CN104774801A - 一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用。所述的核酸核糖体结合体系构建方法是在经0.1%DEPC处理过的500μl的离心小管中于0~5℃加入12μl核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含100mM KAC,4mM Mg(AC)₂,20mM Hepes, 20mM DTT的溶液，1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（promega），2.5ul 10mM ATP,1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA,0.5ul磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25μl，离心后置于23~26℃下14~16min，然后转置于0~5℃条件下得到核酸-核糖体结合体系。应用为所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。本发明构建的核酸核糖体结合体系可应用于病毒核酸-核糖体结合抑制的药物筛选研究。

Description

一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用

技术领域

本发明属于化学生物学技术领域，具体涉及一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用。    

背景技术

农业生产上病毒病危害严重，是仅次于真菌的第二大类病害，每年都给农业生产造成重大损失，其防治一直以来就是病害防治中的难点，尽管长期以来人们一直致力于抗植物病毒的研究，在目前市场上也可得到一些抗病毒的药剂，然而绝大多数抗植物病毒剂的抗病毒活性仅仅在30%至60%之间，理想的抗植物病毒药剂依然十分缺乏。安全高效的抗植物病毒剂研究开发一直以来就是农业生产上急需解决的重要问题。

近年，对天然产物研究用于病害抵抗和抗植物病毒药剂开发日益引起研究者们的关注，植物活性成分的研究是其中一个重要分枝。世界各地的不少植物中都含有抗植物病毒的活性成分，它们将为抗植物病毒药剂开发提供优良的先导,植物是抗植物病毒活性成分筛选及药理研究的一个重要资源库，植物提取物（植化成分）的抗病毒活性研究在世界范围正逐步变成一个重要而有前景的研究领域。我国植物资源丰富，尤其中草药是我国的一个传统优势，用现代技术开展植物资源的抗病毒研究，对于高效安全抗植物病毒药剂开发和发扬我国的植物资源优势都具有重要作用；然而，在植物成分抗植物病毒实际研究中研究者所面临的困难在于在植物中的成分通常是多样而复杂的，并且大多数活性成分在植物体中往往含量少（甚至是痕量状态），它们通常不能满足目前常规（传统）抗病毒药剂筛选的要求。传统筛选由于受材料等多种因素的限制，筛选效率受到影响，尤其是病毒与寄主关系密切，则针对药剂特定调控靶标，首先从药理角度出发去构建发展新的微量快速药物筛选体系及研究方法，进行安全高效特异性活性成分筛选，对抗植物病毒活性物的筛选及药理研究以及植物资源的现代化研究都具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种核酸核糖体结合体系构建方法；第二目的在于提供所述的核酸核糖体结合体系构建方法的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的核酸核糖体结合体系构建方法是在经0.1%DEPC处理过的500μl的离心小管中于0~5℃加入12μl核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含100 mM KAC, 4mM Mg(AC)₂, 20mM Hepes, 20mM DTT的溶液，1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（promega），2.5ul 10mM ATP, 1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5 ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA, 0.5ul磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25μl，离心后置于23~26℃下14~16min，然后转置于0~5℃条件下得到核酸-核糖体结合体系。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。

目前以病毒蛋白翻译或核酸复制为靶点进行抗病毒活性药物筛选研究在动物病毒研究中已经引起人们的注意，本发明从病毒侵染循环的特点出发，以重要经济作物烟草上发生普遍且危害相对严重的烟草普通花叶病毒TMV作为供试病毒，选取病毒核酸（RNA）和核糖体的结合作为筛选靶标，进行药物针对靶点的离体微量筛选体系构建，并依此进行中草药抗植物病毒活性筛选和活性成分研究。对于发掘丰富的中草药植物资源筛选天然抗植物病毒活性物，为人工抗植物病毒剂的仿生合成提供优良的先导，推动抗植物病毒药剂开发及抗植物病毒剂药理相关研究具有积极作用。

本发明构建的核酸核糖体结合体系可应用于病毒核酸-核糖体结合抑制的药物筛选研究，结合抑制率计算公式R%=(10ΔCt / k -1) ×100/ 10ΔCt/k ，ΔCt为筛选样品和对照（空白样品）实时荧光定量PCR检测Ct差值，k为cDNA系列稀释制作的cDNA相对浓度对数LgC与检测Ct间相对定量标准曲线（y=-kx+b）斜率绝对值。

附图说明

图1为完整结合体系（S₃）结合反应并离心分离后RNA分布的在线定位示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的核酸核糖体结合体系构建方法，是在经0.1%DEPC处理过的500μl的离心小管中于0~5℃加入12μl核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含100 mM KAC, 4mM Mg(AC)₂, 20mM Hepes, 20mM DTT的溶液，1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（购于promega），2.5ul 10mM ATP, 1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5 ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA, 0.5ul磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25μl，离心后置于23~26℃下14~16min，然后转置于0~5℃条件下得到核酸-核糖体结合体系。

所述的核糖体麦胚抽提溶液是经麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤制备得到，具体包括以下步骤：

A、麦胚的制备：取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径1mm筛，再过孔径0.45mm筛，收集0.45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗涤，洗涤后加入固液体积比8~12倍的无菌水，置于摇床上于温度3~5℃晃摇洗涤8~12min，洗涤2~4次，加入固液体积比1~3倍的裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理8~12min，处理2~4次，干燥，于3~5℃保存备用；

B、核糖体麦胚抽提物的制备：称取A步骤制备的麦胚0.05～0.15g，置于DEPC处理过的离心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5～1.5ml的核糖体抽提缓冲液（2×Buffer A ：40mM Hepes/KOH, 120mM K(AC)₂ ,5mM Mg(AC)₂, 2mM CaCl₂,4mM DTT）和8～12μl标准混合氨基酸(1mM/each，promega），混摇使粉末分散，置于频率30Hz的振荡器上震荡抽提20～40s，于0～5℃静置2～4min，于3～5℃、30000xg离心20～40min，上清液上Sephadex G-25柱，用1× Buffer A（核糖体抽提缓冲液2× Buffer A倍比稀释）洗脱，以1.5ml/管或0.5ml/管依次收集洗脱液，并将洗脱液于3～5℃、30000g离心8～12min纯化处理，测定各管洗脱液260nm和280nm紫外吸收值，作洗脱曲线，以吸收峰作为不同组分的依据，对相应峰的洗脱液通过琼脂糖电泳和氯仿/酚法去蛋白后核酸琼脂电泳，鉴定洗脱液，确定含核糖体的麦胚抽提物并收集，得到目标物，置液氮中保存备用。

A步骤中所述的悬浮液为环己烷-四氯化碳溶液。

所述的环己烷-四氯化碳溶液的体积配比为2：5。

A步骤中所述的裂解液为NP-40。

所述的裂解液的浓度为0.5％。

A步骤中所述的超声处理是在20-40Hz下处理2~4min。

B步骤中所述的核糖体抽提缓冲液为2×BufferA，配方具体为：40mM Hepes/KOH、120mM K(AC)₂ 、5mM Mg(AC)₂、 2mM CaCl₂、4mM DTT。

B步骤所述的标准混合氨基酸1mM/each（购于promega公司）。

本发明的应用为所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。

实施例1

1、材料和方法：

1.1 病毒核酸-核糖体结合体系（S₃）的构建：

在经0.1%DEPC处理过的500ul体积的离心小管中进行。把管置于冰上，25ul反应体系中分别加入12ul核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul溶液A(含100 mM KAC, 4mM Mg(AC)₂, 20mM Hepes, 20mM DTT),1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（promega），2.5ul 10mM ATP, 1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5 ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA, 0.5ul磷酸肌酸激酶。最后用DEPC处理水补足25ul。混合再低速点式离心后置于室温（23~26℃）下15分钟。然后回置于冰上。同时设置不同组成的体系，各体系组成见表1，进行相同操作。

表1  结合反应设置各处理的组成表

1.2 离心后EB染色核酸的在线分布定位：

采用移液枪吸取100ul离心分离蔗糖垫溶液（17% 蔗糖, pH7.5含有24mM Hepes/KOH,80mM KAC, 1mM Mg(AC)₂,1ug/ml 肝素钠，0.5ug/ml EB（Ethidium bromide，溴化乙锭），枪头垂直伸入反应液底部从EP管下底加入蔗糖垫。使结合反应体系处于垫子的顶部。然后于高速离心机上于30000g离心力的转速下离心2.5h。离心后把各处理的透明EP小管垂直置于水平照射的紫外灯下，在线观察各核酸（包括病毒核酸和核糖体）条带在管中的分布状况，对结合状况进行在线观察和直观的定性判断。

1.3 结合核酸分离后的定量检测

使用不加EB的分离垫，采用以上相同的离心分离方式，离心结束吸弃上部85ul溶液。下部液用移液枪对底部来回进行吸打撞击冲洗近十次，悬浮底部可能和核糖体结合离心沉淀的核酸，再在快速旋涡混合器上进一步旋涡震动混合１５s，对悬浮液取样进行反转录实时荧光定量PCR检测。用上章普通RT-PCR扩增回收的cDNA,系列稀释制作RNA相对定量标准曲线，检测结果代表结合体系核酸与核糖体的结合情况。每一处理三次重复实验，测定结果通过SAS8.2进行差异显著性比较。

2、 结果与分析：

2.1 离心分离后病毒核酸分布的在线定位观察

结合分离后，完整结合体系与对照在线病毒核酸分布在线观察结果见图1：

现象：由于离心垫中预先混入了微量EB溶液，当结合反应终止及离心分离结束后，把各微型的透明Doffer小管垂直放在合适的水平管架上并置于水平照射的紫外（254nm）光下，由于EB对结合及分离体系中核酸的结合染色效应，可看到体系中病毒RNA的分布情况。结果显示：核糖体信号较弱（核蛋白的包被作用）但用肉眼可看到在中部偏下有更多的分布。作为无核糖体的对照的ck₂ 和 ck₃ （为游离的病毒RNA）仍然保持在分离垫的上部，而完整的结合体系中（相同RNA加入）上部RNA信号明显消失，取而代之在底部溶液中出现明显的红色。

2.2 体系不同处理分离核酸的定量检测（见表2）

表2   不同处理体系离心后底部溶液中病毒RNA

实时荧光定量PCR检测相对量结果

 

实时荧光定量(Real-time quantitative) PCR对底部各处理溶液进行TMV-RNA定量检测，结果显示，以上核酸分布在线定位观察与平行处理的重复样品相对应，S₃处理红色信号与平行处理的重复样品定量结果相关，转移到下部的红色部分所对应的重复处理样品的下部溶液检测到相对量显著比其他处理高的TMV-RNA，表明体系中病毒核酸与核糖体结合，而在具有核糖体和核酸但结合条件并不完善的体系S₂ 及S₁反应离心后在线观察上部依然是明显的红色游离核酸带，而实时荧光定量PCR检测结果也显示，Ct值与S₃有较大差距，其检测的病毒核酸相对量与非结合的对照处于同一水平，不到S₃的１％，这表明构建的S₃体系能较好维护或促进病毒核酸与核糖体识别并在较短时间中结合，并被成功用高速离心的方法实现短距离与原结合体系中游离核酸的成功分离。

所构建的结合体系S₃能保证病毒核酸和核糖体的较好结合，其Ct值小于其他各处理，且差异极为显著，在结合组成不完整的体系中，所检出的TMV-RNA相应的Ct值明显高于所构建的完整结合体系，但在RNA 相对量上来说较低；结果证明下部沉淀在线悬浮溶液中含有TMV-RNA，却主要是来自于正常结合体系中与核糖体结合的核酸。所以，构建筛选出的结合体系S₃通过以上在线分布及实时荧光定量PCR检测技术验证能较为理想的结合研究体系。该结果也体现了整个结合反应及分离体系的成功性。

2.3 关于结合体系检测的误差分析

对以上提纯TMV-RNA进行三次重复，和感病叶总RNA 进行的结合，分别对检测各自Ct，应用标准曲线计算各重复Ct所对应的RNA 检测值，进行结合体系测定中的变异分析结果见表3：

表3   结合体系进行正常结合反应后操作的变异分析表

由变异统计结果可见结合体系中RNA检测变异为18.22%~35.22%

3、 药物筛选时操作思路及结合抑制率的计算

构建的结合体系用于药物结合抑制活性筛选研究的思路及结合抑制率的计算：以上针对病毒RNA和植物核糖体的结合进行研究，成功建立了离体结合研究体系和响应分离与定量检测方法。当把建立的完整核酸核糖体结合系统作为一个药剂筛选的阴性对照，结合前面对实时荧光定量PCR作为终端病毒核酸定量检测的相关研究，所建立的这个方法可应用于药剂病毒核酸核糖体结合抑制活性研究，并依此来进行抗植物病毒药剂对该靶点活性的微量快速筛选。

在筛选中，完整结合时（或药物阴性对照）实时荧光定量PCR所测得到的结合病毒核酸所对应的Ct值假设为Ct₀,  在结合体系中加入药剂后筛选样品所对应的结合病毒核酸所对应的Ct值为Cts, 则其中药剂对靶点产生结合抑制的效应即是核酸减少量的相对变化率，在此若正常结合的病毒核酸测定量为R₀,药剂结合抑制效应后结合核酸量为Rs，则药剂对靶点（核酸核糖体结合）的抑制活性(结合抑制率R%)大小的数学表达式应当为R%=(R₀-Rs) ×100/R₀。在操作中，除药剂之外，在处理和对照间加入核酸等情况完全一致的情况下，由于Ct值与检测核酸起始模板（浓度）对数成负相关，药剂对结合抑制的效应也直接导致Ct值发生变化，却具有结合抑制的药剂将导致Ct值变大，假设处理样品和结合对照间Ct值的变化大小(Cts—Ct₀)为ΔCt。 则通过与样品和对照平行测定中制作的定量标准曲线y=-kx+b 即Ct= -kLgC+b, Ct与相对浓度对数LogC间的线性方程，将可得到对照与筛选样品对应的两对坐标值分别为（X₀, Ct₀）和（Xs, Cts）,再通过反对数得到相应的病毒核酸R₀和Rs, 从而计算药剂的结合抑制活性R%=(R₀-Rs) ×100/R₀。实际上由于活性抑制率是个相对比值，数据的真实大小在最终结果计算中被相比而消去，若按以上步骤获取相关准确数据，不仅操作麻烦，而最终对所要获取的结果也没有太大的意义。考虑到这一点，所以在实际操作中我们更为关心的是如何来获得所得数据之间的相对量大小。而避免一些非必要的测定操作和结果计算。其中包括用PCR扩增并回收保存的cDNA制作标准曲线，（或用具有目的基因cDNA体内扩增回收的重组质粒来制作标准曲线）作为RNA相对定量标准曲线。在制作中通过梯度稀释可获得彼此之间准确的相对量及相对量对数LgC，结合测定结果可获得Ct值与相对量对数之间的相对定量标准曲线y= -kx+b, 即Ct= -kLgC+b, 操作更为方便，大大节省了在制作标准曲线中对系列RNA操作的成本；而通过标准曲线,结果计算中也是从最终结果为相对值的角度考虑，当设定对照和药剂处理对应的表达形式y=-kx+b分别为Ct₀= -kX₀+b和Cts= -kXs+b，ΔCt =Cts-Ct₀时，直接通过表达式数学变换来获取结合抑制率比值(R₀-Rs) ×100/R₀为[(10^ΔCt / k -1)/ 10^ΔCt/k ] ×100，即只要获取标准曲线的斜率绝对值k就可由测定得到的各Ct 值直接计算得到所筛药剂对目标靶点（核酸和核糖体结合）的抑制活性大小。虽然这个抑制率表达式也是直接由标准曲线得来的，但它却避免了直接利用标准曲线分别查对和计算单个结果的麻烦以及在结果计算中由于有效数据的取舍而带来的误差,其结果更为方便可靠。

   检测样品间的相对含量与它们检测Ct的差值通过以上标准曲线也可推导为C2/C1=1/10^ΔCt / k）,从而所测Ct间的差值（ΔCT）直接就反应了它们结合核酸的相对量之间的关系，相对于正常结合（或试剂空白）也可从结合抑制率定义得出结合抑制率计算公式：

R%=[(10^ΔCt / k -1)/ 10^ΔCt/k ]×100，这与以上关系是一致的。

通常在做组织中RNA相对含量（如表达差异）比较时，为消除起始模板制备来源的差异，通常选用在组织中表达量基本恒定的基因（如Actin基因）来做内标进行校准，由样品同时进行目的基因和Actin基因CT检测，求对应的CT差值（校准值），再由校准值之间比较大小，进行目的基因（所要检测的mRNA）不同处理或组织间的相对量（表达差异）比较。

根据在下一步药剂筛选中的具体情况，由于在同以批药物筛选中可以做到各体系(即各药物筛选的结合体系及样品空白体系)加入同样量的目的RNA, 在除药剂种类或浓度不同而其他操作相同的情况下，在相同测定操作条件下,直接采用以药剂空白样（正常结合）做对照，本身也就充当相对定量的Ct参照标准。

Claims (6)

1.一种核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于所述的核酸核糖体结合体系构建方法是在经0.1%DEPC处理过的500μl的离心小管中于0~5℃加入12μl核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含100 mM KAC, 4mM Mg(AC)₂, 20mM Hepes, 20mM DTT的溶液，1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（promega），2.5ul 10mM ATP, 1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5 ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA, 0.5ul磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25μl，离心后置于23~26℃下14~16min，然后转置于0~5℃条件下得到核酸-核糖体结合体系。

2.根据权利要求1所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于所述的核糖体麦胚抽提溶液是经麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤制备得到，具体包括以下步骤：

A、麦胚的制备：取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径1mm筛，再过孔径0.45mm筛，收集0.45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗涤，洗涤后加入固液体积比8~12倍的无菌水，置于摇床上于温度3~5℃晃摇洗涤8~12min，洗涤2~4次，加入固液体积比1~3倍的裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理8~12min，处理2~4次，干燥，于3~5℃保存备用；

B、核糖体麦胚抽提物的制备：称取A步骤制备的麦胚0.05～0.15g，置于DEPC处理过的离心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5～1.5ml的核糖体抽提缓冲液和8～12μl标准混合氨基酸，混摇使粉末分散，置于频率30Hz的振荡器上震荡抽提20～40s，于0～5℃静置2～4min，于3～5℃、转速30000r/min离心20～40min，上清液上Sephadex G-25柱，用1× Buffer A洗脱，以1.5ml/管或0.5ml/管依次收集洗脱液，并将洗脱液于3～5℃、转速30000r/min离心8～12min纯化处理，测定各管洗脱液260nm和280nm紫外吸收值，作洗脱曲线，以吸收峰作为不同组分的依据，对相应峰的洗脱液通过琼脂糖电泳和氯仿/酚法去蛋白后核酸琼脂电泳，鉴定洗脱液，确定含核糖体的麦胚抽提物并收集，得到目标物，置液氮中保存备用。

3.根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于A步骤中所述的悬浮液为环己烷-四氯化碳溶液，其体积配比为2：5。

4.根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，，其特征在于A步骤中所述的裂解液为NP-40。

5.根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于B步骤中所述的核糖体抽提缓冲液为2×BufferA，配方具体为：40mM Hepes/KOH、120mM K(AC)₂ 、5mM Mg(AC)₂、2mM CaCl₂、4mM DTT。

6.一种权利要求1~5任一所述的核酸核糖体结合体系构建方法的应用，其特征在于所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。