DE60025824T2

DE60025824T2 - VERFAHREN ZUR PRäSENTATION VON HETERODIMEREN PROTEINEN AUF FILAMENTöSEN PHAGEN UNTER VERWENDUNG VON PVII UND PIX, ZUSAMMENSETZUNGEN, VEKTOREN UND KOMBINATORISCHE BIBLIOTHEKEN

Info

Publication number: DE60025824T2
Application number: DE60025824T
Authority: DE
Inventors: D. Kim La Jolla JANDA; Peter Del Mar WIRSCHING; A. Richard La Jolla LERNER; Changshou San Diego GAO
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: EP1185636A1; US7078166B2; EP1185636B1; AU782349B2; EP1185636A4; DE60025824D1; CA2374505C; US20030186322A1; US6472147B1; PT1185636E; CA2374505A1; WO2000071694A1; ES2256015T3; AU5290000A; ATE317008T1; DK1185636T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Klonierungsvektoren und Verfahren zum Herstellen einer Genbank von DNA-Molekülen, die fähig sind, ein Fusionspolypeptid auf der Oberfläche eines filamentösen Phagenpartikels zu exprimieren. Die Erfindung betrifft insbesondere die Präsentation kombinatorischer Genbanken, besonders heterodimerer Proteine, unter Verwendung der Proteine pVII und pIX des filamentösen Phagen.
Hintergrund der Erfindung
Zum Herstellen kombinatorischer Antikörpergenbanken und zur Präsentation kombinatorischer Arrays von Peptidelementen ist die Phagenpräsentation intensiv untersucht worden. Siehe zum Beispiel Rodi et al., Curr. Ogin. Biotechnol., 10: 87–93, 1999; Vaughan et al., Nat. Biotechnol., 16: 535–539, 1998; Griffiths et al., Curr. Ogin. Biotechnol., 9: 102–108, 1998; Zwick et al., Curr. Ogin. Biotechnol., 9: 427–436, 1998; Dall'Acqua et al., Curr. Ogin. Struct. Biol., 8: 443–450, 1998; Raag et al:, Faseb J., 9: 73–80, 1995; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978–7982, 1991; Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4363–4366, 1991; Huse et al., Science, 246: 1273–1278, 1989).
Viele Details des Phagenpartikels selbst sind jedoch nicht völlig aufgeklärt worden und die Möglichkeit alternativer Präsentationsformate muss auch noch erkundet werden. Der filamentöse Bakteriophage fd, und ähnlich M13, besteht aus einem zirkulären einzelsträngigen DNA-Molekül, das von einem Zylinder von Hüllproteinen umgeben ist (1). Das Molekulargewicht eines Partikels ist etwa 1,6 × 10⁷ Da, wovon 88% Protein ist und 12% DNA ist (Berkowitz et al., J. Mol. Biol., 102: 531–547, 1976). Es gibt etwa 2700 Moleküle des Haupthüllproteins pVIII, die den Phagen umhüllen. An einem Ende des Partikels gibt es jeweils fünf Kopien von pIII und pVI, die mit der Wirtszellbindung und der Beendigung des Asseembly-Vorgangs in Zusammenhang stehen. Das andere Ende enthält jeweils fünf Kopien von pVII und pIX, wobei es sich um hydrophobe Peptide von 33 bzw. 32 Aminosäuren handelt, die zur Assembly-Initiation und zur Aufrechterhaltung der Virionstabilität erforderlich sind. Während pIII, pVI und pVIII verwendet worden sind, um biologische Moleküle zu präsentieren, sind pVII und pIX nicht benutzt worden (Rodi et al., Curr. Ogin. Biotechnol., 10: 87–93, 1999; Russel et al., J. Virol., 63: 3284–3295, 1989).
Versuche zum Phagenassembly in Abwesenheit von pVII und pIX hoben die Phagenherstellung beinahe vollständig auf. Frühere Versuche, ein Fusionsprotein auf pVII oder pIX zu präsentieren, zeigten vorher zusätzlich, dass pVII und pIX mit einem anderem Protein, das an ihre N-Termini fusioniert war, nicht funktionell waren (Endemann et al., J. Mol. Biol., 250: 496–506, 1995), was anzeigte, dass Präsentation unter Verwendung von pVII, pIX oder beiden nicht möglich sein würde.
Trotz der enormen Aufmerksamkeit, die sich auf durch pIII und pVIII vermittelte Phagenpräsentation konzentriert, gibt es keine Beschreibungen der Verwendung von pVII oder pIX zur Präsentation fremder Proteine, Polypeptide oder Antigen bindender Moleküle, wie zum Beispiel Einkettenantikörper oder Komponenten eines heterodimeren Proteinkomplexes.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist jetzt entdeckt worden, dass pVII und pIX, wenn sie an die N-Termini von einem der zwei Hüllproteine fusioniert sind, zum Präsentieren eines Peptids verwendet werden können. Von größerer Bedeutung wird hier beschrieben, dass an pVII und pIX fusionierte variable Antikörperregionen auf der Oberfläche des Phagen eine dynamische Wechselwirkung eingehen, um einen funktionellen Fv-Antikörper, ein repräsentatives heterodimeres Motiv, zu präsentieren. Die Präsentation variabler Regionen der schweren und leichten Antikörperkette auf Phagen ist deshalb ein Prototyp zur Präsentation und Analyse vielfältiger Genbanken kombinatorischer heterodimerer Arrays, wobei die Mitglieder als dimere künstliche Antikörperspezies funktionieren können und die Auswahl neuer biologischer Aktivitäten ermöglichen.
Künstliche Antikörper werden hier als Proteinmotive von großer Vielfältigkeit definiert, die die funktionelle Strategie des Antikörpermoleküls verwenden, aber von den strukturellen Einschränkungen durch Schleife und Gerüst frei sein können. Auf seinen Kern reduziert ist das Antikörpermolekül eine biologische Einrichtung zur Präsentation eines kombinatorischen Arrays von Peptidelementen im dreidimensionalen Raum. Das entscheidende Merkmal ist, dass, während CDRs (komplementaritätsbestimmende Bereiche) zusammenwirken, um eine Bindungsstelle zu bilden, ihre Wechselwirkung dynamisch und funktionell ist, mit geringer struktureller Assoziation zwischen den CDRs selbst. Das ganze Komplement der Aminosäurereste ist auf diese Weise zur Antigenerkennung verfügbar, bei minimalen energetischen Kosten für das Binden. Es wird vorgeschlagen, dass die Fähigkeit, die kombinatorische Gestaltung nicht nur des Sequenzraums, sondern auch des dreidimensionalem Raums zu kontrollieren, die natürliche Gestaltung des Immunrepertoires wiederholen und letztendlich darüber hinausgehen würde.
Die Erfindung beschreibt daher ein kombinatorisches Phagenpräsentationsformat zur Konstruktion höchst vielfältiger heterodimerer Polypeptidarrays.
Insbesondere beschreibt die Erfindung ein filamentöses Phagenpartikel, das ein Genom einkapselt, das ein Fusionspolypeptid kodiert, wobei das Fusionspolypeptid ein prokaryotisches Sekretionssignal hat und ein an den Aminoterminus eines Proteins pVII oder pIX des filamentösen Phagen fusioniertes exogenes Polypeptid umfasst. Das Phagenpartikel umfasst das exprimierte Fusionsprotein auf der Oberfläche des Phagenpartikels.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das Phagengenom überdies ein zweites Fusionspolypeptid, wobei das zweite Fusionspolypeptid ein prokaryotisches Sekretionssignal hat und ein an den Aminoterminus des Proteins pIX fusioniertes zweites exogenes Fusionspolypeptid umfasst und das erste exogene Polypeptid im ersten Fusionspolypeptid an den Aminoterminus des Proteins pVII fusioniert wird. In dieser Ausführungsform umfasst das Phagenpartikel überdies das zweite Fusionspolypeptid auf der Phagenpartikeloberfläche und die ersten und zweiten Fusionspolypeptide können miteinander assoziieren, um einen heterodimeren Proteinkomplex zu bilden, wie zum Beispiel ein Immunglobulin-Fv, ein katalytisches Fv, einen Rezeptor, ein Nukleinsäure bindendes Protein oder ein Enzym.
In einer verwandten Ausführungsform beschreibt die Erfindung einen Vektor zum Exprimieren eines Fusionsproteins auf der Oberfläche eines filamentösen Phagen, umfassend eine Kassette zum Exprimieren des Fusionsproteins. Die Kassette enthält stromaufwärts und stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenzen, funktionell verbunden durch eine Sequenz von Nukleotiden, die für die gerichtete Ligierung einer Insert-DNA angepasst worden ist, d. h. einen Polylinker, wobei die stromaufwärts gelegene Sequenz ein prokaryotisches Sekretionssignal kodiert, die stromabwärts gelegene Sequenz ein Protein pVII oder pIX des filamentösen Phagen kodiert. Die translatierbaren DNA-Sequenzen sind funktionell verbunden mit einem Satz von DNA-Expressionssignalen zur Expression der translatierbaren DNA-Sequenzen als Teilstücke des Fusionspolypeptids. Der Vektor umfasst überdies einen Replikationsstartpunkt des filamentösen Phagen. In einer bevorzugten Variation umfasst der Vektor überdies eine zweite Kassette zum Exprimieren eines zweiten Fusionsproteins auf der Oberfläche des filamentösen Phagen, wobei die zweite Kassette die Struktur der ersten Kassette hat, mit der Maßgabe, dass die erste Fusionsprotein-Expressionskassette das Protein pVII kodiert und die zweite Fusionsprotein-Expressionskassette das Protein pIX kodiert. Der Vektor wird wie ein Phagengenom verwendet, um heterodimere Proteinkomplexe auf der Oberfläche des Phagenpartikels zu exprimieren, wobei die beiden exogenen Polypeptide des Heterodimers durch die Fusion an die ersten und zweiten Phagenproteine, pVII bzw. pIX, am Phagenpartikel verankert werden.
In einer anderen Ausführungsform zieht die Erfindung eine Genbank von Phagenpartikeln gemäß der vorliegenden Erfindung, d. h. eine kombinatorische Genbank, in Erwägung, wobei jedes repräsentative Partikel in der Genbank ein anderes Fusionsprotein präsentiert. Wo das Partikel einen heterodimeren Proteinkomplex präsentiert, umfasst die Genbank eine kombinatorische Genbank von Heterodimeren, wie zum Beispiel Antikörper in der Form einer Genbank von Fv-Molekülen. Bevorzugte Genbanken haben eine Vielfältigkeit von mindestens 10⁷ unterschiedlichen Fusionsproteinspezies.
Eine verwandte Ausführungsform beschreibt ein Fusionsprotein, umfassend erste und zweite Polypeptide, wobei das erste Polypeptid ein exogenes Protein und das zweite Polypeptid ein Protein pVII oder pIX des filamentösen Phagen ist, wobei das exogene Protein an den Aminoterminus des Proteins des filamentösen Phagen fusioniert wird.
Die Erfindung zieht überdies noch eine Vielzahl von Verfahren zum Herstellen einer kombinatorischen Phagen-Genbank in Erwägung, einschließlich durch Klonieren von Genrepertoires, die ein exogenes Polypeptid kodieren, in einen Vektor der vorliegenden Erfindung, Modifizieren der Struktur der exogenen Polypeptide in einer Genbank durch Mutagenese, durch zufallsbedingte Kombination von Populationen von Genbanken der ersten und zweiten Fusionsproteine, durch Affinitätsauswahl ("Panning"), um die Vielfältigkeit einer Genbank zu verändern und dergleichen.
Die Gestaltung von Proteinen mit verbesserten oder neuen Funktionen ist ein wichtiges Ziel bei einer Vielzahl medizinischer, gewerblicher, die Umwelt betreffender Anwendungen und Anwendungen in der Grundlagenforschung. Nach der Entwicklung kombinatorischer Antikörpergenbanken ist ein nächster starker Schritt die Evolution in Richtung künstlicher Antikörperkonstrukte sowie anderer Proteinmotive, wobei dimere Spezies natürlich sind oder funktionell sein könnten.
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit diesen Herausforderungen durch Bereitstellen eines Phagen-Präsentationsformats zur Konstruktion kombinatorischer heterodimerer Polypeptidarrays, wobei pVII und pIX zur Präsentation von Fusionsproteinen, die dimere Spezies bilden, benutzt werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass dies eine vollkommen neue Methodik ist, weil man zwei Proteinmotive unabhängig voneinander in enger Nachbarschaft präsentieren kann, um eine Genbank funktioneller Wechselwirkungen zu erzeugen.
Im Umfang und in der Stärke der Technik innewohnend ist die Fähigkeit, eine Vielzahl von Proteinen zu präsentieren, die sich an dimeren Wechselwirkungen beteiligen können. Diese schließen nicht nur Antikörper, sondern auch einige Enzyme, Hormone und Hormonrezeptoren und DNA bindende Proteine ein. Die hier beschriebene Präsentationstechnik kann zur kombinatorischen Veränderung von Antikörper-Gerüstregionen verwendet werden und um die Antikörperstruktur neu zu organisieren und zu verkleinern oder um DNA bindende Proteine, wie zum Beispiel Repressoren, als eine Genbank von Heterodimeren zur Auswahl gegen besondere DNA-Sequenzen von klinischer und therapeutischer Bedeutung zu präsentieren.
Die vorliegende Technik sorgt daher für die Präsentation und Auswahl von mutierten dimeren Proteinen und kombinatorischen Genbanken, wobei die Mitglieder aus heterodimeren Arrays bestehen. Unter Verwendung dieser Technik kann die native Immunglobulinstruktur, in einem hier gezeigten heterodimeren V_H-V_L Fv-Format, auf verschiedene Arten modifiziert und auf Spezifität und Aktivität durchgemustert werden. Zum Beispiel werden durch die kombinatorische Veränderung von Gerüstregionen (FRs) oder durch andere Manipulationen, um die Antikörperstruktur durch Vorgänge, die mit "Neukombinieren des komplementaritätsbestimmenden Bereichs (CDR)" und "Twinibody"-Bildung ausgedrückt werden, neu zu organisieren und zu verkleinern, antikörperähnliche Sekundärstrukturen entstehen, die neue Paratope oder vollkommen andere Strukturelemente enthalten. Um die Genbanken heterodimerer Proteine durchzumustern wird eine Selektion auf Bindung und/oder Katalyse gegen das natürliche Antigen und/oder Substrat sowie einige verwandte Verbindungen umwendet werden.
Außerdem können Sequenz-Randomisierungen, um Genbanken zu bilden, und Protokolle zur Ketten-Neukombination, um Hybridspezies zu bilden, zu Teilsätzen neuer Proteine führen. Die Präsentation und die Modifikation der Arrays von Zink-Finger-Domänen in homodimerer oder heterodimerer Form stellt zum Beispiel Strukturen her, die spezifische DNA-Wechselwirkungen besitzen. Zusätzlich sind vollkommen neue Konstrukte durch die Insertion eines gewünschten kodierenden Fragments in ein vorgeformtes Grundgerüst, wie zum Beispiel eine Antikörperkette, möglich. Mögliche Insertionen schließen eine Enzym-Signatursequenz oder ein Repressor bindendes Protein ein.
Es sollte selbstverständlich sein, dass sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd sind und für die so beanspruchte Erfindung nicht beschränkend sind.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht eine schematische Zeichnung der Konstruktion eines filamentösen Phagen fd mit den 10 Genen, die Proteine kodieren, die mit Namen und Lage im Phagenpartikel angegeben sind.
2A veranschaulicht die Hauptmerkmale des Phagemid-Expressionsvektors pCGMT-1b, die den lacZ Promotor, um die Transkription zu initiieren, die Ribosomenbindungsstellen (RIBS), um die Translation zu initiieren, die Leadersequenzen ompA und pelB für die beiden in dem dicistronischen Vektor kodierten Polypeptide und die relevanten Klonierungsstellen einschließen. Die zwei großen leeren Abschnitte geben die Stuffer-Fragmente an, die vor der Insertion der relevanten zu exprimierenden Polypeptide entfernt werden.
2B veranschaulicht die Hauptmerkmale des in 2A beschriebenen dicistronischen Expressionsvektors pCGMT-1b, nachdem die Konstrukte V_H-G₄S-Gen VII und V_L-G₄S-Gen IX zwischen die Sac I/Xba I- bzw. Nco I/Nhe I-Stellen, wie in den Beispielen beschrieben, eingefügt worden sind.
3 veranschaulicht die Ergebnisse des Phagen-ELISA der verschiedenen Flag- und pVII- oder pIX-Fusionsproteine, wie in den Beispielen beschrieben.
Die 4A und 4B veranschaulichen die Strukturformeln für die in den Beispielen beschriebenen Haptene PCP und GNC.
5 veranschaulicht die Ergebnisse der Antigen(PCP-BSA)-Bindungskapazitäten der verschiedenen Fusionsproteinkonstrukte der V_H und V_L von 2H6 mit pVII und pIX durch Phagen-ELISA, wie in den Beispielen beschrieben.
6 veranschaulicht die Ergebnisse des Phagen-ELISA, der die Anreicherung des Phagen 2H6 Anti-PCP-Fv aus einem Gemisch der Phagen 2H6 und 92H2 demonstriert, wie in den Beispielen beschrieben. Vereinigte Gemische der Phagen wurden nach jeder Panning-Runde eluiert und wurden amplifiziert; danach wurden 10 Milliarden cfu der Phagen in jede Vertiefung von Mikrotiterplatten gegeben, die mit PCP-BSA oder GNC-BSA vorbeschichtet worden waren, und der Phagen-ELISA wurde ausgeführt, um unter Verwendung eines Anti-M13-Antikörpers die Menge an Phagenpartikeln zu ermitteln.
Die 7A und 7B veranschaulichen elektronenmikroskopische Aufnahmen, welche die antigenspezifische Markierung filamentöser Phagen zeigen, die ein 2H6-Fv Heterodimer präsentieren, wie in den Beispielen beschrieben. 7A zeigt einen Phagen, der spezifisch mit 5-nm kolloidalen Goldpartikeln markiert ist, die an das PCP-BSA-Antigen gebunden sind (×105.000). 7B zeigt den Phagen auf demselben Netz wie in 7A, aber mit zwei Goldpartikeln markiert (×105.000).
8 veranschaulicht die Ergebnisse des Phagen-ELISA des Einketten-Fv (scFv)-Konstrukts 21H3 fusioniert an pIX (scFV21H3- pIX) unter Verwendung des PCP-BSA-Antigens, wie in den Beispielen beschrieben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen

Aminosäurerest: Eine Aminosäure, die nach dem chemischen Verdau (der Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptidbindungen gebildet wird. Die hier beschriebenen Aminosäurereste sind vorzugsweise in der "L"-isomeren Form. Reste in der "D"-isomeren Form können jedoch an die Stelle jedes L-Aminosäurerests gesetzt werden, solange die gewünschte funktionelle Eigenschaft durch das Polypeptid beibehalten bleibt. NH₂ bezeichnet die freie, am Aminoterminus eines Polypeptids vorliegende Aminogruppe. COOH bezeichnet die freie, am Carboxyterminus eines Polypeptids vorliegende Carboxygruppe. In Übereinstimmung mit der Standard-Polypeptidnomenklatur (beschrieben in: J. Biol. Chem., 243: 3552–59 (1969) und angenommen als 37 C. F. R. 1,822 (b) (2)), werden die Abkürzungen für Aminosäurereste in der folgenden Zuordnungstabelle gezeigt: ZUORDNUNGSTABELLE
Es sollte angemerkt werden, dass alle hier durch Formeln dargestellten Sequenzen von Aminosäureresten eine links-rechts Orientierung in der herkömmlichen Richtung von Aminoterminus zu Carboxyterminus haben. Zusätzlich wird der Ausdruck "Aminosäurerest" allgemein definiert, um die in der Zuordnungstabelle aufgeführten Aminosäuren und modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren, wie zum Beispiel die in 37 CFR 1,822 (b) (4) aufgeführten, einzuschließen. Außerdem sollte erwähnt werden, dass ein Bindestrich am Anfang oder am Ende einer Sequenz von Aminosäureresten eine Peptidbindung an eine weitere Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten oder eine kovalente Bindung an eine aminoterminale Gruppe, wie zum Beispiel NH₂ oder Acetyl, oder an eine Carboxy-terminale Gruppe, wie zum Beispiel COOH, angibt.
Nukleotid: Eine monomere DNA- oder RNA-Einheit, die aus einer Zuckereinheit (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base besteht. Eine Sequenz von funktionell verbundenen Nukleotiden wird hier üblicherweise als "Basensequenz" oder "Nukleotidsequenz" und deren grammatikalische Äquivalente bezeichnet, und wird hier durch eine Formel dargestellt, deren links-rechts Orientierung die herkömmliche Richtung vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus ist.
Nucleinsäure: Ein Polymer von Nukleotiden, entweder einzel- oder doppelsträngig.
Polynukleotid: Ein Polymer von einzel- oder doppelsträngigen Nukleotiden. Wie hier verwendet, werden "Polynukleotid" und dessen grammatikalische Äquivalente den vollständigen Bereich der Nukleinsäuren einschließen. Ein Polynukleotid wird üblicherweise ein aus einem linearen Strang von zwei und mehr Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden bestehendes Nukleinsäuremolekül bezeichnen. Die exakte Größe wird, wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt, von vielen Faktoren abhängen, was wiederum von den endgültigen Verwendungsbedingungen abhängen wird. Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung schließen Primer, Sonden, RNA/DNA-Abschnitte, Oligonukleotide oder "Oligos" (relativ kurze Polynukleotide), Gene, Vektoren, Plasmide und dergleichen ein.
Gen: Eine Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz eine RNA oder ein Polypeptid kodiert. Bei einem Gen kann es sich entweder um RNA oder DNA handeln. Vektor: Ein rDNA-Molekül, das zur autonomen Replikation in einer Zelle fähig ist und mit dem ein DNA-Abschnitt, z. B. ein Gen oder Polynukleotid, funktionell verbunden werden kann, um so die Replikation des angehefteten Abschnitts zu bewirken. Vektoren, die fähig sind, die Expression von Genen zu steuern, die ein oder mehrere Polypeptide kodieren, werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Besonders wichtige Vektoren ermöglichen das Klonieren von cDNA (komplementärer DNA), die aus mRNAs unter Verwendung von reverser Transkriptase hergestellt wird.
Rezeptor: Ein Rezeptor ist ein Molekül, wie zum Beispiel ein Protein, Glycoprotein und dergleichen, das spezifisch (nichtzufällig) an ein anderes Molekül binden kann.
Antikörper: Der Begriff Antikörper wird hier in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen verwendet, um Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teilstücke von Immungiobulinmolekülen zu bezeichnen, d. h. Moleküle, die eine Antikörperkombinationsstelle oder ein Paratop enthalten. Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und Teilstücke eines Immunglobulinmoleküls, einschließlich jener Teilstücke, die auf dem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab')₂ und Fv bekannt sind.
Antikörperkombinationsstelle: Eine Antikörperkombinationsstelle ist das strukturelle Teilstück eines Antikörpermoleküls, bestehend aus variablen und hypervariablen Regionen einer schweren und leichten Kette, das spezifisch an ein Antigen bindet (mit ihm immunreagiert). Der Begriff immunreagieren in seinen verschiedenen Formen bedeutet das spezifische Binden zwischen einem Molekül, das eine Antigen-Determinante enthält, und einem Molekül, das eine Antikörperkombinationsstelle enthält, wie zum Beispiel einem ganzen Antikörpermolekül oder einem Teilstück davon.
Fusionspolypeptid: Ein Polypeptid, bestehend aus mindestens zwei Polypeptiden und einer verbindenden Sequenz, um die beiden Polypeptide funktionell zu einem durchgehenden Polypeptid zu verbinden. Die beiden in einem Fusionspolypeptid verbundenen Polypeptide sind üblicherweise von zwei unabhängigen Quellen abgeleitet und ein Fusionspolypeptid umfasst deshalb zwei verbundene Polypeptide, die in der Natur normalerweise nicht verbunden vorgefunden werden.
Cistron: Sequenz von Nukleotiden in einem DNA-Molekül, das eine Sequenz von Aminosäureresten kodiert, und das stromaufwärts und stromabwärts gelegene Kontrollelemente der DNA-Expression einschließt.

B. Filamentöser Phage
Die vorliegende Erfindung zieht einen filamentösen Phagen in Erwägung, umfassend eine Proteinmatrix, die ein Genom einkapselt, das ein Fusionsprotein (Protein) kodiert. Das Fusionsprotein umfasst ein Teilstück eines exogenen Polypeptids, das an den Aminoterminus eines Proteins pVII oder pIX des filamentösen Phagen fusioniert ist.
Mit "exogen" ist gemeint, dass das an das Phagenprotein fusionierte Polypeptid in Wildtypvarietäten des filamentösen Phagen normalerweise nicht mit dem Protein pVII oder pIX des Phagen assoziiert ist, sondern dem normalen Phagenprotein eher fremd ist.
Ein typisches exogenes Polypeptid ist jedes Polypeptid von Interesse, einschließlich einer variablen Domäne der schweren Immunglobulinkette (V_H), einer variablen Domäne der leichten Immunglobulinkette (V_L), natürlicher oder synthetischer Polypeptide, eines Einkettenantikörpers (scFv) und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kapselt ein filamentöser Phage ein Genom ein, das ein erstes und zweites Fusionsprotein kodiert, wobei das erste Fusionsprotein ein erstes an pVII fusioniertes exogenes Polypeptid umfasst und das zweite Fusionsprotein ein zweites an pIX fusioniertes exogenes Polypeptid umfasst.
Der filamentöse Phage wird überdies das/die Fusionsproteine) enthalten, die, wie in den Beispielen beschrieben, auf der Oberfläche des Phagenpartikels präsentiert werden. Wo es erste und zweite Fusionsproteine gibt, kann der Phage diese Proteine daher in einer funktionellen Weise präsentieren, so dass die ersten und zweiten exogenen Polypeptide als Heterodimer wechselwirken können, um einen funktionellen Zweiketten-Proteinkomplex auf der Phagenoberfläche zu bilden.
Wo ein exprimiertes heterodimeres Protein die Kapazität hat an Liganden zu binden, wird es hier alternativ dazu als ein Liganden-bindender heterodimerer Rezeptor bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der heterodimere Rezeptor ein Epitopbindender Komplex. Das heißt, ein Komplex aus ersten und zweiten Polypeptiden, der fähig ist, an ein Epitop zu binden. Vorzugsweise sind die ersten und zweiten Polypeptide schwere und leichte Antikörper-Polypeptidketten. Eine bevorzugte Ausführungsform benutzt besonders V_H und V_L, um einen Fv-Komplex zu bilden. Andere heterodimere Proteinkomplexe schließen ein katalytisches Fv, einen Rezeptor, ein Nukleinsäure bindendes Protein und Enzym und dergleichen heterodimere Proteine ein.
Bei einem Fusionsprotein, das auf einem Phagen dieser Erfindung vorliegt, kann die "Fusion" zwischen dem exogenen Polypeptid und dem Protein pVII oder pIX des filamentösen Phagen eine typische Amidbindung umfassen oder kann, wie in den Beispielen beschrieben, ein Linker-Polypeptid (d. h. einen "Linker") umfassen. Aus einer Vielzahl von Linkern, die üblicherweise eine Strecke von etwa 5 bis 50 Aminosäuren lang sind, kann jeder verwendet werden. Besonders bevorzugte Linker stellen dem Fusionsprotein einen hohen Mobilitätsgrad am Linkerort bereit. Ein beispielhafter und bevorzugter Linker hat die Formel -(Gly₄Ser)_n-, wobei n 1–5 ist. Beispielhafte Linker werden in den Beispielen beschrieben.
Ein bevorzugter Phage enthält ein Genom, das den in den Beispielen beschriebenen Vektor pCGMT oder pCGMT-1b umfasst. Ein besonders bevorzugter filamentöser Phage präsentiert ein in den Beispielen beschriebenes Fv.
Da der Rezeptor mit dem Phagen in einer der Oberfläche zugänglichen Weise verbunden wird, kann der Phage vorteilhafterweise als Festphasen-Affinitätssorbens verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Phagen mit einer festen (wasserunlöslichen) Matrix, wie zum Beispiel Agarose, Zellulose, synthetischen Harzen, Polysacchariden und dergleichen, verbunden, vorzugsweise auf entfernbare Weise verbunden. Zum Beispiel können Transformanten, die den Phagen abwerten, unter Bedingungen, die das Abwerfen des Phagen unterstützen, aufgetragen und in einer Säule zurückbehalten und erhalten werden. Dann lässt man eine wässrige Zusammensetzung, die einen Liganden enthält, der an den vom Phagen exprimierten Rezeptor bindet, in einer vorbestimmten Geschwindigkeit und unter Rezeptor bindenden Bedingungen durch die Säule passieren, um einen Festphsaen-Rezeptor-Liganden-Komplex zu bilden. Die Säule wird dann gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen, wobei der an den Festphasen-Phagen gebundene Ligand zurückgelassen wird. Der Ligand kann dann entfernt werden und durch Waschen der Säule mit einem Puffer zurückgewonnen werden, der die Dissoziation des Rezeptor-Liganden-Komplexes fördert.
Alternativ dazu kann ein gereinigter Phage mit einer wässrigen Lösung vermischt werden, die den Liganden enthält, der affinitätsgereinigt werden soll. Das so gebildete Rezeptor/Liganden bindende Reaktionsgemisch wird für einen ausreichenden Zeitraum und unter ausreichenden Bindungsbedingungen gehalten, um einen mit einem Phagen verbundenen Rezeptor-Liganden-Komplex zu bilden. Die an den Phagen gebundenen Liganden (Liganden tragende Phagen) werden dann abgetrennt und aus den nicht gebundenen Materialien zurückgewonnen, wie zum Beispiel durch Zentrifugation, Elektrophorese, Präzipitation und dergleichen.
Ein Phage dieser Erfindung kann markiert werden, wenn er in einem diagnostischen Verfahren dieser Erfindung verwendet wird. Bevorzugte Markierungen schließen in das Phagengenom aufgenommene radioaktiv markierte Nukleinsäuren oder in Proteinkomponenten des Phagenpartikels aufgenommene radioaktiv markierte Aminosäuren ein. Die Herstellung eines markierten Phagen kann routinemäßig durch das Züchten der Phagen, wie hier beschrieben, hergestellt werden, aber einschließlich radioaktiv markierter Nukleotide oder radioaktiv markierter Aminosäuren im Anzuchtmedium zur Aufnahme in die Nukleinsäuren bzw. Polypeptide des Phagen. Beispielhafte Markierungen sind ³H-Thymidin oder ³⁵S-Methionin. Andere Isotopenmarkierungen und andere Nukleotid- oder Aminosäurevorläufer sind für einen Fachmann jederzeit erhältlich. Der markierte Phage enthält vorzugsweise eine ausreichende Markierung, um in einem Ligandenbindungsassay dieser Erfindung nachgewiesen zu werden, d. h. der Phage ist nachweisbar markiert.
Ein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneter filamentöser Phage kann einer von einer Vielzahl von Phagenpartikeln sein, einschließlich sowohl natürlicher Isolate auf dem Fachgebiet bekannter filamentöser Phagen, modifizierter filamentöser Phagen und künstlicher filamentöser Phagen, solange die Grundeigenschaften, die zum Durchführen der vorliegenden Erfindung notwendig sind, bewahrt werden. Diese Eigenschaften umfassen die Kapazität ein Genom einzukapseln, das eine Expressionskassette umfasst, die das Fusionsprotein kodiert, und die Kapazität, zu einem Partikel gebildet zu werden, welches das Protein pVII und pIX in die Oberfläche des Phagenpartikels eingliedert und das exogene Polypeptid präsentiert. Das Gebiet der Forschung und Entwicklung filamentöser Phagen ist umfangreich gewesen und deshalb ist eine große Vielzahl filamentöser Phagenvarianten beschrieben worden, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sein würden, einschließlich "Phagemids", wobei es sich um filamentöse Phagengenome handelt, die angepasst worden sind, um sich zusätzlich dazu, sich wie ein filamentöses Phagengenom zu verhalten, wie Plasmide zu verhalten.
Für beispielhafte Beschreibungen des Gebiets filamentöser Phagenvarianten und Phagengenome, der Struktur von filamentösen Phagenpartikeln, ihrer Hüllproteine und des Partikelassembly siehe die Übersichtsartikel von Smith et al., "Phage Display" in: Chem. Rev., 97: 391–410, 1997; Rached et al., Microbiol. Rev., 50: 401–427 (1986); und Model et al., in: "The Bacteriophages: Vol. 2", R. Calendar, Hrsg. Plenum Publishing Co., S. 375–456 (1988).
Wie auf dem Gebiet angemerkt wird, kann eine Vielzahl genetischer Defizienzen im Genom des filamentösen Wildtypphagen vorliegen und durch die Verwendung von Helferphagen zur Herstellung des gewünschten Phagenpartikels komplementiert werden. Deshalb ist die Erfindung nicht für ein bestimmtes Genom eines Phagen oder Phagemids auszulegen, solange das eingekapselte Genom zu einem Partikel mit einem Oberflächen-exprimierten pVII und/oder pIX gebildet werden kann.
C. DNA-Expressionsvektoren
Ein erfindungsgemäßer Vektor ist ein rekombinantes DNA-Molekül (rDNA), das für das Aufnehmen und Exprimieren translatierbarer DNA-Sequenzen in Form eines Fusionspolypeptids angepasst worden ist, das ein Protein des filamentösen Phagen, das aus der Gruppe bestehend aus Protein pVII und pIX ausgewählt ist, und eine prokaryotische Sekretionssignal-Domäne enthält. Der Vektor umfasst eine Kassette, die stromaufwärts und stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenzen einschließt, die durch eine Sequenz von Nukieotiden, die für eine gerichtete Ligierung an eine Insert-DNA angepasst worden sind, funktionell verbunden sind. Die stromaufwärts gelegene translatierbare Sequenz kodiert, wie hier definiert, das Sekretionssignal. Die stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenz kodiert, wie hier definiert, das Protein pVII oder pIX des filamentösen Phagen. Die Kassette schließt vorzugsweise Kontrollsequenzen der DNA-Expression zum Exprimieren des Fusionspolypeptids ein, das hergestellt wird, wenn eine translatierbare Insert-DNA-Sequenz (Insert-DNA) durch die Sequenz von Nukleotiden, die für eine gerichtete Ligierung angepasst worden sind, gerichtet in die Kassette eingefügt wird.
Ein Expressionsvektor ist dadurch gekennzeichnet, dass er fähig ist, das Produkt eines Strukturgens, wie zum Beispiel ein Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung, in einem kompatiblen Wirt zu exprimieren.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das dazu fähig ist, eine andere Nukleinsäure, mit der es funktionell verbunden worden ist, zwischen unterschiedlichen genetischen Umgebungen zu transportieren. Bevorzugte Vektoren sind jene, die zur autonomen Replikation und Expression von Produkten von Strukturgenen fähig sind, die in den DNA-Abschnitten vorliegen, mit denen sie funktionell verbunden werden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "funktionell verbunden" in Bezug auf DNA-Sequenzen oder -Abschnitte, dass Sequenzen oder Abschnitte kovalent zu einem DNA-Strang, ob in einzel- oder doppelsträngiger Form, verbunden worden sind, vorzugsweise durch herkömmliche Phosphodiesterbindungen.
Die Wahl des Vektors, mit dem eine Kassette dieser Erfindung funktionell verbunden wird, hängt, wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt, direkt von den gewünschten funktionellen Eigenschaften, z. B. Vektorreplikation und Proteinexpression, und der zu transformierenden Wirtszelle ab, wobei diese Beschränkungen dem Fachgebiet des Konstruierens rekombinanter DNA-Moleküle innewohnen.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt der benutzte Vektor ein prokaryotisches Replikon ein, d. h. eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit, autonome Replikation und extrachromosomale Aufrechterhaltung des rekombinanten DNA-Moleküls in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie zum Beispiel in einer damit transformierten bakteriellen Wirtszelle, zu steuern. Derartige Replikons sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zusätzlich schließen jene Ausführungsformen, die ein prokaryotisches Replikon einschließen, auch ein Gen ein, dessen Expression einem damit transformierten bakteriellen Wirt einen selektiven Vorteil verleiht, wie zum Beispiel eine Arzneistoffresistenz. Typische bakterielle Arzneistoffresistenzgene sind jene, die eine Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz verleihen. Vektoren enthalten üblicherweise auch günstige Restriktionsstellen zur Insertion von translatierbaren DNA-Sequenzen. Beispielhafte Vektoren sind die von BioRad Laboratories (Richmond, CA) erhältlichen Plasmide pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329 und die von Pharmacia (Piscataway, NJ) erhältlichen Plasmide pPL und pKK223.
Eine Sequenz von Nukleotiden, die für die gerichtete Ligierung angepasst worden ist, d. h. ein Polylinker, ist eine Region des DNA-Expressionsvektors, die (1) die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenzen für Replikation und Transport funktionell verbindet und (2) eine Stelle oder Mittel für die gerichtete Ligierung einer DNA-Sequenz in den Vektor bereitstellt. Üblicherweise ist ein gerichteter Polylinker eine Sequenz von Nukleotiden, die zwei oder mehr Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen oder Restriktionstellen definiert. Nach der Restriktionsspaltung ergeben die beiden Stellen kohäsive Termini, an die eine translatierbare DNA-Sequenz an den DNA-Expressionsvektor ligiert werden kann. Vorzugsweise stellen die beiden Restriktionsstellen nach Restriktionsspaltung kohäsive Termini bereit, die nicht komplementär sind und dadurch eine gerichtete Insertion einer translatierbaren DNA-Sequenz in die Kassette ermöglichen. In einer Ausführungsform wird ein Mittel zur gerichteten Ligierung durch Nukleotide bereitgestellt, die in der stromaufwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenz, der stromabwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenz oder in beiden vorliegen. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Sequenz von Nukleotiden, die für die gerichtete Ligierung angepasst worden sind, eine Sequenz von Nukleotiden, die mehrere Möglichkeiten zur gerichteten Klonierung definiert. Wo die Sequenz von Nukleotiden, die für die gerichtete Ligierung angepasst worden ist, zahlreiche Restriktionsstellen definiert, wird sie als multiple Klonierungsstelle bezeichnet.
Eine translatierbare DNA-Sequenz ist eine lineare Aufeinanderfolge von Nukleotiden, die eine ununterbrochene Aufeinanderfolge von mindestens 8 Codons bereitstellen, die ein Polypeptid in einem Leserahmen kodieren.
Eine stromaufwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenz kodiert ein prokaryotisches Sekretionssignal. Das Sekretionssignal ist eine Leaderpeptiddomäne eines Proteins, die das Protein gezielt an die periplasmatische Membran von gramnegativen Bakterien setzt.
Ein bevorzugtes Sekretionssignal ist ein pelB oder ompA Sekretionssignal. Andere Sekretionssignal-Polypeptiddomänen von E. coli, die in dieser Erfindung nützlich sind, schließen die im U. S. Patent Nr. 5.658.727 beschriebenen malE, ompF, phoA, Bla und lamB ein.
Eine stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenz kodiert ein filamentöses Protein pVII oder pIX. Bevorzugte Phagenproteine sind von dem filamentösen Phagen M13, f1, fd und dergleichen äquivalenten filamentösen Phagen erhältlich. Eine stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenz kodiert daher eine Aminosäuresequenz, die mit dem Gen VII- oder IX-Hüllpolypeptid des filamentösen Phagen übereinstimmt und vorzugsweise identisch ist.
Die Sequenz der Aminosäurereste eines bevorzugten Proteins pVII wird daher vom Gen VII-Protein des filamentösen Phagen M13 (auch pVII genannt) abgeleitet. Ein bevorzugtes Protein pVII hat eine in SEQ ID NO 21 gezeigte Aminosäuresequenz.
Die Sequenz der Aminosäurereste eines anderen bevorzugten Proteins pIX wird vom Gen IX-Protein des filamentösen Phagen M13 (auch pIX genannt) abgeleitet. Ein bevorzugtes Protein pIX hat eine in SEQ ID NO 23 gezeigte Aminosäuresequenz.
Eine Kassette in einem DNA-Expressionsvektor dieser Erfindung ist die Region des Vektors, die nach der Insertion einer translatierbaren DNA-Sequenz (Insert-DNA) eine Sequenz von Nukleotiden bildet, die in einem geeigneten Wirt zum Exprimieren eines Fusionspolypeptids dieser Erfindung fähig ist. Die expressionskompetente Sequenz von Nukleotiden wird als ein Cistron bezeichnet. Die Kassette umfasst daher Kontrollelemente der DNA-Expression, die mit den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenzen funktionell verbunden sind. Ein Cistron wird gebildet, wenn eine translatierbare DNA-Sequenz zwischen die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sequenzen mittels der Sequenz von Nukleotiden, die für diesen Zweck angepasst worden ist, gerichtet eingefügt (gerichtet ligiert) wird. Die drei so erhal tenen translatierbaren DNA-Sequenzen, nämlich die stromaufwärts gelegenen, die eingefügten und die stromabwärts gelegenen Sequenzen, werden alle im selben Leserahmen funktionell verbunden.
Kontrollsequenzen der DNA-Expression umfassen einen Satz von DNA-Expressionssignalen für das Exprimieren eines Strukturgenprodukts und schließen, wie wohlbekannt ist, sowohl 5'- als auch 3'-Elemente ein, die funktionell mit dem Cistron verbunden sind, so dass das Cistron in der Lage ist, ein Strukturgenprodukt zu exprimieren. Die 5'-Kontrollsequenzen definieren einen Promotor zum Initiieren der Transkription und eine Ribosomenbindungsstelle, die am 5'-Terminus der stromaufwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenz funktionell verbunden ist.
Um hohe Genexpressionswerte in E. coli zu erreichen, ist es nötig, nicht nur starke Promotoren zu verwenden, um große Mengen mRNA zu erzeugen, sondern auch Ribosomenbindungsstellen, um zu gewährleisten, dass die mRNA effizient translatiert wird. Bevorzugte Ribosomenbindungsstellen (RIBS) werden im U. S. Patent 5.658.727 beschrieben und in den Beispielen beschrieben.
Die 3'-Kontrollsequenzen definieren mindestens ein Terminationscodon (Stoppcodon) im gleichen Leserahmen und funktionell verbunden mit der stromabwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenz.
Ein erfindungsgemäßer DNA-Expressionsvektor stellt daher ein System zum Klonieren translatierbarer DNA-Sequenzen in das Kassettenteilstück des Vektors bereit, um ein Cistron herzustellen, das fähig ist, ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid zu exprimieren.
In bevorzugten Ausführungsformen stellt ein DNA-Expressionsvektor ein System für das unabhängige Klonieren (Einfügen) von zwei translatierbaren DNA-Sequenzen in zwei im Vektor vorliegende getrennte Kassetten bereit, um zwei getrennte Cistrons zum Exprimieren der beiden Polypeptide eines heterodimeren Rezeptors oder der Liganden bindenden Teilstücke der Polypeptide, die einen heterodimereren Rezeptor umfassen, zu bilden. Der DNA-Expressionsvektor zum Exprimieren beider Cistrons wird als ein dicistronischer Expressionsvektor bezeichnet.
Ein bevorzugter erfindungsgemäßer DNA-Expressionsvektor umfasst daher zusätzlich zu der vorher im Detail beschriebenen Kassette eine zweite Kassette zum Exprimieren eines zweiten Fusionspolypeptids. Die zweite Kassette schließt, wie in der ersten Kassette, stromaufwärts und stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenzen ein, wobei die Sequenzen durch eine Sequenz von Nukleotiden, die für die gerichtete Ligierung einer Insert-DNA angepasst worden ist, funktionell verbunden werden, mit der Maßgabe, dass das stromaufwärts gelegene prokaryotische Sekretions signal üblicherweise ein anderes ist als das in der ersten Kassette vorliegende Sekretionssignal und die stromabwärts gelegene Sequenz, die ein Protein eines filamentösen Phagen kodiert, eine andere ist als das Phagenprotein in der ersten Kassette. Vorzugsweise kodiert die erste Fusionsprotein-Expressionskassette das Protein pIX und die zweite Fusionsprotein-Expressionskassette kodiert das Protein pVII.
In bevorzugten Ausführungsformen eines dicistronischen Expressionsvektors schließt die erste Expressionskassette das ompA-Sekretionssignal ein und die zweite Expressionskassette schließt das pelB-Sekretionssignal ein.
Die zweite Kassette ist fähig, nach der Insertion einer translatierbaren DNA-Sequenz (Insert-DNA) das zweite Fusionspolypeptid zu exprimieren, das eine Fusion des Sekretionssignals mit einem Polypeptid umfasst, das durch die Insert-DNA kodiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein DNA-Expressionsvektor für die einfache Manipulation in Form eines filamentösen Phagenpartikels gestaltet, der ein Genom gemäß der erfindungsgemäßen Lehren einkapselt. In dieser Ausführungsform enthält ein DNA-Expressionsvektor überdies eine Nukleotidsequenz, die einen Replikationsstartpunkt des filamentösen Phagen definiert, so dass der Vektor bei Präsentation der passenden genetischen Komplementation als filamentöser Phage in einzelsträngiger replikativer Form replizieren kann und in filamentöse Phagenpartikel verpackt werden kann. Dieses Merkmal stellt die Fähigkeit des DNA-Expressionsvektors bereit, in Phagenpartikel verpackt zu werden, zur anschließenden Absonderung des Partikels und des darin enthaltenen Vektors, frei von anderen Partikeln, die eine Population von Phagenpartikeln umfassen.
Ein Replikationsstartpunkt des filamentösen Phagen ist, wie wohlbekannt ist, eine Region des Phagengenoms, die Stellen zur Initiierung der Replikation, Termination der Replikation und Verpackung der durch die Replikation hergestellten replikativen Form definiert. Siehe zum Beispiel Rasched et al., Microbiol. Rev., 50: 401–427 (1986); und Horiuchi, J. Mol. Biol., 188: 215–223 (1986).
Ein bevorzugter Replikationsstartpunkt filamentöser Phagen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ein Replikationsstartpunkt des Phagen M13, f1 oder fd. Bevorzugte erfindungsgemäße DNA-Expressionsvektoren sind der Vektor pCGMT und der dicistronische Expressionsvektor pCGMT-1b, die in Beispiel 1 beschrieben werden.
Ein bevorzugter Vektor kann unter Verwendung einer Vielzahl von Mitteln hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet der rekombinanten DNA wohlbekannt sind und die Erfindung sollte deshalb nicht so beschränkt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen der beispielhaften erfindungsgemäßen Vektoren umfasst das Herstellen über lappender synthetischer Oligonukleotide, die auf der vollständigen Nukleotidsequenz beruhen, und die Ligierung der synthetischen Oligonukleotide, um unter Verwendung wohlbekannter Gestaltungs-, Synthese- und Ligierungsverfahren eine vollständige Sequenz zu bilden.
Insoweit als ein Vektor dieser Erfindung manipuliert werden kann, um eine Insert-DNA zu enthaften, wodurch er die Kapazität hat, ein Fusionspolypeptid zu exprimieren, zieht eine Ausführungsform die vorher beschriebenen Vektoren, die eine Insert-DNA enthalten, in Erwägung. Besonders bevorzugte Vektoren, die Antikörpergene enthalten, werden in den Beispielen beschrieben.
D. Fusionspolypeptide
In einer anderen Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung ein Fusionspolypeptid (Protein) in Erwägung, umfassend erste und zweite funktionell verbundene (fusionierte) Polypeptide. Das erste Polypeptid ist ein exogenes Protein und das zweite Polypeptid ist das Protein pVII oder pIX eines filamentösen Phagen, wodurch das exogene Protein an den Aminoterminus des Proteins des filamentösen Phagen fusioniert wird.
Wo das Fusionsprotein in der unreifen Form ist, d. h. wo die Leadersequenz nicht prozessiert (entfernt) worden ist, kann ein Fusionsprotein auch, wie hier beschrieben, ein aminoterminales prokaryotisches Sekretionssignal enthalten, wie zum Beispiel pelB, ompA und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem exogenen Polypeptid um eine variable Domäne der schweren Immunglobulinkette (V_H), eine variable Domäne der leichten Immunglobulinkette (V_L), natürliche oder synthetische Polypeptide, einen Einkettenantikörper (scFv) und dergleichen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "funktionell verbunden" in Bezug auf Polypeptide, dass Polypeptidfragmente oder von Polypeptiden repräsentierte Proteindomänen zu einem einzigen Polypeptidpolymer kovalent verbunden worden sind, üblicherweise durch herkömmliche Amidbindungen zwischen den benachbarten Aminosäuren, die in dem Polypeptid verbunden werden. Der Begriff impliziert auch eine weiter reichende Verbindung durch ein Linker-Polypeptid, wie hier vorstehend ausführlicher beschrieben wird. Ein bevorzugtes Fusionspolypeptid hat einen Linker gemäß der Formel (Gly₄Ser)_n, wobei n 1 bis 5 ist.
E. Verfahren zum Herstellen einer Genbank
1. Grundprinzip
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein System zum gleichzeitigen Klonieren und Durchmustern von vorgewählten Liganden-Bindungsspezifitäten aus Genrepertoires unter Verwendung eines einzigen Vektorsystems bereit. Dieses System stellt eine Verknüpfung von Klonierungs- und Durchmusterungsmethodiken bereit und hat zwei Anforderungen. Erstens, dass die Expression der Polypeptidketten eines heterodimeren Rezeptors in einem in-vitro-Expressions-Wirt, wie zum Beispiel in E. coli, die Koexpression der beiden Polypeptidketten erfordert, damit sich ein funktioneller heterodimecer Rezeptor auf der Phagenoberfläche zusammensetzen kann, um einen Rezeptor herzustellen, der einen Liganden bindet. Zweitens, dass das Durchmustern von isolierten Mitgliedern der Genbank auf eine vorgewählte Liganden-Bindungskapazität ein Mittel erfordert, um die Bindungskapazität eines exprimierten Rezeptormoleküls mit einem einfachen Mittel, um das Gen, welches das Mitglied kodiert, aus der Genbank zu isolieren, in Beziehung (eine Verknüpfung) zu setzen.
Die Verknüpfung von Expression und Durchmusterung wird durch die Kombination des gezielten Einführens eines Fusionspolypeptids in das Periplasma einer bakteriellen Zelle erreicht, um das Prozessieren und das Assembly eines funktionellen Fusionsproteins zu ermöglichen, und das gezielte Einführen eines Fusionspolypeptids auf die Hülle eines filamentösen Phagenpartikels während des Phagenassembly, um ein einfaches Durchmustern auf das Genbankmitglied von Interesse zu ermöglichen. Ein gezieltes periplasmatisches Einführen wird durch die Anwesenheit einer Sekretionssignaldomäne in einem Fusionspolypeptid dieser Erfindung bereitgestellt. Ein gezieltes Einführen in die Phagenpartikeloberfläche wird durch die Anwesenheit des Proteins pVII oder pIX eines filamentösen Phagen in einem Fusionspolypeptid dieser Erfindung bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Herstellen einer Genbank von DNA-Molekülen, wobei jedes DNA-Molekül ein Cistron zum Exprimieren eines Fusionspolypeptids auf der Oberfläche eines filamentösen Phagenpartikels umfasst. Das Verfahren umfasst die Schritte, (a) ein Ligierungsgemisch zu bilden, indem (I) ein Repertoire von Polypeptid kodierenden Genen und (ii) eine Vielzahl von DNA-Expressionsvektoren in linearer Form, die zur Bildung eines Cistrons angepasst worden sind, das ein Fusionspolypeptid exprimiert, in einem Ligierungspuffer kombiniert werden und (b) das Gemisch Ligierungsbedingungen zu unterwerten, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit das Genrepertoire mit der Vielfalt der Vektoren funktionell verbunden (ligiert) wird, um die Genbank zu bilden.
In dieser Ausführungsform ist das Repertoire von Genen, die Polypeptide kodieren, in der Form doppelsträngiger (ds) DNA und jedes Mitglied des Repertoires hat kohäsive Termini, die für eine gerichtete Ligierung angepasst worden sind. Zusätzlich handelt es sich bei der Vielfalt der DNA-Expressionsvektoren jeweils um lineare DNA-Moleküle mit stromaufwärts und stromabwärts gelegenen kohäsiven Termini, die (a) für die gerichtete Aufnahme der Polypeptidgene in einen gemeinsamen Leserahmen angepasst worden sind und (b) mit den jeweiligen stromaufwärts und stromabwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenzen funktionell verbunden werden. Die stromaufwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenz kodiert ein Sekretionssignal, vorzugsweise ein pelB- oder ompA-Sekretionssignal, und die stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenz kodiert ein Protein pVII oder pIX des filamentösen Phagen, wie es hier für ein erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid beschrieben wird. Die translatierbaren DNA-Sequenzen werden auch mit den jeweiligen stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Kontrollsequenzen der DNA-Expression funktionell verbunden, wie es für einen hier beschriebenen DNA-Expressionsvektor definiert wird.
Die so hergestellte Genbank kann zur Expression und zum Durchmustern der Fusionspolypeptide benutzt werden, die durch die so erhaltene Genbank von Cistrons kodiert werden, die in der Genbank durch die hier beschriebenen Expressions- und Durchmusterungsverfahren repräsentiert sind.
2. Herstellung von Genrepertoires
Ein Genrepertoire ist eine Kollektion von verschiedenen Genen, vorzugsweise von Genen, die Polypeptide kodieren (Polypeptidgene), und kann aus natürlichen Quellen isoliert werden oder kann künstlich erzeugt werden. Bevorzugte Genrepertoires bestehen aus konservierten Genen. Besonders bevorzugte Genrepertoires umfassen entweder eins der Gene, die die Mitglieder eines dimeren Rezeptormoleküls kodieren, oder beide.
Ein Genrepertoire, das bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich ist, enthält mindestens 10³, vorzugsweise mindestens 10⁴, stärker bevorzugt mindestens 10⁵ und am meisten bevorzugt mindestens 10⁷ verschiedene Gene, obwohl wegen der der Genbank beim Vermehren filamentöser Phagen innewohnenden Eigenschaften höhere Vielfältigkeitsgrade von 10⁹ und sogar 10¹¹ möglich sind. Verfahren zum Auswerten der Vielfältigkeit eines Genrepertoires sind einem Fachmann wohlbekannt.
Die vorliegende Erfindung zieht daher in einer Ausführungsform ein Isolierungsverfahren für ein Genpaar aus einem Repertoire konservierter Gene in Erwägung, das einen dimeren Proteinkomplex mit einer vorgewählten Aktivität kodiert. Zusätzlich wird auch das Exprimieren des klonierten Genpaars und das Isolieren des so erhaltenen exprimierten dimeren Proteinkomplexes beschrieben. Der Proteinkomplex wird vorzugsweise ein heterodimeres Polypeptid sein, das zum Binden eines Liganden fähig ist, wie zum Beispiel ein Antikörpermolekül oder ein immunologisch aktives Teilstück davon, ein zellulärer Rezeptor oder ein zelluläres Adhäsionsprotein, das durch ein Mitglied einer Familie konservierter Gene kodiert wird, d. h. Gene, die eine konservierte Nukleotidsequenz von mindestens etwa 10 Nukleotiden Länge enthalten. Wie hier gezeigt wird, kann der Proteinkomplex auch ein katalytischer Antikörper sein.
Beispielhafte konservierte Genfamilien, die verschiedene Polypeptidketten eines dimeren Rezeptors kodieren, sind jene, die Immunglobuline, Klasse I oder II Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes, Lymphozytenrezeptoren, Integrine und dergleichen kodieren.
Dass ein Gen zu einem Repertoire von konservierten Genen gehört, kann unter Verwendung von mehreren Verfahren identifiziert werden. Zum Beispiel kann ein isoliertes Gen als Hybridisierungssonde unter geringen Stringenzbedingungen verwendet werden, um andere in der genomischen DNA vorliegende Mitglieder des Repertoires konservierter Gene nachzuweisen, unter Verwendung der Verfahren, die von Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975) beschrieben wordensind. Falls das als Hybridisierungssonde verwendete Gen mit mehreren Restriktionsendonukleasefragmenten des Genoms hybridisiert, ist das Gen ein Mitglied eines Repertoires konservierter Gene.
Die Immunglobuline oder Antikörpermoleküle sind eine grolle Molekülfamilie, die mehrere Molekültypen einschließen, wie zum Beispiel IgD, IgG, IgA, IgM und IgE. Das Antikörpermolekül besteht üblicherweise aus zwei schweren (H) und leichten (L) Ketten mit sowohl einer auf jeder Kette vorliegenden variablen (V) als auch einer konstanten Region (C). Mehrere verschiedene Regionen eines Immunglobulins enthalten konservierte Sequenzen, die zum Isolieren eines Immunglobulinrepertoires nützlich sind. Umfangreiche Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzdaten, die beispielhaft konservierte Sequenzen präsentieren, werden für Immunglobulinmoleküle von Kabat et al., in: Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987, zusammengestellt.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ist ein großer genetischer Locus, der eine umfangreiche Proteinfamilie kodiert, die mehrere Klassen von Molekülen einschließt, die als Klasse I, Klasse II und Klasse III MHC-Moleküle bezeichnet werden. Paul et al., in: Fundamental Immunology, Raven Press, NY, S. 303–378 (1984).
Lymphozyten enthalten mehrere Proteinfamilien auf ihren Zelloberflächen, einschließlich des T-Zell-Rezeptors, Thy-1-Antigens und zahlreicher T-Zell-Oberflächen antigene, einschließlich der durch die monoklonalen Antikörper OKT4 (leu3), OKT5/8 (leu2), OKT3, OKT1 (leu1), OKT 11 (leu5), OKT6 und OKT9 definierten Antigene. Paul, vorstehend auf S. 458–479.
Adhäsionsproteine, die an der Zellanheftung beteiligt sind, sind Mitglieder einer großen Familie verwandter Proteine, die Integrine genannt werden. Integrine sind Heterodimere, die aus einer Beta- und einer Alpha-Untereinheit bestehen. Mitglieder der Integrinfamilie schließen die Zelloberflächenglykoproteine Blutplättchen-Rezeptor GpIIb-IIIa, Vitronektin-Rezeptor (VnR), Fibronektin-Rezeptor (FnR) und die Leukozytenadhäsions-Rezeptoren LFA-1, Mac-1, Mo-1 und 60.3 ein. Rouslahti et al., Science, 238: 491–497 (1987). Nukleinsäure- und Proteinsequenzdaten demonstrieren, dass es Regionen konservierter Sequenzen bei den Mitgliedern dieser Familien gibt, besonders zwischen der Beta-Kette von GpIIb-IIIa, VnR und FnR und zwischen der Alpha-Untereinheit von VnR, Mac-1, LFA-1, FnR und GpIIb-IIIa, Suzuki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8614–8618, 1986; Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 262: 5437–5440, 1987.
Verschiedene wohlbekannte Verfahren können eingesetzt werden, um ein nützliches Genrepertoire herzustellen. Zum Beispiel können V_H- und V_L-Genrepertoires durch Isolieren von V_H- und V_L-kodierender mRNA aus einer heterogenen Population von Antikörper produzierenden Zellen hergestellt werden, d. h. B-Lymphozyten (B-Zellen), vorzugsweise umgelagerte B-Zellen, wie zum Beispiel jene, die im Blutkreislauf oder in der Milz eines Vertebraten gefunden werden. Umgelagerte B-Zellen sind jene, in denen eine Translokation, d. h. Umlagerung des Immunglobulingens stattgefunden hat, wie durch die Anwesenheit von mRNA, bei der die Transkripte der V-, D- und J-Regionen der Immunglobulingene benachbart liegen, in der Zelle nachgewiesen wird. Üblicherweise werden die B-Zellen in einer 1–100 ml großen Blutprobe gesammelt, die normalerweise 10⁶ B-Zellen/ml enthält.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, ein Repertoire für eine vorgewählte Aktivität zu beeinflussen, wie zum Beispiel durch das Verwenden von Zellen (Quell-Zellen) von Vertebraten in verschiedenen Zuständen des Alters, der Gesundheit und der Immunreaktion als Nukleinsäurequelle. Zum Beispiel führt die wiederholte Immunisierung eines gesunden Tieres vor dem Sammeln umgelagerter B-Zellen zum Erhalten eines Repertoires, das für genetisches Material angereichert ist, das einen Rezeptor hoher Affinität herstellt. Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8095–8099 (1990). Umgekehrt führt das Sammeln umgelagerter B-Zellen aus einem gesunden Tier, dessen Immunsystem nicht kürzlich herausgefordert worden ist (d. h. ein unerfahrenes Immunsystem), zum Herstellen eines Repertoires, das nicht in Richtung auf die Herstellung hochaffiner V_H- und/oder V_L-Polypeptide beeinflusst wird.
Verfahren zum Herstellen von Fragmenten genomischer DNA, aus denen die Gene der variablen Region von Immunglobulinen als eine vielfältige Population kloniert werden können, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Siehe zum Beispiel U. S. Patent Nr. 5.658.727, Herrmann et al., Methods In Enzymol., 152: 180–183, (1987); Frischauf, Methods In Enzymol., 152: 183–190 (1987); Frischauf, Methods In Enzymol., 152: 190–199 (1987); und DiLella et al., Methods In Enzymol., 152: 199–212 (1987).
Das gewünschte Genrepertoire kann entweder aus genomischem Material, das das Gen enthält, das die variable Region exprimiert, oder aus der Boten-RNA (mRNA), die ein Transkript der variablen Region repräsentiert, isoliert werden
3. Herstellung von Polynukleotidprimern
Wie hier verwendet, wird mit Bezugnahme auf durch Primer-Extension zu synthetisierende Primer, Sonden und Nukleinsäurefragmente oder -segmente der Begriff "Polynukleotid" als ein Molekül definiert, das aus zwei oder mehr Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, vorzugsweise mehr als 3, besteht. Seine exakte Größe wird von vielen Faktoren abhängen, die wiederum von den endgültigen Verwendungsbedingungen abhängen.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Primer" ein Polynukleotid, ob aus einem Nukleinsäure-Restriktionsverdau gereinigt oder synthetisch hergestellt, das, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, bei denen die Synthese eines Primer-Extensionsprodukts induziert wird, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, fähig ist, als ein Initiierungspunkt der Nukleinsäuresynthese zu wirken, d. h. in Anwesenheit von Nukleotiden und einem Mittel zur Polymerisation, wie zum Beispiel DNA-Polymerase, reverser Transkriptase und dergleichen, und bei geeigneter Temperatur und pH. Für höchste Wirksamkeit ist der Primer vorzugsweise einzelsträngig, kann aber alternativ dazu in doppelsträngiger Form vorliegen. Falls doppelsträngig, wird der Primer erst behandelt, um ihn von seinem komplementären Strang abzutrennen, bevor er zur Herstellung von Verlängerungsprodukten verwendet wird. Der Primer ist vorzugsweise ein Polydesoxyribonukleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Anwesenheit der Mittel zur Polymerisation zu starten. Die exakte Länge der Primer wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich Temperatur und der Primerquelle. In Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz enthält ein Polynukleotidprimer zum Beispiel üblicherweise 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide enthalten kann. Kurze Primermoleküle erfordern im Allgemeinen kühlere Temperaturen, um ausreichend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize zu bilden.
Die hier verwendeten Primer werden ausgewählt, um zu den verschiedenen Strängen jeder zu synthetisierenden oder zu amplifizierenden spezifischen Sequenz "im Wesentlichen" komplementär zu sein. Dies bedeutet, dass der Primer ausreichend komplementär sein muss, um mit seinem jeweiligen Matrizenstrang nichtzufällig zu hybridisieren. Die Primersequenz kann deshalb die exakte Sequenz der Matrize widergeben oder auch nicht. Zum Beispiel kann ein nicht komplementäres Nukleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angeheftet werden, wobei der Rest der Primersequenz im Wesentlichen komplementär zum Strang ist. Üblicherweise kodieren derartige nicht komplementäre Fragmente eine Endonuklease-Restriktionsstelle. Alternativ dazu können nicht komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer hier und da eingefügt werden, vorausgesetzt, dass die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz des zu synthetisierenden oder zu amplifizierenden Strangs hat, um nichtzufällig damit zu hybridisieren und dadurch unter Bedingungen des Synthetisierens von Polynukleotid ein Verlängerungsprodukt zu bilden.
Die Polynukleotidprimer können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie zum Beispiel der Phosphotriester- oder Phosphodiesterverfahren, siehe Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90, (1979); U. S. Patent Nr. 4.356.270; und Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109, (1979).
Die Wahl der Nukleotidsequenz eines Primers hängt von Faktoren, wie zum Beispiel dem Abstand auf der Nukleinsäure von der Region, die den gewünschten Rezeptor kodiert, seiner Hybridisierungsstelle auf der Nukleinsäure relativ zu einem zweiten zu verwendenden Primer, der Anzahl der Gene im Repertoire, an die er hybridisieren soll, und dergleichen ab.
a. Primer zum Herstellen von Immunglobulin-Genrepertoires
V_H- und V_L-Genrepertoires können vor ihrer Anwendung in der vorliegenden Erfindung getrennt hergestellt werden. Die Herstellung eines Repertoires wird üblicherweise durch Primer-Extension erreicht, vorzugsweise durch Primer-Extension in einem Polymerasekettenreaktionsformat (PCR).
Falls die Repertoires der V_H-kodierenden und V_L-kodierenden DNA-Homologe durch (PCR-) Amplifikation hergestellt werden sollen, müssen für jeden zu amplifizierenden kodierenden Nukleinsäurestrang zwei Primer verwendet werden, d. h. ein PCR-Primerpaar. Der erste Primer wird Teil des nichtkodierenden (Minus- oder Komplementär-) Strangs und hybridisiert an eine Nukleotidsequenz, die zwischen V_H- (Plus- oder kodierenden) Strängen innerhalb des Repertoires konserviert ist. Um V_H-kodierende DNA-Homologe herzustellen, werden deshalb erste Primer gewählt, um an konservierte Regionen in der J-Region, CH1-Region, Hinge-Region, CH2-Region oder CH3-Region von Immunglobulingenen und dergleichen zu hybridisieren (d. h. dazu kamplementär zu sein). Um ein V_L-kodierendes DNA-Hamalog herzustellen, werden erste Primer gewählt, um an eine konservierte Region in der J-Region oder konstanten Region der leichten Kette der Immunglobulingene und dergleichen zu hybridisieren (d. h. dazu komplementär zu sein). Zweite Primer werden Teil des kodierenden (Plus-) Strangs und hybridisieren an eine zwischen Minus-Strängen konservierte Nukleotidsequenz. Um die V_H-kodierenden DNA-Homologe herzustellen werden deshalb zweite Primer gewählt, um mit einer konservierten Nukleotidsequenz am 5'-Ende des V_H-kodierenden Immunglobulingens zu hybridisieren, wie zum Beispiel in dem Bereich, der den Leader oder die erste Gerüstregion kodiert. Es sollte beachtet werden, dass bei der Amplifikation von sowohl V_H- als auch V_L-kodierenden DNA-Homologen die konservierte 5'-Nukleotidsequenz des zweiten Primers zu einer exogen zugegebenen Sequenz komplementär sein kann, wobei terminale Desoxynukleotidyltransferase verwendet wird, wie von Loh et al., Science, 243: 217–220 (1989) beschrieben. Einer der ersten und zweiten Primer oder beide können eine Nukleotidsequenz enthalten, die eine Endonukleaseerkennungsstelle definiert. Die Stelle kann zu dem Immunglobulingen, das amplifiziert wird, heterolog sein und erscheint üblicherweise am 5'-Ende des Primers oder nahe daran.
Wenn vorhanden, wird das Teilstück, das die Restriktionsstelle definiert, üblicherweise in einem nicht startenden 5'-terminalen Teilstück des Primers lokalisiert. Die durch den ersten Primer definierte Restriktionsstelle wird üblicherweise so gewählt, dass sie eine ist, die durch ein Restriktionsenzym erkannt wird, das die Restriktionsstelle, die durch den zweiten Primer definiert wird, nicht erkennt, wobei das Ziel ist, in der Lage zu sein, ein DNA-Molekül mit kohäsiven Enden herzustellen, die nicht komplementär zueinander sind und daher eine gerichtete Insertion in einen Vektor ermöglichen.
4. Polymerasekettenreaktion zum Herstellen von Genrepertoires
Die zum Klonieren der in einem Repertoire enthaltenen V_H- und V_L-Gene verwendete Strategie wird, wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist, von Typ, Komplexität und Reinheit der Nukleinsäuren, die das Repertoire bilden, abhängen. Andere Faktoren schließen ein, ob die Gene in einem oder einer Vielfalt von Repertoires enthalten sind oder nicht und ob sie amplifiziert und/oder mutagenisiert werden sollen oder nicht.
Nach dem Herstellen von V_H- und V_L-kodierenden DNA-Homologen für eine Vielfalt verschiedener V_H- und V_L-kodierender Gene in den Repertoires werden die DNA-Moleküle üblicherweise weiter amplifiziert. Während die DNA-Moleküle durch klassische Techniken amplifiziert werden können, wie zum Beispiel Eingliederung in einen autonom replizierenden Vektor, wird es bevorzugt, die Moleküle vor ihrem Einfügen in einen Vektor erst zu amplifizieren, indem sie einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unterzogen werden.
PCR-Amplifikationsverfahren werden in den U. S. Patenten Nr. 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159 und 4.965.188 und mindestens in mehreren Texten einschließlich "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification" , Hrsg. H. Erlich, Stockton Press, New York (1989); und "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Hrsg. Innis et al., Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) im Detail beschrieben.
5. Lineare DNA-Expressionsvektoren
Ein DNA-Expressionsvektor für die Verwendung in einem Verfahren der Erfindung zum Herstellen einer Genbank von DNA-Molekülen ist ein linearisiertes DNA-Molekül, wie vorstehend beschrieben, mit zwei (stromaufwärts und stromabwärts gelegenen) kohäsiven Termini, die für eine gerichtete Ligierung an ein Polypeptidgen angepasst worden sind.
Ein linearer DNA-Expressionsvektor wird üblicherweise durch einen Restriktionsendonukleaseverdau eines zirkulären DNA-Expressionsvektors dieser Erfindung hergestellt, um an zwei vorgewählten Restriktionsstellen in der für die gerichtete Ligierung angepassten Nukleotidsequenz des Vektors zu schneiden, um ein lineares DNA-Molekül mit den erforderlichen kohäsiven Termini herzustellen, die für die gerichtete Ligierung angepasst worden sind. Eine gerichtete Ligierung bezieht sich auf die Anwesenheit von zwei (einem ersten und zweiten) kohäsiven Termini auf einem Vektor oder auf dem in den ausgewählten Vektor zu ligierenden Insert DNA-Molekül, so dass die Termini auf einem einzelnen Molekül nicht komplementär sind. Ein erster Terminus des Vektors ist zu einem ersten Terminus des Inserts komplementär und der zweite Terminus des Vektors ist zu einem zweiten Terminus des Inserts komplementär.
Beim Herstellen einer Genbank von DNA-Molekülen dieser Erfindung wird, wie vorstehend beschrieben, ein Ligierungsgemisch hergestellt und das Gemisch wird für einen ausreichend langen Zeitraum Ligierungsbedingungen unterzogen, damit das vermischte Repertoire von Polypeptidgenen mit der Vielfalt der DNA-Expressionsvektoren ligieren (funktionell verbunden werden) kann, um die Genbank zu bilden.
Ligierungsbedingungen sind Bedingungen, die ausgewählt sind, um eine Ligierungsreaktion zu begünstigen, bei der eine Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten 3'-Hydroxyl- und 5'-Phosphoryltermini der DNA gebildet wird. Die Ligierungsreaktion wird vorzugsweise durch das Enzym T4 DNA-Ligase katalysiert. Wie wohlbekannt ist, können Ligierungsbedingungen in der Zeit, Temperatur, Pufferkonzentration, den Mengen von zu ligierenden DNA-Molekülen und Ligasemengen variieren.
6. Herstellung dicistronischer Genbanken
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer Genbank von dicistronischen DNA-Molekülen in Erwägung. Ein dicistronisches DNA-Molekül ist ein einzelnes DNA-Molekül mit der Kapazität, zwei getrennte Polypeptide von zwei getrennten Cistrons zu exprimieren. In bevorzugten Ausführungsformen werden die zwei Cistrons an jeweiligen Orten auf dem DNA-Molekül funktionell verbunden, so dass beide Cistrons unter der transkriptionellen Kontrolle eines einzelnen Promotors sind. Jedes dicistronische Molekül ist fähig, erste und zweite Polypeptide von ersten bzw. zweiten Cistrons zu exprimieren, die in einem geeigneten Wirt einen heterodimeren Rezeptor auf der Oberfläche eines filamentösen Phagenpartikels bilden können.
Bevorzugte Verfahren zum Herstellen einer Genbank von dicistronischen DNA-Molekülen werden in den Beispielen ausführlicher beschrieben.
DNA-Expressionsvektoren, die zum Ausführen des vorstehenden Verfahrens nützlich sind, sind die hier sehr ausführlich beschriebenen dicistronischen DNA-Expressionsvektoren.
Bei der Ausführung des Verfahrens zum Herstellen einer Genbank von dicistronischen DNA-Molekülen enthalten die dicistronischen Vektoren verschiedene Sätze kohäsiver Termini zum Klonieren (Einfügen) der ersten und zweiten Insert DNA-Moleküle, die als stromaufwärts und stromabwärts gelegene erste kohäsive Termini bzw. stromaufwärts und stromabwärts gelegene zweite kohäsive Termini bezeichnet werden. In dieser Ausführungsform bezieht der Behandlungsschritt des Linearisierens der zirkulären DNA-Moleküle üblicherweise die Verwendung von Restriktionsendonukleasen ein, die für das Herstellen der zweiten Termini spezifisch sind, aber das zirkuläre DNA-Molekül an den Stellen, die die ersten Termini bilden, nicht spalten. Beispielhafte und bevorzugte erste und zweite Termini sind die durch Spaltung von pCGMT-1b mit Sac I und Xba I definierten Termini, um stromaufwärts und stromabwärts gelegene erste Termini zu bilden, und die durch Spaltung von pCGMT-1b mit Nco I und Nhe I definierten zweiten Termini, um die stromaufwärts und stromabwärs gelegenen zweiten Termini zu bilden. In dieser Ausführungsform können andere Paare kohäsiver Termini bei den entsprechenden Paaren der ersten und zweiten Termini benutzt werden, solange alle vier Termini verschiedene, nicht komplementäre Termini sind.
Im Allgemeinen sind Verfahren zum Behandeln der Vielfalt zirkulärer DNA-Moleküle unter DNA-Spaltungsbedingungen, um lineare DNA-Moleküle zu bilden, wohlbekannt und hängen von der zu spaltenden Nukleotidsequenz und dem Spaltungsmechanismus ab. Bevorzugte Behandlungen beziehen das Vermischen der DNA-Moleküle mit einer für eine Endonukleaseerkennungsstelle am gewünschten Spaltungsort spezifischen Restriktionsendonuklease in einer genügenden Menge, damit die Restriktionsendonuklease das DNA-Molekül spalten kann, ein. Puffer, Spaltungsbedingungen und Substratkonzentrationen für eine Restriktionsendonukleasespaltung sind wohlbekannt und hängen von dem bestimmten Enzym ab, das benutzt wird.
7. Verfahren zum Verändern der Vielfältigkeit einer Genbank
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Veränderung der Vielfältigkeit einer Genbank filamentöser Phagen der vorliegenden Erfindung bereit. Diese Verfahren erhöhen im Allgemeinen die Vielfältigkeit der Genbank, wodurch der Pool möglicher Epitop-bindender Komplexe erhöht wird, die auf die gewünschte Bindungsaktivität hin durchgemustert werden. Alternativ dazu können die Verfahren darauf gerichtet werden, eine Klasse Epitop-bindender Komplexe anzureichern. Die Klasse wird üblicherweise durch die Fähigkeit definiert, ein bestimmtes Epitop oder eine Familie von Epitopen zu binden, die auf einem vorgewählten Antigen oder einer Gruppe von Antigenen vorliegen. Alternativ dazu kann dort, wo Katalyse die gewünschte Aktivität ist, die Klasse eine katalytische Aktivität sein.
a. Erhöhen der Vielfältigkeit einer Genbank durch Mutation
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Erhöhen der Vielfältigkeit ist es, die Aminosäuresequenz eines oder mehrerer Polypeptide des Epitop-bindenden Komplexes, der vom Genom eines Phagen dieser Erfindung kodiert wird, zu verändern. Veränderungen können einfach auf der Nukleinsäureebene durch Mutation der Nukleinsäure eingeführt werden. Das Verfahren kann mit einer einzelnen Nukleinsäurespezies, die ein Polypeptid dieser Erfindung kodiert, ausgeführt werden, oder kann mit einer Genbank von Nukleinsäuren ausgeführt werden, die in einer Phagen-Genbank dieser Erfindung vorliegen.
Die Mutation einer Nukleinsäure kann durch eine Vielzahl von im Fachgebiet wohlbekannten Mitteln durchgeführt werden und insbesondere so, wie im U. S. Patent Nr. 5,658,727 beschrieben.
Daher zieht diese Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Vielfältigkeit einer Genbank filamentöser Phagen in Erwägung, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Genbank filamentöser Phagenpartikel gemäß der vorliegenden Erfindung und b) Mutieren der Nukleotidsequenz, die das exogene Polypeptid kodiert, an seiner funktionellen Stelle, wie zum Beispiel der die variable Immunglobulindomäne kodierenden Sequenz, die in jedem DNA-Expressionsvektor der Genbank vorliegt, um eine Genbank von Phagenpartikeln zu bilden, in der beispielsweise jedes eine mutierte Nukleinsäuresequenz für die variable Immunglobulindomäne enthält.
Das Bereitstellen kann das Manipulieren der Genome der Phagenpartikel in der Genbank einschließen, um die Nukleinsäuren in Vorbereitung auf eine mutagenisierende PCR-Reaktion zu isolieren. Die Manipulationen einer Phagen-Genbank, um das Phagengenom für die Verwendung in einer PCR-Reaktion zu isolieren, werden hier an anderer Stelle beschrieben.
In einer Ausführungsform umfasst das Mutieren, dass die Nukleotidsequenz, welche die variable Immunglobulindomäne kodiert, einer fehleranfälligen Polymeraseketten-Reaktion unterzogen wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Mutieren, dass die Nukleinsäuresequenz, welche die variable Immunglobulindomäne kodiert, einem Verfahren zur Mutation einer CDR der Nukleinsäuresequenz, welche die variable Immunglobulindomäne kodiert, unterzogen wird, unter Verwendung eines auf die CDR gerichteten Oligonukleotids, wie im U. S. Patent Nr. 5,658, 727 beschrieben.
b. Anreicherung einer Genbank
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren, um die Vielfältigkeit der Genbank durch das Anreichern der Genbank für eine vorgewählte Klasse Epitop-bindender Komplexe zu verändern. Der Vorgang bezieht im Allgemeinen die Affinitätsauswahl jener Phagenpartikel in einer Genbank ein, die fähig sind, ein vorgewähltes Antigen zu binden. Der Vorgang der Affiniätsauswahl oder des "Panning" wird ausführlich in den Beispielen beschrieben.
Daher zieht diese Erfindung ein Verfahren zum Verändern der Vielfältigkeit einer Genbank filamentöser Phagenpartikel in Erwägung, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Genbank filamentöser Phagenpartikel gemäß der vorliegenden Erfindung, b) In Kontakt Bringen der bereitgestellten Genbank mit einem vorgewählten Liganden unter Bedingungen, die den Mitgliedern der Genbank genügen, um an den Liganden zu binden und einen Liganden-Phagenpartikel Komplex zu bilden und c) Isolieren von Phagenpartikeln in dem Komplex, frei von nicht gebundenen Mitgliedern der Genbank, um eine Liganden-angereicherte Genbank zu bilden, umfassend Phagenpartikel mit Bindungsspezifität für den vorgewählten Liganden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird der vorgewählte Ligand auf einer festen Unterlage befestigt und der Liganden-Phagenpartikel Komplex wird in der festen Phase gebildet. Diese Ausführungsform umfasst überdies die Schritte i) Waschen der festen Untertage nach dem Schritt des In Kontakt Bringens, um nicht gebundene Mitglieder der Genbank von der festen Unterlage zu spülen; und ii) Eluieren aller an die Festphase gebundener Phagenpartikel weg von der festen Unterlage. Die eluierten Phagenpartikel werden gesammelt, wodurch isolierte Phagenpartikel gebildet werden, die eine angereicherte Genbank umfassen.
Die Elution kann unter einer Vielzahl von Bedingungen durchgeführt werden, die die Wechselwirkungen des Liganden-Epitop-Bindungskomplexes unterbrechen. Typische Bedingungen schließen Hochsalz oder Puffer mit niedrigem pH-Wert ein. Besonders bevorzugt werden Puffer von etwa pH 1 bis 5, vorzugsweise etwa pH 2 bis 3. Alternativ dazu kann die Wechselwirkung durch Kompetition mit einer überschüssigen Menge des vorgewählten Liganden im Elutionspuffer unterbrochen werden. Beide Elutionsverfahren werden in den Beispielen beschrieben.
Eine verwandte Ausführungsform kombiniert die Merkmale sowohl des Erhöhens der Vielfältigkeit einer Genbank durch Mutation und des Anreicherns der Genbank durch Panning zu "reifen" Epitop-Bindungskomplex-Affinitäten für einen vorgewählten Liganden. Daher ist es möglich, dass sich neue Bindungsspezifitäten und potentere Bindungsspezifitäten unter Verwendung der vorliegenden Verfahren zur Veränderung der Genbankvielfältigkeit entwickeln.
Die Kombination dieser Verfahren kann, wie für einen qualifizierten Praktiker offensichtlich sein wird, auf verschiedene Weise gestaltet werden. Zum Beispiel kann man eine Genbank isolieren, mutagenisieren (diversifizieren) und dann auf eine bestimmte Bindungsaktivität hin durchmustern (anreichern). Alternativ dazu kann man eine bestimmte Aktivität aus einer Genbank anreichern, den spezifischen Epitop-Bindungskomplex mutagenisieren und die durch die Mutagenese hergestellte Genbank weiter anreichern.
F. Phagen-Genbanken
Die vorliegende Erfindung zieht eine Genbank von DNA-Molekülen in Erwägung, die jedes ein Fusionspolypeptid dieser Erfindung kodieren, wobei die Genbank in der Form einer Population verschiedener filamentöser Phagenpartikel vorliegt, von denen jedes ein unterschiedliches rDNA-Molekül dieser Erfindung enthält. Mit unterschiedlichem rDNA-Molekül ist ein rDNA-Molekül gemeint, das sich in der Nukleotidbasen sequenz, die ein Polypeptid dieser Erfindung kodiert, im Vergleich zur Nukleotidsequenz eines anderen rDNA-Moleküls in der Genbank unterscheidet.
Eine Phagen-Genbank ist daher eine Population filamentöser Phagen, vorzugsweise der flamentösen Phagen f1, fd oder M13, wobei jeder Phage einen erfindungsgemäßen rDNA-Expressionsvektor dieser Erfindung in das Partikel verpackt hat, die rDNA ist im Phagenpartikel durch die Matrixproteine des Phagen eingekapselt. Anders ausgedrückt enthält eine Phagen-Genbank eine Vielfalt filamentöser Phagenpartikel, wobei, wie hier beschrieben, jedes unterschiedliche Phagenpartikel mindestens einen Fusionsproteinkomplex auf seiner Oberfläche enthält. Eine bevorzugte Genbank besteht aus Phagenpartikeln, die DNA-Moleküle enthalten, die mindestens 10⁶, vorzugsweise 10⁷ und stärker bevorzugt 10^8–9 unterschiedliche erfindungsgemäße Fusionspolypeptide kodieren. Mit unterschiedlichen Fusionspolypeptiden sind Fusionspolypeptide gemeint, die sich in der Aminosäuresequenz unterscheiden. Noch größere Genbankvielfältigkeiten sind erhältlich, wenn die Verfahren der zufälligen Kombination oder Mutagenese, wie hier beschrieben, benutzt werden, um die Genbankvielfältigkeit zu erhöhen.
Wo die verpackten Expressionsvektoren erste und zweite Polypeptide eines sich autogen zusammensetzenden Rezeptors kodieren, z. B. V_H- und V_L-Polypeptide, die ein Fab bilden, kann die Genbank auch dadurch charakterisiert werden, eine Vielzahl von Rezeptorspezifitäten zu enthalten oder zu exprimieren. Daher exprimieren Genbanken mindestens 10⁵, vorzugsweise mindestens 10⁶ und stärker bevorzugt mindestens 10⁷ unterschiedliche Rezeptoren, wie zum Beispiel unterschiedliche Antikörper, T-Zell-Rezeptoren, Integrine und dergleichen.
Die Größe der Genbank kann in Abhängigkeit von einer Anzahl von Faktoren, besonders dem Verfahren, mit dem die Genbank hergestellt wird, variieren. Wie hier verwendet, bedeutet Größe eher die Komplexität oder Vielfältigkeit der Genbank, d. h. die Zahl der verschiedenen Spezies, die die Genbank bilden, als die absolute Zahl der Partikel in der Genbank.
Daher wird, wo eine Genbank hergestellt wird, indem man zuerst zwei genrepertoires getrennt kloniert, die den ersten und zweiten Polypetiden entsprechen, die so erhaltene Größe der Genbank nach dem zufälligen Kombinieren der beiden Repertoires in Form eines dicistronischen Vektors stark erhöht. Betrachtet man zum Beispiel die Antikörper-Genrepertoires für die variable leichte Kette und schwere Kette, hat jedes 10⁶ verschiedene Mitglieder. Das Kombinieren der beiden Repertoires ergibt theoretisch eine Genbank von 10¹² möglichen unterschiedlichen dicistronischen Vektorspezies.
Die Genbankkomplexität kann auch erhöht werden, indem die Verfahren hier zum Mutieren von Nucleotidsequenzen in einer bereits existierenden Sequenzbank verwen det werden. Angegeben in Form von Unterschieden in Aminosäureresten für ein exprimiertes Fusionspolypeptid kann es potenziell zu einer zwanzigfachen Erhöhung der Genbankgröße für jede Position der Aminosäurereste kommen, auf die die zufällige Mutation abzielt.
Zum Beispiel kann unter Verwendung der auf die komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) gerichteten Mutagenese von Antikörpergenen, wie im U. S. Patent Nr. 5.658.727 beschrieben, eine lineare Region von beispielsweise 16 Aminosäureresten gezielt zufällig mutiert werden. Das Beginnen mit einer einzelnen Spezies und Mutieren aller 16 Positionen der Reste durch alle möglichen Kombinationen mit einer Auswahl von 20 unterschiedlichen Aminosäuren würde theoretisch eine Genbank von 20¹⁶ unterschiedlichen Spezies oder 6 × 10²⁰ unterschiedliche Spezies herstellen.
Wie hier beschrieben, ist ein besonderer Vorteil eines filamentösen Phagen in der vorliegenden Erfindung, dass das in dem Phagenpartikel vorliegende und ein oder beide Mitglieder des heterodimeren Rezeptors kodierende DNA-Molekül von anderen in der Genbank vorliegenden DNA-Molekülen auf der Grundlage der Anwesenheit des jeweiligen exprimierten Fusionspolypeptids auf der Oberfläche des Phagenpartikels abgesondert werden kann.
Die Isolierung (Absonderung) eines DNA-Moleküls, das eines oder beide Mitglieder eines heterodimeren Rezeptors kodiert, wird durch die Absonderung des filamentösen Phagenpartikels durchgeführt, der das Gen oder die Gene von Interesse enthält, frei von der Population anderer Phagenpartikel, die die Genbank umfassen. Die Absonderung von Phagenpartikeln bezieht die physikalische Trennung und Vermehrung einzelner Phagenpartikel frei von anderen Partikeln in der Genbank ein. Verfahren für die physikalische Trennung filamentöser Phagenpartikel, um einzelne Partikel herzustellen, und für die Vermehrung der einzelnen Partikel, um von dem einzelnen abgesonderten Partikel abgeleitete Populationen von Phagennachkommen zu bilden, sind auf dem Fachgebiet der filamentösen Phagen wohlbekannt.
Ein bevorzugtes Trennungsverfahren bezieht die Identifizierung des exprimierten Heterodimers auf der Oberfläche des Phagenpartikels durch eine Liganden-Bindungsspezifität zwischen dem Phagenpartikel und einem vorgewählten Liganden ein. Beispielhaft und bevorzugt ist die Verwendung der "Panning"-Verfahren, wobei eine Suspension von Phagenpartikeln mit einem Festphasen-Liganden (Antigen) in Kontakt gebracht wird und ihr ermöglicht wird spezifisch zu binden (oder immunzureagieren, wobei das Heterodimer eine variable Immunglobulindamäne einschließt). Nach dem Binden werden nicht gebundene Partikel von der Festphase abgewaschen und die gebundenen Phagenpartikel sind jene, die einen Liganden-spezifischen heterodimeren Rezeptor (Heterodimer) auf ihrer Oberfläche enthalten. Die gebundenen Partikel können dann durch Elution der gebundenen Partikel von der Festphase gewonnen werden, üblicherweise durch die Verwendung wässriger Lösungsmittel, die mit der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung interferieren. Typische Lösungsmittel schließen Puffer mit hoher Ionenstärke, niedrigem pH oder einer Menge löslicher kankurrierender Liganden ein, die genügt, um die Wechselwirkung der Rezeptor-Liganden-Bindung zu unterbrechen.
Ein alternatives Verfahren zum Tennen eines Phagenpartikels aus einer Partikelpopulation, beruhend auf der Ligandenspezifität des Oberflächen-exprimierten Heterodimers, ist es, die Phagenpartikel aus der Lösungsphase durch Vernetzung mit dem Liganden zu präzipitieren.
Die Verwendung der vorstehenden Verfahren zur Partikelabsonderung stellt ein Mittel zum Durchmustern einer Population filamentöser Phagenpartikel bereit, die in einer Phagen-Genbank dieser Erfindung vorliegen. Das Durchmustern kann, wie für eine Phagen-Genbank angewandt, benutzt werden, um die Genbank für ein oder mehrere Partikel anzureichern, die ein Heterodimer mit einer vorgewählten Liganden-Bindungsspezifität exprimieren. Wo die Genbank so gestaltet wird, dass sie mehrere Heterodimerspezies enthält, die alle ein gewisses nachweisbares Maß an Liganden-Bindungsaktivität haben, sich aber in Proteinstruktur, Antigenwirkung, Liganden-Bindungsaffinität oder -avidität und dergleichen unterscheiden, können die Durchmusterungs-Verfahren nacheinander benutzt werden, um zuerst eine Genbank herzustellen, die auf eine vorgewählte Bindungsspezifität angereichert ist, und dann eine zweite Genbank herzustellen, die durch weiteres Durchmustern, das ein oder mehrere isolierte Phagenpartikel umfasst, weiter angereichert wird. Verfahren zum Messen von Liganden-Bindungsaktivitäten, Antigenwirkung und dergleichen Wechselwirkungen zwischen einem Liganden und einem Rezeptor sind im Allgemeinen wohlbekannt und werden nicht weiter diskutiert, da sie keine wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
In einer Ausführungsform ist daher eine Phagen-Genbank eine auf eine vorgewählte Liganden-Bindungsspezifität angereicherte Population von Partikeln.
In einer anderen Ausführungsform umfasst eine Phagen-Genbank eine Population von Partikeln, wobei jedes Partikel mindestens ein Fusionspolypeptid dieser Erfindung auf der Oberfläche des Phagenpartikels enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Phagen-Genbank einen heterodimeren Proteinkomplex, der, wie hier beschrieben, ein erstes und zweites Fusionsprotein einbezieht und an das Phagenpartikel durch pVII bzw. pIX angeheftet wird. Ein derartiges Phagenpartikel in dieser Genbank enthält überdies ein dicistronisches Expressionsvektorgenom zur Expression der ersten und zweiten Fusionsproteine.
Ein filamentöses Phagenpartikel in einer Genbank dieser Erfindung wird durch Standardverfahren zur Herstellung filamentöser Phagenpartikel hergestellt und hängt in einem DNA-Expressionsvektor dieser Erfindung, wie hier beschrieben, von der Anwesenheit eines Replikationsstartpunkts eines filamentösen Phagen ab, um die nötigen Signale für (1) die Herstellung einer einzelsträngigen replikativen Form des filamentösen Phagen und (2) das Verpacken der replikativen Form in ein filamentöses Phagenpartikel bereitzustellen. Ein derartiges DNA-Molekül kann, wenn es in einer bakteriellen Wirtszelle vorliegt, nach Einführung der genetischen Komplementation, um die für die Herstellung infektiöser Phagenpartikel erforderlichen filamentösen Phagenproteine bereitzustellen, verpackt werden. Ein typisches und bevorzugtes Verfahren für genetische Komplementation ist es, eine bakterielle Wirtszelle, die einen DNA-Expressionsvektor dieser Erfindung enthält, mit einem filamentösen Helferphagen zu infizieren, wie zum Beispiel einem Wildtyp-Phagen, z. B. M13, obwohl modifizierte Phagen bevorzugt werden, wie zum Beispiel der hier beschriebene VCSM13, wodurch die für das Assembly der Phagenpartikel erforderlichen genetischen Elemente bereitgestellt werden. Beispielhafte Helfer-Gewinnungs-Verfahren werden hier beschrieben.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein von Fachleuten des relevanten Fachgebiets verstanden wird. Sofern nicht anders erwähnt, sind die hier eingesetzten und in Erwägung gezogenen Techniken Standardmethodiken, die einem Fachmann wohlbekannt sind. Die Beispiele der Ausführungsformen dienen nur zur Veranschaulichung.
Beispiele
Die folgenden Beispiele, die diese Erfindung betreffen, sind veranschaulichend und sollten natürlich nicht dahingehend ausgelegt werden, die Erfindung besonders zu beschränken.
1. Konstruktion von Vektoren zur Expression von heterodimeren V_H- und V_L-Fusionsproteinen
a. Primer für Polymerasekettenreaktionen (PCR)
Um die verschiedenen hier beschriebenen Konstrukte herzustellen, werden Oligonukleotidprimer unter Verwendung von Standardsynthesegeräten für Oligonukleotide hergestellt, um, wie wohlbekannt ist, geeignete Primer für das Durchführen der Polymerasekettenreaktionen (PCR) herzustellen.
Zur Konstruktion von Flag- und pVII/pIX-Fusionsproteinen wurde ein Flag-Peptid (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (SEQ ID NO 39) entweder an den N- oder C-Terminus von pVII und pIX fusioniert. Die Konstrukte wurden durch PCR mit einzelsträngiger VCSM13-DNA als Matrize amplifiziert. Die für die vier Permutationen verwendeten Primer waren wie folgt: um pVII-Flag herzustellen: VII-FOR:
(5'-CTATCCATGGCAATGGAGCAGGTCGCGGATTTC-3') (SEQ ID NO 1) und VII-fBW: (5'-ATTTAGCTAGCTTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCTCTTTGACCCCCAGCGATTAT-3') (SEQ ID NO 2); um Flag-pVII herzustellen: VII-fFOR (5'-CTATCCATGGCAGACTACAAAGATGACGATGACAAAATGGAGCAGGTCGCGGATTTC-3') (SEQ ID NO 3) und VII-BW (5'-GATTTAGCTAGCTTATTATCTTTGACCCCCAGCGATTAT-3') (SEQ ID NO 4); um pIX-Flag herzustellen: IX-FOR (5'-CTATCCATGGCAATGAGTGTTTTAGTGTATTCT-3') (SEQ ID NO 5) und IX-fBW (5'-ATTTAGCTAGCTTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCTGAGGAAGTTTCCATTAAACG-3') (SEQ ID NO 6); um Flag-pIX herzustellen: IX-fFOR (5'-CTATCCATGGCAGACTACAAAGATGACGATGACAAAATGAGTGTTTTAGTGTATTCT-3') (SEQ ID NO 7) und IX-BW (5'-GATTTAGCTAGCTTATTATGAGGAAGTTTCCATTAAACG-3') (SEQ ID NO 8).
Die sich aus den PCR-Reaktionen unter Verwendung von VCSM13 und den vorstehenden Primerpaaren ergebenden PCR-Produkte und die vorstehenden Primer-Paare wurden mit Restriktionsenzymen, Nco I und Nhe I, verdaut und in den Phagemid-Vektor pCGMT (Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 11777–11782, 1997) eingefügt, um vier Flag-Fusionsproteinkonstrukte zu bilden: pVII-Flag, Flag-pVII, pIX-Flag und Flag-pIX. Die vollständige Nukleotidsequenz für den Vektor pCGMT wird in SEQ ID NO 19 gezeigt.
Um Fusionsproteine der variablen (V) Region der Antikörperkette herzustellen, die entweder ein M13-pVII oder M13-pIX Protein enthalten, wurden die folgenden Primer verwendet:
b. Konstruktion von pVII- oder pIX-Fusionsproteinen der variablen Antikörperregion
Um die V_H-(Gly₄Ser)-pVII und V_L-(Gly₄Ser)-pIX genannten Konstrukte herzustellen, wurden V-Ketten von zwei verschiedenen katalytischen Mausantikörpern, 21H3 und 2H6 (Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 11777–11782, 1997; Janda et al., Science, 244: 437–440, 1989; Lo et al., Isr. J. Chem., 36: 195–198, 1996; Wirsching et al., Science, 252: 680–685, 1991), und ein Anti-Kokain Mausantikörper, 92H2 (durch unser Labor erzeugt), verwendet, so dass Gene, die die schwere Kette der variablen Polypeptiddomäne (V_H) oder die leichte Kette der variablen Polypeptiddomäne (V_L) kodieren, von den klonierten monoklonalen Antikörpern bereitgestellt wurden, um Fusionsgene zum Exprimieren der V_H-(Gly₄Ser)-pVII- und V_L-(Gly₄Ser)-pIX-Fusionsproteine zu konstruieren.
In diesem Beispiel wurden die V_H-Sequenzen jeweils an den N-Terminus von pVII fusioniert und die V_L-Sequenzen wurden an den N-Terminus von pIX fusioniert. Die Konstrukte wurden durch das Einfügen einer Linkersequenz, Gly₄Ser, (SEQ ID NO 37, von 249–253), zwischen V_H und pVII und zwischen V_L und pIX verändert. Die Fab-Gene für 21H3, 2H6 und 92H2 waren aus vorheriger, vorstehend zitierter Arbeit erhältlich und bei ihnen handelte es sich um die am leichtesten manipulierten Sequenzen zur Amplifikation variabler Regionen.
Zuerst wurden die V_H-Linkerfragmente durch PCR unter Verwendung der Primer H1 und H2 für Fab-21H3, H1 und H3 für Fab-2H6 und H1 und H4 für Fab-92H2 amplifiziert. Die V_L-Linkerfragmente wurden unter Verwendung der Primer L1 und L2 für Fab-21H3, L1 und L3 für Fab-2H6 und L1 und L4 für Fab-92H2 amplifiziert. Dann wurden die Linker-pVII-Fragmente und Linker-pIX-Fragmente mit VCSM13 als Matrize amplifiziert. Die Primer VII-F und VII-BW wurden für Linker-pVII verwendet und die Primer IX-F und IX-BW für das Linker-pIX-Konstrukt. Schließlich wurden die Konstrukte V_H-(Gly₄Ser)-pVII und V_L-(Gly₄Ser)-pIX durch Overlap-Extension-PCR durch Mischen äquimolarer Mengen der V_H-Linker- und Linker-pVII-Fragmente oder der V_L-Linker- und Linker-pIX-Fragmente zusammengesetzt. Die Primer H1 und VII-BW wurden verwendet, um das V_H-(Gly₄Ser)-pVII-Fragment zu bilden und die Primer L1 und IX-BW wurden verwendet, um das V_L-(Gly₄Ser)-pIX-Fragment zu bilden.
Nach dem Verdau mit Nco I und Nhe I wurde das V_H-(Gly₄Ser)-pVII-Fragment, das unter Verwendung von entweder 21H3, 2H6 oder 92H2 hergestellt wurde, in den Phagenpräsentationsvektor pCGMT-1b ligiert, der mit Nco I und Nhe I vorverdaut worden war.
Der Vektor pCGMT-1b ist ein dicistronischer Expressionsvektor, der durch die Zugabe einer Ribosomenbindungsstelle und einer ompA Leader-Sequenz von pCGMT abgeleitet wurde, um eine zweite Expressionskassette zu bilden. Eine schematische Karte, die die relevanten Merkmale des pCGMT-1b Vektors zeigt, einschließlich der Restriktionsstellen, wird in 2A gezeigt. pCGMT-1b enthält daher zwei Ribosomenbindungsstellen und zwei Leader-Sequenzen von ompA und pelB und kann zwei Polypeptide von einem einzelnen Transkriptionspromotor (lacZ) aus exprimieren, wie zum Beispiel die schweren und leichten Ketten der variablen Immunglobulinregion. Die vollständige Nukleotidsequenz für den Vektor pCGMT und pCGMT-1b werden in SEQ ID NO 19 bzw. 20 gezeigt.
In ähnlicher Weise wurde das V_L-(Gly₄Ser)-pIX-Fragment, das unter Verwendung von entweder 21H3, 2H6 oder 92H2 hergestellt wurde, mit Sac I und Nhe I verdaut und in pCGMT-1b ligiert, der schon das entsprechende V_H-(Gly₄Ser)-pVII-Insert hatte und der mit Sac I und Xba I vorverdaut worden war, um einen dicistronischen Expressionsvektor zu bilden, der in 2B veranschaulicht wird, der fähig ist, einen heterodimeren V_H-(Gly₄Ser)-pVII/V_L-(Gly₄Ser)-pIX-Antikörper zu exprimieren.
Werden die Fab-21H3-Gene als Ausgangsmaterialien verwendet, wird der dicistronische Vektor pCGMT-1b/21H3-V_HV_L genannt. Werden die Fab-2H6-Gene verwendet, wird der Vektor pCGMT-1b/2H6-V_HV_L genannt und werden die Fab-92H2-Gene verwendet, wird der Vektor pCGMT-1b/92H2-V_HV_L genannt.
Die Sequenzen der Aminosäurereste der verschiedenen V_H- und V_L-Fusionspolypeptide werden im Sequenzprotokoll als reifes (prozessiertes) Protein, dem die Leader-Sequenz fehlt, wie folgt gezeigt: 21H3-V_H-pVII (SEQ ID NO 27); 21H3-V_L-pIX (SEQ ID NO25); 2H6-V_H-pVII (SEQ ID NO 31); 2H6-V_L-pIX (SEQ ID NO 29); 92H2-V_H-pVII (SEQ ID NO 35); und 92H2-V_L-pIX (SEQ ID NO33).
Die Nukleotidsequenz, welche die Sequenz der Aminosäurereste der verschiedenen V_H- und V_L-Fusionspolypeptide kodiert, wird im Sequenzprotokoll als die, welche reifes (prozessiertes) Protein, dem die Leader-Sequenz fehlt, kodiert, wie folgt gezeigt: 21H3-V_H-pVII (SEQ ID NO 28); 21H3-V_L-pIX (SEQ ID NO 26); 2H6-V_H-pVII (SEQ ID NO 32); 2H6-V_L-pIX (SEQ ID NO 30); 92H2-V_H-pVII (SEQ ID NO 36); und 92H2-V_L-pIX (SEQ ID NO 34).
2. Expression des heterodimeren V_HV_L-Fusionsproteins auf Phagenpartikeln
a. Vermehrung von Phagenpartikeln
Ein vorstehend hergestellter ligierter Vektor, wie zum Beispiel pCGMT-1b/21H3-V_HV_L, wird in eine E. coli Wirtszelle transformiert. Genau gesagt wurden die XL1-Blue E. coli Zellen (Stratagene, La Jolla, California) unter Verwendung von Standardverfahren mit dem ligierten Vektor transformiert und auf LB-Agarmedium, das 100 μg/ml Carbenicillin enthielt, ausplattiert.
Der einzelne Klon von XL1-Blue-Zellen, die das Phagemid pCGMT (Flag-pVII oder pVII-Flag/Flag-pIX/pIX-Flag enthaltend) oder pCGMT-1b (VH-Gly4Ser-pVII und VL-Gly4Ser-pIX enthaltend) tragen, wurde abgeimpft und in Superbrothmedium, das 1 % Glukose, 10 μg/ml Tetracyclin und 100 μg/ml Carbenicillin enthält, überimpft. Man ließ die Zellen bei 37 °C unter kräftigem Schütteln (300 Umdrehungen/Minute) bis zur OD600 0,1 wachsen. Der Helferphage VCSM13 wurde in einem Verhältnis von 20 ~ 50 : 1 (Phage : Zelle) in die Zellen gegeben. Man ließ die Zellen weitere 2 Stunden lang bei 37 °C wachsen und Kanamycin und Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurden bis zu einer Endkonzentration von 70 μg/ml bzw. 1 mM zugegeben. Man ließ die Zellen dann über Nacht bei 28–30 °C wachsen. Die in das Anzuchtmedium (Zellüberstand) freigesetzten Phagenpartikel wurden zu diesem Zeitpunkt in Form von Phagenmedium geerntet und direkt in ELISA-Phagenassays verwendet oder die Phagenpartikel wurden durch Mischen des Kulturüberstands mit einem Fünftel Volumen 20 % Polyethylenglykol 8000 und 3 M NaCl und 30 Minuten langes Inkubieren in Eiswasser weiter konzentriert. Präzipitierte Phagen wurden durch 10 Minuten lange Zentrifugation, 15.000 Upm, 40 °C, in einem Beckman JA-17 Rotor pelletiert. Das Phagenpellet wurde in PBS (pH 7.4) in einem Fünfzigstel des Ausgangszellkulturvolumens resuspendiert.
b. ELISA zum Nachweisen V_HV_L-exprimierender Phagen
Der Überstand der vorstehend beschriebenen Phagenkultur wurde direkt für einen ELISA verwendet. Mikrotitervertiefungen (Corning) wurden mit 25 μl eines 10 μg/ml Anti-Flag-Mausantikörpers beschichtet, um die Flagkonstrukte mit pVII/pIX zu analysieren, mit PCP-BSA für die 21H3- und 2H6-Konstrukte, und mit dem Kokain-Konjugat GNC-BSA, um das 92H2-Konstrukt zu analysieren. Die beschichteten Platten wurden dann bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert und mit 50 μl Blotto (4 % Magermilchpulver in PBS) blockiert. Üblicherweise wurden 25 μl des Phagenüberstands zugegeben und die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Waschen wurden 25 μl einer 1/1000 Verdünnung eines Meerrettichperoxidase/Anti-M13-Konjugats (Pharmacia) in Blotto zugegeben und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Platte wurde dreimal ausführlich mit PBS/0,1 % Tween-20 gewaschen und heftig auf und ab pipettiert, um unspezifisch bindende Phagen zu entfernen. Die Platte wurde dann mit TMB (3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin)-Substrat (Pierce) entwickelt und mit einem gleichen Volumen 2 M H₂SO₄ gequencht. Die Absorption jeder Reaktion wurde dann auf einem ELISA Platten-Lesegerät bei 450 nM abgelesen.
Die Ergebnisse der Analyse durch ELISA an den Flag-Fusionsproteinen ermöglicht die Bestimmung der Orientierung von exprimiertem pVII und pIX auf dem Phagenpartikel. Die vorliegende Erfindung hängt von einer Kenntnis der Orientierung von pVII oder pIX auf der Oberfläche des Phagen ab, um Peptide und Proteine korrekt zu präsentieren. Deshalb wurde das Oktapeptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, (SEQ ID NO 39), das weit verbreitet beim Nachweis und bei der Reinigung von Protein (Russe) et al., J. Virol., 63: 3284–3295, 1989) verwendet worden ist, als ein Flag-Etikett an den N- oder C-Terminus von pVII und pIX fusioniert und die Konstrukte wurden in einen Phagemid-Vektor pCGMT eingefügt. Phagenpartikel, die die vier unterschiedlichen Fusionsproteine Flag-pVII und Flag-IX (an den N-Terminus von pVII bzw. von pIX fusioniertes Flag), pVII-Flag und pIX-Flag (an den C-Terminus von pVII bzw. von pIX fusioniertes Flag) trugen, wurden aus XL1-Blue Zellen, die diese Phagemids enthielten, wiedergewonnen. Die Bindungskapazitäten der Phagenpartikel an den monoklonalen Antikörper Anti-Flag M2, der das Flag-Etikett erkannte, wurden durch ELISA getestet. Wie in 3 gezeigt, ist zu sehen, dass nur das an den N-Terminus von pVII oder pIX fusionierte Flag durch einen Phagen-ELISA nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse zeigen an, dass das Flag-Peptid in diesen Konstrukten auf der Außenseite der Phagenhülle exponiert war, und deshalb müssen die N-Termini von pVII und pIX auch auf der Außenseite des Phagenpartikel sein.
Außerdem war es wichtig zu demonstrieren, dass die Präsentation funktioneller Fv-Fragmente durch die Wechselwirkung der pVII- und pIX-Konstrukte stattfindet. Ein grundsätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung war es, zu demonstrieren, dass ein funktionelles heterodimeres Protein durch die unabhängige Expression von pVII- und pIX-Fusionsproteinen auf der Phagenoberfläche präsentiert werden konnte. Deswegen wurden in drei getrennten Beispielen die schweren Ketten der monoklonalen Mausantikörper 21H3, 2H6 und 92H2 als Fusionsproteine mit pVII konstruiert und die vergleichbaren leichten Ketten wurden als Fusionen mit pIX konstruiert, und die V_H- und V_L-Fusionskonstrukte wurden gleichzeitig exprimiert und auf der Oberfläche von Phagenpartikeln präsentiert. Als negative Kontrollen fusionierten wir nur die V_H dieser drei Antikörper an pVII oder die V_L an pIX und ließen die andere Kette weg. Die korrekte Konstruktion der Phagemids pCGMT-1b/21H3-V_HV_L, pCGMT-1b/2H6-V_HV_L und pCGMT-1b/92H2-V_HV_L wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Phagenpartikel, welche die Antikörper 21H3, 2H6 oder 92H2 präsentierten, wurden aus XL1-Blue Zellen mit dem Helferphagen VCSM13 wiedergewonnen.
Von den Antikörpern 21H3 und 2H6 wurde früher gezeigt, dass sie spezifisch an PCP-BSA Konjugate binden, wobei PCP ein Phosphonat-Hapten mit der in 4A gezeigten Struktur ist, wie von Janda et al., Science, 244: 437–440, 1989 beschrieben wird. Von dem Antikörper 92H2 wurde früher gezeigt, dass er spezifisch an GNC-KLN-Konjugate bindet, wobei GNC ein von Kokain abgeleitetes Hapten mit der in 4B gezeigten Struktur ist, wie von Sakurai et al., Tetrahedron Letters, 37: 5479–5482, 1996 beschrieben. Die BSA-Konjugate PCP-BSA und GNC-BSA wurden unter Verwendung von durch N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) katalysierter Standard-Vernetzung hergestellt.
Ein Phagen-ELISA zeigte, dass die Phagenantikörper 21H3 und 2H6 spezifisch an PCP-BSA banden und der Phagenantikörper 92H2 spezifisch an GNC-BSA band. Ein typisches Ergebnis für das 2H6-Konstrukt wird gezeigt (5). Für die zwei erstgenannten Antikörper konnte die Bindungsaktivität durch das freie Hapten PCP und für 92H2 durch Kokain inhibiert werden. An BSA selbst gab es keine Bindung. Für die Phagen, die nur die V_H- oder V_L-Ketten präsentierten, wurden keine Bindungsaktivitäten nachgewiesen. Infolgedessen wurde geschlossen, dass, wenn sowohl die V_H- als auch die V_L-Ketten auf der Oberfläche des Phagen als pVII- bzw. pIX-Fusionsproteine präsentiert wurden, eine Wechselwirkung der Ketten stattfand, um ein funktionelles Fv-Antikörpermotiv zu bilden.
c. Selektive Phagenanreicherung durch Panning
Das Potenzial zum Verwenden von durch pVII und pIX präsentierten Fv-Fragmenten in Selektions- und Evolutionsexperimenten wurde durch Selektionsanreicherung einer Antikörperspezies aus einem Gemisch von zwei Antikörpern, beruhend auf der Funktion, demonstriert. Die 2H6- und 92H2-Phagen-Fvs wurden für das Experiment verwendet, weil sie ähnliche Zelldichten unter gleichen Wachstumsbedingungen hatten. Das 21H3-Gen war für die XL1-Blue Zellen toxischer und zeigte eine viel geringere Zelldichte.
Der 2H6-Phage wurde in den 92H2-Phagen in einem Verhältnis von 1 : 100 oder 1 : 10⁸ verdünnt und das Gemisch wurde für die Selektion gegen PCP-BSA verwendet. In einem anderen Experiment wurde der 92H2-Phage mit 2H6 in einem Verhältnis von 1 : 100 gemischt und das Gemisch wurde für eine Selektion gegen GNC-BSA verwen det. Mikrotiterplatten (Corning) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 25 μl/Vertiefung des PCP-BSA- oder GNC-BSA-Konjugats (10 μg/ml in PBS) beschichtet. Nach fünfmaligem Waschen mit Wasser wurden die Vertiefungen 1 Stunde lang bei 37 °C mit 4 % Milch in PBS blockiert. Dann wurden 50 μl (10¹² cfu/Vertiefung) des Phagengemisches (wie vorstehend beschrieben hergestellt) zugegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Platte wurde 20 Mal mit PBS/0,1 % Tween-20 und 10 Mal mit PBS gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden dann mit 50 μl/Vertiefung Elutionspuffer (0,1 M HCl/Glycin/0,1 % BSA, pH 2,2) eluiert. Nach 10 Min. wurde der Elutionspuffer entfernt und mit 3 μl 2 M Tris-Base pro Vertiefung neutralisiert. Aus der ersten Selektionsrunde eluierte Phagen wurden verwendet, um E. coli XL1-Blue Zellen zu infizieren. Phagenpartikel wurden aus den Zellen wiedergewonnen und für die anschließende Runde von Antigenselektionen verwendet.
In einem ersten Panning-Experiment wurde die Anreicherung durch Mischen von 2H6-Phagen-Fv und 92H2-Phagen-Fv in einem Verhältnis von 1 : 100 oder 100 : 1, gefolgt von Selektion gegen PCP-BSA oder GNC-BSA, getestet. Nach einer Panning-Runde waren 9 von 10 zufällig ausgewählten Klonen 2H6-Phagen-Fv, wenn in einem Verhältnis von 1 : 100 gemischt und gegen PCP-BSA selektioniert wurde, und es wurde festgestellt, dass 6 von 10 Klonen 92H2-Phagen-Fv waren, wenn in einem Verhältnis von 1: 100 gemischt und gegen GNC-BSA selektioniert wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass mindestens eine 100-fache Anreicherung pro Panning-Runde erreicht werden konnte, wenn ein funktionelles Fv-Fragment auf der Phagenoberfläche präsentiert wurde, als Ergebnis der Wechselwirkung von pVII- und pIX-Konstrukten.
In einem zweiten Panning-Experiment wurde die Selektion aus einem hoch verdünnten Gemisch untersucht. Die 2H6-Phagen-Fv wurden mit 92H2-Phagen-Fv in einem Verhältnis von 1 : 10⁸ gemischt und gegen immobilisiertes PCP-BSA affinitätsausgewählt. Das Panning wurde insgesamt zwei Runden lang durchgeführt. Nach jeder Panning-Runde wurden die Phagen vereinigt und durch ELISA auf ihre Fähigkeit, PCP-BSA und GNC-BSA zu binden, getestet. Das Phagengemisch vor dem Panning zeigte keine Bindungsaktivität an PCB-BSA und starke Bindung an GNC-BSA. Nach zwei Selektionsrunden zeigten die Phagen jedoch außerordentlich verstärkte Bindung an PCP-BSA und schwache Bindung an GNC-BSA (6). Um das Verhältnis der Klone 2H6 und 92H2 vor und nach jeder Panning-Runde zu verifizieren, wurden die Phagen von 15 zufällig ausgewählten Klonen wiedergewonnen und durch ELISA auf ihre Fähigkeit, an PCP-BSA und GNC-BSA zu binden, getestet. Von den 15 Klonen erhöhte sich die Zahl der 2H6-Klone von 7 nach der ersten Panning-Runde auf 15 nach der zweiten Panning-Runde. Im Gegensatz dazu war keiner von 15 zufällig ausgewählten Klonen von dem nicht affinitätsausgewählten Phagengemisch 2H6. Die Ergebnisse zeigten, dass eine 10⁸-fache Anreicherung nach nur zwei Panning-Runden erreicht wurde.
3. Assays zum Messen der Aktivität katalytischer Antikörper
Um die katalytische Aktivität eines exprimierten V_HV_L-Fusionsproteinheterodimers zu messen, wurden Reaktionen in 100 mM Bicin (N, N-Bis-(2-hydroxyethyl)glycin), pH 8.5, das 10 % DMSO (Dimethylsuffoxid) als Kolösungsmittel enthält, durchgeführt.
Ungefähr 150 nM 21H3-Phagen (1 × 10¹⁴ cfu/ml) in 100 mM Bicin, pH 8.5 wurden mit 5 mM (S)-(-)-sec-Phenethylalkohol und 16 mM Vinyl-4-acetamidophenylacetat gemischt, die als Stammlösungen in DMSO hergestellt wurden. Ein 50 μl Aliquot wurde alle 30 Min. entnommen und durch Zugabe von 4 μl 10 % HClO₄ gequencht. Die Bildung des Produkts (S)-(-)-sec-Phenethyl-4-acetamidophenylacetat wurde unter Verwendung von Reverse-Phase-HPLC [C18-VYDAC 201TP54 Säule; isokratische mobile Phase (62 Wasser- 0,1 % TFA/38 % Acetonitril); 1,75 ml/min; 254nm] überwacht.
Im Fall des 21H3-Phagen-Fv wurde die katalytische Aktivität untersucht und mit unserem früher untersuchten 21H3-IgG-Antikörper (Wirsching et al., Science, 252: 680–685, 1991) verglichen. Wenn 150 nM des Phagenantikörpers (1 × 10¹⁴ cfu/ml) mit 5 mM Alkohol und 16 mM Vinylester gemischt wurden, konnte das Esterprodukt innerhalb von 30 Min. nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Ein Vergleich von Zeitverlaufskurven zeigte, dass die katalytische Aktivität von 150 nM Phagen-Fv annähernd gleich zu 50 nM des 21H3-IgG war.
4. Charakterisierung von exprimierten V_HV_L-Proteinen
a. Analyse der Dissoziation von V_H- und V_L-Fusionsproteinen auf der Phagenpartikeloberfläche
Um zu verifizieren, dass der Fv-Antikörper auf der Phagenoberfläche tatsächlich durch sowohl pVII als auch pIX durch Assoziation der V_H- und V_L-Fusionsproteine präsentiert wurde, wurden 5 × 10¹³ cfu des Fv-Antikörper-Phagen in 1,5 ml 20 Stunden lang mit 0,1 % Sarkosyl in PBS behandelt und auf eine HIPrep TM 26/60 Sephacryl S-100HR Gelfiltrationssäule (Pharmacia) geladen, die mit PBS, das 0,1 % Sarkosyl enthielt, vorequilibriert wurde. Die Phagenfraktion wurde gesammelt, mit Polyethylenglycol (PEG) präzipitiert und in PBS ohne Sarkosyl dialysiert. Die Antigenbindungsaktivität von 21H3 wurde vor und nach der Sarkosyfbehandlung durch Phagen-ELISA getestet.
Bei früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass V_H- und V_L-Domänen assoziieren und eine Antigenbindungsstelle auf der Phagenoberfläche bilden (Ito et al., J. Biochem Tokyo 123: 832–838, 1998). Obwohl in den vorliegenden Experimenten unwahrscheinlich, existierte die Möglichkeit, dass, während eine variable Domäne auf der Phagenoberfläche als das vorgesehene pVII- oder pIX-Fusionsprotein präsentiert wurde, die andere Domäne als freie Kette existierte und mit der ersten im periplasmatischen Raum assoziierte. Um zu verifizieren, dass sich das Fv auf der Phagenoberfläche durch Wechselwirkung sowohl der pVII- als auch der pIX-Fusionsproteine ergab, wurde das 21H3-Phagen-Fv 20 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 0,1 % Sarkosyl in PBS behandelt und durch Gelfiltration gereinigt. Sarkosyl, ein relativ mildes Detergenz, ist häufig zum Lösen von Phagenpartikel-Präzipitaten verwendet worden und wurde erfolgreich verwendet, um Fv-Fragmente zu dissoziieren (Ito et al., J. Biochem (Tokyo), 123: 832–838, 1998). Die Phagenfraktion wurde gesammelt und gegen PBS dialysiert, um das Sarkosyl zu entfernen. Die Antigenbindungsaktivität von 21H3 wurde durch Phagen-ELISA vor und nach der Sarkosylbehandlung getestet und kein Unterschied wurde beobachtet (Daten nicht gezeigt).
b. Elektronenmikroskopie zum Auswerten der Oberflächenexpression von V_HV_L auf dem Phagenpartikel
Die spezifische Bindung der Phagen-Fvs an ihr Antigen, das mit 5 nm kolloidalem Gold markiert wurde, wurde durch Elektronenmikroskopie direkt sichtbar gemacht. Stabile Komplexe der an PCP-BSA gebundenen 5 nm Goldpartikel wurden gemäß bekannter Methodiken hergestellt (Horisberger et al., J. Histochem. Cytochem., 25: 295–305, 1977; Slot et al., Eur. J. Cell Biol., 38: 87–93, 1985). Die Bezeichnung PCP bezeichnete das Phosphonat-Hapten, das ursprünglich verwendet wurde, um die Antikörper 21H3 und 2H6 zu erhalten (Janda et al., Science, 244: 437–440, 1989). Um die Entfernung aller nicht gebundenen Proteine sicherzustellen, wurden die Komplexe wie beschrieben (Slot et al., Eur. J. Cell Biol., 38: 87–93, 1985) 1,5 Stunden lang bei einer Geschwindigkeit von 55.000 Upm durch ein 7 % Glycerinkissen zentrifugiert. Die pelletierten Komplexe wurden in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung; 10 mM Phosphat, 150 mM NaCl, pH 7.4), das 0,1 % BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, resuspendiert und bei 4 °C gelagert. Phagen wurden durch Induktion mit 1 mM IPTG über Nacht bei 30 °C hergestellt, mit PEG präzipitiert und in 0,01 % BSA enthaltendem PBS auf eine Endkonzentration von 5 × 10¹⁰ cfu/ml verdünnt. Ein 2 μl Aliquot der verdünnten Phagen wurde 5 Min. lang auf mit Formvar beschichtete Nickelnetze (200 mesh) aufgetragen. Nicht gebundene Phagen wurden durch 10 Min. langes Waschen mit PBS und dann 1 % BSA in PBS entfernt. PCP-BSA-Goldkomplexe wurden unverdünnt auf die Netze aufgetragen.
Nach 30 Min. wurden die Netze mit PBS gewaschen, dann mit 1 % Uranylacetat zur Sichtbarmachung durch Elektronenmikroskopie angefärbt. Zufällig ausgewählte Bereiche auf den Netzen wurden fotografiert, um die Anzahl der mit den Phagen assoziierten Goldpartikel zu quantifizieren.
Die spezifische Bindung von Phagen-Fvs an ihr mit 5 nm kolloidalem Gold markiertes Antigen wurde durch Elektronenmikroskopie direkt sichtbar gemacht. Die Untersuchung der filamentösen Phagen 21H3 und 2H6 enthüllte eine spezifische Markierung durch den PCP-BSA-Goldkomplex an einem Ende der Phagen (7A, 7B). Es wurde beobachtet, dass einige Phagen von mehr als einem Goldpartikel markiert wurden (7B). Die Spezifität der Markierung für 21H3 und 2H6 Phagen wurde durch die Abwesenheit von Markierung unter Verwendung eines BSA-Goldkomplexes angezeigt und auch dadurch, dass 92H2-Phagen durch den PCP-BSA-Goldkomplex nicht markiert werden konnten (Daten nicht gezeigt).
c. ELISA Kompetitions-Assay
Ein kompetetiver ELISA-Assay wird unter Verwendung der Phagen 92H2 und 2H6 durchgeführt, um die Natur der Antikörperbindungsspezifität auszuwerten. Zu diesem Zweck wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 25 μl 10 μg/ml PCP-BSA zum Assay des PCP2H6-Konstrukts und GNC-BSA für das 92H2-Konstrukt beschichtet. Die Phagen-Fv-Antikörper wurde durch serielle Verdünnung titriert, um die geeignete Konzentration von Phagen-Antikörpern für den Hemmungs-ELISA zu bestimmen. Variierende Konzentrationen des freien Haptens von PCP (für 2H6) und GNC (für 92H2) wurden dann mit der geeigneten Konzentration von Phagen-Antikörpern 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dieses Gemisch wurde dann auf die Mikrotiterplatten aufgetragen und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und, wie vorstehend für ELISA beschrieben, entwickelt.
5. Diskussion der Beispiele 1–4
Obwohl es früher nahe gelegt worden war, dass pVII und pIX mit einem anderen an ihre N-Termini fusionierten Protein nicht funktionell waren (Endemann et al., J. Mol. Biol., 250: 496–506, 1995), demonstrieren die vorliegenden Ergebnisse, dass derartige Fusionen brauchbar waren. Mit den vorliegenden Ergebnissen ist zu sehen, dass pVII oder pIX oder beide auf kombinatorische Phagenpräsentationsprotokolle, die höchst vielfältige Proteinsequenzen benutzen, anwendbar sind.
Die spezifische Goldmarkierung der Phagen-Fv, die aus der Elektronenmikroskopie bestimmt wurde, zeigte eindeutig die Anwesenheit von Gold an einem Ende der Phagenpartikel. Interessanterweise wurden Phagen, die entweder ein oder zwei Goldmarker beherbergten, beobachtet. Es wird vermutet, dass sich die Letzteren eher aus der bivalenten Präsentation der Fv-Fragmente als durch mehrfache Goldmarkierung von PCP-BSA ergab. Ungefähr 20 % der Phagen wurden durch Gold markiert und präsentierten deshalb einen funktionellen Fv-Antikörper. Die kinetische Analyse zeigte jedoch, dass die Aktivität von 150 nM 21H3-Phagen-Fv der Aktivität von 50 nM 21H3-IgG entsprach. Zusammengenommen legten die Daten, zusammen mit der Annahme, dass die spezifischen Aktivitäten von den Fv und IgG vergleichbar waren, nahe, dass einige Phagenpartikel mehr als ein Fv-Fragment gleichzeitig präsentierten.
Fv-Fragmente sind aus V_H- und V_L-Domänen zusammengesetzte Heterodimere und sind die kleinsten Antikörperfragmente, welche die ganze für spezifische Antigenbindung nötige Information enthalten. Die nicht kovalent assoziierten Ketten in einem vereinzelten Fv-Fragment sind jedoch nicht sehr stabil und neigen zum Dissoziieren (Glockshuber et al., Biochemistry, 29: 1362–1367, 1990). Bekannte Verfahren zum Stabilisieren von Fv-Fragmenten sind als Einketten-Fvs (scFvs) (Rodi et al., Curr. Opin. Biotechnol., 10: 87–93, 1999) und als Disulfid-stabilisierte Fvs (dsFvs) (Bird et al., Science, 242: 423–426, 1988). Sogar scFvs sind noch häufig instabil und können geringere Affinitäten im Vergleich zu Fabs und einem ganzen IgG haben, weit der Linker mit der Bindung interferiert oder das Heterodimer nicht ausreichend stabilisiert. Während die dsFvs im Allgemeinen stabiler und ohne einen Linker sind, erfordern sie die Eingliederung eines Disulfids in die Genbankkonstruktion. Zusätzlich ist es wahrscheinlich, dass dsFv-Genbanken einen einseitig bevorzugten Antikörper-Teilsatz abdecken, bei dem das Zwischenketten-Disulfid nicht mit der Antigenbindung interferiert (Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41–50, 1995). Der Fv-Antikörper, der in unserem Format durch pVII und pIX präsentiert wird, kann als ein Phagen-stabilisiertes Fv (psFv) angesehen werden, das die natürliche Antikörperstruktur ohne die Nachteile von scFvs und dsFvs nachahmt. Unsere Fvs behalten die Affinität und sind darin robust, dass jede Kette unabhängig an der Phagenhülle verankert wird.
Am wichtigsten ist, dass unser neues Format besonders nützlich für die kombinatorische Präsentation heterodimerer Arrays wäre. Obwohl die Gründe noch nicht eindeutig sind, scheint dieses Format außerdem eine besonders starke Anreicherung bei Panning-Pratokollen zu ergeben. pVII und pIX sind anscheinend in ausreichend dichter Nachbarschaft, so dass Fusionsproteine in der Lage sind, mit dem V_H und V_L eines Antikörpers ein funktionelles Heterodimer zu bilden. Es wird geglaubt, dass der Ansatz auf die Präsentation verschiedener Polypeptide für die Schaffung künstlicher Antikörper ausgedehnt werden kann. Die Fähigkeit, ein großes Repertoire neuer dimerer Bindungsdomänen zu präsentieren, uneingeschränkt durch die spezifische Programmierung der Antikörperstruktur, wird unser Verstehen von Protein-Protein-Wechselwirkungen erhöhen und potenziell zur Entdeckung einzigartiger biolgischer Aktivitäten führen.
6. Herstellung eines Einketten-Fv-Fusionsproteins
Als eine Demonstration der Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung wurde ein Einkettenantikörper (scFv) beruhend auf den Fv-Teilstücken der schweren und leichten Ketten eines 21H3 konstruiert. Zu diesem Zweck wurden die relevanten Teilstücke der V_H- und V_L-Gene für den 21H3-Antikörper durch PCR amplifiziert und mit einer Sequenz, die einen (Gly₄Ser)₃-Linker (SEQ ID NO 37, von 125–139) kodiert, durch überlappende PCR fusioniert und überdies durch überlappende PCR mit einem (Gly₄Ser)-Linker (SEQ ID NO 37, von 249–253) an das pIX-Gen fusioniert, um das als scFV21H3-pIX bezeichnete scFv-Konstrukt zu bilden, wobei die Komponenten als V_H-(Gly₄Ser)₃-V₄-(Gly₄Ser)-pIX angeordnet sind. Die Sequenz der Aminosäurereste des Fusionsproteins wird in SEQ ID NO 37 gezeigt und die Nukleotidsequenz, die das Fusionsprotein kodiert, wird in SEQ ID NO 38 gezeigt. Das so erhaltene Konstrukt wurde, wie vorstehend beschrieben, in E. coli transformiert, Phagenpartikel wurden auf ähnliche Weise hergestellt und das auf Phagenpartikeln exprimierte Fusionsprotein scFV-21H3-pIX wurde in dem hier vorstehend beschriebenen Phagen-ELISA ausgewertet. Die Fusion des 21H3-Einkettenantikörpers an pIX war, nach ELISA, im Vergleich zu Wildtyp-Phagen (VCSM13) stark reaktiv mit dem PCP-BSA-Konjugat, wie in 8 gezeigt wird.
Die Beispiele sollen in jeder Hinsicht nur als veranschaulichend und nicht als einschränkend betrachtet werden und der Umfang der Erfindung wird durch die Ansprüche angegeben, die folgen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Filamentöser Phage, der ein Genom einkapselt, das ein Fusionspolypeptid kodiert, wobei das Polypeptid ein prokaryotisches Sekretionssignal hat und ein an den Amino-Terminus eines Proteins pVII oder pIX des filamentösen Phagen fusioniertes exogenes Polypeptid umfasst und wobei der Phage das Fusionspolypeptid auf der Oberfläche des Phagenpartikels umfasst.
Filamentöser Phage nach Anspruch 1, wobei das Fusionspolypeptid ein erstes an das Protein pVII fusioniertes Fusionspolypeptid ist und das Genom überdies ein zweites Fusionspolypeptid kodiert, wobei das zweite Fusionspolypeptid ein prokaryotisches Sekretionssignal hat und ein zweites an den Aminoterminus des Proteins pIX fusioniertes exogenes Polypeptid umfasst und der Phage überdies das zweite Fusionspolypeptid auf der Oberfläche des Phagenpartikels umfasst.
Filamentöser Phage nach Anspruch 1, wobei das exogene Polypeptid aus der Gruppe bestehend aus einer variablen Domäne der schweren Immunglobulinkette (V_H), einer variablen Domäne der leichten Immunglobulinkette (V_L), einem synthetischen Polypeptid und einem Einkettenantikörper (scFv) ausgewählt ist.
Filamentöser Phage nach Anspruch 2, wobei die ersten und zweiten exogenen Polypeptide die ersten und zweiten Polypeptide eines heterodimeren Proteinkomplexes umfassen.
Filamentöser Phage nach Anspruch 4, wobei der heterodimere Proteinkomplex ein Immunglobulin-Fv, ein katalytisches Fv, ein Rezeptor, ein Nukleinsäure bindendes Protein oder ein Enzym ist.
Filamentöser Phage nach Anspruch 1, wobei das Genom pCGMT oder pCGMT-1b mit einer in SEQ ID NO 19 bzw. 20 gezeigten Nukleotidsequenz umfasst.
Filamentöser Phage nach Anspruch 5, wobei das Fv 21H3-V_HV_L, 2H6-V_HV_L, oder 92H2-V_HV_L ist.
Vektor zum Exprimieren eines Fusionsproteins auf der Oberfläche eines filamentösen Phagen, umfassend eine Kassette zum Exprimieren des Fusionsproteins, die stromaufwärts und stromabwärts gelegene translatierbare DNA-Sequenzen enthält, funktionell verbunden durch eine Sequenz von Nukleotiden, die für die gerichtete Ligierung einer Insert-DNA geeignet sind, wobei die stromaufwärts gelegene Sequenz ein prokaryotisches Sekretionssignal kodiert, die stromabwärts gelegene Sequenz ein Protein des filamentösen Phagen kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus den Proteinen pVII und pIX ausgewählt ist, wobei die translatierbaren DNA-Sequenzen funktionell mit einem Satz von DNA-Expressionssignalen, umfassend einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle und mindestens ein Stoppcodon im gleichen Leserahmen mit der stromabwärts liegenden translatierbaren DNA-Sequenz, zur Expression der translatierbaren DNA-Sequenzen als Teilstücke des Fusionspolypeptids verbunden sind und der Vektor überdies einen Replikationsstartpunkt des filamentösen Phagen umfasst.
Vektor nach Anspruch 8, überdies umfassend eine zweite Kassette zum Exprimieren eines zweiten Fusionsproteins auf der Oberfläche des filamentösen Phagen, wobei die zweite Kassette die Struktur der ersten Kassette hat, mit der Maßgabe, dass die erste Fusionsprotein-Expressionskassette das Protein pVII und die zweite Fusionsprotein-Expressionskassette das Protein pIX kodiert.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor pCGMT mit einer in SEQ ID NO 19 gezeigten Nukleotidsequenz umfasst.
Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor pCGMT-1b mit einer in SEQ ID NO 20 gezeigten Nukleotidsequenz umfasst.
Vektor nach Anspruch 8, wobei das prokaryotische Sekretionssignal ein pelB- oder ompA-Sekretionssignal ist.
Genbank filamentöser Phagenpartikel, wobei jedes Phagenpartikel Anspruch 2 entspricht.
Genbank filamentöser Phagenpartikel, wobei jedes Phagenpartikel einen Vektor gemäß Anspruch 8 enthält.
Genbank filamentöser Phagenpartikel, wobei jedes Phagenpartikel einen Vektor gemäß Anspruch 9 enthält.
Genbank nach Anspruch 14, wobei die Genbank mindestens 10⁷ verschiedene Arten des Vektors enthält.
Genbank nach Anspruch 15, wobei die Genbank mindestens 10⁷ verschiedene Arten des Vektors enthält.
Fusionsprotein, umfassend erste und zweite Polypeptide, wobei das erste Polypeptid ein exogenes Protein mit einem prokaryotischen Sekretionssignal ist und das zweite Polypeptid ein Protein pVII oder pIX eines filamentösen Phagen ist, wobei das exogene Protein an den Amino-Terminus des Proteins des flamentösen Phagen fusioniert ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 18, wobei das exogene Polypeptid aus einer Gruppe, bestehend aus einer variablen Domäne der schweren Immunglobulinkette (V_H), einer variablen Domäne der leichten Immunglobulinkette (V_L), einem synthetischen Polypeptid und einem Einkettenantikörper (scFv), ausgewählt ist.
Verfahren zum Verändern der Diversität einer Genbank filamentöser Phagenpartikel, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Genbank filamentöser Phagenpartikel gemäß Anspruch 15; b) In Kontakt Bringen der bereitgestellten Genbank mit einem vorgewählten Liganden unter Bedingungen, die den Mitgliedern der Genbank genügen, um an den Liganden zu binden und einen Liganden-Phagenpartikel-Komplex zu bilden; und c) Isolieren von Phagenpartikeln in dem Komplex, frei von nicht gebundenen Mitgliedern der Genbank, um eine Liganden-angereicherte Genbank zu bilden, umfassend Phagenpartikel mit Bindungsspezifität für den vorgewählten Liganden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der vorgewählte Ligand auf einer festen Unterlage befestigt ist, der Komplex in der festen Phase ist und das Isolieren die Schritte umfasst: i) Waschen der festen Unterlage, um nicht gebundene Mitglieder der Genbank von der festen Unterlage zu spülen; und ii) Eluieren der an die Festphase gebundenen Phagenpartikel, um die isolierten Phagenpartikel zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Eluieren umfasst, die an die Festphase gebundenen Phagenpartikel mit einem Elutionspuffer mit einem pH-Wert von pH 2 bis pH 6 in Kontakt zu bringen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Elution umfasst, die an die Festphase gebundenen Phagenpartikel mit einem Elutionspuffer in Kontakt zu bringen, der den vorgewählten Liganden enthält.