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HINTERGRUND
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1. Technisches
Gebiet
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Diese
Offenbarung betrifft Klonierungsvektoren. Insbesondere werden Phagemidvektoren,
die zur Klonierung und Exprimierung von fremder genetischer Information
nützlich
sind, offenbart.
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2. Hintergrund
der verwandten Technik
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Plasmide
sind extrachromosonale genetische Elemente, die zur autonomen Replikation
in ihren Wirten fähig
sind. Bakterielle Plasmide liegen größenmäßig im Bereich von 1 Kb bis
200 Kb oder mehr und kodieren eine Vielzahl von nützlichen
Eigenschaften. Von Plasmiden kodierte Merkmale umfassen Resistenz
gegen Antibiotika, Bildung von Antibiotika, Abbau von komplexen
organischen Molekülen,
Bildung von Bacteriocinen, wie z. B. Colicinen, Bildung von Enterotoxinen
und Bildung von DNA-Restriktions- und Modifikationsenzymen.
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Obwohl
Plasmide selbst über
mehrere Jahre insbesondere im Hinblick auf ihre Replikation, Übertragbarkeit,
Struktur und Evolution untersucht worden sind, wechselte der Fokus
der Plasmidforschung mit dem Aufkommen der Verfahren der Gentechnik
zu der Verwendung von Plasmiden als Vektoren für das Klonieren und Exprimieren
von fremder genetischer Information. Für seine Anwendung als ein Vektor
sollte das Plasmid eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften
aufweisen. Die Plasmid-DNA sollte relativ klein sein, aber dazu
geeignet sein, daß sie
relativ große
Mengen an fremder DNA aufweist, die in sie inkorporiert ist. Die
Größe des DNA-Inserts
ist von Bedeutung bei Vektoren, die auf Bacteriophagen basieren,
bei denen die Packung der Nukleinsäure in die Phagenpartikel eine
obere Grenze bestimmen kann. Das Plasmid sollte unter lockerer Replikationskontrolle
stehen. Das heißt,
daß die
Replikation des Plasmidmoleküls
nicht streng mit der Replikation der Wirts-DNA gekoppelt ist (strenge
Kontrolle), was zu vielen Kopien der Plasmid-DNA pro Wirtszelle führt. Das
Plasmid sollte einen oder mehrere selektierbare Marker exprimieren,
wie z. B. die oben genannten Arzneistoffresistenzmarker, um die
Identifizierung der Wirtszellen zu ermöglichen, die das Plasmid enthalten, und
auch um einen positiven Selektionsdruck für die Aufrechterhaltung des
Plasmids in der Wirtszelle bereitzustellen. Schließlich sollte
das Plasmid eine einzelne Restriktionsstelle für eine oder mehrere Endonukleasen in
einem Bereich des Plasmids aufweisen, der für die Plasmidreplikation nicht
essentiell ist. Ein Vektor der oben beschriebenen Art ist beispielsweise
geeignet zur Klonierung von genetischer Information, womit die Integrierung
eines Abschnitts an fremder DNA in den Vektor und die Reproduzierung
von identischen Kopien dieser Information durch die Replikation
der Plasmid-DNA gemeint ist.
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Der
nächste
Schritt in der Evolution der Vektor-Technologie war die Konstruktion
von sogenannten Expressionsvektoren. Diese Vektoren sind gekennzeichnet
durch ihre Fähigkeit,
nicht nur die inserierte fremde genetische Information zu replizieren,
sondern auch die Transkription der genetischen Information in mRNA und
deren anschließende
Translation in Protein zu fördern.
Diese Expression erfordert eine Vielzahl von regulierenden genetischen
Sequenzen, einschließlich,
ohne notwendige Beschränkung
hierauf, Promotoren, Operatoren, Transkriptionsterminatoren, ribosomale
Bindungsstellen und Start- und Stopp-Codons für die Proteinsynthese. Diese
Expressionselemente können
mit dem fremden DNA-Segment als Teile davon bereitgestellt werden,
oder sie können
in den Vektor in einen zu einer Restriktionsstelle benachbarten
Bereich integriert werden, so daß, wenn ein fremdes DNA-Segment
in den Vektor eingebracht wird, dieses unter die Kontrolle jener Elemente
fällt,
mit denen es nun chemisch verbunden ist.
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Filamentöse Bacteriophagen
bestehen aus einem kreisförmigen,
Einzelstrang-DNA-Molekül, das von einem
Zylinder an Hüllproteinen
umgeben ist. Es gibt etwa 2700 Moleküle des Haupthüllproteins
pVIII, die den Phagen umhüllen.
Am einen Ende des Phagenpartikels sind ungefähr 5 Kopien von jedem der Gen-III-
und -VI-Proteine (pIII und pVI), die bei der Wirtszellbindung und
bei der Beendigung des Zusammenfügungsprozesses
involviert sind. Das andere Ende enthält 5 Kopien von jeweils pVII
und pIX, die für
die Initiation des Zusammengehens und für die Aufrechterhaltung der
Stabilität
des Virions erforderlich sind. In den letzten Jahren wurden Vektoren
für das
Präsentieren
von fremden Peptiden und Proteinen auf der Oberfläche von
filamentösen
Phagen- oder Phagemidpartikeln entwickelt und benutzt.
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Die
Präsentation
von Peptiden und Proteinen auf der Oberfläche von Phagen- oder Phagemidpartikeln stellt
eine schlagkräftige
Methode für
die Selektion von seltenen Mitgliedern in einer komplexen Bibliothek
dar und für
die Durchführung
einer molekularen Evolution im Labor. Die Möglichkeit, Bibliotheken von
enormer molekularer Diversität
aufzubauen und nach Molekülen
mit vorbestimmten Eigenschaften auszuwählen, machte diese Technik
für einen
breiten Bereich an Problemen anwendbar. Einige wenige dieser vielen
Anwendungen einer solchen Technik sind: i) die Phagenpräsentation
von natürlichen
Peptiden, einschließlich
der Kartierung von Epitopen von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern und
der Erzeugung von Immunogenen, ii) die Phagenpräsentation von Zufallspeptiden,
einschließlich
der Kartierung von Epitopen von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, der
Identifizierung von Peptidliganden und der Kartierung von Substratstellen
für Proteasen
und Kinasen, und iii) die Phagenpräsentation von Protein und Proteindomänen, einschließlich der geleiteten
Evolution von Proteinen, der Isolierung von Antikörpern und
dem Screening der cDNA-Expression.
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Es
wurden Vektoren entwickelt, die DNA aus Plasmiden und Bacteriophagen
inkorporieren. Diese Phagemidvektoren stammen aus der Modifikation
eines Plasmidgenoms, das einen Replikationsursprung aus einem Bacteriophagen
(z. B. f1, M13, fd) sowie den Plasmidreplikati onsursprung enthält. Phagemide
sind nützlich
für die
Exprimierung von fremder genetischer Information.
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Ein
bekannter Phagemidvektor ist pBluescript II KS+ (pBS II KS+); Stratagene,
(La Jolla, Kalifornien), der aufgrund seiner kleinen Größe ein geeigneter
Ausgangspunkt für
die Konstruktion des vorliegenden Vektors darstellt und aufgrund
der Tatsache, daß er
den colE1-Plasmidreplikationsursprung
und den Phagenreplikationsursprung f1 in der gewünschten Anordnung enthält. Das
Plasmid trägt
auch ein Ampicillinresistenzgen.
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Vektoren,
die aufgrund ihrer Struktur eine verbesserte Funktionalität liefern,
wären wünschenswert.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Es
werden hierin neuartige Plasmidvektoren beschrieben, die zur Replikation
und Exprimierung von fremder genetischer Information in Bakterien,
wie z. B. Cyanobacterium und E. coli, in der Lage sind. Diese neuen
Vektoren enthalten eine spezifische Sequenz von Merkmalen nach dem
ColE1-Ursprung, jedoch vor dem f1-Ursprung. Insbesondere enthält der vorliegende
Phagemidvektor nach dem ColE1-Ursprung, jedoch vor dem f1-Ursprung,
einen bakteriellen Transkriptionsterminator, einen Promotor, eine
erste ribosomale Bindungstelle, eine erste Leadersequenz und einen
ersten Klonierungsbereich, eine zweite ribosomale Bindungsstelle,
eine zweite Leadersequenz und einen zweiten Klonierungsbereich.
Der zweite Klonierungsbereich ist angepaßt, um ein Gen aufzunehmen,
das ein zu präsentierendes
Polypeptid kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die wenigstens eine
funktionelle Domäne
eines Präsentationsproteins
kodiert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Phagemidvektor offenbart, welcher
einen
selektierbaren Marker,
einen ColE1-Ursprung,
einen f1-Ursprung
umfasst und
nach dem ColE1-Ursprung, aber vor dem f1-Ursprung,
weiterhin die folgenden Merkmale umfaßt:
einen bakteriellen
Transkriptionsterminator,
einen Promotor,
eine erste ribosomale
Bindungsstelle,
eine erste Leadersequenz,
einen ersten
Klonierungsbereich,
eine zweite ribosomale Bindungsstelle,
eine
zweite Leadersequenz,
einen zweiten Klonierungsbereich zur
Aufnahme eines Gens, das ein zu präsentierendes Polypeptid kodiert, und
eine
Nukleotidsequenz, die ein Produkt kodiert, welches eine Präsentation
eines Polypeptids an der Oberfläche
eines Phagemidpartikels ermöglicht.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfaßt
wenigstens eine von den ersten oder zweiten ribosomalen Bindungsstellen
des Phagemidvektors Seq. ID Nr. 13, und wenigstens eine der ersten
oder zweiten Leadersequenzen umfaßt eine Sequenz, die aus der
Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus Seq. ID Nr. 14 und Seq. ID Nr. 17.
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Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kodiert die Nukleotidsequenz, die ein Produkt kodiert,
ein Protein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus pIII
und pVIII, vorzugsweise kodiert eine Nukleotidsequenz, die ein Produkt
kodiert, ein trunkiertes pIII oder ein synthetisches pIII.
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Darüber hinaus
wird der selektierbare Marker aus der Gruppe ausgewählt, bestehend
aus Ampicillinresistenz, Chloramphenicoltransferaseresistenz, Tetracyclinresistenz
und Kanamycinresistenz.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfaßt
der Phagemidvektor Seq. ID Nr. 18 oder umfaßt eine Sequenz, die aus der
Gruppe ausgewählt
ist, bestehend aus Seq. ID Nr. 19, 20 und 21.
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Die
hierin beschriebenen Vektoren werden durch eine Reihe von Stufen
konstruiert, bei denen ein Ausgangsvektor über eine Reihe von intermediären Plasmiden
zu dem vorliegenden neuartigen Vektor umgewandelt werden, der zum
Präsentieren
von Antikörperbibliotheken
verwendet werden kann.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
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1 stellt
schematisch die Struktur von pBS II KS+ dar, einem geeigneten Ausgangsvektor
zur Herstellung der hierin beschriebenen neuartigen Vektoren,
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2 ist
ein Flußdiagramm,
das das Verfahren zur Herstellung der hierin beschriebenen neuartigen Vektoren
darstellt,
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3 stellt
schematisch den Verdau des Ausgangsvektors und die Insertion des
Promotors dar,
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die 4A–C zeigen
die Sequenz (Seq. ID Nr. 19) des intermediären Vektors p110-81.6,
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5 stellt
die Insertion des Terminators schematisch dar,
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die 6A–C zeigen
die Sequenz (Seq. ID Nr. 20) des intermediären Vektors p131-03.7,
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7 stellt
die Insertion von multiplen Klonierungsstellen dar,
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die 8A–C zeigen
die Sequenz (Seq. ID Nr. 21) des intermediären Vektors p131-39.1,
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9 stellt
schematisch dar die Insertion der Nukleotidsequenz, die das Präsentationsprotein
kodiert, und der zwei Transkriptionskontrollkassetten,
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10 ist
eine Karte des Plasmids pAX131 und
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die 11A–D
zeigen die Nukleinsäruesequenz
(Seq. ID Nr. 18) des Plasmids pAX131, einschließlich der Domänen, die
den bestimmten Genen entsprechen.
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Die 12A–G
zeigen die Nukleinsäuresequenzen
der illustrierenden Stuffer-Sequenzen.
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Die 13A–C
zeigen die Nukleinsäuresequenzen
des Plasmids pAX131 Xba/Not.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegenden neuartigen Phagemidvektoren sind nützlich, um Polypeptide, wie
z. B. Antikörperbibliotheken,
zu präsentieren.
Die hierin beschriebenen Vektoren können unter Verwendung jedes
im Handel erhältlichen
Vektors, der einen ColE1- und einen f1-Replikationsursprung enthält, als
Ausgangsmaterial hergestellt werden. Solche Ausgangsmaterialien
sind bekannt und sind im Handel erhältlich. Ein geeignetes Ausgangsmaterial
ist der Vektor pBS II KS+, der von Stratagene Corp., La Jolla, Kalifornien,
käuflich
erworben werden kann (s. 1).
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2 ist
ein Flußdiagramm,
das eine Ausführungsform
der Stufen darstellt, die bei der Umwandlung eines Ausgangsvektors
in einen der vorliegenden neuartigen Vektoren beteiligt sind. Der
Fachmann wird leicht andere Schemata zur Herstellung der vorliegenden
Vektoren erkennen. Dementsprechend ist die vorliegende Offenbarung
nicht auf die in 2 gezeigte Abfolge von Stufen
beschränkt.
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Bei
der ersten Stufe wird der Ausgangsvektor mit Restriktionsenzymen
verdaut, um einen wesentlichen Anteil des Vektors zwischen dem ColE1-Ursprung
und dem f1-Ursprung der Replikation zu entfernen. Typischerweise
umfaßt
der aus dem Ausgangsvektor zu entfernende Anteil multiple Klonierungsstellen.
In Abhängigkeit
von den jeweiligen in dem Ausgangsvektor vorliegenden Restriktionsstellen
sind dem Fachmann geeignete Verfahren für den Verdau des Ausgangsvektors
bekannt und können
von ihm leicht ausgewählt
werden.
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Danach
wird downstream vom ColE1-Ursprung des verdauten Ausgangsvektors
ein Promotor eingefügt.
Es kann jeder Promotor, der von einer Wirtszelle erkannt wird, verwendet
werden. Geeignete Promotoren umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein,
ara-, lac- und trc-Promotoren.
Der Promotor treibt die Expression von anderen in den Vektor eingefügten Sequenzen
an, wie z. B. die Expression von Polypeptiden. Bei besonders geeigneten
Ausführungsformen
wird eine Promotorsequenz, die aus dem Ausgangsvektor erzeugt wurde, als
der Promotor verwendet, der downstream des ColE1-Ursprungs eingefügt wird,
wie unten noch ausführlicher
beschrieben wird.
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Bei
der nächsten
Stufe wird ein bakterieller Transkriptionsterminator downstream
des ColE1-Ursprungs und upstream vom Promotor eingefügt. Es kann
jeder Terminator, der von einer Wirtszelle erkannt wird, eingesetzt
werden. Geeignete Terminatoren umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein,
den tHP-Terminator, den bglG-Terminator
und den crp-Terminator. Es sollte zur Kenntnis genommen werden,
daß Bioinformatikanalysen
die Identifizierung von über
100 rho-unabhängigen
Transkriptionsterminatoren im E.-coli-Genom ermöglicht haben, von denen alle
für diesen
Zweck geeignet sein sollten (Ermolaeva, et al., J. Mol Biol 301:
27–33
(2000)).
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Bei
der nächsten
Stufe werden multiple Restriktionsstellen downstream des Promotors
eingefügt.
Die Restriktionsstelle kann jede bekannte Restriktionsstelle sein.
Die für
die Insertion geeigneten Restriktionsstellen umfassen, ohne hierauf
beschränkt
zu sein, NheI, HindIII, NcoI, XmaI, BglII, BstI, PvuI etc. Die Zahl
der Restriktionsstellen, die eingefügt werden, ist nicht entscheidend,
vorausgesetzt, es wird eine genügende
Anzahl von Restriktionsstellen eingefügt, um die Vervollständigung
des Gleichgewichts der Stufen zu ermöglichen, die erforderlich sind,
um die vorliegenden neuartigen Vektoren zu erzeugen. Daher können so
wenige wie 2 bis zu so vielen wie 10 oder mehr Restriktionsstellen
bei dieser Stufe eingefügt
werden. Es sollte klar sein, daß,
falls eine oder mehrere Restriktionsstellen, die für die Einfügung ausgewählt wurden,
in dem Ausgangsvektor vorliegen, es gewünscht sein kann, die native
Restriktionsstelle zu entfernen oder unwirksam zu machen, um ungewollten
Verdau während
der weiteren Verarbeitung zu vermeiden. Die Restriktionsstelle kann eingefügt werden,
indem eine beliebige, dem Fachmann bekannte Technik angewandt wird.
Eine bei dieser Stufe eingefügte
besonders bevorzugte Kombination von Restriktionsstellen ist NotI,
SfiI, SpeI, XhoI, XbaI und EcoRI.
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Die
nächste
Stufe umfaßt
das Einfügen
einer Nukleotidsequenz, die ein Produkt kodiert, welches die Präsentation
eines Polypeptids auf der Oberfläche
eines Phagemidpartikels ermöglicht.
Das kodierte Produkt kann daher wenigstens als eine funktionelle
Domäne
eines Präsentationsproteins
betrachtet werden. Das Präsentationsprotein
kann jedes natürliche
oder synthetische Polypeptid sein, mit dem ein zu präsentierendes
Polypeptid fusioniert werden kann und welches das zu präsentierende
Polypeptid für
Screeningprozesse präsentieren
kann. Geeignete Präsentationspolypeptide
umfassen Proteine, die in die Hülle
eines Phagenpartikels inkorporiert werden können. Für den Fachmann ist klar, daß filamentöse Bakteriophagen
aus einem kreisförmigen
Einzelstrang-DNA-Molekül
bestehen, das von einem Zylinder aus Hüllproteinen umgeben ist. Es
gibt über
2700 Moleküle
des Haupthüllproteins
pVIII, die den Phagen einkapseln. An einem Ende des Phagepartikels
gibt es ungefähr
fünf Kopien
von jedem der Gen-III- und -VI-Proteine (pIII und pVI), die bei
der Wirtszellbindung und bei der Beendigung des Zusammenfügungsprozesses
beteiligt sind. Das andere Ende enthält fünf Kopien von jeweils pVII
und pIX, die für
die Initiation der Zusammenfügung
und für
die Aufrechterhaltung der Stabilität des Virions erforderlich
sind. Eine Nukleotidsequenz, die eines dieser Hüllproteine kodiert, kann bei
der Herstellung der hiesigen neuartigen Vektoren eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Nukleotidsequenzen, die wenigstens eine
funktionelle Domäne
von pIII kodieren. Die Nukleotidsequenz, die wenigstens eine funktionelle
Domäne
von pIII kodiert, kann natürlich
oder synthetisch sein. Die eingefügte Nukleotidsequenz kann ein
trunkiertes pIII kodieren, vorausgesetzt die Präsentationsfunktion des Proteins
bleibt erhalten. Ein Beispiel eines hier verwendbaren synthetischen
oder künstlichen
Hüllproteins
ist das in Weiss et al., J. Mol. Biol., 300 (1), 213–219 (2000)
offenbarte.
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Bei
der nächsten
Stufe werden zwei Transkriptionskontrollkassetten eingefügt, eine
upstream-Transkriptionskontrollkassette und eine downstream-Transkriptionskontrollkassette.
Jede der Transkriptionskontrollkassetten umfaßt eine ribosomale Bindungsstelle,
eine Leadersequenz und eine Klonierungsstelle zur Aufnahme eines
Gens, das ein Polypeptid, das exprimiert werden soll, kodiert. Es
kann jede bekannte ribosomale Bindungsstelle (RBS) und Leadersequenz,
die von der Wirtszelle erkannt wird, eingesetzt werden. Vorzugsweise ist
die eingesetzte RBS und Leadersequenz für die Expression in E. coli
optimiert. Die Klonierungsstelle ist ein Bereich der Nukleinsäure zwischen
zwei Restriktionsstellen, typischerweise mit einem nicht essentiellen
Bereich Nukleotidsequenz (im allgemeinen als eine "Stuffer"-Sequenz bezeichnet),
die dazwischen angeordnet ist. Alternativ kann die Stuffer-Sequenz
einen nicht essentiellen Bereich und einen Teil einer konstanten
Domäne
eines Antikörpers
enthalten. Geeignete Stuffer-Sequenzen umfassen beispielsweise diejenigen,
die in den 12A–G dargestellt sind.
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Die
downstream-Transkriptionskontrollkassette wird benachbart zu der
Nukleotidsequenz, die wenigstens die funktionelle Domäne des Präsentationsproteins
kodiert, eingefügt.
Auf diese Weise wird ein Fusionsprotein exprimiert, wenn ein Gen,
das ein zu präsentierendes
Polypeptid kodiert, bei der Klonierungstelle der downstream-Transkriptionskontrollkassette
eingefügt
wird. Es ist dem Fachmann bewußt,
daß zwischen
dem Gen, das das zu präsentierende
Polypeptid kodiert, und der Nukleotidsequenz, die wenigstens eine
funktionelle Domäne
des Präsentationsproteins
kodiert, ein supprimierbares Stoppcodon angeordnet sein könnte, so daß in einem
supprimierenden Wirt eine Fusionspräsentation erreicht wird (solange
das Gen eingerahmt eingefügt
ist) und bei einem nicht supprimierenden Wirt ein sezerniertes Protein
ohne das Präsentationsprotein erhalten
wird.
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Die
upstream-Transkriptionskontrollkassette wird upstream der downstream-Transkriptionskontrollkassette
eingefügt.
Die upstream-Transkriptionskontrollkassette liefert einen zweiten
Klonierungsbereich zur Aufnahme eines zweiten Gens, das ein Polypeptid
kodiert, welches mit dem zu präsentierenden
Polypeptid dimerisieren kann. Wenn beispielsweise der Vektor ein
mit einem Präsentationsprotein
fusioniertes schwere-Kette-Fd exprimiert, kodiert das zweite Gen
vorzugsweise eine leichte Kette eines Antikörpers. Wie bei der Klonierungsstelle
der downstream-Transkriptionskontrollkassette ist die Klonierungsstelle
der upstream- Transkriptionskontrollkassette
ein Bereich des Vektors zwischen zwei Restriktionsstellen, typischerweise
mit einem dazwischen angeordneten Stuffer. Selbstverständlich sollte
es klar sein, daß,
wenn ein anderes Polypeptid als ein Antikörper präsentiert werden soll (wie z.
B. wenn die monomere Präsentation
eines einzelnen Polypeptids oder Proteins beabsichtigt wird), kein
zweites Gen an der Klonierungsstelle der upstream-Transkriptionskontrollkassette
in den Vektor kloniert werden muß. In solchen Fällen kann
die zweite Klonierungsstelle einfach ungenutzt bleiben. Es ist dem
Fachmann ebenso bewußt,
daß, wenn
ein Einzelketten-Antikörper
von dem an der Klonierungsstelle der downstream-Transkriptionskontrollkassette
eingefügten
Gen kodiert wird, es keinen Bedarf gibt, ein zweites Gen an der
Klonierungsstelle der upstream-Transkriptionskontrollkassette
in den Vektor einzufügen.
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Folglich
wird der nach dem in 2 dargestellten Verfahren hergestellte
Phagemidvektor nach dem ColE1-Ursprung, aber vor dem f1-Ursprung,
einen Terminator, einen Promotor, eine erste ribosomale Bindungsstelle,
eine erste Leadersequenz und einen ersten Klonierungsbereich, eine
zweite ribosomale Bindungsstelle, eine zweite Leadersequenz und
einen zweiten Klonierungsbereich zur Aufnahme eines Gens, das ein
zu präsentierendes
Polypeptid kodiert, und eine Nukleotidsequenz, die wenigstens eine
funktionelle Domäne
eines Präsentationsproteins
kodiert, enthalten.
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Die
vorliegenden Vektoren umfassen auch einen selektierbaren Marker.
Gemäß der vorliegenden
Offenbarung kann entweder ein ampicillinresistenter oder ein CAT-resistenter
Vektor hergestellt werden. Die Ampicillin- oder CAT-Resistenz kann
verliehen werden, indem einfach ein Ausgangsvektor gewählt wird,
der die gewünschte
Resistenz aufweist. Falls der Ausgangsvektor ampicillinrestistent
ist, wird alternativ das Ampicillinresistenzgen entfernt und mit
dem Chloramphenicoltransferasegen ersetzt, um einen CAT-resistenten
Vektor zu erzeugen. Die Verfahren, um dem vorliegenden Vektoren
entweder Ampicillin- oder CAT-Resistenz zu verleihen, werden für den Fachmann
leicht ersichtlich sein. Andere geeignete selektierbare Marker umfassen, ohne
hierauf beschränkt
zu sein, Tetracyclin- oder Kanamycin-Resistenz.
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Die
hier beschriebenen Vektoren können
unter Anwendung von bekannten Verfahren (z. B. Elektroporation)
in eine Wirtszelle transformiert werden und amplifiziert werden.
Gemäß dieser
Offenbarung können
die hier beschriebenen Vektoren auch verdaut werden und ein erstes
Gen und wahlweise ein zweites Gen hinein ligiert bekommen. Der so
zusammengebaute Vektor kann unter Anwendung bekannter Verfahren
in eine Wirtszelle transformiert werden und amplifiziert werden,
um die Expression von dadurch kodierten Polypeptiden und/oder Proteinen
zu bewirken, um Phagenpartikel hervorzubringen, die einzelne Polypeptide
oder dimäre Spezies
präsentieren.
Der Fachmann wird leicht weitere Anwendungen für die hier beschriebenen neuartigen Vektoren
vergegenwärtigen.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung, ohne
ihren Umfang zu beschränken. Die
Stufen, die die Konstruktion der hier beschriebenen Vektoren mit
sich bringt, werden in den Beispielen ausführlich diskutiert. Der Fachmann
verfügt über das
Wissen über
geeignete Verfahren, um die unten beschriebenen Stufen zu vervollständigen,
ohne daß hierfür übermäßiges Experimentieren
erforderlich wäre,
wobei dem Fachmann solche Verfahren gut bekannt sind.
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BEISPIEL 1
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Dieses
Beispiel beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen für die Konstruktion
einer Ausführungsform
eines Phagemidvektors gemäß der vorliegenden
Offenbarung. Das für
die Konstruktion ausgewählte
Ausgangsphagemid war pBS II KS+, das ein Ampicillinresistenzgen
enthält,
was zu einem fertigen Vektor pAX131 führt, der ampicillinresistent
ist.
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Verdau des Ausgangsvektors
und Insertion des Promotors
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Der
im Handel erhältliche
Vektor pBS II KS+ (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) wurde mit
PvuI und SapI verdaut, um ein Fragment mit 2424 bp von pBS II KS+
zu erzeugen, dem die Basen an den Positionen 500 bis 1037 fehlen,
die dem multiplen Klonierungsbereich entsprechen. Das hieraus hervorgehende
Fragment enthält
das Ampicillinresistenzgen (AmpR), den Phagenursprung f1 und den
ColE1-Ursprung (s. 3). Danach wurden zwei mutagene
Primer mit dem Fragment pBS II KS+ in einer PCR-Reaktion verwendet,
gefolgt von dem Verdau mit EcoRI und SapI, um so ein Fragment mit
209 bp zu erzeugen, das den lac-Promotor enthält. Die verwendeten Primer
waren die folgenden:
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Das
Fragment mit 2424 bp und das Fragment mit 209 bp wurden in einer
Drei-Wege-Ligationsreaktion mit
zwei überlappenden
Oligonukleotiden, die NotI-, EcoRI- und PvuI-Stellen enthalten, kombiniert, um so
ein erstes intermediäres
Plasmid (bezeichnet als p110-81.6)
auszubilden (s. 3). Die für diese Reaktion verwendeten
Oligonukleotide waren:
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Das
resultierende Plasmid p110-81.6 wurde verdaut und in dem veränderten
Bereich sequenziert, um einen Klon mit der korrekten Inkorporation
des lac-Promotors, der PvuI-, SapI-EcoRI- und NotI-Stellen zu identifizieren.
Die Sequenzierung von p110-81.6 ergab eine Nukleinsäureveränderung
an Position 875 innerhalb des lac-Promotors. Die veröffentlichte
Sequenz von pBS II KS+ wies in Position 875 ein Adenin auf. Allerdings ergaben
die Sequenzierung von p110-81.6 und des ursprünglichen pBS II KS+ in Position
875 ein Guanin. Die Sequenz (Seq. ID Nr. 19) des intermediären Plasmids
p110-81.6 ist in den 4A–C dargestellt.
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Insertion des Terminators
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Upstream
vom lac-Promotor wurde in das erste intermediäre Plasmid (p110-81.6) an der
SapI-Stelle eine Transkriptionsterminationssequenz eingefügt (s. 5).
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Das
Plasmid 110-81.6 wurde mit SapI verdaut, um einen Insertionspunkt
für die
Oligonukleotide zu erzeugen, die einen tHP-Terminator
enthalten (Nohno et al., Molecular and General Genetics, Vol. 205,
Seiten 260–269
(1986)). Die bei dieser Ligation verwendeten Oligonukleotide waren:
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Der
hieraus hervorgehende intermediäre
Vektor (bezeichnet als p131-03.7) wurde verdaut und in dem veränderten
Bereich sequenziert, um seine Identität zu bestimmen. Die Sequenz
(Seq. ID Nr. 20) des intermediären
Vektors p131-03.7 ist in den 6A–C dargestellt.
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Einfügung von multiplen Restriktionsstellen
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In
das intermediäre
Plasmid p131-03.7 wurden dann Oligonukleotide eingeführt, die
die XbaI-, XhoI-, SpeI- und Sfi-Stellen enthalten (s. 7).
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Der
intermediäre
Vektor p131-03.7 wurde mit EcoRI und NotI verdaut und dann mit einem
Gel aufgereinigt. Danach wurden die überlappenden Oligonukleotide,
die die XbaI-, XhoI-, SpeI- und SfiI-Stellen enthalten, in die p131-03.7-Hauptkette
ligiert. Die eingefügten
Oligonukleotide waren:
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Das
hieraus hervorgehende intermediäre
Plasmid (bezeichnet als p131-39.1) wurde sequenziert und analysiert,
um seine Identität
zu bestimmen. Die Sequenz (Seq. ID Nr. 21) des intermediären Plasmids p131-39.1
ist in den 8A–C dargestellt.
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Konstruktion der Nukleotidsequenz,
die das Präsentationsprotein
kodiert
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Für die Klonierung
des Gens III wurde als eine Matrize die Einzelstrang-DNA aus dem
Phagen f1 (ATCC #15766-B2) verwendet (s. 9).
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Die
verwendeten Primer waren:
5' AGT
GGC CAG GCC GGC CTT GAA ACT GTT GAA AGT TGT TTA GCA AA 3' (Seq. ID Nr. 9),
welcher die SfiI-Stelle, Basen zur Aufrechterhaltung des kodierenden
Rahmens und einen Teil des Gens III enthält, und
5 TCT GCG GCC
GCT TAG CTA GCT TAA GAC TCT TTA TTA CGC AGT ATG TTA GCA 3' (Seq. ID Nr. 10), welcher
das Ende des Gens III enthält,
bei welchem eine interne ribo somale Bindungsstelle, die normalerweise für das nächste downstream-Gen
verwendet wird, entfernt worden ist, indem eine stumme dritte Basenposition in
dem entsprechenden Codon ausgetauscht wurde. Dieses Oligonukleotid
enthält
auch ein Stoppcodon, eine NheI-Stelle für die mögliche Verwendung bei der Fusionsentfernung,
ein zweites Stoppcodon für
die Verwendung bei der Fusion und die NotI-Stelle für die Klonierung.
Das PCR-Fragment wurde mit SfiI und NotI verdaut und in mit SfiI
und NotI verdautes p131-39.1 eingefügt, um den intermediären Vektor
p131-44.2 zu erzeugen. Die Integrität des Bereichs des Gens III
und der flankierenden Sequenzen wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
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Erzeugung der upstream-Transkriptionskontrollkassette
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Das
Plasmid 131-39.1 wurde als ein Shuttlevektor zur Klonierung der
Oligonukleotide verwendet, die die Sequenz enthalten, die das ompA-Signalpeptid
kodieren. Die upstream-Transkriptionskontrollkassette
wurde in dem intermediären
Plasmid 131-39.1 erzeugt, indem ein Paar von Oligonukleotiden, die
EcoRI enthalten, der Leader des ompA-Signalpeptids, gefolgt von
einer SacI-Stelle, eine kleine Stuffer-Region und eine ribosomale
Bindungsstelle eingefügt
wurden (s. 9). Die verwendeten Oligonukleotide
waren:
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Die
RBS- und die Leadersequenzen, die in der upstream-Transkriptionskontrollkassette
eingeschlossen sind, sind für
die Verwendung in E. coli optimiert. Diese neuartigen Sequenzen
sind:
5' AAG
GAG 3' (Seq. ID
Nr. 13) für
die RBS und
5' ATG
AAA AAA ACC GCG ATT GCG ATT GCG GTG GCG CTG GCG GGC TTT GCG ACC
GTG GCC CAG GCG GCC 3' (Seq.
ID Nr. 14) für
den ompA-Leader.
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Das
hieraus hervorgehende Plasmid wurde sequenziert, um die Identität des Inserts
zu bestätigen, und
an den EcoRI- und XbaI-Stellen verdaut, um ein Fragment mit 94 bp
zu erzeugen, welches die upstream-Transkriptionskontrollkassette
ist.
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Erzeugung der downstream-Transkriptionskontrollkassette
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Das
intermediäre
Plasmid 131-39.1 wurde als ein Shuttlevektor zur Klonierung der
Oligonukleotide, die die Sequenz enthalten, die das pelB-Signalpeptid
kodieren, verwendet. Die downstream-Transkriptionskontrollkassette
wurde in dem intermediären
Plasmid 131-39.1 erzeugt, indem ein Paar an Oligonukleotiden, die
das pelB-Signapeptid enthalten, eine XbaI- Stelle und eine ribosomale Bindungsstelle
eingeführt
werden. Die verwendeten Oligonukleotide waren:
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Die
neuartige pelB-Leadersequenz wurde für die Verwendung in E. coli
optimiert und wies die Sequenz
5' TAT GAA ATA TCT GCT GCC GAC CGC GGC
GGC GGG CCT GCT GCT GCT GGC GGC GCA GCC GGC GAT GGC G 3' (Seq. ID Nr. 17)
auf. Das hieraus hervorgehende Plasmid wurde sequenziert, um die
Identität des
Inserts zu bestätigen,
und an den XbaI- und XhoI-Stellen verdaut, um ein Fragment mit 91
bp zu erzeugen, welches die dowstream-Transkriptionskontrollkassette
ist.
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Konstruktion des pAx131-Vektors
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Die
upstream-Transkriptionskontrollkassette und die downstream-Transkriptionskontrollkassette
wurden mit dem mit EcoRI und XhoI verdauten intermediären Plasmid
p131-44.2 in einer Drei-Wege-Ligationsreaktion kombiniert, um pAX131
zu erzeugen (s. 9). 10 ist
eine Karte des hieraus hervorgehenden Vektors pAX131. Das pAX131
wurde analysiert, um seine Nukleinsäuresequenz (Seq. ID Nr. 18)
zu bestimmen, welche in den 11A–D gezeigt
ist.
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BEISPIEL 2:
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Einfügung einer alternativen upstream-Transkriptionskontrollkassette
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Der
Vektor pAX131 wurde mit dem Restriktionsenzym NotI verdaut. Die
resultierende überstehende DNA
wurde dann mit der Klenowfragment-Polymerase ausgefüllt, um
die Enden der DNA abzustumpfen, was gefolgt wurde von der Ligation.
Dies wurde durchgeführt,
um die bestehende NotI-Stelle zu entfernen. Der Vektor pAX131, aus
dem NotI entfernt wurde, wurde mit EcoRI/XbaI verdaut und mit einem
duplexierten Oligo, das EcoRI- und SpeI-Überstände enthält ligiert (XbaI und SpeI weisen
kompatible Enden auf).
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Der
hieraus hervorgehende Vektor (pAX131 Xba/Not) wies XbaI- und NotI-Stellen
für die
Klonierung eines Gens auf, wie z. B. leichte Ketten, eher als SacI
und XbaI. Die 13A–C zeigen die Nukleinsäuresequenz
für den
Vektor pAX131 Xba/Not.
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Es
wird vorgeschlagen, daß die
vorliegenden neuartigen Vektoren in Verbindung mit der Herstellung und
dem Screening von Bibliotheken verwendet werden können, die
in Übereinstimmung
mit herkömmlichen Phagenpräsentationstechniken
erstellt wurden. Es wurden sowohl natürliche als auch synthetische
Antikörperrepertoires
als von Phagen präsentierte
Bibliotheken erzeugt. Natürliche
Antikörper
können
aus B-Zell-mRNA geklont werden, die aus Lymphozyten des peripheren
Bluts isoliert wurden, oder aus dem Knochenmark, der Milz oder anderem
lymphatischen Gewebe eines menschlichen oder nicht menschlichen
Donors. Donoren mit einer Immunantwort auf das (die) interessierende(n)
Antigen(e) können
verwendet werden, um Immunantikörperbibliotheken
zu erzeugen. Alternativ können
Nicht-Immunbibliotheken von Donoren erzeugt werden, indem ungekünstelte
B-Zellgene für
Antikörper
isoliert werden. Die PCR, bei der antikörperspezifische Primer auf dem
ersten Strang der cDNA verwendet werden, ermöglicht die Isolierung von Leichte-Kette-
und Schwere-Kette-Antikörperfragmenten,
die dann in den Präsentationsvektor
kloniert werden können.
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Synthetische
Antikörper
oder Antikörperbibliotheken
können
teilweise oder vollständig
mit Bereichen von synthetisch abgeleiteten Sequenzen erstellt werden.
Die Diversität
einer Bibliothek kann innerhalb der variablen Bereiche technisch
bearbeitet werden, insbesondere in den CDRs, indem degenerierte
Oligonukleotide verwendet werden. Zum Beispiel kann ein einzelnes
Fab-Gen in der CDR3-Position der schweren Kette modifiziert werden,
so daß sie
zufällige
Nukleotidsequenzen enthält.
Die zufällige
Sequenz kann in das schwere-Kette-Gen eingeführt werden, indem ein Oligonukleotid,
welches den degenerierten Kodierungsbereich enthält, in einem Überlapp-PCR-Ansatz
verwendet wird. Alternativ können
degenerierte Oligokassetten in die Restriktionsstellen, die den
(die) CDR(s) flankieren, kloniert werden, um Diversität zu erzeugen.
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Die
resultierende Bibliothek, die nach diesem oder anderen Ansätzen erzeugt
wurde, kann dann in einen Präsentationsvektor
gemäß dieser
Offenbarung kloniert werden.
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Durch
die Einführung
der Präsentationsbibliothek
in Bakterien werden Phagenpartikel erzeugt, die auf der Oberfläche Antikörper präsentiert
haben. Die hieraus hervorgehende Sammlung an von Phagen präsentierten
Antikörpern
kann hinsichtlich derjenigen ausgewählt werden, die die Fähigkeit
haben, das interessierende Antigen zu binden, indem hierfür dem Fachmann
bekannte Verfahren angewandt werden. Die nach diesem System identifizierten
An tikörper
können
therapeutisch verwendet werden, als diagnostische Reagenzien oder
als Werkzeuge für
die Forschung.
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Es
wird vorgeschlagen, daß einzel-
und doppelstrangige Versionen der hier beschriebenen Vektoren innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Die Übersicht
des Fachmanns umfaßt
selbstverständlich
die Herstellung von entweder einzel- oder doppelstrangigen Vektoren,
die die hierin beschriebenen Merkmale aufweisen.
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Es
ist klar, daß zu
den hierin beschriebenen Ausführungsformen
verschiedene Abwandlungen vorgenommen werden können. Beispielsweise ist dem
Fachmann bewußt,
daß ein
erstes Gen, das ein Fusionsprotein kodiert, welches die leichte
Kette eines Antikörpers
aufweist, die mit pVIII fusioniert und von diesem präsentiert
werden soll, und ein zweites Gen, das eine schwere-Kette-Fd kodiert,
in den Vektor an der neu erzeugten Restriktionsstelle eingefügt werden
kann, um eine effektive Antikörperpräsentation
zu liefern. Daher sollte die obige Beschreibung nicht beschränkend ausgelegt
werden, sondern eher als Erläuterung
von bevorzugten Ausführungsformen.
Der Fachmann wird weitere Modifikationen innerhalb des Umfangs und
des Geistes der hieran anhängenden
Ansprüche
vergegenwärtigen.
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