JP2013533746A - 抗ｒｏｎ抗体 - Google Patents

Abstract

ヒトＲＯＮ（Ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’ Ｏｒｉｇｉｍｅ Ｎａｎｔａｉｓ）に結合し、その活性化を阻害するモノクローナル抗体を開示する。抗体は、ＲＯＮの活性化に関連する一定形態の癌の治療に使用することができる。本発明は部分的に、ヒトＲＯＮに特異的に結合する抗体ファミリーの発見に基づいている。抗体は、抗体のＣＤＲに基づくＲＯＮ結合部位を含有する。抗体は、治療薬として用いることができる。治療薬として用いる場合、抗体は、ヒト患者に投与した際の免疫応答を低減または除去するために、操作、例えばヒト化される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年３月２３日出願の米国仮特許出願第６１／４６６，６７９号明細書、および２０１０年７月６日出願の米国仮特許出願第６１／３６１，８０８号明細書に対する優先権の利益を主張し、各出願内容は、参照としてそれらの全体が本明細書に援用されている。

本発明の分野は、分子生物学、免疫学および腫瘍学である。より具体的には、その分野は、治療用抗体である。

マクロファージ刺激タンパク質受容体（ＭＳＰ Ｒ、またはＭＳＴ１−Ｒ）としても知られているＲｅｃｅｐｔｅｕｒ ｄ’Ｏｒｉｇｉｎｅ Ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）は、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）として知られているリガンドに結合する受容体チロシンキナーゼ類のＭＥＴファミリーのメンバーである。ＲＯＮは、４０ｋＤａの細胞外α鎖および１５０ｋＤａの膜貫通β鎖からなる。β鎖は内因性キナーゼ活性を担い、２本の鎖の細胞外部分は一緒にリガンド結合ドメインとして機能する（Ｗａｇｈら、２００８、ＡＤＶ．ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．１００：１−３３）。

ＲＯＮへのＭＳＰ結合により、複数の下流シグナル伝達経路が活性化され、複数の細胞活性が媒介される。ＲＯＮ経路の調節不全は、炎症反応、創傷治癒および肝臓再生に関係している。ＲＯＮシグナル伝達は、一定の悪性疾患における腫瘍の成長、存続、運動、浸潤および血管新生を保持し得る。ＲＯＮタンパク質は、いくつかのスプライシング変異体に存在し、そのいくつかは、癌の動物モデルにおいて腫瘍形成性である。このようなスプライシング変異体の１つは、デルタ１６０ＲＯＮであり、これはエキソン５と６を欠いている（Ｌｕら、２００７、ＣＡＮＣＥＲ ＬＥＦＴ．２５７：１５７−１６４）。

リガンド結合により活性化されると、ＲＯＮは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路とＭＡＰＫ経路を活性化する。ＲＯＮはまた、他の受容体、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、インテグリン類およびＥＧＦＲとの相互作用を介して細胞に影響を与える。現在までに、ＲＯＮエキソンにおける活性化変異体は報告されていない。選択的スプライシングと過剰発現が、受容体の構造的活性化に関する主要な機構のようである。ＲＯＮなどの複数の受容体チロシンキナーゼを阻害するいくつかの小型分子阻害剤が報告されており、例えば、ＥＸＣＥＬ−２８８０（Ｑｉａｎら、２００９、ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．６９：８００９−８０１６）およびＢＭＳ−７７６０７（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、２００９、Ｊ．ＭＥＤ．ＣＨＥＭ．５２：１２５１−１２５４）が挙げられる。二重のｃ−ｍｅｔ／ＲＯＮ阻害剤、Ａｍｇｅｎ化合物Ｉも報告されている（Ｚｈａｎｇら、２００８、ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳ．６８：６６８０−６６８７）。最近の出版物には、選択的ＲＯＮ小型分子阻害剤が記載されている（Ｒａｅｐｐｅｌら、２０１０、ＢＩＯＯＲＧ ＭＥＤ ＣＨＥＭ ＬＥＴＴ ２０：２７４５−９）。ヒトのＲＯＮ活性を阻害するいくつかの抗体が報告されている（Ｈｕｅｔらの米国特許出願公開第２００９／０２２６４４２号明細書；Ｐｅｒｅｉｒａらの米国特許出願公開第２００９／０１３６５１０号明細書；Ｚｈｕらの国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレット；Ｐｅｒｅｉｒａら、国際公開第２００５／１２０５５７号パンフレット；および市販の抗体ＭＡＢ６９１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。

天然抗体は、４本のポリペプチド鎖を含有する多量体タンパク質である（図１）。ポリペプチド鎖のうちの２本は重鎖（Ｈ鎖）と呼ばれ、ポリペプチド鎖のうちの２本は軽鎖（Ｌ鎖）と呼ばれる。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖は鎖間のジスルフィド結合によって結合している。免疫グロブリンの重鎖は、鎖間のジスルフィド結合によって結合している。軽鎖は、１つの可変領域（図１のＶ_Ｌ）と１つの定常領域（図１のＣ_Ｌ）からなる。重鎖は、１つの可変領域（図１のＶ_Ｈ）と少なくとも３つの定常領域（図１のＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）からなる。可変領域は抗体の特異性を決定する。各可変領域は、４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）にフランクされた相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られている３つの超可変領域を含む。ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３と称される３つのＣＤＲは、抗体の結合特異性に寄与する。天然抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの人工抗体のための出発材料として用いられている。

ＲＯＮに結合する抗体は当該技術分野に知られているが、治療薬として使用できる改善されたＲＯＮ抗体が依然として求められている。

本発明は部分的に、ヒトＲＯＮに特異的に結合する抗体ファミリーの発見に基づいている。抗体は、抗体のＣＤＲに基づくＲＯＮ結合部位を含有する。抗体は、治療薬として用いることができる。治療薬として用いる場合、抗体は、ヒト患者に投与した際の免疫応答を低減または除去するために、操作、例えばヒト化される。

抗体は、ヒトＲＯＮの活性化（すなわち、中和）を防止または阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＲＯＮがそのリガンド、ＭＳＰに結合することを防ぎ、それによって、ＲＯＮ活性を中和する。一定の実施形態において、抗体は、ＭＳＰに対するＲＯＮの結合を阻害することなくＲＯＮ活性化を防ぐ。抗体は、乳癌細胞系Ｔ４７Ｄの下流シグナル伝達を阻害するために用いることができる。さらに、哺乳動物に投与した場合、抗体は、哺乳動物における腫瘍の成長を抑制または低減させることができる。

本発明のこれらおよび他の態様ならびに利点は、以下の図、詳細な説明、および請求項を考察すれば明らかになろう。本明細書に用いられる「含む」は、限定しない意味であり、挙げられた例は非限定的である。

本発明は、以下の図面を参照にしてより完全に理解することができる。

（先行技術）は、例示的な天然抗体の概略図を示す。 抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９および２９Ｂ０６の完全免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列図を示す。各抗体のアミノ酸配列は、互いにアラインメントしており、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３は枠で識別してある。枠取りしていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）を表す。アラインメントの位置決め（ギャップ）は、Ｃｌｕｓｔａｌ配列などのアラインメント演算ではなく、Ｋａｂａｔのナンバリングに基づいている。 図２の免疫グロブリン重鎖可変領域配列各々のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列を表す配列アラインメント図を示す。 抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９および２９Ｂ０６の完全免疫グロブリン軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す配列アラインメント図を示す。各抗体のアミノ酸配列は、互いにアラインメントしており、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３は枠で識別してある。枠取りしていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）を表す。アラインメントの位置決め（ギャップ）は、Ｃｌｕｓｔａｌ配列などのアラインメント演算ではなく、Ｋａｂａｔのナンバリングに基づいている。 図４の免疫グロブリン軽鎖可変領域配列各々のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列を表す配列アラインメント図を示す。 電気化学的発光アッセイにより測定した、抗体１７Ｆ０６（▲）、０７Ｆ０１（●）、１２Ｂ１１（◆）、１８Ｈ０９（■）および２９Ｂ０６（ｘ）によるＭＳＰ−ＲＯＮ結合相互作用の阻害に関する用量−応答曲線のグラフを示す。 ＥＬＩＳＡアッセイによる抗体１７Ｆ０６（▲）、０７Ｆ０１（●）、１２Ｂ１１（◆）、１８Ｈ０９（■）および２９Ｂ０６（ｘ）によるＥＲＫのＭＳＰ依存性リン酸化阻害に関する用量−応答曲線のグラフを示す。 トランスウェルアッセイによる抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、およびＩｇＧ陰性対照（マウスＩｇＧ）によるＭＳＰ誘導ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞移動の阻害を測定する実験からの結果をまとめた棒グラフを示す。 抗体０７Ｆ０１（●）、１２Ｂ１１（◆）、１８Ｈ０９（■）、２９Ｂ０６（^＊）およびマウスＩｇＧ対照（〇）による野生型（ｗｔ）ＲＯＮ依存性インビボ腫瘍モデルの成長抑制についてのデータをまとめたグラフを示す。抗体およびＩｇＧ対照は腹腔内に週２回２０ｍｇ／ｋｇを投与した。 抗体１７Ｆ０６（▲）、０７Ｆ０１（●）、１２Ｂ１１（◆）、１８Ｈ０９（■）、２９Ｂ０６（^＊）およびマウスＩｇＧ対照（〇）によるデルタ１６０ＲＯＮ依存性インビボ腫瘍モデルの成長抑制についてのデータをまとめたグラフを示す。抗体およびＩｇＧ対照は腹腔内に週２回２０ｍｇ／ｋｇを投与した。 抗体２９Ｂ０６（^＊）およびマウスＩｇＧ対照（〇）によるＮＣＩ−Ｈ３５８異種移植腫瘍モデルの成長抑制についてのデータをまとめたグラフを示す。抗体およびＩｇＧ対照は腹腔内に週３回４０ｍｇ／ｋｇ（「ｍｐｋ」と略す）を投与した。 図１２Ａは、０７Ｆ０１（配列番号２）の完全免疫グロブリン重鎖可変領域およびキメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ（配列番号１３３）、Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８（配列番号１３５）、およびＳｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ（配列番号１３７）で表される完全重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す概略図を示す。各重鎖可変領域のアミノ酸配列は互いにアラインメントしており、相補性決定配列（ＣＤＲ）（Ｋａｂａｔの定義）、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３は枠で特定してある。枠取りしていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列を表す。図１２Ｂは、２９Ｂ０６（配列番号４２）の完全免疫グロブリン重鎖可変領域ならびにＳｈ２９Ｂ０６＿Ｈｖ４−５９（配列番号１４３）、Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９（配列番号１４５）、およびＨｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ １６７Ｖ Ｙ７８Ｆ（配列番号１４７）で表される完全重鎖可変領域のアミノ酸配列の概略図を示す。各重鎖可変領域のアミノ酸配列は、互いにアラインメントしており、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）は枠で識別してある。枠取りしていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列を表す。 図１３Ａは、図１２Ａで示した各可変領域配列のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）を表す概略図を示す。図１３Ｂは、図１２Ｂで示した各可変領域配列のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）を表す概略図を示す。 図１４Ａは、０７Ｆ０１（配列番号４）の完全軽鎖可変領域ならびにＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９（配列番号１３９）およびＳｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１（配列番号１４１）で表される完全軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す概略図を示す。各軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、互いにアラインメントしており、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）は枠で識別してある。枠取りしていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列を表す。図１４Ｂは、２９Ｂ０６（配列番号４４）の完全軽鎖可変領域ならびにＳｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８（配列番号１４９）で表される完全軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す概略図を示す。各軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、互いにアラインメントしており、ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）は枠で識別してある。枠取りしていない配列は、フレームワーク（ＦＲ）配列を表す。 図１５Ａは、図１４Ａで示した各可変領域配列のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）を表す配列アラインメントを示す。図１５Ｂは、図１４Ｂで示した各可変領域配列のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３配列（Ｋａｂａｔの定義）を表す配列アラインメントを示す。 トランスウェルアッセイによって、抗ＲＯＮ抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびＳｈ０７Ｆ０１−６２、ＩｇＧ陰性対照（ヒトＩｇＧ）、ならびに無ＭＳＰ対照によるＭＳＰ誘導ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞移動の阻害を測定する実験結果をまとめた棒グラフを示す。 ０ｎＭおよび１ｎＭのＭＳＰにおける抗ＲＯＮ抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびＳｈ０７Ｆ０１−６２ならびにＩｇＧ陰性対照（ヒトＩｇＧ）によるＭＳＰ誘導ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞浸潤の阻害を測定する実験結果をまとめた棒グラフを示す。 抗ＲＯＮ抗体ｍｕ０７Ｆ０１（〇）、Ｓｈ０７Ｆ０１−６２（▲）、ｍｕ２９Ｂ０６（◆）、ＲＯＮ８（■）、およびＳｈ２９Ｂ０６−７８（●）、ならびにヒトＩｇＧ対照（＋）によるＮＣＩ−Ｈ３５８異種移植腫瘍モデルの成長抑制をまとめたデータのグラフを示す。 抗ＲＯＮ抗体ｍｕ０７Ｆ０１、Ｓｈ０７Ｆ０１−６２、ｍｕ２９Ｂ０６、ＲＯＮ８、およびＳｈ２９Ｂ０６−７８によるＲＯＮ受容体分解を測定する実験結果をまとめたウェスタンブロットを示す。

本明細書に開示した抗ＲＯＮ抗体は、ヒトＲＯＮへの結合とその活性の中和に基づいて選択された一定のモノクローナル抗体の抗原結合部位に基づいている。これらの抗体は、ヒトＲＯＮに対する結合部位を規定する免疫グロブリン可変領域ＣＤＲ配列を含有する。

これらの抗体の中和活性に鑑みて、一定のタイプの癌細胞の成長および／または増殖の調節に有用である。治療薬として用いられる場合、ヒト患者へ投与した際の免疫応答を最少化または除去するために、抗体を操作することができる。いくつかの実施形態において、エフェクター分子（例えば、他のタンパク質または小型分子の治療薬）、検出可能な標識または毒素部分などの他の部分に、抗体を融合または共役させる。以下においてさらに詳細に、本発明の種々の特徴および態様を考察する。

別に指示しない限り、本明細書で用いられる用語「抗体」は、修飾、操作または化学的に共役された、またはヒト抗体である完全抗体または抗原結合断片を含め、完全抗体（例えば、完全モノクローナル抗体）または抗体の抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体の抗原結合断片）を意味する。修飾または操作された抗体の例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびマルチ特異的抗体（例えば、ビス特異的抗体）がある。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニ体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）およびジア体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）が挙げられる。毒素部分に共役した抗体は、化学的に共役した結合抗体の一例である。

Ｉ．ＲＯＮに結合する抗体
本明細書に開示された抗体は、（ａ）構造ＣＤＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域および（ｂ）構造ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は一緒にヒトＲＯＮタンパク質結合に関する単一の結合部位を規定する。

いくつかの実施形態において、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域および（ｂ）免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は一緒にヒトＲＯＮ結合に関する単一の結合部位を規定する。ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号５（０７Ｆ０１）、配列番号５１（０７Ｆ０１）、配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）、配列番号１５（１２Ｂ１１）、配列番号５３（１２Ｂ１１）、２５（１７Ｆ０６）、配列番号５５（１７Ｆ０６），配列番号３５（１８Ｈ０９）、配列番号５７（１８Ｈ０９）、配列番号４５（２９Ｂ０６）、配列番号５９（２９Ｂ０６）、および配列番号１２６（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９、ｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号６（０７Ｆ０１）、配列番号１６（１２Ｂ１１）、配列番号２６（１７Ｆ０６）、配列番号３６（１８Ｈ０９）、配列番号４６（２９Ｂ０６）、および配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号７（０７Ｆ０１）、配列番号１７（１２Ｂ１１）、配列番号２７（１７Ｆ０６）、配列番号３７（１８Ｈ０９）、配列番号４７（２９Ｂ０６）、および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書を通して、特定の配列番号の後の括弧内にあるのはその配列の元の抗体である。例えば、「配列番号５（０７Ｆ０１）」は、配列番号５が、抗体０７Ｆ０１由来であることを意味する。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号５（０７Ｆ０１）、配列番号５１（０７Ｆ０１）、または配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１；配列番号６（０７Ｆ０１）または配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２；配列番号７（０７Ｆ０１）または配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号５（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１５（１２Ｂ１１）または配列番号５３（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号１６（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号１７（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号２５（１７Ｆ０６）または配列番号５５（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号２６（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号２７（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む。

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号３５（１８Ｈ０９）または配列番号５７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号３６（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号３７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む。

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号４５（２９Ｂ０６）、配列番号５９（２９Ｂ０６）、または配列番号１２６（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９，Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号４６（２９Ｂ０６）、およびのアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号４７（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む。

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、配列番号４５（２９Ｂ０６）または配列番号１２６（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９，Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号４６（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号４７（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含む。

ＣＤＲ_Ｈ１、ＣＤＲ_Ｈ２、およびＣＤＲ_Ｈ３の配列は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦＲの間に挿入されていることが好ましい。抗体は、完全抗体でもよく、抗原結合抗体断片でもよい。

いくつかの実施形態において、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域および（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ＩｇＧ軽鎖可変領域とＩｇＧ重鎖可変領域は一緒にヒトＲＯＮ結合に関する単一の結合部位を規定する。ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号８（０７Ｆ０１）、配列番号１８（１２Ｂ１１）、２８（１７Ｆ０６）、配列番号３８（１８Ｈ０９）、配列番号４８（２９Ｂ０６）、および配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号９（０７Ｆ０１）、配列番号１９配列番号（１２Ｂ１１）、配列番号２９（１７Ｆ０６）、配列番号３９（１８Ｈ０９）、配列番号４９（２９Ｂ０６）、および配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号１０（０７Ｆ０１）、配列番号２０（１２Ｂ１１）、配列番号３０（１７Ｆ０６）、配列番号４０（１８Ｈ０９）、および配列番号５０（２９Ｂ０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号８（０７Ｆ０１）または配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号９（０７Ｆ０１）または配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号１０（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１；配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２；および配列番号１０（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１８（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１；配列番号１９（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２；および配列番号２０（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２８（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１；配列番号２９（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２；および配列番号３０（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号３８（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１；配列番号３９（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２；および配列番号４０（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号４８（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１；配列番号４９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２；および配列番号５０（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

ＣＤＲ_Ｌ１、ＣＤＲ_Ｌ２、およびＣＤＲ_Ｌ３の配列は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンＦＲの間に挿入されていることが好ましい。抗体は、完全抗体でもよく、抗原結合抗体断片でもよい。

いくつかの実施形態において、抗体は、（ａ）構造ＣＤＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域および（ｂ）構造ＣＤＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は一緒にヒトＲＯＮ結合に関する単一の結合部位を規定する。ＣＤＲ_Ｈ１は、配列番号５（０７Ｆ０１）、配列番号５１（０７Ｆ０１）、配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）、配列番号１５（１２Ｂ１１）、配列番号５３（１２Ｂ１１）、配列番号２５（１７Ｆ０６）、配列番号５５（１７Ｆ０６）、配列番号３５（１８Ｈ０９）、配列番号５７（１８Ｈ０９）、配列番号４５（２９Ｂ０６）、配列番号５９（２９Ｂ０６）、および配列番号１２６（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９，Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲ_Ｈ２は、配列番号６（０７Ｆ０１）、配列番号１６（１２Ｂ１１）、配列番号２６（１７Ｆ０６）、配列番号３６（１８Ｈ０９）、配列番号４６（２９Ｂ０６）、および配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲ_Ｈ３は、配列番号７（０７Ｆ０１）、配列番号１７（１２Ｂ１１）、配列番号２７（１７Ｆ０６）、配列番号３７（１８Ｈ０９）、配列番号４７（２９Ｂ０６）、および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。ＣＤＲ_Ｌ１は、配列番号８（０７Ｆ０１）、配列番号１８（１２Ｂ１１）、配列番号２８（１７Ｆ０６）、配列番号３８（１８Ｈ０９）、配列番号４８（２９Ｂ０６）、および配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲ_Ｌ２は、配列番号９（０７Ｆ０１）、配列番号１９（１２Ｂ１１）、配列番号２９（１７Ｆ０６）、配列番号３９（１８Ｈ０９）、配列番号４９（２９Ｂ０６）、および配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり；ＣＤＲ_Ｌ３は、配列番号１０（０７Ｆ０１）、配列番号２０（１２Ｂ１１）、配列番号３０（１７Ｆ０６）、配列番号４０（１８Ｈ０９）、および配列番号５０（２９Ｂ０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列である。

本明細書に開示された抗体は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２（０７Ｆ０１）、配列番号１２（１２Ｂ１１）、配列番号２２（１７Ｆ０６）、配列番号３２（１８Ｈ０９）、配列番号４２（２９Ｂ０６）、配列番号１３３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ）、配列番号１３５（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８）、配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）、配列番号１４３（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９）、配列番号１４５（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９）、および配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域、および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態において、抗体は、配列番号４（０７Ｆ０１）、配列番号１４（１２Ｂ１１）、配列番号２４（１７Ｆ０６）、配列番号３４（１８Ｈ０９）、配列番号４４（２９Ｂ０６）、配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）、配列番号１４１（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）、および配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域、および免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２（０７Ｆ０１）、配列番号１２（１２Ｂ１１）、配列番号２２（１７Ｆ０６）、配列番号３２（１８Ｈ０９）、配列番号４２（２９Ｂ０６）、配列番号１３３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ）、配列番号１３５（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８）、配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）、配列番号１４３（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９）、配列番号、１４５（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９）、および配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４（０７Ｆ０１）、配列番号１４（１２Ｂ１１）、配列番号２４（１７Ｆ０６）、配列番号３４（１８Ｈ０９）、配列番号４４（２９Ｂ０６）、配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）、配列番号１４１（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）、および配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１２（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１４（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号２２（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号２４（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号３２（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号３４（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号４２（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４４（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

一定の実施形態において、本明細書に開示された抗体は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号９３（０７Ｆ０１）、配列番号９７（１２Ｂ１１）、配列番号１０１（１７Ｆ０６）、配列番号１０５（１８Ｈ０９）、配列番号１０９（２９Ｂ０６）、配列番号１５６（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ ＩｇＧ１）、配列番号１６０（キメラ２９Ｂ０６ ＩｇＧ１）、配列番号１６４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ ＩｇＧ１）、配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）、配列番号１７２（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ ＩｇＧ１）、配列番号１７４（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ ＩｇＧ１）、および配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖を含む。

別の実施形態において、抗体は、配列番号９５（０７Ｆ０１）、配列番号９９（１２Ｂ１１）、配列番号１０３（１７Ｆ０６）、配列番号１０７（１８Ｈ０９）、配列番号１１１（２９Ｂ０６）、配列番号１５８（キメラ０７Ｆ０１カッパ）、配列番号１６２（キメラ２９Ｂ０６カッパ）、配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）、配列番号１７０（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１カッパ）、および配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリン重鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号 ９３（０７Ｆ０１）、配列番号９７（１２Ｂ１１）、配列番号１０１（１７Ｆ０６）、配列番号１０５（１８Ｈ０９）、配列番号１０９（２９Ｂ０６）、配列番号１５６（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ ＩｇＧ１）、配列番号１６０（キメラ２９Ｂ０６ ＩｇＧ１）、配列番号１６４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ ＩｇＧ１）、配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）、配列番号１７２（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ ＩｇＧ１）、配列番号１７４（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ ＩｇＧ１）、および配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖、および（ｉｉ）配列番号９５（０７Ｆ０１）、配列番号９９（１２Ｂ１１）、配列番号１０３（１７Ｆ０６）、配列番号１０７（１８Ｈ０９）、配列番号１１１（２９Ｂ０６）、配列番号１５８（キメラ０７Ｆ０１カッパ）、配列番号１６２（キメラ２９Ｂ０６カッパ）、配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）、配列番号１７０（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１カッパ）、および配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号９３（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号９５（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号９７（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号９９（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１０１（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０３（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１０５（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１０９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１１１（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

一定の実施形態において、ヒトＲＯＮに結合する単離抗体は、全可変領域に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一性であるアミノ酸配列か、または配列番号２（０７Ｆ０１）、配列番号１２（１２Ｂ１１）、配列番号２２（１７Ｆ０６）、配列番号３２（１８Ｈ０９）、配列番号４２（２９Ｂ０６）、配列番号１３３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ）、配列番号１３５（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８）、配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）、配列番号１４３（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９）、配列番号１４５（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９）、または配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のフレームワーク領域配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。

一定の実施形態において、ヒトＲＯＮに結合する単離抗体は、全可変領域に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一性であるアミノ酸配列か、または配列番号４（０７Ｆ０１）、配列番号１４（１２Ｂ１１）、配列番号２４（１７Ｆ０６）、配列番号３４（１８Ｈ０９）、配列番号４４（２９Ｂ０６）、配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）、配列番号１４１（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）、または配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）のフレームワーク領域配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。

相同性または同一性は、当該技術分野の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの市販のコンピューターソフトウェアを用いて、決定することができる。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｘ（参照として援用されたＫａｒｌｉｎら、(１９９０)、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ ８７、２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９３）Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ．３６、２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．２５、３３８９−３４０２）により採用された演算を用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）解析を、配列類似性探索用に調整する。ＢＬＡＳＴプログラムにより用いられるアプローチは、第一に、照会配列とデータベース配列との間の類似区域を考慮し、次いで、同定される全てのマッチの統計的有意性を評価し、最後に、予備選択した有意性閾値に合うマッチのみを要約するためのものである。配列データベースの類似性探索における基本的問題の考察に関しては、参照として全体が援用されているＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ６、１１９−１２９を参照されたい。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントに達するために必要な演算など、アラインメント測定用の適切なパラメータを決定することができる。棒グラフ、記述、アラインメント、予想（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルターのための探索パラメータは、デフォルト設定される。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより用いられるデフォルトスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（参照として完全に援用されているＨｅｎｉｋｏｆｆら、（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ｃＵＳＡ ８９、１０９１５−１０９１９）である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、以下のとおり調整する：Ｑ＝１０（ギャップ作製ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（照会に沿った全てのｗｉｎｋ．ｓｕｐ．ｔｈ位置におけるワードヒットを生じる）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生じるウィンドウ幅を設定する）。等価Ｂｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であり得る。探索はまた、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｐｔｉｏｎパラメータ（例えば、：−Ｇ、オープンギャップに対するコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドに関して５／タンパク質に関して１１；−Ｅ、拡張ギャップに対するコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドに関して２／タンパク質に関して１；−ｑ、ヌクレオチドミスマッチに対するペナルティー［整数］：デフォルト＝−３；−ｒ、ヌクレオチドマッチに対する報酬［整数］：デフォルト＝１；−ｅ、予想値［実数］：デフォルト＝１０；−Ｗ、ワードサイズ［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドに関して１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔに関して２８／タンパク質に関して３；−ｙ、ｂｌａｓｔ拡張に関するビットの減少（Ｘ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎに関して２０／その他に関して７；−Ｘ、ギャップアラインメントに関するＸ減少値（ビット）：デフォルト＝全プログラムに関して１５、ｂｌａｓｔｎには適用不可；および−Ｚ、ギャップアラインメントに関する最終Ｘ減少値（ビット）：ｂｌａｓｔｎに関して５０、その他に関して２５）を用いても実施できる。対タンパク質アラインメントに関するＣｌｕｓｔａｌＷもまた使用できる（デフォルトパラメータとしては、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスおよびギャップオープニングペナルティー＝１０およびギャップ拡張ペナルティー＝０．１を挙げることができる）。ＧＣＧパッケージ版１０．０で利用できる配列間の最良適合比較では、ＤＮＡパラメータのＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティー）を用い、タンパク質比較における等価設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。

先述の実施形態各々において、ヒトＲＯＮに一緒に結合する免疫グロブリン重鎖可変領域配列および／または軽鎖可変領域配列は、重鎖および／または軽鎖可変領域のフレームワーク領域に、アミノ酸の改変（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、または１０個のアミノ酸の置換、欠失、または付加）を含有することができる。

一定の実施形態において、抗体は、１ｎＭ、９００ｐＭ、７５０ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたはそれ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する。別に指定しない限り、Ｋ_Ｄ値は、実施例５および１４に記載された条件下、表面プラズモン共鳴法によって決定される。

抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８は、実施例５および１４に記載された条件下、表面プラズモン共鳴法によって測定した５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭまたはそれ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する。例示的な実施形態において、抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８は、実施例５および１４に記載された条件下、３７℃で表面プラズモン共鳴法によって測定した１５０ｐＭ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する。

抗体ＳＨ０７Ｆ０１−６２は、実施例５および１４に記載された条件下、表面プラズモン共鳴法によって測定した５００ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭまたはそれ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する。例示的な実施形態において、抗体ＳＨ０７Ｆ０１−６２は、実施例５および１４に記載された条件下、３７℃で表面プラズモン共鳴法によって測定した２５０ｐＭから３５０ｐＭ、またはそれ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する。

一定の実施形態において、抗体は、ヒトＲＯＮに対するヒトＭＳＰの結合を阻害する。例えば、抗体は、実施例８および１５に記載されたプロトコルを用いてアッセイした場合、約５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭまたはそれ以下のＩＣ_５０（最大阻害の５０％における濃度）を有し得る。

実施例に例示した実施形態は、１つは重鎖から、そして１つは軽鎖からの可変領域の対、完全長抗体鎖の対、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域の対を含むが、代替実施形態が、抗体の重鎖か軽鎖からの単一の重鎖可変領域、または単一の軽鎖可変領域、単一の完全長抗体鎖、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含み得ることを、当業者は認識するであろう。一本鎖の単一の可変領域、完全長抗体鎖またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、別の鎖における対応するドメインのスクリーニングするために使用でき、これら二本鎖は抗原に結合する抗体を形成することができる。スクリーニングは、例えば、ＰＣＴ公開番号国際公開第９２／０１０４７号パンフレットに開示された階層二重組合わせ法を用いて、ファージ表示スクリーニング法によって達成できる。この方法では、重鎖または軽鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを用いて、別の鎖（軽鎖または重鎖）をコードするクローンの完全ライブラリーに感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを、記載されたファージ表示技法に従って選択する。

ＩＩ．抗体の作製
本明細書に開示されたような抗体を作製する方法は当該技術分野に知られている。例えば、本明細書に提供された配列情報を用いて、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子を化学的に合成することができる。所望の抗体をコードする従来の遺伝子発現構築体を作製するために、合成ＤＮＡ分子を、例えば、定常領域コード配列、および発現制御配列などの他の適切なヌクレオチド配列に結合することができる。規定された遺伝子構築体の作製は、当該技術分野におけるルーチン技術内にある。あるいは、その配列が本明細書に提供された配列情報、またはハイブリドーマ細胞におけるマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に関する先行の配列情報に基づいている合成核酸プローブを用い、従来のハイブリダイゼーション技法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法により、本明細書に提供された配列をハイブリドーマからクローニングすることができる。

所望の抗体をコードする核酸を発現ベクター内に組み込み（結合し）、これを従来のトランスフェクション技法または形質転換技法により宿主細胞に導入することができる。例示的な宿主細胞は、他ではＩｇＧタンパク質を作製しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ ２９３）細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および骨髄腫細胞である。形質転換した宿主細胞を、宿主細胞に免疫グロブリン軽鎖／重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させる条件下で増殖させることができる。

具体的な発現条件および精製条件は、採用した発現系に依って変わり得る。例えば、遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させる場合、遺伝子を先ず、好適な細菌のプロモータ、例えば、ＴｒｐまたはＴａｃの下流に改変遺伝子、および原核生物のシグナル配列を配置することにより発現ベクター内にクローニングする。発現した分泌タンパク質は光屈折性体または封入体の中に蓄積し、フレンチプレスまたは音波処理による細胞の破壊後により得ることができる。次いで光屈折性体を可溶化し、当該技術分野に知られた方法により、タンパク質をリフォールディングさせ、開裂させる。

改変遺伝子をユーカヨティック（ｅｕｋａｙｏｔｉｃ）の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞中に発現させる場合、それを先ず、好適な真核生物プロモータ、分泌シグナル、ＩｇＧエンハンサー、および種々のイントロンを含有する発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、定常領域の全部または一部をコードする配列を任意に含有し、重鎖または軽鎖の全部または一部を発現できる。遺伝子構築体は、慣例的な技法を用いて真核生物の宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、別の機能（例えば細胞毒性）を有する部分と各々結合できるＶ_ＬまたはＶ_Ｈ断片、Ｖ_Ｌ−Ｖ_Ｈヘテロダイマー、Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ一本鎖ポリペプチド、完全重または軽免疫グロブリン鎖、またはそれらの一部を発現する。いくつかの実施形態において、宿主細胞に、重鎖の全部または一部（例えば、重鎖可変領域）または軽鎖の全部または一部（例えば、軽鎖可変領域）を発現するポリペプチドを発現する単一のベクターをトランスフェクトする。別の実施形態において、宿主細胞に、（ａ）重鎖可変領域を含むポリペプチドおよび軽鎖可変領域を含むポリペプチド、または（ｂ）完全免疫グロブリン重鎖および完全免疫グロブリン軽鎖、をコードする単一のベクターをトランスフェクトする。さらに別の実施形態において、宿主細胞に、２つ以上の発現べクター（例えば、重鎖または重鎖可変領域の全部または一部を含むポリペプチドを発現する１つの発現ベクターと、軽鎖または軽鎖可変領域の全部または一部を含むポリペプチドを発現するもう１つの発現ベクター）を同時にトランスフェクトする。

免疫グロブリン重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドは、そのような可変領域をコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、このポリペプチドを発現させる条件下で増殖させることによって製造することができる。発現後、ポリペプチドは、当該技術分野に周知の技法、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグおよびヒスチジンタグなどのアフィニティータグを用いて、採収し、精製することができる。

ヒトＲＯＮに結合するモノクローナル抗体または抗体の抗原結合断片は、（ａ）完全または部分的な免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクター、および完全または部分的な免疫グロブリン軽鎖をコードする別個の発現ベクター；または（ｂ）双方の鎖（例えば、完全または部分的な重鎖および軽鎖）をコードする単一の発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、双方の鎖を発現させる条件下で増殖させることによって製造することができる。完全抗体（または抗原結合断片）は、当該技術分野に周知の技法、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグおよびヒスチジンタグなどのアフィニティータグを用いて、採収し、精製することができる。単一の発現ベクターまたは２つの別個の発現ベクターから重鎖および軽鎖を発現することは、当該技術分野の通常の技法の範囲内にある。

ＩＩＩ．抗体の改変
抗体および抗体断片の抗原性を低減または除去するための方法は当該技術分野に知られている。抗体をヒトに投与する場合、抗体はヒトにおける抗原性を低減または除去するために、「ヒト化」することが好ましい。ヒト化抗体は、抗原に対して、由来した非ヒト化マウス抗体と同一または実質的に同一な親和性を有することが好ましい。

１つのヒト化アプローチにおいて、マウスの免疫グロブリン定常領域がヒトの免疫グロブリン定常領域で置換されているキメラタンパク質が作出される。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．８１：６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、ＮＡＴＵＲＥ３１２：６０４−６０８；米国特許第６，８９３，６２５号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；米国特許第５，５００，３６２号明細書（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書（Ｃａｂｉｌｌｙ）を参照されたい。

ＣＤＲグラフティングとして知られているアプローチでは、軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲが別の種のフレームワーク内に移植される。例えば、マウスのＣＤＲをヒトのＦＲに移植することができる。いくつかの実施形態において、抗ＲＯＮ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲを、ヒトのＦＲまたはコンセンサスヒトＦＲ内に移植する。コンセンサスヒトＦＲを作出するために、ヒトの重鎖または軽鎖のいくつかのアミノ酸配列からのＦＲをアラインメントして、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。ＣＤＲ移植は、米国特許第７，０２２，５００号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第６，９８２，３２１号明細書（Ｗｉｎｔｅｒ）；米国特許第６，１８０，３７０号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第６，０５４，２９７号明細書（Ｃａｒｔｅｒ）；米国特許第５，６９３，７６２号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，８５９，２０５号明細書（Ａｄａｉｒ）；米国特許第５，６９３，７６１号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，５６５，３３２号明細書（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）；米国特許第５，５８５，０８９号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；米国特許第５，５３０，１０１号明細書（Ｑｕｅｅｎ）；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）ＮＡＴＵＲＥ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）ＳＣＩＥＮＣＥ ２３９：１５３４−１５３６；およびＷｉｎｔｅｒ（１９９８）ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ ４３０：９２−９４に記載されている。

「ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）」と称されるアプローチでは、ヒトＣＤＲ配列は、ヒト化されるマウス抗体のＣＤＲに対するヒトＣＤＲの構造的類似性に基づいて、ヒト生殖細胞系から選択される。例えば、米国特許第６，８８１，５５７号明細書（Ｆｏｏｔｅ）；およびＴａｎら、２００２、Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ、１６９：１１１９−１１２５を参照されたい。

免疫原性を低減させる他の方法としては、「リシェーピング」、「超キメラ化」、および「ベニアリング／リサーフェーシング」が挙げられる。例えば、Ｖａｓｗａｍｉら、１９９８、ＡＮＮＡＬＳ ＯＦＡＬＬＥＲＧＹ，ＡＳＴＨＭＡ，＆ＩＭＭＵＮＯＬ，８１：１０５；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９６、ＰＲＯＴ．ＥＮＧＩＮＥＥＲ９：８９５−９０４；および米国特許第６，０７２，０３５号明細書（Ｈａｒｄｍａｎ）を参照されたい。ベニアリング／リサーフェーシング法では、マウス抗体中の表面接触可能なアミノ酸残基を、ヒト抗体の同じ位置に見られることがより多いアミノ酸残基によって置換する。このタイプの抗体リサーフェーシングは、例えば、米国特許第５，６３９，６４１号明細書（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）に記載されている。

マウスの抗体を、ヒトにおける医療的使用に好適な形態に変換するための他のアプローチは、哺乳動物細胞に抗体を発現させるためにワクシニアウィルスをベースにしたベクターを含むＡＣＴＩＶＭＡＢ（商標）技法（Ｖａｃｃｉｎｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）として知られている。ＩｇＧの重鎖および軽鎖の高レベルな組み合わせ多様性が生じると言われている。例えば、米国特許第６，７０６，４７７号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）；米国特許第６，８００，４４２号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）；および米国特許第６，８７２，５１８号明細書（Ｚａｕｄｅｒｅｒ）を参照されたい。

マウスの抗体をヒトにおける使用に好適な形態に変換するための他のアプローチは、ＫａｌｏＢｉｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）により商業的に実施されている技法である。この技法は、抗体選択用の「エピトープ照準」ライブラリーを作製するために、商標つきのヒト「アクセプター」ライブラリーの使用を含む。

マウスの抗体をヒトにおける医療的使用に好適な形態に改変するための他のアプローチは、ＸＯＭＡ（米国）ＬＬＣにより商業的に実施されているＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標）技法である。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９３／１１７９４号パンフレットおよび米国特許第５，７６６，８８６号明細書（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ）；米国特許第５，７７０，１９６号明細書（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ）；米国特許第５，８２１，１２３号明細書（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ）および米国特許第５，８６９，６１９号明細書（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ）を参照されたい。

抗体のヒト免疫原性を低減または除去するために、上記のアプローチを含む好適な任意のアプローチを使用することができる。

また、完全ヒト抗体をマウスにおいて作出することが可能である。何らかの非ヒト配列を欠いた完全ヒトｍＡｂｓを、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９、１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ １４：８４５−８５１、１９９６；およびＭｅｎｄｅｚら、ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ １５：１４６−１５６、１９９７に参照した技法により、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウスから調製することができる。ヒトＡｂｓはまた、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２９６：５７−８６、２０００；およびＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ、２５４：６７−８４ ２００１）に参照した技法により、ファージ表示ライブラリーから調製し、最適化することもできる。

抗体を治療薬として使用される場合、標準的なインビトロ共役化学を用いて、抗体を小型分子毒素または放射性核種などのエフェクター剤に共役させることができる。エフェクター剤がポリペプチドの場合、抗体は、エフェクターに化学的に共役させるか、または融合タンパク質としてエフェクターに結合させることができる。融合タンパク質の構築は、当該技術分野の通常技法の範囲内にある。

ＩＶ．抗体の使用
本明細書に開示された抗体は、種々の形態の癌、例えば、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、大腸癌、肺癌、膵癌、胃癌、頭部および頚部癌の治療に用いることができる。癌細胞の増殖を阻害または低減させるために、癌細胞を治療的有効量の抗体に曝露する。いくつかの実施形態において、抗体は癌細胞の増殖を、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％抑制する。

いくつかの実施形態において、抗体（例えば、０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、１２Ｂ１１、ｓｈ２９Ｂ０６、ｓｈ０７Ｆ０１）は、ヒトＲＯＮのそのリガンド、ＭＳＰへの結合を阻害することによって、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減させる。いくつかの実施形態において、抗体（例えば、０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、１２Ｂ１１、ｓｈ２９Ｂ０６、ｓｈ０７Ｆ０１）は、ＭＳＰへのＲＯＮ結合を阻害することなく、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減させる。抗体（例えば、０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、１２Ｂ１１、ｓｈ２９Ｂ０６、ｓｈ０７Ｆ０１）は治療に用いることもできる。抗体（例えば、０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、１２Ｂ１１、ｓｈ２９Ｂ０６、ｓｈ０７Ｆ０１）は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）における腫瘍細胞の増殖を抑制するために用いることができる。いくつかの実施形態において、哺乳動物における腫瘍の成長を抑制するための抗体の使用は、哺乳動物に治療的有効量の抗体を投与することを含む。

一定の実施形態において、抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８が治療に用いられる。例えば、抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８を、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減させるために使用することができる。抗体Ｓｈ２９Ｂ０６−７８はまた、哺乳動物における腫瘍の成長を抑制または低減させるために使用することもできる。

他の実施形態において、抗体Ｓｈ０７Ｆ０１−６２が治療に用いられる。例えば、抗体Ｓｈ０７Ｆ０１−６２を、腫瘍細胞の増殖を阻害または低減させるために使用することができる。抗体Ｓｈ０７Ｆ０１−６２はまた、哺乳動物における腫瘍の成長を抑制または低減させるために使用することもできる。

ＲＯＮの過剰発現または不適切な活性化に関連した癌としては、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、膵癌、膀胱癌、いくつかの形態の脳癌、黒色腫、および胃腸癌が挙げられる。

本明細書に用いられる「治療する」、「治療すること」および「治療」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾病の治療を意味する。これには、（ａ）疾病の抑制、すなわち、その発現の阻止；および（ｂ）疾病の緩和、すなわち、疾病状態の退行が含まれる。

一般に、活性成分の治療的有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。投与量は、疾病のタイプおよび程度、または治療される適応症、患者の全体的健康、抗体のインビボ効力、薬剤の剤形、および投与経路などの変数に依存する。最初の投与量は、組織レベルの所望の血中濃度を速やかに達成するために、上限レベルを超えて増加させることができる。あるいは、最初の投与量を最適量より少なくでき、治療経過中に徐々に増加させてもよい。ヒトの投与量は、０．５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇで操作するようにデザインされた慣例的な第Ｉ相段階的用量増加試験において最適化することができる。投与頻度は、投与経路、投与量、および治療されている疾病などの要因に依って変わり得る。例示的な投与頻度は、１日１回、週１回および２週に１回である。いくつかの実施形態において、投与は２週に１回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば、静脈内注入である。モノクローナル抗体ベースの薬剤の製剤化は、当該技術分野の通常の技法の範囲内にある。いくつかの実施形態において、抗体は凍結乾燥され、投与時に緩衝生理食塩水中で再構成される。

治療的使用では、抗体は薬学的に許容できる担体と組み合わせることが好ましい。本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題または合併症がなく、利益／危険性の比率が釣り合っている、ヒトおよび動物の組織と接触させる使用に好適な緩衝剤、担体、および賦形剤を意味する。担体は、製剤の他の成分に適合性であり、レシピアントに対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体としては、薬剤投与に適合性である緩衝剤、溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張化剤および吸収遅延化剤などが挙げられる。薬学的活性物質に対するこのような媒体および試剤の使用は当該技術分野に知られている。

本明細書に開示されたものなどの抗体を含有する製薬組成物は、用量単位形態で提供でき、好適な方法により調製することができる。製薬組成物は、意図された投与経路に適合性であるように製剤化すべきである。投与経路の例には、静脈内（ＩＶ）投与、皮内投与、吸入投与、経皮投与、局所投与、経粘膜投与、および直腸投与がある。モノクローナル抗体の好ましい投与経路は、ＩＶ注入である。有用な製剤は、製薬業界でよく知られた方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）を参照されたい。非経口投与に好適な製薬成分としては、注射用の水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張化剤が挙げられる。

静脈内投与のために好適な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物に抗して保存すべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。

製薬製剤は滅菌されていることが好ましい。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって達成できる。組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥および再構成の前または後に、濾過滅菌を実施することができる。

以下の実施例は単に例示的なものであり、決して本発明の範囲または内容の限定は意図されていない。

実施例１：ヒトＲＯＮ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の製造
本実施例では、抗原、ｈＲＯＮ ＥＣＤタンパク質の作製を記載する。免疫原として完全長ＥＣＤを使用することにより、以下の２つのクラスのハイブリドーマの選択が可能になった：（ａ）リガンド結合ドメインと相互作用し、そのことによって、受容体に対するリガンドの接触を阻害する抗体を製造するもの；および（ｂ）リガンド結合ドメインの外で結合し、そのことによって、リガンド結合の阻害以外の機構により、受容体機能を阻害するもの。

ヒトＲＯＮの細胞外ドメイン（ｈＲＯＮ ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ（参照配列ＮＭ＿００２４４７）は、ＰＣＲによって増幅し、ＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位インフレームを用いて、ＴＨＸｍＦＣ（トロンビン／Ｈｉｓタグ／Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ−ＡＪマウスＩｇＧ−Ｆｃ）を含有するｐＥＥ１４．４ベクター（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にサブクローニングし、融合タンパク質を製造する。得られたクローンをＰｖｕＩ酵素（ＮＥＢＢｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１５０）を用いて直線化してから、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ）内に電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、２００ｍｌのＣＤ ＣＨＯ媒体（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０７４３−０１１）中に希釈した。翌日、最終濃度５０μＭのメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＣＨＯ培地を細胞に加えた。４週間後、固定化抗体が市販のモノクローナル抗ｈＲＯＮ抗体ＭＡＢ６９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）であり、検出抗体が市販のポリクローナル抗ｈＲＯＮ抗体ＡＦ６９１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）であるサンドイッチＥＬＩＳＡにより、陽性クローンを選択した。陽性クローンは、標準的プロトコルにおいて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を用いて、再トランスフェクトした。細胞を４つの別個のシェーカーフラスコに分取し、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、および４００μＭのＭＳＸを用いて選択した。２週間の選択後、個々のフラスコを、ｈＲＯＮ−ＥＣＤタンパク質発現に関して、ＥＬＩＳＡによりチェックした。最高選択圧、４００μＭ ＭＳＸにより良好なタンパク質発現が得られたため、スケールアップと精製に選択した。細胞は、ＣＤ ＣＨＯ媒体中、２〜２．５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で、ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ Ｂｏｔｔｌｅｓ（Ｂｅｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）中、３７℃で２週間、増殖させ、タンパク質製造のための最終濃度を８０μＭ ＭＳＸとした。得られた細胞を５００ｍｌの円錐管中、１５分間遠心沈殿させた。０．４５ミクロンのフィルター、次いで０．２２ミクロンのフィルターを使用する減圧濾過を用いて、上澄液を濾過した。次いでタンパク質のｐＨを７．５に調整した後、４℃で攪拌しながら、ＰｒｏＳｅｐＡビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、一晩バッチ結合させた。ビーズを１×ＰＢＳにより洗浄し、使い捨てタンパク質Ａアフィニティーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃカラム；Ｂｉｏ−Ｒａｄカタログ番号７３２−１０１０）に装填した。１０カラム容量（ＣＶ）のグリシン結合用緩衝液（３Ｍのグリシン、ｐＨ９．０、１ＭのＮａＣｌ）によりビーズを洗浄した。次いで、２００ｍＭのグリシン、ｐＨ２．５の酸性溶出用緩衝液の５〜１０ＣＶを用いて、タンパク質をカラムから溶出させた。次いで、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮機（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて濃縮した１．０Ｍのトリス、ｐＨ８．０の中和緩衝液１．３ｍＬを用いて、サンプルを中和した。

実施例２：抗ＲＯＮ抗体
本実施例では、抗ｈＲＯＮモノクローナル抗体の作製を記載する。Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｉｔｅｓ（ＲＩＭＭＳ）プロトコルに従って、Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）において、免疫化、融合、および一次スクリーニングを実施した。５匹のＡＪマウスおよび５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、組換えヒトＲＯＮ細胞外ドメイン（ｈＲＯＮ−ＥＣＤ）により免疫化した。Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により最高の抗ＲＯＮ活性を示す血清を有する２匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、引き続く融合に選択した。適切なマウスから脾臓およびリンパ節を採取した。Ｂ細胞を採取して、骨髄腫系に融合した。融合産物を、近クローン性へ４０の９６ウェルプレートに連続的に希釈した。

組換えｈＲＯＮ−ＥＣＤへの結合のため、細胞融合物からおよそ４，０００の上澄液をスクリーニングした。ＲＯＮに対する抗体を含有する合計１５８の上澄液を、下記の通り、インビトロ生化学的アッセイおよび細胞ベースのアッセイによりさらに特性化した。ハイブリドーマの一群を選択し、サブクローニングし、増加させた。抗体発現および標準的条件下、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによる精製のため、ハイブリドーマ細胞系をＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）に移した。

実施例３：スクリーニングアッセイ
リガンド結合を阻害する抗体を同定するために、生化学的アッセイを実施した。受容体のＭＳＰ誘導ホスホＥＲＫ下流シグナル伝達を阻害する抗体を同定するために、細胞ベースのアッセイを実施した。中和アッセイにおけるリガンド結合をブロックするかどうかには関わりなく、さらなる特性化のために、ＲＯＮ媒介細胞シグナル伝達を阻害した抗体を選択した。

生化学的中和アッセイでは、電気化学発光（ＥＣＬ）を用い、ハイブリドーマ上澄液において、ｈＲＯＮに対するＭＳＰ結合の抗体による阻害を測定する。ＭＡ２４００の９６ウェル高結合プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、室温で１時間、攪拌しながら、ＰＢＳ中、０．４２μｇ／ｍＬのｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩ（ｈＲＯＮのＥＣＤのＮ末端部分；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌによりコーティングした。プレートを、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、１５０μｌのチャコール除去ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）によりブロックした。ハイブリドーマ上澄液を加え、室温で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、チャコール除去ＦＢＳ中、５μｌのＭＳＰ（３μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴにより４回洗浄し、１μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＭＳＰ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）２５μｌを、室温で１時間、攪拌しながらプレートに加えた。プレートをＰＢＳＴにより４回洗浄し、１μｇ／ｍＬのＳＴ−ストレプトアビジン（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２５μｌにより、室温で１時間、攪拌しながらインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、各ウェルに１５０μｌのリード緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を加えてから、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ２４００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）計測器でプレートを分析した。この中和アッセイにおいて、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９および２９Ｂ０６は各々、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するＭＳＰ結合をブロックした。

細胞ベースのアッセイにおいて、ハイブリドーマ上澄液中の抗体を、ＲＯＮ下流シグナル伝達分子であるＥＲＫのＭＳＰ誘導リン酸化阻害に関して試験した。ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ＋インスリン中、９６ウェルプレートにおいてＴ４７Ｄ細胞を培養した。培地を除去し、細胞を無血清培地中、２４時間インキュベートした。ＲＯＮ抗体を含有するハイブリドーマ上澄液を無血清培地中、１：４の希釈で細胞に加え、３７℃で１時間、インキュベートした。ＭＳＰ（５ｎＭ）をウェルに加え、１５分間インキュベートした。培地を除去し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で細胞を固定した。供給業者の取扱い説明書（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ１０１８）に従って、ＥＲＫとホスホ−ＥＲＫの合計を測定した。抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９および２９Ｂ０６は各々、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＭＳＰ誘導ＥＲＫリン酸化を阻害した。

本明細書で検討した通り（実施例８および９を参照）、中和アッセイにおいて、抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９および２９Ｂ０６は各々、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＭＳＰ誘導ＥＲＫリン酸化を阻害したが、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９および２９Ｂ０６のみが各々、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するＭＳＰ結合を阻害した。このことは、抗体１２Ｂ１１と１７Ｆ０６は、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩドメインに対するＭＳＰの結合を中和せず、全ＲＯＮ細胞外ドメインのコンテキストにおいて、ＲＯＮに対するＭＳＰの結合を中和するか、またはＲＯＮに対するＭＳＰの結合以外の機構によって機能することを示唆している。

実施例４：抗体配列の解析
ＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔを用い、供給業者の取扱い説明書（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に従って、実施例２における各モノクローナル抗体の軽鎖アイソタイプおよび重鎖アイソタイプを決定した。抗体は全て、カッパまたはラムダの軽鎖およびＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａの重鎖であることが分かった。

マウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の高速増殖）を用いて配列決定した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用い、キット供給業者の取扱い説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従って各モノクローナルハイブリドーマ細胞系から総ＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）またはＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のいずれかを用い、キット供給業者の取扱い説明書に従い、５’ＲＡＣＥにはランダムプライマーを用いて、５’端を含有する完全長第一鎖ｃＤＮＡを作出した。

ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、またはＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、キット供給業者の指示に従い、軽鎖（カッパまたはラムダ）および重鎖（ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ）の可変領域を、ＰＣＲによって増幅した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）Ｋｉｔ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’Ｐｒｉｍｅｒと関連させた５’ｃＤＮＡ端の増幅には、５’プライマーとして、５’ｃｇａｃｔｇｇａｇｃａｃｇａｇｇａｃａｃｔｇａ３’（配列番号１１２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ Ａプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と関連させた５’ｃＤＮＡ端の増幅には、５’プライマーとして、５’ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ ３’（配列番号１１３）および５’ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ ３’（配列番号１１４）の混合物を用いた。重鎖可変領域は、上記の５’プライマーおよび３’ＩｇＧ１定常領域特異的プライマーである５’ ＴＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡ ３’（配列番号１１５）または３’ＩｇＧ２ａ定常領域特異的プライマーである５’ ＡＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧ ３’（配列番号１１６）．を用いて増幅した。カッパ鎖可変領域は、上記の５’プライマーおよび３’カッパ定常領域特異的プライマーである５’ ＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ ３’（配列番号１１７）を用いて増幅した。ラムダ鎖可変領域は、上記の５’プライマーおよび３’ラムダ定常領域特異的プライマーである５’ＧＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＣ ３’（配列番号１１８）と５’ ＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧ ３’（配列番号１１９）との混合物を用いて増幅した。

個々のＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法により単離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用い、キット供給業者の取扱い説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従って精製した。引き続き、ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ（登録商標）４ＢｌｕｎｔプラスミドまたはｐＣＲ２．１（登録商標）ＴＯＰＯプラスミド内に、それぞれＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ＫｉｔまたはＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用い、キット供給業者の取扱い説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、クローン化し、標準的な分子生物学技法によりＤＨ５−α細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。形質転換した細菌クローンから単離したプラスミドＤＮＡを、標準的なジデオキシＤＮＡ配列決定法を用い、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）によるＭ１３正プライマー、(５’ ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ３’）（配列番号１２０）およびＭ１３逆プライマー、（５’ ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ ３’）（配列番号１２１）を用いて配列決定して、可変領域配列の配列を同定した。配列は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔウェブサーバーを用いて解析し、可変領域配列を同定し、確認した。

マウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする核酸配列および規定するタンパク質配列を以下に示す（アミノ末端シグナルペプチド配列は示されていない）。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔの定義）は、アミノ酸配列中、太字と下線で示されている。

０７Ｆ０１抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１）

０７Ｆ０１抗体の重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号２）

０７Ｆ０１抗体のカッパ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３）

０７Ｆ０１抗体のカッパ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号４）

１２Ｂ１１抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１１）

１２Ｂ１１抗体の重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１２）

１２Ｂ１１抗体のカッパ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１３）

１２Ｂ１１抗体のカッパ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１４）

１７Ｆ０６抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２１）

１７Ｆ０６抗体の重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号２２）

１７Ｆ０６抗体のラムダ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２３）

１７Ｆ０６抗体のラムダ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号２４）

１８Ｈ０９抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３１）

１８Ｈ０９抗体の重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号３２）

１８Ｈ０９抗体のラムダ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号３３）

１８Ｈ０９抗体のラムダ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号３４）

２９Ｂ０６抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号４１）

２９Ｂ０６抗体の重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号４２）

２９Ｂ０６抗体のカッパ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号４３）

２９Ｂ０６抗体のカッパ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号４４）

実施例２で作製した抗体に関して、免疫グロブリン重鎖可変領域を規定するアミノ酸配列は、図２にアラインメントさせてある。アミノ末端シグナルペプチド配列（発現／分泌に関する）は示されていない。ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２およびＣＤＲ_３（Ｋａｂａｔの定義）は、枠で識別してある。図３は、各抗体に関する個々のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２およびＣＤＲ_３配列のアラインメントを示す。

実施例２における抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列は、図４にアラインメントさせてある。アミノ末端シグナルペプチド配列（発現／分泌に関する）は示されていない。ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２およびＣＤＲ_３は、枠で識別してある。図５は、各抗体に関する個々のＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２およびＣＤＲ_３配列のアラインメントを示す。

表１は、本実施例において検討した各配列の配列番号を示している。

マウスモノクローナル抗体重鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）は、表２に示す。

マウスモノクローナル抗体カッパ軽鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＩＭＧＴ定義）は、表３に示す。

完全重鎖またはカッパ鎖抗体配列を作出するために、上記の各可変配列を、それぞれの定常領域と組み合わせる。例えば、完全重鎖は、重可変配列に引き続いて、マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ重鎖定常配列を含み、完全カッパ鎖は、カッパ可変配列に引き続いて、マウスカッパ軽鎖定常配列を含み。完全ラムダ鎖は、ラムダ可変配列に引き続いて、マウスラムダＩＧＬＣ１またはＩＧＬＣ２軽鎖定常配列を含む。

マウスＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号８２）

マウスＩｇＧ１重鎖定常領域を規定するタンパク質配列（配列番号８３）

マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号８４）

マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域を規定するタンパク質配列（配列番号８５）

マウスカッパ軽鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号８６）

マウスカッパ軽鎖定常領域を規定するタンパク質配列（配列番号８７）

マウスラムダ（ＩＧＬＣ１）軽鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号８８）

マウスラムダ（ＩＧＬＣ１）軽鎖定常領域を規定するタンパク質配列（配列番号８９）

マウスラムダ（ＩＧＬＣ２）軽鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号９０）

マウスラムダ（ＩＧＬＣ２）軽鎖定常領域を規定するタンパク質配列（配列番号９１）

以下の配列は、本実施例に記載した各抗体に関する実際の、または想定された完全長重鎖および軽鎖の配列（すなわち、可変領域と定常領域双方の配列を含有する）を表す。抗体の適切な分泌に関するシグナル配列（例えば、ＤＮＡ配列の５’端またはタンパク質配列のアミノ末端のシグナル配列）は、本明細書に開示した完全長重鎖および軽鎖配列には示されておらず、最終分泌タンパク質には含まれない。また、ＤＮＡ配列の３’端において必要な翻訳終止のための停止コドンも示されていない。開示された完全長ＩｇＧ重鎖および軽鎖配列発現のためのシグナル配列および／または停止コドンの選択は、当該技術分野の通常の技法の範囲内にある。また、活性完全長ＩｇＧ重鎖および軽鎖を作製するために、可変領域配列を、他の定常領域配列と結合し得ることも想定される。

０７Ｆ０１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号９２）

０７Ｆ０１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号９３）

０７Ｆ０１の完全長軽鎖配列（カッパ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号９４）

０７Ｆ０１の完全長軽鎖配列（カッパ鎖可変領域および定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号９５）

１２Ｂ１１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号９６）

１２Ｂ１１の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号９７）

１２Ｂ１１の完全長軽鎖配列（カッパ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号９８）

１２Ｂ１１の完全長軽鎖配列（カッパ鎖可変領域および定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号９９）

１７Ｆ０６の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ２Ａ定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１００）

１７Ｆ０６の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ２Ａ定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号１０１）

１７Ｆ０６の完全長軽鎖配列（ラムダ鎖可変領域および定常領域（ＩＧＬＣ２））をコードする核酸配列（配列番号１０２）

１７Ｆ０６の完全長軽鎖配列（ラムダ鎖可変領域および定常領域（ＩＧＬＣ２））を規定するタンパク質配列（配列番号１０３）

１８Ｈ０９の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１０４）

１８Ｈ０９の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号１０５）

１８Ｈ０９の完全長軽鎖配列（ラムダ鎖可変領域および定常領域（ＩＧＬＣ１））をコードする核酸配列（配列番号１０６）

１８Ｈ０９の完全長軽鎖配列（ラムダ鎖可変領域および定常領域（ＩＧＬＣ１））を規定するタンパク質配列（配列番号１０７）

２９Ｂ０６の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１０８）

２９Ｂ０６の完全長重鎖配列（重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号１０９）

２９Ｂ０６の完全長軽鎖配列（カッパ鎖可変領域および定常領域）をコードする核酸配列（配列番号１１０）

２９Ｂ０６の完全長軽鎖配列（カッパ鎖可変領域および定常領域）を規定するタンパク質配列（配列番号１１１）

表４は、本実施例において検討した抗体の完全長配列と配列一覧表との間の対応を示す。

実施例５：結合親和性
組換えヒトＲＯＮ−ＥＣＤ／ｍＦｃ融合タンパク質（ｒｈＲＯＮ ＥＣＤ／ｍＦｃ）および組換えヒトＲＯＮ ＳＥＭＡとＰＳＩドメイン（ヒトＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に対する抗体０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および１２Ｂ１１の結合親和性および結合動態は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００計測器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用い、表面プラズモン共鳴により測定した。

ウサギ抗マウスＩｇＧ類（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、カルボキシメチル化デキストラン ＣＭ４センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、標準的プロトコルに従って免疫化した。移動用緩衝液として、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳを用い、２５℃および３７℃での分析を実施した。抗体は、１０μｌ／分の流速で、個々のフローセルに捕捉された。注射時間は各抗体で変え、３０ＲＵと６０ＲＵとの間のＲｍａｘを得た。必要な場合は、タンパク質のＦｃ部分に対する抗体の非特異的結合をブロックするために、２５０μｇ／ｍＬのマウスＦｃを、３０μｌ／分で１２０秒間注入した。緩衝液は、移動用緩衝液で希釈したｒｈＲＯＮ ＥＣＤ／ｍＦｃまたはｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩを、参照表面（抗体捕捉無し）および活性表面（試験抗体）上に、６０μｌ／分で３００秒間、連続的に注入した。解離相を３６００秒までモニタリングした。次いで、表面を、６０μｌ／分の流速で、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．７の６０秒の注入２回によって再生した。試験したｒｈＲＯＮ ＥＣＤ／ｍＦｃまたはｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩの濃度範囲は、０．６２５ｎＭから２０ｎＭであった。

二重参照減算（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）でＢＩＡ評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の動態関数を用い、動態パラメータを決定した。各抗体に関する動態パラメータ、ｋ_ａ（結合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）およびＫ_Ｄ（平衡解離定数）を決定した。２５℃および３７℃におけるｒｈＲＯＮ ＥＣＤ／ｍＦｃ上のモノクローナル抗体の動態値を表５に要約する。

表５のデータは、抗体０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および１２Ｂ１１が、約１ｎＭ以下、７５０ｐＭ以下、６５０ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、または５０ｐＭ以下のＫ_ＤでｒｈＲＯＮ ＥＣＤ／ｍＦｃに結合することを示している。

２５℃および３７℃でのｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するモノクローナル抗体の動態値は、表６に要約する。

表６のデータは、抗体０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６および１８Ｈ０９が、約１ｎＭ以下、７５０ｐＭ以下、６５０ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、７５ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のＫ_ＤでｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに結合することを示している。抗体１２Ｂ１１は、ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに結合しなかった。

細胞表面ヒト野生型ＲＯＮおよびデルタ１６０ＲＯＮ変異体に対する抗体２９Ｂ０６と０７Ｆ０１による結合を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）を用い、４℃で測定した。ヒト野生型ＲＯＮを発現するＰＣ３細胞、およびデルタ１６０変異体を発現するＨＴ２９細胞は、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＢＳＡを有するＰＢＳ）により２回洗浄し、Ｃｙｔｏ Ｑ Ａｎｔｉｂｏｄｙ希釈液およびＦＣ受容体ブロック（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）により１０分間処理した。精製抗体を、０．０２ｎＭから４０ｎＭの濃度範囲にわたり、ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した。細胞を、１００μｌの抗体で１時間インキュベイションし、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に、４５分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００ ＦＡＣＳ計測器を用いて分析した。結果は表７に要約する。

表７の結果は、抗体２９Ｂ０６と０７Ｆ０１が、野生型ＲＯＮとデルタ１６０ＲＯＮ変異体の双方に、細胞表面上、同様の親和性で結合することを示している。

実施例６：細胞表面結合
抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および２９Ｂ０６に関して、ＦＡＣＳを用い、細胞表面野生型ＲＯＮおよびデルタ１６０ＲＯＮに対する４℃における結合を、測定した。細胞解離用緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、野生型ＲＯＮを発現する細胞（ＰＣ３）およびデルタ１６０ＲＯＮを発現する細胞（ＨＴ−２９）を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ ＰＢＳ）により２回洗浄し、ＣｙｔｏＱ Ａｎｔｉｂｏｄｙ希釈液およびＦＣ受容体ブロック（Ｉｎｎｏｖｅｘ）により処理した。精製抗体を、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した。細胞を、１００μｌの抗体混合物と共に１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４５分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄し、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００ ＦＡＣＳ計測器を用いて分析した。マウスＩｇＧ対照と比較した結合パーセントを表８に要約する。

表８の結果は、抗体０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および１２Ｂ１１が、細胞表面上発現した野生型ＲＯＮとデルタ１６０ＲＯＮ変異体の双方に結合することを示している。

実施例７：受容体インターナリゼーション
ＦＡＣＳを用いて、抗体刺激受容体インターナリゼーションを測定した。野生型ＲＯＮ受容体の抗体刺激インターナリゼーションを測定するために、ＰＣ３細胞を用いた。デルタ１６０ＲＯＮ受容体変異体に関しては、ＨＴ−２９細胞を用いた。抗体を先ず、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｃｅｒｔｈｒｉｎ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、カタログ番号ＰＪ３１Ｋ）に結合した。細胞は全てＰＢＳで洗浄し、ＣｙｔｏＱ Ａｎｔｉｂｏｄｙ希釈液およびＦＣ受容体ブロック（Ｉｎｎｏｖｅｘ）によって処理した。細胞を抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃または４℃で２時間インキュベートした。細胞を４℃に移し、酸性溶液（０．５ＭのＮａＣｌ、０．１８Ｍの酢酸、０．５％のアジ化ナトリウム）で洗浄して細胞表面に残留している抗体を除去し、ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５０２８）を用いて固定し、インターナリゼーションによって細胞内に保持された抗体を測定した。３７℃で細胞は抗体媒介受容体インターナリゼーションを受けることができるが、この過程は４℃の低温で阻害されるため、ベースライン（インターナリゼーション無し）として役立つ。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００ ＦＡＣＳ計測器を用いて、細胞を分析した。３７℃で得られたものと比較した４℃での抗ＲＯＮ蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の低下および棒グラフの左方シフトにより、抗体誘導受容体インターナリゼーションが示される。３７℃でのＭＦＩから４℃でのＭＦＩを差し引くことにより、受容体インターナリゼーションを定量化した。結果は表９に要約する。

これらの結果は、野生型ＲＯＮを発現するＰＣ−３細胞において、抗体２９Ｂ０６、０７Ｆ０１および１２Ｂ１１が、受容体インターナリゼーションを誘導することを示している。デルタ１６０ ＲＯＮ変異体を発現するＨＴ−２９細胞においては、０７Ｆ０１と１２Ｂ１１のみが受容体インターナリゼーションを誘導する。

実施例８：ＭＳＰ−ＲＯＮ結合の阻害
抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および２９Ｂ０６を、実施例３に記載した電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイにより測定した際の、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するＭＳＰ結合の阻害に関して試験した。抗体（濃度範囲：０．００６〜１０μｇ／ｍＬ）を、室温で４５分間インキュベートした。

ＭＳＰ−ｈＲＯＮ結合相互作用は、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、および２９Ｂ０６によって阻害されたが、抗体１７Ｆ０６および１２Ｂ１１によっては阻害されなかった（図６）。抗体（ＩｇＧ１）に関するＩＣ_５０および最大阻害パーセント値は表１０に示す。

表１０の結果により、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、および２９Ｂ０６は、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するＭＳＰ結合をブロックするが、抗体１２Ｂ１１および１７Ｆ０６はブロックしないことが示される。

実施例９：抗ＲＯＮ抗体による下流シグナル伝達の阻害
実施例３に記載した細胞ベースのアッセイを用いて、ＲＯＮ下流シグナル伝達分子であるＥＲＫのＭＳＰ依存性リン酸化の阻害に関して、抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および２９Ｂ０６を試験した。ＲＰＭＩ中の抗体（濃度範囲：０．００６〜１０μｇ／ｍＬ）を細胞に加え、３７℃で１時間インキュベートした。

抗体０７Ｆ０１、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、１８Ｈ０９、および２９Ｂ０６によるＥＲＫリン酸化の用量依存性阻害を表１１および図７に示す。

表１１および図７の結果により、抗体１２Ｂ１１および１７Ｆ０６はＲＯＮに対するＭＳＰ結合を効果的にはブロックしないが、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１および１７Ｆ０６は、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞系におけるＭＳＰ誘導ＥＲＫリン酸化を阻害することが示されている（実施例３および実施例８を参照）。

実施例１０：ＭＳＰ依存性細胞移動の阻害
ＭＳＰ依存性細胞移動の阻害に関して、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１および１７Ｆ０６を試験した。ＨＰＡＦ−ＩＩ膵癌細胞（ＡＴＣＣ）を、低血清条件（１％のＦＢＳ、ＭＥＭ）下、一晩インキュベートした。細胞をトリプシン化し、カウントし、ＢＤ ９６ウェルＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（商標）プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の上部チャンバ内に、４５μｌの１％のＦＢＳ／ＭＥＭ中、５０，０００／ウェルの濃度で入れた。抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で加え、細胞を２時間インキュベートした。下部チャンバは、１％のＦＢＳ ＭＥＭ（２００μｌ）および１ｎＭのＭＳＰを含有し、細胞は２４時間インキュベートした。下部チャンバに４μｇ／ｍｌの最終濃度でＣａｌｃｉｅｎ Ｄｙｅを加え、引き続き、１時間インキュベートすることにより移動細胞数を測定した。蛍光強度は、Ｗａｌｌａｃｅ １４２０機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。ベースラインの蛍光測定は、ＭＳＰの非存在下で行った。阻害パーセントは、以下の式を用い、ベースラインに対する抗体処理サンプルと抗体非処理のサンプルを比較することにより測定した：１００−（抗ＲＯＮ抗体処理−ベースライン）／（対照ｈｕＩｇＧ処理−ベースライン）^＊１００。抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１、および１７Ｆ０６によるＭＳＰ誘導ＨＰＡＦＩＩ細胞移動の阻害に関する結果は、表１２および図８に要約する。

表１２の結果から、たとえ１２Ｂ１１および１７Ｆ０６は、ＲＯＮに対するＭＳＰの結合を有効にはブロックしないものの、抗体０７Ｆ０１、１８Ｈ０９、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１および１７Ｆ０６が、ＨＰＡＦ−ＩＩの膵癌細胞系におけるＭＳＰ依存細胞移動を阻害することが示されている。

実施例１１：野生型ＲＯＮ依存性腫瘍モデルの成長抑制
野生型ＲＯＮ駆動腫瘍成長の定方向相補性モデルにおいて、腫瘍成長の抑制を試験した。Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの米国特許第７，５５６，７９６号明細書に記載されたとおり「定方向相補性」腫瘍を得た。野生型ヒトＲＯＮをコードするｃＤＮＡを、レトロウィルス移入によってＢＨ３腫瘍細胞に導入した。次に、トランスフェクトした腫瘍細胞をレシピエントマウスに皮下移植した。ＢＨ３腫瘍の増殖は、誘導されなかった誘導性ＨＥＲ２遺伝子の発現に依存した。したがって、ＲＯＮ遺伝子が、非誘導ＨＥＲ２遺伝子を機能的に相補した場合のみ、腫瘍は成長すると考えられる。定方向相補性腫瘍の成長が見られた。薬効試験用に十分な腫瘍材料を作り出すために原発腫瘍をインビボ増殖させた。定方向相補性腫瘍に関する品質管理には、ＲＯＮ発現用にＲＴ−ＰＣＲ、およびタンパク質発現用に免疫組織化学（ＩＨＣ）が含まれた。腫瘍は、約１．５×１０^５個細胞／バイアルの凍結保存アリコートとして貯蔵した。これらの腫瘍を解凍し、一度洗浄し、ＨＢＳ＋マトリゲル中に再懸濁し、皮下注射した。腫瘍は、ノギスを用いて週２回測定した。腫瘍容積は、式：幅×幅×長さ／２を用いて算出した。腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したら、マウスを、各々１０匹の５群に無作為化した。各群（各々１０匹のマウス）は、全て２０ｍｇ／ｋｇで以下の抗体：０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１、もしくは１８Ｈ０９、またはマウスＩｇＧ対照のうち、１つの処置を受けた。処置は、週２回で２週間腹腔内注射により投与した。抗体２９Ｂ０６と０７Ｆ０１は、５０％超の腫瘍成長抑制（「ＴＧＩ」）を生じた（Ｐ＜０．００１）が、抗体１８Ｈ０９と１２Ｂ１１は、それぞれ２５％と２９％のＴＧＩを示した（図９）。全ての処置で、有意な体重減少がなく、耐容性は良好であった。

２９Ｂ０６と０７Ｆ０１の処置後のＲＯＮ受容体レベルにおける薬力学的変化を評価した。腫瘍を、２０ｍｇ／ｋｇの以下の抗体：ｍＩｇＧ（対照）、２９Ｂ０６または０７Ｆ０１で処置し、２４時間目または４８時間目で採取した。採取後、腫瘍を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４６９３１５９００１）およびホスファターゼ阻害剤ＩならびにＩＩ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ２３５０およびＰ５７２６）を含有する標準ＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＰ−１１５）中に溶解した。溶解液を澄明にし、タンパク質濃度を測定した。総ＲＯＮに関するウェスタンブロットは、ポリクローナル坑ＲＯＮ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−３２２）を用いて実施した。ウェスタンブロット解析により、ＲＯＮ−ＤＣ異種移植片における抗体２９Ｂ０６が、２４時間目に受容体インビボ分解を誘導し、４８時間目にその程度がより高くなることを示した。

実施例１２：デルタ１６０ ＲＯＮ駆動腫瘍モデルの成長抑制
デルタ１６０ ＲＯＮ駆動腫瘍成長の定方向相補性モデルにおいて抗体による腫瘍成長抑制を試験した。モデルは、トランスフェクトしたｃＤＮＡがＲＯＮのヒトデルタ１６０（発癌性）形態をコードしたこと以外、実施例１１に記載されたとおりに得た。定方向相補性腫瘍の成長が見られた。薬効試験用に十分な腫瘍材料を作り出すために原発腫瘍をインビボ成長させた。定方向相補性腫瘍に関する品質管理としては、ＲＯＮ発現用にＲＴ−ＰＣＲおよびタンパク質発現用にＩＨＣが含まれた。腫瘍は、約１．５×１０^５個細胞／バイアルの凍結保存アリコートとして貯蔵した。これらの腫瘍を解凍し、一度洗浄し、ＨＢＳプラスマトリゲル中に再懸濁し、皮下注射した。腫瘍は、週２回測定した。腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したら、マウスを、各々１０匹の５群に無作為化した。各群（各々１０匹のマウス）は、全て２０ｍｇ／ｋｇで以下の抗体：マウスＩｇＧ対照、０７Ｆ０１、２９Ｂ０６、１２Ｂ１１、１７Ｆ０６、および１８Ｈ０９のうち、１つの処置を受けた。処置は、週２回で２週間腹腔内注射により投与した。図１０に示すように、各処置群は、１８Ｈ０９（ＴＧＩ５４％）を除き６０％（ｐ＜０．００１）超の同様な腫瘍成長抑制を示した。全ての処置で有意な体重減少がなく、耐容性は良好であった。

実施例１３：ＮＣＩ−Ｈ３５８の肺異種移植腫瘍モデルの成長抑制
ＮＣＩ−Ｈ３５８の肺異種移植腫瘍モデルにおいて２９Ｂ０６抗体による腫瘍成長抑制を試験した。１０％ＦＢＳを含有するＲＭＰＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５％ＣＯ_２を含有する大気中、３７℃の培養でＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を増殖させた。細胞を８週齢のメスＣＢ．１７ＳＣＩＤマウスの側腹部内に、５０％マトリゲル中マウス１匹当たり５×１０^６個の細胞で皮下接種した。腫瘍の測定を週２回行った。腫瘍が約１５０ｍｍ^３に達したら、マウスを、各々１０匹の２群に無作為化した。各群は、以下の処置：４０ｍｇ／ｋｇでマウスＩｇＧ対照または２９Ｂ０６のうちの１つを受けた。処置は、週３回で３週間、腹腔内注射により投与した。抗体２９Ｂ０６の処置により７０％（ｐ＜０．００１）の腫瘍成長抑制を生じた（図１１）。処置では有意な体重減少がなく、耐容性は良好であった。

実施例１４：坑ＲＯＮ抗体のヒト化
Ａ．ヒト化坑ＲＯＮ抗体およびキメラ坑ＲＯＮ抗体の構築
本実施例では、０７Ｆ０１および２９Ｂ０６と称される２種のマウス抗体のヒト化、および得られたヒト化抗体の特性化を記載する。ヒト化坑ＲＯＮ抗体は、ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）法（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｒａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）およびＨｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ら（２００５）ＭＥＴＨＯＤＳ ３６：３５−４２）、復帰変異によるＣＤＲ移植法（ヒトフレームワーク残基のいくつかを、マウス残基に変換した）（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，６９３，７６１号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第６，１８０，３７０号明細書；米国特許第７，０２２，５００号明細書を参照）、またはＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標）法（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９４ Ｊｕｎ；７（６）：８０５−１４；また例えば、ＰＣＴ国際公開第９３／１１７９４号パンフレットおよび米国特許第５，７６６，８８６号明細書；米国特許第５，７７０，１９６号明細書；米国特許第５，８２１，１２３号明細書；および米国特許第５，８６９，６１９号明細書を参照）を用いてデザインした。重鎖ＣＤＲ１を除いて、ヒトフレームワーク（ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）上へのＣＤＲ移植および復帰変異によるＣＤＲ移植はＫａｂａｔのＣＤＲ定義を用いた。いくつかの場合において、重鎖ＣＤＲ１を移植するためにＫａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせを用いた。いくつかの場合において、ヒト性を増加させるために、ＣＤＲ残基（Ｋａｂａｔ定義またはＣｈｏｔｈｉａ定義）をヒト残基に変換した。マウス抗体のモデルは、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬウェブ・サーバ（ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を用いて作製した。予測残基の接触は、Ｃｏｎｔａｃｔ Ｍａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓウェブ・サーバ（ｌｉｇｉｎ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｃｍａ／）を用いて測定し、残基表面へのアクセス可能性は、Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅウェブ・サーバ（ｓｗｉｆｔ．ｃｍｂｉ．ｒｕ．ｎｌ／ｓｅｒｖｅｒｓ／ｈｔｍｌ／ａｃｃｅｓｓｒｅｓ．ｈｔｍｌ）を用いて測定した。残基表面へのアクセス可能性、ＣＤＲ残基との接触、および重鎖と軽鎖の間の界面における関与予測に基づいた復帰変異に関して残基を選択した。さらに、０７Ｆ０１の重鎖ＣＤＲ３に存在するシステイン残基は、凝集の可能性を防ぐためにセリンに変換し、いくつかの実施例において、０７Ｆ０１重ＣＤＲ２（例えば、Ｎ５８、Ｙ５９、Ｔ６０）における予測されたＮ−結合グリコシル化コンセンサス部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）は、グリコシル化の可能性を防ぐために変異させた（例えば、Ｔ６０Ａ）。デザインされたアミノ酸配列は、コドン最適化ＤＮＡ配列に変換し、５’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ヒトアミノ末端シグナル配列、ヒト化可変領域、ヒトＩｇＧ１またはカッパ定常領域、停止コドン、および３’ＥｃｏＲＩ制限部位の順序で、これらを含むようにＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．により合成された。

本明細書に記載されているＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）法に従ってヒト化された抗ＲＯＮ抗体鎖は、抗体鎖名の前に接頭語「Ｓｈ」を付けて称される。本明細書に記載されている復帰変異によるＣＤＲ移植法によってヒト化された抗ＲＯＮ抗体鎖は、抗体鎖名の前に接頭語「Ｈｕ」を付けて称される。本明細書に記載されているＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標）法によってヒト化された抗ＲＯＮ抗体鎖は、抗体鎖名の前に接頭語「ＨＥ」を付けて称される。

抗ＲＯＮ抗体重鎖０７Ｆ０１は、ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）法に従ってヒト化した。ヒト生殖細胞系配列ＩＧＨＶ３−４８^＊０１（本明細書においてＨｖ３−４８とも称される）を、ヒト重鎖フレームワークとして選択した。いくつかの実施形態において、ヒトＨｖ３−４８重鎖フレームワーク配列を、アミノ酸位置２８（例えば、Ｄ２８Ｔ）で変異せた。アミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づいている。

抗ＲＯＮ抗体軽鎖０７Ｆ０１は、ＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商法）法に従ってヒト化した。ヒト生殖細胞系配列ＩＧＫＶ１−９^＊０１を、ヒト軽鎖フレームワークとして選択した。

抗ＲＯＮ抗体重鎖２９Ｂ０６は、復帰変異によるＣＤＲ移植法によってヒト化した。ヒト生殖細胞系配列ＩＧＨＶ４−５９^＊０１（本明細書においてＨｖ４−５９とも称される）を、ヒトフレームワークとして選択した。ヒトフレームワークは、ＫａｂａｔのＣＤＲ定義が使用された場合のマウス配列に対してアミノ酸位置２７、３０、３９、４４、４７、４８、６７、７１、および７８に復帰変異させた。復帰変異させたヒトＨｖ４−５９フレームワーク配列はさらに変異させ、２７、３０、４８、６７、および７８の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含ませた。復帰変異させたＨｖ４−５９ フレームワーク配列におけるアミノ酸置換（例えば、マウス残基からヒト残基へのアミノ酸置換、例えば、ＩＧＨＶ４−５９に見られるヒト残基）は、Ｄ２７Ｇ、Ｔ３０Ｓ、Ｍ４８Ｉ、Ｉ６７ＶおよびＹ７８Ｆからなる群から選択することができる。アミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づいている。

抗ＲＯＮ抗体軽鎖２９Ｂ０６は、ＳＵＰＥＲＨＵＭＡＮＩＺＡＴＩＯＮ（商標）法に従ってヒト化した。ヒト生殖細胞系配列ＩＧＫＶ２−２８^＊０１を、ヒト軽鎖フレームワークとして選択された。

キメラ（マウス可変領域とヒト定常領域）０７Ｆ０１および２９Ｂ０６重（ヒトＩｇＧ１）および軽（ヒトカッパ）鎖もまた構築した。０７Ｆ０１の重鎖ＣＤＲ３に存在するシステイン残基は、凝集の可能性を防ぐためにセリンに変換させた。キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域は、重複拡大ＰＣＲを用いてヒト定常領域に融合させ、５’ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列、アミノ末端シグナル配列、マウス可変領域、ヒトＩｇＧ１またはカッパ定常領域、停止コドン、および３’ＥｃｏＲＩ制限部位の順序でこれらを含めた。

Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用い、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を介してヒト化重鎖ならびにキメラ重鎖をｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内にサブクローニングした。ヒト化カッパ軽鎖ならびにキメラカッパ軽鎖を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（商標）ＰＣＲクローニングを用い、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を介してｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ）内にサブクローニングした。

抗体を産生させるために、ヒト化抗体鎖またはキメラ抗体鎖を２９３Ｔ細胞内に一時的にトランスフェクトした。抗体は、精製するかまたは引き続くインビトロ分析用に細胞培養培地の上澄液中に用いた。ヒトＲＯＮに対するキメラ抗体ならびにヒト化抗体の結合を、下記のとおり測定した。結果は、表２０に要約する。

さらに、大量の精製ヒト化抗体産生させるために、ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）を用い、いくつかのヒト化抗体重鎖と軽鎖の組み合わせをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞中で安定に発現させた。ｐＥＥ６．４ベースおよびｐＥＥ１４．４ベースのベクターを組み合わせることにより単一の発現ベクターを構築した。第一に、完全長ヒト化重鎖ｃＤＮＡを含有するｐＥＥ６．４を、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモータ＋完全長ヒト化重鎖ｃＤＮＡ＋ＳＶ４０ポリＡ断片を単離した。この断片を、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ部位を介して、完全長ヒト化軽鎖ｃＤＮＡを既に含有するｐＥＥ１４．４ベクター内に挿入することによって、重鎖と軽鎖を同時に発現する発現ベクターを作り出した。重鎖と軽鎖の組み合わせベクターを直線化し、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞内にトランスフェクトした。メチオニンスルホキシミンの存在下で安定なクローンを選択した。

ヒト化０７Ｆ０１の免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の可能な各組み合わせを各々、下表１３に記載する。

ヒト化２９Ｂ０６の免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域の可能な各組み合わせを各々、下表１４に示す。

ヒト化０７Ｆ０１抗体と２９Ｂ０６抗体の可変領域をコードする核酸配列およびそれらの可変領域を規定するタンパク質配列は、下記に要約した（アミノ末端シグナルペプチド配列は示していない）。ＣＤＲ３中のシステインがセリンに変換されている修飾キメラ０７Ｆ０１重可変領域の配列もまた、下記に要約する。ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔの定義）は、太字で示し、アミノ酸配列中に下線が引かれている。

キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１３２）

キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１３３）

Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１３４）

Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１３５）

Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１３６）

Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１３７）

ＨＥ＿Ｌ ０７Ｆ０１＿Ｋｖ１−９カッパ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１３８）

ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１３９）

ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１カッパ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１４０）

ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１カッパ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１４１）

Ｓｈ２９Ｂ０６＿Ｈｖ４−５９重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１４２）

Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１４３）

Ｈｕ２９Ｂ０６＿Ｈｖ４−５９重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１４４）

Ｈｕ２９Ｂ０６＿Ｈｖ４−５９重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１４５）

Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１４６）

Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ重鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１４７）

Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号１４８）

Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ鎖可変領域を規定するタンパク質配列（配列番号１４９）

実施例１４で作製された抗体に関する免疫グロブリン重鎖可変領域を規定するアミノ酸配列は、図１２Ａおよび１２Ｂにアラインメントされている。アミノ末端シグナルペプチド配列（適切な発現／分泌に関する）は示していない。ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３（Ｋａｂａｔの定義）は、枠により識別されている。図１３Ａおよび図１３Ｂは、それぞれ図１２Ａおよび図１２Ｂに示されている可変領域配列の各々に関する個別のＣＤＲ_１配列、ＣＤＲ_２配列、およびＣＤＲ_３配列のアラインメントを示す。

実施例１４における抗体に関する免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列は、図１４Ａおよび図１４Ｂにアラインメントされている。アミノ末端シグナルペプチド配列（適切な発現／分泌に関する）は示していない。ＣＤＲ_１、ＣＤＲ_２、およびＣＤＲ_３は、枠により識別されている。図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ図１４Ａおよび図１４Ｂに示されている可変領域配列の各々に関する個別のＣＤＲ_１配列、ＣＤＲ_２配列、およびＣＤＲ_３配列のアラインメントを示す。

表１５は、本実施例に検討された各配列の配列番号を示す項目索引チャートである。

ヒト化モノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＩＭＧＴの定義）を、表１６に示す。

ヒト化モノクローナル抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義およびＩＭＧＴの定義）を、表１７に示す。

完全キメラ抗体およびヒト化重鎖またはカッパ鎖抗体の配列を作製するために、上記の各可変配列を、それぞれのそのヒト定常領域と組み合わせる。例えば、完全重鎖は、重可変配列に次いでヒトＩｇＧ１重鎖定常配列を含む。完全カッパ鎖は、カッパ可変配列に次いでヒトカッパ軽鎖定常配列を含む。

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする核酸配列（配列番号１５０）

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を規定するタンパク質配列（配列番号１５１）

ヒトカッパ軽鎖定常領域をコードする核酸配列（キメラ抗体に使用される）（配列番号１５２）

ヒトカッパ軽鎖定常領域をコードする核酸配列（ヒト化抗体に使用される）（配列番号１５３）

ヒトカッパ軽鎖定常領域を規定するタンパク質配列（キメラ抗体およびヒト化抗体に使用される）（配列番号１５４）

以下の配列は、本実施例に記載された抗体各々に関する実際の、または想定された完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列（すななわち、可変領域配列と定常領域の双方を含有する）を表す。本明細書に開示された完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列には、抗体の適切な分泌に関するシグナル配列（例えば、ＤＮＡ配列の５’端またはタンパク質配列のアミノ末端でのシグナル配列）は示しておらず、また最終分泌タンパク質にも含まれていない。ＤＮＡ配列の３’端に必要な翻訳終了のための停止コドンもまた示されていない。開示された完全長ＩｇＧの重鎖配列および軽鎖配列の発現のためにシグナル配列および／または停止コドンを選択することは、当該技術分野の通常の技法の範囲内にある。活性の完全長ＩｇＧの重鎖および軽鎖を作製するために、可変領域配列が、他の定常領域配列に結合し得ることもまた想定されている。

完全長キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ重鎖をコードする核酸配列（マウス重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１５５）

完全長キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ重鎖を規定するタンパク質配列（マウス重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１５６）

完全長キメラ０７Ｆ０１軽鎖をコードする核酸配列（マウスカッパ鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域）（配列番号１５７）

完全長キメラ０７Ｆ０１軽鎖を規定するタンパク質配列（マウスカッパ鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域）（配列番号１５８）

完全長キメラ２９Ｂ０６重鎖をコードする核酸配列（マウス重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１５９）

完全長キメラ２９Ｂ０６重鎖を規定するタンパク質配列（マウス重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１６０）

完全長キメラ２９Ｂ０６軽鎖をコードする核酸配列（マウスカッパ鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域）（配列番号１６１）

完全長キメラ２９Ｂ０６軽鎖を規定するタンパク質配列（マウスカッパ鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域）（配列番号１６２）

完全長ヒト化Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８重鎖をコードする核酸配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１６３）

完全長ヒト化Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８重鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１６４）

完全長ヒト化Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ重鎖をコードする核酸配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１６５）

完全長ヒト化Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ重鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１６６）

完全長ヒト化ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９軽鎖をコードする核酸配列（ヒト化カッパ鎖可変領域およびヒト定常領域）（配列番号１６７）

完全長ヒト化ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９軽鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化カッパ鎖可変領域およびヒト定常領域）（配列番号１６８）

完全長ヒト化ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１軽鎖をコードする核酸配列（ヒト化カッパ鎖可変領域およびヒト定常領域）（配列番号１６９）

完全長ヒト化ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１軽鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化カッパ鎖可変領域およびヒト定常領域）（配列番号１７０）

完全長ヒト化Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９重鎖をコードする核酸配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１７１）

完全長ヒト化Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９重鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１７２）

完全長ヒト化Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９重鎖をコードする核酸配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１７３）

完全長ヒト化Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９重鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１７４）

完全長ヒト化Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ重鎖をコードする核酸配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１７５）

完全長ヒト化Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ重鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１７６）

完全長ヒト化Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８軽鎖をコードする核酸配列（ヒト化カッパ鎖可変領域およびヒト定常領域）（配列番号１７７）

完全長ヒト化Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８軽鎖を規定するタンパク質配列（ヒト化カッパ鎖可変領域およびヒト定常領域）（配列番号１７８）

表１８は、便宜上、本実施例で検討された各配列の配列番号を示す項目索引チャートを提供している。

下表１９は、キメラ免疫グロブリンの重鎖ならびに軽鎖、および完全長キメラまたはヒト化免疫グロブリンの重鎖ならびに軽鎖の各々可能な組み合わせを含有する抗体を示している。

完全長キメラの重鎖ならびに軽鎖を含有する抗体構築物は、下記に指定されている：
キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ＝完全長キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ重鎖（Ｃ１０２Ｓ変異によるマウス可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１５６）プラス完全長キメラ０７Ｆ０１軽鎖（マウス可変領域およびヒトカッパ定常領域）（配列番号１５８）
キメラ２９Ｂ０６＝完全長キメラ２９Ｂ０６重鎖（マウス可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域）（配列番号１６０）プラス完全長キメラ２９Ｂ０６軽鎖（マウス可変領域およびヒトカッパ定常領域）（配列番号１６２）

ヒト化可変領域を含有する完全長免疫グロブリンの重鎖ならびに軽鎖を含む可能な抗体構築物のうちの２つは、下記に指定されている：
Ｓｈ０７Ｆ０１−６２＝ヒト化Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１６６）プラスＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域（配列番号１６８）
Ｓｈ２９Ｂ０６−７８＝ヒト化Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１７６）プラスＳｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８軽鎖可変領域およびヒトカッパ定常領域（配列番号１７８）

Ｂ．ヒト化およびキメラの抗ＲＯＮモノクローナル抗体の結合親和性
組換えヒトＲＯＮ ＳＥＭＡドメインおよびＰＳＩドメイン（ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に対する、実施例１４で作製されたモノクローナル抗体の相互作用に関する結合親和性および動力学は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）計測器を用い、表面プラズモン共鳴により測定した。

ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を、供給業者の取扱説明書に従い標準的カップリングプロトコルを用いるアミンカップリング（Ｂｉａｃｏｒｅ）により、カルボキシメチル化デキストランＣＭ４センサチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定化した。分析は、移動用緩衝液として０．０５％の界面活性剤Ｐ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ）を含有するＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で実施した。

抗体は、６０μｌ／分の流量で個々のフローセル中に捕捉した。注入時間は、各抗体に関して変え、３０ＲＵと６０ＲＵとの間のＲ_ｍａｘを生じさせた。緩衝液または移動用緩衝液中で希釈したｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩを、参照表面（捕捉抗体なし）と活性表面（試験抗体）上に６０μｌ／分で３００秒間、連続的に注入した。解離相を、１２００秒までモニターした。次いで表面は、６０μｌ／分でグリシンｐＨ２．２５（グリシンｐＨ２．０（Ｂｉａｃｏｒｅ）とグリシンｐＨ２．５（Ｂｉａｃｏｒｅ）から作製）の２回の６０秒注入により再生した。最初のスクリーニングに関しては、ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩを、１種のみまたは２種の濃度、典型的には１０．０ｎＭと２．５ｎＭとで試験した（結果は表２０に要約する）。

動力学的パラメータは、二重参照減算によるＢＩＡ評価ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）の動力学的関数を用いて決定した。各抗体に関する動力学的パラメータ、ｋ_ａ（結合速度定数）、ｋ_ｄ（解離速度定数）およびＫ_Ｄ（平衡解離定数）を決定した。分泌抗体を含有する細胞培養培地の上澄液を用いて一定のモノクローナル抗体をスクリーニングし、３７℃におけるｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩ上でのモノクローナル抗体の動力学的値を、表２０に要約する。

表２０の結果により、Ｓｈ２９Ｂ０６−２５を除いたキメラ抗体および各ヒト化抗体は、速い結合速度（ｋ_ａ）、極めて遅い解離速度（ｋ_ｄ）および極めて高い親和性（Ｋ_Ｄ）を有することが示されている。特に抗体は、約２６０ｐＭから約１．１ｎＭの範囲の親和性を有する。Ｓｈ２９Ｂ０６−２５では結合が見られなかった。なぜならば、Ｓｈ２９Ｂ０６−２５は、ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに結合しないが、Ｓｈ２９Ｂ０６−２３は結合するからであり、Ｓｈ２９Ｂ０６−２３の重鎖に存在する１つ以上の復帰変異が、高親和性を有する結合には必要とされるようである。

一定の精製モノクローナル抗体の結合親和性および動力学もまた測定した。一定の抗体をさらに特性化するために、上記の表面プラズモン共鳴実験を、ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩの０．３１２５ｎＭと１０．０ｎＭ（２倍連続希釈）との間の濃度を用いて実施した。

ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩ上での一定の精製モノクローナル抗体（すなわち、Ｓｈ０７Ｆ０１−６２およびＳｈ２９Ｂ０６−７８）の２５℃および３７℃における動力学値を、表２１に要約する。

表２１における結果により、精製抗体は、２５℃で試験した場合の約５２ｐＭから３６０ｐＭの範囲の親和性または３７℃で試験した場合の約１１０ｐＭから約８６０ｐＭの範囲の親和性を有することが示されている。

抗体０７Ｆ０１、Ｓｈ０７Ｆ０１−６２、２９Ｂ０６、およびＳｈ２９Ｂ０６−７８による細胞表面のヒト野生型ＲＯＮおよびデルタ１６０ＲＯＮ変異体に対する結合を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）を用いて、４°Ｃで測定した。ヒト野生型ＲＯＮを発現するＰＣ３細胞、およびデルタ１６０変異体を発現するＨＴ２９細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡを有するＰＢＳ）で２回洗浄し、ＣｙｔｏＱ Ａｎｔｉｂｏｄｙ希釈剤およびＦＣ受容体ブロック（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）により１０分間処理した。精製抗体を、０．０１ｎＭから２５ｎＭの濃度範囲にわたってＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した。細胞を、１００μｌの抗体と共に１時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＰＥ共役抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）またはロバ抗ヒトＰＥ共役抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に４５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００ＦＡＣＳ計測器を用いて分析した。４種の抗体全てを、同一の実験で比較した。結果を表２２に要約する。

表２２の結果により、ヒト化抗体Ｓｈ０７Ｆ０１−６２およびＳｈ２９Ｂ０６−７８が、マウス抗体対応物（すなわち、それぞれ０７Ｆ０１および２９Ｂ０６）と等価な親和性で細胞表面上に野生型ＲＯＮおよびデルタ１６０ ＲＯＮ変異体の双方に結合する能力を保持することが示されている。

Ｃ．他の抗ＲＯＮ抗体の比較
公開情報を用いて、ヒトＲＯＮの機能を阻害する３種の抗体を構築し、発現させた。１Ｐ３Ｂ２−ＢＩＩＢ Ａｂと称される抗体の１種は、Ｈｕｅｔらの米国特許出願公開第２００９／０２２６４４２号明細書（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｉｎｃ．）の開示に基づいて構築した。ＲＯＮ６およびＲＯＮ８と称される２種のさらなる抗体は、Ｐｅｒｅｉｒａらの米国特許出願公開第２００９／０１３６５１０号明細書（Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）の開示に基づいて構築した。

ｒｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩ上の１Ｐ３Ｂ２−ＢＩＩＢ Ａｂ、ＲＯＮ６、およびＲＯＮ８抗体に関する２５℃および３７℃における動力学的パラメータは、上記のとおり、Ｂｉａｃｏｒｅにより決定した（Ｂ節．ヒト化およびキメラ抗ＲＯＮモノクローナル抗体の結合親和性を参照）。各抗体に関する動力学的値は表２３に要約する。

表２３の結果は、Ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびＳｈ０７Ｆ０１−６２に関する全体的平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が、２５℃および３７℃の双方で１Ｐ３Ｂ２−ＢＩＩＢ、ＲＯＮ６、およびＲＯＮ８に関するＫ_Ｄよりも小さかったこと（すなわち、より高い親和性）を示している。表２１および表２３を比較することにより、１Ｐ３Ｂ２−ＢＩＩＢ、ＲＯＮ６、およびＲＯＮ８抗体のＫ_Ｄを、他のヒト化２９Ｂ０６変異体または０７Ｆ０１変異体と比較することもできる。

したがって、本明細書に開示されるように、Ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびＳｈ０７Ｆ０１−６２の結合親和性は、１Ｐ３Ｂ２−ＢＩＩＢ、ＲＯＮ６、およびＲＯＮ８抗体の親和性よりも有意に高い。

実施例１５：ＭＳＰ−ＲＯＮの結合の阻害
実施例３に記載された電気化学的蛍光（ＥＣＬ）アッセイにより測定されたように、実施例１４で作製したキメラ抗体およびヒト化抗体を、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するＭＳＰ結合の阻害に関して試験した。抗体（濃度範囲：０．００６〜１０μｇ／ｍＬ）を、室温で４５分間インキュベートした。

ＭＳＰ−ｈＲＯＮ結合相互作用は、本アッセイで試験された表２４に記載されたキメラ抗体およびヒト化抗体により阻害された。抗体（ＩｇＧ１）に関するＩＣ_５０を、表２４に示す。

表２４の結果により、表２４に記載されたキメラ抗ＲＯＮ抗体およびヒト化抗ＲＯＮ抗体（すなわち、Ｓｈ２９Ｂ０６−１、Ｓｈ２９Ｂ０６−２３、Ｓｈ２９Ｂ０６−７８、Ｓｈ０７Ｆ０１−２、Ｓｈ０７Ｆ０１−４３、Ｓｈ０７Ｆ０１−６２、Ｓｈ０７Ｆ０１−６９、Ｓｈ０７Ｆ０１−７６、およびＳｈ０７Ｆ０１−８３）は、ｈＲＯＮ ＳＥＭＡ＋ＰＳＩに対するＭＳＰ結合を高い効力でブロックする能力を保持することが示されている。

実施例１６：抗ＲＯＮ抗体による下流シグナル伝達の阻害
実施例３に記載された細胞ベースのアッセイを用い、ＲＯＮ下流シグナル伝達分子であるＥＲＫのＭＳＰ誘導リン酸化を阻害する能力に関して、実施例１４で作製したキメラ抗ＲＯＮ抗体およびヒト化抗ＲＯＮ抗体を試験した。ＲＰＭＩ中の抗体（濃度範囲：０．００６〜１０μｇ／ｍＬ）を細胞に添加し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。本アッセイで試験されたキメラ抗ＲＯＮ抗体およびヒト化抗ＲＯＮ抗体によるＥＲＫリン酸化阻害のＩＣ５０値を、表２５に示す。

表２５の結果により、表２５に記載されたキメラ抗ＲＯＮ抗体およびヒト化抗ＲＯＮ抗体（すなわち、Ｓｈ２９Ｂ０６−１、Ｓｈ２９Ｂ０６−２３、Ｓｈ２９Ｂ０６−７８、Ｓｈ０７Ｆ０１−２、Ｓｈ０７Ｆ０１−４３、Ｓｈ０７Ｆ０１−６２、Ｓｈ０７Ｆ０１−６９、Ｓｈ０７Ｆ０１−７６、およびＳｈ０７Ｆ０１−８３）は、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞系におけるＭＳＰ誘導ＥＲＫリン酸化を高い効力で阻害することが示されている。

実施例１７：ＭＳＰ依存細胞移動の阻害
実施例１０に記載されたＭＳＰ誘導細胞移動を阻害する能力に関して、実施例１４で作製したヒト化抗体ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびｓｈ０７Ｆ０１−６２を試験した。本実施例において、抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、１：５希釈で連続希釈し、細胞を２時間インキュベートした。阻害パーセントは、以下の式：１００−（処理された抗ＲＯＮ抗体−ベースライン）／（処理された対照ｈｕＩｇＧ−ベースライン）^＊１００により決定した。ＭＳＰ誘導ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞移動の抗ＲＯＮ抗体、ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびｓｈ０７Ｆ０１−６２による阻害に関する結果は、表２６と図１６に要約する。

表２６の結果により、ヒト化抗ＲＯＮ抗体、ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびｓｈ０７Ｆ０１−６２は、ＨＰＡＦ−ＩＩ膵癌細胞系におけるＭＳＰ誘導細胞移動を強力に阻害することが示されている。

実施例１８：ＭＳＰ誘導細胞浸潤の阻害
ＭＳＰ誘導細胞浸潤を阻害する能力に関して、実施例１４で作製したヒト化抗体ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびｓｈ０７Ｆ０１−６２を試験した。ＨＰＡＦ−ＩＩ膵癌細胞をトリプシン処理し、カウントし、５０，０００／ウェルの濃度で９６ウェルのＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（商標）プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上部チャンバ内の４５μｌの１０％ＦＢＳ／ＭＥＭ中に入れた。３０μｇ／ｍｌの濃度で抗体を加え、細胞を２時間インキュベートした。下部チャンバは１０％ＦＢＳ ＭＥＭ（２００μｌ）および１ｎＭのＭＳＰを含み、細胞を２４時間インキュベートした。下部チャンバに４μｇ／ｍｌの最終濃度のＣａｌｃｉｅｎ色素を添加し、次いで１時間のインキュベーションにより、膜を通って浸潤を受けた細胞数を測定した。Ｗａｌｌａｃｅ １４２０計測器を用いて蛍光強度を測定した。ＭＳＰ誘導ＨＰＡＦＩＩ細胞侵入の抗ＲＯＮ抗体による阻害の結果を、図１７に要約する。

図１７の結果から、ヒト化抗ＲＯＮ抗体ｓｈ２９Ｂ０６−７８およびｓｈ０７Ｆ０１−６は、ＨＰＡＦ−ＩＩ膵癌細胞系におけるＭＳＰ依存細胞浸潤を強力に阻害することが示されている。

実施例１９：ＮＣＩ−Ｈ３５８肺異種移植腫瘍モデルの成長抑制
ＮＣＩ−Ｈ３５８肺異種移植腫瘍モデルにおいて、ヒト化抗ＲＯＮ抗体による腫瘍成長の抑制を試験した。５％ＣＯ_２を含有する大気中、１０％ＦＢＳを含有するＲＭＰＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃での培養によりＮＣＩ−Ｈ３５８細胞（ＡＴＣＣ）を増殖させた。８週齢のメスＣＢ．１７ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ）の側腹内に、５０％のマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中マウス１匹当たり５ｘ１０^６個の細胞で、細胞を皮下接種した。ノギスを用いて週２回、腫瘍の測定を行った。腫瘍が、約１５０ｍｍ^３に達したら、マウスを、各群１０匹の６群に無作為化した。各群は、以下の処置のうちの１つを受けた：ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）対照、ｍｕ２９Ｂ０６、ｓｈ２９Ｂ０６−７８、ｍｕ０７Ｆ０１、ｓｈ０７Ｆ０１−６２およびＲＯＮ８。処置は、１０ｍｇ／ｋｇで週２回７週間腹腔内注射により行われた。処置は、有意な体重減少がなく耐容性は良好であった。腫瘍成長の抑制は、ｈｕＩｇＧ対照に対する阻害パーセント（ベースラインを差し引く）として表し、統計解析は、ＡＮＯＶＡを用いて実施した。ＮＣＩ−Ｈ３５８モデルの４１日目における腫瘍成長の抑制に関する結果を、図１８と表２７に示す。

抗ＲＯＮ抗体処置により、ｈｕＩｇＧ対照と比較して腫瘍成長の抑制が生じた。具体的には、ｍｕ２９Ｂ０６抗体処置により８９％（Ｐ＜０．０１）の腫瘍成長の抑制が生じ；ｓｈ２９Ｂ０６−７８抗体処置により８９％（Ｐ＜０．０１）の腫瘍成長の抑制が生じ；ｍｕ０７Ｆ０１抗体処置により３４％（Ｐ＞０．０５）の腫瘍成長の抑制が生じ；ｓｈ０７Ｆ０１−６２抗体処置により３９％（Ｐ＞０．０５）の腫瘍成長の抑制が生じ；ＲＯＮ８抗体処置により３８％（Ｐ＞０．０５）の腫瘍成長の抑制が生じた。これらの結果から、ｓｈ２９Ｂ０６−７８抗体およびｍｕ２９Ｂ０６抗体は、ＮＣＩ−Ｈ３５８異種移植モデルにおける腫瘍の成長を抑制するが（Ｐ＜０．０１）、一方、ｍｕ０７Ｆ０１抗体、ｓｈ０７Ｆ０１−６２抗体、およびＲＯＮ８抗体は、このモデルにおいて腫瘍の成長を抑制しなかった（統計的に有意でないＰ＞０．０５）ことが示されている。

実施例２０：ＲＯＮ受容体の分解
処置終末におけるＲＯＮ受容体の総レベルを測定するために、ウエスタンブロットを実施した。各処置群から４つの腫瘍サンプルを秤量し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、 １ｍＭのＳｏｄｉｕｍ ＯｒｔｈｏＶａｎｄａｄａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）、１Ｘプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）および１ＸＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＩおよびＩＩ（Ｓｉｇｍａ）中に溶解した。サンプルを、手持形電気ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、氷上で１０分間インキュベートした。サンプルを、４℃、１１，０００ＲＰＭで３０分間遠心沈殿させた。上澄液を集め、タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイキットを用い、製造元のプロトコルに従って測定した。Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体を用いて総ＲＯＮタンパク質を検出した。β−チューブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ローディング対照としてブロットした。ウェスタンブロットは、１Ｘ ＴＢＳＴ（ＴＢＳ−０．１％ ＴＷＥＥＮ）（Ｓｉｇｍａ）中５％ミルクで１時間ブロックし、次いで双方の抗体に関して、一次抗体を１：１０００で５％のＢＳＡ １Ｘ ＴＢＳＴ中、４℃で一晩インキュベートした。ウェスタンブロットを１Ｘ ＴＢＳＴで３回洗浄し、抗ウサギＨＲＰ共役二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、室温で１時間インキュベートした。ウェスタンブロットを１Ｘ ＴＢＳＴで３回洗浄してから、Ｄｕｒａ Ｓｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて展開させた。

図１９の結果は、ｍｕ２９Ｂ０６ならびにｓｈ２９Ｂ０６−７８処理サンプル中のＲＯＮ受容体の分解、およびより低い程度でのｍｕ０７Ｆ０１ならびにｓｈ０７Ｆ０１−６２処理サンプル中のＲＯＮ受容体の分解を示している。ＲＯＮ８処理サンプル中にはＲＯＮ受容体の分解は見られなかった。

文献の援用
本明細書に引用された特許文書および科学論文の各々の開示全体が、全ての目的のために参照として援用されている。

等価体
本発明は、本発明の意図またはその本質的な特性から逸脱することなく他の具体的な形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、全ての点で本明細書に記載された発明を限定するものではなく例示であると考えるべきである。したがって本発明の範囲は、前述の説明ではなく添付の請求項によって示され、請求項と等価な意味と範囲に入る全ての変更は、請求項に包含されるように意図されている。

抗体は、ヒトＲＯＮの活性化（すなわち、中和）を防止または阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＲＯＮがそのリガンド、ＭＳＰに結合することを防ぎ、それによって、ＲＯＮ活性を中和する。一定の実施形態において、抗体は、ＭＳＰに対するＲＯＮの結合を阻害することなくＲＯＮ活性化を防ぐ。抗体は、乳癌細胞系Ｔ４７Ｄの下流シグナル伝達を阻害するために用いることができる。さらに、哺乳動物に投与した場合、抗体は、哺乳動物における腫瘍の成長を抑制または低減させることができる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトＲＯＮに結合する単離抗体であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４５（２９Ｂ０６）、配列番号５９（２９Ｂ０６）、および配列番号１２６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ
Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号４６（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、および配列番号４７（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ 、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号４８（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号４９（２９Ｂ０６）アミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号５０（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ 、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）（ｉ）配列番号５（０７Ｆ０１）、配列番号５１（０７Ｆ０１）および配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号６（０７Ｆ０１）および配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、配列番号７（０７Ｆ０１）および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ 、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号８（０７Ｆ０１）および配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１
Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号９（０７Ｆ０１）および配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号１０（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ 、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）（ｉ）配列番号１５（１２Ｂ１１）および配列番号５３（１２Ｂ１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号１６（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、および配列番号１７（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ 、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号１８（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号１９（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号２０（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ 、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｄ）（ｉ）配列番号２５（１７Ｆ０６）および配列番号５５（１７Ｆ０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号２６（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、および配列番号２７（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ 、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号２８（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号２９（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号３０（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ 、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｅ）（ｉ）配列番号３５（１８Ｈ０９）および配列番号５７（１８Ｈ０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号３６（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、および配列番号３７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ 、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
（ｉｉ）配列番号３８（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号３９（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号４０（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ 、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む単離抗体。
（項目２）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４５（２９Ｂ０６）および配列番号１２６（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９，Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号４６（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、および配列番号４７（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ を含み；
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４８（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号４９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号５０（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ を含む項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５（０７Ｆ０１）および配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ１ 、配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ２ 、および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｈ３ を含み；
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ１ 、配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ２ 、および配列番号１０（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ _Ｌ３ を含む項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記ＣＤＲ配列が、ヒト配列とヒト化フレームワーク配列との間に挿入されている項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５）
ヒト生殖系フレームワーク配列をさらに含む項目２に記載の抗体。
（項目６）
前記ヒト生殖系フレームワーク配列が、ＩＧＨＶ４−５９ ^＊ ０１である項目５に記載の抗体。
（項目７）
前記フレームワーク配列が、アミノ酸位置２７、３０、４８、６７または７８に少なくとも１つの置換を含み、前記アミノ酸のナンバリングがＫａｂａｔに基づく項目６に記載の抗体。
（項目８）
前記少なくとも１つの置換が、Ｄ２７Ｇ、Ｔ３０Ｓ、Ｍ４８Ｉ、Ｉ６７Ｖ、およびＹ７８Ｆからなる群から選択される項目７に記載の抗体。
（項目９）
前記抗体が、抗原結合性断片である項目１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１０）
項目１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目１１）
項目１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目１２）
項目１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目１３）
項目１１に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目１４）
項目１０に記載の核酸をさらに含む項目１３に記載の発現ベクター。
（項目１５）
項目１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１６）
項目１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１７）
項目１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１８）
項目１２に記載の発現ベクターをさらに含む項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１９）
免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現させるような条件下で項目１５または１６に記載の宿主細胞を増殖させることと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること、
を含む方法。
（項目２０）
ヒトＲＯＮに結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させるような条件下で項目１７または１８に記載の宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を作製することと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を精製すること、
を含む方法。
（項目２１）
ヒトＲＯＮに結合する単離抗体であって、
（ａ）配列番号４２（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４４（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１２（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１４（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２２（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号２４（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号３２（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号３４（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体。
（項目２２）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４２（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４４（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む項目２１に記載の抗体。
（項目２３）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９
Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）のアミノ酸配列を含む項目２１に記載の抗体。
（項目２４）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号２（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む項目２１に記載の抗体。
（項目２５）
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８
Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）のアミノ酸配列を含む項目２１に記載の抗体。
（項目２６）
項目２１に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目２７）
項目２１に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目２８）
項目３６に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目２９）
項目３７に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目３０）
項目３６に記載の核酸をさらに含む項目２９に記載の発現ベクター。
（項目３１）
項目２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３２）
項目２９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３３）
項目３０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目３４）
項目２８に記載の発現ベクターをさらに含む項目３２に記載の宿主細胞。
（項目３５）
免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現させるような条件下で項目３１または３２に記載の宿主細胞を増殖させることと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること、
を含む方法。
（項目３６）
ヒトＲＯＮに結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させるような条件下で項目３３または３４に記載の前記宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を作製することと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の前記抗原結合断片を精製すること、
を含む方法。
（項目３７）
ヒトＲＯＮに結合する単離抗体であって、
（ａ）配列番号１０９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１１１（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｂ）配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）配列番号９３（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号９５（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｄ）配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｅ）配列番号９７（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号９９（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｆ）配列番号１０１（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０３（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｇ）配列番号１０５（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖、
からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む単離抗体。
（項目３８）
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１０９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１１１（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む項目３７に記載の抗体。
（項目３９）
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号９３（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号９５（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む項目３７に記載の抗体。
（項目４０）
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）のアミノ酸配列を含む項目３７に記載の抗体。
（項目４１）
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）のアミノ酸配列を含む項目３７に記載の抗体。
（項目４２）
前記抗体が、抗原結合性断片である項目２１または３７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目４３）
項目３７に記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目４４）
項目３７に記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
（項目４５）
項目４３に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目４６）
項目４４に記載の核酸を含む発現ベクター。
（項目４７）
項目４３に記載の核酸をさらに含む項目４６に記載の発現ベクター。
（項目４８）
項目４５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目４９）
項目４６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目５０）
項目４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目５１）
項目４５に記載の発現ベクターをさらに含む項目４９に記載の宿主細胞。
（項目５２）
免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現させるような条件下で項目４８または４９に記載の前記宿主細胞を増殖させることと；
（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること、
を含む方法。
（項目５３）
ヒトＲＯＮに結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を作製する方法であって、
（ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させるような条件下で項目５０または５１に記載の前記宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体または前記抗体の前記抗原結合断片を作製することと；
（ｂ）前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を精製すること、
を含む方法。
（項目５４）
前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定された９００ｐＭ以下のＫ _Ｄ でヒトＲＯＮに結合する項目１〜９、２１〜２５、または３７〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５５）
前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定された５００ｐＭ以下のＫ _Ｄ でヒトＲＯＮに結合する項目５４に記載の抗体。
（項目５６）
前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定された２５０ｐＭ以下のＫ _Ｄ でヒトＲＯＮに結合する項目５５に記載の抗体。
（項目５７）
ヒトＲＯＮに対するＭＳＰの結合を阻害することなくヒトＲＯＮの生物活性を阻害する単離抗体。
（項目５８）
腫瘍細胞の増殖を抑制または低減させる方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を抑制または低減させるために、項目１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体の有効量に前記細胞を曝露させることを含む方法。
（項目５９）
哺乳動物における腫瘍増殖を抑制または低減させる方法であって、前記腫瘍の増殖を抑制または低減させるために、項目１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の前記抗体の有効量に前記哺乳動物を曝露させることを含む方法。
（項目６０）
ヒト患者における癌を治療する方法であって、項目１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
（項目６１）
前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、大腸癌、肺癌、膵癌、胃癌、および頭部頚部癌からなる群から選択される項目６０に記載の方法。
（項目６２）
治療に使用するための項目１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６３）
腫瘍細胞増殖の抑制または低減に使用するための項目１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６４）
哺乳動物における腫瘍増殖の抑制または低減に使用するための項目１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体。

Claims (64)

1. ヒトＲＯＮに結合する単離抗体であって、
   （ａ）（ｉ）配列番号４５（２９Ｂ０６）、配列番号５９（２９Ｂ０６）、および配列番号１２６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号４６（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号４７（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；
   （ｉｉ）配列番号４８（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号４９（２９Ｂ０６）アミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号５０（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
   （ｂ）（ｉ）配列番号５（０７Ｆ０１）、配列番号５１（０７Ｆ０１）および配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号６（０７Ｆ０１）および配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、配列番号７（０７Ｆ０１）および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
   （ｉｉ）配列番号８（０７Ｆ０１）および配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号９（０７Ｆ０１）および配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号１０（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
   （ｃ）（ｉ）配列番号１５（１２Ｂ１１）および配列番号５３（１２Ｂ１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号１６（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号１７（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
   （ｉｉ）配列番号１８（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号１９（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号２０（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
   （ｄ）（ｉ）配列番号２５（１７Ｆ０６）および配列番号５５（１７Ｆ０６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号２６（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号２７（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
   （ｉｉ）配列番号２８（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号２９（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号３０（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
   （ｅ）（ｉ）配列番号３５（１８Ｈ０９）および配列番号５７（１８Ｈ０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号３６（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号３７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３、を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；および
   （ｉｉ）配列番号３８（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号３９（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号４０（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３、を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
   からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む単離抗体。
2. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４５（２９Ｂ０６）および配列番号１２６（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９，Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号４６（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号４７（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含み；
   前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４８（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号４９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号５０（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む請求項１に記載の抗体。
3. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号５（０７Ｆ０１）および配列番号１２４（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ１、配列番号１２２（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ２、および配列番号１２３（キメラ０７Ｆ０１ Ｃ１０２Ｓ，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｈ３を含み；
   前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１３０（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ１、配列番号１３１（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９，Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９ Ｆ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ２、および配列番号１０（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ_Ｌ３を含む請求項１に記載の抗体。
4. 前記ＣＤＲ配列が、ヒト配列とヒト化フレームワーク配列との間に挿入されている請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
5. ヒト生殖系フレームワーク配列をさらに含む請求項２に記載の抗体。
6. 前記ヒト生殖系フレームワーク配列が、ＩＧＨＶ４−５９^＊０１である請求項５に記載の抗体。
7. 前記フレームワーク配列が、アミノ酸位置２７、３０、４８、６７または７８に少なくとも１つの置換を含み、前記アミノ酸のナンバリングがＫａｂａｔに基づく請求項６に記載の抗体。
8. 前記少なくとも１つの置換が、Ｄ２７Ｇ、Ｔ３０Ｓ、Ｍ４８Ｉ、Ｉ６７Ｖ、およびＹ７８Ｆからなる群から選択される請求項７に記載の抗体。
9. 前記抗体が、抗原結合性断片である請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
10. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
11. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
12. 請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
13. 請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター。
14. 請求項１０に記載の核酸をさらに含む請求項１３に記載の発現ベクター。
15. 請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
16. 請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
17. 請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
18. 請求項１２に記載の発現ベクターをさらに含む請求項１６に記載の宿主細胞。
19. 免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを作製する方法であって、
    （ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現させるような条件下で請求項１５または１６に記載の宿主細胞を増殖させることと；
    （ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること、
    を含む方法。
20. ヒトＲＯＮに結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を作製する方法であって、
    （ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させるような条件下で請求項１７または１８に記載の宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を作製することと；
    （ｂ）前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を精製すること、
    を含む方法。
21. ヒトＲＯＮに結合する単離抗体であって、
    （ａ）配列番号４２（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４４（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
    （ｂ）配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
    （ｃ）配列番号２（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
    （ｄ）配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
    （ｅ）配列番号１２（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号１４（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
    （ｆ）配列番号２２（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号２４（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；
    （ｇ）配列番号３２（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号３４（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
    からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体。
22. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号４２（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４４（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む請求項２１に記載の抗体。
23. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１４７（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１４９（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８）のアミノ酸配列を含む請求項２１に記載の抗体。
24. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号２（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む請求項２１に記載の抗体。
25. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１３７（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号１３９（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９）のアミノ酸配列を含む請求項２１に記載の抗体。
26. 請求項２１に記載の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
27. 請求項２１に記載の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
28. 請求項３６に記載の核酸を含む発現ベクター。
29. 請求項３７に記載の核酸を含む発現ベクター。
30. 請求項３６に記載の核酸をさらに含む請求項２９に記載の発現ベクター。
31. 請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
32. 請求項２９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
33. 請求項３０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
34. 請求項２８に記載の発現ベクターをさらに含む請求項３２に記載の宿主細胞。
35. 免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを作製する方法であって、
    （ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現させるような条件下で請求項３１または３２に記載の宿主細胞を増殖させることと；
    （ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること、
    を含む方法。
36. ヒトＲＯＮに結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を作製する方法であって、
    （ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させるような条件下で請求項３３または３４に記載の前記宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を作製することと；
    （ｂ）前記抗体または前記抗体の前記抗原結合断片を精製すること、
    を含む方法。
37. ヒトＲＯＮに結合する単離抗体であって、
    （ａ）配列番号１０９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１１１（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
    （ｂ）配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
    （ｃ）配列番号９３（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号９５（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
    （ｄ）配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
    （ｅ）配列番号９７（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号９９（１２Ｂ１１）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
    （ｆ）配列番号１０１（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０３（１７Ｆ０６）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
    （ｇ）配列番号１０５（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号１０７（１８Ｈ０９）のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖、
    からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む単離抗体。
38. 前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１０９（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１１１（２９Ｂ０６）のアミノ酸配列を含む請求項３７に記載の抗体。
39. 前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号９３（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号９５（０７Ｆ０１）のアミノ酸配列を含む請求項３７に記載の抗体。
40. 前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１７６（Ｈｕ２９Ｂ０６ Ｈｖ４−５９ Ｄ２７Ｇ Ｔ３０Ｓ Ｍ４８Ｉ Ｉ６７Ｖ Ｙ７８Ｆ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１７８（Ｓｈ２９Ｂ０６ Ｋｖ２−２８カッパ）のアミノ酸配列を含む請求項３７に記載の抗体。
41. 前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１６６（Ｓｈ０７Ｆ０１ Ｈｖ３−４８ Ｄ２８Ｔ Ｔ６０Ａ Ｌ６３Ｖ Ｅ６５Ｇ ＩｇＧ１）のアミノ酸配列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１６８（ＨＥ Ｌ ０７Ｆ０１ Ｋｖ１−９カッパ）のアミノ酸配列を含む請求項３７に記載の抗体。
42. 前記抗体が、抗原結合性断片である請求項２１または３７のいずれか一項に記載の抗体。
43. 請求項３７に記載の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
44. 請求項３７に記載の免疫グロブリン軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
45. 請求項４３に記載の核酸を含む発現ベクター。
46. 請求項４４に記載の核酸を含む発現ベクター。
47. 請求項４３に記載の核酸をさらに含む請求項４６に記載の発現ベクター。
48. 請求項４５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
49. 請求項４６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
50. 請求項４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
51. 請求項４５に記載の発現ベクターをさらに含む請求項４９に記載の宿主細胞。
52. 免疫グロブリン重鎖可変領域または免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを作製する方法であって、
    （ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現させるような条件下で請求項４８または４９に記載の前記宿主細胞を増殖させることと；
    （ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域または前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること、
    を含む方法。
53. ヒトＲＯＮに結合する抗体または前記抗体の抗原結合性断片を作製する方法であって、
    （ａ）宿主細胞が、前記免疫グロブリン重鎖可変領域および前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現させるような条件下で請求項５０または５１に記載の前記宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体または前記抗体の前記抗原結合断片を作製することと；
    （ｂ）前記抗体または前記抗体の前記抗原結合性断片を精製すること、
    を含む方法。
54. 前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定された９００ｐＭ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する請求項１〜９、２１〜２５、または３７〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
55. 前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定された５００ｐＭ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する請求項５４に記載の抗体。
56. 前記抗体が、表面プラズモン共鳴により測定された２５０ｐＭ以下のＫ_ＤでヒトＲＯＮに結合する請求項５５に記載の抗体。
57. ヒトＲＯＮに対するＭＳＰの結合を阻害することなくヒトＲＯＮの生物活性を阻害する単離抗体。
58. 腫瘍細胞の増殖を抑制または低減させる方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を抑制または低減させるために、請求項１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体の有効量に前記細胞を曝露させることを含む方法。
59. 哺乳動物における腫瘍増殖を抑制または低減させる方法であって、前記腫瘍の増殖を抑制または低減させるために、請求項１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の前記抗体の有効量に前記哺乳動物を曝露させることを含む方法。
60. ヒト患者における癌を治療する方法であって、請求項１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む方法。
61. 前記癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、大腸癌、肺癌、膵癌、胃癌、および頭部頚部癌からなる群から選択される請求項６０に記載の方法。
62. 治療に使用するための請求項１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体。
63. 腫瘍細胞増殖の抑制または低減に使用するための請求項１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体。
64. 哺乳動物における腫瘍増殖の抑制または低減に使用するための請求項１〜９、２１〜２５、３７〜４２または５４〜５７のいずれか一項に記載の抗体。

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