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Diese
Erfindung stellt eine Methodik zur in-vitro-Selektion und, falls
gewünscht,
anschließenden
Identifizierung von Proteinen oder Peptiden mit gewünschten
Eigenschaften aus Pools von Protein- oder Peptidvarianten (Banken)
bereit.
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Proteine
und Peptide, hierin nachstehend gemeinsam als Polypeptide bezeichnet,
mit gewünschten Eigenschaften,
wie zum Beispiel Bindungsaffinität
an ein bestimmtes Zielmolekül,
katalytischer Aktivität,
chemischer oder enzymatischer Aktivität oder immunogener Aktivität, sind
von großer
Bedeutung in vielen Bereichen der Biotechnologie, wie zum Beispiel
Arzneistoff- und Impfstoffentwicklung, diagnostische Anwendungen und
Bioseparation.
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Der
jüngste
Fortschritt in der Gentechnik hat die Einführung neuer Prinzipien des
Isolierens und Identifizierens derartiger Polypeptide aus großen Sammlungen
von Varianten bereitgestellt, die durch unterschiedliche Verfahren
einschließlich
kombinatorischer Prinzipien konstruiert werden (Clackson und Wells,
Trends Biotechnol. 12, S. 173-184
[1994]). Typischerweise werden unter Verwendung von Biosynthese
zur Herstellung der Mitglieder einer Bank große Pools von Genen konstruiert,
welche die einzelnen Mitglieder der Bank kodieren, was eine spätere Selektion
oder Anreicherung gewünschter
Varianten unter Verwendung eines geeigneten Ködermoleküls oder einer geeigneten chemischen
Bedingung ermöglicht
(Smith und Petrenko, Chem. Rev. 97, S. 391-410 [1997]). Zur Identifizierung
selektierter Varianten sind mehrere Techniken beschrieben worden, um
eine physikalische Verbindung zwischen dem translatierten Protein
(Phänotyp)
und der genetischen Information, die sie kodiert, (Genotyp) bereitzustellen,
was die Identifizierung selektierter Mitglieder der Bank unter Verwendung
von DNA-Sequenziertechnik ermöglicht.
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Unter
Verwendung von Phagen- oder Zellpräsentierungstechniken wird eine
Genotyp-Phänotyp-Kopplung
durch Einbauen einzelner Mitglieder der Bank in die Hüll- bzw. Zelloberflächenstrukturen
eines Phagen oder einer Zelle erhalten, der/die das entsprechende
Gen enthält,
das typischerweise in die Phagen-, Phagemid-, Plasmid- oder Virus-DNA eingefügt ist.
Bei der Konstruktion derartiger Banken müssen die Genpools in eine Empfängerzelle
transformiert werden, die zur Biosynthese der entsprechen den Proteine
verwendet wird. Die mit diesem entscheidenden Schritt in Verbindung
stehenden praktischen Beschränkungen
beim Erhalten großer
(komplexer) Banken (typischerweise mehr als 109 unterschiedliche
Mitglieder) sind eine antreibende Kraft für die Entwicklung alternativer
Techniken gewesen, die auf in-vitro-Transkription und -Translation
genetischer Information beruhen, wodurch der Transformationsschritt
vermieden wird.
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Beispiele
für derartige
Techniken sind ribosomale Präsentierung
(Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, S. 9022-9026
[1994]; Hanes et al., FEBS Letters 450, S. 105-110 [1999]) und RNA-Peptid-Fusionen
unter Verwendung von Puromycin (Roberts und Szostak, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94, S. 12297-12302 [1997]). Bei der ribosomalen Präsentierung
wird ein Genpool (typischerweise Produkte einer Polymerasekettenreaktion
(PCR), die zur Transkription und Translation notwendige Signale
enthalten) in vitro transkribiert, um einen entsprechenden Pool
von mRNA herzustellen, der zur Ribosomen-vermittelten Translation
von Proteinen verwendet wird, die typischerweise, durch die Abwesenheit
von Translations-Stoppsignalen, physikalisch mit dem Ribosom-mRNA-Komplex
verbunden bleiben. Dies ermöglicht
eine Selektion von Polypeptiden auf der Grundlage ihrer Kennzeichen
und eine Identifizierung durch DNA-Sequenzierung nach der Umwandlung der
Ribosomen-assoziierten mRNA in DNA durch die Verwendung von reverser
Transkriptase. Spezielle Vorkehrungen (Temperatur, Pufferbedingungen)
müssen
jedoch getroffen werden, um die Stabilität der Ribosom-mRNA-Protein-Komplexe
sicherzustellen, was die Bedingungen, unter denen eine Selektion
durchgeführt werden
kann, beschränkt
(Jermutus et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9, S. 534-548 [1998];
Hanes et al., in der angeführten
Arbeit [1999]). Zusätzliche
Entwicklungen des Verfahrens der Ribosomen-Präsentierung werden in WO 98/54312
vorgelegt. Die Autoren beschreiben ein eukaryotisches Verfahren
der Ribosomen-Präsentierung
und stellen fest, dass es bei der Selektion von z. B. Antikörpern nützlich ist.
Bei dem RNA-Peptid-Fusionssystem wird RNA, an die Puromycin angehängt ist,
während
der Translation verwendet, was zu kovalenten RNA-Protein/Peptid-Bindungen
mittels der Aufnahme von Puromycin in die entstehende Polypeptidkette
durch das Ribosom führt.
Für jede
Selektionsrunde müssen
jedoch neue Puromycin-mRNA-Fusionen hergestellt werden, was die
Wirksamkeit der Technik schwerwiegend beschränkt (Jermutus et al., in der
angeführten
Arbeit [1998]; Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3, S. 268-273 [1999]).
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Ein
weiteres System ist von Tawfik und Griffiths (Nature Biotechnology,
[1998] 16; 652-656) beschrieben worden, das zellfrei ist, aber danach
strebt, die Wirkung von Zellen beim Erzeugen von Kompartimenten nachzuahmen,
um Genotyp und Phänotyp
zu verbinden. Unter Verwendung einer Wasser-in-Öl-Emulsion werden Mizellen
gebildet, die dann durch Mischen mit Ether aufgebrochen werden können. Dieses
System ist jedoch nicht ohne Probleme, das Zweiphasensystem führt zu mehreren
praktischen Beschränkungen.
Um die verkapselten Moleküle
zu gewinnen, muss das Zweiphasensystem aufgebrochen werden, was
ziemlich arbeitsaufwändig
ist, indem es mehrere Spülungen
erfordert und einen Materialverlust verursacht. Darüberhinaus
könnten
die nicht wässrigen
Komponenten, die notwendig sind, um das Zweiphasensystem zu erzeugen, Biomoleküle hemmen
oder denaturieren und die Verkapselung selbst macht es schwieriger,
zusätzliche
Reagenzien abzugeben, die z. B. zum Nachweis oder Einfangen spezifischer
molekularer Einheiten notwendig sind.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, dass unter Verwendung
eines festen Trägers, wie
zum Beispiel eines Teilchensystems, als Träger von genetischer Information
(z. B. RNA oder DNA), das zur Identifizierung verwendet wird und
an welche das entsprechende in vitro translatierte Polypeptid gekoppelt ist,
eine Methodik etabliert wird, die Genotyp und Phänotyp verbindet. Die Isolierung
fester Trägerteilchen,
die ein gewünschtes
Mitglied oder gewünschte
Mitglieder einer Bank tragen, kann typischerweise unter Verwendung
einer Sortiertechnik, die z. B. fluoreszierende Markierungen einsetzt,
die in ein Zielmolekül
oder die Polypeptidmitglieder der Bank eingebaut sind, oder durch
magnetische Isolierung unter Verwendung magnetischer Teilchen, die
ein immobilisiertes Zielmolekül
enthalten, durchgeführt
werden.
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Somit
wird gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines oder
mehrerer gewünschter
Polypeptide bereitgestellt, umfassend:
- (a)
zellfreie Expression von Nukleinsäuremolekülen, die auf einem festen Trägersystem
immobilisiert sind, um Polypeptide herzustellen, wobei der feste
Träger
Mittel für
eine biospezifische Wechselwirkung mit mindestens dem gewünschten
Polypeptid oder einem daran befestigten Molekül trägt;
- (b) Abtrennung des festen Trägers,
der sowohl das gewünschte
Polypeptid als auch die Nukleinsäure,
die es kodiert, trägt;
und wahlweise
- (c) Gewinnung der Nukleinsäure
und/oder des gewünschten
Polypeptids, vorzugsweise der Nukleinsäure.
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Das
Selektionsverfahren der Erfindung kann auch als ein Verfahren zum
Anreichern des gewünschten Polypeptids
aus einer Ausgangsbank von Molekülen,
die es enthält,
betrachtet werden. Wobei „Anreicherung" das Erhöhen des
relativen Anteils des gewünschten
Polypeptids innerhalb der Probe von Molekülvarianten bezeichnet. Auf ähnliche
Weise kann das Verfahren als eines betrachtet werden, durch das
ein Nuklein säuremolekül von Interesse,
d. h. eines, welches das gewünschte
Polypeptid kodiert, angereichert wird.
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Schritt
(a) ist zellfrei. Der Begriff „Zelle" wird in einem weiten
Sinne verwendet; um Zell- und vorzugsweise zellähnliche Systeme einzuschließen, und
umfasst vorzugsweise Liposomen, Mizellen, die durch Wasser-in-Öl-Emulsionen
gebildet werden, Gele, Glas oder jedes andere Mehrphasensystem,
das eine physikalische Grenze zwischen einem System für Genexpression/biospezifische
Wechselwirkung und einem anderen erzeugt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
des vorliegenden Verfahrens findet keine tatsächliche Kompartimentierung
statt, keine Membran oder ein anderes Trennungssystem ist erforderlich,
um einzelne Nukleinsäuremoleküle voneinander
zu isolieren.
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Der
Abtrennungsschritt (b) kann zweckmäßigerweise durch Wechselwirkung
des immobilisierten gewünschten
Polypeptids mit einem (z. B. biospezifischen) Zielreaktanten dafür bewirkt
werden, der Mittel trägt, welche
die Abtrennung des so erhaltenen Komplexes aus festem Träger/Nukleinsäure/gewünschtem
Polypeptid/Zielreaktant gestattet. Derartige Mittel können zum
Beispiel eine Markierung, wie zum Beispiel eine Fluoreszenzmarkierung
oder ein magnetisches Teilchen, umfassen. Auf diese Weise kann der
Komplex unter Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiertechnik
(FACS) oder Magnettrenntechnik abgetrennt werden.
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Bei
den immobilisierten Nukleinsäuren
kann es sich zum Beispiel um RNA oder DNA handeln, die einzelne
Polypeptide, wie zum Beispiel die Mitglieder einer Proteinbank,
kodiert. Es wird offensichtlich sein, dass ihre in-vitro-Translation
im Falle von immobilisierter DNA in Kombination mit oder nach einer
in-vitro-Transkription bewirkt wird.
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Bei
geeigneten festen Trägern
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann es sich um jeden der
wohlbekannten Träger
oder jede der wohlbekannten Matrizen handeln, die derzeit zur Immobilisierung, Trennung
usw. allgemein verwendet oder vorgeschlagen werden. Diese können die
Form von Teilchen, Platten, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern, Kapillaren
oder Mikrotiterstreifen, -röhrchen,
-platten oder -vertiefungen usw. annehmen, wobei teilchenförmige feste
Träger
bevorzugt werden. Der Träger
kann günstigerweise aus
Glas, Silicagel, Latex oder einem polymeren Material hergestellt
werden.
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Nicht
magnetische Polymerkugeln, die zur Verwendung beim Verfahren der
Erfindung geeignet sind, sind von Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norwegen)
sowie von Qiagen, Pharmacia und Serotec erhältlich. Um bei der Handhabung
und Trennung zu helfen, werden jedoch magnetische Kugeln bevorzugt.
Der Begriff „magnetisch", wie hierin verwendet,
bedeutet, dass der Träger
dazu fähig
ist, ein magnetisches Moment verliehen zu bekommen, wenn er in ein
Magnetfeld gebracht wird, und somit unter der Wirkung dieses Feldes
verlagerbar ist.
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Somit
können,
unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung, die magnetischen
Teilchen nach Genexpression und biospezifischer Wechselwirkung durch
Anwendung eines Magnetfeldes, z. B. unter Verwendung eines permanenten
Magneten, auf einer geeigneten Oberfläche gewonnen werden. Es ist
normalerweise ausreichend, einen Magneten auf der Seite des Gefäßes anzuwenden,
welches das Probegemisch enthält,
um die Teilchen an der Wand des Gefäßes zu aggregieren und den
Rest der Probe wegzuschütten.
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Besonders
bevorzugt werden superparamagnetische Teilchen, zum Beispiel sind
die wohlbekannten magnetischen Teilchen, die von Dynal AS (Oslo,
Norwegen) als DYNABEADS verkauft werden, zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet.
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Verfahren
zur Befestigung von Nukleinsäuremolekülen oder
Einheiten aus Protein, wie zum Beispiel die hierin diskutierten
zugehörigen
Bindungspartner oder Zielmoleküle,
an einem festen Träger
sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können chemisches Koppeln, z.
B. unter Einbeziehung von Amin-, Aldehyd-, Thiol-, Thioether- oder Carboxylgruppen,
oder biospezifisches Koppeln, zum Beispiel unter Ausnutzung von Wechselwirkungen
zwischen Streptavidin und Biotin oder Analoga davon, IgG und Protein
A oder G, HSA und Protein G, Glutathion-S-Transferase (G-ST) und
Glutathion, Maltose und einem Maltose-Bindungsprotein, Antikörper und
Antigen (einschließlich
Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten und Haptenen), Lektinen und
Kohlenhydraten, Histidinen und chelierenden Gruppen und Nukleinsäure/Nukleinsäure-Hybridisierung
einschließen,
sind aber nicht darauf beschränkt.
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Bei
den exprimierten Polypeptiden kann es sich zweckmäßigerweise
um Fusionsproteine handeln, die einen Affinitätsfusionspartner enthalten,
wobei der feste Träger
einen zugehörigen
Bindungspartner für
den Affinitätsfusionspartner
als Mittel zur biospezifischen Wechselwirkung trägt. Somit wird das exprimierte
Fusionsprotein typischerweise einen Affinitätsfusionspartneranteil sowie
das gewünschte
Polypeptid oder eine Molekülvariante
des gewünschten
Polypeptids aus der Molekülbank
umfassen, die das gewünschte
Polypeptid enthält.
Auf diese Weise wird eine Bank von Fusionsproteinen erzeugt, die
einen variablen Anteil haben, der aus dem gewünschten Polypeptid oder Varianten
davon aus der Ausgangsbank und einem im Wesentlichen gemeinsamen
Anteil, dem Affinitätsfusionspartner,
besteht. Wo es angemessen ist, wird hierin ein Bezug zu Molekülbanken
hergestellt, bei denen es sich um Banken von Nukleinsäuremolekülen oder
Banken von Polypeptiden handeln kann. Auf ähnliche Weise kann ein Mitglied
einer Bank ein Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen.
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In
einer alternativen Ausführungsform
wird ein Zielmolekül,
das zur biospezifischen Wechselwirkung mit dem gewünschten
Polypeptid fähig
ist, als Mittel zur biospezifischen Wechselwirkung auf dem festen
Träger
immobilisiert. In dieser Ausführungsform
kann auch eine Fusionsproteinbank erzeugt werden, wobei jedes Fusionsprotein
ein Reporterprotein, das günstigerweise
bei dem Abtrennungsschritt (b) verwendet werden kann, sowie das
gewünschte
Polypeptid oder eine molekulare Variante des gewünschten Polypeptids aus der Molekülbank, die
das gewünschte
Polypeptid enthält
einbezieht. Somit wird wiederum das Motiv eines variablen Anteil
und eines im Wesentlichen gemeinsamen Anteils (hier das Reporterprotein)
bereitgestellt. Jedes Molekül
in der Fusionsproteinbank wird somit vorzugsweise einen Bereich
haben, der im Wesentlichen der gleiche ist wie der entsprechende
Bereich anderer Moleküle
in der Bank, während
der variable Bereich jedes Mitgliedes der Bank sich von allen oder
wenigstens den meisten entsprechenden Bereichen der anderen Mitglieder der
Bank unterscheiden wird. Im Allgemeinen wird sich ein variabler
Bereich nicht signifikant von manchen oder allen anderen variablen
Bereichen in der Fusionsproteinbank unterscheiden. Auf diese Weise
kann die Wirkung von geringen Variationen der primären Aminosäuresequenz
auf z. B. Bindung untersucht werden.
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Das
Gewinnen der Nukleinsäure(n),
welche das (die) gewünschte(n)
Polypeptid(e) kodiert (kodieren), kann zum Beispiel durch in-vitro-Amplifikation,
z. B. mittels PCR, PCR mit reverser Transkriptase oder Rolling-Circle-Amplifikation,
bewirkt werden.
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Die
Sequenz abgetrennter und/oder amplifizierter Nukleinsäure(n) kann
z. B. durch herkömmliche
Sequenziertechniken bestimmt werden, wodurch eine Bestimmung der
Sequenz des gewünschten
Polypeptids gestattet wird, um es zu identifizieren.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann der Ausgangspool von Nukleinsäuren, die einzelne Mitglieder
der Bank kodieren, eine erhebliche Komplexität aufweisen (z. B. ≥ 1015 Mitglieder) (Roberts, in der angeführten Arbeit
[1999]). Die Anzahl unterschiedlicher Nukleinsäurespezies, die pro Trägerteilchen der
festen Phase immobilisiert sind, kann bei der Herstellung der Teilchen
kontrolliert werden, zum Beispiel durch die Verwendung unterschiedlicher
Konzentrationen des Moleküls,
das als Anker dient (zum Beispiel DNA, RNA, PNA oder ein Protein),
oder durch Vorbehandlung von Teilchen mit kompetierendem Material.
Die Selektion diskreter Teilchen in nur einem einzigen erfindungsgemäßen Selektionsverfahren
kann zur gleichzeitigen Selektion einer signifikant verringerten
Anzahl von Mitgliedern der Bank führen.
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Das
Durchführen
wiederholter Zyklen in Übereinstimmung
mit der Erfindung, wahlweise unter Einsetzen von Festphasenträgerteilchen
mit sukzessiv abnehmenden Anzahlen von Verankerungsstellen für Nukleinsäuren, und
wahlweise mit gleichzeitiger Verdünnung des Nukleinsäurematerials,
kann zu einer allmählichen Umwandlung
zu einem beschränkten
Satz von Mitgliedern einer Bank führen, die einer individuellen
Analyse auf der Klonebene unterworfen werden können, um eine gewünschte Polypeptidspezies
zu identifizieren. Wo eine Selektionstechnik, wie zum Beispiel FACS,
eingesetzt wird, kann die Verwendung unterschiedlicher Schwellenwerte
für eine
positive Selektion eine stringente Selektion von Festphasenträgerteilchen
gestatten, die hohe Anzahlen des gewünschten Mitglieds der Bank
enthalten.
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Alternativ
dazu kann der angereicherte Pool von Nukleinsäuresequenzen, nach einer Verringerung
der Anzahl von Mitgliedern der Bank durch Abtrennung in Übereinstimmung
mit der Erfindung, weiteren Selektionen unter Verwendung eines anderen
Selektionsprinzips, wie zum Beispiel (aber nicht beschränkt auf)
Zellpräsentierung,
Phagenpräsentierung,
Plasmidpräsentierung,
ribosomale Präsentierung
oder mRNA-Peptid-Fusionen
unterworfen werden.
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Somit
handelt es sich bei dem Verfahren der Erfindung vorzugsweise um
einen iterativen Vorgang, wobei eine Anreicherung des (der) Polypeptids
(Polypeptide) von Interesse stattfindet, je mehr Zyklen durchgeführt werden.
Während
es etwas Diffusion exprimierter Polypeptide und Bindung an benachbarte
Kugeln (oder Bereiche eines festen Trägers, Teilchen usw.) geben
kann, wird die lokale Bindung an die eigene Kugel (oder den eigenen
Bereich des festen Trägers,
das eigene Teilchen usw.) des Polypeptids bevorzugt werden. Somit wird
nach mehreren Zyklen eine signifikante Anreicherung erreicht werden.
Die Verfahrensschritte (a) und (b) werden somit vorzugsweise mehr
als einmal durchgeführt
werden, typischerweise wird die Anzahl der Zyklen zwischen 1 und
100, vorzugsweise 2 bis 50, stärker
bevorzugt 2 bis 20, z. B. 5 bis 10, betragen. Auf diese Weise kann
die Anzahl der Varianten sehr signifikant beschränkt werden und die relativ
kleine verbleibende Anzahl kann eine nach der anderen analysiert
werden, z. B. durch ELISA, statistische Analyse von Klonen nach
dem Sequenzieren oder Biacore-Analyse.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung kann die Selektion eines Festphasenträgers, der mehrere
Nukleinsäurespezies
trägt,
einschließlich
des gewünschten
Mitglieds der Bank, verwendet werden, um nützliche Reagenzien herzustellen,
ohne Notwendigkeit zur Identifizierung des bestimmten gewünschten Mitglieds
der Bank. Somit kann das Verfahren auf iterative Weise durchgeführt, aber
beendet werden, wenn die selektierte Probe noch eine gemischte Population
von DNA-Molekülen
enthält,
dieser Pool von DNA-Fragmenten kann als „polyklonales" Material verwendet
werden, das auf der Molekülebene
nicht definiert, aber trotzdem nützlich
ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung können
zwei unterschiedliche Nukleinsäurebanken auf
getrennten festen Trägersystemen
immobilisiert werden und das Verfahren kann verwendet werden, um
in Wechselwirkung tretende Polypeptidpaare zu selektieren und zu
identifizieren. Somit kann zum Beispiel eine der Nukleinsäurebanken
Polypeptide, wie zum Beispiel Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide oder
Proteindomänen,
kodieren und die andere kann cDNA-kodierte Polypeptide kodieren.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird eine Molekülbank
bereitgestellt, die ein festes Trägersystem umfasst, das eine
Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen darauf
immobilisiert hat und das mit jedem der Nukleinsäuremoleküle zusammenhängende und
auch auf dem Trägersystem
immobilisierte Mittel für
eine biospezifische Wechselwirkung mit dem Expressionsprodukt eines
oder mehrerer der Nukleinsäuremoleküle hat.
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Das
feste Trägersystem
ist vorzugsweise teilchenförmig
und somit wird jedes Teilchen günstigerweise ein
Nukleinsäuremolekül aus der
Bank und Mittel für
eine biospezifische Wechselwirkung mit dessen Expressionsprodukt
tragen. Somit wird der zuvor erwähnte „Zusammenhang" zwischen Nukleinsäuremolekülen und Mitteln
für eine
biospezifische Wechselwirkung erreicht. Wie in größerem Detail
vorstehend diskutiert wurde, wird die Nukleinsäuremolekülbank günstigerweise Fusionsproteine
kodieren und die Mittel für
eine biospezifische Wechselwirkung können mit entweder dem variablen
oder dem gemeinsamen Anteil des Fusionsproteins in Wechselwirkung
treten, typischerweise daran binden.
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In
den begleitenden Bildern, die dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen,
ohne sie auf irgendeine Weise zu beschränken, handelt es sich bei
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1 um
eine schematische Beschreibung des grundlegenden Konzeptes der Erfindung.
Ein Pool von Nukleinsäurefragmenten,
die einzelne Mitglieder einer Polypeptidbank kodieren, wird auf
Teilchen eines festen Trägers
immobilisiert. In einem auf DNA beruhenden Format werden Fragmente
immobilisiert, wonach ein gekoppelter Transkriptions-/Translationsschritt
durchgeführt
wird, der zur Herstellung der entsprechenden Genprodukte führt. In
einem auf RNA beruhenden Format werden RNA-Moleküle transkriptionell von den DNA-Fragmenten
hergestellt, wonach sie auf dem festen Träger immobilisiert werden, gefolgt
von einem Translationssschritt, der zu den entsprechenden Genprodukten
führt.
Typischerweise, aber nicht ausschließlich handelt es sich bei den
Genprodukten um Fusionsproteine aus Mitgliedern der Polypeptidbank
und einem Affinitätsfusionspartner,
für den
ein zugehöriger
Bindungspartner auf den festen Trägerteilchen vorliegt. Eine funktionelle
Selektion eines gewünschten
Polypeptids führt
zur Isolierung von Teilchen, welche die entsprechenden Gene (DNA
oder RNA) tragen, die nach Nukleinamplifikation und DNA-Sequenzierung
identifiziert werden.
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Bei 2 handelt
es sich um eine schematische Beschreibung der Verwendung eines festen
Trägers als
Träger
von gekoppelter genetischer und Protein-Information (Version mit
immobilisierter DNA/markiertem Ziel in Lösung). Eine Bank von DNA-Konstrukten (typischerweise,
aber nicht ausschließlich
PCR-Fragmenten), die Signale enthalten, die zur RNA-Transkription
und Proteintranslation eines Mitglieds der Bank notwendig sind,
wird auf Teilchen eines geeigneten Trägers immobilisiert (z. B. unter
Verwendung von Biotin/Streptavidin-Chemie durch Einbau einer Biotingruppe
in die DNA des zur PCR-Amplifikation verwendeten Primers und durch
Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kugeln). Die genetischen
Konstrukte kodieren einzelne Mitglieder der Bank, genetisch fusioniert
an einen gemeinsamen Affinitätsfusionspartner
(AFP), für
den der zugehörige
Bindungspartner (CBP) auf den Teilchen immobilisiert ist (z. B.
mittels geeigneter Kopplungs-Chemie wie zum Beispiel Streptavidin/Biotin-Chemie).
Nach Zugabe von Komponenten zur Transkription und Translation in
vitro (z. B. eines S30-Extrakts
von Escherichia coli), werden RNA-(mRNA-)Moleküle hergestellt, welche die
unterschiedlichen, anschließend
translatierten Mitglieder der Proteinbank kodieren. Durch Wechselwirkung zwischen
dem immobilisierten Bindungspartner und dem neu translatierten Affinitätsfusionspartner
sind die einzelnen Mitglieder der Bank physikalisch mit den festen
Trägerteilchen
verbunden, welche die genetische Information (DNA), die sie kodiert,
enthalten.
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Nach
dem Spülen
werden die festen Trägerteilchen
mit markierten Zielmolekülen
inkubiert, die z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umfassen, was
eine physikalische Isolierung von Fluoreszenz-positiven Teilchen
ermöglicht,
zum Beispiel durch FACS oder durch magnetische Trennung. Somit werden
Teilchen isoliert, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem
mit dem Teilchen zusammenhängenden
Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information
(DNA) tragen.
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Unter
Verwendung von z. B. PCR werden die DNA-Fragmente, die an einzelne
oder mehrere isolierte Teilchen oder Kugeln gekoppelt sind, erneut
amplifiziert und zur Identifizierung des (der) selektierten Polypeptids
(Polypeptide) oder wahlweise für
aufeinanderfolgende Runden von Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Transkription
und -Translation, gefolgt von Selektion, z.B. durch FACS, verwendet.
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Bei 3 handelt
es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung eines festen
Trägers als
Träger
gekoppelter genetischer und Proteininformation (Version mit immobilisierter
mRNA/markiertem Ziel in Lösung).
Aus einer Bank genetischer Konstrukte, die zur Transkription und
Proteintranslation eines Mitglieds der Bank notwendige Signale enthalten,
wird RNA (mRNA) in vitro hergestellt (Transkription) und auf Teilchen eines
geeigneten Trägers
immobilisiert (z. B. mittels Hybridisierung zwischen komplementären Sequenzen,
die in der mRNA und der immobilisierten DNA, PNA oder den RNA-Fragmenten
vorliegen). Die immobilisierten mRNA-Moleküle kodieren einzelne Mitglieder
der Bank, genetisch an einen gemeinsamen Affinitätsfusionspartner (AFP) fusioniert,
für den
der zugehörige
Bindungspartner (CBP) auf den Teilchen immobilisiert ist (z. B.
mittels Streptavidin/Biotin-Chemie). Nach Zugabe der Komponenten
zur in-vitro-Translation
(z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli) werden die mRNA-Moleküle translatiert,
um die unterschiedlichen Mitglieder der Proteinbank herzustellen.
Durch Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Bindungspartner
und dem neu translatierten Affinitätsfusionspartner werden die
einzelnen Mitglieder der Bank physikalisch mit den festen Trägerteilchen
verbunden, welche die genetische Information (mRNA), die sie kodiert,
enthalten.
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Nach
dem Spülen
werden die festen Trägerteilchen
mit markierten Zielmolekülen
inkubiert, die z. B. FITC umfassen, was eine physikalische Isolierung
von Fluoreszenzpositiven Teilchen ermöglicht, zum Beispiel durch
FACS. Somit werden einzelne oder mehrere Teilchen isoliert, die
Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden
Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information
(mRNA) tragen.
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Unter
Verwendung von z. B. PCR mit reverser Transkriptase werden die mit
einer Kugel/einem Teilchen zusammenhängenden mRNA-Moleküle in die
entsprechenden DNA-Fragmente umgewandelt, die PCR-amplifiziert und
zur Identifizierung des (der) selektierten Polypeptids (Polypeptide)
oder wahlweise für aufeinanderfolgende
Runden von in-vitro-Transkription, Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Translation,
gefolgt von Selektion, z.B. durch FACS oder magnetische Selektion,
verwendet werden.
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Bei 4 handelt
es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung eines festen
Trägers als
Träger
gekoppelter genetischer und Proteininformation (Version mit immobilisierter
DNA/markiertem Bindungspartner). Eine Bank von DNA-Konstrukten (typischerweise,
aber nicht ausschließlich
PCR-Fragmenten), die zur RNA-Transkription und Proteintranslation
eines Mitglieds der Bank notwendige Signale enthalten, wird auf
diskreten Teilchen eines geeigneten Trägers immobilisiert (z. B. unter
Verwendung von Biotin/Streptavidin-Chemie durch Einbau einer Biotin-Gruppe
in die DNA des für
die PCR-Amplifikation verwendeten Primers und durch Verwendung von
Streptavidinbeschichteten Kugeln). Die Teilchen tragen auch das
Zielmolekül,
von dem gewünscht
wird, dass in Wechselwirkung tretende Mitglieder der Bank mit ihm
in Wechselwirkung treten. Diese Immobilisierung kann unter Verwendung
von z. B. Standard-Kopplungs- Chemieverfahren,
wie zum Beispiel EDC/NHS-Chemie oder Biotin/Streptavidin-Chemie,
erreicht werden. Die genetischen Konstrukte kodieren die einzelnen
Mitglieder der Bank, genetisch an einen Reporterfusionspartner (RFP)
fusioniert, wie zum Beispiel ein Enzym oder ein autofluoreszierendes
Protein wie zum Beispiel das grün
fluoreszierende Protein (GFP). Nach Zugabe von Komponenten zur in-vitro-Transkription
und -Translation (z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli)
werden die RNA(mRNA)-Moleküle
hergestellt, welche die anschließend translatierten unterschiedlichen
Mitglieder der Proteinbank kodieren. Durch Wechselwirkung zwischen
dem immobilisierten Zielmolekül
und dem neu translatierten Mitglied der Bank werden einzelne Mitglieder
der Bank, die zur Wechselwirkung mit dem auf dem festen Träger immobilisierten
Zielmolekül
fähig sind,
physikalisch mit den festen Trägerteilchen
verbunden, welche die genetische Information (DNA), die sie kodiert,
enthalten.
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Nach
dem Spülen
werden die festen Trägerteilchen
sortiert, z. B. unter Verwendung von FACS-Technik oder magnetischer
Trennung, um einzelne oder mehrere Teilchen zu isolieren, die Komplexe
aus dem immobilisierten, markierten Ziel und dem mit dem Teilchen
zusammenhängenden
Genprodukt des Mitglieds der Bank tragen. Somit werden Teilchen
isoliert, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden
Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information
(DNA) tragen.
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Unter
Verwendung von PCR werden die DNA-Fragmente, die an diskrete, isolierte
Kugeln gekoppelt sind, erneut amplifiziert und zur Identifizierung
des (der) selektierten Polypeptids (Polypeptide) oder wahlweise für aufeinanderfolgende
Runden von Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Transkription und -Translation,
gefolgt von Abtrennung, z. B. durch FACS oder magnetische Selektion
verwendet.
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Bei 5 handelt
es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung eines festen
Trägers als
Träger
von gekoppelter genetischer und Protein-Information (Version mit
immobilisierter mRNA/markiertem Bindungspartner). Aus einer Bank
genetischer Konstrukte, die zur Transkription und Proteintranslation
eines Mitglieds der Bank notwendige Signale enthalten, wird RNA
(mRNA) in vitro hergestellt (Transkription) und auf Teilchen eines
geeigneten Trägers
immobilisiert (z. B. mittels Hybridisierung zwischen komplementären Sequenzen,
die in der mRNA und den immobilisierten DNA-, PNA- oder RNA-Fragmenten
vorliegen). Die Teilchen tragen auch das Zielmolekül, von dem
gewünscht
wird, dass Mitglieder der Bank mit ihm in Wechselwirkung treten.
Diese Immobilisierung kann unter Verwendung von z. B. Standard-Kopplungs-Chemieverfahren, wie
zum Beispiel EDC/NHS-Chemie oder Biotin/Streptavidin-Chemie, erhalten
werden. Die genetischen Konstrukte (mRNA) kodieren einzelne Mitglieder
der Bank, genetisch fusioniert an einen Reporterfusionspartner (RFP),
wie zum Beispiel ein Enzym oder ein autofluoreszierendes Protein,
wie zum Beispiel das grün
fluoreszierende Protein (GFP). Nach Zugabe von Komponenten zur in-vitro-Translation
(z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli) werden die mRNA-Moleküle translatiert,
um die unterschiedlichen Mitglieder der Proteinbank herzustellen.
Durch Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Zielmolekül und dem
neu translatierten Mitglied der Bank werden einzelne Mitglieder
der Bank, die zur Wechselwirkung mit dem auf dem festen Träger immobilisierten
Zielmolekül
fähig sind,
physikalisch mit dem festen Träger
verbunden, der die genetische Information (mRNA), die sie kodiert,
enthält.
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Nach
dem Spülen
werden die festen Trägerteilchen
sortiert, z. B. unter Verwendung von FACS-Technik, um einzelne oder
mehrere Teilchen zu isolieren, die Komplexe aus dem markierten Ziel
und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds
der Bank zu isolieren. Somit werden Teilchen isoliert, die Komplexe
aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden
Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information
(mRNA) tragen.
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Unter
Verwendung von z. B. PCR mit reverser Transkriptase werden die mit
einer Kugel/einem Teilchen zusammenhängenden mRNA-Moleküle in die
entsprechenden DNA-Fragmente verwandelt, die PCR-amplifiziert und
für aufeinanderfolgende
Runden von in-vitro-Transkription, Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Translation,
gefolgt von Selektion, z.B. durch FACS, verwendet werden.
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6 veranschaulicht
das experimentelle Setup für
Beispiel 1. Paramagnetische, mit Streptavidin beschichtete Teilchen
wurden zunächst
mit biotinyliertem menschlichem Serumalbumin (HSA) inkubiert, was zu
einer stabilen Verankerung von HSA führte. Getrennte Teilmengen
wurden anschließend
mit entweder (A) Protein ABD-Z, einem genetischen Fusionsprotein
aus einem vom Protein G aus Streptokokken abgeleiteten Serumalbumin-bindenden
Protein (ABD) und einem von Protein A aus Staphylokokken abgeleiteten
Immunglobulin-bindenden Protein (Z), gefolgt von Inkubation mit
polyklonalen, mit fluoreszierendem Isothiocyanat (FITC) konjugierten
Ziegen-IgG-Antikörpern,
oder (B) mit den FITC-konjugierten Ziegen-IgG-Antikörpern direkt inkubiert.
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Bei 7 handelt
es sich um eine Photographie von UV-Mikroskopie-Analysen Streptavidin-beschichteter
Kugeln/Teilchen, die biotinyliertes, mit Streptavidin/Biotin-Chemie immobilisertes
menschliches Serumalbumin enthalten. (A) Teilchen, die mit FITC-konjugierten
polyklonalen Ziegen-IgG-Antikörpern
inkubiert wurden, nachdem sie zunächst einer Lösung, die
das Fusionsprotein Z-ABD enthält,
ausgesetzt wurden. (B) Teilchen, die nur mit FITC-konjugierten polyklonalen
Ziegen-IgG-Antikörpern
inkubiert wurden.
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Bei 8 handelt
es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung der Erfindung
zum Selektieren in Wechselwirkung tretender Polypeptidpaare durch
das Kreuzen von zwei unterschiedlichen Banken. Zwei Pools von Nukleinsäurefragmenten,
die unterschiedliche Polypeptidbanken kodieren, werden getrennt
auf Teilchen von festen Trägersystemen
immobilisiert. In einem auf DNA beruhenden Format werden Fragmente
immobilisiert, wonach ein gekoppelter Transkriptions-/Translationschritt
durchgeführt
wird, der zur Herstellung der entsprechenden Genprodukte führt. In
einem auf RNA beruhenden Format werden RNA-Moleküle transkriptionell von den
DNA-Fragmenten hergestellt, wonach sie auf dem festen Träger immobilisiert werden,
gefolgt von einem Translationsschritt, der zu den entsprechenden
Genprodukten führt.
Typischerweise, aber nicht ausschließlich handelt es sich bei den
Genprodukten um Fusionsproteine aus Mitgliedern der Polypeptidbank
und einem Affinitätsfusionspartner,
für den
ein zugehöriger
Bindungspartner auf den Teilchen vorliegt. Die unterschiedlichen
Banken sind unterschiedlich markiert, z. B. unter Verwendung von
zwei Fluorophoren mit unterschiedlichen Anregungsspektren. Biospezifische
Wechselwirkungen zwischen Mitgliedern der unterschiedlichen Polypeptidbanken
werden als doppelt markierte Teilchenpaare nachgewiesen. Zur Identifizierung
werden die auf den isolierten Teilchen vorliegenden Nukleinsäuren, welche
die entsprechenden Gene kodieren, durch DNA-Sequenzierung analysiert.
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Bei 9 handelt
es sich um eine schematische Beschreibung der Konstruktion der Plasmide pGEM-SD-K-FLAG-Zwt und pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA die
zur Verwendung als Matrize für
die Amplifikation von PCR-Produkten zur zellfreien Transkription
und Translation von entweder freier oder auf einer Kugel immobilisierter
DNA/RNA gestaltet worden sind.
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Bei 10 handelt
es sich um eine Radiographie, die nach einer SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden
Bedingungen von Proteinen erhalten wurde, die unter Verwendung eines
zellfreien Extrakts, der mit [35S]-Methionin
angereichert ist, und PCR-Produkten,
die mit den Primern NOOL-12 und NOOL-13 unter Verwendung unterschiedlicher
Plasmide als Matrizen hergestellt wurden, synthetisiert wurden.
Spur 1: pGEM-SD-K-FLAG-Zwt, Spur 2: pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA.
Ein Marker mit 14C-markierten Proteinen
wurde als Größenreferenz
verwendet (Prod. nr. CFA756, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Schweden). Pfeile zeigen die Positionen von Referenzproteinen mit
Molekulargewichten von 14,3, 20,1 bzw. 30,0 kDa an.
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Bei 11 handelt
es sich um einen Überlagerungsgraphen
aus einer vergleichenden FACS-Analyse von mit anti-FLAG BioM5-Antikörper beschichteten
Kugeln, die einem Transkriptions-/Translationsgemisch mit dem PCR-Produkt
FLAG-Zwt ausgesetzt wurden, und Kugeln der
Negativkontrolle, die auf die gleiche Weise behandelt, aber nicht
mit anti-FLAG BioM5-Antikörpern
beschichtet wurden.
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Bei 12 handelt
es sich um einen Überlagerungsgraphen
aus einer vergleichenden FACS-Analyse von mit anti-FLAG BioM5-Antikörper und
einem PCR-Produkt doppelt beschichteten Kugeln, die einem Transkriptions-/Translationsgemisch
ausgesetzt wurden, gefolgt von Nachweis. Das Bild zeigt die Analyse
von zwei unterschiedlichen Sätzen
von Kugeln, die PCR-Produkte, die entweder FLAG-Zwt oder
FLAG-ZIgA kodieren, enthalten, die der Analyse
unterworfen wurden.
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Bei 13(A) handelt es sich um eine schematische
Darstellung der Anwesenheit einer MluI Restriktionsstelle in dem
PCR-Produkt, das durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer
NOOL-12 und NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhalten
wurde. Im Gegensatz dazu liegt in dem PCR-Produkt, das durch PCR-Amplifikation
unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 auf der Plasmidmatrize
pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA erhalten wurde, keine
MluI Stelle vor. Auch gezeigt werden die Größen der Spaltungsprodukte,
die nach Inkubation des das Fusionsprotein FLAG-Zwt kodierenden
PCR-Produkts mit MluI erhalten wurden.
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Bei
(B) handelt es sich um Photographien, die Agarosegelelektrophoreseanalysen
von PCR-Produkten zeigen, die durch PCR-Amplifikation unterschiedlicher
Proben erhalten wurden, die vor oder nach auf FACS beruhenden Anreicherungen
genommen wurden. Spur 1: Kugeln, die nur das PCR-Produkt, das FLAG-Zwt kodiert, enthalten; Spur 2: Kugeln, die
nur das PCR-Produkt, das FLAG-Zwt kodiert,
enthalten. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit
MluI unterworfen; Spur 3: Kugeln, die nur das PCR-Produkt, das FLAG-ZIgA kodiert, enthalten; Spur 4: Kugeln, die
nur das PCR-Produkt,
das FLAG-ZIgA kodiert, enthalten. Das so
erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit MluI unterworfen;
Spur 5: Kugeln, die ein 1 : 1 Gemisch von PCR-Produkten, die FLAG-Zwt und
FLAG-ZIgA kodieren, enthalten. Probe von
vor dem FACS-Anreicherungsexperiment;
Spur 6: Kugeln, die ein 1 : 1 Gemisch von PCR-Produkten, die FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA kodieren,
enthalten. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit
MluI unterworfen. Probe von vor dem FACS-Anreicherungsexperiment;
Spur 7: Probe von Kugeln, die im FACS-Anreicherungsexperiment sortiert
wurden; Spur 8: Probe von Kugeln, die im FACS Anreicherungsexperiment
sortiert wurden. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation
mit MluI unterworfen. Flankierende Spuren mit Größenmarkern (DNA des Phagen
I gespalten mit PstI, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)
sind mit M markiert.
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Bei 14 oben
handelt es sich um einen Überlagerungsgraphen
von Intensitätsaufzeichnungen,
die den Spuren 6 (gestrichelte Linie) und 8 (durchgezogene Linie)
in 13 entsprechen. Die relative Intensität wird als
Funktion der Migrationskoordinate gezeigt. Unten: zeigt digital
ausgeschnittene Strecken von dem Gelbild, die den Spuren 6 und 8
aus dem in 13 gezeigten Gel entsprechen.
Eine relative Verlagerung der Intensität in Richtung auf die Spaltungsprodukte
mit kleinerem Molekulargewicht wird für die Probe beobachtet, die
durch PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren erhalten wurde, die auf
Kugeln vorliegen, die in der FACS-Anreicherung gesammelt wurden
(Strecke, die Spur 8 entspricht).
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In
einer repräsentativen
Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung wird ein Pool von Genfragmenten (2-5),
welche die DNA enthalten, die unterschiedliche Mitglieder einer
Polypeptidbank kodiert, unter Verwendung von Standard-DNA-Technik,
zum Beispiel wie von Nord et al., Prot. Engineering 8, S. 601-608
[1995] und Nord et al., Nature Biotechnol. 15, S. 772-777 [1997]
beschrieben, hergestellt. Die Genfragmente sollten eine erste Sequenz
einschließen,
die einer geeigneten Promotorsequenz für RNA-Polymerase entspricht,
wie zum Beispiel den Promotor des E. coli-Phagen T7, den T3-Promotor,
den SP6-Promotor, den lac-Promotor, den lac UV5-Promotor, den ara
B-Promotor, den
trp-Promotor, den Promotor des Proteins A aus Staphylokokken oder
virale Promotoren wie den Promotor des Rous-Sarkom-Virus (RSV) und
die späten und
frühen
Promotoren des Cytomegalovirus (CMV), um als Signale zur Transkription
des DNA-Fragments in mRNA unter Verwendung eines geeigneten Extrakts
wie zum Beispiel eines S30-Extrakts von E. coli für E. coli-Promotoren
oder Promotoren prokaryotischen Ursprungs oder eines Retikulozytenextrakts
oder Weizenkeimextrakts für
Promotoren eukaryotischen Ursprungs (gekoppelte Systeme) oder durch
einen ersten transkriptionellen Schritt unter Verwendung einer Präparation
gereinigter, geeigneter RNA-Polymerase,
getrennt von einem späteren
Translationsschritt (nicht gekoppeltes System), bei dem die mRNA-Matrizen
zur Translation der genetischen Information in die entsprechenden
Polypeptide verwendet werden, zu wirken.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung folgt auf die Promotorsequenz eine Sequenz, die einen
zum Binden eines zugehörigen
Bindungspartners eingesetzten Affinitätsfusionspartner (AFP) kodiert,
der auf einem festen Trägerteilchen
immobilisiert ist. Bei diesem Affinitätsfusionspartner kann es sich
zum Beispiel um den Albuminbindenden Bereich des Streptokokken-Proteins
G oder von dessen Derivaten, um das Immunglobulin-bindende Protein
A oder dessen Derivate, ein Maltose-bindendes Protein, die Glutathion-S-Transferase, das
FLAG-Peptid, einen Bio-Anhang (biotinyliertes Peptid), eine Hexahistidylsequenz,
einen c-myc-Anhang oder jedes andere Polypeptid handeln, für das ein
geeigneter zugehöriger
Bindungspartner zur Verfügung steht.
Die Genfragmente sollten jeweils auch das Gen enthalten, das ein
einzelnes Polypeptidmit glied der Bank kodiert, in translationalem
Rahmen mit dem Affinitätsfusionspartner-Polypeptid,
falls dieses verwendet wird. Alternativ dazu kann das Gen, das den
Affinitätsfusionspartner
kodiert, hinter dem Gen für
das Mitglied der Polypeptidbank positioniert werden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung geht der Sequenz, die das einzelne Polypeptidmitglied
der Bank kodiert, eine Sequenz entweder voraus oder folgt ihr, die
ein geeignetes Reporterpolypeptid kodiert, wie zum Beispiel das
grün fluoreszierende
Protein (GFP), alkalische Phosphatase, Luciferase, Meerrettichperoxidase
(HRP) oder β-Galaktosidase.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung enthalten die Genfragmente eine geeignete chemische
Gruppe (z. B. Biotin oder Digoxin), die z.B. durch PCR-Amplifikation
unter Verwendung eines Primers oder von Nukleotiden, die mit der
Gruppe markiert sind, eingeführt
wird. Diese Gruppe wird verwendet, um das DNA-Fragment auf festen
Trägerteilchen
zu verankern, die mit einem geeigneten zugehörigen Bindungspartner, wie
zum Beispiel Streptavidin oder anti-Digoxin-Antikörper(n),
beschichtet sind (2 und 4).
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird ein Pool transkribierter mRNA mittels einer geeigneten
Befestigungseinheit auf den festen Trägerteilchen immobilisiert.
Bei dieser Einheit kann es sich zum Beispiel um eine Nukleotidsequenz
am 5'- oder 3'-Ende der mRNA handeln,
für die
eine komplementäre
Sequenz von RNA, DNA oder PNA auf den festen Trägerteilchen immobilisiert ist
(3 und 5).
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Nach
dem Immobilisieren von DNA-Fragmenten auf den festen Trägerteilchen
wird unter Verwendung einer geeigneten RNA-Polymerase, abhängig von
dem Promotor, der für
die Konstruktion der Fragmente verwendet wurde, ein Transkriptionsschritt
durchgeführt.
Die dadurch transkribierte mRNA wird zur Translation der genetischen
Information in die entsprechenden Polypeptide eingesetzt, die durch
biospezifische Wechselwirkung mit entweder einem immobilisierten
zugehörigen
Bindungspartner für
einen Affinitätsfusionspartner, der
im translationalen Rahmen mit dem Polypeptid kodiert ist, oder mittels
der Erkennung eines Zielmoleküls, das
auf dem Teilchen immobilisiert ist, an die festen Trägerteilchen
gebunden sind. Zur Translation kann ein geeigneter Extrakt oder
können
reine Bestandteile verwendet werden, wie zum Beispiel ein S30-Extrakt aus E. coli,
ein Extrakt aus Kaninchen-Retikulozyten oder ein rekonstituiertes
Gemisch gereinigter wesentlicher Bestandteile einer Translationsmaschinerie.
Geeignete Teilchen können
zum Beispiel aus Polystyrol oder jedem anderen Polymer oder Polymergemisch,
Cellulose, Hydroxylapatit, Sepharose, Dextran oder Silicagel hergestellt
werden.
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Nach
der Immobilisierung von mRNA-Molekülen auf festen Trägerteilchen
wird deren Translation in die entsprechenden Proteine wie vorstehend
beschrieben durchgeführt.
Die dadurch hergestellten Polypeptide sind durch biospezifische
Wechselwirkung mit entweder einem immobilisierten zugehörigen Bindungspartner für einen
Affinitätsfusionspartner,
der im translationalen Rahmen mit dem Polypeptid kodiert ist, oder
mittels Erkennung eines Zielmoleküls, das auf dem Teilchen immobilisiert
ist, an die festen Trägerteilchen
gebunden.
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Um Überkreuzreaktionen,
d. h. die Bindung eines translatierten Polypeptid-Fusionsproteinmoleküls an einen
zugehörigen
Bindungspartner oder an ein Zielmolekül, das auf einem festen Trägerteilchen
vorliegt, das nicht auch die genetische Information (DNA oder RNA)
trägt,
die das Polypeptid kodiert, zu umgehen, kann das Gemisch verdünnt werden,
um so eine große
Nähe zwischen
Teilchen zu verhindern.
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Eine
Selektion von Teilchen, die ein gewünschtes Polypeptid oder eine
Gruppe von Polypeptiden enthalten, kann durch direkte Isolierung,
zum Beispiel in einem FACS-Scanner,
durchgeführt
werden, falls das Ziel mit einem Fluorophor markiert ist oder falls
das Polypeptid genetisch mit einem fluoreszierenden Protein wie zum
Beispiel dem grün
fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Ein anderes Selektionsverfahren
besteht darin, magnetische Prinzipien zu verwenden, wobei magnetische
(oder paramagnetische) Teilchen, die mit dem Zielmolekül von Interesse
beschichtet sind (1 und 2) verwendet
werden. Alternativ dazu können
Teilchen, die mittels einer spezifischen Wechselwirkung mit einem
Polypeptid-Genprodukt eines Mitglieds der Bank markiert sind, unter
Verwendung z. B. eines UV-Mikroskops physikalisch isoliert werden.
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Eine
Selektion kann auf der Grundlage funktioneller Eigenschaften der
kodierten Polypeptide durchgeführt
werden, wie zum Beispiel Binden an ein gewünschtes Ziel (Antikörper oder
andere Proteine oder Peptide, Kohlenhydrate, organische Moleküle, Zellen,
Viren, Pflanzen usw.), katalytische Aktivität oder durch proteolytische
oder chemische Stabilität
unter bestimmten chemischen Bedingungen.
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Nach
der Isolierung von Teilchen, die ein Polypeptid mit den gewünschten
Kennzeichen tragen, wird die Nukleinsäureinformation (DNA oder RNA),
die auf den gleichen Teilchen vorliegt, (falls notwendig) durch in-vitro-Nukleinsäureamplifikationsverfahren
wie zum Beispiel PCR mit reverser Transkriptase (im Falle von RNA),
PCR (im Falle von DNA) oder Rolling-Circle-Replikation amplifiziert.
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Falls
notwendig kann das Verfahren mit zusätzlichen Zyklen direkter DNA-Immobilisierung
oder RNA-Immobilisierung nach in-vitro-Transkription erneut amplifizierter,
an Teilchen gebundener Nukleinsäuren wiederholt
werden. Falls eine weitere Variation für die nächste Selektionsrunde gewünscht wird,
können
die Amplifikationsbedingungen oder Polymerase(n) gewählt werden,
um in den nächsten
Pool von DNA-Fragmenten Mutationen einzuführen.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
der Erfindung werden zwei unterschiedliche Polypeptidbanken auf
in Wechselwirkung tretende Paare hin untersucht (8).
Teilchen, die einer Bank von z. B. cDNA-kodierten Polypeptiden entsprechen,
werden mit Teilchen gemischt, die Mitglieder einer Polypeptidbank
von zum Beispiel cDNA-kodierten
Proteinen, Antikörpern
oder Fragmenten davon, Peptiden oder Proteindomänen tragen. Die für die Immobilisierung
der Nukleinsäuren
verwendeten Teilchen werden so hergestellt, dass sie zwei unterschiedliche
Markierungen enthalten, eine für
jede Bank. Die Isolierung in Wechselwirkung tretender Polypeptidpaare,
die sich aus biospezifischen Wechselwirkungen ergeben, werden z.
B. durch FACS-Technik unter Einsetzen des Nachweises von doppelt
markierten Teilchenpaaren isoliert.
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Das
Verfahren der Erfindung hat mehrere Vorteile gegenüber existierenden
Selektionssystemen, die einen in-vivo-Polypeptidbiosyntheseschritt
verwenden, da es keinen Bedarf zur Transformation des genetischen
Materials in eine Empfängerzelle
gibt. Die einzige Beschränkung
im Hinblick auf die Bankgröße (Komplexität) ist das
Bindungsvermögen
des festen Trägersystems.
Darüberhinaus
verwendet das vorliegende in-vitro-Selektionssystem einen stabilen festen
Träger
als Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp, was es ermöglicht,
raue Bedingungen zu verwenden, wenn Liganden mit hoher Affinität gegenüber einem
gegebenen Zielmolekül
selektiert werden. Als Folge daraus, dass die Nukleinsäuren direkt
auf dem festen Träger
immobilisiert werden, können
sie leicht gewonnen werden; somit können zum Beispiel, falls der
feste Träger
magnetische Kugeln umfasst, diese aus dem Transkriptions-/Translationsgemisch
mit einem Magneten entnommen werden, wodurch das Risiko einer Kontamination
mit nicht immobilisierten Nukleinsäuren verringert wird.
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Die
folgenden, nicht beschränkenden
Beispiel dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
-
STANDARDVERFAHREN:
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Klonierung und PCR-Amplifikationen:
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Die
Standard-Klonierungsarbeit einschließlich Plasmidpräparationen,
Restriktionsenzymspaltungen und Ligationen usw. wurde wie in (Sambrook,
J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) beschrieben
und gemäß den Empfehlungen
der Lieferanten durchgeführt.
Restriktionsenzyme und Ligase wurden entweder von MBI Fermentas, Vilnius,
Litauen, oder New England Biolabs, MA, USA, gekauft. PCR-Amplifikationen
unter Verwendung von Plasmiden oder von auf Kugeln immbolisierten
PCR-Produkten als Matrizen wurden unter Verwendung von Standardbedingungen
in einem GeneAmp® PCR-System 9700 (PE Biosystems,
Foster City, CA, USA) durchgeführt.
Als Primer wurden Oligonukleotide aus Tabelle 1 verwendet, wie in
den Beispielen spezifiziert wird. Typischerweise wurden 5 pmol der
Primer in einer PCR-Amplifikation mit 30 Zyklen unter Verwendung
eines Puffers, der aus 0,2 mM Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs),
50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, (pH-Wert 8,5), 0,1% Tween
20 und 0,1 Einheiten AmpliTaq® DNA-Polymerase (PE Biosystems)
bestand, verwendet. Ein PCR-Standardzyklus
hatte die folgenden Einstellungen: 15 s 94°C, 20 s 55°C, 1 min 72°C. Standardanalysen von Nukleinsäuren mit
Agarosegelelektrophorese wurden unter Verwendung von Ethidiumbromid
zum Färben
durchgeführt.
Bei E. coli-Zellen, die zur Klonierung und für Plasmidpräparationen verwendet wurden,
handelte es sich um RR1DM15 (Rüther,
U., Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772, 1982).
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Tabelle
1. Liste der Oligonukleotidprimer
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Herstellung rekombinanter
Proteine:
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Bei
E. coli-Zellen, die zur Expression verwendet wurden, handelte es
sich entweder um RR1DM15 (Rüther,
U. Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772, 1982) oder BL21DE3 (Novagen,
Madison, WI, USA). Verfahren mit osmotischem Schock wurden wie früher beschrieben
durchgeführt
(Nygren et al., J. Mol. Recognit. 1: 69-74, 1988). Affinitätschromatographie-Reinigungen
von Proteinen auf HSA- und IgG-Sepharose-Harzen wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Nygren
et al., J. Mol. Recognit. 1: 69-74, 1988). Menschliches polyklonales
IgG wurde von Pharmacia und Upjohn AB, Stockholm geliefert.
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Biotinylierung von Proteinen:
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Menschliches
Serumalbumin (HSA) (Prod. nr. A-8763, Sigma) wurde unter Verwendung
des EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin-Kits (Prod.
nr. 21335, Pierce Chemical Company, Rodeford, IL, USA) biotinyliert.
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Zellfreie Transkription
und Translation von PCR-Fragmenten:
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Die
angegebenen PCR-Produkte wurden einer zellfreien Transkription und
Translation unter Verwendung eines kommerziellen E. coli S30-Extraktsystems
für lineare
DNA (Prod. nr. L1030, Promega, Madison, WI, USA) gemäß den Anleitungen
durch den Hersteller unterworfen. Für eine gekoppelte Transkription/Translation
freier (nicht immobilisierter) PCR-Produkte wurden typischerweise
10-70 ng PCR-Produkt mit 50 μl
Zellextrakt gemischt und 1 h lang bei 25°C inkubiert. In anderen Experimenten
wurden PCR-Produkte
auf Streptavidin-beschichteten Mikrokugeln (M280-SA, Dynal, Norwegen
oder Bang Laboratories, Prod. nr. CP01N/004109, wo angegeben) immobilisiert.
Derartige Kugeln waren vorher mit einer 1,89 mg/ml Lösung von biotinyliertem
BioM5-Antikörper
(Prod. nr. F-2922, Sigma, Saint Louis, MO, USA), der gegen ein FLAG-Peptid gerichtet
ist, zum Affinitätseinfangen
von Proteinen, an die ein FLAG-Peptid angehängt war, inkubiert worden. Typischerweise
wurden 10 ng PCR-Produkt mit 1 mg BioM5-enthaltenden Kugeln gemischt,
die anschließend zweimal
gespült
wurden, bevor eine gekoppelte Transkriptions-/Translationsreaktion
unter Verwendung von 25 μl
E. coli-Extrakt durchgeführt
wurde.
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Gelelektrophorese von
Proteinen:
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Eine
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
(SDS-PAGE) unter
reduzierenden Bedingungen wurde unter Verwendung des Phast-Systems
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) oder in einem Novex
Xcell II (San Diego, CA, USA) wie von den jeweiligen Lieferanten
beschrieben durchgeführt.
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DNA-Sequenzierung:
-
Eine
DNA-Sequenzierung wurde durch Zyklus-Sequenzierung (Carothers et
al., BioTechniques 7: 494-499, 1989; Savolainen, P., et al., Mol.
Biol. Evol. 17: 474-488, 2000) unter Verwendung von ThermoSequenase
DNA-Polymerase (Amersham Pharma cia Biotech) und den angegebenen
Primern durchgeführt.
Die Sequenzierreaktionen wurden auf ein ABI Prism 377XL Gerät (PE Biosystems,
Foster City, CA, USA) geladen.
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Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierungs-(FACS-)Experimente:
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FACS-Analysen
wurden entweder mit einem FACSCalibur, einem FACScan oder einem
FACSVantage SE Gerät
(Becton Dickinson, Oxnard, USA) durchgeführt.
-
Wo
angegeben wurden mit Meerrettichperoxidase konjugierte Antikörper für Signalamplifikationen
unter Verwendung eines Fluoresceintyramid-Reagens (Boehringer Mannheim,
Deutschland), wie von Anton und Mitarbeitern beschrieben (Anton
et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998), verwendet.
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Beispiel 1
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Unterscheidung zwischen
festen Trägerteilchen,
die durch eine biospezifische Wechselwirkung mit fluoreszierenden
Proteinen markiert sind, und festen Kontrollträgerteilchen
-
Ungefähr 2 mg
Streptavidin-beschichtete Teilchen (M280-SA, Dynal, Norwegen) wurden
mit 30 μl
einer 2 mg/ml Lösung
von menschlichem Serumalbumin (HSA) (Sigma Artikelnr. A-8763), das
unter Verwendung eines Proteinbiotinylierungs-Kits (Pierce Artikelnr.
21335) gemäß den Anleitungen
des Herstellers biotinyliert worden war, in PBS-Puffer (0,15 M NaCl, 20 mM Phosphat,
pH-Wert 7,2) inkubiert. Die Teilchen wurden dann entweder direkt
mit polyklonalen Ziegen-IgG-Antikörpern, die mit FITC (Sigma
Artikelnr. F-9887) markiert waren, inkubiert oder zuerst mit 30 μl einer 2
mg/ml Lösung
eines Fusionsproteins (Z-ABD) aus einem von Protein G aus Streptokokken
abgeleiteten Serumalbumin-bindenden Protein (ABD) und einem von
Protein A aus Staphylokokken abgeleiteten Immunglobulin-bindenden
Protein (Z), das wie früher
beschrieben hergestellt und HSA-affinitätsgereingt wurde (Nord et al.,
in den angeführten
Arbeiten [1995] und [1997]) in PBS inkubiert. Zwischen allen Inkubationen
wurden mehrere (5-10) Spülungen
mit PBS durchgeführt,
um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen.
-
Um
zu untersuchen, ob eine Unterscheidung zwischen Teilchen, die durch
die FITC-markierten polyklonalen Ziegenantikörper mittels einer biospezifischen
Wechselwirkung an die Z-Einheit des Z-ABD-Fusionsproteins markiert
waren, und Teilchen, die nicht mit dem Z-ABD-Fusionsprotein inkubiert
worden waren und somit unfähig
waren, den Ziegenantikörper
zu binden, wurden Teilchen unter Verwendung von Olympus BH2-RFCA-Mikroskopie
bei einer Anregungswellenlänge
von 495 nm durch UV-Mikroskopie analysiert. Die in 5 gezeigten
Ergebnisse zeigen, dass ein klarer Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen
den beiden unterschiedlich behandelten Pools von Teilchen gesehen
werden kann (5A und 5B).
Dies zeigt, dass das Ergebnis einer biospezifischen Wechselwirkung
zwischen einem (ABD-HSA)-immobilisierten Fusionsprotein und einem
in Lösung
zugegebenen markierten Zielprotein beobachtet werden kann.
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Beispiel 2
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Zusammensetzung
und Klonierung genetischer Konstrukte für zellfreie Transkriptions-
und Translationsexperimente
-
Um
in der Lage zu sein, PCR-Produkte zu erhalten, die relevante Proteine
oder Mitglieder einer Proteinbank kodieren und die für zellfreie
Transkriptions- und Translationsexperimente unter Verwendung von
festen Trägern
als Träger
sowohl für
Nukleinsäuren
als auch deren entsprechende kodierte Proteine geeignet sind, wurde
ein genetisches Konstrukt im Plasmidvektor pGEM-4Z zusammengesetzt
(9). In einer Splice-Overlap-Extension-(SOE-)PCR-Reaktion
unter Verwendung der Primer NOOL-10
und NOOL-11 (Tabelle 1), wurden zwei Genfragmente, die ein Albumin-bindendes
Protein (ABP) (Larsson, et al., Prot. Expr. Purif. 7: 447-457, 1996)
beziehungsweise die Z-Domäne
(Zwt) (Nilsson et al., Prot. Engineering
1: 107-113, 1987) kodieren, verbunden. Die beiden Fragmente waren
vorher durch getrennte PCR-Reaktionen unter Verwendung von pT7-ABPc
(ABP) (Larsson, et al., Prot. Expr. Purif. 7: 447-457, 1996) (Primer
NOOL-6 und NOOL-7, Tabelle 1) beziehungsweise pKN1-Zwt (Nord
et al., Prot. Engineering, 8: 601-608, 1995) (Primer NOOL-8 und
NOOL-9, Tabelle 1) als Plasmidmatrizen hergestellt worden. Bei der
SOE-Reaktion wurden zwei Fragmente verbunden, was zu einem ABP-(Ser)3-Zwt kodierenden Genfragment führte, das
am 5'-Ende Erkennungsstellen für die beiden
Enzyme HindIII und NcoI und am 3'-Ende
zwei Translations-Stoppcodons und eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym
EcoRI umfasst (9). Dieses Fragment wurde durch
Ligation als HindIII-EcoRI-Fragment
in das mit den gleichen Enzymen gespaltene Plasmid pGEM-4Z eingefügt, was
zum Konstrukt pGEM-ABP-Zwt führte.
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Ein
Fragment wurde durch Aneinanderlagern der beiden Oligonukleotide
SD KOZAK-1 und SD KOZAK-2 (Tabelle 1) zusammengesetzt, was zu einem
40 bp großen
Fragment führte,
das eine Shine Dalgarno-(SD-)Sequenz aus E. coli (zur effizienten
Translation in E. coli) und eine Kozak-Sequenz (zum Erleichtern der
Expression in Zellextrakten aus Säugerquellen), flankiert durch
HindIII und NcoI Restriktionsstellen führte (9). Dieses
Fragment wurde durch Ligation in mit HindIII und NcoI gespaltenen
pGEM-ABP-Z eingefügt, was
zu dem Plasmidvektor pGEM-SD-K-ABP-Zwt führte. Dieser
Vektor wurde anschließend
mit den Enzymen NcoI und XhoI gespalten, wodurch das ABP-kodierende
Fragment freigesetzt wurde. Das dadurch erhaltene Vektorfragment
wurde an ein FLAG-Peptid kodierendes Genfragment ligiert, das vorher
durch Aneinanderlagern der beiden Oligonukleotide FLAG-1 und FLAG-2
(Tabelle 1) erhalten worden war, was zu dem Vektor pGEM-SD-K-FLAG-Z
führte.
Dieser Vektor kodiert somit ein FLAG-Zwt-Fusionsprotein,
verbunden durch einen (Ser)3-Linker (9). Der
Vektor enthält
auch einen stromaufwärts
gelegenen T7-Promotor, der fähig
ist, die Transkription des Gens für das Fusionsprotein FLAG-Zwt durch die Wirkung von T7 RNA-Polymerase
anzutreiben. Von diesem Vektor kann jedes geeignete Genfragment,
das zwischen den XhoI und EcoRI Stellen eingefügt ist, als eine mRNA transkribiert
werden, die funktionell mit einer SD-Sequenz, einer Kozak-Sequenz
und einem ein FLAG-Peptid kodierenden Teil verbunden ist. Zusätzlich können, unter
Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 (Tabelle 1), PCR-Produkte
erhalten werden, die für
eine durch T7 RNA-Polymerase angetriebene Transkription geeignet
sind und an ihren 3'-Enden biotinyliert
sind, geeignet zur Immobilisierung z. B. auf Streptavidin-beschichteten
Oberflächen
und anderen festen Trägern.
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Um
den als pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA bezeichneten
Vektor zu konstruieren, bei dem das Zwt kodierende Genfragment
durch ein Genfragment substituiert worden ist, welches das menschliche
IgA-bindende Protein ZIgA kodiert (Gunneriusson
et al., J. Bact. 1999), wurde ein ZIgA kodierendes
Genfragment unter Verwendung der Primer NOOL-8 und NOOL-9 unter
Verwendung der Plasmidmatrize pKN1-ZIgA amplifiziert
(Gunneriusson et al., J. Bact. 1999). Das so erhaltene PCR-Produkt
wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und EcoRI gespalten und in
den Vektor pGEM-SD-K-FLAG-Zwt, der vorher
mit den gleichen Enzymen gespalten worden war, eingefügt. Der
so erhaltene Vektor pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA kodiert
somit ein FLAG-ZIgA-Fusionsprotein, verbunden
durch einen (Ser)3-Linker (9).
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Beispiel 3
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Zellfreie Transkrigtion/Translation
von FLAG-Zwt- und FLAG-ZIga-Fusionsproteinen
von ihren jeweiligen PCR-Produkten
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Unter
Verwendung der Plasmidvektoren pGEM-SD-K-FLAG-Zwt beziehungsweise pGEM-SD-K-FLAG-Zwt für
PCR-Amplifikationen unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13
(Tabelle 1) wurden PCR-Produkte erhalten, von denen ungefähr 70 ng
einer einstündigen
zellfreien Transkription/Translation bei 25°C unter Verwendung von 50 μl eines S30-Zellextrakts
von E. coli (L1030, Promega, MA, USA), ergänzt mit [35S]-Methionin und 1600
Einheiten T7 RNA-Polymerase, unterworfen. Proben der unterschiedlichen
Transkriptions-/Translations-Gemische wurden durch 10% NuPAGE (Novex,
San Diego, CA, USA) unter reduzierenden Bedingungen durch die Zugabe
von 50 mM DTT (Endkonzentration) im Probenladepuffer (NuPAGE LDS
Probenpuffer, Novex), gefolgt von Belichtung eines Films (Kodak
XOMAT-AR, 18 × 24 cm)
mit dem Gel bei –70°C über Nacht,
analysiert. Die Entwicklung des Films deckte ein radioaktives Protein der
erwarteten Größe (8 kDa)
für die
beiden PCR-Produkte, die FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA kodieren (10), auf.
Dies zeigt, das die konstruierten Plasmidvektoren pGEM-SD-K-FLAG-Zwt und pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA beide
zur Verwendung als Matrizen für
die Amplifikation von PCR-Produkten geeignet waren, die fähig sind,
eine durch T7 RNA-Polymerase angetriebene Transkription von mRNA
zu steuern, die zur zellfreien Translation von FLAG-Zwt-
und FLAG-ZIgA-Fusionsproteinen in einem
S30-Extrakt von
E. coli verwendet werden konnte.
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Beispiel 4
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Immobilisierung von FLAG-Zwt- und FLAG-ZIgA-Fusionsproteinen
auf Kugeln, die einen anti-FLAG-Antikörper enthalten
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Um
die Funktionalität
der FLAG-Peptid-Einheiten der FLAG-Zwt-
und FLAG-ZIgA-Fusionsproteine zu untersuchen, wurden
Reaktionsgemische, die aus der Herstellung der beiden Fusionsproteine
von ihren jeweiligen PCR-Produkten unter Verwendung zellfreier Transkription/Translation
wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten wurden, drei Stunden lang
bei Raumtemperatur mit Streptavidin-beschichteten M-280-SA Dynabeads (Dynal,
Norwegen) (50 mg) gemischt, die vorher mit 5 μl einer 1,89 mg/ml Lösung biotinylierter
monoklonaler anti-FLAG BioM5-Antikörper (Sigma) in PBS (0,15 M
NaCl, 20 mM Phosphat, pH-Wert 7,2) inkubiert worden waren. In das
Experiment wurden auch Kugeln, die nicht mit der Lösung des
biotinylierten anti-FLAG BioM5-Antikörpers inkubiert worden waren,
eingeschlossen (Kontrolle). Die Kugeln wurden anschließend mit PBST
(PBS mit 0,1% Tween 20) gespült
und unter Verwendung eines Beckman LS6000 SC Szintillators (Beckman-Coulter,
Fullerton, CA, USA) unter Verwendung von Szintillationspuffer unter
Standardbedingungen analysiert. Die gemessenen Signale von mit anti-FLAG BioM5 beschichteten
Kugeln, die den Transkriptions-/Translations-Gemischen, die den
FLAG-Zwt- beziehungsweise FLAG-ZIgA-Fusionsproteinen entsprachen, unterworfen
worden waren, waren im Vergleich zu den negativen Kontrollen signifikant
höher (Tabelle
2). Dies zeigt, dass Fusionsproteine, hier beispielhaft durch die
beiden Fusionsproteine FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA angeführt,
von ihren jeweiligen PCR-Produkten durch zellfreie Transkription/Translation
hergestellt werden können, die
einen funktionellen Affinitätsfusionsparter,
der hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt ist,
enthält,
das zur Immobilisierung der Proteine an Kugeln, die einen zugehörigen Affinitätspartner enthalten,
der hier durch den monoklonalen anti-FLAG-Antikörper BioM5 beispielhaft angeführt ist,
geeignet ist.
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Tabelle
2. Gemessene Szintillationssignale (über 1 min hinweg angesammelt)
von nativen Streptavidinkugeln (SA) beziehungsweise mit biotinyliertem
anti-FLAG BioM5-Antikörper beschichteten
Streptavidinkugeln nach dem Mischen (und anschließendem Spülen) mit
Transkriptions-/Translations-Gemischen von unterschiedlichen Proben.
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Beispiel 5
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Zellfreie Transkriation/Translation
eines FLAG-Zwt kodierenden PCR-Produkts
biospezifische Immobilisierung des Genprodukts auf Kugeln und Analyse
durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
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Die
zellfreie Transkription und Translation eines durch PCR-Amplifikation
mit den Primern NOOL-12 und NOOL-13 (Tabelle 1) an der Plasmidmatrize
pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhaltenen PCR-Produkts wurde wie in Beispiel
3 durchgeführt,
aber ohne Zugabe von [35S]-Methionin. Das
so erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden lang mit 50 mg Streptavidin-beschichteten
Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von ungefähr 0,95 mm (Bangs Laboratories,
Fishers, IN, USA) inkubiert, die vorher mit 5 μl einer 1,89 mg/ml Lösung biotinylierter
monoklonaler anti-FLAG BioM5-Antikörper (Sigma) inkubiert worden
waren. In das Experiment wurden als Kontrolle auch Kugeln, die nicht
mit dem biotinylierten anti-FLAG BioM5-Antikörper inkubiert worden waren,
eingeschlossen. Nach sorgfältigem
Spülen
mit TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween
20) wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP) (Artikelnr. P0402, Dako,
Dänemark)
konjugierte anti-DNP IgG-Antikörper
aus Kaninchen zu den Kugeln gegeben und 45 min lang bei 25°C inkubiert,
gefolgt von Spülen mit
TNT-Puffer, um das translatierte und biospezifisch immobiliserte
FLAG-Zwt Fusionsprotein-Genprodukt mittels
der biospezifischen Wechselwirkung zwischen den konstanten Teilen
(Fc) der Kaninchenantikörper und der
Z-Domäneneinheit
des Fusionsproteins nachzuweisen. Um ein zur FACS nützliches
Signal zu erhalten, wurde die enzymatische Aktivität der an
die Kaninchenantikörper
konjugierten HRP durch Zugabe von einem ml eines Signalamplifikationsgemisches,
das Fluoresceintyramid enthielt (Anton et al., J. Histochem. Cytochem.
46: 771-777, 1998), verwendet. Zwischen allen Inkubationsschritten
wurden die Kugeln sorgfältig
gespült,
3 min lang bei 2000 × g
zentrifugiert, gefolgt von Resuspension in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl,
pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), um unspezifisch gebundenes
Protein zu entfernen. TNB Blockierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert
7,5, 0,15 M NaCl, 0,5% Blockierungsreagens aus dem Tyramid-Signalamplifikationskit,
NEN Life Science, Boston, MA, USA) wurde während der Inkubationsschritte
gemäß den Anleitungen
der Hersteller verwendet.
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Nach
einer fünf
Minuten langen Inkubation bei 25°C
und anschließendem
Spülen
wurden die Kugeln zur FACS-Analyse in PBS resuspendiert. Diese Analyse
zeigte, dass die mit dem biotinylierten anti-FLAG BioM5-Antikörper beschichteten
Kugeln, die mit dem Transkriptions-/Translations-Gemisch des FLAG-Zwt kodierenden PCR-Produktes inkubiert worden
waren, die anschließend
mit dem Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat inkubiert und schließlich dem
Fluoresceintyramid enthaltenden Signalamplifikationsgemisch unterworfen
wurden, signifikant höhere
Fluoreszenzsignale in der FACS-Analyse
aufzeigten als Kugeln, die auf die gleiche Weise behandelt wurden,
aber keinen anti-FLAG BioM5-Antikörper enthielten (11).
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Dies
zeigt, dass Fusionsproteine, hier durch das Fusionsprotein FLAG-Zwt beispielhaft angeführt, von einem entsprechenden
PCR-Produkt durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt
werden können,
die einen funktionellen Affinitätsfusionspartner,
hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt, enthält, das fähig ist, zu einer biospezifischen
Immobilisierung des Proteins an Kugeln zu führen, die einen zugehörigen Affinitätspartner
enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG BioM5-Antikörper beispielhaft
angeführt ist,
und dass derartige Kugeln durch FACS-Analyse unter Verwendung einer
geeigneten Kombination von Nachweisreagenzien, hier durch ein Kaninchen-anti-DNP
IgG-HRP-Konjugat und ein Fluoresceintyramid enthaltendes Signalamplifikationsgemisch
beispielhaft angeführt,
nachgewiesen werden können.
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Beispiel 6
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Zellfreie Transkription/Translation
eines auf Kugeln immobilisierten, FLAG-Zwt kodierenden
PCR-Produkts, biospezifische Immobilisierung des Genprodukts auf
Kugeln und Analyse durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
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Biotinylierte,
ein FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodierende PCR-Fragmente,
die nach PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und
NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhalten wurden,
wurden auf Streptavidin-beschichteten Kugeln (Bangs Laboratories)
in einer Konzentration von ungefähr
10 ng/mg Kugeln immobilisiert. Die Kugeln (50 mg) waren vorher mit
5 μl einer
Lösung
inkubiert worden, die 1,89 mg/ml eines biotinylierten anti-FLAG-Peptid-Antikörpers (BioM5,
Sigma) enthielt. Die Kugeln, die sowohl die biotinylierten PCR-Produkte
als auch den anti-FLAG-Peptid-Antikörper enthielten,
wurden einer zellfreien Transkription und Translation unter Verwendung
von 25 ml eines S30-Extrakts (Promega, Madison, WI, USA), der mit
200 Einheiten T7 RNA-Polymerase (Epicentre, Madison, WI, USA) und
40 Einheiten rRNasin (Promega, Madison, WI, USA) ergänzt war,
unterworfen. Nach einer einstündigen
Inkubation bei 25°C,
gefolgt von wiederholtem Spülen
unter Verwendung von TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15
M NaCl, 0,05% Tween 20), wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP)
konjugierte anti-DNP IgG-Antikörper
aus Kaninchen (Artikelnr. P0402, Dako, Dänemark) zu den Kugeln gegeben
und über
Nacht bei 4°C
inkubiert (über-Kopf-Mischen), gefolgt
von Spülen
mit TNT, um das translatierte und biospezifisch immobilisierte FLAG-Zwt Fusionsprotein-Genprodukt mittels der
biospezifischen Wechselwirkung zwischen den konstanten Teilen (Fc)
der Kaninchenantikörper
und der Z-Domäneneinheit
des Fusionsproteins nachzuweisen (Nilsson et al., Protein engineering,
1: 107-113, 1987).
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Um
ein zur FACS nützliches
Signal zu erhalten, wurde die enzymatische Aktivität der an
die Kaninchenantikörper
konjugierten HRP durch Zugabe von einem ml eines Signalamplifikationsgemisches,
das Fluoresceintyramid enthielt (Anton et al., J. Histochem. Cytochem.
46: 771-777, 1998), verwendet. Zwischen allen Inkubationsschritten
wurden die Kugeln sorgfältig
gespült,
3 min lang bei 2000 × g
zentrifugiert, gefolgt von Resuspension in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl,
pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), um unspezifisch gebundenes
Protein zu entfernen. TNB Blockierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert
7,5, 0,15 M NaCl, 0,5% Blockierungsreagens aus dem Tyramid-Signalamplifikationskit,
NEN Life Science, Boston, MA, USA) wurde während der Inkubationsschritte
gemäß den Anleitungen
der Hersteller verwendet. Als Negativkontrolle wurden Streptavidin-beschichtete
Kugeln, die immobiliserte anti-FLAG BioM5-Antikörper enthielten, und ein PCR-Produkt,
das aus einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12
und NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA erhalten
wurde, in das Experiment eingeschlossen.
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Die
Ergebnisse der FACS-Analyse zeigen, dass die Kugeln, welche die
immobilisierten, biotinylierten, ein FLAG-Zwt-Fusionsprotein
kodierenden PCR-Fragmente enthielten, die nach einer PCR-Amplifikation
unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 an der Plasmidmatrize
pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhalten wurden, eine
signifikant höhere
Fluoreszenzintensität
präsentieren
als die Kontrollkugeln, die immobilisierte PCR-Produkte enthalten,
die ein Fusionsprotein kodieren, das durch das zum Nachweis verwendete
Kaninchen-HRP-Konjugat-Reagens nicht erkannt wird (12).
Dies zeigt, dass Fusionsproteine, hier durch das Fusionsprotein
FLAG-Zwt beispielhaft angeführt, aus
einem entsprechenden, auf einer Kugel immobilisierten PCR-Produkt
durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt werden können, die
einen funktionellen Affinitätsfusionspartner,
hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt, enthält, das fähig ist, zu einer biospezifischen
Immobilisierung des Proteins an Kugeln zu führen, die einen zugehörigen Affinitätspartner
enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG BioM5-Antikörper beispielhaft
angeführt
ist, und dass derartige Kugeln durch FACS-Analyse unter Verwendung
einer geeigneten Kombination von Nachweisreagenzien, hier durch
ein Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat und ein Fluoresceintyramid
enthaltendes Signalamplifikationsgemisch beispielhaft angeführt, nachgewiesen
werden können.
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Beispiel 7
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Auf Fluoreszenz-aktivierter
Zellsortierung (FACS) beruhendes Anreichern von Kugeln, die immobiliserte PCR-Produkte
enthalten, die ein gewünschtes
Genprodukt kodieren
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Biotinylierte,
FLAG-Zwt- beziehungsweise FLAG-ZIgA-Fusionsproteine kodierende PCR-Fragmente,
die nach PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und
NOOL-13 an den Plasmidmatrizen pGEM-SD-K-FLAG-Zwt beziehungsweise
pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA erhalten worden waren, wurden getrennt
auf Streptavidin-beschichteten Kugeln (Bangs Laboratories) bis zu
einem Spiegel von ungefähr
10 ng/mg Kugeln immobilisiert. Die Kugeln (50 mg) waren vorher mit
5 μl einer
Lösung
inkubiert worden, die 1,89 mg/ml eines biotinylierten anti-FLAG-Peptid-Antikörpers (BioM5,
Sigma, Saint Louis, Mo, USA) enthielt. Kugeln aus den beiden Pools
wurden anschließend
in einem Verhältnis
von 1 : 1 (gleiche Mengen Kugeln beider Sorten) gemischt und zellfreier
Transkription und Translation unter Verwendung von 25 ml eines S30-Extrakts
(Promega, Madison, WI, USA), der mit 200 Einheiten T7 RNA-Polymerase
(Epicentre, Madison, WI, USA) und 40 Einheiten rRNasin (Promega,
Madison, WI, USA) ergänzt
war, unterworfen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 25°C, gefolgt
von wiederholtem Spülen
unter Verwendung von TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M
NaCl, 0,05% Tween 20), wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte
anti-DNP IgG-Antikörper aus Kaninchen
(Artikelnr. P0402, Dako, Dänemark)
zu den Kugeln gegeben und über
Nacht bei 4°C
inkubiert, gefolgt von Spülen
mit TNT, um das translatierte und biospezifisch immobiliserte FLAG-Zwt Fusionsprotein-Genprodukt mittels der
biospezifischen Wechselwirkung zwischen den konstanten Teilen (Fc)
der Kaninchenantikörper
und der Z-Domäneneinheit
des Fusionsproteins nachzuweisen. Um ein zur FACS nützliches
Signal zu erhalten, wurde die enzymatische Aktivität der an
die Kaninchenantikörper
konjugierten HRP durch Zugabe von einem ml eines Signalamplifikationsgemisches
verwendet, das Fluoresceintyramid enthielt (Anton et al., J. Histochem.
Cytochem. 46: 771-777, 1998). Zwischen allen Inkubationsschritten
wurden die Kugeln sorgfältig
gespült,
3 min lang bei 2000 × g
zentrifugiert, gefolgt von Resuspension in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert
7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), um unspezifisch gebundenes Protein
zu entfernen. TNB Blockierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M
NaCl, 0,5% Blockierungsreagens aus dem Tyramid-Signalamplifikationskit,
NEN Life Science, Boston, MA, USA) wurde während der Inkubationsschritte
gemäß den Anleitungen
der Hersteller verwendet. Unter Verwendung von FACS wurde ein Pool
aus Kugeln, der ursprünglich
durch das Mischen im Kugelverhältnis
von 1 : 1 erhalten wurde, anschließend einem auf der Fluoreszenzintensität beruhenden
Anreicherungsexperiment unterworfen. Bei diesem Verfahren wurden
die Einstellungen im FACS-Gerät zur präparativen
Isolierung einzelner Kugeln (Singlets) mit einer relativen Fluoreszenzintensität von über 50 eingestellt.
Mit dieser Einstellung wurde das Gemisch dem Sortieren unterworfen
und Röhrchen
mit ungefähr
4500 sortierten Kugeln wurden gesammelt.
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Um
zu analysieren, ob Kugeln, die das FLAG-Zwt-Fusionsprotein
kodierende PCR-Produkte tragen, die spezifisch durch das Markierungsverfahren,
welches das Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat einbezieht, markiert sein
sollten, relativ zu Kugeln angereichert waren, welche die PCR-Produkte
und FLAG-Zwt-Fusionsproteine tragen, die
nicht durch das Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat erkannt werden, wurde
der Unterschied in der DNA-Sequenz zwischen den beiden PCR-Produkten
eingesetzt.
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Die
das FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodierenden
PCR-Produkte enthalten eine Erkennungssequenz für das Enzym MluI, die in den
PCR-Produkten, die das FLAG-ZIgA-Fusionsprotein kodieren,
nicht vorliegt. Dies ermöglichte
eine Unterscheidung zwischen den beiden PCR-Produkten durch eine
Analyse der Empfindlichkeit gegenüber einem Verdau mit MluI (13A). Proben von Kugeln von vor und nach
dem Sortieren wurden deshalb einer PCR-Amplifikation unter Verwendung
der Primer NOOL-12 und NOOL-13 unterworfen, die an Stellen in den
immobilisierten PCR-Produkten anlagern, die Bereiche flankieren,
die sich zwischen den beiden PCR-Produktspezies unterscheiden, und
deshalb für
die gleichzeitige Amplifikation von beiden PCR-Produktspezies verwendet
werden konnten. Eine anschließende
Inkubation der so erhaltenen neuen PCR-Produkte mit dem Restriktionsenzym
MluI konnte daher verwendet werden, um die relativen Verhältnisse
zwischen den beiden Spezies in Proben von vor und nach dem Sortieren
durch eine Analyse der Größen der
DNA-Fragmente und Bandenintensitäten
nach Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromidfärbung, zu
untersuchen.
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Eine
PCR-Amplifikation der Nukleinsäuren,
die auf ungefähr
10000 Kugeln des 1:1 Gemisches vorlagen (Probe von vor dem Sortieren),
gefolgt von einem Verdau mit MluI und einer Analyse durch Gelelektrophorese
zeigt, wie erwartet, ein Gemisch von gegenüber MluI empfindlichen und
gegen MluI resistenten PCR-Produkten (13B,
Spur 6).
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Als
ungefähr
400 Kugeln, die während
der FACS-Anreicherung gewonnen wurden, der gleichen Analyse unterworfen
wurden, hatte sich das Intensitätsverhältnis zwischen
der oberen Bande (443 bp, ungespalten) und der unteren Doppelbande
(zwei Spaltungsprodukte, 239/204 bp, nicht aufgelöst) zu den
kleineren (unteren) Banden hin verschoben (13B,
Spur 8). Unter Verwendung des Gelscanners Gel Doc 2000 und der Software
Quantity One Vers. 4.1 (Biorad, Hercules, CA, USA) wurde diese Verschiebung
der relativen Intensitäten
aufgezeichnet, was zu dem Überlagerungsgraph,
der in 14 gezeigt wird, führte. Aus
dieser Analyse kann klar gesehen werden, dass eine Verschiebung
der relativen Intensität
zu den Spaltungsprodukten mit niedrigerem Molekulargewicht hin stattgefunden
hatte. Dies zeigt, dass Kugeln, die ein gegenüber MluI empfindliches PCR-Produkt
enthalten, welches das FLAG-Zwt-Fusionsprotein
kodiert, während
des Experiments relativ zu Kugeln, die das gegen MluI resistente
PCR-Produkt enthalten,
welches das FLAG-ZIgA-Fusionsprotein kodiert,
angereichert worden waren.
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Zusammen
genommen zeigt dieses Beispiel, dass Fusionsproteine, hier durch
das Fusionsprotein FLAG-Zwt beispielhaft
angeführt,
aus einem entsprechenden, auf Kugeln immobilisierten PCR-Produkt
durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt werden können, die
einen funktionellen Affinitätsfusionspartner, hier
durch das FLAG-Peptid
beispielhaft angeführt,
enthält,
das fähig
ist, zu einer biospezifischen Immobilisierung des Proteins an Kugeln
zu führen,
die einen zugehörigen
Affinitätspartner
enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG BioM5-Antikörper beispielhaft
angeführt
ist, und dass derartige Kugeln, wenn sie mit irrelevanten Kugeln
gemischt und zusammen verarbeitet werden, die ein anderes Genprodukt
kodierende PCR-Produkte enthalten, durch auf FACS beruhender Anreicherung
unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Nachweisreagenzien,
hier durch ein Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat und ein Fluoresceintyramid
enthaltendes Signalamplifikationsgemisch beispielhaft angeführt, angereichert
werden können.