tipos de constructos con epítopo de EGFR marcados, por ejemplo, EGFR-flag y EGFR -myc que contienen las marcas Flag y Myc, respectivamente, en la región C-terminal de EGFR. EGFR-flag y EGFR -myc se co-transfectan en células, por ejemplo, células COS-7 y se incuban en medio libre de suero. Los Usados celulares se precipitan con anticuerpo anti-Flag y el material precipitado se analiza por transferencia tipo Western usando el anticuerpo anti-Myc, o viceversa. Se mide y compara la cantidad de co-precipitación de EGFR-myc con el anticuerpo anti-Flag, y el coprecipitado EGFR-flag con el anticuerpo anti-Myc en presencia y ausencia de anticuerpo (control).

Ensayo de internalización del EGFR Para medir el grado de internalización de EGFR (es decir, disminución de la expresión de EGFR), se incuban las células que expresan EGFR radiomarcado (por ejemplo, l 25I) en presencia y ausencia de anticuerpo (control). Se determina y compara la proporción de radiactividad internalizada y de la superficie.

Afinidad de unión Las constantes de disociación de los anticuerpos anti-EGFR se pueden medir usando dos técnicas independientes, por ejemplo, un ensayo de resonancia de plasmón superficial y un ensayo de unión celular usando células A431. Las afinidades y la reactividad cruzada de los anticuerpos también se miden en solución con el receptor de EGF recombinante usando la instrumentación KinExA (SAPIDY E Instruments, Boise, ID). El procedimiento usó 12 diluciones tituladas 1 :3 de ErbBl .óhis (1000 nM, 333 nM, 1 1 1 nM, 37 nM, 12.3nM, 4.1 nM, 1.37 nM, 450 pM, 150 pM, 50 pM, 17 pM) preparado en tubos de 5 mi, manteniendo la concentración de anticuerpos en cada tubo constante en 250pM. Se preparan 15 mi del anticuerpo secundario Ga de IgG humana marcado con 2µg/ml de Cy5 a través de una dilución 1 : 1000 de la solución madre (2 mg/ml). Las perlas ErbBl .óHIS conjugadas con PMMA se acoplan de acuerdo con el protocolo KinExA de SAPIDYNE. Se añade 100 µg de ErbB l-6His a una alícuota medida previamente de 200mg de perlas de PMMA. Se añade después PBS IX a la solución para llevar el volumen final de 1 mi. Esta solución se incuba a continuación a temperatura ambiente durante 1 h. Las perlas se transfieren a un frasco de perlas con 27 mi de PBS IX. El experimento se configura después mediante la introducción de los parámetros en el programa de ordenador Pro KinExA.

Ensayo de resonacia de plasmón superficial El ensayo de resonancia de plasmón superficial se realiza como sigue.

Cualquier anticuerpo o antígeno (300 RU) se inmoviliza en un chip CM5 usando acoplamiento de amina. Se inyectan después diferentes concentraciones de anticuerpos o antígenos para estudiar su asociación y disociación con la proteína inmovilizada. Entre inyecciones diferentes, el chip se regenera usando un tampón de regeneración adecuado (tal como glicina, pH 2.5). La fase de disociación se ajusta usando la Ecuación 1 para determinar K-off (velocidad de disociación): R= R0*exp(- off*t) (1 ) La fase de asociación se ajusta usando este valor de K0¡ y la Ecuación 2 para determinar K( (velocidad de asociación) y KQ (constante de equilibrio). donde C representa o bien la concentración de antígeno o anticuerpo en solución, fm¿v o representa la señal de saturación y i representa el tiempo.

Ensayo de unión celular Los ensayos de unión celular para determinar los valores ¾ se realizaron como sigue: células A431 se separan con 3 mi tripsina-EDTA a 37 °C por 5 minutos. El DMEM completo (10 mi) se añade de inmediato a las células tripsinizadas, se resuspenden suavemente y se centrifugan en una centrífuga de mesa Beckman a 1 100 rpm por 5 minutos. Las células se resuspenden en tampón de tinción (PBS + 0.2% BSA+ 0.1% de azida de sodio) a una concentración de 2 x 106 células por mi y 50 µ? de las alícuotas (1 x 105 células) se colocan en una placa de titulación de 96 pocilios. 300 µ? de una solución madre de 2000 nM de anticuerpo anti-EGFR se prepara en tampón de tinción y 100 µ? de esta se diluye seriadamente en 200 µ? de tampón de tinción. Las concentraciones del anticuerpo diluido se encuentran en el intervalo de 2000 nM a 0.1 nM. Alícuotas de 150 µ? de las diferentes diluciones de proteína se adicionaron directamente después a la 50 µ? suspensión celular dando las concentraciones finales de 1 00 nM, 500 nM, 166.7 nM, 55.6 nM, 18.5 nM, 6.17 nM, 2.05 nM, 0.68 nM, 0.23 nM y 0.076 nM del anticuerpo.

Las células alicuotadas en la placa de 96 pocilios se incubaron con las diluciones de proteína por 2 h a temperatura ambiente con agitación y se lavaron tres veces con 300 µ? tampón de tinción. Las células se incubaron después con 100 µ? de una dilución 1 :750 de IgG de cabra anti- humana marcada Alexa 647 en tampón de tinción BD por 45 minutos con agitación a 4°C. Por último, las células se lavaron dos veces, se centrifugaron para obtener el sedimento celular y se resuspendieron en 250 µ? de tampón de tinción + 0.5 µg/ml de yoduro de propidio. Los análisis de 10,000 células se realizaron en un citómetro de flujo FACSCALIBUR que usa el canal FL4. Los valores de MFI y las concentraciones correspondientes de los anticuerpos anti-EGFR se representan en el eje y el eje x, respectivamente. El KQ de la molécula se determina mediante el software GraphPad PRISM que usa el modelo de unión de un sitio para una curva de regresión no lineal.

El valor de KD se calcula sobre la base de la fórmula Y = Bmáx*X/Ko + X (Bmáx = fluorescencia en la saturación. X = concentración de anticuerpo. Y = grado de unión).

Inhibición de la proliferación de células tumorales La inhibición de la proliferación celular de células que expresan EGFR (por ejemplo, células cancerosas) se examinó como sigue: las células Dul45, A431 o OVCAR-3 se siembran en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios a 20,000 células por pocilio y se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, 2 mM de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (FBS) durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. El medio después se cambió al medio RPMI-1640 (con antibióticos, 2 mM de L-glutamina, 0.5% de FBS), que está a las concentraciones sin o con anticuerpo a 200 nM, 20 nM, 2 nM, 0,2 nM, 0.02nM y OnM (se usa una IgG de control como un control de isotipo). Las células se cultivan durante 36 horas a 37 °C y 5% de dióxido de carbono. A continuación las células se pulsan con 25 µ? de una dilución 1 :40 de 3H-timidina (20 Ci/mmol, l mCi/ml), se incuban durante la noche (18 h), se recogieron en FILTERMATS y se lee en un contador beta.

Inhibición de la fosforilación de EGFR en células tumorales Para evaluar la inhibición de la fosforilación de EGFR in vivo, las muestras se lisan y se realizan los ensayos de BCA y ELISA como se describió anteriormente.

Inhibición de EGF inducida por fosforilación de EGFR La inhibición de EGF inducida por fosforilación de EGFR se examina como sigue:Las células OVCAR-3 y ADRR se siembran con una densidad de 35,000 células/pocilio en una placa de 96 pocilios. Las células se incuban en 10% de suero durante 24 horas y, a continuación se privan de suero durante 14 horas. Después las células se preincuban con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-EGFR durante 40 minutos. Después de la incubación previa, se retira el medio y las células se estimulan durante 5 minutos a 37°C, 5% C02 con 50 nM de EGF humano. Se usan también los controles de EGF al 10% de suero y 0% (5 minutos, 5 nM). Las células se lavan con PBS IX frío y se lisan en 50 µ? de tampón de lisis frío con hielo (Kit ELISA R & D SYSTEMS tampón 12 con inhibidores de proteasa recién añadidos) mediante la incubación en hielo durante 30 minutos. Los Usados se analizan ya sea inmediatamente o se congelan a -80°C hasta su uso.

Inhibición de la señalización mediada por EGF en células tumorales La inhibición de la señalización de una célula tumoral mediada por el ligando se investigó como sigue: las células OVCAR-3 o Dul45 se siembran en placas de 96 pocilios de cultivo de tejidos y se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, 2 mM de L-glutamina y 10% suero bovino fetal (FBS) durante 24 horas a 37°C y 5% de dióxido de carbono. Las células se privan de suero en medio RPMI-1640 con antibióticos y 2 mM de L-glutamina durante 24 horas a 37° C y 5% de dióxido de carbono. Las células se pre-tratan con y sin el anticuerpo anti-EGFR en las concentraciones ? µ?, 250nM, 63nM, 16nM, 4.0nM, l .OnM, 240pM y 61pM durante 30 minutos y luego se estimulan con ligando EGF durante 10 minutos a 37°C y 5% de dióxido de carbono. Las células se lavan con PBS frío a continuación se recogen con tampón de lisis de extracto de proteínas de mamíferos (mPER) (Pierce, 78505) que contiene NaCl 150 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, bpV (phen) lOmM, fenilarsina 50 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, P714 ). Los lisados celulares se diluyen dos veces con 4% de suero de albúmina bovina en tampón fosfato salino con 0.1% de Tween-20, y luego se analizan por ELISA para la fosforilación de EGFR y AKT (un efector corriente abajo de EGFR).

Para probar la fosforilación de AKT, los lisados se corren en una placa de ELISA con un anticuerpo de captura específico para AKT y un anticuerpo de detección biotinilado específico para el sitio de fosforilación en la serina 473 de AKT. Se genera una señal con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano que reaccionan con el sustrato quimioluminiscente (Pierce, 37070).

Ejemplo 1 : Producción de anticuerpos Con el fin de obtener anticuerpos anti-EGFR humanos, se seleccionan las bibliotecas de expresión de acuerdo con los métodos descritos en las publicaciones de patente de Estados Unidos 20100056386 y 20090181855.

Ejemplo 2: Afinidad de unión / Clasificación de Epítopos Se usa la resonancia de plasmón superficial (SPR) para analizar la afinidad de unión. En concreto, una de las proteínas (anticuerpos o de destino) se inmoviliza sobre la superficie del chip (como se describe en la presente) y se añade la otra proteína. Se mide la interacción de asociación/disociación de las dos proteínas. Como la proteína en solución se asocia con la proteína inmovilizada, resulta en un aumento en el índice de refracción cuya señal de resonancia es captada. Como la proteína se disocia, resulta en una disminución de la señal.

La clasificación de epítopo (bloqueo EGF) se analiza mediante el análisis BIACORE como se describió anteriormente. Uno de los anticuerpos se inmoviliza en la superficie del chip.

Como el EGFR se asocia con el anticuerpo, se incrementa la señal de resonancia. El chip se regenera a continuación y se inyecta una mezcla de EGFR y otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo previamente determinado para unirse al EGFR). Si el anticuerpo se une a epítopos solapados con el anticuerpo inyectado, entonces la señal será menor en comparación con EGFR inyectado solo. El chip se regenera de nuevo a continuación y una mezcla de ligando de EGF y EGFR se inyecta. Se mide la señal de resonancia. Una disminución en la señal indica los epítopos solapados con el ligando EGF. El chip se regenera para el momento final y se inyecta con EGFR para confirmar la actividad del anticuerpo.

Ejemplo 3: Inhibición de la fosforilación de EGFR en las células tumorales La inhibición de la fosforilación de EGFR en las células ADRR, OVCAR3, y A431 por anticuerpos anti-EGFR particulares se analizan como se describió anteriormente.

Ejemplo 4: Inhibición de la fosforilación de AKT en las células tumorales La inhibición de la fosforilación de AKT en las células Dul45 y OVCAR3 para combinaciones de anticuerpos se analiza como se describió anteriormente. Dos líneas celulares se ensayan sobre la base de dos parámetros: (1) alta expresión de ErbBl (>105 receptores/célula) y (2) el intervalo dinámico de la inducción de pAKT es >5 veces.

Todos los anticuerpos anti-EGFR se combinan con otro anticuerpo anti-EGFR sin tener en cuenta mapeo de epítopos. Se crearon seis puntos de las curvas de inhibición (pico de concentración 2 µ? con diluciones seriadas 10 veces para muchas parejas y tríos, mientras que algunos se seleccionan con curvas de dilución de 4 puntos.

Todos los anticuerpos que inhiben pAKT tanto aditiva como sinérgicamente mapearán a distintos epítopos. Algunos pares serán inhibidores más potentes que cetuximab. Los resultados en dos líneas celulares idénticas una de la otra sugieren que, en ausencia de receptores mutados o vías de señalización (por ejemplo, kRAS), la alta expresión de ErbBl (y quizás ErbBl > ErbB2/3) es un criterio de comienzo para la sinergia.

Se llevaron a cabo estudios de inhibición a corto y largo plazo, usando combinaciones de anticuerpo anti-EGFR con 40 minutos de pre-incubación de anticuerpos. Los ensayos se repitieron cada 40 minutos, en comparación con la pre-incubación de anticuerpos de 24 horas. Los datos muestran que los efectos de la intemalización y degradación de EGFR cambian las lecturas.

Ejemplo 5: Inhibición de la proliferación celular tumoral La inhibición de la proliferación de células tumorales se analiza como se ha descrito anteriormente. La acción inhibidora de las parejas y trios proporcionados en la presente en las células DU 145 es preferentemente fuerte. Además, los pares y tríos de anticuerpos preferentes presentan una mayor inhibición de la proliferación de células Du l45 que una concentración equimolar de cetuximab. Se evalúan también las parejas y tríos en el ensayo de pERK. Las parejas y tríos preferentes son potentes antagonistas de la señalización de pERK.

Materiales y métodos para los Ejemplos 6-12 A lo largo de los Ejemplos 6 a 13, los siguientes materiales y métodos se usan a menos que se indique lo contrario.

En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos), y técnicas estándar en la preparación de polipéptido. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y otros, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y otros, John Wiley & Sons (1992). Los sistemas de modelo in vitro e in vivo para evaluar la biología del HCV se describen, por ejemplo, en Cell culture models and animal models of viral hepatitis. Parte II: hepatitis C, Lab. Anim. (NY).;34(2):39-47 (2005) y en The chimpanzee model of hepatitis C virus infections, ILAR J.; 42(2): 117-26 (2001 ).

Líneas celulares: A431 -carcinoma epidermoide Du 145 - carcinoma de próstata H1975 carcinoma de pulmón de células no pequeñas Purificación de proteínas de dominio extracelular de EGFR (EGFR-ECD) mutantes Se generan mutantes del dominio extracelular de EGFR (EGFR-ECD) para la clasificación de epítopo de mAb. Las mutaciones fueron diseñadas en base tanto a los epítopos de cetuximab (Li S. y otros, Cáncer Cell. 7: 301 -31 1 , 2005) y Hl 1 (Spangler J. y otros, PNAS. 107: 13252- 13257, 2010) epitopes and upon structural analysis of the EGFR-ECD structure (Banco de Datos de Proteínas ID: 1 NQL; Ferguson KM. y oíros, Mol Cell. 11 : 507-5 17, 2003). Los residuos se mutan en las alaninas como se indica en las secuencias de proteínas incluidas en esta solicitud. La síntesis de ADN de los constructos de expresión se completa con DNA2.0 (www.dna20.com). La subclonación posterior del ADN, la expresión de proteínas en células 293F y la purificación de proteínas se completó como se describió previamente.

Inhibición de la señalización mediada por EGF de EGFR o ERK en células tumorales La inhibición de la señalización mediada por ligando de célula tumoral se investiga como sigue: las células A431 o Dul45 se siembran a una densidad de 35,000 células/pocilio o 17,500 células por medio pocilio en placas de 96 pocilios de cultivo de tejidos y se cultivan en medio DMEM o RPMI-1640 suplementado con antibióticos, 2 mM de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (FBS) durante 24 horas a 37°C y 5% de dióxido de carbono. Las células se privan de suero en el medio FBS al 1% con antibióticos y 2 mM de L-glutamina durante aproximadamente 20 horas a 37°C y 5% de dióxido de carbono.Después las células se preincuban con concentraciones variables de anticuerpos anti-EGFR durante 2 horas, y luego se estimulan con ligando EGF humano (50 ng/ml)(Preprotech, cat # AF-100-15) durante 10 minutos a 37°C y 5% de dióxido de carbono. Las células se lavan con PBS frío en hielo y se lisan en 50µ1 de tampón de lisis helado (tampón de lisis de extracto de proteínas de mamíferos (MPER-Pierce, 78505) modificado con 150 mM de NaCl y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, P714)) mediante la incubación en hielo durante 30 minutos. Los lisados se analizan inmediatamente por ELISA tanto para ERK (un efector corriente abajo de EGFR) y para la fosforilación de EGFR, o se congelan a -80°C hasta su uso.

Ensayos ELISA Para el ELISA de tipo sándwich de fosfo-EGFR, se recubren la mitad de las placas de 96 pocilios de alta afinidad de GREINER (Cat. # 675077; GREINER BIO-ONE, Monroe, NC) con 50 µ? de un anticuerpo de EGFR (EGFR Ab-1 1, Clon: 199.12, sin BSA y azida, Fisher Scientifíc, cat # MS396P 1ABX), y se incuban durante la noche a temperatura ambiente. La mañana siguiente, las placas se lavan 3 veces con ???µ?/pocillo de PBST (0.05% de Tween-20) en un lavador de placas BIOTEK. Las placas se bloquean posteriormente durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente con 2% de BSA en PBS. Las placas se lavan 3 veces con 100 µ?/pocillo de PBST (0.05% de Tween-20) en el lavador de placas BIOTEK. Los lisados celulares (50 µ?) o estándares (kit ELISA pEGFR pY1068, R & D Systems, cat # DYC3570) se diluyen en 50% de tampón de lisis y 1 % BSA-PBS (según las recomendaciones del fabricante) se añaden a las placas por duplicado y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C con agitación. Las placas se lavan a continuación 3 veces con 100 µ?/pocillo en el lavador de placas BIOTEK con PBST (PBS con 0.05% de Tween-20).Se añaden aproximadamente 50 µ? de un anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (kit ELISA pEGFR pY1068, R & D Systems, cat # DYC3570) diluido en BSA al 2%, PBS y se incuba durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. La placa se lava 3 veces con 100 µ?/ pocilio en el lavador de placas BIOTEK con PBST (0.05% de Tween-20). Se añade aproximadamente 50µ1, de sustrato de ELISA PICO SuperSignal y la placa se lee usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). Los datos se analizan y las muestras duplicadas se promedian y las barras de error se usan para representar la desviación estándar entre las dos repeticiones.

El ELISA fosfo-ERK se realiza de manera similar al ELISA fosfo-EGFR con los siguientes cambios: se compra kit ELISA Duoset pERK Humano de R & D Systems (cat# DYC1018-5) y usa como se recomienda por el fabricante.

Se realiza un ELISA directo usando EGFR-ECD de tipo salvaje (WT), un epítopo mutante Binl, o un epítopo mutante Bin3 como reactivos de captura (4 µg ml). Se recubren la mitad de las placas de 96 pocilios altas de unión de GREINER (Cat. # 675077; GREI ER BIO-ONE, Monroe, NC) con 50 µ? de reactivo de captura y se incuban durante la noche a temperatura ambiente. La mañana siguiente, las placas se lavan 3 veces con 100 µ?/pocillo en un lavador de placas BIOTEK con PBST (0.05% de Tween-20) y se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente con 1% de BSA en PBS, pH 7.2. Se incubaron diferentes concentraciones (1, 0.25, 0.06, y 0.02 µg/ml) de anticuerpos monoclonales (mAbs) diluidos en 1% de BSA en PBS, pH 7.2 con los reactivos de captura a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido por la detección del fragmento Fe de IgG de cabra anti- humano conjugado con peroxidasa de AffiniPure (catálogo de Jackson Immunoresearch # 109-035-008) con dilución 1 :50,000 en 1% de BSA en PBS, pH 7.2 durante 2 horas. Se añade aproximadamente 50 µ? de sustrato Supersignal ELISA PICO y la placa se lee usando un lector de placas Envision (Perkin Elmer). Los datos se analizan y las muestras duplicadas se promedian y las barras de error se usan para representar la desviación estándar entre las dos repeticiones. Las células se pre-trataron con y sin el anticuerpo anti-EGFR a concentraciones de 2 µ?, 666.6 nM, 222.2 nM, 74 nM, 24.7 nM, 8.2 nM, 2.7 nM, 914 pM y 304 pM por 2 horas.

Afinidad de unión: Ensayo de exclusión cinética (KinExA) Las afinidades y la reactividad cruzada de los anticuerpos también se miden en solución con el receptor de EGF recombinante usando la instrumentación KinExA (SAPIDYNE Instruments, Boise, ID).Los materiales usados para este ensayo son un instrumento KinExA 3000 y el programa de ordenador (Sapidyne Instruments, Boise, ID), perlas de polimetilmetacrilato (PMMA) (Instrumentos Sapidyne), IgG humana anti-EGFR, EGFR humano recombinante, anti-IgG humana de cabra conjugado con Cy5 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), tampón fosfato salino (PBS), y albúmina de suero bovino en PBS (100 mg/ml).

Para acoplar el receptor de EGF recombinante a las perlas de PMMA, se añade 100 µg de EGFR recombinante a una alícuota medida previamente de 200 mg de perlas de PMMA, y se añade PBS para que el volumen total de 1 mi. Las perlas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en una rueda giratoria. A continuación, las perlas se centrifugan brevemente y se elimina el sobrenadante. Se añade 100 µ? de 100 mg/ml de BSA en PBS a las perlas, con más adición de PBS para hacer un volumen total de 1 mi. Las perlas se incuban de nuevo durante 1 hora a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Las perlas se transfieren después a una botella de vidrio que contiene 27 mi de PBS.

Para determinar la afinidad de unión de los anticuerpos monovalentes, se prepara una serie de diluciones de doce etapas de EGFR recombinante (75 nM, 25 nM, 8.3 nM, 2.8 nM, 0.9 nM, 0.3 nM, 100 pM, 33 pM, 1 1 pM, 4 pM, 1.3pM, 0 pM) en 5 mi de PBS con una concentración constante del anticuerpo anti-EGFR. Para la medición precisa de la afinidad, la concentración de sitio de unión total de anticuerpos ("ABC"; dos veces la concentración molar del anticuerpo, debido a la valencia) debe ser menor que la afinidad monovalente del anticuerpo para EGFR. Las mezclas anticuerpo-receptor se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente con el fin de alcanzar el equilibrio. Dependiendo de la afinidad esperada del complejo anticuerpo-receptor, este tiempo de equilibrio puede por tanto ajustarse. En un tubo separado, se prepara 15 mi de 2 µg/ml del anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con Cy5, usando una dilución 1 : 1000 del conjunto (2 mg/ml) de anticuerpo en PBS. Entonces, las líneas del instrumento KinExA se adjuntan a cada uno de los 12 tubos de solución de anticuerpo-receptor. Cada solución se inyecta a través de una columna empaquetada de perlas con EGFR. (El instrumento KinExA automáticamente empaqueta la columna de perlas nuevas para cada inyección. )Después de una etapa de lavado, el anticuerpo secundario marcado se pasa a través de la columna. Finalmente, usando la cantidad medida del receptor no acomplejado a diferentes concentraciones de receptores, los datos de la titulación del equilibrio se ajusta a un modelo de enlace 1 : 1 en el del programa de ordenador de KinExA para producir un valor de afinidad KD.

Para determinar la velocidad de unión obligatoria usando el "método directo"de KinExA, la afinidad de unión del equilibrio monovalente (KD) se determina usando el modo anterior y la concentración del sitio de unión total del anticuerpo (ABC). Luego, se determina la concentración de partida del antígeno (LO) usando el programa de ordenador de la "Demostración Teórica de la Curva de Unión " (Instrumentos Sapidyne), para el experimento de cinética. Para ello, los valores de afinidad y ABC determinados en el experimento de afinidad de unión monovalente se introducen, y se selecciona una concentración de antígeno de partida como la concentración donde aproximadamente el 20% del anticuerpo estará no unido al antígeno en el equilibrio. Esto asegura una buena relación señal-ruido en el experimento. Se prepara 15 mi de 2 µg/ml del anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con Cy5, usando una dilución de 1 : 1000 del conjunto (2 mg/ml) de anticuerpo en PBS. En un tubo separado, se prepara 8 mi de una solución del anticuerpo anti-EGFR a una concentración de 2 x ABC. Esta concentración es del doble de la concentración de corrida, ya que se mezcla con 8 mi de solución de antígeno antes del experimento. En un tubo separado, se prepara 8 mi de solución de EGFR recombinante a una concentración de 2 x LO. Esta concentración es también el doble de la concentración de corrida, ya que se mezcla con 8 mi de solución de anticuerpo antes del experimento. A continuación, las perlas recubiertas de EGFR y la solución de anticuerpo secundario se colocan en el recipiente y línea adecuados, respectivamente. El anticuerpo y la solución de antígeno se mezclan cuidadosamente e inmediatamente se conecta a la línea adecuada, y el programa de ordenador de KinExA se usa para medir la cantidad de anticuerpo libre como una función del tiempo en la solución resultante. Para determinar la constante Kon de asociación (Kon), el programa de ordenador de KinExA se usa para ajustar el agotamiento de la cantidad de anticuerpo libre como una función del tiempo en una ecuación de velocidad bimolecular reversible. La constante de disociación Ko f (Koff) es igual a la Kon*KD (Kd).

Afinidad de unión: Ensayo de resonancia de plasmón superficial El ensayo de resonancia de plasmón superficial se realiza como sigue.

Cualquier anticuerpo o antígeno (300 RU) se inmoviliza en un chip CM5 usando acoplamiento de amina. Se inyectan después diferentes concentraciones de anticuerpos o antígenos para estudiar su asociación y disociación con la proteína inmovilizada. Entre inyecciones diferentes, el chip se regenera usando un tampón de regeneración adecuado (tal como glicina, pH 2.5). La fase de disociación se ajusta usando la Ecuación 1 para determinar K0ff (velocidad de disociación): R= R0*exp(- off*t) (1 ) La fase de asociación se ajusta usando este valor de K0¡f y la Ecuación 2 para determinar KON (velocidad de asociación) y KD (constante de equilibrio). donde C representa o bien la concentración de antígeno o anticuerpo en solución, Rm,i o representa la señal de saturación y t representa el tiempo.

Ensayo de unión celular Los ensayos de unión celular para determinar los valores KD se realizaron como sigue: células A431 se separan con 3 mi tripsina-EDTA a 37 °C por 5 minutos. El DMEM completo (10 mi) se añade de inmediato a las células tripsinizadas, se resuspenden suavemente y se centrifugan en una centrífuga de mesa Beckman a 1 100 rpm por 5 minutos. Las células se resuspenden en tampón de tinción (PBS + 0.2% BSA+ 0.1% de azida de sodio) a una concentración de 2 x 106 células por mi y 50 µ? de las alícuotas (1 x 105 células) se colocan en una placa de titulación de 96 pocilios. 300 µ? de una solución madre de 2000 nM de anticuerpo anti-EGFR se prepara en tampón de tinción y 100 µ? de esta se diluye seriadamente en 200 µ? de tampón de tinción. Las concentraciones del anticuerpo diluido se encuentran en el intervalo de 2000 nM a 0.1 nM. Alícuotas de 150 µ? de las diferentes diluciones de proteína se adicionaron directamente después a la 50 µ? suspensión celular dando las concentraciones finales de 1500 nM, 500 nM, 166.7 nM, 55.6 nM, 18.5 nM, 6.17 nM, 2.05 nM, 0.68 nM, 0.23 nM y 0.076 nM del anticuerpo.

Las células alicuotadas en la placa de 96 pocilios se incubaron con las diluciones de proteína por 2 h a temperatura ambiente con agitación y se lavaron tres veces con 300 µ? tampón de tinción. Las células se incubaron después con 100 µ? de una dilución 1 :750 de IgG de cabra anti- humana marcada Alexa 647 en tampón de tinción BD por 45 minutos con agitación a 4°C. Por último, las células se lavaron dos veces, se centrifugaron para obtener el sedimento celular y se resuspendieron en 250 µ? de tampón de tinción + 0.5 µg/ml de yoduro de propidio. Los análisis de 10,000 células se realizaron en un citómetro de flujo FACSCALIBUR que usa el canal FL4. Los valores de MFI y las concentraciones correspondientes de los anticuerpos anti-EGFR se representan en el eje y el eje x, respectivamente. El KD de la molécula se determina mediante el software GraphPad PRISM que usa el modelo de unión de un sitio para una curva de regresión no lineal.

El valor de KD se calcula sobre la base de la fórmula Y = Bmáx*X/K.D + X (Bmáx = fluorescencia en la saturación. X = concentración de anticuerpo. Y = grado de unión).

Inhibición de la proliferación celular tumoral in vitro La inhibición de la proliferación celular de las células que expresan EGFR (por ejemplo, células cancerosas) se examina in vitro como sigue: las células H 1975 o A431 se siembran en placas de 96 pocilios de cultivo de tejidos a 250, 500, 1000 o 2,000 células por pocilio y se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, 2 mM de L-glutamina y 10% suero fetal de ternero (FCS) durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. El medio se cambió a medio RPMI-1640 (con antibióticos, 2 mM de L-glutamina, 1% FBS) suplementado con 50 ng/ml de EGF en presencia o ausencia de 1 µ??? de anticuerpo (concentración final). Las células se cultivan durante 6 días a 37°C y 5% de dióxido de carbono. La viabilidad celular se mide usando el Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente de CellTiter-Glo® (CTG) (Promega Corporation) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo CTG mide el número de células viables en cultivo basándose en la cuantiñcación del ATP presente, que es un indicador de las células metabólicamente activas. Los tratamientos de control incluyen las células tratadas con medio RPMI-1640 con antibióticos, 2 mM de L-glutamina, 1% de FCS pero no suplementado con 50 ng/ml de EGF (referido como tratamiento de l%de FCS) y las células tratadas con medio RPMI-1640 con antibióticos, 2 mM de L-glutamina pero no suplementado con FCS o EGF (referido como medio libre de suero, o tratamiento SFM).

Estudios in vivo de xenoinjerto de ratón Los ratones nu/nu (Charles River Labs) se inyectan por vía subcutánea con 3.5 x 106 de células A431 o 2.0 x 106 células H1975 y los tumores resultantes se dejaron crecer hasta que alcanzar un tamaño medio de 200 mm. La dosificación se inicia a continuación como sigue. Los anticuerpos de reacción cruzada con el ratón EGFR se administran cada 2 días (q2d) y los anticuerpos de reacción no cruzada se administran cada 4 días (q4d). Las mediciones se toman a intervalos de 3 días. La dosificación se detuvo después de 5 y 7 dosis para A431 y H1975, respectivamente. Un período de recuperación se mantiene para ambos estudios. Las dosis de anticuerpos se normalizaron para representar un suero uniforme vida media.

Ejemplo 6: Afinidad de unión / Clasificación de epítopo La clasificación de epítopo se analiza mediante el análisis BIACORE como se describió anteriormente. Uno de los anticuerpos se inmoviliza en la superficie del chip. Como el EGFR se asocia con el anticuerpo, se incrementa la señal de resonancia. Se llevan a cabo las inyecciones secuenciales de anticuerpos que pertenecen a los tres tipos 1 , 2 y 3. Si el anticuerpo se une a epítopos solapados con el anticuerpo inyectado, entonces la señal no va a cambiar en comparación con la inyección anterior. Si el anticuerpo se une a un epítopo no solapado, la señal en el chip será más alta que la inyección previa. El anticuerpo conjugado con el chip se inyecta finalmente como ligando libre para confirmar la falta de unión con epítopos solapados (Figura 17D).

Los tipos se diseñaron de manera que los anticuerpos seleccionados puedan abarcar tres epítopos distintos, que no se solapan en el dominio extracelular (ECD) de EGFR. Estos se agrupan en tres tipos: Binl se mapea para el dominio III de EGFR y representa el epítopo C225 (el sitio de unión a cetuximab); Bin2 se mapea para el dominio I y representa el epítopo ICR10 (Abcam Ab231) (Cochran j otros (2004) Journal of Immunological Methods, 287: 147-158), y Bin3 se mapea para el dominio III y representa el clon Hl l del epítopo (Spangler J y otros, PNAS. 107: 13252-13257, 2010). Los mutantes Binl (Bl-7MT-Ala) y Bin3 (B3-4MT) se generaron por el mapeo de epítopo en las posiciones de los aminoácidos en el dominio extracelular de EGFR que se muestran a continuación en negrita.

EGFR ECD (sec. con núm. de ident.: 59) 1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV 61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA 121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF 181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL T IICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC 241 TGPRESDCLV CR FRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV 301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCK CE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK 361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF 421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSL EISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL 481 FGTSGQKTKI ISNRGENSC ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN 541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNIT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM 601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSHHHHH H Las siguientes sustituciones mutantes se realizaron en las posiciones de aminoácido indicadas usando la tecnología de ADN recombinante estándar para crear los mutantes de los epítopos Binl (B l) y Bin3 (B3) con los siguientes residuos mutantes: Mutantes Residuos mutantes Binl (B l) Bl -7MT-Ala: Q408A, Q432M, H433E, 467A, K.489A, 1491 A, N497A Residuos mutantes Bin3 (B3) B3-4MT: S380A, F381G, T382A, H383G Se realizó un ELISA directo usando EGFR-ECD de tipo salvaje (WT), un epítopo mutante Binl (C225 epítopo), o un epítopo mutante Bin3 (epítopo Hll) como reactivos de captura. Se incubaron diferentes concentraciones (1 , 0.25, 0.06, y 0.02 µg/ml) de anticuerpos monoclonales (mAb) ca (Bin l), cd (Bin2), y ch (Bin3) con los reactivos de captura a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de la detección con conjugado HRP de anticuerpo policlonal Fe anti-humano durante 1 hora. Como se muestra en la Figura 17A, los tres anticuerpos se unen al dominio extracelular de EGFR de tipo salvaje, mientras que el anticuerpo ca de Binl no se unió al epítopo Binl muíante (Figura 1 B) y el anticuerpo ch no se unió al epítopo Bin3 mutante (Figura 17C).

Con el fin de caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-EGFR, mAb ch (Bin3) se conjugó a la superficie de un chip BIACORE. Se inyectaron 0.5 µ? de dominio extracelular EGFR (EGFR-ECD) seguido por inyecciones secuenciales de mAb cd (Bin2), mAb cb (Binl), y finalmente mAb ch (Bin3) como un control negativo para los epítopos bloqueados por la unión de EGFR ECD con el anticuerpo conjugado Bin3 en la superficie del chip. Como se muestra en la Figura 17D, los anticuerpos de los tres tipos se unen secuencialmente al dominio extracelular de EGFR, lo que demuestra que los mAb pertenecen a Bin 1, 2 y 3 tienen epítopos distintos que no se solapan.

Un sumario del mapeo de epítopos por ELISA y BIACORE se encuentra en la Tabla VIII a continuación y un sumario de las afinidades de unión como se determina por KinExA® se encuentra más abajo en la Tabla IX. Todas las afinidades fueron mejores que 0.8 nM.

Tabla VIII: Si, denota eventos de unión, correspondientes a los epítopos no solapantes No, denota falta de eventos de unión, correspondientes a los epítopos solapantes Tabla IX Ejemplo 7: inhibición de señalización fosfo-ERK por combinaciones de dos anticuerpos anti-EGFR con epítopos que no solapantes Las combinaciones de anticuerpos anti-EGFR que no solapantes se ensayaron para determinar su capacidad para inhibir la señalización mediada por EGFR, como se mide por la inhibición de pERK, en células A431 tumorales mediante la selección de un anticuerpo a partir de cada uno de dos o tres tipos (Binl, Bin2, y Bin3 descrito anteriormente). Las células A431 se incubaron durante 2 h con combinaciones equimolares indicadas de anticuerpos Bin 1 + Bin 3 (Figuras 18A y 18B) o Bin 1 + Bin 2 (Figura 18C) y los lisados celulares se analizaron por ELISA fosfo-ERK. Los resultados demuestran que todas las combinaciones pareadas causan la inhibición completa de la señalización de pERK, pero exhiben diferentes eficacias en los IC90 de las curvas de inhibición.

Ejemplo 8: Inhibición de la fosforilación de ERK por combinaciones de dos o tres anticuerpos anti-EGFR con epítopos no solapantes.

Experimentos adicionales sobre la capacidad de combinaciones de anticuerpos para inhibir la señalización de EGFR, como medida de la inhibición de pERK, se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 7 y en la sección de metodología anterior, las células A431 se trataron con cantidades equimolares de combinaciones dobles (por pares) de anticuerpos Binl/Bin2 indicados (Figura 19A), o anticuerpos Binl/Bin2 o Binl/Bin3 (Figura 19B) o la combinación triple de anticuerpos Binl, Bin 2 y Bin 3 (Figura 19A). El tratamiento con las combinaciones de anticuerpos Bin l +Bin2, anticuerpos Bin l +Bin3 o anticuerpos Bin l+ Bin2+ Bin3 mostraron una disminución dependiente de la dosis en la producción de pERK. Como se muestra en la Figura 19A, la combinación equimolar de los tres anticuerpos con epítopos no solapantes inhibió completamente la activación ERK. Cuando se compara con el anticuerpo anti-EGFR cetuximab, la combinación de los dúos de anticuerpos cb (Bin 1) y cd (Bin 2) exhibió una eficacia 100 y 1000 veces mayor en la reducción de la señalización de pERK en la 1C50 e IC90 de la curva de inhibición (Figura 19B). Además, la mezcla del dúo inhibió completamente la señalización de pERK, mientras cetuximab no alcanzó la máxima inhibición a la dosis más alta (sólo el 50%).

Ejemplo 9: Inhibición de la señalización fosfo-ERK por combinaciones equimolares y no-eq inmolares de dos anticuerpos anti-EGFR con epítopos no solapantes Las células A431 se trataron con diversas proporciones (en µg/ml) de pares de anticuerpo cb y cd (Figura 20A), cb y ch (Figura 20B), cb y ci (Figura 20C) y ca y cd (Figura 20D) y se determinó la capacidad de las combinaciones del par de anticuerpos de inhibir la señalización de EGFR, como se mide por la inhibición de pERK. Cuando se usa individualmente (300 µg/ml solos sin un segundo anticuerpo), los anticuerpos anti-EGFR de Bin2 (cd) y Bin3 (ch y ci) fueron inefectivos en la reducción de la señalización de pERK (Figuras 20A, 20B y 20C), mientras que los anticuerpos de Binl (cb y ca) mostraron una eficacia mejorada. En todos los casos, las combinaciones de dúos resultaron en la completa inhibición de la señalización de pERK. Cambiando las relaciones de distancia de concentraciones equimolares no resultaron en un cambio equivalente en la potencia de las mezclas, excepto para el dúo ca y cd (Figura 20D). Estos resultados demuestran la potencia mejorada de las mezclas por encima de los componentes de anticuerpos individuales, y una tolerancia de al menos el 10% de cada componente para contribuir a completar la inhibición de la señalización ¡n vitro (es decir, una proporción de 270+30 µg/ml de cb + ch es igual en potencia a una combinación 150 +150 g/ml). Un resumen de estos datos se representa por un mapa de calor (Figura 21) en el que el eje x (columnas) indica la concentración de anticuerpo, el eje y (filas) denota pares de anticuerpos combinados en proporciones indicadas, y el eje z (en el plano) denota la fracción de actividad fosfo-ERK en escala de grises. El mapa de color del eje z representa actividad alta fosfo-ERK como blanco, actividad baja como negro, y las actividades intermedias en tonos de gris. Los valores de muestra se normalizaron independientemente a la media del control + del ligando EGF en la placa de ELISA en el que se analizaron y los valores medios de los controles (+/-) de ligando EGF a través de las placas se indican en la parte superior izquierda.

Ejemplo 10: Inhibición de la señalización del receptor de fosfo-EGF y fosfo-ERK por las combinaciones individuales y por parejas de anticuerpos Bin 1 + Bin 2 o Bin 1 + Bin 3 y las comparaciones con otros anticuerpos anti-EGFR conocidos, tales como cetuximab, nimotuzumab y zalutumumab.

Las células A431 se trataron con anticuerpos individuales o pares de anticuerpos y se comparó su capacidad para inhibir la señalización dependiente de EGFR con la de anticuerpos anti-EGFR conocidos cetuximab, nimotuzumab, o zalutumumab. Los experimentos se realizaron como se describió anteriormente para la señalización de pERK y pEGFR y los resultados se muestran en las Figuras 22A-C. Sólo las mezclas de anticuerpos cb y cd Bin l/Bin2 (Figura 22A) y los anticuerpos cb y ch Binl/Bin3 (Figura 22C) fueron efectivos para inhibir completamente la señalización fosfo- ERK en comparación con los anticuerpos conocidos en la técnica así como los componentes individuales de los las mezclas, cb, cd, y ch. Todos los anticuerpos, incluyendo las mezclas fueron efectivos en la inhibición completa de la señalización del receptor de fosfo-EGF con la excepción de nimotuzumab (Figura 22B).

Ejemplo 11: Inhibición de la proliferación de células tumorales in vitro La inhibición de la proliferación de células tumorales in vitro se analiza mediante los métodos descritos anteriormente o variaciones menores de los mismos. Las células A431 (epidermoide) o las células H1975 (NSCLC) se sembraron a 250, 500, 1000, o 200 células/pocilio y se trataron con combinaciones de anticuerpos en 1 µ?. Las Figuras 23A-D muestran la inhibición de la proliferación celular usando el Ensayo de viabilidad celular luminiscente de CellTiter-Glo® (CTG) (Promega Corporation) que mide el número de células viables en cultivo basándose en la cuantificación del ATP presente, que es un indicador de la actividad metabólica las células. La Figura 23A muestra la inhibición de crecimiento de las células H1975 tratadas con una combinación de los anticuerpos ca de Binl y 3 anticuerpos ca o un anticuerpo que compite por la unión al dominio extracelular de EGFR con los anticuerpos ca y ch, pero no por el medio libre de suero (SFM) o medio de ensayo solo (1% de FCS) en presencia o ausencia del ligando EGF. La Figura 23B muestra resultados similares a la Figura 23A, pero con una combinación de anticuerpos ca y cd de Binl y Bin2. Las Figuras 23C (células H1975) y 23D (células A431) muestran la inhibición de la proliferación celular con las células tratadas con el trio de anticuerpos ca + cd + ch de Bin 1/2/3. Todas las combinaciones usadas en este ejemplo demuestran claramente la capacidad de las mezclas de anticuerpos para inhibir la proliferación de células tumorales in vitro.

Ejemplo 12: Inhibición del crecimiento tu moral en un modelo de xenoinjcrto iti vivo Con el fin de evaluar la inhibición del crecimiento del tumor in vivo, se usan pares de anticuerpos en el modelo de xenoinjerto de tumores de ratón usando la línea celular tumoral epidermoide A431 (Figura 24A) y la línea celular tumoral de NSCLC en H1975 (Figura 24B). 75 ratones nu/nu de 4-5 semanas de edad se inyectaron por vía subcutánea (implantada) con 3.5 x 106 células por ratón de células A431 o 2.0 x 106 células por ratón de células H1975. Los ratones se dosifican con pares de anticuerpos que comienzan en el día 8 (células A431) o día 4 (H1975 células) después de la implantación. Usando los métodos anteriores o variaciones menores de los mismos, los pares de anticuerpos de Binl/2 (cb + cd) y Bin 1/3 (cb + ch; ca + ch) fueron al menos tan efectivos en la inhibición del crecimiento tumoral como cetuximab en tumores A431. Todos los tratamientos resultaron en la estasis del tumor que se mantuvo a través del período de recuperación después de interrumpir el régimen de dosificación. En las células H1975, sin embargo, todos los tratamientos resultaron en la estasis del tumor, pero los tumores regresaron rápidamente después que la dosificación se interrumpió en todos los ratones excepto los tratados con el par ca + ch.

Ejemplo 13: Inhibición de la unión de EGF a las células por anticuerpos anti-EGFR Las células A431 se cultivan hasta la confluencia en medio DMEM completo (como se describe anteriormente) en un matraz de cultivo de tejido T -150 cm2 , se lavó con 10 mi de PBS frío en hielo y se separó con 5 mi de tripsina al 0.25%, mientras se supervisaba cuidadosamente para el desprendimiento con el fin de minimizar la tripsinización de las proteínas de la superficie celular (~5-7 min). Tan pronto como las células comienzan a levantar, se añade 15 mi de medio completo, para diluir la tripsina, y las células en suspensión se transfieren a tubos de centrifuga cónicos de 50 mi, y se centrifuga a 1200 rpm durante 7 min. El sobrenadante se desecha y el sedimento de células se resuspende en tampón de citometría de flujo (2% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio en tampón de pH 1XPBS 7.2). Las células se transfieren a una placa de 96 pocilios con fondo en V a una densidad de 30,000 células por pocilio en un volumen total de 100 µ?. Un total de 12 pocilios se siembran para cada réplica técnica (1 1 para la curva de dilución del ligando, 1 para el ligando de control sólo), a los que se añade mezcla de anticuerpos de reacción a una concentración de 4µ? a cada pocilio (concentración final en los pocilios a 2µ?), excepto para los pocilios de control de sólo ligando a los que se añade sólo tampón de citometría de flujo. Las células se incuban con los anticuerpos a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la adición de 100 µ? de diluciones 1 :3 en tampón de citometría de flujo del ligando biotina-XX-EGF (Invitrogen cat # E3477) a partir de 600 nM (concentraciones finales en los pocilios de 200 nM -0.003nM), y se incuban durante 10 min a temperatura ambiente. Después las células se lavan con 100 µ? de tampón frío con hielo de citometría de flujo, se centrifuga a 1800 rpm durante 2 min, y el sobrenadante se descarta. Las células se incuban a continuación en ? ??µ? de una dilución 1 :500 del conjugado 647estreptavidina-Alexa Fluor (Invitrogen cat # S21374) en tampón de citometría de flujo durante 30 min a temperatura ambiente. Esta etapa es seguida por lavado de las células en ? ??µ? de tampón frío con hielo de citometría de flujo, se centrifuga a 1800 rpm durante 2 min, después de lo cual se descarta el sobrenadante. La etapa de lavado se repite y las células se resuspenden en 80 µ? de tampón de fijación (2% de suero fetal bovino, 2% de paraformaldehído en 1XPBS, pH 7.2), y se transfiere placas 96 pocilios de fondo en U. Las células con ligando unido se detectan mediante citometría de flujo, selección para las células vivas (FSC/SSC) y para las células positivas los canales FL4 (medición de la señal Alexa Fluor-647). Los resultados obtenidos usando los métodos descritos en la presente, o variaciones menores de los mismos, se muestran en la Figura 25 y los resultados se describen en la descripción de los mismos.

Equivalentes Aquellos con experiencia en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes para las modalidades específicas descritas específicamente en la presente descripción. Se pretende que esos equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones. Cualquier combinación de las modalidades descritas en cualquiera de una pluralidad de las reivindicaciones dependientes están contempladas dentro del alcance de la descripción.

Incorporación como referencia Todas las patentes, solicitudes de patentes pendientes y publicaciones de patentes referidas anteriormente se incorporan por este medio como referencia en su totalidad.

ANEXO A AGENTES CONTRA EL CANCER Agente contra el Comentarios Ejemplos cáncer Anticuerpos Anticuerpos que se unen A12 (mAb completamente humanizado) a IGF- IR (receptor del 19D12 (mAb completamente factor de crecimiento humanizado) similar a la insulina tipo CP751-871 (mAb completamente I), que se expresa en la humanizado) superficie celular de la H7C10 (mAb humanizado) mayoría de los cánceres alphaIR3 (ratón) humanos scFV/FC (quimera ratón/humano) EM/164 (ratón) AMG 479 (mAb completamente humanizado; Amgen) IMCA 12 (mAb completamente humanizado; Imclone) NSC-742460 (Dyax) MR-0646, F50035 (Pierre Fabre Medicament, Merck) Anticuerpos que se unen matuzumab (EMD72000) a EGFR; Las mutaciones Erbitux® / cetuximab (Imclone) que afectan la expresión Vectibix® / panitumumab (Amgen) o actividad del EGFR mAb 806 pueden resultar en cáncer nimotuzumab (TheraCIM®) INCB7839 (Incyte) panitumumab (Vectibix®; Amgen) Anticuerpos que se unen AV299 (A VEO) a cMET (factor de AMG 102 (Amgen) transición epitelial 5D5 (OA-5D5) (Genentech) mesenquimal); un miembro de la familia MET del receptor de tirosina quinasas) Anticuerpos anti-ErbB3 MM-121 (Merrimack Pharmaceuticals) Ab #14 descrito en WO 2008/100624 1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG) U3-1287/AMG888 (U3 Pharma/Amgen) Anticuerpos anti-ErbB2 Herceptin® (trastuzumab; (HER2) Genentech/Roche); Omnitarg (pertuzumab; 2C4,R1273; Genentech/Roche) IGF I R dirigido a IGF- I R (receptor del NVP-AEW541-A moléculas factor de crecimiento BMS-536,924 ( 1 H-benzoimidazol-2-il)-pequeñas similar a la insulina tipo 1 H-piridin-2-ona) I), que se expresa en la BMS-554,417 superficie celular de la Cicloligan mayoría de los cánceres TAE226 humanos PQ401 EGFR dirigido a EGFR; Las mutaciones Iressa® / gefitinib (AstraZeneca) moléculas que afectan la expresión CI-1033 (PD 183805) (Pfizer) pequeñas o actividad del EGFR TYVERB / lapatinib (GlaxoSmithKline) pueden resultar en cáncer Tykerb® / lapatinib ditosilato (SmithKline Beecham) Tarceva®/ Erlotinib HCL (OSI Pharma) PKI-166 (Novartis) PD-158780 EKB-569 Tyrphostin AG 1478(4-(3-cloroanillino)-6,7- dimetoxiquinazolina) ErbB2 dirigido a ErbB2, conocido además HKI-272 (neratinib; Wyeth) moléculas como HER2, un miembro KOS-953 (tanespimicina; Kosan pequeñas de la familia ErbB de Biosciences) receptores, que se expresa en ciertas células de cáncer cMET dirigido a cMET (factor de PHA665752 moléculas transición epitelial ARQ 197 (ArQule) pequeñas mesenquimal); un ARQ-650RP (ArQule) miembro de la familia MET del receptor de tirosina quinasas) Antimetabolitos Un antimetabolito es una flourouracilo (5-FU) sustancia química con capecitabina / XELODA® (HLR Roche) una estructura similar a 5-trifluorometil-2'-deoxiuridina una sustancia (un metotrexato sódico (Trexall) (Barr) metabolito) requerida raltitrexed / Tomudex® (AstraZaneca) para las reacciones pemetrexed / Alimta® (Lilly) bioquímicas normales, lo tegafur suficiente diferente aún arabinósido de citosina (Cytarabine, Ara- para interferir con las C) / tioguaninea/ Lanvis® funciones normales de las (GlaxoSmithKline) células, incluyendo la 5- azacitidina división celular. 6- mercaptopurina (Mercaptopurine, 6- MP) azatioprina / Azasan® (AAIPHARMA LLC) 6-tioguanina(6-TG) / Purinethol® (TEVA) pentostatina / Nipent® (Hospira Inc.) fosfato de fludarabina / Fludara® (Bayer Health Care) cladribina / Leustatin® (2-CdA, 2- clorodeoxiadenosina) (Ortho Biotech) floxuridina (5-fluoro-2'-deoxiuridina) / FUDR® (Hospira, Inc,) Agentes Un agente antineoplásico Inhibidor de la ribonucleotido reductasa alquilatantes alquilatante en un agente (RNR) alquilatante que se une un ciclophosfamida / Cytoxan® (BMS) / grupo alquilo al ADN. Neosar® (TEVA) Ya que las células de ifosfamida /Mitoxana® (ASTA Medica) cáncer generalmente ThioTEPA (Bedford, Abraxis, Teva) proliferan de manera no BCNU? 1 ,3-bis(2-cloroetil)- 1 -nitosourea restrictiva más de lo que CCNU? l,-(2-cloroetil)-3-ciclohexil-l - lo hacen las células nitrosourea (metil CCNU) saludables son más hexametilmelamina (altretamina, HMM) / sensibles al daño del Hexalen® (MG1 Pharma Inc.) ADN, y los agentes busulfán / Myleran® (GlaxoSmithKline) alquilatantes se usan procarbazina HCL / Matulane® (Sigma clínicamente para tratar Tau) una variedad de tumores. Dacarbazina (DTIC®) clorambucil / Leukaran® (SmithKJine Beecham) Melfalano / Alkeran® (GlaxoSmithKline) cisplatino (Cisplatino, CDDP) / Platinol (Bristol Myers) carboplatino / Paraplatino (BMS) oxaliplatino / Eloxitan® (Sanofí-Aventis US) Bendamustina carboquona carmustina clorometina dacarbazina (DTIC) fotemustina lomustina mannosulfán nedaplatino nimustina prednimustina ranimustina satraplatino semustina estreptozocina temozolomida treosulfán triaziquona trietileno melamina triplatin tetranitrato trofosfamida uramustina Inhibidores de la Los inhibidores de la doxorubicina HCL / Doxil® (Alza) topoisomerasa topoisomerasa son citrato de daunorubicina / Daunoxome® agentes para la (Gilead) quimioterapia diseñados mitoxantrona HCL/ ovantrona (EMD para interferir con la Serono) acción de las enzimas actinomicina D topoisomerasas etopósido / Vepesid® (BMS)/ (topoisomerasa I y II), Etopophos® (Hospira, Bedford, Teva que son enzimasque Parenteral, Etc.) controlan los cambios ten topotecán HCL / Hycamtin® la estructura del ADN (GlaxoSmithKline) catalizando el teniposide (VM-26) / Vumon® (BMS) rompimiento y la unión irinotecán HCL(CPT-1 1) / del esqueleto de camptosar® (Pharmacia & Upjohn) fosfodiéster de las camptotecina (CPT) cadenas de ADN durante belotecán el ciclo celular normal. rubitecán Agentes dirigidos a Los microtúbulos son uno vincristina / Oncovin® (Lilly) los microtúbulos de los componentes del sulfato de vinblastina/ citoesqueleto. Tienen un Velban®(descontinuado) (Lilly) diámetro de tartrato de vinorelbina / Navelbine® aproximadamente 24 nm (PierreFabre) y longitud variable de sulfato de vindesina / Eldisine® (Lilly) varios micrómetros a paclitaxel / Taxol® (BMS) posiblemente milímetros docetaxel / Taxotere® (Sanofí Aventis en axones de células US) nerviosas. Los Nanopartícula paclitaxel (ABI-007) / microtúbulos sirven Abraxane® (Abraxis BioScience, Inc.) como componentes ixabepilona / IXEMPRA™ (BMS) estructurales dentro de las larotaxel células y están ortataxel involucrados en muchos tesetaxel procesos celulares que vinflunina incluyen la mitosis, citoquinesis, y transporte vesicular.

Las tirosina quinasas son mesilato de imatinib / Gleevec (Novartis) enzimas dentro de la malato de sunitinib / Sutent® (Pfizer) célula que funcionan para tosilato de sorafenib / Nexavar® (Bayer) unir los grupos fosfato al nilotinib hidrocloruro monohidrato / aminoácido tirosina. Al Tasigna® (Novartis) bloquear la capacidad de AMG 386 (Amgen) la proteína tirosina axitinib (AG-013736; Pfizer, Inc.) quinasa de funcionar, bosutinib (SKI-606; Wyeth) estos compuestos alalinatode brivanib (BMS-582664; proporcionan una BMS) herramienta para cediranib (AZD2171; Recentín, controlar el crecimiento AstraZeneca) de las células cancerosas. dasatinib (BMS-354825: Sprycel®; BMS) lestaurtinib (CEP-701 ; Cephalon) motesanib difosfago (AMG-706; Amgen/Takeda) pazopanib HCL (GW786034; Armala, GSK) semaxanib (SU5416; Pharmacia) vandetanib (AZD647; Zactima; AstraZeneca) vatalanib (PTK-787; Novartis, Bayer Schering Pharma) XL184 (NSC718781; Exelixis, GSK) Inhibidores de la Induce la apoptosis L-asparaginasa / Elspar® (Merck & Co.) síntesis de proteína celular Agentes Induce a los pacientes Alfa interferón Inmunoterapéuticos con cáncer a exhibir Inhibidor de la angiogénesis / Avastin® capacidad de respuesta (Genentech) inmune IL-2? Interleucina 2 (Aldesleukin) / Proleukin® (Chiron) IL-12? Interleucina 12 Terapias hormonales Las terapias citrato de toremifeno / Fareston® (GTX, hormonales asociadas Inc.) con la menopausia y el fulvestrant / Faslodex® (AstraZeneca) envejecimiento apuntan raloxifeno HCL / Evista® (Lilly) a incrementar la anastrazol / Arimidex® (AstraZeneca) cantidad de ciertas letrozol / Femara® (Novartis) hormonas en el cuerpo fadrozol (CGS 16949A ) para compensar el exemestano / Aromasin® (Pharmacia & decline hormonal Upjohn) relacionado con la edad acetato de leuprolida / Eligard® (QTL o enfermedad. La USA) terapia hormonal como Lupron® (TAP Pharm.) un tratamiento para el acetato de goserelina / Zoladex® cáncer generalmente (AstraZeneca) reduce el nivel de una o pamoato de triptorelina / Trelstar® más hormonas (Watson Labs) específicas, bloquea buserelina / Suprefact® (Sanofi Aventis) una hormona de nafarelina interactuar con su cetrorelix / Cetrotide® (EMD Serono) receptor celular o de bicalutamida / Casodex® (AstraZeneca) cualquier otra forma nilutamida / Nilandron® (Aventis Pharm.) altera la capacidad del acetato de megestrol / Megace® (BMS) cáncer de ser análogos de somatostatina (por ejemplo, estimulado por las acetato de octreotida / Sandostatin® hormonas para crecer y (Novartis)) diseminarse. Tales abarelix (Plenaxis™ ; Amgen) terapias hormonales acetato de abiraterona (CB7630; BTG incluyen así los pie) antagonistas de afimoxifeno (TamoGel; Ascend hormonas y los Therapeutics, Inc.) inhibidores de la inhibidor de aromatasa (Atamestano más síntesis de hormonas. toremifeno; Intarcia Therapeutics, Inc.) En algunos ejemplos arzoxifeno (Eli Lilly & Co) los agonistas de Asentar™; DN-101 (Novacea; Oregon hormonas pueden Health Sciences U) usarse además como flutamida (Eulexin®, Schering; Prostacur, terapias hormonales Laboratorios Almirall, S.A) contra el cáncer. letrozol (CGS20267) (Femara®, Chugai; Estrochek®, (Jagsonpal Pharmaceuticals Ltd;) Delestrogen®, estradiol valerato (Jagsonpal) acetato de magestrol / Megace® acetato de medroxiprogesterona (Veraplex®; Combiphar) MT206 (Medisyn Technologies, Inc.) decanoato de nandrotona (Zestabolin®; Mankind Pharma Ltd) tamoxifeno (Taxifen®, Yung Shin Pharmaceutical; Tomifen®, Alkem Laboratories Ltd.) citrato de tamoxifeno (Nolvadex, AstraZeneca; soltamox, EUSA Pharma Inc; citrato de tamoxifeno SOPHARMA, Sopharma JSCo.) Glucocorticoides Los fármacos predinsolona antiinflamatorios dexametasona / Decadron® (W yeth) usados para reducir el prednisona (Deltasone, Orasone, Liquid hinchamiento que Pred, Sterapred®) causa el dolor por cáncer.

Inhibidores de Incluye imidazoles ketoconazol aromatasa Inhibidores mTOR La vía de señalización sirolimus (Rapamicina) /Rapamune® de mTOR se descubrió (Wyeth) originalmente durante Temsirolimus (CCI-779) / Torisel® estudios del agente (Wyeth) inmunosupresivo Deforolimus (AP23573) (Ariad Pharm.) rapamicina. Esta vía Everolimus (RAD001) /Certican® altamente conservada (Novartis) regula la proliferación celular y el metabolismo en respuesta a los factores ambientales, vinculando la señalización del receptor del factor de crecimiento celular a través de la fosfoinositida-3- quinasa (PI-3K) al crecimiento celular, proliferación, y angiogénesis.

Agentes adriamicina, 5-fluorouracilo, citoxina, quimioterapéuticos bleomicina, mitomicina C, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas, clofarabina, mercaptopurina, pentostatina, tioguanina, citarabina, decitabina, fioxuridina, gemcitabina (Gemzar), enocitabina, sapacitabina Inhibidores de la Inhibidor AKT Astex® (Astex proteína quinasa B Therapeutics) (P B) Inhibidores AKT NERVIANO (Nerviano Medical Sciences) Inhibidor AKT quinasa TELIK (Telik Inc) AKT DECIPHERA (Deciphera Pharmaceuticals, LLC) perifosina (KRX0401, D-21266; Keryx Biopharmaceuticals Inc, AEterna Zentaris Inc) perifosina con Docetaxel (Keryx Biopharmaceuticals Inc, AEterna Zentaris Inc) perifosina con Gemcitabina (AEterna Zentaris Inc) perifosina con paclitaxel (AEterna Zentaris Inc) inhibidor de la proteína quinasa-B DEVELOGEN (DeveloGen AG) PX316 (Oncothyreon, Inc.) RX0183 (Rexahn Pharmaceuticals Inc) RX0201 (Rexahn Pharmaceuticals Inc) VQD002 (VioQuest Pharmaceuticals Inc) XL418 (Exelixis Inc) ZEN027 (AEterna Zentaris Inc) Inhibidores de la BEZ235 (Novartis AG) fosfatidilinositol 3- BGT226 (Novartis AG) quinasa (P13 ) CALI 01 (Calistoga Pharmaceuticals, Inc.) CHR4432 (Chroma Therapeutics Ltd) Inhibidores Erk/P13K ETERNA (AEterna Zentaris Inc) GDC0941 (Genentech Inc/Piramed Limited/Roche Holdings Ltd) enzastaurin HCL (LY317615; Enzastaurin; Eli Lilly) LY294002/Wortmannin Inhibidores de PI3K SEMAFORE (Semafore Pharmaceuticals) PX866 (Oncothyreon, Inc.) SF1 126 (Semafore Pharmaceuticals) VMD-8000 (VM Discovery, Inc.) XL147 (Exelixis Inc) XL147 con XL647 (Exelixis Inc) XL765 (Exelixis Inc) PI-103 (Roche/Piramed) CYC200, R-roscovitina (Seliciclib; ciclacel Pharma) NSC-649890, L86-8275, HMR-1275 (alvocidib; NCI) IMOxine (Merck KGaA) HYB2055 (Idera) IMO-2055 (Isis Pharma) 1018 ISS (Dynavax Technologies/UCSF) PF-3512676 (Pfizer) lonafarnib(SCH66336; Sarasar; SuperGen, U Arizona) AMG-655 (Aeterna Zentaris, Keryx Biopharma) Apo2L/TRAIL, AMG951 (Genentech, Amgen) APOMAB (mAb completamente humanizado; Genentech) Inhibidores de ME [Proteína quinasa ARRY 162 (Array BioPharma Inc) quinasa 1 activada con ARRY704 (Array BioPharma Inc) mitógeno (MAP2K1 ); ARRY886 (Array BioPharma Inc) Proteína quinasa AS703026 (Merck Serono S.A) quinasa 2 activada con AZD6244 (AstraZeneca Pie) mitógeno (MAP2K2)] AZD8330 (AstraZeneca Pie) RDEA1 19 (Ardea Biosciences, Inc.) RDEA436 (Ardea Biosciences, Inc.) XL518 (Exelixis Inc; Genentech Inc) Inhibidores Imprime PGG (Biothera) misceláneos CHR-2797 (inhibidor de aminopeptidasaMl ; Chroma Therapeutics) E7820, NSC 719239 (inhibidor de integrina-alfa2 , Eisai) INCB007839 (ADAM 17, inhibidor TACE; Incyte) CNF2024,BIIB021 (inhibidor Hsp90; Biogen Idee) MP470, HPK-56 (inhibidor Kit/Mel/Ret; Schering-Plough) SNDX-275/MS-275 (inhibidor HDAC; Syndax) Zarnestra™,Tipifarnib, Rl 15777 (inhibidor Ras; Janssen Pharma) volociximab; Eos 200-4,M200 (inhibidor de alfa581 integrina; Biogen Idee; Eli Lilly/UCSF/PDL BioPharma) apricoxib (TP2001 ; inhibidor de COX-2, Daiichi Sankyo; Tragara Pharma) sec. con núm. de ident.:58 (EGFR humano) 10 20 30 40 50 60 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV 70 80 90 100 110 120 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQI IRGN MYYENSYALA 130 140 150 160 170 180 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SN PALCNVE SIQWRDIVSS DFLSN SMDF 190 200 210 220 230 240 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC 250 260 270 280 290 300 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPR YV 310 320 330 340 350 360 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK 370 380 390 400 410 420 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF 430 440 450 460 470 480 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTIN KKL 490 500 510 520 530 540 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN 550 560 570 580 590 600 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAM IT CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM 610 620 630 640 650 660 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLW 670 680 690 700 710 720 ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKI VLGS 730 740 750 760 770 780 GAFGTVYKGL WIPEGEKV I PVAIKELREA TSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI 790 800 810 820 830 840 CLTSTVQLIT QLMPFGCLLD YVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA 850 860 870 880 890 900 RNVLVKTPQH VKITDFGLA LLFAEEKEYH AEFFKCPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSY 910 920 930 940 950 960 GVTVWELMTF GSKPYDGI A SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK 970 980 990 1000 1010 1020 FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLP SPTDSNFYRA LMDEEDMDDV VDADEYLIPQ 1030 1040 1050 1060 1070 1080 QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACI DR GLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED 1090 1000 1110 1120 1130 1140 SIDDTFLPVP EYINQSVPKR PAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS TAVGNPELY 1150 1160 1170 1180 1190 1200 TVQPTCVNST FDSPAH AQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRV 1210 APQSSEFIGA

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un trío de anticuerpos anti-EGFR que comprende un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo y un tercer anticuerpo, en donde (i) el primer anticuerpo es, o compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de ca, cb y ce; (ii) el segundo anticuerpo es, o compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cd, ce y cf; y (iii) el tercer anticuerpo es, o compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de cg, ch, ci, cj y ck.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde (i) el primer anticuerpo es, o compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ca (que comprende las CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 29, 30 y 34, respectivamente, y las CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 48, 45 y 49, respectivamente); (ii) el segundo anticuerpo es, o compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cd (que comprende las CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 29, 30 y 31, respectivamente, y las CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 53, 54 y 55, respectivamente); y (iii) el tercer anticuerpo es, o compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ch (que comprende las CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 23, 24 y 26, respectivamente, y las CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 39, 40 y 42, respectivamente).

3. Uso de la composición de la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer.

4. El uso de la reivindicación 3, en donde el tratamiento del cáncer es tratamiento por terapia de combinación con un medicamento adicional que es un agente contra el cáncer.

5. El uso de la reivindicación 4 en donde el agente contra el cáncer comprende un inhibidor de la topoisomerasa.

6. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las sec. con núms. de ident.: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, y 1 1 y comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las sec. con núms. de ident.: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21 , y 22.

7. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: (a) sec. con núm. de ident.9 y sec. con núm. de ident.:20, respectivamente; (b) sec. con núm. de ident.: 10 y sec. con núm. de ident. :21 , respectivamente; (c) sec. con núm. de ident.: 1 1 y sec. con núm. de ident.:22, respectivamente; (d) sec. con núm. de ident.: 1 y sec. con núm. de ident.: 12, respectivamente; (e) sec. con núm. de ident.:2 y sec. con núm. de ident.: 13, respectivamente; (f) sec. con núm. de ident.:3 y sec. con núm. de ident.: 14, respectivamente; (g) sec. con núm. de ident. :4 y sec. con núm. de ident.: 15, respectivamente; (h) sec. con núm. de ident.:5 y sec. con núm. de ident.: 16, respectivamente; (i) sec. con núm. de ident.:6 y sec. con núm. de ident : 17, respectivamente; y (j) sec. con núm. de ident.:8 y sec. con núm. de ident.: 19, respectivamente.

8. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une al dominio extracelular de EGFR y comprende secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena ligera y pesada, en donde las secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena ligera y pesada se seleccionan de: (a) secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 34, 20, y 29 respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 49, 45, y 48, respectivamente; (b) secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 37, 36, y 35, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 51, 45 y 50, respectivamente; (c) secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 38, 36, y 35, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDR1 de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 52,45, y 48, respectivamente; (d) secuencias CDR3, CDR2, y CDR l de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 31 , 30, y 29, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 55, 54, y 53, respectivamente; (e) secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 32, 30, y 29, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 56, 54 y 53, respectivamente; (f secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident: 33, 30, y 29, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 56, 54, y 53, respectivamente; (g) secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 25, 24, y 23, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 41 , 40, y 39 respectivamente; (h) secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 26, 24, y 23, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 42, 40, y 39, respectivamente; (i) secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 27, 24, y 23, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 43, 40, y 39, respectivamente; (j) secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 28, 24, y 23, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 46, 45, y 44, respectivamente; y (k) secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena pesada de sec. con núms. de ident.: 28, 24, y 23, respectivamente, y secuencias CDR3, CDR2, y CDRl de cadena ligera de sec. con núms. de ident.: 47, 45, y 44, respectivamente.

9. Un anticuerpo monoclonal aislado que compite por la unión al dominio extracelular de EGFR con, o se une al mismo epítopo que uno de los anticuerpos de la reivindicación 7.

10. Un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde el anticuerpo es humano, quimérico, o humanizado.

1 1. Un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 5-9 ó 5-10, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo biespecífíco, inmunoconjugado, Fab, Fab'2, ScFv, aficuerpo, avimero, nanocuerpo, y un anticuerpo del dominio.

12. Una composición que comprende un par de anticuerpos seleccionados de los pares que se exponen en la Tabla II o la Tabla III, en donde cada anticuerpo es un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 5-9 ó 5-1 1.

13. Una composición que comprende un trío de anticuerpos seleccionados de los trios que se exponen en la Tabla IV o la Tabla V, en donde cada anticuerpo es un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 5-9 ó 5-1 1.

14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 5-9 ó 12 ó 13, en donde cada uno de los anticuerpos comprendidos por la composición se une al EGFR con una KD mayor que lOOnm.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 5-9 ó 12, o 13, o 14, en donde la composición exhibe al menos una de las siguientes propiedades: (a) inhibición de AKT o la fosforilación de ERK, medida en un ensayo in vitro basado en células; (b) inhibición del crecimiento de las células que expresan EGFR in vitro; (c) inhibición del crecimiento de las células de tumor que expresan EGFR en un modelo de xenoinjerto in vivo; (d) inhibición de la unión del ligando al dominio extracelular de EGFR in vitro; (e) inhibición de la dimerización del EGFR in vitro; o (f) regulación descendente de EGFR en las superficies celulares in vitro.

16. La composición de la reivindicación 15, en donde la inhibición es aditiva o sinérgica comparada con una preparación que comprende un anticuerpo individual comprendido por la composición en una cantidad (en moles) equivalente a la cantidad total (en moles) de anticuerpos combinados en la composición.

17. Una composición que comprende dos o más anticuerpos, en donde dos de los dos o más anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste de: (a) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca, y el anticuerpo cd, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo cd; (b) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca, y el anticuerpo ce, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ce; (c) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca, y el anticuerpo cf, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cf; (d) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca y el anticuerpo cg, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cg; (e) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca y el anticuerpo ch, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ch; (f) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca y el anticuerpo ci, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ci; (g) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca y el anticuerpo cj, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cj; (h) anticuerpo ca o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo ca y el anticuerpo ck, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ck; (i) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo cb y el anticuerpo cd, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cd; (j) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo anticuerpo ca y el anticuerpo ce, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ce; (k) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo cb y el anticuerpo cf, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cf; (1) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo cb y el anticuerpo cg, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cg; (m) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo cb y el anticuerpo ch, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ch; (n) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo cb y el anticuerpo ci, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ci; (o) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo cb y el anticuerpo cj, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cj; (p) anticuerpo cb o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo cb y el anticuerpo ck, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ck; (q) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo cd, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cd; (r) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo ce, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ce; (s) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo cf, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cf; (t) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo cg, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo cg; (u) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo ch, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ch. (v) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo ci, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ci; (w) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo cj, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que el anticuerpo cj; (x) anticuerpo ce o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con el anticuerpo ce y el anticuerpo ck, o un anticuerpo que compite por la unión a EGFR con, o se une al mismo epítopo que, el anticuerpo ck.

18. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en donde los anticuerpos son: (a) seleccionados del grupo que consiste de los anticuerpos va y vd, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vd; o (b) el grupo que consiste de los anticuerpos va y ve, o anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que los anticuerpos va y ve; o (c) el grupo que consiste de los anticuerpos va y vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vf; (d) el grupo que consiste de los anticuerpos va y vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vg; (e) el grupo que consiste de los anticuerpos va y vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vh; (f) el grupo que consiste de los anticuerpos va y vi, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vi; (h) el grupo que consiste de los anticuerpos va y vj, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vj; (i) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va y vi; (j) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb y ve; (k) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb y vf; (1) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb y vg; (m) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb y vh; (n) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y vi, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb y vi; (o) el grupo que consiste de los anticuerpos vb y vj, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb y vj; (p) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y vd; (q) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y ve; (r) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y vf; (s) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y vg; (t) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y vh; (u) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y vi, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y vi; and (v) el grupo que consiste de los anticuerpos ve y vj, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve y vj.

19. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 12-18, que comprende además un tercer anticuerpo.

20. La composición de la reivindicación 19, en donde los anticuerpos son: (a) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, cg, cd, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que los anticuerpos ca, cg, y cd; (b) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, cg, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, cg, y ce; (c) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, cg, cf, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, cg, y cf; (d) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ch, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ch, y cd; (e) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ch, ce, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ch, y ce; (f) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ch, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ch, y cf; (g) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ci, cd, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ci, y cd; (h) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ci, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ci, y ce; (i) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ci, cf, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ci, y cf; (j) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, cj, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, cj, y cd; (k) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, cj, ce, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, cj, y ce; (1) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, cj, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, cj, y cf; (m) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ck, cd, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ck, y cd; (n) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ck, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ck, y ce; (o) el grupo que consiste de los anticuerpos ca, ck, cf, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ca, ck, y cf; (p) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, cg, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, cg, y cd; (q) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, cg, ce, y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, cg, y ce; (r) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, cg, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, cg, y cf; (s) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ch, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ch, y cd; (t) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ch, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ch, y ce; (u) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ch, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ch, y cf; (v) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ci, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ci, y cd; (w) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ci, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ci, y ce; (x) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ci, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ci, y cf; (y) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, cj, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, cj, y cd; (z) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, cj, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, cj, y ce; (aa) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, cj, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, cj, y cf; (bb) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ck, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ck, y cd; (ce) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ck, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ck, y ce; (ce) el grupo que consiste de los anticuerpos cb, ck, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos cb, ck, y cf; (dd) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, cg, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, cg, y cd; (ee) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, cg, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, cg, y ce; (ff) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, cg, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, cg, y cf; (gg) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ch, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ch, y cd; (hh) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ch, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ch, y ce; (ii) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ch, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ch, y cf; (jj) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ci, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ci, y cd; (kk) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ci, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ci, y ce; (11) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ci, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ci, y cf; (mm) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, cj, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, cj, y cd; (nn) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, cj, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, cj, y ce; (oo) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, cj, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, cj, y cf; (pp) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ck, cd y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ck, y cd; (qq) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ck, ce y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ck, y ce; and (rr) el grupo que consiste de los anticuerpos ce, ck, cf y los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ce, ck, y cf.

21. La composición de la reivindicación 15, en donde los anticuerpos son: (a) anticuerpos va, vi, vd, o anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que los anticuerpos va, vi, y vd; (b) anticuerpos va, vi, ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vi, y ve; (c) anticuerpos va, vi, vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vi, y vf; (d) anticuerpos va, vj, vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vi, y vg; (e) anticuerpos va, vj, vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vi, y vh; (f) anticuerpos va, vj, vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vj, y vd; (g) anticuerpos va, vj, ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vi, y ve; (h) anticuerpos va, vj, vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vi, y vf; (i) anticuerpos va, vj, vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vj, y vg; (j) anticuerpos va, vj, vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos va, vj, y vh; (k) anticuerpos vb, vi, vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vi, y vd; (1) anticuerpos vb, vi, ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vi, y ve; (m) anticuerpos vb, vi, vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vi, y vf; (n) anticuerpos vb, vi, vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vi, y vg; (o) anticuerpos vb, vi, vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vi, y vh; (p) anticuerpos vb, vj, vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vj, y vd; (q) anticuerpos vb, vj, ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vj, y ve; (r) anticuerpos vb, vj, vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vj, y vf; (s) anticuerpos vb, vj, vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vj, y vg; (t) anticuerpos vb, vj, vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos vb, vj, y vh; (u) anticuerpos ve, vi, vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vi, y vd; (v) anticuerpos ve, vi, ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vi, y ve; (w) anticuerpos ve, vi, vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vi, y vf; (x) anticuerpos ve, vi, vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vi, y vg; (y) anticuerpos ve, vi, vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vi, y vh; (z) anticuerpos ve, vj, vd, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vj, y vd; (aa) anticuerpos ve, vj, ve, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vj, y ve; (bb) anticuerpos ve, vj, vf, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vj, y vf; (ce) anticuerpos ve, vj, vg, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vj, y vg; or (dd) anticuerpos ve, vj, vh, o los anticuerpos que compiten por la unión a EGFR con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos ve, vj, y vh.

22. Uso de una composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-21 , para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer por terapia de combinación con un agente contra el cáncer adicional.

23. La composición de la reivindicación 22, en donde el agente contra el cáncer adicional comprende un inhibidor de la topoisomerasa.

24. Un kit que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 8-23 en un contenedor.

25. El kit de la reivindicación 24, en donde el contenedor contiene la composición en un solo frasco.

26. Un método para seleccionar una combinación de anticuerpos monoclonales, cada uno de estos se une al dominio extracelular de EGFR, que comprende seleccionar al menos dos anticuerpos que tiene cada uno un IC90 mayor que 80nM para inhibir la señalización mediada por EGFR y que no compiten entre si por la unión al dominio extracelular de EGFR y que exiben cada uno al menos una de las siguientes propiedades: (i) inhibición del crecimiento de células que expresan EGFR en un modelo de xenoinjerto in vivo; (ii) inhibición de la unión del ligando al dominio extracelular de EGFR in vitro; (iii) inhibición de la dimerización del EGFR in vitro; o (iv) regulación decreciente de EGFR en las superficies celulares in vitro. (v) inhibición de la fosforilación de AKT o la fosforilación de ERK, medida en un ensayo basado en células in vitro