ES2279761T3 - Seleccion in vitro e identificacion opcional de polipeptidos usando vehiculos de soporte solido. - Google Patents

Abstract

Un método para la selección de uno o múltiples polipéptidos deseados, que comprende: (a) expresión acelular de moléculas de ácidos nucleicos inmovilizadas sobre un sistema de soporte sólido para producir polipéptidos, en donde el soporte sólido porta un medio para la interacción específica con al menos el polipéptido deseado o una molécula unida al mismo; (b) separación del soporte sólido que porta tanto el polipéptido deseado como el ácido nucleico que lo codifica; y, opcionalmente, (c) recuperación de dicho ácido nucleico y/o dicho polipéptido deseado.

Description

Selección in vitro e identificación opcional de polipéptidos usando vehículos de soporte sólido.

Esta invención proporciona la metodología para la selección in vitro y, si así se desea, la subsiguiente identificación de proteínas o péptidos con propiedades deseadas de combinaciones de variantes de proteínas o péptidos (bibliotecas).

Las proteínas y péptidos, a los que se hará referencia en lo sucesivo como polipéptidos, con propiedades deseadas tales como afinidad de fijación a una molécula diana particular, actividad catalítica, actividad química o enzimática, o actividad inmunogénica, son de gran importancia en muchas áreas de la biotecnología tales como el desarrollo de medicamentos y vacunas, aplicaciones diagnósticas, y bioseparación.

Recientes avances en tecnología de los genes han dado lugar a la introducción de nuevos principios de aislamiento e identificación de estos polipéptidos a partir de grandes colecciones de variantes, construidas por diferentes métodos, incluyendo principios de combinación (Clackson y Wells, Trends Biotechnol. 12, págs. 173-184 [1994]). Típicamente, utilizando biosíntesis para la producción de miembros de la biblioteca, se construyen grandes combinaciones de genes que codifican los miembros individuales de la biblioteca, permitiendo la posterior selección o el enriquecimiento de variantes deseadas, empleando una molécula cebo o las condiciones químicas apropiadas (Smith y Petrenko, Chem. Rev. 97, págs. 391-410 [1997]). Para la identificación de las variantes seleccionadas, se han descrito múltiples técnicas para proporcionar un enlace físico entre la proteína traducida (fenotipo) y la información genética que la codifica (genotipo), lo que permite la identificación de miembros seleccionados de la biblioteca empleando tecnología de secuenciación de ADN.

Con el uso de tecnología de presentación en bacteriófagos o células (phage or cell display), se obtiene un acoplamiento de genotipo-fenotipo a través de la incorporación de los miembros individuales de la biblioteca a las estructuras de cubierta o superficie celular de bacteriófagos o células, respectivamente, que contienen el gen correspondiente, que típicamente está insertado en el ADN de bacteriófago, fagomidio, plasmidio o viral. En la construcción de estas bibliotecas, es necesario transformar las combinaciones de genes en una célula receptora usada para la biosíntesis de las correspondientes proteínas. Las limitaciones prácticas asociadas con este paso para obtener bibliotecas grandes (complejas) (típicamente con 10^{9} miembros diferentes) han sido la fuerza de impulso para el desarrollo de tecnologías alternativas basadas en la trascripción y traducción in vitro de información genética, evitando, de esta forma, el paso de transformación.

Ejemplos de estas tecnologías son la presentación en ribosomas (ribosomal display) (Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, págs. 9022-9026 [1994]; Hanes et al., FEBS Letters 450, págs. 105-110 [1999]) y las fusiones de ARN-péptido usando puromicina (Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, págs. 12297-12302 [1997]). En la presentación en ribosomas, se trascribe in vitro una combinación de genes (típicamente productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que contienen las señales necesarias para la trascripción y traducción) para producir una correspondiente combinación de ARNm usado para la traducción, mediada por ribosomas, de proteínas que, típicamente debido a la ausencia de señales de detención de la traducción, permanecen físicamente unidas al complejo ribosoma-ARNm. Esto permite la selección de polipéptidos sobre la base de sus características, y la identificación por secuenciación de ADN, tras la conversión del ARNm asociado al ribosoma en ADN mediante el uso de trascriptasa inversa. Sin embargo, se deben adoptar precauciones especiales (temperatura, condiciones de tampón) para garantizar la estabilidad de los complejos ribosoma-ARNm-proteína, las cuales limitan las condiciones bajo las cuales se puede llevar a cabo la selección (Jermutus et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9, págs. 534-548 [1998]; Hanes et al., véase obra citada [1999]). En el documento WO 98/54312 se exponen desarrollos adicionales del método de la presentación en ribosomas. Los autores describen un método eucariótico de presentación en ribosomas y afirman que resulta útil en la selección de, por ejemplo, anticuerpos. En el sistema de fusión de ARN-péptido, se utiliza durante la traducción ARN marcado con puromicina, lo que da como resultado enlaces covalentes de ARN-proteína/péptido a través de la aceptación por parte de los ribosomas de la puromicina en la cadena polipeptídica naciente. Sin embargo, es necesario preparar nuevas fusiones de puromicina-ARNm para cada ronda de selección, limitando así fuertemente la eficiencia de la tecnología (Jermutus et al., véase obra citada [1998]; Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3, págs. 268-273 [1999]).

Tawfik y Griffiths (Natural Biotechnology, (1998) 16; 652-656) han descrito un sistema adicional, que está exento de células, pero intenta imitar el efecto de las células en la creación de compartimentos para enlazar genotipo y fenotipo. Se forman micelas utilizando una emulsión de agua en aceite que, a continuación, se pueden romper por la mezcla con éter. Sin embargo, este sistema no está libre de problemas, y el sistema bifásico tiene como consecuencia varias limitaciones prácticas. Al objeto de recuperar las moléculas encapsuladas, el sistema bifásico se debe romper mediante un procedimiento que es bastante laborioso, que requiere múltiples lavados y que da lugar a la pérdida de material. Adicionalmente, los componentes no acuosos necesarios para crear el sistema bifásico podrían inhibir o desnaturalizar biomoléculas, y la propia encapsulación dificulta el suministro de reactivos adicionales necesarios, por ejemplo, para la detección o captura de entidades moleculares específicas.

La presente invención se basa en el hallazgo de que mediante el uso de un soporte sólido tal como un sistema de partículas como portador de información genética (por ejemplo, ARN o ADN), utilizado para la identificación, y acoplando al mismo el correspondiente polipéptido traducido in vitro, se establece una metodología de enlace entre genotipo y fenotipo. El aislamiento de partículas sólidas de soporte, portadoras de uno o múltiples miembros de la biblioteca deseada, se puede llevar a cabo típicamente utilizando tecnología de clasificación que emplea, por ejemplo, marcas fluorescentes incorporadas en una molécula diana, o los miembros polipeptídicos de la biblioteca, o por aislamiento magnético empleando partículas magnéticas que contienen una molécula diana inmovilizada.

De esta forma, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la selección de uno o múltiples polipéptidos deseados, que comprende:

(a) expresión exenta de células de moléculas de ácidos nucleicos, inmovilizadas sobre un sistema de soporte sólido para producir polipéptidos, en donde el soporte sólido porta un medio para la interacción específica con al menos el polipéptido deseado o una molécula unida al mismo;

(b) separación del soporte sólido portador tanto del polipéptido deseado como del ácido nucleico que lo codifica; y, opcionalmente

(c) recuperación de dicho ácido nucleico y/o dicho polipéptido deseado, preferentemente del ácido nucleico.

El método de selección de la invención se puede considerar también como un método para enriquecer el polipéptido deseado de la biblioteca inicial de moléculas que lo contienen. El término "enriquecimiento" hace alusión al incremento de la proporción relativa del polipéptido deseado dentro de la muestra de moléculas variantes. Del mismo modo, se puede considerar que por medio de este método se enriquece una molécula de ácido nucleico de interés, es decir, que codifica el polipéptido deseado.

La etapa (a) está exenta de células. El término "célula" se utiliza en un sentido amplio, para incluir células y, preferentemente, sistemas similares a los celulares y comprende preferentemente, por lo tanto, liposomas, micelas formadas por emulsiones de agua en aceite, geles, sistemas de vidrio o cualquier otro sistema multifásico que genera una barrera física entre un sistema de expresión de genes/interacción bioespecífica y otro. De acuerdo con un aspecto preferido del presente método, no se produce compartimentalización verdadera, no se requiere ninguna membrana ni otro sistema de separación para aislar las moléculas individuales de ácidos nucleicos entre sí.

La etapa de separación (b) se puede llevar a cabo, de manera conveniente, por interacción del polipéptido deseado e inmovilizado con un reactante diana (por ejemplo, bioespecífico) apropiado, portador de un medio que permite la separación del complejo de soporte sólido/ácido nucleico/polipéptido deseado/reactante diana resultante. Dicho medio puede comprender, por ejemplo, una marca tal como una marca fluorescente, o una partícula magnética. De esta forma, el complejo se puede separar usando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), o por tecnología de separación magnética.

Los ácidos nucleicos inmovilizados pueden ser, por ejemplo, ARN o ADN que codifica polipéptidos individuales tales como los miembros de una biblioteca de proteínas. Se puede apreciar que su traducción in vitro se llevará a cabo en combinación, o después de la trascripción in vitro, en el caso de ADN inmovilizado.

Soportes sólidos adecuados para usar en la presente invención pueden ser cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos y extensamente utilizados o propuestos en la actualidad para procedimientos de inmovilización, separación, etc. Éstos pueden adoptar la forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas, fibras, capilares o tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, etc., siendo preferidos los soportes sólidos en forma de partículas. De forma conveniente, el soporte puede ser de vidrio, sílice, látex o un material polímero.

Perlas polímeras no magnéticas adecuadas para utilizar en el método según la invención se encuentran disponibles en Dyno Particles AS (Lillestr\diameterm, Noruega), así como en Qiagen, Pharmacia y Serotec. No obstante, para ayudar en la manipulación y separación, se prefieren las perlas magnéticas. El término "magnético" tal como se usa en este documento significa que el soporte es capaz de tener un momento magnético que le es impartido cuando se sitúa en un campo magnético y, de este modo, es desplazable bajo la acción de dicho campo.

De esta forma, utilizando el método según la invención, tras la expresión de genes y la interacción específica, las partículas magnéticas se pueden retirar hacia una superficie adecuada mediante la aplicación de un campo magnético, utilizando, por ejemplo, un imán permanente. Habitualmente, es suficiente aplicar un imán al lado del recipiente que contiene la mezcla de muestra para agregar las partículas a la pared del recipiente, y vaciar el resto de la muestra.

Se prefieren especialmente las partículas súper-paramagnéticas, por ejemplo, las conocidas partículas magnéticas comercializadas por Dynal AS (Oslo, Noruega), con la marca DYNABEADS, son apropiadas para utilizar en la presente invención.

Los métodos para la fijación de moléculas de ácidos nucleicos o restos proteínicos, tales como las moléculas de fijación análogas (cognate) o moléculas diana discutidas en este documento, a un soporte sólido son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, pero sin estar limitados a ellos, acoplamiento químico, por ejemplo, en el que intervienen grupos amina, aldehído, tiol, tioéter o carboxilo, o acoplamientos bioespecíficos, utilizando, por ejemplo, las interacciones entre estreptavidina y biotina, o sus análogos, IgG y proteína A o G, HSA, y proteína G, glutatión-S-transferasa (S-GT) y glutatión, maltosa y proteína que se fija a la maltosa, anticuerpo y antígeno (incluidas proteínas, péptidos, hidratos de carbono y haptenos), lectinas e hidratos de carbono, histidinas y grupos quelantes, e hibridación de ácidos nucleicos/ácidos nucleicos.

Los polipéptidos expresados pueden ser, de manera conveniente, proteínas de fusión que contienen una molécula de fusión por afinidad, en donde el soporte sólido porta una molécula de fijación análoga para dicho miembro de fusión por afinidad como medio para la interacción bioespecífica. De esta forma, la proteína de fusión expresada comprenderá, típicamente, una porción de miembro de fusión por afinidad, así como el polipéptido deseado o una variante molecular del polipéptido deseado de la biblioteca de moléculas que contiene el polipéptido deseado. Se genera, de este modo, una biblioteca de proteínas de fusión que tiene una porción variable, formada por el polipéptido deseado o variantes del mismo, procedentes de la biblioteca de partida, y una porción básicamente común, o miembro de fusión por afinidad. Según resulte apropiado, se hará referencia en este documento a bibliotecas moleculares que pueden ser bibliotecas de moléculas de ácidos nucleicos, o bibliotecas de polipéptidos. De manera similar, una molécula de la biblioteca puede hacer referencia a un polipéptido o a una molécula de ácido nucleico.

En una realización alternativa, se inmoviliza sobre el soporte sólido, como medio para la interacción bioespecífica, una molécula diana capaz de interactuar de forma bioespecífica con el polipéptido deseado. En esta realización, también se puede generar una biblioteca de proteínas de fusión, en donde cada proteína de fusión incorpora una proteína informadora que se puede utilizar, de manera conveniente, en la etapa de separación (b), así como el polipéptido deseado o una variante molecular del polipéptido deseado, de la biblioteca de moléculas que contiene el polipéptido deseado. De esta manera, se proporciona nuevamente el modelo de una porción variable y una porción básicamente común (en este caso, la proteína informadora). Cada molécula dentro de la biblioteca de proteínas de fusión tendrá preferentemente, de este modo, una región que es básicamente idéntica a la región correspondiente de otras moléculas en la biblioteca, en tanto que la región variable de cada miembro de la biblioteca diferirá de todas o, al menos, de la mayor parte de las regiones correspondientes de los restantes miembros de la biblioteca. En general, una región variable no diferirá significativamente de algunas o todas las regiones variables restantes dentro de la biblioteca de proteínas de fusión. Es posible investigar, de esta forma, el impacto de variaciones mínimas en la secuencia de aminoácidos primarios sobre, por ejemplo, la fijación.

La recuperación del o de los aminoácidos que codifican el o los polipéptidos deseados se puede efectuar, por ejemplo, mediante PCR, TCR de trascriptasa inversa, o amplificación por círculo rodante (rolling circle amplification).

La secuencia de ácido(s) nucleico(s) separados y/o amplificados se puede determinar, por ejemplo, por técnicas de secuenciación convencionales, permitiendo de este modo la determinación de la secuencia del polipéptido deseado para su identificación.

En un aspecto adicional de la invención, la combinación de partida de ácidos nucleicos que codifican los miembros individuales de la biblioteca puede ser de una complejidad considerable (por ejemplo, \geq10^{15} miembros) (Roberts, véase obra citada [1999]). El número de diferentes especies de ácidos nucleicos inmovilizadas por partícula portadora sólida se puede controlar en la preparación de las partículas, por ejemplo, mediante el uso de diferentes concentraciones de la molécula que actúa como ancla (por ejemplo, ADN, ARN, APN o una proteína), o por tratamiento previo de las partículas con material de competición. De esta forma, la selección de partículas discretas en solamente un único procedimiento de selección según la invención puede tener como resultado la selección simultánea de un número significativamente reducido de miembros de la biblioteca.

La realización de ciclos repetidos de acuerdo con la invención, empleando opcionalmente partículas de soporte de fase sólida con números sucesivamente decrecientes de sitios de anclaje para los ácidos nucleicos, y opcionalmente con la dilución simultánea del material de ácido nucleico, puede dar como resultado una convergencia gradual hasta un conjunto limitado de miembros de la biblioteca que pueden ser sometidos a análisis individual a nivel de clones, con el fin de identificar una especie de polipéptido deseada. Cuando se emplea una tecnología de selección tal como FACS, el uso de diferentes valores de umbral para la selección positiva puede permitir la selección rigurosa de partículas portadoras de fase sólida que contienen números elevados del miembro deseado de la biblioteca.

De manera alternativa, tras la reducción del número de miembros de la biblioteca por separación, de acuerdo con la invención, la combinación enriquecida de secuencias de ácidos nucleicos se puede someter a selecciones adicionales usando un principio de selección diferente tal como (pero sin estar limitado a) presentación en células, presentación de bacteriófagos, presentación en plasmidios, presentación en ribosomas, o fusiones de ARNm-péptidos.

De esta forma, el método según la invención es, preferentemente, un proceso iterativo con enriquecimiento del o de los polipéptidos de interés que aparecen a medida que se llevan a cabo más ciclos. En tanto que puede haber cierta difusión de los polipéptidos expresados y en la fijación a perlas (o regiones del soporte sólido, partículas, etc.) adyacentes, se preferirá la fijación local a la perla (o región de soporte sólido, partícula, etc.) propia. De esta manera, tras varios ciclos se logrará un enriquecimiento significativo. De este modo, las etapas (a) y (b) del método se llevarán a cabo, preferentemente, más de una vez; típicamente, el número de ciclos estará comprendido entre 1 y 100, preferentemente 2 y 50, más preferentemente entre 2 y 20, por ejemplo 5 a 10. De esta manera, el número de variantes puede quedar limitado de forma muy importante y el número relativamente pequeño remanente se puede analizar de modo individual, por ejemplo, por ELISA, análisis estadístico de clones tras la secuenciación, o por análisis de Biacore.

En otro aspecto de la invención, se puede utilizar la selección de un vehículo de soporte de fase sólida, portador de múltiples especies de ácidos nucleicos, incluido el miembro deseado de la biblioteca, para producir reactantes útiles sin la necesidad de identificar el miembro deseado de la biblioteca particular. De esta forma, el método se puede llevar a cabo de manera iterativa, pero deteniéndolo cuando la muestra seleccionada contiene todavía una población mixta de moléculas de ADN; este combinado de fragmentos de ADN se puede utilizar como material "policlonal", no definido a nivel molecular, pero que sigue siendo de utilidad.

En una realización adicional de la invención, se pueden inmovilizar dos bibliotecas diferentes de ácidos nucleicos sobre sistemas de soporte sólido separados, y el método se puede usar para seleccionar e identificar pares de polipéptidos que interactúan entre sí. De esta forma, por ejemplo, una de las bibliotecas de ácidos nucleicos puede codificar polipéptidos tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, dominios peptídicos o proteínicos, y la otra puede codificar polipéptidos codificados por ADNc.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una biblioteca molecular que comprende un sistema de soporte sólido sobre el cual se encuentra inmovilizada una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos, y asociado con cada una de dichas moléculas de ácidos nucleicos y también inmovilizado sobre dicho sistema de soporte, existe un medio para interacción específica con el producto de expresión de una o más de dichas moléculas de ácidos nucleicos.

El sistema de soporte sólido es, preferentemente, en forma de partículas y, de este modo, cada partícula portará, convenientemente, una molécula de ácido nucleico de la biblioteca, y un medio para la interacción bioespecífica con el producto de expresión de la misma. De esta manera, se alcanza la anteriormente mencionada "asociación" entre moléculas de ácidos nucleicos y un medio para la interacción bioespecífica. Como se ha analizado anteriormente de forma más detallada, la biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos codificará, de manera conveniente, proteínas de fusión, y los medios de interacción bioespecífica pueden interactuar, por lo general unirse, a la porción variable o común de dicha proteína de fusión.

En los dibujos adjuntos, que sirven para ilustrar la invención sin limitarla en modo alguno:

Figura 1 es una descripción esquemática del concepto básico de la invención. Una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos que codifican miembros individuales de la biblioteca de polipéptidos se encuentra inmovilizada sobre partículas de un vehículo de soporte sólido. En un formato basado en el ADN, los fragmentos están inmovilizados, tras lo cual se lleva a cabo una etapa acoplada de trascripción/ traducción que tiene como resultado la producción de los correspondientes productos génicos. En un formato basado en el ARN, se producen moléculas de ARN por trascripción a partir de los fragmentos de ADN, tras lo cual se les inmoviliza sobre el vehículo de soporte sólido, a lo que sigue una etapa de traducción que da como resultado los correspondientes productos génicos. De forma típica, pero no exclusiva, los productos génicos son proteínas de fusión entre miembros de la biblioteca de polipéptidos y una molécula de fusión por afinidad, para la cual se encuentra presente una molécula de fijación análoga sobre las partículas del vehículo de soporte sólido. La selección funcional de un polipéptido deseado tiene como resultado el aislamiento de partículas portadoras de los genes correspondientes (ADN o ARN), que se identifican tras amplificación nucleica y secuenciación de ADN.

Figura 2 es una descripción esquemática del uso de un soporte sólido como vehículo de información genética y proteínica acoplada (ADN inmovilizado/diana marcada en la versión de solución). Una biblioteca de construcciones de ADN (típica, pero no exclusivamente, fragmentos de PCR), que contiene señales necesarias para la trascripción de ARN de miembros de la biblioteca y la traducción de proteínas, se encuentra inmovilizada sobre partículas de un soporte portador adecuado (por ejemplo, utilizando la química de biotina/estreptavidina por la incorporación de un grupo de biotina en el ADN del cebador utilizado para la amplificación por PCR, y el uso de perlas recubiertas con estreptavidina). Las construcciones genéticas codifican miembros individuales de la biblioteca como fusionados genéticamente con una molécula común de fusión por afinidad (AFP), para el cual una molécula de fijación análoga (CBP) se encuentra inmovilizada sobre las partículas (por ejemplo, a través de un procedimiento de química de acoplamiento apropiada tal como la química de biotina/estreptavidina). Tras la adición de componentes para la trascripción y traducción in vitro (por ejemplo, un extracto de Escherichia coli S30), se producen moléculas de ARN (ARNm) que codifican los diferentes miembros de la biblioteca de proteínas subsiguientemente traducidos. A través de la interacción entre la molécula de fijación inmovilizada y la molécula de fusión por afinidad recientemente traducida, los miembros individuales de la biblioteca se encuentran enlazados físicamente con las partículas del vehículo de soporte sólido que contienen la información genética (ADN) que los codifica.

Después de lavarlas, las partículas del vehículo de soporte sólido se incuban con moléculas diana marcadas, por ejemplo, que comprenden isotiocianato de fluoresceína (FITC), lo que permite el aislamiento físico de partículas positivas para fluorescencia, por ejemplo por FACS o por separación magnética. De este modo, se aislan las partículas portadoras de complejos entre la marca diana y el producto de la biblioteca asociado a la partícula y su información genética (ADN).

Por ejemplo, mediante el uso de PCR, los fragmentos de ADN acoplados a partículas o perlas aisladas, individuales o múltiples, se re-amplifican y se utilizan para la identificación del o de los polipéptidos seleccionados, o rondas opcionalmente consecutivas de inmovilización de partículas, trascripción y traducción in vitro, seguidas por selección, por ejemplo, por FACS.

Figura 3 es una representación esquemática del uso de un soporte sólido como vehículo de información genética y proteínica acoplada (ARNm inmovilizado/diana marcada en versión de solución). A partir de una biblioteca de construcciones genéticas que contiene señales necesarias para la trascripción de los miembros de la biblioteca y la traducción de proteínas, se produce ARN (ARNm) (trascripción) in vitro, que se inmoviliza sobre partículas de un soporte de vehículo adecuado (por ejemplo, por hibridación entre secuencias complementarias presentes en el ARNm y fragmentos inmovilizados de ADN, PNA [ácido nucleico peptídico, en sus siglas en inglés] o ARN). Las moléculas inmovilizadas de ARNm codifican los miembros individuales de la biblioteca como genéticamente fusionados con una molécula de fusión por afinidad (AFP), para lo cual la molécula de fijación análoga (CBP) se encuentra inmovilizada sobre las partículas (por ejemplo, por química de biotina/estreptavidasa). Tras la adición de componentes para la traducción in vitro (por ejemplo, un extracto de Escherichia coli S30), las moléculas de ARNm se traducen para producir los diferentes miembros de la biblioteca de proteínas. Mediante la interacción entre la molécula de fijación inmovilizada y la molécula de fusión por afinidad recientemente traducida, los miembros individuales de la biblioteca quedan enlazados físicamente con las partículas del vehículo de soporte sólido que contienen la información genética (ARNm) que los codifica.

Después de lavarlas, las partículas del vehículo de soporte sólido se incuban con moléculas de la diana marcada, que comprenden, por ejemplo, FITC, permitiendo el aislamiento de las partículas positivas para fluorescencia, por ejemplo, por FACS. De esta forma, se aislan partículas individuales o múltiples, portadoras de complejos entre la diana marcada y el producto génico del miembro de la biblioteca asociado con las partículas, y su información genética (ARNm).

Mediante el uso de, por ejemplo, PCR de trascriptasa inversa, las moléculas de perla/ARNm asociado a las partículas se convierten en los correspondientes fragmentos de ADN que se amplifican por PCR y se utilizan para la identificación del o de los polipéptidos seleccionados u, opcionalmente, rondas consecutivas de trascripción in vitro, inmovilización sobre partículas, traducción in vitro, seguida de selección mediante, por ejemplo, FACS, o selección magnética.

Figura 4 es una representación esquemática del uso de un soporte sólido como vehículo de información genética y proteínica acoplada (versión de ADN inmovilizado/fijador marcado). Una biblioteca de construcciones de ADN (típica, pero no exclusivamente, fragmentos de PCR), que contienen señales necesarias para la trascripción de ARN de los miembros de la biblioteca, y la traducción de proteínas, se inmoviliza sobre partículas discretas de un vehículo de soporte adecuado (por ejemplo, empleando química de biotina/estreptavidina mediante la incorporación de un grupo de biotina en el ADN del cebador utilizado para la amplificación por PCR, y el uso de perlas recubiertas con estreptavidina). Las partículas portan también la molécula diana con la que se desea que interactúen los miembros de la biblioteca de interacción. Esta inmovilización se puede lograr utilizando, por ejemplo, químicas de acoplamiento estándares tales como la química de EDC/NHS o la química de biotina/estreptavidina. Las construcciones genéticas codifican los miembros individuales de la biblioteca como fusionados genéticamente con una molécula de fusión informadora (RFP) tal como una enzima o una proteína auto-fluorescente, tal como una proteína fluorescente verde (GFP). Tras la adición de componentes para la trascripción y traducción in vitro (por ejemplo, un extracto S30 de Escherichia coli), se producen moléculas de ARN (ARNm) que codifican los diferentes miembros de la biblioteca de proteínas subsiguientemente traducidos. Por la interacción entre la molécula diana inmovilizada y el miembro de la biblioteca recientemente traducido, los miembros individuales de la biblioteca, capaces de interactuar con la molécula diana inmovilizada sobre el soporte sólido, quedan enlazados físicamente con las partículas del vehículo de soporte sólido que contienen la información genética (ADN) que los codifica.

Después de lavarlas, se clasifican las partículas del vehículo de soporte sólido, por ejemplo, usando tecnología FACS o separación magnética, para aislar las partículas individuales o múltiples que portan complejos entre la diana marcada inmovilizada y el producto génico del miembro de la biblioteca asociado con las partículas. De esta forma, se aislan partículas portadoras de complejos establecidos entre la diana marcada y el producto génico del miembro de la biblioteca asociado con partículas, y su información genética (ADN).

Por medio de PCR, los fragmentos de ADN acoplados a perlas aisladas discretas se re-amplifican y se utilizan para la identificación del o de los polipéptidos seleccionados u, opcionalmente, rondas consecutivas de inmovilización de partículas, trascripción y traducción in vitro, seguidas de separación, por ejemplo, por FACS o selección magnética.

Figura 5 es una representación esquemática del uso de un soporte sólido como vehículo para la información genética y proteínica acoplada (versión de ARNm inmovilizado/fijador marcado). A partir de una biblioteca de construcciones genéticas que contienen las señales necesarias para la trascripción de miembros de la biblioteca y la traducción de proteínas, se produce ARN (ARNm) (trascripción) in vitro, y se inmoviliza sobre partículas de un vehículo de soporte adecuado (por ejemplo, a través de la hibridación entre secuencias complementarias presentes en el ARNm y fragmentos inmovilizados de ADN, PNA o ARN). Las partículas portan también la molécula diana con la que se desea que interactúen los miembros de la biblioteca. Esta inmovilización se puede obtener usando, por ejemplo, químicas de acoplamiento estándares tales como la química de EDC/NHS o la química de biotina/estreptavidina. Las construcciones genéticas (ARNm) codifican los miembros individuales de la biblioteca como fusionados genéticamente con una molécula de fusión informadora (RFP) tal como una enzima o una proteína auto-fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde (GFP). Después de la adición de componentes para la traducción in vitro (por ejemplo, un extracto S30 de Escherichia coli), las moléculas de ARNm se traducen para producir los diferentes miembros de la biblioteca de proteínas. A través de la interacción entre la molécula diana inmovilizada y el miembro de la biblioteca recientemente traducido, los miembros individuales de la biblioteca, capaces de interactuar con la molécula diana inmovilizada sobre el soporte sólido, se enlazan físicamente con el vehículo de soporte sólido que contiene la información genética (ARNm) que los codifica.

Después de lavarlas, se clasifican los vehículos de soporte sólido, por ejemplo, usando tecnología FACS, para aislar las partículas individuales o múltiples que portan complejos entre la diana marcada inmovilizada y el producto génico del miembro de la biblioteca asociado con las partículas. De esta forma, se aislan partículas portadoras de complejos establecidos entre la diana marcada y el producto génico del miembro de la biblioteca asociado con partículas, y su información genética (ARNm).

Con el uso de, por ejemplo, PCR de trascriptasa inversa, las moléculas de perla/ARNm asociado con la partícula se convierten en los correspondientes fragmentos de ADN, que se amplifican por PCR y se utilizan para rondas consecutivas de trascripción in vitro, inmovilización de partículas, traducción in vitro, seguidas de selección mediante, por ejemplo, FACS.

Figura 6 ilustra el sistema experimental para el Ejemplo 1. En primer lugar, se incubaron partículas paramagnéticas, recubiertas con estreptavidina, con albúmina sérica humana (HSA) biotinilada, lo que dio como resultado un robusto anclaje para la HSA. Subsiguientemente, se incubaron partes alícuotas separadas con (A) proteína ABD-Z, una proteína de fusión genética entre una proteína de fijación de la albúmina sérica (ABD), derivada de una proteína G estreptocócica, y una proteína fijadora de inmunoglobulina (Z), derivada de la proteína A estafilocócica, seguido de incubación con anticuerpos contra IgG de cabra conjugados con isotiocianato fluorescente (FITC), o (B), directamente con anticuerpos contra IgG de cabra conjugados con FITC.

Figura 7 es una fotografía de los análisis a microscopia UV de perlas recubiertas con estreptavidina/partículas que contienen estreptavidina/albúmina sérica humana biotinilada inmovilizada por química de biotina. (A) Partículas incubadas con anticuerpos policlonales contra IgG de cabra conjugados con FITC, después de haberlos sometido inicialmente a una solución que contiene la proteína de fusión Z-ABD. (B) Partículas incubadas solamente con anticuerpos policlonales contra IgG de cabra conjugados con FITC.

Figura 8 es una representación esquemática del uso de la invención para seleccionar pares de polipéptidos de interacción a través del entrecruzamiento de dos bibliotecas diferentes. Sobre partículas de sistemas de vehículos de soporte sólido, se inmovilizan por separado dos combinaciones de fragmentos de ácidos nucleicos que codifican diferentes bibliotecas de polipéptidos. En un formato basado en el ADN, se inmovilizan los fragmentos, tras lo cual se lleva a cabo una etapa de trascripción/traducción acoplada, que da como resultado la producción de los correspondientes productos génicos. En un formato basado en el ARN, se producen por trascripción moléculas de ARN a partir de los fragmentos de ADN, tras lo cual se les inmoviliza sobre el vehículo de soporte sólido, seguido de una etapa de traducción cuyo resultado son los correspondientes productos génicos. Típica, pero no exclusivamente, los productos génicos son proteínas de fusión entre miembros de la biblioteca de polipéptidos y una molécula de fusión por afinidad, para la cual hay presente en las partículas una molécula de fijación análoga. Las diferentes bibliotecas están marcadas de manera diferente, por ejemplo, usando dos fluoróforos con diferentes espectros de excitación. Se detectan interacciones bioespecíficas entre los miembros de las diferentes bibliotecas de polipéptidos en forma de pares de partículas doblemente marcadas. Para la identificación, se analizan por secuenciación de ADN los ácidos nucleicos presentes en las partículas aisladas que codifican los correspondientes genes.

Figura 9 es una descripción esquemática de la construcción de los plasmidios pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt} y pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}, diseñados para ser usados como moldes para la amplificación de productos de PCR para la trascripción y traducción acelular de ADN/ARN libre o inmovilizado sobre perlas.

Figura 10 es una radiografía obtenida tras el análisis por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras de proteínas sintetizadas, usando un extracto acelular suplementado con [35S]-metionina, y productos de PCR producidos con los cebadores NOOL-12 y NOOL-13, empleando diferentes plasmidios como moldes. Pista 1: pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt}; Pista 2: pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}. Se utilizó un marcador con proteínas marcadas con 14C como referencia de tamaño (producto nº CFA756, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las flechas indican las posiciones de las proteínas de referencia con pesos moleculares de 14,3, 20,1 y 30,0 kDa, respectivamente.

Figura 11 es un trazado sobrepuesto de un análisis comparativo de FACS de perlas recubiertas con el anticuerpo anti-FLAG BioM5 sometidas a una mezcla de trascripción/traducción de producto de PCR con FLAG-Z_{wt}, y perlas de control negativo, tratadas de la misma forma, pero no recubiertas con anticuerpos anti-FLAG BioM5.

Figura 12 es un trazado sobrepuesto de un análisis comparativo de FACS de perlas doblemente recubiertas con anticuerpo BioM5 anti-FLAG y producto de PCR, sometidas a una mezcla de trascripción/traducción, seguida de detección. La imagen muestra el análisis de dos diferentes conjuntos de perlas que contienen FLAG-Z_{wt} o FLAG-Z_{IgA} que codifican los productos de PCR sometidos al análisis.

Figura 13 (A) es una representación esquemática de la presencia de un sitio de restricción Mlu I en el producto de PCR obtenido por amplificación de PCR, usando los cebadores NOOL-12 y NOOL-13 sobre un molde del plasmidio pGEM-SD-K-FLAGZ_{wt}. Por el contrario, no hay presencia de un sitio Mlu I en el producto de PCR obtenido por amplificación de PCR usando los cebadores NOOL-12 y NOOL-13 sobre el molde del plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}. También se muestran los tamaños de los productos de escisión obtenidos tras la incubación de la proteína de fusión FLAG-Z_{wt} que codifica el producto de PCR tras la incubación con Mlu I.

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(B) son fotografías que muestran los análisis de electroforesis sobre gel de agarosa de productos de PCR, obtenidos por amplificación de PCR, de diferentes muestras tomadas antes y después de enriquecimientos basados en FACS. Pista 1: Perlas que contienen únicamente el producto de PCR codificado por FLAG-Z_{wt}; Pista 2: Perlas que contienen solamente producto de PCR codificado por FLAG-Z_{wt}. Producto de PCR resultante, sometido a incubación con Mlu I; Pista 3: Perlas que contienen solamente producto de PCR codificado por FLAG-Z_{IgA}; Pista 4: Perlas que contienen solamente producto de PCR codificado por FLAG-Z_{IgA}. Producto de PCR resultante, sometido a incubación con Mlu I; Pista 5: Perlas que contienen una mezcla 1:1 de productos de PCR codificados por FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA}. Muestra previa al experimento de enriquecimiento por FACS; Pista 6: Perlas que contienen una mezcla 1:1 de productos de PCR codificados por FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA}. Producto de PCR resultante, sometido a incubación con Mlu I. Muestra previa al experimento de enriquecimiento por FACS; Pista 7: Muestra de perlas clasificadas en el experimento de enriquecimiento por FACS; Pista 8: Muestra de perlas clasificadas en el experimento de enriquecimiento por FACS. Producto de PCR resultante, sometido a incubación con Mlu I. Las pistas laterales con marcadores de tamaño (ADN de bacteriófago 1, escindido con Pat I, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) están marcadas M.

Figura 14, parte superior: es un trazado superpuesto de registros de intensidad de las huellas correspondientes a las pistas 6 (línea de puntos) y 8 (línea continua) en la figura 13. La intensidad relativa se muestra como función de la coordenada de migración. Parte inferior: muestra huellas escindidas digitalmente de la imagen de gel correspondiente a las pistas 6 y 8 del gel, que se muestran en la figura 13. Se observa un desvío relativo de intensidad hacia los productos de escisión de menor peso molecular en la muestra obtenida por amplificación de PCR de los ácidos nucleicos presentes en las perlas recogidas en el enriquecimiento por FACS (huella correspondiente a la pista 8).

En una realización representativa del método según la invención, se prepara una combinación de fragmentos génicos (Figs. 2-5) que contienen el ADN que codifica los diferentes miembros de la biblioteca de polipéptidos, utilizando tecnología de ADN estándar, por ejemplo, como la descrita por Nord et al., Prot. Engineering 8, págs. 601-608 [1995], y Nord et al., Natural Biotechnol. 15, págs. 772-777 [1997]). Los fragmentos génicos deben incluir una primera secuencia correspondiente a una secuencia promotora de ARN-polimerasa adecuada, tal como el promotor del bacteriófago T7 de E. coli, promotor T3, promotor SP6, promotor lac, promotor lac UV5, promotor ara B, promotor trp, promotor de proteína A estafilocócica, o promotores virales tales como el promotor de Virus del Sarcoma de Raus (RSV), los promotores tardío y precoz de Citomegalovirus (CMV), para actuar como señales para la trascripción del fragmento de ADN en ARNm, usando un extracto apropiado tal como un extracto S30 de E. coli para los promotores de E. coli o de origen procariótico, o un extracto de reticulocitos o extracto de germen de trigo para promotores de origen eucariótico (sistemas acoplados), o mediante una primera etapa de trascripción empleando una preparación de ARN-polimerasa purificada apropiada, separada de una etapa posterior de trascripción (sistema desacoplado), en la que se utilizan moldes de ARNm para la traducción de la información genética en los correspondientes polipéptidos.

En un aspecto de la invención, la secuencia promotora va seguida por una secuencia que codifica una molécula de fusión por afinidad (AFP), usada para fijar una molécula de fijación análoga inmovilizada sobre una partícula del vehículo de soporte sólido. Esta molécula de fusión por afinidad puede ser, por ejemplo, la región de fijación de la albúmina de la proteína G estreptocócica o derivados de la misma, la proteína A fijadora de inmunoglobulina o sus derivados, proteína fijadora de maltosa, glutatión S-transferasa, péptido FLAG, Bio-tag (péptido biotinilado), secuencia de hexahistidilo, c-myc tag, o cualquier otro polipéptido para el que haya disponible una molécula de fijación análoga adecuada. Asimismo, cada uno de los fragmentos de genes debe contener también el gen que codifica un polipéptido individual, miembro de la biblioteca, en un marco de traducción con la molécula de polipéptido de fusión por afinidad, si se la utiliza. De manera alternativa, el gen que codifica la molécula de fusión por afinidad puede estar dispuesto después del gen para el miembro de la biblioteca de polipéptidos.

En un aspecto de la invención, la secuencia que codifica el polipéptido individual, miembro de la biblioteca, está precedida o seguida por una secuencia que codifica un polipéptido informador adecuado, tal como una proteína verde fluorescente (GFP), fosfatasa alcalina, luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), o \beta-galactosidasa.

En un aspecto de la invención, los fragmentos génicos contienen un grupo químico apropiado (por ejemplo, biotina o digoxina) introducido, por ejemplo, por amplificación por PCR, utilizando un cebador o nucleótidos marcados con el grupo. Este grupo se usa para anclar el fragmento de ADN sobre las partículas del soporte sólido recubiertas con una molécula de fijación análoga, tal como anticuerpo(s) de estreptavidina o anti-digoxina (Figs. 2 y 4).

En otro aspecto de la invención, se inmoviliza una combinación de ARNm trascrito sobre las partículas del soporte sólido a través de un resto de fijación adecuado. Este resto puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótido en el extremo 5' o 3' del ARNm, para la cual se encuentra inmovilizada una secuencia complementaria de ARN, ADN o PNA sobre las partículas del soporte sólido (Figs. 3 y 5).

Después de la inmovilización de fragmentos de ADN sobre las partículas del soporte sólido, se lleva a cabo una etapa de trascripción utilizando una ARN-polimerasa adecuada, dependiendo del promotor usado para la construcción de los fragmentos. El ARNm trascrito de este modo se emplea para la traducción de la información genética en los correspondientes polipéptidos, que están unidos a las partículas del soporte sólido por interacción bioespecífica con una molécula de fijación análoga inmovilizada para una molécula de fusión por afinidad, codificada en el marco de traducción con el polipéptido, o mediante reconocimiento de una molécula diana inmovilizada sobre la partícula. Para la traducción se puede utilizar un extracto adecuado o componentes puros tales como extracto S30 de E. coli, un extracto de reticulocitos de conejo, o una mezcla reconstituida de componentes esenciales purificados de un sistema de traducción. Las partículas adecuadas pueden estar formadas, por ejemplo, por poliestireno o cualquier otro polímero o mezclas de polímeros, celulosa, hidroxiapatita, sefarosa, dextrano o sílice.

Tras la inmovilización de moléculas de ARNm sobre las partículas del soporte sólido, la traducción de éstas en las correspondientes proteínas se realiza de la forma anteriormente descrita. Los polipéptidos producidos de este modo se encuentran unidos a las partículas del soporte sólido por interacción específica con una molécula de fijación análoga para una molécula de fusión por afinidad, codificada en el marco de traducción con el polipéptido, o a través del reconocimiento de una molécula diana inmovilizada sobre la partícula.

Al objeto de evitar reacciones cruzadas, es decir, la fijación de una molécula de proteína de fusión de un polipéptido traducido a una molécula de fijación análoga o una molécula diana presente en una partícula de soporte sólido, que tampoco porta la información genética (ADN o ARN) que codifique el polipéptido, la mezcla se puede diluir con el fin de prevenir una proximidad excesiva entre partículas.

La selección de partículas que contienen un polipéptido o grupo de polipéptidos deseados se puede llevar a cabo por aislamiento directo, por ejemplo, en un escáner FACS, si la diana está marcada con un fluoróforo, o si el polipéptido está fusionado genéticamente con una proteína fluorescente tal como una proteína fluorescente verde. Un método diferente de selección consiste en utilizar principios magnéticos, empleando partículas magnéticas (o paramagnéticas) recubiertas con la molécula diana de interés (Figs. 1 y 2). De manera alternativa, las partículas marcadas a través de una interacción específica entre un producto génico de un polipéptido miembro de la biblioteca, se pueden aislar físicamente usando, por ejemplo, un microscopio UV.

La selección se puede llevar a cabo sobre la base de las propiedades funcionales de los polipéptidos codificados, tales como la fijación a una diana deseada (anticuerpos u otras proteínas o péptidos, hidratos de carbono, moléculas orgánicas, células, virus, plantas, etc.), actividad catalítica, o por estabilidad proteolítica o química bajo determinadas condiciones químicas.

Después del aislamiento de partículas portadoras de un polipéptido con las características deseadas, la información del ácido nucleico (ADN o ARN) presente en las mismas partículas se amplifica (si es necesario) por métodos de amplificación in vitro de ácidos nucleicos tales como PCR de trascriptasa inversa (en el caso de ARN), PCR (en caso de ADN), o replicación de círculo rodante.

Si es necesario, se puede repetir el procedimiento para ciclos adicionales de inmovilización directa de ADN o inmovilización de ARN tras la trascripción in vitro de ácidos nucleicos unidos a partículas re-amplificados. Si se desea una variación adicional para la siguiente ronda de selección, se pueden seleccionar las condiciones de amplificación o polimerasa(s) para introducir mutaciones en la siguiente combinación de fragmentos de ADN.

En todavía otro aspecto de la invención, se investigan pares de interacción en dos bibliotecas diferentes de polipéptidos (Fig. 8). Las partículas correspondientes a una biblioteca de, por ejemplo, polipéptidos codificados por ADNc se mezclan con partículas portadoras de miembros de una biblioteca de polipéptidos de, por ejemplo, proteínas codificadas por ADNc, anticuerpos o fragmentos de los mismos, o dominios peptídicos o proteínicos. Las partículas utilizadas para la inmovilización de los ácidos nucleicos se preparan de forma tal que contienen dos marcas diferentes, una para cada biblioteca. El aislamiento de pares de interacción de polipéptidos, resultantes de interacciones bioespecíficas, se lleva a cabo, por ejemplo, por tecnología FACS, utilizando detección de pares de partículas doblemente marcadas.

El método según la invención presenta varias ventajas con respecto a los sistemas de selección existentes, que utilizan una etapa de biosíntesis de polipéptidos in vivo, dado que no hay necesidad de transformar el material genético en una célula receptora. La única limitación con respecto al tamaño de la biblioteca (complejidad) es la capacidad de fijación del sistema de soporte sólido. Adicionalmente, el presente sistema de selección in vitro utiliza un soporte sólido robusto como enlace entre genotipo y fenotipo, lo que permite utilizar condiciones severas en la selección de ligandos con alta afinidad frente a una molécula diana determinada. Como consecuencia de la inmovilización directa de los ácidos nucleicos sobre el soporte sólido, se les puede recuperar fácilmente; de esta forma, por ejemplo, si el soporte sólido comprende perlas magnéticas, éstas se pueden separar de la mezcla de trascripción/traducción con un imán, lo que reduce el riesgo de contaminación con ácidos nucleicos no inmovilizados.

El siguiente Ejemplo no limitante sirve para ilustrar la invención.

Procedimientos estándares Clonación y amplificaciones de PCR

El trabajo habitual de clonación, incluidas las preparaciones de plasmidios, escisión y uniones por enzimas de restricción, etc., se llevó a cabo de la forma descrita en (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, 1989), y de acuerdo con las recomendaciones de los proveedores. Las enzimas de restricción y ligasas se adquirieron en MBI Fermentas, Vilnius, Lituania, o New England Biolabs, MA, EE.UU. Las amplificaciones por PCR usando plasmidios o productos de PCR inmovilizados sobre perlas como moldes se llevaron a cabo en un sistema de PCR GeneAmp® 9700 (PE Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), empleando condiciones estándares. Como cebadores, se utilizaron oligonucleótidos de la Tabla 1 según se especifica en los ejemplos. Típicamente, se usaron 5 pmoles de cebadores en una amplificación por PCR de 30 ciclos, usando un tampón consistente en trifosfatos de desoxi-ribonucleósido (dNTPs) 0,2 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,5), Tween 80 al 0,1%, y 0,1 unidades de ADN-polimerasa AmpliTaq® (PE Biosystems). Un ciclo estándar de PCR tuvo las siguientes condiciones: 15 seg a 94ºC, 20 seg a 55ºC, 1 min a 72ºC. Los análisis estándares por electroforesis sobre gel de agarosa de los ácidos nucleicos se efectuaron usando bromuro de etidio como tinción. Las células de E. coli usadas para la clonación y la preparación de plasmidios fueron RR1DM15 (Rüther, U. Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772, 1982).

TABLA 1 Relación de oligonucleótidos cebadores.

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Producción de proteínas recombinantes

Las células de E. coli usadas para la expresión fueron RR1DM15 (Rüther, U. Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772, 1982) o BL21DE3 (Novagen, Madison, WI, EE.UU.). Se llevaron a cabo procedimientos de choque osmótico de la forma anteriormente descrita (Nygren et al., J. Mol. Recognit. 1: 69-74, 1988). Las purificaciones por cromatografía de afinidad de proteínas sobre HSA y resinas de IgG-Sefarosa se efectuaron de la forma anteriormente descrita (Nygren et al., J. Mol. Recognit. 1: 69-74, 1988). La Compañía Pharmacia y Upjohn AB, Estocolmo, suministró IgG policlonal humana.

Biotinilación de proteínas

La albúmina sérica humana (HSA, en sus siglas en inglés) (producto nº A-8763, Sigma) se sometió a biotinilación usando el kit EZ-Link® Sulfo-NHS-LC-Biotin (producto nº 21335, Pierce Chemical Company, Rodeford, IL, EE.UU.).

Trascripción y traducción acelulares de fragmentos de PCR

Según se ha indicado, los productos de PCR se sometieron a trascripción y traducción acelulares usando un sistema de extracto S30 de E. coli para ADN lineal (producto nº L1030, Promega, Madison, WI, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la trascripción/traducción acoplada de productos de PCR libres (no inmovilizados), se mezclaron típicamente 10-70 ng de producto de PCR con 50 \mul de extracto celular y se incubó durante 1 h a 25ºC. En otros experimentos, los productos de PCR se inmovilizaron sobre microperlas recubiertas con estreptavidina (M280-SA, Dynal, Noruega, o Bang Laboratories, producto nº CP01N/004109, en los casos indicados). Estas perlas se habían incubado previamente con 1,89 mg/ml de solución de anticuerpo de biotinilación BioM5 (producto nº F-2922, Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) dirigido contra un péptido FLAG para la captura por afinidad de proteínas marcadas con el péptido FLAG. Típicamente, se mezclaron 10 ng de producto de PCR con perlas que contuvieron 1 mg de BioM5 que, subsiguientemente, se lavaron dos veces antes de llevar a cabo una reacción de trascripción/traducción acoplada usando 25 \mul de extracto de E. coli.

Electroforesis sobre gel de proteínas

Se llevó a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) de las proteínas, bajo condiciones reductoras, usando el sistema Phast (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), o en un dispositivo Novex Xcell II (San Diego, CA, EE.UU.), de la forma descrita por los correspondientes proveedores.

Secuenciación de ADN

La secuenciación de ADN se realizó por secuenciación de ciclos (Carothers et al., BioTechniques 7: 494-499, 1989; Savolainen, P. et al., Mol. Biol. Evol. 17: 474-488, 2000), usando ADN-polimerasa ThermoSequenase (Amersham Pharmacia Biotech) y cebadores según se indique. Las reacciones de secuenciación se cargaron en un instrumento ABI Prism 377XL (PE Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).

Experimentos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

Los análisis de FACS se llevaron a cabo con un instrumento FACSCalibur, FACScan o FACSVantage SE (Becton Dickinson, Oxnard, EE.UU.).

En los casos indicados, se utilizaron anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante para las amplificaciones de señales, utilizando un reactivo de fluoresceína tiramida (Boehringer Mannheim, Alemania) de la forma descrita por Anton y colaboradores (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998).

Ejemplo 1 Discriminación entre partículas de soporte sólido, marcadas con proteínas fluorescentes, a través de una interacción bioespecífica, y partículas de soporte sólido de control

Aproximadamente 2 mg de partículas recubiertas con estreptavidina (M280-SA, Dynal, Noruega) se incubaron con 30 \mul de una solución de 2 mg/ml en tampón PBS (NaCl 0,15 M, fosfato 20 mM, pH 7,2) de albúmina sérica humana (HSA) (artículo nº A-8763 de Sigma) biotinilada, usando un kit de biotinilación de proteínas (artículo nº 21335 de Pierce), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las partículas se incubaron directamente con anticuerpos policlonales contra la IgG de cabra, marcados con FITC (artículo nº F-9887 de Sigma), o se incubaron inicialmente con 30 \mul de una solución de 2 mg/ml en PBS de una proteína de fusión (Z-ABD), entre una proteína de fijación de albúmina sérica (ABD), derivada de la proteína G estreptocócica, y una proteína de fijación de inmunoglobulina (Z), derivada de la proteína A estafilocócica producida y purificada por afinidad con HSA de la forma anteriormente descrita (Nord et al., véase obra citada [1995], y [1997]). Entre cada incubación, se efectuaron múltiples (5-10) lavados con PBS para separar las proteínas no fijadas de manera específica.

Para investigar si era posible discriminar entre partículas marcadas con los anticuerpos policlonales contra la IgG de cabra marcados con FITC, a través de una interacción bioespecífica frente al resto Z de la proteína de fusión Z-ABD, y las partículas no incubadas con la proteína de fusión Z-ABD y, por lo tanto, incapaces de fijar el anticuerpo de cabra, las partículas se analizaron por microscopia UV, usando un microscopio Olympus BH2-RFCA a una longitud de onda de excitación de 495 nm. Los resultados que se muestran en la Figura 5 demuestran que se puede observar una diferencia manifiesta de la intensidad de fluorescencia entre las dos combinaciones de partículas tratadas de forma diferente (Fig. 5A y 5B). Esto demuestra que se puede observar el resultado de una interacción bioespecífica entre una proteína de fusión inmovilizada en (ABD-HSA) y una proteína diana marcada, agregada en solución.

Ejemplo 2 Ensamblaje y clonación de construcciones genéticas para experimentos de trascripción y traducción acelulares

Para poder obtener productos de PCR que codifican proteínas importantes o miembros de la biblioteca de proteínas, y experimentos adecuados, o acelulares, de trascripción y traducción, usando soportes sólidos como vehículos tanto para ácidos nucleicos como sus correspondientes proteínas codificadas, se ensambló una construcción genética en el vector de plasmidio pGEM-4Z (Figura 9). En una reacción de PCR de extensión de solapamiento de empalme (splice overlap extension, SOE, en sus siglas en inglés), en la que se utilizaron los cebadores NOOL-10 y NOOL-11 (tabla 1), se unieron dos fragmentos génicos que codifican una proteína de fijación de albúmina (APB) (Larsson et al., Prot. Expr. Purif. 7: 447-457, 1996) y el dominio Z (Z_{wt}) (Nilsson et al., Prot. Engineering 1: 107-113, 1987), respectivamente. Los dos fragmentos habían sido producidos anteriormente por reacciones separadas de PCR usando pT7-ABPc (ABP) (Larsson et al., Prot. Expr. Purif. 7: 447-457, 1996) (cebadores NOOL-6 y NOOL-7, tabla 1), o pKN1-Z_{wt} (Nord et al., Prot. Engineering, 8: 601-608, 1995) (cebadores NOOL-8 y NOOL-9, tabla 1) como moldes de plasmidios, respectivamente. En la reacción de SOE se unieron dos fragmentos que dieron como resultado un fragmento génico codificado por (Ser)3-Z_{wt} que comprende en el extremo 5' sitios de reconocimiento para las dos enzimas Hin dIII y Nco I y, en el extremo 3', dos codones de terminación de la traducción y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Eco RI (Figura 9). Este fragmento se insertó por ligación como un fragmento Hin dIII-Eco RI en el plasmidio pGEM-4Z, escindido con las mismas enzimas, que dio como resultado la construcción pGEM-ABP-Z_{wt}.

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Un fragmento se ensambló por hibridación de los dos oligonucleótidos SD KOZAK-1 y SD KOZAK-2 (tabla 1), que tuvo como resultado un fragmento de 40 pb que comprende una secuencia de E. coli Shine Dalgarno (SD) (para una eficaz traducción en E. coli), y una secuencia Kozak (para facilitar la expresión en extractos celulares de origen mamífero), flanqueados por sitios de restricción Hin dIII y Nco I (Figura 9). Este fragmento se insertó por ligación en pGEM-ABP-Z escindido con Hin dIII y Nco I, que dio como resultado el vector de plasmidio pGEM-SD-K-ABP-Z_{wt}. Subsiguientemente, este vector se escindió con las enzimas Nco I y Xho I, liberando el fragmento de codificación ABP. El fragmento de vector obtenido de esta forma se ligó a un fragmento génico que codifica un péptido FLAG, obtenido previamente por hibridación de dos oligonucleótidos FLAG-1 y FLAG-2 (tabla 1), de donde resultó el vector pGEM-SD-K-FLAG-Z. De esta forma, este vector codifica una proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, enlazada por un enlazador (Ser)3 (Figura 9). Asimismo, el vector contiene un promotor T7 corriente arriba que es capaz de dirigir la trascripción del gen de la proteína de fusión FLAG-Z_{wt} por la acción de la ARN-polimerasa T7. A partir de este vector, es posible transcribir cualquier fragmento génico adecuado, insertado entre los sitios Xho I y Eco RI, en forma de ARNm enlazado operativamente con una secuencia SD, una secuencia Kozak, y una parte codificadora de péptido FLAG. Adicionalmente, usando los cebadores NOOL-12 y NOOL-13 (tabla 1), se pueden obtener productos de PCR que son apropiados para la trascripción dirigida por ARN-polimerasa T7, y que están biotinilados en sus extremos 3', aptos para la inmovilización sobre superficies recubiertas, por ejemplo, con estreptavidina, y otros soportes sólidos.

Para construir el vector designado pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}, en el cual el fragmento génico que codifica Z_{wt} ha sido sustituido por un fragmento génico que codifica la proteína de fijación de IgA humana, Z_{IgA} (Gunneriusson et al., J. Bact. 1999), se amplificó un fragmento génico que codifica Z_{IgA} usando los cebadores NOOL-8 y NOOL-9, empleando un molde de plasmidio pKN1-Z_{IgA} (Gunneriusson et al., J. Bact. 1999). El producto de PCR resultante se escindió con las enzimas de restricción Xho I y Eco RI, y se insertó en el vector pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt}, previamente escindido con las mismas enzimas. El vector resultante pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA} codifica, de esta forma, una proteína de fusión FLAG-Z_{IgA}, enlazada por un enlazador (Ser)3 (Figura 9).

Ejemplo 3 Trascripción/traducción acelulares de las proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA} a partir de sus correspondientes productos de PCR

Mediante el uso de los vectores de plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt} y pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}, respectivamente, para las amplificaciones por PCR utilizando los cebadores NOOL-12 y NOOL-13 (tabla 1), se obtuvieron productos de PCR de los cuales aproximadamente 70 ng se sometieron a una trascripción/traducción acelulares de 1 hora de duración a 25ºC, usando 50 \mul de un extracto celular S30 de E. coli (L1030, Promega, MA, EE.UU.), suplementado con [^{35}S]-metionina y 1600 unidades de ARN-polimerasa T7. Se analizaron muestras de las diferentes mezclas de trascripción/traducción por medio de NuPAGE al 10% (Novex, San Diego, CA, EE.UU.) bajo condiciones reductoras, a través de la adición de DTT 50 mM (concentración final) en un tampón de carga de muestras (tampón de muestras NuPAGE LDS, Novex), seguida de exposición del gel a una película (Kodak XOMAT-AR, 18x24 cm) a -70ºC durante la noche. El revelado de la película puso de manifiesto proteínas radiactivas de los tamaños esperados
(\sim 8 kDa) para los productos de PCR que codifican tanto FLAG-Z_{wt} como FLAG-Z_{IgA} (Figura 10). Se demuestra así que los vectores de plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt} y pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA} son apropiados para ser usados como moldes para la amplificación de productos de PCR capaces de dirigir una trascripción impulsada por ARN-polimerasa T7 del ARNm, que se podría utilizar para la traducción acelular de las proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} t FLAG-Z_{IgA} en un extracto S30 de E. coli.

Ejemplo 4 Inmovilización de las proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA} sobre perlas que contienen anticuerpos anti-FLAG

Para investigar la funcionalidad de los restos de péptidos FLAG de las proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA}, mezclas de reacción obtenidas a partir de la producción de las dos proteínas de fusión de sus correspondientes productos de PCR, utilizando la trascripción/traducción acelular de la forma descrita en el Ejemplo 3, se mezclaron durante 3 horas a temperatura ambiente con perlas Dyna M-280-SA (Dynal, Noruega) recubiertas con estreptavidina (50 mg) incubadas previamente con 5 \mul de una solución de 1,89 mg/ml de anticuerpos monoclonales BioM5 anti-FLAG biotinilados (Sigma) en PBS (NaCl 0,15 M, fosfato 20 mM, pH 7,2). Se incluyeron en el experimento también perlas que no habían sido incubadas con la solución de anticuerpos BioM5 anti-FLAG biotinilados (control).

Subsiguientemente, las perlas se lavaron con PBST (PBS con Tween 20 al 0,1%), y se analizaron usando un escintilador Beckman LS6000 SC (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.), bajo condiciones estándares, utilizando tampón de escintilación. Las señales medidas de las perlas recubiertas con BioM5 anti-FLAG, sometidas a las mezclas de trascripción/traducción correspondientes a las proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA}, respectivamente, fueron significativamente más altas en comparación con los controles negativos (Tabla 2). Esto demuestra que las proteínas de fusión, ejemplificadas en este caso por las dos proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA}, se pueden producir a partir de sus respectivos productos de PCR por trascripción/traducción acelular que contiene una molécula de fusión por afinidad funcional, ejemplificado en este caso por el péptido FLAG, que es adecuado para la inmovilización de las proteínas sobre perlas que contienen una molécula de afinidad análoga, ejemplificado en este caso por el anticuerpo monoclonal BioM5 anti-FLAG.

TABLA 2 Señales de escintilación medidas (acumuladas durante 1 min) a partir de perlas de estreptavidina (SA) nativas o perlas de estreptavidina recubiertas con anticuerpo BioM5 anti-FLAG biotinilado, respectivamente, después de mezclar (y subsiguiente lavado) con mezclas de trascripción/traducción de diferentes muestras

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Ejemplo 5 Trascripción/traducción acelular de un producto de PCR que codifica FLAG-Z_{wt}, inmovilización bioespecífica del producto génico sobre perlas, y análisis por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

La trascripción y traducción acelulares de un producto de PCR obtenido por amplificación de PCR con cebadores NOOL-12 y NOOL-13 (Tabla 1) sobre el molde de plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt} se llevaron a cabo como en el Ejemplo 3, pero sin la adición de [^{35}S]-metionina. La mezcla resultante se incubó durante 2 horas con 50 mg de perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina, con un diámetro de aproximadamente 0,95 mm (Bangs Laboratories, Fishers, IN, EE.UU.), incubadas previamente con 5 \mul de una solución de 1,89 mg/ml de anticuerpos monoclonales BioM5 anti-FLAG biotinilados. En el experimento, se incluyeron también perlas no recubiertas con el anticuerpo BioM5 anti-FLAG biotinilado a modo de control. Tras un exhaustivo lavado con tampón TNT (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%), se agregaron a las perlas anticuerpos IgG anti-DNP de conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (artículo nº P0402, Dako, Dinamarca), y se incubó durante 45 min a 25ºC, seguido de lavado con tampón TNT, para detectar el producto génico de la proteína de fusión FLAG-Z_{wt} traducida y bioespecíficamente inmovilizada a través de la interacción bioespecífica entre las partes constantes (Fc) de los anticuerpos de conejo y el resto del dominio Z de la proteína de fusión. Para la obtención de una señal útil para la FACS, se usó la actividad enzimática del HRP conjugado con los anticuerpos de conejo a través de la adición de 1 ml de una mezcla de amplificación de señal que contiene fluoresceína tiramida (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998). Entre cada etapa de incubación, las perlas se lavaron de manera exhaustiva, se centrifugaron durante 3 min a 2000 x g, seguido de resuspensión en tampón TNT (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) para separar la proteína no específicamente unida. Se usó tampón de bloqueo TNB (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, reactivo de bloqueo al 0,5%, del kit de Amplificación de la Señal de Tiramida, NEN Life Science, Boston, MA, EE.UU.) durante las etapas de incubación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de incubar durante 5 min a 25ºC, y subsiguiente lavado, se resuspendieron las perlas en PBS para el análisis de FACS. Este análisis demostró que las perlas recubiertas con el anticuerpo BioM5 anti-FLAG biotinilado, incubadas con la mezcla de trascripción/traducción del producto de PCR que codifica FLAG-Z_{wt}, tras la subsiguiente incubación con el conjugado de IgG anti-DNP-HRP de conejo y sometiéndolas finalmente a la mezcla de amplificación de señales que contiene fluoresceína tiramida, exhibieron señales de fluorescencia significativamente más altas en el análisis de FACS que las perlas tratadas de la misma forma, pero que no contuvieron el anticuerpo BioM5 anti-FLAG (Figura 11).

Esto demuestra que las proteínas de fusión, ejemplificadas en este caso por la proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, se pueden producir a partir de un correspondiente producto de PCR por trascripción/traducción acelular que contiene una molécula de fusión por afinidad funcional, ejemplificado en este caso por el péptido FLAG, que es capaz de dar como resultado una inmovilización bioespecífica de la proteína sobre perlas que contienen una molécula de afinidad análoga, ejemplificada en este caso por el anticuerpo monoclonal BioM5 anti-FLAG, y que estas perlas se pueden detectar por análisis de FACS utilizando una combinación adecuada de reactivos de detección, ejemplificada en este caso por un conjugado de IgG anti-DNP-HRP de conejo y una mezcla de amplificación de señales que contiene fluoresceína tiramida.

Ejemplo 6 Trascripción/traducción acelular de un producto de PCR que codifica FLAG-Z_{wt} inmovilizado sobre perlas, inmovilización bioespecífica del producto génico sobre perlas, y análisis por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

Fragmentos biotinilados de PCR que codifican una proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, obtenidos tras la amplificación por PCR usando cebadores NOOL-12 y NOOL-13 en un molde de plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt}, se inmovilizaron sobre perlas recubiertas con estreptavidina (Bangs Laboratories), a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml de perlas. Las perlas (50 mg) habían sido incubadas previamente con 5 \mul de una solución que contuvo 1,89 mg/ml de un anticuerpo biotinilado (BioM5, Sigma) anti-péptido FLAG. Las perlas que contuvieron tanto los productos de PCR biotinilados y el anticuerpo anti-péptido FLAG se sometieron a trascripción y traducción acelulares, usando 25 ml de un extracto S30 (Promega, Madison, WI, EE.UU.), suplementado con 200 unidades de ARN-polimerasa T7 (Epicentre, Madison, WI, EE.UU.) y 40 unidades de rRNasin (proteína inhibidora de la ARNasa) (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Después de incubar durante 1 hora a 25ºC, seguido de lavados repetidos con tampón TNT (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%), se agregaron a las perlas anticuerpos de IgG anti-DNP de conejo, conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (artículo nº P0402, Dako, Dinamarca), y se incubaron durante la noche a 4ºC (mezcla de extremo a extremo), seguido de lavado con TNT, para detectar el producto génico de la proteína de fusión FLAG-Z_{wt} traducida y bioespecíficamente inmovilizada a través de la interacción bioespecífica entre las partes constantes (Fc) de los anticuerpos de conejo y el resto del dominio Z de la proteína de fusión (Nilsson et al., Protein Engineering, 1: 107-113, 1987).

Para obtener una señal útil para FACS, se utilizó la actividad enzimática de la HRP conjugada con los anticuerpos de conejo a través de la adición de 1 ml de una mezcla amplificadora de señal que contiene fluoresceína tiramida (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998). Entre cada etapa de incubación, las perlas se lavaron de forma exhaustiva, se centrifugaron durante 3 min a 2000 x g, seguido de resuspensión en tampón TNT (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) para separar la proteína no específicamente unida. Durante las etapas de incubación se utilizó tampón de bloqueo (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,5% de reactivo bloqueador del kit de Amplificación de la Señal de Tiramida, NEN Life Science, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como control negativo, se incluyeron en el experimento perlas recubiertas con estreptavidina que contuvieron anticuerpos BioM5 anti-FLAG inmovilizados, y un producto de PCR obtenido de la amplificación por PCR que usó cebadores NOOL-12 y NOOL-13 sobre el molde de plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}.

Los resultados del análisis FACS demuestran que las perlas que contienen los fragmentos de PCR biotinilados inmovilizados, que codifican una proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, obtenidos tras la amplificación por PCR usando cebadores NOOL-12 y NOOL-13 sobre un molde de plasmidio pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt}, exhiben una intensidad de fluorescencia significativamente mayor que las perlas de control, que contienen productos de PCR inmovilizados que codifican una proteína de fusión no reconocida por el reactivo de conjugado de HRP de conejo usado para la detección (Figura 12).

Se demuestra de esta forma que las proteínas de fusión, ejemplificadas en este caso por la proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, se pueden producir a partir del correspondiente producto de PCR, inmovilizado sobre perlas, por trascripción/traducción acelular, que contiene una molécula de fusión por afinidad, ejemplificada en este caso por el péptido FLAG, que es capaz de dar como resultado una inmovilización bioespecífica de la proteína a las perlas que contienen una molécula de afinidad análoga, ejemplificada en este caso por el anticuerpo monoclonal BioM5 anti-FLAG, y que estas perlas se pueden detectar por análisis de FACS utilizando una combinación adecuada de reactivos de detección, ejemplificados en este caso por el conjugado de IgG anti-DNP de conejo-HRP, y una mezcla de amplificación de señal que contiene fluoresceína tiramida.

Ejemplo 7 Enriquecimiento, basado en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), de perlas que contienen productos de PCR inmovilizados que codifican un producto génico deseado

Sobre perlas recubiertas con estreptavidina (Bangs Laboratories), se inmovilizaron por separado fragmentos de PCR biotinilados que codifican las proteínas de fusión FLAG-Z_{wt} y FLAG-Z_{IgA}, respectivamente, obtenidos tras la amplificación por PCR usando cebadores NOOL-12 y NOOL-13 sobre moldes de plasmidios pGEM-SD-K-FLAG-Z_{wt} y pGEM-SD-K-FLAG-Z_{IgA}, hasta un nivel de aproximadamente 10 ng/mg de perlas. Las perlas (50 mg) habían sido previamente incubadas con 5 \mul de una solución que contuvo 1,89 mg/ml de un anticuerpo biotinilado contra el péptido FLAG (BioM5, Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.). Subsiguientemente, se mezclaron perlas de ambas combinaciones en una relación de 1:1 (cantidades idénticas de perlas de ambas clases), y se sometieron a trascripción y traducción acelulares usando 25 ml de un extracto S30 (Promega, Madison, WI, EE.UU.), suplementado con 200 unidades de ARN-polimerasa (Epicentre) y 40 unidades de rRNasin (Promega). Después de incubar durante 1 h a 25ºC, seguido de lavados repetidos usando tampón TNT (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,5 M, Tween 20 al 0,05%), se agregaron a las perlas anticuerpos de IgG anti-DNP de conejo, conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (artículo nº P0402, Dako, Dinamarca), y se incubó durante la noche a 4ºC, seguido de lavado con TNT, para detectar el producto génico de la proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, traducida y bioespecíficamente inmovilizada, a través de la interacción bioespecífica entre las partes constantes (Fc) de los anticuerpos de conejo y el resto del dominio Z de la proteína de fusión. Para obtener una señal útil para FACS, se usó la actividad enzimática de la HRP conjugada con los anticuerpos de conejo, a través de la adición de 1 ml de una mezcla de amplificación de señal que contuvo fluoresceína tiramida (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998). Entre cada etapa de incubación, las perlas se lavaron de forma exhaustiva, se centrifugaron durante 3 min a 2000 x g, seguido de resuspensión en tampón TNT (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%) para separar la proteína no específicamente unida. Durante las etapas de incubación se utilizó tampón de bloqueo (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,5% de reactivo bloqueador del kit de Amplificación de la Señal de Tiramida, NEN Life Science, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el uso de FACS, una combinación de perlas obtenida originalmente por la mezcla en una relación de 1:1 se sometió, subsiguientemente, a un experimento de enriquecimiento basado en la intensidad de fluorescencia. En este procedimiento, las condiciones del instrumento de FACS se ajustaron para el aislamiento preparativo de perlas solas (singletes) con una intensidad de fluorescencia por encima de 50. Bajo estas condiciones, la mezcla se sometió a clasificación y se recogieron tubos con aproximadamente 4500 perlas clasificadas.

Para analizar si las perlas portadoras de los productos de PCR que codifican la proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, que debería estar específicamente marcada por el procedimiento de marcado que implica el conjugado de IgG de conejo-HRP, se habían enriquecido en relación con las perlas portadoras de productos de PCR y proteínas de fusión FLAG-Z_{IgA} no reconocidos por el conjugado de IgG de conejo-HRP, se utilizaron las diferencias en la secuencia de ADN entre los dos productos de PCR.

Los productos de PCR que codifican la proteína de fusión FLAG-Z_{wt} contienen una secuencia de reconocimiento para la enzima Mlu I, que no está presente en los productos de PCR que codifican la proteína de fusión FLAG-Z_{IgA}. De esta forma, se pudo discriminar entre los dos productos de PCR mediante un análisis de la susceptibilidad a la digestión con Mlu I (Figura 13A). Por lo tanto, muestras de perlas procedentes de antes y después de la clasificación se sometieron a amplificación por PCR usando cebadores NOOL-12 y NOOL-13, que se hibridan con sitios de los productos de PCR inmovilizados que flanquean las regiones que difieren entre las dos especies de productos de PCR y que, por consiguiente, se podrían utilizar para la amplificación simultánea de ambas especies de productos de PCR. La subsiguiente incubación de los nuevos productos de PCR resultantes con la enzima de restricción Mlu I se podría utilizar, en consecuencia, para investigar las relaciones relativas entre las dos especies de muestras procedentes de antes y después de la clasificación, por análisis del tamaño de los fragmentos de ADN y de las intensidades de banda tras la electroforesis en gel de agarosa, seguida de tinción con bromuro de etidio.

Como era de esperar, una amplificación por PCR de los ácidos nucleicos presentes en aproximadamente 10.000 perlas de la mezcla 1:1 (muestra previa a la clasificación), seguida de digestión con Mlu I y análisis por electroforesis en gel, demuestra una mezcla de productos de PCR susceptibles a Mlu I y resistentes a Mlu I (Figura 13B, pista 6).

Al someter aproximadamente 400 perlas recogidas durante el enriquecimiento por FACS al mismo análisis, la relación de intensidad entre la banda superior (443 pb, no escindida) y la doble banda inferior (dos productos de escisión, 239/204 pb, sin resolver) había variado hacia las bandas más pequeñas (inferiores) (Figura 13B, pista 8). Utilizando un dispositivo de escaneo en gel Gel Doc 2000 y el software Quantity One vers. 4.1 (Biorad, Hercules, CA, EE.UU.), se registró esta desviación de las intensidades relativas, que da como resultado el trazado superpuesto de la Figura 14. A partir de este análisis, se puede observar claramente que se ha producido una desviación de la intensidad relativa hacia los productos de escisión de menor peso molecular. Esto demuestra que las perlas que contienen un producto de PCR susceptible a Mlu I, y que codifica la proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, se enriquecieron durante el experimento con respecto a las perlas que contienen el producto de PCR resistente a Mlu I, que codifica la proteína de fusión FLAG-Z_{IgA}.

En conjunto, este ejemplo pone de manifiesto que las proteínas de fusión, ejemplificadas en este caso por la proteína de fusión FLAG-Z_{wt}, se pueden producir a partir de un correspondiente producto de PCR, inmovilizado sobre perlas, por trascripción/traducción acelular, que contiene una molécula de fusión por afinidad funcional, ejemplificada en este caso por el péptido FLAG, que es capaz de dar como resultado una inmovilización bioespecífica de la proteína sobre las perlas que contienen una molécula de afinidad análoga, ejemplificada en este caso por el anticuerpo monoclonal BioM5 anti-FLAG, y que estas perlas se pueden enriquecer cuando se mezclan y procesan conjuntamente con perlas irrelevantes, que contienen productos de PCR que codifican un producto génico diferente, por enriquecimiento basado en FACS, utilizando una combinación apropiada de reactivos de detección, ejemplificados en este caso por un conjugado de IgG anti-DNP de conejo-HRP, y una mezcla de amplificación de señal que contiene fluoresceína tiramida.

Claims (16)

1. Un método para la selección de uno o múltiples polipéptidos deseados, que comprende:

(a) expresión acelular de moléculas de ácidos nucleicos inmovilizadas sobre un sistema de soporte sólido para producir polipéptidos, en donde el soporte sólido porta un medio para la interacción específica con al menos el polipéptido deseado o una molécula unida al mismo;

(b) separación del soporte sólido que porta tanto el polipéptido deseado como el ácido nucleico que lo codifica; y, opcionalmente,

(c) recuperación de dicho ácido nucleico y/o dicho polipéptido deseado.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que los polipéptidos expresados son proteínas de fusión.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que cada proteína de fusión comprende una porción variable y una porción común.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que la porción común comprende una molécula de fusión por afinidad, cuya molécula de fijación análoga está inmovilizada sobre el soporte sólido.

5. Un método según la reivindicación 3, en el que la porción común comprende un resto de proteína informadora.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la porción variable es una molécula de una biblioteca de polipéptidos.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo de forma iterativa durante más de un ciclo.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que las etapas (a) y (b) se llevan a cabo entre 2 y 20 veces.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sistema de soporte sólido es en forma de partículas.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que sobre cada partícula del soporte sólido se encuentran inmovilizados una molécula de ácido nucleico y el citado medio para la interacción bioespecífica con al menos el polipéptido deseado o una molécula unida al mismo.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio inmovilizado para la interacción bioespecífica es una molécula diana para el polipéptido deseado.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el medio inmovilizado para la interacción específica es una molécula de fijación análoga para una molécula de fijación por afinidad, que forma una proteína de fusión con el polipéptido deseado.

13. Una biblioteca molecular que comprende un sistema de soporte sólido, sobre el cual se encuentra inmovilizada una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos, y asociado con cada una de dichas moléculas de ácidos nucleicos, y también inmovilizado sobre dicho sistema de soporte sólido, se encuentra un medio para la interacción bioespecífica con el producto de expresión de una o múltiples de dichas moléculas de ácidos nucleicos.

14. Una biblioteca según la reivindicación 13, en la que el sistema de soporte sólido es en forma de partículas.

15. Una biblioteca según la reivindicación 14, en la que sobre cada partícula del soporte sólido se encuentran inmovilizados una molécula de ácido nucleico y un medio para la interacción bioespecífica con el producto de expresión de una o múltiples de dichas moléculas de ácidos nucleicos.

16. Una biblioteca según la reivindicación 15, en la que el medio inmovilizado para la interacción bioespecífica es una molécula diana para el producto de expresión de una o múltiples de dichas moléculas de ácidos nucleicos.