PT1712623E - Selecção de proteínas utilizando fusões de arn-proteína - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "SELECÇÃO DE PROTEÍNAS UTILIZANDO FUSÕES DE ARN-PROTEÍNA"

Existem actualmente métodos para o isolamento de moléculas de ARN e ADN com base nas suas funções. Por exemplo, as experiências de Ellington e Szostak (Nature 346:818 (1990); e Nature 355:850 (1992)) e Tuerk e Gold (Science 249:505 (1990); e J. Mol. Biol 222:739 (1991)) demonstraram que se podem isolar moléculas de ácido nucleico muito raras (isto é, menos de 1 em 1013) com propriedades desejadas, a partir de agrupamentos complexos de moléculas por meio de ciclos repetidos de selecção e amplificação. Estes métodos têm vantagens em relação às selecções genéticas tradicionais, em que (i) se podem rastrear agrupamentos candidatos muito grandes (>1015), (ii) a viabilidade do hospedeiro e as condições ín vivo não são uma preocupação e (iii) as selecções podem ser realizadas mesmo se não existir um rastreio genético in vivo. O poder da selecção ín vitro foi demonstrado definindo novas sequências de ARN e ADN com funções de ligação a proteína muito específicas (veja-se, por exemplo, Tuerk e Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J.

Mol. Biol 222:739 (1991); Oliphant et al., Mol. Cell Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et al., Science 250:1104 (1990);

Pollock e Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen e Bach, Nuc. Acids Res. 18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529 (1991); Stormo e Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5699 (1991); e Bock et al. , Nature 355:564 (1992)), funções de ligação a moléculas pequenas (Ellington e Szostak, Nature 346:818 (1990); Ellington e Szostak, Nature 355:850 (1992)), e funções catalíticas (Green et ai.,

Nature 347:406 (1990); Robertson e Joyce, Nature 344:467 (1990); Beaudry e Joyce, Science 257:635 (1992); Bartel e

Szostak, Science 261:1411 (1993); Lorsch e Szostak, Nature 2 371:31-36 (1994); Cuenoud e Szostak, Nature 375:611-614 (1995); Chapman e Szostak, Chemistry and Biology 2:325-333 (1995); e Lohse e Szostak, Nature 381:442-444 (1996)). Não foi demonstrado um esquema semelhante para a selecção e amplificação de proteínas.

Assume-se que uma molécula do tipo vírus que compreende um cofactor específico de uma ribozima de replicação ligada ao seu ARN genético tenha sido um mediador na coevolução da replicação e da tradução. Descreveu-se também que esta molécula é útil para a engenharia molecular evolutiva utilizando o sistema de tradução livre de células. (Husimi et al., Progress in biophysics and molecular biology 65, supl. 1, página 64, 1996)

Niemeyer et ai. (Nucleic Acid Research 22(25):5530-5539, 1994) descrevem moléculas híbridas, em que ADN de cadeia simples curta é reticulado a estreptavidina. Assim, estas moléculas híbridas semi-sintéticas compreendem um domínio de ligação específica para ácidos nucleicos complementares bem como a quatro locais de ligação a biotina nativa de estreptavidina. Esta bioespecificidade permite que as moléculas híbridas atraiam ácidos nucleicos e proteínas biotiniladas num complexo e sirvam assim como conectores para a geração de bioconjugados supramoleculares e arranjos (arrays) macroscópicos.

Sumário da invenção A invenção refere-se a um microchip que compreende um arranjo (array) de ácidos nucleicos de cadeia simples imobilizados, sendo hibridados os ditos ácidos nucleicos a fusões de ARN-proteína, em que cada uma das ditas fusões de ARN-proteína compreende um ARN ligado covalentemente na extremidade 3' do ARN a uma proteína através de um aceitador de péptidos, e em que a dita proteína é codificada pelo dito ARN. 3 A invenção também se refere a uma biblioteca de moléculas cada uma compreendendo um ácido ribonucleico ligado covalentemente a uma proteína codificada pelo dito ácido ribonucleico A invenção também se refere a uma molécula que compreende uma porção de ácido ribonucleico (ARN) e uma porção de proteína codificada pela dita porção de ácido ribonucleico; em que a porção de ácido ribonucleico é ligada covalentemente à dita porção de proteína através de um aceitador de péptidos, e em que a porção de ácido ribonucleico é ligada covalentemente na sua extremidade 3' ao dito aceitador de péptidos através de um local de pausa. A invenção também se refere a uma molécula que compreende um ácido ribonucleico ligado covalentemente a um anticorpo, em que o dito anticorpo é codificado inteiramente pelo dito ácido ribonucleico. A invenção também se refere a um ácido ribonucleico que compreende uma sequência de iniciação de tradução e um codão de início ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata, sendo ligado covalentemente o dito ácido ribonucleico a um aceitador de péptidos na extremidade 3' da dita sequência codificante de proteína candidata, que compreende ainda uma sequência de ADN ou sequência análoga de ADN ligada covalentemente à extremidade 3' do ácido ribonucleico. 0 propósito da presente invenção é permitir aplicar os princípios de selecção in vitro e evolução in vitro a proteínas. A invenção facilita o isolamento de proteínas com propriedades desejadas, a partir de agrupamentos grandes de sequências de aminoácidos parcialmente ou totalmente aleatórias. Além disso, a invenção soluciona o problema de recuperar e amplificar a informação da sequência de proteína por meio da união de forma covalente da sequência codificante de ARNm à molécula de proteína. 4

Em geral, o método inventivo consiste num protocolo de transcrição/tradução in vitro ou in situ que gera proteína ligada covalentemente à extremidade 3' do seu próprio ARNm, isto é, uma fusão de ARN-proteína. Isto é conseguido pela síntese e tradução in vitro ou in situ de uma molécula de ARNm com um aceitador de péptidos unido à sua extremidade 3'. Um aceitador de péptidos preferido é a puromicina, um análogo de nucleósido que se adiciona ao terminal C de uma cadeia de péptido crescente e termina a tradução. Numa concepção preferida, inclui-se uma sequência de ADN entre o final da mensagem e o aceitador de péptidos, que é concebido de modo a fazer com que o ribossoma faça uma pausa no final da grelha de leitura aberta, proporcionando um tempo adicional para que o aceitador de péptidos (por exemplo, puromicina) aceite a cadeia de péptido nascente, antes da hidrólise da ligação peptidil-ARNt.

Se for desejado, a fusão de ARN-proteína resultante permite ciclos repetidos de selecção e amplificação, porque a informação da sequência de proteína pode ser recuperada por transcrição reversa e amplificação (por exemplo, por meio de amplificação por PCR, bem como qualquer outra técnica de amplificação, incluindo técnicas de amplificação à base de ARN, tais como 3SR ou TSA) . 0 ácido nucleico amplificado pode então ser transcrito, modificado e traduzido in vitro ou in situ para gerar fusões de ARNm-proteína para o ciclo de selecção seguinte. A capacidade de realizar múltiplos ciclos de selecção e amplificação, permite o enriquecimento e isolamento de moléculas muito raras, por exemplo, uma molécula desejada a partir de um conjunto de 1015 membros. Isto, por sua vez, permite o isolamento de proteínas novas ou melhoradas que reconhecem especificamente, praticamente qualquer alvo ou que catalisam reacções químicas desejadas.

Consequentemente, uma proteína desejada pode ser seleccionada por um método que envolve as etapas de: (a) 5 proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, cada uma das quais inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de inicio ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e cada uma das quais é ligada covalentemente a um aceitador de péptidos na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas para produzir uma população de fusões de ARN-proteína candidatas; e (c) seleccionar uma fusão de ARN-proteína desejada, seleccionando desse modo a proteína desejada.

Uma molécula de ADN que codifica uma proteína desejada pode ser seleccionada por um método que envolve as etapas de (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, cada uma das quais inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de início ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e cada uma das quais é ligada covalentemente a um aceitador de péptidos na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidata para produzir uma população de fusões de ARN-proteína candidatas; (c) seleccionar uma fusão de ARN-proteína desejada; e (d) gerar a partir da porção de ARN da fusão, uma molécula de ADN que codifica a proteína desejada.

Uma proteína que tem uma função alterada em relação a uma proteína de referência pode ser seleccionada por um método que envolve as etapas de: (a) produzir uma população de moléculas de ARN candidatas a partir de uma população de moldes de ADN, em que os moldes de ADN candidatos têm, cada um, uma sequência codificante de proteína candidata que difere da sequência codificante de proteína de referência, em que as moléculas de ARN compreendem, cada uma, uma sequência de iniciação da tradução e um codão de início ligado operativamente à sequência codificante de proteína 6 candidata e estão, cada uma, ligadas covalentemente a um aceitador de péptidos na extremidade 3'; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências de proteína candidatas para produzir uma população de fusões de ARN-proteína candidatas; e (c) seleccionar uma fusão de ARN-proteína que tem uma função alterada, seleccionando desse modo a proteína que tem a função alterada.

Uma molécula de ADN que codifica uma proteína que tem uma função alterada em relação a uma proteína de referência pode ser seleccionada por um método que envolve as etapas de: (a) produzir uma população de moléculas de ARN candidatas a partir de uma população de moldes de ADN candidatos, em que os moldes de ADN candidatos têm, cada um, uma sequência codificante de proteína candidata que difere da sequência codificante de proteína de referência, as moléculas de ARN compreendem, cada uma, uma sequência de iniciação da tradução e um codão de inicio ligado operativamente à sequência codificante de proteína candidata e cada uma das quais é ligada covalentemente a um aceitador de péptidos na extremidade 3'; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas, para produzir uma população de fusões de ARN-proteína; (c) seleccionar uma fusão de ARN-proteína que tem uma função alterada e (d) gerar a partir da porção de ARN da fusão, uma molécula de ADN que codifica a proteína que tem a função alterada.

Um ARN desejado pode ser seleccionado por um método que envolve as etapas de: (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, cada uma das quais inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de início ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e cada uma das quais é ligada covalentemente a um aceitador de péptidos na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de 7 proteína candidatas, para produzir uma população de fusões de ARN-proteína candidatas; e (c) seleccionar uma fusão de ARN-proteína desejada, seleccionando desse modo o ARN desejado.

Em formas de realização preferidas dos métodos acima, o aceitador de péptidos é puromicina; cada uma das moléculas de ARN candidatas inclui ainda uma sequência de pausa, ou inclui também uma sequência de ADN ou sequência análoga de ADN, ligada covalentemente à extremidade 3' do ARN; a população de moléculas de ARN candidatas inclui pelo menos 109, de preferência pelo menos IO10, mais preferivelmente, pelo menos ΙΟ11, 1012, ou 1013, e muito preferivelmente, pelo menos 1014 moléculas de ARN diferentes; a reacção de tradução in vitro é levada a cabo num lisado preparado a partir de uma célula eucariota ou porção da mesma (e é, por exemplo, levada a cabo num lisado de reticulócitos, ou lisado de gérmen de trigo); a reacção de tradução in vitro é levada a cabo num extracto preparado a partir de uma célula procariota (por exemplo, E. coli) ou porção da mesma; a etapa de selecção envolve a ligação da proteína desejada a um parceiro de ligação imobilizado, a etapa de selecção envolve ensaiar uma actividade funcional da proteína desejada; a molécula de ADN é amplificada; o método envolve também repetir as etapas dos métodos de selecção acima; o método envolve também fazer a transcrição de uma molécula de ARN a partir da molécula de ADN e repetir as etapas (a) a (d) ; após a etapa de tradução in vitro, o método envolve também uma etapa de incubação levada a cabo na presença de 50 - 100 mM de Mg2+; e a fusão de ARN-proteína inclui também uma sequência de ácido nucleico ou sequência análoga de ácido nucleico posicionada próximo do aceitador de péptidos, o que aumenta a flexibilidade. A invenção caracteriza uma fusão de ARN-proteína seleccionada por qualquer dos métodos da invenção; um ácido 8 ribonucleico ligado covalentemente através de uma ligação amida a uma sequência de aminoácidos, sendo codificada a sequência de aminoácidos pelo ácido ribonucleico; e um ácido ribonucleico que inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de inicio ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata, sendo ligado operativamente o ácido ribonucleico a um aceitador de péptidos (por exemplo, puromicina) na extremidade 3' da sequência codificante da proteína candidata.

Uma proteína desejada ou ARN desejado podem ser seleccionados através do enriquecimento de um agrupamento de sequências. Este método envolve as etapas de: (a) proporcionar uma população de moléculas de ARN candidatas, cada uma das quais inclui uma sequência de iniciação da tradução e um codão de início ligado operativamente a uma sequência codificante de proteína candidata e cada uma das quais é ligada covalentemente a um aceitador de péptidos na extremidade 3' da sequência codificante de proteína candidata; (b) traduzir in vitro ou in situ as sequências codificantes de proteína candidatas, para produzir uma população de fusões de ARN-proteína candidatas; (c) colocar em contacto a população de fusões de ARN-proteína com um parceiro de ligação específico para a porção de ARN, ou para a porção de proteína da fusão de ARN-proteína, sob condições que separam substancialmente os complexos de fusão de parceiro de ligação-ARN-proteína dos membros não ligados da população; (d) libertar as fusões de ARN-proteína ligadas dos complexos; e (e) colocar em contacto a população de fusões de ARN-proteína da etapa (d) com um parceiro de ligação específico para a porção de proteína da fusão de ARN-proteina desejada, sob condições que separam substancialmente o complexo de parceiro de ligação-ARN-proteína dos membros não ligados da referida população, seleccionando desse modo a proteína desejada e o ARN desejado. 9

Em formas de realização preferidas, o método envolve ainda repetir as etapas (a) a (e) . Além disso, para estas etapas repetidas, podem-se utilizar os mesmos, ou outros parceiros de ligação, em qualquer ordem, para o enriquecimento selectivo da fusão de ARN-proteína desejada. Em outra forma de realização preferida, a etapa (d) envolve a utilização de um parceiro de ligação (por exemplo, um anticorpo monoclonal) especifico para a porção de proteína da fusão desejada. Esta etapa é preferivelmente levada a cabo após transcrição reversa da porção de ARN da fusão, para gerar um ADN que codifica a proteína desejada. Se for desejado, este ADN pode ser isolado e/ou amplificado por PCR. Esta técnica de enriquecimento pode ser utilizada para seleccionar uma proteína desejada, ou pode ser utilizada para seleccionar uma proteína que tem uma função alterada em relação a uma proteína de referência.

Em outras formas de realização preferidas dos métodos de enriquecimento, o aceitador de péptidos é puromicina; cada uma das moléculas de ARN candidatas inclui também uma sequência de pausa ou inclui ainda uma sequência de ADN ou sequência análoga de ADN ligada covalentemente à extremidade 3' do ARN; a população de moléculas de ARN candidatas inclui pelo menos 109, de preferência pelo menos IO10, mais preferivelmente, pelo menos ΙΟ11, 1012, ou 1013, e muito preferivelmente, pelo menos 1014 moléculas de ARN diferentes; a reacção de tradução in vitro é levada a cabo num lisado preparado a partir de uma célula eucariota ou porção da mesma (e é, por exemplo, levada a cabo num lisado de reticulócitos ou lisado de gérmen de trigo); a reacção de tradução in vitro é levada a cabo num extracto preparado a partir de uma célula procariota ou sua porção (por exemplo, E. coli); a molécula de ADN é amplificada; pelo menos um dos parceiros de ligação é imobilizado sobre um suporte sólido; após a etapa de tradução in vitro, o método envolve ainda uma etapa de incubação levada a cabo na 10 presença de 50 - 100 mM de Mg2+; e a fusão de ARN-proteína inclui ainda uma sequência de ácido nucleico ou sequência análoga de ácido nucleico posicionada próximo do aceitador de péptidos, o que aumenta a flexibilidade.

Além disso, descrevem-se kits para levar a cabo qualquer dos métodos de selecção descritos no presente documento.

Num aspecto adicional, a invenção caracteriza um microchip que inclui um arranjo de ácidos nucleicos de cadeia simples imobilizados, sendo hibridados os ácidos nucleicos com fusões de ARN-proteína. 0 componente proteico da fusão de ARN-proteína é codificado pelo ARN.

Como é utilizado no presente documento, por uma "população" entende-se mais de uma molécula (por exemplo, mais de um ARN, ADN ou molécula de fusão de ARN-proteína). Uma vez que os métodos da invenção facilitam selecções que começam, se for desejado, com números elevados de moléculas candidatas, uma "população" de acordo com a invenção significa preferivelmente mais de 109 moléculas, preferivelmente mais de 1011, 1012, ou 1013 moléculas e muito preferivelmente mais de 1013 moléculas.

Por "seleccionar" entende-se separar substancialmente uma molécula de outras moléculas numa população. Como é utilizado no presente documento, uma etapa de "seleccionar" proporciona um enriquecimento de pelo menos 2 vezes, preferivelmente de 30 vezes, mais preferivelmente de 100 vezes e muito preferivelmente de 1000 vezes de uma molécula desejada, em relação a moléculas indesejadas numa população, após a etapa de selecção. Como é indicado no presente documento, uma etapa de selecção pode ser repetida um número qualquer de vezes e podem-se combinar diferentes tipos de etapas de selecção numa determinada abordagem.

Por uma "proteína" entende-se quaisquer dois ou mais aminoácidos de ocorrência natural ou modificados, ligados 11 por uma ou mais ligações peptídicas. "Proteína" e "péptido" são utilizados intercambiavelmente no presente documento.

Por "ARN" entende-se uma sequência de dois ou mais ribonucleótidos de ocorrência natural ou modificados, ligados covalentemente. Um exemplo de um ARN modificado incluído neste termo é ARN fosforotioato.

Por uma "sequência de iniciação da tradução" entende-se qualquer sequência que é capaz de proporcionar um local de entrada de ribossoma funcional. Em sistemas bacterianos, esta região é algumas vezes denominada como uma sequência de Shine-Dalgarno.

Por um "codão de início" entende-se três bases que sinalizam o começo de uma sequência codificante de proteína. Geralmente, estas bases são AUG (ou ATG); no entanto, qualquer outro tripleto de bases capaz de ser utilizado desta maneira pode ser substituído.

Por "ligado covalentemente" a um aceitador de péptidos entende-se que o aceitador de péptidos é ligado a uma "sequência codificante de proteína", ou directamente através de uma ligação covalente, ou indirectamente através de outra sequência ligada covalentemente (por exemplo, ADN correspondente a um local de pausa).

Por um "aceitador de péptidos" entende-se qualquer molécula capaz de ser adicionada ao terminal C de uma cadeia de proteína crescente pela actividade catalítica da função peptidiltransferase do ribossoma. Tipicamente, estas moléculas contêm (i) um nucleótido ou porção do tipo nucleótido (por exemplo, adenosina ou um análogo de adenosina (a dimetilação na posição amino N-6 é aceitável)), (ii) um aminoácido ou porção do tipo aminoácido (por exemplo, qualquer um dos 20 D- ou L-aminoácidos, ou qualquer análogo de aminoácido dos mesmos (por exemplo, O-metil tirosina ou qualquer dos análogos descritos por Ellman et ai., Meth. Enzymol. 202:301, 1991) e (iii) uma ligação entre os dois (por exemplo uma ligação 12 éster, amida ou cetona na posição 3' ou, menos preferivelmente, na posição 2'); preferivelmente, esta ligação não perturba de forma significativa a curvatura do anel da conformação natural do ribonucleótido. Os aceitadores de péptidos podem também possuir um nucleófilo que pode ser, sem limitação, um grupo amino, um grupo hidroxilo, ou um grupo sulfidrilo. Além disso, os aceitadores de péptidos podem ser compostos por miméticos de nucleótidos, miméticos de aminoácidos ou miméticos da estrutura combinada nucleótido-aminoácido.

Por um aceitador de péptidos posicionado na "extremidade 3'" de uma sequência codificante de proteína entende-se que a molécula de aceitador de péptidos está posicionada após o codão final dessa sequência codificante de proteína. Este termo inclui, sem limitação, uma molécula de aceitador de péptidos que está posicionada precisamente na extremidade 3' da sequência codificante de proteína, bem como uma que está separada do codão final por uma sequência codificante ou não codificante interveniente (por exemplo, uma sequência que corresponde a um local de pausa) . Este termo também inclui construções nas quais as sequências codificantes ou não codificantes estão a seguir (isto é, são 3' em relação) à molécula de aceitador de péptidos. Além disso, este termo inclui, sem limitação, uma molécula de aceitador de péptidos que é ligada covalentemente (directamente ou indirectamente através da sequência de ácido nucleico interveniente) à sequência codificante de proteína, bem como uma que está unida à sequência codificante de proteína por algum meio não covalente, por exemplo por hibridação utilizando uma segunda sequência de ácido nucleico que se liga a, ou próximo da extremidade 3' da sequência codificante de proteína e que por si mesma é ligada a uma molécula de aceitador de péptidos. 13

Por uma "função alterada" entende-se qualquer alteração qualitativa ou quantitativa na função de uma molécula.

Por uma "sequência de pausa" entende-se uma sequência de ácido nucleico que faz atrasar ou parar a velocidade de tradução de um ribossoma.

Por "parceiro de ligação", como é utilizado no presente documento, entende-se qualquer molécula que tem uma afinidade especifica, covalente ou não covalente, para uma porção de uma fusão de ARN-proteina desejada. Os exemplos de parceiros de ligação incluem, sem limitação, membros de pares antigénio/anticorpo, pares proteina/inibidor, pares receptor/ligando (por exemplo, pares receptor de superfície celular/ligando, tais como pares receptor de hormona/hormona peptídica), pares enzima/substrato (por exemplo, pares quinase/substrato), pares lectina/hidrato de carbono, agregados de proteínas oligoméricos ou hetero- oligoméricos, pares proteína de ligação a ADN/local de ligação a ADN, pares ARN/proteína e dúplices, heterodúplices ou cadeias ligadas de ácido nucleico, bem como qualquer molécula que seja capaz de formar uma ou mais ligações covalentes ou não covalentes (por exemplo, ligações dissulfureto) com qualquer porção de uma fusão ARN/proteína. Os parceiros de ligação incluem, sem limitação, quaisquer dos "motivos de selecção" apresentados na Figura 2.

Por um "suporte sólido" entende-se, sem limitação, qualquer coluna (ou material de coluna), pérola, tubo de ensaio, placa de microtítulo, partícula sólida (por exemplo, agarose ou Sepharose), microchip (por exemplo, um chip de silício, de vidro de silicio ou de ouro), ou membrana (por exemplo, a membrana de um lipossoma ou vesícula) ao qual se pode ligar um complexo de afinidade, directamente ou indirectamente (por exemplo, através de outros intermediários de parceiros de ligação, tais como 14 outros anticorpos ou proteína A) , ou em que um complexo de afinidade pode ser incorporado (por exemplo, através de um receptor ou canal).

Os métodos descritos no presente documento proporcionam várias vantagens significativas. Para começar, é o primeiro exemplo deste tipo de esquema para a selecção e amplificação de proteínas. Esta técnica ultrapassa o impasse criado pela necessidade de recuperar sequências de nucleótidos correspondentes a proteínas isoladas, desejadas (uma vez que somente os ácidos nucleicos podem ser replicados). Em particular, muitos métodos anteriores que permitiam o isolamento de proteínas a partir de agrupamentos parcialmente ou totalmente aleatórios, faziam-no através de uma etapa in vivo. Os métodos deste tipo incluem tecnologia de anticorpos monoclonais (Milstein, Sei. Amer. 243:66 (1980); e Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)), apresentação em fagos (Smith, Science 228:1315 (1985); Parmley e Smith, Gene 73:305 (1988); e McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)), fusões de péptido-repressor lac (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1865 (1992)), e selecções genéticas clássicas. Ao contrário da presente técnica, cada um destes métodos baseia-se numa ligação topológica entre a proteína e o ácido nucleico, de modo que a informação da proteína é retida e pode ser recuperada na forma de ácido nucleico que pode ser lido.

Além disso, os métodos descritos proporcionam vantagens em relação ao método de tradução bloqueada (Tuerk e Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J. Mol. Biol 222:739 (1991); Korman et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:1844-1848 (1982); Mattheakis et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9022- 9026 (1994); Mattheakis et al . , Meth. Enzymol. 267:195 (1996); e Hanes e Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4937 (1997)), uma técnica na qual a selecção é para alguma propriedade de uma cadeia de 15 proteína nascente que está ainda complexada com o ribossoma e o seu ARNm. Ao contrário da técnica de tradução bloqueada, o presente método não se baseia na manutenção da integridade de um complexo ternário ARNm:ribossoma:cadeia nascente, um complexo que é muito frágil e portanto limitativo em relação aos tipos de selecções que são tecnicamente possíveis. 0 presente método também proporciona vantagens em relação à abordagem de síntese ramificada proposta por Brenner e Lerner (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5381-5383 (1992)) em que se geram fusões de ADN-péptido e a informação genética é teoricamente recuperada em seguida a um ciclo de selecção. Ao contrário da abordagem de síntese ramificada, o presente método não requer a regeneração de um péptido a partir de uma porção de ADN de uma fusão (que, na abordagem de síntese ramificada é normalmente conseguido por ciclos individuais de síntese química). Consequentemente, o presente método permite ciclos repetidos de selecção utilizando populações de moléculas candidatas. Além disso, ao contrário da técnica de síntese ramificada, que se limita geralmente à selecção de sequências relativamente curtas, o presente método é aplicável à selecção de moléculas de proteína de comprimento considerável.

Ainda em outra vantagem, a presente técnica de selecção e evolução dirigida pode utilizar bibliotecas de sequências candidatas muito grandes e complexas. Pelo contrário, os métodos de selecção de proteínas existentes que se baseiam numa etapa in vivo, são tipicamente limitados a bibliotecas relativamente pequenas, de complexidade algo limitada. Esta vantagem é particularmente importante quando se seleccionam sequências de proteína funcionais, considerando, por exemplo, que existem 10 sequências possíveis para um péptido de apenas 10 aminoácidos de comprimento. Em técnicas genéticas 16 clássicas, abordagens de fusão do repressor lac e métodos de apresentação em fagos, as complexidades máximas têm geralmente uma magnitude inferior a 10 membros. Um tamanho de biblioteca grande também proporciona uma vantagem para aplicações de evolução dirigida, na medida em que o espaço da sequência pode ser explorado numa maior profundidade em torno de qualquer sequência de partida particular. A presente técnica também difere das abordagens anteriores na medida em que a etapa de selecção é independente do contexto. Em muitos outros esquemas de selecção, o contexto em que, por exemplo, uma proteína expressa está presente pode influenciar profundamente a natureza da biblioteca produzida. Por exemplo, uma proteína expressa pode não ser expressa de forma adequada num sistema particular, ou pode não ser apresentada de forma adequada (por exemplo, na superfície de uma partícula de fago) . Alternativamente, a expressão de uma proteína pode efectivamente interferir com um ou mais etapas críticos num ciclo de selecção, por exemplo, viabilidade ou infecciosidade do fago, ou ligação do repressor lac. Estes problemas podem resultar na perda de moléculas funcionais ou em limitações da natureza dos procedimentos de selecção que podem ser aplicados.

Finalmente, o presente método é vantajoso porque proporciona um controlo sobre o repertório de proteínas que podem ser testadas. Em certas técnicas (por exemplo, selecção de anticorpos) existe pouco ou nenhum controlo em relação à natureza do agrupamento de partida. Ainda em outras técnicas (por exemplo, fusões lac e apresentação em fagos), o agrupamento candidato deverá ser expresso no contexto de uma proteína de fusão. Pelo contrário, as construções de fusão de ARN-proteína proporcionam um controlo sobre a natureza dos agrupamentos candidatos disponíveis para rastreio. Além disso, o tamanho do 17 agrupamento candidato tem o potencial de ser tão elevado quanto o de agrupamentos de ARN ou ADN (~ 1015 membros), sendo somente limitado pelo tamanho da reacção de tradução in vítro realizada. E a constituição do agrupamento candidato depende completamente da concepção experimental; as regiões aleatórias podem ser rastreadas isoladamente ou no contexto de uma proteína de fusão desejada e a maioria, se não todas, as sequências possíveis podem ser expressas em agrupamentos candidatos de fusões de ARN-proteína.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada seguinte e das reivindicações.

Descrição Detalhada

As Figuras serão primeiro descritas resumidamente. Breve Descrição das Figuras

As FIGURAS 1A-1C são representações esquemáticas de etapas envolvidas na produção de fusões de ARN-proteína. A Figura IA ilustra uma construção de ADN de amostra para a geração de uma porção de ARN de uma fusão. A Figura 1B ilustra a geração de um conjugado de ARN/puromicina. A Figura 1C ilustra a geração de uma fusão de ARN-proteína. A FIGURA 2 é uma representação esquemática de um protocolo de selecção generalizado de acordo com a invenção. A FIGURA 3 é uma representação esquemática de um protocolo de síntese para moldes de tradução mínimos contendo 3' puromicina. A etapa (A) mostra a adição de grupos protectores aos grupos funcionais reactivos em puromicina (5'-OH e NH2) ; na forma modificada, estes grupos são adequadamente protegidos para utilização na síntese de oligonucleótidos à base de fosforamidito. A puromicina protegida foi unida a vidro de poro controlado (CPG) de amino hexilo, através do grupo 2ΌΗ, utilizando o protocolo convencional para união de ADN através do seu 3ΌΗ (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The 18

Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). Na etapa (B), sintetizou-se um molde de tradução minimo (denominado "43-P") que continha 43 nucleótidos, utilizando quimica de ADN e ARN padrão (Millipore, Bedford, MA) , desprotegeu-se utilizando NH4OH e TBAF, e purificou-se em gel. 0 molde continha 13 bases de ARN na extremidade 5', seguidas de 29 bases de ADN ligadas à puromicina 3' na sua extremidade 5'- OH. A sequência de ARN continha (i) uma sequência de consenso de Shine-Dalgarno complementar a cinco bases de ARNr 16S (Stormo et al. , Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine e Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71:1342-1346 (1974); e Steitz e Jakes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:4734- 4738 (1975)), (ii) um espaçador de cinco bases, e (iii) um único codão de inicio AUG. A sequência de ADN era dA27dCdCP, em que "P" é puromicina. A Figura 4 é uma representação esquemática de um método preferido para a preparação de puromicina ligada a CPG protegida. A FIGURA 5 é uma representação esquemática que mostra modos possíveis de incorporação de metionina num molde da invenção. Como é mostrado na reacção (A), o molde liga-se ao ribossoma permitindo a formação do complexo de iniciação 70S. O ARNt de Fmet liga-se ao local P e ocorre o emparelhamento de bases com o molde. A puromicina na extremidade 3 ' do molde entra no local A de um modo intramolecular e forma uma ligação amida com a N-formil metionina através de um centro de peptidil transferase, desacilando desse modo o ARNt. A extraeção da reacção com fenol/clorofórmio origina o molde com metionina ligada covalentemente. Na reacção (B) é mostrada uma reacção intermolecular indesejada do molde com puromicina que contém oligonucleótidos. Como anteriormente, o molde mínimo estimula a formação do ribossoma 70S que contém ARNt de fmet ligado ao local P. Isto é seguido de entrada de um 19 segundo molde em trans, para dar uma metionina unida covalentemente.

As FIGURAS 6A-6H são fotografias que mostram a incorporação de 35S metionina (35S met) em moldes de tradução. A Figura 6A demonstra a dependência da reacção do magnésio (Mg2+) . A Figura 6B demonstra a estabilidade de base do produto; a alteração na mobilidade apresentada nesta figura corresponde a uma perda da sequência de ARN 5' de 43-P (também denominada como "molde Met") para produzir a porção ADN-puromicina, denominada como 30-P. A retenção do marcador após tratamento com base era consistente com a formação de uma ligação peptidica entre 35S metionina e a 3' puromicina do molde. A Figura 6C demonstra a inibição da formação de produto na presença de inibidores de peptidil transferase. A Figura 6D demonstra a dependência da incorporação de 35S numa sequência codificante molde. A Figura 6E demonstra a dependência da incorporação de 35S metionina no comprimento do molde de ADN. A Figura 6F ilustra a formação de produto cis versus trans, utilizando os moldes 43-P e 25-P. A Figura 6G ilustra a formação de produto cis versus trans utilizando os moldes 43-P e 13-P. A Figura 6H ilustra a formação de produto cis versus trans utilizando os moldes 43-P e 30-P num sistema de lisado de reticulócito.

As FIGURAS 7A-7C são ilustrações esquemáticas de construções para testar a formação e selecção de fusões de péptido. A Figura 7A mostra LP77 ("produto ligado", "77" nucleótidos de comprimento) (também denominado, "molde myc curto") (SEQ ID NO: 1). Esta sequência contém a etiqueta de epitopo de anticorpo monoclonal de c-myc EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 2) (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610-3616 (1985)) flanqueado por um codão de inicio 5' e um ligante 3'. A região 5' contém uma sequência Shine-Dalgarno bacteriana idêntica à essa de 43-P. A sequência codificante foi optimizada para tradução em sistemas bacterianos. Em 20 particular, as 5' UTR de 43-P e LP77 continham uma sequência de Shine-Dalgarno complementar a cinco bases de ARNr 16S (Steitz e Jakes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:4734-4738 (1975)) e espaçadas de modo semelhante às sequências de proteina ribossómicas (Stormo et al, Nucleic Acids Res. 10:2971-2996 (1982)). A Figura 7B mostra LP154 (produto ligado, 154 nucleótidos de comprimento) (também denominado "molde myc longo") (SEQ ID NO: 3). Esta sequência contém o código para gerar o péptido utilizado para isolar o anticorpo de c-myc. A extremidade 5' contém uma versão truncada da sequência a montante de TMV (denominada como "TE) . Esta 5' UTR continha uma sequência de 22 nucleótidos derivada da 5' UTR de TMV que inclui duas repetições directas ACAAAUUAC (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 16:883 (1988)). A Figura 7C mostra o agrupamento N° 1 (SEQ ID NO: 4), um exemplo de sequência a ser utilizada para a selecção de péptidos. Os sete aminoácidos finais do péptido myc original foram incluídos no molde para servir como região constante 3' necessária para amplificação do molde por PCR. Sabe-se que esta sequência não faz parte do epítopo de ligação ao anticorpo. A FIGURA 8 é uma fotografia que mostra a síntese de fusões de ARN-proteína utilizando os moldes 43-P, LP77 e LP154 e sistemas de tradução de reticulócito ("Retic") e gérmen de trigo ("Trigo"). A metade esquerda da figura ilustra a incorporação de 35S metionina em cada um dos três moldes. A metade direita da figura ilustra os produtos resultantes após tratamento com ARNase A de cada um dos três moldes, para retirar a região codificante de ARN; são apresentadas fusões de ADN-proteína marcadas com 35S metionina. A porção de ADN de cada uma era idêntica ao oligo 30-P. Assim, as diferenças na mobilidade eram proporcionais ao comprimento das regiões codificantes, o que é consistente com a existência de proteínas de diferentes tamanhos em cada caso. 21 A FIGURA 9 é uma fotografia que demonstra a sensibilidade à protease de uma fusão de ARN-proteina sintetizada a partir de LP154 e analisada por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. A pista 1 contém 30-P marcado com 32P. As pistas 2-4, 5-7 e 8-10 contêm moldes de tradução marcados com 35S recuperados de reacções de lisados de reticulócitos, sem tratamento, com tratamento com ARNase A, ou com tratamento com ARNase A e proteinase K, respectivamente. A FIGURA 10 é uma fotografia que mostra os resultados de reacções de imunoprecipitação, utilizando a proteína de epítopo de myc de 33 aminoácidos traduzida in vitro. As pistas 1 e 2 mostram os produtos de tradução da proteína de epítopo de myc e moldes de β-globina, respectivamente. As pistas 3-5 mostram os resultados de imunoprecipitação do péptido de epítopo de myc utilizando um anticorpo monoclonal de c-myc e tampões de lavagem PBS, DB e PBSTDS, respectivamente. As pistas 6-8 mostram as mesmas reacções de imunoprecipitação, mas utilizando o produto de tradução de β-globina. A FIGURA 11 é uma fotografia que demonstra a imunoprecipitação de uma fusão de ARN-proteina a partir de uma reacção de tradução in vitro. São indicadas as picomoles de molde utilizadas na reacção. As pistas 1-4 mostram ARN124 (a porção de ARN da fusão LP154) e as pistas 5-7 mostram a fusão de ARN-proteina LP154. Após imunoprecipitação utilizando um anticorpo monoclonal de c-myc e proteína G Sepharose, as amostras foram tratadas com ARNase A e polinucleótido-quinase de T4, em seguida foram carregadas num gel de poliacrilamida com ureia, desnaturante, para visualizar a fusão. Nas pistas 1-4 com amostras que contêm ou não nenhum molde, ou contêm somente a porção de ARN do molde myc longo (ARN124), não se observou nenhuma fusão. Nas pistas 5-7 eram claramente visualizadas as bandas que correspondem à fusão. A posição 22 do 30-P marcado com 32P é indicada e a quantidade de molde inicial é indicada no topo da figura. A FIGURA 12 é um gráfico que mostra uma quantificação de material de fusão obtido de uma reacção de tradução in vitro. A intensidade das bandas de fusão mostradas nas pistas 5-7 da Figura 11 e a banda 30-P (isolada de um modo semelhante em dT25, não mostrado) foram quantificadas em placas de PhosphorImager e representadas graficamente como uma função da concentração de LP154 de entrada. 0 30-P modificado recuperado (eixo y da esquerda) era linearmente proporcional ao molde inicial (eixo x) , enquanto que a fusão de ligante-péptido (eixo y da direita) era constante. A partir desta analise, calculou-se que se formaram ~10 fusões por ml de amostra de reacção de tradução. A FIGURA 13 é uma representação esquemática de tiopropil Sepharose e agarose dT25 e a capacidade destes substratos interagirem com as fusões de ARN-proteína da invenção. A FIGURA 14 é uma fotografia que mostra os resultados do isolamento sequencial de fusões da invenção. A pista 1 contém 30-P marcado com 32P. As pistas 2 e 3 mostram o LP154 isolado a partir de reacções de tradução e tratado com ARNase A. Na pista 2, o LP154 foi isolado sequencialmente, utilizando tiopropil Sepharose seguido de dT25 agarose. A pista 3 mostra o isolamento utilizando somente agarose dT25. Os resultados indicaram que o produto continha um tiol livre, provavelmente a penúltima cisteina na sequência codificante do epítopo myc.

As FIGURAS 15A e 15B são fotografias que mostram a formação de produtos de fusão utilizando moldes de (β-globina, tal como ensaiado por SDS-tricina-PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida). A Figura 15A mostra a incorporação de 35S, não utilizando molde (pista 1) , ou utilizando molde syn-p-globina (pistas 2-4), ou um molde LP^-globina (pistas 5-7) . A Figura 15B (pistas 23 marcadas como na Fig. 15A) mostra material marcado com 35S isolado por cromatografia de afinidade de oligonucleótidos. Nenhum material foi isolado na ausência de uma cauda 30-P (pistas 2-4).

As FIGURAS 16A-16C são diagramas e fotografias que ilustram o enriquecimento de ADNcd de myc versus agrupamento de ADNcd por selecção in vitro. A Figura 16A é um esquema do protocolo de selecção. Quatro misturas dos moldes myc e do agrupamento foram traduzidas in vitro e isoladas em agarose dT25 seguido de TP Sepharose para purificar as fusões de molde dos moldes não modificados. As fusões de ARNm-péptido foram então transcritas inversamente para suprimir qualquer estrutura secundária ou terciária presente nos moldes. Retiraram-se alíquotas de cada mistura tanto antes (Figura 16B) como depois (Figura 16C) da selecção por afinidade, amplificou-se por PCR na presença de um iniciador marcado e digeriu-se com uma enzima de restrição que clivou somente o ADN de myc. As misturas de moldes de entrada eram myc puro (pista 1) ou myc:agrupamento a 1:20, 1:200 ou 1:2000 (pistas 2-4). O material não seleccionado desviava-se das razões de entrada devido à tradução preferencial e transcrição reversa do molde de myc. O enriquecimento do molde de myc durante a etapa selectiva foi calculado a partir da alteração na razão agrupamento:myc antes e após selecção. A FIGURA 17 é uma fotografia que ilustra a tradução de moldes de ARN de myc. Utilizaram-se os ligantes seguintes: pistas 1-4, dA27dCdCP; pistas 5-8, dA27rCrCP; e pistas 9-12, dA^CgCgCgdAdCdCP. Em cada pista, a concentração de molde de ARN era de 600 nM, e utilizou-se 35S-Met para marcação. As condições reaccionais eram como se segue: pistas 1, 5, e 9, 30 °C durante 1 hora; pistas 2, 6, e 10, 30 °C durante 2 horas; pista 3, 7, e 11, 30 °C durante 1 hora, -20 °C durante 16 horas; e pistas 4, 8, e 12, 30 °C durante 1 hora, -20 °C durante 16 horas com 50 mM de Mg2+. Nesta

Figura, "A" representa péptido livre, e "B" representa fusão de ARNm-péptido. A FIGURA 18 é uma fotografia que ilustra a tradução de moldes de ARN de myc marcados com 32P. 0 ligante utilizado era dA2iC9C9C9dAdCdCP. A tradução foi levada a cabo a 30 °C durante 90 minutos e as incubações foram realizadas a -20 °C durante 2 dias, sem Mg2+ adicional. As concentrações de moldes de ARNm eram 400 nM (pista 3), 200 nM (pista 4), 100 nM (pista 5), e 100 nM (pista 6). A pista 1 mostra a fusão de ARNm-péptido marcada com 35S-Met. A pista 2 mostra ARNm marcado com 32P. Na pista 6, a reacção foi levada a cabo na presença de 0,5 mM de análogo protector. A FIGURA 19 é uma fotografia que ilustra a tradução do molde de ARN de myc utilizando lisado obtido da Ambion (pista 1) , Novagen (pista 2] 1 e Amersham (pista 3) . 0 ligante utilizado era dA27dCdCP. A concentração do molde era 600 nM e utilizou-se 35S- •Met para marcação. As traduções foram realizadas a 30 °C durante 1 hora e as incubações foram realizadas a -20 °C durante a noite, na presença de 50 mM de Mg2+.

Descreve-se aqui um método geral para a selecção de proteínas com funções desejadas, utilizando fusões em que estas proteínas são ligadas covalentemente aos seus próprios ARN mensageiros. Estas fusões de ARN-proteína são sintetizadas por tradução in vitro ou in vivo de agrupamentos de ARNm que contêm um aceitador de péptidos ligado às suas extremidades 3' (Figura 1B) . Numa forma de realização preferida, após a leitura da grelha de leitura aberta da mensagem, o ribossoma pausa quando alcança o local de pausa concebido e a porção aceitadora ocupa o local A ribossómico e aceita a cadeia de péptido nascente do peptidil-ARNt no local P para produzir a fusão de ARN-proteína (Figura 1C). A ligação covalente entre a proteína e o ARN (na forma de uma ligação amida entre a extremidade 3' do ARNm e o terminal C da proteína que codifica) permite 25 que a informação genética na proteína seja recuperada e amplificada (por exemplo, por PCR) após selecção por transcrição reversa do ARN. Uma vez gerada a fusão, a selecção ou enriquecimento é realizado com base nas propriedades da fusão de ARNm-proteína ou, alternativamente, pode-se realizar a transcrição reversa utilizando o molde de ARNm, enquanto este está unido à proteína, para evitar qualquer efeito do ARN de cadeia simples na selecção. Quando se utiliza a construção ARNm-proteína, as fusões seleccionadas podem ser testadas para determinar qual porção (a proteína, o ARN ou ambos) proporciona a função desejada.

Numa forma de realização preferida, a puromicina (que se assemelha a tirosil adenosina) actua como aceitador para unir o péptido crescente ao seu ARNm. A puromicina é um antibiótico que actua terminando o alongamento do péptido. Como mimético de aminoacil-ARNt age como um inibidor universal da síntese de proteína ligando o local A, aceitando a cadeia peptídica crescente e saindo do ribossoma (a uma Kd = 1CT4 M) (Traut e Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964); Smith et al., J. Mol. Biol. 13:617 (1965)). Uma das características mais atractivas da puromicina é o facto de formar uma ligação amida estável com a cadeia peptídica crescente, permitindo assim fusões mais estáveis que os aceitadores potenciais que formam ligações éster instáveis. Em particular, a molécula de peptidil-puromicina contém uma ligação amida estável entre o péptido e a porção de O-metil tirosina da puromicina. A O-metil tirosina, por sua vez, é ligada por uma ligação amida estável ao grupo 3'-amino da porção de adenosina modificada da puromicina.

Outras escolhas adequadas para aceitadores incluem estruturas do tipo ARNt na extremidade 3' do ARNm, bem como outros componentes que agem de um modo semelhante à puromicina. Estes compostos incluem, sem limitação, qualquer composto que possui um aminoácido ligado a uma 26 adenina ou um composto do tipo adenina, tal como os nucleótidos de aminoácido fenilalanil adenosina (A-Phe), tirosil adenosina (A-Tyr), e alanil adenosina (A-Ala), bem como estruturas ligadas a amida, tais como fenilalanil 3' desoxi 3' aminoadenosina, alanil 3' desoxi 3' aminoadenosina e tirosil 3' desoxi 3' aminoadenosina; em qualquer destes compostos, pode-se utilizar qualquer dos L-aminoácidos de ocorrência natural, ou os seus análogos. Além disso, também pode ser utilizado na invenção um conjugado de estrutura 3' do tipo ARNt-puromicina combinado.

Na Figura 2, mostra-se um esquema de selecção preferido de acordo com a invenção. As etapas envolvidas nesta selecção são geralmente levadas a cabo como se segue.

Etapa 1. Preparação do molde de ADN. Como uma etapa para a produção de fusões de ARN-proteína da invenção, a porção de ARN da fusão é sintetizada. Isto pode ser conseguido por síntese química de ARN directa ou, mais usualmente, é conseguido por transcrição de um molde de ADN de cadeia dupla apropriado.

Tais moldes de ADN podem ser criados por qualquer técnica padrão (incluindo qualquer técnica de tecnologia de ADN recombinante, síntese química ou ambas). Em princípio, pode-se utilizar para este propósito qualquer método que permita a produção de um ou mais moldes contendo uma sequência conhecida, aleatória, modificada aleatoriamente ou submetida a mutagénese. Numa abordagem particular, um oligonucleótido (por exemplo, contendo bases aleatórias) é sintetizado e amplificado (por exemplo, por PCR), antes da transcrição. Também se pode utilizar síntese química para produzir uma cassete aleatória que é então inserida no meio de uma sequência codificante de uma proteína conhecida (veja-se, por exemplo, capítulo 8.2, Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons e Greene Publishing Company, 1994). Esta última abordagem 27 produz uma densidade elevada de mutações em torno de um local de interesse especifico na proteína.

Uma alternativa à modificação aleatória total de uma sequência molde de ADN é a modificação aleatória parcial, e um agrupamento sintetizado deste modo é geralmente denominado agrupamento "dopado". Um exemplo desta técnica realizada numa sequência de ARN é descrito, por exemplo, por Ekland et al. (Nucl. Acids Research 23:3231 (1995)). A modificação aleatória parcial pode ser realizada quimicamente desviando as reacções de síntese de um modo tal que cada mistura de reacção de adição de bases contém um excesso de uma base e pequenas quantidades de cada uma das outras; controlando cuidadosamente as concentrações das bases, pode-se conseguir uma frequência de mutação desejada, por esta abordagem. Os agrupamentos parcialmente modificados aleatoriamente podem também ser gerados utilizando técnicas de PCR propensas a erro, por exemplo, como descrito em Beaudry e Joyce (Science 257:635 (1992)) e Bartel e Szostak (Science 261:1411 (1993)).

Estão também disponíveis vários métodos para produzir uma construção de ADN começando com uma sequência conhecida e criando um agrupamento de ADN alterado por mutagénese. Os exemplos destas técnicas estão descritos em Ausubel et al. (supra, capítulo 8) e Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, 2a ed. (1989)). As sequências aleatórias podem também ser produzidas pela técnica de "vaivém" descrita em Stemmer (Nature 370: 389 (1994)).

Para optimizar um esquema de selecção da invenção, as sequências e estruturas nas extremidades 5' e 3' de um molde também podem ser alteradas. Preferivelmente, isto é levado a cabo em duas selecções separadas, cada uma envolvendo a inserção de domínios aleatórios no molde, próximo da extremidade adequada, seguido de selecção. Estas selecções podem servir (i) para maximizar a quantidade de 28 fusão produzida (e assim para maximizar a complexidade de uma biblioteca), ou (ii) para proporcionar sequências de tradução optimizadas. Além disso, o método pode ser aplicado em geral, combinado com PCR mutagénica, para optimização de moldes de tradução tanto nas regiões codificantes, como não codificantes.

Etapa 2. Geração de ARN. Como referido acima, a porção de ARN de uma fusão de ARN-proteína pode ser sintetizada quimicamente utilizando técnicas padrão de síntese de oligonucleótidos. Alternativamente, e em particular, quando se utilizam sequências de ARN maiores, a porção de ARN é produzida por transcrição in vitro de um molde de ADN. Numa abordagem preferida, utiliza-se polimerase de T7 para produzir enzimaticamente a cadeia de ARN. Outras polimerases de ARN adequadas para esta utilização incluem, sem limitação, as polimerases de ARN de SP6, T3 e E. coli (descritas, por exemplo, em Ausubel et al. (supra, capitulo 3) . Além disso, o ARN sintetizado pode ser ARN modificado, totalmente ou parcialmente. Num exemplo particular, pode-se produzir ARN fosforotioato (por exemplo, por transcrição de T7) utilizando ribonucleótidos modificados e técnicas padrão. Este ARN modificado tem a vantagem de ser estável a nucleases.

Etapa 3. Ligação de Puromicina ao Molde. Em seguida, a puromicina (ou qualquer outro aceitador de péptidos adequado) é ligada covalentemente à sequência molde. Esta etapa pode ser realizada utilizando ligase de ARN T4 para ligar a puromicina directamente à sequência de ARN ou, preferivelmente, a puromicina pode ser ligada por meio de uma "tira" de ADN utilizando ligase de ADN T4 ou qualquer outra enzima que é capaz de ligar duas sequências de nucleótidos uma à outra (veja-se Figura 1B) (veja-se também, por exemplo, Ausubel et al., supra, capítulo 3, secções 14 e 15) . As ARNt sintetases também podem ser utilizadas para ligar compostos do tipo puromicina a ARN. 29

Por exemplo, a fenilalanil ARNt sintetase liga a fenilalanina a moléculas de fenilalanil ARNt que contêm um grupo amino 3', produzindo moléculas de ARN com extremidades 3' do tipo puromicina (Fraser e Rich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70:2671 (1973)). Outros aceitadores peptidicos que podem ser utilizados incluem, sem limitação, qualquer composto que possui um aminoácido ligado a uma adenina ou um composto do tipo adenina, tais como os nucleótidos de aminoácidos, fenilalanil adenosina (A-Phe) , tirosil adenosina (A-Tyr) , e alanil adenosina (A-Ala), bem como estruturas ligadas a amida, tais como fenilalanil 3' desoxi 3' aminoadenosina, alanil 3' desoxi 3' aminoadenosina e tirosil 3' desoxi 3' aminoadenosina; em qualquer destes compostos, pode-se utilizar qualquer dos L-aminoácido de ocorrência natural, ou os seus análogos. Estão descritos vários aceitadores peptidicos, por exemplo, em Krayevsky e Kukhanova, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology 23:1 (1979).

Etapa 4. Geração e Recuperação de Fusões de ARN-Proteína. Para gerar fusões de ARN-proteína pode-se utilizar qualquer sistema de tradução in vitro ou in situ. Como é mostrado a seguir, preferem-se os sistemas eucarióticos e dois sistemas particularmente preferidos incluem os sistemas de lisado de gérmen de trigo e de reticulócitos. Em principio, no entanto, qualquer sistema de tradução que permita a formação de uma fusão de ARN-proteína e que não degrade significativamente a porção de ARN da fusão é útil na invenção. Além disso, para reduzir a degradação do ARN em qualquer destes sistemas, podem-se incluir na mistura de reacção de tradução, oligonucleótidos anti-senso que bloqueiam a degradação; estes oligonucleótidos hibridam especificamente com e cobrem sequências na porção de ARN da molécula que desencadeia a degradação (veja-se, por exemplo, Hanes e Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Sei USA 94:4937 (1997)). 30

Como referido acima, qualquer número de sistemas de tradução eucarióticos está disponível para utilização na presente invenção. Estes incluem, sem limitação, lisados de levedura, ascites, células de tumor (Leibowitz et al. , Meth. Enzymol. 194:536 (1991)), e ovos de oócito de Xenopus. Sistemas de tradução in vitro úteis de sistemas bacterianos incluem, sem limitação, os descritos em Zubay (Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973)); Chen e Zubay (Meth. Enzymol. 101:44 (1983)); e Ellman (Meth. Enzymol. 202:301 (1991)) .

Além disso, as reacções de tradução podem ser realizadas in situ. Num exemplo particular, a tradução pode ser levada a cabo por meio da injecção de ARNm em ovos de Xenopus, utilizando técnicas padrão.

Uma vez geradas, as fusões de ARN-proteína podem ser recuperadas da mistura de reacção de tradução por qualquer técnica padrão de purificação de proteína ou ARN. Tipicamente, utilizam-se técnicas de purificação de proteína. Como é mostrado a seguir, por exemplo, a purificação de uma fusão pode ser facilitada pela utilização de reagentes cromatográficos adequados, tais como agarose dT25 ou tiopropil Sepharose. A purificação, no entanto, pode envolver também, ou alternativamente, a purificação com base na porção de ARN da fusão; técnicas para tal purificação são descritas, por exemplo, em Ausubel et al. (supra, capítulo 4) .

Etapa 5. Selecção da Fusão de ARN-Proteína Desejada. A selecção de uma fusão de ARN-proteína desejada pode ser conseguida por qualquer meio disponível para separar ou isolar selectivamente uma fusão desejada a partir de uma população de fusões candidatas. Os exemplos de técnicas de isolamento incluem, sem limitação, ligação selectiva, por exemplo, a um parceiro de ligação que está imobilizado directa ou indirectamente numa coluna, pérola, membrana ou outro suporte sólido e imunoprecipitação utilizando um 31 anticorpo específico para a fracção de proteína da fusão. A primeira destas técnicas utiliza um motivo de selecção imobilizado que pode consistir de qualquer tipo de molécula com a qual se pode estabelecer ligação. Uma lista de moléculas de motivo de selecção possíveis é apresentada na Figura 2. A selecção também pode estar baseada na utilização de moléculas de substrato ligadas a um marcador de afinidade (por exemplo, substrato-biotina) que reagem com uma molécula candidata, ou por qualquer outro tipo de interacção com uma molécula de fusão. Além disso, as proteínas podem ser seleccionadas com base na sua actividade catalítica, de um modo análogo ao descrito por Bartel e Szostak para o isolamento de enzimas de ARN (supra); de acordo com essa técnica particular, as moléculas desejadas são seleccionadas com base na sua capacidade para ligar uma molécula alvo às mesmas e as moléculas funcionais são então isoladas com base na presença desse alvo. Os esquemas de selecção para isolar proteínas catalíticas novas ou melhoradas utilizando esta mesma abordagem ou qualquer outra selecção funcional são proporcionados pela presente invenção.

Além disso, como é descrito no presente documento, a selecção de uma fusão de ARN-proteína desejada (ou a sua cópia de ADN) pode ser facilitada por enriquecimento dessa fusão num agrupamento de moléculas candidatas. Para levar a cabo tal enriquecimento óptimo, uma população de fusões de ARN-proteína candidatas é colocada em contacto com um parceiro de ligação (por exemplo, um dos parceiros de ligação acima descritos) que é específico, ou para a porção de ARN, ou para a porção de proteína da fusão, sob condições que separam substancialmente o complexo de fusão de parceiro de ligação de membros não ligados na amostra. Esta etapa pode ser repetida e a técnica inclui preferivelmente pelo menos duas etapas de enriquecimento sequenciais, uma em que as fusões são seleccionadas 32 utilizando um parceiro de ligação especifico para a porção de ARN e outra em que as fusões são seleccionadas utilizando um parceiro de ligação especifico para a porção de proteina. Além disso, quando se repetem etapas de enriquecimento direccionadas para a mesma porção da fusão (por exemplo, a porção de proteina), utilizam-se preferivelmente diferentes parceiros de ligação. Num exemplo particular descrito no presente documento, uma população de moléculas é enriquecida nas fusões desejadas utilizando primeiro um parceiro de ligação especifico para a porção de ARN da fusão e em seguida, em duas etapas sequenciais, utilizando dois parceiros de ligação diferentes, sendo ambos específicos para a porção de proteína da fusão. Mais uma vez, estes complexos podem ser separados dos componentes da amostra por qualquer técnica de separação padrão, incluindo, sem limitação, cromatografia de afinidade em coluna, centrifugação ou imunoprecipitação.

Além disso, a eluição de uma fusão de ARN-proteína de um complexo de enriquecimento (ou selecção) pode ser conseguida por várias abordagens. Por exemplo, como é descrito no presente documento, pode-se utilizar uma etapa de eluição química desnaturante ou não específica para isolar uma fusão de ARN-proteína desejada. Esta etapa facilita a libertação de componentes complexos uns dos outros, ou de um suporte sólido associado, de um modo relativamente não específico, degradando ligações não covalentes entre os componentes e/ou entre os componentes e o suporte sólido. Como é descrito no presente documento, um exemplo de reagente de eluição química desnaturante ou não específica é H0Ac/H20 a 4 %. Outros exemplos de reagentes de eluição química desnaturante ou não específica incluem guanidina, ureia, concentração elevada de sal, detergente ou qualquer outro meio pelo qual se podem retirar em geral aductos não covalentes. Alternativamente, pode-se utilizar 33 uma abordagem de eluição química específica em que se explora um produto químico que origina a libertação específica de uma molécula de fusão. Num exemplo particular, se o ramo ligante de uma proteína de fusão desejada contém uma ou mais ligações dissulfureto, podem-se eluir aptâmeros de fusão ligados por adição, por exemplo, de DTT, resultando na redução da ligação dissulfureto e libertação do alvo ligado.

Alternativamente, a eluição pode ser conseguida quebrando especificamente complexos de afinidade; estas técnicas libertam selectivamente componentes complexos por adição de um excesso de um membro do complexo. Por exemplo, numa selecção de ligação de ATP, a eluição é realizada por adição de excesso de ATP à mistura de incubação. Finalmente, pode-se realizar uma etapa de eluição enzimática. Por esta abordagem, uma molécula ligada cliva ela própria, ou uma protease adicionada exogenamente (ou outra enzima hidrolítica adequada) e liberta ou o alvo, ou a enzima. Num exemplo particular, pode-se incluir um local alvo de protease em qualquer dos componentes do complexo e as moléculas ligadas podem ser eluídas por adição da protease. Alternativamente, numa selecção catalítica, a eluição pode ser utilizada como uma etapa de selecção para isolar moléculas capazes de se libertar (por exemplo, clivando) a elas próprias de um suporte sólido.

Etapa 6 . Geração de uma Cópia de ADN da Sequência de ARN utilizando Transcriptase Reversa. Se for desejado, uma cópia de ADN de uma sequência de fusão de ARN seleccionada é facilmente disponibilizada por transcrição reversa dessa sequência de ARN, utilizando qualquer técnica padrão (por exemplo, utilizando transcriptase reversa Superscript). Esta etapa pode ser levada a cabo antes da etapa de selecção ou enriquecimento (por exemplo, como é descrito na Figura 16), ou após essa etapa. Alternativamente, o processo de transcrição reversa pode ser levado a cabo 34 antes do isolamento da fusão a partir da mistura de tradução in vitro ou in situ.

Em seguida, o molde de ADN é amplificado, como sequência de cadeia dupla parcial, ou de tamanho total. Preferivelmente, nesta etapa, produzem-se moldes de ADN de tamanho total, utilizando oligonucleótidos adequados e amplificação por PCR.

Estas etapas e os reagentes e técnicas para levar a cabo estas etapas são agora descritos em detalhe, utilizando exemplos particulares. Estes exemplos são proporcionados para o propósito de ilustração da invenção e não deverão ser entendidos como limitativos.

GERAÇÃO DE MOLDES PARA FUSÕES DE ARN-PROTEÍNA

Como é mostrado nas Figuras IA e 2, o esquema de selecção da presente invenção utiliza preferivelmente moldes de ADN de cadeia dupla que incluem um número de elementos de concepção. 0 primeiro destes elementos é um promotor a ser utilizado em conjunto com uma polimerase de ARN desejada para síntese de ARNm. Como é mostrado na Figura IA e descrito no presente documento, o promotor T7 é preferido, embora se possa utilizar qualquer promotor capaz de dirigir a síntese de um ADN de cadeia dupla, linear. 0 segundo elemento do molde apresentado na Figura IA é denominado região 5' não traduzida (ou 5' UTR) e corresponde ao ARN a montante do local de iniciação da tradução. Na Figura IA é apresentada uma 5' UTR preferida (denominada como "TE") que é um mutante de eliminação da região 5' não traduzida do virus de mosaico de tabaco e, em particular, corresponde às bases directamente 5' do início da tradução TMV; a sequência desta UTR é como se segue: rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA (sendo os primeiros 3 nucleótidos G inseridos para aumentar a transcrição) (SEQ ID NO: 5). Pode-se utilizar qualquer outra 5' UTR adequada (veja-se, por exemplo, Kozak, Microbiol. Rev. 47:1 (1983)). 35 0 terceiro elemento apresentado na Figura IA é o local de inicio da tradução. Em geral, este é um codão AUG. No entanto, há exemplos em que se utilizam codões além do AUG em sequências codificantes de ocorrência natural e estes codões também podem ser utilizados no esquema de selecção da invenção. 0 quarto elemento na Figura IA é a grelha de leitura aberta da proteína (denominada como ORF) que codifica a sequência de proteína. Esta grelha de leitura aberta pode codificar qualquer sequência de proteína que ocorre naturalmente, aleatória, modificada aleatoriamente, submetida a mutagénese ou totalmente sintética. 0 quinto elemento apresentado na Figura IA é a região constante 3'. Esta sequência facilita a amplificação por PCR das sequências do agrupamento e a ligação do oligonucleótido que contém puromicina ao ARNm. Se for desejado, esta região pode também incluir um local de pausa, uma sequência que faz com que o ribossoma pause, permitindo assim um tempo adicional para que uma porção aceitadora (por exemplo, puromicina) aceite uma cadeia de péptido nascente do peptidil-ARNt; este local de pausa é discutido em mais detalhe a seguir.

Para desenvolver a presente metodologia, geraram-se inicialmente fusões de ARN-proteína utilizando moldes de ARNm altamente simplificados contendo 1-2 codões. Esta abordagem foi seguida por duas razões. Em primeiro lugar, os moldes deste tamanho podiam ser construídos facilmente por sintese química. E em segundo lugar, uma pequena grelha de leitura aberta permitiu ensaiar facilmente características críticas da reacção, incluindo eficiência de ligação, heterogeneidade de extremidade, dependência do molde e precisão da tradução.

Concepção da construção. Utilizou-se uma construção básica para produzir fusões de ARN-proteína de teste. A molécula consistia num ARNm que contém uma sequência de 36

Shine-Dalgarno (SD) para iniciação da tradução, que continha uma eliminação de 3 bases da sequência de SD da proteína ribossómica LI e que era complementar a 5 bases do ARNr 16S (isto é, rGrGrA rGrGrA rCrGrA rA) (SEQ ID NO: 6) (Stormo et al., Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982); Shine e Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71:1342-1346 (1974); e Steitz e Jakes, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72:4734-4738 (1975)), (ii) um codão de início AUG, (iii) um ligante de ADN para actuar como local de pausa (isto é, 5'-(dA)27), (iv) dCdC-3', e (v) uma puromicina 3' (P) . A sequência poli dA foi escolhida pois é conhecido que é um fraco molde de ARNt no local A (Morgan et al., J. Mol. Biol. 26:477-497 (1967); Ricker e Kaji, Nucleic Acid Research 19:6573-6578 (1991)) e foi concebida para agir como um bom local de pausa. O tamanho do ligante oligo dA foi escolhido para abranger a distância de -60-70 Á entre o local de descodificação e o centro de transferência de peptidilo do ribossoma. 0 dCdCP mimetizava a extremidade CCA de um ARNt e foi concebido para facilitar a ligação da puromicina ao local A do ribossoma. Síntese química do Molde Mínimo 43-P. Para sintetizar a construção 43-P (apresentada na Figura 3), a puromicina foi primeiro ligada a um suporte sólido de um modo tal que fosse compatível com a química de síntese de oligonucleótidos de fosforamidito padrão. 0 protocolo de síntese para este oligo está delineado esquematicamente na Figura 3 e é descrito em maior detalhe a seguir. Para unir a puromicina a um suporte sólido de vidro de poro controlado (CPG), o grupo amino foi protegido com um grupo trifluoroacetilo, como descrito no boletim do utilizador N° 49 da Applied Biosystems para o sintetizador de ADN modelo 380 (1988) . Em seguida, a protecção do 5 ΌΗ foi levada a cabo utilizando uma abordagem DMT- Cl padrão (Gait, Oligonucleotide Synthesis a practical Approach The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)), e a 37 ligação a amino hexilo CPG através do 2'-OH foi efectuada exactamente do mesmo modo que o 3'-OH seria utilizado para ligação de um desoxinucleósido (veja-se Fig. 3 e Gait, supra, p. 47). A puromicina protegida ligada a 5' DMT- CPG-era então adequada para alongamento da cadeia com monómeros de fosforamidito. A síntese do oligo prosseguiu na direcção 3' -> 5' na ordem: (i) 3' puromicina, (ii) pdCpdC, (iii) -27 unidades de dA como um ligante, (iv) AUG, e (v) a sequência de Shine-Dalgarno. A sequência da construção 43-P é mostrada a seguir. Síntese de Puromicina em CPG. A síntese de puromicina em CPG protegida seguiu a via geral utilizada para desoxinucleósidos, como foi descrito anteriormente (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). As principais diferenças incluíam a selecção de um grupo bloqueador de N adequado, ligação no 2'-OH ao suporte sólido, e reacção de ligação ao suporte sólido. No caso da última, a reacção foi levada a cabo a concentrações muito baixas de nucleótido activado, dado que este material era significativamente mais valioso que o suporte sólido. 0 rendimento resultante (~20 μπιοΐ/g de suporte) era bastante satisfatório, considerando as condições de reacção diluída. Síntese de N-Trifluoroacetil Puromicina. 267 mg (0,490 mmol) de Puromicina*HCl foram primeiro convertidos na forma de base livre dissolvendo em água, adicionando tampão carbonato pH 11 e extraindo (3X) em clorofórmio. A fase orgânica foi evaporada até à secura e pesada (242 mg, 0,513 mmol) . A base livre foi então dissolvida em 11 ml de piridina seca e 11 ml de acetonitrilo seco e adicionaram-se, com agitação, 139 μΐ (2,0 mmol) de trietilamina (TEA) e 139 μΐ (1,0 mmol) de anidrido trifluoroacético (TFAA). O TFAA foi então adicionado à solução turva em alíquotas de 20 μΐ, até não permanecer nenhum material de partida, tal como ensaiado por cromatografia em camada fina (tlc) (93:7, 38

Clorofórmio/MeOH) (um total de 280 μΐ). Deixou-se a reacção prosseguir durante 1 hora. Nesta altura, foram reveladas duas bandas por cromatografia em camada fina, ambas de mobilidade mais elevada que o material de partida. O processamento da reacção com NH4OH e água reduziu o produto a uma única banda. Por cromatografia em sílica (93:7 Clorofórmio/MeOH) obtiveram-se 293 mg (0,515 mmol) do produto, N-TFA-Pur. O produto desta reacção é mostrado esquematicamente na Figura 4. Síntese de N-Trifluoroacetil 5'-DMT Puromicina. O produto da reacção acima foi dividido em alíquotas e co-evaporado 2X com piridina seca, para retirar a água. Prepararam-se vários tubos para testar múltiplas condições de reacção. Numa reacção em pequena escala, dissolveram-se 27,4 mg (48,2 μπιοί) de N-TFA-Pur em 480 μΐ de piridina contendo 0,05 eq de DMAP e 1,4 eq de TEA. A esta mistura, adicionaram-se 20,6 mg de cloreto de tritilo (60 μιηοΐ) e deixou-se a reacção prosseguir até estar completa, com agitação. A reacção foi parada por adição de um volume igual de água (aproximadamente 500 μΐ) à solução. Uma vez que esta reacção parecia ser bem-sucedida, fez-se uma versão em grande escala. Em particular, dissolveram-se 262 mg (0,467 mmol) de N-TFA-Pur em 2,4 ml de piridina, seguido de adição de 1,4 eq de TEA, 0,05 eq de DMAP e 1,2 eq de cloreto de tritilo. Após aproximadamente duas horas, adicionaram-se mais 50 mg (0,3 eq) de dimetoxitritilo*Cl (DMT*C1) e deixou-se a reacção prosseguir por mais 20 minutos. A reacção foi parada por adição de 3 ml de água e co-evaporada 3X com CH3CN. A reacção foi purificada por Clorof órmio/MeOH a 95:5 numa coluna de 100 ml de sílica (seca) com 2 mm de diâmetro. Devido a purificação incompleta, correu-se uma segunda coluna idêntica com Clorofórmio/MeOH a 97,5:2,5. O rendimento total era de 325 mg ou 0,373 mmol (ou um rendimento de 72 %) . O produto desta reacção é apresentado esquematicamente na Figura 4. 39 Síntese de N-Trifluoroacetilo, 5'-DMT, 2' Succinil Puromicina. Numa reacção em pequena escala combinaram-se 32 mg (37 μπιοί) do produto sintetizado acima com 1,2 eq de DMAP dissolvido em 350 μΐ de piridina. A esta solução adicionaram-se 1,2 equivalentes de anidrido succínico em 44 μΐ de CH3CN seco e deixou-se a agitar durante a noite. A cromatografia em camada fina revelou pouca quantidade de material de partida remanescente. Numa reacção em grande escala, combinaram-se 292 mg (336 μιηοΐ) do produto anterior com 1,2 eq de DMAP em 3 ml de piridina. A este, adicionaram-se 403 μΐ de anidrido succínico 1M em CH3CN seco e deixou-se a mistura a agitar durante a noite. A cromatograf ia em camada fina revelou mais uma vez pouca quantidade de material de partida remanescente. As duas reacções foram combinadas e adicionaram-se mais 0,2 eq de DMAP e succinato. 0 produto foi co-evaporado com tolueno IX e seco até uma espuma amarela em vácuo elevado. Adicionou-se CH2CI2 (20 ml) e esta solução foi extraída duas vezes com 15 ml de ácido acético a 10 % arrefecido em gelo e em seguida duas vezes com água pura. O produto foi seco, redissolvido em 2 ml de CH2CI2 e precipitado por adição de 50 ml de hexano, com agitação. O produto foi então agitado num vórtex e centrifugado a 600 rpm durante 10 minutos na centrífuga clínica. A maioria do eluente foi retirada e o resto do produto foi seco, primeiro sob baixo vácuo, em seguida sob alto vácuo, num exsicador. O rendimento desta reacção era de aproximadamente 260 pmol para um rendimento em etapas de ~70 %. Síntese de N-Trifluoroacetil 5'-DMT, 2' Succinil. Puromicina em CPG. 0 produto da etapa anterior foi em seguida dissolvido com 1 ml de dioxano seguido de 0,2 ml de dioxano/0,2 ml de piridina. A esta solução, adicionaram-se 40 mg de p-nitrofenol e 140 mg de diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) e deixou-se a reacção prosseguir durante 2 horas. A ciclohexil ureia insolúvel produzida pela reacção foi 40 retirada por centrifugação e a solução de produto foi adicionada a 5 g de vidro de poro controlado (CPG) de amino hexilo, suspensa em 22 ml de DMF seca e agitada durante a noite. A resina foi então lavada com DMF, metanol, e éter e seca. A resina resultante foi ensaiada revelando conter 22,6 μπιοί de tritilo por g, o que está bem dentro da gama aceitável para este tipo de suporte. O suporte foi então protegido por incubação com 15 ml de piridina, 1 ml de anidrido acético e 60 mg de DMAP, durante 30 minutos. O material de coluna resultante produziu um teste de ninidrina negativo (sem cor) ao contrário dos resultados obtidos antes do bloqueio, em que o material produziu uma reacção de cor azul escura. O produto desta reacção é mostrado esquematicamente na Figura 4. Síntese de Conjugado de ARNm-Puromicina. Como foi discutido acima, pode-se utilizar um oligo com ligante puromicina em qualquer um dos dois modos para gerar um conjugado de ARNm-puromicina que age como um molde de tradução. Para as grelhas de leitura extremamente curtas, o oligo de puromicina é tipicamente alongado quimicamente com monómeros de ARN ou ADN, para criar um molde totalmente sintético. Quando se pretendem quadros de leitura aberta maiores, o oligo de ARN ou ADN é geralmente ligado à extremidade 3' de um ARNm utilizando uma tira de ADN e ligase de ADN T4, como descrito por Moore e Sharp (Science 256:992 (1992)) .

TRADUÇÃO IN VITRO E TESTE DE FUSÕES DE ARN-PROTEÍNA

Os moldes gerados acima foram traduzidos in vitro utilizando sistemas de tradução in vitro, tanto bacterianos como eucarióticos, como se segue.

Tradução in vitro de Moldes Mínimos. Adicionou-se 43-P e conjugados de ARN-puromicina relacionados a vários sistemas de tradução in vitro diferentes, incluindo: (i) o sistema S30 derivado de E. coli MRE600 (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen e 41

Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B.D. Hammes, S.J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; e Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991)) preparado como foi descrito por Ellman et ai. (Methods Enzymol. 202:301 (1991)); (ii) a fracção ribossómica derivada da mesma estirpe, preparada como foi descrito por Kudlicki et al. (Anal. Chem. 206:389 (1992)); e (iii) o sistema S30 derivado de E. coli BL21, preparado como foi descrito por Lesley et al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). Em cada caso, a pré-mistura utilizada era essa de Lesley et al . (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)), e as incubações tinham uma duração de 30 minutos.

Teste da Natureza da Fusão. 0 molde 43-P foi primeiro testado utilizando extractos de tradução S30 de E. coli. A Figura 5 (reacção "A") demonstra a reacção intramolecular desejada (cis) em que o 43-P se liga ao ribossoma e age ao mesmo tempo como um molde para, e um aceitador de fMet. A incorporação de 35S-met ionina e a sua posição no molde foram primeiro testadas e os resultados são apresentados nas Figuras 6A e 6B. Após a extracção da mistura de reacção de tradução in vitro com fenol/clorofórmio e análise dos produtos por SDS-PAGE, surgiu uma banda marcada com 35S com a mesma mobilidade que o molde 43-P. A quantidade deste material sintetizado era dependente da concentração de Mg2+ (Figura 6A) . A concentração óptima de Mg2+ parecia ser entre 9 e 18 mM, o que era similar ao óptimo para tradução neste sistema (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen e Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, in Transcription and Translation: A Practical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) pp. 179-209; Ellman et ai., Methods Enzymol. 202:301 (1991); Kudlicki et ai., Anal. Chem. 206:389 (1992); e Lesley et ai., J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). Além disso, o marcador incorporado era estável a 42 tratamento com NH4OH (Figura 6B), indicando que o marcador estava localizado na metade 3' da molécula (a porção de ADN estável a base) e estava ligado por uma ligação estável a base, como esperado para uma ligação amida entre puromicina e fMet.

Dependência do Ribossoma e do Molde. Para demonstrar que a reacção observada acima ocorreu no ribossoma, testaram-se os efeitos de inibidores específicos da função de peptidil transferase do ribossoma (Figura 6C) e analisou-se o efeito de alterar a sequência que codifica metionina (Figura 6D). A Figura 6C demonstra claramente que a reacção era fortemente inibida pelos inibidores de peptidil transferase, virginiamicina, gougerotina e cloranfenicol (Monro e Vazquez, J. Mol. Biol. 28:161-165 (1967); e Vazquez e Monro, Biochemica et Biophysical Acta 142:155-173 (1967)). A Figura 6D mostra que a alteração de uma única base no molde de A para C eliminou a incorporação de 35S metionina a 9 mM de Mg2+ e diminuiu a mesma bastante a 18 mM (o que é consistente com o facto de níveis elevados de Mg2+ levarem a erros de leitura da mensagem) . Estas experiências demonstraram que a reacção ocorreu no ribossoma de um modo dependente do molde.

Tamanho do Ligante. Também se testou a dependência da reacção no tamanho do ligante (Figura 6E). 0 molde original foi concebido de modo a que o ligante abrangesse a distância desde o local de descodificação (ocupado pelo AUG do molde) até ao local aceitador (ocupado pela porção de puromicina), uma distância que tinha aproximadamente o mesmo tamanho que a distância entre a laçada do anticodão e a haste aceitadora num ARNt, ou cerca de 60-70 À. O primeiro ligante testado tinha 30 nucleótidos de comprimento, com base num mínimo de 3,4 Â por base (> 102 À) . No intervalo entre 30 e 21 nucleótidos (n = 27 - 18; comprimento > 102 - 71 À) , observou-se pouca alteração na eficiência da reacção. Deste modo, o tamanho do ligante 43 pode ser variado. Apesar de um ligante entre 21 e 30 nucleótidos representar um comprimento preferido, também se podem utilizar na invenção ligantes mais curtos que 80 nucleótidos e, preferivelmente, mais curtos que 45 nucleótidos.

Reacções Intramoleculares versus Intermoleculares. Finalmente, foi testado se a reacção ocorria de um modo intramolecular (Figura 5, Reacção "A") como era desejado, ou intermolecularmente (Figura 5, Reacção "B") . Isto foi testado adicionando oligonucleótidos com 3' puromicina, mas sem sequência de ligação ao ribossoma (isto é, moldes 25-P, 13-P, e 30-P) às reacções de tradução contendo o molde 43-P (Figuras 6F, 6G, e 6H) . Se a reacção ocorreu por um mecanismo intermolecular, os oligos mais curtos também estarão marcados. Como é mostrado nas Figuras 6F-H, havia pouca incorporação de 35S metionina nos três oligos mais curtos, indicando que a reacção ocorreu essencialmente de um modo intramolecular. As sequências de 25-P (SEQ ID NO: 10), 13-P (SEQ ID NO: 9), e 30-P (SEQ ID NO: 8) são apresentadas a seguir.

Lisado de Reticulócitos. A figura 6H mostra que a 35S-metionina pode ser incorporada no molde 43-P utilizando um lisado de reticulócitos de coelho (ver a seguir) para tradução in vitro, além dos lisados de E. coli utilizados acima. Esta reacção ocorreu essencialmente num mecanismo intramolecular, como era desejado.

SÍNTESE E TESTE DE FUSÕES QUE CONTÊM UMA ETIQUETA DE EPÍTOPO DE C-MYC

Também se produziram fusões exemplares que continham, na porção de proteína, a etiqueta de epítopo para o anticorpo monoclonal de c-myc 9E10 (Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610 (1985)) .

Concepção dos Moldes. Foram concebidos três moldes iniciais de etiqueta de epítopo (isto é, LP77, LP154, e Agrupamento N° 1) e estes são apresentados nas Figuras 7A- 44 C. Os dois primeiros moldes continham a sequência de etiqueta de epítopo de c-myc EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 2), e o terceiro molde era a concepção utilizada na síntese de um agrupamento de selecção aleatório. 0 LP77 codificava para uma sequência de 12 aminoácidos, com os codões optimizados para tradução bacteriana. 0 LP154 e seus derivados continham uma sequência de ARNm de 33 aminoácidos em que os codões foram optimizados para tradução eucariótica. A sequência de aminoácidos codificada de MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 7) correspondia ao péptido original utilizado para isolar o anticorpo 9E10. 0 Agrupamento N° 1 continha 27 codões de NNG/C (para gerar péptidos aleatórios) seguidos de uma sequência que corresponde aos últimos sete aminoácidos do péptido myc (que não faziam parte da sequência de epítopo de myc). Estas sequências são mostradas a seguir.

Sistemas de Tradução In Vitro de Reticulócitos versus Gérmen de Trigo. Os moldes 43-P, LP77, e LP154 foram testados tanto em sistemas de tradução de extractos de reticulócitos de coelho como de gérmen de trigo (Promega,

Boehringer Mannheim ) (Figura 8) . As traduções foram realizadas a 30 °C durante 60 minutos. Os moldes foram isolados utilizando agarose dT25 a 4 °C. Os moldes foram eluídos da agarose utilizando NaOH 15 mM, EDTA 1 mM, neutralizados com tampão NaOAc/HOAc, precipitados imediatamente com etanol (2,5 - 3 vol), lavados (com etanol a 100 %) , e secos num concentrador Speedvac. A Figura 8 mostra que a 35S metionina foi incorporada em todos os três moldes, em ambos os sistemas de gérmen de trigo e reticulócitos. Observou-se menos degradação do molde nas reacções de fusão do sistema de reticulócitos e, deste modo, este sistema é preferido para a produção de fusões de ARN-proteína. Além disso, em geral os sistemas eucarióticos são preferidos em relação aos sistemas bacterianos. Uma vez que as células eucarióticas tendem a conter níveis mais 45 baixos de nucleases, os tempos de vida do ARNm são geralmente 10-100 vezes maiores nestas células que em células bacterianas. Em experiências utilizando um sistema de tradução de E. coli particular, não se observou a geração de fusões utilizando um molde que codifica o epitopo de c-myc; a marcação do molde em vários locais demonstrou que isso era provavelmente devido a degradação de ambas as porções de ARN e ADN do molde.

Para analisar a porção de péptido destas fusões, as amostras foram tratadas com ARNase para retirar as sequências codificantes. Após este tratamento, o produto 43-P correu com uma mobilidade quase idêntica à do oligo 30-P marcado com 32P, o que é consistente com a adição de um péptido muito pequeno (talvez somente metionina) a 30-P. Para LP77, a retirada da sequência codificante produziu um produto com uma mobilidade menor do que a do oligo 30-P, consistente com a noção de que um péptido de 12 aminoácidos foi adicionado à puromicina. Finalmente, para o LP154, a retirada da sequência codificante produziu um produto de mobilidade ainda mais baixa, consistente com uma sequência de 33 aminoácidos ligada ao oligo 30-P. Não se observou nenhum oligo na pista de reticulócitos tratados com ARNase devido a um erro na carga. Na Figura 9, pode ver-se que a mobilidade deste produto é igual à do produto gerado no extracto de gérmen de trigo. Em resumo, estes resultados indicam que produtos resistentes a ARNase foram adicionados às extremidades dos oligos 30-P, que os tamanhos dos produtos eram proporcionais ao tamanho das sequências codificantes e que os produtos eram bastante homogéneos em tamanho. Além disso, embora ambos os sistemas tenham produzido produtos de fusão semelhantes, o sistema de reticulócitos parecia ser superior devido a uma maior estabilidade do molde.

Sensibilidade a ARNase A e Proteinase K. Na Figura 9, a sensibilidade a ARNase A e proteinase K foram testadas 46 utilizando a fusão LP154. Como é mostrado nas pistas 2-4, a incorporação de 35S-metionina foi demonstrada para o molde LP154. Quando este produto foi tratado com ARNase A, a mobilidade da fusão diminuiu, mas era ainda significativamente mais elevada que a do oligonucleótido 30-P marcado com 32P, consistente com a adição de um péptido de 33 aminoácidos à extremidade 3'. Quando este material também foi tratado com proteinase K, o sinal de 35S desapareceu completamente, mais uma vez consistente com a noção de que o marcador estava presente num péptido na extremidade 3' do fragmento 30-P. Obtiveram-se resultados semelhantes em experiências equivalentes, utilizando as fusões 43-P e LP77.

Para confirmar que a marcação do molde por 35S Met era uma consequência da tradução e, mais especificamente, que resultava da actividade de peptidil transferase do ribossoma, analisou-se o efeito de vários inibidores na reacção de marcação. Os inibidores específicos de peptidil transferase eucariótica, anisomicina, gougerotina e esparsomicina (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, Nova Iorque), pp. 312 (1979)), bem como os inibidores de translocação ciclo-heximida e emetina (Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis (Springer-Verlag, Nova Iorque), pp. 312 (1979)) diminuíram todos a formação da fusão ARN-péptido em ~95 %, utilizando o molde de myc longo e um extracto de tradução de lisado de reticulócitos.

Experiências de Imunoprecipitação. Numa experiência concebida para ilustrar a eficácia da imunoprecipitação de uma fusão de ARNm-péptido, fez-se uma tentativa para imunoprecipitar um péptido c-myc isolado, produzido por tradução in vitro. A Figura 10 mostra os resultados destas experiências testadas num gel de péptidos de SDS PAGE. As pistas 1 e 2 mostram o material marcado de reacções de tradução contendo ou ARN124 (a porção de ARN de LP154) ou 47 ARNm de β-globina. As pistas 3-8 mostram a imunoprecipitação destas amostras da reacção, utilizando o anticorpo monoclonal de c-myc 9E10, sob várias condições de tampão diferentes (descrito a seguir). As pistas 3-5 mostram que o péptido derivado de ARN124 foi eficazmente imunoprecipitado, sendo o melhor caso a pista 4, em que se isolou ~83 % das contagens totais precipitáveis com TCA. As pistas 6-8 mostram pouca proteína β-globina, indicando uma purificação >100 vezes. Estes resultados indicaram que o péptido codificado por ARN124 (e por LP154) pode ser isolado quantitativamente por este protocolo de imunoprecipitação.

Imunoprecipitação da Fusão. Em seguida testou-se a capacidade de imunoprecipitar um produto ARN-péptido quimérico, utilizando uma reacção de tradução de LP154 e o anticorpo monoclonal de c-myc 9E10 (Figura 11). Os produtos de tradução de uma reacção de reticulócitos foram isolados por imunoprecipitação (como é descrito no presente documento) e tratados com 1 pg de ARNase A à temperatura ambiente, durante 30 minutos, para retirar a sequência codificante. Isto gerou um 5'OH que foi marcado com 32P com polinucleótido quinase de T4 e testado por PAGE desnaturante. A Figura 11 demonstra que foi isolado um produto com uma mobilidade semelhante à observada para a fusão do epítopo de c-myc com 30-P gerada por tratamento da fusão LP154 com ARNase (ver acima) , mas não foi gerado nenhum produto correspondente quando somente a porção de ARN do molde (ARN124) foi traduzida. Na Figura 12, a quantidade de proteínas de fusão isoladas foi determinada e representada graficamente contra a quantidade de 30-P não modificado (não apresentado nesta Figura). A quantificação da razão entre ligante não modificado e fusão ligante-péptido myc mostra que 0,2 - 0,7 % da mensagem de entrada foram convertidos no produto de fusão. Uma fracção maior do ARN de entrada foi convertida em produto de fusão na 48 presença de uma razao ribossoma/molde mais elevada; no intervalo de concentrações de ARNm de entrada que foram 12 testadas, produziram-se aproximadamente 0,8 - 1,0 x 10 moléculas de fusão por ml de extracto de tradução.

Além disso, os presentes resultados indicaram que os péptidos ligados às espécies de ARN eram codificados por esse ARNm, isto é, o péptido nascente não foi transferido para a puromicina de outro ARNm. Não se observou nenhuma indicação de transferência cruzada quando um ligante (30-P) foi co-incubado com o molde de myc longo nos extractos de tradução, em razões tão elevadas quanto 20:1, nem a presença de ligante livre diminuiu significativamente a quantidade de fusão myc longa produzida. De modo similar, a co-tradução dos moldes curto e longo, 43-P e LP154, produziu somente os produtos de fusão observados quando os moldes foram traduzidos isolados e não se observou nenhum produto de mobilidade intermediária, como seria de esperar para uma fusão do molde curto com o péptido myc longo. Ambos estes resultados sugeriram que a formação da fusão ocorreu essencialmente entre um péptido nascente e ARNm ligado ao mesmo ribossoma.

Isolamento Sequencial. Como posterior confirmação da natureza do produto do molde LP154 traduzido, analisou-se o comportamento deste produto em dois tipos diferentes de meios cromatográficos. A tiopropil (TP) Sepharose permite o isolamento de um produto que contém uma cisteina livre (por exemplo, o produto LP154 que tem um residuo de cisteina adjacente ao terminal C) (Figura 13) . De igual modo, a agarose dT25 permite o isolamento de moldes que contêm uma sequência poli dA (por exemplo, 30-P) (Figura 13). A Figura 14 mostra que o isolamento sequencial em TP Sepharose seguido de agarose dT25 produziu o mesmo produto que o isolamento em agarose dT25 isolado. O facto do produto de tradução in vitro conter tanto uma caracteristica poli-A 49 como um tiol livre, era uma forte indicação de que o produto de tradução era a fusão de ARN-proteina desejada.

Os resultados acima são consistentes com a capacidade de sintetizar fusões de ARNm-péptido e de recuperar as mesmas intactas a partir de extractos de tradução ín vitro. As porções de péptido de fusões assim sintetizadas pareciam ter as sequências pretendidas, como foi demonstrado por imunoprecipitação e isolamento utilizando técnicas cromatográficas adequadas. De acordo com os resultados apresentados acima, as reacções são intramoleculares e ocorrem de um modo dependente do molde. Finalmente, mesmo com uma modificação do molde inferior a 1 %, o presente sistema facilita selecções baseadas em complexidades de candidatos de cerca de 1013 moléculas.

Selecção da Recuperação do Epítopo de c-myc. Para seleccionar epítopos de c-myc adicionais, é produzida uma biblioteca grande de moldes de tradução (por exemplo, 1011 membros), que contêm uma região modificada aleatoriamente (veja-se Figura 17C e a seguir). Esta biblioteca é utilizada para produzir ~1012 - 1013 fusões (como é descrito no presente documento) que são tratadas com o anticorpo anti-c-myc (por exemplo, por imunoprecipitação ou utilizando um anticorpo imobilizado numa coluna ou outro suporte sólido) para se obter um enriquecimento em moldes que codificam para c-myc, em ciclos repetidos de selecção in vitro.

Modelos para Formação de Fusões. Sem que esteja vinculado a uma teoria particular, propõe-se um modelo para o mecanismo de formação de uma fusão, em que a tradução se inicia normalmente e o alongamento prossegue até ao propósito da grelha de leitura aberta. Quando o ribossoma atinge a porção de ADN do molde, a tradução bloqueia. Nesta altura, o complexo pode seguir dois destinos: dissociação do péptido nascente ou transferência do péptido nascente para a puromicina na extremidade 3' do molde. A eficiência 50 da reacção de transferência é provavelmente controlada por vários factores que influenciam a estabilidade do complexo de tradução bloqueado e a entrada do residuo 3' -puromicina no local A do centro de peptidil transferase. Após a reacção de transferência, a fusão de ARNm-péptido provavelmente permanece complexada com o ribossoma, uma vez que os factores de libertação conhecidos não podem hidrolisar a ligação amida estável entre os dominios de ARN e péptido.

Tanto o modelo clássico para alongamento (Watson, Buli. Soc. Chim. Biol. 46:1399 (1964)) e o modelo dos estados intermediários (Moazed e Noller, Nature 342:142 (1989)) requerem que o local A esteja vazio para a entrada de puromicina no centro de peptidil transferase. Para que a puromicina entre no local A vazio, o ligante deve fazer uma laçada em torno do exterior do ribossoma, ou passar directamente do local de descodificação através do local A, para o centro da peptidil transferase. Os dados descritos no presente documento não distinguem claramente entre estas alternativas, pois o ligante mais curto testado (21 nt) é ainda suficientemente grande para passar em torno do exterior do ribossoma. Em alguns modelos da estrutura do ribossoma (Frank et ai., Nature 376:441 (1995)), o ARNm passa através de um canal que se estende de cada lado do local de descodificação, caso em que seria necessário retirar o ligante do canal para permitir que a puromicina atingisse o centro de peptidil transferase através do local A. A transferência do péptido nascente para a puromicina parece ser lenta em relação ao processo de alongamento, como demonstrado pela homogeneidade e comprimento do péptido ligado ao ligante. Se a puromicina competisse efectivamente com os aminoacil-ARNt durante o alongamento, seria de esperar que as fusões ligante-péptido presentes nos produtos de fusão tivessem um tamanho heterogéneo. Além 51 disso, não parecia que o ribossoma lia na região ligante, tal como indicado pela semelhança de mobilidades em gel entre a fusão de Met-molde e o ligante não modificado. 0 dA3n deverá codificar (lisina)nque iria certamente diminuir a mobilidade do ligante. A baixa velocidade de retirada do ARNm poderá explicar a baixa velocidade de formação da fusão em relação à velocidade de translocação. Resultados preliminares sugerem que a quantidade de produto de fusão formado aumenta acentuadamente após uma incubação pós-tradução prolongada, a baixa temperatura, talvez devido ao maior tempo disponível para transferência do péptido nascente para a puromicina.

MATERIAIS E MÉTODOS DETALHADOS

Descrevem-se a seguir materiais e métodos detalhados, em relação à tradução in vitro e teste de fusões de ARN-proteína, incluindo fusões com um etiqueta de epítopo de c-myc.

Sequências. Utilizaram-se vários oligonucleótidos acima para a geração de fusões de ARN-proteína. Estes oligonucleótidos têm as seguintes sequências. 52

NOME SEQUÊNCIA 30- Ρ 5ΆΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ CCP (SEQ ID ΝΟ: 8) 13-Ρ 5'ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 9) 25-Ρ 5'CGC GGI ITT ΙΑΙ ITT ITT ITT ICC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 10) 43-Ρ 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArArU rGAA ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 11) 43-Ρ [CDG] 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 12) 40-Ρ 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 13) 37-Ρ 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 14) 34-Ρ 5'rGrGr A rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 15} 31- Ρ 5'rGrGrA rGrGrA rCrGrA rArCrU rGAA ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ACC Ρ (SEQ ID ΝΟ: 16) 53 (continuação)

NOME SEQUÊNCIA LP77 5'rGrGrG rArGrG rArCiG rArArA rUrGrG rArArC rArGrA rArArC rUrGrA rUrCrU rCrllrG rArArG rArArG rArCrC rUrGrA rArC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCF (SEQ ID NO: 1) LP 154

5'rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArOrO rOrArC rArArU rUrArC rA rArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA

rGrArA rGrArC rCrUrG rCrOrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG

rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC

rOrCrO rUrGrC rGrCrU AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCF (SEQ ID NO: 3) LP 160

5' 5'rGrGrG rArCrA rArDrD rArCrD rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA rArUrG rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS

rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS

rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rNrNrS rCrArG rCrOrG

rCrGrO rArArC rUrCrU rOrGrC rGrCrU AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CCF (SEQ ID NO: 17) 54

Todos os oligonucleótidos estão representados na direcção 5' para 3'. As bases de ribonucleótido são indicadas pela letra minúscula "r" antes da designação do nucleótido; P é puromicina; rN indica quantidades iguais de rA, rG, rC e rU; rS indica quantidades iguais de rG e rC; e todas as outras designações de bases indicam oligonucleótidos de ADN.

Produtos químicos. Puromicina HC1, vidro de poro controlado de alquilamina de cadeia longa, gougerotina, cloranfenicol, virginiamicina, DMAP, cloreto de dimetiltritilo e anidrido acético foram obtidos da Sigma Chemical (St. Louis, MO). A piridina, dimetilformamida, tolueno, anidrido succínico e para-nitrofenol foram obtidos da Fluka Chemical (Ronkonkoma, NY). 0 ARNm de β-globina foi obtido da Novagen (Madison, WI). 0 ARN de TMV foi obtido da Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).

Enzimas. A proteinase K foi obtida da Promega (Madison, WI) . A ARNase isenta de ADNase foi produzida ou pelo protocolo de Sambrook et al. (supra), ou adquirida da Boehringer Mannheim. A polimerase de T7 foi produzida pelo protocolo publicado de Grodberg e Dunn (J. Bacteriol. 170:1245 (1988)) com as modificações de Zawadzki e Gross (Nucl. Acids Res. 19:1948 (1991)). A ADN-ligase de T4 foi obtida da New England Biolabs (Beverly, MA) .

Quantificação da Incorporação de Marcador Radioactivo. Para bandas de geles radioactivos, a quantidade de marcador radioactivo (35S ou 32P) presente em cada banda foi determinada por quantificação, ou num analisador de manchas Betagen 603 (Betagen, Waltham, MA), ou utilizando placas de phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . Para amostras líquidas e sólidas, a quantidade de marcador radioactivo (35S ou 32P) presente foi determinada por contagem de cintilação (Beckman, Columbia, MD). 55

Imagens de gel. Obtiveram-se imagens de geles por autorradiografia (utilizando película Kodak XAR), ou utilizando placas de phosphorimager (Molecular Dynamics). Síntese de Puromicina em CPG. A seguir descrevem-se protocolos detalhados para a síntese de puromicina em CPG.

Reacções Enzimáticas. Em geral, a preparação de ácidos nucleicos para reacções de quinase, transcrição, PCR e tradução utilizando extractos de E. coli foi a mesma. Cada protocolo preparativo começou com extracção utilizando um volume igual de fenol/clorofórmio a 1:1, seguido de centrifugação e isolamento da fase aquosa. Adicionou-se acetato de sódio (pH 5,2) e espermidina a uma concentração final de 300 mM e 1 mM, respectivamente e a amostra foi precipitada por adição de 3 volumes de etanol a 100 % e incubação a -70 °C, durante 20 minutos. As amostras foram centrifugadas a >12.000 g, o sobrenadante foi retirado e os sedimentos foram lavados com um excesso de etanol a 95 %, a 0 °C. Os sedimentos resultantes foram então secos sob vácuo e ressuspensos.

Oligonucleótidos. Todos os ADN e ARN sintéticos foram sintetizados num sintetizador Millipore Expedite utilizando química padrão para cada, como fornecido pelo fabricante (Milligen, Bedford, MA). Os oligonucleótidos contendo 3' puromicina foram sintetizados utilizando colunas de CPG puromicina empacotadas com 30-50 mg de suporte sólido (~20 pmol de puromicina/grama). Os oligonucleótidos que contêm uma 3' biotina foram sintetizados utilizando 1 μπιοί de colunas bioteg CPG da Glen Research (Sterling, VA) . Os oligonucleótidos que contêm uma 5' biotina foram sintetizados por adição de bioteg fosforamidito (Glen Research) como base 5'. Os oligonucleótidos a ser ligados nas extremidades 3' das moléculas de ARN foram, ou quimicamente fosforilados na extremidade 5' (utilizando o reagente de fosforilação química da Glen Research) antes de desprotecção, ou fosforilados enzimaticamente utilizando 56 ATP e quinase de polinucleótido T4 (New England Biolabs) após desprotecção. As amostras contendo somente ADN (e 3'-puromicina ou 3'-biotina) foram desprotegidas por adição de NH4OH a 25 % seguido de incubação durante 12 horas a 55 °C. As amostras que contêm monómeros de ARN (por exemplo, 43-P) foram desprotegidas por adição de etanol (25 % (v/v)) à solução de NH4OH e incubação durante 12 horas a 55 °C. 0 2ΌΗ foi desprotegido utilizando TBAF 1M em THF (Sigma) durante 48 horas à temperatura ambiente. 0 TBAF foi retirado utilizando uma coluna NAP-25 Sephadex (Pharmacia, Piscataway, NJ).

As amostras de ADN e ARN desprotegidas foram então purificadas utilizando PAGE desnaturante, seguido ou de impregnação ou electro-eluição do gel, utilizando Elutrap (Schleicher e Schuell, Keene, NH) e dessalinização utilizando ou uma coluna NAP-25 Sephadex, ou precipitação com etanol, como foi descrito acima.

Construção de ADN de myc. Construiram-se dois moldes de ADN que contém a etiqueta de epítopo de c-myc. 0 primeiro molde foi construído a partir de uma combinação dos oligonucleótidos 64.27 (5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3') (SEQ ID NO: 18) e 18.109 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3') (SEQ ID NO: 19) . A transcrição utilizando este molde produziu ARN 47.1 que codificava para o péptido MEQKLISEEDLN (SEQ ID NO: 20). A ligação de ARN 47.1 a 30-P originou LP77, apresentado na Figura IA.

0 segundo molde foi construído primeiro como um oligonucleótido simples de 99 bases de comprimento, tendo a designação RWR 99.6 e a sequência 5'AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TTC CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3 (SEQ ID NO: 21) . Os moldes de transcrição de cadeia dupla que contêm esta sequência foram construídos por PCR com os oligos RWR 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3') (SEQ 57 ID NO: 22) e RWR 63.26 (5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA CTG-3 ' ) (SEQ ID NO: 23) de acordo com protocolos publicados (Ausubel et al. , supra, capítulo 15) . A transcrição utilizando este molde produziu um ARN denominado ARN124 que codificava para o péptido MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 24). Este péptido continha a sequência utilizada para produzir o anticorpo monoclonal 9E10 quando conjugado com uma proteína transportadora (Oncogene Science Technical Bulletin). 0 ARN124 tinha 124 nucleótidos de comprimento e a ligação de ARN124 a 30-P produziu LP154 apresentado na Figura 7B. A sequência de ARN12 4 é como se segue (SEQ ID NO: 32): 5'-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU-3'

Construção do Agrupamento Aleatorizado. 0 agrupamento aleatorizado foi construído como um oligonucleótido simples de 130 bases de comprimento, denominado RWR130.1. Começando na extremidade 3', a sequência era 3' CCCTGTTAATGATAAATGTTAATGTTAC (NNS)27 GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (SEQ ID NO: 25). N designa uma posição aleatória e esta sequência foi gerada de acordo com o protocolo sintetizador padrão. S designa uma mistura igual de bases dG e dC. Fez-se PCR com os oligonucleótidos 42.108 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA) (SEQ ID NO: 2 6) e 21.103 (5 ' -AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (SEQ ID NO: 27). A transcrição deste molde produziu um ARN denominado agrupamento 130.1. A ligação do agrupamento 130.1 a 30-P originou o agrupamento N° 1 (também denominado LP 160) apresentado na Figura 7C.

Fizeram-se sete ciclos de PCR de acordo com protocolos publicados (Ausubel et al. , supra) com as seguintes 58 excepções: (i) a concentração inicial de RWR130.1 era 30 nanomolar, (ii) cada iniciador foi utilizado a uma concentração de 1,5 μΜ, (iii) a concentração de dNTP era de 400 μΜ para cada base e (iv) a polimerase de Taq (Boehringer Mannheim) foi utilizada a 5 unidades por 100 μΐ. 0 produto de cadeia dupla foi purificado em PAGE desnaturante e isolado por electro-eluição. A quantidade de ADN foi determinada tanto por absorvância no UV a 26 0 nm como por comparação de fluorescência de brometo de etidio com padrões conhecidos. Síntese Enzimática de ARN. As reacções de transcrição de ADN de PCR de cadeia dupla e oligonucleótidos sintéticos foram realizadas como foi descrito anteriormente (Milligan e Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51 (1989)). 0 ARN de tamanho total foi purificado por PAGE desnaturante, electroeluído e dessalinizado como foi descrito acima. A concentração de ARN do agrupamento foi estimada utilizando um coeficiente de extinção de 1300 D.O./μπιοΙ; ARN124, 1250 D.O./μπιοΙ; ARN 47.1, 480 D.O./μπιοΙ. A transcrição a partir do ADN do agrupamento de cadeia dupla produziu ~90 nanomoles de ARN do agrupamento. Síntese Enzimática de Conjugados de ARN-Puromicina. A ligação das sequências de myc e de ARN mensageiro do agrupamento ao oligonucleótido que contém puromicina foi levada a cabo utilizando uma tira de ADN, denominada como 19.35 (5'-TTT TXT TTT TAG CGC AAG A) (SEQ ID NO: 28) utilizando um procedimento análogo ao descrito por Moore e Sharp (Science 250:992 (1992)). A reacção consistia em ARNm, tira e oligonucleótido de puromicina (30-P, dA27dCdCP) numa razão molar de 0,8:0,9:1,0 e 1-2,5 unidades de ADN-ligase por picomole de ARNm do agrupamento. As reacções foram realizadas durante 1 hora, à temperatura ambiente. Para a construção das fusões de ARN do agrupamento, a concentração de ARNm era de ~6,6 pmolar. Após a ligação, o conjugado de ARN-puromicina foi preparado 59 como foi descrito acima para reacções enzimáticas. 0 precipitado foi ressuspenso e purificaram-se fusões de tamanho total em PAGE desnaturante e isolaram-se por electro-eluição, como foi descrito acima. A concentração de ARN do agrupamento foi estimada utilizando um coeficiente de extinção de 1650 D.O./μπιοΙ e o molde myc 1600 Ό.Ο./μπιοΙ. Deste modo, produziram-se 2,5 nanomoles de conjugado.

Preparação de Agarose Estreptavidina dT25. Incubou—se dT25 que contém uma 3' biotina (sintetizada em colunas bioteg fosforamidito (Glen Research) ) a 1-10 μΜ com uma pasta de Agarose estreptavidina (agarose a 50 % em volume, Pierce, Rockford, IL) durante 1 hora à temperatura ambiente, em TE (Tris Cloreto 10 mM pH 8,2, 1 mM EDTA) e lavou-se. A capacidade de ligação da agarose foi então estimada opticamente através do desaparecimento de biotina-dT25 da solução e/ou por titulação da resina com quantidades conhecidas de oligonucleótido complementar.

Reacções de Tradução utilizando Extractos Derivados de E. coli e Ribossomas. Em geral, as reacções de tradução foram realizadas com kits adquiridos comercialmente (por exemplo, extracto de E. coli S30 para moldes lineares, Promega, Madison, WI). No entanto, a E. coli MRE600 (obtida da ATCC, Rockville, MD) também foi utilizada para gerar extractos de S30, preparados de acordo com protocolos publicados (por exemplo, Ellman et al. , Meth. Enzymol. 202:301 (1991)), bem como uma fracção ribossómica preparada como foi descrito por Kudlicki et al. (Anal. Biochem. 206:389 (1992)). A reacção padrão foi levada a cabo num volume de 50 μΐ com 20-40 μΟί de 35S-metionina como marcador. A mistura de reacção consistia em extracto a 30 % v/v, MgCl2 9-18 mM, pré-mistura a 40 % menos metionina (Promega) v/v, e 5 pM de molde (por exemplo, 43-P) . Para experiências de co-incubação, os oligos 13-P e 25-P foram adicionados a uma concentração de 5 μΜ. Para experiências utilizando ribossomas, adicionaram-se 3 μΐ de solução de 60 ribossomas por reacção, em vez do lisado. Todas as reacções foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos. Os moldes foram purificados como foi descrito acima sob reacções enzimáticas.

Reacções de Tradução de Gérmen de Trigo. As reacções de tradução na Figura 8 foram realizadas utilizando kits que não possuem metionina adquiridos comercialmente (Promega), de acordo com as recomendações do fabricante. As concentrações de molde eram 4 μΜ para 43-P e 0,8 μΜ para LP77 e LP154. As reacções foram realizadas a 25 °C com 30 pCi de 35S metionina, num volume total de 25 μΐ.

Reacções de Tradução de Reticulócitos. As reacções de tradução foram realizadas com kits adquiridos comercialmente (Novagen, Madison, WI), ou utilizando extracto preparado de acordo com protocolos publicados (Jackson e Hunt, Meth. Enzymol. 96:50 (1983)). Obteve-se sangue rico em reticulócitos da Pel-Freez Biologicals (Rogers, AK) . Em ambos os casos, as condições de reacção eram as recomendadas para utilização com lisado Red Nova (Novagen). As reacções consistiam em KC1 100 mM, MgOAc 0,5 mM, DTT 2 mM, HEPES 20 mM pH 7,6, fosfato de creatina 8 mM, 25 μΜ em cada aminoácido (com a excepção de metionina quando se utilizou 35S Met), e lisado a 40 % v/v. A incubação foi levada a cabo a 30 °C durante 1 hora. As concentrações de molde dependiam da experiência, mas em geral variavam de 50 nM a 1 μΜ, com a excepção de 43-P (Figura 6H) que era 4 μΜ.

Para a geração do agrupamento aleatorizado, foram realizados 10 ml de reacção de tradução a uma concentração de molde de ~0,1 μΜ (1,25 nanomoles de molde). Além disso, incluiu-se molde marcado com 32P na reacção para permitir a determinação da quantidade de material presente em cada etapa do procedimento de purificação e selecção. Após a tradução a 30 °C durante uma hora, a reacção foi arrefecida em gelo durante 30-60 minutos. 61

Isolamento da fusão com Agarose Estreptavidina dT25. Após a incubação, a reacção de tradução foi diluída aproximadamente 150 vezes em tampão de isolamento (NaCl 1,0 M, Tris cloreto 0,1 M pH 8,2, EDTA 10 mM, DTT 1 mM) que contém um excesso molar de mais de 10X de agarose dT25-biotina-estreptavidina cuja concentração de dT25 era de ~10 μΜ (volume de pasta igual ou superior ao volume de lisado) e incubou-se com agitação a 4 °C, durante uma hora. A agarose foi então retirada da mistura, ou por filtração (filtros ultrafree MC Millipore), ou centrifugação e lavada com tampão de isolamento frio 2- 4 vezes. O molde foi então libertado da agarose estreptavidina dT2s por lavagem repetida com alíquotas de 50-100 μΐ de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM. 0 eluente foi imediatamente neutralizado em NaOAc 3M pH 5,2, espermidina 10 mM e foi precipitado com etanol. Para a reacção do agrupamento, a radioactividade total recuperada indicou que se recuperaram aproximadamente 50-70 % do molde inicial.

Isolamento da Fusão com Tiopropil Sepharose. As fusões que contêm cisteína podem ser purificadas utilizando tiopropil Sepharose 6B como na Figura 13 (Pharmacia) . Nas experiências aqui descritas o isolamento foi levado a cabo, ou directamente a partir da reacção de tradução, ou após isolamento inicial da fusão (por exemplo, com agarose estreptavidina). Para as amostras purificadas directamente, utilizou-se uma razão de 1:10 (v/v) entre lisado e Sepharose. Para o agrupamento, utilizaram-se 0,5 ml de pasta de Sepharose para isolar todo o material de fusão a partir de 5 ml da mistura de reacção. As amostras foram diluídas numa pasta de tiopropil-Sepharose a 50:50 (v/v) em IX TE 8,2 (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2) contando ARNase isenta de ADNase (Boehringer Mannheim) e incubou-se com rotação durante 1-2 horas a 4 °C, para permitir uma reacção completa. O líquido em excesso foi retirado e a Sepharose foi lavada repetidamente com tampão de isolamento 62 que contém DTT 20 mM e recuperada por centrifugação ou filtração. As fusões foram eluidas da Sepharose utilizando uma solução de ditiotreitol (DTT) 25-30 mM em Tris-cloreto 10 mM pH 8,2, EDTA 1 mM. A fusão foi então concentrada por uma combinação de evaporação sob vácuo elevado e precipitação com etanol, como foi descrito acima. Para a reacção do agrupamento, a radioactividade total recuperada indicou que aproximadamente 1 % do molde foi convertido em fusão.

Para algumas aplicações, o dT2s foi adicionado a este eluato e submetido a rotação durante 1 hora a 4 °C. A agarose foi lavada três vezes com tampão de isolamento frio, isolada por filtração e o material ligado foi eluido como acima. Adicionou-se ARNt transportador e o produto de fusão foi precipitado com etanol. A amostra foi ressuspensa em TE pH 8,2 que contém ARNase A isenta de ADNase para retirar a porção de ARN do molde.

Reacções de Imunoprecipitação. As imunoprecipitações de péptidos das reacções de tradução (Figura 10) foram realizadas por meio da mistura de 4 μΐ de reacção de tradução de reticulócitos, 2 μΐ de soro de ratinho normal e 20 μΐ de Proteína G + A agarose (Calbiochem, La Jolla, CA) com 200 μΐ, ou de PBS (Na2HP04 58 mM, NaH2P04 17 mM, NaCl 68 mM) , tampão de diluição (Tris cloreto 10 mM pH 8,2, NaCl 140 mM, Triton X-100 a 1 % v/v), ou PBSTDS (PBS + Triton X-100 a 1 %, desoxicolato a 0,5 % SDS a 0,1 %) . As amostras foram em seguida submetidas a rotação durante 1 hora a 4 °C, seguido de centrifugação a 2500 rpm durante 15 minutos. O eluente foi retirado e adicionaram-se 10 μΐ de anticorpo monoclonal de c-myc 9E10 (Calbiochem, La Jolla, CA) e 15 μΐ de Proteina G + A agarose e submetido a rotação durante 2 horas a 4 °C. As amostras foram então lavadas com volumes de 1 ml, ou de PBS, tampão de diluição, ou PBSTDS. Adicionaram-se à mistura 40 μΐ de tampão de gel de carga (Calbiochem Product Bulletin) e carregaram-se 20 μΐ num 63 PAGE desnaturante, como foi descrito por Schagger e von Jagow (Anal. Biochem. 166:368 (1987)).

As imunoprecipitações de fusões (como apresentado na Figura 11) foram realizadas misturando 8 μΐ de reacção de tradução de reticulócitos com 300 μΐ de tampão de diluição (Tris cloreto 10 mM pH 8,2, NaCl 140 mM, Triton X-100 a 1 % v/v) , 15 μΐ de proteína G-Sepharose (Sigma) e 10 μΐ (1 pg) de anticorpo de c-myc 9E10 (Calbiochem), seguido de rotação durante várias horas a 4 °C. Após isolamento, as amostras foram lavadas, tratadas com ARNase A isenta de ADNase, marcadas com polinucleotido quinase e P gama ATP e separadas por PAGE com ureia desnaturante (Figura 11).

Transcrição Reversa do Agrupamento de Fusão. Foram realizadas as reacções de transcrição reversa de acordo com a recomendação do fabricante para Superscript II, excepto que o molde, água e iniciador foram incubados a 70 °C durante somente dois minutos (Gibco BRL, Grand Island, NY). Para monitorizar o alongamento, foram incluídos 50 pCi de alfa 32P dCTP em algumas reacções; em outras reacções, a transcrição reversa foi monitorizada utilizando iniciadores marcados com 32P 5' que foram preparados utilizando 32P cxATP (New England Nuclear, Boston, MA) e polinucleótido quinase de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA).

Preparação de Sepharose de Proteína G e Anticorpo. Lavaram-se duas alíquotas de 50 μΐ de pasta de Sepharose de Proteína G (50 % de sólido por volume) (Sigma) com tampão de diluição (Tris cloreto 10 mM pH 8,2, NaCl 140 mM, NaN3 a 0,025 %, Triton X-100 a 1 % v/v) e isolou-se por centrifugação. A primeira alíquota foi reservada para utilização como uma pré-coluna, antes da matriz de selecção. Após ressuspensão da segunda alíquota em tampão de diluição, adicionaram-se 40 pg de anticorpo monoclonal de c-myc AB-1 (Oncogene Science) e a reacção foi incubada durante a noite a 4 °C com rotação. A Sepharose de anticorpo foi então purificada por centrifugação durante 15 64 minutos a 1500-2500 rpm numa microcentrífuga e lavada 1-2 vezes com tampão de diluição.

Selecção. Após isolamento da fusão e síntese da cadeia complementar, toda a reacção de transcriptase reversa foi utilizada directamente no processo de selecção. São aqui delineados dois protocolos. Para o primeiro ciclo, a reacção de transcriptase reversa foi adicionada directamente à Sepharose de anticorpo preparada como foi descrito acima e incubou-se durante 2 horas. Para os ciclos subsequentes, a reacção é incubada durante ~2 horas com Sepharose de proteína G lavada, antes da coluna de anticorpo, para diminuir o número de ligantes que interagem com a proteína G, em vez do anticorpo imobilizado.

Para eluir o agrupamento da matriz, podem utilizar-se várias abordagens. A primeira é lavar a matriz de selecção com ácido acético a 4 %. Este procedimento liberta o péptido da matriz. Alternativamente, pode-se utilizar uma lavagem mais restringente (por exemplo, utilizando ureia ou outro desnaturante) ao invés de, ou em adição à abordagem do ácido acético. PCR_de_Fusões_Seleccionadas . As moléculas seleccionadas são amplificadas por PCR utilizando protocolos padrão como foi descrito acima para construção do agrupamento.

SÍNTESE E TESTE DE FUSÕES DE BETA-GLOBINA

Para sintetizar uma construção de fusão de β-globina, produziu-se ADNc de β-globina a partir de 2,5 pg de ARNm de globina por transcrição reversa com 200 μπιοί de iniciador 18.155 (5' GTG GTA TTT GTG AGC CAG) (SEQ ID NO: 29) e transcriptase reversa Superscript (Gibco BRL) de acordo com o protocolo do fabricante. A sequência de iniciador era complementar aos 18 nucleótidos de β-globina 5' em relação ao codão de terminação. Para adicionar um promotor de T7 retiraram-se 20 μΐ da reacção de transcrição reversa e submeteram-se a 6 ciclos de PCR com iniciadores 18.155 e 65 40.54 (5 ' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C) (SEQ ID NO: 30). O ARNm de "syn-β-globina" foi então gerado por transcrição runoff de T7 de acordo com Milligan e Uhlenbeck (Methods Enzymol. 180:51 (1989)) e o gel de ARN foi purificado, electroeluido e dessalinizado como é descrito no presente documento. Gerou-se então "LP-β-globina" a partir da construção syn^-globina por ligação dessa construção a 30-P, de acordo com o método de Moore e Sharp (Science 256:992 (1992)) utilizando o iniciador 20.262 (5 ' TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G) (SEQ ID NO: 31) como tira. O produto da reacção de ligação foi em seguida purificado em gel, electroeluido e dessalinizado como acima. A concentração do produto final foi determinada por absorvância a 260 nm.

Estes moldes de β-globina foram então traduzidos in vitro como foi descrito no Quadro 1, num volume total de 25 μΐ cada. Adicionou-se Mg2+ de uma solução mãe a 25 mM. Todas as reacções foram incubadas a 30 °C durante uma hora e colocadas a -20 °C durante a noite. Os CPM precipitáveis com dT25 foram então determinados duas vezes utilizando 6 μΐ de lisado e fez-se a sua média menos o ruído de fundo. QUADRO 1

Reacções de Tradução com Moldes de Beta-Globina

Reacção Molde Mg2+ 35S-Met CPM de CPM de (mM) (μΐ) TCA (2 μΐ) dT25 (6 1 — 1, o 2, 0 (20 μΟί) 3312 0 2 2,5 μ9 de 0, 5 2, 0 (20 μΟί) 33860 36 syn-β-globina 3 2,5 μ9 de 1,0 2, 0 (20 μΟί) 22470 82 syn-β-globina 4 2,5 μ9 de 2, 0 2, 0 (20 μΟί) 15696 86 syn-β-globina 66 (continuação)

Reacção Molde Mg2 + 35S-Met CPM de CPM de (mM) (μΐ) TCA (2 μΐ) dT25 (6 μΐ) 5 2,5 pg de 0,5 2,0 (20 μθί) 32712 218 LP^-globina 6 2,5 pg de 1, o 2,0 (20 μθί) 24226 402 syn-p-globina 7 2,5 μμ de 2, 0 2,0 (20 μθί) 15074 270 LP-^-globina

Para preparar as amostras para análise em gel, misturaram-se 6 μΐ de cada reacção de tradução com 1000 μΐ de tampão de isolamento (NaCl 1 M, Tris-Cl 100 mM pH 8,2, EDTA 10 mM, DTT 0,1 mM) , ARNase A 1 μΐ (isenta de ADNase, Boehringer Mannheim) e 20 μΐ de agarose estreptavidina dT25 20 μΜ. As amostras foram incubadas a 4 °C durante uma hora, com rotação. Retirou-se o excesso de tampão de isolamento e as amostras foram adicionadas a um filtro MC Millipore para retirar qualquer tampão de isolamento remanescente. As amostras foram em seguida lavadas quatro vezes com 50 μΐ de H20 e duas vezes com 50 μΐ de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM. A amostra foi neutralizada (300 μΐ) com 100 μΐ de TE pH 6,8 (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM), adicionou-se 1 μΐ de ARNase A 1 mg/ml (como acima) e as amostras foram incubadas a 37 °C. Adicionaram-se então 10 μΐ de 2X tampão de carga com SDS (Tris-Cl 125 mM pH 6,8, SDS a 2 %, (3-mercaptoetanol a 2 % glicerol a 20 %, azul de bromofenol a 0,001 %) e a amostra foi liofilizada até à secura e ressuspensa em 20 μΐ de H20 e β-mercaptoetanol a 1 %. As amostras foram então carregadas num gel resolvente de péptidos, como foi descrito por Schagger e von Jagow (Analytical Biochemistry 166:368 1987)) e visualizado por autorradiografia.

Os resultados destas experiências são mostrados nas Figuras 15A e 15B. Como indicado na Figura 15A, incorporou-se 35S-metionina na porção de proteína das fusões syn-β- 67 globina e LP-p-globina. A proteína era heterogénea, mas uma banda forte exibia a mobilidade esperada para o ARNm de β-globina. Além disso, como é mostrado na Figura 15B, após isolamento de dT25 e digestão com ARNase A, não permaneceu nenhum material marcado com 35S nas pistas de syn-p-globina (Figura 15B, pistas 2-4). Pelo contrário, nas pistas de LP-β-globina, observou-se um produto marcado com 35S de tamanho homogéneo.

Estes resultados indicaram que, como acima, foi isolado um produto de fusão por cromatografia de afinidade de oligonucleótidos, somente quando o molde continha uma 3' puromicina. Isto foi confirmado por contagem de cintilação (veja-se Quadro 1). É esperado que o material obtido contenha o ligante 30-P fundido com alguma porção da β-globina. 0 produto de fusão parecia ter um tamanho bastante homogéneo, como avaliado por análise em gel. No entanto, uma vez que o produto exibia uma mobilidade muito semelhante à β-globina natural (Figuras 15A e 15B, pistas de controlo), foi difícil determinar o tamanho preciso da porção de proteína do produto de fusão.

OPTIMIZAÇÃO ADICIONAL DA FORMAÇÃO DA FUSÃO DE ARN-PROTEÍNA

Verificou-se que alguns factores aumentam ainda mais a eficiência de formação de fusões de ARN-péptido. A formação da fusão, isto é, a transferência da cadeia de péptido nascente a partir do seu ARNt para a porção de puromicina na extremidade 3' do ARNm, é uma reacção lenta que se segue à tradução inicial, relativamente rápida, da grelha de leitura aberta, para produzir o péptido nascente. A extensão da formação da fusão pode ser substancialmente potenciada por uma incubação pós-tradução em condições de Mg2+ elevado (preferivelmente, num intervalo de 50-100 mM) e/ou utilizando um ligante mais flexível entre o ARNm e a porção de puromicina. Além disso, incubações longas (12-48 horas) a temperaturas baixas (preferivelmente, -20 °C) também resultam em maiores rendimentos de fusões com menos 68 degradação de ARNm que a que ocorre durante a incubação a 30 °C. Combinando estes factores, podem-se converter até 40 % do ARNm de entrada em produtos de fusão de ARNm-péptido, como é mostrado a seguir. Síntese de Conjugados de ARNm-Puromicina. Nestas experiências de optimização, ligaram-se oligonucleótidos ligantes que contêm puromicina às extremidades 3' de ARNm utilizando ADN-ligase de bacteriófago T4, na presença de tiras de ADN complementares, de um modo geral como foi descrito acima. Uma vez que a ligase de ADN T4 prefere um emparelhamento de bases preciso, próximo da junção de ligação e os produtos de transcrição runoff com polimerase de ARN de T7, T3, ou SP6 são muitas vezes heterogéneos nas suas extremidades 3' (Nucleic Acids Research 15:8783 (1987)), somente os ARN que contêm o nucleótido de terminal 3' correcto foram ligados eficazmente. Quando se utilizou uma tira de ADN padrão, aproximadamente 40 % dos produtos de transcrição runoff foram ligados ao oligo de puromicina. A quantidade de produto de ligação aumentou utilizando ARN em excesso, mas não aumentou utilizando oligonucleótido de puromicina em excesso. Sem que esteja vinculado a uma teoria particular, parecia que o factor limitativo para a ligação era a quantidade de ARN que era totalmente complementar à região correspondente da tira de ADN.

Para permitir a ligação dos transcritos que terminam com um nucleótido extra não existente no molde, no terminal 3' (denominados "produtos N+l"), utilizou-se uma mistura da tira de ADN padrão com uma nova tira de ADN que contém uma base aleatória adicional na junção da ligação. A eficiência da ligação aumentou mais de 70 % para um exemplo de molde de ARN de myc (isto é, ARN124) na presença desta tira de ADN mista.

Além desta abordagem de tira de ADN modificada, a eficiência da formação do conjugado de ARNm-puromicina também foi optimizada tendo em conta os seguintes três 69 factores. Primeiro, utilizaram-se ou conceberam-se preferivelmente ARNm que não possuíam terminais 3' com qualquer estrutura secundária estável, significativa que pudesse interferir com a fusão a um oligonucleótido de tira. Além disso, devido ao facto de que uma concentração elevada de sal provocou algumas vezes a falha da reacção de ligação, incluiu-se preferivelmente uma dessalinização profunda dos oligonucleótidos utilizando colunas NAP-25, como uma etapa no procedimento. Finalmente, devido ao facto de que a reacção de ligação era relativamente rápida e estava geralmente completa no espaço de 40 minutos à temperatura ambiente, não se utilizaram em geral períodos de incubação significativamente mais longos e muitas vezes resultavam na degradação desnecessária do ARN.

Utilizando as condições acima, sintetizaram-se conjugados de ARNm-puromicina como se segue. A ligação da sequência de ARN de myc (ARN124) ao oligonucleótido que contém puromicina foi realizada utilizando uma tira de ADN padrão (por exemplo, 5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA) ou uma tira que contém uma base aleatória (N) na junção da ligação (por exemplo, 5'-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA). As reacções consistiam em ARNm, a tira de ADN, e o oligonucleótido de puromicina numa razão molar de 1,0 : 1,5-2,0 : 1,0. A mistura destes componentes foi primeiro aquecida a 94 °C durante 1 minuto e em seguida arrefecida em gelo, durante 15 minutos. As reacções de ligação foram realizadas durante uma hora à temperatura ambiente em Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA a 25 μρ/πιΐ, oligo de puromicina 15 μΜ, ARNm 15 μΜ, tira de ADN 22,5-30 μΜ, inibidor ARNsina (Promega) a 1 U/μΙ, e 1,6 unidades de ligase de ADN T4 por picomole de oligo de puromicina. Após incubação, adicionou-se EDTA a uma concentração final de 30 mM, e as misturas reaccionais foram extraídas com fenol/clorofórmio. Os conjugados de tamanho total foram 70 purificados por PAGE desnaturante e isolados por electro-eluição.

Condições Gerais de Tradução de Reticulócitos. Além de melhorar a síntese do conjugado de ARNm-puromicina, as reacções de tradução foram também optimizadas como se segue. As reacções foram realizadas em lisados de reticulócito de coelho de diferentes fontes comerciais (Novagen, Madison, WI; Amersham, Arlington Heights, IL; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Ambion, Austin, TX; e Promega, Madison, WI) . Uma mistura de reacção típica (volume final de 25 μΐ) consistia em HEPES 20 mM pH 7,6, DTT 2 mM, fosfato de creatina 8 mM, KC1 100 mM, Mg(OAc)2 0,75 mM, ATP 1 mM, GTP 0,2 mM, 25 pM de cada aminoácido (metionina 0,7 μΜ quando se utiliza 35S-Met), ARNsina a 1 U/μΙ e lisado a 60 % (v/v) . A concentração final de molde era no intervalo de 50 nM a 800 nM. Para cada incubação, todos os componentes, excepto o lisado, foram misturados cuidadosamente em gelo e o lisado congelado foi descongelado imediatamente antes de ser utilizado. Após adição do lisado, a mistura de reacção foi bem misturada, pipetando cuidadosamente, e incubada a 30 °C para iniciar a tradução. As concentrações óptimas de Mg2+ e K+ variavam nos intervalos de 0,25 mM - 2 mM e 75 mM - 200 mM, respectivamente, para diferentes ARNm e eram determinadas preferivelmente em experiências preliminares. Em particular para ARNm fracamente traduzidos, as concentrações de hemina, fosfato de creatina, ARNt e aminoácidos também foram algumas vezes optimizadas. 0 cloreto de potássio era geralmente preferido em relação ao acetato de potássio para reacções de fusão, mas uma mistura de KC1 e KOAc algumas vezes produzia melhores resultados.

Após a tradução a 30 °C durante 30 a 90 minutos, a reacção foi arrefecida em gelo durante 40 minutos e adicionou-se Mg2+. A concentração final de Mg2+ adicionado nesta etapa também foi optimizada para diferentes moldes de 71 ARNm, mas era geralmente no intervalo de 50 mM a 100 mM (utilizando-se preferivelmente 50 mM para agrupamentos de moldes mistos). A mistura resultante foi incubada a -20 °C durante 16 a 48 horas. Para visualizar os produtos de fusão marcados, misturaram-se 2 μΐ de mistura de reacção com 4 μΐ de tampão de carga e a mistura foi aquecida a 75 °C durante 3 minutos. A mistura resultante foi então carregada num gel de SDS-poliacrilamida com glicina a 6 % (para moldes marcados com 32P) ou um gel de SDS-poliacrilamida com tricina a 8 % (para moldes marcados com 35S-Met) . Como alternativa a esta abordagem, os produtos de fusão também podem ser isolados utilizando agarose estreptavidina dT25 ou tiopropil Sepharose (ou ambas), de um modo geral como é descrito no presente documento.

Para retirar a porção de ARN do conjugado de ARN-ligante-puromicina-péptido para análise subsequente por SDS-PAGE, adicionou-se uma quantidade adequada de EDTA após a incubação pós-tradução e a mistura de reacção foi dessalinizada utilizando uma coluna microcon-10 (ou microcon-30). Misturaram-se 2 μΐ da mistura resultante (aproximadamente 25 μΐ no total) com 18 μΐ de tampão de ARNase H (Tris-HCl 30 mM, pH 7,8, (NH4)2S04 30 mM, MgCl2 8 mM, (3-mercaptoetanol 1,5 mM, e uma quantidade adequada de tira de ADN complementar) e a mistura foi incubada a 4 °C durante 45 minutos. Adicionou-se então ARNase H e a digestão foi levada a cabo a 37 °C durante 20 minutos.

Qualidade do Oligo de Puromicina. A qualidade do oligonucleótido de puromicina também era importante para a produção eficaz de produtos de fusão. O acoplamento de 5'-DMT, 2'-succinil, N-trifluoroacetil puromicina com CPG não era tão eficaz quanto o acoplamento dos nucleótidos convencionais. Assim, a reacção de acoplamento foi cuidadosamente monitorizada para evitar a formação de CPG com uma concentração demasiado baixa de puromicina acoplada e os grupos amino não reagidos no CPG foram totalmente 72 neutralizados para evitar a síntese subsequente de oligonucleótidos que não possuem uma puromicina no terminal 3'. Também era importante evitar a utilização de CPG que contém partículas de malha muito fina, uma vez que estas seriam capazes de causar problemas de entupimento de válvulas durante as etapas seguintes de síntese de oligonucleótidos automatizada.

Além disso, a puromicina sintetizada foi preferivelmente testada antes de uma utilização em grande escala, para assegurar a presença de puromicina na extremidade 3'. Nas presentes experiências, não era detectada nenhuma fusão se a puromicina fosse substituída com uma desoxiadenosina que contém um grupo amino primário na extremidade 3'. Para testar a presença de grupos 3'-hidroxilo (isto é, a síntese indesejada de oligos que não possuem uma puromicina no terminal 3' ), a puromicina pode ser primeiro marcada radioactivamente (por exemplo, por fosforilação 5') e em seguida utilizada como um iniciador para alongamento com desoxinucleotidil transferase terminal. Na presença de uma porção de puromicina de terminal 3', não se deverá observar nenhum produto de alongamento.

Evolução no Tempo da Tradução e Incubação Pós-Tradução. A reacção de tradução era relativamente rápida e estava geralmente completa dentro de 25 minutos a 30 °C. A reacção de fusão, no entanto, era mais lenta. Quando se utilizou um ligante padrão (dA27dCdCP) a 30 °C, a síntese da fusão atingiu o seu nivel máximo em mais 45 minutos. A incubação pós-tradução pôde ser levada a cabo a temperaturas baixas, por exemplo, temperatura ambiente, 0 °C, ou -20 °C. Observou-se menos degradação do molde de ARNm a -20 °C, e os melhores resultados de fusão foram obtidos após incubação a -20 °C, durante 2 dias. O Efeito da Concentração de Mg2+. Uma concentração elevada de Mg2+ na incubação pós-tradução estimulou 73 bastante a formação da fusão. Por exemplo, para o molde de ARN de myc descrito acima, observou-se uma estimulação de 3-4 vezes da formação da fusão utilizando um ligante padrão (dA27dCdCP) na presença de Mg2+ 50 mM durante a incubação de 16 horas a -20 °C (Figura 17, comparar pistas 3 e 4) . De igual modo, também se observou uma formação de fusão eficiente utilizando uma incubação pós-tradução na presença de uma concentração de Mg2+ de 50-100 mM quando as reacções foram realizadas à temperatura ambiente, durante 30-45 minutos.

Comprimento e Sequência do Ligante. A dependência da reacção de fusão no comprimento do ligante também foi analisada. No intervalo entre 21 e 30 nucleótidos (n=18-27) , observou-se pouca alteração na eficiência da reacção de fusão (como foi descrito acima). Ligantes mais curtos (por exemplo, com 13 nucleótidos de comprimento) resultaram numa menor fusão. Além disso, embora ligantes particulares de comprimento maior (isto é, de 45 nucleótidos e 54 nucleótidos) também tenham resultado em eficiências de fusão de certo modo menores, continua a ser provável que ligantes ainda maiores também possam ser utilizados para optimizar a eficiência da reacção de fusão.

Em relação à sequência do ligante, a substituição de resíduos de desoxirribonucleótido próximo da extremidade 3' com resíduos de ribonucleótido não alterou significativamente a eficiência da fusão. A sequência dCdCP (ou rCrCP) na extremidade 3' do ligante era, no entanto, importante para a formação da fusão. A substituição de dCdCP com dUdUP reduziu significativamente a eficiência da formação da fusão.

Flexibilidade do Ligante. A dependência da reacção de fusão na flexibilidade do ligante também foi testada. Nestas experiências, determinou-se que a eficiência da fusão era baixa se a rigidez do ligante fosse aumentada por fusão com um oligonucleótido complementar próximo da 74 extremidade 3'. De igual modo, quando se utilizou um ligante mais flexível (por exemplo, dA2iC9C9C9dAdCdCP, em que C9 representa HO (CH2CH20) 3P02) , a eficiência da fusão era significativamente melhorada. Em comparação com o ligante padrão (dA27dCdCP), a utilização de um ligante mais flexível (dA^CgCgCgdAdCdCP) melhorou a eficiência de fusão para ARN124 em mais de 4 vezes (Figura 17, comparar pistas 1 e 9) . Além disso, ao contrário do molde com o ligante padrão, cuja fusão pós-tradução prosseguiu fracamente na ausência de uma concentração elevada de Mg (Figura 17, pista 3 e 4), o molde com o ligante flexível não necessitava de Mg2+ elevado para produzir um bom rendimento de produto de fusão numa incubação pós-tradução prolongada, a -20 °C (Figura 17, comparar pistas 11 e 12). Este ligante era, portanto, muito útil se não se desejassem adições pós-tradução de concentrações elevadas de Mg2+. Além disso, o ligante flexível também produziu rendimentos de fusão óptimos, na presença de Mg2+ elevado.

Quantificação da Eficiência de Fusão. A eficiência de fusão pode ser expressa quer como a fracção de péptido traduzido convertido em produto de fusão, quer como a fracção de molde inicial convertida em produto de fusão. Para determinar a fracção de péptido traduzido convertido em produto de fusão, utilizou-se marcação com 35S-Met do péptido traduzido. Nestas experiências, quando se utilizou um ligante dA27dCdCP ou dA27rCrCP, cerca de 3,5 % do péptido traduzido foram fusionados com o seu ARNm após uma incubação de tradução de 1 hora, a 30 °C. Este valor aumentou para 12 % após incubação durante a noite a -20 °C. Quando a incubação pós-tradução foi levada a cabo na presença de uma concentração elevada de Mg2+, mais de 50 % do péptido traduzido foram fusionados com o molde.

Para um molde com um ligante flexível, aproximadamente 25 % do péptido traduzido foram fusionados com o molde após 1 hora de tradução a 30 °C. Este valor aumentou para mais 75 de 50 % após incubação durante a noite a -20 °C e para mais de 75 %, se a incubação pós-tradução fosse realizada na presença de Mg2+ 50 mM.

Para determinar a percentagem do molde de entrada convertido em produto de fusão, as traduções foram realizadas utilizando molde de ARNm-ligante marcado com 32P. Quando se utilizou o ligante flexível e se realizou a incubação pós-tradução a -20 °C sem adição de Mg2+, cerca de 20 %, 40 %, 40 %, 35 %, e 20 % do molde inicial foram convertidos na fusão de ARNm-péptido quando a concentração do molde de ARN de entrada era de 800, 400, 200, 100, e 50 nM, respectivamente (Figura 18). Obtiveram-se resultados semelhantes quando a incubação pós- tradução foi levada a cabo na presença de Mg2+ 50 mM. Obtiveram-se os melhores utilizando lisados obtidos da Novagen, Amersham, ou Ambion (Figura 19).

As diferenças de mobilidade entre os ARNm e fusões de ARNm-péptido, como foi medido por SDS-PAGE, podem ser muito pequenas se o molde de ARNm for longo. Nestes casos, o molde pode ser marcado na extremidade 5' do ligante com 32p. A porção de ARN longa pode ser então digerida com ARNase H na presença de uma tira de ADN complementar, após tradução/incubação e a eficiência da fusão pode ser determinada por quantificação da razão entre ligante não modificado e fusão ligante-péptido. Em comparação com a digestão com ARNase A, que produz 3'-P e 5'-OH, esta abordagem tem a vantagem do 32P na extremidade 5' do ligante não ser retirado.

Fusão Intramolecular versus Intermolecular Durante a Incubação Pós-Tradução. Além das experiências acima, foi testado se a reacção de fusão que ocorria a -20 °C na presença de Mg2+ era de natureza intra- ou intermolecular. Fez-se a co-incubação de ligante livre (dA27dCdCP ou dA2iC9C9C9dAdCdCP, em que C9 é -O (CH2CH20) 3P02~) com um molde que contém um ligante de ADN, mas sem puromicina na 76 extremidade 3', sob as condições de incubação durante a tradução e pós-tradução descritas acima. Nestas experiências, não se incorporou nenhuma quantidade detectável (isto é, menos de 2 % do nível normal) de S-Met no produto ligante-péptido, sugerindo que a fusão pós-tradução ocorreu essencialmente entre o péptido nascente e o ARNm ligado ao mesmo ribossoma.

Resultados da optimização. Como foi ilustrado acima, utilizando o ligante flexível e/ou realizando a incubação pós-tradução na presença de uma concentração elevada de Mg2+, as eficiências de fusão aumentaram para aproximadamente 40 % do ARNm de entrada. Estes resultados indicaram que podiam ser produzidas tanto quanto 1014 moléculas da fusão de ARNm-péptido por ml de mistura de reacção in vitro, produzindo conjugados de fusões de ARNm-péptido de complexidade muito elevada, para utilização em experiências de selecção in vitro.

ENRIQUECIMENTO SELECTIVO DE FUSÕES DE ARN-PROTEÍNA

Demonstrou-se a possibilidade de utilizar fusões de ARN-péptido em experiências de selecção e evolução, por enriquecimento de uma fusão ARN-péptido particular a partir de um agrupamento complexo de fusões de sequências aleatórias com base no péptido codificado. Em particular, preparou-se uma série de misturas em que uma pequena quantidade de sequência conhecida (neste caso, o molde myc longo, LP154) foi combinada com alguma quantidade do agrupamento de sequências aleatórias (isto é, LP 160) . Estas misturas foram traduzidas e os produtos de fusão ARN-péptido seleccionados por cromatografia de afinidade de oligonucleótido e dissulfureto, como é descrito no presente documento. As fusões de myc-molde foram selectivamente imunoprecipitadas com anticorpo monoclonal anti-myc (Figura 16A). Para medir o enriquecimento obtido nesta etapa selectiva, amplificaram-se por PCR alíquotas da mistura de fusões ADNc/ARNm-péptido, de antes e depois da 77 imunoprecipitação, na presença de um iniciador marcado radioactivamente. 0 ADN amplificado foi digerido com uma endonuclease de restrição que cortou a sequência do molde de myc, mas não o agrupamento (Figuras 16B e 16C) . A quantificação da razão entre ADN cortado e não cortado indicou que a sequência de myc estava enriquecida em 20-40 vezes em relação à biblioteca aleatória, por imunoprecipitação.

Estas experiências foram realizadas como se segue.

Reacções de tradução. As reacções de tradução foram realizadas de um modo geral como foi descrito acima.

Especificamente, as reacções foram realizadas a 30 °C durante uma hora, de acordo com as especificações do fabricante (Novagen) e congeladas durante a noite a -20 °C. Fizeram-se duas versões de seis amostras, uma que contém 35S metionina e uma que contém metionina fria, adicionada a uma concentração final de 52 μΜ. As reacções 1-6 continham as quantidades de moldes descritas no Quadro 2. Todos os números no Quadro 2 representam picomoles de molde por 25 μΐ de mistura de reacção. QUADRO 2

Razões de moldes utilizadas na selecção dopada

Reacçao 1 LP 154 LP _L 2 5 — 3 1 20 4 0,1 20 5 0,01 20 6 — 20

Preparação de agarose estreptavidina dT2.s. A agarose estreptavidina (Pierce) foi lavada três vezes com TE 8,2 (Tris-Cl 10 mM pH 8,2, EDTA 1 mM) e ressuspensa como uma pasta a 1:1 (v/v) em TE 8,2. Adicionou-se em seguida 3' biotinil T25 sintetizado utilizando Bioteg CPG (Glen Research) na concentração final desejada (geralmente 10 ou 78 20 μΜ) e a incubação foi levada a cabo com agitação durante 1 hora. A agarose estreptavidina dT25 foi então lavada três vezes com TE 8,2 e armazenada a 4 °C até ser utilizada.

Purificação de Moldes a partir de Reacções de Tradução. Para purificar moldes a partir de reacções de tradução, retiraram-se 25 μΐ de cada reacção e adicionaram-se a 7,5 ml de tampão de isolamento (NaCl 1 M, Tris-Cl 100 mM pH 8,2, EDTA 10 mM, DTT 0,1 mM) e 125 μΐ de agarose estreptavidina dT25 20 μΜ. Esta solução foi incubada a 4 °C durante uma hora, com rotação. Os tubos foram centrifugados e retirou-se o eluente. Adicionou-se 1 ml de tampão de isolamento, a pasta foi ressuspensa e as misturas foram transferidas para tubos de microcentrifuga de 1,5 ml. As amostras foram em seguida lavadas quatro vezes com aliquotas de 1 ml de tampão de isolamento arrefecido em gelo. As amostras de quente e frio de reacções idênticas foram então combinadas numa unidade de filtros de filtro MC Millipore e eluidas da agarose dT25 por lavagem com 2 volumes de 100 μΐ de H20, DTT 0,1 mM e 2 volumes de NaOH 15 mM, EDTA 1 mM. A este eluente adicionaram-se 40 μΐ de uma pasta a 50 % de tiopropil Sepharose (Pharmacia) lavada e a incubação foi levada a cabo a 4 °C com rotação durante 1 hora. As amostras foram em seguida lavadas com três volumes de 1 ml de TE 8,2 e retirou-se o eluente. Adicionou-se ao sólido 1 μΐ de DTT 1 M (volume total de aproximadamente 20-30 μΐ), e a amostra foi incubada durante várias horas, retirada e lavada quatro vezes com 20 μΐ de H20 (volume total de 90 μΐ). O eluente continha tiopiridona 2,5 mM, tal como avaliado por absorvância no UV. Precipitaram-se 50 μΐ desta amostra com etanol adicionando 6 μΐ de NaOAc 3 M pH 5,2, espermina 10 mM, 1 μΐ de glicogénio (10 mg/ml, Boehringer Mannheim) , e 170 μΐ de EtOH a 100 %, incubando durante 3 0 minutos a -70 °C e centrifugando durante 30 minutos a 13.000 rpm numa microcentrifuga. 79

Reacções de Transcriptase Reversa. Realizaram-se reacções de transcriptase reversa quer nas amostras precipitadas com etanol, quer nas amostras de eluente tiopiridona como se segue. Para as amostras precipitadas com etanol, 30 μΐ de molde ressuspenso, H20 até 48 μΐ, e 200 picomoles de iniciador 21.103 (SEQ ID NO: 22) foram hibridados a 70 °C, durante 5 minutos e arrefeceu-se em gelo. A esta amostra adicionaram-se 16 μΐ de tampão de primeira cadeia (Tris Cl 250 mM pH 8,3, KC1 375 mM, e MgCl2 15 mM; disponível da Gibco BRL, Grand Island, Nova Iorque), adicionaram-se 8 μΐ de DTT 100 mM e 4 μΐ de NTP 10 mM e equilibrou-se a 42 °C e adicionaram-se 4 μΐ de transcriptase reversa Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, Nova Iorque). Adicionou-se H20 (13 μΐ) ao eluente de Sepharose TP (35 μΐ) e as reacções foram realizadas como acima. Após a incubação durante 1 hora, combinaram-se as amostras de números iguais (volume total de 160 μΐ) . Reservaram-se 10 μΐ de amostra para a PCR de cada amostra não seleccionada e reservaram-se 150 μΐ de amostra para imunoprecipitação.

Imunoprecipitação. Para levar a cabo imunoprecipitações, adicionaram-se 170 μΐ da reacção de transcrição reversa a 1 ml de tampão de diluição (Tris Cl 10 mM, pH 8,2, NaCl 140 mM, Triton X-100 a 1 % v/v) e 20 μΐ de conjugado de Proteína G/A (Calbiochem, La Jolla, CA) , e fez-se uma pré-clarificação por incubação a 4 °C com rotação, durante 1 hora. O eluente foi retirado e adicionaram-se 20 μΐ de conjugado de G/A e 20 μΐ de anticorpo monoclonal (2 pg, 12 picomoles) e a amostra foi incubada com rotação durante duas horas a 4 °C. O conjugado foi precipitado por microcentrifugação a 2500 rpm durante 5 minutos, o eluente foi retirado e o conjugado foi lavado três vezes com alíquotas de 1 ml de tampão de diluição arrefecido em gelo. A amostra foi em seguida lavada com 1 ml Tris-Cl 10 mM, pH 8,2, NaCl 100 mM arrefecido em gelo. 80

Os fragmentos ligados foram retirados utilizando 3 volumes de HOAc a 4 % congelado e as amostras foram liofilizadas até à secura. PCR de Amostras Seleccionadas e Não Seleccionadas.

Realizaram-se reacções de PCR adicionando 20 μΐ de NH4OH concentrado a 10 μΐ do material não seleccionado e à totalidade do material seleccionado e incubou-se durante 5 minutos cada, a 55 °C, 70 °C e 90 °C para destruir qualquer ARN presente na amostra. As amostras foram então evaporadas até à secura utilizando um Speedvac. Adicionaram-se a cada amostra 200 μΐ de mistura de PCR (1 μΜ de iniciadores 21.103 e 42.108, dNTP 200 μΜ em tampão de PCR mais Mg2+ (Boehringer Mannheim), e 2 μΐ de polimerase Taq (Boehringer Mannheim)). Fizeram-se 16 ciclos de PCR na amostra não seleccionada número 2 e fizeram-se 19 ciclos em todas as outras amostras.

As amostras foram em seguida amplificadas na presença de iniciador 21.103 marcado com 32P em 5 ’, de acordo com o Quadro 3 e purificadas duas vezes individualmente, utilizando kits de purificação de PCR directa Wizard (Promega) para retirar todo o iniciador e fragmentos mais curtos. QUADRO 3

Amplificação de Amostras de PCR Seleccionadas e Não

Seleccionadas

Amostra Tipo Volume C 1 Não seleccionada 20 μΐ 5 2 Não seleccionada 5 i—1 d 4 3 Não seleccionada 20 μΐ 5 4 Não seleccionada 20 μΐ 5 5 Não seleccionada 20 ι—1 d- 5 6 Não seleccionada 20 μΐ 5 1 Seleccionada 20 μΐ 5 2 Seleccionada 5 ι—1 d- 4 81 (continuação)

Amostra Tipo Volume Ciclos 3 Seleccionada 20 μΐ 5 4 Seleccionada 20 μΐ 7 5 Seleccionada 20 μΐ 7 6 Seleccionada 20 μΐ 7 Jigestões de Restrição. Adicionou-se em quantidades iguais ADN marcado com 32P preparado a partir de cada uma das reacções de PCR acima (por cpm de amostra) a reacções de digestão de restrição de acordo com o Quadro 4. 0 volume total de cada reacção era de 25 μΐ. Adicionaram-se 0,5 μΐ de Alwnl (5 unidades, New England Biolabs) a cada reacção. As amostras foram incubadas a 37 °C durante 1 hora e a enzima foi inactivada pelo calor, por uma incubação de 20 minutos a 65 °C. As amostras foram em seguida misturadas com 10 μΐ de tampão de carga desnaturante (1 ml de formamida ultrapura (USB), 20 μΐ de EDTA 0,5 M e 20 μΐ de NaOH 1 M), aquecidas a 90 °C durante 1 minuto, arrefecidas e carregadas num gel de poliacrilamida desnaturante a 12 %, que contém ureia 8M. Após a electroforese, o gel foi fixado com HOAc a 10 % (v/v), MeOH a 10 % (v/v), H2O. QUADRO 4

Condições de Digestão de Restrição c/ Alwnl

Amostra Tipo Volume de ADN adicionada à reacção Volume 1 Não seleccionada 20 μΐ 25 1—1 2 Não seleccionada 4 μΐ 25 ι—1 2- 3 Não seleccionada 20 μΐ 25 μΐ 4 Não seleccionada 20 μΐ 25 ι—1 2- 5 Não seleccionada 4 μΐ 25 ι—1 2- 6 Não seleccionada 20 μΐ 25 ι—1 2- 1 Seleccionada 20 μΐ 25 μΐ 2 Seleccionada 8 μΐ 25 μΐ 3 Seleccionada 12 μΐ 25 ι—1 3- 82 (continuação)

Amostra Tipo

Volume de ADN adicionada Volume total a reacçao 4 Seleccionada 12 μΐ 25 μΐ 5 Seleccionada 20 μΐ 25 μΐ 6 Seleccionada 20 μΐ 25 μΐ

Quantificação da digestão. A quantidade de ADN de myc versus agrupamento presente numa amostra foi quantificada utilizando um phosphorimager (Molecular Dynamics). A quantidade de material presente em cada banda foi determinada como o volume integrado de rectângulos idênticos desenhados em torno das bandas do gel. Os cpm totais presentes em cada banda foram calculados como volume menos o ruído de fundo. Utilizaram-se três valores de ruído de fundo: (1) uma média de quadrados idênticos fora da área onde ocorreram as contagens no gel; (2) os cpm presentes na pista do agrupamento não seleccionado em que a banda de myc deverá aparecer (não aparece nenhuma banda nesta posição no gel); e (3) um valor normalizado que reproduzia o valor mais próximo dos incrementos de 10 vezes de molde, entre pistas não seleccionadas. As pistas 2, 3 e 4 das Figuras 16B e 16C mostram o enriquecimento da sequência alvo versus o agrupamento. O enriquecimento demonstrável na pista 3 (não seleccionado/seleccionado) originou os valores mais elevados (17, 43 e 27 vezes utilizando os métodos 1-3, respectivamente) devido à optimização da razão entre sinal e ruído para esta amostra. Estes resultados estão resumidos no Quadro 5. QUADRO 5

Enriquecimento de Agrupamento versus Molde de myc Método Pista 2 (20) Pista 3 (200) Pista 4 (2000) 1 7,0 16,6 5,7 2 10,4 43 39 83 (continuação) Método Pista 2 (20) Pista 3 (200) Pista 4 (2000) 3 8, 7 27 10,2

Num segundo conjunto de experiências, estes mesmos produtos de PCR foram purificados uma vez utilizando kits de purificação de PCR directa Wizard e as digestões foram quantificadas pelo método (2) acima. Nestas experiências obtiveram-se resultados similares; enriquecimentos de 10,7, 38 e 12 vezes, respectivamente, foram medidos para amostras equivalentes às das pistas 2, 3 e 4 acima.

UTILIZAÇÃO DE SISTEMAS DE SELECÇÃO DE PROTEÍNA

Os sistemas de selecção descritos no presente documento têm aplicações comerciais em qualquer área em que a tecnologia de proteínas é utilizada para resolver problemas terapêuticos, de diagnóstico ou industriais. Esta tecnologia de selecção é útil para melhorar ou alterar proteínas existentes, bem como para o isolamento de novas proteínas com funções desejadas. Estas proteínas podem ser sequências de ocorrência natural, podem ser formas alteradas de sequências de ocorrência natural, ou podem ser sequências parcialmente ou totalmente sintéticas.

Isolamento de Novos Reagentes de Ligação. Numa aplicação particular a tecnologia de fusão de ARN-proteína descrita no presente documento é útil para o isolamento de proteínas com propriedades de ligação específica (por exemplo, ligação do ligando). As proteínas que exibem interacções de ligação altamente específicas podem ser utilizadas como reagentes de reconhecimento que não anticorpos, permitindo que a tecnologia de fusão de ARN-proteína contorne a tecnologia tradicional de anticorpos monoclonais. Os reagentes do tipo anticorpo isolados por este método podem ser utilizados em qualquer área em que se utilizam anticorpos tradicionais, incluindo aplicações de diagnóstico e terapêuticas. 84

Melhora de Anticorpos Humanos. A tecnologia de fusão de ARN-proteína descrita no presente documento pode também ser utilizada para melhorar anticorpos humanos ou humanizados para o tratamento de qualquer de várias doenças. Neste pedido, desenvolvem-se bibliotecas de anticorpos e faz-se a sua pesquisa in vitro, eliminando a necessidade de técnicas como fusão celular ou apresentação em fagos. Numa aplicação importante, a invenção é útil para melhorar bibliotecas de anticorpo de cadeia simples (Ward et al. , Nature 341:544 (1989); e Goulot et al. , J. Mol. Biol. 213:617 (1990)). Para este pedido, a região variável pode ser construída, ou a partir de uma fonte humana (para minimizar possíveis reacções imunitárias adversas do receptor), ou pode conter uma cassete totalmente aleatória (para maximizar a complexidade da biblioteca). Para pesquisar moléculas de anticorpo melhoradas, testa-se um agrupamento de moléculas candidatas quanto à ligação a uma molécula alvo (por exemplo, um antigénio imobilizado como é mostrado na Figura 2). Níveis de restringência mais elevados são então aplicados à etapa de ligação à medida que a selecção progride de um ciclo para o próximo. Para aumentar a restringência, as condições tais como o número de etapas de lavagem, concentração de competidor em excesso, condições de tampão, duração do tempo de reacção de ligação e escolha da matriz de imobilização são alteradas.

Os anticorpos de cadeia simples podem ser utilizados, ou directamente para terapia, ou indirectamente para conceber anticorpos convencionais. Estes anticorpos têm várias aplicações potenciais, incluindo o isolamento de anticorpos anti-auto-imunes, supressão imunitária e o desenvolvimento de vacinas para doenças virais, tais como a SIDA.

Isolamento de Catalisadores Novos. A tecnologia de fusão de ARN-proteína descrita no presente documento pode 85 também ser utilizada para seleccionar novas proteínas catalíticas. A selecção e evolução in vitro têm sido utilizadas anteriormente para o isolamento de novos ARN e ADN catalíticos e, na presente invenção, são utilizadas para o isolamento de novas proteínas enzimas. Num exemplo particular desta abordagem, um catalisador pode ser isolado indirectamente seleccionando para ligação a um análogo químico do estado de transição do catalisador. Em outro exemplo particular, o isolamento directo pode ser realizado seleccionado para a formação de ligações covalentes com um substrato (por exemplo, utilizando um substrato ligado a um marcador de afinidade) ou por clivagem (por exemplo, seleccionado para a capacidade de quebrar uma ligação específica e libertar assim membros catalíticos de uma biblioteca a partir de um suporte sólido).

Esta abordagem para o isolamento de novos catalisadores tem pelo menos duas vantagens importantes em relação à tecnologia de anticorpos catalíticos (revisto em Schultz et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)). Primeiro, na tecnologia de anticorpos catalíticos, o agrupamento inicial limita-se geralmente ao enrolamento da imunoglobulina; pelo contrário, a biblioteca de fusões de ARN-proteína de partida pode ser completamente aleatória ou pode consistir, sem limitação, em variantes de estruturas enzimáticas conhecidas ou estruturas base de proteína. Além disso, o isolamento de anticorpos catalíticos baseia-se geralmente numa selecção inicial para a ligação a análogos de reacção do estado de transição, seguido de pesquisa laboriosa de anticorpos activos; mais uma vez, pelo contrário, a selecção directa para a catálise é possível utilizando uma abordagem de biblioteca de fusão de ARN-proteína, como anteriormente demonstrado utilizando bibliotecas de ARN. Numa abordagem alternativa para isolar proteínas enzimas, podem-se combinar as abordagens de análogo de estado de transição e de selecção directa. 86

As enzimas obtidas por este método são altamente valiosas. Por exemplo, existe actualmente uma necessidade premente de catalisadores industriais novos e eficazes que permitam o desenvolvimento de processos quimicos melhorados. Uma vantagem principal da tecnologia de fusão de ARN-proteina descrita no presente documento é que as selecções podem ser realizadas em condições arbitrárias e não se limitam, por exemplo, a condições in vivo. A invenção facilita assim o isolamento de novas enzimas ou variantes melhoradas de enzimas existentes que podem realizar transformações altamente especificas (e desse modo minimizar a formação de produtos secundários indesejados), funcionando ao mesmo tempo em meios ambiente pré-determinados, por exemplo, meios ambiente de temperatura, pressão ou concentração de solvente elevada.

Uma Armadilha de Interacção In Vitro. A tecnologia de fusão de ARN-proteina também é útil para rastrear bibliotecas de ADNc e clonar genes novos com base em interacções proteína-proteína. Por este método, constrói-se uma biblioteca de ADNc a partir de uma fonte desejada (por exemplo, pelo método de Ausubel et al.r supra, capítulo 5) . A cada um dos ADNc candidatos liga-se (por exemplo, utilizando as técnicas descritas acima para a produção de LP77, LP154 e LP160) um aceitador de péptidos (por exemplo, tal como uma cauda de puromicina). Geram-se então fusões de ARN-proteina como é descrito no presente documento e a capacidade destas fusões (ou versões melhoradas das fusões) de interagirem com moléculas particulares é em seguida testada como foi descrito acima. Se for desejado, podem evitar-se neste processo codões de terminação e regiões 3' UTR (i) adicionando ARNt supressor para permitir a leitura das regiões de terminação, (ii) removendo o factor de libertação da reacção de tradução por imunoprecipitação, (iii) uma combinação de (i) e (ii), ou (iv) removendo os codões de terminação e 3' UTR das sequências de ADN. 87

0 facto da etapa de interacção ocorrer in vitro permite o controlo cuidadoso da restringência da reacção, utilizando condições de competidor não especifico, temperatura e iónicas. A alteração de moléculas pequenas normais com análogos não hidrolisáveis (por exemplo, ATP versus ATPgS) proporciona selecções que discriminam entre diferentes confórmeros da mesma molécula. Esta abordagem é útil tanto para a clonagem como identificação funcional de muitas proteínas, uma vez que a sequência de ARN do parceiro de ligação seleccionado é ligada covalentemente e pode, portanto, ser facilmente isolada. Além disso, a técnica é útil para identificar funções e interacções dos -50-100.000 genes humanos cujas sequências estão actualmente a ser determinadas pelo projecto do Genoma Humano. UTILIZAÇÃO DE FUSÕES DE ARN-PROTEÍNA NUM FORMATO DE MICROCHIP

Os "chips de ADN" consistem em séries espacialmente definidas de oligonucleótidos imobilizados ou fragmentos de ADNc ou ADN genómico clonados e têm aplicações, tais como as rápidas sequenciação e determinação do perfil de transcritos. Hibridando uma mistura de fusões de ARN-proteína (por exemplo, geradas a partir de um agrupamento de ADN ou ARN celular) com um chip de ADN deste tipo, é possível gerar um "chip de apresentação de proteína", em que cada ponto correspondente a uma sequência imobilizada é capaz de hibridar com a sua sequência de ARN correspondente no agrupamento de fusões de ARN-proteína. Por esta abordagem, a proteína correspondente é imobilizada de um modo espacialmente definido devido à sua ligação com o seu próprio ARNm e os chips que contêm agrupamentos de sequências de ADN apresentam o agrupamento correspondente de proteínas. Alternativamente, os fragmentos de péptido destas proteínas podem ser apresentados se a biblioteca de fusão for gerada a partir de fragmentos de ADNc ou ADN genómico menores.

Estas apresentações ordenadas de proteínas e péptidos têm muitas utilizações. Por exemplo, representam ferramentas poderosas para a identificação de interacções proteína-proteína anteriormente desconhecidas. Num formato específico, uma sonda de proteína é marcada de forma detectável (por exemplo, com um corante fluorescente) e a proteína marcada é incubada com um chip de apresentação de proteína. Por esta abordagem, a identidade das proteínas que são capazes de se ligar à proteína sonda é determinada a partir da localização dos pontos no chip, que ficam marcados devido à ligação da sonda. Outra aplicação é a determinação rápida de proteínas que são quimicamente modificadas através da acção de enzimas modificadoras (por exemplo, proteínas quinases, acil transferases e metil transferases). Incubando o chip de apresentação de proteína com a enzima de interesse e um substrato marcado radioactivamente, seguido de lavagem e autorradiografia, a localização e, portanto, a identidade das proteínas que são substratos para a enzima modificadora podem ser facilmente determinadas. Além disso, a utilização desta abordagem com apresentações ordenadas de péptidos pequenos permite também a localização destes locais de modificação. A tecnologia de apresentação de proteínas pode ser levada a cabo utilizando séries de ácidos nucleicos (incluindo ARN, mas preferivelmente ADN) imobilizados num suporte sólido adequado. Os suportes sólidos exemplo podem ser feitos de materiais como o vidro (por exemplo, placas de vidro), silício ou vidro de silício (por exemplo, microchips), ou ouro (por exemplo, placas de ouro). Os métodos para unir ácidos nucleicos a regiões precisas nestas superfícies sólidas, por exemplo, métodos fotolitográficos, são bem conhecidos na especialidade e podem ser utilizados para produzir suportes sólidos (tais como chips de ADN) para utilização na invenção. Os métodos exemplares para este propósito incluem, sem limitação 89

Schena et al., Science 270:467-470 (1995); Kozal et al. , Nature Medicine 2:753-759 (1996); Cheng et al. , Nucleic Acids Research 24:380-385 (1996); Lipshutz et al. , BioTechniques 19:442-447 (1995); Pease et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5022-5026 (1994); Fodor et al . , Nature 364:555-556 (1993); Pirrung et al. , Patente US N° 5.143.854; e Fodor et al., documento WO 92/10092. 90

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada somente para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5143854 A, Pirrung [0185] • WO 9210092 A, Fodor [0185]

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Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES Reivindicações para o(s) seguinte(s) Estado(s) Contratante(s): AT, BE, CH, DK, ES, FR, GB, IT, LI, LU, MC, NL, SE, 1. Um microchip que compreende um arranjo (array) de ácidos nucleicos de cadeia simples imobilizados, estando hibridados os ditos ácidos nucleicos a fusões de ARN-proteína, cada uma das quais das ditas fusões de ARN-proteina compreende um ARN ligado covalentemente na extremidade 3' do ARN a uma proteína através de um aceitador de péptidos, e em que a dita proteína é codificada pelo dito ARN.

2. 0 microchip de acordo com a reivindicação 1, em que o dito ARN é ligado covalentemente ao dito aceitador de péptidos através de um local de pausa.

3. 0 microchip de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o dito aceitador de péptidos é seleccionado de puromicina, conjugado de ARNt-puromicina, fenilalanil-adenosina, tirosil adenosina, alanil adenosina, fenilalanil 3' desoxi 3' amino adenosina, alanil 3' desoxi 3' amino adenosina, e tirosil 3' desoxi 3' amino adenosina, e em que a dita proteína é codificada pelo dito ARN ligado covalentemente.

4. Uma biblioteca de moléculas cada uma compreendendo um ácido ribonucleico ligado covalentemente a uma proteína codificada pelo dito ácido ribonucleico.

5. A biblioteca de acordo com a reivindicação 4, em que o dito ácido ribonucleico é ligado covalentemente à 2 extremidade 3' à dita proteína através de um aceitador de péptidos.

6. A biblioteca de acordo com a reivindicação 5, em que o dito aceitador de péptidos é puromicina.

7. A biblioteca de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-6, em que o dito ácido ribonucleico é ligado covalentemente ao dito aceitador de péptidos através de um local de pausa.

8. A biblioteca de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-7, em que a dita biblioteca compreende pelo menos 109 moléculas diferentes.

9. Uma molécula que compreende uma porção de ácido ribonucleico (ARN) e uma porção de proteína codificada pela dita porção de ácido ribonucleico; em que a porção de ácido ribonucleico é ligada covalentemente à dita porção de proteína através de um aceitador de péptidos, e em que a porção de ácido ribonucleico é ligada covalentemente na sua extremidade 3' ao dito aceitador de péptidos através de um local de pausa.

10. A molécula de acordo com a reivindicação 9, em que o local de pausa é ácido desoxirribonucleico.

11. A molécula de acordo com a reivindicação 10, em que o ácido desoxirribonucleico compreende uma sequência oligo dA.

12. A molécula de acordo com a reivindicação 9, em que o local de pausa é uma combinação de ácido desoxirribonucleico e uma fracção não nucleotídica. 3

13. A molécula de acordo com a reivindicação 12, em que a fracção não nucleotidica compreende uma ou mais fracções H0(CH2CH20) 3po2.

14. A molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-13, em que o aceitador de péptidos é puromicina.

15. Uma molécula que compreende um ácido ribonucleico ligado covalentemente a um anticorpo, em que o dito anticorpo é codificado inteiramente pelo dito ácido ribonucleico.

16. A molécula de acordo com a reivindicação 15, em que o dito anticorpo é seleccionado do grupo que consiste num anticorpo humano, um anticorpo humanizado e um anticorpo de cadeia simples.

17. A molécula de acordo com a reivindicação 15 ou 16, que compreende ainda um aceitador de péptidos posicionado entre o dito ácido ribonucleico e o dito anticorpo.

18. A molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-17, em que a dita molécula é imobilizada sobre um suporte sólido.

19. A molécula de acordo com a reivindicação 18, em que o dito suporte sólido é um chip.

20. Um ácido ribonucleico que compreende uma sequência de iniciação de tradução e um codão de inicio ligado operativamente a uma sequência que codifica a proteína candidata, sendo ligado covalentemente o dito ácido ribonucleico a um aceitador de péptidos na extremidade 3' da dita sequência que codifica a proteína candidata, que 4 compreende ainda uma sequência de ADN ou sequência análoga de ADN ligada covalentemente à extremidade 3' do ácido ribonucleico.

21. 0 ácido ribonucleico de acordo com a reivindicação 20, em que o aceitador de péptidos é puromicina.