KR20170036503A - 신규 항-메소텔린 항체 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 상기 항체의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 항원에 대한 높은 친화도(affinity) 및 특이성(specificity)으로 인해 암 또는 종양 질환의 치료 또는 진단에 효과적으로 사용할 수 있는 항체의 개발을 가능하도록 한다.

Description

신규 항-메소텔린 항체 및 이를 포함하는 조성물{Novel Antibody Binding to Mesothelin(MSLN), and Composition Comprising the Same}
본 발명은 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 상기 항체의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
항체는 고형 종양을 포함한 다양한 암 또는 종양을 치료하는데 매우 효과적이다. 예를 들면, 허셉틴(Herceptin)의 경우에는 유방암, 아바스틴(Avastin)의 경우에는 대장암의 치료에 성공적으로 사용되고 있다. 항체를 이용한 암 또는 종양 치료법 개발의 핵심은 종양 세포에서 우세하게 발현(과발현)하는 막 표면 단백질에 대한 항체를 개발하는 것이다.
메소텔린(Mesothelin, MSLN)은 69~71kDa 전구체 폴리펩티드로서 당단백질(glycoprotein)이고, 세포 표면 상에 글리코포스파티딜이노시톨(GPI)-결합 단백질의 전구체 형태로 발현된다. 상기 전구체는 전구체 내 퓨린(furin) 부위(RPRFRR)에서 분할되면, 40kDa의 C-말단 폴리펩티드인 GPI-결합 메소텔린 막단백질과 세포로부터 유리되는 N-말단 폴리펩티드인 32kDa의 거핵세포 강화인자(megakaryocyte potentiating factor, MFP)를 형성하게 된다(Hassan R. et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937-3942, 2004; Chang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(1):136-40, 1996).
메소텔린은 인간 췌장 세포주인 HPC-Y5로부터 정제된 바 있고, 거핵세포 강화 능력(megakaryocyte-potentiating activity)을 가지는 것으로 관찰되어 거핵세포 강화인자(MFP, megakaryocyte potentiating factor)라고 명명되었다(Yamaguchi N. et al., J. Biol. Chem. 269:805-808, 1994).
메소텔린의 기능은 아직까지 불명확하고, 메소텔린 유전자 발현이 결핍된 생쥐(mouse)를 제조한 경우, 치명적인 생식학적, 혈액학적, 또는 해부학적 이상이 관찰되지는 않았다(Bera, T.K. et al., Mol. Cell. Biol. 20(8):2902-2906, 2000).
메소텔린은 복막, 흉막 및 심막 체강의 중피층(mesothelial lining)의 세포 표면에 존재하는 당단백질이다. 메소텔린은 암/종양세포인 중피종(mesothelioma), 난소암, 췌장암, 위암, 폐암 및 자궁내막암에서 우세하게 발현(과발현)되는 반면 정상 세포, 예컨대 중피세포에서는 그 발현이 한정되어 종양 치료법의 이상적인 표적이 될 수 있다(Argani, P. et al., Clin. Cancer Res., 7(12):3862-8, 2001; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937, 2004).
또한, 메소텔린은 난소암 항원으로 확인된 종양세포 표면에 존재하는 뮤신-유사 당단백질인 CA125(MUC-16)에 특이적으로 반응(상호작용)한다. 즉, 막-부착 메소텔린(membrane bound mesothelin)에 대한 CA125 결합은 이형(heterotype) 세포 부착(adhesion) 및 전이(metastasis)를 매개할 수 있으며, CA125 및 메소텔린은 진행된 난소샘 암종에서 공-발현되는 것으로 나타났다(Rump, A. et al., J. Biol. Chem., 279(10):9190-8, 2004). 복강 내피에서 메소텔린의 발현은 난소암의 전이 형성에 선호되는 부위와 상호관련이 있고, 메소텔린-CA125 결합은 난소 종양의 복강 전이를 용이하게 한다(Gubbels, J.A. et al., Mol. Cancer, 5(1):50, 2006).
최근에는 메소텔린을 발현하는 폐암, 난소암 및 췌장암을 대상으로 하는 항체 기반의 표적화 치료법이 개발되고 있다. 일례로, 생쥐를 면역화하여 생성된 mAb K1은 막-결합 메소텔린 폴리펩티드에 대한 1차 항체로 개발된 바 있다(Chang, K., et al., Int. J. Cancer, 50(3):373, 1992). 그러나, mAb K1 항체의 저친화도 및 불량한 내재화율로 인해, 화학적으로 변형된 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 A의 절단형에 연결된 mAb K1으로 이루어진 면역독소(immunotoxin)는 임상적으로 개발하는데 적합하지 않은 것으로 나타났다(Hassan, R., et al., J. Immunother., 23(4):473, 2000]; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937, 2004). 이후, SS1-(dsFv)-PE38을 비롯하여 친화도가 보다 높은 단일쇄 항체가 개발되었고, 이는 생체 외(in vitro) 상에서 종양 세포를 사멸시키는 능력뿐만 아니라(Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 8(11):3520, 2002) 인간 메소텔린-발현 종양의 설치류 모델에서도 효능을 나타내었다(Fan, D., et al., Mol. Cancer Ther., 1(8):595, 2002). 상기 결과에 따르면, 메소텔린은 다발성 암의 면역 치료에 적합한 표적임을 알 수 있었다. 그러나, 상기 SS1-(dsFv)-PE38은 임상 시험에서 면역원성이 관찰되어, 대부분의 환자에서 2차 투여가 중단된 바 있고, SS1-(dsFv)-PE38은 급속하게 혈중에서 제거되는 경향을 보이므로 융합 단백질의 형태로 SS1-(dsFv)-PE38을 페길화하여 생체 내 항체의 지속성을 증가시키는 시도가 이루어지고 있다(Filpula, D., et al., Bioconjugate Chem., 18(3):773, 2007).
이종이식 설치류를 암 모델로 하는 면역독소 암 치료법의 임상 시험은 종종 치료 항체와 이의 설치류 동족체 간의 교차 반응성의 결핍에 의해 제한된다. 또한, 설치류 유래의 항체 또는 키메라 항체로 치료받은 환자에서 형성된 중화성 항-생쥐 Fv 항체는 용량 제한 독성을 야기하거나, 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 따라서, 암 치료의 효능을 높이기 위해서는 메소테린 항원에 대한 증가된 친화도, 감소된 해리율, 설치류 교차 반응성이 함께 조합된 표적화 항체가 요구된다.
또한, 항-메소텔린 신규 항체의 추가적인 특성은 상이한 암 또는 종양 세포의 세포 표면에 발현되는 메소테린에 대한 친화도가 유지되어야 한다. 메소텔린은 매우 가변적인 단백질로, 다중 부위에서 번역(translation) 후 단백질가수분해를 거칠뿐만 아니라, 글리코실화(glycosylation)된다(Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937, 2004). 전사 변형체 1(Genbank NM_005823)이 현재까지 시험된 종양 세포주에서 나타난 주요 종을 대표하는 것으로 보이나, 3개의 상이한 스플라이스 변형체(splicing variant)가 검출되었으므로, 가변성은 전사 수준으로까지 확대된다(Muminova, Z.E., et al., BMC Cancer, 4:19, 2004; Hellstrom, I., et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 15(5):1014, 2006). 따라서, 효과적인 항-메소텔린 항체는 상이한 형태의 메소텔린을 발현시키는 글리코실화 패턴에서의 가변성을 포함하나, 개개의 가변성과는 독립적으로, 상이한 환자로부터 유래한 암 또는 종양 세포 표면에서 발현되는 메소텔린 에피토프에 불변적으로 결합해야 한다.
이에, 본 발명자들은, MSLN에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 제조하고자 예의 노력한 결과, 암세포에서 과발현되는 MSLN에 대한 높은 친화력을 갖는 상기 신규 항체를 발명하였으며, 본 발명에 따른 항체의 효율적인 항암 치료제로서의 가능성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 신규 항체, 상기 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 이의 제조방법 및 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메소텔린(Mesothelin, MSLN)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 9, 15, 21, 27, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 10, 16, 22, 28, 60, 65, 71, 75, 80, 84, 121, 122, 123 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 11, 17, 23, 29, 61, 66, 72, 76, 81, 85, 124 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 12, 18, 24, 30, 62, 67, 70, 77, 86 또는 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 13, 19, 25, 63, 68, 73, 78 또는 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 14, 20, 26, 64, 69, 74, 79, 83, 87, 118, 119 또는 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체를 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1, 3, 5, 7, 46, 48, 51, 53, 55, 57, 112, 113, 114, 115 또는 116의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 47, 52, 54, 56, 58, 109, 110 또는 111의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, MSLN에 대한 항체를 코딩하는 핵산; 상기 핵산을 함유하는 벡터; 및 상기 벡터가 도입되어 있는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 항-MSLN 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 항원에 대한 높은 친화도(affinity) 및 특이성(specificity)으로 인해 암 또는 종양 질환의 치료 또는 진단에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 항-메소텔린(Mesothelin, MSLN) 항체 중 클론 MS502의 경쇄 가변영역(VL)과 중쇄 가변영역(VH)의 예측 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 경쇄 가변영역 돌연변이의 결합력 상대비교를 나타낸 것이다.
도 3은 중쇄 가변영역 돌연변이의 결합력 상대비교를 나타낸 것이다.
도 4는 MSLN을 세포주에서 발현하기 위한 벡터를 도시한 것이다.
도 5는 MSLN의 전구체 형태와 성숙 형태를 SDS-PAGE 상에서 나타낸 것이다.
도 6은 MSLN을 발현하는 세포주 및 종양 세포주에서의 MSLN 발현량을 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 항-MSLN 항체를 이용하여 MSLN을 발현하는 세포주에 대한 선택적 결합 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 항-MSLN 항체를 이용하여 중피종(H226, H2052) 및 췌장암 (AsPC-1)의 세포막에 항체 결합 여부를 FACS 수행 후 MFI 값으로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 항-MSLN 항체를 이용하여 MSLN을 발현하는 종양 세포에 선택적으로 결합하는지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "메소텔린" 또는 "MSLN(Mesothelin)"은 세포에 의해 천연적으로 발현되는, 인간 MSLN의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 지칭한다.
용어 "인간 메소텔린"은 진뱅크(Genbank) 기탁번호 NP_005814를 가지는 인간 메소텔린의 완전한 아미노산 서열과 같은, 인간 서열 메소텔린을 지칭한다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 127로 표시되는 메소텔린에 특이적으로 결합하도록 구조적으로 특성화되어 분리된 단클론 항체 "클론 MI323", "클론 MI329", "클론 MI403" 및 "클론 MI407"과 "클론 MS501", "클론 MS502", "클론 MS503", "클론 MS504", "클론 MS505" 및 "클론 MS506"과 "클론 C2G1", "클론 C2G4", "클론 C3C8", "클론 54", "클론 56", "클론 2-30", "클론 2-73" 및 "클론 2-78"과 "클론 56-C2G4", "클론 2-30-C2G4", "클론 2-73-C2G4" 및 "클론 2-78-C2G4"를 제조하였다.
각 항체의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR에 대한 아미노산 서열은 하기 표 2, 표 5, 표 12 및 표 16에 기재된 바와 같다. 하기 표 1, 표 4, 표 11 및 표 15에 기재된 바와 같이, 항-MSLN 항체는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 또는 이와 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 정제된 항체인 "클론 MI323", "클론 MI329", "클론 MI403", "클론 MS502"과 "클론 C2G1", "클론 C2G4", "클론 C3C8"과 "클론 56-C2G4", "클론 2-30-C2G4", "클론 2-73-C2G4" 또는 "클론 2-78-C2G4"의 재조합 인간 MSLN(Recombinant human MSLN)에 대한 개별 항체 클론을 선별하기 위해 효소면역측정법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하였고(데이터 미도시), Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 정량적인 결합력을 측정하였다(실시예 2-5, 실시예 3-11, 실시예 3-14). 그 결과, 표 8, 표 14, 및 표 18에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 모든 클론 항체에서 다소 차이는 있으나 메소텔린에 대한 친화도를 보였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 면역 및 합성 라이브러리로부터 도출된 항-MSLN 항체가 MSLN을 발현하는 세포에 선택적으로 결합하는지 평가하기 위해 암세포주에서 MSLN의 발현량을 측정하고, 각 세포에 대한 항체의 결합을 FACS 시험으로 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 각각의 암세포주로부터 70kDa의 전구체(precursor) 형태와 40~50kDa의 성숙(mature) 형태의 MSLN 존재 여부를 측정하여 H28, MiaPaCa-2, BxPC-3, Capan-1 세포주는 MSLN 음성이고, H226, H2452(H2052), AsPC-1은 MSLN 양성임을 확인하였다.
또한, 상기 MSLN 발현 세포주(H226, H2452(H2052), AsPC-1)에 대한 항-MSLN 후보 항체의 선택적 결합 분석을 수행한 결과, 도 8 및 표 19에 나타난 바와 같이, 중피종과 췌장암 세포주의 MSLN에 대한 MI323, MI329, MI403, MS502 후보 항체의 결합 정도는 다소 차이가 있었으나 모두 유의한 결합력을 나타내었으며, 특히 MI323 후보 항체는 우수한 결합 양상을 나타내었다.
아울러, MSLN에 대한 결합 양상이 우수한 MI323 후보 항체와 Biacore KD(Koff/Kon) 값의 패턴이 다른 MS502, MS502 후보 항체로부터 제작된 중쇄 가변영역 돌연변이 2-78-C2G4 후보 항체가 MSLN을 발현하는 종양 세포에 선택적으로 결합하는지를 MSLN 과발현 MiaPaCa-MSLN #2 세포와 MSLN을 발현하지 않는 MiaPaCa-2에서 평가한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, MI323, MS502, 2-78-C2G4 후보 항체는 MiaPaCa-2 대비 MSLN 과발현 MiaPaCa-MSLN #2 세포에서 우수한 결합 양상을 나타내었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 메소텔린(Mesothelin, MSLN), 바람직하게는 서열번호 127로 표시되는 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 9, 15, 21, 27, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 10, 16, 22, 28, 60, 65, 71, 75, 80, 84, 121, 122, 123 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 11, 17, 23, 29, 61, 66, 72, 76, 81, 85, 124 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 12, 18, 24, 30, 62, 67, 70, 77, 86 또는 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 13, 19, 25, 63, 68, 73, 78 또는 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 14, 20, 26, 64, 69, 74, 79, 83, 87, 118, 119 또는 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1, 3, 5, 7, 46, 48, 51, 53, 55, 57, 112, 113, 114, 115 또는 116의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 47, 52, 54, 56, 58, 109, 110 또는 111의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 100%의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 1, 3, 5, 7, 46, 48, 51, 53, 55, 57, 112, 113, 114, 115 또는 116의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 47, 52, 54, 56, 58, 109, 110 또는 111의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항체는 인간 단클론 항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체는 보존적 치환을 통해서 항체의 아미노산 서열이 치환될 수 있다. 여기서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 당업계에 규정되어 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
핵산 및 폴리펩티드의 경우, 용어 "실질적 상동성"은 2종의 핵산 또는 2종의 폴리펩티드 또는 이것들의 지정된 서열이 최적으로 정렬 및 비교되는 경우에 적절한 뉴클레오티드 또는 아미노산 삽입 또는 결실을 가지면 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 80％, 통상적으로는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 적어도 약 85％, 바람직하게는 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96％, 97％, 98％, 99％, 99.1％, 99.2％, 99.3％, 99.4％ 또는 99.5％에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 절편이 선택적인 혼성화 조건하에 그 가닥의 상보체와 혼성화되는 경우, 핵산에 대한 실질적 상동성이 존재한다. 본 발명은 본원에서 언급된 특정 핵산 서열 및 아미노산 서열에 대해 실질적 상동성을 갖는 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 예를 들어, 표 2, 표 5, 표 12 및 표 16에 기술된 중쇄(VH) CDR1, 2 및 3 서열과 경쇄(VL) CDR1, 2 및 3 서열은 구조적으로 유사한 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)　서열이 혼합되어 중쇄(VH)/경쇄(VL)　쌍의　CDR1, 2 및 3으로 배치되어 형성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 여기서 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 단클론 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내(in vitro) 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체 내(in vivo) 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응성인 면역글로블린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody) 항체와 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함할 수 있다.
전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 항체 단편은 항원결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 및 Fv 등을 포함한다.
상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
상기 Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고, 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 가변영역을 코딩하는 DNA 및 경쇄 또는 이의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 주형으로 하고, 프라이머쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)법에 의해 증폭시키고, 펩티드 링커를 코딩하는 DNA와 양 말단이 각각 중쇄 또는 이의 가변영역 및 경쇄 또는 이의 가변영역과 연결되도록 하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭)을 통하여 제작할 수 있다.
면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변영역 및 가변영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변영역은, 상보성 결정영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 명세서에서 사용하는 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 의미하고, 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, i) 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다는 점, ii) 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는다는 점, 및 iii) 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 점에서 장점이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 MSLN에 특이적으로 결합하는 항체인 "클론 MI323", "클론 MI329", "클론 MI403" 및 "클론 MI407"과 "클론 MS501", "클론 MS502", "클론 MS503", "클론 MS504", "클론 MS505" 및 "클론 MS506"과 "클론 C2G1", "클론 C2G4", "클론 C3C8", "클론 54", "클론 56", "클론 2-30", "클론 2-73" 및 "클론 2-78"과 "클론 56-C2G4", "클론 2-30-C2G4", "클론 2-73-C2G4" 및 "클론 2-78-C2G4"는 MSLN에 결합하여 MSLN의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미하며, 항-MSLN 항체와 혼용하여 사용할 수 있다.
여기서 "클론 MI323", "클론 MI329", "클론 MI403" 및 "클론 MI407"은 생쥐에 재조합 인간 MSLN을 면역(immunization)한 다음 수득한 항체이며, "클론 MS501", "클론 MS502", "클론 MS503", "클론 MS504", "클론 MS505" 및 "클론 MS506"은 scFV 라이브러리로부터의 파지 디스플레이로부터 수득한 항체이고, "클론 C2G1", "클론 C2G4", "클론 C3C8", "클론 54", "클론 56", "클론 2-30", "클론 2-73" 및 "클론 2-78"은, 표 9에 나타난 바와 같이, 상기 "클론 MS502"에 돌연변이(mutation)를 도입한 항체이고, "클론 56-C2G4", "클론 2-30-C2G4", "클론 2-73-C2G4" 및 "클론 2-78-C2G4"은 도입된 돌연변이 항체 간의 조합으로 제조한 항체이다.
상기 MSLN에 대한 항체의 KD(평형 해리상수, equilibrium dissociation constant)는 예를 들어:
(1) 클론 MI323의 경우, 1.8 x 10-8M 이하, 바람직하게 1.8 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 1.8 x 10-10M 이하일 수 있으며,
(2) 클론 MI329의 경우, 3.5 x 10-9M 이하, 바람직하게 3.5 x 10-10M 이하, 더욱 바람직하게 3.5 x 10-11M 이하일 수 있으며,
(3) 클론 MI403의 경우, 4.5 x 10-8M 이하, 바람직하게 4.5 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 4.5 x 10-10M 이하일 수 있으며,
(4) 클론 MS502의 경우, 2.3 x 10-8M 이하, 바람직하게 2.3 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 2.3 x 10-10M 이하일 수 있으며(표 8 참조),
(5) 클론 C2G1의 경우, 9.39 x 10-9M 이하, 바람직하게 9.39 x 10-10M 이하, 더욱 바람직하게 9.39 x 10-11M 이하일 수 있으며,
(6) 클론 C2G4의 경우, 4.32 x 10-9M 이하, 바람직하게 4.32 x 10-10M 이하, 더욱 바람직하게 4.32 x 10-11M 이하일 수 있으며,
(7) 클론 C3C8의 경우, 1.22 x 10-8M 이하, 바람직하게 1.22 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 1.22 x 10-10M 이하일 수 있으며(표 14 참조),
(8) 클론 56의 경우, 1.25 x 10-8M 이하, 바람직하게 1.25 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 1.25 x 10-10M 이하일 수 있으며,
(9) 클론 2-30의 경우, 1.66 x 10-8M 이하, 바람직하게 1.66 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 1.66 x 10-10M 이하일 수 있으며,
(10) 클론 2-78의 경우, 1.63 x 10-9M 이하, 바람직하게 1.63 x 10-10M 이하, 더욱 바람직하게 1.63 x 10-11M 이하일 수 있으며,
(11) 클론 56-C2G4의 경우, 1.63 x 10-8M 이하, 바람직하게 1.63 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 1.63 x 10-10M 이하일 수 있으며,
(12) 클론 2-30-C2G4의 경우, 2.34 x 10-8M 이하, 바람직하게 2.34 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 2.34 x 10-10M 이하일 수 있으며,
(13) 클론 2-73-C2G4의 경우, 1.65 x 10-8M 이하, 바람직하게 1.65 x 10-9M 이하, 더욱 바람직하게 1.65 x 10-10M 이하일 수 있고,
(14) 클론 2-78-C2G4의 경우, 3.72 x 10-9M 이하, 바람직하게 3.72 x 10-10M 이하, 더욱 바람직하게 3.72 x 10-11M 이하일 수 있다(표 18 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 인간 MSLN에 결합하는 면역 라이브러리로부터 유래한 생쥐(mouse)의 중쇄 가변영역(heavy chain variable region)과 경쇄 가변영역(light chain variable region)의 유전자를 파악한 다음, 중쇄 가변영역 유전자는 인간 이뮤노글로불린 타입 1의 중쇄 불변영역(IgG1 heavy chain constant region) 유전자와 연결하고, 경쇄 가변영역 유전자는 인간 카파 경쇄 불변영역(kappa light chain constant region)과 연결한 다음, 이들을 각각 동물세포용 단백질 발현 벡터에 삽입하여 벡터를 제작한 후 이들을 Expi293F™ 세포주에 형질주입(transfection)하고 배양하여 항체를 생산한 다음 이를 프로테인 A(protein A)로 정제하여 항체를 제조하였다(실시예 1-3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 인간 MSLN에 결합하는 합성 scFV 라이브러리로부터 유래한 중쇄 가변영역(heavy chain variable region)과 경쇄 가변영역(light chain variable region)의 유전자를 파악한 다음, 중쇄 가변영역 유전자는 인간 이뮤노글로불린 타입 1의 중쇄 불변영역(IgG1 heavy chain constant region) 유전자와 연결하고, 경쇄 가변영역 유전자는 인간 카파 경쇄 불변영역(kappa light chain constant region)과 연결한 다음, 이들을 각각 동물세포용 단백질 발현 벡터에 삽입하여 벡터를 제작한 후 이들을 Expi293F™ 세포주에 형질주입(transfection)하고 배양하여 항체를 생산한 다음 이를 프로테인 A(protein A)로 정제하여 항체를 제조하였다(실시예 2-4, 실시예 3-10, 실시예 3-12, 실시예 3-13).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 당업계에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 되는" 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 항체 또는 그의 항체 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어 PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 "작동되도록 결합"되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 숙주세포와 상용성 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 항체의 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 프레임에 맞게 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 결합되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. "조절서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 당업자는 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 상기 핵산 또는 상기 벡터는 숙주세포에 형질주입 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 포유류 세포에의 적용 가능성을 고려하여, 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 숙주세포에서 발현될 수 있다. 상기 항체의 발현에 적합한 포유류 숙주세포는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포(예를 들어 DHFR 선발 가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 또는 SP2 세포 등을 예시할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조방법에 관한 것이다. 상기 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
경우에 따라서, 발현된 항체는 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
용어 "암" 또는 "종양"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프구증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 본 발명에서 상기 암은 바람직하게는 메소텔린-양성 암이고, 췌장암, 난소암, 폐암, 위암, 자궁내막암 및 중피종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 치료 유효량의 항-MSLN 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 치료 유효량의 1종 이상의 항-MSLN 항체를 함유할 것이다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
제약 조성물은 고통받는 환자의 중증도에 따라 달라질 수 있는 투여량 및 빈도로 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항체의 볼루스 투여는 0.0025 내지 100mg/kg 체중, 0.025 내지 0.25mg/kg, 0.010 내지 0.10mg/kg 또는 0.10 내지 0.50mg/kg의 양일 수 있다. 연속 주입의 경우, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항체는 0.001 내지 100mg/kg 체중/분, 0.0125 내지 1.25mg/kg/분, 0.010 내지 0.75mg/kg/분, 0.010 내지 1.0mg/kg/분 또는 0.10 내지 0.50mg/kg/분으로 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 12시간, 6시간 내지 12시간, 2시간 내지 8시간, 또는 1시간 내지 2시간의 기간 동안 투여될 수 있다. 전장 항체(완전 불변 영역을 가짐)로 제시되는 본 발명의 항체를 투여하는 경우, 투여량은 약 1 내지 10mg/kg 체중, 2 내지 8mg/kg, 또는 5 내지 6mg/kg일 수 있다. 이러한 전장 항체는 전형적으로 30분 내지 35분의 기간 동안 지속되는 주입을 통해 투여한다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 빈도는 1주당 3회 내지 매 1주 또는 2주 마다 1회의 범위일 수 있다.
추가로, 조성물은 피하 주사를 통해 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 10 내지 100mg 투여량의 항-MSLN 항체가 매주, 격주 또는 매달 피하 주사를 통해 환자에게 투여할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 항-MSLN 항체의 조합물의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특징, 의도된 환자 집단, 개개의 환자의 고려사항 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이고 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.　
본 발명의 약제학적 조성물의 복용량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경한다.　 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 쥐(rat), 생쥐(mouse), 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 경구로, 직장으로, 정맥으로(intravenously), 피하로(subcutaneously), 자궁내로(intrauterinely) 또는 뇌혈관내로(intracerebrovascularly) 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 면역 라이브러리로부터의 항-MSLN 항체의 제조 방법
암세포 표면에 과발현하는 MSLN(Mesothelin)에 대한 항체로, 항암 항체치료제를 제작하고자 하였다.
1-1: 항-MSLN 항체의 선별
생쥐(mouse)에 재조합 인간 MSLN를 면역(immunization)한 다음 비장(spleen)을 적출하여 B 림프구를 추출하고, 이로부터 총 RNA(total RNA)를 분리한 다음 cDNA를 합성하였다. 상기 합성한 cDNA로부터 생쥐(mouse)의 다양한 항체 유전자들을 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 클로닝하였고, 이를 pComb3X phagemid에 삽입하여 다양한 서열의 항체 절편을 디스플레이하는 항체 라이브러리를 제작하였다. 항체 라이브러리로부터 인간 MSLN에 특이적으로 결합하는 항체를 찾기 위해 MSLN이 고정된 마그네틱 비드(magnetic bead)와 항체 라이브러리를 섞어 표적 항원에 결합하는 클론들을 분리하여 배양한 후, 효소면역측정법(ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay)을 통해 표적 항원(인간 MSLN)에 특이적으로 결합하는 클론들(MI323, MI329, MI403, MI407)을 개별적으로 확인하고, 염기서열 분석을 통해 항체 유전자 서열 및 이에 따른 아미노산 서열을 파악하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 인간 MSLN에 특이적으로 결합하는 클론을 선별할 수 있었고, 이들의 아미노산 서열을 확인하였다.
표 2는 표 1의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.
클론 가변영역 아미노산 서열 서열번호
MI323 중쇄 EVQLQQSGPELVKPGTSVKISCKASGYSFTSYFIQWVKQRPGQGLEWIGWIFPGSGNTKYNEMFKGKATLAADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSGGYQYYFDYWGQGTSVTVSS 1
경쇄 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYPGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKR 2
MI329 중쇄 EVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRRTPEKRLEWVATINSDGSYTFYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRSEDTAMYYCARWGENWYFDVWGAGTTVTVSS 3
경쇄 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHFPRTFGGATKLELKR 4
MI403 중쇄 EVQVVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAMYYCARQGTAVKNYWYFDVWGAGTSVTVSS 5
경쇄 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSSSYVHWYQQRPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTGTYYCQHSWEIPFTFGSGTKLEIKR 6
MI407 중쇄 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFPFSNYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYFCVRQGTSVESYWYFDVWGAGTTVTVSS 7
경쇄 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSSSYIHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEDDTATYYCQHSWEIPFTFGSGTELEIKR 8
클론 가변영역 CDR1 CDR2 CDR3
MI323 중쇄 SYFIQ
(서열번호 9)		 WIFPGSGNTKYNEMFKG
(서열번호 10)		 SGGYQYYFDY
(서열번호 11)
경쇄 KASQDVSTAVA
(서열번호 12)		 SASYRYP
(서열번호 13)		 QQHYSTPWT
(서열번호 14)
MI329 중쇄 SYAMS
(서열번호 15)		 TINSDGSYTFYPDSVKG
(서열번호 16)		 WGENWYFDV
(서열번호 17)
경쇄 RSSQSLVHSNGNTYLH
(서열번호 18)		 KVSNRFS
(서열번호 19)		 SQSTHFPRT
(서열번호 20)
MI403 중쇄 SYDMS
(서열번호 21)		 YISSGGGSTYYPDTVKG
(서열번호 22)		 QGTAVKNYWYFDV
(서열번호 23)
경쇄 RASQSVSTSSSSYVH
(서열번호 24)		 YASNLES
(서열번호 25)		 QHSWEIPFT
(서열번호 26)
MI407 중쇄 NYDMS
(서열번호 27)		 YISSGGGNTYYPDTVKG
(서열번호 28)		 QGTSVESYWYFDV
(서열번호 29)
경쇄 SVSTSSSSYIH
(서열번호 30)		 YASNLES
(서열번호 25)		 QHSWEIPFT
(서열번호 26)
1-2: MI323, MI329, MI403, MI407 클론 항체의 IgG 유전자 클로닝
상기 MI323, MI329, MI403, MI407 클론 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 유전자가 함유된 pComb3X phagemid를 추출한 다음, 이를 주형(template)으로 Accupower Pfu PCR premix(Bioneer)를 이용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 3: 서열번호 31~34)와 ApaI이 포함된 역방향 프라이머로(표 3: 서열번호 35) PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 분리된 유전자를 NotI, ApaI 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음, 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. 인간 이뮤노글로불린 타입 1의 중쇄 불변영역(IgG1 heavy chain constant region) 유전자가 들어있는 pcIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 MI323, MI329, MI403, MI407 중쇄 가변영역 유전자를 인간 중쇄 불변영역이 들어있는 선형 pcIW 벡터의 NotI, ApaI 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
상기 MI323, MI329, MI403, MI407 클론 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자가 함유된 pComb3X phagemid를 추출한 다음, 이를 주형(template)으로 MI323, MI329, MI403, MI407 클론 항체의 가변 경쇄영역을 Accupower Pfu PCR premix를 이용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 3: 서열번호 36, 38, 40, 42)와 역방향 프라이머(표 3: 서열번호 37, 39, 41, 43)로 PCR을 수행하였다. 또한, 인간 항체의 카파 경쇄 불변영역(kappa light chain constant region)을 순방향 프라이머(표 3: 서열번호 44)와 HindIII가 포함된 역방향 프라이머(표 3: 서열번호45)로 PCR을 수행하였다. 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 각 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역을 섞어 중첩 PCR(overlapping PCR)을 수행하여 경쇄영역(light chain region)을 발현하는 유전자를 클로닝하였다. 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 분리된 유전자를 NotI, HindIII 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음, 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pcIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 MI323, MI329, MI403, MI407 경쇄 영역 유전자를 선형 pcIW 벡터의 NotI, HindIII 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
이름 DNA 염기 서열 서열번호
MI323VH-F GCGGCCGCCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCT 31
MI329VH-F GCGGCCGCCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAGGTGATGCTGGTGGAGTCT 32
MI403VH-F GCGGCCGCCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAGGTGCAGGTGGTGGAGTCT 33
MI407VH-F GCGGCCGCCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAGGTGAAGTTGGTGGAGTCT 34
VHApaI-R ACCGATGGGCCCTTGGTGGA 35
MI323VL-F GCGGCCGCCATGGATAGCCAGGCTCAGGTGCTGATGCTGCTGCTGCTGTGGGTGTCAGGGACTTGCGGGGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAA 36
MI323VLCL-R ACACTAGGAGCGGCCACGGTTCGTTTGATTTCCAGTTTGGTCCCT 37
MI329VL-F GCGGCCGCCATGGATAGCCAGGCTCAGGTGCTGATGCTGCTGCTGCTGTGGGTGTCAGGGACTTGCGGGGACGTTGTGATGACCCAGACTCCACTC 38
MI329VLCL-R ACACTAGGAGCGGCCACGGTTCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTC 39
MI403VL-F GCGGCCGCCATGGATAGCCAGGCTCAGGTGCTGATGCTGCTGCTGCTGTGGGTGTCAGGGACTTGCGGGGATATTGTGATGACCCAGTCTCCTGCT 40
MI403VLCL-R ACACTAGGAGCGGCCACGGTTCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGA 41
M407VL-F GCGGCCGCCATGGATAGCCAGGCTCAGGTGCTGATGCTGCTGCTGCTGTGGGTGTCAGGGACTTGCGGGGATATTGTGTTGACACAGTCTCCTGCT 42
M407VLCL-R ACACTAGGAGCGGCCACGGTTCGTTTTATTTCCAACTCTGTCCCCG 43
Ck-F ACCGTGGCCGCTCCTAGTGT 44
CkSHB-R NNNNGGATCCAAGCTTACTAGCACTCCCC 45
1-3: MI323, MI329, MI403, MI407 클론 항체의 IgG 생산 및 정제
생쥐 면역반응으로 얻어진 항-MSLN 항체 MI323, MI329, MI403, MI407 클론을 생산 및 정제하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.0 X 106 세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO2, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 106 세포/mL 농도(생존율(viability)=95%)로 30mL를 준비하였다. 30μg의 DNA(pcIW-anti-MSLN heavy chain: 15μg, pcIW-anti-MSLN light chain: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamine™ 293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiProTM SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분간 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamineTM 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamineTM 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO2, 125rpm) ExpiFectamineTM 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamineTM 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL를 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분간 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다.
실시예 2: 파아지 디스플레이 합성 scFv 라이브러리로부터의 항-MSLN 항체의 제조 방법
2-1: 파아지 디스플레이(phage display)를 이용한 항-인간 MSLN scFv 항체 선별
1차 panning은 1013 이상의 library stock 1mL을 MSLN이 코팅된 Solid phase polystyrene tube(Cat.No.444202, Nunc)에서 37℃, 2시간 동안 반응시켰다. 이와 동시에 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene) 10μL를 SB 10ml/테트라사이클린(tetracycline) 10μL에 접종(inoculation)시켜 OD600에서 0.8~1.0이 되게 키웠다. 37℃, 2시간 동안 반응시켰던 것을 0.05% Tween 20/PBS 5ml로 4회 세척하고 2차 panning부터 panning 횟수 증가에 따라 0.05% Tween 20/PBS의 세척 횟수를 증가시켰다. 이후 1%BSA/0.1M Glycine pH 2.0으로 상온에서 10분간 배양하여 phagemid를 정제하였다. 정제한 phagemid를 50mL 튜브에 옮기고 2M Tris 70μL로 중화시켰다. XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene) 9mL을 처리하고 1mL은 세척된 튜브에 처리하였다. 상온에서 30분간 감염시킨 후 SB 10mL, 테트라사이클린(tetracycline) 20μL, 카베니실린(carbenicillin) 10μL를 첨가하여 37℃, 220rpm으로 1시간 동안 현탁배양시켰다. 이후 VCS M13 helper phage 1mL(1011pfu)을 처리한 후 1시간 동안 37℃, 220rpm에서 현탁배양한 후 SB 80mL, 카나마이신(kanamycin) 100μL, 카베니실린(carbenicillin) 100μL를 처리하고 37℃, 220rpm으로 12시간 이상 배양하였다. 12시간 이상 배양한 것을 3500rpm, 4℃, 10분간 원심분리한 후 상등액을 새로운 튜브로 옮겨 20% PEG/15% NaCl 20mL를 첨가하여 잘 섞은 후 얼음에서 30분간 반응하였다. 이후 8000rpm, 4℃, 30분으로 상등액을 버리고 펠렛(pellet)을 모아서 1%BSA/PBS 2ml로 재현탁시켜 15000rpm, 4℃, 10분간 원심분리시켰다. 이때 모인 펠렛은 버리고 상등액 2mL 중 1mL은 -20℃에 보관하고 1mL은 다음 차수 panning에 이용하였다.
2-2: ELISA 방식의 개별클론 확보
Phage display 합성 scFv 라이브러리 최종 증폭집단의 단일 콜로니를 채취한 다음 SB/카베니실린(carbenicillin) 1.5mL에 OD600에서 0.8~1.0 정도까지 37℃, 220rpm으로 배양한 후 1mM IPTG, 30℃, 200rpm으로 12시간 이상 배양시켰다. 이 반응물을 5500rpm, 5분간 원심분리한 후 각각의 상층액만을 MSLN 항원이 깔려있는 ELISA 플레이트에 첨가한 후 2시간 동안 상온에서 반응한 후 PBST(1XPBS, 0.05% tween 20)로 4회 세척 후 HRP/Anti-hFab-HRP conjugate를 1% BSA/1XPBS로 1/5000로 희석한 것을 첨가한 후 1시간 동안 상온에서 반응한 후 다시 PBST(1XPBS, 0.05% tween 20)로 4회 세척한 후 TMB 용액을 첨가한 후 5~10분간 반응한 후에 TMB stop 용액을 첨가한 후 TECAN sunrise를 이용하여 450nm 측정 파장에서 그 값을 읽고 높은 O.D 값을 갖는 클론을 개별클론으로 확보하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 인간 MSLN에 특이적으로 결합하는 클론을 선별할 수 있었고, 이들의 아미노산 서열을 확인하였다.
표 5는 표 4의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.
클론 가변영역 아미노산 서열 서열번호
MS501 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSS 46
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG 47
MS502 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 48
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLNGYVFGGGTKVTVLG 49
MS502-1 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 48
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCICSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLNGYVFGGGTKLTVLG 50
MS503 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAFTFDYWGQGTLVTVSS 51
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG 52
MS504 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPNGSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDMAVYYCAKNLLTFDYWGQGTLVTVSS 53
경쇄 QSVLTQPPSASGPPGQRVTISCTGSSSNIGNNSVSWYQQLPGTAPKLLIYYDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIGGLRSEDEADYYCGAWDDSLNAYVFGGGTKLTVLG 54
MS505 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPDGSNKYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNAYTFDYWGQGTLVTVSS 55
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLNGYVFGGGTKLTVLG 56
MS506 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPGSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLYTFDYWGQGTLVTVSS 57
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYYDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGPRSEDEADYYCGAWDSSLSAYVFGGGTKLTVLG 58
클론 가변영역 CDR1 CDR2 CDR3
MS501 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIYPDSGSTYYADSVKG
(서열번호 60)		 NIYTFDY
(서열번호 61)
경쇄 SGSSSNIGSNAVS
(서열번호 62)		 YNNQRPS
(서열번호 63)		 GSWDSSLSGYV
(서열번호 64)
MS502 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
MS502-1 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 ICSSSNIGSNAVS
(서열번호 70)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
MS503 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 SIYPGDGSTYYADSVKG
(서열번호 71)		 NAFTFDY
(서열번호 72)
경쇄 SGSSSNIGSNAVS
(서열번호 62)		 YNSHRPS
(서열번호 73)		 GTWDSSLSGYV
(서열번호 74)
MS504 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 SIYPNGSSKYYADSVKG
(서열번호 75)		 NLLTFDY
(서열번호 76)
경쇄 TGSSSNIGNNSVS
(서열번호 77)		 YDSHRPS
(서열번호 78)		 GAWDDSLNAYV
(서열번호 79)
MS505 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 AIYPDGSNKYYADSVKG
(서열번호 80)		 NAYTFDY
(서열번호 81)
경쇄 SGSSSNIGSNAVS
(서열번호 62)		 YNSQRPS
(서열번호 82)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 83)
MS506 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 SIYPGSGSTYYADSVKG
(서열번호 84)		 NLYTFDY
(서열번호 85)
경쇄 TGSSSNIGSNAVT
(서열번호 86)		 YDSHRPS
(서열번호 78)		 GAWDSSLSAYV
(서열번호 87)
2-3: 항-메소텔린 항체의 IgG 유전자 클로닝
확보된 MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 클론 항체의 경쇄 가변영역을 코딩하는 유전자가 함유된 pComb3X phagemid를 추출한 다음, 이를 주형(template)으로 MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 클론 항체의 가변 경쇄영역을 Accupower Pfu PCR premix를 이용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 6: 서열번호 86)와 역방향 프라이머(표 6: 서열번호 87)로 PCR을 수행하였다. 또한, 인간 항체의 카파 경쇄 불변영역(kappa light chain constant region)을 순방향 프라이머(표 6: 서열번호 88)와 역방향 프라이머(표 6: 서열번호 89)로 PCR을 수행하였다. 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 각 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역을 섞어 중첩 PCR(overlapping PCR)을 수행하여 경쇄 영역(light chain region)을 발현하는 유전자를 클로닝하였다. 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 분리된 유전자를 NotI, HindIII 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음, 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pcIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 경쇄 영역 유전자를 선형 pcIW 벡터의 NotI, HindIII 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
상기 MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 클론 항체의 중쇄 가변영역을 코딩하는 유전자가 함유된 pComb3X phagemid를 추출한 다음, 이를 주형(template)으로 Accupower Pfu PCR premix(Bioneer)를 이용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 6: 서열번호 90)와 ApaI이 포함된 역방향 프라이머로(표 6: 서열번호 91) PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 분리된 유전자를 NotI, ApaI 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음, 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. 인간 이뮤노글로불린 타입 1의 중쇄 불변영역(IgG1 heavy chain constant region) 유전자가 들어있는 pcIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 중쇄 가변영역 유전자를 인간 중쇄 불변영역이 들어있는 선형 pcIW 벡터의 NotI, ApaI 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
이름 염기서열 서열번호
NotI-Leader- VL-F NNNNGCGGCCGCCATGGATAGCCAGGCTCAGGTGCTGATGCTGCTGCTGCTGTGGGTGTCAGGGACTTG CGGGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCA 88
VL-R GGGGTTGGCCTTGGGCTGGCCTAGGACCGTCAGCTTGGT 89
VL-CL-F CAGCCCAAGGCCAACCCC 90
HindIII-VL-R NNNNGGATCCAAGCTTACTAACATTCTGTAGGGGCCACTGTC 91
HD-Heavy-F GGTGTCCAGGCGGCCGCCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG 92
HD-Heavy-R GGGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAGTGT 93
2-4: MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 클론 항체의 IgG의 생산 및 정제
Phage display scFv 라이브러리로부터 얻어진 MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 클론 항체를 생산 및 정제하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.5 X 106 세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO2, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 106 세포/mL 농도(생존율(viability)=95%)로 30mL를 준비하였다. 30℃의 DNA(pcIw-MS502 중쇄 가변영역: 15μg, pcIw-anti-Mesothelin 경쇄 가변영역 돌연변이: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamine™ 293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분간 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO2, 125rpm) ExpiFectamine™ 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamine™ 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전 반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL을 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분간 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다.
2-5: 항-MSLN 항체의 항원에 대한 정량적인 결합력 측정
정제된 항-MSLN 항체인 MI323, MI329, MI403, MS502클론 항체의 재조합 인간 MSLN(Recombinant human Mesothelin)에 대한 정량적인 결합력(친화도(Affinity))을 Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. HEK293 세포로부터 정제된 MSLN(Cat.No.3265-MS, R&D systems)를 아민-카르복실 반응을 이용하여 CM5칩(GE Healthcare, 미국)에 200 Rmax가 되도록 고정시킨 다음, HBS-EP 완충용액(10mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 클론 C2G1, 클론 C2G4 또는 클론 C3C8 항체를 0.078nM~5nM 농도 범위에서 결합(association) 120초, 해리(dissociation) 1800초간 유속 30μL/분으로 흘려주었다. 10mM Glycine-HCl pH1.5를 30초 동안 유속 30μL/분으로 흘려줌으로써 MSLN에 결합된 항체의 해리를 유도하였다(표 7). Biacore T-200 evaluation software를 이용하여 친화도를 운동속도상수(Kon 및 Koff)와 평형해리상수(KD)로 수득하였다(표 8).
SPR Biacore T200
칩(Chip) CM5
러닝버퍼(Running Buffer) HBS-EP pH7.4
유속률(Flow rate) 30μL/분
결합(Association) / 해리(dissociation time) 120초 / 600초
IgG 농도 0.078~5nM, 1/2 계단희석(serial dilution)
재생(Regeneration) 10mM Glycine-HCl pH1.5, 30초
Kon Koff KD
MI323 2.7X105 4.8X10-5 1.8X10-10
MI329 1.4X106 5.1X10-5 3.5X10-11
MI403 8.9X104 4.0X10-5 4.5X10-10
MS502 1.9X107 4.3X10-3 2.3X10-10
실시예 3: MS502 클론 친화성 성숙(affinity maturation) 항체의 제조방법
3-1: MS502 클론 친화성 성숙(affinity maturation) 라이브러리 디자인
항-메소텔린 MS502 클론의 아미노산 서열을 Swiss model 홈페이지(http://swissmodel.expasy.org/)에 접속하여 입력 후 주형(template) 서열을 찾았다. 상동성 서열 기반으로 50개의 서열을 찾았고, 각 서열을 주형으로 지정하여 modeling을 수행하였다. QMEAN4 값(Cβ, all atom, solvation, torsion)을 기준으로 50여개의 서열을 순위별로 나열하였고, QMEAN4 값 이외에도 서열 identity와 resolution을 감안하여 주형을 선정하였다. 중쇄 가변영역은 3g6a.1.B, 경쇄 가변영역은 3qhz.1.B(LCDR1,2)과 4o5l.1.A(LCDR3)가 선정되었다. 선정된 주형을 기반으로 얻어진 MS502 구조를 pymol 프로그램으로 분석하여 CDR 중 돌출된 아미노산을 기준으로 paratope을 선정하였다(도 1 참조). 이 중 VL CDR2 Y49, Y50, K53의 경우 Tyr과 Lys이 일반적으로 결합에 긍정적 효과를 나타내는 아미노산이므로 paratope으로 예상되지만 돌연변이 후보 아미노산에서 제외시켰다. 돌연변이 도입은 기존 서열을 50%보존 후 Tyr, Ser, Gly 비율을 높이고, 친수성(hydrophilic), 소수성(hydrophobic), 양전하(positive charge), 음전하(negative charge) 비율이 고르게 들어가도록(표 9) handmix primer(IDT, 미국)를 이용하여 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열을 조절하여 디자인하였다. 중쇄 가변영역은 CDR1, 2, 3에 모두 돌연변이가 도입되므로 각 3개의 절편(fragment)으로 나뉘어 절편 PCR(fragment PCR) 이후 중첩 PCR(overlapping PCR)을 통해 라이브러리가 구축되도록 디자인하였고 경쇄 가변영역은 CDR1,3에만 돌연변이(mutation)가 도입되므로 각 2개의 절편으로 나뉘어 절편 PCR 이후 중첩 PCR을 통해 라이브러리가 구축되도록 디자인하였다. 돌연변이 도입에 따른 라이브러리의 이론적 크기는 중쇄 가변영역은 5.83 X 1010, 경쇄 가변영역은 2.16 X 104이었다.
Figure pat00001
3-2: 경쇄 가변영역 라이브러리 구축
라이브러리에 돌연변이를 도입하기 위하여 우선 경쇄 가변영역을 2개로 나누어 절편 PCR(fragment PCR)을 수행하였다. 경쇄 가변영역 절편(fragment) 1번은 항-메소텔린 MS502 클론의 경쇄 가변영역 유전자서열을 주형으로 순방향 primer(표 10: 서열번호 93), 역방향 primer(표 10: 서열번호 94)를 첨가하고, 경쇄 가변영역 fragment 2번은 항-메소텔린 MS502 클론의 경쇄 가변영역 유전자서열을 주형으로 순방향 primer(표 10: 서열번호 95), 역방향 primer(표 10: 서열번호 96)를 첨가한 후 각각의 fragment를 Primerstar polymerase premix(Takara)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit, CAT. NO. 28706, QIAGEN)를 이용하여 각각 분리하였다. 경쇄 불변영역은 경쇄 람다영역을 주형으로 순방향 primer(표 10: 서열번호 97), 역방향 primer(표 10: 서열번호 98)를 첨가한 후 각각의 절편을 Primestar polymerase premix를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 30초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 분리하였다. 확보된 경쇄 가변영역 절편(fragment) 1, 2와 경쇄 불변영역을 1:1:1 몰 비를 맞추어 주형을 삼고, 순방향 primer(표 10: 서열번호 92), 역방향 primer(표 10: 서열번호 98)를 첨가한 후 각각의 절편을 Primestar polymerase premix를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 20초, 60℃에서 30초, 72℃에서 60초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 분리 후 경쇄 가변-불변영역 친화성 성숙(affinity maturation) 유전자를 확보하였다. 확보된 유전자를 NruI과 XbaI(NEB) 제한효소로 37℃에서 4시간 반응시켰다. 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, NEB)를 사용하여, 상기 분리된 유전자를 MS502 중쇄 가변-불변영역이 들어있는 선형 pComb3x 벡터의 NruI, XbaI 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-competent cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, LB 배지 300mL에 1시간동안 37℃, 220rpm에서 배양 후 카베니실린(carbenicillin) 150μL, 테트라사이클린(tetracycline) 300μL를 처리한 후 1시간 동안 37℃, 220rpm에서 진탕배양하였다. 여기에 VCS M13 helper phage 4.5mL(1011pfu)을 처리한 후 1시간 동안 37℃, 220rpm에서 진탕배양한 후 카나마이신(kanamycin) 300μL, 카베니실린(carbenicillin) 300μL를 처리하고 37℃, 220rpm으로 밤새 배양하였다. 다음날, 배양한 세포를 4000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 새로운 용기에 옮겨 담았다. phage를 침전시키기 위해 5X PEG/NaCl을 1X가 되게 상등액에 첨가한 후 얼음에 30분 이상 방치하였다. 침전시킨 phage를 8000rpm, 30분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고 침전된 phage를 10mL의 PBS로 재현탁(re-suspension)하였다. 세포 파괴물(cell debris)을 제거하기 위해 10mL의 PBS로 녹인 phage를 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리한 후 4℃에 보관하였다. 라이브러리 크기는 형질전환 후 1시간 뒤 배양액 100μL를 채취하여 단계적 희석방식으로 카베니실린(Carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 콜로니 카운팅(colony counting)을 통하여 확인하였다.
3-3: 중쇄 가변영역 라이브러리 구축
라이브러리에 돌연변이를 도입하기 위하여 우선 중쇄 가변영역을 3개로 나누어 절편 PCR(fragment PCR)을 수행하였다. 중쇄 가변영역 절편(fragment) 1번은 항-메소텔린 MS502 클론의 중쇄 가변영역 유전자서열을 주형으로 순방향 primer(표 10: 서열번호 99) , 역방향 primer(표 10: 서열번호 100)를 첨가하고, 중쇄 가변영역 fragment 2번은 항-메소텔린 MS502 클론의 중쇄 가변영역 유전자서열을 주형으로 순방향 primer(표 10: 서열번호 101), 역방향 primer(표 10: 서열번호 102)를 첨가하고, 중쇄 가변영역 fragment 3번은 항-메소텔린 MS502 클론의 중쇄 가변영역 유전자서열을 주형으로 순방향 primer(표 10: 서열번호 103), 역방향 primer(표 10: 서열번호 104)를 첨가 후 각각의 fragment를 Primerstar polymerase premix(Takara)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 확보된 중쇄 가변영역 절편(fragment) 1, 2, 3을 1:1:1 몰 비를 맞추어 주형을 삼고, 순방향 primer(표 10: 서열번호 99), 역방향 primer(표 10: 서열번호 106)를 첨가한 후 각각의 fragment를 Primestar polymerase premix를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 20초, 60℃에서 30초, 72℃에서 60초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 분리 후 중쇄 가변영역 친화성 성숙(affinity maturation) 유전자를 확보하였다. 확보된 유전자를 XhoI과 ApaI(NEB) 제한효소로 37℃에서 4시간 반응시켰다. 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, NEB)를 사용하여, 상기 분리된 유전자를 MS502 경쇄 가변-불변영역이 들어있는 선형 pComb3x 벡터의 XhoI, ApaI 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-competent cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, LB 배지 300mL에 1시간 동안 37℃, 220rpm에서 배양 후 카베니실린(carbenicillin) 150μL, 테트라사이클린(tetracycline) 300μL를 처리한 후 1시간 동안 37℃, 220rpm에서 현탁배양하였다. 여기에 VCS M13 helper phage 4.5mL(1011pfu)을 처리한 후 1시간 동안 37℃, 220rpm에서 진탕배양한 후 카나마이신(kanamycin) 300μL, 카베니실린(carbenicillin) 300μL를 처리하고 37℃, 220rpm으로 밤새 배양하였다. 다음날, 배양한 세포를 4000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 새로운 용기에 옮겨 담았다. phage를 침전시키기 위해 5X PEG/NaCl을 1X가 되게 상등액에 첨가한 후 얼음에 30분 이상 방치하였다. 침전시킨 phage를 8000rpm, 30분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고 침전된 phage를 10mL의 PBS로 재현탁(re-suspension)하였다. 세포 파괴물(cell debris)를 제거하기 위해 10mL의 PBS로 녹인 phage를 14,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리한 후 4℃에 보관하였다. 라이브러리 크기는 형질전환 후 1시간 뒤 배양액 100μL를 채취하여 단계적 희석방식으로 카베니실린(Carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말 한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 콜로니 카운팅(colony counting)을 통하여 확인하였다.
이름 염기서열 서열번호
MS502 VL FR1 Fo NruI GC Tcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtggcccaggcggcc CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA 94
MS502 VL FR1 Fo CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CCC TCA 95
MS502 VL FR1 Re GAG CTG CTG GTA CCA GGA GAC AGC ATT RX5X4 GCC AAT ATT AGA TGA AGA GCC AGT ACA AGA 96
MS502 VL FR2 Fo GCC AAT ATT AGA TGA AGA GCC AGT ACA AGA 97
MS502 VL FR2 Re ACC TAG GAC GGT CAC CTT GGT GCC TCC GCC GAA GAC ATA ACC RX3X3 CAG GCT RX7X4 ATC CX8X4 AGA ACC ACA GTA ATA ATC AGC CTC ATC CTC GGA 98
MS502 CL Fo GGC ACC AAG GTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC AAG GCC AAC CCC ACT GTC 99
MS502 CL Re GCT CTA GAA CAT TCT GTA GGG GCC ACT GTC TTC TC 100
MS502 VH FR1 Fo NcoI gcccatggcc GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG 101
MS502 VH FR1 Re AGC CTG GCG GAC CCA GCT CAT NX1X2 RX3X4 RX3X3 GCT AAA GGT GAA TCC AGA GGC CGC ACA 102
MS502 VH FR2 Fo atgagctgggtccgccaggct 103
MS502 VH FR2 Re GGT GAA CCG ACC TCT TAC AGA ATC AGC GTA ATA TTT RX5X4 NX2X2 ACT RX3X2 AGG AGG GAT CCC TGA GAC CCA CTC 104
MS502 VH FR3 Fo AAA TAT TAC GCT GAT TCT GTA AGA GGT CGG TTC ACC 105
MS502 VH FR3 Re TGA GCT CAC CGT GAC CAG TGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC RX6X6 RX7X4 NX4X1 CAT ATT TTT CGC ACA GTA ATA CAC GGC CGT 106
MS502 VH Re TGA GCT CAC CGT GAC CAG TGT ACC CTG 107
MS502 VH Re ApaI GCG GGC CCT TGG TGG AGG CTG AGC TCA CCG TGA CCA GTG TAC CCT G 108
표 10에서 X 코돈(codon)은 ACGT 각각을 특정비율로 조절한 degenerative codon으로, 해독(translation)되는 아미노산의 비율을 조절을 가능하게 한다. 일례로, 서열번호 102의 NX1X2 코돈의 경우 N은 A, C, G, T가 무작위 비율로 코딩되고, X1은 A 10%, C 10%, G 70%, T 10%, X2는 A 10% C 70% G 10% T 10% 비율로 코딩된다. 이는 역방향 프라이머로 디자인된 것이므로 정방향으로 변환한다면, X2X1N 코돈이 되고, X2는 A 10%, C 70%, G 10%, T 10%, X1은 A 10%, C 10%, G 70%, T 10% 비율를 코딩된다. 결과적으로, 이는 중쇄가변영역 CDR1 Kabat 넘버기준 31번을 Tyr 7%, Ser 8%, Gly 1%, His 7%, Asp 7% Phe 1%, Thr 7%, Asn 49%, Ala 1%, Val 1%, Leu 1%, Ile 7%, Pro 1%, Cys 1%의 아미노산으로 해독(translation)되게 한다.
3-4: 경쇄 가변영역 돌연변이 항체선별
Solid phase polystyrene tube(Cat.No.444202, Nunc)에 재조합 인간 단백질 MSLN을 1μg/mL의 농도로 1mL 넣고 4℃에서 12시간 이상 코팅한 튜브를 0.05% PBST 5mL로 3회 세척하였다. MSLN이 코팅된 Immuno tube에 1%BSA/PBS 5ml을 넣고, 상온에서 2시간 블로킹(blocking)하였다. Immuno tube의 블로킹(blocking) 버퍼를 제거한 후 경쇄 가변영역 phage 라이브러리를 튜브에 처리하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 이 후 PBST 5mL로 4회 세척하였다. Immuno tube에 1mL Glycine(pH2.0) Elution 버퍼를 처리하여 상온에서 10분간 반응시켜 상등액을 얻은 후 용출(Elution)한 phage에 1.5M Tris-Cl(pH 8.8) 100μL를 첨가하여 중화시켰다. 약 2시간 배양한(OD600 = 0.8~1.0) XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene) 10mL에 중화시킨 phage를 처리하였다. 상온에서 30분간 감염(infection)시킨 후 감염된 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene) 10mL에 SB 10mL, 테트라사이클린(tetracycline)(50mg/ml) 20μL, 카베니실린(carbenicillin)(100mg/mL) 10μL를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕배양(200rpm)하였다. VCSM13 helper phage(> 1011 pfu/ml) 1mL을 처리한 후 37℃에서 1시간 진탕배양(200rpm)하였다. 1시간 배양 후 SB 80mL, 카나마이신(kanamycin) 100μL, 카베니실린(carbenicillin)(100mg/mL) 100μL를 처리하고 37℃에서 밤새 배양(200 rpm)하였다. 밤새 배양한 library는 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액만을 분리하고, 5X PEG/NaCl 버퍼를 1X로 넣어 섞어 준 다음 얼음에서 30분 방치하였다. 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 펠렛(pellet)을 2ml의 1% BSA/PBS로 재현탁한 다음 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 다음 차수의 panning에 사용하였다. 상기 과정을 4회 반복 수행하였다.
3-5: 중쇄 가변영역 돌연변이 항체선별
Streptavidin microbead(Miltenyl biotec 130-048-101) 50μL 상등액을 제거한 후 PBS 1ml 넣어주어 3회 세척하였다. Bead에 1% BSA가 포함된 PBS 1mL을 넣어주고 상온에서 2시간 회전(rotation)하여 블로킹(blocking)시켜준다. 50nM MSLN을 500μL PBS에 넣어준 후 MS502 VH rational library phage 500μL를 섞어주어 상온에서 1시간 회전하여 반응시켜준다. Bead의 블로킹(blocking) 버퍼를 제거한 후 MSLN 과 phage가 혼합된 용액을 Bead에 처리하여 상온에서 15분간 반응시켰다. 이 후 PBST 1mL로 6회 세척하였다. Bead에 1mL Glycine(pH2.0) Elution buffer를 처리하여 상온에서 10분간 반응시켜 상등액을 얻은 후 용출한 phgae에 1.5M Tris-Cl(pH 8.8) 100μL을 첨가하여 중화시켰다. 약 2~2.5시간 배양한(OD600 = 0.8~1.0) XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene) 10 mL에 중화시킨 phage를 처리하였다. 상온에서 30분간 감염(infection)시킨 후 감염된(infected) XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene) 10mL에 SB 10mL, 테트라사이클린(tetracycline)(50mg/mL) 20μL, 카베니실린(carbenicillin)(100mg/mL) 10μL를 첨가하여 37℃에서 1시간 진탕배양(200rpm)하였다. VCSM13 helper phage(> 1011 pfu/mL) 1mL을 처리한 후 37℃에서 1시간 현탁배양(200rpm)하였다. 1시간 배양 후 SB 80mL, 카나마이신(kanamycin) 100μL, 카베니실린(carbenicillin)(100mg/ml) 100μL를 처리하고 37℃에서 밤새 배양(200 rpm)하였다. 밤새 배양한 library는 4000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액만을 분리하고, 5X PEG/NaCl buffer를 1X로 넣어 섞어준 다음 얼음에서 30분간 방치하였다. 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 펠렛(pellet)을 2mL의 1% BSA/PBS로 재현탁한 다음 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 다음 차수의 panning에 사용하였다. MSLN에 대해 MS502 VH rational library phage 를 이용하여 Bead panning을 총 3차까지 진행하였다. 2, 3차 panning 결과 output titer가 증가한 것으로 보아 MSLN에 대한 항체가 증폭된 것으로 확인되었다.
3-6: ELISA 방식의 개별클론 확보
경쇄/중쇄 가변영역 각각의 라이브러리의 최종 증폭집단의 단일 콜로니를 채취한 다음 SB/카베니실린(carbenicillin) 1.5mL에 OD600에서 0.8~1.0 정도까지 37℃, 220rpm으로 배양한 후 1mM IPTG, 30℃, 200rpm으로 12시간 이상 배양시켰다. 이 반응물을 5500rpm, 5분간 원심분리한 후 각각의 상층액만을 MSLN 항원이 깔려있는 ELISA 플레이트에 첨가한 후 2시간 동안 상온에서 반응한 후 PBST(1XPBS, 0.05% tween 20)로 4회 세척 후 HRP/Anti-hFab-HRP conjugate를 1% BSA/1XPBS로 1/5000로 희석한 것을 첨가한 후 1시간 동안 상온에서 반응한 후 다시 PBST(1XPBS, 0.05% tween 20)로 4회 세척한 후 TMB 용액을 첨가한 후 5~10분간 방치한 후에 TMB stop 용액을 첨가한 후 TECAN sunrise를 이용하여 450nm 측정 파장에서 그 값을 읽고 높은 O.D 값을 갖는 클론을 개별클론으로 확보하였다.
그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 인간 MSLN에 특이적으로 결합하는 클론을 선별할 수 있었고, 이들의 아미노산 서열을 확인하였다.
표 12는 표 11의 클론 항체의 CDR 아미노산 서열을 Kabat numbering 기준으로 표기한 것이다.
클론 가변영역 아미노산 서열 서열번호
C2G1 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 48
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGPNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKVTVLG 109
C2G4 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 48
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG 110
C3C8 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 48
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGPNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSDLRGYVFGGGTKVTVLG 111
54 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPDSSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNIYTFDYWGQGTLVTVSS 112
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG 47
56 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSASKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 113
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLNGYVFGGGTKVTVLG 49
2-30 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSNSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMRTFDYWGQGTLVTVSS 114
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDSSLSGYVFGGGTKLTVLG 49
2-73 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPNSDSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 115
경쇄 QSVLTQPPSASGPPGQRVTISCTGSSSNIGNNSVSWYQQLPGTAPKLLIYYDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIGGLRSEDEADYYCGAWDDSLNAYVFGGGTKLTVLG 49
2-78 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMFSFDYWGQGTLVTVSS 116
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGRRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDSSLNGYVFGGGTKLTVLG 49
클론 가변영역 CDR1 CDR2 CDR3
C2G1 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGPNAVS
(서열번호 117)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLSGYV
(서열번호 118)
C2G4 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDPSLNGYV
(서열번호 119)
C3C8 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGPNAVS
(서열번호 117)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSDLRGYV
(서열번호 120)
54 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSSSKYYADSVRG
(서열번호 121)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
56 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSASKYYADSVRG
(서열번호 122)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
2-30 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSNSKYYADSVRG
(서열번호 123)		 NMRTFDY
(서열번호 124)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
2-73 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPNSDSKYYADSVRG
(서열번호 125)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
2-78 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMFSFDY
(서열번호 126)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDSSLNGYV
(서열번호 69)
3-7: SPR을 이용한 개별클론의 결합력 상대 비교 및 선정
실시예 3-3에서 실시한 ELISA 방식의 개별클론 확인에서 확보된 개별클론의 배양액으로 결합력을 비교 측정하기 위하여, 먼저 Biacore Series S CM5 Chip(GE healthcare)에 인간 MSLN을 pH4.0 acetate 버퍼에 1μg/ml로 녹이고 유속 10μL/분으로 흘려 1000Ru가 되도록 고정하였다. 실시예 3-6에서 발현한 Fab 상등액(supernatant)을 pH7.4 HBS-EP 버퍼에 1/10 희석하여 유속 30μL/분으로 결합(association) 120초, 해리(dissociation) 180초로 흘려 바인딩(binding) 분석을 수행하였다. 재생(Regeneration)은 10mM Glycine-HCl pH1.5 버퍼로 30초간 수행한다 ELISA와 SPR 바인딩 데이터를 비교 분석하여 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역의 최종 클론을 선정하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 경쇄 가변영역 돌연변이 및 중쇄 가변영역 돌연변이의 결합력을 상대 비교하여, 최종 클론으로 경쇄 가변영역은 C2G1, C2G4 C3C8을 선정하였고, 중쇄 가변영역은 56, 2-30, 2-58, 2-73, 2-78을 선정하였다.
3-8: 클론 MS502 경쇄 가변영역 돌연변이 항체의 IgG 유전자 클로닝
확보된 경쇄 가변영역 C2G1, C2G4 C3C8 유전자를 주형으로 각각을 PrimeSTAR HS DNA 중합효소(Cat.No.R010B; Takara)를 사용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 6: 서열번호 86)와 역방향 프라이머(표 6: 서열번호 87)로 PCR을 수행하였다. 또한, 인간 항체의 카파 경쇄 불변영역(kappa light chain constant region)을 순방향 프라이머(표 6: 서열번호 88)와 역방향 프라이머(표 6: 서열번호 89)로 PCR을 수행하였다. 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 각 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역을 섞어 중첩 PCR(overlapping PCR)을 수행하여 경쇄 영역(light chain region)을 발현하는 유전자를 클로닝하였다. 조건은 94℃에서 10분간 노출 후 94℃에서 15초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 분리된 유전자를 NotI, HindIII 제한효소로 37℃에서 12시간 이상 반응시킨 다음, 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pcIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA Ligase(Cat.No.M0203S, New England BioLabs(NEB))를 사용하여, 상기 분리된 C2G1, C2G4, C3C8 경쇄 영역 유전자를 선형 pcIW 벡터의 NotI, HindIII 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
3-9: 클론 MS502 중쇄 가변영역 돌연변이 항체의 IgG 유전자 클로닝
중쇄 가변영역은 56, 2-30, 2-58, 2-73, 2-78 유전자를 주형으로 각각을 PrimeSTAR HS DNA 중합효소(Cat.No.R010B; Takara)를 사용하여 NotI이 포함된 순방향 프라이머(표 6: 서열번호 90)와 ApaI이 포함된 역방향 프라이머(표 6: 서열번호 91)로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분간 노출 후 98℃에서 10초, 58℃에서 10초, 72℃에서 30초간 노출을 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응하였다. 상기 증폭된 유전자를 1% 아가로스 젤에서 예상한 크기의 DNA 밴드를 확인하였으며 이를 젤 적출 키트를 이용하여 각각 분리하였다. 이후 분리된 세 종류의 유전자를 KpnI과 ApaI 제한효소로 37℃에서 4시간 반응시켰다. 제한효소로 반응한 유전자를 다시 1% 아가로스 젤에서 분리하였다. pCIW 플라스미드 벡터도 같은 방법으로 절단하였으며 아가로스 젤 상에서 분리하였다. T4 DNA 라이게이즈를 사용하여, 상기 분리된 유전자를 인간 중쇄 불변영역이 들어있는 선형 pcIw 벡터의 NotI, ApaI 사이트에 삽입하였다. 상기 라이게이션(ligation) 반응물을 XL1-Blue 박테리아(Electroporation-Competent Cells; Cat.No.200228, Stratagene)에 형질전환시킨 다음, 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 LB 플레이트(Cat.No.LN004CA, NaraeBiotech)에 도말한 후 37℃에서 12시간 이상 배양한 다음, 단일 콜로니(single colonies)를 골라 배양 후 플라스미드 미니 키트(Cat.No.27405, QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 분리하였고, 이를 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
3-10: 클론 MS502 경쇄 가변영역 돌연변이 항체의 IgG의 생산 및 정제
경쇄 가변영역 돌연변이 항체 C2G1, C2G4, C3C8을 생산 및 정제하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.5 X 106 세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO2, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 106 세포/mL 농도(생존율(viability)=95%)로 30mL를 준비하였다. 30μg의 DNA(pcIw-MS502 중쇄 가변영역: 15μg, pcIw-anti-Mesothelin 경쇄 가변영역 돌연변이: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamine™ 293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분간 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO2, 125rpm) ExpiFectamine™ 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamine™ 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전 반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL를 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분간 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다.
3-11: MSLN 항원에 대한 MS502 경쇄 가변영역 돌연변이 항체의 정량적인 결합력 측정
정제된 항-MSLN 항체인 MS502클론 경쇄 가변영역 돌연변이 항체 C2G1, C2G4, C3C8의 재조합 인간 MSLN(Recombinant human Mesothelin)에 대한 정량적인 결합력(친화도(Affinity))을 Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. HEK293 세포로부터 정제된 MSLN (Cat.No.3265-MS, R&D systems, 미국)를 아민-카르복실 반응을 이용하여 CM5칩(GE Healthcare, CAT. No. BR-1005-30)에 200 Rmax가 되도록 고정시킨 다음, HBS-EP 완충용액(10mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 클론 C2G1, 클론 C2G4 또는 클론 C3C8 항체를 0.078nM~5nM 농도 범위에서 결합(association) 120초, 해리(dissociation) 1800초간 유속 30μL/분으로 흘려주었다. 10mM Glycine-HCl pH1.5를 30초 동안 유속 30μL/분으로 흘려줌으로써 MSLN에 결합된 항체의 해리를 유도하였다(표 13). Biacore T-200 evaluation software를 이용하여 친화도를 운동속도상수(Kon 및 Koff)와 평형해리상수(KD)로 수득하였다(표 14).
SPR Biacore T200
칩(Chip) CM5
러닝버퍼(Running Buffer) HBS-EP pH7.4
유속률(Flow rate) 30μL/분
결합(Association) / 해리(dissociation time) 120초 / 600초
IgG 농도 0.078~5nM, 1/2 계단희석(serial dilution)
재생(Regeneration) 10mM Glycine-HCl pH1.5, 30초
Kon Koff KD
C2G1 7.20X107 6.76X10-3 9.39X10-11
C2G4 1.40X108 6.05X10-3 4.32X10-11
C3C8 5.84X107 7.11X10-3 1.22X10-10
3-12: 클론 MS502 중쇄 가변영역 돌연변이 항체의 IgG의 생산 및 정제
중쇄 가변영역 돌연변이 항체 56, 2-30, 2-58, 2-73, 2-78을 생산 및 정제하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.5 X 106 세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO2, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 106 세포/mL 농도(생존율(viability)=95%)로 30mL를 준비하였다. 30μg의 DNA(pcIw-MS502 중쇄 가변영역 돌연변이: 15μg, pcIw-MS502 경쇄 가변영역: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamine™ 293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO2, 125rpm) ExpiFectamine™ 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamine™ 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전 반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL를 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분간 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다.
3-13: 클론 MS502의 최종 경쇄 가변영역 돌연변이 C2G4 클론과 조합한 중쇄 가변영역 돌연변이 항체의 IgG의 생산 및 정제
경쇄 가변영역 돌연변이 중 친화도 측정에서 가장 우수한 값을 갖는 C2G4 클론을 경쇄 가변영역 최종클론으로 선정하여 고정하고, 이에 중쇄 가변영역 돌연변이 항체 56, 2-30, 2-58, 2-73, 2-78을 조합하여 생산 및 정제하기 위하여 형질주입(transfection) 하루 전에 Expi293F™ 세포를 2.5 X 106 세포/mL 농도로 접종하였다. 24시간 배양(37℃, 8% CO2, 125rpm)후 Expi293™ Expression 배지(Cat.No.A1435101, Gibco)를 첨가하여 세포수 2.5 X 106 세포/mL 농도(생존율(viability)=95%)로 30mL를 준비하였다. 30μg의 DNA(pcIw-MS502 중쇄 가변영역 돌연변이 항체: 15μg, pcIw-경쇄 가변영역 돌연변이 C2G4: 15μg)를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco)에 희석하여 상온에서 5분간 반응하였다. ExpiFectamine™ 293 시약(Cat.No.A14524, Gibco) 80μL를 전체 부피가 1.5mL이 되도록 OptiPro™ SEM 배지(Cat.No.12309019, Gibco) 1.5mL에 섞어준 후 상온에서 5분간 반응하였다. 5분간 반응 후 각각 희석한 DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 1.5mL을 잘 섞어서 상온에서 20~30분간 반응하였다. DNA와 ExpiFectamine™ 293 시약 혼합액 3mL을 Expi293F™ 세포에 처리하였다. 16~18시간 현탁배양 후(37℃, 8% CO2, 125rpm) ExpiFectamine™ 293 Enhancer1(Cat.No.A14524, Gibco) 150μL와 ExpiFectamine™ 293 Enhancer2(Cat.No.A14524, Gibco) 1.5mL을 첨가하여 5일간 현탁배양하였다. 배양이 끝나면 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)를 제거한 후 상등액을 0.22μm 필터에 통과시켜 준비하였다. 각 30mL의 배양액 당 프로테인 A 레진(Protein A resin)인 MabSelect Xtra(Cat.No.17-5269-02, GE Healthcare)를 100μL씩 준비하여 1000rpm에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거하고, 프로테인 A 바인딩 버퍼(Cat.No.21007, Pierce) 400μL씩 3회 세척하였다. 상기 준비된 배양액에 프로테인 A 레진(protein A resin)을 넣고 실온에서 30분간 회전 반응하였다. Pierce spin column-snap cap(Cat.No.69725, Thermo)에 배양액과 레진(resin) 혼합물을 넣고 QIAvac 24 Plus(Cat.No.19413, QIAGEN) vacuum manifold를 사용하여 컬럼에 레진(resin)만을 남겼다. 프로테인 A 바인딩 버퍼 5mL을 넣어 레진(resin)을 세척한 후, 프로테인 A 용출 버퍼(Protein A elution buffer)(Cat.No.21009, Pierce) 200μL를 넣고 재현탁(resuspension)하여 실온에서 2분간 반응한 후 1000rpm에서 1분간 원심분리하여 용출하였다. 각 용출액(eluate)에는 1.5M Tris-HCl(pH 9.0) 2.5μL를 넣어 중화시켰다. 용출은 4~6회에 걸쳐 진행하며, 각 분획(fraction)은 Nanodrop 200C(Thermo scientific)를 사용하여 정량하였다. 단백질이 검출된 분획(fraction)들은 모아서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5mL(Cat.No.0089892, Pierce)을 사용하여 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 버퍼로 완충액을 교환해 준 다음, 환원 및 비환원 조건에서 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하여 최종적으로 농도의 정량 및 항체의 상태를 검증하고, 4℃에 보관하였다.
클론 가변영역 아미노산 서열 서열번호
56-C2G4 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSASKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 113
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG 110
2-30-C2G4 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSNSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMRTFDYWGQGTLVTVSS 114
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG 110
2-73-C2G4 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPNSDSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMLSFDYWGQGTLVTVSS 115
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG 110
2-78-C2G4 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIPPDSGSKYYADSVRGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNMFSFDYWGQGTLVTVSS 116
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDPSLNGYVFGGGTKVTVLG 110
클론 가변영역 CDR1 CDR2 CDR3
56-C2G4 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSASKYYADSVRG
(서열번호 122)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDPSLNGYV
(서열번호 119)
2-30-C2G4 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSNSKYYADSVRG
(서열번호 123)		 NMRTFDY
(서열번호 124)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDPSLNGYV
(서열번호 120)
2-73-C2G4 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPNSDSKYYADSVRG
(서열번호 125)		 NMLSFDY
(서열번호 66)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDPSLNGYV
(서열번호 119)
2-78-C2G4 중쇄 NYAMS
(서열번호 59)		 GIPPDSGSKYYADSVRG
(서열번호 65)		 NMFSFDY
(서열번호 126)
경쇄 TGSSSNIGSNAVS
(서열번호 67)		 YNSKRPS
(서열번호 68)		 GSWDPSLNGYV
(서열번호 119)
3-14: MSLN 항원에 대한 MS502 중쇄 가변영역 돌연변이 항체 및 C2G4와 중쇄 가변영역 돌연변이 항체 조합의 정량적인 결합력 측정
정제된 항- MSLN 항체인 MS502클론 중쇄 가변영역 돌연변이 항체 56, 2-30, 2-73, 2-78와 이를 C2G4 경쇄 가변영역과 조합한 항체 56-C2G4, 2-30-C2G4, 2-73-C2G4, 2-78-C2G4 각각을 재조합 인간 MSLN(Recombinant human Mesothelin)에 대한 정량적인 결합력(친화도(Affinity))을 Biacore T-200(GE Healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. HEK293 세포로부터 정제된 MSLN(Cat.No.3265-MS, R&D systems, 미국)를 아민-카르복실 반응을 이용하여 CM5칩(GE Healthcare, CAT. No. BR-1005-30)에 200 Rmax가 되도록 고정시킨 다음, HBS-EP 완충용액(10mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% surfactant P20)에 순차적으로 희석한 클론 56, 클론 2-30, 클론 2-78, 클론 56-C2G4, 클론 2-30-C2G4, 클론 2-73-C2G4, 클론 2-78-C2G4 항체를 0.078nM~5nM 농도 범위에서 결합(association) 120초, 해리(dissociation) 1800초간 유속 30μL/분으로 흘려주었다. 10mM Glycine-HCl pH1.5를 30초 동안 유속 30μL/분으로 흘려줌으로써 MSLN에 결합된 항체의 해리를 유도하였다(표 17). Biacore T-200 evaluation software를 이용하여 친화도를 운동속도상수(Kon 및 Koff)와 평형해리상수(KD)로 수득하였다(표 18).
SPR Biacore T200
칩(Chip) CM5
러닝버퍼(Running Buffer) HBS-EP pH7.4
유속률(Flow rate) 30μL/분
결합(Association) / 해리(dissociation time) 120초 / 600초
IgG 농도 0.078~5nM, 1/2 계단희석(serial dilution)
재생(Regeneration) 10mM Glycine-HCl pH1.5, 30초
Kon Koff KD
56 1.26X107 1.57X10-3 1.25X10-10
2-30 1.92X108 3.19X10-2 1.66X10-10
2-78 1.50X108 2.44X10-3 1.63X10-11
56 - C2G4 6.61X107 1.08X10-2 1.63X10-10
2-30 - C2G4 1.15X108 2.70X10-2 2.34X10-10
2-73 - C2G4 8.98X107 1.48X10-2 1.65X10-10
2-78 - C2G4 2.10X108 7.82X10-3 3.72X10-11
실시예 4: MSLN 발현 암세포에 대한 항-MSLN 항체의 결합에 대한 FACS 분석
면역 및 합성 라이브러리로부터 도출된 항-MSLN 항체가 MSLN을 발현하는 세포에 선택적으로 결합하는지 평가하기 위해 암세포주에서 MSLN의 발현량을 측정하고, 각 세포에 대한 항체의 결합을 FACS 시험으로 확인하였다.
4-1: MSLN 발현 세포주 제작
MSLN 음성 세포주로 확인된 MiaPaCa-2 췌장암 세포에 MSLN 발현 유닛과 하이그로마이신(Hygromycin) 저항 유전자가 있는 플라스미드(pCMV/MSLN)를 jetPEI(polyethyleneimine) transfection system(Polyplus, 101-40)을 이용하여 세포 내로 전달하였다(도 4). 세포배양액을 48시간 후에 하이그로마이신 B(Hygromycin B)(200μg/mL)를 포함하고 있는 배양액으로 교환하였다. 3일 마다 배양액을 교환해주면서 하이그로마이신(Hygromycin)에 대해 저항성을 보이는 콜로니를 10개 획득하여 각각의 MSLN 발현량을 웨스턴블롯법으로 확인하였다. 췌장암 세포 주 4종(MiaPaCa-2, BxPC-3, Capan-1, AsPC-1) 및 중피종 세포주 2종(H28, H2452)에 대해서도 항-MSLN 항체(#133489, Abcam)를 사용하여 웨스턴블롯으로 세포 내 MSLN 발현량을 확인하였다. 배양되고 있는 세포들에 Tryple Express 용액을 가하여 떼어낸 후 15mL 튜브에 담아 2000rpm에서 3분간 상온에서 원심분리하여 배양액을 제거하고, 100μL 1xSDS-PAGE 시료 완충액(50mM Tris(pH6.8), 2% SDS, 100mM DTT(dithiothreitol), 0.1% BPB(bromophenol blue), 10% 글리세롤)으로 현탁하여 5분 동안 가열하였다. 원심분리하여 상청액을 수거하여 4-12% SDS-PAGE에서 20mA로 약 2시간 동안 전기영동하였고, PVDF 막으로 분리된 단백질을 옮기기 위해 트랜스퍼 유닛을 이용하여 300mA로 Tris-Glycine 완충액(39mM Glycine, 48mM Tris, 0.037% SDS, 20% 메탄올)에서 약 90분 동안 전기영동하였다. 단백질이 옮겨진 PVDF 막에 TBS 블로킹 용액(blocking solution)을 사용하여 상온에서 한 시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체로 항-MSLN 항체(#133489, Abcam)를 5% skim milk/1xTBST 완충액에 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 정도 반응시킨 후에 1xTBST 완충액으로 5분씩 6회 세척해 주었다. 2차 항체로 항 생쥐 HRP(KPL, MA, USA)를 5% skim milk/1xTBST 완충액에 1:20,000으로 희석하여 30분 동안 반응시킨 후 1xTBST 완충액으로 5분씩 6회 세척하고 발색반응액(ECL, Amersham, UK)으로 MSLN 단백질 밴드를 검증하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 각각의 암세포주로부터 70kDa의 전구체(precursor) 형태와 40~50kDa의 성숙(mature) 형태의 MSLN 존재 여부를 측정하여 H28, MiaPaCa-2, BxPC-3, Capan-1 세포주는 MSLN 음성이고, H226, H2452(H2052), AsPC-1은 MSLN 양성임을 확인하였다.
4-2: MSLN 발현 세포주 및 종양 세포주에서 MSLN 발현량 분석
MSLN을 인위적으로 발현시킨 세포주인 MiaPaCa-MSLN에 대해 세포 표면에 존재하는 MSLN을 FACS 시험으로 측정하였다. 배양접시에서 키우고 있는 분석할 세포들을 Tryple Express 용액을 가하여 떼어낸 후 50mL 튜브에 담아 2000rpm에서 3분간 상온에서 원심분리하여 배양액을 따라버리고 PBS로 1회 세척하였다. FACS 완충용액으로 현탁한 다음, 둥근 바닥 튜브로 옮기고 2000rpm에서 3분간 상온에서 원심 분리하였다. 상층액을 버리고 FACS 완충용액으로 세포의 밀도가 4x105개/mL이 되도록 잘 풀어주었다. 그리고 4℃에서 후보 항체 1μg을 첨가하였다. 1시간 후에 FACS 완충용액으로 2회 세척하고, 염소 유래 항-인간 IgG 항체(FITC 접합)를 시료 당 1μL를 넣고 4℃에서 30분 동안 결합시켰다. 2000rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 수거한 다음, 고정 완충용액(Fixation buffer)을 500μL 넣고, 세포를 재현탁시키고, FACS calibur로 측정하였다(도 6).
4-3: 항-MSLN 항체의 MSLN 발현 세포주에 대한 선택적 결합 분석
MSLN을 과발현시킨 세포주(MiaPaCa-MSLN #2)에 항-MSLN 항체가 선택적으로 결합하는지를 FACS 시험으로 측정하였다. 상기 실시예 4-2에서 기술된 방법으로 항-MSLN 후보 항체를 표지시킨 다음, FACS calibur로 측정하였다(도 7).
결합력이 우수한 MI323, MI329, MI403, MS502 후보 항체가 중피종(H226, H2052) 및 췌장암(AsPC-1)의 세포막 MSLN에도 잘 결합하는지 FACS 시험으로 측정하여 MFI 값으로 비교하였다.
Figure pat00002
그 결과, 도 8 및 표 19에 나타난 바와 같이, 중피종과 췌장암 세포주의 MSLN에 대한 MI323, MI329, MI403, MS502 후보 항체의 결합 정도는 다소 차이가 있었으나 모두 유의한 결합력을 나타내었으며, 특히 MI323 후보 항체는 우수한 결합 양상을 나타내었다.
아울러, MSLN에 대한 결합 양상이 우수한 MI323 후보 항체와 Biacore KD(Koff/Kon) 값의 패턴이 다른 MS502, MS502 후보 항체로부터 제작된 중쇄 가변영역 돌연변이 2-78-C2G4 후보 항체가 MSLN을 발현하는 종양 세포에 선택적으로 결합하는지를 MSLN 과발현 MiaPaCa-MSLN #2 세포와 MSLN을 발현하지 않는 MiaPaCa-2에서 평가하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, MI323, MS502, 2-78-C2G4 후보 항체는 MiaPaCa-2 대비 MSLN 과발현 MiaPaCa-MSLN #2 세포에서 우수한 결합 양상을 나타내었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Mogam Biotechnology Institute <120> Novel Antibody Binding to Mesothelin(MSLN), and Composition Comprising the Same <130> P15-B242 <160> 127 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> clone MI323_Variable heavy chain <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Phe Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Met Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> clone MI323_Variable light chain <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 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Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Ser Asp Leu 85 90 95 Arg Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 112 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> clone 54_Variable heavy chain <400> 112 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Pro Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Ile Tyr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser 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Pro Asp Ser Asn Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Met Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 115 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> clone 2-73_Variable heavy chain <400> 115 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Pro Pro Asn Ser Asp Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Met Leu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 116 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial 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115 120 125 Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile 130 135 140 Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln 145 150 155 160 Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu 165 170 175 Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu 180 185 190 Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu 195 200 205 Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg 210 215 220 Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp 225 230 235 240 Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly 245 250 255 Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg 260 265 270 Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile 275 280 285 Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser 290 295 300 Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys 305 310 315 320 Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met 325 330 335 Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu 340 345 350 Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val 355 360 365 Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile 370 375 380 Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu 385 390 395 400 Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp 405 410 415 Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr 420 425 430 Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu 435 440 445 Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp 450 455 460 Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala 465 470 475 480 Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile 485 490 495 Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser 500 505 510 Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr 515 520 525 Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly 530 535 540 Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg 545 550 555 560 Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu 565 570 575 Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser 580 585 590 Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro 595 600 605 Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala 610 615 620

Claims (10)

  1. 다음의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체:
    서열번호 9, 15, 21, 27, 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
    서열번호 10, 16, 22, 28, 60, 65, 71, 75, 80, 84, 121, 122, 123 또는 125의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 11, 17, 23, 29, 61, 66, 72, 76, 81, 85, 124 또는 126의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.
  2. 다음의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체:
    서열번호 12, 18, 24, 30, 62, 67, 70, 77, 86 또는 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
    서열번호 13, 19, 25, 63, 68, 73, 78 또는 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 14, 20, 26, 64, 69, 74, 79, 83, 87, 118, 119 또는 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1, 3, 5, 7, 46, 48, 51, 53, 55, 57, 112, 113, 114, 115 또는 116의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 함유하는 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체.
  4. 제2항에 있어서, 서열번호 2, 4, 6, 8, 47, 52, 54, 56, 58, 109, 110 또는 111의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체.
  5. 서열번호 1, 3, 5, 7, 46, 48, 51, 53, 55, 57, 112, 113, 114, 115 또는 116의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 47, 52, 54, 56, 58, 109, 110 또는 111의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 메소텔린 특이적 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코딩하는 핵산.
  7. 제6항의 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제7항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  9. 제8항의 숙주세포를 배양하여 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물.
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IL258215A IL258215B (en) 2015-09-24 2016-09-23 An anti-mesothelin antibody, encoding said nucleic acid, a vector consisting of said nucleic acid, a host cell consisting of said vector, a preparation method of said antibody, and a pharmaceutical antibody
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ES16848966T ES2857500T3 (es) 2015-09-24 2016-09-23 Anticuerpo anti-mesotelina y composición que comprende el mismo
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101966362B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-05 주식회사 녹십자 항-msln 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
WO2022030730A1 (ko) * 2020-08-04 2022-02-10 주식회사 셀렌진 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체
WO2023277361A1 (ko) * 2021-06-30 2023-01-05 (주)이노베이션바이오 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
US11795215B2 (en) 2020-08-04 2023-10-24 Cellengene Inc Anti-mesothelin chimeric antigen receptor specifically binding to mesothelin

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3472207T (pt) 2016-06-20 2021-03-31 F Star Delta Ltd Moléculas ligantes que se ligam a pd-l1 e lag-3
RU2018142573A (ru) 2016-06-20 2020-07-21 Ф-Стар Бета Лимитед Партнеры по связыванию lag-3
GB201612520D0 (en) 2016-07-19 2016-08-31 F-Star Beta Ltd Binding molecules
WO2019005208A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY
EP3728316A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 F-Star Beta Limited Fc binding fragments comprising a pd-l1 antigen-binding site
GB201811415D0 (en) * 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd Anti-Mesothelin Anti bodies
GB201811450D0 (en) * 2018-07-12 2018-08-29 F Star Delta Ltd Mesothelin and CD137 binding molecules
KR102070016B1 (ko) * 2019-01-21 2020-01-29 (주)녹십자셀 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포
WO2020204305A1 (ko) * 2019-03-29 2020-10-08 주식회사 녹십자 항-메소텔린 항체, 항-cd3 항체 또는 항-egfr 항체를 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체 및 이의 용도
KR102216225B1 (ko) * 2019-06-27 2021-02-17 (주)녹십자셀 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포
KR102507337B1 (ko) * 2021-05-26 2023-03-08 주식회사 셀렌진 항 메소텔린 scFv를 포함하는 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도
TW202321296A (zh) 2021-10-06 2023-06-01 美商鏈接免疫療法公司 抗間皮素抗原結合分子及其用途
CN114423789B (zh) * 2021-12-24 2022-09-30 浙江时迈药业有限公司 针对间皮素的抗体及其用途
KR20240043161A (ko) * 2022-09-23 2024-04-03 국민대학교산학협력단 Grp94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2386367T3 (es) 2005-03-10 2012-08-17 Morphotek, Inc. Anticuerpos anti-mesotelina
KR101554848B1 (ko) * 2007-10-01 2015-09-21 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 메소텔린에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도
US20100222289A1 (en) 2007-10-22 2010-09-02 Cfs Research Llc Methods for diagnosis and treatment of chronic fatigue syndrome
CA2706529C (en) * 2007-11-26 2016-10-25 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Anti-mesothelin antibodies and uses therefor
EP2257572A1 (en) * 2008-03-27 2010-12-08 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Human anti-mesothelin monoclonal antibodies
PH12018500046A1 (en) * 2010-12-20 2019-04-08 Genentech Inc Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates
US20140004121A1 (en) 2012-06-27 2014-01-02 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
AU2013306076B2 (en) * 2012-08-21 2018-01-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
KR20150029457A (ko) * 2013-09-10 2015-03-18 삼성전자주식회사 아넥신 a1에 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101966362B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-05 주식회사 녹십자 항-msln 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
WO2019078698A3 (ko) * 2017-10-20 2019-07-04 주식회사 녹십자 항 -msln항체 및 이를포함하는 암치료용 약학적 조성물
US11401343B2 (en) 2017-10-20 2022-08-02 Green Cross Corporation Anti-MSLN antibody and pharmaceutical composition for cancer treatment comprising same
WO2022030730A1 (ko) * 2020-08-04 2022-02-10 주식회사 셀렌진 메소텔린에 특이적으로 결합하는 항-메소텔린 키메릭 항원 수용체
US11795215B2 (en) 2020-08-04 2023-10-24 Cellengene Inc Anti-mesothelin chimeric antigen receptor specifically binding to mesothelin
WO2023277361A1 (ko) * 2021-06-30 2023-01-05 (주)이노베이션바이오 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도

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