JP6738893B2 - 新規抗‐メソテリン抗体およびそれを含む組成物 - Google Patents
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Description
(1)クローンMI323の場合、1.8x1−8M以下、好ましくは1.8x10−9M以下、より好ましくは1.8x10−10M以下であってもよく、
(2)クローンMI329の場合、3.5x1−9M以下、好ましくは3.5x10−10M以下、より好ましくは3.5x10−11M以下であってもよく、
(3)クローンMI403の場合、4.5x1−8M以下、好ましくは4.5x10−9M以下、より好ましくは4.5x10−10M以下であってもよく、
(4)クローンMS502の場合、2.3x1−8M以下、好ましくは2.3x10−9M以下、より好ましくは2.3x10−10M以下であってもよく(表8参照)、
(5)クローンC2G1の場合、9.39x1−9M以下、好ましくは9.39x10−10M以下、より好ましくは9.39x10−11M以下であってもよく、
(6)クローンC2G4の場合、4.32x1−9M以下、好ましくは4.32x10−10M以下、より好ましくは4.32x10−11M以下であってもよく、
(7)クローンC3C8の場合、1.22x1−8M以下、好ましくは1.22x10−9M以下、より好ましくは1.22x10−10M以下であってもよく、
(8)クローン56の場合、1.25x1−8M以下、好ましくは1.25x10−9M以下、より好ましくは1.25x10−10M以下であってもよく、
(9)クローン2‐30の場合、1.66x1−8M以下、好ましくは1.66x10−9M以下、より好ましくは1.66x10−10M以下であってもよく、
(10)クローン2‐78の場合、1.63x1−9M以下、好ましくは1.63x10−10M以下、より好ましくは1.63x10−11M以下であってもよく、
(11)クローン56‐C2G4の場合、1.63x1−8M以下、好ましくは1.63x10−9M以下、より好ましくは1.63x10−10M以下であってもよく、
(12)クローン2‐30‐C2G4の場合、2.34x1−8M以下、好ましくは2.34x10−9M以下、より好ましくは2.34x10−10M以下であってもよく、
(13)クローン2‐73‐C2G4の場合、1.65x1−8M以下、好ましくは1.65x10−9M以下、より好ましくは1.65x10−10M以下であってもよく、
(14)クローン2‐78‐C2G4の場合、3.72x10−9M以下、好ましくは3.72x10−10M以下、より好ましくは3.72x10−11M以下であってもよい(表18参照)。
癌細胞の表面で過発現するMSLN(Mesothelin)に対する抗体を用いて、抗がん剤を作製しようとした。
マウス(mouse)に組換えヒトMSLNを免疫化(immunization)した後、脾臓(spleen)を摘出してBリンパ球を抽出し、これから全RNA(total RNA)を分離してから、cDNAを合成した。前記合成したcDNAからのマウス(mouse)の種々の抗体遺伝子をPCR(Polymerase Chain Reaction)によりクローニングし、これをpComb3X phagemidに挿入して、様々な配列の抗体断片をディスプレイする抗体ライブラリを作製した。抗体ライブラリからヒトMSLNに特異的に結合する抗体を探すために、MSLNが固定された磁気ビーズ(magnetic bead)と抗体ライブラリを交ぜ、標的抗原に結合するクローンを分離して培養した。その後、酵素免疫測定法(ELISA:Enzyme linked immunosorbent assay)により、標的抗原(ヒトMSLN)に特異的に結合するクローン(MI323、MI329、MI403、MI407)を個別的に確認し、塩基配列分析により、抗体遺伝子配列およびそれによるアミノ酸配列を把握した。
前記MI323、MI329、MI403、MI407クローン抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたpComb3X phagemidを抽出した後、これを鋳型(template)にして、Accupower Pfu PCR premix(Bioneer)を用いて、NotIが含まれた順方向プライマー(表3:配列番号31〜34)とApaIが含まれた逆方向プライマー(表3:配列番号35)でPCRを行った。PCRの条件としては、94℃で10分間露出後、94℃で15秒、56℃で30秒、72℃で90秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、分離した遺伝子をNotI、ApaI制限酵素で37℃で12時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに1%のアガロースゲルから分離した。ヒト免疫グロブリンタイプ1の重鎖不変領域(IgG1 heavy chain constant region)遺伝子が入っているpcIWプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S、New England BioLabs(NEB))を用いて、前記分離されたMI323、MI329、MI403、MI407の重鎖可変領域遺伝子を、ヒト重鎖不変領域が入っている線形pcIWベクターのNotI、ApaIサイトに挿入した。前記ライゲーション(ligation)反応物をXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)に形質転換させた後、カルベニシリン(carbenicillin)が含まれたLBプレート(Cat.No.LN004CA、NaraeBiotech)に塗抹した後、37℃で12時間以上培養した。次に、単コロニー(single colonies)を選んで培養した後、プラスミドミニキット(Cat.No.27405、QIAGEN)を用いてプラスミドを分離し、それをDNAシーケンシングにより確認した。
マウス免疫反応により得られた抗‐MSLN抗体であるMI323、MI329、MI403、MI407クローンを生産および精製するために、形質移入(transfection)の一日前に、Expi293FTM細胞を2.0×106細胞/mLの濃度で接種した。24時間培養(37℃、8%CO2、125rpm)後、Expi293TMExpression培地(Cat.No.A1435101、Gibco)を添加して、細胞数2.5×106細胞/mLの濃度(生存率(viability)=95%)で30mLを準備した。30μgのDNA(pcIW‐anti‐MSLN heavy chain:15μg、pcIW‐anti‐MSLN light chain:15μg)を、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)に希釈し、常温で5分間反応させた。ExpiFectamineTM293試薬(Cat.No.A14524、Gibco)80μLを、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)1.5mLに混合した後、常温で5分間反応させた。5分間反応後、それぞれ希釈したDNAとExpiFectamineTM293試薬1.5mLをよく混合して常温で20〜30分間反応させた。DNAとExpiFectamineTM293試薬の混合液3mLをExpi293FTM細胞に処理した。16〜18時間懸濁培養した後(37℃、8%CO2、125rpm)、150μLのExpiFectamineTM293 Enhancer 1(Cat.No.A14524、Gibco)と1.5mLのExpiFectamineTM293 Enhancer 2(Cat.No.A14524、Gibco)を添加し、5日間懸濁培養した。培養が終わると、4000rpmで20分間遠心分離して細胞破片(cell debris)を除去した後、上澄み液を0.22μmのフィルターに通過させて準備した。各30mLの培養液当たりにプロテインAレジン(Protein A resin)であるMabSelect Xtra(Cat.No.17‐5269‐02、Gibco)を100μLずつ準備し、1000rpmで2分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインAバインディング緩衝液(Cat.No.21007、Pierce)400μLずつ3回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインAレジン(protein A resin)を入れて室温で30分間回転反応させた。Pierce spin column‐snap cap(Cat.No.69725、Thermo)に培養液とレジン(resin)の混合物を入れ、QIAvac 24 Plus vacuum manifold(Cat.No.19413、Qiagen)を用いて、カラムにレジン(resin)のみを残した。プロテインAバインディング緩衝液5mLを入れてレジン(resin)を洗浄した後、プロテインA溶出緩衝液(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009、Pierce)200μLを入れて再懸濁(resuspension)し、室温で2分間反応させた後、1000rpmで1分間遠心分離して溶出した。各溶出液(eluate)には1.5MのTris‐HCl(pH9.0)2.5μLを入れて中和させた。溶出は4〜6回にわたって行い、各分画(fraction)はNanodrop 200C(Thermo scientific)を用いて定量した。タンパク質が検出された分画(fraction)は集めてZeba Spin Desalting Columns、7K MWCO、5mL(Cat.No.0089892、Pierce)を用いてPBS(Phosphate‐Buffered Saline)緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動(SDS‐PAGE)を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、4℃に保管した。
2‐1:ファージディスプレイ(phage display)を用いた抗‐ヒトMSLN scFv抗体の選別
1次パニング(panning)では、1013以上のライブラリーストック(library stock)1mLを、MSLNがコーティングされたSolid phase polystyrene tube(Cat.No.444202,Nunc)にて37℃、2時間反応させた。これと同時に、XL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)10μLをSB10ml/テトラサイクリン(tetracycline)10μLに接種(inoculation)させ、OD600で0.8〜1.0となるように育てた。37℃、2時間反応させたものを5mlの0.05%Tween20/PBSで4回洗浄し、2次パニングからは、パニングの回数が増加するにつれて0.05%Tween20/PBSの洗浄回数を増加させた。その後、1%のBSA/0.1Mのグリシン(pH2.0)で常温で10分間培養してファージミド(phagemid)を精製した。精製したファージミドを50mLのチューブに移し、2MのTris70μLで中和させた。XL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)9mLを処理し、1mLは洗浄されたチューブに処理した。常温で30分間感染させた後、SB10mL、テトラサイクリン(tetracycline)20μL、カルベニシリン(carbenicillin)10μLを添加し、37℃、220rpmで1時間懸濁培養させた。その後、VCS M13ヘルパーファージ(helper phage)1mL(1011pfu)を処理してから、1時間37℃、220rpmで懸濁培養した後、SB80mL、カナマイシン(kanamycin)100μL、カルベニシリン(carbenicillin)100μLを処理し、37℃、220rpmで12時間以上培養した。12時間以上培養したものを、3500rpm、4℃、10分間遠心分離した後、上澄み液を新しいチューブに移し、20mLの20%PEG/15%NaClを添加してよく混合した後、氷で30分間反応させた。その後、8000rpm、4℃、30分で上澄み液を捨て、ペレット(pellet)を集めて2mlの1%BSA/PBSで再懸濁させてから、15000rpm、4℃、10分間遠心分離させた。この際、集まったペレットは捨て、上澄み液2mLのうち1mLは−20℃に保管し、1mLは次のパニングに用いた。
ファージディスプレイ合成scFvライブラリから最終増幅集団の単コロニーを採取した後、SB/カルベニシリン(carbenicillin)1.5mLに、OD600で0.8〜1.0程度まで37℃、220rpmで培養した後、1mMのIPTG、30℃、200rpmで12時間以上培養させた。この反応物を5500rpm、5分間遠心分離した後、それぞれの上澄み液のみを、MSLN抗原が敷かれているELISAプレートに添加し、2時間常温で反応させた。その後、PBST(1XPBS、0.05%tween20)で4回洗浄した後、HRP/Anti‐hFab‐HRP conjugateを1%BSA/1XPBSで1/5000に希釈したものを添加し、常温で1時間反応させた。その後、さらにPBST(1XPBS、0.05%tween20)で4回洗浄した後、TMB溶液を添加し、5〜10分間反応させてから、TMB stop溶液を添加した。その後、TECAN sunriseを用いて450nmの測定波長でその値を読み取り、高いO.D値を有するクローンを個別クローンとして確保した。
確保されたMS501、MS502、MS503、MS504、MS505、MS50クローン抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたpComb3X phagemidを抽出した後、これを鋳型(template)にして、MS501、MS502、MS503、MS504、MS505、MS506クローン抗体の軽鎖可変領域をAccupower Pfu PCR premix(Bioneer)を用いて、NotIが含まれた順方向プライマー(表6:配列番号86)と逆方向プライマー(表6:配列番号87)でPCRを行った。また、ヒト抗体のカッパー軽鎖不変領域(kappa light chain constant region)に対して、順方向プライマー(表6:配列番号88)と逆方向プライマー(表6:配列番号89)でPCRを行った。PCRの条件としては、94℃で10分間露出後、94℃で15秒、56℃で30秒、72℃で90秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を交ぜ、重なりPCR(overlapping PCR)を行い、軽鎖領域(light chain region)を発現する遺伝子をクローニングした。条件としては、94℃で10分間露出後、94℃で15秒、56℃で30秒、72℃で90秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。分離した遺伝子をNotI、HindIII制限酵素で37℃で12時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに1%のアガロースゲルから分離した。pcIWプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S、New England BioLabs(NEB))を用いて、前記分離されたMS501、MS502、MS503、MS504、MS505およびMS506の軽鎖可変領域遺伝子を、線形pcIWベクターのNotI、HindIIIサイトに挿入した。前記ライゲーション(ligation)反応物をXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)に形質転換させた後、カルベニシリン(carbenicillin)が含まれたLBプレート(Cat.No.LN004CA、NaraeBiotech)に塗抹した後、37℃で12時間以上培養した。次に、単コロニー(single colonies)を選んで培養した後、プラスミドミニキット(Cat.No.27405、QIAGEN)を用いてプラスミドを分離し、それをDNAシーケンシングにより確認した。
ファージディスプレイscFvライブラリから得られたMS501、MS502、MS503、MS504、MS505、MS506クローン抗体を生産および精製するために、形質移入(transfection)の一日前に、Expi293FTM細胞を2.5×106細胞/mLの濃度で接種した。24時間培養(37℃、8%CO2、125rpm)後、Expi293TMExpression培地(Cat.No.A1435101、Gibco)を添加して、細胞数2.5×106細胞/mLの濃度(生存率(viability)=95%)で30mLを準備した。30μgのDNA(pcIW‐MS502重鎖可変領域:15μg、pcIW‐anti‐MSLN軽鎖可変領域突然変異:15μg)を、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)に希釈し、常温で5分間反応させた。ExpiFectamineTM293試薬(Cat.No.A14524、Gibco)80μLを、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)1.5mLに混合した後、常温で5分間反応させた。5分間反応後、それぞれ希釈したDNAとExpiFectamineTM293試薬1.5mLをよく混合して常温で20〜30分間反応させた。DNAとExpiFectamineTM293試薬の混合液3mLをExpi293FTM細胞に処理した。16〜18時間懸濁培養した後(37℃、8%CO2、125rpm)、150μLのExpiFectamineTM293 Enhancer 1(Cat.No.A14524、Gibco)と1.5mLのExpiFectamineTM293 Enhancer 2(Cat.No.A14524、Gibco)を添加し、5日間懸濁培養した。培養が終わると、4000rpmで20分間遠心分離して細胞破片(cell debris)を除去した後、上澄み液を0.22μmのフィルターに通過させて準備した。各30mLの培養液当たりにプロテインAレジン(Protein A resin)であるMabSelect Xtra(Cat.No.17‐5269‐02、Gibco)を100μLずつ準備し、1000rpmで2分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインAバインディング緩衝液(Cat.No.21007、Pierce)400μLずつ3回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインAレジン(protein A resin)を入れて室温で30分間回転反応させた。Pierce spin column‐snap cap(Cat.No.69725、Thermo)に培養液とレジン(resin)の混合物を入れ、QIAvac 24 Plus vacuum manifold(Cat.No.19413、Qiagen)を用いて、カラムにレジン(resin)のみを残した。プロテインAバインディング緩衝液5mLを入れてレジン(resin)を洗浄した後、プロテインA溶出緩衝液(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009、Pierce)200μLを入れて再懸濁(resuspension)し、室温で2分間反応させた後、1000rpmで1分間遠心分離して溶出した。各溶出液(eluate)には1.5MのTris‐HCl(pH9.0)2.5μLを入れて中和させた。溶出は4〜6回にわたって行い、各分画(fraction)はNanodrop 200C(Thermo scientific)を用いて定量した。タンパク質が検出された分画(fraction)は集めてZeba Spin Desalting Columns、7K MWCO、5mL(Cat.No.0089892、Pierce)を用いてPBS(Phosphate‐Buffered Saline)緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動(SDS‐PAGE)を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、4℃に保管した。
精製された抗‐MSLN抗体であるMI323、MI329、MI403、MS502クローン抗体の組換えヒトMSLN(Recombinant human Mesothelin)に対する定量的な結合力(親和度(Affinity))を、Biacore T‐200(GE Healthcare、米国)バイオセンサを用いて測定した。HEK293細胞から精製されたMSLN(Cat.No.3265‐MS、R&D systems、米国)を、アミン‐カルボキシル反応を用いてCM5チップ(GE Healthcare、米国)に200Rmaxとなるように固定させた後、HBS‐EP緩衝液(10mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20)に順に希釈したクローンC2G1、クローンC2G4、またはクローンC3C8抗体を、0.078nM〜5nMの濃度範囲で結合(association)120秒、解離(dissociation)1800秒間30μL/分の流速で流した。10mMのグリシン‐HCl(pH1.5)を30秒間30μL/分の流速で流すことで、MSLNに結合された抗体の解離を誘導した(表7)。Biacore T‐200 evaluation softwareを用いて、親和度を運動速度定数(KonおよびKoff)と平衡解離定数(KD)として収得した(表8)。
3‐1:MS502クローン親和性成熟(affinity maturation)ライブラリの設計
抗‐メソテリンMS502クローンのアミノ酸配列をSwiss modelのホームページ(http://swissmodel.expasy.org/)に接続して入力した後、鋳型(template)配列を探した。相同性配列に基づいて50個の配列を探した後、各配列を鋳型として指定してモデリング(modeling)を行った。QMEAN4値(Cβ、all atom、solvation、torsion)を基準として50個程度の配列を順位毎に並べ、QMEAN4値以外にも、配列のidentityとresolutionを考慮して鋳型を選定した。重鎖可変領域は3g6a.1.B、軽鎖可変領域は3qhz.1.B(LCDR1、2)と4o5l.1.A(LCDR3)が選定された。選定された鋳型をベースとして得られたMS502構造をpymolプログラムで分析し、CDRののうち突出したアミノ酸を基準としてパラトープ(paratope)を選定した(図1参照)。このうち、VL CDR2 Y49、Y50、K53の場合、TyrとLysが一般的に結合に肯定的な効果を示すアミノ酸であるため、パラトープと予想されるが、突然変異候補アミノ酸から除外させた。突然変異の導入は、既存の配列を50%保存した後、Tyr、Ser、Glyの割合を高め、親水性(hydrophilic)、疎水性(hydrophobic)、正電荷(positive charge)、負電荷(negative charge)の割合が均一に含まれるように(表9)、handmix primer(IDT、米国)を用いてヌクレオチド(nucleotide)配列を調節して設計した。重鎖可変領域は、CDR1、2、3の全てに突然変異が導入されるため、それぞれ3つの断片(fragment)に分けて断片PCR(fragment PCR)を行った後、オーバーラッピングPCR(overlapping PCR)を行うことで、ライブラリが構築されるように設計した。軽鎖可変領域は、CDR1、3のみに突然変異(mutation)が導入されるため、それぞれ2つの断片に分けて断片PCRを行った後、オーバーラッピングPCRを行うことで、ライブラリが構築されるように設計した。突然変異の導入によるライブラリの理論的な大きさは、重鎖可変領域は5.83×1010、軽鎖可変領域は2.16×104であった。
ライブラリに突然変異を導入するために、先ず、軽鎖可変領域を2つに分けて断片PCR(fragment PCR)を行った。軽鎖可変領域の断片(fragment)1番は、抗‐メソテリンMS502クローンの軽鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー(表10:配列番号93)、逆方向プライマー(表10:配列番号94)を添加し、軽鎖可変領域の断片2番は、抗‐メソテリンMS502クローンの軽鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー(表10:配列番号95)、逆方向プライマー(表10:配列番号96)を添加した後、それぞれの断片をPrimerstar polymerase premix(Takara)を用いてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃で2分間露出後、98℃で10秒、60℃で15秒、72℃で20秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、それをゲル抽出キット(QIAquick Gel Extraction Kit、CAT.NO.28706、QIAGEN)を用いてそれぞれ分離した。軽鎖不変領域は、軽鎖ラムダ領域を鋳型にして順方向プライマー(表10:配列番号97)、逆方向プライマー(表10:配列番号98)を添加した後、それぞれの断片をPrimestar polymerase premixを用いてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃で2分間露出後、98℃で10秒、60℃で15秒、72℃で30秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いて分離した。確保された軽鎖可変領域の断片(fragment)1、2と、軽鎖不変領域を1:1:1のモル比となるようにして鋳型にし、順方向プライマー(表10:配列番号92)、逆方向プライマー(表10:配列番号98)を添加した後、それぞれの断片をPrimestar polymerase premixを用いてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃で2分間露出後、98℃で20秒、60℃で30秒、72℃で60秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いて分離した後、軽鎖可変‐不変領域の親和性成熟(affinity maturation)遺伝子を確保した。確保された遺伝子をNruIとXbaI(NEB)制限酵素で37℃で4時間反応させた。制限酵素で反応させた遺伝子をさらに1%アガロースゲルから分離した。T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S、NEB)を用いて、前記分離された遺伝子を、MS502重鎖可変‐不変領域が入っている線形pComb3xベクターのNruI、XbaIサイトに挿入した。前記ライゲーション(ligation)反応物をXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐competent cells;Cat.No.200228、Stratagene)に形質転換させた後、LB培地300mLで1時間、37℃、220rpmで培養した後、カルベニシリン(carbenicillin)150μL、テトラサイクリン(tetracycline)300μLを処理した後、37℃、220rpmで1時間振盪培養した。これに、VCS M13ヘルパーファージ4.5mL(1011pfu)を処理した後、37℃、220rpmで1時間振盪培養した。その後、カナマイシン(kanamycin)300μL、カルベニシリン(carbenicillin)300μLを処理し、37℃、220rpmで一晩培養した。翌日、培養した細胞を4000rpmで20分間遠心分離した後、上澄み液を新しい容器に移した。ファージ(phage)を沈殿させるために、5XのPEG/NaClを1Xとなるように上澄み液に添加した後、氷で30分以上放置した。沈殿させたファージを8000rpmで30分間遠心分離した。上澄み液を捨て、沈殿されたファージを10mLのPBSで再懸濁(re‐suspension)した。細胞破片(cell debris)を除去するために、10mLのPBSで溶かしたファージを14,000rpmで10分間遠心分離して上澄み液を分離した後、4℃に保管した。ライブラリの大きさは、形質転換1時間後に培養液100μLを採取し、段階的希釈方式によりカルベニシリン(Carbenicillin)が含まれたLBプレート(Cat.No.LN004CA、NaraeBiotech)に塗抹した後、37℃で12時間以上培養してから、コロニーカウンティング(colony counting)によって確認した。
ライブラリに突然変異を導入するために、先ず、重鎖可変領域を3つに分けて断片PCR(fragment PCR)を行った。重鎖可変領域の断片(fragment)1番は、抗‐メソテリンMS502クローンの重鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー(表10:配列番号99)、逆方向プライマー(表10:配列番号100)を添加し、重鎖可変領域の断片2番は、抗‐メソテリンMS502クローンの重鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー(表10:配列番号101)、逆方向プライマー(表10:配列番号102)を添加し、重鎖可変領域の断片3番は、抗‐メソテリンMS502クローンの重鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー(表10:配列番号103)、逆方向プライマー(表10:配列番号104)を添加した後、それぞれの断片をPrimerstar polymerase premix(Takara)を用いてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃で2分間露出後、98℃で10秒、60℃で15秒、72℃で20秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。確保された重鎖可変領域の断片(fragment)1、2、3を1:1:1のモル比となるようにして鋳型にし、順方向プライマー(表10:配列番号99)、逆方向プライマー(表10:配列番号106)を添加した後、それぞれの断片をPrimestar polymerase premixを用いてPCRを行った。PCRの条件としては、98℃で2分間露出後、98℃で20秒、60℃で30秒、72℃で60秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いて分離した後、重鎖可変‐不変領域の親和性成熟(affinity maturation)遺伝子を確保した。確保された遺伝子をXhoIとApaI(NEB)制限酵素で37℃で4時間反応させた。制限酵素で反応させた遺伝子をさらに1%アガロースゲルから分離した。T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S、NEB)を用いて、前記分離された遺伝子を、MS502軽鎖可変‐不変領域が入っている線形pComb3xベクターのXhoI、ApaIサイトに挿入した。前記ライゲーション(ligation)反応物をXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐competent cells;Cat.No.200228、Stratagene)に形質転換させた後、LB培地300mLで1時間、37℃、220rpmで培養した後、カルベニシリン(carbenicillin)150μL、テトラサイクリン(tetracycline)300μLを処理した後、37℃、220rpmで1時間懸濁培養した。これに、VCS M13ヘルパーファージ4.5mL(1011pfu)を処理した後、37℃、220rpmで1時間振盪培養した。その後、カナマイシン(kanamycin)300μL、カルベニシリン(carbenicillin)300μLを処理し、37℃、220rpmで一晩培養した。翌日、培養した細胞を4000rpmで20分間遠心分離した後、上澄み液を新しい容器に移した。ファージ(phage)を沈殿させるために、5XのPEG/NaClを1Xとなるように上澄み液に添加した後、氷で30分以上放置した。沈殿させたファージを8000rpmで30分間遠心分離した。上澄み液を捨て、沈殿されたファージを10mLのPBSで再懸濁(re‐suspension)した。細胞破片(cell debris)を除去するために、10mLのPBSで溶かしたファージを14,000rpmで10分間遠心分離して上澄み液を分離した後、4℃に保管した。ライブラリの大きさは、形質転換1時間後に培養液100μLを採取し、段階的希釈方式によりカルベニシリン(Carbenicillin)が含まれたLBプレート(Cat.No.LN004CA、NaraeBiotech)に塗抹した後、37℃で12時間以上培養してから、コロニーカウンティング(colony counting)によって確認した。
Solid phase polystyrene tube(Cat.No.444202,Nunc)に、組換えヒトタンパク質MSLN1mLを1μg/mLの濃度で入れ、4℃で12時間以上コーティングしたチューブを0.05%のPBST5mLで3回洗浄した。MSLNがコーティングされたイムノチューブ(Immuno tube)に5mlの1%BSA/PBSを入れ、常温で2時間ブロッキング(blocking)した。イムノチューブのブロッキング(blocking)緩衝液を除去した後、軽鎖可変領域ファージライブラリをチューブに処理して常温で2時間反応させた。その後、PBST5mLで4回洗浄した。イムノチューブに1mLのグリシン(pH2.0)溶出緩衝液を処理し、常温で10分間反応させて上澄み液を収得した後、溶出(Elution)したファージに1.5MのTris‐Cl(pH8.8)100μLを添加して中和させた。約2時間培養した(OD600=0.8〜1.0)XL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)10mLに、中和させたファージを処理した。常温で30分間感染(infection)させた後、感染されたXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)10mLに、SB10mL、テトラサイクリン(tetracycline)(50mg/ml)20μL、カルベニシリン(carbenicillin)(100mg/mL)10μLを添加し、37℃で1時間振盪培養(200rpm)した。VCSM13ヘルパーファージ(>1011pfu/ml)1mLを処理した後、37℃で1時間振盪培養(200rpm)した。1時間培養後、SB80mL、カナマイシン(kanamycin)100μL、カルベニシリン(carbenicillin)(100mg/mL)100μLを処理し、37℃で一晩培養(200rpm)した。一晩培養したライブラリは4000rpmで15分間遠心分離して上澄み液のみを分離し、5XのPEG/NaCl緩衝液を1Xで入れて混合してから、氷で30分間放置した。8000rpmで30分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレット(pellet)を2mlの1%BSA/PBSで再懸濁した後、12000rpmで10分間遠心分離して上澄み液のみを取って次のパニングに使用した。前記過程を4回繰り返して行った。
Streptavidin microbead(Miltenyl biotec 130‐048‐101)50μLの上澄み液を除去した後、PBS1mlを入れて3回洗浄した。ビーズ(Bead)に、1%のBSAが含まれたPBS1mLを入れ、常温で2時間回転(rotation)してブロッキング(blocking)させた。50nMのMSLNを500μLのPBSに入れた後、MS502 VH rational library phage500μLを混合し、常温で1時間回転して反応させた。ビーズのブロッキング(blocking)緩衝液を除去した後、MSLNとファージが混合された溶液をビーズに処理して常温で15分間反応させた。その後、PBST1mLで6回洗浄した。beadに1mLのグリシン(pH2.0)溶出緩衝液を処理し、常温で10分間反応させて上澄み液を収得した後、溶出(Elution)したファージに1.5MのTris‐Cl(pH8.8)100μLを添加して中和させた。約2〜2.5時間培養した(OD600=0.8〜1.0)XL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)10mLに、中和させたファージを処理した。常温で30分間感染(infection)させた後、感染されたXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)10mLに、SB10mL、テトラサイクリン(tetracycline)(50mg/ml)20μL、カルベニシリン(carbenicillin)(100mg/mL)10μLを添加し、37℃で1時間振盪培養(200rpm)した。VCSM13ヘルパーファージ(>1011pfu/ml)1mLを処理した後、37℃で1時間懸濁培養(200rpm)した。1時間培養後、SB80mL、カナマイシン(kanamycin)100μL、カルベニシリン(carbenicillin)(100mg/mL)100μLを処理し、37℃で一晩培養(200rpm)した。一晩培養したライブラリは4000rpmで15分間遠心分離して上澄み液のみを分離し、5XのPEG/NaCl緩衝液を1Xで入れて混合してから、氷で30分間放置した。8000rpmで30分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレット(pellet)を2mlの1%BSA/PBSで再懸濁した後、12000rpmで10分間遠心分離して上澄み液のみを取って次のパニングに使用した。MSLNに対して、MS502 VH rational library phageを用いてビーズパニングを総3次まで行った。2、3次パニングの結果、output titerが増加したことから、MSLNに対する抗体が増幅されたことが確認された。
軽鎖/重鎖可変領域のそれぞれのライブラリの最終増幅集団の単コロニーを採取した後、SB/カルベニシリン(carbenicillin)1.5mLに、OD600で0.8〜1.0程度まで37℃、220rpmで培養した後、1mMのIPTG、30℃、200rpmで12時間以上培養させた。この反応物を5500rpm、5分間遠心分離した後、それぞれの上澄み液のみを、MSLN抗原が敷かれているELISAプレートに添加し、2時間常温で反応させてから、PBST(1XPBS、0.05%tween20)で4回洗浄した。その後、HRP/Anti‐hFab‐HRP conjugateを1%BSA/1XPBSで1/5000に希釈したものを添加した後、1時間常温で反応させた。その後、さらにPBST(1XPBS、0.05%tween20)で4回洗浄した後、TMB溶液を添加し、5〜10分間放置してからTMB stop溶液を添加した。その後、TECAN sunriseを用いて、450nmの測定波長でその値を読み取り、高いO.D値を有するクローンを個別クローンとして確保した。
実施例3‐3で実施したELISA方式の個別クローンの確認で確保された個別クローンの培養液を用いて結合力を比較測定するために、先ず、Biacore Series S CM5 Chip(GE healthcare)に、ヒトMSLNをアセテート緩衝液(pH4.0)に1μg/mlに溶かし、流速10μL/分で流して、1000Ruとなるように固定した。実施例3‐6で発現したFab上澄み液(supernatant)をpH7.4のHBS‐EP緩衝液に1/10に希釈し、流速30μL/分で結合(association)120秒、解離(dissociation)180秒で流して、バインディング(binding)分析を行った。再生(Regeneration)は、10mMのグリシン‐HCl(pH1.5)緩衝液で30秒間行った。ELISAとSPRバインディングデータを比較分析し、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の最終クローンを選定した。
確保された軽鎖可変領域C2G1、C2G4、C3C8遺伝子を鋳型にして、それぞれをPrimeSTAR HS DNA重合酵素(Cat.No.R010B;Takara)を用いて、NotIが含まれた順方向プライマー(表6:配列番号86)と逆方向プライマー(表6:配列番号87)でPCRを行った。また、ヒト抗体のカッパー軽鎖不変領域(kappa light chain constant region)に対して、順方向プライマー(表6:配列番号88)と逆方向プライマー(表6:配列番号89)でPCRを行った。PCRの条件としては、94℃で10分間露出後、94℃で15秒、56℃で30秒、72℃で90秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を交ぜ、重なりPCR(overlapping PCR)を行い、軽鎖領域(light chain region)を発現する遺伝子をクローニングした。条件としては、94℃で10分間露出後、94℃で15秒、56℃で30秒、72℃で90秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で10分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。分離した遺伝子をNotI、HindIII制限酵素で37℃で12時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに1%のアガロースゲルから分離した。pcIWプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S、New England BioLabs(NEB))を用いて、前記分離されたMS501、MS502、MS503、MS504、MS505およびMS506の軽鎖可変領域遺伝子を、線形pcIWベクターのNotI、HindIIIサイトに挿入した。前記ライゲーション(ligation)反応物をXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)に形質転換させた後、カルベニシリン(carbenicillin)が含まれたLBプレート(Cat.No.LN004CA、NaraeBiotech)に塗抹した後、37℃で12時間以上培養した。次に、単コロニー(single colonies)を選んで培養した後、プラスミドミニキット(Cat.No.27405、QIAGEN)を用いてプラスミドを分離し、それをDNAシーケンシングにより確認した。
重鎖可変領域56、2‐30、2‐58、2‐73、2‐78遺伝子を鋳型にして、それぞれをPrimeSTAR HS DNA重合酵素(Cat.No.R010B;Takara)を用いて、NotIが含まれた順方向プライマー(表6:配列番号90)とApaIが含まれた逆方向プライマー(表6:配列番号91)でPCRを行った。PCRの条件としては、98℃で2分間露出後、98℃で10秒、58℃で10秒、72℃で30秒間の露出を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、1%のアガロースゲルで予想した大きさのDNAバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、分離した遺伝子をKpnIとApaI制限酵素で37℃で4時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに1%のアガロースゲルから分離した。pcIWプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。T4 DNA Ligaseを用いて、前記分離された遺伝子を、ヒト重鎖不変領域が入っている線形pcIWベクターのNotI、ApaIサイトに挿入した。前記ライゲーション(ligation)反応物をXL1‐Blueバクテリア(Electroporation‐Competent Cells;Cat.No.200228、Stratagene)に形質転換させた後、カルベニシリン(carbenicillin)が含まれたLBプレート(Cat.No.LN004CA、NaraeBiotech)に塗抹した後、37℃で12時間以上培養した。次に、単コロニー(single colonies)を選んで培養した後、プラスミドミニキット(Cat.No.27405、QIAGEN)を用いてプラスミドを分離し、それをDNAシーケンシングにより確認した。
軽鎖可変領域突然変異抗体C2G1、C2G4、C3C8を生産および精製するために、形質移入(transfection)の一日前に、Expi293FTM細胞を2.5×106細胞/mLの濃度で接種した。24時間培養(37℃、8%CO2、125rpm)後、Expi293TMExpression培地(Cat.No.A1435101、Gibco)を添加して、細胞数2.5×106細胞/mLの濃度(生存率(viability)=95%)で30mLを準備した。30μgのDNA(pcIW‐MS502重鎖可変領域:15μg、pcIW‐anti‐MSLN軽鎖可変領域突然変異:15μg)を、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)に希釈し、常温で5分間反応させた。ExpiFectamineTM293試薬(Cat.No.A14524、Gibco)80μLを、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)1.5mLに混合した後、常温で5分間反応させた。5分間反応後、それぞれ希釈したDNAとExpiFectamineTM293試薬1.5mLをよく混合して常温で20〜30分間反応させた。DNAとExpiFectamineTM293試薬の混合液3mLをExpi293FTM細胞に処理した。16〜18時間懸濁培養した後(37℃、8%CO2、125rpm)、150μLのExpiFectamineTM293 Enhancer 1(Cat.No.A14524、Gibco)と1.5mLのExpiFectamineTM293 Enhancer 2(Cat.No.A14524、Gibco)を添加し、5日間懸濁培養した。培養が終わると、4000rpmで20分間遠心分離して細胞破片(cell debris)を除去した後、上澄み液を0.22μmのフィルターに通過させて準備した。各30mLの培養液当たりにプロテインAレジン(Protein A resin)であるMabSelect Xtra(Cat.No.17‐5269‐02、Gibco)を100μLずつ準備し、1000rpmで2分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインAバインディング緩衝液(Cat.No.21007、Pierce)400μLずつ3回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインAレジン(protein A resin)を入れて室温で30分間回転反応させた。Pierce spin column‐snap cap(Cat.No.69725、Thermo)に培養液とレジン(resin)の混合物を入れ、QIAvac 24 Plus vacuum manifold(Cat.No.19413、Qiagen)を用いて、カラムにレジン(resin)のみを残した。プロテインAバインディング緩衝液5mLを入れてレジン(resin)を洗浄した後、プロテインA溶出緩衝液(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009、Pierce)200μLを入れて再懸濁(resuspension)し、室温で2分間反応させた後、1000rpmで1分間遠心分離して溶出した。各溶出液(eluate)には1.5MのTris‐HCl(pH9.0)2.5μLを入れて中和させた。溶出は4〜6回にわたって行い、各分画(fraction)はNanodrop 200C(Thermo scientific)を用いて定量した。タンパク質が検出された分画(fraction)は集めてZeba Spin Desalting Columns、7K MWCO、5mL(Cat.No.0089892、Pierce)を用いてPBS(Phosphate‐Buffered Saline)緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動(SDS‐PAGE)を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、4℃に保管した。
精製された抗‐MSLN抗体であるMS502クローン軽鎖可変領域突然変異抗体C2G1、C2G4、C3C8の組換えヒトMSLN(Recombinant human Mesothelin)に対する定量的な結合力(親和度(Affinity))を、Biacore T‐200(GE Healthcare、米国)バイオセンサを用いて測定した。HEK293細胞から精製されたMSLN(Cat.No.3265‐MS、R&D systems、米国)を、アミン‐カルボキシル反応を用いてCM5チップ(GE Healthcare、Cat.No.BR‐1005‐30)に200Rmaxとなるように固定させた後、HBS‐EP緩衝液(10mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20)に順に希釈したクローンC2G1、クローンC2G4、またはクローンC3C8抗体を、0.078nM〜5nMの濃度範囲で結合(association)120秒、解離(dissociation)1800秒間30μL/分の流速で流した。10mMのグリシン‐HCl(pH1.5)を30秒間30μL/分の流速で流すことで、MSLNに結合された抗体の解離を誘導した(表13)。Biacore T‐200 evaluation softwareを用いて、親和度を運動速度定数(KonおよびKoff)と平衡解離定数(KD)として収得した(表14)。
重鎖可変領域突然変異抗体クローン56、2‐30、2‐58、2‐73、2‐78を生産および精製するために、形質移入(transfection)の一日前に、Expi293FTM細胞を2.5×106細胞/mLの濃度で接種した。24時間培養(37℃、8%CO2、125rpm)後、Expi293TMExpression培地(Cat.No.A1435101、Gibco)を添加して、細胞数2.5×106細胞/mLの濃度(生存率(viability)=95%)で30mLを準備した。30μgのDNA(pcIW‐MS502重鎖可変領域突然変異:15μg、pcIW‐MS502軽鎖可変領域:15μg)を、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)に希釈し、常温で5分間反応させた。ExpiFectamineTM293試薬(Cat.No.A14524、Gibco)80μLを、全体積が1.5mLとなるようにOptiProTMSEM培地(Cat.No.12309019、Gibco)1.5mLに混合した後、常温で5分間反応させた。5分間反応後、それぞれ希釈したDNAとExpiFectamineTM293試薬1.5mLをよく混合して常温で20〜30分間反応させた。DNAとExpiFectamineTM293試薬の混合液3mLをExpi293FTM細胞に処理した。16〜18時間懸濁培養した後(37℃、8%CO2、125rpm)、150μLのExpiFectamineTM293 Enhancer 1(Cat.No.A14524、Gibco)と1.5mLのExpiFectamineTM293 Enhancer 2(Cat.No.A14524、Gibco)を添加し、5日間懸濁培養した。培養が終わると、4000rpmで20分間遠心分離して細胞破片(cell debris)を除去した後、上澄み液を0.22μmのフィルターに通過させて準備した。各30mLの培養液当たりにプロテインAレジン(Protein A resin)であるMabSelect Xtra(Cat.No.17‐5269‐02、Gibco)を100μLずつ準備し、1000rpmで2分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインAバインディング緩衝液(Cat.No.21007、Pierce)400μLずつ3回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインAレジン(protein A resin)を入れて室温で30分間回転反応させた。Pierce spin column‐snap cap(Cat.No.69725、Thermo)に培養液とレジン(resin)の混合物を入れ、QIAvac 24 Plus vacuum manifold(Cat.No.19413、Qiagen)を用いて、カラムにレジン(resin)のみを残した。プロテインAバインディング緩衝液5mLを入れてレジン(resin)を洗浄した後、プロテインA溶出緩衝液(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009、Pierce)200μLを入れて再懸濁(resuspension)し、室温で2分間反応させた後、1000rpmで1分間遠心分離して溶出した。各溶出液(eluate)には1.5MのTris‐HCl(pH9.0)2.5μLを入れて中和させた。溶出は4〜6回にわたって行い、各分画(fraction)はNanodrop 200C(Thermo scientific)を用いて定量した。タンパク質が検出された分画(fraction)は集めてZeba Spin Desalting Columns、7K MWCO、5mL(Cat.No.0089892、Pierce)を用いてPBS(Phosphate‐Buffered Saline)緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動(SDS‐PAGE)を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、4℃に保管した。
精製された抗‐MSLN抗体であるMS502クローン重鎖可変領域突然変異抗体クローン56、2‐30、2‐73、2‐78と、これをC2G4軽鎖可変領域と組み合わせた抗体56‐C2G4、2‐30‐C2G4、2‐73‐C2G4、2‐78‐C2G4のそれぞれの組換えヒトMSLN(Recombinant human Mesothelin)に対する定量的な結合力(親和度(Affinity))を、Biacore T‐200(GE Healthcare、米国)バイオセンサを用いて測定した。HEK293細胞から精製されたMSLN(Cat.No.3265‐MS、R&D systems、米国)を、アミン‐カルボキシル反応を用いてCM5チップ(GE Healthcare、Cat.No.BR‐1005‐30)に200Rmaxとなるように固定させた後、HBS‐EP緩衝液(10mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005%の界面活性剤P20)に順に希釈したクローン56、クローン2‐30、クローン2‐73、クローン2‐78、クローン56‐C2G4、クローン2‐30‐C2G4、クローン2‐73‐C2G4、クローン2‐78‐C2G4抗体を、0.078nM〜5nMの濃度範囲で結合(association)120秒、解離(dissociation)1800秒間30μL/分の流速で流した。10mMのグリシン‐HCl(pH1.5)を30秒間30μL/分の流速で流すことで、MSLNに結合された抗体の解離を誘導した(表17)。Biacore T‐200 evaluation softwareを用いて、親和度を運動速度定数(KonおよびKoff)と平衡解離定数(KD)として収得した(表18)。
免疫および合成ライブラリから導出された抗‐MSLN抗体が、MSLNを発現する細胞に選択的に結合するかを評価するために、癌細胞株におけるMSLNの発現量を測定し、各細胞に対する抗体の結合をFACS試験により確認した。
MSLN陰性細胞株であると確認されたMiaPaCa‐2膵臓癌細胞に、MSLN発現ユニットとハイグロマイシン(Hygromycin)抵抗遺伝子を有するプラスミド(pCMV/MSLN)を、jetPEI(polyethyleneimine) transfection system(Polyplus、101‐40)を用いて細胞内に伝達した(図4)。細胞培養液を、48時間後にハイグロマイシンB(Hygromycin B)(200μg/mL)を含んでいる培養液に交換した。3日毎に培養液を交換しながら、ハイグロマイシン(Hygromycin)に対して抵抗性を示すコロニーを10個獲得し、それぞれのMSLN発現量をウエスタンブロット法により確認した。膵臓癌細胞株4種(MiaPaCa‐2、BxPC‐3、Capan‐1、AsPC‐1)および中皮腫細胞株2種(H28、H2452)に対しても、抗‐MSLN抗体(#133489、Abcam)を用いてウエスタンブロット法により細胞内のMSLN発現量を確認した。培養されている細胞にTryple Express溶液を加えて剥離させた後、15mLのチューブに入れて2000rpmで3分間常温で遠心分離して培養液を除去し、1xSDS‐PAGE試料緩衝液(50mMのTris(pH6.8)、2%のSDS、100mMのDTT(dithiothreitol)、0.1%のBPB(bromophenol blue)、10%のグリセロール)100μLで懸濁し、5分間加熱した。遠心分離により上澄み液を回収し、4‐12%のSDS‐PAGEで20mAで約2時間電気泳動し、分離されたタンパク質をPVDF膜に移すために、トランスファーユニットを用いて300mAにて、Tris‐グリシン緩衝液(39mMのグリシン、48mMのTris、0.037%のSDS、20%メタノール)で約90分間電気泳動した。タンパク質が移されたPVDF膜に、TBSブロッキング溶液(blocking solution)を用いて常温で一時間ブロッキングした。1次抗体として抗‐MSLN抗体(#133489、Abcam)を5%スキムミルク/1xTBST緩衝液に1:2,000に希釈し、常温で1時間程度反応させた後、1xTBST緩衝液で5分ずつ6回洗浄した。2次抗体として抗マウスHRP(KPL、MA、USA)を5%スキムミルク/1xTBST緩衝液に1:20,000に希釈し、30分間反応させた後、1xTBST緩衝液で5分ずつ6回洗浄し、発色反応液(ECL、Amersham、UK)でMSLNタンパク質バンドを検証した。
MSLNを人為的に発現させた細胞株であるMiaPaCa‐MSLNに対して、細胞の表面に存在するMSLNをFACS試験により測定した。培養容器で培養している分析すべき細胞をTryple Express溶液を加えて剥離させた後、50mLのチューブに入れて2000rpmで3分間常温で遠心分離して培養液を捨て、PBSで1回洗浄した。FACS緩衝液で懸濁した後、丸底チューブに移して2000rpmで3分間常温で遠心分離した。上澄み液を捨て、FACS緩衝液で細胞の密度が4x105個/mLとなるようによく溶いた。そして、4℃で候補抗体1μgを添加した。1時間後にFACS緩衝液で2回洗浄し、ヤギ由来の抗‐ヒトIgG抗体(FITC接合)を試料当たり1μLを入れ、4℃で30分間結合させた。2000rpmで3分間遠心分離して細胞を回収した後、固定緩衝液(Fixation buffer)500μLを入れ、細胞を再懸濁させ、FACS caliburで測定した(図6)。
MSLNを過発現させた細胞株(MiaPaCa‐MSLN #2)に抗‐MSLN抗体が選択的に結合するかを、FACS試験により測定した。前記実施例4‐2で記述した方法により抗‐MSLN候補抗体を標識させた後、FACS caliburで測定した(図7)。
Claims (8)
- 配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号16のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号66のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号117のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号118のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号66のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号119のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号126のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号126のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号119のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号60のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号61のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号64のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号66のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号68のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
配列番号59のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号71のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号72のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号73のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号74のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;又は
配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域;
を含有することを特徴とするメソテリン特異的抗体。 - 配列番号1、3、46、48、51、または116のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項1に記載のメソテリン特異的抗体。
- 配列番号2、4、47、49、52、109、または110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項1に記載のメソテリン特異的抗体。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号52のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号109のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
配列番号116のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号49のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
配列番号116のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
を含有することを特徴とする請求項1に記載のメソテリン特異的抗体。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項5に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項7に記載の宿主細胞を培養して抗体を発現させるステップを含む請求項1〜4のいずれかに記載の抗体の製造方法。
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