DE69932446T2

DE69932446T2 - Verfahren zur herstellung von nukleinsäure- und polypeptidbanken durch in vivo rekombination und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69932446T2
Application number: DE69932446T
Authority: DE
Inventors: Raymon Andrew Santa Fe BRADBURY; Daniele Sblattero
Original assignee: Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati SISSA
Current assignee: Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati SISSA
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2019-11-19
Also published as: EP1131421B1; AU3790300A; DE69932446D1; CA2350779A1; EP1131421A2; WO2000031246A3; IL143123A0; ES2268907T3; WO2000031246A2; ITMI982509A1; ATE333502T1; IL143123A; IT1303776B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung genetischer Diversität durch die Herstellung von Genbibliotheken und auf die Verwendung der Genbibliotheken für die Herstellung von neuen Polypeptiden und auf die Polypeptide, die in dieser Weise erhalten werden.
Hintergrund der Erfindung
Die Erzeugung einer Diversität in Populationen von Polypeptiden ist bei der Ableitung von Polypeptiden mit nützlichen Eigenschaften ein wichtiges Werkzeug geworden. Diese Ansätze umfassen typischerweise Verfahren zur Erzeugung verschiedener Populationen von Molekülen (beispielsweise Nukleinsäuren, Polypeptide usw.), die mit Verfahren verknüpft sind, um Populationsmitglieder auszuwählen und zu screenen, die ein oder mehrere gewünschte Eigenschaften besitzen.
Eine Vielzahl von Ansätzen ist verwendet worden, um verschiedene Populationen von Molekülen zu erzeugen. Diese Verfahren umfassen Zufallsmutagenese, rekombinatorische Mutagenese und ortspezifische Mutagenese. Bei der Zufallsmutagenese werden Mutationen typischerweise in eine DNA-Sequenz zufällig inseriert. Dies kann unter Verwendung einer Vielzahl von unterschiedlichen Verfahren durchgeführt werden, einschließlich chemische Mutagenese, Mutator-Bakterienstämmen und fehlerauslösende PCR. Bei der rekombinatorischen Mutagenese findet die Rekombination zwischen unterschiedlichen DNA-Strängen in einer solchen Weise statt, daß Mutationen, Unterschiede oder Gene, die ursprünglich auf unterschiedlichen DNA-Strängen vorliegen, af demselben Strang zusammen gebracht werden. Bei der ortspezifischen Mutagenese werden Mutationen in eine DNA-Sequenz an Stellen eingeführt, an denen bekannt ist oder vermutet wird, daß das codierte Protein an speziellen Verfahren beteiligt ist, wie Bindung oder enzymatische Aktivität. Dies kann durch ortspezifische Mutagenese oder PCR durchgeführt werden.
Von diesen drei Formen der Mutagenese scheinen die rekombinatorische Mutagenese und ortspezifische Mutagenese die effizientesten zu sein. Jedoch erfordert die ortspezifische Mutagenese genaue strukturelle Kenntnisse über das Zielprotein und/oder die Nukleinsäure.
Die rekombinatorische Mutagenese mit dem Ziel der Herstellung von Genbibliotheken ist nur in vitro unter Verwendung von DNA-Shuffling durchgeführt worden (Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA, 91: 10747–10751). Unter Verwendung von DNA-Shuffling, Klonen und Transfektion wies eine Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen, einschließlich beta-Lactamase, Galactosidase und Antikörpern, modifizierte Eigenschaften auf (in einer ortspezifischen Weise).
Unter Verwendung eher eng verwandter Gene beim DNA-Shuffling als von Mutationen, die sich während PCR ansammelten, sind neue Proteine hergestellt worden, die Eigenschaften aufweisen, die in keinem der Proteine, die die Gene codieren, die als Substrate für das Shuffling verwendet werden, gefunden werden. Beispiele umfassen Interferone und Cephalosporinasen (Crameri, et al. (1998) Nature, 391: 288–91).
Eine spezielle Anwendung, in der die Diversität eher durch die kombinatorische Auswahl von zwei unterschiedlichen Genen als durch die Rekombination innerhalb eines einzelnen Gens oder einer Gruppe von Genen erzeugt wird, ist die Erzeugung von Antikörperbibliotheken, die auf der Oberfläche von filamentöser Phage oder Phagemid angezeigt werden (Phagenanzeige) (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222, 581–597).
Die Bindungsdomäne von Antikörpern ist in den V-Regionen codiert, wobei jede Bindungsdomäne aus einer einzelnen V_H-Domäne und einer einzelnen V_L-Domäne besteht. Es ist nachweislich möglich, die V-Domänen von dem Rest des Immunoglobulins abzutrennen und neue funktionelle Bindungspolypeptide zu erzeugen. Fv-Fragmente bestehen aus V_H und V_L und werden durch nicht-kovalente Kräfte zusammengehalten. Jedoch sind sie relativ instabil, und die zwei Ketten trennen sich leicht. Das Verbinden der zwei Ketten mit einem Polypeptidlinker erzeugt das einkettige Fv-Fragment (scFv-Fragment), das weitaus stabiler ist.
Das Fab-Fragment besteht aus V_H und C_Hl, die kovalent über Disulfidbindungen mit V_L und C_L verknüpft ist. Dieses Fragment ist stabil, aber leidet unter dem Nachteil, daß es relativ schwieriger ist, es in Bakterien herzustellen, und es die Tendenz zum Aggregieren aufweist. Die meisten Bibliotheken aus filamentöser Phase sind in dem scFv-Format, obwohl wenige ebenso in dem Fab-Format hergestellt werden.
Obwohl Antikörper gegen eine große Anzahl an Antigenen unter Verwendung von Phagenantikörperbibliotheken isoliert worden sind (siehe beispielsweise (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222, 581–597; Griffiths, et al. (1994) EMBO J., 13, 3245–3260)), wird das Verfahren noch nicht weitgehend verwendet. Dies kann an der Schwierigkeit zur Herstellung großer Phagenantikörperbibliotheken liegen, die typischerweise erfordern, daß eine Bibliothek mit mindestens 10⁹ unabhängigen Klonen aus einer guten Quelle an verschiedenen VH- und VL-Genen erzeugt wird. Im allgemeinen werden diese Bibliotheken mittels Durchführen einer großen Anzahl an Ligationen und Transfektionen hergestellt, und sobald hergestellt werden sie zu einer begrenzten Ressource, da die Amplifikation ohne eine mögliche Verringerung der Diversität nicht durchgeführt werden kann. Im allgemeinen ist die Affinität von isolierten Antikörpern proportional zu der anfänglichen Größe der zu Selektion verwendeten Bibliothek.
Ortspezifische Rekombination ist als ein alternatives Verfahren zu der Verwendung von Klonen vorgeschlagen worden, um große Genbibliotheken zu erzeugen, und für die Herstellung von Antikörpern mit neuen Spezifitäten. Um VH- und VL-Ketten in den Fab- (Griffiths et al. 1994) oder in dem scFv-Format (Tsurushita et al. (1996) Gene 172: 59–63) zu rekombinieren, ist die cre-Rekombinase verwendet worden, während in einem anderen Fall lambda-Rekombinase verwendet worden ist, um Fab zu rekombinieren (Geoffroy et al., (1994) Gene 151: 109–113).
Während die Rekombination zwischen einzelnen Antikörpern, um funktionelle Bindungsregionen wiederherzustellen, in all diesen Berichten beschrieben wurde, ist eine große Phagenantikörperbibliothek nur unter Verwendung von cre-Rekombinase hergestellt worden, um Fabs zu rekombinieren (d. h. ortspezifische Rekombination), beschrieben in WO 93/19172 und (Griffiths, et al. (1994) EMBO J., 13: 3245–3260).
In beiden Veröffentlichungen wurde eine Bibliothek mit Gendiversität unter Verwendung von ortspezifischer Rekombination zwischen einem ersten Vektor, enthaltend das V_H-Gen, und einem zweiten Vektor, enthaltend das V_L-Gen, hergestellt, wobei der resultierende rekombinierte Vektor sowohl V_H- als auch V_L-Gene enthält. Diese Systeme nutzten zwei unterschiedliche Vektoren für die Rekombination.
Die Einführung von unterschiedlichen Expressionsvektoren, die die Gene tragen, die innerhalb der Zelle rekombiniert werden sollen, warf jedoch ernste Probleme für die Erzeugung von Bibliotheken mit hoher Diversität auf. Typischerweise müssen die zwei Vektoren unterschiedlich sein (beispielsweise ein Vektor ein Plasmid, der andere Vektor eine Phage). Dies ist so, da berichtet worden ist, daß Bakterien, die durch eine filamentöse Phage infiziert wurden, gegen weitere Infektion durch andere filamentöse Phage resistent sind (Boeke et al. (1982) Mol Gen Genet 186: 185–192). Einer der beiden Vektoren mußte daher eher der Transfektion als der Infektion unterzogen werden, und dies verringerte die Wirksamkeit der Transformation der Zelle drastisch.
Außerdem wurde angenommen, daß die zwei Konstrukte unterschiedliche Replikationsursprünge erforderten, die zu unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen und ebenso unterschiedlichen antibiotischen Resistenzgenen gehören. Dies ist so, da von Experten auf diesem Gebiet angenommen wurde, daß Plasmide, die dasselbe Replikationssystem (Replikationsursprung) nutzen, in einer Zelle nicht stabil coexistieren können, weshalb sie inkompatibel sein sollen (siehe Seiten 1.3–4 von (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)). Für jedes Plasmid und Replikationsursprung war ein unterschiedliches antibiotisches Resistenzgen auch erforderlich. Dies beschränkte die Gesamtzahl an unterschiedlichen Plasmiden, die innerhalb einer Einzelzelle gehalten werden konnten. Folglich war die Anzahl an Rekombinationssubstraten, die innerhalb einer Einzelzelle vorliegen konnten, auf die Anzahl von unterschiedlichen Replikationsursprüngen und antibiotischen Resistenzgenen, die verwendet werden konnten, beschränkt. Daher wurde die Größe und die Diversität einer Bibliothek, die unter Verwendung dieses Ansatzes hergestellt werden könnte, ernsthaft eingeschränkt.
Die Verwendung des „Zwei-Konstrukt"-Ansatzes (Plasmid + Phage) weist andere Probleme auf, die dessen Verwendung einschränken. Zunächst ist das Zwei-Konstrukt-Rekombinationssystem reversibel, und infolgedessen sind die Bibliotheken, die unter Verwendung dieses Systems produziert wurden, mit der Ausgangsphage (beispielsweise enthaltend unechte V_H- Ketten) und Plasmiden (enthaltend die V_H+C_Hl-Bibliothek oder das unechte V_H+CH₁) bei relativ hohen Niveaus „kontaminiert". Die Wirtszellen wurden daher mit „nutzlosen" Konstrukten überladen und das System erfordert erhebliche Mittel (beispielsweise Wirtszellen), um die signifikanten Niveaus von „nützlichen" (richtig rekombinierten) Konstrukten zu halten.
Ein zweites Problem ist, daß die Plasmide, selbst wenn sie keinen Ff-Replikationsursprung enthalten, trotzdem in Phagenteilchen mit variablen Wirksamkeiten eingeführt werden können. Infolgedessen enthält die Endbibliothek ein Gemisch aus vielen unterschiedlichen genetischen Elementen, wodurch so die effektive funktionelle Diversität verringert wird.
Ein drittes Problem war, daß die Rekombination zwischen einem einzelnen Phagen-DNA- und einem einzelnen Plasmid-DNA-Molekül in einer Wirtszelle stattfindet, und die Rekombination zwischen mehreren unterschiedlichen Plasmiden nicht möglich war. Infolgedessen erzeugte jede Bakterie (Wirtszelle) einen einzelnen neuen rekombinierten Antikörper. Dies beschränkte die Größe der erhaltenen Bibliothek auf die Anzahl an Bakterien, die in dem Rekombinationsschritt verwendet wurden, was eine praktische Grenze von 5 × 10¹² für 10 Liter erreicht. Um größere Bibliotheken zu erhalten, müssen mehr Bakterien verwendet werden.
Eine vierte Einschränkung bestand darin, daß die Produkte der Rekombination in einem solchen System „Endprodukte" sind, und nicht erneut rekombiniert werden können. Infolgedessen gibt es keine Möglichkeit, weiterer Rekombination zwischen: bereits rekombinierten V_H- und V_L-Genen oder rekombinierten V_H-Genen und der Bibliothek von V_L-Genen zu unterliegen. Nur rekombinierte V_L-Gene konnten mit der ursprünglichen V_H-Genbibliothek rekombiniert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Verfahren und Konstrukte der vorliegenden Erfindung überwinden diese und andere Probleme und ermöglichen die Erzeugung von großen Bibliotheken mit hoher Diversität aus Nukleinsäuren und/oder Polypeptiden. Das Verfahren nutzt die Entdeckung, daß die Rekombination, insbesondere Rekombinaserekombination zwischen zwei oder mehr Konstrukten desselben Typs auftreten kann (beispielsweise mit demselben Replikationsursprung und/oder denselben Regulations- oder selektierbaren Markern). Die Verfahren umfassen daher das Einfüh ren von mindestens zwei Mitgliedern einer anfänglichen Population von Nukleinsäuremolekülen in mindestens eine Zelle (beispielsweise eine Bakterien-, Pflanzen-, Hefe-, Insekten-, Pilz-, Wirbel-, Säugerzelle usw.). Die Nukleinsäuremoleküle umfassen bevorzugt eine Nukleinsäuresequenz, die für jedes Molekül (Mitglied der Bibliothek) identisch ist, und die einen Replikationsursprung umfaßt (und gegebenenfalls andere Regulationssequenzen und/oder das Vektorrückgrat usw.); und eine Nukleinsäure, die zwischen den Mitgliedern der Population variiert und mindestens ein Substrat für die Rekombination umfaßt. Sobald in der Zelle, rekombinieren die Mitglieder der Bibliothek so, daß mindestens ein Substrat für die Rekombination zwischen mindestens zwei Mitgliedern der Population rekombiniert, wodurch eine Population erzeugt wird, die rekombinierte Nukleinsäuremitglieder umfaßt. Die Rekombination kann durch einen zur Zellen endogenen Rekombinationsmechanismus (beispielsweise allgemeine Rekombination oder Rekombinase-vermittelte Rekombination) oder durch eine zur Zelle exogenen Rekombinase (beispielsweise extern bereitgestellte Rekombinase oder durch Transfektion mit einer Rekombinase-exprimierenden Nukleinsäure) durchgeführt werden. Typischerweise weisen die Mitglieder der Bibliothek mindestens zwei Rekombinaseerkennungsstellen auf, und die Rekombination findet bevorzugt an einer für die Rekombination vorgewählten Stelle statt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Rekombination durch eine Rekombinase vermittelt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Mitglied der hin-Familie von Rekombinasen, einem Mitglied der Lambda-Integrasefamilie, einer flp-Rekombinase, einer Resolvase, einem Transposon und einer Cre-Rekombinase, und in am stärksten bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Rekombinasen Cre, hin, gin, pin, cin und flp, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Rekombination an einer loxP-Stelle oder einer flp-Stelle.
In bestimmten Ausführungsformen umfaßt ein Substrat für die Rekombination (ist beispielsweise flankiert durch) ein Paar aus Rekombinationserkennungsstellen (beispielsweise eine erste und eine zweite Rekombinationserkennungsstelle), und diese Stellen können gleich oder verschieden sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen führt die Rekombination zum Austausch von mindestens einem Rekombinationssubstrat zwischen mindestens zwei Mitgliedern der Nukleinsäurepopulation. Ein bevorzugtes Paar Rekombinationserkennungsstellen ist loxP und eine loxP-Mutante (beispielsweise loxP 511 oder fas loxP).
Die Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek können in die Zelle durch jedes geeignete Verfahren eingeführt werden, einschließlich Gentransfer-Technik mit Hilfe der Partikelkanone, Transfektion oder Infektion (beispielsweise wenn innerhalb infektiöser Teilchen enthalten). Bevorzugte Populationen von Nukleinsäuremolekülen umfassen mindestens 2 unterschiedliche Mitglieder, bevorzugt mindestens 10 unterschiedliche Mitglieder, stärker bevorzugt mindestens 50 unterschiedliche Mitglieder und am stärksten bevorzugt mindestens 500 unterschiedliche Mitglieder pro Zelle (d. h. transfektiert und/oder infiziert in eine Zelle). Bevorzugte Nukleinsäurebibliotheken umfassen mindestens 10⁵, bevorzugt mindestens 10⁷, stärker bevorzugt mindestens 10⁸, 10⁹ oder 10¹⁰ unterschiedliche Mitglieder und am stärksten bevorzugt mindestens 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵ oder mehr unterschiedliche Mitglieder. Typischerweise (obwohl nicht darauf beschränkt) werden die Bibliotheken vor der Rekombination 10⁶ bis 10⁸ unterschiedliche Mitglieder und nach der Rekombination 10⁹ bis 10¹³ oder mehr Mitglieder umfassen.
Bevorzugte infektiöse Teilchen, die in diesem Verfahren verwendet werden, umfassen Phage (beispielsweise filamentöse Phage wie Phage der Ff-Familie) und Phagemid (beispielsweise Phagemid, abgeleitet von Mitgliedern der Phagen-Ff-Familie), sind aber nicht darauf beschränkt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können außerdem das Transfektieren oder Infizieren einer oder mehrerer Zellen mit Mitgliedern der Population von rekombinierten Nukleinsäuremitgliedern, so daß die Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (moi) von weniger als etwa 1 infiziert sind; und das Packen der Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek in replizierbare genetische Anzeigepakete, so daß ein Protein an der Oberfläche des replizierbaren Anzeigepakets durch eine Nukleinsäure codiert wird, die innerhalb des Anzeigepakets gepackt ist, d. h. eine Nukleinsäuresequenz, die zwischen Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek variiert, umfassen.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die variable Nukleinsäuresequenz, die das Substrat für die Rekombination in den Mitgliedern der Nukleinsäurebibliotheken umfaßt, eine Expressionskassette, bevorzugt eine Expressionskassette, die Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die für ein oder mehrere Polypeptide codieren. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure, die für mindestens eines der Polypeptide codiert, durch Paare von Rekombinaseerkennungsstellen flankiert (beispielsweise wo die Mitglieder des Paars an Erkennungsstellen gleich oder verschieden sind, wie oben beschrieben).
Bevorzugte Expressionskassetten exprimieren die Polypeptide auf der Oberfläche einer Phage, eines Phagemids oder einer Bakterie. In einer Ausführungsform kann die variable Sequenz (beispielsweise die Expressionskassette) eine Nukleinsäuresequenz, die für eine erste Polypeptidkette codiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die für eine zweite Polypeptidkette codiert, umfassen, wo die Polypeptidketten aus einem spezifischen Bindungspaarmitglied sind (beispielsweise einem Antikörper, einem Rezeptor usw.), so daß auf die Rekombination hin die variable Sequenz für Bindungsproteine (oder Paare von Bindungsproteinen) codiert, die nicht in der ursprünglichen Population von Nukleinsäuren codiert werden. In diesem Fall umfassen bevorzugte erste und zweite Polypeptide Antikörperpolypeptide (beispielsweise Antikörperfragmente/-domänen). Besonders bevorzugte Antikörperfragmente umfassen eine V_H-Region, eine V_L-Region, eine V_HCDR₁, eine V_HCDR₂, eine V_HCDR₃, eine V_LCDR₁, eine V_LCDR₂, eine V_LCDR₃, eine an ein CH₁ gebundene V_H und eine an C_L gebundene V_L und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Wo die zwei Polypeptide ein scFv bilden, ist das erste Polypeptid eine V_H-Region und das zweite Polypeptid eine V_L-Region. Typischerweise wird mindestens eine Rekombinaseerkennungsstelle in der Nukleinsäure vorliegen, die für ein Linker codiert, der an die V_H- und V_L-Regionen gebunden ist. Die V_H- und V_L-Regionen können in der Reihenfolge V_L gefolgt von V_H oder umgekehrt vorliegen. Diese Rekombinasestellen sind oftmals Mitglieder eines Paares von Rekombinaseerkennungsstellen, die die Nukleinsäure flankieren, die für ein erstes Polypeptid codiert, und die Rekombinasestellen, die das Paar bilden, können gleich oder verschieden sein, wie oben erläutert. Beide Polypeptide von jeder Kombination von Antikörperfragmenten, die einen Antikörper umfassen, können ein oder mehrere der Substituentenfragmente haben, die von einem Paar von Rekombinaseerkennungsstellen flankiert sind. Besonders bevorzugte Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek codieren für einen Einkettenantikörper (beispielsweise scFv). Andere bevorzugte Konstrukte umfassen Fab, einen Diakörper, einen V_H-Dimer und einen V_L-Dimer und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung Nukleinsäurebibliotheken bereit, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.
Diese Erfindung stellt ebenso eine Nukleinsäurebibliothek bereit, umfassend eine Population aus Nukleinsäuremolekülen, umfassend zwei oder mehrere einzelne Nukleinsäuren, von denen jede aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die bei jedem Molekül gleich ist und die einen Replikationsursprung und mindestens zwei Rekombinaseerkennungsstellen einschließt; und eine Nukleinsäuresequenz, die zwischen Mitgliedern der Population variiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, die variiert, ein Substrat für die Rekombination umfaßt, und wobei jedes Mitglied der Bibliothek den gleichen Replikationsursprung aufweist. Diese Bibliotheken umfassen typischerweise mindestens 2 unterschiedliche Mitglieder, bevorzugt mindestens 10 unterschiedliche Mitglieder, stärker bevorzugt mindestens 50 unterschiedliche Mitglieder und am stärksten bevorzugt mindestens 500 unterschiedliche Mitglieder pro Zelle. Diese Bibliotheken umfassen typischerweise mindestens 10⁵, bevorzugt mindestens 10⁷, stärker bevorzugt mindestens 10⁸ und am stärksten bevorzugt mindestens 10⁹ bis zu 10¹⁵ oder mehr unterschiedliche Mitglieder, wie oben beschrieben. Die Rekombinasestellen und die Nukleinsäuremitglieder umfassen eines oder mehrere der hierin beschriebenen Merkmale, und können gegebenenfalls innerhalb infektiöser Teilchen enthalten sein, wie hierin beschrieben. Daher ist erkennbar, daß die Bibliotheken eine Sammlung von isolierter Phage, oder Phagemid oder Bakterien umfassen können, die die Nukleinsäurebibliothekmitglieder enthält. Die Nukleinsäuren können Phagemidvektoren sein, die für die Antikörper codieren, und bereit zum Subklonen in einen Phagenvektor sind, oder die Nukleinsäuren können eine Sammlung eines Phagemids sein, das bereits die subklonierten Antikörper-codierenden Nukleinsäuren trägt.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereit. Die Verfahren umfassen das Bereitstellen einer Nukleinsäurebibliothek, wie hierin beschrieben; das Auswählen eines oder mehrerer Mitglieder der Bibliothek; und Exprimieren der Nukleinsäuren der ausgewählten Mitglieder. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Auswählen das Exprimieren von Proteinen, die durch die Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek codiert sind; und das Screenen der exprimierten Proteine bezüglich einer oder mehrerer gewünschter Eigenschaften (beispielsweise spezifisches Binden an ein oder mehrere vorgewählte Targets, eine Mindestbindungsavidität für ein oder mehrere vorgewählte Targets, eine maximale Bindungsavidität für ein oder mehrere vorgewählte Targets, Thermostabilität bei einer speziellen vorgewählten Temperatur, eine vordefinierte katalytische Aktivität, eine vordefinierte enzymatische Aktivität unter ausgewählten Bedingun gen, eine vordefinierte biologische Aktivität; Stabilität und/oder Aktivität unter oxidierenden oder reduzierenden Bedingungen oder in nicht-wässerigen Lösungsmitteln usw.) und das Auswählen der Bibliotheksmitglieder, die den Kriterien des Screenens entsprechen, umfassen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Screenen das Screenen auf spezifisches Binden an ein vorgewähltes Target, und in diesen Fällen exprimieren besonders bevorzugte Bibliotheksmitglieder Antikörper (beispielsweise auf replizierbaren genetischen Anzeigepaketen (rgdps) oder auf der Oberfläche von Zellen, die mit den Mitgliedern der Nukleinsäurebibliothek infiziert oder transfektiert sind). Bevorzugte rgdps umfassen einen Phagen oder ein Phagemid, der ein oder mehrere Polypeptide exprimiert, die Oberflächenproteine ersetzen oder an Oberflächenproteine kovalent gebunden sind. Die ausgewählten Mitglieder können für eine andere Runde der Rekombination und Screenen oder zum Anreichern oder Bilden einer Bibliothek für anschließende Runden der Rekombination oder Screenen verwendet werden.
In verschiedenen anderen Ausführungsformen stellt diese Erfindung ebenso Wirtszellen bereit, die eine Nukleinsäurebibliothek umfassen, wie hierin beschrieben.
Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Antikörper" auf ein Protein, bestehend aus ein oder mehreren Polypeptiden, die im wesentlichen durch Immunoglobulingene oder Fragmente von Immunoglobulingenen codiert sind. Die erkannten Immunoglobulingene umfassen kappa-, lambda-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene für die konstante Region sowie unzählige Gene für die variable Region der Immunoglobuline. Leichte Ketten werden entweder als kappa oder lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als gamma, mu, alpha, delta oder epsilon klassifiziert, die wiederum die Immunoglobulinklassen, IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE, definieren.
Es ist bekannt, daß eine typische Immunoglobulin-(Antikörper-)-Struktureinheit ein Tetramer umfaßt. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine „leichte" (etwa 25 kD) und eine „schwere" Kette (etwa 50 bis 70 kD) aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die in erster Linie für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Ausdrücke variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) beziehen sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
Antikörper existieren als intakte Immunoglobuline oder als eine Anzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch Digestion mit verschiedenen Peptidasen produziert werden. Daher digeriert beispielsweise Pepsin einen Antikörper unter den Disulfidverknüpfungen in der hinge-Region, um F(ab)'₂, ein Dimer von Fab, zu produzieren, das selbst eine leichte Kette ist, die an V_H-C_H1 durch eine Disulfidbindung gebunden ist. Das F(ab)'₂ kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidverknüpfung in der hinge-Region zu brechen, wodurch das (Fab')₂-Dimer in ein Fab'-Monomer umgewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im wesentlichen ein Fab mit einem Teil der hinge-Region (siehe Fundamental Immunology, W. E. Paul, Hrsg., Raven Press, N. Y. (1993), für eine ausführlichere Beschreibung von anderen Antikörperfragmenten). Während verschiedene Antikörperfragmente hinsichtlich der Digestion eines intakten Antikörpers definiert werden, wird der Fachmann erkennen, daß diese Fab'-Fragmente de novo entweder chemisch oder durch Nutzung rekombinanter DNA-Methodologie synthetisiert werden können. Daher umfaßt der Ausdruck Antikörper, wie hierin verwendet, auch Antikörperfragmente, entweder hergestellt durch die Modifikation vollständiger Antikörper oder synthetisiert de novo unter Verwendung rekombinanter DNA-Methodologien. Bevorzugte Antikörper umfassen Einkettenantikörper (Antikörper, die als eine einzelne Polypeptidkette existieren), stärker bevorzugt Einketten-Fv-Antikörper (sFv oder scFv), bei denen eine variable schwere und eine variable leichte Kette miteinander verbunden sind (direkt oder durch einen Peptidlinker), um ein zusammenhängendes Polypeptid zu bilden. Der Einketten-Fv-Antikörper ist ein kovalent gebundenes V_H-V_L-Heterodimer, das aus einer Nukleinsäure, die V_H- und V_L-codierende Sequenzen umfaßt, die entweder direkt oder durch einen Peptid-codierenden Linker verbunden sind, exprimiert werden kann. Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879 – 5883. Während V_H und V_L aneinander als eine einzelne Polypeptidkette gebunden sind, assoziieren die V_H- und V_L-Domänen nicht-kovalent. Die ersten funktionellen Antikörpermoleküle, die auf der Oberfläche der filamentösen Phage exprimiert werden sollten, waren Einketten-Fv's (scFv), jedoch waren alternative Expressionsstrategien ebenso erfolgreich. Beispielsweise können Fab-Moleküle auf der Phage angezeigt werden, wenn eine der Ketten (schwer oder leicht) an ein g3-Hüllprotein gebunden ist und die komplementäre Kette zu dem Periplasma als lösliches Molekül exportiert wird. Die zwei Ketten können auf denselben oder unterschiedlichen Replikonen codiert werden; der wichtige Punkt ist, daß sich die zwei Antikörperketten in jedem Fab-Molekül post-translatorisch vereinigen und das Dimer in das Phagenteilchen über Verknüpfung von einer der Ketten mit beispielsweise g3p eingeführt wird (siehe beispielsweise US-Patent Nr: 5733743). Die scFv-Antikörper und eine Anzahl von anderen Strukturen, die die natürlich aggregierten, aber chemische getrennten leichten und schweren Polypeptidketten von einer Antikörper-V-Region in ein Molekül umwandeln, welches sich in eine dreidimensionale Struktur faltet, die im wesentlichen der Struktur einer Antigen-Bindungsstelle ähnelt, sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise US-Patente Nr. 5,091,513, 5,132,405 und 4,956,778). Besonders bevorzugte Antikörper sollten alle umfassen, die auf Phagen angezeigt worden sind (beispielsweise scFv, Fv, Fab und Disulfid-verknüpftes Fv (Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8: 1323–1331)).
Eine „Antigen-Bindungsstelle" oder ein „Bindungsabschnitt" bezieht sich auf den Teil eines Immunoglobulinmoleküls, das an der Antigenbindung beteiligt ist. Die Antigenbindungsstelle wird durch Aminosäurereste der N-terminalen variablen („V")-Regionen der schweren („H")- und leichten („L")-Ketten gebildet. Drei stark divergente Strecken innerhalb der V-Regionen der schweren und leichten Ketten werden als „hypervariable Regionen" bezeichnet, die zwischen stärker konservierten flankierenden Strecken, bekannt als „Gerüstregionen" oder „FRs", angeordnet sind. Daher bezieht sich der Ausdruck „FR" auf Aminosäuresequenzen, die natürlich zwischen oder nachbarständig zu den hypervariablen Regionen in Immunoglobulinen gefunden werden. In einem Antikörpermolekül sind die drei hypervariablen Regionen einer leichten Kette und die drei hypervariablen Regionen einer schweren Kette relativ zueinander in einem dreidimensionalen Raum angeordnet, um eine „Antigenbindungsoberfläche" zu bilden. Diese Oberfläche vermittelt die Erkennung und Bindung des Targetantigens. Die drei hypervariablen Regionen von jeder der schweren und leichten Kette werden als „Komplementarität-bestimmende Regionen" oder „CDRs" bezeichnet und werden beispielsweise von Kabat et al. Sequences of proteins of immunological interest, 4. Aufl. U. S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987) charakterisiert.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „immunologisches Binden" und „immunologische Bindungseigenschaften" auf die nicht-kovalenten Interaktionen des Typs, der zwischen einem Immunoglobulimolekül und einem Antigen auftritt, für den das Immunoglobulin spezifisch ist. Die Stärke oder Affinität von immunologischen Bindungsinteraktionen kann als Dissoziationskonstante (K_d) der Interaktion ausgedrückt werden, wobei eine kleinere Kd eine größere Affinität darstellt. Immunologische Bindungseigenschaften von ausgewählten Polypeptiden können unter Verwendung von in der Technik allgemein bekannten Verfahren quantifiziert werden. Ein solches Verfahren bedeutet das Messen der Geschwindigkeiten der Antigenbindungsstellen/Antigen-Komplexbildung und -dissoziation, wobei diese Geschwindigkeiten von den Konzentrationen der Komplexpartner, der Affinität der Interaktion und von den geometrischen Parametern abhängen, die gleichermaßen die Geschwindigkeit in beiden Richtungen beeinflussen. Daher können sowohl die „Assoziations-Geschwindigkeitskonstante" (k_on) als auch die „Dissoziation-Geschwindigkeitskonstante" (k_off) durch Berechnung der Konzentrationen und der tatsächlichen Geschwindigkeiten der Assoziation und Dissoziation bestimmt werden. Das Verhältnis von k_off/k_on ermöglicht die Streichung aller Parameter, die sich nicht auf die Affinität beziehen, und ist daher gleich zu der Dissoziationskonstante K_d (siehe im allgemeinen Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem., 59: 439–473).
Die Ausdrücke „bindet spezifisch an ein Protein" oder „spezifisch immunoreaktiv mit", wenn sie sich auf einen Antikörper beziehen, beziehen sich auf eine Bindungsreaktion, die für die Gegenwart des Proteins in Gegenwart einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Verbindungen bestimmend ist. Daher binden unter vorgegebenen Immunoassaybedingungen die spezifizierten Antikörper an ein spezielles Protein und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Spezifisches Binden an ein Protein unter diesen Bedingungen kann einen Antikörper erforderlich machen, der hinsichtlich seiner Spezifität für ein spezielles Protein ausgewählt wird. Beispielsweise können F5- oder C1-Antikörper gegen das c-erbB-2-Protein, das an c-erbB-2 bindet, und nicht gegen andere Proteine, die in einer Gewebeprobe vorliegen, gezüchtet werden. Eine Vielzahl von Immunoassayformaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die mit einem speziellen Protein spezifisch immunoreaktiv sind. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper, die mit einem Protein spezifisch immunoreaktiv sind, auszuwählen. Siehe Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, für eine Beschreibung von Immunoassayformaten und -bedingungen, die verwendet werden können, um spezifische Immunoreaktivität zu bestimmen.
Die Ausdrücke „Polypeptid", „Peptid" oder „Protein" werden austauschbar hierin verwendet, um eine lineare Reihe von Aminosäureresten zu bezeichnen, die einer an den anderen durch Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxygruppen von benachbarten Resten verbunden sind. Die Aminosäurereste liegen bevorzugt in der natürlichen isomeren „L-Form vor. Jedoch kann jeder L-Aminosäurerest durch Reste in der isomeren „D"-Form ersetzt werden, so lange wie die gewünschte funktionelle Eigenschaft des Polypeptids erhalten bleibt. Außerdem umfassen die Aminosäuren zusätzlich zu den 20 „Standardaminosäuren" modifizierte und unübliche Aminosäuren, die die umfassen, die in 37 CFR 1.822 (b) (4) aufgelistet sind, sind aber nicht darauf beschränkt. Außerdem sollte angemerkt werden, daß ein Bindestrich am Anfang oder Ende einer Aminosäurerestesequenz entweder eine Peptidbindung an eine weitere Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten oder eine kovalente Bindung an eine Carboxyl- oder Hydroxylendgruppe darstellt.
Der Ausdruck „Bindungspolypeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid, das spezifisch an ein Targetmolekül (beispielsweise ein Zellrezeptor) in einer Weise analog zu dem Binden eines Antikörpers an ein Antigen bindet. Bindungspolypeptide unterscheiden sich von Antikörpern, indem Bindungspolypeptide letztendlich nicht von Immunoglobulingenen oder -fragmenten von Immunoglobulingenen stammen.
Der Ausdruck „Nukleinsäure" bezieht sich auf Deoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und Polymere davon in entweder ein- oder doppelsträngiger Form. Wenn nicht speziell eingeschränkt, umfaßt der Ausdruck Nukleinsäuren, enthaltend bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden, die ähnliche Bindungseigenschaften wie die Referenznukleinsäure aufweist, und in einer Weise metabolisiert werden, ähnlich den natürlich vorkommenden Nukleotiden. Wenn nicht anders angegeben, umfaßt eine spezielle Nukleinsäuresequenz ebenso implizit konservativ modifizierte Varianten davon (beispielsweise Substitutionen degenerierter Codone) und Komplementärsequenzen und ebenso die explizit angegebene Sequenz. Speziell können Substitutionen degenerierter Codone durch Erzeugen von Sequenzen erreicht werden, bei denen die dritte Stellung von ein oder mehreren (oder allen) Codonen mit gemischten Base- und/oder Deoxyinosinresten substituiert ist (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605–2608; und Cassol et al. (1992); Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91–98). Der Ausdruck Nukleinsäure wird austauschbar mit Gen, cDNA und mRNA, kodiert durch ein Gen, verwendet.
Die Ausdrücke „isoliert" oder „biologisch rein" beziehen sich auf Material, das im wesentlichen oder im Grunde frei von Komponenten ist, die es normalerweise begleiten, wie in seinem nativen Zustand gefunden. Jedoch soll sich der Ausdruck „isoliert" nicht auf die Komponenten beziehen, die in einem elektrophoretischen Gel oder anderem Trennungsmedium vorliegen. Eine isolierte Komponente ist frei von solchen Trennungsmedien und in einer für eine andere Anwendung fertigen Form oder bereits in der neuen Anwendung/Milieu in Verwendung.
Der Ausdruck „heterologe Nukleinsäure" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die nicht für die Zelle nativ ist, in der sie gefunden wird, oder deren endgültiger Ursprung nicht die Zelle oder Zellinie ist, in der die „heterologe Nukleinsäure" derzeit gefunden wird.
Der Idiotyp stellt die hoch variable Antigenbindungsstelle eines Antikörpers dar und ist selbst immunogen. Während der Erzeugung einer Antikörper-vermittelten Immunantwort wird ein Individuum Antikörper für das Antigen sowie Anti-Idiotyp-Antikörper entwickeln, deren imnmunogene Bindungstelle (Idiotyp) das Antigen nachahmt. Anti-Idiotyp-Antikörper können ebenso durch Immunisierung mit einem Antikörper oder einem Fragment davon erzeugt werden.
Eine „Phagenanzeigebibliothek" bezieht sich auf eine Sammlung von Phagen (beispielsweise filamentöse Phagen), wobei der Phage ein externes (typischerweise heterologes) Protein exprimiert. Das externe Protein kann mit anderen Einheiten interagieren (daran zu binden), mit denen der Phage kontaktiert wird. Jeder Phage, der ein externes Protein anzeigt, ist ein „Mitglied" der Phagenanzeigebibliothek.
Der Ausdruck „filamentöser Phage" bezieht sich auf ein Virusteilchen, das ein heterogenes Polypeptid auf seiner Oberfläche anzeigen kann. Obwohl ein Fachmann erkennen wird, daß eine Vielzahl von Bakteriophagen in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, ist in bevorzugten Ausführungsformen der Vektor ein filamentöser Bakteriophage oder davon abgeleitet, wie beispielsweise fl, fd, Pfl, Ml3 usw. Der filamentöse Phage kann auswählbare Marker enthalten, wie Tetracyclin (beispielsweise „fd-tet"). Verschiedene filamentöse Phagenanzeigesysteme sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe beispielsweise Zacher et al. (1980) Gene 9: 127–140, Smith et al. (1985) Science 228: 1315–1317 (1985); und Parmley and Smith (1988) Gene 73: 305–318).
Ein „Virenpaketsignal" ist eine Nukleinsäuresequenz, die notwendig und ausreichend ist, um die Einführung einer Nukleinsäure in ein Viruskapsid zu steuern.
Eine Assembly-Zelle ist eine Zelle, in der eine Nukleinsäure in ein Virushüllprotein (Kapsid) gepackt werden kann. Assembly-Zellen können mit ein oder mehreren unterschiedlichen Virusteilchen (beispielsweise einem normalen oder geschwächten Phagen und einem Helferphagen) infiziert werden, die einzeln oder in Kombination das Verpacken einer Nukleinsäure in ein Viruskapsid steuern.
Die folgenden Abkürzungen werden hierin verwendet: AMP, Ampicillin; CDR, Komplementarität-bestimmende Region; ELISA, heterologer Enzym-Immunassay; FACS, Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer; FR, Gerüstregion; Glu, Glukose; IMAC, imobilisierte Metallaffinitätschromatographie; k_on, Assoziationsgeschwindigkeitskonstante; k_off, Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante; PCR, Polymerasekettenreaktion; RU, Resonanzeinheiten; scFv oder sFv, einkettiges Fv-Fragment; Oberflächenplasmonresonanz; V_k, variable Region der leichten kappa-Kette des Immunoglobulins; V_λ, variable Region der leichten lampda-Kette des Immunoglobulins; VL, variable Region der leichten Kette des Immunoglobulins; VH, variable Region der schweren Kette des Immunoglobulins; wt, Wildtyp.
Eine „Rekombinase" bezieht sich auf ein Protein, das die Rekombination zwischen zwei oder mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren vermittelt. Eine bevorzugte Rekombinase „erkennt" eine oder mehrere spezielle Nukleotidsequenzen (eine Rekombinaseerkennungsstelle) und entfernt das Nukleinsäuresegment an diesen Stellen. Die Verwendung einer Rekombinase und entsprechender Rekombinaseerkennungsstellen kann dadurch das Rekombinationsubstrat beschreiben (die Nukleinsäuresequenz unterliegt einem Rekombinationsvorgang).
In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich ein „infektiöses Teilchen" auf ein Nukleinsäuremolekül, das mit „Hüllproteinen" umhüllt ist und das in Zellen mit hoher Effizienz aufgrund spezifischer Interaktionen zwischen Hüllprotein(en) und einem Rezeptor auf der Zelloberfläche eindringen kann. Ein Beispiel eines infektiösen Teilchens ist ein Ff-Phage oder Phagemid.
Ein „Hüllprotein" bezieht sich auf ein Protein, das auf der Oberfläche eines infektiösen Teilchens gefunden wird, welches die eingeschlossene Nukleinsäure „umhüllt". Hüllproteine können in Abhängigkeit der Anzahl an Kopien, die auf dem infektiösen Teilchen vorliegen, als Haupt-Hüllproteine oder als Neben-Hüllproteine bezeichnet werden. In Ff-Phage ist p8 das Haupt-Hüllprotein und liegt in ungefähr 2800 Kopien vor, während p3 das Neben-Hüllprotein ist, das in 3 bis 5 Kopien vorliegt.
Der Ausdruck „Infektion" bezieht sich auf das Verfahren, durch das ein infektiöses Teilchen in eine Zelle aufgrund spezifischer Interaktionen zwischen einem Hüllprotein oder Proteinen, die auf der Oberfläche des infektiösen Teilchens gefunden werden, und einem Rezeptor auf der Zelloberfläche eindringt. In dem Fall der Ff-Phage und dem Phagemid findet die Interaktion zwischen p3 auf der Phagenoberfläche und dem F-Pilus auf den Bakterien statt.
Eine „primäre Bibliothek" oder eine „primäre Genbibliothek" bezieht sich auf eine Population von einzelnen Nukleinsäuremolekülen, wobei jedes aus zwei Teilen besteht: eine Nukleinsäuresequenz, die in jedem Molekül, das identisch ist, vorliegt; und eine variable Nukleinsäuresequenz, nicht notwendigerweise zusammenhängend, die das Substrat zur Rekombination bildet. Jedes Nukleinsäuremolekül unterscheidet sich von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der Genbibliothek gefunden werden. Die Bibliotheken können eine Anzahl von Formen annehmen. Daher ist in einer Ausführungsform die Bibliothek eine Sammlung von Zellen, enthaltend Mitglieder der Phagenanzeigebibliothek, während in einer anderen Ausführungsform die Bibliothek aus einer Sammlung von isolierten Phagen besteht, und in noch einer anderen Ausführungsform die Bibliothek aus einer Bibliothek aus Nukleinsäuren, die eine Phagenanzeigebibliothek codieren, besteht. Die Nukleinsäuren können Phagemid- oder Plasmidvektoren sein, die Polypeptide oder Antikörper codieren und zum Subklonen in einen Phagenvektor bereit sind, oder die Nukleinsäuren können eine Sammlung von Phagemiden sein, die bereits das subgeklonte Polypeptid oder Antikörper-codierende Nukleinsäuren tragen.
Eine „sekundäre Bibliothek" oder eine „sekundäre Genbibliothek" bezieht sich auf eine Sammlung aus Nukleinsäuren, bestehend aus einzelnen Nukleinsäuremolekülen, abgeleitet aus einer primären Genbibliothek, in der die Diversität durch das Verfahren von entweder ortsspezifischer oder allgemeiner Rekombination erhöht worden ist.
Eine „Bibliothek von infektiösen Teilchen" bezieht sich auf eine Sammlung von infektiösen Teilchen, wovon jedes ein Nukleinsäuremolekül enthält, das sich von den Nukleinsäuremolekülen unterscheidet, die von anderen infektiösen Teilchen in der Bibliothek getragen werden, wobei diese Unterschiede normalerweise auf ein spezielles Gen, das für eine spezielle Funktion codiert, dessen Eigenschaften modifiziert werden sollen, beschränkt ist, wobei alle anderen Teile des infektiösen Teilchengenoms normalerweise identisch bleiben. Wenn die Anzahl an infektiösen Teilchen größer als die Diversität der Bibliothek ist, kann jedes der Teilchen in mehr als einer Kopie vorliegen.
Ein „Rekombinationssubstrat" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem anderen Rekombinationssubstrat rekombinieren kann, entweder aufgrund der Gegenwart von spezifischen Rekombinationsstellen (beispielsweise loxP, wo die Rekombination durch die spezifische Rekombinase, cre, katalysiert wird) oder aufgrund von Ähnlichkeiten in den Nukleinsäuresequenzen, die das Stattfinden von allgemeiner zellulärer Rekombination (allgemeiner Rekombination) ermöglichen.
Der Ausdruck „spezifische Rekombination" bezieht sich auf die Rekombination, die an spezifischen Stellen (beispielsweise loxP) stattfindet, die durch Rekombinasen (beispielsweise cre-Rekombinase) erkannt werden, die an solchen Stellen agieren.
Der Ausdruck „Infektionsmultiplizität (MOI)" bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Anzahl von Phagen oder Phagemiden (gemessen als Kolonie-bildende Einheiten oder Plaque-bildende Einheiten), die zu einer Kultur aus Bakterien zugegeben wird, und der Anzahl an Bakterien. Eine MOI von 200 gibt an, daß Phage(mid) in einem 200fachen Überschuß gegenüber den Bakterien vorliegt.
Ein „replizierbares genetisches Anzeigepaket" oder „rdgp" bezieht sich auf ein biologisches Teilchen, welche genetische Information aufweisen, was die Teilchen mit der Fähigkeit, unter entsprechenden Bedingungen zu replizieren, ausstattet. Das Teilchen kann auf seiner Oberfläche mindestens einen Teil eines Polypeptids anzeigen. Das Polypeptid kann durch genetische Information codiert werden, die für das Teilchen nativ sind, und/oder künstlich in dem Teilchen plaziert werden. Das angezeigte Polypeptid oder ein Teil davon kann jedes Mitglied eines spezifischen Bindungspaars sein, beispielsweise einkettiges Fv (scFv), Domänen schwerer oder leichter Ketten, basierend auf einem Immunoglobulinmolekül, ein Enzym oder Rezeptor usw. Ein rdgp kann eine Zelle, eine Bakterie, eine Phage, ein Phagemid oder jedes andere biologische Teilchen mit den oben beschriebenen Charakteristika sein.
Ein Vektor ist ein Nukleinsäuremolekül, das sich selbst und jede andere Sequenz, die darin enthalten ist, in einer Wirtszelle (beispielsweise bakteriell) replizieren kann. Normalerweise enthalten die Vektoren einen Replikationsursprung, ein antibiotisches Resistenzgen und Restriktionsenzymstellen, die das Klonen von anderen DNA-Fragmenten ermöglichen.
Ein „Anzeigevektor" bezieht sich auf einen Vektor, der für die Erzeugung von rgdps verwendet wird. Normalerweise enthalten Anzeigevektoren zusätzlich zu einem Replikationsursprung und einem antibiotischen Resistenzgen ein Gen, das ein Protein codiert, innerhalb dessen ein Polypeptid exprimiert werden kann, das für das biologische Teilchen fremd ist und das auf der Oberfläche des biologischen Teilchens angezeigt wird. Sie enthalten ebenso bevorzugt einen zusätzlichen Replikationsursprung, der die Einführung der Vektor-DNA in das biologische Teilchen ermöglicht, welches das fremde Polypeptid anzeigt. pDAN5, ein Phagemid-Vektor, ist ein Beispiel eines Anzeigevektors.
Ein „Phagemid" ist ein infektiöses Teilchen, das aus Plasmid-DNA besteht, enthaltend den Replikationsursprung eines Phagens (beispielsweise eines filamentösen Phagens), und das mit Phagenhüllproteinen umhüllt ist (beispielsweise bereitgestellt durch eine Helferphage). Der Ausdruck Phagemid kann auch so verwendet werden, daß er auf den DNA-Vektor zutrifft, der innerhalb des infektiösen Teilchens enthalten ist, ein Ff-Phagemid bezieht sich auf ein Phagemid, welches einen Replikationsursprung nutzt, der aus der Ff-Familie von filamentösen Phagen stammt, und erfordert einen Helferphagen, der aus derselben Familie Ff stammt. pDAN5 ist ein Beispiel eines Ff-Phagemids.
Ein „Linker" bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die zwei andere Aminosäuresequenzen verbindet. Daher kann beispielsweise ein Linker die V_L- und die V_H-Ketten eines Antikörpers verbinden, was es ihnen ermöglicht, eine korrekte scFv-Struktur zu bilden. Im allgemeinen ist ein Linker eine Aminosäuresequenz, die zwei Polypeptide in einer solchen Weise kovalent verknüpft, daß ein einzelnes Polypeptid gebildet wird.
Ein „spezifisches Bindungspaar" oder „sbp" bezieht sich auf ein Paar aus Molekülen (wobei jedes ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaars ist), die natürlich abgeleitet oder synthetisch hergestellt werden und spezifisch aneinander binden. Beispiele von Typen von sbps umfassen Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat, IgG-Protein A.
Eine „Phagenanzeigebibliothek" bezieht sich auf eine Sammlung von Phagen (beispielsweise filamentöser Phagen), wobei der Phage ein externes (typischerweise heterologes) Protein exprimiert. Das externe Protein kann mit anderen Einheiten interagieren (daran binden), mit denen der Phage kontaktiert wird. Jeder Phage, der ein externes Protein anzeigt, ist ein „Mitglied" der Phagenanzeigebibliothek.
Der Ausdruck „filamentöser Phage" bezieht sich auf ein Virusteilchen, welches ein heterogenes Polypeptid auf seiner Oberfläche anzeigen kann. Obwohl ein Fachmann erkennen wird, daß eine Vielzahl von Bakteriophagen in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, ist in bevorzugten Ausführungsformen der Vektor ein filamentöser Bakteriophage oder davon abgeleitet, wie beispielsweise fl, fd, Pfl, Ml3 usw. Der filamentöse Phage kann einen auswählbaren Marker enthalten, wie Tetracyclin (beispielsweise „fd-tet"). Verschiedene filamentöse Phagenanzeigesysteme sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe beispielsweise Zacher et al. (1980) Gene 9: 127–140, Smith et al. (1985) Science 228: 1315–1317 (1985); und Parmley and Smith (1988) Gene 73: 305–318).
Ein „selektierbarer Marker" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die es erlaubt, Organismen, die die Sequenz exprimieren und/oder die Sequenz präsentieren, von den Organismen unterscheiden, die die Sequenz nicht exprimieren und/oder nicht präsentieren. Selektierbare Marker sind dem Fachmann allgemein bekannt. Einige Beispiele umfassen das hprt-Gen (Littlefield (1964) Science 145: 709–710), das tk-Gen (Thymidinkinase) vom Herpes simplex-Virus (Giphart-Gassler et al. (1989) Mutat, Res. 214: 223–232), das nDtII-Gen (Thomas et al. (1987) Cell 51: 503–512; Mansour et al. (1988) Nature 336: 348–352) oder andere Gene, die Resistenz gegen Aminosäure- oder Nukleosidanaloga oder antibiotische Verbindungen usw. verleihen.
Eine „loxP-Stelle" bezieht sich auf eine Rekombinaseerkennungsstelle, die als eine Rekombinaseerkennungsstelle für Cre agiert. Eine loxP-Stelle umfaßt native loxP-Sequenzen sowie modifizierte loxP-Stellen. Modifizierte loxP-Stellen sind dem Fachmann bekannt und umfassen loxP 511, fas und andere verschiedene Mutationen, sind aber nicht darauf beschränkt, wie in der Literatur beschrieben worden (siehe beispielsweise Mack et al., a.a.O.; Hoess et al. (1986), a.a.O.; Hoess et al. (1984) Biochem, 81: 1026–29; Hoess et al. (1985) Gene, 40: 325–329; Abremski et al. (1986) J. Biolog. Chem., 261: 391–396; Sauer (1996) Nuc. Acids Res. 24: 4608–13).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Erzeugung einer Diversität (beispielsweise eine Antikörperbibliothek) des einen Vektorsystems gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Die Infektion eines Bakteriums durch zwei Phagemide, enthaltend V_HA/V_LA- und V_HB/V_LBV-Regionen, wird gezeigt. Nach der Rekombination werden vier Produkte vorliegen: das ursprüngliche V_HA/V_LA und V_HB/V_LB, und die zwei neuen Produkte V_HA/V_LB und V_HB/V_LA. Alle Phagemide, sowohl vor als auch nach der Rekombination, enthalten funktionelle Antikörper (scFv). Zusätzlich zu der Anzahl an verwendeten Zellen wird die Größe der End-Genbibliothek auch durch die Anzahl an Phagemiden, die in eine Zelle eindringen, und durch das Ausmaß der Rekombination, die stattfindet, bestimmt.
2 stellt die Sequenz des loxP-511-scFv-Linkers, der in den Beispielen verwendet wird, dar. Insbesondere werden die DNA und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des loxP-511-Linkers angegeben, der verwendet wird, um Minibibliotheken zu erzeugen und scFv zu klonieren. Die Restriktionsstellen, die zum Klonen von V-Regionen verwendet werden, werden unter der DNA-Sequenz angegeben. Die Sequenz der loxP-511-Erkennungsstelle, die bei der Rekombination involviert ist, ist in Kursivschrift dargestellt, die Restriktionsstellen, die zum Klonen verwendet werden, sind unterstrichen, und die invertierten Wiederholungen in der loxP-511-Erkennungssequenz sind doppelt unterstrichen. Antikörper-V-Regionen wurden in der Reihenfolge V_L-Linker-V_H geklont.
3 stellt den hierin beschriebenen pDAN5-Polylinker dar. Die Sequenz des pDAN5-Polylinkers für das Klonen von scFvs wird angegeben (die Sequenz der V-Regionen und Gen 3 wird weggelassen). Die Position der V_L- und V_H-Ketten wird angegeben, und die Restriktionsstellen, die zu deren Klonen verwendet werden, werden fett angegeben. Die loxP-511- und loxP-Wildtypstellen, die verwendet werden, um die Rekombination zu induzieren, werden angegeben, wobei die invertierten Wiederholungen unterstrichen sind. Andere wichtige Merkmale, einschließlich Leitsequenz, SV5-Tag, die verwendet wird, um das scFv zu erkennen, der His-Tag zur Reinigung, das Amberstopcodon und Gen 3, werden ebenso angegeben.
4 stellt die Karte von pDAN5 dar. Insbesondere wird eine Karte des Anzeigenvektors pDAN5 mit den geklonten D1.3 scFv gezeigt. Stellen, die für das V-Gen-Klonen verwendet werden, sind fett dargestellt.
5 stellt das Schema des D1.3-Rekombinationsexperiments dar. Zwei Phagemide, enthaltend V_L/X-V_H/D1.3 und V_L/D1.3-V_H/Y (wo X und Y unbekannte Antikörper darstellen) wurden verwendet, um entweder cre-exprimierende Bakterien oder Wildtyp-DH5αF (das keine cre-Rekombinase exprimiert) bei hoher Infektionsmultiplizität (MOI) zu infizieren. Nach dem Wachstum für etwa 12 Stunden wurden die hergestellten Phagemide wieder in DH5αF infiziert (d. h. nicht in den cre-exprimierenden Zellen), um Genotyp und Phänotyp zu verbinden, und durch PCR und ELISA hinsichtlich der Gegenwart von funktionellem V_L/D1.3-V_H/D1.3 getestet.
6 stellt ein Schema zur Erzeugung einer sekundären Genbibliothek durch in-vivo-Rekombination dar. Bakterien, die cre exprimieren, werden durch Phagemid der primären Bibliothek bei einer MOI von 200:1 infiziert. Nach der Rekombination werden Phagemide hergestellt und wieder in DH5αF bei einer MOI von weniger als 1 infiziert, um den Phänotyp und Genotyp zu verbinden. Diese Phagemide mit verbundenem Phänotyp und Genotyp werden für die Bibliotheksauswahlen verwendet. Die Diversität, die aus der Infektion eines einzelnen Bakteriums mit nur vier Phagemiden (wobei unterschiedliche VH- und VL-Gene unterschiedlich schraffiert) erzeugt wird, dient zur Vereinfachung. Jedoch wird gemäß der vor liegenden Erfindung ein einzelnes Bakterium mit einer viel höheren Anzahl an Phagemiden infiziert. PCR-Fingerprinting-Experimente (siehe 9) bestätigen diese Daten.
7 stellt die Bewertung der Diversität in Bakterien dar, die cre-Rekombinase exprimieren und die durch mehrere Phagemide infiziert wurden. Einzelne Bakterienkolonien, die einzelne Phagemidspezifitäten exprimieren (nach der erneuten Infektion bei einer MOI von weniger als 1), wurden nach der Rekombination isoliert, wie in 6 dargestellt. V_H- und V_L-Gene aus diesen Kolonien wurden unter Verwendung von VH- und VL-spezifischen Primern (Sblattero und Bradbury (1998) Immunotechnology 3: 271–278) und Fingerprinting unter Verwendung von BstNI amplifiziert. Die unterschiedlichen V_H-Genfingerprints wurden horizontal beziffert von 1 bis 17 für Zelle 1 und 1 bis 18 für Zelle 2, während die unterschiedlichen V_L-Fingerprints vertikal von 1 bis 12 für Zelle 1 und 1 bis 14 für Zelle 2 beziffert sind. Es gibt nur eine Tabelle, die eine Zelle in 7 darstellt. Die V_H- und V_L-Fingerprints, die in 37 einzelnen Bakterien für Zelle 1 und 41 einzelnen Bakterien für Zelle 2 gefunden wurden, wurden analysiert und in der Tabelle zusammengefaßt, wobei die Anzahl angegeben wurde, mit der jede VH/VL-Kombination gefunden wurde. Diese Daten geben einen Hinweis auf die Anzahl und die unterschiedlichen Kombinationen von VH/VL, die in den ursprünglichen Zellen 1 und 2 vorliegen.
8 stellt das Schema der allgemeinen Rekombination dar, die verwendet wird, um Cefotaxim-resistente Gene zu erzeugen. Wildtypbakterien wurden durch eine primäre beta-Lactamase-Phagemidbibliothek bei einer MOI von größer als 10:1 infiziert. Die Rekombination findet statt und bringt Mutationen, die anfangs in unterschiedlichen Genen vorlagen, in demselben Gen hervor. Nur ein Phagemid, das die rekombinierten beta-Lactamasegene enthält, kann Cefotaxim-Resistenz verleihen und wird ausgewählt. Die verwendete primäre Bibliothek wies eine Diversität von 5 × 10⁵ auf. Dies wird in der Figur durch zwei Phagemide dargestellt, wovon jedes eine einzelne Mutation enthält, angegeben durch ein Sternchen oder durch einen Punkt. Keine dieser Mutationen allein kann Cefotaxim-Resistenz verleihen, wobei beide zusammen (die nach der Rekombination entstehen) Cefotaxim-Resistenz verleihen können. Die Phagen, die für den Rekombinationsvorgang ausgewählt werden, der auf dem beta-Lactamasegen stattfindet, werden ebenso eine neue Kombination von Mutationen auf dem zweiten Gen tragen.
9 stellt das Schema der allgemeinen Rekombination dar, die verwendet werden kann, um rekombinierte Gene zu selektieren, indem sie zur Rekombination mit einem Marker oder einem Selektorgen verknüpft werden. Eine Bibliothek aus unterschiedlichen Genen oder mutanten Versionen eines einzelnen Gens würde zu einem Vektor geklont werden, der selbst eine Bibliothek von Vektoren ist, enthaltend Mutationen innerhalb eines Markers oder Selektorgens (beispielsweise beta-Lactamase). Eine solche Bibliothek könnte ebenso vorgescreent werden, um nur bekannte vorteilhafte Mutationen zu enthalten, um das Vorkommen von nützlichen Rekombinationsvorgängen zu erhöhen, oder könnten sogar aus zwei einzelnen Mutationen bestehen, die nur effektiv sind, wenn sie auf demselben Gen gefunden werden. Bei der Wahl des Selektionsmediums (beispielsweise Cefotaxim, wenn beta-Lactamase verwendet wird) werden nur die Vektoren, die der Rekombination innerhalb des beta-Lactamasegens unterliegen, dafür ausgewählt. Da die Rekombination normalerweise an zwei Stellen stattfindet, wird dies normalerweise für Vektoren gewählt, die der Rekombination in einem anderen Teil des Vektors unterliegen, was häufig innerhalb des Gens, das rekombiniert werden soll, sein wird. Die Figur stellt die Situation mit zwei Vektoren dar, jeder davon enthält vorteilhafte Mutationen innerhalb sowohl des Selektorgens (beta-Lactamase) als auch dem Gen von Interesse. Die Rekombination innerhalb des beta-Lactamase-Gens, vermittelt durch die zelluläre Rekombinasemaschinerie, bringt die zwei beta-Lactamasemutationen in cis und ermöglicht so die Wahl durch Cefotaxim-Resistenz. Gleichzeitig erfolgt die Rekombination innerhalb des Gens von Interesse, welches ebenso vorteilhafte Mutationen in cis bringt und die Identifizierung von diesem nützlichen Gen durch die Selektion oder Screening ermöglicht. In dem Schema stellen offene Boxen Phagemide dar und offene Kreise stellen den Vektor in seiner replikativen (plasmiden) Form dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neue Verfahren zur Erzeugung von großen, stark vielfältigen Bibliotheken aus Nukleinsäuren und/oder exprimierten Proteinen bereit. Die Erzeugung der Diversität in Populationen von Nukleinsäuren oder Polypeptiden ist ein wichtiges Werkzeug bei der Ableitung von Polypeptiden mit nützlichen Eigenschaften geworden. Diese Ansätze umfassen typischerweise das Produzieren einer großen vielfältigen Population von Gegenstandsmolekülen und dann Screenen dieser Moleküle für die gewünschte Eigenschaft oder Eigenschaften von Interesse. Diese Verfahren ahmen daher die Verfahren der Evolution und natürlichen Selektion nach, und können verwendet werden, um Moleküle mit einer breiten Vielzahl von gewünschten Eigenschaften zu entwickeln und auszuwählen.
Diese Selektionsverfahren sind in einer Vielzahl von Zusammenhängen verwendet worden. Daher sind beispielsweise gerichtete Evolutions- und Selektionsverfahren verwendet worden, um einkettige, humane, nicht-humane oder chimäre Antikörper mit einer speziellen Bindungspezifität und/oder -avidität zu erhalten (siehe beispielsweise Stemmer et al. (1992) Biotechniques 14: 256–265; Marks, Marks et al. (1992) Bio/Technology, 10: 779–782 usw.). Diese Ansätze sind ebenso verwendet worden, um spezielle Bindungsproteine zu erhalten (siehe beispielsweise Clackson and Wells (1994) Trends in Biotechnology 12: 173–184), um RNA-Enzyme zu erhalten (Beaudry et al. (1992) 257: 635–641), um Protein mit speziellen enzymatischen oder katalytischen Aktivitäten zu entwickeln und auszuwählen.
Im Gegensatz zu den Ansätzen des Standes der Technik, die ortsspezifische oder Zufallsmutageneseansätze (beispielsweise fehlerauslösende PCR) nutzen, um die Diversität einer Bibliothek zu erhöhen, nutzen die erfindungsgemäßen Verfahren Rekombinationsverfahren. Diese umfassen die natürlichen (endogenen) Rekombinationsmechanismen, die innerhalb einer Zelle stattfinden (beispielsweise Crossing-over, homologe Rekombination usw.) oder Rekombinase-vermittelte Verfahren, wo das Verfahren durch eine endogene und/oder exogene Rekombinase vermittelt wird.
Im Gegensatz zu anderen Ansätzen, die Rekombinasen nutzen, um die Rekombination zwischen zwei unterschiedlichen Konstrukten zu vermitteln (beispielsweise einen Vektor und eine genomische DNA, zwei unterschiedliche Vektoren usw.), nutzen in einer Ausführungsform die erfindungsgemäßen Verfahren Rekombinasen, um die Rekombination zwischen zwei oder mehreren identischen Konstrukten zu vermitteln; das heißt, die Konstrukte sind im wesentlichen identisch, ohne das/die Segment(e), das/die rekombiniert werden soll/sollen.
Es war eine überraschende Entdeckung dieser Erfindung, daß im Gegensatz zu den Lehren im Stand der Technik mehrere Konstrukte derselben Klasse (beispielsweise Phagemid, Plasmid usw.), die im wesentlichen in regulatorischen Elementen (beispielsweise Replikationsursprung und/oder Promotor(en) und/oder Enhancer(n) und/oder Terminationssequenzen) und/oder auswählbaren Markern (beispielsweise antibiotische Resistenzgene) identisch sind, in einer Wirtszelle (beispielsweise eine Bakterienzelle) für einen ausreichend langen Zeitraum coexistieren können, daß eine umfassende Rekombination (beispielsweise vermittelt durch zelluläre Nicht-Rekombinase-Mechanismen, durch zelluläre Rekombinasen oder durch exogene Rekombinasen) zwischen den Konstrukten stattfinden kann und die Erzeugung von großen Nukleinsäure- und/oder Peptidbibliotheken mit hoher Diversität ermöglicht. Außerdem war es ebenso eine Entdeckung dieser Erfindung, daß die Rekombination insbesondere in Zellen verbessert wird, die bei hoher Infektionsmultiplizität infiziert werden (beispielsweise MOI größer als etwa 5, stärker bevorzugt MOI größer als etwa und am stärksten bevorzugt MOI größer als etwa 200 oder mehr). Es war ebenso eine Entdeckung dieser Erfindung, daß Bibliotheken, die in Vektoren mit hohen Kopiezahlen (beispielsweise größer als 300) geklont werden, eine längere Cobeständigkeit als Vektoren mit niedrigen Kopiezahlen (beispielsweise 10) aufweisen, wodurch die Rekombination extensiver stattfinden kann. Daher sollte eine Transfektion, um mehr als eine Kopie des Vektors (bevorzugt 200, 300 oder sogar mehr als 500) in jede Zelle einzuführen, zur Rekombination führen.
Da die Rekombination in einer einzelnen Klasse von im wesentlichen identischen (ohne die zu rekombinierenden Nukleinsäure(n)) Konstrukten stattfindet, werden die Probleme, die mit den oben beschriebenen sogenannten Zweikonstruktsystemen in Verbindung stehen, überwunden. Daher können beispielsweise alle Konstrukte, die in eine Einzelzelle gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren eingeführt werden, identische Replikationsursprünge und/oder auswählbare Marker und/oder Kontrollsequenzen aufweisen. Daher muß nur ein Einzeltyp an „Rekombinationsvektor" konstruiert werden und die verschiedenen Sequenzen, die rekombiniert werden sollen, können in den Vektor an einer oder mehreren vorausgewählten Stellen eingeführt werden (beispielsweise bereitgestellt durch einen oder mehrere Polylinker). Außerdem kann es bis zu 500, 1000 oder mehr Konstrukte innerhalb einer Zelle geben, beschränkt nur durch die Kopiezahl des verwendeten Vektors, und die Rekombination kann zwischen jeden oder allen dieser Konstrukte stattfinden. Daher kann ein sehr hoher Grad an Diversität in einer Einzelzelle produziert werde, und eine bescheiden große Population von Zellen (beispielsweise 10⁵ bis 10⁷ Zellen) kann eine Bibliothek mit außerordentlicher Diversität produzieren (beispielsweise 10¹¹ bis 10¹⁸ oder mehr unterschiedliche Mitglieder). Das System ist nicht auf einen einzelnen Rekombinanten pro Zelle beschränkt. Außerdem sind selbst nach der Rekombination die Konstrukte, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, im wesentlichen unverändert, ohne die Rekombination. Folglich können sie verwen det werden, um die Diversität in anderen Bibliotheken oder in mehreren Runden der Rekombination und Selektion im wesentlichen ohne Modifikation zu erhöhen.
Diese Vorteile sind nur illustrativ. Andere Eigenschaften und Vorteile kann der Fachmann im Lichte der vorliegenden Beschreibung erkennen.
Die Bibliotheken, sobald hergestellt, können verwendet werden, um spezielle Eigenschaften zu modifizieren oder zu verbessern. In jeder rekombinierten Bibliothek wird ein kleiner Anteil an Proteinen (beispielsweise scFv) spezielle Eigenschaften aufweisen, wie gutes Falten, Beständigkeit gegen Reduktionsmittel oder hohe Temperatur. Durch Vorauswählen einer dieser Eigenschaften wird eine kleine Teilmenge der rekombinierten Bibliothek erhalten, die in dieser Eigenschaft angereichert ist. Die Stärke des hier beschriebenen Rekombinationsverfahrens ermöglicht die Erzeugung von neuen Bibliotheken, die so groß wie die ursprüngliche rekombinierte Bibliothek sind, aber die sich auf die Eigenschaften richten, die dafür vorausgewählt worden sind. Beispielsweise wählt bei den scFv-Bibliotheken die Selektion der rekombinierten Bibliothek auf Protein LA (das ein konformatives Epitop auf einigen V_H- und V_L-Regionen erkennt) hinsichtlich gut gefaltete scFvs vor aus, die für den Abbau nicht anfällig ist. Diese scFvs liegen in einem kleinen Anteil der endrekombinierten Bibliothek vor, aber mittels Durchführen weiterer Runden der Rekombination kann eine sehr vielfältige scFv-Bibliothek, bestehend aus gut gefalteten scFvs, erzeugt werden. Ebenso kann ein kleiner Anteil an scFv in der rekombinierten Bibliothek gegen Reduktionsmittel wie DTT resistent sein. Durch Behandeln der Bibliothek mit DTT und Selektieren dieser scFvs, die überleben (beispielsweise durch die Selektion eines Tags, lokalisiert am N-Terminus, oder unter Verwendung von Protein LA) kann scFv, das gegen dieses Mittel resistent ist, ausgewählt werden. Eine weitere Runde der Rekombination wird eine neue Bibliothek erzeugen, die an scFvs angereichert ist, die gegen DTT resistent sind und so intrazellulär funktionell sein können. Phage(mid)-Antikörperbibliotheken wachsen normalerweise bei niedrigen Temperaturen (beispielsweise 30°C). Dies ist so, da viele Antikörper toxisch oder bei höheren Temperaturen instabil sind. Durch Züchten von Bakterien der rekombinierten Bilbliothek bei höheren Temperaturen (beispielsweise 37°C oder sogar 42°C) werden nur die Bakterien, die weniger toxisches und stabileres scFv enthalten, ausgewählt. Mittels Durchführen einer weiteren Runde der Selektion werden scFvs in der Bibliothek aus den V_H- und V_L-Regionen hergestellt, die hinsichtlich der Nicht-Toxizität oder Stabilität vorausgewählt werden. Ebenso wird durch Selektieren hinsichtlich des Bindens an ein spezielles Target eine eingeschränkte Bibliothek, die auf eine spezielle Spezifität gerichtet ist, abgeleitet. Mittels Durchführen der Rekombination unter diesen scFvs, von denen alle ein spezielles Antigen erkennen, können Antikörper mit höherer Affinität, die nicht in der ursprünglichen Bibliothek vorliegen, ausgewählt werden. Ähnliche Verfahren der Vorauswahl, beispielsweise Resistenz gegen spezielle Lösungsmittel, ionische Bedingungen, Temperaturen, Aktivität usw., sind vorstellbar.
I. Effiziente Erzeugung einer großen Nukleinsäurebibliothek mit hoher Diversität
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung Verfahren zur Herstellung einer großen Nukleinsäurebibliothek mit hoher Diversität bereit. Die Verfahren umfassen das Transfektieren mindestens einer Zelle (stärker bevorzugt einer Population an Zellen) mit mehr als einem Nukleinsäuremolekül pro Zelle (bevorzugt mehr als 2, stärker bevorzugt mehr als 10 und am stärksten bevorzugt mehr als 50 oder 500). Wenn ein infektiöses Teilchen verwendet wird, wird die Zelle (oder Population an Zellen) bevorzugt bei einer Infektionsmultiplizität von mehr als 1 infiziert (beispielsweise einer MOI größer als 5, stärker bevorzugt eine MOI größer als 20, und am stärksten bevorzugt einer MOI von etwa 200 oder mehr). In bevorzugten Ausführungsformen sind die Nukleinsäuremoleküle Mitglieder einer Bibliothek, in der jedes Nukleinsäuremolekül denselben (identischen) Replikationsursprung und/oder auswählbare Marker (beispielsweise antibiotische Resistenzgen(e)) und/oder regulatorische Sequenzen aufweist. Jedes der Nukleinsäuremoleküle enthält ebenso ein Substrat zur Rekombination, das sich in jedem Nukleinsäuremolekül unterscheidet.
Das Verfahren wird leicht durch den Bezug auf 1 verstanden. Für die Zwecke der Einfachheit wird die Rekombination zwischen nur zwei Phagemiden schematisch gezeigt, aber es ist klar, daß die Zahl von unterschiedlichen Vektoren, die eine Einzelzelle infizieren können, sehr hoch ist.
Die Substrate zur Rekombination werden zu einer einzelnen Vektorhauptkette geklont, um ein Phagemid zu bilden, das die Replikationsursprünge CoIE1 und Ff enthält. Auswählbare Marker (beispielsweise beta-Lactamase oder antibiotische Resistenzgen(e)) liegen gegebenenfalls vor. Zwei Phagemide, die die Gene für V_HA/V_LA bzw. V_HB/V_LB tragen, werden erzeugt. Nach der Rekombination werden 4 unterschiedliche Phagemide erhalten: die zwei Ausgangsphagemide (V_HA/_LA und V_HB/V_LB) und zwei neue Phagemide (V_HA/V_LB und V_HB/V_LA).
Wie bereits oben erwähnt, wird ein vereinfachtes Schema in 1 gezeigt. Tatsächlich kann eine einzelne Bakterienzelle durch eine hohe Anzahl an Vektoren infiziert werden. Daher wird in Beispiel 3 eine Einzelzelle durch bis zu 19 Phagemide infiziert. Diese führt zu einem rekombinatorischen Potential, das enorm ist. In Beispiel 3 kann eine Einzelzelle bis zu 361 (19 × 19) unterschiedliche Bibliotheksmitglieder enthalten. Ebenso könnte eine Zelle, die 50 Konstrukte enthält, nach der Rekombination bis zu 2500 unterschiedliche Bibliotheksmitglieder enthalten.
Die resultierenden Bibliotheksmitglieder können einer oder mehreren Runden an Screenen unterzogen werden, wodurch die Bibliothek für Populationsmitglieder, die bestimmte Eigenschaften exprimieren, angereichert wird. Diese angereicherte Bibliothek kann mit einer anderen Bibliothek vereinigt werden, um die Diversität der Bibliothek zu erhöhen, oder kann selbst einer anderen Runde der Rekombination in Wirtszellen unterzogen werden, wie oben beschrieben. Das Verfahren der Selektion und Rekombination der ausgewählten Bibliotheksmitglieder kann so oft, wie gewünscht, wiederholt werden, bis eine Bibliothek erhalten wird, die Mitglieder enthält, welche die gewünschten Eigenschaften zeigen.
Es wird angemerkt, daß es, wenn die Bibliotheksmitglieder verpackt werden können (beispielsweise in einem replizierbaren Anzeigenpaket), möglich ist, daß die so hergestellten Teilchen einen Genotyp aufweisen können, der aus dem Phänotyp des Pakets entkoppelt ist. Daher ist es beispielsweise, wenn die Bibliotheksmitglieder ein Substrat zur Rekombination enthalten, welches ein Protein auf der Oberfläche einer Phage (beispielsweise ein pIII-Hüllprotein) exprimiert, möglich, daß das Hüllprotein, in dem das Bibliotheksmitglied (die Nukleinsäure) gepackt ist, nicht das Hüllprotein ist, das durch die Nukleinsäure codiert wird, da die Zelle viele unterschiedliche Bibliotheksmitglieder enthält und die Paketmaschinerie „unabhängig" von der Nukleinsäuresequenz ist, die das Bibliotheksmitglied umfaßt. Mit anderen Worten, ist der Phänotyp (Hüllprotein) des Pakets aus dem Genotyp (Nukleinsäure) des Pakets entkoppelt.
Da die Bibliotheksmitglieder dieser Erfindung ohne weiteres für die Wiederverwendung in weiteren Runden der Rekombination/Selektion änderbar sind, können der Genotyp und Phänotyp des replizierbaren Anzeigepakets ohne weiteres wieder gekoppelt werden (wie beispielsweise in 6 dargestellt). Um dies zu erreichen, wird die Nukleinsäurebibliothek oder eine Fraktion davon verwendet, um Wirtszellen bei einer niedrigen MOI oder niedrigen Kopiezahl (d. h., Kopiezahl oder ein MOI von etwa 1) wieder zu transfektieren/wieder zu infizieren. Dies produziert eine zweite „abgeleitete" Bibliothek mit durchschnittlich einem Bibliotheksmitglied pro Zelle. In diesem Fall, wenn die Nukleinsäuremitglieder wieder verpackt werden, da es nur ein Bibliotheksmitglied (obwohl möglicherweise viele Kopien dieses einen Bibliotheksmitglieds) pro Zelle gibt, werden im wesentlichen alle der replizierbaren genetischen Pakethüllproteine (beispielsweise Phagemidhüllproteine), die nicht durch eine Helferzelle bereitgestellt werden, durch das Bibliotheksmitglied codiert. Wenn das Nukleinsäurebibliotheksmitglied verpackt wird, wird es in eine Proteinhülle gepackt, umfassend Proteine, die durch das Bibliotheksmitglied codiert werden. In diesem Fall wird der Phänotyp des replizierbaren Anzeigepakets durch die Nukleinsäure codiert, die innerhalb des Pakets enthalten ist. Mit anderen Worten werden der Genotyp und Phänotyp des Pakets verknüpft.
Die oben beschriebene Rekombination kann durch Nutzen der Nicht-Rekombinase-Rekombinationssysteme, die in der Zelle vorliegen, stattfinden, und in diesem Fall wird es als allgemeine Rekombination bezeichnet, oder kann an speziellen Stellen stattfinden (beispielsweise Rekombinase-vermittelt). Die Wirksamkeit der allgemeinen Rekombination kann erhöht werden unter Verwendung bakterieller Stämme, enthaltend bestimmte Mutationen, beispielsweise mutS oder recO98, oder mit physikalischen Behandlungen, beispielsweise UV-Behandlung, chemische Mutagenese usw.
Typischerweise findet die allgemeine Mutation mit viel geringerer Effizienz als die Rekombinase-vermittelte Rekombination statt. Daher ist es in bevorzugten Ausführungsformen, die die allgemeine Rekombination nutzen, oftmals wünschenswert, einen Selektionsschritt vorzusehen, um Rekombinanten vor dem anschließenden Screening- und/oder Rekombinationsschritt positiv auszuwählen. Verschiedene Selektionsstrategien sind dem Fachmann bekannt. Jedoch wird eine besonders bevorzugte Selektionsstrategie in Beispiel 4 und in 9 dargestellt. Kurz, ein oder mehrere selektierbare Marker werden mit den Segmenten verbunden, die rekombiniert werden sollen. Bevorzugt werden selektierbare Marker ausgewählt, die in Abwesenheit eines Rekombinationsvorgangs defekt sind. Wenn die Rekombination stattfindet, wird die selektierbare Eigenschaft der Marker wiederhergestellt und das rekombinierte Mitglied kann isoliert werden. Parallel wird in einem hohen Anteil an Fällen die Rekombination ebenso in Segmenten stattfinden, die rekombinieren sollen. Daher wird, wie in Beispiel 4 gezeigt, Wildtyp-beta-Lactamase, die normalerweise instabil ist, um signifikante Resistenz gegen antibiotisches Cefotaxim bereitzustellen, ein signifikanter Cefotaxim-Resistenzmarker, wenn Rekombinationsvorgänge stattfinden, wodurch ein effektiver Marker zur Selektion von Rekombinanten bereitgestellt wird.
Wenn die Rekombinase-vermittelte Rekombination genutzt wird, findet die Rekombination typischerweise an mindestens einer, stärker bevorzugt mindestens zwei oder mehreren Rekombinaseerkennungsstellen statt. Typischerweise werden die Rekombinaseerkennungsstellen in dem Nukleinsäurebibliotheksmitglied konstruiert, so daß sie eine oder mehrere Sequenzen flankieren, die Rekombinationssubstrate sind (d. h. Sequenen, die rekombinieren sollen). Daher werden beispielsweise in dem Fall einer Antikörper-Bibliothek die Rekombinaseerkennungsstellen so plaziert, daß sie eine oder mehrere Antikörperregionen flankieren (beispielsweise eine variable schwere Kette, eine variable leichte Kette usw.). Es ist möglich, viele unterschiedliche Rekombinaseerkennungsstellen in einem einzelnen Konstrukt bereitzustellen, und diese können Stellen für einen Typ an Rekombinase sein, und mehrere Rekombinasesysteme können verwendet werden.
Die Rekombinase-vermittelte Rekombination kann durch eine endogene Rekombinase in der Zelle und/oder durch eine exogene Rekombinase vermittelt werden. Die exogene Rekombinase kann ein exogenes Rekombinaseprotein sein, das an die Zellen abgegeben wird, aber in einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die exogene Rekombinase durch eine Nukleinsäure exprimiert, die in die Zelle transfektiert worden ist. Die Zelle kann ebenso eine Zelle sein, die modifiziert worden ist, um eine endogene Rekombinase in einem abnormal hohem Niveau zu exprimieren.
II. Konstrukte und Wirtszellen für die Erzeugung von vielfältigen Bibliotheken
A) Wirtszellen
So gut wie jede Zelle, die mit den Nukleinsäuremitgliedern der hierin beschriebenen Bibliotheken transfektiert oder infiziert werden kann oder die die Rekombination unterstützen kann (allgemeine oder Rekombinase-vermittelt), kann in dieser Erfindung verwendet werden. Eukaryotische Zellen, einschließlich Hefe-, Pflanzen-, Pilz-, Insekten- und Säugerzellen, können verwendet werden, sowie sowohl gramnegative als auch grampositive prokaryotische Zellen, die durch infektiöse Teilchen infiziert werden können, die normalerweise diese Zellen infizieren, oder konstruiert oder ausgewählt worden sind, diese Zellen zu infizieren. Die verwendeten Zellen können normal, mutiert, um höhere Niveaus der Rekombination zu induzieren, oder konstruiert sein, um spezifische Rekombinasen zu exprimieren, die an spezifischen Nukleinsäuresequenzen agieren können, die innerhalb der Nukleinsäuremoleküle, die in den infektiösen Teilchen enthalten sind, vorliegen. Besonders bevorzugte Zellen umfassen bakterielle Zellen (beispielsweise E. coli), Hefezellen und Säugerzellen.
B) Vektoren zur Verwendung in der Erfindung
Die Nukleinsäuremitglieder der hierin beschriebenen Bibliotheken können so gut wie in jeder geeigneten Form vorliegen, wobei die bevorzugten Formen Formen sind, die die Replikation und das Klonen erleichtern. Während daher in einigen Ausführungsformen die Nukleinsäurebibliotheksmitglieder einfach Rekombinationsstellen mit assoziierten Rekombinaseerkennungsstellen sein können, sind bevorzugte Nukleinsäurebibliotheksmitglieder Vektoren, einschließlich Plasmiden, Cosmiden und Phagemiden, filamentöse Phagen (M13, F1, fd, usw.) und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Obwohl nicht bevorzugt, können bestimmte Ausführungsformen, speziell die, die große Nukleinsäuresegmente nutzen, P1-Vektoren, YACs und BACs nutzen.
Daher, wie oben angegeben, ist die Verwendung der Erfindung nicht auf E. coli und Phagemide beschränkt. Für Verfahren, die infektiöse Vektoren nutzen, ist jedes infektiöse Teilchen, das in der Lage ist, eine Zelle zu infizieren, so daß mehrere Kopien (d. h., zwei oder mehrere) der Nukleinsäure in die Zelle eindringen können und Substrate zur Rekombination werden, geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein infektiöses Teilchen als ein Nukleinsäuremolekül betrachtet werden, das mit „Hüllmolekülen" (beispielsweise Proteinen) abgedeckt ist, wobei das Teilchen in die Zellen mit hoher Effizienz eindringen kann, beispielsweise aufgrund spezifischer Interaktionen zwischen den Hüllmolekülen und einem Rezeptor oder Marker auf der zellulären Oberfläche. Diese infektiösen Teilchen können natürlich vorkommen, konstruiert sein, um Rekombinationssubstrate zu enthalten, oder rekombinante infektiöse Teilchen sein, denen es an der notwendigen genetischen Information fehlt, sich selbst zu replizieren, aber in der Lage sind, speziell in Zellen einzudringen, und bevorzugt mit hoher Effizienz. Ein Phagemid ist ein Beispiel eines solchen infektiösen Teilchens.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Mitglieder der Nukleinsäurebibliotheken dieser Erfindung Nukleinsäuresequenzen (Domänen), die für im wesentlichen jedes Mitglied der Bibliothek identisch sind, und andere Sequenzen auf, die zwischen den Mitgliedern der Bibliothek variieren. Wenn gesagt wird, daß die Sequenzen für „jedes" Mitglied der Bibliothek identisch sind, ist zu erkennen, daß rekombinante DNA-Methodologien nicht perfekt sind und eine bestimmte Fraktion der Bibliothek fehlerhafte und/oder kontaminierende Mitglieder enthalten wird, in denen sich die „identischen" Sequenzen unterscheiden. Diese „abnormalen" Mitglieder werden bevorzugt mit geringer Häufigkeit auftreten, so daß typischerweise mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, und am stärksten bevorzugt mindestens 99% oder mindestens 99,9% der Mitglieder der Bibliothek identische Sequenzen aufweisen.
Die „identischen" Sequenzen sind typischerweise länger als ein Codon und weisen in bevorzugten Ausführungsformen mindestens 10, bevorzugt mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 50 angrenzende Nukleotide in der Länge auf. Die identischen Sequenzen umfassen typischerweise mindestens einen Replikationsursprung und/oder ein oder mehrere selektierbare Marker (beispielsweise ein Ampicillin-Resistenzgen). Andere Merkmale, die gegebenenfalls in den „identischen" Sequenzen vorliegen, umfassen einen Sekretions-Leader, Tags (beispielsweise SV5 und His), ein Gen oder cDNA, die einen Phagen codieren, oder bakterielles Hüllprotein (beispielsweise Gen 3), PCR-Primerstellen, Rekombinaseerkennungsstellen (beispielsweise loxP, loxP511 usw.), Vektor-"Hauptketten" und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfassen die „identischen" Sequenzen im wesentlichen jede andere Sequenz als die Sequenz(en), die rekombinieren soll(en), und die „identischen" Sequenzen sind bevorzugt Sequenzen desselben „Typs" an Molekül (beispielsweise Phage, Plasmid, Phagemid usw.). Daher können die „Bibliotheksmitglieder" als identische Konstrukte betrachtet werden, in die die „variablen" (Rekombinations)substrate inseriert werden.
Die "Rekombinationssubstrat"-Sequenzen werden zwischen den Mitgliedern der Bibliothek variieren. Es ist nicht notwendig, daß sich jedes Mitglied der Bibliothek von jedem anderen Mitglied der Bibliothek unterscheidet. Je größer und vielfältiger eine Bibliothek ist, je höher ist jedoch die Wahrscheinlichkeit, ein Molekül mit den gewünschten Eigenschaften zu selektieren. Man kann die Bibliothek auch so betrachten, daß sie durchschnittlich X Mitglieder hat, von denen y% unterschiedlich sind (beispielsweise wird eine Bibliothek mit 10¹² Mitgliedern, von denen 90% unterschiedlich sind, etwa 10¹¹ unterschiedliche Mitglieder enthalten) oder alternativ Messen der Bibliotheksgröße als Durchschnittszahl von unterschiedlichen Mitgliedern. Daher kann eine Bibliothek mit 10¹² physikalischen Mitgliedern, von denen 90% unterschiedlich sind, als eine Bibliothek mit etwa 10¹¹ Mitgliedern betrachtet werden.
Das Rekombinationssubstrat kann eine einzelne Sequenz oder zwei oder mehrere Sequenzen sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Rekombinationssubstrate mindestens zwei Sequenzen. Die Sequenzen können zusammenhängend sein oder können intervenierende Sequenzen enthalten (beispielsweise Linker und/oder Rekombinaseerkennungsstellen usw.).
Wie oben angegeben, können die „identischen" Sequenzen eine oder mehrere Rekombinaseerkennungsstellen umfassen. Es wird angemerkt, daß, wenn die Rekombination stattfindet (beispielsweise in dem Cre-lox-System), oftmals die Rekombinaseerkennungsstelle geschnitten wird und sich ein Teil der Stelle mit der entfernten Nukleinsäure bewegt. Die Stelle wird effektiv rekonstruiert, wenn das Fragment wieder in die Target-DNA inseriert wird, so daß die Rekombinaseerkennungsstelle effektiv unverändert bleibt und als „identisch" betrachtet wird.
Eine Zahl von geeigneten Rekombinationsstellen, einschließlich loxP, loxP-Mutanten und dergleichen, ohne darauf beschränkt zu sein, wird nachstehend beschrieben.
Das Rekombinationssubstrat kann ein oder mehrer Gene oder cDNAs, die ein oder mehrere Polypeptide codieren, umfassen, oder sie können Nukleinsäuresequenzen sein, die selbst biologische Aktivität aufweisen, wie Sequenzen, die an der genetischen Regulierung beteiligt sind, Sequenzen, die Ribozyme, DNA-Enzyme und dergleichen codieren.
Ein besonders bevorzugtes Bibliotheksmitglied wird durch den Vektor pDAN5 (Beispiel 2) veranschaulicht. Der Vektor pDAN5 besteht aus dem Replikationsursprung, der Ampicillinresistenz, einem Sekretions-Leader, den Tags (SV5 und His), gene3 und dem Ff-Replikationsursprung. In dem angegebenen Beispiel gibt es zwei „variable" Sequenzen, die eine V_H- bzw. eine V_L-Region eines Einkettenantikörpers codieren. Ein Linker, umfassend eine Rekombinaseerkennungsstelle (beispielsweise loxP), befindet sich zwischen den V_H- und V_L-Segmenten. Dieses Konstrukt ist nicht auf das spezielle V_H und V_L, dargestellt in dem Beispiel, beschränkt, sondern praktisch kann jedes andere V_H und/oder V_L ersetzt werden. Außerdem müssen Rekombinaseerkennungsstellen ein V_H oder V_L nicht einfach flankieren, sondern können statt dessen jedes gewünschte Antikörperfragments oder Kombination aus Fragmenten flankieren. Außerdem können mehrere Rekombinaseerkennungsstellen bereitgestellt werden, und sie können ausgewählt werden, um mit denselben oder mehreren unterschiedlichen Rekombinasen zu arbeiten.
Wie oben angegeben, sind in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen die Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek so gestaltet, daß sie eine Wirtszelle infizieren können. Typischerweise werden diese Nukleinsäuremitglieder in infektiöse Teilchen gepackt, und in diesen Fällen codiert die „identische" (nicht variierende) Komponente des Mitglieds bevorzugt eine oder mehrere Sequenzen, die für das Verpacken und/oder die Replikation und/oder das Überleben in der Zelle wesentlich sind. Die nicht variierenden Komponenten eines solchen Vektors können alle Nukleinsäuresequenzen bereitstellen, die für die Verpackungsreplikation und das Überleben in der Wirtszelle notwendig und ausreichend sind, oder sie können so ausgewählt werden, daß das Replikationsverpacken und das Überleben mit Hilfe eines Helferkonstrukts durchgeführt werden (beispielsweise eines Helferplasmids).
C) Anzeigebibliotheken
Die Mitglieder der Nukleinsäurebibliotheken dieser Erfindung können so gestaltet werden, daß, wenn sie in ein replizierbares genetisches Paket gepackt werden (beispielsweise Phage, Bakterien usw.), sie ein codiertes Protein auf der Oberfläche des Pakets anzeigen. Wenn das codierte Protein eines ist, das durch ein oder mehrere Rekombinationssubstrate codiert wird, stellt die Sammlung von Paketen ein günstiges System bereit, das die riesigen Zahlen von erhältlichen rekombinierten Sequenzen „anzeigt". Die angezeigten Proteine können einem oder mehreren Screening/Selektionsschritten unterliegen (beispielsweise hinsichtlich Bindungsspezifität/-avidität, katalytische Aktivität usw.) und ausgewählte Bibliotheksmitglieder können verwendet werden, um anschließende Bibliotheken für anschließende Runden der Anreicherung/Selektion zu erzeugen. Wie nachstehend erläutert, kann die „Anzeigebibliothek" monovalent oder polyvalent sein.
1) Monovalente Antikörperbibliotheken und Polypeptidbibliotheken
Die Fähigkeit, Polypeptid- und Antikörperfragmente auf der Oberfläche von Viren zu exprimieren, die Bakterien (Bakteriophage oder Phage) oder Bakterien (siehe beispielsweise Charbit, et al. (1988) Gene, 70 (1): 181–189) infizieren, macht es möglich, ein einzelnes bindendes Polypeptid- oder Antikörperfragment aus einer Bibliothek von mehr als 101 nicht-bindenden Klonen zu isolieren. Um Polypeptid- oder Antikörperfragmente auf der Oberfläche des Phagen (Phagenanzeige) zu exprimieren, wird ein Polypeptid- oder ein Antikörperfragmentgen in das Gen inseriert, das ein Phagenoberflächenprotein codiert (beispielsweise pIII), und das Antikörperfragment-pIII-Fusionsprotein wird auf der Phagenoberfläche angezeigt (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552–554; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133–4137). Da die Antikörperfragmente auf der Oberfläche des Phagen funktionell sind, kann ein Phage, der Antigenbindungspolypeptide oder Antikörperfragmente trägt, von dem nicht-bindenden Phagen durch Antigen-Affinitäts-Chromatographie getrennt werden (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552–554). In Abhängigkeit der Affinität des Antikörperfragments werden Anreicherungsfaktoren vom 20fachen bis 1.000.000fachen für eine einzelne Runde an Affinitätsselektion erhalten. Durch Infizieren von Bakterien mit der eluierten Phage kann jedoch mehr Phage gezüchtet werden und einer anderen Runde der Selektion unterliegen. In dieser Weise kann eine Anreicherung vom 100fachen in einer Runde das 1.000.000fache in zwei Runden der Selektion werden (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552–554). Selbst wenn daher die Anreicherungen niedrig sind (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581–597) können mehrere Runden der Affinitätsselektion zur Isolierung des seltenen Phagen führen. Da die Selektion der Phagen-Antikörper-Bibliothek im Hinblick auf Antigen zur Anreicherung führt, bindet die Mehrheit der Klone das Antigen nach vier Runden der Selektion. Daher muß nur eine relativ kleine Anzahl an Klonen (mehrere Hundert) hinsichtlich des Bindens an das Antigen analysiert werden. Typischerweise sind diese Phagen-Anzeigebibliotheken, wenn sie verwendet werden, um Antikörper anzuzeigen, monovalent, wobei sie einen einzelnen Antikörper auf ihrer Oberfläche von jedem Bibliotheksmitglied anzeigen.
2) Polyvalente Antikörperbibliotheken
Im Gegensatz zu mehrwertig angezeigten Peptidphagenbibliotheken zeigen Phagenantikörperbibliotheken typischerweise monomere einkettige Fv- (scFv) oder Fab-Antikörperfragmente, fusioniert mit pIII, als Einzelkopien auf der Phagenoberfläche unter Verwendung eines Phagemidsystems an (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581–597; Sheets et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6157–6162). Wie hierin verwendet, bezieht sich eine polyvalente Phagenanzeige-Antikörper-Bibliothek auf eine Bibliothek, in der jedes Mitglied (beispielsweise Phagenteilchen) durchschnittlich zwei oder mehrere Bindungsdomänen anzeigt, wobei jede Bindungsdomäne eine variable Region einer schweren und einer leichten Kette umfaßt. Im allgemeineren zeigt eine mehrwertige Phagenanzeigebibliothek durchschnittlich zwei oder mehr pIII-Fusionen pro Phagenteilchen an. Eine polyvalente Phagenanzeige kann durch Exprimieren von Diakörpern (d. h., einem Protein, gebildet durch Fusion oder Konjugation von zwei Einkettenantikörpern (beispielsweise scFv)) oder durch Anzeige von durchschnittlich zwei oder mehreren Antikörpern auf jedem Phagenteilchen erreicht werden. Im Gegensatz dazu zeigt eine einwertige Bibliothek durchschnittlich einen Einkettenantikörper pro Virusteilchen an.
i) Diakörperexpression
Diakörper sind scFv-Dimere, bei denen jede Kette aus variablen Domänen schwerer (V_H) und leichter Ketten (V_L) besteht, die unter Verwendung eines Linkers (beispielsweise eines Peptidlinkers) verbunden sind, der zu kurz ist, um die Paarbildung zwischen den Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen. Folglich tritt die Paarbildung zwischen komplementären Domänen von zwei unterschiedlichen Ketten auf, was ein stabiles nicht-kovalentes Dimer mit zwei Bindungsstellen erzeugt (Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6444–6448).
In einem Ansatz werden speziell Diakörpergene zur Expression als pIII-Fusionen in dem Phagemid subkloniert (siehe beispielsweise Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133–4137). Dies ergibt ein Phagemid, das überwiegend eine einzelne scFv- oder Diakörper-pIII-Fusion nach der Befreiung mit Helferphage exprimiert (Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007–16010). Ein Diakörperphagemid zeigt ein bivalentes Antikörperfragment an, das aus der intermolekularen Paarbildung von einem scFv-pIII-Fusionsmolekül und einem nativen scFv-Molekül resultiert. Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Lehren kann ein Fachmann routinemäßig andere Diakörper herstellen.
ii) Polyvalente Anzeige von Einkettenantikörpern
Als eine Alternative zu der Verwendung von Diakörpern werden Antikörperphagenanzeigebibliotheken erzeugt, in denen jedes Virusteilchen durchschnittlich mindestens 2, bevorzugt mindestens 3, stärker bevorzugt mindestens 4 und am stärksten bevorzugt mindestens 5 Kopien eines Einkettenantikörpers exprimiert.
Im Prinzip sollte jede Kopie von pIII auf der Phage (und es ist kontrovers, ob 3 oder 5 Kopien von pIII pro Phage vorliegen) einen Antikörper exprimieren. Jedoch findet die Proteolyse statt und die tatsächlich angezeigte Zahl ist typischerweise geringer. Daher werden bevorzugte mehrwertige Antikörperbibliotheken in einem Phagenvektor und nicht in einem Phagemidvektor konstruiert. Dies bedeutet, daß der Helferphage nicht hinzugefügt werden muß, um die Phage herzustellen. Der Helferphage, der in den E. coli-Wildtyp-pIII eingebracht ist, konkurriert mit der scFv-pIII-Fusion. Daher hinterläßt in dem Phagemidvektor diese Konkurrenz durchschnittlich nur 1 (oder weniger) Antikörper pro Phage.
Um mehrwertige Antikörperbibliotheken zu produzieren, werden die Einkettenantikörper, die typischerweise in Phagemid exprimiert werden, aus dem Phagemidvektor in einen Phagenvektor subkloniert. Kein Helferphage ist erforderlich, und es gibt keine Konkurrenz zwischen dem Wildtyp-pIII und der Fusion scFv pIII. Daher zeigt der Phage durchschnittlich zwei oder mehrere pIII-Fusionen.
IV. Rekombinasesysteme zur Verwendung in dieser Erfindung
A) Verschiedene Rekombinasen
In der vorliegenden Erfindung wird der Austausch der Nukleinsäuresegmente durch die Verwendung von Rekombinationsproteinen erreicht, einschließlich Rekombinasen und damit verbundenen Cofaktoren und Proteinen. Verschiedene Rekombinationsproteine werden in der Technik beschrieben. Beispiele von diesen Rekombinasen umfassen die Cre-Familie, die Integrase-Familie und die Resolvase-Familie, sind aber nicht darauf beschränkt.
Cre, ein Protein aus Bakteriophage P1 (Abremski and Hoess (1984) J. Biol. Chem. 259 (3): 1509–1514) katalysiert den Austausch (d. h., verursacht Rekombination) zwischen 34 bp DNA-Sequenzen, genannt loxP (Ort des Crossover) Stellen (siehe beispielsweise Hoess et al, (1986) Nucl. Acids Res. 14 (5): 2287). Cre ist kommerziell erhältlich (Novagen, Katalog Nr. 69247-1).
Rekombination, vermittelt durch Cre, ist leicht umkehrbar. Cre arbeitet in einfachen Puffern mit entweder Magnesium oder Spermidin als Cofaktor, wie in der Technik allgemein bekannt. Die DNA-Substrate können entweder linear oder supergeknäult sein. Eine Anzahl von mutanten loxP-Stellen ist beschrieben worden (Hoess et al., a.a.O.). Eine von diesen, loxP 511, rekombiniert mit einer anderen loxP-511-Stelle, aber wird nicht mit einer loxP-Stelle rekombinieren.
Integrase ist ein Protein aus dem lambda-Bakteriophagen, die die Integration des lambda-Genoms in das E. coli-Chromosom vermittelt. Die lambda-Bakteriophagen-Int-Rekombinationsproteine beschleunigen die irreversible Rekombination zwischen ihren Substrat-att-Stellen als Teil der Bildung oder Induktion eines lysogenen Zustandes. Reversibilität der Rekombinationsreaktionen resultiert aus zwei unterschiedlichen Wegen für integrative und exzisive Rekombination. Jeder Weg nutzt eine einzigartige, aber überlappende Gruppe der 15 Proteinbindungsstellen, die att-Stellen-DNAs umfassen. Cooperative und konkurrierende Interaktionen, die vier Proteine (Int, Xis, IHF und FIS) umfassen, bestimmen die Richtung der Rekombination.
Die integrative Rekombination umfaßt die Int- und IHF-Proteine und Stellen attP (240 bp) und attB (25 bp). Die Rekombination führt zur Bildung von zwei neuen Stellen: attL und attR. Exzisive Rekombination erfordert Int, IHF und Xis und Stellen attL und attR, um attP und aftB zu erzeugen. Unter bestimmten Bedingungen stimuliert FIS die exzisive Rekombination. Zusätzlich zu diesen normalen Reaktionen sollte angemerkt werden, daß attP und attB, wenn sie auf demselben Molekül plaziert sind, die exzisive Rekombination beschleunigen können, um zwei Exzisionsprodukte zu erzeugen, eines mit attL und eines mit attR.
Ebenso kann die intermolekulare Rekombination zwischen Molekülen, enthaltend attL und attR, in Gegenwart von Int, IHF und Xis zur integrativen Rekombination und der Erzeugung von attP und attB führen. Daher kann man durch Flankieren von DNA-Segmenten mit entsprechenden Kombinationen von konstruierten att-Stellen in Gegenwart von entsprechenden Rekombinationsproteinen die exzisive oder integrative Rekombination als Umkehrreaktionen voneinander steuern.
Jede der att-Stellen enthält eine Kernsequenz mit 15 bp; einzelne Sequenzelemente von funktioneller Signifikanz liegen innerhalb, außerhalb und über den Grenzen dieses gemeinsamen Kerns (Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913). Die effiziente Rekombination zwischen den verschiedenen att-Stellen erfordert, daß die Sequenz der zentralen gemeinsamen Region zwischen den rekombinierenden Partnern identisch ist, jedoch ist nun festgestellt worden, daß die exakte Sequenz modifizierbar ist. Folglich wurde nun entdeckt, daß Derivate der att-Stellen mit Veränderungen in dem Kern mindestens so effizient wie die nativen Kernsequenzen rekombinieren.
Integrase fungiert so, daß die attP-Stelle auf lambda-Bakteriophage (etwa 240 bp) mit der attB-Stelle auf dem E. coli-Genom (etwa 25 bp) rekombiniert (Weisberg und Landy (1983) In Lambda II, S. 211, Cold Spring Harbor Laboratory), um das integrierte lambda-Genom, flankiert durch attL- (etwa 100 bp) und attR-Stellen (etwa 160 bp), zu produzieren. In Abwesenheit von Xis (siehe nachstehend) ist diese Reaktion im wesentlichen irreversible. Die Integrationsreaktion, vermittelt durch Integrase und IHF, arbeitet in vitro mit einfachem Puffer, der Spermidin enthält. Integrase kann erhalten werden, wie von Nash (1983) Meth. Enzym., 100: 210–216 beschrieben. IHF kann erhalten werden, wie von Filutowicz et al. (1994) Gene 147: 149–150 beschrieben.
In Gegenwart des lambda-Proteins Xis (exsisiv) katalysiert Integrase die Reaktion von attR und attL unter Bildung von attP und attB, d. h., es beschleunigt die Unmkehrung der oben beschriebenen Reaktion. Diese Reaktion kann ebenso in der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Zahlreiche Rekombinationssysteme aus verschiedenen Organismen können ebenso verwendet werden, basierend auf den hierin bereitgestellten Lehren und Anleitungen (siehe beispielswei se Hoess et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 (6): 2287; Abremski et al. (1986) J. Biol. Chem. 261 (1): 391; Campbell (1992) Bacteriol. 174 (23): 7495; Qian et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (11): 7794; Araki et al. (1992) J. Mol. Biol. 225 (1): 25). Viele von diesen gehören zu der Integrase-Familie von Rekombinasen (Argos et al. (1986) EMBO J. 5: 433–440). Wie oben angegeben, sind die vielleicht am besten studierten das Integrase/att-System aus lambda-Bakteriophage (Landy (1993) Current Opinions in Genetics and Devel. 3: 699–707), das Cre/loxP-System aus P1-Bakteriophage (Hoess und Abremski (1990) In Nucleic Acids and Molecular Biology Bd. 4. Hrsg.: Eckstein und Lilley, Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag; S. 90–109) und das FLP/FRT-System aus Saccharomyces cerevsiae 2 mu circuläres Plasmid (Broach et al. (1982) Cell 29: 227–234).
Mitglieder einer zweiten Familie von ortsspezifischen Rekombinasen, die Resolvase-Familie (beispielsweise gamma delta, Tn3-Resolvase, Hin, Gin und Cin) sind ebenso bekannt und zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet. Obwohl Mitglieder von dieser stark verwandten Familie von Rekombinasen typischerweise auf intramolekulare Reaktionen beschränkt sind (beispielsweise Inversionen und Exzisionen) und Wirts-kodierte Faktoren erfordern können, sind Mutanten isoliert worden, die einigen der Erfordernissen für Wirtsfaktoren (Maeser und Kahnmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170–176) sowie einigen der Beschränkungen der intramolekularen Rekombination nicht unterliegen.
Andere ortsspezifische Rekombinasen, ähnlich lambda Int und ähnlich P1Cre, können Int und Cre ersetzen. Diese Rekombinasen sind bekannt. In vielen Fällen ist die Reinigung von diesen anderen Rekombinasen in der Technik beschrieben worden. In Fällen, wo sie nicht bekannt sind, können Zellextrakte verwendet werden, oder die Enzyme können teilweise unter Verwendung der für Cre und Int beschriebenen Verfahrensweisen gereinigt werden.
Während Cre und Int ausführlich hinsichtlich der Beispiele beschrieben werden, existieren viele der verwandten Rekombinasesysteme, und ihre Anwendung auf die beschriebene Erfindung wird ebenso gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Wie oben angegeben, kann die Integrase-Familie von ortsspezifischen Rekombinasen verwendet werden, um alternative Rekombinationsproteine und Rekombinationsstellen für die vorliegende Erfindung bereitzustellen, da ortsspezifische Rekombinationsproteine durch die Bakteriophagen lambda, phi 80, P22, P2, 186, P4 und PI kodiert werden. Obwohl die Gruppe an Proteinen eine uner wartet große Diversität von Sequenzen aufweist, können alle diese Rekombinasen in ihren C-terminalen Hälften angeordnet werden, und dies stellt ein Mittel zum Identifizieren neuer Rekombinasen bereit.
Eine Region mit 40 Resten nahe des C-Terminus wird in all den Proteinen besonders gut konserviert und ist zu einer Region nahe dem C-Terminus des Hefe 2 mu Plasmid-Flp-Proteins homolog. Drei Positionen werden perfekt innerhalb dieser Familie konserviert: Histidin, Arginin und Tyrosin werden an den jeweiligen Anordnungspositionen 396, 399 und 433 innerhalb der gut konservierten C-terminalen Region gefunden. Diese Reste tragen zu der aktiven Stelle dieser Familie von Rekombinasen bei, und lassen darauf schließen, daß Tyrosin-433 eine unbeständige kovalente Verknüpfung mit DNA während der Strangspaltung und Wiedervereinigung bildet (siehe beispielsweise Argos et al. (1986) EMBO J. 5: 433–40).
Alternativ könnten transponible Elemente von IS231 und anderen Bacillus thuringiensis als Rekombinationsproteine und Rekombinationsstellen verwendet werden. Bacillus thuringiensis ist ein entomopathogenes Bakterium, dessen Toxizität auf der Gegenwart von delta-Endotoxin-Kristallen in den Sporangien beruht, die gegen landwirtschaftliche Schädlinge und Vektoren von menschlichen und tierischen Krankheiten wirksam sind. Die meisten der Gene, die für diese Toxinproteine kodieren, sind Plasmid-getragen und sind im allgemeinen mit Insertionssequenzen (IS231, IS232, IS240, ISBT1 und ISBT2) und Transposonen (Tn4430 und Tn5401) strukturell verbunden. Es ist gezeigt worden, daß mehrere dieser mobilen Elemente aktiv sind und an der Kristallgenmobilität beteiligt sind, wodurch sie zu der Variation von bakterieller Toxizität beitragen.
Eine Strukturanalyse der iso-IS231-Elemente zeigt, daß sie mit IS1151 aus Clostridium perfringens verwandt sind und daß sie entfernt mit IS4 und IS186 aus Escherichia coli verwandt sind. Wie die anderen IS4-Familienmitglieder enthalten sie ein konserviertes Transposase-Integrase-Motiv, das in anderen IS-Familien und Retroviren gefunden wird.
Außerdem zeigen die funktionellen Daten, die aus IS231A in Escherichia coli gewonnen wurden, eine nicht-replikative Transpositionsweise, mit einem Vorzug für spezifische Targets. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Bacillus subtilis und B. thuringiensis erhalten (sie he beispielsweise Mahillon et al., (1994) Genetica 93: 13–26; Campbell (1992) J. Bacteriol. 7495–7499.
In einer bevorzugten Ausführungsform nutzt die Erfindung Cre/Lox-getriebene Rekombination. Bevorzugt werden die loxP- und loxP511-Stellen als Lox-Stellen eingesetzt. Verschiedene Mutationen dieser Sequenz sind ebenso geeignet, wie in der Literatur beschrieben worden ist (siehe beispielsweise Mack et al., a.a.O.; Hoess et al. (1986), a.a.O.; Hoess et al. (1984) Biochem, 81: 1026–29; Hoess et al. (1985) Gene, 40: 325–329; Abremski et al. (1986) J. Biolog. Chem., 261: 391–396). Ähnliche mutierte Sequenzen von loxP, die noch isoliert werden müssen, können ebenso eingesetzt werden, so lange wie diese Sequenzen als rekombinierende Stellen für Cre dienen können.
Intrazellulär exprimierte Rekombinase liegt typischerweise in ausreichender Konzentration, um die Rekombinationen in den erfindungsgemäßen Verfahren ausreichend anzutreiben. Wenn ein exogenes Rekombinaseprotein zugeführt wird, kann die Menge an Rekombinase, die die Rekombinationsreaktion antreibt, unter Verwendung bekannter Assays bestimmt werden. Speziell kann ein Titrationsassay verwendet werden, um die entsprechende Menge eines gereinigten Rekombinaseenzyms oder die entsprechende Menge eines Extraktes zu bestimmen.
B) Konstruieren/Modifizieren von Rekombinationsstellen
Die obigen Rekombinasen und entsprechenden Rekombinasestellen sind zur Verwendung beim Erzeugen vielfältiger Bibliotheken gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Jedoch enthaltend Wildtyp-Rekombinationsstellen oftmals Sequenzen, die die Wirksamkeit oder Spezifität von Rekombinationsreaktionen verringern. Beispielsweise können mehrere Stoppcodone in attB-, attR-, attP-, attL- und loxP-Rekombinationsstellen in mehreren Leserahmen auf beiden Strängen auftreten, so daß die Rekombinationseffizienz verringert, beispielsweise wenn die kodierende Sequenz die Rekombinationsstellen kreuzen muß (nur ein Leserahmen ist auf jedem Strang von loxP- und attB-Stellen verfügbar), oder unmöglich (in attP, attR oder attL) wird.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ebenso konstruierte Rekombinationsstellen bereit, die diese Probleme überwinden. Beispielsweise können att-Stellen konstruiert werden, um ein oder mehrere Mutationen zu haben, um die Spezifität und Effizienz der Rekombinationsreaktion und der Eigenschaften der Produkt-DNAs zu verbessern (beispielsweise att1-, att2- und att3-Stellen); um die Umkehrreaktion zu verringern (beispielsweise Entfernen von PI und HI aus attB). Der Test dieser Mutanten bestimmt, welche Mutanten ausreichende Rekombinationsaktivität ergeben, die für die Rekombination gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sein soll.
Mutationen können in Rekombinationsstellen zur Verbesserung der ortsspezifischen Rekombination eingeführt werden. Diese Mutationen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: Rekombinationsstellen ohne Translationsstoppcodone, die die Kodierung von Fusionsproteinen ermöglichen; Rekombinationsstellen, erkannt durch dieselben Proteine, aber unterschiedlich in der Grundsequenz, so daß sie größtenteils oder ausschließlich mit ihren homologen Partnern reagieren, was mehrere Reaktionen ermöglicht, die in Betracht gezogen werden sollen. Welche speziellen Reaktionen stattfinden, kann durch die speziellen Partner spezifiziert werden, die in dem Reaktionsgemisch vorliegen.
Es gibt allgemein bekannte Verfahrensweisen zur Einführung spezifischer Mutationen in Nukleinsäuresequenzen. Eine Vielzahl von diesen werden in Ausubel et al. (1989–1996) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, beschrieben. Mutationen können in Oligonukleotiden, die verwendet werden können, um existierende geklonte Sequenzen zu modifizieren, oder in Amplifikationsreaktionen konstruiert werden. Zufallsmutagenese kann ebenso eingesetzt werden, wenn entsprechende Selektionsverfahren verfügbar sind, um die gewünschte mutierte DNA oder RNA zu isolieren. Die Gegenwart von diesen gewünschten Mutationen kann durch Sequenzieren der Nukleinsäure durch allgemein bekannte Verfahren bestätigt werden.
Eine Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um eine Kernregion einer gegebenen Rekombinationsstelle zu konstruieren, um mutierte Stellen bereitzustellen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Diese umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die Mutation der gewünschten Kernsequenz (beispielsweise über ortsspezifische Mutagenese, fehlerauslösende PCR, chemische Mutagenese usw.) oder durch Rekombination von zwei Eltern-DNA-Sequenzen durch ostsspezifische (beispielsweise attL und attR, um attB zu erhalten) oder andere (beispielsweise homologe) Rekombinationmechanismen.
Die Funktionalität der mutanten Rekombinationsstellen kann in Wegen dargestellt werden, die von den speziellen Merkmalen, die gewünscht sind, abhängen. Beispielsweise kann der Mangel an Translationsstoppcodonen in einer Rekombinationsstelle durch Exprimieren der entsprechenden Fusionsproteine gezeigt werden. Die Spezifität der Rekombination zwischen homologen Partnern kann beispielsweise durch Einführen der entsprechenden Moleküle in in-vitro-Reaktionen und Analysieren der Rekombinationsprodukte, wie hierin beschrieben oder in der Technik bekannt, gezeigt werden. Andere gewünschte Mutationen in Rekombinationsstellen können die Gegenwart oder Abwesenheit von Restriktionsstellen, Translations- oder Transkriptionsstartsignalen, Proteinbindungsstellen und anderen bekannten Funktionalitäten von Nukleinsäuregrundsequenzen umfassen. Genetische Selektionsschemen für spezielle funktionelle Attribute in den Rekombinationsstellen können gemäß den bekannten Verfahrensschritten verwendet werden. Beispielsweise kann die Modifikation von Stellen, um (aus einem Paar von Stellen, die nicht interagieren) Partner bereitzustellen, die interagieren, durch Erzwingen der Deletion, über Rekombination zwischen den Stellen, einer DNA-Sequenz, die eine toxische Substanz kodiert, erreicht werden. Ebenso kann die Selektion hinsichtlich Stellen, die Translationsstoppsequenzen entfernen, die Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinbindungsstellen usw. leicht durch den Fachmann ersonnen werden.
V. Selektion von Molekülen, die rekombiniert (gemischt) werden sollen
So gut wie jede Nukleinsäure oder jedes Molekül, das durch eine Nukleinsäure kodiert ist, kann rekombiniert („gemischt") werden und gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren selektiert werden. Es wird angemerkt, daß die Nukleinsäuren Deoxyribonukleinsäuren, Ribonukleinsäuren und in einigen Fällen Peptidnukleinsäuren umfassen. Die Nukleinsäuren können genomische DNAs (gDNAs), CDNAs, mRNAs, umkehrtranskribierte cDNAs, Amplifikationsprodukte und dergleichen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Ebenso umfassen die Polypeptide natürliche und nicht-natürliche Polypeptide.
Moleküle, die der Rekombination und/oder anschließenden Selektion gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren unterliegen, umfassen Polypeptidliganden (beispielsweise normale und/oder modifizierte Interleukine, Wachstumsfaktoren und dergleichen), Enzyme, Rezeptorproteine, Zelloberflächenmarker und/oder Antigene, Antikörper und/oder Antikörperfragmente, Nukleinsäuren, die katalytische RNAs (beispielsweise Ribozyme) kodieren, katalytische DNAs, DNA-Bindungsstellen (beispielsweise Transkriptionsfaktor- und/oder Rekombinasebindungsstellen) und andere regulatorische Elemente (beispielsweise Promotoren, Enhancer, Signale usw.), sind aber nicht darauf beschränkt. Einzelne „funktionelle" Elemente können in einem einzigen Experiment rekombiniert werden, oder verwandte Gruppen von Elementen (beispielsweise Gruppen von Promotoren und Enhancern in einem Stoffwechselweg (beispielsweise einer Polyketidsynthase)) können in einem einzigen Rekombinationsschritt rekombiniert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, um Antikörperfragmente zu rekombinieren, um Antikörper mit speziellen Bindungsspezifitäten und/oder -aviditäten zu erzeugen. Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um VH- und VL-Regionen oder Fragmente davon zu rekombinieren. In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Rekombination zwischen zwei oder mehreren Elementen, einschließlich V_H, V_L, V_H CDR1, V_H CDR2, V_H CDR3, V_L CDR1, V_L CDR2, V_L CDR3, einzelne Ketten eines Fab-Fragments (beispielsweise V_H+C_H1 und V_L+C_L), V_H-Dimeren, V_L-Dimeren und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Wiederum können, wie oben angegeben, mehrere Rekombinationsvorgänge gleichzeitig stattfinden. Daher können beispielsweise V_H CDR1 und V_L CDR3 beide in demselben Experiment rekombiniert werden.
Antikörperbibliotheken zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren können durch Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind (siehe beispielsweise Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581–597). In einer Ausführungsform umfassen diese Verfahren das Isolieren natürlicher V_H- und V_L-Repertoires, die in den Zellen vorliegen (beispielsweise menschliche periphere Blutlymphozyten) durch PCR. Die V-Genrepertoires werden zusammen zufällig unter Verwendung von PCR gespleißt, um ein scFv-Genrepertoire zu erzeugen, das in einen Vektor (beispielsweise einen Phagenvektor) geklont wird, um eine große Bibliothek von Phagenantikörpern (Id.) zu erzeugen.
Nukleinsäuren (beispielsweise kodierende Liganden, Antigene, Rezeptoren usw.) können unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt oder chemisch synthetisiert werden gemäß den Standardverfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind (siehe beispielsweise Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2. Aufl., Bd. 1–3), Cold Spring Harbor Laboratory, Berger & Kimel (1987) Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, San Diego, Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, usw.).
Die verschiedenen oben beschriebenen Moleküle und andere werden der Rekombination und Selektion unterzogen, um neue Moleküle mit neuen und/oder veränderten Eigenschaften bereitzustellen, wie nachstehend beschrieben.
VI. Screening rekombinierter Polypeptide
Die Proteine und/oder Nukleinsäuren, die gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren rekombiniert wurden, können hinsichtlich einer oder mehrerer Eigenschaften gescreent werden. Diese Bibliotheksmitglieder, die die Screening-Kriterien erfüllen, können dann selbst für weitere Runden der Rekombination und Selektion verwendet werden, oder können verwendet werden, um eine andere Bibliothek für weitere Runden der Rekombination und Selektion anzureichern.
Die Bibliotheksmitglieder können für so gut wie jede Eigenschaft oder Aktivität gescreent werden. Daher können beispielsweise Nukleinsäuremitglieder hinsichtlich der Fähigkeit, mit speziellen Targetsequenzen unter vorausgewählten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, gescreent werden, oder sie können hinsichtlich katalytischer (beispielsweise RNAase-Aktivität) gescreent werden, oder sie können hinsichtlich veränderter regulatorischer Aktivität (beispielsweise Reaktion auf spezielle Promotoren, spezielle Gewebespezifität usw.) und dergleichen gescreent werden. Ebenso können Proteine hinsichtlich der Fähigkeit, spezifisch an ein spezielles Target (beispielsweise Targetprotein, Rezeptor, Glykoprotein, Fett usw.) bei einer ausgewählten minimalen Aviditiät zu binden, oder hinsichtlich der Fähigkeit, eine spezielle chemische Reaktion unter bestimmten Bedingungen (beispielsweise bei einer speziellen Temperatur, oder pH, oder in speziellen Lösungsmitteln (beispielsweise organische Lösungsmittel usw.) oder unter Reduktions- oder Oxidationsbedingungen oder in Gegenwart von Proteasen usw.) zu katalysieren, hinsichtlich der Stabilität unter speziellen Bedingungen (beispielsweise in Gegenwart von bestimmten Denaturierungsmitteln, bei speziellem pH, oder extremer Temperatur usw.) gescreent werden.
Daher kann beispielsweise in dem Fall von Antikörpern oder Bindungsproteinen die Bindungsspezifität und/oder -avidität in einem BiaCore, einem Biosensor, basierend auf der Oberflächenplasmonresonanz, bestimmt werden. Für diese Technik wird der Target (beispielsweise Antigen, Rezeptor usw.) mit einem derivatisierten Sensorchip, der Veränderungen in der Masse detektieren kann, verknüpft. Wenn die Bibliotheksmitglieder über den Sensorchip geführt werden, binden einige Bibliotheksmitglieder an den immobilisierten Target, was zur Erhöhung der Masse führt, die quantifizierbar ist. Die Messung der Assoziationsgeschwindigkeit als eine Funktion der Konzentration des speziellen Mitglieds kann verwendet werden, um die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (k_on) zu berechnen. Nach der Assoziationsphase wird Puffer über den Chip geführt und die Dissoziationsgeschwindigkeit des Antikörpers (k_off) bestimmt. In bestimmten Ausführungsformen wird K_on typischerweise in dem Bereich von 1,0 × 10² bis 5,0 × 10⁶ und k_off in dem Bereich von 1,0 × 10^–1 bis 1,0 × 10^–6 gemessen. Die Gleichgewichtskonstante K_d wird oftmals als k_off/k_on berechnet und wird daher typischerweise in dem Bereich von 10^–5 bis 10^–12 gemessen. Affinitäten, die in dieser Weise gemessen werden, stimmen gut mit den Affinitäten überein, die in Lösung durch Fluoreszenzquenchtitration gemessen wurden.
Katalytische oder Enzymaktivitäten können durch Bereitstellen eines entsprechenden Substrats und Puffersystems und Bestimmen der Reaktionsgeschwindigkeit gemessen werden (beispielsweise durch Überwachen der Verlustgeschwindigkeit von Ausgangsmaterial oder der Produktionsgeschwindigkeit des Reaktionsproduktes). Daher kann beispielsweise die Aktivität einer Protease, rekombiniert gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren, durch Bereitstellen eines entsprechenden Polypeptidsubstrats, das Fluoreszenzmoleküle trägt, die einander quenchen, bestimmt. Dann spaltet/spalten das/die Bibliotheksmitglieder) das Substrat, die Fluoreszenzmoleküle werden abgetrennt, beenden das Quenchen voneinander, und ein Fluoreszenzsignal ist detektierbar (siehe beispielsweise US-Patent 5,714,342). Ähnliche Messungen können hinsichtlich der RNA- oder DNA-katalytische Aktivität durchgeführt werden.
Die Aktivität von Elementen, die die Genexpression steuern, kann unter Verwendung von Reportergenen (d. h. Gene oder cDNAs, die ein detektierbares Produkt kodieren, beispielsweise β-Galactosidase, grünes Fluoreszenzprotein usw.), betriebsbereits verknüpft mit den Elementen, analysiert werden. Das Überwachen des Expressionsniveaus der Reportergen(e) unter speziellen Umständen (beispielsweise in einem speziellen Gewebe oder einer speziellen Zelle, in Gegenwart eines speziellen Inducers usw.) stellt ein Maß der Aktivität der Kontrollelemente bereit.
Es wird angemerkt, daß diese Liste von möglichen Screeningkriterien und Assays illustrativ ist und nicht einschränkend sein soll. Der spezielle entsprechende Assay wird durch die Beschaffenheit des Bibliotheksmitglieds und die Aktivität oder Eigenschaft, die wünschenswerterweise bewertet werden soll, bestimmt werden. Assays für im wesentlichen jede enzymatische oder katalytische Aktivität, physikalische oder chemische Eigenschaft oder Bindungsspezifität und/oder -avidität sind dem Fachmann bekannt und können allenfalls mit Routineexperimenten durchgeführt werden.
Obwohl das Screening der Bibliotheken dieser Erfindung manuell durchgeführt werden kann, ist zu erkennen, daß viele von diesen Assays stark automatisiert werden können. Tatsächlich ist es üblich, große kombinatorische Bibliotheken nun unter Verwendung von „Hochdurchsatz"-Techniken zu screenen, die mehrere hunderttausend Assays ermöglichen, die in nur einer Woche durchgeführt werden sollen. Hochdurchsatzassays für die Gegenwart, Abwesenheit oder Quantifizierung von speziellen Nukleinsäuren oder Proteinprodukten sind dem Fachmann allgemein bekannt. Ebenso sind Bindungsassays und Assays für spezielle chemische Aktivitäten ebenso allgemein bekannt. Daher offenbart beispielsweise US-Patent 5,559,410 Hochdurchsatzscreeningverfahren für Proteine und US-Patent 5,585,639 Hochdurchsatzscreeningverfahren für die Nukleinsäurebindung (d. h., unter Verwendung von High-Density-Anordnungen), während US-Patente 5,576,220 und 5,541,061 Hochdurchsatzverfahren zum Screenen für die Ligand/Antikörper-Bindung offenbaren.
Hochdurchsatzscreeningsysteme können für spezielle Assays von Interesse kundenspezifisch konstruiert werden. Alternativ kann eine Vielzahl von allgemeinen Hochdurchsatzsystemen für eine breite Vielzahl von Assays angepaßt werden. Hochdurchsatzscreeningsysteme sind kommerziell erhältlich (siehe beispielsweise Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, usw.). Diese Systeme automatisieren typischerweise die gesamten Verfahren, einschließlich der gesamten Proben- und Reagenzienpipettierung, Flüssigkeitsdispensierung, zeitlich abgestimmte Inkubationen und schließlich Ablesungen der Mikroplatte in Detektor(en), der/die für den Assay geeignet ist/sind. Diese konfigurierbaren Systeme stellen hohen Durchsatz und schnellen Start sowie hohen Grad an Flexibilität und kundenspezifische Anpassung bereit. Die Hersteller von solchen Systemen stellen ausführliche Protokolle der verschiedenen hohen Durchsätze bereit. Daher stellt beispielsweise Zymark Corp. technische Bulletins bereit, die Screeningsysteme zum Detektieren der Modulation der Gentranskription, Ligandenbindung und dergleichen beschreiben.
VII. Kits
In einer Ausführungsform stellt diese Erfindung Kits zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren bereit. Ein bevorzugter Kit wird typischerweise einen Behälter umfassen, der ein oder mehrere Bibliotheken gemäß dieser Erfindung enthält. Die Bibliotheken können eine Vielzahl von Formen annehmen. Daher ist in einer Ausführungsform die Bibliothek eine Sammlung von Zellen, enthaltend Mitglieder einer Phagenanzeigebibliothek, während in einer anderen Ausführungsform die Bibliothek aus einer Sammlung von isolierten Phage besteht. Noch eine andere Bibliothek besteht aus einer Bibliothek aus ungepackten Nukleinsäuren (beispielsweise einer Plasmidbibliothek). Die Nukleinsäuren können Phagemidvektoren sein, die die gewünschten Rekombinationssubstrat(e) kodieren und zum Subklonen in einen Phagenvektor bereit sind, oder die Nukleinsäuren können eine Sammlung aus Phagemid sein, der bereits die subklonierten Nukleinsäuren trägt.
Die Bibliothek kann eine primäre Bibliothek sein, umfassend eine Population aus einzelnen Nukleinsäuremolekülen, die noch nicht der Rekombination unterlagen, wie hierin beschrieben, oder alternativ eine sekundäre Bibliothek, umfassend Nukleinsäuremoleküle, die aus einer primären Genbibliothek stammen, in der die Diversität durch das Verfahren von entweder ortsspezifischer oder allgemeiner Rekombination erhöht worden ist.
In einer anderen Ausführungsform kann der Kit einen Behälter umfassen, der Vektoren (beispielsweise Plasmid, Phagemid usw.) enthält, die entsprechend lokalisierte Rekombinaseerkennungsstellen enthalten, und gegebenenfalls Polylinker oder andere Stellen zur Erleichterung des Klonens von ein oder mehreren Rekombinationssubstraten bereitstellt.
Außerdem können die Kits gegebenenfalls ein oder mehrere Reagenzien (beispielsweise Mikrotiterplatten, Puffer, Zellen, Reportermoleküle, Antibiotika usw.) umfassen, die zur Umsetzung der hierin beschriebenen Verfahren geeignet sind.
Außerdem können die Kits Instruktionsmaterialien umfassen, enthaltend Anweisungen (d. h. Protokolle) für die Praxis der erfindungsgemäßen Verfahren. Bevorzugte Instruktionsmaterialien stellen Protokolle zur Erzeugung von großen und vielfältigen Nukleinsäurebibliotheken und/oder zum Screenen der Mitglieder dieser Bibliotheken bereit. Während die Instruktionsmaterialien typischerweise geschriebene oder gedruckte Materialien umfassen, sind sie nicht auf diese beschränkt. Jedes Medium, das diese Instruktionen speichert und sie an den Endverbraucher weitergibt, wird durch diese Erfindung in Betracht gezogen. Diese Medien umfassen elektronische Speichermedien (beispielsweise Magnetdisks, -Bänder, -Kassetten, -Chips), optische Medien (beispielsweise CD-ROM) und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Medien können Adressen für Internetseiten umfassen, die diese Instruktionsmaterialien bereitstellen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden dargeboten, um die beanspruchte Erfindung darzustellen, aber sie nicht einzuschränken.
Beispiel 1: Bakterien können durch mehr als ein Phagemid infiziert werden
Als erster Schritt zur Entwicklung eines in-vivo-Rekombinationssystems wurde die Anzahl an unterschiedlichen Phagemiden, die einzelne Bakterien infizieren könnten, unter Verwendung von fünf unterschiedlichen Phagemiden, die unterschiedliche Antibiotika-Resistenzen exprimieren, bewertet: Ampicillinresistenz (Bluescript: Stratagene, La Jolla), Kanamycinresistenz (pMPM-K1), Tetracyclinresistenz (pMPM T1), Chloramphenicolresistenz (pBSL121) und Gentamycinresistenz (pBSL141). pMPM-Plasmide sind von Mayer (1995) Gene 163: 41–46 und die pBSL-Plasmide von Alexeyev et al. (1995) Gene 160: 63–67. Durch das Infizieren von Bakterien mit gleichen Titern von diesen Phagemiden und Plattieren auf einzelnen oder doppelten Antibiotika und Betrachten der Anzahl an Kolonien, die auf den Platten ohne Antibiotika als 100% vorliegen, geht hervor (Tabelle 1), daß die meisten Bakterien, die mit zwei unterschiedlichen Phagemiden infiziert wurden, zwei unterschiedliche Resistenzen aufwiesen.
Tabelle 1: Eintritt und Überleben von Phagemiden in einer Zelle, die gegen unterschiedliche Antibiotika Resistenz zeigt
Beispielsweise sind 94% aller Bakterien resistent gegen Ampicillin und Tetracyclin, und 85% sind gegen Tetracyclin und Kanamycin resistent. Als eine minimale Schätzung scheinen 10 bis 40% der Bakterien das Potential aufzuweisen, Resistenz gegen alle fünf Antibiotika zu zeigen. Resistenz gegen Gentamycin mit anderen Antibiotika wurde am seltensten gefunden, aber diese ist wahrscheinlich ein Merkmal der Resistenz gegen dieses Antibiotika, da nur 52% der Bakterien gegen Gentamycin resistent gemacht werden könnten, selbst wenn sie allein verwendet werden. Die Resistenz gegen einige Antibiotikapaare wird nicht angegeben, wenn die verwendeten Plasmide das Testen dieser Kombinationen nicht ermöglichen.
Diese Daten zeigen, daß die Infektion unter Verwendung von Phagemiden ein effizientes Verfahren zur Einführung von mindestens fünf unterschiedlichen Nukleinsäuremolekülen in eine Zelle ist.
Beispiel 2: Intrazelluläre Rekombination kann verwendet werden, um einen funktionellen Antikörper aufzubauen, wobei seine Kettenkomponenten auf separaten Phagemiden vorliegen
Um cre-Rekombinase zu verwenden, um Gene der Antikörper-variablen Region in dem scFv-Format zu mischen, wurde eine lox-Stelle zwischen den Genen der schweren und der leichten Ketten plaziert. Dies umfaßte die Verwendung der translatierten lox-Stelle als Proteinlinker. Eine Untersuchung der sechs möglichen Rahmen, verfügbar für die Wildtyp-loxP-Stelle und die mutierte loxP511-Stelle (die nicht mit dem Wildtyp-loxP rekombinieren wird (Hoess und Abremski (1985) J. Mol. Biol, 181: 351–362), identifizierte eine Translation von loxP 511 (ITSYNVYYTKL, SEQ ID Nr: 1), die nur eine einzelne Grundaminosäure aufwies (um die Möglichkeit der Proteolyse zu verringern), der es an Stoppcodonen fehlte und die am wenigsten hydrophob war. Die Sequenz des Linkers, wie in dem scFvs verwendet, wird in den 2 und 3 angegeben. Die Fähigkeit dieser Sequenz, als ein scFv-Linker zu fungieren, sowie zweier üblicherweise verwendeter Linker, (gly₄ser)₃ (SEQ ID Nr: 2) (Bird et al. (1988) [veröffentlichte Errata erschienen in Science 1989 Apr. 28; 244 (4903): 409], Science 242: 423–426) und 220, eine modifizierte Version des 218-Linkers (Whitlow (1993) Protein Engineering, 6: 989–995), wurde durch Erzeugen kleiner scFv-Bibliotheken für jeden dieser Linker und Bewerten der Anzeigeniveaus durch Westernblot, die sich mit dem SV5-Antikörper entwickeln, der den Tag zwischen dem geklonten scFv und Gen-3-Protein erkennt, durchgeführt. Der loxP511-Linker zeigte ebenso gute oder bessere Anzeigeniveaus wie die zwei anderen stärker verbreitet verwendeten Linker.
Auf der Grundlage dieses Ergebnisses wurde ein neuer Phagemidanzeigevektor, pDAN5, gestaltet und konstruiert (3, 4, SEQ ID Nr: 3). (Anzumerken ist, daß die dargestellte Sequenz der pDAN5-D1.3-Vektor ist, der das D1.3-scFv darin geklont aufweist. Nukleotide 102 bis 426 sind das D1.3-VL-Gen, und Nukleotide 490 bis 837 sind das D1.3-VH-Gen. Der Grund-pDAN5-Vektor (abwesender Antikörper) umfaßt keine Nukleotide 102 bis 426 und 490 bis 837, und wird an deren Stelle Polylinkersequenzen umfassen). Dieser Vektor wurde hinsichtlich der Fähigkeit, drei unterschiedliche scFvs anzuzeigen, die aus zuvor charakterisierten monoklonalen Antikörpern stammen, getestet. Die Ergebnisse zeigen, daß alle drei scFvs die entsprechenden Antigene erkennen, wenn sie in diesem neuen Vektor unter Verwendung des loxP511-Linkers angezeigt werden. ELISA-Signale, die unter Verwendung dieses Vektors erhalten wurden, waren ähnlich denen, die unter Verwendung von Anzeigevektoren mit dem gly-ser-Linker erhalten wurden.
Um pDAN5 herzustellen, wurde ein neuer Polylinker in pUC119 unter Verwendung von EcoRI und HindIII durch Überlappungs-PCR von zwei langen Oligonukleotiden geklont. Dies führte die bakterielle Leitsequenz, eine polyklonierende Kassette, enthaltend die Restriktionsstellen, die in 3 fett angegeben sind, den SVS-Tag (Hanke et al. (1992) J Gen Virol, 73: 653–660.), einen His₆-Tag (SEQ ID Nr: 4) und ein Amberstoppcodon (siehe 3 und 4) ein. Gen 3 wurde anschließend in diesen Polylinker durch PCR-Amplifikation aus fdtet unter Verwendung von NotI und EcoRI geklont. Das 5'-Ende des reifen Gens 3 wurde stromabwärts des Amberstoppcodons eingeführt, und eine Wildtyp-lox-Sequenz wurde an dem 3'-Ende des Gens 3 nach dem Stoppcodon und vor der EcoRI-Stelle durch PCR inseriert. Das D1.3-scFv wurde zusammengesetzt (in der Ordnung VL-VH) aus D1.3-scFv (VH- VL-Folge) unter Amplifizieren von VH D1.3 mit VHback-DAN und VHfor-2-DAN, und VK D1.3 mit VK2back-DAN und VK2for-DAN (Tabelle 2).
Tabelle 2: Primer, verwendet für die PCR-Amplifikation, neben denen, die durch Sblattero und Bradbury (1998) Immunotechnology 3: 271–8 beschrieben sind
Alle V-Gene waren gelgereinigt, und ungefähr 200 ng wurden als Matrizes zur weiteren Amplifikation verwendet, um eine Region der Überlappung in dem scFv-Linker hinzuzufügen, sowie lange Schwänze, um die Restriktionsenzymdigestion zu erleichtern. Die Primer VLbackPT1 und VLforPTL wurden verwendet, um VL-Gene zu amplifizieren, und VHforPT1 und VHbackPTL für die VH-Gene. Amplifizierte Bänder wurden, wie nachstehend, gelgereinigt.
Das D1.3-scFv wurde durch Mischen gleicher Mengen (50 bis 200 ng) von VH- und VL-Genen und Durchführen der Vereinigung zusammengesetzt, wie im wesentlichen in (Krebber et al. (1997) J. Immunol. Meth. 201: 35–55) beschrieben: 8 Zyklen von PCR ohne Primer, gefolgt von 25 Zyklen in Gegenwart von VLbackPT2 und VHforPT2. Zyklenparameter waren 94°C für 1 min (Denaturierung), 60°C für 1 min (Annealing) und 72°C für 1'30'' (Extension).
Das amplifizierte scFv wurde mit BssHII und NheI digeriert und in BssHII/NheI-geschnittenes pDAN5 ligiert. Die Ligationsmischung wurde in elektrokompetentes DH5αF elektroporiert und auf 2XTY 100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose-Platten plattiert, Klone wurden durch Sequenzieren bestätigt.
Die Fähigkeit, V-Gene schwerer und leichter Ketten in vivo zu mischen, um funktionelle Antikörper zu erzeugen, wurde unter Verwendung von scFv, abgeleitet aus dem Anti-Lysozym mAb, D1.3, getestet. Zwei scFvs, die entweder D1.3 VH oder D1.3 VL mit irrelevanten Partnerketten enthielten, wurden durch PCR-Klonen erzeugt (VL/D1.3-VH/X und VL/Y-VH/D1.3). Es wurde gezeigt, daß die Erkennung von Lysozym durch D1.3-scFv die Gegenwart von sowohl schweren als auch leichten D1.3-Ketten erfordert; einzelne D1.3-Ketten, assoziiert mit irrelevanten Partnerketten, waren nicht-funktionell. Eine kurze Darstellung des verwendeten Schemas wird in 5 gegeben.
10 ml E. coli BS1365, das cre-Rekombinase konstitutiv exprimiert (BS1365: BS591 F' kan (BS591: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 D lacU169 supE44 hsdR17 [lamda1mm434 nin5 X1-cre] (Sauer und Henderson (1988) Gene 70: 331–341)), wuchs auf OD550 0,5 bei 37°C in 2XTY 100 μg/ml Kanamycin/1% Glukose.
Gleiche Mengen an Phagemid, enthaltend die zwei scFv-Gene (VL/D1.3-VH/X und VL/Y VH/D1.3), wurden zu den Bakterien bei einer MOI von 20:1 zugegeben (5 × 10¹⁰ von jedem Phagemid, zugegeben zu 5 × 10⁹ Bakterien). Dies wurde für 30 Minuten bei 37°C ohne Schütteln stehengelassen, wodurch die Infektion stattfand.
Ampicillin wurde zu 100 μg/ml zugegeben und die Bakterien wuchsen für mindestens 12 Stunden bei 30°C. Die Rekombination fand während dieses Zeitraums statt.
Nach dem Wachstum für 12 Stunden wurden die Bakterien 1:20 in 10 ml desselben Wachstumsmediums verdünnt, wuchsen auf OD550 0,5 und M13 K07 Helferphage, zugegeben bei einer MOI von 20:1.
Dies wurde für 30 Minuten bei 37°C ohne Schütteln stehengelassen, wodurch die Infektion stattfand.
Die Kultur wuchs für 6 bis 18 Stunden bei 30°C, wurde bei 4000 U/min für 15 min zentrifugiert, und der Überstand wurde entnommen. Dieser Schritt stellt Phagemid her, das kein scFv anzeigt, wobei der Phänotyp oder Genotyp (normalerweise nicht) verknüpft ist.
10 ml DH5αF wuchsen auf OD550 0,5 in 2XTY bei 37°C.
Phagemid, das in Schritt 6 hergestellt wurde, wurde zu dem DH5αF bei einer MOI von weniger als 1 zugegeben, für 30 Minuten bei 37°C stehengelassen und auf 2XTY 100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose-Platten plattiert. Dieser Schritt verknüpft Phänotyp mit Genotyp, in Abwesenheit dieses Schrittes kann das angezeigte scFv notwendigerweise nicht dem scFv-Gen innerhalb des Phagemids entsprechen.
Phagemide, die scFv anzeigen, wurden aus 20 einzelnen Kolonien durch Wachsen auf OD550 0,5 in 10 ml 2XTY 100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose, Infizieren mit M13K07 bei MOI 20:1 für 30 Minuten bei 37°C, Zentrifugieren und Resuspendieren der Bakterien 10 ml 2XTY 100 μg/ml Ampicillin hergestellt. Die Kulturen wuchsen für 6 bis 18 Stunden bei 30°C.
Wenn die Rekombination erfolgreich war, sollte jede Bakterie vier unterschiedliche scFv-Gene enthalten (V_L/D1.3-V_H/D1.3; V_L/D1.3-V_H/X; V_L/Y-V_H/D1.3 und V_L/Y-V_H/X), (siehe 5). In Gegenwart der cre-Rekombinase unterlagen 25% (16/64) der bakteriellen Kolonien, erhalten in Schritt 8/9, der Rekombination durch PCR. Außerdem wurde durch ELISA gezeigt, daß 25% Phagemid, hergestellt in Schritt 9, Lysozym erkennen können. In Bakterien, die kein cre exprimieren, wurde keine Rekombination festgestellt und kein funktionelles D1.3 weder durch PCR oder ELISA identifiziert. Dies zeigt, daß die Rekombination, wie vorhergesagt, in den Zellen, die cre exprimieren, an den loxP-Stellen, gefunden zwischen V_L und V_H und am Ende des Gens 3, induziert wurde, wobei das Endergebnis ein Austausch von V_H (und angelagertem Gen 3, das konstant ist) zwischen unterschiedlichen Phagemiden ist.
Beispiel 3: Erzeugen einer großen Genbibliothek aus Antikörpern in pDAN5 mittels intrazellulärer Rekombination
A) Erzeugung einer primären scFv-Genbibliothek durch Standardklonierungstechniken
Eine primäre scFv-Phagemidgenbibliothek, bestehend aus 7 × 10⁷ unabhängigen Klonen, wurde in pDAN5 durch Klonen von PCR-zusammengesetzten scFv, abgeleitet aus Vμ-, Vλ- und Vκ-(Vmu-, Vlambda- und Vkappa-)Genen aus peripherem Blut, in folgender Weise erzeugt:

1 menschliche periphere Blutlymphozyten wurden durch Dichte-Gradientenzentrifugation auf Ficoll Hypaque (Pharmacia) hergestellt.
2 die gesamte RNA wurde aus diesen Lymphozyten durch saures Guanidinthiocyanat, Phenolchloroformextraktion und Isopropanolausfällung hergestellt (Chomczynski und Sacks (1987) Anal. Biochem. 162: 156–159).
3 cDNA wurde unter Verwendung von SuperScript II RNase H^– Umkehrtranskriptase (Gibco BRL) mit zufälligen Hexameren, ausgehend von 1 bis 5 μg von gesamter RNA in einem Endvolumen von 20 ml, gefolgt von Instruktionen, die mit dem SuperScript bereitgestellt werden, hergestellt.
4 IgM-VH-Gene wurden zuerst aus 0,5 μl cDNA-Reaktion unter Verwendung von IgMfor und den VHback-Primern, beschrieben in (Sblattero und Bradbury, (1998) Immunotechnology 3: 271–8), amplifiziert. Reaktionsvolumen betrugen 20 μl unter Verwendung von 0,5 μl cDNA-Reaktion, 10 pmol von jedem Primer, 200 μM dNTPs, 2 μl 10 × PCR-Puffer und 0,5 μl (2,5 U) Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer): Zyklenparameter waren 94°C für 1 min (Denaturierung), 55°C für 1 min (Annealing) und 72°C für 1' (Extension) für dreißig Zyklen. Alle 20 μl wurden auf ein 2%iges Agarosegel (FMC) geladen und unter Verwendung des Qiagel-Reinigungskits (Qiagen) gelgereinigt. Anschließend wurden VH-Gene unter Verwendung der VHfor-Mischung aus Primern mit den einzelnen VHback-Primern reamplifiziert, beschrieben in (Sblattero und Bradbury, 1998), in 50 μl Volumen unter Verwendung von 1 μl gereinigtem VH (andere Parameter als zuvor).
5 Vlambda- und Vkappa-Gene wurden ähnlich (unter Verwendung einzelner VLback-Primer mit der Mischung aus VLfor-Primern) aus der zuvor abgeleiteten cDNA amplifiziert.
6 Alle V-Gene wurden gelgereinigt und ungefähr 200 ng wurden als Matrizes zur weiteren Amplifikation verwendet, um eine Region an Überlappung in dem scFv-Linker sowie lange Schwänze zur Erleichterung der Restriktionsenzymdigestion hinzuzufügen. Die Primer VLbackPTI und VLforPTL wurden verwendet, um VL-Gene und VHforPTI und VHbackPTL für die VH-Gene zu amplifizieren. Amplifizierte Bänder wurden wie oben gelgereinigt.
7 Die scFv-Bibliothek wurde durch Mischen gleicher Mengen (200 bis 500 ng) von VH- und VL-Genen und Durchführen der Vereinigung zusammengesetzt, wie im wesentlichen in (Krebber et al., 1997) beschrieben: 8 Zyklen von PCR ohne Primer, gefolgt von 25 Zyklen in Gegenwart von VLbackPT2 und VHforPT2. Zyklenparameter waren 94°C für 1 min (Denaturierung), 60°C für 1 min (Annealing) und 72°C für 1'30'' (Extension).
8 Das amplifizierte scFv wurde mit BssHII und NheI digeriert und in BssHII/NheI-geschnittes pDAN5-D1.3 ligiert. Die Ligationsmischung wurde in elektrokompetentes DH5αF elektroporiert und auf 2XTY 100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose-Platten plattiert, um eine primäre Bibliothek zu erhalten, bestehend aus 7 × 10⁷ unabhängigen Klonen.
9 Die Kolonien wurden in 2XTY 10% Glycerol abgekratzt und in 1 ml aliquoten Teilen gefroren.

B) Intrazelluläre Rekombination zur Erzeugung einer großen sekundären Genbibliothek
Um eine große sekundäre Bibliothek zu erzeugen, folgte man dem Schema, das in 6 dargestellt ist. Das ausführliche Protokoll ist wie nachstehend:

1. 100 μl von Bakterien einer primären Bibliothek wurden in 100 ml 2XTY 100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose verdünnt und wuchsen auf OD550 0,5 und M13 K07 Helferphage, hinzugefügt bei einer MOI von 20:1.
2. Dies wurde für 30 Minuten bei 37°C ohne Schütteln stehengelassen, wodurch die Infektion stattfand.
3. Kanamycin wurde zu 100 μg/ml zugegeben und die Kultur wuchs für 5 bis 18 Stunden bei 30°C, wurde bei 4000 U/min für 15 min zentrifugiert, und der Überstand wurde entnommen. Dieser Schritt stellte Phagemid her, das kein scFv anzeigte, aber scFv-Gene enthielt.
4. 20 ml E. coli BS1365, das cre-Rekombinase konstitutiv exprimiert, wuchs auf OD550 0,5 bei 37°C in 2XTY 100 μg/ml Kanamycin/1% Glukose.
5. Phagemid, hergestellt in Schritt 3, wurde bei einer MOI von 200:1 zugegeben (2 × 10¹² Phagemid wurden zu 1 × 10¹⁰ Bakterien zugegeben). Dies wurde für 30 Minuten bei 37°C ohne Schütteln stehengelassen, wodurch die Infektion stattfand. Dies führte zur Infektion von Bakterien durch mehr als ein Phagemid.
6. Ampicillin wurde zu 100 μg/ml zugegeben und Bakterien wuchsen für mindestens 12 Stunden bei 30°C. Rekombination fand während dieses Zeitraums statt.
7. Nach dem Wachstum für etwa 12 Stunden wurden Bakterien zu 380 ml desselben Wachstumsmediums zugegeben (1/20-Verdünnung), wuchsen auf OD550 0,5 bei 37°C und M13 K07 Helferphage, zugegeben bei einer MOI von 20:1. Bakterien wuchsen für weitere 6 bis 18 Stunden, und Phagemid wurde, wie oben beschrieben, hergestellt. Dies erzeugt eine genetisch vielfältige rekombinierte Antikörperphagemidbibliothek, aber ohne angezeigtes Protein (die jedenfalls nicht verknüpften Phänotyp und Genotyp aufweisen). Dies wird durch Reinfizieren von DH5αF bei einer MOI von weniger als 1 überwunden.
8. 1 Liter DH5αF' wuchs auf OD550 0,5 in 2XTY/1% Glukose bei 37°C, 5 × 10¹¹ Phagemid wurden zugegeben (MOI von weniger als 1) und für 30 Minuten stehengelassen, wodurch Infektion stattfand. M13K07 wurde bei einer MOI von 20:1 zugegeben, die Kultur wurde für 30 Minuten bei 37°C stehengelassen, wodurch Infektion stattfand, und dann zentrifugiert bei 4000 U/min für 15 Minuten. Bakterien wurden in 1 Liter 2XTY 100 μg/ml Ampicillin/100 μg/ml Kanamycin resuspendiert und wuchsen für 6 bis 18 Stunden bei 30°C. Die Kultur wurde zentrifugiert (4000 U/min, 30 Minuten), und Phagemid wurde aus dem Überstand geerntet.
9. 150 ml 2,5 M NaCl 40% PEG 8000 wurden zu dem Überstand zugegeben (dies fällte Phagemid aus). Das Pellet wurde durch Zentrifugation (4000 U/min, 15 Minuten) erhalten, in 50 ml PBS resuspendiert und zentrifugiert (9000 U/min, 15 Minuten) unter Entfernung von Bakterien und aggregiertem Phagemid.
10. Schritt 9 wurde durch Zugeben von 10 ml 2,5 M NaCl 40% PEG 8000 zu den 50 ml Phagemidpräparat wiederholt. Der End-PEG-Niederschlag wurde in 20 ml resuspendiert und Phagemid weiter durch Cäsiumchlorid-Dichtenzentrifugation gereinigt, wie in (Smith und Scott (1993) Meth. Enzymol., 217: 228–157) beschrieben, und in 20 ml resuspendiert. Dieses bildet die Endantikörper-Phagemidbibliothek, die für Selektionen verwendet wurde.

C) Bewertung der Diversität in einzelnen Zellen
Die Experimente, beschrieben in Beispielen 1 und 2 oben, zeigen, daß mindestens fünf unterschiedliche Phagemide in ein einzelnes Bakterium eindringen konnten und daß zwei Phagemide, die in eine einzelne Bakterie eindringen, in der Lage waren, miteinander zum Gleichgewicht zu rekombinieren, was zu vier unterschiedlichen Phagemiden führt. Jedoch gaben sie keinen Hinweis, wie lange ein solches Phagemid nach dem Wachstum in entweder flüssiger oder fester Kultur überleben würde. Um diesen Punkt zu klären und die mögliche Diversität der erzeugten Genbibliothek zu charakterisieren, wurden Phagemide aus einer einzelnen Kolonie aus cre-Bakterien produziert, enthaltend Phagemide, die der Rekombination unterlagen. Diese Phagemide wurden verwendet, um einzelne Bakterienkolonien zu erhalten, wobei jede nur einen Typ an Phagemid enthielt. Die Analyse von diesen unterschiedlichen Kolonien durch PCR ermöglichte die Identifikation der unterschiedlichen VH- und VL-Ketten, die in der ursprünglichen cre-Kolonie vorlagen (siehe 6 für Einzelheiten).
Nach dem Wachstum für mindestens 12 Stunden in cre-exprimierenden Bakterien wurde die Kultur plattiert, um einzelne Kolonien zu isolieren. Wenn die Rekombination erfolgreich gewesen ist, und alle Phagemide noch vorliegen, sollte jede dieser Kolonien viele Phagemide mit mehrfach rekombinierten V-Genen enthalten. Um diese zu identifizieren, wurden Phagemide zunächst aus einer einzelnen Kolonie hergestellt (diese sollten aus allen der unterschiedlichen scFv-Kombinationen bestehen, die innerhalb der ursprünglichen Ausgangszelle entstanden), und dann wurden diese verwendet, um Kolonien herzustellen, die einzelne Phagemide enthielten. In dieser Weise ist es möglich, die vielen einzelnen scFv-Gene, die in der Ausgangskolonie gefunden wurden, zu isolieren.
Dies wurde in Kürze folgendermaßen durchgeführt:

1. Nach der Infektion bei hoher MOI und Wachstum über Nacht wurden cre-exprimierende Bakterien auf 2XTY 100 μg/ml Kanamycin/100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose-Platten plattiert, um die einzelnen Kolonien zu isolieren.
2. Phagemide wurden aus diesen einzelnen Kolonien durch Wachsen dieser Kolonien auf OD550 0,5 in 1 ml 2XTY 100 μg/ml Kanamycin/100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose bei 37°C, Infizieren mit M13K07 und Verwenden der oben beschriebenen Techniken, um Phagemid herzustellen, hergestellt.
3. Um Kolonien aus diesen Phagemiden abzuleiten, wurden DH5αF-Bakterien auf ein OD550 0,5 in 2XTY bei 37°C gezüchtet und mit den Phagemiden infiziert, erhalten in Schritt 2, bei einer MOI von weniger als 1. Diese Kolonien enthalten einzelne Phagemide, und die vollständige Population von Kolonien stellt die Diversität der Phagemide dar, die innerhalb der einzelnen Ausgangsbakterien, die in Schritt 2 wuchsen, enthalten sind.
4. Einzelne V_H- und V_L-Ketten, die in jedem einzelnen Phagemid vorliegen, wurden durch PCR-Amplifikation und Fingerprinting mit BstNI oder durch Sequenzieren identifiziert. Zwei Zellen wurden für die Analyse entnommen und die Ergebnisse für beide werden in 7 gezeigt. Beide Zellen ergaben sehr ähnliche Ergebnisse, wobei 17–18 V_H-Gene und 12–14 V_L-Gene pro Zelle identifiziert wurden.

Diese unterschiedlichen V-Gene liegen in 28–29 unterschiedlichen Kombinationen vor, wobei viele der unterschiedlichen V-Gene in mehr als einer scFv-Kombination gefunden wurden. In dem Fall der ersten dargestellten Zelle können alle vier Kombinationen von zwei V_H/V_L-Paaren identifiziert werden, was angibt, daß die Rekombination umfangreich gewesen ist. In beiden Zellen liegen über 50% der identifizierten V_H/V_L-Paare in einzelnen Kopien vor, was darauf schließen läßt, daß die kleine analysierte Probe (37–41 scFv) nicht das ganze Komplement von V_H- und V_L-Genen oder ihren Kombinationen identifizierte, und daß die wahre Diversität höher als die identifizierte ist.
Der Grad an Diversität, erzeugt in einer Einzelzelle, war schwierig zu bewerten. Es ist sehr wahrscheinlich, daß den 18 unterschiedlichen V_H-Gene, die aus einer einzelnen Kolonie erhalten wurden, 18 unterschiedliche V_L-Genen entsprechen. Die mögliche Diversität, die in dieser kleinen Probe identifiziert wurde, beträgt 324 (18²). Es ist wahrscheinlich, daß nicht alle der unterschiedlichen V-Gene, die vorliegen, identifiziert wurden, und es ist bekannt, daß V-Gene identische Fingerabdrücke, aber unterschiedliche Sequenzen haben können, was darauf schließen läßt, daß die Diversität, erzeugt in einer Einzelzelle, jenes überschreiten kann, was eine maximale Schätzung ergibt, die 500 bis 700 Kopiezahlen von pUC-basierenden Plasmiden erreicht (Sambrook et al., 1989 a.a.O.). Die unterste Schätzung ist die, die auf der Grundlage der Fingerabdruckanalyse beobachtet wurde: 28 bis 29 unterschiedliche scFv-Kombinationen pro Zelle.
Der Grad an Rekombination war umfangreich mit vielen unterschiedlichen Gruppen aus drei von vier identifizierten Kombinationen. Eine leichte Kette wurde gefunden mit neun unterschiedlichen schweren Ketten, und eine schwere Kette mit fünf unterschiedlichen leichten Ketten. Die Tatsache, daß so viele unterschiedliche Plasmide stabil in einer Einzelzelle coexistieren können, ist ziemlich überraschend, und steht im Widerspruch zu dem Dogma, das angibt, daß nur ein Plasmid pro Komplementationsgruppe fähig ist, in einer Bakterienzelle zu überleben. Jedoch ist es wahrscheinlich, daß, sobald eine große Anzahl an V-Genen in eine Zelle eingeführt worden ist, die andauernde Rekombination sowohl die Diversität aufrechthalten als auch selektiven Druck, der einzelne V-Gene beseitigt, verhindern wird. Diese ergibt einen möglichen Bereich an Diversität, die durch eine Einzelzelle von 29 bis 500 unterschiedlichen scFvs erzeugt wird.
In der hier erzeugten Bibliothek wurden 10¹⁰ (20 ml) Bakterien, die die cre-Rekombinase exprimieren, mit 2 × 10¹² Phagen (eine MOI von 200) infiziert. Auf der Grundlage der tatsächlich beobachteten Diversität (jede Bakterie produziert 29 unterschiedliche Phagen) wird die endgültige Bibliothekengröße 2,9 × 10¹¹ (29 × 10¹⁰) sein. Wenn alle 324 möglichen V-Genkombinationen vorliegen, wird die Bibliothek beispielsweise ungefähr zehnmal größer sein (3,2 × 10¹²). Die Größe der Bibliothek, die praktisch verwendet werden kann, ist jedoch durch den Reinfektionsschritt bei einer niedrigen MOI eingeschränkt, wenn Phänotyp und Genotyp verknüpft sind. Bei Verwendung von einem Liter, um diesen Schritt durchzuführen, kann sie 5 × 10¹¹, der Zahl an Bakterien in einem Liter. nicht überschreiten, obwohl unter Verwendung größerer Volumen, größere Bibliotheken leicht erzeugt werden können.
D) Testen der großen Phagen-Antikörperbibliothek
Die Bibliothek wurde durch Selektion auf eine Vielzahl von unterschiedlichen Antigenen (siehe Tabelle 3) getestet, und Antikörper wurden gegen alle in zwei Zyklen isoliert. In jedem Fall wurden mindestens 3 unterschiedliche scFvs pro Antigen mit durchschnittlich 6 pro Antigen erhalten.
Tabelle 3. Antigene, für die Antikörper selektiert worden sind
Die Selektion wurde folgendermaßen durchgeführt:

1. Ein Immunröhrchen (Nunc) wurde mit 1 ml Antigen von Interesse bei 10 μg/ml über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Nach der Beschichtung wurde das Röhrchen mit PBS dreimal gewaschen und durch Füllen des Immunröhrchens mit 2% Marvel/PBS (MPBS) blockiert. Gleichzeitig wurde 1 ml Bibliothek (enthaltend 5 × 10¹²–10¹³ Phagemid) durch Zugeben von 10% Marvel/PBS auf eine Endkonzentration von 2% blockiert.
2. Nach dem Blockieren wurde das Immunröhrchen dreimal mit PBS gewaschen und die Bibliothek wurde zugegeben und 1 Stunde inkubiert, Stehengelassen und 1 Stunde langsam Ende über Ende gedreht.
3. Nach der Selektion wurde das Röhrchen zehnmal mit PBS und zehnmal mit 0,1% Tween 20/PBS gewaschen.
4. Bindungphagemide wurden mit 1 ml 100 mM Triethanolamin für 8 Minuten bei Raumtemperatur eluiert, und direkt in ein neues Röhrchen übertragen und mit 1 M Tris pH 7–7,5 neutralisiert.
5. Eluierte Phagemide wurden zu DH5αF bei OD550 0,5 zugegeben und ohne Schütteln für 30 Minuten bei 37°C stehengelassen.
6. Die infizierten Bakterien wurden auf 2XTY/100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose-Platten plattiert und wuchsen 12 bis 18 Stunden bei 30°C.
7. Bakterien wurden in 10 ml 2XTY abgekratzt, gründlich gemischt und in 50 ml 2XTY/100 μg/ml Ampicillin/1% Glukose auf ein OD550 0,05 verdünnt, und Phagemide wurden durch Waschen bei 37°C auf ein OD550 0,5, Infizieren mit M13K07 und gemäß dem oben beschriebenen Protokoll hergestellt, einschließlich zwei Ausfällungen mit PEG/NaCl, was zu einem Endvolumen von 1 ml Phagemid führt.
8. 10¹² dieser Phagemide wurden als Eingabe für die nächste Runde der Selektion verwendet, die genau, wie oben beschrieben, durchgeführt wurde, außer daß in Schritt 3 das Waschen zwanzigmal mit PBS und zehnmal mit 0,1% Tween 20/PBS durchgeführt wurde, gefolgt von einer langen Waschung von 30 bis 60 Minuten in PBS bei Raumtemperatur.
9. Eluierte Phagen wurden bei niedriger Dichte plattiert, um einzelne Kolonien zu isolieren, Phagemide wurden aus diesen hergestellt und in ELISA getestet, wie in (Marks et al., 1991) beschrieben.

Beispiel 4: In vivo-Zufallsrekombination ohne spezifische Rekombinasen
Beta-Lactamase vom Wildtyp ist nicht in der Lage, Resistenz gegen das antibiotische Cefotaxim zu verleihen, außer bei einer Konzentration von nur 0,025 μg/ml, die nicht größer als die ist, die durch Bakterien bereitgestellt wird, die dieses Resistenzgen nicht aufweisen. Es kann gezeigt werden, daß die Resistenz gegen Cefotaxim durch Mutation des beta-Lactamasegens in einer Vielzahl von Schlüsselresten produziert werden kann, wobei dies durch in-vitro-Rekombination, aber nicht durch fehlerauslösende PCR allein durchgeführt wird (Stemmer 1994).
Um die in-vivo-Zufallsrekombination ohne spezifische Rekombinasen zu zeigen (d. h. unter Verwendung der endogenen zellulären Rekombinationsmachinerie), wurde das Gen für beta-Lactamase (das die Ampicillinresistenz kodiert) aus dem Vektor pBSL167 (Alexeyev et al. (1995)) Gene 160: 63–67) unter Verwendung der Bedingungen der fehlerauslösenden PCR amplifiziert. Nach der Transfektion wurde eine primäre Bibliothek mit 3 × 10⁵ unabhängigen Klonen erhalten. Phagemide wurden aus diesen erhalten und verwendet, um Bakterien bei unterschiedlichen Phagemid : Bakterien-Verhältnissen zu infizieren. Diese Bakterien wuchsen für mindestens 12 Stunden, und Phagemid wurde daraus hergestellt. Es wurde herausgefunden, daß die Phagemide, die aus Bakterien hergestellt wurden, die zuvor mit hohen Phagemid : Bakterien-Verhältnissen (größer als 10 : 1) infiziert worden waren, fähig waren, viele Bakterienkolonien mit Resistenz gegen 0,25 μg/ml Cefotaxim hervorzubringen, während die Phagemide, die aus Bakterien hergestellt worden, die zuvor mit einem niedrigen Phagemid Bakterien-Verhältnissen (weniger als 1 : 1) infiziert worden waren, fähig waren, weit weniger Kolonien hervorzubringen, die gegen 0,25 μg/ml Cefotaxim resistent waren. Rekombination kann nur stattfinden, wo mehr als ein Phagemid innerhalb eines einzelnen Bakteriums vorliegt, und die nützliche Rekombination kann nur stattfinden, wenn mindestens zwei Phagemide mit komplementären Mutationen (Mutationen, die, wenn auf demselben beta-Lactamasegen gefunden, eher zwei unterschiedliche sind als eine, die fähig ist, eine größere Resistenz gegen Cefotaxim hervorzubringen) in demselben Bakterium vorliegen. Der einzige Unterschied zwischen den Phagemiden, die fähig sind, resistente Kolonien hervorzubringen, und denen, die fähig sind, weniger resistente Kolonien hervorzubringen, ist die Infektionsmultiplizität, daraus geht deutlich hervor, daß die Rekombination im ersteren Fall, aber nicht im letzteren stattfand.
Das befolgte Protokoll ist folgendes:

1. Das beta-Lactamsegen wurde unter Bedingungen der fehlerauslösenden PCR mit zwei Primern, die mit dem Polylinker hybridisieren, in dem Plasmid pBSL167 amplifiziert.
2. Das amplifizierte Band wurde mit XsacI und KpnI geschnitten und zurück zu pBSL167 geklont, geschnitten mit denselben Enzymen, wodurch eine primäre Bibliothek aus 3 × 10⁵ Kolonien auf Chloramphenicolplatten (34 μg/ml) erhalten wurden. Resistenz gegen Chloramphenicol wird durch das Chloramphenicolacetyltransferasegen, gefunden im Rückgrat des Vektors, bereitgestellt.
3. Die Bakterien wurden in 2XTY abgekratzt, auf OD550 0,1 in 10 ml 2XTY 50 μg/ml Chloramphenicol verdünnt, wuchsen auf OD550 0,5 bei 37°C, und 10¹¹ Helferphagen wurden zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C wurde Kanamycin zu 25 μg/ml zugegeben.
4. Bakterien wuchsen für mindestens 12 Stunden bei 37°C, und Phagemid wurde aus der Kultur hergestellt. Die Kultur wurde zentrifugiert (3500 U/min, 20 Minuten), der Überstand mit 2,5 ml 2,5 M NaCl 40% PEG 8000 behandelt (diese fällte Phagemid aus). Das Pellet wurde durch Zentrifugation (3000 U/min, 20 Minuten) erhalten, in 1 ml PBS resuspendiert und zentrifugiert (13000 U/min, 10 Minuten) unter Entfernung von Bakterien und aggregiertem Phagemid. Dies bildete die primäre Phagemidbibliothek.
5. Eine Vielzahl von aliquoten Teilen von 10 ml DH5αF'-Bakterien wuchsen auf OD550 0,5 in 2XTY bei 37°C. Aliquote Teile der primären Phagemidbibliothek wurden zu diesen Bakterien bei unterschiedlichen Phagemid:Bakterien-Verhältnissen zwischen 0,1:1 und 100:1 zugegeben. Die Bakterien wurden für 30 Minuten bei 37°C stehengelassen, wodurch die Infektion stattfand, Chloramphenicol wurde zugegeben und die Bakterien wuchsen bei 37°C für mindestens 12 Stunden.
6. Nach dem Wachstum wurden Phagemide aus dem bakteriellen Überstand hergestellt, wie in den Schritten 3 bis 4 oben beschrieben. Dies bildet die sekundäre oder rekombinierte Bibliothek.
7. Um die Fähigkeit der sekundären oder rekombinierten Bibliothek, eine größere Resistenz gegen Cefotaxim zu verleihen, zu testen, wuchsen Dh5αF'-Bakterien auf OD550 0,5 in 2XTY bei 37°C, und Phagemide aus den unterschiedlichen sekundären Bibliotheken (hergestellt bei unterschiedlichen Phagemid : Bakterien-Verhältnissen) wurden zu 1 ml DH5αF' zugegeben (d. h., bei einem Phagemid : Bakterien-Verhältnis von weniger als 1, um sicherzustellen, daß jede Bakterie durch durchschnittlich nur ein Phagemid infiziert ist). Die Kultur wurde für 30 Minuten bei 37°C stehengelassen und auf Cefotaximplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen plattiert.
8. Sekundäre Bibliotheken, erzeugt aus Bakterien, infiziert bei Phagemid:Bakterien-Verhältnissen von größer als 10 : 1, ergeben 100 bis 800 Kolonien auf 0,25 μg/ml Cefotaxim, während diese Bibliotheken, erzeugt aus Bakterien, infiziert bei Phagemid:Bakterien-Verhältnissen von weniger als 1, keine resistenten Kolonien ergaben.

Es ist selbstverständlich, daß die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur für illustrative Zwecke sind, und daß verschiedene Modifikationen oder Veränderungen im Lichte davon dem Fachmann nahegelegt werden.
SEQUENZPROTOLL

Claims

Verfahren für das Zubereiten einer Nukleinsäurebibliothek, wobei das Verfahren das Einführen von mindestens zwei Mitgliedern einer anfänglichen Population von Nukleinsäuremolekülen in mindestens eine Zelle umfasst, wobei die Population von Nukleinsäuremolekülen zwei oder mehr einzelne Nukleinsäuren umfasst, von denen jede aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die bei jedem Molekül gleich ist und die den gleichen Replikationsursprung einschließt; und eine Nukleinsäuresequenz, die zwischen Mitgliedern der Population variiert und ein Substrat für die Rekombination umfasst, wobei das Einführen zur Rekombination des Substrats zur Rekombination zwischen mindestens zwei Mitgliedern der Population führt, wodurch eine Population erzeugt wird, die rekombinierte Nukleinsäuremitglieder umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Rekombination durch einen der Zelle endogenen Rekombinationsmechanismus durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Rekombination durch eine exogene Rekombinase vermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Rekombination durch eine endogene Rekombinase vermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Rekombination an einer für die Rekombination vorgewählten Stelle stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die für die Rekombination vorgewählte Stelle eine Rekombinaseerkennungsstelle ist und die Rekombination durch eine Rekombinase vermittelt wird, die durch die Zelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Rekombination durch eine Rekombinase vermittelt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einem Mitglied der hin-Familie von Rekombinasen, einem Mitglied der Lambda-Integrasefamilie, einer flp-Rekombinase, einer Resolvase, einem Transposon und einer Cre-Rekombinase.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Rekombinase aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Cre, hin, gin, pink, cin und flp.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die für die Rekombination ausgewählte Stelle eine loxP-Stelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat für die Rekombination eine erste Stellenrekombinaseerkennungsstelle und eine zweite Rekombinaseerkennungsstelle umfasst, die von der ersten Rekombinaseerkennungsstelle verschieden ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Rekombinase zum Austausch zwischen zwei Mitgliedern der Nukleinsäurepopulation der durch die ersten und zweiten Rekombinaseerkennungsstellen flankierten Nukleinsäure führt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die erste Rekombinaseerkennungsstelle eine loxP-Stelle und die zweite Rekombinaseerkennungsstelle eine mutante loxP-Stelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die mutante loxP-Stelle loxP 511 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Hefezelle, einer Insektenzelle und einer Säugerzelle.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Bakterienzelle eine Escherichia coli-Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mitglieder einer Population von Nukleinsäuremolekülen durch Transfizierung in die Zelle eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Nukleinsäuremolekülen mindestens 10 verschiedene Mitglieder umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mitglieder einer Population von Nukleinsäuremolekülen inner halb infektiöser Teilchen enthalten und in die Zellen durch Infektion mit den infektiösen Teilchen eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die infektiösen Teilchen ein Phage sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die infektiösen Teilchen eines filamentösen Phagen sind.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die infektiösen Teilchen der filamentöse Phage der Ff-Familie sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die infektiösen Teilchen Phagemide sind, die phagemidische DNA enthalten.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die infektiösen Teilchen Phagemide sind, die von filamentösem Phage der Ff-Familie deriviert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren des Weiteren Folgendes umfasst: Transfizieren oder Infizieren einer oder mehrerer Zellen mit Mitgliedern der Population von rekombinierten Nukleinsäuremitgliedern, derart, dass die Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (moi) von weniger als ca. 1 infiziert sind.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Verfahren des Weiteren das Packen der Mitglieder der Nuk leinsäurebibliothek in replizierbare genetische Anzeigepakete umfasst, derart, dass ein Protein an der Oberfläche des replizierbaren Anzeigepakets durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die innerhalb des Anzeigepakets gepackt ist, die eine Nukleinsäuresequenz ist, die zwischen Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek variiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die variable Nukleinsäuresequenz, die das Substrat für die Rekombination umfasst, eine Expressionskassette umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Expressionskassette Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für ein oder mehrere Polypeptide kodieren.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Expressionskassette Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für ein oder mehrere Polypeptide kodieren und die Nukleinsäure, die für mindestens eines der Polypeptide kodiert, durch Paare von Rekombinaseerkennungsstellen flankiert sind.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Polypeptide auf der Oberfläche eines Phagen, eines Phagemids oder einer Bakterie exprimiert sind.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die variable Sequenz Nukleinsäure umfasst, die für eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette aus einem spezifischen Bindungspaarmitglied derart kodiert, dass auf die Rekombination hin die variable Sequenz für Bindungsproteine kodiert, die nicht in der ursprünglichen Population von Nukleinsäuren vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die ersten und zweiten Polypeptide Antikörperpolypeptide sind.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das erste und zweite Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus einer V_H-Region, einer V_L-Region, einem V_HCDR₁, einem V_HCDR₂, einem V_HCDR₃, einem V_LCDR₁, einem V_LCDR₂, einem V_LCDR₃, einem an ein CH₁ gebundenen V_H und einem an CL gebundenen V_L.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das erste Polypeptid eine V_H-Region und das zweite Polypeptid eine V_L-Region ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei ein Paar Rekombinaseerkennungsstellen die Nukleinsäure flankiert, die für ein erstes Polypeptid kodiert und das Paar Rekombinaseerkennungsstellen eine erste Rekombinaseerkennungsstelle und eine andere zweite Rekombinaseerkennungsstelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die erste Rekombinaseerkennungsstelle eine loxP-Stelle und die zweite Rekombinaseerkennungsstelle eine loxP 511-Stelle ist.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das erste Polypeptid von einem Paar Rekombinaseerkennungsstellen flankiert ist und die Erkennungsstellen voneinander verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid jeweils von einem Paar Rekombinaseerkennungsstellen flankiert sind und die Erkennungsstellen innerhalb jedes Paars voneinander verschieden sind.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei die loxP-Stellen aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus loxP, loxP 511 und fas loxP.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Mitglieder der Bibliothek für einen Einkettenantikörper kodieren.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Antikörperfragmente scFv sind.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Mitglieder der Bibliothek für einen Anteil kodieren, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einem Fab, einem Fv, einem Diakörper, einem V_H-Dimer und einem V_L-Dimer.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Mitglieder der Bibliothek für einen Antikörper kodieren, bei dem die Antikörper-V-Regionen durch einen Polypep tidkoppler verkoppelt sind, der eine Rekombinaseerkennungsstelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die Rekombinaseerkennungsstelle aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus loxP, einem loxP-Mutanten, einer Erkennungsstelle für eine hin-Familienrekombinase, einer Erkennungsstelle für eine Lambda-Integrase, einer Erkennungsstelle für eine flp-Rekombinase, einer Erkennungsstelle für eine Resolvase und einer Erkennungsstelle für ein Transposon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der variable Anteil der Nukleinsäure des Weiteren einen auswählbaren Marker umfasst, wobei der auswählbare Marker mit einem zweiten auswählbaren Marker rekombiniert werden muss, um aktiv zu werden.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei der auswählbare Marker ohne Rekombination aufgrund von Mutationen inaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei der auswählbare Marker ohne Rekombination inaktiv ist, weil er ein unvollständiger auswählbarer Marker ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei der auswählbare Marker derart positioniert ist, dass er mit dem Rekombinationssubstrat verknüpft ist und mit einem Gen, das in dem Rekombinationssubstrat von Interesse ist, gleichzeitig übertragen wird.
Nukleinsäurebibliothek umfassend eine Population von Nukleinsäuremolekülen umfassend zwei oder mehr einzelne Nukleinsäuren, von denen jede aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die bei jedem Molekül gleich ist und die den gleichen Replikationsursprung und mindestens zwei Rekombinaseerkennungsstellen einschließt; und eine Nukleinsäuresequenz, die zwischen Mitgliedern der Population variiert, wobei die Nukleinsäuresequenz, die variiert, ein Substrat für die Rekombination umfasst, und wobei jedes Mitglied der Bibliothek den gleichen Replikationsurspruch aufweist.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48, wobei die Bibliothek mindestens 10 verschiedene Mitglieder in einer einzigen Zelle umfasst.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48, wobei die Bibliothek mindestens 100 verschiedene Mitglieder in einer einzigen Zelle umfasst.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48, wobei die Rekombinaseerkennungsstellen Stellen umfassen, die durch eine Rekombinase erkannt werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einem Mitglied der hin-Familie von Rekombinasen, einem Mitglied der Lambda-Integrasefamilie, einer flp-Rekombinase, einer Resolvase, einem Transposon und einer Cre-Rekombinase.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 51, wobei die Rekombinase aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Cre, hin, gin, pin, cin und flp.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 52, wobei die Rekombinaseerkennungsstelle eine loxP-Stelle oder eine mutante loxP-Stelle ist.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 53, wobei die Mitglieder einer Population von Nukleinsäuremolekülen innerhalb infektiöser Teilchen enthalten sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 54, wobei die infektiösen Teilchen Phage sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 55, wobei die infektiösen Teilchen filamentöser Phage sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 56, wobei die infektiösen Teilchen filamentöse Phagen der Ff-Familie sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 54, wobei die infektiösen Teilchen Phagemid sind, der phagemidische DNA enthält.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 58, wobei die infektiösen Teilchen Phagemide sind, die von filamentösem Phage der Ff-Familie deriviert sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48, wobei die variable Nukleinsäuresequenz, die das Substrat für die Rekombination umfasst, eine Expressionskassette umfasst.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 60, wobei die Expressionskassette Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für ein oder mehrere Polypeptide kodieren.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 61, wobei die Polypeptide auf der Oberfläche eines Phagen oder eines Phagemids exprimiert werden.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48, wobei die variable Sequenz Nukleinsäure einschließt, die für eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette aus einem spezifischen Bindungspaarmitlied derart kodiert, dass auf die Rekombination hin Bindungsnukleinsäuren, die für Bindungsproteine kodieren, erzeugt werden, die nicht in der ursprünglichen Population von Nukleinsäuren vorhanden sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 63, wobei das erste und das zweite Polypeptid Antikörperpolypeptide sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 64, wobei das erste und zweite Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus einer v_H-Region, einer V_L-Region, einem V_HCDR₁, einem V_HCDR₂, einem V_HCDR₃, einem V_LCDR₁, einem V_LCDR₂, einem V_LCDR₃, einem an CH₁ gebundenen V_H und einem an C_L gebundenen V_L.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 65, wobei das erste Polypeptid eine V_H-Region und das zweite Polypeptid eine V_L-Region ist.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 63–66, wobei ein Paar Rekombinaseerkennungsstellen die Nukleinsäure flankiert, die für ein erstes Polypeptid kodiert und das Paar Rekombinaseerkennungsstellen eine erste Rekombinaseerkennungsstelle und eine andere zweite Rekombinaseerkennungsstelle umfasst.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 67, wobei die erste Rekombinaseerkennungsstelle eine LoxP-Stelle und die zweite Rekombinaseerkennungsstelle eine LoxP 511-Stelle ist.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48, wobei die Mitglieder der Bibliothek für einen Einkettenantikörper kodieren.
Nukleinsäurebibliothek nach den Ansprüchen 63–66, wobei das erste und das zweite Polypeptid auf der Oberfläche eines Phagen oder einer Bakterie exprimiert sind.
Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 70, wobei die Polypeptide scFv sind, wobei VH und VL durch einen Polypeptidverknüpfer verbunden sind, der durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die ein loxP, einen loxP-Mutanten, eine Erkennungsstelle für eine hin-Familienrekombinase, eine Erkennungsstelle für eine Lambda-Integrase, eine Erkennungsstelle für eine flp-Rekombinase, eine Erkennungsstelle für eine Resolvase und eine Erkennungsstelle für einen Transposon umfasst.
Nukleinsäurebibliothek nach Ansprüchen 48–66, wobei die Nukleinsäuren rgdp-Polypeptide exprimieren.
Verfahren für das Zubereiten eines Polypeptids, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Bereitstellen einer Nukleinsäurebibliothek nach den Ansprüchen 48–72; b Auswählen eines oder mehrerer Mitglieder der Bibliothek; c) Exprimieren der Nukleinsäuren des einen oder mehrerer ausgewählter Mitglieder.
Verfahren nach Anspruch 73, wobei das Auswählen Folgendes umfasst: i) Exprimieren von Proteinen, die durch die Mitglieder der Nukleinsäurebibliothek kodiert sind; und ii) Screenen der exprimierten Proteine bezüglich einer oder mehrerer Eigenschaften ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus spezifischem Binden an ein oder mehrere vorgewählte Targets, einer Mindestbindungsavidität für ein oder mehrere vorgewählte Targets, einer maximalen Bindungsavidität für ein oder mehrere vorgewählte Targets, Thermostabilität bei einer spezifischen vorgewählten Temperatur, einer vordefinierten katalytischen Aktivität, einer vordefinierten enzymatischen Aktivität unter ausgewählten Bedingungen, einer vordefinierten biologischen Aktivität; und iii) Auswählen der Bibliotheksmitglieder, die den Kriterien des Screenens entsprechen.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei das Screenen das Screenen auf spezifisches Binden an ein vorgewähltes Target umfasst.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei die exprimierten Proteine Einkettenantikörper umfassen.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei die Polypeptide auf der Oberfläche von Zellen exprimiert werden, die mit den Mitgliedern der Nukleinsäurebibliothek infiziert oder transfiziert sind.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei die Polypeptide auf der Oberfläche replizierbarer genetischer Anzeipakete (rgdp) exprimiert sind.
Verfahren nach Anspruch 74, wobei die in Schritt (iii) ausgewählten Mitglieder zum Anreichern oder Bilden einer Bibliothek dem Verfahren von Anspruch 1 entsprechend verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 78, wobei das replizierbare genetische Anzeigepaket (rgdp) ein Phagemid ist, der ein oder mehrere Polypeptide exprimiert, die an Oberflächenproteine gebunden sind.
Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäurebibliothek nach Anspruch 48–72.
Wirtszelle nach Anspruch 81, wobei die Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer Bakterienzelle, einer Pflanzenzelle, einer Säugerzelle, einer Insektenzelle und einer Hefezelle.