ES2324512T3 - Seleccion de proteinas mediante el uso de fusiones de proteinas y arn. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una genoteca de proteínas que comprende las etapas de: a) proporcionar una población de moléculas de ARN, cada una de las cuales comprende una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de inicio ligado operativamente a una secuencia codificante de una proteína, y cada una de las cuales está unida covalentemente a un aceptor de péptidos en el extremo 3'' de dicha secuencia codificante de una proteína; siendo dicho aceptor de péptidos una molécula que puede ser añadida al terminal C de una cadena proteica en crecimiento mediante la actividad catalítica de una peptidil-transferasa ribosómica; y b) traducir in vitro dichas secuencias codificantes de proteínas de dichas moléculas de ARN y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN, produciendo así una genoteca de proteínas en la que dicha salinidad elevada comprende un catión monovalente a una concentración de entre 300 mM-1,5M y un catión divalente.

Description

Selección de proteínas mediante el uso de fusiones de proteínas y ARN.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud en tramitación junto a la presente, Szostak al., U.S.S.N. 09/007.005, presentada el 14 de enero de 1998, que reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales Szostak et al., U.S.S.N. 60/064.491, presentada el 6 de noviembre de 1997, actualmente abandonada, y U.S.S.N. 60/035.963, presentada el 21 de enero de 1997, actualmente abandonada.

Esta invención se refiere a procedimientos de selección de proteínas.

La invención se realizó con apoyo del gobierno en virtud de las subvenciones F32 GM17776-01 y F32 GM17776-02. El gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.

Actualmente existen procedimientos para aislar moléculas de ARN y ADN en base a sus funciones. Por ejemplo, los experimentos de Ellington y Szostak (Nature 346: 818 (1990); y Nature 355: 850 (1992)), y Tuerk y Gold (Science 249: 505 (1990); y J. Mol. Biol 222:739 (1991)) han demostrado que es posible aislar moléculas de ácido nucleico muy poco comunes (i.e., menos de 1 en 10^{13}) con propiedades deseadas de mezclas complejas de moléculas mediante series repetidas de selección y amplificación. Estos procedimientos ofrecen ventajas frente a las selecciones genéticas tradicionales en tanto en cuanto (i) se pueden rastrear mezclas candidatas de gran tamaño (> 10^{15}), (ii) la viabilidad de los huéspedes y las condiciones in vivo son irrelevantes e (iii) las selecciones se pueden llevar a cabo incluso sin que tenga lugar un rastreo genético in vivo. El poder de la selección in vitro se ha demostrado en la definición de nuevas secuencias de ARN y ADN con funciones de unión a proteínas muy específicas (véase, por ejemplo, Tuerk y Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol 222:739 (1991); Oliphant et al., Mol. Cell Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et al., Science 250:1104 (1990); Pollock y Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen y Bach, Nuc. Acids Res. 18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529 (1991); Stormo y Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:5699 (1991); y Bock et al., Nature 355:564 (1992)), funciones de unión a moléculas pequeñas (Ellington y Szostak, Nature 346:818 (1990); Ellington y Szostak, Nature 355:850 (1992)), y funciones catalíticas (Green et al., Nature 347:406 (1990); Robertson y Joyce, Nature 344:467 (1990); Beaudry y Joyce, Science 257:635 (1992); Bartel y Szostak, Science 261:1411 (1993); Lorsch y Szostak, Nature 371:31-36 (1994); Cuenoud y Szostak, Nature 375:611-614 (1995); Chapman y Szostak, "Chemistry and Biology" 2:325-333 (1995); y Lohse y Szostak, Nature 381:442-444 (1996)). La selección de proteínas mediante el uso de fusiones de proteínas y ARN se conoce por Roberts et al., 1997, PNAS, 94:12297 y el documento WO98/31700.

Resumen de la invención

El objetivo de la presente invención consiste en permitir la aplicación de los principios de la selección in vitro y la evolución in vitro a las proteínas. La invención facilita el aislamiento de proteínas con propiedades deseadas de mezclas de gran tamaño de secuencias de aminoácidos parcial o completamente aleatorias. Además, la invención resuelve el problema de mejorar la recuperación y la amplificación de información sobre secuencias de proteínas uniendo mediante enlace covalente la secuencia codificante de ARNm a la molécula proteica en condiciones de salinidad elevada.

En general, el procedimiento de la invención consta de un protocolo de transcripción/traducción in vitro o in situ que genera proteínas unidas mediante enlace covalente al extremo 3' de su propio ARNm, i.e., una fusión de proteína y ARN. Esto se logra mediante la síntesis y la traducción in vitro o in situ de una molécula de ARNm con un aceptor de péptidos unido a su extremo 3'. Un aceptor de péptidos preferido es la puromicina, un análogo de nucleósido que se agrega al terminal C de una cadena peptídica en crecimiento y finaliza la traducción. En un diseño preferido, se incluye una secuencia de ADN entre el extremo del mensaje y el aceptor de péptidos, que está diseñado para hacer que el ribosoma se detenga en el extremo del marco de lectura abierto, dando más tiempo para que el aceptor de péptidos (por ejemplo, la puromicina) acepte la cadena peptídica naciente antes de la hidrólisis del enlace peptidil-ARNt.

Si se desea, la fusión de proteína y ARN resultante permite la repetición de series de selección y amplificación, porque la información sobre las secuencias de proteínas se puede recuperar mediante la transcripción inversa y la amplificación (por ejemplo, mediante amplificación por PCR, así como mediante cualquier otra técnica de amplificación, incluyendo técnicas de amplificación basadas en ARN, tales como 3SR o TSA). Entonces el ácido nucleico amplificado puede ser transcrito, modificado y traducido in vitro o in situ para generar fusiones de proteínas y ARNm para la siguiente serie de la selección. La capacidad de llevar a cabo múltiples series de selección y amplificación permite el enriquecimiento y el aislamiento de moléculas muy raras, p. ej., una molécula deseada de una mezcla de 10^{15} miembros. Esto a su vez permite el aislamiento de nuevas o mejores proteínas que reconocen específicamente casi cualquier diana o que catalizan reacciones químicas deseadas.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención muestra un procedimiento para la selección de una proteína deseada que implica las etapas de: (a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína candidata, y cada una de las cuales está unida operativamente a un aceptor de péptidos en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN candidatas; y (c) seleccionar una fusión de proteína y ARN deseada, seleccionando de ese modo la proteína deseada.

En un aspecto relacionado, la invención muestra un procedimiento para la selección de una molécula de ADN que codifica una proteína deseada, que implica las etapas de: (a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína candidata, y cada una de las cuales está unida operativamente a un aceptor de péptidos en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN candidatas; (c) seleccionar una fusión de proteína y ARN deseada; y (d) generar a partir de la parte de ARN de la fusión una molécula de ADN que codifica la proteína deseada.

En otro aspecto relacionado, la invención muestra un procedimiento para la selección de una proteína que tiene una función modificada en comparación con una proteína de referencia que implica las etapas de: (a) producir una población de moléculas de ARN candidatas a partir de una población de moldes de ADN, teniendo cada uno de los moldes de ADN candidatos una secuencia codificante de una proteína candidata que difiere de la secuencia codificante de la proteína de referencia, comprendiendo cada una de las moléculas de ARN una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a la secuencia codificante de la proteína candidata y estando cada una unida operativamente a un aceptor de péptidos en el extremo 3'; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones candidatas de proteínas y ARN; y (c) seleccionar una fusión de proteína y ARN que tenga una función modificada, seleccionando de ese modo la proteína que tenga la función modificada.

En otro aspecto relacionado más, la invención muestra un procedimiento para la selección de una molécula de ADN que codifica una proteína que tiene una función modificada en comparación con una proteína de referencia que implica las etapas de: (a) producir una población de moléculas de ARN candidatas a partir de una población de moldes de ADN candidatos, teniendo cada uno de los moldes de ADN candidatos una secuencia codificante de una proteína candidata que difiere de la secuencia codificante de la proteína de referencia, comprendiendo cada una de las moléculas de ARN una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a la secuencia codificante de la proteína candidata y estando cada una unida operativamente a un aceptor de péptidos en el extremo 3'; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN; y (c) seleccionar una fusión de proteína y ARN que tenga una función modificada; y (d) generar a partir de la parte de ARN de la fusión una molécula de ADN que codifique la proteína que tenga la función modificada.

En otro aspecto más, la invención muestra un procedimiento para la selección de un ARN deseado que implica las etapas de: (a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína candidata, y cada una de las cuales está unida operativamente a un aceptor de péptidos en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ la secuencia codificante de la proteína candidata y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN candidatas; y (c) seleccionar una fusión de proteína y ARN deseada, seleccionando de ese modo ARN deseado.

En realizaciones preferidas de los procedimientos anteriores, el aceptor de péptidos es puromicina; cada una de las moléculas de ARN candidatas incluye además una secuencia de pausa o incluye además una secuencia de ADN o de análogo de ADN unida mediante enlace covalente al extremo 3' del ARN; la población de moléculas de ARN candidatas incluye al menos 10^{9}, preferiblemente, al menos 10^{10}, más preferiblemente, al menos 10^{11}, 10^{12} ó 10^{13}, y lo más preferible, al menos 10^{14} moléculas de ARN diferentes; la reacción de traducción in vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de una célula eucariota o una parte de la misma (y es, por ejemplo, llevada a cabo en un lisado de reticulocito o en un lisado de germen de trigo); la reacción de traducción in vitro se lleva a cabo en un extracto preparado a partir de una célula procariota (por ejemplo, E. coli) o una parte de la misma; la etapa de selección implica la unión de la proteína deseada con un patrón de unión inmovilizado; la etapa de selección implica analizar la actividad funcional de la proteína deseada; la molécula de ADN se amplifica; el procedimiento implica además repetir las etapas de los procedimientos de selección anteriores; el procedimiento implica además transcribir una molécula de ARN a partir de la molécula de ADN y repetir las etapas (a) a (d); tras la etapa de traducción in vitro, el procedimiento implica además una etapa de incubación llevada a cabo en condiciones de salinidad elevada que comprende un catión monovalente a una concentración de entre 300 mM-1,5M y un catión divalente; y la fusión de proteína y ARN incluye además una secuencia de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico colocada próxima al aceptor de péptidos que aumenta la flexibilidad.

En otros aspectos relacionados, la invención muestra una fusión de proteína y ARN seleccionada mediante cualquiera de los procedimientos de la invención; un ácido ribonucleico unido covalentemente mediante un enlace de tipo amida a una secuencia de aminoácidos; estando la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido ribonucleico; y un ácido ribonucleico que incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína candidata, estando el ácido ribonucleico unido operativamente a un aceptor de péptidos (por ejemplo, puromicina) en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína candidata.

En un segundo aspecto, la invención muestra un procedimiento para la selección de una proteína deseada o un ARN deseado mediante el enriquecimiento de una mezcla de secuencias. Este procedimiento implica las etapas de: (a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de iniciación unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína candidata y cada una de las cuales está unida operativamente a un aceptor de péptidos por el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones candidatas de proteínas y ARN; (c) poner en contacto la población de fusiones de proteínas y ARN con un patrón de unión específico de bien la parte de ARN o la parte proteica de la fusión de proteína y ARN en condiciones que separan sustancialmente los complejos de patrón de unión-fusión de proteína y ARN de los miembros no unidos de la población; (d) liberar las fusiones de proteína y ARN unidas de los complejos; y (e) poner en contacto la población de fusiones de proteínas y ARN de la etapa (d) con un patrón de unión específico de la parte proteica de la fusión de proteína y ARN deseada en condiciones que separan sustancialmente el complejo de patrón de unión-fusión de proteína y ARN
de los miembros sin unir de dicha población, seleccionando de ese modo la proteína deseada y el ARN deseado.

En realizaciones preferidas, el procedimiento implica además repetir las etapas (a) a (e). Además, para estas etapas repetidas, se pueden usar los mismos patrones de unión o diferentes, en cualquier orden, para el enriquecimiento selectivo de la fusión de proteína y ARN deseada. En otra realización preferida, la etapa (d) implica el uso de un patrón de unión (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) específico de la parte proteica de la fusión deseada. Esta etapa se lleva a cabo preferiblemente tras la transcripción inversa de la parte de ARN de la fusión para generar un ADN que codifique la proteína deseada. Si se desea, se puede aislar este ADN y/o amplificar por PCR. Se puede usar esta técnica de enriquecimiento para seleccionar una proteína deseada o se puede usar para seleccionar una proteína que tenga una función modificada en comparación con una proteína de referencia.

En otras realizaciones preferidas de los procedimientos de enriquecimiento, el aceptor de péptidos es puromicina; cada una de las moléculas de ARN candidatas incluye además una secuencia de pausa o incluye además una secuencia de ADN o de análogo de ADN unida mediante enlace covalente al extremo 3' del ARN; la población de moléculas de ARN candidatas incluye al menos 10^{9}, preferiblemente, al menos 10^{10}, más preferiblemente, al menos 10^{11}, 10^{12} ó 10^{13}, y lo más preferible, al menos 10^{14} moléculas de ARN diferentes; la reacción de traducción in vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de una célula eucariota o una parte de la misma (y es, por ejemplo, llevada a cabo en un lisado de reticulocito o en un lisado de germen de trigo); la reacción de traducción in vitro se lleva a cabo en un extracto preparado a partir de una célula procariota o una parte de la misma (por ejemplo, E. coli); la molécula de ADN se amplifica; se inmoviliza al menos uno de los patrones de unión sobre un soporte sólido; tras la etapa de traducción in vitro, el procedimiento implica además una etapa de incubación llevada a cabo en presencia de Mg^{2+} 50-100 mM; y la fusión de proteína y ARN incluye además una secuencia de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico colocada próxima al aceptor de péptidos que aumenta la flexibilidad.

La invención muestra procedimientos para producir genotecas (por ejemplo, genotecas de proteínas, ADN o de fusiones con ARN) o procedimientos para la selección de moléculas deseadas (por ejemplo, moléculas de proteínas, ADN o ARN, o moléculas que tienen una determinada función o una función modificada) que implican una etapa de incubación posterior a la traducción en presencia de una salinidad elevada (incluyendo, sin limitación, una salinidad elevada que incluye un catión monovalente, tal como K^{+}, NH_{4}^{+} o Na^{+}, y un catión divalente, tal como Mg^{+2}). Esta incubación se puede llevar a cabo a aproximadamente la temperatura ambiente o a aproximadamente -20ºC y a concentraciones de sales preferidas de entre aproximadamente 300 mM-1,5M (más preferiblemente, de entre 300 mM-600 mM) para cationes monovalentes y de entre 25 mM-200 mM para cationes divalentes.

En otro aspecto relacionado, la invención muestra equipos para llevar a cabo cualquiera de los procedimientos de selección descritos en la presente memoria.

En un tercer y último aspecto, la invención muestra un microchip que incluye un alineamiento de ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados, estando los ácidos nucleicos hibridados con fusiones de proteínas y ARN. Preferiblemente, el componente proteico de la fusión de proteína y ARN está codificado por el ARN.

Como se usa en la presente memoria, "población" pretende significar más de una molécula (por ejemplo, más de una molécula de ARN, ADN o de fusión de proteína y ARN). Debido a que los procedimientos de la invención facilitan las selecciones que comienzan, si se desea, con grandes números de moléculas candidatas, una "población" según la invención significa preferiblemente más de 10^{9} moléculas, más preferiblemente, más de 10^{11}, 10^{12} ó 10^{13} moléculas, y lo más preferible, más de 10^{13} moléculas.

"Seleccionar" pretende significar separar sustancialmente una molécula de otras moléculas de una población. Como se usa en la presente memoria, una etapa de "selección" proporciona al menos un enriquecimiento del doble, preferiblemente, 30 veces mayor, más preferiblemente, 100 veces mayor y, lo más preferible, 1.000 veces mayor de una molécula deseada en comparación con moléculas no deseadas de una población tras la etapa de selección. Como se indica en la presente memoria, una etapa de selección se puede repetir cualquier número de veces y se pueden combinar diferentes tipos de etapas de selección en un determinado enfoque.

"Proteína" pretende significar dos o más aminoácidos cualesquiera naturales o modificados unidos por uno o más enlaces peptídicos. "Proteína" y "péptido" se usan indistintamente en la presente memoria.

"ARN" pretende significar una secuencia de dos o más ribonucleótidos naturales o modificados unidos covalentemente. Un ejemplo de un ARN modificado incluido en este término es el ARN de fosforotioato.

Una "secuencia de iniciación de la traducción" pretende significar cualquier secuencia que sea capaz de proporcionar un sitio de entrada al ribosoma funcional. En sistemas bacterianos, esta región se denomina a veces secuencia de Shine-Dalgarno.

Un "codón de iniciación" pretende significar tres bases que señalan el comienzo de una secuencia codificante de una proteína. Generalmente, estas bases son AUG (o ATG); sin embargo, se pueden sustituir por cualquier otro triplete de bases capaz de ser utilizado de esta manera.

"Unido covalentemente" a un aceptor de péptidos pretende significar que el aceptor de péptidos está unido a una "secuencia codificante de una proteína" bien directamente a través de un enlace covalente o indirectamente a través de otra secuencia unida mediante enlace covalente (por ejemplo, ADN correspondiente a un sitio de pausa).

Un "aceptor de péptidos" pretende significar cualquier molécula capaz de ser agregada al terminal C de una cadena proteica en crecimiento mediante la actividad catalítica de la función peptidil-transfereasa ribosómica. Comúnmente, tales moléculas contienen (i) un nucleótido o un resto de tipo nucleótido (por ejemplo, adenosina o un análogo de adenosina (la dimetilación en la posición N-6 es aceptable)), (ii) un aminoácido o un resto de tipo aminoácido (por ejemplo cualquiera de los 20 D- o L-aminoácidos o cualquier análogo de aminoácido de los mismos (por ejemplo, O-metil-tirosina o cualquiera de los análogos descritos por Ellman et al., Meth. Enzymol. 202: 301,1991), e (iii) un enlace entre los dos (por ejemplo, un enlace tipo éster, amida o cetona en la posición 3' o, menos preferiblemente, en la posición 2'); preferiblemente, este enlace no perturba significativamente el fruncido del anillo de la configuración de ribonucleótido natural. Los aceptores de péptidos también pueden poseer un nucleófilo, que puede ser, sin limitación, un grupo amino, un grupo hidroxilo o un grupo sulfhidrilo. Además, los aceptores de péptidos pueden estar compuestos por miméticos de nucleótido, miméticos de aminoácido o miméticos de la estructura combinada de nucleótido-aminoácido.

Un aceptor de péptidos que está situado "en el extremo 3'" de una secuencia codificante de una proteína pretende significar que la molécula aceptora de péptidos está colocada detrás del codón final de esa secuencia codificante de la proteína. Este término incluye, sin limitación, una molécula aceptora de péptidos que está colocada exactamente en el extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína, así como una que está separada del codón final por una secuencia codificante o no codificante intercalada (por ejemplo, una secuencia correspondiente a un sitio de pausa). Este término también incluye constructos en los que las secuencias codificantes o no codificantes siguen (es decir, están en 3' con respecto) a la molécula aceptora de péptidos. Además, este término engloba, sin limitación, una molécula aceptora de péptidos que está unida covalentemente (bien directa o indirectamente a través de una secuencia de ácido nucleico intercalada) con la secuencia codificante de la proteína, así como una que es unida con la secuencia codificante de la proteína mediante algún medio no covalente, por ejemplo, mediante hibridación usando una segunda secuencia de ácido nucleico que se une a o está cerca del extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína, estando ella misma unida con una molécula aceptora de péptidos.

Una "función modificada" pretende significar cualquier cambio cualitativo o cuantitativo en la función de una molécula.

Una "secuencia de pausa" pretende significar una secuencia de ácido nucleico que hace que un ribosoma disminuya o detenga su velocidad de traducción.

"Patrón de unión", como se usa en la presente memoria, pretende significar cualquier molécula que tiene una afinidad específica, covalente o no covalente, por una parte de una fusión de proteína y ARN deseada. Los ejemplos de patrones de unión incluyen, sin limitación, miembros de pares de antígeno/anticuerpo, pares de proteína/inhibidor, pares de receptor/ligando (por ejemplo, pares de receptor de la superficie celular/ligando, tales como pares de receptor hormonal/hormona peptídica), pares de enzima/sustrato (por ejemplo, pares de quinasa/sustrato), pares de lectina/hidrato de carbono, agregados de proteínas oligoméricas o heterooligoméricas, pares de proteína de unión al ADN/sitio de unión al ADN, pares de ARN/proteína y dúplex de ácidos nucleicos, heterodúplex o cadenas unidas, así como cualquier molécula que sea capaz de formar uno o más enlaces covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces de tipo disulfuro) con cualquier parte de una fusión de proteína y ARN. Los patrones de unión incluyen, sin limitación, cualquiera de los "motivos de selección" presentados en la figura 2.

"Soporte sólido" pretende significar, sin limitación, cualquier columna (o material de columna), perla, tubo de ensayo, placa de microvaloración, partícula sólida (por ejemplo, agarosa, o sefarosa), microchip (por ejemplo, silicona, vidrio de silicona o chip de oro) o membrana (por ejemplo, la membrana de un liposoma o una vesícula) a la que se puede unir un complejo de afinidad, bien directa o indirectamente (por ejemplo, a través de otros patrones de unión intermedios tales como anticuerpos o proteína A), o en los que se puede introducir un complejo de afinidad (por ejemplo, a través de un receptor o un canal).

"Salinidad elevada" pretende significar que tiene una concentración de un catión monovalente de al menos 300 mM, y preferiblemente, de al menos 500 mM o incluso 1M, y una concentración de un catión divalente o de valencia superior de al menos 25 mM, preferiblemente, de al menos 50 mM, y lo más preferible, de al menos 100 mM.

La invención aquí reivindicada proporciona un número de ventajas significativas. Para empezar, se trata del primer ejemplo de este tipo de esquema para la selección y la amplificación de proteínas. Esta técnica supera el punto muerto creado por la necesidad de recuperar secuencias de nucleótidos correspondientes a proteínas aisladas deseadas (pues sólo se pueden replicar ácidos nucleicos). En concreto, muchos procedimientos anteriores que permiten el aislamiento de proteínas de mezclas parcial o completamente aleatorizadas lo hicieron mediante una etapa in vivo. Los procedimientos de este tipo incluyen tecnología con anticuerpos monoclonales (Milstein, Sci. Amer. 243: 66 (1980); y Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)), visualización de fagos (Smith, Science 228:1315 (1985); Parmley y Smith, Gene 73:305 (1988); y McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)), fusiones de péptidos-represor lac (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:1865 (1992)), y selecciones genéticas clásicas. A diferencia de la presente técnica, cada uno de estos procedimientos se basa en un enlace topológico entre la proteína y el ácido nucleico tal que la información de la proteína se conserva y se puede recuperar en forma de ácido nucleico legible.

Además, la presente invención proporciona ventajas frente al procedimiento de traducción estancado (Tuerk y Gold, Science 249: 505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol 222:739 (1991); Korman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 79:1844-1848 (1982); Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:9022-9026 (1994); Mattheakis et al., Meth. Enzymol. 267:195 (1996); y Hanes y Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94:4937 (1997)), una técnica en la que la selección es para alguna propiedad de una cadena proteica naciente que todavía forma un complejo con el ribosoma en su ARNm. A diferencia de la técnica de traducción estancada, el presente procedimiento no se basa en mantener la integridad de un complejo terciario de ARNm:ribosoma:cadena naciente, un complejo que es muy frágil y que, por tanto, es restrictivo en cuanto a los tipos de selecciones que son técnicamente viables.

El presente procedimiento también proporciona ventajas frente al enfoque de síntesis ramificado propuesto por Brenner y Lemer (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:5381-5383 (1992)), en el que se generan fusiones de péptidos y ADN, y la información genética se recupera teóricamente tras una serie de selección. A diferencia del enfoque de síntesis ramificado, el presente procedimiento no necesita la regeneración de un péptido a partir de una parte de ADN de una fusión (que, en el enfoque de síntesis ramificado, se realiza generalmente mediante series individuales de síntesis química). Por consiguiente, el presente procedimiento permite la repetición de series de selección usando poblaciones de moléculas candidatas. Además, a diferencia de la técnica de síntesis ramificada, que está generalmente limitada a la selección de secuencias bastante cortas, el presente procedimiento es aplicable a la selección de moléculas de proteínas de una longitud considerable.

En otra ventaja más, la presente técnica de selección y evolución dirigida puede hacer uso de genotecas complejas y de tamaño muy elevado de secuencias candidatas. Por el contrario, los procedimientos de selección de proteínas existentes que se basan en una etapa in vivo se limitan comúnmente a genotecas relativamente pequeñas de una complejidad algo limitada. Esta ventaja es particularmente importante al seleccionar secuencias de proteínas funcionales teniendo en cuenta que, por ejemplo, existen 10^{13} secuencias posibles para un péptido de una longitud de sólo 10 aminoácidos. En las técnicas genéticas clásicas, los enfoques de fusión con el represor lac y los procedimientos de visualización de fagos, las complejidades máximas caen en órdenes de magnitud por debajo de 10^{13} miembros. Un tamaño de genoteca grande también es ventajoso para las aplicaciones de evolución dirigida, en tanto en cuanto se puede explorar el espacio secuencial con mayor profundidad en torno a una determinada secuencia de inicio.

La presente técnica también difiere de los enfoques anteriores en que la etapa de selección es independiente del contexto. En muchos otros esquemas de selección, el contexto en el que, por ejemplo, está presente una proteína expresada puede influir profundamente en la naturaleza de la genoteca generada. Por ejemplo, una proteína expresada puede no estar expresada adecuadamente en un determinado sistema o puede no ser visualizada adecuadamente (por ejemplo, sobre la superficie de una partícula de fago). Alternativamente, la expresión de una proteína puede interferir realmente en una o más etapas fundamentales de un ciclo de selección, p. ej., la viabilidad o la infectividad de los fagos, o la unión del represor lac. Estos problemas pueden dar como resultado la pérdida de moléculas funcionales o limitaciones sobre la naturaleza de los procedimientos de selección que se pueden aplicar.

Finalmente, el presente procedimiento es ventajoso porque proporciona un control frente al repertorio de proteínas que se pueden analizar. En determinadas técnicas (por ejemplo, la selección de anticuerpos), hay poco o ningún control sobre la naturaleza de la mezcla inicial. En otras técnicas más (por ejemplo, las fusiones con lac y la visualización de fagos), la mezcla candidata debe ser expresada en el contexto de una proteína de fusión. Por el contrario, los constructos de fusión de proteína y ARN proporcionan un control sobre la naturaleza de las mezclas candidatas disponibles para el rastreo. Además, el tamaño de la mezcla candidata tiene el potencial de ser tan elevado como las mezclas de ARN o ADN (\sim 10^{15} miembros), sólo limitado por el tamaño de la reacción de traducción in vitro realizada. Y la composición de la mezcla candidata depende completamente del diseño experimental; las regiones aleatorias se pueden rastrear en aislamiento o dentro del contexto de la proteína de fusión deseada, y más si no se pueden expresar todas las secuencias posibles en las mezclas candidatas de las fusiones de proteínas y ARN.

Hay otras características y ventajas de la invención que resultarán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción detallada

Primero se describirán brevemente las figuras.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1C son representaciones esquemáticas de las etapas implicadas en la producción de fusiones de proteínas y ARN. La figura 1A ilustra un constructo de ADN de muestra para la generación de una parte de ARN de una fusión; la figura 1B ilustra la generación de un conjugado de ARN/puromicina; y la figura 1C ilustra la generación de una fusión de proteína y ARN.

La Figura 2 es una representación esquemática de un protocolo de selección generalizado según la invención.

La Figura 3 es una representación esquemática de un protocolo de síntesis para los moldes de traducción mínimos que contienen puromicina en 3'. La etapa (A) muestra la adición de grupos protectores en los grupos funcionales reactivos sobre puromicina (OH de 5' y NH_{2}); según lo modificado, estos grupos están protegidos adecuadamente para su uso en síntesis de oligonucleótidos basada en fosforamidita. La puromicina protegida fue unida a vidrio de poro controlado (CPG) con aminohexilo a través de un grupo OH de 2' usando el protocolo estándar para la unión de ADN a través de su OH de 3' (Gait, "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series" (IRL Press, Oxford, 1984)). En la etapa (B), se sintetizó un molde de traducción mínimos (denominado "43-P"), que contenía 43 nucleótidos usando química de ARN y ADN estándar (Millipore, Bedford, MA), se desprotegió usando NH_{4}OH y TBAF, y se purificó sobre gel. El molde contenía 13 bases de ARN en el extremo 5' seguidas por 29 bases de ADN unidas a la puromicina de 3' de su OH de 5'. La secuencia de ARN contenía (i) una secuencia consenso de Shine-Dalgarno complementaria a cinco bases de ARNr de 16S (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine y Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 71: 1342-1346 (1974); y Steitz y Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72: 4734-4738 (1975)), (ii) un espaciador de cinco bases e (iii) un codón de iniciación de una sola AUG. La secuencia de ADN era dA_{27}dCdCP, en la que "P" es puromicina.

La Figura 4 es una representación esquemática de un procedimiento preferido para la preparación de puromicina protegida enlazada con CPG.

La Figura 5 es una representación esquemática que muestra los posibles modos de incorporar metionina en un molde de la invención. Según lo mostrado en la reacción (A), el molde se une al ribosoma permitiendo la formación del complejo de iniciación de 70S. El ARNt de Fmet se une al sitio P y se aparea con el molde. La puromicina del extremo 3' del molde se introduce en el sitio A de un modo intramolecular y forma un enlace de tipo amida con la N-formil-metionina por el centro peptidil-transferasa, desacilando de ese modo el ARNt. La extracción en fenol/cloroformo de la reacción proporciona el molde con metionina unida covalentemente. En la reacción (B), se muestra una reacción intermolecular no deseada del molde con puromicina que contiene oligonucleótidos. Como antes, el molde mínimo estimula la formación del ribosoma 70S que contiene ARNt de fmet unido al sitio P. A esto le sigue la entrada de un segundo molde en trans para proporcionar una metionina unida mediante enlace covalente.

Las Figuras 6A-6H son fotografías que muestran La incorporación de ^{35}S-metionina (^{35}S-met) en moldes de traducción. La figura 6A demuestra la dependencia que tiene la reacción del magnesio (Mg^{2+}). La figura 6B demuestra la estabilidad de las bases del producto; el cambio de movilidad mostrado en esta figura se corresponde con una pérdida de la secuencia de ARN de 5' de 43-P (también denominado "molde Met") para producir una parte de puromicina del ADN, denominada 30-P. La retención del marcador tras el tratamiento de las bases coincidió con la formación de un enlace peptídico entre la ^{35}S-metionina y la puromicina de 3' del molde. La figura 6C demuestra la inhibición de la formación de producto en presencia de inhibidores de la peptidil-transferasa. La figura 6D demuestra la dependencia de la incorporación de ^{35}S-metionina sobre una secuencia codificante del molde. La figura 6E demuestra la dependencia que tiene la incorporación de ^{35}S-metionina de la longitud del molde de ADN. La figura 6F ilustra la formación de producto cis frente a trans usando moldes 43-P y 25-P. La figura 6G ilustra la formación de producto cis frente a trans usando los moldes 43-P y 13-P. La figura 6H ilustra la formación de producto cis frente a trans usando los moldes 43-P y 30-P en un sistema de lisados de reticulocito.

Las Figuras 7A-7C son ilustraciones esquemáticas de constructos para analizar la formación y la selección de fusiones de péptidos. La figura 7A muestra LP77 ("producto ligado" de "77" nucleótidos de longitud) (también denominado "molde de myc corto") (SEC ID N.º 1). Esta secuencia contiene la etiqueta de epítopo de anticuerpo monoclonal frente a c-myc EQKLISEEDL (SEC ID N.º 2) (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5: 3610-3616 (1985)) flanqueada por un codón de iniciación de 5' y un ligador de 3'. La región de 5' contiene una secuencia bacteriana de Shine-Dalgarno idéntica a la de 43-P. La secuencia codificante fue optimizada para la traducción en sistemas bacterianos. En concreto, las UTR de 5' de 43-P y LP77 contenían una secuencia de Shine-Dalgarno complementaria a cinco bases de ARNr de 16S (Steitz y Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72: 4734-4738 (1975)) y estaban espaciadas similarmente a las secuencias de proteínas ribosómicas (Stormo et al, Nucleic Acids Res. 10: 2971-2996 (1982)). La figura 7B muestra LP154 ("producto ligado" de 154 nucleótidos de longitud) (también denominado "molde de myc largo") (SEC ID N.º 3). Esta secuencia contiene el código para la generación del péptido usado para aislar el anticuerpo frente a c-myc. El extremo 5' contiene una versión truncada de la secuencia arriba del TMV (denominada "TE"). Esta UTR de 5' contenía una secuencia de 22 nucleótidos derivada de la UTR de 5' del TMV que engloba dos repeticiones directas de ACAAAUUAC (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 16: 883 (1988)). La figura 7C muestra la mezcla n.º 1 (SEC ID N.º 4), una secuencia ejemplar para usarla en la selección de péptidos. Los siete últimos aminoácidos del péptido myc original fueron incluidos en el molde para que sirvieran como la región constante de 3' necesaria para la amplificación por PCR del molde. Se sabe que esta secuencia no forma parte del epítopo de unión a anticuerpos.

La Figura 8 es una fotografía que demuestra la síntesis de fusiones de proteínas y ARN usando los moldes 43-P, LP77 y LP154, y sistemas de traducción de reticulocito ("Retic") y de germen de trigo ("Trigo"). La mitad izquierda de la figura ilustra la incorporación de ^{35}S-metionina en cada uno de los tres moldes. La mitad derecha de la figura ilustra los productos resultante tras el tratamiento con RNasa A de cada uno de los tres moldes para eliminar la región codificante de ARN; se muestran las fusiones de proteínas y ADN marcadas con ^{35}S-metionina. La parte de ADN de cada una era idéntica al oligo 30-P. De este modo, las diferencias en la movilidad eran proporcionales a la longitud de las regiones codificantes, coincidiendo con la existencia de proteínas de diferente longitud en cada caso.

La Figura 9 es una fotografía que demuestra la sensibilidad a la proteasa de una fusión de proteína y ARN sintetizada desde LP154 y analizada mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante. El carril 1 contiene 30-P marcado con ^{32}P. Los carriles 2-4, 5-7 y 8-10 contienen los moldes de traducción marcados con ^{35}S recuperados de las reacciones con lisados de reticulocito bien sin tratamiento, con tratamiento de RNasa A o con tratamiento de RNasa A y proteinasa K, respectivamente.

La Figura 10 es una fotografía que muestra los resultados de las reacciones de inmunoprecipitación usando proteína epítopo myc de 33 aminoácidos traducida in vitro. Los carriles 1 y 2 muestran los productos de traducción de la proteína epítopo myc y los moldes de \beta-globina, respectivamente. Los carriles 3-5 muestran los resultados de la inmunoprecipitación del péptido epítopo myc usando un anticuerpo monoclonal frente a c-myc y tampones de lavado de PBS, DB y PBSTDS, respectivamente. Los carriles 6-8 muestran las mismas reacciones de inmunoprecipitación, pero usando el producto de traducción de \beta-globina.

La Figura 11 es una fotografía que demuestra la inmunoprecipitación de una fusión de proteína y ARN a partir de una reacción de traducción in vitro. Se indican los picomoles de molde usados en la reacción. Los carriles 1-4 muestran ARN124 (la parte de ARN de la fusión LP154) y los carriles 5-7 muestran la fusión de proteína y ARN LP154. Tras la inmunoprecipitación en la que se usa anticuerpo monoclonal frente a c-myc y proteína sefarosa G, se trataron las muestras con RNasa A y polinucleótido quinasa de T4, luego se cargaron sobre gel de poliacrilamida de urea desnaturalizante para visualizar la fusión. En los carriles 1-4, con muestras que contenían bien nada de molde o sólo la parte de ARN del molde de myc largo (ARN124), no se observó fusión alguna. En los carriles 5-7, las bandas correspondientes a la fusión se visualizaron claramente. Se indica la posición de 30-P marcado con ^{32}P y la cantidad de de molde de entrada se indica en la parte superior de la figura.

La Figura 12 es una gráfica que muestra una cuantificación de material de fusión obtenido a partir de una reacción de traducción in vitro. La intensidad de las bandas de fusión mostradas en los carriles 5-7 de la figura 11 y de la banda de 30-P (aislada en un modo en paralelo sobre dT_{25}, no mostrado) fueron cuantificadas sobre placas de tipo Phosphorimager y representadas como una función de la concentración de entrada de LP154. El 30-P modificado recuperado (eje y de la izquierda) era linealmente proporcional al molde de entrada (eje x), mientras que fusión de ligador-péptido (eje y de la derecha) se mantuvo constante. A partir de este análisis, se calculó la formación de \sim10^{12} fusiones por ml de muestra de reacción de traducción.

La Figura 13 es una representación esquemática de la tiopropil-sefarosa y la dT_{25}-agarosa, y de la capacidad de estos sustratos para interactuar con las fusiones de proteínas y ARN de la invención.

La Figura 14 es una fotografía que muestra los resultados del aislamiento secuencial de las fusiones de la invención. El carril 1 contiene 30-P marcado con ^{32}P. Los carriles 2 y 3 muestran LP154 aislado de reacciones de traducción y tratada con RNasa A. En el carril 2, se aisló LP154 consecutivamente usando tiopropil-sefarosa seguida de dT_{25}-agarosa. El carril 3 muestra el aislamiento usando sólo dT_{25}-agarosa. Los resultados indicaron que el producto contenía un tiol libre, probablemente la penúltima cisteína de la secuencia codificante del epítopo myc.

Las Figuras 15A y 15B son fotografías que muestran la formación de los productos de fusión usando moldes de \beta-globina según lo analizado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS-tricina. La figura 15A muestra la incorporación de ^{35}S usando bien nada de molde (carril 1), un molde de sin-\beta-globina (carriles 2-4) o un molde de LP-\beta-globina (carriles 5-7). La figura 15B (carriles marcados como en la Fig. 15A) muestra material marcado con ^{35}S aislado mediante cromatografía de afinidad de oligonucleótidos. No se aisló ningún material en ausencia de una cola de 30-P (carriles 2-4).

Las Figuras 16A-16C son diagramas y fotografías que ilustran el enriquecimiento de ADNbc de myc frente al ADNbc de la mezcla mediante una selección in vitro. La figura 16A es un esquema del protocolo de selección. Se tradujeron in vitro cuatro mezclas de moldes de myc y de mezcla, y se aislaron sobre dT_{25}-agarosa seguida por TP-sefarosa para purificar las fusiones de molde de los moldes sin modificar. Entonces se transcribieron de forma inversa las fusiones de péptidos y ARNm para eliminar cualquier estructura secundaria o terciaria presente en los moldes. Se eliminaron las alícuotas de cada mezcla tanto antes (figura 16B) como después (figura 16C) de la selección por afinidad, se amplificaron por PCR en presencia de un cebador marcado y se digirieron con una enzima de restricción que sólo escindió el ADN de myc. Las mezclas de los moldes de entrada eran myc puro (carril 1) o myc:mezcla en una proporción de 1:20; 1:200 ó 1:2000 (carriles 2-4). El material sin seleccionar se desvió de las proporciones de entrada debido a la traducción preferencial y a la transcripción inversa del molde de myc. El enriquecimiento del molde de myc durante la etapa selectiva se calculó a partir del cambio de la proporción de mezcla:myc antes y después de la selección.

La Figura 17 es una fotografía que ilustra la traducción de los moldes de ARN de myc. Se usaron los siguientes ligadores: carriles 1-4: dA_{27}dCdCP; carriles 5-8: dA_{27}rCrCP; y carriles 9-12: dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP. En cada carril, la concentración del molde de ARN era de 600 nM y se usó ^{35}S-Met para el marcaje. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: carriles 1, 5 y 9: 30ºC durante 1 hora; carriles 2, 6 y 10: 30ºC durante 2 horas; carriles 3, 7 y 11: 30ºC durante 1 hora; -20ºC durante 16 horas; y carriles 4, 8 y 12: 30ºC durante 1 hora, -20ºC durante 16 horas con Mg^{2+} 50 mM. En esta figura, "A" representa péptido libre y "B" representa fusión de péptido y ARNm.

La Figura 18 es una fotografía que ilustra la traducción de los moldes de ARN de myc marcados con ^{32}P. El ligador utilizado fue Da_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP. La traducción se realizó a 30ºC durante 90 minutos y las incubaciones se llevaron a cabo a -20ºC durante 2 días sin más Mg^{2+}. Las concentraciones de moldes de ARNm fueron de 400 nM (carril 3), 200 nM (carril 4), 100 nM (carril 5) y 100 nM (carril 6). El carril 1 muestra la fusión de péptido y ARNm marcada con ^{35}S-Met. El carril 2 muestra ARNm marcado con ^{32}P. En el carril 6, la reacción se llevó a cabo en presencia de análogo de cap 0,5 mM.

La Figura 19 es una fotografía que ilustra la traducción de molde de ARN de myc usando lisado obtenido en Ambion (carril 1), Novagen (carril 2) y Amersham (carril 3). El ligador utilizado fue Da_{27}dCdCP. La concentración del molde fue de 600 nM y se usó ^{35}S-Met para el marcaje. Las traducciones se realizaron a 30ºC durante 1 minutos y las incubaciones se llevaron a cabo a -20ºC durante una noche en presencia de Mg^{2+} 50 mM.

La Figura 20 es una gráfica que ilustra el enriquecimiento de fusiones de péptidos y ARN unidas por el anticuerpo monoclonal anti-myc 9E10 durante seis series de selección in vitro.

La Figura 21 es una gráfica que muestra los ensayos de competición con péptidos myc sintéticos.

La Figura 22 es una representación esquemática que ilustra las secuencias de aminoácidos de 12 péptidos seleccionados de una genoteca de 27 meros aleatorios.

La Figura 23 es una fotografía que ilustra el efecto de la longitud del ligador sobre la formación de fusiones. En esta figura, los moldes de Myc que contenían ligadores de longitud [N] = 13, 19, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos (dA_{10-47}dCdCP) se analizaron en cuanto a la formación de fusiones por electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS. También se muestra el ligador flexible F (Da_{21}[C9]_{3}dAdCdCP). Las traducciones se realizaron con molde 600 nM a 30ºC durante 90 minutos, seguidas por la adición de Mg^{+2} 50 mM e incubaciones a -20ºC durante dos días.

La Figura 24 es una fotografía que ilustra la co-traducción de ARNm de myc y \lambdaPPasa. En esta figura se tradujeron 200 nM de ARN de \lambdaPPasa (ARN716) y/o 50 nM de ARN de myc (ARN152) que contenía el ligador flexible F (dA_{21}[C9]_{3}dAdCdCP) con [^{35}S]-Met. Se añadió Mg^{+2} (75 mM), seguido por la incubación a -20ºC. No se observaron bandas procedentes de los productos cruzados (fusión de los moldes de myc con proteína \lambdaPPasa).

En la presente memoria, se describe un procedimiento general para la selección de proteínas con funciones deseadas usando fusiones en las que estas proteínas están unidas covalentemente con sus propios ARN mensajeros. Estas fusiones de proteínas y ARN se sintetizan mediante la traducción in vitro o in situ de mezclas de ARNm que contienen un aceptor de péptidos unido a su extremos 3' (figura 1B). En una realización preferida, tras la translectura del marco de lectura abierto del mensaje, el ribosoma se detiene cuando llega al sitio de pausa diseñado y el resto aceptor ocupa el sitio A ribosómico y acepta la cadena peptídica naciente del peptidil-ARNt del sitio P para generar la fusión de proteína y ARN (figura 1C). El enlace covalente entre la proteína y el ARN (en forma de un enlace de tipo amida entre el extremo 3' del ARNm y el terminal C de la proteína que codifica) permite la recuperación de la información genética de la proteína y su amplificación (p. ej., por PCR) seguida por la selección mediante una transcripción inversa del ARN. Una vez generada la fusión, se lleva a cabo la selección o el enriquecimiento en base a las propiedades de la fusión de proteína y ARNm o, alternativamente, se puede llevar a cabo la transcripción inversa usando el molde de ARNm mientras está unido a la proteína para evitar cualquier efecto del ARN monocatenario sobre la selección. Cuando se usa el constructo de proteína y ARNm, se pueden analizar las fusiones seleccionadas para determinar qué resto (la proteína, el ARN o ambos) proporciona la función deseada.

En una realización preferida, la puromicina (que se parece a la tirosil-adenosina) actúa como el aceptor para unir el péptido en crecimiento con su ARNm. La puromicina es un antibiótico que actúa terminando el alargamiento del péptido. Como mimético del ARNt de aminoacilo, actúa como un inhibidor universal de la síntesis de proteínas mediante la unión del sitio A, aceptando la cadena peptídica en crecimiento y soltándose del ribosoma (a una Kd = 10^{-4}M) (Traut y Monro, J. Mol. Biol. 10: 63 (1964); Smith et al., J. Mol. Biol. 13:617 (1965)). Una de las características más atractivas de la puromicina es el hecho de que forma un enlace de tipo amida estable con la cadena peptídica en crecimiento, permitiendo así más fusiones estables que aceptores potenciales que formen enlaces tipo éster inestables. En concreto, la molécula de peptidil-puromicina contiene un enlace de tipo amida estable entre el péptido y la parte de O-metil-tirosina de la puromicina. La O-metil-tirosina está a su vez ligada por un enlace de tipo amida estable con el grupo amino de 3' de la parte de adenosina modificada de la puromicina.

Otras posibles elecciones de aceptores incluyen estructuras de tipo ARNt en el extremo 3' del ARNm, así como otros compuestos que actúan de una manera similar a la puromicina. Tales compuestos incluyen, sin limitación, cualquier compuesto que posea un aminoácido enlazado a una adenina o a un compuesto de tipo adenina, tal como, los nucleótidos de aminoácido, fenilalanil-adenosina (A-Phe), tirosil-adenosina (A-Tyr) y alanil-adenosina (A-Ala), así como estructuras enlazadas a amida tales como fenilalanil-3'-desoxi-3'-amino-adenosina, alanil-3'-desoxi-3'-amino-adenosina y tirosil-3'-desoxi-3'-amino-adenosina; en cualquiera de estos compuestos, se puede utilizar cualquiera de los L-aminoácidos naturales o sus análogos. Además, también se puede usar en la invención un conjugado de puromicina con estructura de 3' de tipo ARNt combinado.

En la figura 2, se muestra el esquema de selección preferido según la invención. Las etapas implicadas en esta selección se llevan a cabo generalmente como se explica a continuación.

Etapa 1 Preparación del molde de ADN

Como etapa hacia la generación de fusiones de proteínas y ARN de la invención, se sintetiza la parte de ARN de la fusión. Esto se puede realizar mediante una síntesis de ARN química directa, o más comúnmente, mediante la transcripción de un molde de ADN bicatenario apropiado.

Tales moldes de ADN se pueden crear mediante cualquier técnica estándar (incluyendo cualquier técnica de tecnología de ADN recombinante, síntesis química o ambas). En principio, se puede usar a este efecto cualquier procedimiento que permita la producción de uno o más moldes que contengan una secuencia aleatoria, aleatorizada o mutagenizada conocida. En un enfoque particular, se sintetiza un oligonucleótido (por ejemplo, que contenga bases aleatorias) y se amplifica (por ejemplo, por PCR) antes de la transcripción. También se puede usar la síntesis química para producir un casete aleatorio que luego sea insertado en la mitad de una secuencia codificante de una proteína conocida (véase, por ejemplo, capítulo 8.2, Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons y Greene Publishing Company, 1994). Este último enfoque produce una alta densidad de mutaciones alrededor de un sitio específico de interés de la proteína.

Una alternativa a la aleatorización total de una secuencia de molde de ADN es la aleatorización parcial, denominándose generalmente una mezcla sintetizada de este modo mezcla "dopada". Hay descrito un ejemplo de esta técnica, realizada sobre una secuencia de ARN, por, por ejemplo, Ekland et al. (Nucl. Acids Research 23:3231 (1995)). La aleatorización parcial se puede realizar químicamente afectando a las reacciones de síntesis tal que cada mezcla de reacción de adición de bases contenga un exceso de una base y pequeñas cantidades de cada una de las otras; con un minucioso control de las concentraciones de las bases, se puede alcanzar una frecuencia de mutación deseada mediante este enfoque. También se pueden generar mezclas parcialmente aleatorizadas usando técnicas de PCR propensa a error, por ejemplo, según lo descrito en Beaudry y Joyce (Science 257:635 (1992)), y Bartel y Szostak (Science 261:1411 (1993)).

También hay numerosos procedimientos disponibles para la generación de un constructo de ADN comenzando con una secuencia conocida y creando luego una mezcla de ADN mutagenizado. En Ausubel et al. (capítulo 8 anterior); Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª ed. (1989); Cadwell et al. ("PCR Methods and Applications" 2:28 (1992)); Tsang et al. (Meth. Enzymol. 267:410 (1996)); Reidhaar- Olsen et al. (Meth. Enzymol. 208:564 (1991)); y Ekland y Bartel (Nucl. Acids. Res. 23:3231 (1995)), se describen ejemplos de tales técnicas. También se pueden generar secuencias aleatorias mediante la técnica del "barajado" esbozada en Stemmer (Nature 370:389 (1994)). Finalmente, se puede recombinar un conjunto de dos o más genes homólogos in vitro para generar una genoteca inicial (Crameri et al. Nature 391:288-291 (1998)).

Se pueden construir ORF a partir de secuencias aleatorias en una variedad de modos en función de los codones elegidos. Es preferible evitar los codones de terminación del marco de lectura abierto. Se pueden usar genotecas de secuencias totalmente aleatorias (codificación NNN), pero contienen una proporción de codones de terminación
(3/64 = 4,7% por codón) que puede ser inaceptablemente elevada para todas excepto para las genotecas más cortas. Tales genotecas también contienen codones raramente usados que pueden dar como resultado algunas veces una traducción escasa. Los codones NNG/C proporcionan una frecuencia de terminación ligeramente reducida (1/32 = 3,1% por codón), mientras que proporcionan acceso a los mejores codones para el total de 20 aminoácidos para los sistemas de traducción de mamíferos. Los codones NNG/C son menos óptimos cuando se aplican a sistemas de traducción bacterianos en los que los mejores codones terminan en A o T en 7 casos (AEGKRTV). Existen varias soluciones que proporcionan una frecuencia de codones de terminación muy baja (\sim0,1%), con un contenido de aminoácidos similar a las proteínas globulares usando tres mezclas diferentes de nucleótidos, codones N_{1}N_{2}N_{3} (LaBean y Kauffman, Protein Science 2:1249-1254 (1993)) (y las referencias de esa memoria). Finalmente, se puede emplear una variedad casi infinita de estrategias de diseño semi-rotacionales para diseñar genotecas según el tipo de aminoácido. Por ejemplo, se pueden seleccionar aminoácidos hidrófobos (h) o polares (p) usando los codones NTN o NAN respectivamente ((Beasley y Hecht, J. Biol. Chem. 272:2031-2034 (1997)). Estas se pueden diseñar para dar preferencia a la formación de hélices \alpha (phpphhpp...) o de hélices \beta (phphph...).

Los ORF construidos a partir de secuencias sintéticas también pueden contener codones de terminación que resulten de las inserciones o las eliminaciones realizadas en el ADN sintético. Estos defectos pueden tener consecuencias negativas debido a las alteraciones del marco de lectura de traducción. El examen de un número de mezclas y de genes sintéticos construidos a partir de oligonucleótidos sintéticos indica que las inserciones y las eliminaciones tienen lugar con una frecuencia del \sim0,6% por posición o del 1,8% por codón. La frecuencia exacta de estas apariciones es variable, y se cree que depende del origen y de la longitud del ADN sintético. En concreto, las secuencias más largas muestran una mayor frecuencia de inserciones y eliminaciones (Haas et al., Current Biology 6: 315-324 (1996)). Una solución simple para reducir los desplazamientos de marco dentro del ORF consiste en trabajar con segmentos relativamente cortos de ADN sintético (de 80 nucleótidos o menos) que puedan ser purificados hasta la homogeneidad. Entonces se pueden generar ORF más largos mediante restricción y unión de varias secuencias más cortas.

Para optimizar un esquema de selección de la invención, también se pueden modificar las secuencias y las estructuras en los extremos 5' y 3' de un molde. Preferiblemente, esto se lleva a cabo en dos selecciones separadas, implicando cada una la inserción de dominios aleatorios en el molde próximo al extremo apropiado, tras lo que se realiza la selección. Estas selecciones pueden servir (i) para maximizar la cantidad de fusión realizada (y maximizar de ese modo la complejidad de una genoteca) o (ii) para proporcionar secuencias de traducción optimizadas. Además, el procedimiento se puede aplicar generalmente combinado con una PCR mutagénica para la optimización de los moldes de traducción tanto en las regiones codificantes como en las no codificantes.

Etapa 2 Generación de ARN

Según lo indicado anteriormente, es posible sintetizar químicamente la parte de ARN de una fusión de proteína y ARN usando técnicas estándar de síntesis de oligonucleótidos. Alternativamente, y particularmente si se utilizan secuencias de ARN más largas, la parte de ARN se genera mediante una transcripción in vitro de un molde de ADN. En un enfoque preferido, se usa polimerasa de T7 para generar enzimáticamente la cadena de ARN. La transcripción se realiza generalmente en el mismo volumen que la reacción PCR (se usa ADN de PCR derivado de una reacción de 100 \mul para 100 \mul de transcripción). Este ARN se puede generar con una cubierta de 5' si se desea usando un gran exceso molar de m^{7}GpppG con respecto a GTP en la reacción de transcripción (Gray y Hentze, EMBO J. 13:3882-3891 (1994)). Otras ARN polimerasas apropiadas para este uso incluyen, sin limitación, las ARN polimerasas de SP6, T3 y E. coli (descritas, por ejemplo, en Ausubel et al. (supra, capítulo 3). Además, el ARN sintetizado puede ser, en su totalidad o en parte, ARN modificado. En un ejemplo concreto, se puede producir ARN de fosforotioato (por ejemplo, mediante la trancripción de T7) usando ribonucleótidos modificados y técnicas estándar. Tal ARN modificado proporciona la ventaja de ser estable a las nucleasas. Entonces se purifican muestras de ARN de longitud completa de las reacciones de transcripción según lo descrito anteriormente usando electroforesis sobre gel de poliacrilamida y urea seguida por una desalinización sobre NAP-25 (Pharmacia) (Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 12297-12302 (1997)).

Etapa 3 Unión de puromicina con el molde

A continuación, se une mediante enlace covalente puromicina (o cualquier otro aceptor de péptidos apropiado) con la secuencia del molde. Esta etapa se puede realizar usando ARN ligasa de T4 para unir la puromicina directamente con la secuencia de ARN, o preferiblemente, se puede unir la puromicina por medio de un "puente" de ADN usando ADN ligasa de T4 o cualquier otra enzima que sea capaz de unir dos secuencias de nucleótidos entre sí (véase la figura 1B) (véase también, por ejemplo, Ausubel et al., supra, capítulo 3, apartados 14 y 15). También se pueden usar ARNt sintetasas para unir compuestos de tipo puromicina con el ARN. Por ejemplo, la fenilalanil ARNt sintetasa une la fenilalanina con moléculas de fenilalanil-ARNt que contienen un grupo amino en 3', generando moléculas de ARN con extremos 3' de tipo puromicina (Fraser y Rich, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 70:2671 (1973)). Otros aceptores de péptidos que se pueden usar incluyen, sin limitación, cualquier compuesto que posea un aminoácido enlazado a una adenina o a un compuesto de tipo adenina, tal como, los nucleótidos de aminoácido, fenilalanil-adenosina (A-Phe), tirosil-adenosina (A-Tyr) y alanil-adenosina (A-Ala), así como estructuras enlazadas a amida, tales como fenilalanil-3'-desoxi-3'-amino-adenosina, alanil-3'-desoxi-3'-amino-adenosina y tirosil-3'-desoxi-3'-amino-adenosina; en cualquiera de estos compuestos, se puede usar cualquiera de los L-aminoácidos naturales o sus análogos. Por ejemplo, en Krayevsky y Kukhanova, "Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology" 23:1 (1979), se describe un número de aceptores de péptidos.

Etapa 4 Generación y recuperación de fusiones de proteínas y ARN

Para generar fusiones de proteínas y ARN, se puede utilizar cualquier sistema de traducción in vitro o in situ. Según lo mostrado a continuación, se prefieren los sistemas eucariotas, y dos sistemas particularmente preferidos incluyen los sistemas de lisados de germen de trigo y de reticulocito. Sin embargo, en principio, en la invención, es útil cualquier sistema de traducción que permita la formación de una fusión de proteína y ARN, y que no degrade significativamente la parte de ARN de la fusión. Además, para reducir la degradación de ARN en cualquiera de estos sistemas, se pueden incluir oligonucleótidos antisentido de bloqueo de la degradación en la mezcla de reacción de traducción; tales oligonucleótidos se hibridan específicamente con y cubren secuencias de la parte de ARN de la molécula que desencadenan la degradación (véase, por ejemplo, Hanes y Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. 94: 4937 (1997)).

Como se indica anteriormente, hay disponible cualquier número de sistemas de traducción eucariotas para su uso en la invención. Éstos incluyen, sin limitación, lisados de levadura, ascitos, células tumorales (Leibowitz et al., Meth. Enzymol. 194:536 (1991)) y huevos de xenopus oocyte. Los sistemas de traducción in vitro útiles procedentes de sistemas bacterianos incluyen, sin limitación, aquéllos descritos en Zubay (Ann. Rev. Genet. 7: 267 (1973)); Chen y Zubay (Meth. Enzymol. 101:44 (1983)); y Ellman (Meth. Enzymol. 202:301 (1991)).

Además, las reacciones de traducción se pueden llevar a cabo in situ. En un ejemplo concreto, la traducción se lleva a cabo inyectando ARNm en huevos de Xenopus usando técnicas estándar.

Una vez generadas, es posible recuperar las fusiones de proteínas y ARN de la mezcla de reacción de traducción mediante cualquier técnica estándar de purificación de proteínas o de ARN. Comúnmente, se utilizan técnicas de purificación de proteínas. Como se muestra más adelante, por ejemplo, la purificación de una fusión puede ser facilitada por el uso de reactivos cromatográficos adecuados, tales como dT_{25}-agarosa o triopropil-sefarosa. Sin embargo, la purificación también o alternativamente puede implicar la purificación basada en la parte de ARN de la fusión; las técnicas para tal purificación se describen, por ejemplo en Ausubel et al. (supra, capítulo 4).

Etapa 5 Selección de la fusión de proteína y ARN deseada

La selección de una fusión de proteína y ARN deseada se puede realizar mediante cualquier procedimiento disponible para la separación o el aislamiento selectivo de una fusión deseada de una población de fusiones candidatas. Los ejemplos de técnicas de aislamiento incluyen, sin limitación, la unión selectiva, por ejemplo, a un patrón de unión que está directa o indirectamente inmovilizado sobre una columna, una perla, una membrana u otro soporte sólido, y la inmunoprecipitación usando un anticuerpo específico del resto proteico de la fusión. La primera de estas técnicas hace uso de un motivo de selección inmovilizado que puede estar constituido por cualquier tipo de molécula con la que sea posible la unión. En la figura 2, se presenta una lista de las posibles moléculas de motivos de selección. La selección también se puede basar en el uso de moléculas de sustrato unidas a un marcador de afinidad (por ejemplo, la biotina del sustrato) que reacciona con una molécula candidata, o en cualquier otro tipo de interacción con una molécula de fusión. Además, las proteínas se pueden seleccionar en base a su actividad catalítica de una manera análoga a la descrita por Bartel y Szostak para el aislamiento de enzimas de ARN (supra); según esa técnica particular, las moléculas deseadas son seleccionadas en base a su capacidad para unir una molécula diana con ellas mismas, y luego las moléculas funcionales son aisladas en base a la presencia de esa diana. Los esquemas de selección del aislamiento de nuevas o mejores proteínas catalíticas usando este mismo enfoque o cualquier otra selección funcional son permitidos por la presente invención.

Además, según lo descrito en la presente memoria, la selección de una fusión de proteína y ARN deseada (o de su copia de ADN) puede ser facilitada por el enriquecimiento de esa fusión en una mezcla de moléculas candidatas. Para llevar a cabo tal enriquecimiento opcional, se pone en contacto una población de fusiones candidatas de proteínas y ARN con un patrón de unión (por ejemplo, uno de los patrones de unión descritos anteriormente) que sea específico de bien la parte de ARN o la parte proteica de la fusión, en condiciones que separan sustancialmente el complejo de patrón de unión-fusión de los miembros no unidos de la muestra. Se puede repetir esta etapa, y la técnica incluye preferiblemente al menos dos etapas de enriquecimiento secuenciales, una de las cuales en la que se seleccionan las fusiones usando un patrón de unión específico de la parte de ARN y otra de las cuales en la que las fusiones se seleccionan usando un patrón de unión específico de la parte proteica. Además, si se repiten etapas de enriquecimiento dirigidas a la misma parte de la fusión (por ejemplo, a la parte proteica), es preferible utilizar diferentes patrones de unión. En un ejemplo particular descrito en la presente memoria, se enriquece una población de moléculas con las fusiones deseadas usando primero un patrón de unión específico de la parte de ARN de la fusión y luego, en dos etapas secuenciales, usando dos patrones de unión diferentes, ambos de los cuales son específicos de la parte proteica de la fusión. De nuevo, estos complejos se pueden separar de los componentes de la muestra mediante cualquier técnica de separación estándar, incluyendo, sin limitación, cromatografía por afinidad en columna, centrifugación o inmunoprecipitación.

Además, se puede realizar la elución de una fusión de proteína y ARN de un complejo de enriquecimiento (o selección) mediante un número de enfoques. Por ejemplo, según lo descrito en la presente memoria, es posible utilizar una etapa de elución química desnaturalizante o inespecífica para aislar una fusión de proteína y ARN deseada. Tal etapa facilita la liberación de los componentes del complejo entre sí o de un soporte sólido asociado de una manera relativamente inespecífica rompiendo los enlaces no covalentes que hay entre los componentes y/o entre los componentes y el soporte sólido. Según lo descrito en la presente memoria, un ejemplo de reactivo de elución química desnaturalizante o inespecífica es HOAc/H_{2}O al 4%. Otros ejemplos de reactivos de elución química desnaturalizante o inespecífica incluyen guanidina, urea, sal a concentración elevada, detergente o cualquier otro procedimiento mediante el que los aductos no covalentes se puedan eliminar en general. Alternativamente, es posible utilizar un enfoque de elución química específica en el que se aproveche un compuesto químico que provoque la liberación específica de una molécula de la fusión. En un ejemplo particular, si el brazo ligador de una proteína de fusión deseada contiene uno o más enlaces de tipo disulfuro, se pueden eluir los aptámeros de la fusión unidos mediante la adición de, por ejemplo, DTT, dando como resultado la reducción del enlace de tipo disulfuro y la liberación de la diana unida.

Alternativamente, se puede realizar la elución mediante la interrupción específica de los complejos de afinidad; tales técnicas liberan selectivamente los componentes del complejo mediante la adición de un exceso de un miembro del complejo. Por ejemplo, en una selección de unión a ATP, la elución se realiza mediante la adición de un exceso de ATP a la mezcla de incubación. Finalmente, se puede llevar a cabo una etapa de elución enzimática. Mediante este enfoque, la propia molécula unida o una proteasa añadida exógenamente (u otra enzima hidrolítica apropiada) escinde y libera bien la diana o el enzima. En un ejemplo concreto, se puede incluir un sitio diana de proteasa en cualquiera de los componentes del complejo, y las moléculas unidas se eluyen mediante la adición de la proteasa. Alternativamente, en una selección catalítica, se puede usar la elución como una etapa de selección para aislar moléculas capaces de liberarse (por ejemplo, escindirse) de un soporte sólido.

Etapa 6 Generación de una copia de ADN de la secuencia de ARN usando transcriptasa inversa

Si se desea, es fácil obtener una copia de ADN de una secuencia de fusión de ARN seleccionada mediante la transcripción inversa de esa secuencia de ARN usando cualquier técnica estándar (por ejemplo, usando transcriptasa inversa Superscript). Esta etapa se puede llevar a cabo antes de la etapa de selección o enriquecimiento (por ejemplo, según lo descrito en la figura 16), o tras esa etapa. Alternativamente, se puede llevar a cabo el procedimiento de transcripción inversa antes del aislamiento de la fusión de la mezcla de traducción in vitro o in situ.

A continuación, se amplifica el molde de ADN, bien como una secuencia bicatenaria de longitud parcial o de longitud completa. Preferiblemente, en esta etapa, se generan moldes de ADN de longitud completa, usando oligonucleótidos apropiados y amplificación por PCR.

Estas etapas, y los reactivos y las técnicas para llevar a cabo estas etapas se describen ahora detalladamente usando ejemplos concretos. Estos ejemplos son proporcionados a efectos de ilustrar la invención y no deberían ser considerados como restrictivos.

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Generación de moldes para fusiones de proteínas y ARN

Según lo mostrado en las figuras 1A y 2, el esquema de selección de la presente invención hace uso preferiblemente de moldes de ADN bicatenario que incluyen un número de elementos de diseño. El primero de estos elementos es un promotor para ser usado en combinación con una ARN polimerasa deseada para la síntesis de ARNm. Según lo mostrado en la figura 1A y lo descrito en la presente memoria, es preferible el promotor de T7, aunque se puede usar cualquier promotor capaz de dirigir la síntesis desde un ADN bicatenario lineal.

El segundo elemento del molde mostrado en la figura 1A se denomina la región no traducida de 5' (o UTR de 5') y corresponde con el ARN secuencia arriba del sitio de iniciación de la traducción. En la figura 1A, se muestra una UTR de 5' preferida (denominada "TE") que es un mutante de eliminación de la región no traducida de 5' del virus del mosaico del tabaco y, en particular, corresponde a las bases directamente 5' del inicio de la traducción del TMV; la secuencia de esta UTR es la siguiente: rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA (siendo insertados los 3 primeros nucleótidos G para aumentar la transcripción) (SEC ID N.º 5). Se puede utilizar cualquier otra UTR de 5' apropiada (véase, por ejemplo, Kozak, Microbiol. Rev. 47:1 (1983); y Jobling et al., Nature 325: 622 (1987)).

El tercer elemento mostrado en la figura 1A es el sitio de inicio de la traducción. En general, este es un codón AUG. Sin embargo, hay ejemplos en los que se utilizan codones distintos de AUG en las secuencias codificantes naturales, y estos codones también se pueden usar en el esquema de selección de la invención. El contexto de la secuencia exacta que rodea este codón influye en la eficacia de la traducción (Kozak, Microbiological Reviews 47:1-45 (1983); y Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991)). La secuencia 5'RNNAUGR proporciona un buen contexto de inicio para la mayoría de las secuencias con una preferencia para A como la primera purina (-3) y de G como la segunda (+4) (Kozak, Microbiological Reviews 47:1-45 (1983); y Kozak, J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987)).

El cuarto elemento de la figura 1A es el marco de lectura abierto de la proteína (denominado ORF), que codifica la secuencia proteica. Este marco de lectura abierto puede codificar cualquier secuencia proteica natural, aleatoria, aleatorizada, mutagenizada o totalmente sintética. La característica más importante del ORF y de la región constante de 3' adyacente es que ninguno contiene codones de terminación. La presencia de codones de terminación permitiría la terminación prematura de la síntesis de proteínas, evitando la formación de la fusión.

El quinto elemento mostrado en la figura 1A es la región constante de 3'. Esta secuencia facilita la amplificación por PCR de las secuencias de la mezcla y la unión del oligonucleótido que contiene puromicina con el ARNm. Si se desea, esta región también puede incluir además un sitio de pausa, una secuencia que hace que el ribosoma se detenga, dando así más tiempo para que el resto aceptor (por ejemplo, la puromicina) acepte una cadena peptídica naciente del peptidil-ARNt; este sitio de pausa se trata más detalladamente a continuación.

Para desarrollar la presente metodología, se generaron fusiones de proteínas y ARN inicialmente usando moldes de ARNm muy simplificados que contenían 1-2 codones. Se adoptó este enfoque por dos razones. En primer lugar, los moldes de este tamaño se podían elaborar fácilmente mediante síntesis química. Y en segundo lugar, un marco de lectura abierto pequeño permitía el fácil análisis de características fundamentales de la reacción, incluyendo eficacia de enlace, heterogeneidad de los extremos, dependencia del molde y exactitud de la traducción.

Diseño del constructo. Se usó un constructo básico para generar fusiones de proteínas y ARN analíticas. La molécula estaba constituida por un ARNm que contenía una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) para el inicio de la traducción que contenía una eliminación de 3 bases de la secuencia SD de la proteína ribosómica L1 y que era complementaria a 5 bases de ARNr de 16S (i.e., rGrGrA rGrGrA rCrGrA rA) (SEC ID N.º 6) (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10: 2971-2996 (1982); Shine y Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 71:1342-1346 (1974); y Steitz y Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72:4734-4738 (1975)), (ii) un codón de inicio AUG, (iii) un ligador de ADN para actuar como sitio de pausa (i.e., 5'-(dA)_{27}), (iv) dCdC-3' y (v) una puromicina (P) de 3'. Se eligió la secuencia poli(dA) porque se sabía que moldea escasamente el ARNt en el sitio A (Morgan et al., J. Mol. Biol. 26:477-497 (1967); Ricker y Kaji, Nucleic Acid Research 19:6573-6578 (1991)) y fue diseñada para que actuara como un buen sitio de pausa. La longitud del ligador del oligo dA fue seleccionada para que abarcara la distancia de \sim60-70 \ring{A} que hay entre el sitio descodificante y el centro de transferencia peptidilo del ribosoma. El dCdCP imitaba al extremo CCA de un ARNt y fue diseñado para facilitar la unión de la puromicina con el sitio A del ribosoma.

Síntesis química del molde mínimo 43-P. Para sintetizar el constructo 43-P (mostrado en la figura 3), se unió primero puromicina con un soporte sólido de un modo tal que fuera compatible con la química de síntesis de oligonucleótidos de fosforamidita estándar. El protocolo de síntesis para este oligo es explica esquemáticamente en la figura 3 y se describe a continuación más detalladamente. Para unir la puromicina con un soporte sólido de vidrio de poro controlado (CPG), se protegió el grupo amino con un grupo de trifluoroacetilo según lo descrito en el boletín para usuarios de Applied Biosystems #49 para el modelo de sintetizador de ADN 380 (1988). A continuación, se llevó a cabo la protección del OH de 5' usando un enfoque de DMT-Cl estándar (Gait, "Oligonucleotide Synthesis, a practical approach. The Practical Approach Series" (IRL Press, Oxford, 1984)), y se efectuó la unión a CPG de aminohexilo a través del OH de 2' exactamente de la misma manera en la que se usaría el OH de 3' para la unión de un desoxinucleósido (véase la fig. 3 y Gait, supra, p. 47). Entonces la puromicina protegida unida a CPG con DMT en 5' ya era adecuada para la extensión de la cadena con monómeros de fosforamidita. La síntesis del oligo tuvo lugar en el sentido de 3' a 5' en el orden: (i) puromicina de 3', (ii) pdCpdC, (iii) \sim27 unidades de dA como ligador, (iv) AUG y (v) la secuencia de Shine-Dalgarno. A continuación se muestra la secuencia del constructo 43-P.

Síntesis de CPG-puromicina. La síntesis de la puromicina protegida en CPG siguió la ruta general usada para los desoxinucleósidos según lo esbozado anteriormente, (Gait, "Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series" (IRL Press, Oxford, 1984)). Las principales diferencias incluyeron la selección de un grupo de bloqueo de N apropiado, la unión por el OH de 2' de la puromicina con el soporte sólido y la reacción de unión con el soporte sólido. En el último caso, la reacción se llevó a cabo a concentraciones muy bajas de nucleótido activado, pues este material era significativamente más valioso que el soporte sólido. La producción resultante (\sim20 \mumoles/g de soporte) fue bastante satisfactoria teniendo en cuenta las condiciones de reacción diluida.

Síntesis de N-trifluoroacetil-puromicina. Primero se convirtieron 267 mg (0,490 mmoles) de puromicina*HCl en la forma de base libre disolviendo en agua, añadiendo tampón de carbonato a un pH 11 y extrayendo (x 3) en cloroformo. Se evaporó la fase orgánica hasta la sequedad y se pesó (242 mg; 0,513 mmoles). Entonces se disolvió la base libre en 11 ml de piridina seca y en 11 ml de acetonitrilo seco, y se añadieron 139 \mul (2,0 mmoles) de trietilamina (TEA; Fluka) y 139 \mul (1,0 mmoles) de anhídrido trifluoroacético (TFAA; Fluka) con agitación. Después se añadió TFAA a la solución turbia en alícuotas de 20 \mul hasta que no quedó ninguno de los materiales iniciales, según lo analizado mediante cromatografía de capa fina (CCF) (cloroformo/MeOH, 39:7) (un total de 280 \mul). Se dejó proseguir la reacción durante 1 hora. En este momento, se revelaron dos bandas mediante cromatografía de capa fina, ambas de movilidad superior que el material inicial. La reconstitución de la reacción con NH_{4}OH y agua redujo el producto hasta una sola banda. La cromatografía sobre sílice (cloroformo/MeOH, 93:7) produjo 293 mg (0,515 mmoles) del producto, N-TFA-Pur. En la figura 4, se muestra esquemáticamente el producto de esta reacción.

Síntesis de N-trifluoroacetil-5'-DMT-puromicina. Se formaron alícuotas del producto procedente de la reacción anterior y se coevaporaron dos veces con piridina seca para eliminar el agua. Se prepararon múltiples tubos para analizar múltiples condiciones de reacción. En una reacción a pequeña escala, se disolvieron 27,4 mg (48,2 moles) de N-TFA-Pur en 480 \mul de piridina que contenía 0,05 eq de DMAP y 1,4 eq de TEA. Se añadieron a esta mezcla 20,6 mg de cloruro de dimetoxitritilo (60 \mumoles) y se dejó continuar la reacción hasta completarse con agitación. Se detuvo la reacción por adición de un volumen igual de agua (aproximadamente 500 \mul) a la solución. Como esta reacción pareció satisfactoria, se realizó una versión a gran escala. En concreto, se disolvieron 262 mg (0,467 mmoles) de N-TFA-Pur en 2,4 ml de piridina seguidos por la adición de 1,4 eq de TEA, 0,05 eq de DMAP y 1,2 eq de cloruro de dimetoxitritilo (Sigma). Tras aproximadamente dos horas, se añadieron 50 mg más (0,3 eq) de dimetoxitril*Cl (DMT*Cl), y se dejó continuar la reacción durante 20 minutos más. Se detuvo la reacción mediante la adición de 3 ml de agua y se coevaporó tres veces con CH_{3}CN. Se purificó la reacción mediante cloroformo/MeOH (95:5) sobre una columna de 2 mm con 100 ml de sílice (seco). Debido a la purificación incompleta, se ejecutó una segunda columna idéntica con cloroformo/MeOH (97,5:2,5). La producción total fue de 325 mg o 0,373 mmoles (o una producción del 72%). En la figura 4, se muestra esquemáticamente el producto de esta reacción.

Síntesis de N-trifluoroacetil-5'-DMT-2'-Succinil-puromicina. En una reacción a pequeña escala, se combinaron 32 mg (37 \mumoles) del producto sintetizado anteriormente con 1,2 eq de DMAP disueltos en 350 \mul de piridina. A esta solución, se añadieron 1,2 equivalentes de anhídrido succínico en 44 \mul de CH_{3}CN seco y se dejó agitar durante una noche. Una cromatografía de capa fina reveló que quedaba un poco del material inicial. En una reacción a gran escala, se combinaron 292 mg (336 \mumoles) del producto anterior con 1,2 eq de DMAP en 3 ml de piridina. A esto, se añadieron 403 \mul de anhídrido succínico 1M (Fluka) en CH_{3}CN seco y se dejó agitar la mezcla durante una noche. Una cromatografía de capa fina volvió a revelar que quedaba un poco del material inicial. Se combinaron las dos reacciones y se añadieron otros 0,2 eq de DMAP y succinato. Se coevaporó el producto con tolueno una vez y se secó hasta obtener una espuma amarilla en alto vacío. Se añadió CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y se extrajo esta solución dos veces con 15 ml de ácido cítrico enfriado con hielo al 10% y luego dos veces con agua pura. Se secó el producto, se volvió a disolver en 2 ml de CH_{2}Cl_{2} y se precipitó mediante la adición de 50 ml de hexano con agitación. Entonces se sometió a movimientos vorticiales el producto y se centrifugó a 600 rpm durante 10 minutos en el centrifugador clínico. Se retiró la mayoría del eluyente y se secó el resto de producto, primero a un bajo vacío y luego a un alto vacío en un desecador.
La producción de esta reacción fue de aproximadamente 260 \mumoles para un rendimiento por etapas del \sim70%.

Síntesis de N-trifluoroacetil-5'-DMT-2'-succinil-CPG-puromicina. A continuación se disolvió el producto de la etapa anterior con 1 ml de dioxano (Fluka) seguido por 0,2 ml de dioxano/0,2 ml de piridina. A esta solución, se añadieron 40 mg de p-nitrofenol (Fluka) y 140 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC; Sigma), y se dejó continuar la reacción durante 2 horas. Se eliminó la ciclohexil-urea insoluble producida mediante la reacción por centrifugación, y se añadió la solución del producto a 5 g de vidrio de poro controlado (CPG) con aminohexilo suspendido en 22 ml de DMF seco y se agitó durante una noche. Entonces se lavó la resina con DMF, metanol y éter, y se secó. Se analizó la resina resultante y se obtuvo un contenido de 22,6 \mumoles de tritilo por g, entrando en el intervalo aceptable para este tipo de soporte. Entonces se cubrió el soporte por incubación con 15 ml de piridina, 1 ml de anhídrido acético y 60 mg de DMAP durante 30 minutos. El material de la columna resultante produjo un resultado de ninhidrina negativo (sin color), a diferencia de los resultados obtenidos antes del bloqueo, en el que el material produjo una reacción de color azul oscuro. En la figura 4, se muestra esquemáticamente el producto de esta reacción. Alternativamente, se puede obtener CPG con puromicina comercialmente (Trilink).

Síntesis de conjugado de ARNm-puromicina. Según lo tratado anteriormente, se puede usar un oligo unido a puromicina en cualquiera de los dos modos para generar un conjugado de ARNm-puromicina que actúe como un molde de traducción. Para marcos de lectura abiertos sumamente cortos, el oligo de puromicina es por lo común alargado químicamente con monómeros de ARN o ADN para crear un molde totalmente sintético. Cuando se desean marcos de lectura abiertos más largos, generalmente se une el oligo de ARN o ADN con el extremo 3' de un ARNm usando un puente de ADN y ADN ligasa de T4 según lo descrito por Moore y Sharp (Science 256: 992 (1992)).

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Traducción in vitro y análisis de fusiones de proteínas y ARN

Se tradujeron in vitro los moldes generados anteriormente usando sistemas de traducción in vitro tanto bacterianos como eucariotas como se explica a continuación.

Traducción in vitro de moldes mínimos. Se añadieron 43-P y conjugados de ARN-puromicina relacionados a varios sistemas de traducción in vitro diferentes que incluían: (i) el sistema de S30 derivado de E. coli MRE600 (Zubay, Ann Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen y Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, en "Transcription and Translation: A Practical Approach", B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; y Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)) preparados según lo descrito por Ellman et. al. (Methods Enzymol. 202:301 (1991)); (ii) la fracción ribosómica derivada de la misma cepa, preparada según lo descrito por Kudlicki et al. (Anal. Chem. 206:389 (1992)); e (iii) el sistema de S30 derivado de E. coli BL21, preparado según lo descrito por Lesley et al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). En todos los casos, la premezcla usada fue la de Lesley et al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)), y las incubaciones fueron de 30 minutos de duración.

Análisis de la naturaleza de la fusión. Primero se analizó el molde 43-P usando los extractos de traducción de S30 de E. coli. La figura 5 (reacción "A") demuestra la reacción intramolecular (cis) deseada en la que 43-P se une al ribosoma y actúa como un molde para y un aceptor de fMet al mismo tiempo. Se analizó primero la incorporación de ^{35}S-metionina y su posición en el molde, estando los resultados mostrados en las figuras 6A y 6B. Tras la extracción de la mezcla de reacción de traducción in vitro con fenol/cloroformo y el análisis de los productos por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, apareció una banda marcada con ^{35}S con la misma movilidad que el molde 43-P. La cantidad de este material sintetizado dependía de la concentración de Mg^{2+} (Figura 6A). La concentración óptima de Mg^{2+} pareció estar entre 9 y 18 mM, lo que era la óptima para la traducción en este sistema (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen y Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, en "Transcription and Translation: A Practical Approach", B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301 (1991); Kudlicki et al., Anal. Chem. 206:389 (1992); y Lesley et al., J. Biol. Chem. 266: 2632 (1991)). Además, el marcador incorporado resultó ser estable al tratamiento con NH_{4}OH (figura 6B), indicando que el marcador estaba localizado sobre la mitad 3' de la molécula (la parte de ADN de bases estables) y estaba unido por un enlace de bases estables, según lo esperado para el enlace de tipo amida entre la puromicina y fMet.

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Ribosoma y dependencia del molde. Para demostrar que la reacción observada anteriormente tuvo lugar sobre el ribosoma, se analizaron los efectos de los inhibidores específicos de la función peptidil-transferasa del ribosoma (figura 6C), y se examinó el efecto de cambiar la secuencia codificante por metionina (figura 6D). La figura 6C demuestra claramente que la reacción fue enormemente inhibida por los inhibidores de la peptidil-transferasa, virginiamicina, gougerotina y cloranfenicol (Monro y Vazquez, J. Mol. Biol. 28: 161-165 (1967); y Vazquez y Monro, Biochemica et Biophysical Acta 142:155-173 (1967)). La figura 6D demuestra que el cambio de una sola base del molde de A a C suprimió la incorporación de ^{35}S-metionina a Mg^{2+} 9 mM y la disminuyó enormemente a 18 mM (coincidiendo con el hecho de que los niveles elevados de Mg^{2+} permiten una mala lectura del mensaje). Estos experimentos demostraron que la reacción tuvo lugar sobre el ribosoma de un modo dependiente del molde.

Longitud del ligador. También se analizó la dependencia que tenía la reacción de la longitud del ligador (Figura 6E). El molde original fue diseñado para que el ligador abarcara la distancia desde el sitio de descodificación (ocupado por AUG del molde) hasta el sitio aceptor (ocupado por el resto de puromicina), una distancia que era de aproximadamente la misma longitud que la distancia entre el bucle anticodón y el brazo aceptor del ARNt, o de aproximadamente 60-70 \ring{A}. El primer ligador analizado resultó tener una longitud de 30 nucleótidos en base a un mínimo de 3,4 \ring{A} por base (\geq 102 \ring{A}). En el intervalo entre 30 y 21 nucleótidos (n = 27-18; longitud \geq 102-71 \ring{A}), se observó poco cambio en la eficacia de la reacción. Por consiguiente, se puede variar la longitud del ligador. Mientras que un ligador de entre 21 y 30 nucleótidos representa una longitud preferida, los ligadores más cortos de 80 nucleótidos y, preferiblemente, más cortos de 45 nucleótidos, también se pueden utilizar en la invención.

Reacciones intramoleculares frente a intermoleculares. Finalmente, se analizó si la reacción tuvo lugar de una forma intramolecular (figura 5, reacción "A"), según lo deseado, o de una forma intermolecular (figura 5, reacción "B"). Esto se analizó mediante la adición de oligonucleótidos con puromicina de 3', pero ninguna secuencia de unión al ribosoma (i.e., moldes 25-P, 13-P y 30-P) a las reacciones de traducción que contenían el molde 43-P (figuras 6F, 6G y 6H). Si la reacción tuvo lugar mediante un mecanismo intermolecular, los oligos más cortos también estarían marcados. Según lo demostrado en las figuras 6F-H, hubo poca incorporación de ^{35}S-metionina en los tres oligos más cortos, indicando que la reacción tuvo lugar fundamentalmente de una manera intramolecular. Las secuencias de 25-P (SEC ID N.º 10), 13-P (SEC ID N.º 9) y 30-P (SEC ID N.º 8) se muestran más adelante.

Lisado de reticulocito. La figura 6H demuestra que se puede incorporar la ^{35}S-metionina en el molde 43-P usando un lisado de reticulocito de conejo (véase más adelante) para la traducción in vitro, además de los lisados de E. coli usados anteriormente. Esta reacción tuvo lugar fundamentalmente en un mecanismo intramolecular, según lo deseado.

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Síntesis y análisis de fusiones que contienen una etiqueta de epítopo C-MYC

También se generaron fusiones ejemplares que contenían, dentro de la parte proteica, la etiqueta de epítopo para el anticuerpo monoclonal frente a c-myc 9E10 (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5: 3610 (1985)).

Diseño de moldes. Se diseñaron tres moldes de etiqueta de epítopo iniciales (i.e., LP77, LP154 y la mezcla n.º 1), y se muestran en las figuras 7A-C. Los dos primeros moldes contenían la secuencia de la etiqueta de epítopo c-myc EQKLISEEDL (SEC ID N.º 2) y el tercer molde era el diseño usado en la síntesis de una mezcla de selección aleatoria. LP77 codificaba una secuencia de 12 aminoácidos, con los codones optimizados para la traducción bacteriana. LP154 y sus derivados contenían una secuencia de ARNm de 33 aminoácidos en la que los codones estaban optimizados para la traducción eucariota. La secuencia de aminoácidos codificada de MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA (SEC ID N.º 7) correspondía al péptido original usado para aislar el anticuerpo 9E10. La mezcla n.º 1 contenía 27 codones de NNG/C (para generar péptidos aleatorios) seguidos por una secuencia correspondiente los siete últimos aminoácidos del péptido myc (que no formaban parte de la secuencia del epítopo myc). Estas secuencias se muestran más adelante.

Sistemas de traducción in vitro de reticulocito frente a germen de trigo. Se analizaron los moldes 43-P, LP77 y LP154 tanto en sistemas de traducción de reticulocito de conejo como de extracto de germen de trigo (Promega, Boehringer Mannheim) (figura 8). Las traducciones se realizaron a 30ºC durante 60 minutos. Los moldes se aislaron usando dT_{25}-agarosa a 4ºC. Se eluyeron los moldes desde la agarosa usando NaOH 25 mM, EDTA 1 mM, se neutralizaron con tampón de NaOAc/HOAc, se precipitaron inmediatamente en etanol (vol de 2,5-3) y se lavaron (con etanol al 100%), y se secaron sobre un concentrador Speedvac. La figura 8 muestra que la ^{35}S-metionina fue incorporada en los tres moldes, tanto en sistemas de germen de trigo como de reticulocito. Se observó una menor degradación del molde en las reacciones de fusión desde el sistema de reticulocito y, por consiguiente, se prefiere este sistema para la generación de fusiones de proteínas y ARN. Además, en general, se prefieren los sistemas eucariotas frente a los sistemas bacterianos. Como las células eucariotas tienden a contener menores niveles de nucleasas, los tiempos de vida del ARNm son generalmente 10-100 veces mayores en estas células que en células bacterianas. En los experimentos en los que se usó un sistema de traducción de E. coli concreto, no se observó la generación de fusiones usando un molde codificante del epítopo c-myc; el marcaje del molde en diversos lugares demostró que esto se debía probablemente a la degradación de partes tanto ARN como ADN del molde.

Para examinar la parte peptídica de estas fusiones, se trataron las muestras con RNasa para eliminar las secuencias codificantes. Tras este tratamiento, el producto 43-P se desplazó con una movilidad casi idéntica al ligo 30-P marcado con ^{32}P, coincidiendo con un péptido muy pequeño (quizás sólo metionina) añadido al 30-P. Para LP77, la eliminación de la secuencia codificante generó un producto con menor movilidad que el oligo 30-P, coincidiendo con la noción de que se añadió un péptido de 12 aminoácidos a la puromicina. Finalmente, para LP154, la eliminación de la secuencia codificante generó un producto de una movilidad todavía menor, coincidiendo con una secuencia de 33 aminoácidos unida al oligo 30-P. No se observó oligo en el carril del reticulocito de LP154 tratado con RNasa debido a un error de carga. En la figura 9, se demostró que la movilidad de este producto era la misma que la del producto generado en el extracto de germen de trigo. En resumen, estos resultados indicaron que se añadieron productos resistentes a la RNasa a los extremos de los oligos 30-P, que los tamaños de los productos eran proporcionales a la longitud de las secuencias codificantes y que los productos eran bastante homogéneos en cuanto al tamaño. Además, aunque ambos sistemas generaron productos de fusión similares, el sistema de reticulocito pareció superior debido a una mayor estabilidad del molde.

Sensibilidad a la RNasa A y la proteinasa K. En la figura 9, se analizaron la sensibilidad a la RNasa A y a la proteinasa K usando la fusión LP154. Según lo mostrado en los carriles 2-4, se demostró la incorporación de ^{35}S-metionina para el molde LP154. Cuando se trató este producto con RNasa A, disminuyó la movilidad de la fusión, aún siendo todavía significativamente superior al oligonucleótido 30-P marcado con ^{32}p, coincidiendo con la adición de un péptido de 33 aminoácidos en el extremo 3'. Cuando se trató este material también con proteinasa K, la señal de ^{35}S desapareció completamente, coincidiendo de nuevo con la noción de que el marcador estaba presente en un péptido en el extremo 3' del fragmento de 30-P. Se han obtenido resultados similares en experimentos equivalentes usando las fusiones 43-P y LP77.

Para confirmar que el marcaje del molde con ^{35}S-Met era una consecuencia de la traducción, y más específicamente, que resultaba de la actividad peptidil-transferasa del ribosoma, se examinó el efecto de diversos inhibidores sobre la reacción de marcaje. Los inhibidores específicos de la peptidil-transferesa eucariota, la anisomicina, la gougerotina y la esparsomicina (Vazquez, "Inhibitors of Protein biosynthesis" (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 312 (1979)), así como los inhibidores de la translocación cicloheximida y emetina (Vazquez, "Inhibitors of Protein Biosynthesis" (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 312 (1979)), todos disminuyeron la formación de fusiones de péptidos y ARN en \sim95% usando el molde de myc largo y un extracto de traducción de lisado de reticulocito.

Experimentos de inmunoprecipitación. En un experimento diseñado para ilustrar la eficacia de la inmunoprecipitación de una fusión de péptido y ARNm, se hizo un intento por inmunoprecipitar un péptido c-myc libre generado mediante traducción in vitro. La figura 10 muestra los resultados de estos experimentos analizados sobre un gel de péptido por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Los carriles 1 y 2 muestran el material marcado procedente de reacciones de traducción que contienen bien ARN124 (la parte de ARN de LP154) o ARNm de \beta-globina. Los carriles 3-8 muestran la inmunoprecipitación de estas muestras de reacción usando el anticuerpo monoclonal frente a c-myc 9E10, en varias condiciones de tamponamiento diferentes (descritas más adelante). Los carriles 3-5 muestran que el péptido derivado de ARN124 fue inmunoprecipitado eficazmente, siendo el mejor de los casos el carril 4, en el que se aislaron el \sim83% de los recuentos precipitables de TCA totales. Los carriles 6-8 muestran un poco de proteína \beta-globina, indicando una purificación de >100 veces mayor. Estos resultados indicaron que el péptido codificado por ARN124 (y por LP154) se puede aislar cuantitavamente mediante este protocolo de inmunoprecipitación.

Inmunoprecipitación de la fusión. A continuación, se analizó la capacidad de inmunoprecipitación de un producto de péptido y ARN quimérico, usando una reacción de traducción de LP154 y el anticuerpo monoclonal frente a c-myc 9E10 (figura 11). Se aislaron los productos de traducción de una reacción con reticulocito mediante la inmunoprecipitación (según lo descrito en la presente memoria) y se trataron con 1 \mug de RNasa A a temperatura ambiente durante 30 minutos para eliminar la secuencia codificante. Esto generó un OH de 5', que fue marcado con ^{32}P con la polinucleótido quinasa de T4 y analizado mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante. La figura 11 demuestra que se aisló un producto con una movilidad similar al observado para la fusión del epítopo c-myc con 30-P generado mediante un tratamiento con RNasa de la fusión LP154 (véase lo anterior), pero que no se formó el producto correspondiente cuando sólo se tradujo la parte de ARN del molde (ARN124). En la figura 12, se determinó la cantidad de proteína de fusión aislada y se representó frente a la cantidad de 30-P sin modificar (no mostrada en esta figura). La cuantificación de la proporción entre el ligador sin modificar y la fusión de péptido myc y ligador muestra que 0,2-0,7% del mensaje de entrada fue convertido en producto de fusión. Se convirtió una fracción superior del ARN de entrada en producto de fusión en presencia de una proporción de ribosoma/molde superior; en el intervalo de concentraciones de ARNm de entrada que fueron analizadas, se formaron aproximadamente 0,8-1,0 x 10^{12} moléculas de fusión por ml de extracto de traducción.

Además, los resultados indicaron que los péptidos unidos a la especie de ARN estaban codificados por ese ARNm, i.e., el péptido naciente no fue transferido a la puromicina de algún otro ARNm. No se observó ninguna indicación de transferencia cruzada al coincubar un ligador (30-P) con el molde de myc largo en los extractos de traducción en proporciones tan elevadas como de 20:1, ni la presencia de ligador libre disminuyó significativamente la cantidad de fusión de myc largo producida. De manera similar, la co-traducción de moldes cortos y largos, 43-P y LP154, sólo generó los productos de fusión observados cuando los moldes fueron traducidos solos, y no se observaron productos de movilidad intermedia, como cabría esperar para la fusión del molde corto con el péptido myc largo. Ambos resultados sugirieron que la formación de fusiones tuvo lugar fundamentalmente entre un péptido naciente y ARNm enlazado al mismo ribosoma.

Aislamiento secuencial. Como una mayor confirmación de la naturaleza del producto de molde LP154 traducido in vitro, se examinó el comportamiento de este producto sobre dos tipos diferentes de medios cromatográficos. La tiopropil (TP)-sefarosa permite el aislamiento de un producto que contiene una cisteína libre (por ejemplo, el producto LP154 que tiene un residuo de cisteína adyacente al terminal C) (figura 13). De manera similar, la dT_{25}-agarosa permite el aislamiento de moldes que contienen una secuencia de poli(dA) (por ejemplo, 30-P) (figura 13). La figura 14 demuestra que el aislamiento secuencial sobre TP-sefarosa seguida por dT_{25}-agarosa generó el mismo producto que el aislamiento sólo sobre dT_{25}-agarosa. El hecho de que el producto de traducción in vitro contuviera tanto un tracto de poli(A) como un tiol libre indicaba firmemente que el producto de traducción era la fusión de péptido y ARN deseada.

Los resultados anteriores coinciden con la capacidad para sintetizar fusiones de péptidos y ARNm, y para recuperarlas intactas de extractos de traducción in vitro. Las partes peptídicas de las fusiones así sintetizadas parecían tener las secuencias deseadas según lo demostrado mediante inmunoprecipitación y aislamiento usando técnicas cromatográficas apropiadas. Según los resultados presentados anteriormente, las reacciones son intramoleculares y tienen lugar de un modo dependiente del molde. Finalmente, incluso con una modificación del molde menor del 1%, el presente sistema facilita selecciones basadas en complejidades candidatas de aproximadamente 10^{13} moléculas.

Selección de recuperación de epítopo c-myc. Para seleccionar más epítopos c-myc, se genera una gran genoteca de moldes de traducción (por ejemplo, de 10^{15} miembros) que contiene una región aleatorizada (véase la figura 7C y más adelante). Esta genoteca se usa para generar \sim10^{12}-10^{13} fusiones (según lo descrito en la presente memoria) que son tratadas con el anticuerpo anti-c-myc (por ejemplo, mediante inmunoprecipitación o usando un anticuerpo inmovilizado sobre una columna u otro soporte sólido) para enriquecer con moldes codificantes de c-myc en series repetidas de la selección in vitro.

Modelos para la formación de fusiones. Sin quedar vinculados a ninguna teoría en particular, se propone un modelo para el mecanismo de formación de fusiones en el que la traducción comienza normalmente, continuando el alargamiento hasta el extremo del marco de lectura abierto. Cuando el ribosoma llega a la parte de ADN del molde, se detiene la traducción. En este momento, puede haber dos opciones para el complejo: la disociación del péptido naciente o la transferencia del péptido naciente a la puromicina en el extremo 3' del molde. La eficacia de la reacción de transferencia está probablemente controlada por un número de factores que influyen en la estabilidad del complejo de traducción detenido y la entrada del residuo de puromicina de 3' en el sitio A del centro peptidil-transferasa. Tras la reacción de transferencia, es probable que la fusión de péptido y ARNm permanezca en forma de complejo con el ribosoma, pues los factores de liberación conocidos no pueden hidrolizar el enlace de tipo amida estable entre los dominios del ARN y del péptido.

Tanto el modelo clásico de alargamiento (Watson, Bull. Soc. Chim. Biol. 46: 1399 (1964)) como el modelo de estados intermedios (Moazed y Noller, Nature 342:142 (1989)) requieren que el sitio A esté vacío para la entrada de puromicina en el centro peptidil-transferasa. Para que la puromicina entre en el sitio A vacío, el ligador debe bien formar un bucle en torno al exterior del ribosoma o pasar directamente desde el sitio de descodificación por el sitio A hasta el centro peptidil-transferasa. Los datos descritos en la presente memoria no distinguen claramente entre estas alternativas, porque el ligador más corto analizado (21 nt) sigue siendo lo suficientemente largo como para rodear el exterior del ribosoma. En algunos modelos de estructura ribosómica (Frank et al., Nature 376:441 (1995)), el ARNm es pasado por un canal que se extiende sobre cualquiera de los lados del sitio de descodificación, en cuyo caso sería necesario sacar el ligador del canal para permitir que la puromicina alcanzara el centro peptidil-transferasa por el
sitio A.

La transferencia del péptido naciente a la puromicina pareció ser lenta en relación con el procedimiento de alargamiento según lo demostrado por la homogeneidad y la longitud del péptido unido al ligador. Si la puromicina compitiera eficazmente con los ARNt de aminoacilo durante el alargamiento, cabría esperar que las fusiones de péptido y ligador presentes en los productos de fusión fueran de un tamaño heterogéneo. Además, el ribosoma no parecía leerse en la región del ligador según lo indicado por la similitud en las movilidades del gel entre la fusión del molde y Met, y el ligador sin modificar. dA_{3n} debería codificar (lisina)_{n}, lo que ciertamente disminuiría la movilidad del ligador. La lenta velocidad de salida del ARNm puede explicar la lenta velocidad de formación de fusiones en comparación con la velocidad de translocación. Los resultados preliminares sugieren que la cantidad de producto de fusión formado aumenta notablemente tras períodos prolongados de incubación posteriores a la traducción a una temperatura baja, quizás debido al aumento de tiempo disponible para transferir el péptido naciente a la puromicina.

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Materiales y procedimientos detallados

A continuación, se describen los materiales y los procedimientos detallados relativos a la traducción in vitro y el análisis de las fusiones de proteínas y ARN, incluyendo fusiones que tienen una etiqueta de epítopo myc.

Secuencias. En lo anterior, se usó un número de oligonucleótidos para la generación de fusiones de proteínas y ARN. Estos oligonucleótidos tienen las siguientes secuencias.

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1

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2

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Todos los oligonucleótidos figuran en el sentido de 5' a 3'. Las bases de ribonucleótido están indicadas con una "r" minúscula antes de la denominación del nucleótido; P es puromicina; rN indica cantidades iguales de rA, rG, rC y rU; rS indica cantidades iguales de rG y rC; y el resto de las denominaciones de las bases indican oligonucleótidos de ADN.

Compuestos químicos. El HCl de puromicina, el vidrio de poro controlado de alquilamina de cadena larga, la gougerotina, el cloranfenicol, la virginiamicina, el DMAP, el cloruro de dimetiltritilo y el anhídrido acético fueron obtenidos en Sigma Chemical (St. Louis, MO). La piridina, la dimetilformamida, el tolueno, el anhídrido succínico y el para-nitrofenol fueron obtenidos en Fluka Chemical (Ronkonkoma, NY). El ARNm de beta-globina fue obtenido en Novagen (Madison, WI). El ARN del TMV fue obtenido en Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN).

Enzimas. La proteinasa K fue obtenida en Promega (Madison, WI). La ARNasa libre de ADNasa bien se produjo mediante el protocolo de Sambrook et al., (supra) o se adquirió en Boehringer Mannheim. La polimerasa de T7 fue elaborada mediante el protocolo publicado de Grodberg y Dunn (J. Bacteriol. 170:1245 (1988)) con las modificaciones de Zawadzki y Gross (Nucl. Acids Res. 19:1948 (1991)). La ADN ligasa de T4 se obtuvo en New England Biolabs (Beverly, MA).

Cuantificación de la incorporación de radiomarcador. Para las bandas de geles radiactivos, la cantidad de radiomarcador (^{35}S o ^{32}P) presente en cada banda se determinó mediante la cuantificación bien sobre un analizador de transferencia Betagen 603 (Betagen, Waltham, MA) o usando placas de Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Para las muestras líquidas y sólidas, la cantidad de radiomarcador (^{35}S o ^{32}P) presente se determinó mediante recuento de centelleo (Beckman, Columbia, MD).

Imágenes de geles. Las imágenes de los geles se obtuvieron mediante una autorradiografía (usando una película XAR de Kodak) o usando placas de Phosphorimager (Molecular Dynamics).

Síntesis de CPG-puromicina. Los protocolos detallados para la síntesis de CPG-puromicina se explican resumidamente anteriormente.

Reacciones enzimáticas. En general, se realizó la misma preparación de los ácidos nucleicos para las reacciones de quinasa, transcripción, PCR y traducción usando extractos de E. coli. Cada protocolo preparativo comenzó con una extracción usando un volumen igual de fenol/cloroformo (1:1), seguido por la centrifugación y el aislamiento de la fase acuosa. Se añadieron acetato de sodio (pH 5,2) y espermidina hasta una concentración final de 300 mM y 1 mM, respectivamente, y se precipitó la muestra mediante la adición de 3 volúmenes de etanol al 100% y una incubación a -70ºC durante 20 minutos. Se centrifugaron las muestras a >12.000 g, se retiró el sobrenadante y se lavaron los sedimentos con un exceso de etanol al 95% a 0ºC. Entonces se secaron los sedimentos resultantes al vacío y se volvieron a suspender.

Oligonucleótidos. Todo el ADN y el ARN sintético fue sintetizado sobre un sintetizador Millipore Expedite usando la química estándar para cada uno según fue suministrado por el fabricante (Milligen, Bedford, MA). Los oligonucleótidos que contenían puromicina en 3' se sintetizaron usando columnas de CPG-puromicina empaquetadas con 30-50 mg de soporte sólido (\sim20 \mumoles de puromicina/gramo). Los oligonucleótidos que contenían biotina en 3' se sintetizaron usando columnas de CPG BioTEG de 1 \mumol de Glen Research (Sterling, VA). Los oligonucleótidos que contenían biotina en 5' se sintetizaron mediante la adición de fosforamidita BioTEG (Glen Research) como la base de 5'. Los oligonucleótidos destinados a ser unidos con los extremos 3' de las moléculas de ARN fueron bien fosforilados químicamente en el extremo 5' (usando reactivo de fosforilación química de Glen Research) antes de la desprotección o fosforilados enzimáticamente usando ATP y polinucleótido quinasa de T4 (New England Biolabs) tras la desprotección. Las muestras que sólo contenían ADN (y puromicina en 3' o biotina en 3') fueron desprotegidas mediante la adición de NH_{4}OH al 25% seguida por la incubación durante 12 horas a 55ºC. Las muestras que contenían monómeros de ARN (p. ej., 43-P) fueron desprotegidas mediante la adición de etanol (25% (v/v) a la solución de NH_{4}OH y la incubación durante 12 horas a 55ºC. El OH de 2' fue desprotegido usando TBAF 1M en THF (Sigma) durante 48 horas a temperatura ambiente. El TBAF se eliminó usando una columna de Sephadex NAP-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Si se desea, para analizar la presencia de grupos hidroxilo en 3', se puede radiomarcar el oligonucleótido de puromicina en el extremo 5' usando polinucleótido quinasa de T4 y luego usarlo como un cebador para la prolongación con desoxinucleotidil-transferasa terminal. La presencia de la amina primaria en la puromicina se puede analizar mediante la reacción con reactivos derivados de amina tales como NHS-LC-biotina (Pierce). Los oligonucleótidos, tales como el 30-P, muestran un desplazamiento de la movilidad detectable mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante tras la reacción, lo que indica una reacción cuantitativa con el reactivo. Los oligonucleótidos que carecen de puromicina no reaccionan con NHS-LC-biotina ni muestran un cambio de movilidad.

Entonces se purificaron las muestras de ADN y ARN desprotegidas usando electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, seguida por bien una humectación o una electroelución desde el gel usando un Elutrap (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y una desalinización usando bien una columna Sephadex NAP-25 o una precipitación en etanol según lo descrito anteriormente.

\newpage

Construcción de ADN de myc. Se construyeron dos moldes de ADN que contenían la etiqueta de epítopo c-myc. El primer molde se formó a partir de una combinación de los oligonucleótidos 64.27 (5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3') (SEC ID N.º 18) y 18.109 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3') (SEC ID N.º 19). La transcripción usando este molde generó el ARN 47.1 que codificaba el péptido MEQKLISEEDLN (SEC ID N.º 20). La unión de ARN 47.1 con 30-P produjo LP77 mostrado en la figura 7A.

El segundo molde primero fue formado como un solo oligonucleótido de 99 bases de longitud, con la denominación RWR 99.6 y la secuencia 5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTC CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3' (SEC ID N.º 21). Los moldes de transcripción bicatenarios que contenían esta secuencia se construyeron mediante PCR con los oligos RWR 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3') (SEC ID N.º 22) y RWR 63.26 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3') (SEC ID N.º 23) según los protocolos publicados (Ausubel et al., supra, capítulo 15). La transcripción usando este molde generó un ARN denominado ARN124 que codificaba el péptido MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (SEC ID N.º 24). Este péptido contenía la secuencia usada para aumentar el anticuerpo monoclonal 9E10 cuando estaba conjugado con una proteína transportadora (Oncogene Science Technical Bulletin). El ARN124 tenía una longitud de 124 nucleótidos y la unión del ARN124 con 30-P produjo LP154 mostrado en la figura 7B. La secuencia de ARN124 es la siguiente (SEC ID N.º 32):

3

Construcción de mezcla aleatorizada. La mezcla aleatorizada se construyó como un solo oligonucleótido de 130 bases de longitud denominado RWR130. 1. Comenzando por el extremo 3', la secuencia era 3' CCCTGTTAATGA
TAAATGTTAATGTTAC (NNS)_{27} GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (SEC ID N.º 25). N denota una posición aleatoria, y esta secuencia fue generada según el protocolo sintetizador estándar. S denota una mezcla igual de bases dG y dC. La PCR se realizó con los oligonucleótidos 42.108 ((5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA) (SEC ID N.º 26) y 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (SEC ID N.º 27). La transcripción fuera de este molde produjo un ARN denominado mezcla 130.1. La unión de la mezcla 130.1 con 30-P produjo la mezcla n.º 1 (también denominada LP160) mostrada en la figura 7C.

Se realizaron siete ciclos de PCR según los protocolos publicados (Ausubel et al., supra) con las siguientes excepciones: (i) la concentración inicial de RWR130.1 fue de 30 nanomolar, (ii) cada cebador se usó a una concentración de 1,5 \muM, (iii) la concentración de dNTP era de 400 \muM para cada base e (iv) la polimerasa de Taq (Boehringer Mannheim) se usó a 5 unidades por cada 100 \mul. El producto bicatenario fue purificado sobre electroforesis sobre gel de poliacrilamida no desnaturalizante y aislado mediante electroelución. Se determinó la cantidad de ADN tanto por absorbancia de radiación UV a 260 nm como por comparación de la fluorescencia de bromuro de etidio con patrones conocidos.

Síntesis enzimática de ARN. Las reacciones de transcripción desde ADN de PCR bicatenario y oligonucleótidos sintéticos se realizaron según lo descrito anteriormente (Milligan y Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51 (1989)). El ARN de longitud completa se purificó mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, se electroeluyó y se desalinizó según lo descrito anteriormente. Se estimó la concentración de ARN de la mezcla usando un coeficiente de extinción de 1.300 D.O./\mumol; ARN124, 1.250 D.O./\mumol; ARN47.1, 480 D.O./\mumol. La transcripción del ADN de la mezcla bicatenario produjo \sim90 nanomoles de ARN de mezcla.

Síntesis enzimática de conjugados de ARN-puromicina. La unión del myc y las secuencias de ARN mensajero de la mezcla con la puromicina que contenía oligonucleótido se realizó usando un puente de ADN, denominado 19.35 ((5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A) (SEC ID N.º 28) usando un procedimiento análogo al descrito por Moore y Sharp (Science 250: 992 (1992)). La reacción estaba compuesta por ARNm, el puente y oligonucleótido de puromicina (30-P, dA27dCdCP) en una proporción molar de 0,8:0,9:1,0 y 1-2,5 unidades de ADN ligasa por picomol de ARNm de mezcla. Las reacciones se realizaron durante una hora a temperatura ambiente. Para la construcción de las fusiones de ARN de la mezcla, la concentración del ARNm fue de \sim6,6 \mumolar. Tras la unión, se preparó el conjugado de ARN-puromicina según lo descrito anteriormente para las reacciones enzimáticas. Se volvió a suspender el precipitado, y se purificaron las fusiones de longitud completa por electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, y se aislaron mediante electroelución según lo descrito anteriormente. Se estimó la concentración de ARN de la mezcla usando un coeficiente de extinción de 1.650 D.O./\mumol y el molde de myc de 1.600 D.O./\mumol. De este modo, se generaron 2,5 nanomoles de conjugado.

Preparación de dT_{25}-estreptavidina-agarosa. Se incubó dT_{25} que contenía una biotina en 3' (sintetizada sobre columnas de fosforamidita BioTEG (Glen Research)) y se desalinizó sobre una columna de NAP-25 (Pharmacia) a 1-10 \muM o incluso a 1-20 \muM con una suspensión de estreptavidina-agarosa (agarosa al 50% en volumen, Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora a temperatura ambiente en TE (Cloruro de Tris 10 mM, pH 8,2; EDTA 1 mM) y se lavó. Entonces se estimó la capacidad de unión de la agarosa ópticamente mediante la desaparición de biotina-dT_{25} de la solución y/o mediante la valoración de la resina con cantidades conocidas de oligonucleótido complementario.

Reacciones de traducción usando extractos derivados de E. coli y ribosomas. En general, las reacciones de traducción se realizaron con equipos adquiridos comercialmente (por ejemplo, extracto de S30 de E. coli para moldes lineales, Promega, Madison, WI). Sin embargo, también se usó MRE600 de E. coli (obtenido en la ATCC, Rockville, MD) para generar extractos de S30 preparados según los protocolos publicados (por ejemplo, Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301 (1991)), así como una fracción ribosómica preparada según lo descrito por Kudlicki et al. (Anal. Biochem. 206:389 (1992)). La reacción estándar se realizó en un volumen de 50 \mul con 20-40 \muCi de ^{35}S-metionina como marcador. La mezcla de reacción estaba compuesta de extracto al 30% (v/v), MgCl_{2} 9-18 mM; premezcla sin metionina al 40% (Promega) (v/v) y 5 \muM de molde (p. ej., 43-P). Para los experimentos de coincubación, se añadieron los oligos 13-P y 25-P a una concentración de 5 \muM. Para los experimentos en los que se usaban ribosomas, se añadieron 3 \mul de solución ribosómica por reacción en lugar del lisado. Todas las reacciones se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Los moldes se purificaron según lo descrito anteriormente en reacciones
enzimáticas.

Reacciones de traducción con germen de trigo. Las reacciones de traducción de la figura 8 se realizaron usando equipos adquiridos comercialmente que carecían de metionina (Promega) según las recomendaciones del fabricante. Las concentraciones de molde fueron de 4 \muM para 43-P y de 0,8 \muM para LP77 y LP154. Las reacciones se realizaron a 25ºC con 30 \muCi de ^{35}S-metionina en un volumen total de 25 \mul.

Reacciones de traducción de reticulocito. Las reacciones de traducción se realizaron bien con equipos adquiridos comercialmente (Novagen, Madison, WI) o usando extracto preparado según los protocolos publicados (Jackson y Hunt, Meth. Enzymol. 96: 50 (1983)). Se obtuvo sangre rica en reticulocito en Pel-Freez Biologicals (Rogers, AK). En ambos casos, las condiciones de reacción fueron las recomendadas para el uso con lisado Red Nova (Novagen). Las reacciones estaban compuestas de KCl 100 mM; MgOAc 0,5 mM; DTT 2 mM; HEPES 20 mM, pH 7,6; creatina-fosfatasa 8 mM, 25 \muM de cada aminoácido (con la excepción de la metionina en caso de usarse ^{35}S-Met) y 40% (v/v) de lisado. La incubación se realizó a 30ºC durante 1 hora. Las concentraciones de molde dependieron del experimento, pero, en general, variaron de 50 nM a 1 \muM con la excepción de 43-P (figura 6H) que fue de 4 \muM.

Para la generación de la mezcla aleatorizada, se realizaron 10 ml de reacción de traducción a una concentración de molde de \sim0,1 \muM (1,25 nanomoles de molde). Además, se incluyó en la reacción molde marcado con ^{32}P para permitir la determinación de la cantidad de material presente en cada etapa del procedimiento de purificación y de selección. Tras la traducción a 30ºC durante una hora, se enfrió la reacción sobre hielo durante 30-60 minutos.

Aislamiento de la fusión con dT25-estreptavidina-agarosa o celulosa de oligo(dT). Tras la incubación, se diluyó la reacción de traducción aproximadamente 150 veces más en tampón de aislamiento (NaCl 1,0M; cloruro de Tris 0,1M, pH 8,2; EDTA 10 mM y bien DTT 1 mM o Triton X-100 al 0,2%) que contenía un exceso molar más de 10 veces mayor de dT_{25}-biotina-estreptavidina-agarosa cuya concentración de dT_{25} era de \sim10 \muM (volumen de suspensión igual o mayor que el volumen de lisado) o celulosa de oligo(dT) (Pharmacia), y se incubó con agitación a 4ºC durante una hora. Entonces se retiró la agarosa de la mezcla bien por filtración (filtros Ultrafree MC de Millipore) o por centrifugación, y se lavó con tampón de aislamiento frío 2-4 veces. Entonces se liberó el molde de la dT_{25}-estreptavidina-agarosa mediante el lavado repetido con alícuotas de 50-100 \mul de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM a 4ºC o agua pura a temperatura ambiente. Se neutralizó el eluyente inmediatamente en NaOAc 3M, pH 5,2; espermidina 10 mM, y se precipitó en etanol o se usó directamente para la siguiente etapa de purificación. Para la reacción de mezcla, la radiactividad total recuperada indicó la recuperación del aproximadamente 50-70% de molde de entrada.

Aislamiento de la fusión con tiopropil-sefarosa. Las fusiones que contienen cisteína se pueden purificar usando tiopropil-sefarosa 6B como en la figura 13 (Pharmacia). En los experimentos descritos en la presente memoria, el aislamiento se llevó a cabo bien directamente a partir de la reacción de traducción o tras el aislamiento inicial de la fusión (p. ej., con estreptavidina-agarosa). Para las muestras purificadas directamente, se usó una proporción de lisado y sefarosa (v/v) de 1:10. Para la mezcla, se usaron 0.5 ml de suspensión de sefarosa para aislar todo el material de fusión de 5 ml de mezcla de reacción. Las muestras se diluyeron en suspensión (v/v) al 50:50 de tiopropil-sefarosa en 1 x TE 8,2 (Tris-Cl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,2) que contenía RNasa libre de ADNasa (Boehringer Mannheim) y se incubaron con rotación durante 1-2 horas a 4ºC para permitir que la reacción se completara. Se retiró el exceso de líquido, y se lavó la sefarosa repetidamente con tampón de aislamiento que contenía DTT 20 mM y se recuperó mediante centrifugación o filtración. Se eluyeron las fusiones desde la sefarosa usando una solución de ditiotreitol (DTT) 25-30 mM en cloruro de Tris 10 mM, pH 8,2; EDTA 1 mM. Entonces se concentró la fusión mediante una combinación de evaporación bajo un alto vacío, precipitación en etanol según lo descrito anteriormente y, en caso de desearlo, se analizó mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida-tricina-SDS. Para la reacción de mezcla, la radiactividad total recuperada indicó la conversión del molde en fusión del aproximadamente 1%.

Para ciertas aplicaciones, se añadió dT_{25} a este eluido y se hizo girar durante 1 hora a 4ºC. Se aclaró la agarosa tres veces con tampón de aislamiento frío, se aisló mediante filtración y se eluyó el material unido según lo descrito. Se añadió ARNt transportador y se precipitó en etanol el producto de fusión. Se volvió a suspender la muestra en TE, pH 8,2, que contenía RNasa A libre de ADNasa para eliminar la parte de ARN del molde.

Reacciones de inmunoprecipitación. Las inmunoprecipitaciones de los péptidos procedentes de reacciones de traducción (figura 10) se realizaron mezclando 4 \mul de reacción de traducción de reticulocito; 2 \mul de suero de ratón normal y 20 \mul de proteína G + agarosa A (Calbiochem, La Jolla, CA) con 200 \mul de bien PBS (Na_{2}HPO_{4} 58 mM; NaH_{2}PO_{4} 17 mM; NaCl 68 mM), tampón de dilución (cloruro de Tris 10 mM, pH 8,2; NaCl 140 mM; Triton X-100 (v/v) al 1% o PBSTDS (PBS + Triton X-100 al 1%, desoxicolato al 0,5%; SDS al 0,1%). Entonces se hicieron girar las muestras durante una hora a 4ºC, tras lo que se centrifugaron a 2.500 rpm durante 15 minutos. Se retiró el eluyente y se añadieron 10 \mul de anticuerpo monoclonal frente a c-myc 9E10 (Calbiochem, La Jolla, CA) y 15 \mul de proteína G + agarosa A, y se hicieron girar durante 2 horas a 4ºC. Entonces se lavaron las muestras con dos volúmenes de 1 ml de bien PBS, tampón de dilución o PBSTDS. Se añadieron 40 \mul de tampón de carga de gel (Calbiochem Product Bulletin) a la mezcla y se cargaron 20 \mul sobre una electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante según lo descrito por Schagger y von Jagow (Anal. Biochem. 166: 368 (1987)).

Las inmunoprecipitaciones de fusiones (según lo mostrado en la figura 11) se realizaron mezclando 8 \mul de reacción de traducción de reticulocito con 300 \mul de tampón de dilución (cloruro de Tris 10 mM; pH 8,2; NaCl 140 mM; Triton X-100 (v/v) al 1%; 15 \mul de proteína G-sefarosa (Sigma) y 10 \mul (1 \mug) de anticuerpo frente a c-myc 9E10 (Calbiochem), seguidos por una rotación durante varias horas a 4ºC. Tras el aislamiento, se lavaron las muestras, se trataron con RNasa A libre de ADNasa, se marcaron con polinucleótido quinasa y ^{32}P-gamma-ATP, y se separaron mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida-urea desnaturalizante (figura 11).

Transcripción inversa de la mezcla de fusión. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron según las recomendaciones de los fabricantes para Superscript II, a excepción de que el molde, el agua y el cebador se incubaron a 70ºC durante sólo dos minutos (Gibco BRL, Grand Island, NY). Para controlar la prolongación, se incluyeron 50 \muCi de alfa-^{32}P-dCTP en algunas reacciones; en otras reacciones, la transcripción inversa se controló usando cebadores marcados en ^{32}P en 5' que fueron preparados usando ^{32}P-\alphaATP (New England Nuclear, Boston, MA) y polinucleótido quinasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA).

Preparación de sefarosa con proteína G y anticuerpo. Se lavaron dos alícuotas de 50 \mul de suspensión de proteína G y sefarosa (50% de sólido en volumen) (Sigma) con tampón de dilución (cloruro de Tris 10 mM, pH 8,2; NaCl 140 mM; NaN_{3} al 0,025%; Triton X-100 (v/v) al 1%) y se aislaron mediante centrifugación. Se invirtió el primer alícuota para su uso como una precolumna antes de la matriz de selección. Tras la resuspensión del segundo alícuota en el tampón de dilución, se añadieron 40 \mul de anticuerpo monoclonal AB-1 frente a c-myc (Oncogene Science), y se incubó la reacción durante una noche a 4ºC con rotación. Entonces se purificó la sefarosa con anticuerpo mediante centrifugación durante 15 minutos a 1.500-2.500 rpm en un microcentrifugador y se lavó 1-2 veces con tampón de dilución.

Selección. Tras el aislamiento de la fusión y la síntesis de cadenas complementarias, se usó directamente toda la reacción de transcriptasa inversa en el procedimiento de selección. Aquí se esbozan dos protocolos. Para la serie uno, se añadió la reacción de transcriptasa inversa directamente a la sefarosa con anticuerpo preparada según lo descrito anteriormente y se incubó durante 2 horas. Para las series posteriores, la reacción se incuba \sim2 horas con proteína G-sefarosa lavada antes de la columna de anticuerpo para disminuir el número de aglutinantes que interactúan con la proteína G en lugar de con el anticuerpo inmovilizado.

Para eluir la mezcla desde la matriz, se pueden adoptar varios enfoques. El primero consiste en lavar la matriz de selección con ácido acético al 4%. Este procedimiento libera el péptido de la matriz. Alternativamente, se puede usar un lavado más restrictivo (p. ej., usando urea u otro desnaturalizante) en lugar de o además del enfoque del ácido acético.

PCR de fusiones seleccionadas. Las moléculas seleccionadas se amplifican mediante PCR usando protocolos estándar (por ejemplo, Fitzwater y Polisky, Meth. Enzymol. 267:275 (1996); y Conrad et al., Meth. Enzymol. 267:336 (1996)), según lo descrito anteriormente para la construcción de la mezcla. La realización de controles por PCR en esta etapa puede ser deseable para garantizar que la mezcla amplificada resulte de la selección realizada. La pureza del cebador es de importancia fundamental. Los pares deberían ser amplificados en ausencia de molde de entrada, pues puede tener lugar la contaminación con las secuencias de la mezcla o los constructos control. Si se encuentra contaminación, deberían sintetizarse nuevos cebadores. Las fusiones aisladas también deberían ser sometidas a una PCR antes de la etapa de TI para garantizar que no están contaminadas con ADNc. Finalmente, se debería comparar el número de ciclos necesario para las reacciones PCR antes y después de la selección. La necesidad de grandes números de ciclos para amplificar una secuencia dada (>25-30 series de PCR) puede indicar un fallo de la reacción de TI o problemas con los pares de cebadores.

Síntesis y análisis de fusiones de beta-globina

Para sintetizar un constructo de fusión de \beta-globina, se generó ADNc de \beta-globina a partir de 2,5 \mug de ARNm de globina mediante la transcripción inversa con 200 pmoles de cebador 18.155 (5' GTG GTA TTT GTG AGC CAG) (SEC ID N.º 29) y transcriptasa inversa Superscript (Gibco BRL) según el protocolo del fabricante. La secuencia del cebador era complementaria a los 18 nucleótidos del 5' de \beta-globina del codón de terminación. Para añadir un promotor de T7, se retiraron 20 \mul de reacción de transcripción inversa y se sometieron a 6 ciclos de PCR con cebadores 18.155 y 40.54 (5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C) (SEC ID N.º 30). Se generó entonces el ARNm de "sin-\beta-globina" resultante mediante una transcripción no iniciada de T7 según Milligan y Uhlenbeck (Methods Enzymol. 180:51 (1989)), y luego se purificó sobre gel de ARN, se electroeluyó y se desalinizó según lo descrito en la presente memoria. Entonces se generó "LP-\beta-globina" desde el constructo de sin-\beta-globina mediante la unión de ese constructo con 30-P según el procedimiento de Moore y Sharp (Science 256:992 (1992)) usando el cebador 20.262 (5' TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G) (SEC ID N.º 31) como puente. Luego se purificó sobre gel el producto de la reacción de unión, se electroeluyó y se desalinizó como anteriormente. Se determinó la concentración del producto final por absorbancia a 260 nm.

Entonces se tradujeron in vitro estos moldes de \beta-globina según lo descrito en la tabla 1 en un volumen total de 25 \mul cada uno. Se añadió Mg^{2+} de una solución madre 25 mM. Todas las reacciones se incubaron a 30ºC durante una hora y se colocaron a -20ºC durante una noche. Se determinaron entonces las CPM precipitables de dT_{25} dos veces usando 6 \mul de lisado y las medias menos el fondo.

TABLA 1

4

Para preparar las muestras para el análisis del gel, se mezclaron 6 \mul de cada reacción de traducción con 1.000 \mul de tampón de aislamiento (NaCl 1M; Tris-Cl 100 mM, pH 8,2; EDTA 10 mM; DTT 0,1 mM), 1 \mul de RNasa A (libre de ADNasa, Boehringer Mannheim) y 20 \mul de dT_{25}-estreptavidina-agarosa 20 \muM. Se incubaron las muestras a 4ºC durante una hora con rotación. Se retiró el exceso de tampón de aislamiento y se añadieron las muestras a un filtro MC de Millipore para eliminar cualquier resto de tampón de aislamiento. Entonces se lavaron las muestras cuatro veces con 50 \mul de H_{2}O y dos veces con 50 \mul de NaOH 15 mM y EDTA 1 mM. Se neutralizó la muestra (300 \mul) con 100 \mul de TE, pH 6,8 (Tris-Cl 10 mM; EDTA 1 mM), se añadió 1 \mul de 1 mg/ml de RNasa A (como la anterior) y se incubaron las muestras a 37ºC. Entonces se añadieron 10 \mul de 2 x tampón de carga de SDS (Tris-Cl 125 mM, pH 6,8; SDS al 2%; \beta-mercaptoetanol al 2%; glicerol al 20%; azul de bromofenol al 0,001%), y se liofilizó la muestra hasta la sequedad y se volvió a suspender en 20 \mul de H_{2}O y \beta-mercaptoetanol al 1%. Entonces se cargaron las muestras en un gel de resolución de péptidos según lo descrito por Schagger y von Jagow (Analytical Biochemistry 166:368 (1987)) y se visualizaron por autorradiografía.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 15A y 15B. Según lo indicado en la figura 15A, se incorporó ^{35}S-metionina en la parte proteica de las fusiones de sin-\beta-globina y LP-\beta-globina. La proteína era heterogénea, pero una potente banda mostró la movilidad esperada para el ARNm de la \beta-globina. Además, según lo mostrado en la figura 15B, tras el aislamiento de dT_{25} y la digestión con RNasa A, no quedó nada de material marcado con ^{35}S en los carriles de sin-\beta-globina (figura 15B, carriles 2-4). Por el contrario, en los carriles de LP-\beta-globina, se observó un producto marcado con ^{35}S de tamaño heterogéneo.

Estos resultados indicaron que, según lo anterior, sólo se aisló un producto de fusión mediante cromatografía de afinidad de oligonucleótidos cuando el molde contenía puromicina en 3'. Esto fue confirmado mediante recuento de centelleo (véase la tabla 1). Se espera que el material obtenido contenga el ligador 30-P fusionado con alguna parte de la \beta-globina. El producto de fusión pareció de un tamaño bastante homogéneo a juzgar por el análisis del gel. Sin embargo, como el producto presentaba una movilidad muy similar a la \beta-globina natural (figuras 15A y 15B, carriles de control), resultó difícil determinar la longitud exacta de la parte proteica del producto de fusión.

Mayor optimización de la formación de fusiones de proteínas y ARN

Se han descubierto ciertos factores que aumentan más la eficacia de la formación de fusiones de péptidos y ARN. La formación de fusiones, i.e., la transferencia de la cadena peptídica naciente desde su ARNt al resto de puromicina del extremo 3' del ARNm, es una reacción lenta que sigue a la traducción inicial relativamente rápida del marco de lectura abierto para generar el péptido naciente. El grado de formación de fusiones se puede aumentar sustancialmente mediante una incubación posterior a la traducción en condiciones de Mg^{2+} elevado (preferiblemente, en un intervalo de 50-100 mM) y/o mediante el uso de un ligador más flexible entre el ARNm y el resto de puromicina. Además, las incubaciones prolongadas (12-48 horas) a temperaturas bajas (preferiblemente a -20ºC) también dan como resultado mayores producciones de fusiones con menor degradación del ARNm de la que tiene lugar durante la incubación a 30ºC. Mediante la combinación de estos factores, se puede convertir hasta el 40% del ARNm de entrada en productos de fusión de péptido y ARNm como se muestra a continuación.

Síntesis de conjugados de ARNm-puromicina. En estos experimentos de optimización, se unieron oligonucleótidos ligadores que contenían puromicina con los extremos 3' de ARNm usando ADN ligasa del bacteriófago T4 en presencia de puentes de ADN complementarios, en general, según lo descrito anteriormente. Como la ADN ligasa de T4 prefiere una apareamiento de bases exacto cerca de la zona de unión y los productos de la transcripción no iniciada con ARN polimerasa de T7, T3 o SP6 suelen ser heterogéneos en sus extremos 3' (Nucleic Acids Research 15:8783 (1987)), sólo se unieron eficazmente aquellos ARN que contenían el nucleótido terminal en 3' correcto. Cuando se usó un puente de ADN estándar, se unieron aproximadamente el 40% de los productos de transcripción no iniciada con el oligo de puromicina. La cantidad de producto de unión se aumentó usando un exceso de ARN, pero no aumentó mediante el uso de un exceso de oligonucleótido de puromicina. Sin quedar vinculados a ninguna teoría en particular, pareció que el factor restrictivo para la unión fue la cantidad de ARN que era completamente complementario con la correspondiente región del puente de ADN.

Para permitir la unión de aquellos transcriptos que finalizaban con un nucleótido más no moldeado en el terminal 3' (denominados "productos N+1"), se usó una mezcla del puente de ADN estándar con un nuevo puente de ADN que contenía una base aleatoria más en la zona de unión. La eficacia de unión aumentó hasta más del 70% para un molde de ARN de myc ejemplar (es decir, el ARN124) en presencia de tal puente de ADN mixto.

Además de este enfoque del puente de ADN modificado, se aumentó todavía más la eficacia de la formación de conjugados de ARNm-puromicina teniendo en cuenta los tres siguientes factores. En primer lugar, se diseñaron o se utilizaron preferiblemente ARNm que carecían de terminal 3' que tuviera cualquier estructura secundaria significativa estable que pudiera interferir en el apareamiento con un oligonucleótido puente. Además, debido a que una salinidad elevada a veces provoca el fallo de la reacción de unión, se incluyó preferiblemente la profunda desalinización de los oligonucleótidos usando columnas de NAP-25 como una etapa del procedimiento. Finalmente, como la reacción de unión era relativamente rápida y se completaba generalmente en 40 minutos a temperatura ambiente, en general, no se utilizaron períodos de incubación significativamente prolongados, resultando a menudo en la degradación innecesaria del ARN.

Usando las condiciones anteriores, se sintetizaron los conjugados de ARNm-puromicina como se explica a continuación. La unión de la secuencia de ARN de myc (ARN124) con el oligonucleótido que contenía puromicina se realizó usando bien un puente de ADN estándar (p. ej., 5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA) (SEC ID N.º 32) o un puente que contenía una base aleatoria (N) en la zona de unión (p. ej., 5'-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA) (SEC ID N.º 33). Las reacciones estaban compuestas por ARNm, el puente de ADN y oligonucleótido de puromicina en una proporción molar de 1,0:1,5:2,0. También se puede utilizar una proporción molar alternativa de 1,0:1,2:1,4. Primero se calentó una mezcla de estos componentes a 94ºC durante 1 minuto y luego se enfrió sobre hielo durante 15 minutos. Las reacciones de unión se realizaron durante una hora a temperatura ambiente en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM; DTT 10 mM; ATP 1 mM; 25 \mug/ml de ASB; oligo de puromicina 15 \muM; ARNm 15 \muM, puente de ADN 22,5-30 \muM; inhibidor Rnasin® (Promega) a 1 U/\mul y 1,6-2,5 unidades de ADN ligasa de T4 por cada picomol de oligo de puromicina. Tras la incubación, se añadió EDTA hasta una concentración final de 30 mM, y se extrajeron las mezclas de reacción con fenol/cloroformo. Se purificaron los conjugados de longitud completa mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante, se aislaron mediante electroelución y se desalinizaron.

Condiciones generales de la traducción con reticulocito. Además de mejorar la síntesis del conjugado de ARNm-puromicina, también se optimizaron las reacciones de traducción como se explica a continuación. Las reacciones se realizaron en lisados de reticulocito de conejo procedentes de diferentes fuentes comerciales (Novagen, Madison, WI; Amersham, Arlington Heights, IL; Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; Ambion, Austin, TX; y Promega, Madison, WI). Una mezcla de reacción típica (25 \mul de volumen final) estaba compuesta por HEPES 20 mM, pH 7,6; DTT 2 mM; creatina-fosfato 8 mM; KCl 100 mM; Mg(OAc)_{2} 0,75 mM; ATP 1 mM; GTP 0,2 mM; 25 \muM de cada aminoácido (0,7 \muM de metionina en caso de usarse ^{35}S-Met), Rnasin® a 1U/\mul y lisado al 60% (v/v). La concentración final del molde estaba en el intervalo de 50 nM a 800 nM. Para cada incubación, se mezclaron todos los componentes excepto el lisado cuidadosamente sobre hielo y se descongeló el lisado congelado inmediatamente antes de usarlo. Tras la adición de lisado, se mezcló en profundidad la mezcla de reacción pipeteando moderadamente e incubando a 30ºC para iniciar la traducción. Las concentraciones óptimas de Mg^{2+} y K^{+} variaron en los intervalos de 0,25 mM-2 mM y 75 mM-200 mM, respectivamente, para los diferentes ARNm y se determinaron preferiblemente en experimentos preliminares. Particularmente para ARNm escasamente traducidos, también se optimizaron a veces las concentraciones de hemina, creatina-fosfato, ARNt y aminoácidos. En general se prefirió el cloruro de potasio frente al acetato de potasio para las reacciones de fusión, pero a veces una mezcla de KCl y KOAc produjo mejores resultados.

Tras la traducción a 30ºC durante 30 a 90 minutos, se enfrió la reacción sobre hielo durante 40 minutos y se añadió Mg^{2+} o K^{+}. También se optimizó la concentración final de Mg^{2+} añadida en esta etapa para diferentes moldes de ARNm, pero generalmente estuvo en el intervalo de 50 mM a 100 mM (siendo la concentración de 50 mM preferiblemente usada para las mezclas de moldes mixtos). La cantidad de K^{+} añadido estuvo generalmente en el intervalo de 125 mM-1,5M. Para una reacción con Mg^{2+}, la mezcla resultante se incubó preferiblemente a -20ºC durante 16 a 48 horas, pero podría haberse incubado durante un tiempo tan corto como 12 horas. En los casos de usarse K^{+} o Mg^{2+}/K^{+}, la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante una hora.

Para visualizar los productos de fusión marcados, se mezclaron 2 \mul de la mezcla de reacción con 4 \mul de tampón de carga y se calentó la mezcla a 75ºC durante 3 minutos. Entonces se cargó la mezcla resultante sobre gel de poliacrilamida-SDS con glicina al 6% (para los moldes marcados con ^{32}P) o con gel de poliacrilamida-SDS con tricina al 8% (para los moldes marcados con ^{35}S-Met). Como alternativa a este enfoque, también se pueden aislar los productos de fusión usando dT_{25}-estreptavidina-agarosa o tiopropil-sefarosa (o ambas), en general, según lo descrito en la presente memoria.

Para eliminar la parte de ARN del conjugado de ARN-ligador-puromicina-péptido para un posterior análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, se añadió una cantidad apropiada de EDTA tras la incubación posterior a la traducción, y se desalinizó la mezcla de reacción usando una columna microcon-10 (o microcon-30). Se mezclaron 2 \mul de la mezcla resultante (aproximadamente 25 \mul totales) con 18 \mul de tampón de RNasa H (Tris-HCl 30 mM, pH 7,8; (NH_{4})_{2}SO_{4} 30 mM; MgCl_{4} 8 mM; \beta-mercaptoetanol 1,5 mM y una cantidad apropiada de puente de ADN complementario) y se incubó la mezcla a 4ºC durante 45 minutos. Entonces se añadió RNasa H y se realizó la digestión a 37ºC durante 20 minutos.

Calidad del oligo de puromicina. La calidad del oligonucleótido de puromicina también era importante para la generación eficaz de los productos de fusión. El acoplamiento de 5'-DMT-2'-succinil-N-triofluoroacetil-puromicina con CPG no fue tan eficaz como el acoplamiento de los nucleótidos estándar. Como tal, la reacción de acoplamiento fue controlada minuciosamente para evitar la formación de CPG con una concentración demasiado baja de puromicina acoplada, y los grupos amino sin reaccionar sobre el CPG fueron detenidos por completo para evitar la posterior síntesis de oligonucleótidos que carecieran de puromicina en el terminal 3'. También era importante evitar el uso de CPG que contuviera partículas de malla muy fina, pues éstas eran capaces de generar problemas con la obstrucción de la válvula durante las posteriores etapas de síntesis automática de oligonucleótidos.

Además, el oligo de puromicina sintetizado se analizó preferiblemente antes de un uso a gran escala para garantizar la presencia de puromicina en el extremo 3'. En los experimentos de la presente memoria, no se detectó fusión al sustituir la puromicina por una desoxiadenosina que contenía un grupo amino primario en el extremo 3'. Para analizar la presencia de grupos hidroxilo en 3' (i.e., la síntesis no deseada de oligos que carezcan de una puromicina en el terminal 3'), primero se puede radiomarcar el oligo de puromicina (p. ej., mediante la fosforilación de 5') y usarlo luego como cebador para la prolongación con desoxinucleotidil-transferasa terminal. En presencia de un resto de puromicina en el terminal 3', no se debería observar producto de extensión.

Transcurso del tiempo de traducción y de incubación posterior a la traducción. La reacción de traducción fue relativamente rápida y se completó generalmente en 25 minutos a 30ºC. Sin embargo, la reacción de fusión fue más lenta. Cuando se usó un ligador estándar (dA_{27}dCdCP) a 30ºC, la síntesis de fusiones alcanzó su máximo nivel en 45 minutos más. La incubación posterior a la traducción se pudo llevar a cabo a temperaturas inferiores, por ejemplo, a temperatura ambiente, 0ºC o -20ºC. Se observó una menor degradación del molde de ARNm a -20ºC y se obtuvieron mejores resultados de fusión tras la incubación a -20ºC durante 2 días.

El efecto de la concentración de Mg^{2+} o K^{+}. Una concentración elevada de Mg^{2+} o K^{+} en la incubación posterior a la traducción estimuló enormemente la formación de fusiones. Por ejemplo, para el molde de ARN de myc descrito anteriormente, se observó una estimulación 3-4 veces mayor de la formación de fusiones usando un ligador estándar (dA_{27}dCdCP) en presencia de Mg^{2+} 50 mM durante la incubación de 16 horas a -20ºC (figura 17, comparar los carriles 3 y 4). También se observó una formación de fusiones eficaz mediante el uso de una incubación posterior a la traducción en presencia de una concentración de Mg^{2+} de 50-100 mM al llevar a cabo las reacciones a temperatura ambiente durante 30-45 minutos. De manera similar, la adición de K^{+} 250-500 mM aumentó la formación de fusiones en más de 7 veces en comparación con el control sin K^{2+} añadido. Las concentraciones de K^{+} óptimas estuvieron generalmente entre 300 mM y 600 mM (500 mM para las mezclas). La adición posterior a la traducción de NH_{4}Cl también aumentó la formación de fusiones. La selección de OAc^{-} frente a Cl^{-} como el anión no tuvo un efecto profundo sobre la formación de fusiones.

Longitud y secuencia del ligador. También se examinó la dependencia que tenía la reacción de fusión de la longitud del ligador. En el intervalo entre 21 y 30 nucleótidos (n = 18-27), se observó poco cambio en la eficacia de la reacción de fusión (según lo descrito anteriormente). Se obtuvieron resultados similares para los ligadores de 19 y 30 nucleótidos, observándose la mayor formación de fusiones para los ligadores de 25 nucleótidos (figura 23). Los ligadores más cortos (p. ej., de 13 ó 16 nucleótidos de longitud) y los ligadores más largos (p. ej., ligadores de más de 40 nucleótidos de longitud) dieron como resultado una formación de fusiones mucho menor. Además, aunque determinados ligadores de una longitud mayor (es decir, de 45 nucleótidos y 54 nucleótidos) también dieron como resultado eficacias de fusión algo más bajas, sigue siendo probable la posibilidad de usarse ligadores todavía más largos para optimizar la eficacia de la reacción de fusión.

Con respecto a la secuencia ligadora, la sustitución de los residuos de desoxirribonucleótido cerca del extremo 3' con residuos de ribonucleótido no cambió significativamente la eficacia de fusión. La secuencia de dCdCP (o rCrCP) del extremo 3' del ligador fue, sin embargo, importante para la formación de fusiones. La sustitución de dCdCP por dUdUP redujo significativamente la eficacia de la formación de fusiones.

Flexibilidad del ligador. También se analizó la dependencia que tenía la reacción de fusión de la flexibilidad del ligador. En estos experimentos, se determinó que la eficacia de fusión era baja si se aumentaba la rigidez del ligador mediante el apareamiento con un oligonucleótido cerca del extremo 3'. De manera similar, cuando se usó un ligador más flexible (por ejemplo, dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP, en el que C_{9} representa HO(CH_{2}CH_{2}O)_{3}PO_{2}), se mejoró significativamente la eficacia de fusión. En comparación con el ligador estándar (Da_{27}dCdCP), el uso de un ligador más flexible (dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP) mejoró la eficacia de fusión para ARN124 en más de 4 veces (figura 17, comparar los carriles 1 y 9). Además, al contrario que el molde con el ligador estándar cuya fusión posterior a la traducción continuó escasamente en ausencia de una concentración elevada de Mg^{2+} (figura 17, carril 3 y 4), el molde con el ligador flexible no necesitó una concentración elevada de Mg^{2+} para producir un buen rendimiento de producto de fusión en una incubación posterior a la traducción prolongada a -20ºC (figura 17, comparar carriles 11 y 12). Este ligador, por lo tanto, resultó ser muy útil en caso de no desearse adiciones posteriores a la traducción de concentraciones elevadas de Mg^{2+}. Además, el ligador flexible también generó producciones de fusiones óptimas en presencia de una concentración elevada de Mg^{2+}.

Cuantificación de la eficacia de fusión. La eficacia de fusión se puede expresar bien como la fracción del péptido traducido convertido en producto de fusión, o como la fracción del molde de entrada convertido en el producto de fusión. Para determinar la fracción de péptido traducido convertido en producto de fusión, se utilizó un marcaje con ^{35}S-Met del péptido traducido. En estos experimentos, cuando se usó ligador dA_{27}dCdCP o dA_{27}rCrCP, se fusionó aproximadamente el 3,5% del péptido traducido con su ARNm tras una incubación de 1 hora a 30ºC. Este valor aumentó hasta el 12% tras una incubación durante una noche a -20ºC. Cuando se llevó a cabo la incubación posterior a la traducción en presencia de una concentración elevada de Mg^{2+}, se fusionó más del 50% del péptido traducido con el molde.

Para un molde con un ligador flexible, se fusionó aproximadamente el 25% del péptido traducido con el molde tras 1 hora de traducción a 30ºC. Este valor aumentó hasta más del 50% tras la incubación durante una noche a -20ºC y hasta más del 75% al realizar la incubación posterior a la traducción en presencia de Mg^{2+} 50 mM.

Para determinar el porcentaje de molde de entrada convertido en producto de fusión, se realizaron las traducciones usando molde de ARNm y ligador marcado con ^{32}P. Cuando se usó el ligador flexible y se realizó la incubación posterior a la traducción a -20ºC sin la adición de Mg^{2+}, se convirtió aproximadamente el 20%, 40%, 40%, 35% y 20% del molde de entrada en fusión de péptido y ARNm cuando la concentración de molde de ARN de entrada era de 800, 400, 200, 100 y 50 nM, respectivamente (figura 18). Se obtuvieron resultados similares al realizar la incubación posterior a la traducción en presencia de Mg^{2+} 50 mM. Los mejores resultados se obtuvieron usando lisados obtenidos en Novagen, Amersham o Ambion (Figura 19).

Las diferencias de movilidad entre los ARNm y las fusiones de péptido y ARNm medidas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS pueden ser muy pequeñas si el molde de ARNm es largo. En tales casos, se puede marcar el molde en el extremo 5' del ligador con ^{32}P (por ejemplo, usando [^{32}P]\gammaATP y polinucleótido quinasa de T4 antes de la unión del conjugado de puromicina y ARNm). Entonces se puede digerir la parte de ARN larga con RNasa H en presencia de un puente de ADN complementario tras la traducción/incubación, y determinar la eficacia de fusión mediante la cuantificación de la proporción de ligador sin modificar con respecto a la fusión de péptido y ligador. En comparación con la digestión con RNasa A, que produce P en 3' y OH en 5', este enfoque tiene la ventaja de que no se elimina el ^{32}P del extremo 5' del ligador.

Para el tratamiento con RNasa H, se añadió EDTA tras la incubación posterior a la traducción para afectar a los ribosomas, y se desalinizó la mezcla de reacción usando una columna microcon-10 (o microcon-30). Se combinaron 2 \mul de la mezcla resultante con 18 \mul de tampón de RNasa H (Tris-HCl 30 mM, pH 7,8, (NH_{4})_{2}SO_{4} 30 mM; MgCl_{2} 8 mM; \beta-mercaptoetanol 1,5 mM y un exceso de puente de ADN complementario) y se incubaron a 4ºC durante 45 minutos. Entonces se añadió RNasa H y se realizó la digestión a 37ºC durante 20 minutos.

Fusión intramolecular frente a intermolecular durante la incubación posterior a la traducción. Además de los experimentos anteriores, se analizó si la reacción de fusión que tuvo lugar a -20ºC en presencia de Mg^{2+} era de naturaleza intra- o intermolecular. Se coincubaron ligador libre (dA_{27}dCdCP o dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP, en el que C_{9} es -O(CH_{2}CH_{2}O)_{3}PO_{2}-) con un molde que contenía un ligador de ADN, pero sin puromicina en el extremo 3', en las condiciones de traducción y de incubación posterior a la traducción descritas anteriormente. En estos experimentos, se incorporó una cantidad no detectable (es decir, menor del 2% del nivel normal) de ^{35}S-Met en el producto de ligador-péptido, sugiriendo que la fusión posterior a la traducción tuvo lugar fundamentalmente entre el péptido naciente y el ARNm unido al mismo ribosoma.

En otros experimentos, las coincubaciones se llevaron a cabo con moldes y oligonucleótidos de puromicina cuyos productos de fusión y productos cruzados (moldes fusionados con la proteína errónea) se podían separar por electroforesis. No se observó la formación de producto cruzado para ninguna de las combinaciones de molde y ligador examinada. En estos experimentos, los productos cruzados de fusión pudieron formarse mediante dos mecanismos trans diferentes: (1) la reacción de moldes o ligadores libres con el péptido en el complejo de péptido-ARNm-ribosoma o (2) la reacción del molde de un complejo con el péptido de otro. En la figura 24, se muestra un ejemplo concreto del análisis de la última posibilidad. En éste, se coincubó molde de la proteína Lambda-fosfatasa (\lambdaPPasa), que sintetiza una proteína de 221 aminoácidos de longitud, con el molde de myc, que genera un péptido de 33 aminoácidos. Por sí mismos, ambos moldes demuestran la formación de fusión tras la incubación posterior a la traducción. Al mezclarlos entre sí, sólo se observaron los productos de fusión individuales. No se observaron productos cruzados resultantes de la fusión de la proteína \lambdaPPasa con el molde de myc. Experimentos similares demostraron la no formación de productos cruzadas con varias combinaciones diferentes: el molde de myc + el molde de un solo codón, una proporción de 20:1 del ligador estándar + el molde de myc, y el ligador flexible + el molde de myc. Estos experimentos contradicen firmemente ambos mecanismos posibles de formación de fusiones trans.

El efecto de la longitud del ligador sobre la formación de fusiones también coincidió con un mecanismo cis. La reducción de la longitud del ligador de 19 a 13 nucleótidos dio como resultado una disminución brusca de la cantidad de producto de fusión esperada si la cadena ya no pudiera llegar al centro peptidil-transferasa desde el sitio de descodificación (figura 23). Sin embargo, este mecanismo también se podía deber a la oclusión de la puromicina en el ribosoma si dominara el mecanismo trans (p. ej., si los moldes unidos al ribosoma formaran la fusión mediante un mecanismo trans). La disminución de la formación de fusiones con ligadores más largos vuelve a contradecir este tipo de reacción, pues no se debería observar ninguna disminución para la reacción trans una vez que la puromicina estuviera libre del ribosoma.

Resultados de la optimización. Según lo ilustrado anteriormente, mediante el uso del ligador flexible y/o la realización de la incubación posterior a la traducción en presencia de una concentración elevada de Mg^{2+}, se aumentaron las eficacias de fusión hasta el aproximadamente 40% del ARNm de entrada. Estos resultados indicaron la posibilidad de generar tanto como 10^{14} moléculas de fusión de péptido y ARNm por ml de mezcla de reacción de traducción in vitro, produciendo mezclas de fusiones de péptidos y ARNm de una complejidad muy alta en experimentos de selección in vitro.

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Enriquecimiento selectivo de fusiones de proteínas y ARN

Se ha demostrado la viabilidad de usar fusiones de péptidos y ARN en experimentos de selección y evolución mediante el enriquecimiento de una determinada fusión de péptido y ARN de una mezcla compleja de fusiones de secuencias aleatorias en base al péptido codificado. En concreto, se preparó una serie de mezclas en las que se combinó una cantidad pequeña de secuencia conocida (en este caso, el molde de myc corto, LP154) con alguna cantidad de mezcla de secuencias aleatorias (es decir, LP160). Se tradujeron estas mezclas, y se seleccionaron los productos de fusión de péptido y ARN mediante cromatografía de afinidad de oligonucleótidos y disulfuro según lo descrito en la presente memoria. Se inmunoprecipitaron selectivamente las fusiones de molde y myc con anticuerpo monoclonal anti-myc (figura 16A). Para medir el enriquecimiento obtenido en esta etapa selectiva, se amplificaron alícuotas de la mezcla de fusiones de péptidos y ADNc/ARNm procedentes de antes y después de la inmunoprecipitación por PCR en presencia de un cebador radiomarcado. Se digirió el ADN amplificado con una endonucleasa de restricción que cortó la secuencia del molde de myc, pero no la mezcla (figuras 16B y 16C). La cuantificación de la proporción entre el ADN cortado y sin cortar indicó que la secuencia de myc estaba enriquecida 20-40 veces más en comparación con la genoteca aleatoria por inmunoprecipitación.

Estos experimentos se llevaron a cabo como se explica a continuación.

Reacciones de traducción. Las reacciones de traducción se realizaron en general según lo descrito anteriormente. Específicamente, las reacciones se realizaron a 30ºC durante una hora según las especificaciones del fabricante (Novagen) y se congelaron durante una noche a -20ºC. Se hicieron dos versiones de seis muestras, una que contenía ^{35}S-metionina y una que contenía metionina fría añadida hasta una concentración final de 52 \muM. Las reacciones 1-6 contenían las cantidades de moldes descritas en la tabla 2. Todos los números de la tabla 2 representan los picomoles de molde por 25 \mul de mezcla de reacción.

TABLA 2

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5

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Preparación de dT_{25}-estreptavidina-agarosa. Se lavó la estreptavidina-agarosa (Pierce) tres veces con TE 8.2 (Tris-Cl 10 mM, pH 8,2; EDTA 1 mM) y se volvió a suspender como una suspensión a 1:1 (v/v) en TE 8.2. Entonces se añadió 3'-biotinil-T_{25} sintetizado usando CPG de BioTEG (Glen Research) hasta la concentración final deseada (generalmente de 10 ó 20 \muM), y se llevó a cabo una incubación con agitación durante 1 hora. Se lavó la dT_{25}-estreptavidina-agarosa tres veces con TE 8.2 y se almacenó a 4ºC hasta su uso.

Purificación de moldes de reacciones de traducción. Para purificar los moldes de las reacciones de traducción, se retiraron 25 \mul de cada reacción y se añadieron a 7,5 ml de tampón de aislamiento (NaCl 1M; Tris-Cl 100 mM, pH 8,2; EDTA 10 mM; DTT 0,1 mM), y 125 \mul de dT_{25}-estreptavidina-agarosa 20 \muM. Se incubó esta solución a 4ºC durante una hora con rotación. Se centrifugaron los tubos y se retiró el eluyente. Se añadió un ml de tampón de aislamiento, se volvió a suspender la suspensión y se transfirieron las mezclas a 1,5 ml de tubos de microcentrifugación. Entonces se lavaron las muestras cuatro veces con alícuotas de 1 ml de tampón de aislamiento enfriado con hielo. Entonces se combinaron las muestras calientes y frías de reacciones idénticas en una unidad de filtro MC de Millipore y se eluyeron desde la dT_{25}-agarosa lavando con 2 volúmenes de 100 \mul de H_{2}O, DTT 0,1 mM y 2 volúmenes de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM (4ºC) siguiendo con una neutralización.

Se añadieron a este eluyente 40 \mul de una suspensión al 50% de tiopropil-sefarosa lavada (Pharmacia), y se llevó a cabo una incubación a 4ºC con rotación durante 1 hora. Entonces se lavaron las muestras con tres volúmenes de 1 ml de TE 8.2 y se retiró el eluyente. Se añadió un \mul de DTT 1M al sólido (volumen total de aproximadamente 20-30 \mul) y se incubó la muestra durante varias horas, se retiró y se lavó cuatro veces con 20 \mul de H_{2}O (volumen total de 90 \mul). El eluyente contenía tiopiridona 2,5 mM a juzgar por la absorbancia UV. Se precipitaron en etanol 50 \mul de esta muestra mediante la adición de 6 \mul de NaOAc 3M, pH 5,2, espermina 10 mM, 1 \mul de glicógeno (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) y 170 \mul de EtOH al 100%, y la incubación durante 30 minutos a -70ºC y la centrifugación durante 30 minutos a 13.000 rpm en un microcentrifugador.

Reacciones de transcripción inversa. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron tanto en muestras precipitadas en etanol como en muestras con eluyente de tiopiridona como se explica a continuación. Para las muestras precipitadas en etanol, se aparearon 30 \mul de molde resuspendido, H_{2}O hasta 48 \mul y 200 picomoles de cebador 21.103 (SEC ID N.º 22) a 70ºC durante 5 minutos y se enfriaron sobre hielo. Se añadieron a esta muestra 16 \mul del tampón de la primera cadena (Tris-Cl 250 mM, pH 8,3; KCl 375 mM y MgCl_{2} 15 mM; disponible en Gibco BRL, Grand Island, NY), 8 \mul de DTT 100 mM y 4 \mul de NTP 10 mM y se equilibró a 42ºC, y se añadieron 4 \mul de transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY). Se añadió H_{2}O (13 \mul) al eluyente de TP-sefarosa (35 \mul) y se llevaron a cabo las reacciones según lo anterior. Tras la incubación durante una hora, se combinaron las muestras similarmente numeradas (volumen total de 160 \mul). Se reservaron 10 \mul de muestra para la PCR de cada muestra sin seleccionar y se reservaron 150 \mul de la muestra para la inmunoprecipitación.

Inmunoprecipitación. Para llevar a cabo las inmunoprecipitaciones, se añadieron 170 \mul de reacción de transcripción inversa a 1 ml de tampón de dilución (Tris-Cl 10 mM, pH 8,2; NaCl 140 mM, Triton X-100 al 1% (v/v)) y 20 \mul de conjugado de proteína G/A (Calbiochem, La Jolla, CA), y se preaclararon mediante incubación a 4ºC con rotación durante 1 hora. Se retiró el eluyente y se añadieron 20 \mul de conjugado de G/A y 20 \mul de anticuerpo monoclonal (2 \mug, 12 picomoles), y se incubó la muestra con rotación durante dos horas a 4ºC. Se precipitó el conjugado mediante microcentrifugación a 2.500 rpm durante 5 minutos, se retiró el eluyente y se lavó el conjugado tres veces con alícuotas de 1 ml de tampón de dilución enfriado con hielo. Entonces se lavó la muestra con 1 ml de Tris-Cl 10 mM enfriado con hielo, pH 8,2, NaCl 100 mM. Se retiraron los fragmentos unidos usando 3 volúmenes de HOAc al 4% congelado y se liofilizaron las muestras hasta la sequedad.

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PCR de muestras seleccionadas y no seleccionadas. Las reacciones PCR se llevaron a cabo mediante la adición de 20 \mul de NH_{4}OH concentrado a 10 \mul del material sin seleccionar y el material seleccionado en su totalidad, y la incubación durante 5 minutos cada vez a 55ºC, 70ºC y 90ºC para destruir cualquier ARN presente en la muestra. Entonces se evaporaron las muestras hasta la sequedad usando un Speedvac. Se añadieron a cada muestra 200 \mul de mezcla de PCR (cebadores 21.103 y 42.108 1 \muM, dNTP 200 \muM en tampón de PCR más Mg^{2+} (Boehringer Mannheim) y 2 \mul de polimerasa de Taq (Boehringer Mannheim)). Se realizaron 16 ciclos de PCR sobre una muestra sin seleccionar número 2 y 19 ciclos en el resto de las muestras.

Entonces se amplificaron las muestras en presencia de cebador 21.103 marcado con ^{32}P en 5' según la tabla 3 y se purificaron dos veces individualmente usando equipos de purificación de PCR directa de Wizard (Promega) para eliminar todos los fragmentos cortos y de cebador.

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TABLA 3

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Digestos de restricción. Se añadió el ADN marcado con ^{32}P preparado a partir de cada una de las reacciones PCR anteriores en cantidades iguales (por cpm de muestra) a reacciones de digestos de restricción según la tabla 4. El volumen total de cada reacción fue de 25 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de Alwnl (5 unidades, New England Biolabs) a cada reacción. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora y se desactivó la enzima con calor mediante una incubación de 20 minutos a 65ºC. Entonces se mezclaron las muestras con 10 \mul de tampón de carga desnaturalizante (1 ml de formamida ultrapura (USB), 20 \mul de EDTA 0,5M y 20 \mul de NaOH 1M), se calentaron hasta 90ºC durante 1 minuto, se enfriaron y se cargaron sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% que contenía urea 8M. Tras la electroforesis, se fijó el gel con HOAc al 10% (v/v), MeOH al 10% (v/v) y H_{2}O.

TABLA 4

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Cuantificación del digesto. Se cuantificó la cantidad de myc frente al ADN de la mezcla presente en una muestra usando un Phosphorimager (Molecular Dynamics). Se determinó la cantidad de material presente en cada banda como el volumen integrado de los rectángulos idénticos dibujados alrededor de las bandas de gel. Se calcularon las cpm totales presentes en cada banda como el volumen menos el fondo. Se usaron tres valores de fondo: (1) una media de los cuadrados idénticos fuera de la superficie en la que tuvieron lugar los recuentos sobre el gel; (2) las cpm presentes en el carril de la mezcla sin seleccionar, en el que debería aparecer la banda de myc (no aparece ninguna banda en esta posición del gel); y (3) un valor normalizado que reproducía el valor más cercano a los aumentos de molde de 10 veces más entre los carriles sin seleccionar. Los carriles 2, 3 y 4 de las figuras 16B y 16C demuestran un enriquecimiento de la diana frente a la secuencia de la mezcla. El enriquecimiento demostrable del carril 3 (sin seleccionar/seleccionado) produjo los mayores valores (de 17, 43 y 27 veces más usando los procedimientos 1-3, respectivamente) debido a la optimización de proporción entre la señal y el ruido de esta muestra. Estos resultados se resumen en la tabla 5.

TABLA 5

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En un segundo conjunto de experimentos, se purificaron una vez estos mismos productos de PCR usando equipos de purificación por PCR directa de Wizard, y se cuantificaron los digestos mediante el procedimiento (2) anterior. En estos experimentos, se obtuvieron resultados similares; se midieron los enriquecimientos de 10,7; 38 y 12 veces más, respectivamente, para las muestras equivalentes a aquéllas de los carriles 2, 3 y 4 anteriores.

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Selección in vitro desde una gran genoteca de fusiones de péptidos y ARN

En otro experimento que demostraba la selección de moléculas de fusión deseadas de grandes genotecas, se generó un repertorio de 2 x 10^{13} fusiones aleatorizadas de péptidos y ARN usando una modificación del procedimiento descrito anteriormente. Se generó una genoteca de ADN que contenía 27 codones aleatorizados en base al esquema de síntesis 5'-(NNS)_{27}-3' (en el que N representa A, G, C y T equimolar, y S es bien G o C). Cada codón NNS era una mezcla de 32 tripletes que incluía codones para el total de los 20 aminoácidos naturales. La región aleatorizada estaba flanqueda por dos sitios de unión al cebador para la transcripción inversa y la PCR, así como por secuencias codificante del promotor de T7 y un sitio de iniciación de la traducción. Se modificó el ARN, sintetizado mediante transcripción in vitro, mediante una unión dirigida por molde con un ligador de oligonucleótidos que contenía puromicina en su terminal 3', dA_{27}dCdC-P.

El ARN ligado purificado fue traducido in vitro en extracto de reticulocito de conejo para generar fusiones de proteínas y ARN como se explica a continuación: Se sintetizó un ADN de 123 meros PP.01 (5'-AGC TTT TGG TGC TTG TGC ATC (SNN)27 CTC CTC GCC CTT GCT CAC CAT-3', N = A, G, C, T; S = C, G) (SEC ID N.º 34) y se purificó sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 6%. Se amplificó 1nmol del ADN purificado (6 x 10^{14} moléculas) mediante 3 series de PCR (94ºC, 1 minuto; 65ºC, 1 minuto; 72ºC, 2 minutos) usando cebadores 1 \muM P1F (5'-AGC TTT TGG TGC TTG TGC ATC-3') (SEC ID N.º 35) y PT7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3') (SEC ID N.º 36) en un volumen total de 5 ml (KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 9,0; Triton X-100 al 0,1%; MgCl_{2} 2,5 mM; varios dNTP 0,25 mM; 500 unidades de polimerasa de Taq de Promega). Tras la precipitación, se volvió a disolver el ADN en 100 \mul de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6; EDTA 1 mM, pH 8,0). Se transcribió ADN (60 \mul) en ARN en una reacción (1 ml) en la que se usó el equipo de transcripción in vitro Megashortscript de Ambion. Se extrajo la reacción dos veces con fenol/CHCl_{3}, y se retiraron los NTP en exceso mediante la purificación sobre una columna NAP-25 (Pharmacia). Se sintetizó el ligador que contenía puromicina 30-P (5'-dA_{27}dCdCP) según lo descrito en la presente memoria y se añadió al extremo 3' de la genoteca de ARN mediante una unión dirigida por molde. Se incubaron los ARN (25 nmoles) con cantidades equimolares de ligador y puente (5'-TTT TTT TTT TNA GCT TTT GGT GCT TG 3') (SEC ID N.º 37) en una reacción (1,5 ml) que contenía tampón de ADN ligasa de T4 (Promega) y 1.200 unidades de ADN ligasa de T4 (Promega). Tras la incubación a temperatura ambiente durante 4 horas, se separó el ARN ligado del ARN sin ligar sobre un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 6%, se eluyó desde el gel y se volvió a disolver (200 \mul de H_{2}Odd). Para generar las moléculas de fusiones de péptidos y ARNm, se tradujo el ARN ligado (1,25 nmoles) en un volumen total de 7,5 ml usando el equipo IVT de reticulocito de conejo de Ambion en presencia de 3,7 \muCi de ^{35}S-metionina. Tras la incubación (30 minutos a 30ºC), se llevó la reacción hasta una concentración final de KCl 530 mM y MgCl_{2} 150 mM, y se incubó durante 1 hora más a temperatura ambiente. Se aumentó la formación de fusiones en aproximadamente 10 veces más mediante esta adición de KCl 530 mM y MgCl_{2} 150 mM, una vez completada la reacción de traducción.

Mediante el uso de este procedimiento mejorado, se obtuvieron aproximadamente 10^{13} moléculas de fusión purificadas por ml. Se purificaron las fusiones de péptidos y ARN de la reacción de traducción cruda mediante cromatografía de afinidad de oligonucleótidos, y se transcribió inversamente la parte de ARN de las moléculas ensambladas antes de la etapa de selección usando transcriptasa inversa libre de RNasa H como se explica a continuación. Se incubaron los productos de fusión traducidos con celulosa de dT_{25} (Pharmacia) en tampón de incubación (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM, pH 8,0; NaCl 1M y Triton X-100 al 0,25%; 1 hora a 4ºC). Se aisló la celulosa mediante filtración y se lavó con tampón de incubación, siguiendo con la elución de los productos de fusión con H_{2}Odd. El ARN se transcribió inversamente (Tris-HCl 25 mM, pH 8,3; KCl 75 mmM; MgCl_{2} 3 mM; DTT 10 mM y dNTP 0,5 mM con 2 unidades de transcriptasa inversa 2 Superscript II (Gibco BRL)) usando un exceso de 5 veces más de puente como
cebador.

Para explorar el poder de la tecnología de selección de fusiones de proteínas y ARN, se usó la genoteca para seleccionar los péptidos que se unían a un anticuerpo monoclonal frente a c-myc usando la inmunoprecipitación como herramienta de selección. Las cinco series de selección y amplificación repetidas dieron como resultado un aumento de la unión de la población de las moléculas de fusión con el anticuerpo monoclonal anti-myc 9E10 (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5: 3610 (1985)). Se recuperó menos del 1% de la genoteca aplicada a la etapa de selección por elución en cada una de las tres primeras series de selección; sin embargo, aproximadamente el 10% de la genoteca se unió al anticuerpo y fue eluido en la cuarta serie de selección. La proporción de las moléculas de unión aumentó hasta un 34% en la quinta serie de selección. Este resultado coincidió con el porcentaje de un constructo de fusión de c-myc de tipo natural que se unió al anticuerpo anti-myc en estas condiciones (35%). En la sexta serie de selección, no se observó más enriquecimiento, y las moléculas de fusión de la quinta y sexta serie se usaron para la caracterización y la determinación secuencial de los péptidos seleccionados.

Para llevar a cabo estos experimentos, se incubó la genoteca inicial de 2 x 10^{13} moléculas con un exceso de 12 veces más del anticuerpo de unión a c-myc 9E10 (Chemicon) en tampón de selección (1 x PBS; ASB al 0,1%; Tween al 0,05%) durante 1 hora a 4ºC. Se precipitaron los complejos de fusión de péptido-anticuerpo mediante la adición de proteína A-sefarosa. Tras otra incubación durante 1 hora a 4ºC, se aisló la sefarosa mediante filtración y se recogió el flujo que pasó a su través (FT). Se lavó la sefarosa con cinco volúmenes de tampón de selección (W1-W5) para eliminar los aglutinantes inespecíficos, y se eluyeron los péptidos de unión con cuatro volúmenes de ácido acético, 15 mM (E1-E4). Se amplificó la parte de ADNc de las moléculas de fusión eluidas por PCR, y se usó el ADN resultante para generar una población enriquecida de productos de fusión que fue sometida a más series de selección. Para eliminar los péptidos con afinidad por la proteína A-sefarosa de la mezcla, se introdujo una preselección sobre la proteína A-sefarosa en la segunda serie de la selección. Se controló el progreso de la selección mediante la determinación del porcentaje de fusión de péptido y ARN marcada con ^{35}S que fue eluido del inmunoprecipitado con ácido acético. Estos resultados se muestran en la figura 20.

Se demostró que la mezcla de los péptidos seleccionados se unía específicamente al anticuerpo anti-myc usado para la selección. Los experimentos de unión con los péptidos sin fusionar de la serie 6 demostraron una unión similar con el anticuerpo en comparación con el péptido fusionado, lo que indicó que la parte de ácido nucleico de las moléculas de fusión no fue necesaria para la unión (datos no mostrados).

Se evaluaron los productos de fusión de la sexta serie de selección en tres condiciones de inmunoprecipitación diferentes, como se explica a continuación: (1) sin el anticuerpo anti-myc; (2) con el anticuerpo monoclonal anti-integrina ASC-3 que es del mismo isótopo, pero que no se une al epítopo myc, y (3) con el anticuerpo anti-myc 9E10. Se llevaron a cabo experimentos mediante la incubación de los productos de fusión de péptido y ARN marcados con ^{35}S de la sexta serie de selección (0,2 pmoles) en tampón de selección (1 x PBS; ASB al 0,1%; Tween al 0,05%) durante 1 hora a 4ºC bien con anticuerpo monoclonal anti-myc 9E10 (100 pmoles) con anticuerpo monoclonal anti-integrina \beta4 ASC-3 (100 pmoles; Chemicon) o sin anticuerpo. Se precipitaron los complejos de fusión de péptido-anticuerpo con proteína A-sefarosa. Se lavó la sefarosa con cinco volúmenes de tampón de selección, y se eluyeron las especies unidas mediante la adición de ácido acético 15 mM.

No se pudo detectar ninguna unión significativa en el experimento de control sin anticuerpo, lo que demostró que los péptidos seleccionados no se unieron inespecíficamente a la proteína A-agarosa. Además, no se observó unión con el anticuerpo monoclonal anti-integrina, lo que indicó que los péptidos seleccionados eran específicos del anticuerpo anti-myc. Se realizó un experimento de competición con péptido myc sintético para determinar si las moléculas de fusión de péptidos seleccionadas interactuaban con el sitio de unión antigénica del anticuerpo anti-myc 9E10. Cuando se incubaron las moléculas de fusión marcadas con ^{35}S de la sexta serie de selección con anticuerpo monoclonal anti-myc y cantidades en aumento de péptido myc sin marcar, disminuyó el porcentaje de moléculas de unión. Estos resultados se muestran en la figura 21. En esta figura, se incubaron 0,2 pmoles de productos de fusión de péptido y ARN marcados con ^{35}S de la sexta serie de selección con 100 pmoles de anticuerpo monoclonal anti-myc 9E10 en presencia de 0; 0,2; 1; 2 ó 10 nmoles de péptido myc sintético (Calbiochem). Se precipitaron los complejos de fusión de péptido-anticuerpo mediante la adición de proteína A-sefarosa. Los valores representan el porcentaje medio de las moléculas de fusión que se unieron al anticuerpo y pudieron ser eluidas con ácido acético 15 mM determinado en reacciones de unión por triplicado. Los datos de la competición demostraron que la mayoría de las moléculas de fusión aisladas eran específicas del sitio de unión a myc.

El análisis secuencial de 116 clones individuales derivados de la quinta y la sexta serie de selección identificó una secuencia que tuvo lugar dos veces y que contenía el epítopo c-myc de tipo natural EQKLISEEDL (SEC ID N.º 2). Una tercera secuencia era casi idéntica a las otras dos, pero mostraba dos mutaciones puntuales a nivel nucleotídico, una de las cuales provocó una mutación de IIe a Val en la región del epítopo myc conservada. Todas las secuencias contenían un motivo consenso X(Q,E)XLISEXX(L,M) (SEC ID N.º 38), que era muy similar al epítopo c-myc. La región núcleo de cuatro aminoácidos, LISE, era la más conservada. La figura 22 ilustra las secuencias de aminoácidos de 12 péptidos seleccionados aislados de una genoteca de 27 meros aleatorios. En la parte superior de la figura, se muestra la secuencia de aminoácidos del epítopo c-myc. De las secuencias mostradas, sólo se incluyen las regiones que contienen el motivo consenso. Se han señalado los residuos de los péptidos que coinciden con el consenso. El clon R6-63 contenía el epítopo myc de tipo natural. Los residuos consenso (frecuencia de >50% en una determinada posición) aparecen en la parte inferior de la figura.

Teniendo en cuenta que el motivo conservado contenía un aminoácido que estaba codificado por la región del cebador de 5' definida, se calculó que el epítopo c-myc de 10 aminoácidos conocido estaba representado sólo aproximadamente 60 veces en la mezcla inicial de 2 x 10^{13} moléculas. El enriquecimiento observado del epítopo de tipo natural en cinco series de la selección se correspondía con un factor de enriquecimiento de >200 por serie de selección, factor que fue confirmado en una serie separada de experimentos.

Los análisis de inmunoprecipitación realizados en las doce secuencias seleccionadas mostradas en la figura 22 confirmaron la unión específica de las fusiones de péptidos y ARN derivadas de la genoteca con el sitio de unión antigénica del anticuerpo monoclonal anti-myc. Como las fusiones de péptidos y ARN, las doce secuencias se unieron al anticuerpo anti-myc y no presentaron unión a la proteína A-sefarosa. También se comparó la unión competitiva para el anticuerpo anti-myc usando productos de fusión marcados con ^{35}S (derivados de las doce secuencias) y péptido myc sintético sin marcar. En las condiciones usadas, la fusión de myc de tipo natural marcada se unió al 9% en presencia de péptido myc sin marcar, y el porcentaje de unión varió entre el 0,4% y el 12% para las doce secuencias analizadas. Estos datos indicaron que las secuencias se unieron al anticuerpo frente a myc con una afinidad similar a la de la fusión de myc de tipo natural.

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Purificación de péptidos y fusiones con motivo ARM con ARN inmovilizado

Se sintetizaron sitios de unión al ARN para \lambda-boxBR (Cilley y Williamson, "RNA" 3:57-67 (1997)), BIV-TAR (Puglisi et al., Science 270:1200-1203 (1995)), y VIH-RRE (Battiste et al., Science 273:1547-1551 (1997)) que contenían un resto de biotina de 3' usando química de fosforamidita estándar. Se desprotegieron, se desalinizaron y se purificaron sobre gel las muestras de ARN sintéticas según lo descrito en la presente memoria. Entonces se inmovilizaron los sitios de ARN con biotinilo en 3' mezclando una mezcla concentrada del ARN con una suspensión al 50% (v/v) de estreptavidina-agarosa de InmunoPure (Pierce) en 1 x TE 8.2 a una concentración de ARN final de 5 mM durante una hora (25ºC) con agitación. Se realizaron dos reacciones de traducción que contenían (1) el molde codificante del fragmento de péptido IN o (2) ARNm de globina (Novagen) como control. Se lavaron alícuotas (50 \mul de una suspensión al 50% (v/v)) de cada ARN inmovilizado y se volvieron a suspender en 500 \mul de tampón de unión (KCl 100 mM; MgCl_{2} 1 mM; KOH\cdotHepes 10 mM, pH 7,5; EDTA 0,5 mM; NP-40 al 0,01%; DTT 1 mM; 50 \mug/ml de ARNt de levadura). Las reacciones de unión se realizaron mediante la adición de 15 \mul de la reacción de traducción que contenía bien el péptido N o moldes de globina a tubos que contenían uno de los tres sitios de unión inmovilizados, seguida por la incubación a temperatura ambiente durante una hora. Se precipitaron las perlas por centrifugación, se lavaron 2 veces con 100 \mul de tampón de unión. Se añadió RNasa A (libre de ADNasa, 1 \mul, 1 mg/ml) (Boehringer Mannheim) y se incubó durante una hora a 37ºC para liberar las moléculas unidas. Se retiró el sobrenadante, se mezcló con 30 \mul de tampón de carga de SDS y se analizó mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS\cdotTricina. Se usó el mismo protocolo para el aislamiento de las fusiones de péptido N, con la excepción de que se añadió MgCl_{2} 35 mM tras la reacción de traducción, siguiendo con la incubación a temperatura ambiente durante una hora para promover la formación de fusiones.

Los resultados de estos experimentos demostraron que el péptido N conservó su especificidad de unión normal tanto cuando fue sintetizado in vitro como cuando fue generado como una fusión de péptido y ARN con su propio ARNm. Este resultado fue de una importancia fundamental. La unión de una secuencia de ácido nucleico larga con el terminal C de un péptido o una proteína (i.e., la formación de una fusión) tiene el potencial de afectar a la función polipeptídica en comparación con la secuencia no fusionada. Los péptidos con motivos ricos en arginina (ARM) representan un análisis funcional en condiciones restrictivas del sistema de fusión debido a sus propiedades de unión de ácidos nucleicos de una inespecificidad relativamente elevada. El hecho de que la fusión de péptido N y ARNm (antes de la síntesis de ADNc) conserve la función del péptido libre indica que se mantiene la especificidad incluso cuando hay una probabilidad de que se formen bien auto-complejos o complejos inespecíficos.

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Uso de sistemas de selección de proteínas

Los sistemas de selección de la presente invención tienen aplicaciones comerciales en cualquier campo en el que se use la tecnología de proteínas para resolver problemas terapéuticos, de diagnóstico o industriales. Esta tecnología de selección es útil para mejorar o modificar las proteínas existentes, así como para aislar nuevas proteínas con funciones deseadas. Estas proteínas pueden ser secuencias naturales, pueden ser formas modificadas de secuencias naturales o pueden ser secuencias parcial o completamente sintéticas. Además, estos procedimientos también se pueden usar para aislar o identificar dianas de ácido nucleico o de pequeñas moléculas útiles.

Aislamiento de nuevos reactivos de unión. En una aplicación particular, la tecnología de fusiones de proteínas y ARN descrita en la presente memoria es útil para el aislamiento de proteínas con propiedades de unión específica (por ejemplo, unión a ligandos). Las proteínas que presentan interacciones de unión muy específica se pueden usar como reactivos de reconocimiento de no anticuerpos, permitiendo que la tecnología de fusiones de proteínas y ARN prescinda de la tecnología tradicional de anticuerpos monoclonales. Los reactivos de tipo anticuerpo aislados mediante este procedimiento se pueden usar en cualquier campo en el que se utilicen los anticuerpos tradicionales, incluyendo las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas.

Mejora de anticuerpos humanos. La presente invención también se puede usar para mejorar anticuerpos humanos o humanizados para el tratamiento de cualquier número de enfermedades. En esta aplicación, se desarrollan genotecas de anticuerpos y se rastrean in vitro, eliminando la necesidad de técnicas tales como la fusión celular o la visualización de fagos. En una aplicación importante, la invención es útil para mejorar las genotecas de anticuerpos monocatenarios (Ward et al., Nature 341:544 (1989); y Goulot et al., J. Mol. Biol. 213: 617 (1990)). Para esta aplicación, se puede construir la región variable bien a partir de una fuente humana (para minimizar las posibles reacciones inmunes adversas del receptor) o puede contener un casete totalmente aleatorizado (para maximizar la complejidad de la genoteca). Para rastrear las moléculas de anticuerpo mejoradas, se analiza una mezcla de moléculas candidatas en cuanto a su unión con una molécula diana (por ejemplo, un antígeno inmovilizado según lo mostrado en la figura 2). Entonces se aplican condiciones más restrictivas a la etapa de unión a medida que progresa la selección de una serie a la siguiente. Para aumentar el carácter restrictivo, se modifican condiciones tales como el número de etapas de lavado, la concentración del competidor en exceso, las condiciones de tamponamiento, la duración de la reacción de unión y la selección de la matriz de inmovilización.

Se pueden usar anticuerpos monocatenarios bien directamente para la terapia o indirectamente para el diseño de anticuerpos estándar. Tales anticuerpos tienen un número de posibles aplicaciones, incluyendo el aislamiento de anticuerpos anti-autoinmunes, la supresión inmune y en el desarrollo de vacunas para enfermedades víricas tales como el SIDA.

Aislamiento de nuevos catalizadores. La presente invención también se puede usar para seleccionar nuevas proteínas catalíticas. La selección y la evolución in vitro se han usado anteriormente para el aislamiento de nuevos ARN y ADN catalíticos, y en la presente invención, se usan para el aislamiento de nuevas enzimas proteicas. En un ejemplo concreto de este enfoque, se puede aislar un catalizador indirectamente mediante la selección de la unión con un análogo químico del estado de transición del catalizador. En otro ejemplo particular, se puede llevar a cabo el aislamiento directo mediante la selección de una formación enlazada covalentemente con un sustrato (por ejemplo, usando un sustrato unido a una etiqueta de afinidad) o mediante la escisión (por ejemplo, mediante la selección de la capacidad de romper un enlace específico y liberar de ese modo miembros catalíticos de una genoteca desde un soporte sólido).

Este enfoque sobre el aislamiento de nuevos catalizadores tiene al menos dos ventajas importantes frente a la tecnología con anticuerpos catalíticos (revisadas en Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)). En primer lugar, en la tecnología con anticuerpos catalíticos, la mezcla inicial se limita generalmente al pliegue de la inmunoglobulina; por el contrario, la genoteca inicial de fusiones de proteínas y ARN puede ser bien completamente aleatoria o puede estar compuesta de, sin limitación, variantes de structuras enzimáticas o de andamios de proteínas conocidos. Además, el aislamiento de anticuerpos catalíticos generalmente depende de una selección inicial de la unión con análogos de la reacción del estado de transición seguida por el laborioso rastreo de anticuerpos activos; otra vez, por el contrario, la selección directa de la catálisis es posible mediante el uso del enfoque de la genoteca de fusiones de proteínas y ARN, como se demostró anteriormente usando genotecas de ARN. En un enfoque alternativo para aislar enzimas proteicas, se pueden combinar la selección de análogos del estado de transición y la selección directa.

Las enzimas obtenidas mediante este procedimiento son muy valiosas. Por ejemplo, actualmente existe una necesidad apremiante por catalizadores industriales nuevos y eficaces que permitan mejorar los procedimientos químicos por desarrollar. Una ventaja principal de la invención es que las selecciones se pueden llevar a cabo en condiciones arbitrarias y no se limitan, por ejemplo, a las condiciones in vivo. Por lo tanto, la invención facilita el aislamiento de nuevas enzimas o variantes mejoradas de las enzimas existentes que puedan llevar a cabo transformaciones muy específicas (y, de ese modo, minimizar la formación de subproductos no deseados) a la vez que funcionan en medios predeterminados, por ejemplo, en medios de temperatura, presión o concentración de disolvente elevada.

Una trampa de interacción in vitro . La tecnología de fusiones de proteínas y ARN también es útil para rastrear genotecas de ADNc y clonar nuevos genes en base a las interacciones proteína-proteína. Mediante este procedimiento, se genera una genoteca de ADNc de una fuente deseada (por ejemplo, mediante el procedimiento de Ausubel et al., supra, capítulo 5). Se une a cada uno de los ADNc candidatos un aceptor de péptidos (por ejemplo, como una cola de puromicina) (por ejemplo, usando las técnicas descritas anteriormente para la generación de LP77, LP154 y LP160). Entonces se generan las fusiones de proteínas y ARN según lo descrito en la presente memoria, y se analiza la capacidad de estas fusiones (o de versiones mejoradas de las fusiones) para interactuar con determinadas moléculas según lo descrito anteriormente. Si se desea, se pueden evitar los codones de terminación y las regiones UTR de 3' en este procedimiento bien mediante (i) la adición de ARNt supresor para permitir la translectura de las regiones de terminación, (ii) la eliminación del factor de liberación de la reacción de traducción por inmunoprecipitación, (iii) una combinación de (i) e (ii), o (iv) la eliminación de los codones de terminación y la UTR de 3' de las secuencias de ADN.

El hecho de que la etapa de interacción tenga lugar in vitro permite un control minucioso de las condiciones restrictivas de la reacción, usando un competidor inespecífico, temperatura y condiciones iónicas. La modificación de las moléculas pequeñas normales con análogos no hidrolizables (p. ej., ATP frente a ATPgS) proporciona las selecciones que discriminan entre los diferentes conformadores de la misma molécula. Este enfoque es útil tanto para la clonación como para la identificación funcional de muchas proteínas, pues la secuencia de ARN de la pareja de unión seleccionada está unida covalentemente y puede, por tanto, ser aislada fácilmente. Además, la técnica es útil para identificar funciones e interacciones de lo \sim50-100.00 genes humanos cuyas secuencias están siendo actualmente determinadas por el Proyecto del Genoma Humano.

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Uso de fusiones de proteínas y ARN en un formato de microchip

Los "chips de ADN" están constituidos por alineamientos definidos espacialmente de oligonucleótidos inmovilizados o fragmentos clonados de ADNc o ADN genómico, y tienen aplicaciones tales como la rápida secuenciación y perfilado de transcriptos. Mediante el apareamiento de una mezcla de fusiones de proteínas y ARN (por ejemplo, generada a partir de una mezcla de ADN o ARN celular) con tal chip de ADN, es posible generar un "chip de visualización de proteínas" en el que cada sitio correspondiente a una secuencia inmovilizada sea capaz de aparearse con su correspondiente secuencia de ARN de la mezcla de fusiones de proteínas y ARN. Mediante este enfoque, se inmoviliza la correspondiente proteína de un modo definido espacialmente debido a su enlace con su propio ARNm, y los chips que contienen los conjuntos de secuencias de ADN muestran el conjunto correspondiente de proteínas. Alternativamente, se pueden visualizar los fragmentos de péptidos de estas proteínas si la genoteca de fusiones es generada a partir de fragmentos más pequeños de ADNc o ADN genómicos.

Tales visualizaciones ordenadas de proteínas y péptidos tienen muchos usos. Por ejemplo, representan potentes herramientas para la identificación de interacciones proteína-proteína anteriormente desconocidas. En un formato específico, se marca detectablemente una proteína sonda (por ejemplo, con un colorante fluorescente) y se incuba la proteína marcada con un chip de visualización de proteínas. Mediante este enfoque, se determina la identidad de las proteínas que son capaces de unirse a la proteína sonda desde la ubicación de los sitios del chip que se marcan debido a la unión de la sonda. Otra aplicación es la rápida determinación de proteínas que son modificadas químicamente a través de la acción de enzimas modificadoras (por ejemplo, quinasas, acil-transferasas y metil-transferasas de proteínas). Mediante la incubación del chip de visualización de proteínas con la enzima de interés y un sustrato marcado radiactivamente, seguida por el lavado y la autorradiografía, se puede determinar fácilmente la ubicación y, por tanto, la identidad de aquellas proteínas que son sustratos para la enzima modificadora. Además, el uso de este enfoque con visualizaciones ordenadas de pequeños péptidos permite la mejor localización de tales sitios de modificación.

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La tecnología de visualización de proteínas se puede llevar a cabo usando alineamientos de ácidos nucleicos (incluyendo ARN, pero preferiblemente, ADN) inmovilizados sobre cualquier soporte sólido apropiado. Se pueden formar soportes sólidos ejemplares de materiales tales como el vidrio (p.ej., placas de vidrio), silicona o vidrio de silicona (p.ej., microchips) u oro (p.ej., placas de oro). Los procedimientos para unir ácidos nucleicos con regiones exactas sobre tales superficies sólidas, p. ej., procedimientos fotolitográficos, son conocidos en la técnica, y se pueden usar para generar soportes sólidos (tales como chips de ADN) para su uso en la invención. Los ejemplos de procedimientos a este efecto incluyen, sin limitación, Schena et al., Science 270:467-470 (1995); Kozal et al., Nature Medicine 2:753-759 (1996); Cheng et al., Nucleic Acids Research 24:380-385 (1996); Lipshutz et al., BioTechniques 19:442-447 (1995); Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:5022-5026 (1994); Fodor et al., Nature 364:555-556 (1993); Pirrung et al., patente estadounidense n.º 5.143.854; y Fodor et al., WO 92/10092.

<110> The General Hospital Corporation

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<120> SELECCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE EL USO DE FUSIONES DE PROTEÍNAS Y ARN

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<130> 171-98

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<140> EP 00913326.5

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<141> 01-02-2000

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<150> US 09/247,190

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<151> 09-02-1999

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<160> 38

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 76

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Molde de traducción

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<400> 1

\hskip1cm9

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<210> 2

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu}

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<210> 3

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<211> 153

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<212> ARN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Molde de traducción

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<400> 3

\hskip1cm10

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<210> 4

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Péptido aleatorio

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<221> VARIANT

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<222> (1)...(27)

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<223> Xaa es cualquier aminoácido.

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<221> VARIANT

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<222> (1)...(34)

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<223> Xaa = cualquier aminoácido.

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<400> 4

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\hskip1cm11

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<210> 5

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<211> 25

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<212> ARN

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<213> Virus del mosaico del tabaco

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gggacaauua cuauuuacaa uuaca

\hfill

25

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<210> 6

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<211> 10

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<212> ARN

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<213> Escherichia coli

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa

\hfill

10

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<210> 7

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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\hskip1cm12

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<210> 8

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Molde de traducción

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacc

\hfill

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaaaaaaa cc

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggttttt attttttttt ttcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa augaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa augaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaaaa acc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggacgaa cugaaaaaaa aaaaaaaacc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Molde de traducción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(289)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A, T, C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactatag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgcaagag ttacgcagct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores para mezcla de ARN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, t, c o g. s = g o c.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores para mezcla de ARN

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta ca

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores para mezcla de ARN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgcaagag ttacgcagct g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Puente de ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttt agcgcaaga

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggtatttg tgagccag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Fago T7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg acacttgctt ttgacacaac

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Puente de ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttt gtggtatttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Puente de ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, t, c o g.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttt nagcgcaaga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, g, t o c. s = c o g.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttttggt gcttgtgcat c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Puente de ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, t, c o g.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttt nagcttttgg tgcttg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítopo myc consenso

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa de 2 es Gln o Glu; Xaa de 10 es Leu o Met; Xaa de todas las posiciones puede ser cualquier aminoácido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm23

Claims (33)

1. Un procedimiento para producir una genoteca de proteínas que comprende las etapas de:

a)

proporcionar una población de moléculas de ARN, cada una de las cuales comprende una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de inicio ligado operativamente a una secuencia codificante de una proteína, y cada una de las cuales está unida covalentemente a un aceptor de péptidos en el extremo 3' de dicha secuencia codificante de una proteína; siendo dicho aceptor de péptidos una molécula que puede ser añadida al terminal C de una cadena proteica en crecimiento mediante la actividad catalítica de una peptidil-transferasa ribosómica; y b) traducir in vitro dichas secuencias codificantes de proteínas de dichas moléculas de ARN y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN, produciendo así una genoteca de proteínas en la que dicha salinidad elevada comprende un catión monovalente a una concentración de entre 300 mM-1,5M y un catión divalente.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un procedimiento para producir una genoteca de ADN que comprende las etapas de:

a)

proporcionar una población de moléculas de ARN, cada una de las cuales comprende una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de inicio ligado operativamente a una secuencia codificante de una proteína, y cada una de las cuales está unida covalentemente a un aceptor de péptidos en el extremo 3' de dicha secuencia codificante de una proteína; siendo dicho aceptor de péptidos una molécula que puede ser añadida al terminal C de una cadena proteica en crecimiento mediante la actividad catalítica de una peptidil-transferasa ribosómica; y b) traducir in vitro dichas secuencias codificantes de proteínas de dichas moléculas de ARN y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN, en la que dicha salinidad elevada comprende un catión monovalente a una concentración de entre 300 mM-1,5M y un catión divalente; y c) generar a partir de cada una de dichas partes de ARN de dichas fusiones una molécula de ADN, produciendo así una genoteca de ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Un procedimiento para la selección de una proteína deseada o un ácido nucleico codificante de dicha proteína que comprende las etapas de:

a)

proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales comprende una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de inicio ligado operativamente a una secuencia codificante de una proteína candidata, y cada una de las cuales está unida covalentemente con un aceptor de péptidos en el extremo 3' de dicha secuencia codificante de una proteína candidata; siendo dicho aceptor de péptidos una molécula que puede ser añadida al terminal C de una cadena proteica en crecimiento mediante la actividad catalítica de una peptidil-transferasa ribosómica; y b) traducir in vitro dichas secuencias codificantes de proteínas candidatas de dichas moléculas de ARN candidatas y luego incubar dicha reacción de traducción en condiciones de salinidad elevada para producir una población de fusiones de proteínas y ARN candidatas, en la que dicha salinidad elevada comprende un catión monovalente a una concentración de entre 300 mM-1,5M y un catión divalente; y

c)

seleccionar una fusión de proteína y ARN deseada en base a la unión o a la actividad de fusión, seleccionando así dicha proteína deseada y dicho ácido nucleico codificante de dicha proteína.

\vskip1.000000\baselineskip

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho catión monovalente está a una concentración de entre aproximadamente 300 mM-600 mM.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho catión monovalente es K^{+}, NH_{4}^{+} o Na^{+}.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho catión divalente está a una concentración de entre aproximadamente 25 mM-200 mM.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho catión divalente es Mg^{2+}.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa de incubación se lleva a cabo a aproximadamente la temperatura ambiente.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada una de dichas moléculas de ARN comprende además una secuencia de pausa unida covalentemente, una secuencia de ADN unida covalentemente o una secuencia de análogo de ADN unida covalentemente, una cualquiera de las cuales está colocada entre dicha secuencia codificante de una proteína y dicho aceptor de péptidos.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN es de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el sitio de descodificación y el centro peptidil-transferasa de un ribosoma.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN es de una longitud de aproximadamente 60-70 \ring{A}.

12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN es de una longitud de menos de aproximadamente 80 nucleótidos.

13. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN es de una longitud de menos de aproximadamente 45 nucleótidos.

14. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN es de una longitud de entre aproximadamente 21-30 nucleótidos.

15. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN está unida a dicha molécula de ARN usando un puente de ADN.

16. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de pausa, dicha secuencia de ADN o dicha secuencia de análogo de ADN comprende un resto no nucleotídico.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho resto no nucleotídico es uno o más restos de HO(CH_{2}CH_{2}O)_{3}PO_{2} (polietilen-glicol-fosfato).

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha fusión de proteína y ARN comprende además una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de análogo de ácido nucleico colocada próxima a dicho aceptor de péptidos que aumenta la flexibilidad.

19. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha población de fusiones de proteínas y ARN se recupera de dicha reacción de traducción antes de dicha etapa de generación.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicha población de fusiones de proteínas y ARN se recupera mediante una etapa cromatográfica de ARN o proteínas, o una combinación de las mismas.

21. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicha población de fusiones de proteínas y ARN se recupera mediante la unión a dT-agarosa o tiopropil-sefarosa, o una combinación de las mismas.

22. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha población de fusiones de proteínas y ARN candidatas se recupera a partir de dicha reacción de traducción antes de dicha etapa de selección.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha población de fusiones de proteínas y ARN candidatas se recupera mediante una etapa cromatográfica de ARN o proteínas, o una combinación de las mismas.

24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha población de fusiones de proteínas y ARN candidatas se recupera mediante la unión a dT-agarosa o tiopropil-sefarosa, o una combinación de las mismas.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicha población de moléculas de ARN comprende al menos 10^{13} moléculas de ARN diferentes.

26. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha población de moléculas de ARN candidatas comprende al menos 10^{13} moléculas de ARN diferentes.

27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa de traducción in vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de una célula eucariota o una parte de la misma.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha etapa de traducción in vitro se lleva a cabo en un lisado de reticulocito.

29. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicha etapa de traducción in vitro se lleva a cabo en un lisado de germen de trigo.

30. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha etapa de traducción in vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de una célula bacteriana o una parte de la misma.

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31. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el procedimiento comprende además transcribir de forma inversa, y opcionalmente amplificar, dicho ARN de dichas fusiones de proteínas y ARN bien antes o después de dicha etapa de selección.

32. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho procedimiento comprende además amplificar dicha molécula de ADN.

33. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ARN es ARN mensajero.