ES2857500T3 - Anticuerpo anti-mesotelina y composición que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a mesotelina que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-mesotelina y composición que comprende el mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo específicamente unido a mesotelina (MSLN), un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, un vector y una célula hospedadora que incluye el ácido nucleico, un método para producir el anticuerpo y una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer o un tumor que incluye el anticuerpo como principio activo.

Antecedentes de la técnica

Un anticuerpo es altamente efectivo para tratar varios tipos de cáncer o tumores, incluidos los tumores sólidos. Por ejemplo, Herceptin se ha utilizado con éxito en el tratamiento del cáncer de mama, y Avastin se ha utilizado con éxito en el tratamiento del cáncer de colon. El centro del desarrollo de tratamiento de cáncer o tumoral con el anticuerpo es desarrollar un anticuerpo contra una proteína de superficie de membrana expresada predominantemente (sobreexpresión) en células tumorales.

La mesotelina (MSLN) es una glucoproteína como un polipéptido precursor de 69 a 71 kDa, y se expresa como una forma precursora de proteína unida a glucofosfatidilinositol (GPI) sobre una superficie celular. El precursor se separa de un sitio de furina (RPRFRR) en el precursor y forma un factor potenciador de megacariocitos de 32 kDa (MPF) que es un polipéptido N-terminal liberado de la célula con una proteína de membrana de mesotelina unida a GPI que es un polipéptido C-terminal de 40 kDa (Hassan R. et al., Clin. Cáncer Res., 10 (12 Pt 1): 3937-3942, 2004; Chang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1): 136-40, 1996).

La mesotelina recibió el nombre de factor potenciador de megacariocitos (MPF) ya que se había purificado de una línea celular pancreática humana HPC-Y5, y se observó que tenía una actividad potenciadora de megacariocitos (Yamaguchi N. et al., J. Biol. Chem. 269). : 805 - 808, 1994).

La función de la mesotelina aún no se ha encontrado claramente. Además, no se han observado anomalías reproductivas, hematológicas o anatómicas letales cuando se produce un ratón deficiente en expresión de gen de mesotelina (Bera, T.K. et al., Mol. Cell. Biol. 20 (8): 2902 - 2906, 2000).

La mesotelina es una glucoproteína presente en la superficie de una célula de un revestimiento mesotelial de celomas peritoneales, pleurales y pericárdicos. La mesotelina se expresa predominantemente (sobreexpresada) en el mesotelioma que es cáncer/célula tumoral, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de pulmón y cáncer de endometrio. Por el contrario, la expresión de la misma está limitada en una célula normal, por ejemplo, una célula mesotelial, que puede ser un objetivo ideal de tratamiento tumoral (Argani, P. et al., Clin. Cancer Res., 7 (12): 3862-8, 2001; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10 (12 Pt 1): 3937, 2004).

Además, la mesotelina reacciona específicamente (interactúa) a CA125 (MUC-16) que es una glucoproteína de tipo mucina presente en una superficie de la célula tumoral confirmada como un antígeno del cáncer de ovario. Específicamente, parece que la unión de CA125 a la mesotelina unida a la membrana es capaz de mediar en la adhesión de células heterotípicas y metástasis, y la CA125 y la mesotelina se coexpresan en un adenocarcinoma de ovario avanzado (Rump, A. et al., J. Biol. Chem., 279 (10): 9190 - 8, 2004). La expresión de la mesotelina en un endotelio de una cavidad peritoneal se correlaciona con una parte preferida para formar metástasis del cáncer de ovario, y la unión mesotelina-CA125 facilita la metástasis peritoneal del tumor ovárico (Gubbels, JA et al., Mol. Cancer, 5 (1): 50, 2006).

En los últimos años, se ha desarrollado un tratamiento dirigido basado en anticuerpos dirigido al cáncer de pulmón, el cáncer de ovario y el cáncer de páncreas que expresa la mesotelina. Como ejemplo, el mAb K1 producido por inmunización del ratón se ha desarrollado como un anticuerpo primario contra un polipéptido de mesotelina unido a membrana (Chang, K., et al., Int. J. Cancer, 50 (3): 373, 1992 ). Sin embargo, debido a la baja afinidad del anticuerpo mAb K1 y la baja tasa de internalización, una inmunotoxina que consiste en mAb K1 unido a un tipo de truncamiento de exotoxina A de Pseudomonas modificada químicamente no es adecuada para el desarrollo clínico (Hassan, R., et al., J Immunother., 23 (4): 473, 2000; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10 (12 Pt 1): 3937, 2004). Posteriormente, se han desarrollado anticuerpos monocatenarios que tienen una afinidad más alta que incluyen SS1-(dsFv) -PE38, que tienen la capacidad de destruir células tumorales in vitro (Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 8 ( 11): 3520, 2002) y una eficacia en modelos de roedores de tumores de expresión de mesotelina humana (Fan, D., et al., Mol. Cancer Ther., 1 (8): 595, 2002). Se puede apreciar a partir de los resultados anteriores que la mesotelina es un objetivo apropiado para la inmunoterapia de cánceres múltiples. Sin embargo, se observó que el SS1- (dsFv) -PE38 tiene inmunogenicidad en ensayos clínicos, de modo que una segunda administración del mismo se ha suspendido en la mayoría de los pacientes, y el SS1-(dsFv) -PE38 tiende a eliminarse rápidamente de la sangre, y por lo tanto, hay un intento de inducir la pegilación del SS1- (dsFv) -PE38 en una forma de proteína de fusión, aumentando así la persistencia del anticuerpo in vivo (Filpula, D., et al., Bioconjugate Chem., 18 (3): 773, 2007).

El documento 2014/004121 A1 desvela un anticuerpo humano aislado anti-mesotelina o proteína o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde dicho anticuerpo tiene al menos una de las siguientes propiedades: a. se une a un epítopo diferente que el anticuerpo MORAb-009; b. compite por la unión con Ab237; c. se une específicamente a mesotelina humana, de cino, de rata y murina; d. no se internaliza tras la unión a mesotelina; e. cuando se une a mesotelina, no inhibe la interacción de CA125 con mesotelina; f. tiene una KD de afinidad de unión de al menos 5,0 pM contra la mesotelina humana; g. tiene función efectora mejorada; h. se une a mesotelina unida a membrana preferentemente sobre mesotelina soluble; e i. reduce el crecimiento de tumor que expresa mesotelina in vivo.

El ensayo clínico de la terapia de cáncer de inmunotoxina que tiene roedores de xenoinjertos como un modelo de cáncer a menudo está limitado por la deficiencia de reactividad cruzada entre un anticuerpo de tratamiento y un homólogo de roedor del mismo. Además, un anticuerpo Fv anti-ratón neutralizante formado a partir de un paciente tratado con un anticuerpo derivado de roedor o un anticuerpo quimérico puede causar toxicidad limitante de la dosis o puede reducir la eficacia terapéutica. Por lo tanto, con el fin de aumentar la eficacia del tratamiento del cáncer, se requiere un anticuerpo dirigido combinado con afinidad aumentada, una velocidad de disociación reducida y reactividad cruzada de roedor con respecto a un antígeno de mesotelina.

Además, como una propiedad adicional del nuevo anticuerpo anti-mesotelina (MSLN), necesita mantener la afinidad con respecto a la mesotelina expresada en la superficie celular de diferentes células cancerosas o tumorales. La mesotelina es una proteína altamente variable y se somete a glucosilación así como a proteólisis después de la traducción en múltiples partes (Hassan, R., et al., Clin Cáncer Res., 10 (12 Pt 1): 3937, 2004). Parece que una variante de transcripción 1 (Genbank NM_005823) representa la especie principal mostrada en líneas de células tumorales probadas hasta la fecha, pero dado que se detectaron tres variantes diferentes de empalme, la variabilidad se extiende a un nivel de transcripción (Muminova, Z.E., et al., BMC Cáncer, 4:19, 2004; Hellstrom, I., et al., Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev. 15 (5): 1014, 2006). Por consiguiente, un anticuerpo anti-endotelina eficaz incluye variabilidad en el patrón de glucosilación que expresa diferentes formas de mesotelinas, pero se requiere que esté unido de forma inmutable a un epítopo de mesotelina expresado en cáncer o superficies de células tumorales derivadas de diferentes pacientes, que es independiente de la variabilidad individual.

Por lo tanto, los presentes inventores hicieron un esfuerzo para producir un nuevo anticuerpo específicamente unido a MSLN y, como resultado, inventaron el nuevo anticuerpo que tiene alta afinidad con respecto a la MSLN sobreexpresada en células cancerosas, y encontraron un potencial del anticuerpo de acuerdo a la presente invención como un agente terapéutico eficaz contra el cáncer, y completaron la presente invención.

Divulgación

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo anticuerpo específicamente unido a mesotelina (MSLN), un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, un vector y una célula hospedadora que incluye el ácido nucleico, un método para producir el mismo, y una composición farmacéutica para tratar cáncer o tumor que incluye el anticuerpo como principio activo.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo anticuerpo específicamente unido a la mesotelina (MSLN).

Solución técnica

Las realizaciones de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones 1 a 6. Son ejemplos de referencia variantes de anticuerpos distintas de las definidas en el conjunto de reivindicaciones. Con el fin de lograr los objetivos anteriores, la presente invención proporciona un anticuerpo específico de mesotelina según las reivindicaciones 1 a 6. Se proporcionan realizaciones así como ejemplos de referencia, que incluyen: una región variable de cadena pesada que incluye una CDR1 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 15, 21, 27 o 59; una CDR2 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 16, 22, 28, 60, 65, 71, 75, 80, 84, 121, 122, 123 o 125; una CDR3 de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 17, 23, 29, 61, 66, 72, 76, 81, 85, 124 o 126.

Se proporcionan realizaciones así como ejemplos de referencia, que incluyen: una región variable de cadena ligera que incluye una CDR1 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 18, 24, 30, 62, 67, 70, 77, 86 o 117; una CDR2 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 19, 25, 63, 68, 73, 78 u 82; una CDR3 de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 20, 26, 64, 69, 74, 79, 83, 87, 118, 119 o 120.

Adicionalmente, se proporcionan realizaciones así como ejemplos de referencia, que incluyen: una región variable de cadena pesada que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 46, 48, 51, 53, 55, 57, 112, 113, 114, 115 o 116 y una región variable de cadena ligera que incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 47, 52, 54, 56, 58, 109, 110 o 111.

Además, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica el anticuerpo específico de MSLN; y un vector que contiene el ácido nucleico; y una célula en la que se introduce el vector.

Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer o un tumor que incluye el anticuerpo anti-MSLN como principio activo.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra estructuras de predicción de una región variable de cadena ligera (VL) y una región variable de cadena pesada (VH) del clon MS502 entre anticuerpos anti-mesotelina (MSLN).

La FIG. 2 ilustra la comparación relativa de los mutantes de la región variable de cadena ligera en vista de la fuerza de unión.

La FIG. 3 ilustra la comparación relativa de los mutantes de la región variable de cadena pesada en vista de la fuerza de unión.

La FIG. 4 ilustra un vector para expresar la MSLN en una línea celular.

La FIG. 5 ilustra una forma precursora y una forma madura de la MSLN en SDS-PAGE.

La FIG. 6 ilustra el análisis de una cantidad de expresión de MSLN de líneas celulares y líneas celulares tumorales que expresan la MSLN.

La FIG. 7 ilustra el análisis de unión selectiva con respecto a las líneas celulares que expresan la MSLN usando un anticuerpo anti-mesotelina (MSLN) de la presente invención.

La FIG. 8 ilustra los valores de MFI obtenidos confirmando si el anticuerpo anti-MSLN está unido a una membrana celular de mesotelioma (H226, H2052) y cánceres de páncreas (AsPC-1) a través de FACS.

La FIG. 9 ilustra los resultados obtenidos al confirmar si el anticuerpo anti-MSLN de la presente invención se une selectivamente a células tumorales que expresan la MSLN.

Mejor modo

Como se usa en el presente documento, el término "mesotelina" o "MSLN" se refiere a cualquier variante, isoforma y homólogo de especie de MSLN humana que se expresa naturalmente por las células.

El término "mesotelina humana" se refiere a una mesotelina de secuencia humana tal como una secuencia de aminoácidos completa de mesotelina humana que tiene el número de acceso Genbank NP_005814.

En una realización de la presente invención, se produjeron anticuerpos monoclonales que se caracterizan estructuralmente para ser unidos específicamente a la mesotelina representada por la SEQ ID NO: 127 y separados, tales como "clon MI323", "clon MI329" como las realizaciones de la presente invención; "clon MI403" y "clon MI407" como ejemplos de referencia; "clon MS501", "clon MS502", "clon MS503" como las realizaciones de la presente invención; "clon MS504", "clon MS505" y "clon MS506" como ejemplos de referencia; "clon C2G1", "clon C2G4" como las realizaciones de la presente invención; "clon C3C8", "clon 54", "clon 56", "clon 2-30", "clon 2-73" como ejemplos de referencia; "clon 2-78" como la realización de la presente invención; y "clon 56-C2G4", "clon 2-30-C2G4", "clon 2-73-C2G4" como ejemplos de referencia; y "clon 2-78-C2G4" como la realización de la presente invención.

Las secuencias de aminoácidos con respecto a una CDR de cadena pesada y una CDR de cadena ligera de cada anticuerpo se muestran en las siguientes Tablas 2, 5, 12 y 16. Como se muestra en las Tablas 1, 4, 11 y 15, un anticuerpo anti-MSLN puede incluir una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera o una secuencia que tiene homología con la misma.

En la presente divulgación, se seleccionaron clones de anticuerpos individuales de anticuerpos purificados, es decir, "clon MI323", "clon MI329", "clon MI403", "clon MS502" y "clon C2G1", "clon C2G4", "clon C3C8" y "clon 56-C2G4", "clon 2-30-C2G4", "clon 2-73-C2G4" o "clon 2-78-C2G4" con respecto a una MSLN humana recombinante, usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (datos no mostrados), y la fuerza de unión cuantitativa se midió usando un biosensor Biacore T-200 (GE Healthcare, EE. UU.) (Ejemplo 2-5, Ejemplo 3-11, Ejemplos 3-14). Como un resultado, como se muestra en las siguientes Tablas 8, 14 y 18, todos los anticuerpos clones producidos tienen afinidad para la mesotelina aunque existe una ligera diferencia.

En la presente divulgación, para evaluar si el anticuerpo anti-MSLN derivado de la biblioteca inmune y sintética se une selectivamente a una célula que expresa MSLN, se mide una cantidad de expresión de la MSLN en una línea celular cancerosa, y un anticuerpo que se une a cada célula se confirma mediante la prueba FACS. Como resultado, como se ilustra en la FIG. 5, se confirmó que las líneas celulares H28, MiaPaCa-2, BxPC-3, Capan-1 son MSLN-negativas, y H226, H2452 (H2052), AsPC-1 son MSLN-positivas al medir si hay MSLN que tiene forma precursora de 70 kDa y forma madura de 40 a 50 kDa de cada línea celular de cáncer.

Además, como un resultado obtenido llevando a cabo análisis de unión selectiva de anticuerpos candidatos anti-MSLN con respecto a las líneas celulares que expresan MSLN (H226, H2452 (H2052), AsPC-1), como se ilustra en la FIG. 8 y la Tabla 19, todos los anticuerpos candidatos MI323, MI329, MI403, MS502 con respecto a la MSLN de mesotelioma y líneas celulares de cáncer de páncreas tienen una fuerza de unión significativa a pesar de que existe una ligera diferencia en el grado de unión. En particular, el anticuerpo candidato MI323 tiene un excelente aspecto de unión.

Además, como un resultado obtenido evaluando si el anticuerpo candidato MI323 que tiene el excelente aspecto de unión con respecto a la MSLN, el anticuerpo candidato MS502 que tiene un patrón diferente de valor KD(Koff/Kon) de Biacore y un anticuerpo candidato 2-78-C2G4 con mutación de región variable de cadena pesada producido a partir del anticuerpo candidato MS502 se une selectivamente a células tumorales que expresan MSLN, en células MiaPaCa-MSLN n.° 2 que sobreexpresan la MSLN y MiaPaCa-2 que no sobreexpresan la MSLN, como se ilustra en FIG. 9, los anticuerpos candidatos MI323, MS502 y 2-78-C2G4 tienen un excelente aspecto de unión en la célula MiaPaCa-MSLN n.° 2 que sobreexpresa la MSLN en comparación con el MiaPaCa-2.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo específicamente unido a mesotelina (MSLN), preferiblemente, un anticuerpo específicamente unido a mesotelina representado por la SEQ ID NO: 127.

La secuencia de aminoácidos de un anticuerpo puede sustituirse por sustitución conservativa. La "sustitución conservativa" se refiere a la modificación del polipéptido que incluye la sustitución de al menos un aminoácido con un aminoácido que tiene propiedades bioquímicas similares al polipéptido correspondiente sin causar la pérdida de la función biológica o bioquímica. La "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a una sustitución en la que un resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene cadenas laterales similares. Las clases de los restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se definen en la técnica. Estas clases incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), aminoácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), aminoácidos que tienen cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Se anticipa que un anticuerpo de la presente divulgación puede retener todavía una actividad mientras tiene la sustitución conservativa de aminoácidos.

La expresión "homología sustancial" se refiere a que cuando dos tipos de ácidos nucleicos o dos tipos de polipéptidos o secuencias designadas de los mismos se alinean y se comparan de manera óptima, los ácidos nucleicos y polipéptidos que tienen la inserción o eliminación de nucleótidos o aminoácidos apropiados tienen al menos aproximadamente 80 % de identidad con el nucleótido o el aminoácido, generalmente, tienen al menos aproximadamente 85 %, preferiblemente aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 % o 99,5 % con el nucleótido o el aminoácido. Como alternativa, cuando un fragmento se hibrida con una cadena complementaria del mismo en condiciones de hibridación selectiva, existe una homología sustancial con el ácido nucleico. La presente divulgación incluye una secuencia de ácido nucleico y una secuencia de polipéptido que tiene una homología sustancial con respecto a la secuencia de ácido nucleico específica y la secuencia de aminoácidos descritas anteriormente.

En el anticuerpo de acuerdo a la presente divulgación, por ejemplo, las secuencias de la cadena pesada (Vh) CDR1, 2 y 3 y las secuencias de la cadena ligera (Vl) CDR1, 2 y 3 se muestran en la Tabla 2, Tabla 5, Tabla 12 y Tabla 16 pueden formarse mezclando secuencias de cadenas pesadas (Vh) y cadenas ligeras (Vl) estructuralmente similares que serán dispuestas en las CDR1,2 y 3 de los pares de cadena pesada (VH)/cadena ligera (Vl).

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" o "composición de anticuerpo" se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo que tienen una composición de molécula única. Aquí, una composición de anticuerpo monoclonal representa la especificidad de unión única y la afinidad por un epítopo específico. Por consiguiente, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que tiene una región variable y una región constante derivada de una secuencia de inmunoglobulina de cableado humano, y que representa una única especificidad de unión. Un anticuerpo humano de la presente invención puede incluir un resto de aminoácido que no está codificado mediante la secuencia de inmunoglobulina de cableado humano (por ejemplo, mutantes introducidos mediante mutagénesis in vitro aleatoria o específica de sitio, o mediante mutación somática in vivo).

El "anticuerpo" utilizado aquí es una molécula de inmunoglobulina que es inmunológicamente reactiva a un antígeno específico, y significa una molécula de proteína que actúa como un receptor que reconoce específicamente un antígeno, y puede incluir todo un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal (anticuerpo de clon único), un anticuerpo completo y un fragmento de anticuerpo. Además, el anticuerpo puede incluir un anticuerpo quimérico (por ejemplo, anticuerpo murino humanizado) y una molécula bivalente o biespecífica (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), un diacuerpo, un triacuerpo y un tetracuerpo.

El anticuerpo completo tiene una estructura que tiene dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, y cada cadena ligera se puede unir a una cadena pesada a través de un enlace disulfuro. El anticuerpo completo incluye IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, y el IgG es un subtipo e incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. El fragmento de anticuerpo significa un fragmento que conserva una función de unión a antígeno, e incluye Fab, Fab', F(ab')2, scFv y Fv, etc.

El Fab tiene una estructura de regiones variables de una cadena ligera y una cadena pesada y una región constante de la cadena ligera y una primera región constante (dominio CH1) de la cadena pesada, y tiene un sitio de unión a antígeno. El Fab' es diferente del Fab porque el Fab' tiene una región bisagra que incluye uno o más restos de cisteína en el extremo C de un dominio CH1 de cadena pesada. El anticuerpo F(ab')2 se produce logrando el enlace disulfuro del resto de cisteína en la región bisagra del Fab'.

El Fv (fragmento variable) se refiere al fragmento de anticuerpo mínimo que solo tiene la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. En el Fv bicatenario (dsFv), la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera están unidas por el enlace disulfuro. En el Fv de cadena sencilla (scFv), la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera generalmente están unidas por un enlace covalente usando un enlazador peptídico. Este fragmento de anticuerpo puede obtenerse usando una enzima proteolítica (por ejemplo, el Fab puede obtenerse mediante corte de restricción del anticuerpo completo con papaína, y el fragmento F(ab')2 puede obtenerse cortando con pepsina), y puede ser construido mediante una tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) usando ADN que codifica la cadena pesada del anticuerpo o la región variable del mismo y ADN que codifica la cadena ligera o la región variable del mismo como molde y utilizando un par de cebadores y amplificación con combinación del ADN que codifica el enlazador peptídico del par de cebadores que permite que ambos extremos del mismo se unan a la cadena pesada o a la región variable de la misma y a la cadena ligera o a la región variable de la misma, respectivamente).

La inmunoglobulina tiene cadenas pesadas y cadenas ligeras, en donde las cadenas pesadas y cadenas ligeras respectivas incluyen una región constante y una región variable (estas regiones también se conocen como dominio). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada incluyen 3 regiones multi-disponibles denominadas región determinante de la complementariedad (de aquí en adelante, denominada "CDR"), y cuatro regiones marco. La CDR actúa principalmente para unirse a un epítopo del antígeno. Las CDR de las cadenas respectivas se denominan secuencialmente CDR1, CDR2 y CDR3 generalmente comenzando desde el extremo N, y también identificadas por las cadenas en las que se localizan las CDR específicas.

El anticuerpo monoclonal (anticuerpo de clon único) usado en la presente memoria significa una molécula de anticuerpo de composición molecular única sustancialmente obtenida en la misma población de anticuerpos, y puede tener una especificidad de unión única y afinidad por un epítopo específico.

El anticuerpo monoclonal (anticuerpo de clon único) usado en el presente documento es una molécula derivada de una inmunoglobulina humana, y todas las secuencias de aminoácidos que configuran el anticuerpo que incluyen una región determinante de complementariedad, una región de estructura están configuradas de secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humano se usa típicamente en el tratamiento de enfermedades humanas, lo que es ventajoso porque i) interactúa más favorablemente con el sistema inmunitario humano, que destruye más eficazmente las células diana mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), ii) el sistema inmunitario humano no reconoce el anticuerpo como un material extraño, y iii) incluso cuando se administra una cantidad menor de fármaco con menos frecuencia, la semivida en un sistema circulatorio humano es similar a la de un anticuerpo natural.

Las expresiones "clon MI323", "clon MI329", "clon MI403" y "clon MI407" y "clon MS501", "clon MS502", "clon MS503", "clon Ms 504", "clon MS505" y "clon MS506" y "clon C2G1", "clon C2g 4", "clon C3C8", "clon 54", "clon 56", "clon 2­ 30", "clon 2-73" y "clon 2-78" y "clon 56-C2G4", "clon 2-30-C2G4", "clon 2-73-C2G4" y "clon 2-78-C2G4" que son anticuerpos específicamente unidos a MSLN usados en este documento significan anticuerpos unidos a la MSLN y causan la inhibición de actividad de la MSLN, y puede usarse mezclando un anticuerpo anti-MSLN.

Aquí, el "clon MI323", "clon MI329", "clon MI403" y "clon MI407" son anticuerpos obtenidos inmunizando un ratón con MSLN humana recombinante, y el “clon MS501", "clon MS502", "clon MS503", "clon MS504", "clon MS505" y "clon MS506" son anticuerpos obtenidos a partir de una presentación de fagos de una biblioteca de scFV, y "clon C2G1", "clon C2G4", "clon C3C8", "clon 54", "clon 56", "clon 2-30", "clon 2-73" y "clon 2-78" son anticuerpos obtenidos introduciendo la mutación en el "clon MS502" como se muestra en la Tabla 9, y el "clon 56-C2G4", "clon 2-30-C2G4", "clon 2-73-C2G4" y "clon 2-78-C2G4" son anticuerpos producidos por combinación entre los anticuerpos de mutación introducidos.

Kd (constante de disociación de equilibrio) del anticuerpo para la MSLN se puede ejemplificar de la siguiente manera.

(1) el clon MI323 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,8 x 10'8M o menos, preferiblemente, 1,8 x 1°'9M o menos y, más preferiblemente, 1,8 x 10'1°M o menos,

(2) el clon MI329 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 3,5x1°'9 M o menos, preferiblemente, 3,5x10'1°M o menos y, más preferiblemente, 3,5 x 1°'11 M o menos,

(3) el clon MI403 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 4,5 x 10-8M o menos, preferiblemente, 4,5 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 4,5 x 10-10M o menos,

(4) el clon MS502 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 2,3 x 10-8M o menos, preferiblemente, 2,3 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 2,3 x 10-10M o menos (veáse Tabla 8),

(5) el clon C2G1 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 9,39 x 10-9M o menos, preferiblemente, 9,39 x 10-10M o menos y, más preferiblemente, 9,39 x 10-11M o menos,

(6) el clon C2G4 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 4,32 x 10-9M o menos, preferiblemente, 4,32 x 10-10M o menos y, más preferiblemente, 4,32 x 10-11M o menos,

(7) el clon C3C8 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,22 x 10-8M o menos, preferiblemente, 1,22 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 1,22 x 10-10M o menos (véase Tabla 14),

(8) el clon 56 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,25 x 10-8M o menos, preferiblemente, 1,25 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 1,25 x 10-10M o menos,

(9) el clon 2-30 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,66 x 10-8M o menos, preferiblemente, 1,66 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 1,66 x 10-10M o menos,

(10) el clon 2-78 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,63 x 10-9M o menos, preferiblemente, 1,63 x 10-10M o menos y, más preferiblemente, 1,63 x 10-11M o menos,

(11) el clon 56-C2G4 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,63 x 10-8M o menos, preferiblemente, 1,63 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 1,63 x 10-10M o menos,

(12) el clon 2-30-C2G4 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 2,34 x 10-8M o menos, preferiblemente, 2,34 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 2,34 x 10-10M o menos,

(13) el clon 2-73-C2G4 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 1,65 x 10-8M o menos, preferiblemente, 1,65 x 10-9M o menos y, más preferiblemente, 1,65 x 10-10M o menos, y

(14) el clon 2-78-C2G4 puede tener una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 3,72 x 10-9M o menos, preferiblemente, 3,72 x 10-10M o menos y, más preferiblemente, 3,72 x 10-11M o menos (veáse Tabla 18).

En otra realización de la presente divulgación, se identifican los genes de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un ratón derivado de una biblioteca inmunológica unida a la MSLN humana, el gen de la región variable de cadena pesada se une a una inmunoglobulina humana tipo 1 de la región constante de cadena pesada (región constante de cadena pesada IgG1) y el gen de la región variable de cadena ligera está unida a una región constante de cadena ligera kappa humana, y estos genes se insertan en vectores de expresión de proteína para células animales, respectivamente, para producir vectores, seguido de transfección en las líneas celulares Expi293F™ y cultivo para producir el anticuerpo, y el anticuerpo producido se purifica por la proteína A para producir el anticuerpo (Ejemplo 1-3).

En otra forma de realización más de la presente divulgación, se identifican los genes de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera derivados de una biblioteca de scFV sintética unida a MSLN humana, el gen de la región variable de cadena pesada está unido a una inmunoglobulina humana tipo 1 de la región constante de la cadena pesada (región constante de la cadena pesada IgG1) y el gen de la región variable de cadena ligera está unido a una región constante de la cadena ligera kappa humana, y estos genes se insertan en vectores de expresión proteica para células animales, respectivamente, para producir vectores, seguido de transfección en las líneas celulares Expi293F™ y cultivo para producir el anticuerpo, y el anticuerpo es purificado por la proteína A para producir el anticuerpo (Ejemplos 2-4, 3-10, 3-12 y 3-13).

Por lo tanto, en otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de la invención. El ácido nucleico usado aquí puede estar presente en una célula, un lisado celular, o también puede estar presente en una forma parcialmente purificada o en una forma sustancialmente pura. El ácido nucleico está "aislado" o "es sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otro ácido nucleico o proteína de células mediante técnicas convencionales que incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandas CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otras técnicas bien conocidas en la técnica. El ácido nucleico de la presente invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, y puede incluir una secuencia de intrón, o puede no incluir la secuencia de intrón.

En otro aspecto más de la presente invención, la presente invención proporciona un vector que incluye el ácido nucleico de la invención. Para la expresión del anticuerpo o fragmentos de anticuerpo del mismo, el ADN que codifica la cadena ligera y la cadena pesada que tiene una longitud parcial o una longitud completa se puede obtener mediante técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa una anticuerpo objetivo), y el ADN puede estar "unido operativamente" a secuencias de control de transcripción y traducción para insertarse en el vector de expresión.

La expresión "unido operativamente" usado en este documento puede indicar que un gen de anticuerpo está ligado en el vector de modo que las secuencias de control de transcripción y traducción en el vector tienen una función prevista para controlar la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y una secuencia de control de expresión se seleccionan para tener compatibilidad con una célula hospedadora para que se use la expresión. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se insertan en un vector separado, o ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. El anticuerpo se inserta en el vector de expresión mediante un método convencional (por ejemplo, ligamiento de un fragmento de gen de anticuerpo y un sitio de enzima de restricción complementario sobre un vector o cuando el sitio de enzima de restricción no está presente en absoluto, ligamiento de extremos romos). En algunos casos, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo desde la célula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de modo que el péptido señal se una a un extremo amino de los genes de la cadena del anticuerpo de acuerdo con un marco. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal derivado de proteínas, excepto para inmunoglobulina). Además, el vector de expresión recombinante tiene una secuencia reguladora que controla la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en la célula hospedadora. La "secuencia reguladora" puede incluir un promotor, un potenciador y otro elemento de control de la expresión (por ejemplo, señal de poliadenilación) que controla la transcripción o traducción del gen de la cadena del anticuerpo. Los expertos en la técnica pueden reconocer que ese diseño del vector de expresión puede variar cambiando las secuencias reguladoras de acuerdo con factores tales como la selección de la célula hospedadora para transformar, un nivel de expresión de la proteína, etc.

En otro aspecto más de la presente invención, la presente invención proporciona una célula hospedadora que incluye el vector de la invención. El ácido nucleico o el vector se transfecta en la célula hospedadora. Para la "transfección", varios tipos de técnicas generalmente utilizadas tales como electroforesis, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano, lipofección, etc., pueden usarse para introducir un ácido nucleico exógeno (ADN o ARN) en una célula hospedadora procariota o una célula hospedadora eucariota. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención se puede expresar en una célula eucariota, preferiblemente, en una célula hospedadora de mamífero, considerando la aplicabilidad en una célula de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero adecuadas para la expresión del anticuerpo pueden incluir una célula de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, que incluye una célula CHO dhfr- usada junto con un marcador de selección de DHFR), una célula de mieloma NSO, una célula COS o una célula SP2, etc., como ejemplos.

En otro aspecto más de la presente invención, la presente invención proporciona un método para producir el anticuerpo de la invención, que incluye cultivar la célula hospedadora de la invención para expresar el anticuerpo. Cuando el vector de expresión recombinante que codifica el gen del anticuerpo se introduce en la célula hospedadora de mamífero, el anticuerpo puede producirse cultivando la célula hospedadora durante un periodo de tiempo suficiente para que el anticuerpo se exprese en la célula hospedadora o, más preferiblemente, durante un periodo de tiempo suficiente para que el anticuerpo se secrete en un medio de cultivo en el que se cultiva la célula hospedadora.

En algunos casos, el anticuerpo expresado puede separarse de la célula hospedadora y purificarse para uniformidad. La separación o la purificación del anticuerpo se puede realizar mediante un método de separación, un método de purificación generalmente usado para proteína, por ejemplo, cromatografía. La cromatografía puede incluir, por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía hidrófoba que incluye columna de proteína A y columna de proteína G. Además de la cromatografía, el anticuerpo se puede separar y purificar combinando adicionalmente con filtración, ultrafiltración, precipitación con sales, diálisis, etc.

En otro aspecto más de la presente invención, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer o un tumor que incluye el anticuerpo de la invención como principio activo.

El término "cáncer" o "tumor" típicamente se refiere o describe una condición fisiológica de mamíferos caracterizada por crecimiento/proliferación celular que no está controlada. Los ejemplos de cáncer incluyen carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia, pero no están limitados a los mismos. Ejemplos más específicos del cáncer incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer peritoneal, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, glioma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. El cáncer en la presente invención es preferiblemente cáncer positivo para mesotelina, y se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de endometrio y mesotelioma.

La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo anti-MSLN y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El "vehículo farmacéuticamente aceptable" es un material que puede agregarse en el principio activo para ayudar a la formulación o estabilización de la preparación, y no causa efectos toxicológicos adversos significativos para los pacientes.

El vehículo se refiere a un vehículo o diluyente que no inhibe la actividad biológica y las propiedades de un compuesto administrado sin estimular a los pacientes. El vehículo farmacéuticamente aceptable en la composición para formular como una solución líquida se esteriliza y es adecuado para un cuerpo vivo. Puede usarse solución salina, agua estéril, solución de Ringer, solución salina tamponada, solución de inyección de albúmina, solución de dextrosa, solución de maltodextrina, glicerol, etanol como el vehículo, o al menos uno de sus componentes puede mezclarse para usarse, y pueden añadirse otros aditivos convencionales tales como un antioxidante, tampón, un agente bacteriostático, etc., según sea necesario. Además, la composición se puede preparar en formulaciones para inyección, tales como una solución acuosa, suspensión, emulsión, etc., píldora, cápsula, gránulo o comprimido añadiendo adicionalmente diluyente, dispersante, tensioactivo, aglutinante y lubricante a la misma. Otros vehículos se describen en, por ejemplo, [Remington's Pharmaceutical Sciences (E.W. Martin)]. La composición puede contener la cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti-MSLN.

El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye una solución o dispersión acuosa estéril y polvo estéril para preparar una solución o dispersión inyectable estéril extemporánea. El uso de tales medios y agentes para materiales activos farmacéuticos es conocido en la técnica. La composición se formula preferiblemente para inyección parenteral. La composición se puede formular como una solución, una microemulsión, un liposoma u otras estructuras ordenadas adecuadas para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser, por ejemplo, un disolvente o medio de dispersión que contiene agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, etc.) y mezclas adecuadas de los mismos. En algunos casos, la composición puede incluir agente isotónico, por ejemplo, azúcar, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. La solución inyectable estéril se puede preparar incorporando una cantidad requerida de compuesto activo en un disolvente apropiado con un tipo de los componentes descritos anteriormente o una combinación de los mismos, seguido de microfiltración estéril según sea necesario. En general, la dispersión se prepara incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene medio de dispersión básico y otros componentes requeridos de los componentes descritos anteriormente. El polvo estéril para preparar la solución inyectable estéril se obtiene mediante el secado al vacío y la criodesecación (liofilización) del polvo del principio activo y cualquier componente adicional deseable en polvo de una solución previamente esterilizada por filtración.

La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral o parenteral en la dosificación y frecuencia que puede variar dependiendo de la gravedad de los pacientes que la padecen. La composición se puede administrar a un paciente como una embolada o por infusión continua según sea necesario. Por ejemplo, la administración de embolada del anticuerpo de la presente invención que se presenta como un fragmento Fab puede tener una cantidad de 0,0025 a 100 mg/kg de peso corporal, de 0,025 a 0,25 mg/kg, de 0,010 a 0,10 mg/kg o de 0,10 a 0,50 mg/kg. Para la infusión continua, el anticuerpo de la presente invención que se presenta como el fragmento Fab se puede administrar a 0,001 a 100 mg/kg kg/min, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min, 0,010 a 0,75 mg/kg/min, 0,010 a 1,0 mg/kg/min o 0,10 a 0,50 mg/kg/min durante 1 a 24 horas, 1 a 12 horas, 2 a 12 horas, 6 a 12 horas, 2 a 8 horas o 1 a 2 horas. Cuando se administra el anticuerpo de la presente invención que se presenta como un anticuerpo de longitud completa (que tiene una región constante completa, una cantidad de administración puede ser de aproximadamente 1 a 10 mg/kg de peso corporal, de 2 a 8 mg/kg o de 5 a 6 mg/kg. El anticuerpo de longitud completa generalmente se administra mediante una inyección que dura de 30 minutos a 35 minutos. La frecuencia de administración depende de la gravedad de la afección. La frecuencia de administración puede ser de 3 veces por semana a una vez por semana o dos semanas.

Además, la composición se puede administrar a un paciente mediante una inyección subcutánea. Por ejemplo, el anticuerpo anti-MSLN que tiene una cantidad de administración de 10 a 100 mg puede administrarse semanal, bisemanal o mensual a un paciente mediante inyección subcutánea.

Tal como se usa en el presente documento, la "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente para tratar enfermedades con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable para el tratamiento médico, y una cantidad de una combinación del anticuerpo anti-MSLN. La cantidad exacta puede variar dependiendo de una serie de factores que incluyen componentes y características físicas de una composición terapéutica, población de pacientes prevista, consideraciones individuales del paciente, etc., pero no están limitados a los mismos, y pueden ser fácilmente determinados por los expertos en la materia. Cuando se consideran por completo estos factores, es importante administrar la cantidad mínima suficiente para obtener el efecto máximo sin el efecto secundario, y esta dosificación puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica.

La dosificación de la composición farmacéutica de la presente invención no está específicamente limitada, pero se cambia de acuerdo con diversos factores que incluyen un estado de salud y peso, gravedad de la enfermedad de un paciente y un tipo de fármaco, una vía de administración y tiempo de administración. La composición se puede administrar en vías que típicamente se permiten en mamíferos, incluyendo ratas, ratones, vacas, humanos, etc., por ejemplo, por vía oral, rectal, intravenosa, subcutánea, intrauterina o intracerebrovascular en una dosis única o multidosis por día.

Ejemplo

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son solo para ejemplificar la presente invención, y será obvio para los expertos en la técnica que el alcance de la presente invención no se considera limitado a estos ejemplos.

Ejemplo 1 : Método para producir anticuerpos anti-MSLN a partir de la biblioteca inmunológica

Se pretende producir un agente terapéutico de anticuerpos contra el cáncer usando un anticuerpo contra la mesotelina (MSLN) sobreexpresada en una superficie de células cancerosas.

1-1: Selección de anticuerpos anti-MSLN

Se inmunizó un ratón con una MSLN humana recombinante y se extrajo un bazo para extraer el linfocito B. El ARN total se separó del linfocito B y se sintetizó el ADNc. Diversos genes de anticuerpos del ratón se clonaron a partir del ADNc sintetizado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se insertaron en el fagémido pComb3X para producir una biblioteca de anticuerpos que muestra fragmentos de anticuerpos de diversas secuencias. Con el fin de encontrar el anticuerpo específicamente unido a MSLN humana de la biblioteca de anticuerpos, se mezclaron perlas magnéticas que tenían la MSLN fijado al mismo con la biblioteca de anticuerpos, y los clones unidos a un antígeno diana se separaron y se cultivaron. Luego los clones (MI323, MI329, MI403 y MI407) específicamente unidos al antígeno diana (MSLN humana) se identificaron individualmente a través de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), y se identificaron secuencias de genes de anticuerpos y secuencias de aminoácidos de los mismos a través del análisis de secuencia base.

Como resultado, como se muestra en la Tabla 1, los clones específicamente unidos a MSLN humana se pudieron seleccionar, y las secuencias de aminoácidos de los mismos se identificaron.

La Tabla 2 muestra secuencias de aminoácidos de CDR de los anticuerpos clonación de la Tabla 1 sobre la base de la numeración de Kabat.

[Tabla 1]

[Tabla 2]

continuación

1-2: clonación del gen IgG de los anticuerpos monoclonales MI323, MI329, MI403 y MI407

El fagémido pComb3X que contiene los genes que codifican las regiones variables de la cadena pesada de los anticuerpos clones MI323, MI329, MI403 y MI407 se extrajo y se usó como molde para PCR con un cebador directo que contiene NotI (Tabla 3: SEQ ID NO: 31 a 34) y un cebador inverso que contiene Apal (Tabla 3: SEQ ID NO: 35) usando la premezcla Accupower Pfu PCR (Bioneer). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Luego, los genes separados reaccionaron con las enzimas de restricción NotI, ApaI a 37 °C durante 12 horas o más, y los genes que reaccionaron con las enzimas de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. También se cortó un vector plasmídico pcIW que contenía inmunoglobulina humana de tipo 1 de región constante de cadena pesada (región constante de cadena pesada de IgG1) mediante el mismo método que el anterior y se separó en gel de agarosa. Los genes separados de la región variable de cadena pesada MI323, MI329, MI403 y MI407 se insertaron en sitios NotI, ApaI de un vector pcIW lineal que contenía la región constante de la cadena pesada humana mediante el uso de una ligasa de ADN t 4 (Cat. n.° M0203S, New England BioLabs (NEB)). Los materiales de reacción de ligación se transformaron en bacterias XL1-Blue (Células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), se sembraron en una placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C durante 12 horas o más. Posteriormente, se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron, y los plásmidos se separaron usando un mini kit de plásmido (Cat. n.° 27405, QIAGEN) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

El fagémido pComb3X que contiene los genes que codifican las regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos clones MI323, MI329, MI403 y MI407 se extrajo y se usó como molde para PCR de las regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos clones MI323, MI329, MI403 y MI407, en donde la PCR se realizó con un cebador directo que contiene NotI (Tabla 3: SEQ ID NO: 36, 38, 40, 42) y un cebador inverso (Tabla 3: SEQ ID NO: 37, 39, 41, 43) mediante el uso de la premezcla Accupower Pfu PCR. Además, la región constante de la cadena ligera kappa del anticuerpo humano se sometió a PCR con un cebador directo (Tabla 3: SEQ ID NO: 44) y un cebador inverso que contiene HindIII (Tabla 3: SEQ ID NO: 45). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño predicho se confirmaron en gel de agarosa al 1 % y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Posteriormente, se mezclaron las regiones variables de cadena ligera y las regiones constantes de cadena ligera respectivas, seguido de la PCR solapante, de manera que se clonaron los genes que expresan la región de cadena ligera. La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Luego, los genes separados reaccionaron con las enzimas de restricción NotI, HindIII a 37 °C durante 12 horas o más, y los genes que reaccionaron con las enzimas de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. El vector plasmídico pcIW también se cortó mediante el mismo método que el anterior y se separó en gel de agarosa. Los genes separados de la región de cadena ligera MI323, MI329, MI403 y MI407 se insertaron en sitios NotI, HindIII de un vector pcIW lineal usando una ADN ligasa T4 (Cat. n.° M0203S, New England BioLabs (NEB)). Los materiales de reacción de ligación se transformaron en bacterias XL1-Blue (Células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), se sembraron en una placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C durante 12 horas o más. Posteriormente, se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron, y los plásmidos se separaron usando un mini kit de plásmido (Cat. N.° 27405, QIAGEN) y se confirmaron mediante secuenciación de a Dn .

[Tabla 3]

1-3: Producción y purificación de anticuerpos IgG de anticuerpos clones MI323, MI329, MI403 y MI407

Con la finalidad de producir y purificar los clones MI323, MI329, MI403 y MI407 del anticuerpo anti-MSLN obtenidos mediante una respuesta inmunitaria de ratón, se inocularon células Expi293F™ a una concentración de 2,0 X 106 células/ml el día antes de la transfección. Después de la incubación (37 °C, 8 % de CO² , 125 rpm) durante 24 horas, se añadió medio de expresión Expi293™ (Cat. n.° A1435101, Gibco) para preparar un producto de 30 ml con una concentración de 2,5 X 106 células/ml (viabilidad = 95 %). Se diluyeron 30 |jg de ADN (cadena pesada pcIW-anti-MSLN: 15 jg , cadena ligera pcIW-anti-MSLN: 15 jg ) en un medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) para tener un volumen total de 1,5 ml, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezclaron 1,5 ml del medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) con 80 j l de un reactivo ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) de modo que el volumen total es de 1,5 ml y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción durante 5 minutos, 1,5 ml de ADN diluido y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine™ 293 diluido se mezclaron bien entre sí y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se trataron 3 ml de la mezcla de ADN y el reactivo ExpiFectamine™ 293 en las células Expi293F™. Después de cultivo en suspensión (37 °C, 8 % de CO² , 125 rpm) durante 16 a 18 horas, 150 j l de Potenciador 1 de ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) y 1,5 ml de Potenciador 2 de ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) se añadieron a la misma, seguido de cultivo en suspensión durante 5 días. Después del cultivo, los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm para prepararse. Se preparó MabSelect Xtra (Cat. n.° 17-5269-02, GE Healthcare) que es resina de proteína A que tiene 100 j l por cada 30 ml de líquido de cultivo, seguido de centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos para eliminar una solución de almacenamiento, y el producto obtenido se lavó con 400 j l de tampón que se une a proteína A (Cat. n.° 21007, Pierce) 3 veces. La resina de proteína A se añadió al líquido de cultivo preparado y se hizo reaccionar por rotación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla del líquido de cultivo y la resina se colocó en una columna giratoria con tapa a presión Pierce (Cat. n.° 69725, Thermo), y luego, solo se dejó la resina en la columna usando colector al vacío de QIAvac 24 Plus (Cat. n.° 19413, QIAGEN). Se añadieron 5 ml de tampón de unión a proteína A para lavar la resina, se añadieron a la misma 200 j l de un tampón de elución de proteína A (Cat. n.° 21009, Pierce). El material resultante se hizo reaccionar mediante resuspensión a temperatura ambiente durante 2 minutos, y se centrifugó a 1000 rpm durante 1 minuto, y se eluyó. Cada eluido se neutralizó añadiendo 2,5 j l de Tris-HCl 1,5 M (pH 9,0). La elución se realizó de 4 a 6 veces, y cada fracción se cuantificó usando Nanodrop 200C (Thermo Scientific). Las fracciones en las que se detecta la proteína se recogieron y se intercambiaron con un tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) usando columnas de desalación por centrifugación Zeba, 7K PCPM, 5 ml (Cat. n.° 0089892, Pierce). Luego, la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) se realizó en condiciones de reducción y no reducción para verificar finalmente la cuantificación de la concentración y el estado del anticuerpo, y el anticuerpo se mantuvo a 4 °C.

Ejemplo 2: Método para producir anticuerpo anti-MSLN a partir de la biblioteca de scFv sintética de presentación en fagos

2-1: Selección de anticuerpo scFv de anti- MSLN humano usando presentación en fagos

Para una selección primaria, se hizo reaccionar 1 ml de 1013 o más material de biblioteca en un tubo de poliestireno de fase sólida (Cat. n.° 444202, Nunc) recubierto con MSLN a 37 °C durante 2 horas. Al mismo tiempo, se inocularon 10 |jl de bacterias XL1-Blue (células competentes para electroporación, Cat. n.° 200228, Stratagene) con 10 j l de 10 ml de SB/tetraciclina y se desarrollaron hasta una DO⁶⁰⁰ de 0,8 a 1,0. El fondo de biblioteca obtenido después de la reacción a 37 °C durante 2 horas se lavó con 5 ml de Tween 20/PBS al 0.05 % cuatro veces, y a partir de una selección secundaria, el número de veces de lavado con Tween 20/PBS al 0,05 % aumentó de acuerdo a un aumento en el número de veces de selección. Posteriormente, el material resultante se cultivó con BSA al 1 %/glicina 0,1 M, pH 2,0 a temperatura ambiente durante 10 minutos para purificar el fagémido. El fagémido purificado se transfirió a un tubo de 50 ml y se neutralizó con 70 j l de Tris 2 M. Se trataron 9 ml de bacterias XL1-Blue (células competentes para electroporación, Cat. n.° 200228, Stratagene), y se trató 1 ml de las bacterias en un tubo lavado. Las bacterias se infectaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se añadieron a esto 10 ml de SB, 20 j l de tetraciclina, 10 j l de carbenicilina, seguido del cultivo en suspensión a 37 °C y 220 rpm durante 1 hora. Luego, las bacterias se trataron con 1 ml de fago auxiliar VCS M13 (1011 ufp), y se cultivaron en suspensión a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora, y se trataron con 80 ml de SB, 100 j l de kanamicina y 100 j l de carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C y a 220 rpm durante 12 horas o más. Las bacterias cultivadas durante 12 horas se centrifugaron a 3500 rpm y a 4 °C durante 10 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Se añadieron a la misma 20 ml de PEG al 20 %/NaCl al 15 %, se mezclaron bien y se hicieron reaccionar en hielo durante 30 minutos. Luego, se descartó el sobrenadante y se recogieron los sedimentos y se resuspendieron con 2 ml de BSA/PBS al 1 % a 8000 rpm, y a 4 °C durante 30 minutos, y se centrifugaron a 15000 rpm y 4 °C durante 10 minutos. Aquí, los sedimentos recogidos se descartaron y se almacenaron 1 ml del sobrenadante (2 ml) a -20 °C y el resto (1 ml) se usó en el siguiente orden de selección.

2-2: Asegurar clones individuales de acuerdo con ELISA

Se recogieron colonias individuales de una población de amplificación final de la biblioteca de scFv sintética de presentación en fagos y se cultivaron con 1,5 ml de SB/carbenicilina a una DO 600 de 0,8 a 1,0 a 37 °C y a 220 rpm, y posteriormente se cultivaron con IPTG 1 mM a 30 °C y a 200 rpm durante 12 horas o más. Los materiales de reacción se centrifugaron a 5500 rpm durante 5 minutos, y solo se añadió cada sobrenadante a las placas de ELISA que contenían el antígeno MSLN subyacente, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, los materiales resultantes se lavaron con PBST (1XPBS, Tween 20 al 0,05 %) cuatro veces, y se añadió a los mismos conjugado de HRP/Anti-hFab-HRP diluido en 1/5000 con BSA/1XPBS al 1 %, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavó con PBST (1XPBS, Tween 20 al 0,05 %) 4 veces. Posteriormente, se añadió una solución de TMB a la misma y se hizo reaccionar durante 5 a 10 minutos, y se añadió a la misma una solución de parada TMB. A continuación, se midieron los valores de D.O. a una longitud de onda de medición de 450 nm usando un TECAN Sunrise, y los clones que tenían valores altos de D.O. se aseguraron como clones individuales.

Como resultado, como se muestra en la Tabla 4, los clones específicamente unidos a la MSLN humana pudieron seleccionarse, y se identificaron sus secuencias de aminoácidos.

La Tabla 5 muestra las secuencias de aminoácidos de CDR de los anticuerpos clones de la Tabla 4 sobre la base de la numeración Kabat.

[Tabla 4]

continuación

[Tabla 5]

continuación

2-3: clonación del gen IgG del anticuerpo anti-mesotelina

El fagémido pComb3X que contiene los genes que codifican las regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos clones MS501, MS502, MS503, MS505 y MS506 asegurados se extrajo y se usó como molde para PCR de las regiones variables de cadena ligera de anticuerpos clones MS501, MS502, MS503, MS504, Ms 505 y MS506, en donde la PCR se realizó con un cebador directo que contiene NotI (SEQ ID NO: 86) y un cebador inverso (SEQ ID NO: 87) usando la premezcla Accupower Pfu PCR. Además, la región constante de la cadena ligera de anticuerpo kappa humano se sometió a PCR con un cebador directo (Tabla 6: SEQ ID NO: 88) y un cebador inverso (Tabla 6: SEQ ID NO: 89). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron sobre gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. A continuación, se mezclaron las regiones variables de cadena ligera respectiva y las regiones constantes de cadena ligera, seguido de la PCR solapante, de manera que se clonaron los genes que expresan la región de cadena ligera. La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron sobre gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Luego, los genes separados reaccionaron con las enzimas de restricción NotI, HindIII a 37 °C durante 12 horas o más, y los genes que reaccionaron con las enzimas de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. El vector plasmídico pcIW también se cortó mediante el mismo método que el anterior y se separó en gel de agarosa. Los genes separados de la región de cadena ligera MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 se insertaron en los sitios NotI, HindIII del vector pcIW lineal utilizando una ADN ligasa T4 (Cat. n.° M0203S, New England BioLabs (NEB)). Los materiales de reacción de ligación se transformaron en bacterias XL1-Blue (Células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), se sembraron en una placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C durante 12 horas o más. Posteriormente, se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron, y los plásmidos se separaron usando un mini kit de plásmido (Cat. n.° 27405, QIAGEN) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

El fagémido pComb3X que contiene los genes que codifican las regiones variables de la cadena pesada de los anticuerpos clones MS501, MS502, MS503, MS504, MS505 y MS506 se extrajo y se usó como molde para la PCR con un cebador directo que contiene NotI (Tabla 6: SEQ ID NO: 90) y un cebador inverso que contiene Apal (Tabla 6: SEQ ID NO: 91) usando la premezcla Accupower Pfu PCR (Bioneer). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y posteriormente exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Posteriormente, los genes separados reaccionaron con las enzimas de restricción NotI, ApaI a 37 °C durante 12 horas o más, y los genes que reaccionaron con las enzimas de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. También se cortó un vector plasmídico pcIW que contenía inmunoglobulina humana de tipo 1 de región constante de cadena pesada (región constante de cadena pesada de IgG1) mediante el mismo método que el anterior y se separó en gel de agarosa. Los genes separados de la región variable MS501, MS502, MS503, MS504, MS505 y MS506 separados se insertaron en los sitios Notl, Apal del vector pcIW lineal que contiene la región constante de cadena pesada humana mediante el uso de una ADN ligasa T4 (Cat. n.° M0203S, New England BioLabs (NEB)). Los materiales de reacción de ligación se transformaron en bacterias XL1-Blue (Células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), se sembraron en una placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C durante 12 horas o más. Posteriormente, se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron, y los plásmidos se separaron usando un mini kit de plásmido (Cat. n.° 27405, QIAGEN) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

[Tabla 6]

2-4: Producción y purificación de IgG de anticuerpos clones MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506

Con la finalidad de producir y purificar los anticuerpos clones MS501, MS502, MS503, MS504, MS505, MS506 obtenidos de la biblioteca de scFv de presentación en fagos, se inocularon células Expi293F™ a una concentración de 2,5 X 106 células/ml el día antes de la transfección. Después de la incubación (37 °C, 8 % de CO² , 125 rpm) durante 24 horas, se añadió medio de expresión Expi293™ (Cat. n.° A1435101, Gibco) para preparar un producto de 30 ml con una concentración de 2,5 X 106 células/ml (viabilidad = 95 %). Se diluyeron 30 |jg de ADN (región variable de cadena pesada pcIw-MS502: 15 jg , región variable de cadena ligera pclw-anti-Mesotelina: 15 jg ) en un medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) con la finalidad de tener un volumen total de 1,5 ml, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezclaron 1,5 ml del medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) con 80 j l de un reactivo ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) de modo que el volumen total es de 1,5 ml y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción durante 5 minutos, 1,5 ml de ADN diluido y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine™ 293 diluido se mezclaron bien entre sí y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se trataron 3 ml de la mezcla de ADN y el reactivo ExpiFectamine™ 293 en las células Expi293F™. Después de cultivo en suspensión (37 °C, 8 % de CO², 125 rpm) durante 16 a 18 horas, 150 j l de Potenciador 1 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) y 1,5 ml de Potenciador 2 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) se añadieron a la misma, seguido de cultivo en suspensión durante 5 días. Después del cultivo, los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm para ser preparado. Se preparó MabSelect Xtra (Cat. n.° 17­ 5269-02, GE Healthcare) que es resina de proteína A que tiene 100 j l por cada 30 ml del líquido de cultivo, seguido de centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos para eliminar una solución de almacenamiento y el producto se lavó con 400 j l de tampón de unión a proteína A (Cat. n.° 21007, Pierce) 3 veces. La resina de proteína A se añadió al líquido de cultivo preparado y se hizo reaccionar por rotación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla del líquido de cultivo y la resina se colocó en una columna giratoria con tapa a presión Pierce (Cat. n.° 69725, Thermo), y luego, solo se dejó la resina en la columna usando colector al vacío QIAvac 24 Plus (Cat. n.° 19413, QIAGEN). Se añadieron 5 ml de tampón de unión a proteína A para lavar la resina, se añadieron a la misma 200 j l de un tampón de elución de proteína A (Cat. n.° 21009, Pierce). El material resultante se hizo reaccionar mediante resuspensión a temperatura ambiente durante 2 minutos, y se centrifugó a 1000 rpm durante 1 minuto, y se eluyó. Cada eluido se neutralizó añadiendo 2,5 j l de Tris-HCl 1,5 M (pH 9,0). La elución se realizó de 4 a 6 veces, y cada fracción se cuantificó usando Nanodrop 200C (Thermo Scientific). Las fracciones en las que se detecta la proteína se recogieron y se intercambiaron con un tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) usando columnas columnas de desalación rotatorias Zeba, 7K PCPM, 5 ml (Cat. n.° 0089892, Pierce). Luego, la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) se realizó en condiciones de reducción y no reducción para verificar finalmente la cuantificación de la concentración y el estado del anticuerpo, y el anticuerpo se mantuvo a 4 °C.

2-5: Medida de la fuerza de unión cuantitativa del anticuerpo anti-MSLN con respecto al antígeno

La fuerza de unión cuantitativa (afinidad) de los anticuerpos purificados anti-MSLN, es decir, anticuerpos clones MI323, MI329, MI403, MS502 con respecto a la mesotelina (MSLN) humana recombinante se midió usando un biosensor Biacore T-200 (GE Healthcare, EE. UU.). La MSLN (Cat. n.° 3265-MS, R&D systems) purificada a partir de las células HEK293 se fijó a un chip CM5 (GE Healthcare, EE. UU.) para satisfacer 200 Rmáx usando una reacción aminacarboxílica. Posteriormente, el anticuerpo clon C2G1, el anticuerpo clon C2G4 o el anticuerpo clon C3C8 diluido en serie con tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %) se dejó fluir a un intervalo de concentraciones de 0,078 nM a 5 nM y a un caudal de 30 pl/min por asociación de 120 segundos y disociación de 1800 segundos. La disociación del anticuerpo unido a la MSLn se indujo haciendo fluir Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 a un caudal de 30 pl/min durante 30 segundos (Tabla 7). La afinidad se obtuvo como constantes de velocidad de movimiento (Kon y Koff) y una constante de disociación de equilibrio (Kd) utilizando un software de evaluación Biacore T-200 (Tabla 8).

[Tabla 7]

[Tabla 8]

Ejemplo 3: Método para producir anticuerpo de maduración por afinidad de clon MS502

3-1: Diseño de la biblioteca de maduración por afinidad de clon MS502

La secuencia de aminoácidos del clon MS502 anti-mesotelina se ingresó en la página principal de Swiss model (http://swissmodel.expasy.org/) para encontrar una secuencia de molde. Se encontraron 50 secuencias sobre la base de las secuencias homólogas, y el modelado se realizó designando cada secuencia como el molde. Se enumeraron 50 secuencias por prioridad sobre la base de los valores de QMEAN4 (Cp, todos los átomos, solvatación, torsión), y el molde se seleccionó teniendo en cuenta la identidad de secuencia y la resolución además de los valores de QMEAN4. Se seleccionó 3g6a.1.B para la región variable de cadena pesada, y se seleccionaron 3qhz.1.B (LCDR1,2) y 4o5l.1.A (LCDR3) para la región variable de cadena ligera. La estructura de MS502 obtenida sobre la base del molde seleccionado se analizó mediante el programa de pymol, y el parátopo se seleccionó sobre la base del aminoácido que sobresalía de la CDR (véase la Figura 1). Entre ellos, VL CDR2 Y49, Y50, K53 se excluyeron de los aminoácidos candidatos para mutación a pesar de que se anticipó que son parátopos ya que Tyr y Lys son aminoácidos que generalmente tienen un efecto positivo en la unión. La introducción de la mutación se diseñó en un 50 % preservando la secuencia existente, aumentando las tasas de Tyr, Ser, Gly y controlando la secuencia de nucleótidos utilizando un cebador de mezcla manual (IDT, EE. UU.) para que las velocidades de carga hidrofílica, hidrofóbica, positiva y negativa se incluyeran uniformemente (Tabla 9). La región variable de cadena pesada se dividió en cada uno de tres fragmentos, ya que la mutación se introdujo en todas las CDR1, 2 y 3, y se sometieron a PCR de fragmentos y PCR superpuestos para construir una biblioteca, y se dividió la región variable de cadena ligera en cada uno de los dos fragmentos ya que la mutación se introdujo solo en CDR1 y 3, y se sometieron a PCR de fragmento y PCR superpuesto para construir una biblioteca. El tamaño teórico de la biblioteca según la introducción de la mutación en el caso de la región variable de cadena pesada fue de 5,83 X 1010 y el tamaño teórico de la biblioteca según la introducción de la mutación en el caso de la región variable de cadena ligera fue de 2,16 X 104.

T l

3-2: Construcción de la biblioteca de la región variable de cadena ligera

Con la finalidad de introducir la mutación en la biblioteca, primero, la región variable de cadena ligera se dividió en 2 partes, y se sometieron a un fragmento de PCR. El fragmento de la región variable de cadena ligera n.° 1 tenía una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera del clon MS502 anti-mesotelina como molde, y se añadieron al mismo un cebador directo (SEQ ID NO: 93) y un cebador inverso (SEQ ID NO: 94), y el fragmento de la región variable de cadena ligera n.° 2 tenía la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera del clon MS502 antimesotelina como molde, y un cebador directo (Tabla 10: SEQ ID NO: 95) y un cebador inverso (Tabla 10: SEQ ID NO: 96) se añadieron a la misma, y luego, cada fragmento se sometió a PCR usando una premezcla de polimerasa Primestar (Takara). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 98 °C durante 2 minutos, y posteriormente exposición a 98 °C durante 10 segundos, a 60 °C durante 15 segundos, y a 72 °C durante 20 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 % y se separaron usando un kit de extracción en gel (kit de extracción en gel QIAquick, CAT. n.° 28706, QIAGEN), respectivamente. La región constante de la cadena ligera tenía una región lambda de cadena ligera como molde, y se añadieron a la misma un cebador directo (Tabla 10: SEQ ID NO: 97) y un cebador inverso (Tabla 10: SEQ ID NO: 98), y cada fragmento se sometió a PCR usando una premezcla de Primestar polimerasa. La PCR se realizó repitiendo la exposición a 98 °C durante 2 minutos, y luego exposición a 98 °C durante 10 segundos, a 60 °C durante 15 segundos, y a 72 °C durante 30 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Los fragmentos 1 y 2 de la región variable de cadena ligera asegurada, y la región constante de la cadena ligera en una relación molar de 1:1:1 se usaron como molde, y un cebador directo (SEQ ID NO: 92) y un cebador inverso (SEQ ID NO: 98) se añadieron a la misma, y cada fragmento se sometió a PCR usando una premezcla de polimerasa Primestar. La PCR se realizó repitiendo la exposición a 98 °C durante 2 minutos, y luego exposición a 98 °C durante 20 segundos, a 60 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 60 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción en gel para asegurar el gen de maduración de afinidad de región variable constante de cadena ligera. El gen asegurado se hizo reaccionar con la enzima de restricción NruI y XbaI (NEB) a 37 °C durante 4 horas. Los genes que reaccionaron con la enzima de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. El gen separado se insertó en el sitio NruI, XbaI del vector pComb3x lineal que contiene la región constante variable de la cadena pesada MS502 usando una ADN ligasa de T4 (Cat. n.° M0203S, NEB). El material de reacción de ligación se transformó en bacterias XL1-Blue (células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), y se cultivaron en 300 ml de medio LB a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora. Luego, el material resultante se trató con 150 pl de carbenicilina y 300 pl de tetraciclina, y se cultivó con agitación a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora. El material resultante se trató con 4,5 ml de fago auxiliar VCS M13 (1011 ufp) y se cultivó con agitación a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora, y se trató con 300 pl de kanamicina y 300 pl de carbenicilina, y se cultivó durante la noche a 37 °C y a 220 rpm. El día siguiente, las células cultivadas se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente. Con la finalidad de precipitar el fago, se usó 5X PEG/NaCl para añadir 1X PEG/NaCl al sobrenadante, y el producto obtenido se dejó reposar sobre hielo durante 30 minutos. El fago precipitado se centrifugó a 8000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó y el fago precipitado se resuspendió con 10 ml de PBS. Con el fin de eliminar los restos celulares, el fago disuelto en 10 ml de PBS se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar el sobrenadante y se almacenó a 4 °C. El tamaño de la biblioteca se confirmó tomando 100 pl de líquido de cultivo después de 1 hora de la transformación, recubriendo la placa LB con el líquido de cultivo (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina en dilución en serie, cultivando a 37 °C durante 12 horas o más, y contando las colonias.

3-3: Construcción de la biblioteca de la región variable de cadena pesada

Con la finalidad de introducir la mutación en la biblioteca, primero, la región variable de cadena pesada se dividió en 3 partes y se sometieron a un fragmento de PCR. El fragmento de la región variable de cadena pesada n.° 1 tenía una secuencia del gen de la región variable de cadena pesada del clon MS502 antimesotelina como molde, y un cebador directo (Tabla 10: SEQ ID NO: 99) y un cebador inverso (Tabla 10: SEQ ID NO: 100) y el fragmento de la región variable de cadena pesada n.° 2 tenía la secuencia del gen de la región variable de cadena pesada del clon MS502 antimesotelina como molde, y un cebador directo (Tabla 10: SEQ ID NO: 101) y un cebador inverso (Tabla 10: SEQ ID NO: 102) se añadieron a la misma, y el fragmento de la región variable de cadena pesada n.° 3 tenía la secuencia del gen de la región variable de cadena pesada del clon MS502 antimesotelina como molde, y un cebador directo (Tabla 10: SEQ ID NO: 103) y un cebador inverso (Tabla 10: SEQ ID NO: 104) se añadieron a la misma, y posteriormente, cada fragmento se sometió a PCR usando una premezcla de polimerasa Primestar (Takara). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 98 °C durante 2 minutos, y luego exposición a 98 °C durante 10 segundos, a 60 °C durante 15 segundos, y a 72 °C durante 20 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Los fragmentos 1, 2 y 3 de la región variable de cadena pesada asegurados en una relación molar de 1:1:1 se usaron como molde, y un cebador directo (Tabla 10: SEQ ID NO: 99) y un cebador inverso (Tabla 10: SEQ ID NO: 106) se añadieron a la misma, y cada fragmento se sometió a PCR usando una premezcla de polimerasa Primestar. La PCR se realizó repitiendo la exposición a 98 °C durante 2 minutos, y luego exposición a 98 °C durante 20 segundos, a 60 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 60 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción en gel para asegurar el gen de maduración de afinidad de la región variable de cadena pesada. El gen asegurado se hizo reaccionar con la enzima de restricción XhoI y ApaI (NEB) a 37 °C durante 4 horas. Los genes que reaccionaron con la enzima de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. El gen separado se insertó en el sitio XhoI, ApaI del vector pComb3x lineal que contiene la región constante variable de cadena ligera MS502 usando una ADN ligasa T4 (Cat. n.° M0203S, NEB). El material de reacción de ligación se transformó en bacterias XL1-Blue (células competentes para electroporación, Cat. n.° 200228, Stratagene), y se cultivaron en 300 ml de medio LB a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora. Posteriormente, el material resultante se trató con 150 j l de carbenicilina y 300 j l de tetraciclina, y se cultivó en suspensión a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora. El material resultante se trató con 4,5 ml de fago auxiliar VCS M13 (1011 ufp) y se cultivó con agitación a 37 °C y a 220 rpm durante 1 hora, y se trató con 300 j l de kanamicina y 300 j l de carbenicilina, y se cultivó durante la noche a 37 °C y a 220 rpm. El día siguiente, las células cultivadas se centrifugaron a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente. Para precipitar el fago, se usó 5X PEG/NaCl para añadir 1X PEG/NaCl al sobrenadante, y el producto obtenido se dejó reposar sobre hielo durante 30 minutos. El fago precipitado se centrifugó a 8000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se descartó y el fago precipitado se resuspendió con 10 ml de PBS. Con el fin de eliminar los restos celulares, el fago disuelto en 10 ml de PBS se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos para separar el sobrenadante y se almacenó a 4 °C. El tamaño de la biblioteca se confirmó tomando 100 j l de líquido de cultivo después de 1 hora de la transformación, colocando el líquido de cultivo en la placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina en dilución en serie, cultivando a 37 °C durante 12 horas o más, y contando las colonias.

[Tabla 10]

En la Tabla 10, el codón X es un codón degenerativo en el que cada ACGT se controla a una velocidad específica y es capaz de controlar la velocidad de los aminoácidos que se van a traducir. Como ejemplo, para el codón NX1X2 de SEQ ID NO: 102, N está codificado por A, C, G, T con una proporción aleatoria, X1 está codificado al 10 % de A, 10 % de C, 70 % de G y 10 % de T, y X2 está codificado al 10 % de A, 70 % de C, 10 % de G y 10 % de T. Esto está diseñado para el cebador inverso, y, por lo tanto, si se convierte en la dirección de avance, es el codón X2X1N, donde X2 está codificado al 10 % de A, 70 % de C, 10 % de G y 10 % de T, y X1 está codificado al 10 % de A, 10 % de C, 70 % de G, y 10 % de T. Como resultado, Kabat n.° 31 de la CDR1 de región variable de cadena pesada se traduce en aminoácidos, Tyr 7 %, Ser 8 %, Gly 1 %, His 7 %, Asp 7 %, Phe 1 %, Thr 7 %, Asn 49 %, Ala 1 %, Val 1 %, Leu 1 %, Ile 7 %, Pro 1 %, Cys 1 %.

3-4: Selección de anticuerpo de mutación en la región variable de cadena ligera

1 ml de MSLN de proteína humana recombinante que tiene una concentración de 1 jg/m l se puso en un tubo de poliestireno de fase sólida (Cat. n.° 444202, Nunc), y el tubo recubierto a 4 °C durante 12 horas o más se lavó con 5 ml de 0,05 % de PBST tres veces. Se pusieron 5 ml de BSA/PBS al 1 % en el tubo inmunológico recubierto con MSLN, seguido de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 horas. Se retiró un tampón de bloqueo del tubo inmunológico, y luego, se trató la biblioteca de fagos de la región variable de la cadena ligera en el tubo y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego, el producto obtenido se lavó con 5 ml de PBSt cuatro veces. El tubo inmunológico se trató con 1 ml de tampón de elución de glicina (pH 2,0) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos para obtener el sobrenadante. Después de la elución, se añadieron 100 j l de Tris-Cl 1,5 M (pH 8,8) al fago y se neutralizaron. Se trataron 10 ml de bacterias XL1-Blue (células competentes para electroporación, Cat. n.° 200228, Stratagene) cultivadas durante aproximadamente 2 horas (DO⁶⁰⁰ = 0,8 a 1,0) con el fago neutralizado. Después de la infección a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadieron 10 ml de SB, 20 |jl de tetraciclina (50 mg/ml) y 10 j l de carbenicilina (100 mg/ml) a 10 ml de las bacterias XL1-Blue infectadas (células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), y se cultivaron con agitación (200 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Las bacterias se trataron con 1 ml de fago auxiliar VCSM13 (> 1011 ufp/ml) y se cultivaron con agitación (200 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Después de 1 hora de incubación, las bacterias se trataron con 80 ml de SB, 100 j l de kanamicina y 100 j l de carbenicilina (100 mg/ml), y se cultivaron durante la noche (200 rpm) a 37 °C. La biblioteca cultivada durante la noche se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos para separar el sobrenadante solamente, y se usaron 5X PEG/NaCl para añadir 1X PEG/NaCl al sobrenadante, y el producto obtenido se dejó reposar sobre hielo durante 30 minutos. El sobrenadante se eliminó por centrifugación a 8000 rpm durante 30 minutos, y los sedimentos se resuspendieron con 2 ml de BSA/PBS al 1 % y se centrifugaron a 12000 rpm durante 10 minutos. Posteriormente, solo se tomó el sobrenadante y se usó en el siguiente orden de selección. Este proceso se repitió cuatro veces.

3-5: Selección de anticuerpo de mutación en la región variable de cadena pesada

El sobrenadante se eliminó con 50 j l de microperlas de estreptavidina (Miltenyl biotec 130-048-101), y se le añadió 1 ml de PBS para realizar el lavado tres veces. Se añadió 1 ml de PBS que contenía BSA al 1 % a la perla, y la perla se hizo rotar a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de bloqueo. Se puso MSLN 50 nM en 500 j l de PBS, y se mezcló con 500 j l de fago de biblioteca racional de MS502 VH y se hicieron reaccionar por rotación a temperatura ambiente durante 1 hora. El tampón de bloqueo se eliminó de la perla, y la perla se trató con una solución que contenía la MSLN y el fago, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, el producto obtenido se lavó con 1 ml de PBST seis veces. La perla se trató con 1 ml de tampón de elución de glicina (pH 2,0) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos para obtener el sobrenadante. Después de la elución, se añadieron 100 j l de Tris-Cl 1,5 M (pH 8,8) al fago y se neutralizaron. Se trataron 10 ml de bacterias XL1-Blue (células competentes para electroporación, Cat. n.° 200228, Stratagene) cultivadas durante aproximadamente 2 a 2,5 horas (DO⁶⁰⁰ = 0,8 a 1,0) con el fago neutralizado. Después de la infección a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadieron 10 ml de SB, 20 j l de tetraciclina (50 mg/ml) y 10 j l de carbenicilina (100 mg/ml) a 10 ml de las bacterias XL1-Blue infectadas (células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), y se cultivaron con agitación (200 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Las bacterias se trataron con 1 ml de fago auxiliar VCSM13 (> 1011 ufp/ml) y se cultivaron en suspensión (200 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Después de 1 hora de incubación, las bacterias se trataron con 80 ml de Sb , 100 j l de kanamicina y 100 j l de carbenicilina (100 mg/ml), y se cultivaron durante la noche (200 rpm) a 37 °C. La biblioteca cultivada durante la noche se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos para separar el sobrenadante solamente, y se usó tampón 5X PEG/NaCl para añadir 1X PEG/NaCl al sobrenadante, y el producto obtenido se dejó reposar sobre hielo durante 30 minutos. Se eliminó el sobrenadante mediante centrifugación a 8000 rpm durante 30 minutos, y los sedimentos se resuspendieron con 2 m de BSA/PBS al 1 % y se centrifugaron a 12000 rpm durante 10 minutos. Posteriormente, solo se tomó el sobrenadante y se usó en el siguiente orden de selección. Se realizó una selección de perlas primarias, secundarias y terciarias con respecto a la MSLN utilizando el fago de biblioteca racional de MS502 Vh. Como resultado de las selecciones secundaria y terciaria, se confirmó que los títulos de producción se incrementaron, lo que mostró que los anticuerpos contra la MSLN se amplificaron.

3-6: Asegurar clones individuales de acuerdo con ELISA

Se recolectaron colonias individuales de una población amplificada final de cada biblioteca de regiones variables de cadena ligera/cadena pesada, y se cultivaron con 1,5 ml de SB/carbenicilina hasta una DO 600 de 0,8 a 1,0 a 37 °C y a 220 rpm, y posteriormente se cultivaron con IPTG 1 mM a 30 °C y a 200 rpm durante 12 horas o más. Los materiales de reacción se centrifugaron a 5500 rpm durante 5 minutos, y solo se añadió cada sobrenadante a las placas de ELISA que contenían el antígeno MSLN subyacente, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, los materiales resultantes se lavaron con PBST (1XPBS, Tween 20 al 0,05 %) cuatro veces, y se añadió conjugado HRP/Anti-hFab-HRP diluido en 1/5000 con BSA/1XPBS al 1 %, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavó con PBST (1XPBS, 0,05 % de Tween 20) 4 veces. A continuación, se añadió una solución de TMB y se dejó reposar de 5 a 10 minutos, y se añadió a la misma una solución de parada de TMB. A continuación, se midieron los valores de D.O. a una longitud de onda de medición de 450 nm usando un TECAN Sunrise, y se aseguraron clones que tenían un alto valor de D.O. como clones individuales.

Como resultado, como se muestra en la Tabla 11, se pudieron seleccionar los clones específicamente unidos a la MSLN humana y se identificaron sus secuencias de aminoácidos.

La Tabla 12 muestra secuencias de aminoácidos de CDR de los anticuerpos de clonación de la Tabla 11 sobre la base de la numeración de Kabat.

[Tabla 11]

[Tabla 12]

continuación

3-7: Comparación relativa y selección en la fuerza de unión de clones individuales usando SPR

Con la finalidad de comparar y medir la fuerza de unión con el líquido de cultivo de clones individuales asegurados a partir de la confirmación de los clones individuales de acuerdo con el método ELISA realizado en el Ejemplo 3-3, primero, la MSLN humana en el chip CM5 de la serie S de biacore (GE healthcare) se disolvió en tampón de acetato de pH 4,0 a 1 pg/ml, y se dejó fluir a un caudal de 10 pl/min y se fijó a 1000 Ur. El sobrenadante de Fab expresado en el Ejemplo 3-6 se diluyó en 1/10 con tampón HBS-EP de pH 7,4, y se dejó fluir a un caudal de 30 pl/min para la asociación de 120 segundos, y la disociación de 180 segundos para realizar un análisis de unión. La regeneración se realizó con 10 mM de tampón glicina-HCl pH 1,5 durante 30 segundos. Los datos de ELISA y unión a SPR se compararon y analizaron para seleccionar los clones finales de la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada.

Como resultado, como se ilustra en las Figs. 2 y 3, la fuerza de unión de las mutaciones de la región variable de cadena ligera y las mutaciones de la región variable de cadena pesada se compararon relativamente, y C2G1, C2G4 y C3C8 se seleccionaron para los clones finales de la región variable de cadena ligera y se seleccionaron 56, 2-30, 2­ 58, 2-73 y 2-78 para los clones finales de la región variable de cadena pesada.

3-8: clonación del gen de IgG del anticuerpo de mutación de la región variable de cadena ligera del clon MS502

Cada uno de los genes C2G1, C2G4 y C3C8 de la región variable de cadena ligera asegurada como molde se sometió a PCR usando la ADN polimerasa PrimeSTAR HS (Cat. n.° R010B; Takara) y el cebador directo que contenía Notl (Tabla 6: SEQ ID NO : 86) y el cebador inverso (Tabla 6: SEQ ID NO: 87). Además, la región constante de la cadena ligera de anticuerpo kappa humano se sometió a PCR con el cebador directo (Tabla 6: SEQ ID NO: 88) y el cebador inverso (Tabla 6: SEQ ID NO: 89). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. A continuación, se mezclaron las regiones variables de la cadena ligera y las regiones constantes de la cadena ligera respectivas, seguido de la PCR solapante, de manera que se clonaron los genes que expresan la región de la cadena ligera. La PCR se realizó repitiendo la exposición a 94 °C durante 10 minutos, y luego la exposición a 94 °C durante 15 segundos, a 56 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 90 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 10 minutos. En los genes amplificados, se confirmaron bandas de ADN que tenían un tamaño esperado en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Luego, los genes separados que reaccionaron con las enzimas de restricción NotI, HindIII a 37 °C durante 12 horas o más, y los genes que reaccionaron con las enzimas de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. El vector plasmídico pcIW también se cortó mediante el mismo método que el anterior y se separó en gel de agarosa. Los genes separados de la región de cadena ligera C2G1, C2G4 y C3C8 se insertaron en los sitios NotI, HindIII del vector pcIW lineal usando una ADN ligasa T4 (Cat. n.° M0203S, New England BioLabs (NEB)). Los materiales de reacción de ligación se transformaron en bacterias XL1-Blue (Células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), se sembraron en una placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C durante 12 horas o más. Posteriormente, se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron, y los plásmidos se separaron usando un mini kit de plásmido (Cat. n.° 27405, QIAGEN) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

3-9: clonación del gen IgG del anticuerpo de mutación de la región variable de cadena pesada del clon MS502

Cada uno de los genes de la región variable de cadena pesada 56, 2-30, 2-58, 2-73 y 2-78 como molde se sometió a PCR usando la ADN polimerasa PrimeSTAR HS (Cat. n.° R010B; Takara) y el cebador directo que contenía NotI (Tabla 6: SEC ID NO: 90) y el cebador inverso que contenía Apal (Tabla 6: SEQ ID NO: 91). La PCR se realizó repitiendo la exposición a 98 °C durante 2 minutos, y luego se expuso a 98 °C durante 10 segundos, a 58 °C durante 10 segundos, y a 72 °C durante 30 segundos 30 veces, y reaccionando a 72 °C durante 5 minutos. En los genes amplificados, las bandas de ADN que tenían un tamaño esperado se confirmaron en gel de agarosa al 1 %, y se separaron usando un kit de extracción de gel, respectivamente. Posteriormente, los tres tipos de genes separados se hicieron reaccionar con la enzima de restricción KpnI y ApaI a 37 °C durante 4 horas. Los genes que reaccionaron con la enzima de restricción se separaron nuevamente en gel de agarosa al 1 %. El vector plasmídico pcIW también se cortó mediante el mismo método que el anterior y se separó en gel de agarosa. Los genes separados se insertaron en los sitios NotI, ApaI del vector pclw lineal que contenía la región constante de cadena pesada humana usando una ADN ligasa T4. Los materiales de reacción de ligación se transformaron en bacterias XL1-Blue (Células competentes para electroporación; Cat. n.° 200228, Stratagene), se sembraron en una placa LB (Cat. n.° LN004CA, NaraeBiotech) que contenía carbenicilina, y se cultivaron a 37 °C durante 12 horas o más. A continuación, se seleccionaron colonias individuales y se cultivaron, y los plásmidos se separaron usando un mini kit de plásmido (Cat. n.° 27405, QIAGEN) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

3-10: Producción y purificación de IgG del anticuerpo de mutación de la región variable de la cadena ligera del clon MS502

Con la finalidad de producir y purificar los anticuerpos de mutación de la región variable de cadena ligera C2G1, C2G4 y C3C8, se inocularon células Expi293F™ a una concentración de 2,5 X 106 células/ml el día antes de la transfección. Después de la incubación (37 °C, 8 % de CO² , 125 rpm) durante 24 horas, se añadió medio de expresión Expi293™ (Cat. n.° A1435101, Gibco) para preparar un producto de 30 ml que tenía una concentración de 2,5 X 106 células/ml (viabilidad = 95 %). Se diluyeron 30 |jg de ADN (región variable de la cadena pesada pcIw-MS502: 15 |jg, mutante de la región variable de cadena ligera pcIw-anti-Mesotelina: 15 jg ) en un medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) con la finalidad de tener un volumen total de 1,5 ml, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezclaron 1,5 ml del medio OptiPro™ SEM (cat. n.° 12309019, Gibco) con 80 j l de un reactivo ExpiFectamine™ 293 (cat. n.° A14524, Gibco) de modo que un volumen total es de 1,5 ml y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción durante 5 minutos, se mezclaron bien entre sí 1,5 ml de ADN diluido y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine™ 293 diluido, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se trataron 3 ml de la mezcla de ADN y el reactivo ExpiFectamine™ 293 se trató en las células Expi293F™. Después de cultivo en suspensión (37 °C, 8% de CO², 125 rpm) durante 16 a 18 horas, se añadieron a la misma 150 j l de potenciador 1 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) y 1,5 ml de Potenciador 2 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco), seguido de cultivo en suspensión durante 5 días. Después del cultivo, los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm para prepararlo. Se preparó MabSelect Xtra (Cat. n.° 17-5269-02, GE Healthcare) que es resina de proteína A que tiene 100 j l por cada 30 ml de líquido de cultivo, seguido de centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos para eliminar una solución de almacenamiento y el producto obtenido se lavó con 400 j l de tampón de unión a proteína A (Cat. n.° 21007, Pierce) 3 veces. La resina de proteína A se añadió al líquido de cultivo preparado y se hizo reaccionar por rotación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla del líquido de cultivo y la resina se colocó en una columna giratoria con tapa a presión Pierce (Cat. n.° 69725, Thermo), y luego, solo se dejó la resina en la columna usando colector de vacío QIAvac 24 Plus (Cat. n.° 19413, QIAGEN). Se añadieron 5 ml de tampón de unión a proteína A para lavar la resina, y se añadieron a la misma 200 |jl de un tampón de elución de proteína A (Cat. n.° 21009, Pierce). El material resultante se hizo reaccionar mediante resuspensión a temperatura ambiente durante 2 minutos, y se centrifugó a 1000 rpm durante 1 minuto, y se eluyó. Cada eluido se neutralizó añadiendo 2,5 j l de Tris-HCl 1,5 M (pH 9,0). La elución se realizó de 4 a 6 veces, y cada fracción se cuantificó usando Nanodrop 200C (Thermo Scientific). Las fracciones en las que se detecta la proteína se recolectaron, y se intercambiaron con un tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) usando columnas de desalación giratorias Zeba, 7K PCPM, 5 ml (Cat. n.° 0089892, Pierce). Luego, se realizó electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) en condiciones de reducción y no reducción para verificar finalmente la cuantificación de la concentración y el estado del anticuerpo, y el anticuerpo se mantuvo a 4 °C.

3-11: Medida de la fuerza de unión cuantitativa del anticuerpo de mutación de la región variable de cadena ligera MS502 con respecto al antígeno MSLN

La fuerza de unión cuantitativa (afinidad) de los anticuerpos anti-MSLN purificados, es decir, los anticuerpos mutantes C2G1, C2G4 y C3C8 de la región variable de cadena ligera del clon MS502 con respecto a la mesotelina (MSLN) humana recombinante se midió utilizando un biosensor Biacore T-200 (GE Healthcare, EE. UU.). La MSLN (Cat. n.° 3265-MS, R&D systems, EE. UU.) purificada a partir de las células HEK293 se fijó a un chip CM5 (GE Healthcare, CAT n.° BR-1005-30) para satisfacer 200 Rmáx utilizando una reacción amino-carboxílica. A continuación, el anticuerpo clon C2G1, el anticuerpo clon C2G4 o el anticuerpo clon C3C8 diluido en serie con tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %) se dejó fluir a un intervalo de concentración de 0,078 nM a 5 nM y a un caudal de 30 jl/m in por asociación de 120 segundos y disociación de 1800 segundos. La disociación del anticuerpo unido a la MSLN se indujo haciendo fluir Glicina-HCl 10 mM pH 1,5 a un caudal de 30 jl/m in durante 30 segundos (Tabla 13). La afinidad se obtuvo como constantes de velocidad de movimiento (Kon y Koff) y una constante de disociación de equilibrio (Kd) utilizando un software de evaluación Biacore T-200 (Tabla 14).

[Tabla 13]

[Tabla 14]

3-12: Producción y purificación de IgG del anticuerpo de mutación de la región variable de cadena pesada de clon MS502

Con la finalidad de producir y purificar los anticuerpos de la mutación de la región variable de cadena pesada 56, 2­ 30, 2-58, 2-73, 2-78, se inocularon células Expi293F ™ a una concentración de 2,5 X 106 células/ml el día antes de la transfección. Después de la incubación (37 °C, 8 % de CO² , 125 rpm) durante 24 horas, se añadió medio de expresión Expi293™ (Cat. n.° A1435101, Gibco) para preparar un producto de 30 ml que tenía una concentración de 2,5 X 106 células/ml (viabilidad = 95 %). Se diluyeron 30 jg de a Dn (mutación de la región variable de cadena pesada pclw-MS502: 15 jg , región variable de cadena ligera pcIw-MS502: 15 jg ) en un medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) para tener un volumen total de 1.5 ml, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezclaron 1,5 ml del medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) con 80 j l de un reactivo ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) de modo que el volumen total es de 1,5 ml y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción durante 5 minutos, 1,5 ml de ADN diluido y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine™ 293 diluido se mezclaron bien entre sí, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se trataron 3 ml de la mezcla de ADN y el reactivo ExpiFectamine™ 293 en las células Expi293F™. Después de cultivo en suspensión (37 °C, 8% de CO² , 125 rpm) durante 16 a 18 horas, 150 j l de potenciador 1 ExpiFectamineTM 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) y 1,5 ml de Potenciador 2 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) se añadieron a la misma, seguido de cultivo en suspensión durante 5 días. Después del cultivo, los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm para prepararse. Se preparó MabSelect Xtra (Cat. n.° 17-5269-02, GE Healthcare) que es resina de proteína A que tenía 100 j l por cada 30 ml del líquido de cultivo, seguido de centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos para eliminar una solución de almacenamiento, y el producto obtenido se lavó con 400 j l de tampón de unión de proteína A (Cat. n.° 21007, Pierce) 3 veces. La resina de proteína A se añadió al líquido de cultivo preparado y se hizo reaccionar por rotación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla del líquido de cultivo y la resina se colocaron en una columna giratoria con tapa a presión Pierce (Cat. n.° 69725, Thermo), y luego solo se dejó la resina en la columna usando colector de vacío QIAvac 24 Plus (Cat. n.° 19413, QIAGEN). Se añadieron 5 ml de tampón de unión de proteína A para lavar la resina, se añadieron a la misma 200 j l de un tampón de elución de proteína A (Cat. n.° 21009, Pierce). El material resultante se hizo reaccionar mediante resuspensión a temperatura ambiente durante 2 minutos, y se centrifugó a 1000 rpm durante 1 minuto, y se eluyó. Cada eluido se neutralizó añadiendo 2,5 j l de Tris-HCl 1,5 M (pH 9,0). La elución se realizó de 4 a 6 veces, y cada fracción se cuantificó usando Nanodrop 200C (Thermo Scientific). Las fracciones en las que se detecta la proteína se recolectaron y se intercambiaron con un tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) usando columnas de desalación giratoria Zeba, 7K PCPM, 5 ml (Cat. n.° 0089892, Pierce). Posteriormente, la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) se realizó en condiciones de reducción y no reducción para verificar finalmente la cuantificación de la concentración y el estado del anticuerpo, y el anticuerpo se mantuvo a 4 °C.

3-13: Producción y purificación de IgG de anticuerpo de mutación de región variable de cadena pesada combinado con clon de mutación de región variable de cadena ligera final C2G4 del clon MS502

El clon C2G4 que tiene el valor más excelente en la medición de la afinidad entre las mutaciones de la región variable de la cadena ligera se seleccionó y se fijó como el clon final de la región variable de la cadena ligera. Luego, con la finalidad de combinar, producir y purificar los anticuerpos de mutación de la región variable de la cadena pesada 56, 2-30, 2-58, 2-73 y 2-78, se inocularon células Expi293F™ a una concentración de 2,5 X 106 células/ml el día antes de la transfección. Después de la incubación (37 °C, 8% de CO² , 125 rpm) durante 24 horas, se añadió medio de expresión Expi293™ (Cat. n.° A1435101, Gibco) para preparar un producto de 30 ml que tenía una concentración de 2,5 X 106 células/ml (viabilidad = 95 %). Se diluyeron 30 jg de ADN (anticuerpo de mutación de la región variable de cadena pesada pcIw-MS502: 15 jg , mutación C2G4 de la región variable de cadena ligera pclw: 15 jg ) en un medio OptiPro™ SEM (Cat. n.° 12309019, Gibco) con la finalidad de tener un volumen total de 1,5 ml, y reaccionó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezclaron 1,5 ml del medio SEM OptiPro™ (Cat. n.° 12309019, Gibco) con 80 j l de un reactivo ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° 12309019, Gibco) de modo que el volumen total es de 1,5 ml y reaccionó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción durante 5 minutos, 1,5 ml de ADN diluido y 1,5 ml de reactivo ExpiFectamine™ 293 diluido se mezclaron bien entre sí, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Se trataron 3 ml de la mezcla de ADN y el reactivo ExpiFectamine™ 293 en las células Expi293F™. Después de cultivo en suspensión (37 °C, 8 % de CO², 125 rpm) durante 16 a 18 horas, se añadieron a la misma 150 j l de Potenciador 1 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco) y 1,5 ml de Potenciador 2 ExpiFectamine™ 293 (Cat. n.° A14524, Gibco), seguido de cultivo en suspensión durante 5 días. Después del cultivo, los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos, y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm para prepararse. Se preparó MabSelect Xtra (Cat. n.° 17-5269­ 02, GE Healthcare) que es resina de proteína A que tiene 100 j l por cada 30 ml del líquido de cultivo, seguido de centrifugación a 1000 rpm durante 2 minutos para eliminar una solución de almacenamiento, y el producto obtenido se lavó con 400 j l de tampón de unión a proteína A (Cat. n.° 21007, Pierce) 3 veces. La resina de proteína A se añadió al líquido de cultivo preparado y se hizo reaccionar por rotación a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla del líquido de cultivo y la resina se colocó en una columna giratoria con tapa a presión Pierce (Cat. n.° 69725, Thermo), y luego, solo se dejó la resina en la columna usando colector de vacío QIAvac 24 Plus (Cat. n.° 19413, QIAGEN). Se añadieron 5 ml de tampón de unión a proteína A para lavar la resina, se añadieron a la misma 200 j l de un tampón de elución de proteína A (Cat. n.° 21009, Pierce). El material resultante se hizo reaccionar mediante resuspensión a temperatura ambiente durante 2 minutos, y se centrifugó a 1000 rpm durante 1 minuto, y se eluyó. Cada eluido se neutralizó añadiendo 2,5 j l de Tris-HCl 1,5 M (pH 9,0). La elución se realizó de 4 a 6 veces, y cada fracción se cuantificó usando Nanodrop 200C (Thermo Scientific). Las fracciones en las que se detecta la proteína se recogieron, y se intercambiaron con un tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) usando columnas de desalación giratorias Zeba, 7K PCPM, 5 ml (Cat. n.° 0089892, Pierce). Luego, la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) se realizó en condiciones de reducción y no reducción para verificar finalmente la cuantificación de la concentración y el estado del anticuerpo, y el anticuerpo se mantuvo a 4 °C.

[Tabla 15]

continuación

[Tabla 16]

3-14: Medida de la fuerza de unión cuantitativa del anticuerpo de mutación de la región variable de la cadena pesada MS502 y combinación de C2G4 y anticuerpo de mutación de la región variable de la cadena pesada con respecto al antígeno MSLN

La fuerza de unión cuantitativa (afinidad) de cada uno de los anticuerpos anti-MSLN purificados, es decir, los anticuerpos 56, 2-30, 2-73, 2-78 de mutación de la región variable de cadena pesada del clon MS502 y los anticuerpos de combinación de la región variable de cadena ligera de C2G4 y los anticuerpos de mutación de la región variable de cadena pesada que incluyen 56-C2G4, 2-30-C2G4, 2-73-C2G4, 2-78-C2G4 con respecto a la mesotelina (MSLN) humana recombinante se midieron utilizando un biosensor Biacore T-200 (GE Healthcare, EE. UU. La MSLN (Cat. n.° 3265-MS, R&D systems, EE. UU.) purificada a partir de las células HEK293 se fijó a un chip CM5 (GE Healthcare, CAT n.° BR-1005-30) para satisfacer 200 Rmáx utilizando una reacción amino-carboxílica. Luego, el anticuerpo clon 56, el anticuerpo clon 2-30, el anticuerpo clon 2-73, el anticuerpo clon 2-78, el anticuerpo clon 56-C2G4, el anticuerpo clon 2-30 C2G4, el anticuerpo clon 2-73-C2G4 y el anticuerpo clon 2-78-C2G4 diluido en serie con tampón HBS-Ep (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005 %) se dejaron fluir a un intervalo de concentración de 0,078 nM a 5 nM y a una velocidad de flujo de 30 pl/min para la asociación de 120 segundos y la disociación de 1800 segundos. La disociación del anticuerpo unido a la MSLN se indujo haciendo fluir Glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 a una velocidad de flujo de 30 pl/min durante 30 segundos (Tabla 17). La afinidad se obtuvo como constantes de velocidad de movimiento (Kon y Koff) y una constante de disociación de equilibrio (Kd) utilizando un software de evaluación Biacore T-200 (Tabla 18).

[Tabla 17]

[Tabla 18]

Ejemplo 4: análisis FACS de anticuerpo anti-MSLN que se une a células cancerosas que expresan MSLN

Con la finalidad de evaluar si el anticuerpo anti-MSLN derivado de la biblioteca inmunológica y sintética se une selectivamente a la célula que expresa MSLN, se midió una cantidad de expresión de la MSLN en una línea celular cancerosa, y el anticuerpo que se une a cada célula se confirmó mediante prueba FACS

4-1: Construcción de la línea celular que expresa MSLN

El plásmido (pCMV/MSLN) que contiene la unidad de expresión de MSLN y el gen resistente a higromicina se administró en células de cáncer de páncreas MiaPaCa-2 confirmadas como línea celular negativa para MSLN, utilizando un sistema de transfección jetPEI (polietilenimina) (Polyplus, 101-40) (Figura 4). Después de 48 horas, el líquido de cultivo celular se reemplazó con un líquido de cultivo que contenía higromicina B (200 pg/ml). Se obtuvieron 10 colonias que tenían resistencia contra la higromicina mientras se intercambiaba el líquido de cultivo cada 3 días, para confirmar cada cantidad de expresión de MSLN mediante un método de transferencia Western. Con respecto a cuatro tipos de líneas celulares de cáncer de páncreas (MiaPaCa-2, BxPC-3, Capan-1, AsPC-1) y dos tipos de líneas celulares de mesotelioma (H28, H2452), la cantidad de expresión de MSLN en las células fue confirmada usando el anticuerpo anti-MSLN (n.° 133489, Abcam) a través del método de transferencia Western. Las células de cultivo se separaron añadiendo una solución Tryple Express y se almacenaron en un tubo de 15 ml, seguido de centrifugación a 2000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos para decantar el líquido de cultivo, y el producto obtenido se suspendió con 100 pl de tampón de muestra 1xSDS-PAGE (Tris 50 mM (pH 6,8), SDS al 2%, DTT (ditiotreitol) 100 mM, BPB (azul de bromofenol) al 0,1 %, glicerol al 10 %) y se calentó durante 5 minutos. El producto obtenido se centrifugó para recolectar el sobrenadante, seguido de electroforesis en SDS-PAGE al 4-12 %, a 20 mA durante aproximadamente 2 horas, y se utilizó una unidad de transferencia para transferir la proteína separada a una membrana de PVDF, y luego, la electroforesis se realizó a 300 mA con tampón tris-glicina (glicina 39 mM, tris 48 mM, SDS al 0,037 %, metanol al 20 %) durante aproximadamente 90 minutos. La membrana de PVDF en la que se transfirió la proteína se sometió a bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora usando una solución de bloqueo de TBS. El anticuerpo anti-MSLN (n.° 133489, Abcam) como el anticuerpo primario se diluyó en 1: 2000 con 5% de leche desnatada/tampón 1xTBST, y reaccionó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora, y se lavó con tampón 1xTBST 6 veces cada 5 minutos. La HRP anti-ratón (KPL, MA, U.S.A.) como el anticuerpo secundario se diluyó en 1: 20.000 con 5 % de leche desnatada / tampón 1xTBST, y se hizo reaccionar durante 30 minutos, y se lavó con tampón 1xTBST 6 veces cada 5 minutos. Luego, la banda de proteína MSLN se verificó mediante una solución de reacción de desarrollo de color (ECL, Amersham, Reino Unido).

Como resultado, como se ilustra en la FIG. 5, se confirmó que las líneas celulares H28, MiaPaCa-2, BxPC-3, Capan-1 son MSLN-negativas, y H226, H2452 (H2052), AsPC-1 son MSLN-positivas al medir si hay MSLN que tiene forma precursora de 70 kDa y forma madura de 40 a 50 kDa de cada línea celular de cáncer.

4-2: Análisis de la cantidad de expresión de MSLN en líneas celulares que expresan MSLN y líneas celulares tumorales que expresan MSLN

La prueba FACS se realizó en la MSLN presente en la superficie celular con respecto a MiaPaCa-MSLN, que es una línea celular en la que la MSLN se expresó artificialmente. Las células para analizar que se cultivaron en una placa de

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a mesotelina que comprende:

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; o

una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110.

2. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Una célula hospedadora que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un método de preparación del anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende expresar el anticuerpo cultivando la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer o un tumor que comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 como principio activo.