DE60033402T2 - In-vitro-Selektion und wahlweise Identifizierung von Polypeptiden unter Verwendung von festen Trägern - Google Patents

In-vitro-Selektion und wahlweise Identifizierung von Polypeptiden unter Verwendung von festen Trägern Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung stellt eine Methodik zur in-vitro-Selektion und, falls gewünscht, anschließenden Identifizierung von Proteinen oder Peptiden mit gewünschten Eigenschaften aus Pools von Protein- oder Peptidvarianten (Banken) bereit.
  • Proteine und Peptide, hierin nachstehend gemeinsam als Polypeptide bezeichnet, mit gewünschten Eigenschaften, wie zum Beispiel Bindungsaffinität an ein bestimmtes Zielmolekül, katalytischer Aktivität, chemischer oder enzymatischer Aktivität oder immunogener Aktivität, sind von großer Bedeutung in vielen Bereichen der Biotechnologie, wie zum Beispiel Arzneistoff- und Impfstoffentwicklung, diagnostische Anwendungen und Bioseparation.
  • Der jüngste Fortschritt in der Gentechnik hat die Einführung neuer Prinzipien des Isolierens und Identifizierens derartiger Polypeptide aus großen Sammlungen von Varianten bereitgestellt, die durch unterschiedliche Verfahren einschließlich kombinatorischer Prinzipien konstruiert werden (Clackson und Wells, Trends Biotechnol. 12, S. 173-184 [1994]). Typischerweise werden unter Verwendung von Biosynthese zur Herstellung der Mitglieder einer Bank große Pools von Genen konstruiert, welche die einzelnen Mitglieder der Bank kodieren, was eine spätere Selektion oder Anreicherung gewünschter Varianten unter Verwendung eines geeigneten Ködermoleküls oder einer geeigneten chemischen Bedingung ermöglicht (Smith und Petrenko, Chem. Rev. 97, S. 391-410 [1997]). Zur Identifizierung selektierter Varianten sind mehrere Techniken beschrieben worden, um eine physikalische Verbindung zwischen dem translatierten Protein (Phänotyp) und der genetischen Information, die sie kodiert, (Genotyp) bereitzustellen, was die Identifizierung selektierter Mitglieder der Bank unter Verwendung von DNA-Sequenziertechnik ermöglicht.
  • Unter Verwendung von Phagen- oder Zellpräsentierungstechniken wird eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung durch Einbauen einzelner Mitglieder der Bank in die Hüll- bzw. Zelloberflächenstrukturen eines Phagen oder einer Zelle erhalten, der/die das entsprechende Gen enthält, das typischerweise in die Phagen-, Phagemid-, Plasmid- oder Virus-DNA eingefügt ist. Bei der Konstruktion derartiger Banken müssen die Genpools in eine Empfängerzelle transformiert werden, die zur Biosynthese der entsprechen den Proteine verwendet wird. Die mit diesem entscheidenden Schritt in Verbindung stehenden praktischen Beschränkungen beim Erhalten großer (komplexer) Banken (typischerweise mehr als 109 unterschiedliche Mitglieder) sind eine antreibende Kraft für die Entwicklung alternativer Techniken gewesen, die auf in-vitro-Transkription und -Translation genetischer Information beruhen, wodurch der Transformationsschritt vermieden wird.
  • Beispiele für derartige Techniken sind ribosomale Präsentierung (Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, S. 9022-9026 [1994]; Hanes et al., FEBS Letters 450, S. 105-110 [1999]) und RNA-Peptid-Fusionen unter Verwendung von Puromycin (Roberts und Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, S. 12297-12302 [1997]). Bei der ribosomalen Präsentierung wird ein Genpool (typischerweise Produkte einer Polymerasekettenreaktion (PCR), die zur Transkription und Translation notwendige Signale enthalten) in vitro transkribiert, um einen entsprechenden Pool von mRNA herzustellen, der zur Ribosomen-vermittelten Translation von Proteinen verwendet wird, die typischerweise, durch die Abwesenheit von Translations-Stoppsignalen, physikalisch mit dem Ribosom-mRNA-Komplex verbunden bleiben. Dies ermöglicht eine Selektion von Polypeptiden auf der Grundlage ihrer Kennzeichen und eine Identifizierung durch DNA-Sequenzierung nach der Umwandlung der Ribosomen-assoziierten mRNA in DNA durch die Verwendung von reverser Transkriptase. Spezielle Vorkehrungen (Temperatur, Pufferbedingungen) müssen jedoch getroffen werden, um die Stabilität der Ribosom-mRNA-Protein-Komplexe sicherzustellen, was die Bedingungen, unter denen eine Selektion durchgeführt werden kann, beschränkt (Jermutus et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9, S. 534-548 [1998]; Hanes et al., in der angeführten Arbeit [1999]). Zusätzliche Entwicklungen des Verfahrens der Ribosomen-Präsentierung werden in WO 98/54312 vorgelegt. Die Autoren beschreiben ein eukaryotisches Verfahren der Ribosomen-Präsentierung und stellen fest, dass es bei der Selektion von z. B. Antikörpern nützlich ist. Bei dem RNA-Peptid-Fusionssystem wird RNA, an die Puromycin angehängt ist, während der Translation verwendet, was zu kovalenten RNA-Protein/Peptid-Bindungen mittels der Aufnahme von Puromycin in die entstehende Polypeptidkette durch das Ribosom führt. Für jede Selektionsrunde müssen jedoch neue Puromycin-mRNA-Fusionen hergestellt werden, was die Wirksamkeit der Technik schwerwiegend beschränkt (Jermutus et al., in der angeführten Arbeit [1998]; Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3, S. 268-273 [1999]).
  • Ein weiteres System ist von Tawfik und Griffiths (Nature Biotechnology, [1998] 16; 652-656) beschrieben worden, das zellfrei ist, aber danach strebt, die Wirkung von Zellen beim Erzeugen von Kompartimenten nachzuahmen, um Genotyp und Phänotyp zu verbinden. Unter Verwendung einer Wasser-in-Öl-Emulsion werden Mizellen gebildet, die dann durch Mischen mit Ether aufgebrochen werden können. Dieses System ist jedoch nicht ohne Probleme, das Zweiphasensystem führt zu mehreren praktischen Beschränkungen. Um die verkapselten Moleküle zu gewinnen, muss das Zweiphasensystem aufgebrochen werden, was ziemlich arbeitsaufwändig ist, indem es mehrere Spülungen erfordert und einen Materialverlust verursacht. Darüberhinaus könnten die nicht wässrigen Komponenten, die notwendig sind, um das Zweiphasensystem zu erzeugen, Biomoleküle hemmen oder denaturieren und die Verkapselung selbst macht es schwieriger, zusätzliche Reagenzien abzugeben, die z. B. zum Nachweis oder Einfangen spezifischer molekularer Einheiten notwendig sind.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, dass unter Verwendung eines festen Trägers, wie zum Beispiel eines Teilchensystems, als Träger von genetischer Information (z. B. RNA oder DNA), das zur Identifizierung verwendet wird und an welche das entsprechende in vitro translatierte Polypeptid gekoppelt ist, eine Methodik etabliert wird, die Genotyp und Phänotyp verbindet. Die Isolierung fester Trägerteilchen, die ein gewünschtes Mitglied oder gewünschte Mitglieder einer Bank tragen, kann typischerweise unter Verwendung einer Sortiertechnik, die z. B. fluoreszierende Markierungen einsetzt, die in ein Zielmolekül oder die Polypeptidmitglieder der Bank eingebaut sind, oder durch magnetische Isolierung unter Verwendung magnetischer Teilchen, die ein immobilisiertes Zielmolekül enthalten, durchgeführt werden.
  • Somit wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer gewünschter Polypeptide bereitgestellt, umfassend:
    • (a) zellfreie Expression von Nukleinsäuremolekülen, die auf einem festen Trägersystem immobilisiert sind, um Polypeptide herzustellen, wobei der feste Träger Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit mindestens dem gewünschten Polypeptid oder einem daran befestigten Molekül trägt;
    • (b) Abtrennung des festen Trägers, der sowohl das gewünschte Polypeptid als auch die Nukleinsäure, die es kodiert, trägt; und wahlweise
    • (c) Gewinnung der Nukleinsäure und/oder des gewünschten Polypeptids, vorzugsweise der Nukleinsäure.
  • Das Selektionsverfahren der Erfindung kann auch als ein Verfahren zum Anreichern des gewünschten Polypeptids aus einer Ausgangsbank von Molekülen, die es enthält, betrachtet werden. Wobei „Anreicherung" das Erhöhen des relativen Anteils des gewünschten Polypeptids innerhalb der Probe von Molekülvarianten bezeichnet. Auf ähnliche Weise kann das Verfahren als eines betrachtet werden, durch das ein Nuklein säuremolekül von Interesse, d. h. eines, welches das gewünschte Polypeptid kodiert, angereichert wird.
  • Schritt (a) ist zellfrei. Der Begriff „Zelle" wird in einem weiten Sinne verwendet; um Zell- und vorzugsweise zellähnliche Systeme einzuschließen, und umfasst vorzugsweise Liposomen, Mizellen, die durch Wasser-in-Öl-Emulsionen gebildet werden, Gele, Glas oder jedes andere Mehrphasensystem, das eine physikalische Grenze zwischen einem System für Genexpression/biospezifische Wechselwirkung und einem anderen erzeugt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens findet keine tatsächliche Kompartimentierung statt, keine Membran oder ein anderes Trennungssystem ist erforderlich, um einzelne Nukleinsäuremoleküle voneinander zu isolieren.
  • Der Abtrennungsschritt (b) kann zweckmäßigerweise durch Wechselwirkung des immobilisierten gewünschten Polypeptids mit einem (z. B. biospezifischen) Zielreaktanten dafür bewirkt werden, der Mittel trägt, welche die Abtrennung des so erhaltenen Komplexes aus festem Träger/Nukleinsäure/gewünschtem Polypeptid/Zielreaktant gestattet. Derartige Mittel können zum Beispiel eine Markierung, wie zum Beispiel eine Fluoreszenzmarkierung oder ein magnetisches Teilchen, umfassen. Auf diese Weise kann der Komplex unter Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiertechnik (FACS) oder Magnettrenntechnik abgetrennt werden.
  • Bei den immobilisierten Nukleinsäuren kann es sich zum Beispiel um RNA oder DNA handeln, die einzelne Polypeptide, wie zum Beispiel die Mitglieder einer Proteinbank, kodiert. Es wird offensichtlich sein, dass ihre in-vitro-Translation im Falle von immobilisierter DNA in Kombination mit oder nach einer in-vitro-Transkription bewirkt wird.
  • Bei geeigneten festen Trägern zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann es sich um jeden der wohlbekannten Träger oder jede der wohlbekannten Matrizen handeln, die derzeit zur Immobilisierung, Trennung usw. allgemein verwendet oder vorgeschlagen werden. Diese können die Form von Teilchen, Platten, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern, Kapillaren oder Mikrotiterstreifen, -röhrchen, -platten oder -vertiefungen usw. annehmen, wobei teilchenförmige feste Träger bevorzugt werden. Der Träger kann günstigerweise aus Glas, Silicagel, Latex oder einem polymeren Material hergestellt werden.
  • Nicht magnetische Polymerkugeln, die zur Verwendung beim Verfahren der Erfindung geeignet sind, sind von Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norwegen) sowie von Qiagen, Pharmacia und Serotec erhältlich. Um bei der Handhabung und Trennung zu helfen, werden jedoch magnetische Kugeln bevorzugt. Der Begriff „magnetisch", wie hierin verwendet, bedeutet, dass der Träger dazu fähig ist, ein magnetisches Moment verliehen zu bekommen, wenn er in ein Magnetfeld gebracht wird, und somit unter der Wirkung dieses Feldes verlagerbar ist.
  • Somit können, unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung, die magnetischen Teilchen nach Genexpression und biospezifischer Wechselwirkung durch Anwendung eines Magnetfeldes, z. B. unter Verwendung eines permanenten Magneten, auf einer geeigneten Oberfläche gewonnen werden. Es ist normalerweise ausreichend, einen Magneten auf der Seite des Gefäßes anzuwenden, welches das Probegemisch enthält, um die Teilchen an der Wand des Gefäßes zu aggregieren und den Rest der Probe wegzuschütten.
  • Besonders bevorzugt werden superparamagnetische Teilchen, zum Beispiel sind die wohlbekannten magnetischen Teilchen, die von Dynal AS (Oslo, Norwegen) als DYNABEADS verkauft werden, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • Verfahren zur Befestigung von Nukleinsäuremolekülen oder Einheiten aus Protein, wie zum Beispiel die hierin diskutierten zugehörigen Bindungspartner oder Zielmoleküle, an einem festen Träger sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können chemisches Koppeln, z. B. unter Einbeziehung von Amin-, Aldehyd-, Thiol-, Thioether- oder Carboxylgruppen, oder biospezifisches Koppeln, zum Beispiel unter Ausnutzung von Wechselwirkungen zwischen Streptavidin und Biotin oder Analoga davon, IgG und Protein A oder G, HSA und Protein G, Glutathion-S-Transferase (G-ST) und Glutathion, Maltose und einem Maltose-Bindungsprotein, Antikörper und Antigen (einschließlich Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten und Haptenen), Lektinen und Kohlenhydraten, Histidinen und chelierenden Gruppen und Nukleinsäure/Nukleinsäure-Hybridisierung einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Bei den exprimierten Polypeptiden kann es sich zweckmäßigerweise um Fusionsproteine handeln, die einen Affinitätsfusionspartner enthalten, wobei der feste Träger einen zugehörigen Bindungspartner für den Affinitätsfusionspartner als Mittel zur biospezifischen Wechselwirkung trägt. Somit wird das exprimierte Fusionsprotein typischerweise einen Affinitätsfusionspartneranteil sowie das gewünschte Polypeptid oder eine Molekülvariante des gewünschten Polypeptids aus der Molekülbank umfassen, die das gewünschte Polypeptid enthält. Auf diese Weise wird eine Bank von Fusionsproteinen erzeugt, die einen variablen Anteil haben, der aus dem gewünschten Polypeptid oder Varianten davon aus der Ausgangsbank und einem im Wesentlichen gemeinsamen Anteil, dem Affinitätsfusionspartner, besteht. Wo es angemessen ist, wird hierin ein Bezug zu Molekülbanken hergestellt, bei denen es sich um Banken von Nukleinsäuremolekülen oder Banken von Polypeptiden handeln kann. Auf ähnliche Weise kann ein Mitglied einer Bank ein Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird ein Zielmolekül, das zur biospezifischen Wechselwirkung mit dem gewünschten Polypeptid fähig ist, als Mittel zur biospezifischen Wechselwirkung auf dem festen Träger immobilisiert. In dieser Ausführungsform kann auch eine Fusionsproteinbank erzeugt werden, wobei jedes Fusionsprotein ein Reporterprotein, das günstigerweise bei dem Abtrennungsschritt (b) verwendet werden kann, sowie das gewünschte Polypeptid oder eine molekulare Variante des gewünschten Polypeptids aus der Molekülbank, die das gewünschte Polypeptid enthält einbezieht. Somit wird wiederum das Motiv eines variablen Anteil und eines im Wesentlichen gemeinsamen Anteils (hier das Reporterprotein) bereitgestellt. Jedes Molekül in der Fusionsproteinbank wird somit vorzugsweise einen Bereich haben, der im Wesentlichen der gleiche ist wie der entsprechende Bereich anderer Moleküle in der Bank, während der variable Bereich jedes Mitgliedes der Bank sich von allen oder wenigstens den meisten entsprechenden Bereichen der anderen Mitglieder der Bank unterscheiden wird. Im Allgemeinen wird sich ein variabler Bereich nicht signifikant von manchen oder allen anderen variablen Bereichen in der Fusionsproteinbank unterscheiden. Auf diese Weise kann die Wirkung von geringen Variationen der primären Aminosäuresequenz auf z. B. Bindung untersucht werden.
  • Das Gewinnen der Nukleinsäure(n), welche das (die) gewünschte(n) Polypeptid(e) kodiert (kodieren), kann zum Beispiel durch in-vitro-Amplifikation, z. B. mittels PCR, PCR mit reverser Transkriptase oder Rolling-Circle-Amplifikation, bewirkt werden.
  • Die Sequenz abgetrennter und/oder amplifizierter Nukleinsäure(n) kann z. B. durch herkömmliche Sequenziertechniken bestimmt werden, wodurch eine Bestimmung der Sequenz des gewünschten Polypeptids gestattet wird, um es zu identifizieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Ausgangspool von Nukleinsäuren, die einzelne Mitglieder der Bank kodieren, eine erhebliche Komplexität aufweisen (z. B. ≥ 1015 Mitglieder) (Roberts, in der angeführten Arbeit [1999]). Die Anzahl unterschiedlicher Nukleinsäurespezies, die pro Trägerteilchen der festen Phase immobilisiert sind, kann bei der Herstellung der Teilchen kontrolliert werden, zum Beispiel durch die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen des Moleküls, das als Anker dient (zum Beispiel DNA, RNA, PNA oder ein Protein), oder durch Vorbehandlung von Teilchen mit kompetierendem Material. Die Selektion diskreter Teilchen in nur einem einzigen erfindungsgemäßen Selektionsverfahren kann zur gleichzeitigen Selektion einer signifikant verringerten Anzahl von Mitgliedern der Bank führen.
  • Das Durchführen wiederholter Zyklen in Übereinstimmung mit der Erfindung, wahlweise unter Einsetzen von Festphasenträgerteilchen mit sukzessiv abnehmenden Anzahlen von Verankerungsstellen für Nukleinsäuren, und wahlweise mit gleichzeitiger Verdünnung des Nukleinsäurematerials, kann zu einer allmählichen Umwandlung zu einem beschränkten Satz von Mitgliedern einer Bank führen, die einer individuellen Analyse auf der Klonebene unterworfen werden können, um eine gewünschte Polypeptidspezies zu identifizieren. Wo eine Selektionstechnik, wie zum Beispiel FACS, eingesetzt wird, kann die Verwendung unterschiedlicher Schwellenwerte für eine positive Selektion eine stringente Selektion von Festphasenträgerteilchen gestatten, die hohe Anzahlen des gewünschten Mitglieds der Bank enthalten.
  • Alternativ dazu kann der angereicherte Pool von Nukleinsäuresequenzen, nach einer Verringerung der Anzahl von Mitgliedern der Bank durch Abtrennung in Übereinstimmung mit der Erfindung, weiteren Selektionen unter Verwendung eines anderen Selektionsprinzips, wie zum Beispiel (aber nicht beschränkt auf) Zellpräsentierung, Phagenpräsentierung, Plasmidpräsentierung, ribosomale Präsentierung oder mRNA-Peptid-Fusionen unterworfen werden.
  • Somit handelt es sich bei dem Verfahren der Erfindung vorzugsweise um einen iterativen Vorgang, wobei eine Anreicherung des (der) Polypeptids (Polypeptide) von Interesse stattfindet, je mehr Zyklen durchgeführt werden. Während es etwas Diffusion exprimierter Polypeptide und Bindung an benachbarte Kugeln (oder Bereiche eines festen Trägers, Teilchen usw.) geben kann, wird die lokale Bindung an die eigene Kugel (oder den eigenen Bereich des festen Trägers, das eigene Teilchen usw.) des Polypeptids bevorzugt werden. Somit wird nach mehreren Zyklen eine signifikante Anreicherung erreicht werden. Die Verfahrensschritte (a) und (b) werden somit vorzugsweise mehr als einmal durchgeführt werden, typischerweise wird die Anzahl der Zyklen zwischen 1 und 100, vorzugsweise 2 bis 50, stärker bevorzugt 2 bis 20, z. B. 5 bis 10, betragen. Auf diese Weise kann die Anzahl der Varianten sehr signifikant beschränkt werden und die relativ kleine verbleibende Anzahl kann eine nach der anderen analysiert werden, z. B. durch ELISA, statistische Analyse von Klonen nach dem Sequenzieren oder Biacore-Analyse.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Selektion eines Festphasenträgers, der mehrere Nukleinsäurespezies trägt, einschließlich des gewünschten Mitglieds der Bank, verwendet werden, um nützliche Reagenzien herzustellen, ohne Notwendigkeit zur Identifizierung des bestimmten gewünschten Mitglieds der Bank. Somit kann das Verfahren auf iterative Weise durchgeführt, aber beendet werden, wenn die selektierte Probe noch eine gemischte Population von DNA-Molekülen enthält, dieser Pool von DNA-Fragmenten kann als „polyklonales" Material verwendet werden, das auf der Molekülebene nicht definiert, aber trotzdem nützlich ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können zwei unterschiedliche Nukleinsäurebanken auf getrennten festen Trägersystemen immobilisiert werden und das Verfahren kann verwendet werden, um in Wechselwirkung tretende Polypeptidpaare zu selektieren und zu identifizieren. Somit kann zum Beispiel eine der Nukleinsäurebanken Polypeptide, wie zum Beispiel Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide oder Proteindomänen, kodieren und die andere kann cDNA-kodierte Polypeptide kodieren.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Molekülbank bereitgestellt, die ein festes Trägersystem umfasst, das eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen darauf immobilisiert hat und das mit jedem der Nukleinsäuremoleküle zusammenhängende und auch auf dem Trägersystem immobilisierte Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit dem Expressionsprodukt eines oder mehrerer der Nukleinsäuremoleküle hat.
  • Das feste Trägersystem ist vorzugsweise teilchenförmig und somit wird jedes Teilchen günstigerweise ein Nukleinsäuremolekül aus der Bank und Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit dessen Expressionsprodukt tragen. Somit wird der zuvor erwähnte „Zusammenhang" zwischen Nukleinsäuremolekülen und Mitteln für eine biospezifische Wechselwirkung erreicht. Wie in größerem Detail vorstehend diskutiert wurde, wird die Nukleinsäuremolekülbank günstigerweise Fusionsproteine kodieren und die Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung können mit entweder dem variablen oder dem gemeinsamen Anteil des Fusionsproteins in Wechselwirkung treten, typischerweise daran binden.
  • In den begleitenden Bildern, die dazu dienen, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne sie auf irgendeine Weise zu beschränken, handelt es sich bei
  • 1 um eine schematische Beschreibung des grundlegenden Konzeptes der Erfindung. Ein Pool von Nukleinsäurefragmenten, die einzelne Mitglieder einer Polypeptidbank kodieren, wird auf Teilchen eines festen Trägers immobilisiert. In einem auf DNA beruhenden Format werden Fragmente immobilisiert, wonach ein gekoppelter Transkriptions-/Translationsschritt durchgeführt wird, der zur Herstellung der entsprechenden Genprodukte führt. In einem auf RNA beruhenden Format werden RNA-Moleküle transkriptionell von den DNA-Fragmenten hergestellt, wonach sie auf dem festen Träger immobilisiert werden, gefolgt von einem Translationssschritt, der zu den entsprechenden Genprodukten führt. Typischerweise, aber nicht ausschließlich handelt es sich bei den Genprodukten um Fusionsproteine aus Mitgliedern der Polypeptidbank und einem Affinitätsfusionspartner, für den ein zugehöriger Bindungspartner auf den festen Trägerteilchen vorliegt. Eine funktionelle Selektion eines gewünschten Polypeptids führt zur Isolierung von Teilchen, welche die entsprechenden Gene (DNA oder RNA) tragen, die nach Nukleinamplifikation und DNA-Sequenzierung identifiziert werden.
  • Bei 2 handelt es sich um eine schematische Beschreibung der Verwendung eines festen Trägers als Träger von gekoppelter genetischer und Protein-Information (Version mit immobilisierter DNA/markiertem Ziel in Lösung). Eine Bank von DNA-Konstrukten (typischerweise, aber nicht ausschließlich PCR-Fragmenten), die Signale enthalten, die zur RNA-Transkription und Proteintranslation eines Mitglieds der Bank notwendig sind, wird auf Teilchen eines geeigneten Trägers immobilisiert (z. B. unter Verwendung von Biotin/Streptavidin-Chemie durch Einbau einer Biotingruppe in die DNA des zur PCR-Amplifikation verwendeten Primers und durch Verwendung von Streptavidin-beschichteten Kugeln). Die genetischen Konstrukte kodieren einzelne Mitglieder der Bank, genetisch fusioniert an einen gemeinsamen Affinitätsfusionspartner (AFP), für den der zugehörige Bindungspartner (CBP) auf den Teilchen immobilisiert ist (z. B. mittels geeigneter Kopplungs-Chemie wie zum Beispiel Streptavidin/Biotin-Chemie). Nach Zugabe von Komponenten zur Transkription und Translation in vitro (z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli), werden RNA-(mRNA-)Moleküle hergestellt, welche die unterschiedlichen, anschließend translatierten Mitglieder der Proteinbank kodieren. Durch Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Bindungspartner und dem neu translatierten Affinitätsfusionspartner sind die einzelnen Mitglieder der Bank physikalisch mit den festen Trägerteilchen verbunden, welche die genetische Information (DNA), die sie kodiert, enthalten.
  • Nach dem Spülen werden die festen Trägerteilchen mit markierten Zielmolekülen inkubiert, die z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umfassen, was eine physikalische Isolierung von Fluoreszenz-positiven Teilchen ermöglicht, zum Beispiel durch FACS oder durch magnetische Trennung. Somit werden Teilchen isoliert, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information (DNA) tragen.
  • Unter Verwendung von z. B. PCR werden die DNA-Fragmente, die an einzelne oder mehrere isolierte Teilchen oder Kugeln gekoppelt sind, erneut amplifiziert und zur Identifizierung des (der) selektierten Polypeptids (Polypeptide) oder wahlweise für aufeinanderfolgende Runden von Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Transkription und -Translation, gefolgt von Selektion, z.B. durch FACS, verwendet.
  • Bei 3 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung eines festen Trägers als Träger gekoppelter genetischer und Proteininformation (Version mit immobilisierter mRNA/markiertem Ziel in Lösung). Aus einer Bank genetischer Konstrukte, die zur Transkription und Proteintranslation eines Mitglieds der Bank notwendige Signale enthalten, wird RNA (mRNA) in vitro hergestellt (Transkription) und auf Teilchen eines geeigneten Trägers immobilisiert (z. B. mittels Hybridisierung zwischen komplementären Sequenzen, die in der mRNA und der immobilisierten DNA, PNA oder den RNA-Fragmenten vorliegen). Die immobilisierten mRNA-Moleküle kodieren einzelne Mitglieder der Bank, genetisch an einen gemeinsamen Affinitätsfusionspartner (AFP) fusioniert, für den der zugehörige Bindungspartner (CBP) auf den Teilchen immobilisiert ist (z. B. mittels Streptavidin/Biotin-Chemie). Nach Zugabe der Komponenten zur in-vitro-Translation (z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli) werden die mRNA-Moleküle translatiert, um die unterschiedlichen Mitglieder der Proteinbank herzustellen. Durch Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Bindungspartner und dem neu translatierten Affinitätsfusionspartner werden die einzelnen Mitglieder der Bank physikalisch mit den festen Trägerteilchen verbunden, welche die genetische Information (mRNA), die sie kodiert, enthalten.
  • Nach dem Spülen werden die festen Trägerteilchen mit markierten Zielmolekülen inkubiert, die z. B. FITC umfassen, was eine physikalische Isolierung von Fluoreszenzpositiven Teilchen ermöglicht, zum Beispiel durch FACS. Somit werden einzelne oder mehrere Teilchen isoliert, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information (mRNA) tragen.
  • Unter Verwendung von z. B. PCR mit reverser Transkriptase werden die mit einer Kugel/einem Teilchen zusammenhängenden mRNA-Moleküle in die entsprechenden DNA-Fragmente umgewandelt, die PCR-amplifiziert und zur Identifizierung des (der) selektierten Polypeptids (Polypeptide) oder wahlweise für aufeinanderfolgende Runden von in-vitro-Transkription, Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Translation, gefolgt von Selektion, z.B. durch FACS oder magnetische Selektion, verwendet werden.
  • Bei 4 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung eines festen Trägers als Träger gekoppelter genetischer und Proteininformation (Version mit immobilisierter DNA/markiertem Bindungspartner). Eine Bank von DNA-Konstrukten (typischerweise, aber nicht ausschließlich PCR-Fragmenten), die zur RNA-Transkription und Proteintranslation eines Mitglieds der Bank notwendige Signale enthalten, wird auf diskreten Teilchen eines geeigneten Trägers immobilisiert (z. B. unter Verwendung von Biotin/Streptavidin-Chemie durch Einbau einer Biotin-Gruppe in die DNA des für die PCR-Amplifikation verwendeten Primers und durch Verwendung von Streptavidinbeschichteten Kugeln). Die Teilchen tragen auch das Zielmolekül, von dem gewünscht wird, dass in Wechselwirkung tretende Mitglieder der Bank mit ihm in Wechselwirkung treten. Diese Immobilisierung kann unter Verwendung von z. B. Standard-Kopplungs- Chemieverfahren, wie zum Beispiel EDC/NHS-Chemie oder Biotin/Streptavidin-Chemie, erreicht werden. Die genetischen Konstrukte kodieren die einzelnen Mitglieder der Bank, genetisch an einen Reporterfusionspartner (RFP) fusioniert, wie zum Beispiel ein Enzym oder ein autofluoreszierendes Protein wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP). Nach Zugabe von Komponenten zur in-vitro-Transkription und -Translation (z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli) werden die RNA(mRNA)-Moleküle hergestellt, welche die anschließend translatierten unterschiedlichen Mitglieder der Proteinbank kodieren. Durch Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Zielmolekül und dem neu translatierten Mitglied der Bank werden einzelne Mitglieder der Bank, die zur Wechselwirkung mit dem auf dem festen Träger immobilisierten Zielmolekül fähig sind, physikalisch mit den festen Trägerteilchen verbunden, welche die genetische Information (DNA), die sie kodiert, enthalten.
  • Nach dem Spülen werden die festen Trägerteilchen sortiert, z. B. unter Verwendung von FACS-Technik oder magnetischer Trennung, um einzelne oder mehrere Teilchen zu isolieren, die Komplexe aus dem immobilisierten, markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds der Bank tragen. Somit werden Teilchen isoliert, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information (DNA) tragen.
  • Unter Verwendung von PCR werden die DNA-Fragmente, die an diskrete, isolierte Kugeln gekoppelt sind, erneut amplifiziert und zur Identifizierung des (der) selektierten Polypeptids (Polypeptide) oder wahlweise für aufeinanderfolgende Runden von Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Transkription und -Translation, gefolgt von Abtrennung, z. B. durch FACS oder magnetische Selektion verwendet.
  • Bei 5 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung eines festen Trägers als Träger von gekoppelter genetischer und Protein-Information (Version mit immobilisierter mRNA/markiertem Bindungspartner). Aus einer Bank genetischer Konstrukte, die zur Transkription und Proteintranslation eines Mitglieds der Bank notwendige Signale enthalten, wird RNA (mRNA) in vitro hergestellt (Transkription) und auf Teilchen eines geeigneten Trägers immobilisiert (z. B. mittels Hybridisierung zwischen komplementären Sequenzen, die in der mRNA und den immobilisierten DNA-, PNA- oder RNA-Fragmenten vorliegen). Die Teilchen tragen auch das Zielmolekül, von dem gewünscht wird, dass Mitglieder der Bank mit ihm in Wechselwirkung treten. Diese Immobilisierung kann unter Verwendung von z. B. Standard-Kopplungs-Chemieverfahren, wie zum Beispiel EDC/NHS-Chemie oder Biotin/Streptavidin-Chemie, erhalten werden. Die genetischen Konstrukte (mRNA) kodieren einzelne Mitglieder der Bank, genetisch fusioniert an einen Reporterfusionspartner (RFP), wie zum Beispiel ein Enzym oder ein autofluoreszierendes Protein, wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP). Nach Zugabe von Komponenten zur in-vitro-Translation (z. B. eines S30-Extrakts von Escherichia coli) werden die mRNA-Moleküle translatiert, um die unterschiedlichen Mitglieder der Proteinbank herzustellen. Durch Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Zielmolekül und dem neu translatierten Mitglied der Bank werden einzelne Mitglieder der Bank, die zur Wechselwirkung mit dem auf dem festen Träger immobilisierten Zielmolekül fähig sind, physikalisch mit dem festen Träger verbunden, der die genetische Information (mRNA), die sie kodiert, enthält.
  • Nach dem Spülen werden die festen Trägerteilchen sortiert, z. B. unter Verwendung von FACS-Technik, um einzelne oder mehrere Teilchen zu isolieren, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds der Bank zu isolieren. Somit werden Teilchen isoliert, die Komplexe aus dem markierten Ziel und dem mit dem Teilchen zusammenhängenden Genprodukt des Mitglieds der Bank und dessen genetischer Information (mRNA) tragen.
  • Unter Verwendung von z. B. PCR mit reverser Transkriptase werden die mit einer Kugel/einem Teilchen zusammenhängenden mRNA-Moleküle in die entsprechenden DNA-Fragmente verwandelt, die PCR-amplifiziert und für aufeinanderfolgende Runden von in-vitro-Transkription, Teilchenimmobilisierung, in-vitro-Translation, gefolgt von Selektion, z.B. durch FACS, verwendet werden.
  • 6 veranschaulicht das experimentelle Setup für Beispiel 1. Paramagnetische, mit Streptavidin beschichtete Teilchen wurden zunächst mit biotinyliertem menschlichem Serumalbumin (HSA) inkubiert, was zu einer stabilen Verankerung von HSA führte. Getrennte Teilmengen wurden anschließend mit entweder (A) Protein ABD-Z, einem genetischen Fusionsprotein aus einem vom Protein G aus Streptokokken abgeleiteten Serumalbumin-bindenden Protein (ABD) und einem von Protein A aus Staphylokokken abgeleiteten Immunglobulin-bindenden Protein (Z), gefolgt von Inkubation mit polyklonalen, mit fluoreszierendem Isothiocyanat (FITC) konjugierten Ziegen-IgG-Antikörpern, oder (B) mit den FITC-konjugierten Ziegen-IgG-Antikörpern direkt inkubiert.
  • Bei 7 handelt es sich um eine Photographie von UV-Mikroskopie-Analysen Streptavidin-beschichteter Kugeln/Teilchen, die biotinyliertes, mit Streptavidin/Biotin-Chemie immobilisertes menschliches Serumalbumin enthalten. (A) Teilchen, die mit FITC-konjugierten polyklonalen Ziegen-IgG-Antikörpern inkubiert wurden, nachdem sie zunächst einer Lösung, die das Fusionsprotein Z-ABD enthält, ausgesetzt wurden. (B) Teilchen, die nur mit FITC-konjugierten polyklonalen Ziegen-IgG-Antikörpern inkubiert wurden.
  • Bei 8 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Verwendung der Erfindung zum Selektieren in Wechselwirkung tretender Polypeptidpaare durch das Kreuzen von zwei unterschiedlichen Banken. Zwei Pools von Nukleinsäurefragmenten, die unterschiedliche Polypeptidbanken kodieren, werden getrennt auf Teilchen von festen Trägersystemen immobilisiert. In einem auf DNA beruhenden Format werden Fragmente immobilisiert, wonach ein gekoppelter Transkriptions-/Translationschritt durchgeführt wird, der zur Herstellung der entsprechenden Genprodukte führt. In einem auf RNA beruhenden Format werden RNA-Moleküle transkriptionell von den DNA-Fragmenten hergestellt, wonach sie auf dem festen Träger immobilisiert werden, gefolgt von einem Translationsschritt, der zu den entsprechenden Genprodukten führt. Typischerweise, aber nicht ausschließlich handelt es sich bei den Genprodukten um Fusionsproteine aus Mitgliedern der Polypeptidbank und einem Affinitätsfusionspartner, für den ein zugehöriger Bindungspartner auf den Teilchen vorliegt. Die unterschiedlichen Banken sind unterschiedlich markiert, z. B. unter Verwendung von zwei Fluorophoren mit unterschiedlichen Anregungsspektren. Biospezifische Wechselwirkungen zwischen Mitgliedern der unterschiedlichen Polypeptidbanken werden als doppelt markierte Teilchenpaare nachgewiesen. Zur Identifizierung werden die auf den isolierten Teilchen vorliegenden Nukleinsäuren, welche die entsprechenden Gene kodieren, durch DNA-Sequenzierung analysiert.
  • Bei 9 handelt es sich um eine schematische Beschreibung der Konstruktion der Plasmide pGEM-SD-K-FLAG-Zwt und pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA die zur Verwendung als Matrize für die Amplifikation von PCR-Produkten zur zellfreien Transkription und Translation von entweder freier oder auf einer Kugel immobilisierter DNA/RNA gestaltet worden sind.
  • Bei 10 handelt es sich um eine Radiographie, die nach einer SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen von Proteinen erhalten wurde, die unter Verwendung eines zellfreien Extrakts, der mit [35S]-Methionin angereichert ist, und PCR-Produkten, die mit den Primern NOOL-12 und NOOL-13 unter Verwendung unterschiedlicher Plasmide als Matrizen hergestellt wurden, synthetisiert wurden. Spur 1: pGEM-SD-K-FLAG-Zwt, Spur 2: pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA. Ein Marker mit 14C-markierten Proteinen wurde als Größenreferenz verwendet (Prod. nr. CFA756, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Pfeile zeigen die Positionen von Referenzproteinen mit Molekulargewichten von 14,3, 20,1 bzw. 30,0 kDa an.
  • Bei 11 handelt es sich um einen Überlagerungsgraphen aus einer vergleichenden FACS-Analyse von mit anti-FLAG BioM5-Antikörper beschichteten Kugeln, die einem Transkriptions-/Translationsgemisch mit dem PCR-Produkt FLAG-Zwt ausgesetzt wurden, und Kugeln der Negativkontrolle, die auf die gleiche Weise behandelt, aber nicht mit anti-FLAG BioM5-Antikörpern beschichtet wurden.
  • Bei 12 handelt es sich um einen Überlagerungsgraphen aus einer vergleichenden FACS-Analyse von mit anti-FLAG BioM5-Antikörper und einem PCR-Produkt doppelt beschichteten Kugeln, die einem Transkriptions-/Translationsgemisch ausgesetzt wurden, gefolgt von Nachweis. Das Bild zeigt die Analyse von zwei unterschiedlichen Sätzen von Kugeln, die PCR-Produkte, die entweder FLAG-Zwt oder FLAG-ZIgA kodieren, enthalten, die der Analyse unterworfen wurden.
  • Bei 13(A) handelt es sich um eine schematische Darstellung der Anwesenheit einer MluI Restriktionsstelle in dem PCR-Produkt, das durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhalten wurde. Im Gegensatz dazu liegt in dem PCR-Produkt, das durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 auf der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA erhalten wurde, keine MluI Stelle vor. Auch gezeigt werden die Größen der Spaltungsprodukte, die nach Inkubation des das Fusionsprotein FLAG-Zwt kodierenden PCR-Produkts mit MluI erhalten wurden.
  • Bei (B) handelt es sich um Photographien, die Agarosegelelektrophoreseanalysen von PCR-Produkten zeigen, die durch PCR-Amplifikation unterschiedlicher Proben erhalten wurden, die vor oder nach auf FACS beruhenden Anreicherungen genommen wurden. Spur 1: Kugeln, die nur das PCR-Produkt, das FLAG-Zwt kodiert, enthalten; Spur 2: Kugeln, die nur das PCR-Produkt, das FLAG-Zwt kodiert, enthalten. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit MluI unterworfen; Spur 3: Kugeln, die nur das PCR-Produkt, das FLAG-ZIgA kodiert, enthalten; Spur 4: Kugeln, die nur das PCR-Produkt, das FLAG-ZIgA kodiert, enthalten. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit MluI unterworfen; Spur 5: Kugeln, die ein 1 : 1 Gemisch von PCR-Produkten, die FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA kodieren, enthalten. Probe von vor dem FACS-Anreicherungsexperiment; Spur 6: Kugeln, die ein 1 : 1 Gemisch von PCR-Produkten, die FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA kodieren, enthalten. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit MluI unterworfen. Probe von vor dem FACS-Anreicherungsexperiment; Spur 7: Probe von Kugeln, die im FACS-Anreicherungsexperiment sortiert wurden; Spur 8: Probe von Kugeln, die im FACS Anreicherungsexperiment sortiert wurden. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde einer Inkubation mit MluI unterworfen. Flankierende Spuren mit Größenmarkern (DNA des Phagen I gespalten mit PstI, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) sind mit M markiert.
  • Bei 14 oben handelt es sich um einen Überlagerungsgraphen von Intensitätsaufzeichnungen, die den Spuren 6 (gestrichelte Linie) und 8 (durchgezogene Linie) in 13 entsprechen. Die relative Intensität wird als Funktion der Migrationskoordinate gezeigt. Unten: zeigt digital ausgeschnittene Strecken von dem Gelbild, die den Spuren 6 und 8 aus dem in 13 gezeigten Gel entsprechen. Eine relative Verlagerung der Intensität in Richtung auf die Spaltungsprodukte mit kleinerem Molekulargewicht wird für die Probe beobachtet, die durch PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren erhalten wurde, die auf Kugeln vorliegen, die in der FACS-Anreicherung gesammelt wurden (Strecke, die Spur 8 entspricht).
  • In einer repräsentativen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Pool von Genfragmenten (2-5), welche die DNA enthalten, die unterschiedliche Mitglieder einer Polypeptidbank kodiert, unter Verwendung von Standard-DNA-Technik, zum Beispiel wie von Nord et al., Prot. Engineering 8, S. 601-608 [1995] und Nord et al., Nature Biotechnol. 15, S. 772-777 [1997] beschrieben, hergestellt. Die Genfragmente sollten eine erste Sequenz einschließen, die einer geeigneten Promotorsequenz für RNA-Polymerase entspricht, wie zum Beispiel den Promotor des E. coli-Phagen T7, den T3-Promotor, den SP6-Promotor, den lac-Promotor, den lac UV5-Promotor, den ara B-Promotor, den trp-Promotor, den Promotor des Proteins A aus Staphylokokken oder virale Promotoren wie den Promotor des Rous-Sarkom-Virus (RSV) und die späten und frühen Promotoren des Cytomegalovirus (CMV), um als Signale zur Transkription des DNA-Fragments in mRNA unter Verwendung eines geeigneten Extrakts wie zum Beispiel eines S30-Extrakts von E. coli für E. coli-Promotoren oder Promotoren prokaryotischen Ursprungs oder eines Retikulozytenextrakts oder Weizenkeimextrakts für Promotoren eukaryotischen Ursprungs (gekoppelte Systeme) oder durch einen ersten transkriptionellen Schritt unter Verwendung einer Präparation gereinigter, geeigneter RNA-Polymerase, getrennt von einem späteren Translationsschritt (nicht gekoppeltes System), bei dem die mRNA-Matrizen zur Translation der genetischen Information in die entsprechenden Polypeptide verwendet werden, zu wirken.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung folgt auf die Promotorsequenz eine Sequenz, die einen zum Binden eines zugehörigen Bindungspartners eingesetzten Affinitätsfusionspartner (AFP) kodiert, der auf einem festen Trägerteilchen immobilisiert ist. Bei diesem Affinitätsfusionspartner kann es sich zum Beispiel um den Albuminbindenden Bereich des Streptokokken-Proteins G oder von dessen Derivaten, um das Immunglobulin-bindende Protein A oder dessen Derivate, ein Maltose-bindendes Protein, die Glutathion-S-Transferase, das FLAG-Peptid, einen Bio-Anhang (biotinyliertes Peptid), eine Hexahistidylsequenz, einen c-myc-Anhang oder jedes andere Polypeptid handeln, für das ein geeigneter zugehöriger Bindungspartner zur Verfügung steht. Die Genfragmente sollten jeweils auch das Gen enthalten, das ein einzelnes Polypeptidmit glied der Bank kodiert, in translationalem Rahmen mit dem Affinitätsfusionspartner-Polypeptid, falls dieses verwendet wird. Alternativ dazu kann das Gen, das den Affinitätsfusionspartner kodiert, hinter dem Gen für das Mitglied der Polypeptidbank positioniert werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung geht der Sequenz, die das einzelne Polypeptidmitglied der Bank kodiert, eine Sequenz entweder voraus oder folgt ihr, die ein geeignetes Reporterpolypeptid kodiert, wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP), alkalische Phosphatase, Luciferase, Meerrettichperoxidase (HRP) oder β-Galaktosidase.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die Genfragmente eine geeignete chemische Gruppe (z. B. Biotin oder Digoxin), die z.B. durch PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primers oder von Nukleotiden, die mit der Gruppe markiert sind, eingeführt wird. Diese Gruppe wird verwendet, um das DNA-Fragment auf festen Trägerteilchen zu verankern, die mit einem geeigneten zugehörigen Bindungspartner, wie zum Beispiel Streptavidin oder anti-Digoxin-Antikörper(n), beschichtet sind (2 und 4).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Pool transkribierter mRNA mittels einer geeigneten Befestigungseinheit auf den festen Trägerteilchen immobilisiert. Bei dieser Einheit kann es sich zum Beispiel um eine Nukleotidsequenz am 5'- oder 3'-Ende der mRNA handeln, für die eine komplementäre Sequenz von RNA, DNA oder PNA auf den festen Trägerteilchen immobilisiert ist (3 und 5).
  • Nach dem Immobilisieren von DNA-Fragmenten auf den festen Trägerteilchen wird unter Verwendung einer geeigneten RNA-Polymerase, abhängig von dem Promotor, der für die Konstruktion der Fragmente verwendet wurde, ein Transkriptionsschritt durchgeführt. Die dadurch transkribierte mRNA wird zur Translation der genetischen Information in die entsprechenden Polypeptide eingesetzt, die durch biospezifische Wechselwirkung mit entweder einem immobilisierten zugehörigen Bindungspartner für einen Affinitätsfusionspartner, der im translationalen Rahmen mit dem Polypeptid kodiert ist, oder mittels der Erkennung eines Zielmoleküls, das auf dem Teilchen immobilisiert ist, an die festen Trägerteilchen gebunden sind. Zur Translation kann ein geeigneter Extrakt oder können reine Bestandteile verwendet werden, wie zum Beispiel ein S30-Extrakt aus E. coli, ein Extrakt aus Kaninchen-Retikulozyten oder ein rekonstituiertes Gemisch gereinigter wesentlicher Bestandteile einer Translationsmaschinerie. Geeignete Teilchen können zum Beispiel aus Polystyrol oder jedem anderen Polymer oder Polymergemisch, Cellulose, Hydroxylapatit, Sepharose, Dextran oder Silicagel hergestellt werden.
  • Nach der Immobilisierung von mRNA-Molekülen auf festen Trägerteilchen wird deren Translation in die entsprechenden Proteine wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die dadurch hergestellten Polypeptide sind durch biospezifische Wechselwirkung mit entweder einem immobilisierten zugehörigen Bindungspartner für einen Affinitätsfusionspartner, der im translationalen Rahmen mit dem Polypeptid kodiert ist, oder mittels Erkennung eines Zielmoleküls, das auf dem Teilchen immobilisiert ist, an die festen Trägerteilchen gebunden.
  • Um Überkreuzreaktionen, d. h. die Bindung eines translatierten Polypeptid-Fusionsproteinmoleküls an einen zugehörigen Bindungspartner oder an ein Zielmolekül, das auf einem festen Trägerteilchen vorliegt, das nicht auch die genetische Information (DNA oder RNA) trägt, die das Polypeptid kodiert, zu umgehen, kann das Gemisch verdünnt werden, um so eine große Nähe zwischen Teilchen zu verhindern.
  • Eine Selektion von Teilchen, die ein gewünschtes Polypeptid oder eine Gruppe von Polypeptiden enthalten, kann durch direkte Isolierung, zum Beispiel in einem FACS-Scanner, durchgeführt werden, falls das Ziel mit einem Fluorophor markiert ist oder falls das Polypeptid genetisch mit einem fluoreszierenden Protein wie zum Beispiel dem grün fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Ein anderes Selektionsverfahren besteht darin, magnetische Prinzipien zu verwenden, wobei magnetische (oder paramagnetische) Teilchen, die mit dem Zielmolekül von Interesse beschichtet sind (1 und 2) verwendet werden. Alternativ dazu können Teilchen, die mittels einer spezifischen Wechselwirkung mit einem Polypeptid-Genprodukt eines Mitglieds der Bank markiert sind, unter Verwendung z. B. eines UV-Mikroskops physikalisch isoliert werden.
  • Eine Selektion kann auf der Grundlage funktioneller Eigenschaften der kodierten Polypeptide durchgeführt werden, wie zum Beispiel Binden an ein gewünschtes Ziel (Antikörper oder andere Proteine oder Peptide, Kohlenhydrate, organische Moleküle, Zellen, Viren, Pflanzen usw.), katalytische Aktivität oder durch proteolytische oder chemische Stabilität unter bestimmten chemischen Bedingungen.
  • Nach der Isolierung von Teilchen, die ein Polypeptid mit den gewünschten Kennzeichen tragen, wird die Nukleinsäureinformation (DNA oder RNA), die auf den gleichen Teilchen vorliegt, (falls notwendig) durch in-vitro-Nukleinsäureamplifikationsverfahren wie zum Beispiel PCR mit reverser Transkriptase (im Falle von RNA), PCR (im Falle von DNA) oder Rolling-Circle-Replikation amplifiziert.
  • Falls notwendig kann das Verfahren mit zusätzlichen Zyklen direkter DNA-Immobilisierung oder RNA-Immobilisierung nach in-vitro-Transkription erneut amplifizierter, an Teilchen gebundener Nukleinsäuren wiederholt werden. Falls eine weitere Variation für die nächste Selektionsrunde gewünscht wird, können die Amplifikationsbedingungen oder Polymerase(n) gewählt werden, um in den nächsten Pool von DNA-Fragmenten Mutationen einzuführen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden zwei unterschiedliche Polypeptidbanken auf in Wechselwirkung tretende Paare hin untersucht (8). Teilchen, die einer Bank von z. B. cDNA-kodierten Polypeptiden entsprechen, werden mit Teilchen gemischt, die Mitglieder einer Polypeptidbank von zum Beispiel cDNA-kodierten Proteinen, Antikörpern oder Fragmenten davon, Peptiden oder Proteindomänen tragen. Die für die Immobilisierung der Nukleinsäuren verwendeten Teilchen werden so hergestellt, dass sie zwei unterschiedliche Markierungen enthalten, eine für jede Bank. Die Isolierung in Wechselwirkung tretender Polypeptidpaare, die sich aus biospezifischen Wechselwirkungen ergeben, werden z. B. durch FACS-Technik unter Einsetzen des Nachweises von doppelt markierten Teilchenpaaren isoliert.
  • Das Verfahren der Erfindung hat mehrere Vorteile gegenüber existierenden Selektionssystemen, die einen in-vivo-Polypeptidbiosyntheseschritt verwenden, da es keinen Bedarf zur Transformation des genetischen Materials in eine Empfängerzelle gibt. Die einzige Beschränkung im Hinblick auf die Bankgröße (Komplexität) ist das Bindungsvermögen des festen Trägersystems. Darüberhinaus verwendet das vorliegende in-vitro-Selektionssystem einen stabilen festen Träger als Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp, was es ermöglicht, raue Bedingungen zu verwenden, wenn Liganden mit hoher Affinität gegenüber einem gegebenen Zielmolekül selektiert werden. Als Folge daraus, dass die Nukleinsäuren direkt auf dem festen Träger immobilisiert werden, können sie leicht gewonnen werden; somit können zum Beispiel, falls der feste Träger magnetische Kugeln umfasst, diese aus dem Transkriptions-/Translationsgemisch mit einem Magneten entnommen werden, wodurch das Risiko einer Kontamination mit nicht immobilisierten Nukleinsäuren verringert wird.
  • Die folgenden, nicht beschränkenden Beispiel dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen.
  • STANDARDVERFAHREN:
  • Klonierung und PCR-Amplifikationen:
  • Die Standard-Klonierungsarbeit einschließlich Plasmidpräparationen, Restriktionsenzymspaltungen und Ligationen usw. wurde wie in (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) beschrieben und gemäß den Empfehlungen der Lieferanten durchgeführt. Restriktionsenzyme und Ligase wurden entweder von MBI Fermentas, Vilnius, Litauen, oder New England Biolabs, MA, USA, gekauft. PCR-Amplifikationen unter Verwendung von Plasmiden oder von auf Kugeln immbolisierten PCR-Produkten als Matrizen wurden unter Verwendung von Standardbedingungen in einem GeneAmp® PCR-System 9700 (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Als Primer wurden Oligonukleotide aus Tabelle 1 verwendet, wie in den Beispielen spezifiziert wird. Typischerweise wurden 5 pmol der Primer in einer PCR-Amplifikation mit 30 Zyklen unter Verwendung eines Puffers, der aus 0,2 mM Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, (pH-Wert 8,5), 0,1% Tween 20 und 0,1 Einheiten AmpliTaq® DNA-Polymerase (PE Biosystems) bestand, verwendet. Ein PCR-Standardzyklus hatte die folgenden Einstellungen: 15 s 94°C, 20 s 55°C, 1 min 72°C. Standardanalysen von Nukleinsäuren mit Agarosegelelektrophorese wurden unter Verwendung von Ethidiumbromid zum Färben durchgeführt. Bei E. coli-Zellen, die zur Klonierung und für Plasmidpräparationen verwendet wurden, handelte es sich um RR1DM15 (Rüther, U., Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772, 1982).
  • Tabelle 1. Liste der Oligonukleotidprimer
    Figure 00190001
  • Herstellung rekombinanter Proteine:
  • Bei E. coli-Zellen, die zur Expression verwendet wurden, handelte es sich entweder um RR1DM15 (Rüther, U. Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772, 1982) oder BL21DE3 (Novagen, Madison, WI, USA). Verfahren mit osmotischem Schock wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Nygren et al., J. Mol. Recognit. 1: 69-74, 1988). Affinitätschromatographie-Reinigungen von Proteinen auf HSA- und IgG-Sepharose-Harzen wurden wie früher beschrieben durchgeführt (Nygren et al., J. Mol. Recognit. 1: 69-74, 1988). Menschliches polyklonales IgG wurde von Pharmacia und Upjohn AB, Stockholm geliefert.
  • Biotinylierung von Proteinen:
  • Menschliches Serumalbumin (HSA) (Prod. nr. A-8763, Sigma) wurde unter Verwendung des EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin-Kits (Prod. nr. 21335, Pierce Chemical Company, Rodeford, IL, USA) biotinyliert.
  • Zellfreie Transkription und Translation von PCR-Fragmenten:
  • Die angegebenen PCR-Produkte wurden einer zellfreien Transkription und Translation unter Verwendung eines kommerziellen E. coli S30-Extraktsystems für lineare DNA (Prod. nr. L1030, Promega, Madison, WI, USA) gemäß den Anleitungen durch den Hersteller unterworfen. Für eine gekoppelte Transkription/Translation freier (nicht immobilisierter) PCR-Produkte wurden typischerweise 10-70 ng PCR-Produkt mit 50 μl Zellextrakt gemischt und 1 h lang bei 25°C inkubiert. In anderen Experimenten wurden PCR-Produkte auf Streptavidin-beschichteten Mikrokugeln (M280-SA, Dynal, Norwegen oder Bang Laboratories, Prod. nr. CP01N/004109, wo angegeben) immobilisiert. Derartige Kugeln waren vorher mit einer 1,89 mg/ml Lösung von biotinyliertem BioM5-Antikörper (Prod. nr. F-2922, Sigma, Saint Louis, MO, USA), der gegen ein FLAG-Peptid gerichtet ist, zum Affinitätseinfangen von Proteinen, an die ein FLAG-Peptid angehängt war, inkubiert worden. Typischerweise wurden 10 ng PCR-Produkt mit 1 mg BioM5-enthaltenden Kugeln gemischt, die anschließend zweimal gespült wurden, bevor eine gekoppelte Transkriptions-/Translationsreaktion unter Verwendung von 25 μl E. coli-Extrakt durchgeführt wurde.
  • Gelelektrophorese von Proteinen:
  • Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen wurde unter Verwendung des Phast-Systems (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) oder in einem Novex Xcell II (San Diego, CA, USA) wie von den jeweiligen Lieferanten beschrieben durchgeführt.
  • DNA-Sequenzierung:
  • Eine DNA-Sequenzierung wurde durch Zyklus-Sequenzierung (Carothers et al., BioTechniques 7: 494-499, 1989; Savolainen, P., et al., Mol. Biol. Evol. 17: 474-488, 2000) unter Verwendung von ThermoSequenase DNA-Polymerase (Amersham Pharma cia Biotech) und den angegebenen Primern durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden auf ein ABI Prism 377XL Gerät (PE Biosystems, Foster City, CA, USA) geladen.
  • Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs-(FACS-)Experimente:
  • FACS-Analysen wurden entweder mit einem FACSCalibur, einem FACScan oder einem FACSVantage SE Gerät (Becton Dickinson, Oxnard, USA) durchgeführt.
  • Wo angegeben wurden mit Meerrettichperoxidase konjugierte Antikörper für Signalamplifikationen unter Verwendung eines Fluoresceintyramid-Reagens (Boehringer Mannheim, Deutschland), wie von Anton und Mitarbeitern beschrieben (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998), verwendet.
  • Beispiel 1
  • Unterscheidung zwischen festen Trägerteilchen, die durch eine biospezifische Wechselwirkung mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, und festen Kontrollträgerteilchen
  • Ungefähr 2 mg Streptavidin-beschichtete Teilchen (M280-SA, Dynal, Norwegen) wurden mit 30 μl einer 2 mg/ml Lösung von menschlichem Serumalbumin (HSA) (Sigma Artikelnr. A-8763), das unter Verwendung eines Proteinbiotinylierungs-Kits (Pierce Artikelnr. 21335) gemäß den Anleitungen des Herstellers biotinyliert worden war, in PBS-Puffer (0,15 M NaCl, 20 mM Phosphat, pH-Wert 7,2) inkubiert. Die Teilchen wurden dann entweder direkt mit polyklonalen Ziegen-IgG-Antikörpern, die mit FITC (Sigma Artikelnr. F-9887) markiert waren, inkubiert oder zuerst mit 30 μl einer 2 mg/ml Lösung eines Fusionsproteins (Z-ABD) aus einem von Protein G aus Streptokokken abgeleiteten Serumalbumin-bindenden Protein (ABD) und einem von Protein A aus Staphylokokken abgeleiteten Immunglobulin-bindenden Protein (Z), das wie früher beschrieben hergestellt und HSA-affinitätsgereingt wurde (Nord et al., in den angeführten Arbeiten [1995] und [1997]) in PBS inkubiert. Zwischen allen Inkubationen wurden mehrere (5-10) Spülungen mit PBS durchgeführt, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen.
  • Um zu untersuchen, ob eine Unterscheidung zwischen Teilchen, die durch die FITC-markierten polyklonalen Ziegenantikörper mittels einer biospezifischen Wechselwirkung an die Z-Einheit des Z-ABD-Fusionsproteins markiert waren, und Teilchen, die nicht mit dem Z-ABD-Fusionsprotein inkubiert worden waren und somit unfähig waren, den Ziegenantikörper zu binden, wurden Teilchen unter Verwendung von Olympus BH2-RFCA-Mikroskopie bei einer Anregungswellenlänge von 495 nm durch UV-Mikroskopie analysiert. Die in 5 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass ein klarer Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den beiden unterschiedlich behandelten Pools von Teilchen gesehen werden kann (5A und 5B). Dies zeigt, dass das Ergebnis einer biospezifischen Wechselwirkung zwischen einem (ABD-HSA)-immobilisierten Fusionsprotein und einem in Lösung zugegebenen markierten Zielprotein beobachtet werden kann.
  • Beispiel 2
  • Zusammensetzung und Klonierung genetischer Konstrukte für zellfreie Transkriptions- und Translationsexperimente
  • Um in der Lage zu sein, PCR-Produkte zu erhalten, die relevante Proteine oder Mitglieder einer Proteinbank kodieren und die für zellfreie Transkriptions- und Translationsexperimente unter Verwendung von festen Trägern als Träger sowohl für Nukleinsäuren als auch deren entsprechende kodierte Proteine geeignet sind, wurde ein genetisches Konstrukt im Plasmidvektor pGEM-4Z zusammengesetzt (9). In einer Splice-Overlap-Extension-(SOE-)PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer NOOL-10 und NOOL-11 (Tabelle 1), wurden zwei Genfragmente, die ein Albumin-bindendes Protein (ABP) (Larsson, et al., Prot. Expr. Purif. 7: 447-457, 1996) beziehungsweise die Z-Domäne (Zwt) (Nilsson et al., Prot. Engineering 1: 107-113, 1987) kodieren, verbunden. Die beiden Fragmente waren vorher durch getrennte PCR-Reaktionen unter Verwendung von pT7-ABPc (ABP) (Larsson, et al., Prot. Expr. Purif. 7: 447-457, 1996) (Primer NOOL-6 und NOOL-7, Tabelle 1) beziehungsweise pKN1-Zwt (Nord et al., Prot. Engineering, 8: 601-608, 1995) (Primer NOOL-8 und NOOL-9, Tabelle 1) als Plasmidmatrizen hergestellt worden. Bei der SOE-Reaktion wurden zwei Fragmente verbunden, was zu einem ABP-(Ser)3-Zwt kodierenden Genfragment führte, das am 5'-Ende Erkennungsstellen für die beiden Enzyme HindIII und NcoI und am 3'-Ende zwei Translations-Stoppcodons und eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym EcoRI umfasst (9). Dieses Fragment wurde durch Ligation als HindIII-EcoRI-Fragment in das mit den gleichen Enzymen gespaltene Plasmid pGEM-4Z eingefügt, was zum Konstrukt pGEM-ABP-Zwt führte.
  • Ein Fragment wurde durch Aneinanderlagern der beiden Oligonukleotide SD KOZAK-1 und SD KOZAK-2 (Tabelle 1) zusammengesetzt, was zu einem 40 bp großen Fragment führte, das eine Shine Dalgarno-(SD-)Sequenz aus E. coli (zur effizienten Translation in E. coli) und eine Kozak-Sequenz (zum Erleichtern der Expression in Zellextrakten aus Säugerquellen), flankiert durch HindIII und NcoI Restriktionsstellen führte (9). Dieses Fragment wurde durch Ligation in mit HindIII und NcoI gespaltenen pGEM-ABP-Z eingefügt, was zu dem Plasmidvektor pGEM-SD-K-ABP-Zwt führte. Dieser Vektor wurde anschließend mit den Enzymen NcoI und XhoI gespalten, wodurch das ABP-kodierende Fragment freigesetzt wurde. Das dadurch erhaltene Vektorfragment wurde an ein FLAG-Peptid kodierendes Genfragment ligiert, das vorher durch Aneinanderlagern der beiden Oligonukleotide FLAG-1 und FLAG-2 (Tabelle 1) erhalten worden war, was zu dem Vektor pGEM-SD-K-FLAG-Z führte. Dieser Vektor kodiert somit ein FLAG-Zwt-Fusionsprotein, verbunden durch einen (Ser)3-Linker (9). Der Vektor enthält auch einen stromaufwärts gelegenen T7-Promotor, der fähig ist, die Transkription des Gens für das Fusionsprotein FLAG-Zwt durch die Wirkung von T7 RNA-Polymerase anzutreiben. Von diesem Vektor kann jedes geeignete Genfragment, das zwischen den XhoI und EcoRI Stellen eingefügt ist, als eine mRNA transkribiert werden, die funktionell mit einer SD-Sequenz, einer Kozak-Sequenz und einem ein FLAG-Peptid kodierenden Teil verbunden ist. Zusätzlich können, unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 (Tabelle 1), PCR-Produkte erhalten werden, die für eine durch T7 RNA-Polymerase angetriebene Transkription geeignet sind und an ihren 3'-Enden biotinyliert sind, geeignet zur Immobilisierung z. B. auf Streptavidin-beschichteten Oberflächen und anderen festen Trägern.
  • Um den als pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA bezeichneten Vektor zu konstruieren, bei dem das Zwt kodierende Genfragment durch ein Genfragment substituiert worden ist, welches das menschliche IgA-bindende Protein ZIgA kodiert (Gunneriusson et al., J. Bact. 1999), wurde ein ZIgA kodierendes Genfragment unter Verwendung der Primer NOOL-8 und NOOL-9 unter Verwendung der Plasmidmatrize pKN1-ZIgA amplifiziert (Gunneriusson et al., J. Bact. 1999). Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und EcoRI gespalten und in den Vektor pGEM-SD-K-FLAG-Zwt, der vorher mit den gleichen Enzymen gespalten worden war, eingefügt. Der so erhaltene Vektor pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA kodiert somit ein FLAG-ZIgA-Fusionsprotein, verbunden durch einen (Ser)3-Linker (9).
  • Beispiel 3
  • Zellfreie Transkrigtion/Translation von FLAG-Zwt- und FLAG-ZIga-Fusionsproteinen von ihren jeweiligen PCR-Produkten
  • Unter Verwendung der Plasmidvektoren pGEM-SD-K-FLAG-Zwt beziehungsweise pGEM-SD-K-FLAG-Zwt für PCR-Amplifikationen unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 (Tabelle 1) wurden PCR-Produkte erhalten, von denen ungefähr 70 ng einer einstündigen zellfreien Transkription/Translation bei 25°C unter Verwendung von 50 μl eines S30-Zellextrakts von E. coli (L1030, Promega, MA, USA), ergänzt mit [35S]-Methionin und 1600 Einheiten T7 RNA-Polymerase, unterworfen. Proben der unterschiedlichen Transkriptions-/Translations-Gemische wurden durch 10% NuPAGE (Novex, San Diego, CA, USA) unter reduzierenden Bedingungen durch die Zugabe von 50 mM DTT (Endkonzentration) im Probenladepuffer (NuPAGE LDS Probenpuffer, Novex), gefolgt von Belichtung eines Films (Kodak XOMAT-AR, 18 × 24 cm) mit dem Gel bei –70°C über Nacht, analysiert. Die Entwicklung des Films deckte ein radioaktives Protein der erwarteten Größe (8 kDa) für die beiden PCR-Produkte, die FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA kodieren (10), auf. Dies zeigt, das die konstruierten Plasmidvektoren pGEM-SD-K-FLAG-Zwt und pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA beide zur Verwendung als Matrizen für die Amplifikation von PCR-Produkten geeignet waren, die fähig sind, eine durch T7 RNA-Polymerase angetriebene Transkription von mRNA zu steuern, die zur zellfreien Translation von FLAG-Zwt- und FLAG-ZIgA-Fusionsproteinen in einem S30-Extrakt von E. coli verwendet werden konnte.
  • Beispiel 4
  • Immobilisierung von FLAG-Zwt- und FLAG-ZIgA-Fusionsproteinen auf Kugeln, die einen anti-FLAG-Antikörper enthalten
  • Um die Funktionalität der FLAG-Peptid-Einheiten der FLAG-Zwt- und FLAG-ZIgA-Fusionsproteine zu untersuchen, wurden Reaktionsgemische, die aus der Herstellung der beiden Fusionsproteine von ihren jeweiligen PCR-Produkten unter Verwendung zellfreier Transkription/Translation wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten wurden, drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit Streptavidin-beschichteten M-280-SA Dynabeads (Dynal, Norwegen) (50 mg) gemischt, die vorher mit 5 μl einer 1,89 mg/ml Lösung biotinylierter monoklonaler anti-FLAG BioM5-Antikörper (Sigma) in PBS (0,15 M NaCl, 20 mM Phosphat, pH-Wert 7,2) inkubiert worden waren. In das Experiment wurden auch Kugeln, die nicht mit der Lösung des biotinylierten anti-FLAG BioM5-Antikörpers inkubiert worden waren, eingeschlossen (Kontrolle). Die Kugeln wurden anschließend mit PBST (PBS mit 0,1% Tween 20) gespült und unter Verwendung eines Beckman LS6000 SC Szintillators (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) unter Verwendung von Szintillationspuffer unter Standardbedingungen analysiert. Die gemessenen Signale von mit anti-FLAG BioM5 beschichteten Kugeln, die den Transkriptions-/Translations-Gemischen, die den FLAG-Zwt- beziehungsweise FLAG-ZIgA-Fusionsproteinen entsprachen, unterworfen worden waren, waren im Vergleich zu den negativen Kontrollen signifikant höher (Tabelle 2). Dies zeigt, dass Fusionsproteine, hier beispielhaft durch die beiden Fusionsproteine FLAG-Zwt und FLAG-ZIgA angeführt, von ihren jeweiligen PCR-Produkten durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt werden können, die einen funktionellen Affinitätsfusionsparter, der hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt ist, enthält, das zur Immobilisierung der Proteine an Kugeln, die einen zugehörigen Affinitätspartner enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG-Antikörper BioM5 beispielhaft angeführt ist, geeignet ist.
  • Tabelle 2. Gemessene Szintillationssignale (über 1 min hinweg angesammelt) von nativen Streptavidinkugeln (SA) beziehungsweise mit biotinyliertem anti-FLAG BioM5-Antikörper beschichteten Streptavidinkugeln nach dem Mischen (und anschließendem Spülen) mit Transkriptions-/Translations-Gemischen von unterschiedlichen Proben.
    Figure 00250001
  • Beispiel 5
  • Zellfreie Transkriation/Translation eines FLAG-Zwt kodierenden PCR-Produkts biospezifische Immobilisierung des Genprodukts auf Kugeln und Analyse durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
  • Die zellfreie Transkription und Translation eines durch PCR-Amplifikation mit den Primern NOOL-12 und NOOL-13 (Tabelle 1) an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhaltenen PCR-Produkts wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, aber ohne Zugabe von [35S]-Methionin. Das so erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden lang mit 50 mg Streptavidin-beschichteten Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von ungefähr 0,95 mm (Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA) inkubiert, die vorher mit 5 μl einer 1,89 mg/ml Lösung biotinylierter monoklonaler anti-FLAG BioM5-Antikörper (Sigma) inkubiert worden waren. In das Experiment wurden als Kontrolle auch Kugeln, die nicht mit dem biotinylierten anti-FLAG BioM5-Antikörper inkubiert worden waren, eingeschlossen. Nach sorgfältigem Spülen mit TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20) wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP) (Artikelnr. P0402, Dako, Dänemark) konjugierte anti-DNP IgG-Antikörper aus Kaninchen zu den Kugeln gegeben und 45 min lang bei 25°C inkubiert, gefolgt von Spülen mit TNT-Puffer, um das translatierte und biospezifisch immobiliserte FLAG-Zwt Fusionsprotein-Genprodukt mittels der biospezifischen Wechselwirkung zwischen den konstanten Teilen (Fc) der Kaninchenantikörper und der Z-Domäneneinheit des Fusionsproteins nachzuweisen. Um ein zur FACS nützliches Signal zu erhalten, wurde die enzymatische Aktivität der an die Kaninchenantikörper konjugierten HRP durch Zugabe von einem ml eines Signalamplifikationsgemisches, das Fluoresceintyramid enthielt (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998), verwendet. Zwischen allen Inkubationsschritten wurden die Kugeln sorgfältig gespült, 3 min lang bei 2000 × g zentrifugiert, gefolgt von Resuspension in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. TNB Blockierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5% Blockierungsreagens aus dem Tyramid-Signalamplifikationskit, NEN Life Science, Boston, MA, USA) wurde während der Inkubationsschritte gemäß den Anleitungen der Hersteller verwendet.
  • Nach einer fünf Minuten langen Inkubation bei 25°C und anschließendem Spülen wurden die Kugeln zur FACS-Analyse in PBS resuspendiert. Diese Analyse zeigte, dass die mit dem biotinylierten anti-FLAG BioM5-Antikörper beschichteten Kugeln, die mit dem Transkriptions-/Translations-Gemisch des FLAG-Zwt kodierenden PCR-Produktes inkubiert worden waren, die anschließend mit dem Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat inkubiert und schließlich dem Fluoresceintyramid enthaltenden Signalamplifikationsgemisch unterworfen wurden, signifikant höhere Fluoreszenzsignale in der FACS-Analyse aufzeigten als Kugeln, die auf die gleiche Weise behandelt wurden, aber keinen anti-FLAG BioM5-Antikörper enthielten (11).
  • Dies zeigt, dass Fusionsproteine, hier durch das Fusionsprotein FLAG-Zwt beispielhaft angeführt, von einem entsprechenden PCR-Produkt durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt werden können, die einen funktionellen Affinitätsfusionspartner, hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt, enthält, das fähig ist, zu einer biospezifischen Immobilisierung des Proteins an Kugeln zu führen, die einen zugehörigen Affinitätspartner enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG BioM5-Antikörper beispielhaft angeführt ist, und dass derartige Kugeln durch FACS-Analyse unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Nachweisreagenzien, hier durch ein Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat und ein Fluoresceintyramid enthaltendes Signalamplifikationsgemisch beispielhaft angeführt, nachgewiesen werden können.
  • Beispiel 6
  • Zellfreie Transkription/Translation eines auf Kugeln immobilisierten, FLAG-Zwt kodierenden PCR-Produkts, biospezifische Immobilisierung des Genprodukts auf Kugeln und Analyse durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
  • Biotinylierte, ein FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodierende PCR-Fragmente, die nach PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhalten wurden, wurden auf Streptavidin-beschichteten Kugeln (Bangs Laboratories) in einer Konzentration von ungefähr 10 ng/mg Kugeln immobilisiert. Die Kugeln (50 mg) waren vorher mit 5 μl einer Lösung inkubiert worden, die 1,89 mg/ml eines biotinylierten anti-FLAG-Peptid-Antikörpers (BioM5, Sigma) enthielt. Die Kugeln, die sowohl die biotinylierten PCR-Produkte als auch den anti-FLAG-Peptid-Antikörper enthielten, wurden einer zellfreien Transkription und Translation unter Verwendung von 25 ml eines S30-Extrakts (Promega, Madison, WI, USA), der mit 200 Einheiten T7 RNA-Polymerase (Epicentre, Madison, WI, USA) und 40 Einheiten rRNasin (Promega, Madison, WI, USA) ergänzt war, unterworfen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 25°C, gefolgt von wiederholtem Spülen unter Verwendung von TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte anti-DNP IgG-Antikörper aus Kaninchen (Artikelnr. P0402, Dako, Dänemark) zu den Kugeln gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert (über-Kopf-Mischen), gefolgt von Spülen mit TNT, um das translatierte und biospezifisch immobilisierte FLAG-Zwt Fusionsprotein-Genprodukt mittels der biospezifischen Wechselwirkung zwischen den konstanten Teilen (Fc) der Kaninchenantikörper und der Z-Domäneneinheit des Fusionsproteins nachzuweisen (Nilsson et al., Protein engineering, 1: 107-113, 1987).
  • Um ein zur FACS nützliches Signal zu erhalten, wurde die enzymatische Aktivität der an die Kaninchenantikörper konjugierten HRP durch Zugabe von einem ml eines Signalamplifikationsgemisches, das Fluoresceintyramid enthielt (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998), verwendet. Zwischen allen Inkubationsschritten wurden die Kugeln sorgfältig gespült, 3 min lang bei 2000 × g zentrifugiert, gefolgt von Resuspension in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. TNB Blockierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5% Blockierungsreagens aus dem Tyramid-Signalamplifikationskit, NEN Life Science, Boston, MA, USA) wurde während der Inkubationsschritte gemäß den Anleitungen der Hersteller verwendet. Als Negativkontrolle wurden Streptavidin-beschichtete Kugeln, die immobiliserte anti-FLAG BioM5-Antikörper enthielten, und ein PCR-Produkt, das aus einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA erhalten wurde, in das Experiment eingeschlossen.
  • Die Ergebnisse der FACS-Analyse zeigen, dass die Kugeln, welche die immobilisierten, biotinylierten, ein FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodierenden PCR-Fragmente enthielten, die nach einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 an der Plasmidmatrize pGEM-SD-K-FLAG-Zwt erhalten wurden, eine signifikant höhere Fluoreszenzintensität präsentieren als die Kontrollkugeln, die immobilisierte PCR-Produkte enthalten, die ein Fusionsprotein kodieren, das durch das zum Nachweis verwendete Kaninchen-HRP-Konjugat-Reagens nicht erkannt wird (12). Dies zeigt, dass Fusionsproteine, hier durch das Fusionsprotein FLAG-Zwt beispielhaft angeführt, aus einem entsprechenden, auf einer Kugel immobilisierten PCR-Produkt durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt werden können, die einen funktionellen Affinitätsfusionspartner, hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt, enthält, das fähig ist, zu einer biospezifischen Immobilisierung des Proteins an Kugeln zu führen, die einen zugehörigen Affinitätspartner enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG BioM5-Antikörper beispielhaft angeführt ist, und dass derartige Kugeln durch FACS-Analyse unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Nachweisreagenzien, hier durch ein Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat und ein Fluoresceintyramid enthaltendes Signalamplifikationsgemisch beispielhaft angeführt, nachgewiesen werden können.
  • Beispiel 7
  • Auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) beruhendes Anreichern von Kugeln, die immobiliserte PCR-Produkte enthalten, die ein gewünschtes Genprodukt kodieren
  • Biotinylierte, FLAG-Zwt- beziehungsweise FLAG-ZIgA-Fusionsproteine kodierende PCR-Fragmente, die nach PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 an den Plasmidmatrizen pGEM-SD-K-FLAG-Zwt beziehungsweise pGEM-SD-K-FLAG-ZIgA erhalten worden waren, wurden getrennt auf Streptavidin-beschichteten Kugeln (Bangs Laboratories) bis zu einem Spiegel von ungefähr 10 ng/mg Kugeln immobilisiert. Die Kugeln (50 mg) waren vorher mit 5 μl einer Lösung inkubiert worden, die 1,89 mg/ml eines biotinylierten anti-FLAG-Peptid-Antikörpers (BioM5, Sigma, Saint Louis, Mo, USA) enthielt. Kugeln aus den beiden Pools wurden anschließend in einem Verhältnis von 1 : 1 (gleiche Mengen Kugeln beider Sorten) gemischt und zellfreier Transkription und Translation unter Verwendung von 25 ml eines S30-Extrakts (Promega, Madison, WI, USA), der mit 200 Einheiten T7 RNA-Polymerase (Epicentre, Madison, WI, USA) und 40 Einheiten rRNasin (Promega, Madison, WI, USA) ergänzt war, unterworfen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 25°C, gefolgt von wiederholtem Spülen unter Verwendung von TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), wurden mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte anti-DNP IgG-Antikörper aus Kaninchen (Artikelnr. P0402, Dako, Dänemark) zu den Kugeln gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert, gefolgt von Spülen mit TNT, um das translatierte und biospezifisch immobiliserte FLAG-Zwt Fusionsprotein-Genprodukt mittels der biospezifischen Wechselwirkung zwischen den konstanten Teilen (Fc) der Kaninchenantikörper und der Z-Domäneneinheit des Fusionsproteins nachzuweisen. Um ein zur FACS nützliches Signal zu erhalten, wurde die enzymatische Aktivität der an die Kaninchenantikörper konjugierten HRP durch Zugabe von einem ml eines Signalamplifikationsgemisches verwendet, das Fluoresceintyramid enthielt (Anton et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 771-777, 1998). Zwischen allen Inkubationsschritten wurden die Kugeln sorgfältig gespült, 3 min lang bei 2000 × g zentrifugiert, gefolgt von Resuspension in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20), um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. TNB Blockierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5% Blockierungsreagens aus dem Tyramid-Signalamplifikationskit, NEN Life Science, Boston, MA, USA) wurde während der Inkubationsschritte gemäß den Anleitungen der Hersteller verwendet. Unter Verwendung von FACS wurde ein Pool aus Kugeln, der ursprünglich durch das Mischen im Kugelverhältnis von 1 : 1 erhalten wurde, anschließend einem auf der Fluoreszenzintensität beruhenden Anreicherungsexperiment unterworfen. Bei diesem Verfahren wurden die Einstellungen im FACS-Gerät zur präparativen Isolierung einzelner Kugeln (Singlets) mit einer relativen Fluoreszenzintensität von über 50 eingestellt. Mit dieser Einstellung wurde das Gemisch dem Sortieren unterworfen und Röhrchen mit ungefähr 4500 sortierten Kugeln wurden gesammelt.
  • Um zu analysieren, ob Kugeln, die das FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodierende PCR-Produkte tragen, die spezifisch durch das Markierungsverfahren, welches das Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat einbezieht, markiert sein sollten, relativ zu Kugeln angereichert waren, welche die PCR-Produkte und FLAG-Zwt-Fusionsproteine tragen, die nicht durch das Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat erkannt werden, wurde der Unterschied in der DNA-Sequenz zwischen den beiden PCR-Produkten eingesetzt.
  • Die das FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodierenden PCR-Produkte enthalten eine Erkennungssequenz für das Enzym MluI, die in den PCR-Produkten, die das FLAG-ZIgA-Fusionsprotein kodieren, nicht vorliegt. Dies ermöglichte eine Unterscheidung zwischen den beiden PCR-Produkten durch eine Analyse der Empfindlichkeit gegenüber einem Verdau mit MluI (13A). Proben von Kugeln von vor und nach dem Sortieren wurden deshalb einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer NOOL-12 und NOOL-13 unterworfen, die an Stellen in den immobilisierten PCR-Produkten anlagern, die Bereiche flankieren, die sich zwischen den beiden PCR-Produktspezies unterscheiden, und deshalb für die gleichzeitige Amplifikation von beiden PCR-Produktspezies verwendet werden konnten. Eine anschließende Inkubation der so erhaltenen neuen PCR-Produkte mit dem Restriktionsenzym MluI konnte daher verwendet werden, um die relativen Verhältnisse zwischen den beiden Spezies in Proben von vor und nach dem Sortieren durch eine Analyse der Größen der DNA-Fragmente und Bandenintensitäten nach Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromidfärbung, zu untersuchen.
  • Eine PCR-Amplifikation der Nukleinsäuren, die auf ungefähr 10000 Kugeln des 1:1 Gemisches vorlagen (Probe von vor dem Sortieren), gefolgt von einem Verdau mit MluI und einer Analyse durch Gelelektrophorese zeigt, wie erwartet, ein Gemisch von gegenüber MluI empfindlichen und gegen MluI resistenten PCR-Produkten (13B, Spur 6).
  • Als ungefähr 400 Kugeln, die während der FACS-Anreicherung gewonnen wurden, der gleichen Analyse unterworfen wurden, hatte sich das Intensitätsverhältnis zwischen der oberen Bande (443 bp, ungespalten) und der unteren Doppelbande (zwei Spaltungsprodukte, 239/204 bp, nicht aufgelöst) zu den kleineren (unteren) Banden hin verschoben (13B, Spur 8). Unter Verwendung des Gelscanners Gel Doc 2000 und der Software Quantity One Vers. 4.1 (Biorad, Hercules, CA, USA) wurde diese Verschiebung der relativen Intensitäten aufgezeichnet, was zu dem Überlagerungsgraph, der in 14 gezeigt wird, führte. Aus dieser Analyse kann klar gesehen werden, dass eine Verschiebung der relativen Intensität zu den Spaltungsprodukten mit niedrigerem Molekulargewicht hin stattgefunden hatte. Dies zeigt, dass Kugeln, die ein gegenüber MluI empfindliches PCR-Produkt enthalten, welches das FLAG-Zwt-Fusionsprotein kodiert, während des Experiments relativ zu Kugeln, die das gegen MluI resistente PCR-Produkt enthalten, welches das FLAG-ZIgA-Fusionsprotein kodiert, angereichert worden waren.
  • Zusammen genommen zeigt dieses Beispiel, dass Fusionsproteine, hier durch das Fusionsprotein FLAG-Zwt beispielhaft angeführt, aus einem entsprechenden, auf Kugeln immobilisierten PCR-Produkt durch zellfreie Transkription/Translation hergestellt werden können, die einen funktionellen Affinitätsfusionspartner, hier durch das FLAG-Peptid beispielhaft angeführt, enthält, das fähig ist, zu einer biospezifischen Immobilisierung des Proteins an Kugeln zu führen, die einen zugehörigen Affinitätspartner enthalten, der hier durch den monoklonalen anti-FLAG BioM5-Antikörper beispielhaft angeführt ist, und dass derartige Kugeln, wenn sie mit irrelevanten Kugeln gemischt und zusammen verarbeitet werden, die ein anderes Genprodukt kodierende PCR-Produkte enthalten, durch auf FACS beruhender Anreicherung unter Verwendung einer geeigneten Kombination von Nachweisreagenzien, hier durch ein Kaninchen-anti-DNP IgG-HRP-Konjugat und ein Fluoresceintyramid enthaltendes Signalamplifikationsgemisch beispielhaft angeführt, angereichert werden können.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Selektion eines oder mehrerer gewünschter Polypeptide, umfassend: a) zellfreie Expression von Nukleinsäuremolekülen, die auf einem festen Trägersystem immobilisiert sind, um Polypeptide herzustellen, wobei der feste Träger ein Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit mindestens dem gewünschten Polypeptid oder einem daran befestigten Molekül trägt; b) Abtrennung des festen Trägers, der sowohl das gewünschte Polypeptid als auch die Nukleinsäure, die es kodiert, trägt; und wahlweise c) Gewinnung der Nukleinsäure und/oder des gewünschten Polypeptids.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den exprimierten Polypeptiden um Fusionsproteine handelt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei jedes Fusionsprotein einen variablen Anteil und einen gemeinsamen Anteil umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der gemeinsame Anteil einen Affinitäts-Fusionspartner umfasst, dessen zugehöriger Bindungspartner auf dem festen Träger immobilisiert ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der gemeinsame Anteil eine Reporterproteineinheit umfasst.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei es sich bei dem variablen Anteil um ein Mitglied einer Polypeptidbank handelt.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte (a) und (b) auf iterative Weise mit mehr als einem Zyklus durchgeführt werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Schritte (a) und (b) zwischen 2- und 20-mal durchgeführt werden.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das feste Trägersystem teilchenförmig ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei auf jedem festen Trägerteilchen ein Nukleinsäuremolekül und das Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit mindestens dem gewünschten Polypeptid oder einem daran befestigten Molekül immobilisiert sind.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem immobilisierten Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung um ein Zielmolekül für das gewünschte Polypeptid handelt.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei dem immobilisierten Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung um einen zugehörigen Bindungspartner für einen Affinitätsbindungspartner handelt, der ein Fusionsprotein mit dem gewünschten Polypeptid bildet.
  13. Molekülbank, umfassend ein festes Trägersystem, das eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen darauf immobilisiert hat und ein Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit dem Expresssionsprodukt eines oder mehrerer der Nukleinsäuremoleküle hat, das mit jedem der Nukleinsäuremoleküle zusammenhängt und auch auf dem Trägersystem immobilisiert ist.
  14. Bank nach Anspruch 13, wobei das feste Trägersystem teilchenförmig ist.
  15. Bank nach Anspruch 14, wobei auf jedem festen Trägerteilchen ein Nukleinsäuremolekül und ein Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung mit dem Expressionsprodukt eines oder mehrerer der Nukleinsäuremoleküle immobilisiert sind.
  16. Bank nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem immobilisierten Mittel für eine biospezifische Wechselwirkung um ein Zielmolekül für das Expressionsprodukt eines oder mehrerer der Nukleinsäuremoleküle handelt.
DE60033402T 1999-07-20 2000-07-20 In-vitro-Selektion und wahlweise Identifizierung von Polypeptiden unter Verwendung von festen Trägern Expired - Lifetime DE60033402T2 (de)

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