ES2257740T3 - Procedimiento de preparacion de un banco multicombinatorio de vectores de expresion de genes de anticuerpos. - Google Patents

Procedimiento de preparacion de un banco multicombinatorio de vectores de expresion de genes de anticuerpos.

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ES2257740T3 ES95908302T ES95908302T ES2257740T3 ES 2257740 T3 ES2257740 T3 ES 2257740T3 ES 95908302 T ES95908302 T ES 95908302T ES 95908302 T ES95908302 T ES 95908302T ES 2257740 T3 ES2257740 T3 ES 2257740T3
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Abstract

PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE UNA BANDA MULTICOMBINATORIA DE VECTORES DE EXPRESION DE GENES DE ANTICUERPOS , BANCO Y SISTEMAS DE EXPRESION "COLICLONALES" OBTENIDOS. PARTIENDO DE UN PRIMER REPERTORIO DE GENES QUE CODIFICAN UNA POBLACION DE UNO DE DOS TIPOS DE POLIPEPTIDOS SUSCEPTIBLES DE ASOCIARSE, PARTICULARMENTE DE REGION VARIABLE DE CADENA LIGERA DE ANTICUERPOS, Y DE AL MENOS UN GEN Y PREFERENTEMENTE UN SEGUNDO REPERTORIO QUE CODIFICA EL OTRO TIPO DE POLIPEPTIDO, PARTICULARMENTE UNA REGION VARIABLE DE CADENA PESADA DE ANTICUERPOS, SE INTRODUCEN LOS GENES DE DICHO PRIMER REPERTORIO EN UN PRIMER VECTOR PARA FORMAR UNA POBLACION DE VECTORES Y LOS GENES DE DICHO SEGUNDO REPERTORIO EN UN SEGUNDO VECTOR, SIENDO UNO AL MENOS DE DICHOS VECTORES, RECEPTOR PARA EXPRESAR LOS DOS GENES EN FORMA DE POLIPEPTIOS ASOCIADOS A LA SUPERFICIE EXTERIOR DEL PRODUCTO DE DICHO VECTOR DE MANERA IRREVERSIBLE.

Description

Procedimiento de preparación de un banco multicombinatorio de vectores de expresión de genes de anticuerpos.
Las moléculas de anticuerpo están constituidas por la asociación de dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) por mediación de puentes disulfuro. Las dos cadenas pesadas están asociadas entre ellas según una estructura en forma de Y y las dos cadenas ligeras se asocian respectivamente a las dos ramas de esta estructura de tal forma que los dominios variables de las cadenas ligeras (V_{L}) y pesadas (V_{H}) estén situados próximos uno de otro. El enlace con el antígeno es el resultado de las propiedades de las partes variables de las cadenas ligeras y pesadas. Un sistema complejo de redisposición y de selección permite entonces inducir rápidamente una cantidad considerable de anticuerpos específicos contra un antígeno.
La técnica clásica de hibridomas permite la selección de clones de células híbridas que expresan genes que codifican las cadenas ligera y pesada de una molécula de anticuerpo. Esta técnica requiere la fusión de células de origen linfocítico, que contienen los genes que dirigen la formación de anticuerpos, y células susceptibles de conducir a hibridomas que forman estirpes inmortalizadas. Las células portadoras de los genes en cuestión se obtienen generalmente mediante la creación aleatoria de bancos de células en circulación, con o sin inmunización previa por el antígeno específico, y el examen de los hibridomas se efectúa mediante una reacción antígeno-anticuerpo después de las multiplicaciones y cultivos de clones de hibridomas. Esta técnica es fatigosa, de un rendimiento limitado y el examen no es fácil.
Se ha puesto en práctica recientemente otro método que utiliza bacteriófagos recombinantes. Los principios y diversas realizaciones de este procedimiento se describen, por ejemplo, por D.R. Burton, Tiptech- mayo de 1991, vol. 9, 169-175; D.J. Chiswell et al., Tiptech- marzo de 1992, vol. 10, 80-84; H.R. Hoogenboom et al., Rev. Fr. Transfus. Hémobiol., 1993, 36, 19-47 (véanse igualmente las solicitudes de patente PCT WO 92/01047 y 92/20791).
Esta técnica consiste en insertar, en un vector, un repertorio de genes de regiones variables de anticuerpo en asociación con un gen de bacteriófago en condiciones que permitan la expresión del gen en forma de una proteína de fusión que se presenta en la superficie del fago, exponiendo las regiones variables de las cadenas variables ligera y pesada asociadas mediante sus puentes disulfuro en forma de un fragmento Fab de anticuerpo, y seleccionar directamente los fagos mediante un método rápido de separación utilizando el antígeno específico inmovilizado, por ejemplo, mediante cromatografía de inmunoafinidad. Los fagos seleccionados, después de la elución, pueden infectar una bacteria y utilizarse para una producción directa o para repetir ciclos de selección. Este método es particularmente potente, ya que permite la creación, en teoría, de bancos muy considerables y un examen extremadamente fino, eficaz y rápido del banco. Un fago que se presta particularmente bien a este procedimiento es el fago filamentoso fd, en el que se puede fusionar el fragmento que codifica una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con el gen de la proteína minoritaria de superficie e insertar el fragmento que codifica la otra cadena de modo que, después de la infección de bacterias por el fago, se obtiene una población de fagos portadores en su superficie de una proteína de fusión que presenta las cadenas pesada y ligera en una configuración capaz de reconocer el antígeno, y por tanto
examinable.
Además de su simplicidad, esta técnica presenta grandes ventajas. En asociación con la amplificación previa del banco de genes de anticuerpo, puede llegarse a seleccionar un fago que presente un fragmento de anticuerpo específico en una población muy grande de fagos, del orden de 10^{7}, lo que puede permitir buscar los genes de anticuerpos humanos sin tener que proceder obligatoriamente a la inmunización previa del donante.
Mediante escisión seguida de religamiento, o a partir de dos bancos separados de genes de cadenas ligeras y de cadenas pesadas, se pueden obtener fagos que asocian una cadena ligera y una cadena pesada aleatoriamente.
Sin embargo, el número de clones diferentes que se puede obtener está limitado por el rendimiento de la selección y por el grado de eficacia de la transformación bacteriana.
Se ha descrito un medio de aumentar el número de asociaciones exitosas que asocian las cadenas ligeras de un primer banco con las cadenas pesadas de un segundo banco por P. Waterhouse et al., Nucleic Acids Research, 1993, vol. 21, nº 9, 2265-2266, que permite obtener hasta 10^{12} clones utilizando un sistema de recombinación específico de sitios loxP sensible a la acción de una recombinasa Cre. Sin embargo, la asociación permanece reversible. Además, no existe ningún control de la acción de la recombinasa y los vectores recombinados no tienen ninguna ventaja selectiva con relación a los otros vectores.
La solicitud de patente PCT WO 93/19172 describe un procedimiento de preparación de un banco multicombinatorio de miembros de un par de enlace, especialmente mediante la integración reversible de un fagémido portador de un sitio Att P en un plásmido que presenta un sitio Att B, estando flanqueado entonces el ADN integrado por dos sitios AttL y AttR.
Ahora bien, teniendo en cuenta el rendimiento de la etapa de selección de los fagos recombinados que, en realidad, sólo retiene una fracción de los fagos interesantes, es deseable obtener los rendimientos más altos posibles de vectores recombinados con los menores posibles de vectores no recombinados.
Es por tanto un objetivo de la invención proporcionar un procedimiento de producción de bancos multicombinatorios, y especialmente en forma de fagos o fagémidos, a partir de dos repertorios de genes, uno de cadenas ligeras y otro de cadenas pesadas, que permita obtener un número de clones muy elevado.
Es otro objetivo de la invención proporcionar un procedimiento tal en el que el número de vectores no recombinados presentes al final del procedimiento sea reducido.
Es otro objetivo de la invención producir recombinantes tales que tengan una estabilidad aumentada.
La invención tiene como objeto un procedimiento de producción de bancos multicombinatorios en el que, partiendo de un primer repertorio de genes que codifican una población de uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, de manera covalente o no, especialmente de regiones variables de uno de los tipos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo, y al menos de un gen que codifica el otro tipo de polipéptido, especialmente una región variable del otro tipo, de cadena de anticuerpo o preferiblemente de un segundo repertorio de genes que codifican una población de dicho otro tipo, se introducen los genes de dicho primer repertorio en un primer vector para formar una población de vectores portadores de los diferentes genes de dicho primer repertorio, y se introduce dicho gen de dicho otro tipo o los genes de dicho segundo repertorio en un segundo vector, estando dispuesto al menos uno de dichos vectores de tipo fagémido, denominado receptor, para recibir, mediante recombinación con el otro vector de tipo plásmido, todo o parte de dicho otro vecto, con su gen, en condiciones que permitan a dicho vector fagémido receptor contener, después de recombinación, un gen de uno de los dos tipos y un gen del otro tipo y expresar los dos genes en forma de polipéptidos asociados susceptibles de aparecer en la superficie exterior de un fago, manteniéndose allí y estando asociados entre ellos de forma multimérica o simulando un multímero.
A continuación, se describirá la invención en la aplicación en la que los dos tipos de polipéptidos son regiones, al menos parcialmente variables, de cadenas ligeras y de cadenas pesadas de anticuerpo. Sin embargo, se entiende que se aplica a otros tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, y especialmente a las cadenas de receptores heterodiméricos tales como las cadenas \alpha y \beta o \gamma y \delta de receptores de células T.
Los vectores, preferiblemente circularizados, contienen respectivamente los sitios de recombinación específicos attB de E. coli y attP del fago \lambda dispuestos de forma que permitan la recombinación bajo el efecto de la recombinasa o integrasa asociada formando, de forma irreversible en un vector único resultante de la combinación, las secuencias de unión estables attL y attR.
Por supuesto, se podrían igualmente reemplazar estos sitios por sitios de recombinación específicos de otros sistemas de recombinación, bacteriófagos u otros.
De forma que se permita la eliminación de vectores que comprenden sólo una cadena única y se obtenga en consecuencia un aumento suplementario del contenido relativo de vectores recombinados, dicho vector puede estar dispuesto para presentar un marcador de selección inicialmente no funcional y funcionalizado mediante la recombinación.
Preferiblemente, el marcador de selección comprende un gen que permite la selección, cuando se expresa, y un promotor propio del gen, estando insertado el promotor en uno de los vectores y el gen marcador en el otro, de forma que se encuentren asociados en el vector de recombinación obtenido. Entre los marcadores preferidos figuran los genes de resistencia, con su promotor, al cloranfenicol, a tetraciclinas y a gentamicina.
Por supuesto, los dos vectores pueden comprender igualmente marcadores propios utilizables en la construcción específica de cada uno de los vectores, de forma que se permita o mejore la selección de cada uno de los vectores durante su proceso de construcción. A modo de ejemplo, estos marcadores pueden ser los genes de resistencia a antibióticos tales como kanamicina y ampicilina.
Preferiblemente, se utiliza, para controlar la etapa de recombinación entre el primer y el segundo vectores, una recombinasa termoinducible, por ejemplo mediante la elección de un huésped apropiado tal como la cepa D1210 HP de E. coli que figura en el catálogo de la compañía estadounidense Stratagène.
La invención tiene igualmente como objeto los vectores fagémidos susceptibles de obtenerse mediante el procedimiento según la invención y que se caracterizan por la presencia de una secuencia que codifica una parte variable de cadena ligera de anticuerpo y una secuencia que codifica una parte variable de cadena pesada de anticuerpo, estando acompañadas dichas secuencias, en marcos convenientes, por elementos que permitan su expresión en un huésped, estando separadas respectivamente dichas secuencias de cadena ligera y de cadena pesada, con dichos medios a los que están asociadas, por sitios únicos de integración irreversibles attR y attL.
Finalmente, la invención tiene como objeto bancos multicombinatorios formados por los vectores según la invención y que asocian, de forma aleatoria, una secuencia que codifica uno de los tipos de polipéptidos, tal como una parte variable de cadena ligera, y una secuencia que codifica el otro tipo de polipéptido, tal como una parte variable de cadena pesada.
Se va a describir ahora un ejemplo de construcción de un vector recombinado según la invención que combina partes variables de la cadena ligera y de la cadena pesada de un mismo clon anti-gp160 de VIH, vector que se revela capaz de expresar los genes de dichas partes variables ligeras y pesadas y de presentar sus productos de expresión en su superficie o, en variantes, de suministrarlos en forma de una asociación cadena pesada-cadena ligera que reconoce al antígeno gp160.
Podrá utilizarse la misma técnica para realizar las construcciones multicombinatorias que asocian los genes de un repertorio de partes variables de cadena ligera con un gen de parte variable de cadena pesada, o un repertorio de partes variables de cadena pesada con un gen de parte variable de cadena ligera, o dos repertorios de partes variables pesadas y ligeras.
La figura 1 representa esquemáticamente las etapas de construcciones que parten de pM822 para llegar a pM825.
La figura 2 representa esquemáticamente las etapas de construcción que parten de pM829 para llegar a pM833.
La figura 3 representa esquemáticamente la etapa de recombinación de pM827 y pM834.
La figura 4 representa una vista esquemática del vector multicombinatorio pM835 obtenido.
La figura 5 representa los cebadores de amplificación de pACYC177.
La figura 6 representa la secuencia del engarce de 30 pb.
La figura 7 representa el oligonucleótido que incorpora la secuencia de recombinación AttB.
La figura 8 representa la secuencia del engarce de 70 pb.
La figura 9 representa los cebadores de amplificación del promotor lac.
La figura 10 representa la secuencia del engarce de 98 pb.
La figura 11 representa los cebadores de amplificación de la cadena V_{L} anti-gp160.
La figura 12 representa los cebadores de amplificación de pM825.
La figura 13 representa los cebadores de amplificación del gen de resistencia al cloranfenicol.
La figura 14 representa la secuencia del engarce de 68 pb.
La figura 15 representa la secuencia del engarce de 115 pb.
La figura 16 representa los cebadores de amplificación del gen III.
La figura 17 representa los cebadores de amplificación de la cadena V_{H} anti-gp160.
La figura 18 representa los cebadores de amplificación de la secuencia de recombinación AttP.
La figura 19 representa los cebadores de amplificación de la cadena pesada que introducen la mutación Ambre.
La figura 20 representa los cebadores de amplificación del promotor del gen de resistencia al cloranfenicol.
I - Creación de un plásmido que posee un origen de replicación p15A, un gen de resistencia a la kanamicina y una secuencia de recombinación AttB para la inserción del gen o del banco de genes de regiones variables de cadena ligera
1) Se procede a la amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de un fragmento de 2.050 pb que cubre las bases 759 a 2.810 del plásmido pACYC177. Este plásmido (ATCC 37031), difundido por la compañía Biolabs, está catalogado y se describe su secuencia en los bancos de datos (nº de acceso Genbank X06402). Este fragmento amplificado comprende el gen de resistencia a la kanamicina, incluido su promotor, el origen de replicación p15A y un sitio EcoRI en cada extremo. El fragmento amplificado mediante PCR se recirculariza a continuación para formar un plásmido denominado pM822, de 2.056 pb.
Los cebadores utilizados para la amplificación del fragmento se describen en la figura 5 y en los identificadores SEC ID Nº 1 y 2.
2) En el sitio EcoRI único del vector pM822 se inserta un adaptador (engarce) sintético de 30 pb que comprende los sitios de restricción SacI, KpnI, XbaI y SphI, denominándose pM823 el vector obtenido de 2.086 pb. Las secuencias de cebador adaptador (engarce) sintético aparecen en la figura 6 y en los identificadores SEC ID Nº 3
y 4.
3) Se inserta en el vector pM823 la secuencia de recombinación AttB de 23 pb en forma de un oligonucleótido sintético entre los sitios SacI y KpnI, controlando la orientación 5'-3' mediante la destrucción del sitio SacI mediante la modificación de su última base. Se obtiene así un plásmido pM824 de 2.107 pb. Las secuencias oligonucleotídicas sintéticas que corresponden al sitio de recombinación AttB se describen en la figura 7 y los identificadores SEC ID Nº 5 y 6.
4) Inserción del módulo que permite la clonación de las partes variables de las cadenas ligeras V_{L}
- Para construir un fagémido denominado pM452, se procede a la digestión del fagémido pBluescript IISK+ (comercializado por Stratagène) de 2.961 pb por las enzimas AflIII y KpnI y a la eliminación de un fragmento de 501 pb que comprende el promotor de lactosa y diferentes sitios de clonación. Se sintetiza un adaptador de 70 pb representado en la figura 8, cuyas secuencias de cebadores se describen en los identificadores SEC ID Nº 7 y 8, que comprende los sitios de restricción BglII, NheI, EcoRI, SacI, XbaI y NotI, y se inserta el engarce entre AflIII y KpnI para llegar a un fagémido pM836 de 2.530 pb.
- Se inserta entre los sitios NheI y EcoRI un fragmento de 171 pb amplificado mediante PCR a partir de pBluescript (bases 802 a 973) utilizando los cebadores correspondientes a los identificadores de secuencia SEC ID Nº 9 y 10 (figura 9), conteniendo este fragmento el promotor lac, para obtener el fagémido pM837.
- Se inserta entre EcoRI y SacI de pM837 un adaptador sintético de 98 pb que contiene la secuencia señal PelB (figura 10 e identificadores SEC Nº ID 11 y 12) para obtener finalmente un fagémido pM838 de 2.795 pb.
- Se inserta a continuación la secuencia que codifica la región V_{L} de cadena ligera de un clon anti-gp160 de VIH de 642 pb amplificada mediante PCR (banco de ADNc) entre los sitios SacI y XbaI, lo que permite la conservación de la fase de lectura entre PelB y la cadena ligera. Los cebadores (figura 11) se definen en los identificadores de secuencia SEC ID Nº 13 y 14. Se obtiene el fagémido pM452 (3.427 pb) que contiene el módulo V_{L} (promotor lac, secuencia señal PelB y la secuencia (642 pb) que codifica la cadena ligera del clon anti-gp160.
- Se digiere el fagémido pM452 por NheI y XbaI para liberar un fragmento de 960 pb correspondiente al módulo V_{L}, fragmento que se purifica.
- Se inserta a continuación este fragmento en el vector pM824 al nivel de los sitios KpnI y XbaI con destrucción del sitio KpnI para controlar la orientación, dando el plásmido pM825 de 3.056 pb.
5) Se crea un sitio AscI único en posición 3' de la secuencia AttB por amplificación mediante PCR del plásmido pM825 entero con la ayuda de dos cebadores (figura 12) que poseen un sitio AscI en su extremo y que tienen las secuencias que figuran en los identificadores SEC ID Nº 15 y 16. El plásmido así modificado se denomina plásmido pM826 (3.050 pb).
Se amplifica mediante PCR el gen de resistencia al cloranfenicol (770 pb) desprovisto de su promotor a partir del plásmido pBR328 (Boehringer, acceso a Genbank VB0004). Se hace la amplificación con los cebadores (figura 13) cuyas secuencias están indicadas en los identificadores de las secuencias SEC ID Nº 17 y 18. Se clona a continuación el gen de resistencia al cloranfenicol en el plásmido pM826 al nivel del sitio AscI, determinando la orientación correcta para su expresión después de la etapa de recombinación mediante secuenciación. Se obtiene así un plásmido denominado pM827 de 3.816 pb.
II - Creación de un vector de tipo fagémido portador de dos orígenes de replicación ColE1 y f1, un gen de resistencia a la ampicilina y una secuencia de recombinación AttP para la inserción de un banco de regiones variables de cadenas pesadas 1) Modificación del vector pBluescript SKII+ (Stratagène, acceso de Genbank X52328) para obtener un fagémido capaz de presentar un Fab fusionado al nivel del gen III (proteína de superficie) en su superficie
- Después de la digestión de pBluescript por SacI y la destrucción del sitio SacI mediante la acción de la nucleasa de judía mungo más digestión por KpnI para eliminar el sitio de clonación múltiple (poliengarce) (107 pb), se inserta un adaptador sintético de 68 pb (figura 14) que contiene los sitios SacII, XhoI, SpeI, NheI y NotI (secuencias SEC ID Nº 19 y 20), obteniéndose el fagémido pM828 de 2.922 pb.
- Se crea un adaptador sintético de 115 pb (SEC ID Nº 21 y 22) que contiene la secuencia señal PelB. Este engarce (figura 15) se inserta entre los sitios SacII y XhoI para dar el fagémido pM829 de 3.034 pb.
Se procede a la inserción, entre los sitios SpeI y NheI de pM828, de un adaptador flexible de 15 pb (fig. 16 e identificadores SEC ID Nº 23 y 24) y del gen III del fago M13 (663 pb) después de amplificación mediante PCR en el fago M13 mp18 de las bases 2.223 a 2.885 (Biolabs, acceso a Genbank X02513), obteniéndose el fagémido pM830 de 3.709 pb.
- Se amplifica mediante PCR la cadena pesada de un clon (ADNc) anti-gp160 de VIH de 684 pb con la ayuda de los cebadores de SEC ID Nº 25, 26 (figura 17). Esta cadena pesada se inserta a continuación entre los sitios XhoI y SpeI del fagémido pM830 para llegar al fagémido pM831 de 4.384 pb, con conservación de la fase de lectura entre PelB y la cadena pesada y entre ésta y el gen III.
2) Inserción de la secuencia de recombinación AttP de 250 pb al nivel del sitio NheI después de amplificación mediante PCR en el fago \lambda de las bases 27.571 a 27.820 (Biolabs, acceso de Genbank V00636). Los cebadores utilizados (figura 18) poseen las secuencias SEC ID Nº 27 y 28. La secuencia de recombinación AttP amplificada puede insertarse con dos orientaciones posibles, pero sólo se retiene una orientación. Se llega así al fagémido pM832 de 4.641 pb que comprende la estructura representada en la figura 3.
3) Modificación del vector para la producción de Fab solubles
Para producir fácilmente Fab solubles, se introduce pues una mutación Ambre (identificada como un codón de paro en las cepas bacterianas no supresoras) entre la cadena pesada y el gen III, conservando la fase. La cadena pesada se amplifica mediante PCR con un cebador en 5' que posee el sitio XhoI (SEC ID Nº 25) y otro en 3' (SEC ID Nº 29, véase la figura 19) que contiene el sitio SpeI seguido del codón TAG Ambre, además del sitio XbaI compatible con SpeI. Se clona a continuación entre los sitios SpeI y XhoI del vector pM832, llegando al fagémido pM833 de
4.650 pb.
4) Inserción del promotor del gen de resistencia al cloranfenicol al nivel del sitio único KpnI situado en 3' de la secuencia de recombinación AttP. Una sola orientación confiere una nueva resistencia al vector recombinado. El promotor (177 pb) se amplifica previamente mediante PCR a partir de las bases 3.270 a 3.440 del vector pBR328 (comercializado por Biolabs) con la ayuda de cebadores (figura 20) cuyas secuencias se indican en los identificadores de secuencia SEC ID Nº 30 y 31. Se obtiene así el fagémido pM834 de 4.827 pb.
III. Recombinación entre los dos vectores pM827 y pM834
Los dos plásmidos anteriormente citados servirán como punto de partida para obtener bancos de anticuerpos multicombinatorios. En el ejemplo representado, se efectuará la recombinación entre las cadenas V_{L} y V_{H} de los clones anti-gp160 de VIH utilizados. Sin embargo, si los dos vectores se construyen a partir de bancos de genes de cadenas pesadas y/o de genes de cadenas ligeras de anticuerpos, permitirán obtener un banco multicombinatorio de anticuerpos que se podrá examinar a continuación.
Transformados en una cepa adecuada (D1210HP), los dos vectores podrán asociarse gracias a las secuencias AttP y AttB, dianas de un factor de recombinación int inducible. Los mecanismos de recombinación se describen en el capítulo 9 del libro "The recombination of genetic material", (Miller, H.V., "Viral and cellular control of site-specific recombination", 1988, pág. 360-384, editado por Brooks Low K., Academic Press). El vector multicombinatorio así creado (8.643 pb) poseerá tres orígenes de replicación diferentes, tres resistencias a antibióticos y los dos módulos que permiten la expresión de las cadenas V_{L} y V_{H}.
1) Se procede a la transformación mediante electroporación de la cepa de E. coli D1210HP (difundida por Stratagène), y que contiene la recombinasa inducible int, con el episoma F' en forma de ADN que proviene de la cepa bacteriana XL1-Blue (difundida por Stratagène). Las bacterias son así infectables por un fago filamentoso. El episoma F' se mantiene en la cepa gracias a su resistencia a la tetraciclina. La cepa D1210HP-F' así transformada posee el genotipo siguiente: D1210HP-F': HB101, lacI^{q}, lacY^{+}, \lambdaxis^{-} kil^{-} cI857 [F', proAB, lacI^{q}Z\DeltaM15, Tn10(Tet^{R})].
2) Etapas de la recombinación
- Se procede a la transformación de esta cepa mediante el plásmido pM827 (que contiene las cadenas V_{L} y resistente a la kanamicina) y, en paralelo, se transforma una cepa compatible, por ejemplo XL-1 Blue, mediante el fagémido pM834 (resistente a la ampicilina y portador de las cadenas V_{H}).
A partir de la cepa transformada mediante el fagémido pM834, se prepara éste en forma de fago y después se infecta el cultivo de D1210 HP-F’ que contiene el plásmido pM827 a 30ºC (DO= 0,6).
Después de 30 min de infección a 30ºC, se somete el cultivo a un shock térmico a 42ºC durante una hora para desencadenar la recombinación bajo el efecto de la recombinasa inducible.
Después de volver a poner el cultivo a 30ºC y añadir cloranfenicol (50 a 100 \mug/ml final), se extienden los clones sobre medio gelosado que contiene cloranfenicol. Se añade una hora después el fago auxiliar VCSM13 (Kan^{R}) de Stratagène a razón de 10^{12} ufp/100 ml de cultivo. Además, se añade dos horas después la kanamicina a 70 \mug/ml final y se deja el cultivo varias horas a 30ºC.
El análisis de los clones después de recombinación de los vectores pM827 y pM834 muestra que la asociación se ha desarrollado bien. Se obtiene un fagémido recombinado pM835 de 8.463 pb estable que expresa un Fab y sigue siendo capaz de infectar la cepa D1210HP-F. Los puntos de unión AttL y AttR se han verificado mediante secuenciación.
IV. Preparación de un banco multicombinatorio a partir de un banco de cadenas ligeras y de un banco de cadenas pesadas
La etapa de inserción I.4 de la región variable de la cadena ligera del clon anti-gp160 de VIH amplificado mediante PCR se reemplaza por una inserción similar de las regiones variables de cadenas ligeras de un banco de cadenas ligeras de anticuerpo amplificado mediante PCR con la ayuda de un sistema de cebadores conocido conveniente propio del tipo de cadena ligera buscada, o de una pluralidad de sistemas de cebadores si se desea efectuar la multicombinación a partir de poblaciones de diferentes tipos de cadenas ligeras. Los sistemas de cebador que permiten la amplificación de las cadenas ligeras son bien conocidos y se describen por W.D. Huse et al., Science, vol. 246 (1989), 1275-1281.
Del mismo modo, para la clonación de cadenas pesadas, se reemplaza la etapa de inserción II.1 de la cadena pesada de un clon anti-gp160 de VIH por la inserción de un banco de regiones variables de cadenas pesadas amplificado mediante PCR con la ayuda de sistemas de cebador convenientes descritos por M.J. Campbell et al., Molecular Immunology, vol. 29, nº 2, (1992), 193-203 o por W.D. Huse et al. anteriormente.
Después de las etapas de recombinación, se seleccionan los clones resistentes al cloranfenicol y se procede a continuación al examen destinado a seleccionar los clones que expresan asociaciones de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo que tienen las afinidades buscadas contra los antígenos determinados, según las técnicas descritas, por ejemplo, por S.F. Parmley et al., Gene 73 (1988), 305-318.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 58 avenue Leclerc
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Lyon
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69007
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento de preparación de un banco multicombinatorio de vectores de expresión de genes de anticuerpos, bancos y sistemas de expresión de anticuerpos "coliclonales" obtenidos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 31
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador pACYC+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAATTCCC CTTAAATAAGA TGATCT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador pACYC-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAATTCCA TTCAACAAAG CCGCCGTC 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pAC Link+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCGAGCT CGGTACCTCT AGAGCATGCG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pAC Link-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCGCATG CTCTAGAGGT ACCGAGCTCG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: secuencia de recombinación AttB Sac-Kpn+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCTGCTTTT TTATACTAAC TTGGTAC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: secuencia de recombinación AttB Sac-Kpn-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAGTTAGTA TAAAAAAGCA GGCAGCT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 79 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVL Link+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVL Link-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador Pro Lac+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCTAGCT AACACGACAG GTTTCCCGAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador Pro Lac-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCGT AATCATGGTC ATAGCT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 108 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVL PelB+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 100 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVL PelB-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador VL5
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador CL2
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCCGTCTAG AACTATGAAC ATTCTGTAGG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador pAC Asc+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGCGCGCC TAGTAACACG ACAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador pAC Asc-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGCGCGCC GGTACCAAGT TAGTA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador del gen Cm Asc+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGCGCGCC GAGTTATCGA GATTTT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador del gen Cm Asc-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGCGCGCC ATTCATCCGC TTAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVH Link+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVH Link-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 117 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVH PelB+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVH PelB-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVH GIII+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACTAGTG TGGCGGTGGC TCTCCATTCG TTTGTGAAT 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce pVH GIII-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCTAGCA TAATAACGGA ATACCCAAAA G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce VH4f
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador de engarce CGlz
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATGTACTA GTTTTGTCAC AAGATTTGGG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador AttP Nhe+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCTAGCC GCGCTAATGC TCTGTTACAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador AttP Nhe-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGCTAGCA TCAAATAATG ATTTTATTT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador Amb PCR
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTCTAGACT AACTAGTTTT GTCACAAGAT TTG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador Pro Cm Kpn+
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGTACCGA ATAAATACCT GTGA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE CADENAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido sintético: cebador Pro Cm Kpn-
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGTACCAA AAAATACGCC CGGTA 
\hfill
25

Claims (7)

1. Procedimiento de producción de bancos multicombinatorios en el que, partiendo de un primer repertorio de genes que codifican una población de uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente de regiones variables de uno de los tipos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo, y de al menos un gen que codifica el otro tipo de polipéptido, especialmente una región variable del otro tipo de cadena de anticuerpo, o preferiblemente de un segundo repertorio de genes que codifican una población de dicho otro tipo, se introducen los genes de dicho primer repertorio en un primer vector para formar una población de vectores portadores de los diferentes genes de dicho primer repertorio, y se introduce dicho gen de dicho otro tipo o los genes de dicho segundo repertorio en un segundo vector, estando dispuesto al menos uno de dichos vectores de tipo fagémido, denominado receptor, para recibir, mediante recombinación con el otro vector de tipo plásmido, todo o parte de dicho otro vector, con su gen, en condiciones que permitan a dicho vector fagémido receptor contener, después de la recombinación, un gen de uno de los dos tipos y un gen del otro tipo y expresar los dos genes en forma de polipéptidos asociados susceptibles de aparecer en la superficie exterior de un fago, manteniéndose allí y estando asociados entre ellos de forma multimérica o simulando un multímero, caracterizado porque dichos primer y segundo vectores contienen respectivamente uno de los sitios de recombinación específica attB de E. coli y attP del fago \lambda, dispuestos de forma que permitan la recombinación bajo el efecto de una recombinasa o integrasa asociada formando, de forma irreversible en un vector único resultante de la recombinación, las secuencias de unión estables attL y attR.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el vector recombinante obtenido a partir de dichos primer y segundo vectores está dispuesto para presentar un marcador de selección inicialmente no funcional y funcionalizado mediante la recombinación.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el marcador de selección comprende un gen que permite la selección, cuando se expresa, y un promotor propio del gen, estando insertado el promotor en uno de dichos primer y segundo vectores y el gen marcador en el otro.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el marcador es el gen de resistencia a un antibiótico, especialmente un gen del grupo formado por los genes de resistencia a tetraciclinas, a gentamicina y a cloranfenicol, con su promotor.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se utiliza, para controlar la etapa de recombinación entre el primer y el segundo vectores, una recombinasa termoinducible.
6. Vectores fagémidos susceptibles de obtenerse mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, y que se caracterizan por la presencia de una secuencia que codifica uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente una parte variable de cadena ligera de anticuerpo, y una secuencia que codifica el otro de dichos dos tipos, especialmente una parte variable de cadena pesada de anticuerpo, estando acompañadas dichas secuencias, en los marcos convenientes, por elementos que permitan su expresión en un huésped, estando separadas respectivamente dichas secuencias de cadena ligera y de cadena pesada, con dichos medios a los que están asociadas, por secuencias relativas a los sitios únicos de integración attR o attL.
7. Bancos multicombinatorios de vectores, formados por los vectores según la reivindicación 6, y que asocian de forma aleatoria una secuencia que codifica uno de los dos tipos de polipéptidos susceptibles de asociarse, especialmente una parte variable de cadena ligera de anticuerpo, y una secuencia que codifica el otro de dichos dos tipos, especialmente una parte variable de cadena pesada de anticuerpo.
ES95908302T 1994-02-10 1995-02-02 Procedimiento de preparacion de un banco multicombinatorio de vectores de expresion de genes de anticuerpos. Expired - Lifetime ES2257740T3 (es)

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