ES2270505T3 - Evolucion de celulas completas procariotidas por recombinacion de secuencias recursivas. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para desarrollar una célula bacterial o archaebacterial para adquirir una propiedad deseada, que comprende: (1) formar protoplastos de una población de células bacteriales o archaebacteriales diferentes; (2) fusionar los protoplastos para forma protoplastos híbridos, en los cuales los genomas de los protoplastos se recombinan para formar genomas híbridos; (3) incubar los protoplastos híbridos bajo condiciones que potencien la recombinación de células; (4) seleccionar o analizar con el fin de aislar células regeneradas que hayan evolucionado hacia la adquisición de la propiedad deseada; (5) pasos recurrentes (1)-(4) con las células regeneradas del paso (4) usadas para formar el protoplasto en el paso (1) hasta que las células regeneradas hayan adquirido la propiedad deseada.

Description

Evolución de células completas procarióticas por recombinación de secuencias recursivas.

Campo técnico

La invención aplica el campo de la técnica de genética molecular para desarrollar los genomas de células bacteriales o células arqueo bacteriales para adquirir nuevas y mejores propiedades.

Las células tienen un número de usos bien establecidos en la biología molecular. Por ejemplo, las células se emplean con frecuencia como huéspedes para manipular ADN en procesos tales como transformación y recombinación. Las células también se emplean como expresiones de proteínas recombinantes codificadazas por ADN transformadas en células. A pesar de que todos estos procesos son hoy en día rutinarios, en general, los genomas de las células usadas en estos procesos han evolucionado poco de los genomas de células naturales, y en particular en lo referente a la adquisición de propiedades nuevas y mejores para su uso en los procesos anteriormente mencionados.

El enfoque tradicional hacia la evolución molecular artificial o forzada se centra en la optimización de un gen individual que tiene un fenotipo discreto y seleccionable. La estrategia es clonar un gen, identificar una función discreta para el gen y un ensayo a través del cual puede seleccionarse, mutar posiciones seleccionadas en el gen (p.ej., por error-decúbito prono PCR o muta génesis de casete) y seleccionar variantes del gen para mejorar la función conocida del gen. Una variante que haya mejorado la función puede ser entonces expresada en el tipo de célula deseado. Esta visión o enfoque tiene limitaciones. En primer lugar, sólo es aplicable a genes que han sido aislados y funcionalmente caracterizados. En segundo lugar, este enfoque es tan sólo aplicable a genes que tienen una función discreta. En otras palabras, genes múltiples que cooperativamente confieren un fenotipo sencillo no pueden optimizarse de este modo normalmente. Probablemente, la mayoría de los genes tienen funciones cooperativas. Finalmente, este enfoque puede tan sólo explorar un número muy limitado del número total de permutaciones incluso para un gen sencillo. Por ejemplo, variar incluyo diez posiciones en una proteína con todos los aminoácidos posibles podría generar 20^{10} variantes, que es más de lo que los métodos existentes tales como trasfección y revisión pueden dar cabida.

En vista de estas limitaciones, el enfoque tradicional es inadecuado para mejorar genomas celulares con propiedades útiles. Por ejemplo, para mejorar la capacidad de una célula para expresar una proteína recombinante podría requerir modificación en algunos o en todos los genes, conocidos y no conocidos, teniendo papeles en trascripción, traslación, modificación post-traslacional, secreción o degradación proteolítica, entre otros. Intentar de manera individual optimizar incluso todos los genes conocidos que tienen tales funciones sería una tarea virtualmente imposible, dejando de lado la optimización de los genes conocidos hasta ahora que pueden contribuir a la expresión de modos aún no comprensibles.

La presente invención proporciona, entre otros, métodos novedosos para desarrollar el genoma de células completas que superen las dificultades y limitaciones de métodos anteriores.

Hopwood ("The Many Faces of Recombination" en Gentetics of Industrial Microorganisms, pp. 1-9, American Society for Microbiology, Washington, 1979) sugiere el uso de fusión protoplasto en el programa de mejora de resistencia bacterial.

Definiciones

El término cognado ser refiere a la secuencia de genes que está evolucionadamente y funcionalmente relacionada entre especies. Por ejemplo, en el genoma humano, el gen human CD4 es el gen cognado al gen CD4 del ratón, ya que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son altamente homólogos y ambos genes codifican una proteína que funciona al señalar la activación de célula T por medio de reconocimiento antigen restringido clase II MHC.

La Revisión es, en general, un proceso de dos pasos en el cual el primero determina qué células expresan un marcador de revisión y después físicamente separa las células que tienen la propiedad deseada. La selección es una forma de revisión en la cual la identificación y separación física se logran simultáneamente por medio de la expresión de un marcador de selección, que, en algunas circunstancias genéticas, permite que las células que expresan el marcador sobrevivan mientras otras células mueren (o viceversa). Los marcadores de revisión incluyen luciferasa, \beta-galactosidasa, y proteína verde fluorescente. Los marcadores de selección incluyen genes de resistencia a drogas y toxinas.

Un segmento exógeno de ADN es un extranjero (o heterólogo) a la célula u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped donde el elemento no se encuentra normalmente. Los segmentos exógenos de ADN pueden expresarse para producir polipéptidos exógenos.

El término gen se usa de modo amplio para referirse a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen secuencias codificadoras y/o las secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Los genes también incluyen segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas.

La identidad de secuencia de porcentaje se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se da la idéntica base de ácido nucleico en ambas secuencias para producir el número de posiciones equivalentes, dividiendo el número de posiciones equivalentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo por implementaciones computerizadas de algoritmos GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI.

El término "que ocurre naturalmente" se emplea para describir un objeto que puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido intencionadamente modificada por el hombre en un laboratorio es que ocurre naturalmente. Generalmente, el término "que ocurre naturalmente" se refiere a un objeto tan presente en un individuo no patológico (con ninguna enfermedad) como si fuera típico de la especie.

La recombinación asexual es una recombinación que se da sin la fusión de gametos para formar un cigoto.

Resumen de la invención

La invención proporciona métodos para desarrollar bacterias o arco bacterias para adquirir la propiedad deseada, como se establece en las reivindicaciones.

En algunos métodos, la función deseada es la secreción de una proteína, y el conjunto de células además consta de un constructo que codifica la proteína. De manera opcional, la proteína es tóxica al conjunto de célula a menos que sea segregada, y las células modificadas que han evolucionado para adquirir la función deseada son analizadas propagando las células y recubriendo las células supervivientes.

En algunos métodos, la función deseada en la recombinación mejorada. El análisis se logra empleando células que además comprenden un gen que codifica un marcador cuya expresión se previene por una mutación retirable por recombinación. Las células son analizadas por su expresión del marcador que resulta de retirar la mutación por recombinación.

La invención proporciona métodos para desarrollar una célula para adquirir una función deseada. Estos métodos implican facilitar una población de diferentes células bacteriales y arqueo bacteriales. Las células se cultivan bajo condiciones por medio de las cuales el ADN se intercambie entre células, formando células con genomas híbridos. Posteriormente, las células son analizadas y seleccionadas para células que han evolucionado hacia la adquisición de una propiedad deseada. El intercambio de ADN y los pasos de análisis/selección se repiten tantas veces como sea necesario, con las células analizadas/seleccionadas de un ciclo formando la población de células diferentes en el siguiente ciclo, hasta que una célula haya adquirido la propiedad deseada.

De manera opcional, el método también comprende la transformación de protoplastos con una biblioteca de fragmentos de ADN en al menos un ciclo.

Los métodos reivindicados para desarrollar una célula para que adquiera una propiedad deseada son efectivos por el intercambio de ADN entre células mediado por protoplasto. Tales métodos implican la formación de protoplastos a partir de una población de células diferentes. Los protoplastos son posteriormente fusionados para formar protoplastos híbridos, en los cuales los genomas de los protoplastos se recombinan para formar genomas híbridos. Los protoplastos híbridos se incuban bajo condiciones que promueven la regeneración de células. El siguiente paso es seleccionar o analizar células regeneradas aisladas que hayan evolucionado en la adquisición de la propiedad deseada. El intercambio de ADN y los pasos de análisis/selección se repiten tantas veces como sea necesario, con las células regeneradas en un ciclo que se usan para formar protoplastos en el siguiente ciclo hasta que las células regeneradas hayan adquirido la propiedad deseada. Algunos métodos además comprenden un paso de selección y análisis de protoplastos fusionadas libres de protoplastos no fusionadas de células parentales. Algunos métodos además comprenden un paso de selección o análisis de protoplastos fusionados con genomas híbridos libres de células con genomas parentales.

En algunos métodos, la propiedad deseada es la expresión y/o secreción de una proteína o metabolito secundario, como taxol.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras que no se relacionan con la invención reivindicada son meramente ilustrativas.

Fig. 1: Esquema para el cambio in vitro de genes.

Fig. 2: (A, B, C y D) secuencias de ADN de una proteína recA de tipo salvaje (designada new Minshall) y cinco variantes hiperrecombinogénicas de la misma.

Fig. 3: Secuencias de aminoácido de una proteína recA de tipo salvaje y cinco variantes hiperrecombinogénicas de la misma.

Descripción detallada 1. General La Visión Básica

La invención proporciona métodos para desarrollar de modo artificial células bacteriales y arqueobacteriales para adquirir una nueva y mejorada propiedad por medio de recombinación de secuencia recursiva. En resumen, la recombinación de secuencia recursiva conlleva ciclos sucesivos de recombinación y análisis/selección para generar diversidad molecular. Es decir, crear una familia de moléculas de ácido nucleico que muestren secuencia sustancial y/o identidad estructural entre sí pero que difieran en la presencia de mutaciones. Cada ciclo de recombinación es seguido al menos por un ciclo de análisis o selección para moléculas que tiene una característica deseada. La(s) molécula(s) selecciona-
da(s) es una vuelta forman los materiales iniciales para generar diversidad en la siguiente vuelta.

Las células que se pretenden desarrollar son bacteriales o arqueobacteriales y pueden constituir una línea celular homogénea o un cultivo mixto. Células adecuadas para la evolución incluyen las líneas celulares bacteriales comúnmente usadas en ingeniería genética y expresión de proteínas. Muchos tipos de células bacteriales, tanto gramo-positiva como gramo-negativas, son de interés, como Bacilus subtilis, B. licenhniformis, B. cereus, Escherichia coli, Pseudomnoas, Salmonella, actinomycetes y Erwinia. Las secuencias completas de genoma de E. coli y Bacilus subtilis se describen por Blattner et al., Science 277, 1454-1462 (1997); Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997).

La evolución comienza al generar una población de células variadas. Normalmente, las células en la población son del mismo tipo pero representan variantes de una célula progenitora. En algunos casos, la variación es natural como cuando se obtienen diferentes células de diferentes individuos dentro de la misma especie, o de diferentes especies. En otros casos, la variación es inducida por mutagénesis de una célula progenitora. La mutagénesis se hace efectiva al someter a la célula a agentes mutagénicos, o si la célula es una célula mutadora (p. ej. Tiene mutaciones en genes implicados en réplica de ADN, recombinación y/o reparación lo que favorece la introducción de mutaciones) simplemente propagando las células mutadoras. Las células mutadoras pueden generarse a partir de sucesivas selecciones para simples cambios fenotípicos (p. ej., adquisición de resistencia-rifampicina, después resistencia a ácido nalidíxicoy lac- a lac+ (ver Mao et al., J. Bacterial. 179, 417-422 (1997)).

En otros casos, la variación es el resultado de la transferencia a células (p. ej., por conjugación, transformación, transducción o competencia natural) de una biblioteca de fragmentos de ADN. Al menos uno, y normalmente muchos fragmentos de la biblioteca, muestran alguno, pero no completa, la secuencia o identidad estructural con un cognado o gen alélico dentro de las células que sea suficiente para permitir la recombinación homóloga. La biblioteca o fragmentos pueden derivar de una o más fuentes. Una fuente de fragmentos es una biblioteca genómica de una especie, tipo de célula, organismo o individuo diferente de las células que están siendo trasfectadas. En esta situación, muchos de los fragmentos de la biblioteca tiene un cognado o un gen alélico en las células que están siendo transformadas pero difieren de ese gen debido a la presencia de variaciones de especies que ocurren naturalmente, polimorfismos, y mutaciones. De manera alternativa, la biblioteca puede derivarse de ADN del mismo tipo de célula cuando se transforma después de que el ADN ha estado sujeto a mutación inducida, por métodos convencionales, como radiación, error-decúbito prono PCR, crecimiento en un organismo mutador o muta génesis de casete. En cualquiera de estas situaciones, la biblioteca genómica puede ser una biblioteca genómica completa o biblioteca subgenómica que deriva, por ejemplo, de un cromosoma seleccionado, o parte de un cromosoma o un elemento episomal dentro de una célula. Del mismo modo, o en lugar de estas fuentes de fragmentos de ADN, la biblioteca puede contener fragmentos que representan variantes naturales o seleccionadas de genes seleccionados de conocida función (p. ej., bibliotecas enfocadas).

El número de fragmentos en una biblioteca puede variar de un fragmento sencillo a aproximadamente 10^{10}, con bibliotecas que tiene de 10^{3} a 10^{8} fragmentos en común. Los fragmentos deben ser suficientemente largos como para que puedan sufrir recombinación homóloga y suficientemente cortos como para que puedan ser introducidos en una célula, y si es necesario, ser manipulados antes de la introducción. Los tamaños de los fragmentos pueden variar en un rango de 10b a 1000 kba, con tamaños de 500-10,000 bases en común. Los fragmentos pueden ser de doble o de sencillo trenzado.

Los fragmentos pueden introducirse en células como genomas completos o como componentes de virus, plásmidos, YACS, HACs o BACs o pueden introducirse como están, en cuyo caso todos o la mayoría de los fragmentos carecen de origen de réplica. El uso de fragmentos virales con genomas de trenzado sencillo ofrece la ventaja de poder enviar fragmentos en forma de trenzado sencillo, lo que promueve la recombinación. Los fragmentos también pueden estar unidos a un marcador selectivo antes de la introducción. La inclusión de fragmentos en un vector que tiene un origen de réplica permite un periodo más largo de tiempo después de la introducción en la célula en el cual los fragmentos pueden sufrir recombinación con un gen cognado antes de ser degradado o seleccionado y perderse de la célula, aumentando de este modo la proporción de células con genomas recombinantes. De modo opcional, el vector es un vector suicida capaz de una existencia más larga que la de un fragmento aislado de ADN pero incapaz de retenerse permanentemente en la línea celular. Tal vector puede expresar de modo pasajero un marcador durante un tiempo suficiente para analizar o seleccionar una célula que soporte el vector, pero después es degradado o resulta incapaz de expresar el marcador. El uso de tales vectores puede ser ventajoso al llevar a cabo vueltas seguidas de recombinación que se describirán a continuación. Por ejemplo, algunos vectores suicidas expresan una toxina de larga vida que es neutralizada por una molécula de corta vida expresada a partir del mismo vector. La expresión de la toxina sola no permitirá que el vector se establezca. Jense & Verdes, Mol. Microbiol. 17, 205-210 (1995); Bernard et al., Gene 162, 159-160. De modo alternativo, un vector puede declararse suicida por la incorporación de un origen defectuoso de réplica (p. ej., sensibilidad a la temperatura) o por omisión de un origen de réplica. Los vectores también pueden declararse suicidas por inclusión de marcadores de selección negativos, como sacB en muchas bacterias. Estos genes se vuelven tóxicos sólo en la presencia de compuestos específicos. Tales vectores pueden seleccionarse para tener una amplia gama de estabilidades.

Después de la introducción en las células, los fragmentos pueden recombinarse con ADN presente ene el genoma o episomas de las células por recombinación homóloga, no homóloga o específica del lugar. Para los fines presentes, la recombinación homóloga hace la contribución más significante para la evolución de las células porque esta forma de recombinación amplifica la diversidad existente entre el ADN de loas células que están siendo trasfectadas y los fragmentos de ADN. Por ejemplo, si el fragmento de ADN que está siendo trasfectado difiere de un cognado o gen alégico en dos posiciones, hay cuatros productos de recombinación posibles, y cada uno de estos productos de recombinación puede formarse en diferentes células en la población transformada. Por lo tanto, la recombinación homóloga de los fragmentos dobla la diversidad inicial en este gen. Cuando muchos fragmentos recombinan con los correspondientes cognados o genes alélicos, la diversidad de productos de recombinación con respecto a los productos iniciales aumenta exponencialmente con el número de fragmentos. La recombinación resulta en células modificadas que tienen genomas y/o epitomas modificados.

Las células variantes, ya sean el resultado de variación natural, mutagénesis o recombinación, son analizadas y seleccionadas para identifica un subconjunto de células que han evolucionado hacia la adquisición de una nueva y mejorada propiedad. La naturaleza del análisis, por supuesto, depende de la propiedad y a continuación comentaremos varios ejemplo. De modo opcional, el análisis se repite antes de llevar a cabo sucesivos ciclos de recombinación. Se puede aumentar el rigor en los ciclos repetidos de análisis.

La subpoblación de células que sobreviven al análisis es sometida a otra vuelta de recombinación. En algunos casos, la vuelta adicional de recombinación se hace efectiva mediante la propagación de células bajo condiciones que permiten el intercambio de ADN entre células. Por ejemplo, protoplastos pueden formarse a partir de células, a las que se les permite fusionarse, y células con genomas recombinantes propagadas a partir de protoplastos fusionados. De modo alternativo, el intercambio de ADN puede estar promovido por la propagación de células den un campo eléctrico. Para células que tienen un aparato de transferencia conjugado, el intercambio de ADN puede estar promovido simplemente por la propagación de células.

En otros métodos, la vuelta adicional de recombinación es llevada a cabo por una técnica de división y acumulación en pozos. Esta consiste en que las células supervivientes son divididas en dos pozos. Se aísla ADN de un pozo, y si se necesita se amplifica, y posteriormente se transforma en el otro pozo. Por lo tanto, fragmentos de ADN del primer pozo constituyen una biblioteca adicional de fragmentos y recombinan con fragmentos de cognado en el segundo pozo dando como resultado una mayor diversidad.

En otros métodos, algunas o todas las células supervivientes del análisis son trasfectadas con una biblioteca nueva de fragmentos de ADN, que pueden ser la misma o diferente de la biblioteca empleada en la primera vuelta de recombinación. En esta situación, los genes en la nueva biblioteca sufren recombinación con genes de cognado en las células supervivientes. Si los genes son introducidos como componentes de un vector, debe tenerse en cuenta la compatibilidad de este vector con cualquier vector usado en una vuelta previa de trasfección. Si el vector usado en una vuelta previa fue un vector suicida, no hay problema con la compatibilidad. Sin embargo, si el vector usado en una vuelta previa no fue un vector suicida, un vector con un origen de compatibilidad diferente debería usarse en la siguiente vuelta. En todos estos formatos, recombinación adicional genera diversidad adicional en el componente de ADN de las células que resultan en células modificadas.

El resto de células modificas están sometidas a otra vuelta de análisis/selección de acuerdo con los mismos principios que la primera vuelta. El análisis/selección identifica una subpoblación de otras células modificadas que además han evolucionado hacia la adquisición de la propiedad. Esta subpoblación de células puede estar sometida a vueltas adicionales de recombinación y análisis de acuerdo con los mismos principios, opcionalmente con el vigor del análisis en crecimiento en cada vuelta. Finalmente, se identifica que las células han adquirido la propiedad deseada.

Variaciones Fragmentos Cubiertos con Proteína recA

La frecuencia de recombinación homóloga entre los fragmentos de biblioteca y genes endógenos cognados puede aumentar cubriendo los fragmentos con una proteína recombinogénica antes de la introducción a las células. Ver Pati et al., Molecular Biology of Cancer 1, 1, (1996); Sena & Zarling, Nature Genetics 3, 365 (1996); Revet et al., J. Mol. Biol. 232, 779-791 (1993); Kowalczkowski & Zarling in Gene Targeting (CRC 1995), Ch. 7. La proteína recombinogénica potencia el intercambio de parejas y/o filamentos. La proteína mejor caracterizada recA es de E. coli y está disponible en Pharmacia (Piscataway, NJ). Además de la proteína de tipo salvaje, un número de proteínas mutantes similares a recA han sido identificadas (p. ej., recA803). Además, muchos organismos tienen recombinasa similares a recA con actividades de transferencias de filamentos (p. ej., Ogawa et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 18, 567-576 (1993); Johnson & Symington, Mol. Cell. Biol. 15, 4843-4850 (1995); Fugisawa et al., Nucl. Acids Res. 13, 7473 (1985); Hsieh et al., Cell 44, 885 (1986); Hsieh et al., J. Biol. Chem. 264, 5089 (1989); Fishel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683 (1988); Cassuto et al., Mol. Gen. Genet. 208, 10 (1987); Ganea et al., Mol. Cell Biol. 7, 3124 (1987); Moore et al., J. Biol. Chem. 19, 11108 (1990); Keene et al., Nucl. Acids Res. 12, 3057 (1984); Kimiec, Cold Spring Harbor Symp. 48, 675 (1984); Kimeic, Cell 44, 545 (1986); Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560 (1987); Sungino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683 (1985); Halbrook et al., J. Biol. Chem. 264, 21403 (1989); Eisen et al., Proc. Natls. Acad. Sci. USA 85, 7481 (1988); McCarthy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5854 (1988); Lowenhaupt et al., J. Biol. Chem. 264, 20568 (1989). Ejemplos de tales proteínas recombinasas incluyen recA, recA803, uvsX, (Roca, A. I., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 25, 415 (1990)), sep1 (Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 84, 5560 (1987); Tishkoff et al., Nature 354, 506 (1991)), DST2, KEM1, XRN1 (Dykstra et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2583 (1991)), STPa/DST1 (Clark et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2583 (1991)), HPP-1 (Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88, 9067 (1991)), otras recombinasas eucarióticas (Bishop et al., Cell 69, 439 (1992), Shinohara et al., Cell 69, 457.

La proteína recA forma un filamento de nucleoproteína cuando cubre un ADN de trenzado sencillo. En este filamento de nucleoproteína, un monómero de proteína recA está enlazado a aproximadamente 3 nucleótidos. Esta propiedad de recA para cubrir ADN de trenzado sencillo es esencialmente una secuencia independiente, a pesar de que secuencias particulares favorecen la carga inicial de recA en un polinucleótido (p. ej., secuencias de nucleación). El filamento de nucleoproteína puede formarse básicamente para mezclarse y puede formar complejos con ambos ADNs, de sencillo y doble trenzado en células procarióticas y eucarióticas.

Antes de contactar con recA u otra recombinasa, los fragmentos son a menudo desnaturalizados, por ej., por tratamiento de calor. La proteína recA es después añadida en una concentración de aproximadamente 1-10 \muM. Tras la incubación, el ADN de trenzado sencillo recubierto con recA es introducido en células recipientes por medio de métodos convencionales, tales como transformación química o electroporación. Los fragmentos sufren recombinación homóloga con genes endógenos cognados. Debido a la frecuencia aumentada de recombinación causada por el recubierto de recombinasa, los fragmentos no necesitan introducirse como componentes de vectores.

Los fragmentos son cubiertos en ocasiones con otras proteínas de enlace de ácido nucleico que potencian la recombinación, protegen los ácidos nucleicos de degradación, o dirigen los ácido nucleicos hacia el núcleo. Ejemplos de tales proteínas incluyen Agrobacterium virE2 (Durrenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9154-9158
(1989)).

Selección Positiva para Intercambio Aléico

La invención puede emplearse en conjunción con métodos de enriquecimiento de células que portan genes modificados relativos a las células iniciales. Esto se puede lograr introduciendo una biblioteca de fragmento de ADN en un vector suicida (es decir, que no tiene un origen de réplica funcional en el tipo de célula recipiente) que contiene marcadores de selección tanto negativos como positivos. De modo opcional, bibliotecas de fragmentos múltiples de diferentes fuentes (p. ej., B. subtilis, B. licheniformis y B. cereus) pueden clonarse en diferentes vectores que portan marcadores de selección diferentes. Marcadores de selección positiva adecuados incluyen neo^{R}, kanamycin^{R}, hyg, hisD, gpt, ble, tet^{R}, hprt, ura3 y sacB. Marcadores de selección negativa adecuados incluyen hsv-tk, hprt, gpt, y citosina deaminasa. Otra estrategia para aplicar selección negativa es incluir un gen rpsL de tipo salvaje (codificando proteína S12 ribosomal) en un vector de uso en células que tengan un gen rpsL mutante confiriendo resistencia estreptomicina. La forma mutante de rpsL es recesiva en células que tienen rpsL de tipo salvaje. Por lo tanto, la selección de resistencia SM selecciona contra células que tienen una copia de tipo salvaje de rpsL. Ver Skorupski & Taylor, Gen 169, 47-52 (1996). De modo alternativo, los vectores que portan sólo un marcador de selección positiva pueden usarse con una vuelta de selección de células que expresen el marcador, y una vuelta seguida para análisis de células que han perdido el marcador (es decir, análisis para sensibilidad de drogas). El análisis de células que han perdido el marcador de selección positiva es equivalente al análisis contra la expresión de un marcador de selección negativa. Por ejemplo, Bacillus puede transformarse con un vector que soporte un gen CAT y una secuencia que tendrá que integrarse. Ver Harwood & Cutting, Molecular Biological Methods for Bacillus, at pp. 31-33. La selección de resistencia a cloranfenicol aísla células que han tomado al vector. Después de un periodo adecuado para permitir la recombinación, la selección para sensibilidad CAT aísla células que han perdido el gen CAT. Aproximadamente el 50% de estas células sufrirán recombinación con la secuencia que hay que integrar.

Los vectores suicidas que portan un marcador de selección positiva y opcionalmente, un marcador de selección negativa y un fragmento de ADN pueden integrarse en un ADN cromosomal huésped por un paso sencillo en un punto en el homólogo ADN cromosomal al fragmento. La recombinación genera un vector integrado flanqueado por repeticiones directas de la secuencia homóloga. En algunas células, la recombinación sucesiva entre las repeticiones resulta en una eliminación del vector y en la adquisición de una mutación deseada a partir del vector por el genoma o restauración del genoma a tipo salvaje.

En los presentes métodos, después de la transferencia de la biblioteca de gen clonada en un vector adecuado, la selección positiva se aplica para la expresión del marcador de selección positiva. Debido a que copias no integradas del vector suicida se eliminan rápidamente de las células, esta selección enriquece a las células que integrado al vector en el cromosoma huésped. Las células que sobreviven a la selección positiva pueden ser entonces propagadas y someterse a selección negativa, o pueden analizarse para pérdida del marcador de selección positiva. La selección negativa selecciona contra las células que expresan el marcador de selección negativa. Por consiguiente, las células que han retenido el vector integrado expresan el marcador negativo y están eliminadas de manera selectiva. Las células que sobreviven a las dos vueltas de selección son aquellas que inicialmente integraron y que después eliminaron al vector. Estas células están enriquecidas para células que tienen genes modificados por recombinación homóloga con el vector.

Optimización Individualizada de Genes

En general, los métodos anteriormente mencionados no requieren conocimientos sobre el número de genes a ser optimizados, su localización en el mapa o su función. Sin embargo, en algunos casos, cuando esta información está disponible para uno o más genes, puede utilizarse. Por ejemplo, si la propiedad a ser adquirida por evolución es recombinación mejorada de células, un gen con posibilidades de ser importante es recA, aunque muchos otros genes, conocidos y no conocidos, pueden contribuir adicionalmente. En esta situación, el gen recA puede evolucionar, al menos en parte, de modo separado de otros genes candidatos. El gen recA puede evolucionar por medio de cualquier método de recombinación recursiva descrito en la Sección V. En resumen, este enfoque comprende el obtener diversas formas de un gen recA, permitiendo que las formas se recombinen, seleccionando recombinantes que tienen propiedades mejoradas, y sometiendo a los recombinantes a ciclos adicionales de recombinación y selección. En un punto den la mejora individualizada de recA, las formas diversas de recA pueden acumularse con fragmentos que codifican otros genes en una biblioteca para su uso en los métodos generales descritos anteriormente. De este modo, la biblioteca se siembra para contener una proporción más elevada de variantes en un gen conocido por ser importante en la propiedad buscada.

Cultivo de Sustratos ADN para Mezcla

En algunos métodos de mezcla, los sustratos de ADN son aislados de fuentes naturales y no son fácilmente manipulados por enzimas polimerizadas o modificadas de ADN debido a las impurezas recalcitrantes, que envenenan las reacciones enzimáticas. Tales dificultades pueden evitarse procesando sustratos de ADN a través de una variedad de cultivo. La variedad de cultivo es normalmente un tipo de célula con competencia natural y una capacidad de recombinación homóloga entre secuencias con diversidad sustancial (p. ej., secuencias que muestran sólo el 75% de la identidad secuencial). La variedad de cultivo porta un vector que codifica un marcador de selección negativa flanqueado por dos segmentos respectivamente complementarios a los dos segmentos que flanquean un gen u otra región de interés en el ADN de un organismo diana. La variedad de cultivo es conectada con los fragmentos de ADN del organismo diana. Los fragmentos son absorbidos por competencia natural, y un fragmento de interés del organismo diana se recombina con el vector de la variedad de cultivo causando la pérdida del marcador de selección negativa. La selección contra el marcador negativo permite el aislamiento de células que han absorbido el fragmento de interés. La mezcla puede llevarse a cabo en la variedad de cultivo o el vector puede aislarse de la variedad de cultivo para mezcla in vitro o transferencia a un tipo de célula diferente para mezcla in vivo. De manera alternativa, el vector puede transferirse a un tipo de célula diferente por conjugación, fusión protoplasto o electrofusión. Un ejemplo de una variedad de cultivo es Acinetobacter calcoaceticus mutS. Young et al., 97th ASM Meeting Abstracts. Esta variedad es naturalmente competente y absorbe ADN de un modo específico no secuencia. Debido a la mutación mutS, esta variedad es también capaz de recombinación homóloga de secuencias que muestran sólo el 75% de identidad secuencial.

III. Aplicaciones Recombinogenicidad

Un objetivo de la evolución de la célula completa es generar células bacteriales o arqueobacteriales que hayan mejorado la capacidad de recombinación. Tales células son útiles para una variedad de propósitos en genética molecular incluyendo los formatos in vivo de recombinación de secuencia recursiva descrita en la Sección V. Casi treinta genes (p. ej., recA, recB, recC, recD, recE, recF, recG, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA y B, lig, polA, uvrD, E, recL, mutD, mutH, mutL., mutU, helD) y puntos de ADN (p. ej., chi, recN, sbcC) envueltos en recombinación genética han sido identificados en E. coli, y formas de cognados de varios de estos genes han sido encontrados en otros organismos (p. ej., rad51, rad55, rad57, Dmcl en levadura (ver Kowalczykowski et al., Microbiol. REv. 58, 401-465 (1994); Kowalczykowski & Zarling, supra) y homólogos humanos de Rad5l y Dmcl han sido identificados (ver Sandler et al., Nucle. Acids Res. 24,2125-2132 (1996)). Además, mutaciones en genes de reptación dispareja, como mutL, mutS, mutH relajan los requerimientos de homología y permiten la recombinación entre secuencias más divergentes. (Rayssiguier et al., Nature 342, 396-401 (1989). La extensión de recombinación entre variedades divergentes puede mejorarse afectando los genes de reparación desigual y estimulando los genes SOS. Esto se logra mediante el uso de variedades mutantes apropiadas y/o crecimiento bajo condiciones de tensión metabólico, que resultan para estimular SOS e inhibir los genes de reparación desigual. Vullic et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA 94 (1997).

Los sustratos iniciales para la recombinación son seleccionados de acuerdo con los principios generales descritos anteriormente. Esto es, los sustratos pueden ser genomas completos o fracciones de los mismos que contienen recombinación de genes o puntos. Grandes bibliotecas de fragmentos esencialmente arbitrarios pueden cultivarse con colecciones de fragmentos que constituyen variantes de uno o más genes de recombinación conocidos, como recA. De modo alternativo, las bibliotecas pueden formarse mezclando formas variantes de la variedad de genes y puntos de recombinación conocidos.

La biblioteca fragmentos es introducida en las células recipientes que hay que mejorar y se da la recombinación, generando células modificadas. Las células recipientes preferentemente contienen un gen marcador cuya expresión ha sido deshabilitada de modo que pueda ser corregida por recombinación. Por ejemplo, las células pueden contener dos copias de un gen marcador que porta mutaciones en diferentes puntos, cuyas copias pueden recombinarse para generar el gen de tipo salvaje. Un gen marcador adecuado es la proteína fluorescente verde. Un vector puede estar construido codificando una copia de GFP que tiene codones de parada cerca del terminal N, y otra copia de GFP que tiene codones de parada cerca del terminal C de la proteína. La distancia entre los codones de parada en los respectivos extremos de las molécula es 500 bpy aproximadamente el 25% de los hechos de recombinación resultan en GFP activo. La expresión de GFP en una célula señala que una célula es capaz de recombinación homóloga para recombinarse entre los codones de parada para generar una secuencia de codificación contigua. Analizando las células que expresan GFP, se enriquecen las células que tienen la capacidad más elevada de recombinación. El mismo tipo de análisis puede usarse tras vueltas sucesivas de recombinación. Sin embargo, a menos que el marcador de selección empleado en vueltas previas estuviera presente en un vector suicida, las vueltas sucesivas deberían emplear un segundo marcador deshabilitado dentro de un segundo vector que porta un origen diferente de réplica o un marcador de selección positiva a vectores empleados en las vueltas previas.

Número de Copia Multigenómica

La mayoría de células bacteriales en cultivos en fase estacionaria cultivados en un medio rico contienen dos, cuatro u ocho cromosomas. En un medio mínimo las células contienen uno o dos cromosomas. El número de cromosomas por célula bacterial depende de las tasa de crecimiento de la célula cuando entra a la fase estacionaria. Esto se debe a que las células que crecen rápidamente contienen múltiples bifurcaciones de réplica, dando como resultado varios cromosomas en las células después del cese. El número de cromosomas es dependiente de la tensión, aunque todas las tensiones testadas tienen más de un cromosoma en fase estacionaria. El número de cromosomas en células en fase estacionaria disminuye con el tiempo. Esto parece ser debido a la fragmentación y degradación de cromosomas enteros, similar a apoptosis en células de mamíferos. Esta fragmentación de genomas en células que contienen múltiples copias de genoma resulta en recombinación masiva y mutagénesis. Mutantes útiles encuentran modos de usar fuentes de energía que les permitirá continuar creciendo.

Algunos tipos de células, como Deinococcus radians (Daly and Minton J. Bacterial. 177, 5495-5505 (1995)) muestran poliploidía a lo largo del ciclo celular. Este tipo de célula es altamente resistente a la radiación debido a la presencia de muchas copias del genoma. La recombinación de alta frecuencia entre los genomas permite la rápida retirada de mutaciones inducida por una variedad de agentes perjudiciales de ADN.

Un objetivo del presente método es desarrollar otros tipos de células que hayan mejorado el número de copia de genoma muy similar al de Deinoccocus radians. Preferentemente, el número de copia aumentado se mantiene a través de todo o la mayor parte del ciclo celular en todas o la mayoría de las condiciones de crecimiento. La presencia de copias de genoma múltiple en tales células da como resultado una mayor frecuencia de recombinación homóloga en estas células, tanto entre copias de un gen en diferentes genomas dentro de la células, como entre un genoma dentro de la célula y un fragmento transfectado. La frecuencia aumentada de recombinación permite que las células se desarrollen más rápidamente para adquirir otras características útiles.

Los sustratos iniciales para la recombinación pueden ser una biblioteca diversa de genes de los cuales sólo unos pocos son relevantes para el número de copia genómico, una biblioteca centrada formada a partir de variantes de genes que se sabe o se sospecha que tienen un papel en el número de copia genómico o una combinación de los dos. Como norma general, se podría esperar que el aumento de número de copia pudiera lograrse mediante evolución de genes envueltos en la réplica y septación de células de modo que la reptación de células se inhibe sin réplica de daño. Los genes involucrados en la réplica incluyen xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, TerA, TerB, TerC, BERD, TerE, Turf, y genes que influencian la partición de cromosomas y el número de copia de genes incluye minad, mukA (TolC), mukB, mukC, mukD, spoOJ, spolllE (Wake & Errington, Annu. Rev. Genet. 29, 41-67 (1995)). Una fuente útil de sustratos es el genoma de un tipo de célula como Deinoccocus radians por tener el fenotipo deseado de número de copia multigenómico. Junto con o en lugar de los sustratos arriba mencionados, se pueden emplear fragmentos que codifican la proteína o inhibidores antisentido de ADN de genes conocidos por tomar parte en la reptación celular.

En la naturaleza, la existencia de copias genómicas múltiples en un tipo de célula no sería ventajoso debido a los mayores requerimientos nutricionales necesarios para mantener este número de copia. Sin embargo, se pueden crear condiciones artificiales para seleccionar un número de copia elevado. Células modificadas que tienen genomas recombinantes crecen en medios (en cuyas condiciones, el número multicopia no debería ser una desventaja) y expone a un mutagen, como radiación ultravioleta o gama o un mutagen químico, p. ej., mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados, solos o en combinación, lo que induce que las roturas de ADN se reparen por recombinación. Estas condiciones seleccionan células que tienen número multicopia debido a la mayor eficiencia con la que las mutaciones se eliminan. Las células modificadas que sobreviven a la exposición a mutagen son enriquecidas para células con copias múltiples del genoma. Si se desea, las células seleccionadas pueden analizarse de modo individual para número de copia de genoma (por ejemplo, por hibridización cuantitativa con los controles apropiados). Algunas o todo el conjunto de células que sobreviven a la selección proporciona los sustratos para la siguiente vuelta de recombinación. Finalmente las células evolucionan, aquellas que tienen al menos 2, 2, 6, 8 o 10 copias del genoma a lo largo del ciclo celular.

Secreción

Las rutas de secreción de proteína (o metabolito) o células bacteriales pueden evolucionar para exportar las moléculas deseadas de manera más eficiente, como para la manufacturación de productos farmacéuticos de proteínas, drogas de moléculas pequeñas o productos químicos especializados. Las mejoras en la eficiencia son particularmente deseables para proteínas que precisan ensamblaje de multisubunidad (como anticuerpos) o modificación post-translacional extensiva antes de la secreción.

La eficiencia de la secreción puede depender de un número de secuencias genéticas que incluye un péptido señal que codifica la secuencia, secuencias que codifican proteína(s) que se parten o sino reconocen la secuencia codificadora y la secuencia que codifica de la proteína que está siendo segregada. Ésta podría afectar al pliegue de la proteína y la facilidad con la que puede integrarse y cruzar membranas. La ruta de secreción bacterial en E. coli incluye los genes SecA, SecB, SecE y SecF. En Bacillus subtilis los genes principales son secA, secD, secE, secF, secY, ffh, fts Y junto con cinco genes de peptidasa de señal (sipS, sipT, sipU, sipV y sipW) (Kunst et al. supra). Para proteínas que requieren modificación post-traslacional, la evolución de los genes que efectúa tal modificación puede contribuir a la secreción mejorada. Del mismo modo genes con productos de expresión que tienen un papel en el montaje o formación de proteínas multisubunidad (p. ej., caperoninas) pueden también contribuir a la secreción mejorada.

La selección de sustratos para la recombinación sigue a los principios generales descritos anteriormente. En este caso, las bibliotecas enfocadas referidas anteriormente constan de variantes de los genes de secreción conocidos. Para la evolución de células procarióticas que expresen proteínas eucarióticas, los sustratos iniciales para la recombinación se obtienen a menudo en parte de fuentes eucarióticas. Los fragmentos entrantes pueden sufrir recombinación con ADN cromosomal en células recipientes y con el constructo marcador de análisis presente en tales células (ver a continuación). Esta forma de recombinación es importante para la evolución de la señal que codifica la secuencia incorporada al constructo marcador de análisis. La secreción mejorada puede analizarse por la inclusión de un constructor marcador en las células que se están desarrollando. El constructo marcador codifica un gen marcador, operablemente unido a las secuencias de expresión, y normalmente operablemente unido a una secuencia de codificación de péptido de señal. El gen marcador es en ocasiones expresado como proteína de fusión con una proteína recombinante de interés. Este enfoque es útil cuando se desea desarrollar la proteína recombinante que codifica la secuencia junto con los genes de secreción.

En una variación, el gen marcador codifica un producto que es tóxico a la células que contiene el constructo a menos que el producto sea segregado. Proteínas de toxina adecuadas incluyen toxina de difteria y toxina de ricina. La propagación de células modificadas que portan tal constructo selecciona células que han evolucionado para mejorar la secreción de la toxina. De modo alternativo, el gen marcador puede codificar un ligando a un receptor conocido, y las células que portan el ligando puede detectarse por FACs usando el receptor etiquetado. Opcionalmente, dicho ligando puede estar operablemente unido a una secuencia de anclaje fosfolípido que une el ligando a la superficie de la membrana celular tras la secreción. (Ver lo apropiado comúnmente, co-pendiente 08/309,345). En otra variación, la proteína marcadora de secreción puede mantenerse en proximidad con la célula que la segrega por la inoculación de células individuales en gotas agar. La proteína segregada se limita a la matriz agar y puede detectarse por ejemplo mediante FACStm. En otra variación, una proteína de interés se expresa como una proteína de fusión junto con b- lactamasa o fosfatasa alcalina. Estas enzimas metabolizan los sustratos de cromosomas comercialmente disponibles (p.ej., x-gal), pero tan sólo después de secreción en periplasma. Por lo tanto, la aparición de sustratos de color en una colonia de células indica la capacidad para segregar la proteína de fusión y la intensidad de color se relaciona con la eficacia de secreción.

Expresión

Las células bacteriales y arqueobacteriales también pueden desarrollarse para adquirir una expresión aumentada de proteína recombinante. El nivel de expresión, por supuesto, depende en gran grado del constructo desde el cual la proteína recombinante se expresa y las secuencias reguladoras, como el promotor, realzado y punto de fin de trascripción contenida en la misma. La expresión también puede verse afectada por un gran número de genes huésped que tienen papeles en la trascripción, modificación post- traslacional y traslación. Además, los genes huésped envueltos en síntesis de monómeros ribonucleótidos y de aminoácido para trascripción y traslación pueden tener efectos indirectos sobre la eficacia de expresión. La selección de sustratos para recombinación sigue a los principios generales descritos anteriormente. En este caso, las bibliotecas enfocadas constan de variantes de genes conocidos por tener papeles en la expresión. Para la evolución de células procarióticas que expresen proteínas eucarióticas, los sustratos iniciales para recombinación a menudo se obtienen, al menos en parte, de fuentes eucarióticas; es decir, genes eucarióticos que codifican proteínas tales como caperoninas envueltas en la secreción y formación de proteínas. Los fragmentos entrantes pueden sufrir recombinación con ADN cromosomal en células recipientes y con el constructo marcador de análisis presente en tales células (ver a continuación).

El análisis para una expresión mejorada puede efectuarse incluyen un constructo reportero en las células que se pretende desarrollar. El constructo reportero expresa (y a menudo segrega) una proteína reportera, como GFA, que es fácilmente detectable y no es tóxica. La proteína reportera puede expresarse sola o junto con una proteína de interés como una proteína de fusión. Si el gen reportero es segregado, el análisis efectivamente selecciona células que tienen una secreción mejorada o una expresión mejorada o ambas.

Células de Plantas

Una aplicación adicional de recombinación de secuencia recursiva es la evolución de células de plantas, y plantas transgénicas derivadas de las mismas, para adquirir resistencia a enfermedades patogénicas, sustancias químicas, viricidas, fungicidas, insecticidas (p. ej., toxina BT), herbicidas (p. ej., atrazina o glifosata) y bacteriocidas. Los sustratos para la recombinación pueden de nuevo ser bibliotecas genómicas completas, fracciones de las mismas o bibliotecas enfocadas que contienen variantes de genes conocidos o sospechosos de conferir resistencia a uno de los agentes anteriores. Frecuentemente, los fragmentos de biblioteca se obtienen de diferente tipo de planta que la planta que se pretende desarrollar.

Los fragmentos de ADN son introducidos en células de plantas cultivadas o protoplastos de plantas mediante métodos estándar incluyendo electroporación (De et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985), infección por vectores virales como virus de mosaico de coliflor (CaMV) (Hohn et al., Molecular Biology of Plant Tumors, (Academic Press, New York, 1982) pp. 549-560; Howel, US 4,407,956) penetración balística de alta velocidad por pequeñas partículas con el ácido nucleico dentro de la matriz de pequeñas molduras o partículas, o sobre la superficie (Klein et al, Nature 327, 70-73 (1987)), uso de polen como vector (WO 85/01856), o uso de Agrobacterium tumefaciens transformado con un plásmido Ti en el cual se clonan los fragmentos de ADN. El plásmido Ti se transmite a las células de la planta tras la infección con Agrobacterium tumefaciens, y se integra de modo estable a I genoma de la planta (Horsch et al., Science 233, 496-498 (1984); Fraley et al, Proc. Matl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983)).

La diversidad también puede generarse por intercambio genético entre protoplastos de planta de acuerdo con los mismos principios descritos a continuación para protoplastos de hongos. Los procesos para la formación y fusión de protoplastos de planta son descritos por Takahashi et al., US 4,677,066; Akagi et al., US 5,360,725. Shimamoto et al., US 5,250,433; Cheney et al., US 5,426,040.

Tras un periodo adecuado de incubación para permitir la recombinación y la expresión de genes recombinantes, las células de las plantas contactan con el agente al cual se le destina la resistencia, y se recogen las células supervivientes de las plantas. Algunas o todas de estas células de planta pueden ser objeto de una siguiente vuelta de recombinación y análisis. Finalmente, se obtienen las células de planta que tienen el grado de resistencia requerido.

Estas células pueden ser posteriormente cultivadas en plantas transgénicas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados es descrita por Evans et al., "Protoplasts Isolation and Cultura", Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124-176 (Mac-Millan Publishing Co., New York, 1983); Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplastos", Protoplasts, (1983) pp. 12-29, (Birkhauser, Basal 1983); Dale, "Protoplasts Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", Protoplasts (1983) pp. 31-41, (Birkhauser, Basel 1983); Binding, "Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, pp.21-73, (CRC Press, Boca Raton,
1985).

En una variación del método ya mencionado, una o más vueltas preliminares de recombinación y análisis pueden llevarse a cabo en células bacteriales de acuerdo con la misma estrategia general descrita para células de plantas. Se puede conseguir una evolución más rápida en células bacteriales debido a su mayor tasa de crecimiento y a la mayor eficacia con la que el ADN puede introducirse en dichas células. Después de una o más vueltas de recombinación/análisis, una biblioteca de fragmento de ADN se recupera de la bacteria y se transforma a las plantas. La biblioteca puede ser una biblioteca completa o una biblioteca enfocada. Una biblioteca enfocada puede producirse mediante amplificación de cebos específicos para secuencias de plantas, en particular secuencias de plantas conocidas o sospechosas de tener un papel para conferir resistencia.

Ejemplo

Formación Concatemérica de Atrazina-Catabolizante

Plásmido Genes Pseudonomas atrazina catabolizantes AtzA y AtzB fueron sublonados de pMD1 (de Souza et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, 3373-3378 (1995); de Souza et al., J. Bacterial. 178, 4894-4900 (1996)) en Puc18. A. 1.9 kb Aval fragmento que contiene AtzA fue rellenado en el extremo y se insertó en un punto Aval de pUC18. Un fragmento ClaI 3.9 kb que contiene AtzB fue rellenado en el extremo y se clonó en el punto Hincil de pUC18. AtzA fue después eliminado de pUC18 con EcoRI y HindIII. El resultado fue una inserción de 5.8 kb que contiene AtzA y AtzB en pUC18 (tamaño total de plásmido 8.4 kb).

La recombinación de secuencia recursiva se llevó a cabo del siguiente modo. El plásmido completo de 8.4 kb fue tratado con DNAsaI en 50 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MnCl_{2} y fragmentos entre 500 y 2000 bp fueron purificados con gel. Los fragmentos fueron montados en una reacción PCR usando enzima Tht-XL y búfer de Perkin Elmer, 2.5 mM MgOAc, 400 \muM dNTPs y diluciones en serie de fragmentos de ADN. La reacción de ensamblaje fue llevada a cabo en una Investigación MJ "Motor ADN" programada con los siguientes ciclos:

1

94°C, 20 segundos

2

94°C, 15 segundos

3

40°C, 30 segundos

4

72°C, 30 segundos + 2 segundos por ciclo

5

ir a paso 2, 39 veces más

6

4°C

\vskip1.000000\baselineskip

Fuimos incapaces de amplificar los genes AtzA y AtzB de la reacción de ensamblaje empleando la reacción en cadena de polimerasa, así que en su lugar purificamos ADN de la reacción por medio de extracción de fenol y precipitación de etanol, después digirió el ADN ensamblado con una enzima de restricción que colocó en línea al plásmido (KpnI: el punto KpnI en pUC18 se perdió durante las subclonación, dejando solo en punto KpnI en AtzA). El plásmido en línea se purificó con gel, se autoligó durante la noche y se transformó en E. coli variedad NM522. (La elección del tipo de huésped fue importante: se obtuvo muy poco plásmido de poca calidad de un número de otras variedades disponibles comercialmente incluyendo TG1, DH10B, DH12S.).

La dilución en serie de la reacción de transformación fue colocada en placas LB que contenían 50 \mug/ml de ampicilina, y el resto de la transformación se hizo al 25% de glicerol y se congeló a -80°C. Una vez que las células transformadas se titularon, las células congeladas fueron colocadas en placas a una densidad de entres 200 y 500 en placas de 150 mm de diámetro conteniendo 500 \mug/ml de atrazina y crecieron a 37°C.

La atrazina a 500 \mug/ml forma un precipitado insoluble. Los productos de los genes AtzA y AtzB transforman la atrazina en un producto soluble. Las células que contienen los genes AtzA AtzB de tipo salvaje en pUC18 estarán por lo tanto rodeadas de un claro halo donde la atrazina ha sido degradada. Cuando más activas sean las enzimas AtzA y AtzB, más rápidamente se formará un claro halo y crecerán en placas que contienen atrazina. Se eligieron como positivas aquellas colonias que más rápidamente formaron las zonas claras más grandes. Las (aproximadamente) 40 mejores colonias se recogieron, se acumularon, crecieron en la presencia de 50 \mug/ml de ampicilina y se preparó plásmido a partir de ellos. El proceso completo (desde el tratamiento de DNasa a la puesta en placas de atrazina) se repitió 4 veces con 2000-4000 colonias/ciclo.

Se realizó una modificación en la cuarta vuelta. Las células fueron colocadas en placas sobre 500 \mug/ml atrazina y sobre 500 \mug/ml de terbutilazina análoga de atrazina, que no era degradable por los genes AtzA y AtzB de tipo salvaje. Se obtuvieron positivos que degradaron ambos compuestos. Cloridrolasa de atrazina (producto de gen AtzA) fue 10-100 veces mayor que el producido por el gen de tipo salvaje.

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Evolución Rápida como una Herramienta De Pronóstico

La recombinación de secuencia recursiva puede emplearse para simular evolución natural de microorganismos patogénicos en respuesta a la exposición a una droga bajo test. Mediante el uso de recombinación de respuesta recursiva, la evolución procede a una tasa más rápida que en evolución natural. Una medida de la tasa de evolución es el número de ciclos de recombinación y el análisis necesario hasta que el microorganismo adquiere un nivel definido de resistencia a la droga. La información de este análisis es de gran valor para comparar los méritos relativos de diferentes drogas y en particular, para predecir su eficacia a largo plazo tras la repetido a administración.

El microorganismo patogénico empleado en este análisis incluye las bacterias que son una fuente común de infecciones humanas, tales como chlamydia, rickettsial bacteria, mycobacteria, staphyloccocci, treptocci, pneumonoccocci, meningoccocci y conoccocci, kiebsiella, proteus, serratia, pseudonomas, legionella, diphteria, salmonella, bacilli, cholera, tetanus, botulism, ántrax, plague, leptospirosis, y bacteria de enfermedad Lymes. La evolución se efectúa transformando un aislamiento de bacteria que es sensible a una droga bajo test con una biblioteca de fragmentos de ADN. Los fragmentos pueden ser una versión mutada del genoma de la bacteria a ser desarrollada. Si la diana de la droga es una proteína conocida, se puede usar una biblioteca enfocada que contiene variantes del gen que codifica la proteína. De modo alternativo, la biblioteca puede venir de otros tipos de bacteria, especialmente bacterias encontradas normalmente en tejidos humanos inhibidores, simulando de este modo el material fuente disponible para recombinación in vivo. La biblioteca también puede venir de bacterias conocidas por ser resistentes a la droga. Después de la transformación y propagación de bacterias durante un periodo adecuado para permitir que ocurra la recombinación y que los genes recombinantes se expresen, las bacterias son analizadas exponiéndolas a la droga bajo test y después recogiendo a las supervivientes. Las bacterias supervivientes son sometidas a vueltas posteriores de recombinación. La vuelta posterior puede hacerse efectiva mediante una técnica de división y acumulación en la cual ADN de un subconjunto de bacterias es introducido en un segundo subconjunto de bacterias. De modo alternativo, una biblioteca nueva de fragmentos de ADN puede introducirse en las bacterias supervivientes. Se pueden llevar a cabo vueltas posteriores de selección al aumentar las concentraciones de droga, aumentando de este modo el rigor de
selección.

\newpage

IV. Fomentación de Intercambio Genético (1) General

Los métodos de invención efectúan recombinación de ADN celular mediante células propagadoras bajo condiciones que inducen el intercambio de ADN entre células bacteriales o arqueobacteriales. El intercambio de ADN es fomentado por los métodos generalmente aplicables de fusión de protoplasto.

En algunos métodos, la diversidad inicial entre células (p.ej., antes del intercambio de genoma) es inducido por mutagénesis química o inducida por radiación de una tipo de célula progenitora, opcionalmente seguido de análisis del fenotipo deseado. En otros métodos, la diversidad es natural cuando las células se obtienen de diferentes individuos, variedades o especies.

En los métodos de mezcla reivindicados, el intercambio inducido de ADN se usa como mero medio de recombinación en cada ciclo de recombinación. En otros métodos, el intercambio inducido se usa en la combinación con recombinación sexual natural de un organismo. En otros métodos, el intercambio inducido y/o recombinación sexual natural se usan en combinación con la introducción de una biblioteca de fragmento. Tal biblioteca de fragmento puede ser un genoma completo, un cromosoma completo, un grupo de genes unidos funcionalmente o genéticamente, un plásmido, un cósmido, o fragmentos de estos. El ADN puede estar unido a un vector o puede estar de forma libre. Algunos vectores contienen secuencias que promueven recombinación homóloga o no-homóloga con el genoma huésped. Algunos fragmentos contienen cortes de doble trenzado como los causados por esquilar con rebordes de cristal, sonicación o fragmentación química o enzimática, para simular la recombinación.

En cada caso, ADN puede intercambiarse entre células después del cual puede sufrir recombinación para formar genomas híbridos. Las células que sufren genomas híbridos son analizadas par un fenotipo deseado, y las células que tienen este fenotipo son aisladas. Estas células forman los materiales de inicio para el siguiente ciclo de recombinación en una técnica de recombinación/selección recursiva.

Un medio de potenciar el intercambio de ADN entre células es la fusión de protoplasto. Un protoplasto resulta de la retirada de una célula de su pared celular, dejando una célula unida a una membrana que depende de un medio isotónico o hipertónico para mantener su integridad. Si la pared de la célula se retira parcialmente, la célula resultante se refiere estrictamente a un esferoplasto y si se retira completamente, como un protoplasto. Sin embargo, aquí el término protoplasto incluye esferoplasto a menos que se indique lo contrario.

La fusión de protoplasto es descrita por Shaffner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163 (1980) y otros procedimientos ejemplares se describen por Yoakum et al., US 4,608,339, Takahashi et al., US 4,677,066 y Sambrooke et al., at Ch. 16. La fusión de protoplasto se ha presentado entre variedades, especies y genes (p. ej., eritrocito de levadura y pollo).

Los protoplastos pueden prepararse tanto para células bacteriales como eucarióticas, incluyendo células de mamíferos y células de plantas, por varios medios que incluyen el tratamiento químico para vaciar las paredes de las células. Los ejemplo, las paredes de las células pueden vaciarse por digestión con lisozima en un 10/20% sacarosa, 50 mM búfer EDTA. La conversión de células a protoplastos esféricos puede controlarse por microscopia de contraste de fase. Los protoplastos también pueden prepararse por propagación de células en un medio suplementado con un inhibidor de síntesis de pared celular, o el empleo de variedades mutantes que no tengan capacidad par la formación de pared celular. Preferentemente, las células eucarióticas son sincronizadas en la fase G1 por arresto con inhibidores tales como \alpha-factor, K. toxina asesina lactis, leflunamida e inhibidores de adenilato ciclasa. De manara opcional, pero no todos, los protoplastos a ser fusionados pueden morir y/o tener su ADN fragmentado por tratamiento con irradiación ultravioleta, hidroxilamina o cupferron (Reeves et al., FEMS Microbiol. Lett. 99, 193-198 (1992)). En esta situación, nos referimos a los protoplastos asesinados como donantes, y a los protoplastos viables como aceptadores. El empleo de células donantes muertas puede resultar ventajoso para el reconocimiento posterior células fusionadas con genomas híbridos, como se describe a continuación. Además, romper ADN en células donantes es ventajoso para estimular la recombinación con el aceptador ADN. De modo opcional, el aceptador y/o células fusionadas pueden ser brevemente, pero no letalmente, expuestas a radiación uv a continuación de la recombinación estimulada.

Una vez formados, los protoplastos pueden estabilizarse en una variedad de osmolitos y compuestos tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, sacarosa, sorbitol en la presencia de DTT. La combinación de búfer, pH, agente reductor, y estabilizador osmótico puede optimizarse para diferentes tipos de células. Los protoplastos pueden ser inducidos a fusionarse por tratamiento con productos químicos tales como PEG, cloruro de calcio o propionato de calcio o electrofusión. (Tsoneva, Acta Microbiologica Bulgaria 24, 53-59 (1989)). También se ha descrito un método de fusión celular que emplea campos eléctricos. Ver Chang US, 4,970,154. Las condiciones se pueden optimizar para diferentes variedades.

Las células fusionadas son heterocariones que contienen genomas de dos protoplastos componentes. Las células fusionadas pueden enriquecerse de células parentales no fusionadas por sedimentación de gradiente de sacarosa o clasificación celular. Los dos núcleos en los heterocariones pueden fusionarse (cariogramia) teniendo lugar la recombinación homóloga entre los genomas. Los cromosomas también pueden segregar asimétricamente resultando protoplastos regenerados que han perdido o ganado todos los cromosomas. La frecuencia de recombinación puede aumentar mediante tratamiento con radiación ultravioleta o por uso de variedades que sobreexpresen recA u otros genes de recombinación, como MutS o MutL o los genes rad de levadura., y variantes cognados de los mismos en otras especies. La sobreexpresión puede ser el resultado de la introducción de genes de recombinación exógena o el resultado de seleccionar variedades, que como resultado de variación natural o mutación inducida, sobreexpresan genes de recombinación endógena. Los protoplastos fusionados se propagan bajo condiciones que permiten la regeneración de paredes celulares, la recombinación y segregación de genomas recombinantes en células progenies del heterocarión o expresión de genes recombinantes... Después, u ocasionalmente antes o durante la recuperación de las células fusionadas, las células son analizadas o seleccionadas para evolución de la propiedad deseada.

A continuación, puede tener lugar una posterior vuelta de recombinación preparando protoplastos de células supervivientes a selección/análisis de una vuelta previa. Los protoplastos son fusionados, la recombinación tiene lugar en las células fusionadas, y las células se regeneran de los protoplastos fusionados. Protoplastos, células regeneradoras o regeneradas, son sometidos a posteriores selecciones y análisis.

De manera alternativa, puede tener lugar una posterior vuelta de recombinación sobre una base de división y acumulación como se ha descrito anteriormente. Es decir, se emplea una primera subpoblación de células supervivientes a selección/análisis de una vuelta previa para la formación de protoplasto. Una segunda subpoblación de células supervivientes a selección/análisis de una vuelta previa se emplea como fuente para la preparación de biblioteca ADN. La biblioteca ADN de la segunda subpoblación de células es después transformada a los protoplastos de la primera subpoblación. La biblioteca sufre recombinación con los genomas de los protoplastos para formar genomas recombinantes. Las células son regeneradas a partir de protoplastos, y se aplica selección/análisis para células regeneradoras o regeneradas. En una variación adicional, una biblioteca nueva de fragmentos de ácido nucleico es introducida en protoplastos supervivientes de selección/análisis de una vuelta previa.

2. Selección de Variedades Híbridas

La invención puede usare en combinación con estrategias de selección para identificar células formadas por fusión de componentes de células parentales de dos o más subpoblaciones distintas. La selección de células híbridas se lleva a cabo normalmente antes de la selección y análisis de células que han evolucionado (como resultado del intercambio genético) para adquirir una propiedad deseada. Una premisa base de la mayoría de las técnicas de selección es que dos subpoblaciones iniciales tengan dos marcadores distintos. Las células con genomas híbridos pueden por lo tanto identificarse por selección de ambos marcadores.

En una de estas técnica, al menos una subpoblación de células porta un marcador selectivo unido a su membrana celular. Ejemplos de marcadores de membrana adecuados incluyen biotina, fluoresceína y rodamina. Los marcadores pueden estar unidos a amida, grupo tiol o a través de productos químicos de derivación más específicos como yodo-acetatos, yodo-acetamidas, maleimides. Por ejemplo, un marcador puede estar unido como se explica a continuación. Las células o protoplastos se lavan con un búfer (p. ej., PBS) que no interfiere con el enganche químico de un ligando químicamente activo que reacciona con amino grupos de lisinas o a amino grupos de N-terminal de proteínas de membrana. El ligando es bien amino reactivo por sí mismo (p. ej., isotiocianatos, succinimidyl ester, cloruros sulfonilos) o se activa por un enlace heterobifuncional (p. ej., EMCS, SIAB, SPDP, SMB) para convertirse en amino reactivo. El ligando es una molécula que se enlaza fácilmente por las gotas magnéticas derivadas de la proteína o por otros soportes sólidos de capturación. Por ejemplo, el ligando puede biotina activada succinimidyl (Pruebas moleculares: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582). Este enlace reacciona con amino grupos de proteínas que residen dentro y sobre la superficie celular. Las células son posteriormente lavadas para retirar el exceso de agentes de etiquetaje antes de contactar con células de la segunda subpoblación que portan un segundo marcador de selección.

La segunda subpoblación de células también puede portar una marcador de membrana, aunque se trata de una membrana diferente a la de la primera subpoblación. De modo alternativo, la segunda subpoblación puede portar un marcador genético. El marcador genético puede conferir una propiedad selectiva, como expresión de proteína verde fluorescente.

Después de la fusión de las primera y segunda subpoblaciones de células y la recuperación, las células son analizadas y seleccionadas para la presencia de marcadores en ambas subpoblaciones parentales. Por ejemplo, los provocadores de la fusión son enriquecidos por una población por medio de adsorción de gotas específicas y éstas son posteriormente clasificadas por FACTS™ para aquellas que expresan un marcador. Las células que sobreviven ambos análisis para ambos marcadores son aquellas que han sufrido fusión de protoplasto, y que por lo tanto tienen más posibilidades de tener genomas recombinados. Normalmente, los marcadores son analizados o seleccionados por separado. Los marcadores unidos a la membrana, como biotina, pueden analizarse por enriquecimiento de afinidad para el indicador de membrana celular (p. ej. Cribando las células fusionadas sobre una matriz de afinidad). Por ejemplo, una etiqueta de membrana de biotina, las células pueden purificarse por afinidad usando gotas magnéticas cubiertas por estreptavidina (Dynal). Estas gotas se lavan varias vences para retirar las células huésped no fusionadas. De modo alternativo, las células pueden cribarse contra un anticuerpo para el marcador de membrana. En una variación adicional, si el marcador de membrana es fluorescente, las células que portan el marcador pueden identificarse por FACS™. Los análisis para marcadores genéticos dependen de la naturaleza de los marcadores, e incluyen la capacidad para crecer sobre medios tratados con drogas de selección FACS™ para proteína verde fluorescente. Si la primera y segunda población tienen marcadores de diferentes longitudes de onda, ambos marcadores pueden seleccionarse simultáneamente por la clasificación FACS™.

En una técnica de selección adicional para células híbridas, la primera y segunda población de células a fusionar expresan diferentes subunidades de una enzima heteromultimérica. Normalmente, la enzima heteromultimérica tiene dos subunidades diferentes, pero las enzimas heteromultiméricas que tienen tres, cuatro o más subunidades diferentes también pueden usarse. Si una enzima tiene más de dos subunidades, cada subunidad puede expresarse en un subpoblación celular diferente (p. ej., tres subunidades en tres subpoblaciones), o más de una subunidad puede expresarse en la misma subpoblación de células (p. ej., una subunidad en una subpoblación, dos subunidades en duna segunda subpoblación).

Las células híbridas que representan una combinación de genomas de células componentes de una primera y segunda subpoblación pueden reconocerse por medio de un ensayo para enzima intacta. Dicho ensayo puede ser un ensayo de enlace, pero normalmente es un ensayo funcional (p. ej, capacidad para metabolizar un sustrato de la enzima). La actividad enzimática puede detectarse por ejemplo procesando un sustrato a un producto con un fluorescente o sino se puede detectar fácilmente mediante espectro de emisión. Las subunidades individuales de una enzima heteromultimérica empleadas en dicho ensayo preferentemente no tienen actividad enzimática en forma desasociada, o al menos tienen considerablemente menor actividad en forma desasociada que en forma asociada. Preferentemente, las células empleadas para fusión carecen de una forma endógena de la enzima heteromultimérica, o al menos tienen considerablemente menor actividad endógena que los resultados de la enzima heteromultimérica formada por fusión de células.

Ejemplos de enzimas heteromultiméricas son enzimas de penicilina acilasa, cefalosporina acilasa y penicilina aciltransferasa. Estas enzimas se codifican por un solo gen, que es trasladado como una proenzima y se parte por proteolisis autocatalítica post-traslacional para retirar un endopéptido espaciador y generar dos subunidades, que se asocian para formar la enzima heterodimérica activa. Ninguna de las subunidades es activa ante la ausencia de la otra subunidad. Sin embargo, la actividad se puede reconstituir si estas porciones de gen separadas se expresan en la misma célula por co-trasformación. Otras enzimas que pueden usarse tienen subunidades que están codificadas por genes distintos (p. ej., genes faoA y faoB codifican 3-oxoacyl-CoA tiolasa de Pseudonmonas fragi (Biochem. J 328, 815-820 (1997)).

Una enzima ejemplar es penicilina G acilasa de Escherichia coli, que tiene dos subunidades codificadas por un solo gen. Los fragmentos del gen que codifican las dos subunidades operablemente unidos a las secuencias de regulación de expresión adecuadas son transfectadas a la primera y segunda subpoblación de células, que carecen de actividad de penicilina acilasa endógena. Una célula formada por la fusión de células componentes de la primera y segunda subpoblación expresa las dos subunidades, que se unen para formar la enzima funcional, p. ej. penicilina acilasa. Las células fusionadas pueden entonces seleccionarse en placas agar que contienen penicilina G, que es degradada por penicilina acilasa.

En otra variación, las células fusionadas se identifican por complementación de mutantes autotróficos. La subpoblación parental de células puede seleccionarse con mutaciones autotróficas conocidas. De modo alternativo, las mutaciones autotróficas en una población inicial de célula pueden generarse de manera espontánea por exposición a un agente mutagénico. Células con mutaciones autotróficas son seleccionadas por plaqueado en réplica sobre medios mínimos y completos. Las lesiones que resultan en auxotrofia se esperan que sean aisladas a través del genoma, en genes para aminoácido, nucleótido, y rutas sintéticas de vitamina. Tras la fusión de células parentales, las células resultantes de la fusión pueden identificarse por su capacidad para crecer en medios mínimos. Estas células pueden analizarse o seleccionarse para evolución hacia una propiedad deseada. Pueden incorporarse otros pasos de mutagénesis que genere mutaciones auxotróficas nuevas en ciclos posteriores de recombinación y/o análisis/selección.

En variaciones del método arriba mencionado, la nueva generación de mutaciones auxotróficas en cada vuelta de la mezcla puede evitarse los mismos auxotrofos. Por ejemplo, se pueden generar auxotrofos por medio de mutágenos transposones usando un transposon que soporte marcador selectivo. Los auxotrofos se identifican por un filtro tal como el placaje en réplica. Los auxotrofos se acumulan y se prepara un lisado phage de transducción generalizado por crecimiento de phage en una población de célula auxotróficas. Una población separada de células auxotróficas se somete a intercambio genético, y se emplea complementación para las células seleccionadas que han sufrido intercambio genético o recombinación. Estas células son después analizadas y seleccionadas para la adquisición de una propiedad deseada. Las células supervivientes a análisis o selección tienen a continuación marcadores autotróficos regenerados por introducción de la biblioteca de transposón transductora. Las células auxotróficas nuevamente generadas pueden ser sometidas a intercambios genéticos adicionales y análisis/selección.

En una variación adicional, las mutaciones auxotróficas se generan por recombinación homóloga con un vector que dirige que consta de un marcador selectivo flanqueado por regiones de homología con una región biosintética del genoma de células a ser desarrolladas. La recombinación entre el vector y el genoma introduce al marcador de selección positivo en el genoma causando una mutación autotrófica. El vector está en forma lineal antes de la introducción de células. De manera opcional, la frecuencia de introducción del vector puede aumentar limitando sus extremos con oligonucleótidos de auto-complementariedad fijados por calor en la formación de una horquilla. El intercambio genético y el análisis/selección procedieron como se ha descrito anteriormente. En cada vuelta, se introducen vectores dirigentes regenerando la misma población de marcadores autotróficos.

En otra variación, las células fusionadas se identifican por medio de análisis de un marcador genómico presente en una subpoblación de células parentales y un marcador episomal presente en una segunda subpoblación de células.

En una variación adicional, el intercambio genético tiene lugar entre dos subpoblaciones de células, una de las cuales está muerta. Las células viables son posteriormente analizadas para un marcador presente en la subpoblación parental muerta.

3. Transferencias Mediadas por Liposomas

En los métodos mencionados, en los cuales las bibliotecas de fragmentos de ácido nucleico se introducen en protoplastos, en ocasiones los ácidos nucleicos se encapsulan en liposomas para facilitar la toma por protoplastos. La toma mediada por liposomas de ADN por protoplastos se describe en Redford et al., Mol. Gen. Genet. 184, 567-569 (1981). Los liposomas pueden enviar de manera efectiva grandes volúmenes de ADN para protoplastos (ver Deshayes et al., EMBO J. 4,2731-2737 (1985)). Además, el ADN puede enviarse como fragmentos lineares, que a menudo son más recombinogénicos que los genomas completos. En algunos métodos, los fragmentos se mutan antes de la encapsulación en liposomas. En algunos métodos, los fragmentos se combinan con RecA y homólogos, o nucleasas (p. ej., edonucleasas de restricción) antes de la encapsulación en liposomas para potenciar la recombinación.

V. Métodos para Recombinación de Secuencia Recursiva

Algunos formatos y ejemplos para recombinación de secuencia recursiva, algunas veces referidos como mezcla de ADN o reproducción molecular, han sido descritos por los presentes inventores y colaboradores en la solicitud copendiente, listado de documentos no. 16528A-014612, presentado el 25 de marzo, 1996, PCT/US95/02126 presentado el 17 de febrero de 1996 (publicado como WO 95/22(25); Stemmer, Science 270, 1510 (1995); Stemmer et al., Gene, 164, 49-53 (1995); Stemmer, Biol. Technology, 13, 549-553 (1995); Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751 (1994), Stemmer, Nature 370, 389-391 (1994); Crameri et al., Nature Medicine, 2(1):1-3 81996); Crameri et al., Nature Biotechnology 14, 315-319 (1996).

(1) Formatos In Vitro

Se muestra un formato para mezcla in vitro en la Fig. 1. Los sustratos iniciales para recombinación son un pozo de secuencias relacionadas. Las X's en la Fig. 1., panel A, muestran dónde divergen las secuencias. Las secuencias pueden ser ADN o ARN y pueden ser de varias longitudes dependiendo del tamaño del gen o fragmentos ADN a ser recombinado o reensamblado. Preferentemente, las secuencias son de 50 bp a 50 kb.

El pozo de sustratos relacionados es convertido en fragmentos traslapados, p.ej., de aproximadamente 5 bp a 5 kb o más, como se muestra en la Fig. 1, panel B. A menudo, el tamaño de los fragmentos es de aproximadamente entre 10 bp y 1000 bp y algunas veces el tamaño de los fragmentos de ADN es de 100 bp a 500 bp. La conversión puede efectuarse mediante varios métodos, tal como la digestión ADNsaI o ARNsaI, esquileo arbitrario o digestión de enzima de restricción parcial. De modo alternativo, la conversión de sustratos a fragmentos puede efectuarse por amplificación de PCR incompleto de sustratos o PCR preparado a partir de un solo cebo. De modo alternativo, los fragmentos apropiados de trenzado sencillo pueden generarse sobre un sintetizador de ácido nucleico. La concentración de fragmentos de ácido nucleico de una longitud particular y la secuencia es normalmente inferior a 0.1 & o 1% por peso del ácido nucleico total. El número de fragmentos de ácido nucleico específicos diferentes en la mezcla es usualmente al menos alrededor de 100, 500 o 1000.

La población mezclada de fragmentos de ácido nucleico se convierte al menos parcialmente en formas de trenzado sencillo.

La conversión puede efectuarse con calor de 80°C a 100°C, más preferentemente de 90°C a 96°C, para formar fragmentos de ácido nucleico de trenzado sencillo y después se vuelve a fijar con calor. La conversión también puede efectuarse mediante tratamiento de proteína de enlace ADN de trenzado sencillo o proteína recA. Los fragmentos de ácido nucleico de trenzado sencillo que tienen regiones de identidad de secuencia con otros fragmentos de ácido nucleico de trenzado sencillo pueden fijarse de nuevo con calor de 20°C a 75°C, y preferentemente de 40°C a 65°C. La renaturación puede acelerarse mediante la adición de glicol de polietileno (PEG), otros reagentes excluyentes de volumen o sales. La concentración de sal es preferentemente entre 0 mM a 200 mM, siendo la concentración de sal más preferente entre 10 mM y 100 mM. La sal puede ser KCI o NaCl. La concentración de PEG es preferiblemente entre 0% y 20%, más preferentemente entre 5% y 10%. Los fragmentos que vuelven a fijar con calor puedes ser de diferentes sustratos mostrados en la Fig. 1, panel C. Los fragmentos de ácido nucleico se incuban en la presencia de una polimerasa de ácido nucleico, tal como Taq o Klenow, o polimerasa a prueba de lectura, como pfu o pwo, y Dntps (es decir, dATP, dCTP, dGTP Y dTTP). Si las regiones de identidad de secuencia son amplias, se pueden emplear polimerasa Tag con una temperatura de fijación de calor entre 45°C y 65°C. Si estas zonas de identidad son pequeñas, puede emplearse polimerasa Kenow con una temperatura de fijación de calor entre 20°C y 30°C (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra). La polimerasa puede añadirse a los fragmentos de ácido nucleicos arbitrarios antes del calentamiento, simultáneamente con el calentamiento o después del calentamiento.

El proceso de denaturación, renaturación e incubación en la presencia de polimerasa de fragmentos que se traslapan para generar un conjunto de polinucleótidos que contienen diferentes permutaciones de fragmentos es referido algunas veces como cambio del ácido nucleico in vitro. El ciclo se repite durante un número deseado de veces. Preferentemente, el ciclo se repite de 2 a 100 veces, más preferentemente las secuencia se repite de 10 40 veces. Los ácidos nucleicos resultantes son una familia de polinucleótidos de doble trenzado de aproximadamente 50 bp a 100 kb., preferentemente entre 500 bp a 50 kb, como se muestra en la Fig. 1, panel D. La población representa variantes de sustratos iniciales que muestran identidad de secuencia sustancial con la misma, pero que también diverge en varias posiciones. La población tiene muchos más miembros que los sustratos iniciales. La población de fragmentos resultantes de la mezcla se emplea para transformar células huésped, opcionalmente después de clonarlas en un vector.

En una variación de mezcla in vitro, se pueden generar sustratos de subsecuencias de recombinación mediante la amplificación de secuencias de longitud completa bajo condiciones que producen una fracción sustancial, normalmente al menos 20& o más, de productos de amplificación incompletamente extendida. Los productos de amplificación, incluyendo los productos de amplificación incompletamente extendida, son desnaturalizados y sometidos a la menos un ciclo adicional recalentamiento y amplificación. Esta variación, en la cual al menos un ciclo de recalentamiento y amplificación proporciona una fracción sustancial de productos extendidos incompletamente, es denominada "tartamudeo". En la vuelta de amplificación posterior, los productos incompletamente extendidos se fijan con calor a una extensión de cebo sobre diferentes especies de plantilla relacionadas con la secuencia.

En una variación adicional, una mezcla de fragmentos se clava con uno o más oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden estar diseñados para incluir mutaciones precaracterizadas de una secuencia de tipo salvaje, o puntos de variaciones naturales entre individuos o especies. Los oligonucleótides también incluyen secuencias suficientes u homología estructural que flanquea tales mutaciones o variaciones para permitir la fijación con calor con los fragmentos de tipo salvaje. Algunos oligonucleótidos puedes ser secuencias arbitrarias. Las temperaturas de calor se pueden ajustar dependiendo de la longitud de homología. En una variación adicional, la recombinación se da en al menos un ciclo por cambio de plantilla, como cuando un fragmento de ADN derivado de una plantilla se aplica sobre la posición homóloga de una plantilla relacionada pero diferente. El cambio de plantilla puede ser inducido por adición de recA, rad5l, rad55, rad57 u otras polimerasas (p. ej., polimerasas virales, transcriptasas reversas) para la mezcla de amplificación. El cambio de plantilla también puede aumentar incrementando la concentración de plantilla de ADN.

En una variación adicional, al menos un ciclo de amplificación puede ser dirigido usando un conjunto de fragmentos de ADN de trenzado sencillo superpuestos de secuencia relacionada, y de diferentes longitudes. Los fragmentos pueden prepararse usando un phage ADN de trenzado sencillo, como M13. Cada fragmento puede hibridizar y aplicar extensión de cadena de polinucleótido de un segundo fragmento del conjunto, formando así polinucleótidos recombinados de secuencia. En una variación adicional, fragmentos ssADN de longitud variable pueden ser generados a partir de un único cebo por Vent u otra polimerasa de ADN sobre la primera plantilla ADN. Los fragmentos de ADN de trenzado sencillo se usan como cebos para una segunda, plantilla de tipo Kunkel, consistente en un ssADN circular con uracilo. Esto resulta en múltiples sustituciones de la primera plantilla en la segunda. Ver Levichkin et al., Mol. Biology 29, 572-577 (1995).

(2) Formatos In Vivo (a) Recombinación Plásmido-Plásmido

Los sustratos iniciales para recombinación son un conjunto de polinucléotidos consistentes en formas variadas de un gen. Las formas variadas a menudo muestran identidad de secuencia sustancial entre sí lo suficientemente clara como para permitir recombinación homóloga entres sustratos. La diversidad entre los polinucleótidos puede ser natural (p.ej., alélica o variantes de especies), inducida (p. ej., por error-decúbito prono PCR) o el resultado de recombinación in vitro. La diversidad también puede resultar de genes resintetizadores que codifican proteínas naturales con uso de codón alternativo y/o mezclado. Deberían existir al menos suficientes diversidades entre sustrato que la recombinación puede generar en productos diversos y los materiales iniciales. Debe haber por lo menos dos sustratos que se diferencien en dos posiciones. Sin embargo, normalmente se emplea una biblioteca de sustratos de 10^{3}-10^{8} miembros. El grado de diversidad depende de la longitud del sustrato a ser recombinado y la extensión del cambio funcional a desarrollar. Los sustratos diversos se incorporan en los plásmidos. Los plásmidos suelen ser vectores de clonación estándar, p. ej., plásmido multicopia bacterial. Sin embargo, en algunos métodos que se describirán a continuación, los plásmidos incluyen funciones de movilización. Los sustratos pueden incorporarse en los mismos o en diferentes plásmidos. A menudo, al menos dos tipos diferentes de plásmidos que tienen diferente tipo de marcador de selección son empleados para permitir la selección de células que contienen al menos dos tipos de vectores. También, cuando se emplean diferentes tipos de plásmidos, los diferente plásmidos vienen de dos grupos de incompatibilidad distintos para permitir la coexistencia estable de dos plásmidos diferentes dentro de la célula. Sin embargo, plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad pueden coexistir dentro de la célula durante el tiempo suficiente como para permitir que la recombinación homóloga tenga lugar.

Los plásmidos que contienen sustratos diversos son inicialmente inducidos en células procarióticas o eucarióticas por algún método de transfección (p. ej., transformación química, competencia natural, electroforación, transducción viral o biolística). A menudo, los plásmidos están presentes en o cerca de la concentración de saturación (con respecto a la capacidad de transfección máxima) para aumentar la posibilidad de que más de un plásmido entre la misma célula. Los plásmidos que contienen los diferentes sustratos pueden ser transfectados simultáneamente o en múltiples vueltas. Por ejemplo, en la última técnica, las células pueden transfectarse con una primera parte alícuota de plásmido, transfectantes seleccionados y propagados, y después infectados con una segunda parte alícuota de plásmido.

Después de introducir los plásmidos en las células, la recombinación entre sustratos para genera genes recombinantes tiene lugar dentro de las células que contienen múltiples plásmidos diferentes solamente propagándolo en las células. Sin embargo, las células que reciben sólo un plásmido son incapaces de participar en la recombinación y la contribución potencial de sustratos sobre tales plásmidos para la evolución no se explota por completo (aunque estos plásmidos pueden contribuir hasta cierto punto si se propagan en células mutadores o sino acumular mutaciones de punto (es decir, tratamiento de radiación ultravioleta). La tasa de evolución puede aumentar permitiendo que todos los sustratos participen en la recombinación. Esto puede lograrse sometiendo las células transfectadas a electroporación. Las condiciones para electroporación son las mismas que las que se usan convencionalmente para introducir ADN exógeno en células (p. ej., 1,000-2,500 voltios, 400 \muF y 1-2 nM hueco). Bajo estas condiciones, los plásmidos se intercambian entre células permitiendo que todos los sustratos participen en la recombinación. Además, los productos de combinación pueden sufrir vueltas adicionales de recombinación entre sí o con el sustrato original. La tasa de evolución puede aumentar mediante el empleo de transferencia conjugativa. Se conocen sistemas de transferencia conjugativa en muchas bacterias (E. coli, P. aeruginosa, S. pneumoniae, y H. influenzae) y también pueden emplearse para transferir ADN entre bacteria y levadura o entre bacteria y células mamíferas.

Para explotar la transferencia conjugativa, los sustratos son clonados en plásmidos que tienen genes MOB, y también se proporcionan genes tra en cis o in trans a los genes MOB. El efecto de la transferencia conjugada es muy similar al de electroporación en el sentido de que permite que los plásmidos se muevan entre células y permite la recombinación entre cualquier sustrato y los productos de recombinación simplemente propagando el cultivo. Los detalles de cómo la transferencia conjugada se explota en estos vectores se describen a continuación. La tasa de evolución también puede aumentar fusionando protoplastos de células para inducir el intercambio de plásmidos o cromosomas. La fusión puede estar inducida por agentes químicos, como PEG, o virus o proteínas virales, como hemaglutinina del virus de la gripe. La tasa de evolución también puede aumentar por el uso de células huéspedes mutantes (p. ej., Mut L, S, D, T, H).

El tiempo durante el cual las células se propagan y se da la recombinación, por supuesto, varía con el tipo de células pero generalmente o es crítico, porque incluso un grado pequeño de recombinación puede aumentar considerablemente la relativa diversidad para los materiales iniciales. Las células que portan plásmidos que contienen genes recombinados están sometidas al análisis o selección para una función deseada. Por ejemplo, si el sustrato que está siendo desarrollado contiene un gen de resistencia a drogas, se selecciona para la resistencia de drogas. Las células supervivientes a análisis o selección pueden estar sometidas a una o más vueltas de análisis/selección seguido de recombinación o pueden estar sometidas directamente a una vuelta adicional de recombinación.

La siguiente vuelta de recombinación puede lograrse mediante diferentes formatos de la previa vuelta. Por ejemplo, una vuelta adicional de recombinación puede efectuarse simplemente resumiendo la electroporación o transferencia intercelular mediada por conjugación de plásmidos arriba descritos. De manera alternativa, un sustrato o sustratos nuevos, los mismos o diferente de los sustratos anteriores, pueden ser transfectados a células supervivientes a selección/análisis. Opcionalmente, los nuevos sustratos se incluyen en vectores de plásmido que portan un marcador selectivo diferente y/o de un grupo de incompatibilidad diferente que el de los plásmidos originales. Como otra alternativa, las células supervivientes a la selección/análisis pueden subdividirse en dos subpoblaciones, y el ADN plásmido de una subpoblación puede ser transfectado a la otra, donde los sustratos de los plásmidos de las dos subpoblaciones sufren una vuelta adicional de recombinación. En cualquiera de las dos últimas opciones, la tasa de evolución puede aumentar empleando extracción ADN, electroporación, conjugación o células mutantes, como se ha descrito anteriormente. En otra variación adicional, el ADN de las células supervivientes a análisis/selección pueden extraerse y someterse a mezcla ADN in vitro.

Después de la segunda vuelta de recombinación, se lleva a cabo una segunda vuelta de análisis/selección, preferentemente bajo condiciones de mayor vigor. Si se desea, pueden realizarse más vueltas de análisis/selección usando la misma estrategia que para la segunda vuelta. Con sucesivas vueltas de recombinación y análisis/selección los sustratos recombinados supervivientes evolucionan hacia la adquisición de un fenotipo deseado.

Normalmente, en este u otro método de recombinación recursiva, el producto final de recombinación que ha adquirido el fenotipo deseado difiere de los sustratos iniciales en 0.1%-0.25% de posiciones y ha evolucionado a una tasa de orden de magnitud en exceso (p. ejemplo, al menos 10-veces, 100-veces, 1000-veces,o 10,000 veces) de la tasa de mutación naturalmente adquirida de aproximadamente 1 mutación por 10^{-9} posiciones por generación (ver Anderson & Hughes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 906-907 (1996)).

(b) Recombinación Virus-Plásmido

La estrategia usada para recombinación plásmido-plásmido también puede usarse para recombinación virus-plásmido; normalmente la recombinación phage-plásmido. Sin embargo, algunos comentarios adicionales relativos al uso de virus son apropiados. Los sustratos iniciales para recombinación son clonados en ambos plásmidos y vectores virales. No suele resultar crítico qué sustrato(s) es introducido en el vector viral y qué sustrato(s) en el plásmido aunque normalmente el vector viral contiene diferentes sustratos a los de los plásmidos. Al igual que antes, el plásmido (y el virus) normalmente contiene un marcador selectivo. El plásmido y los vectores virales pueden introducirse en células por transfección como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, un procedimiento más eficiente es transfectar las células con plásmido, seleccionar los transfectantes e infectar los transfectantes con el virus. A causa de que la eficacia de la infección de mucho virus alcanza el 100% de células, la mayoría de células transfectadas e infectadas por esta ruta contienen plásmido y virus que porta diferentes sustratos.

La recombinación homóloga tiene lugar entre plásmido y virus generando plásmidos recombinados y virus recombinados. Para algunos virus, como phage de filamento, en los cuales el ADN intracelular existe tanto en forma de doble trenzado como en forma de trenzado sencillo, ambos pueden participar en la recombinación. Siempre que el virus sea aquel que no mata rápidamente a las células, la recombinación puede aumentar mediante el uso de electroporación o conjugación para transferir plásmidos entre células. La recombinación también puede aumentar popar algunos tipos de virus permitiendo que el virus progenitor de una célula reinfecte a las otras células. Para algunos tipos de virus, las células infectadas de virus muestran resistencia a la superinfección. Sin embargo, tal resistencia puede superarse infectando a elevada multiplicidad y/o usando variedades mutantes de los virus en los cuales la resistencia a la superinfección se reduce.

El resultado de infectar células que contienen plásmido con virus depende de la naturaleza del virus. Algunos virus, como phage de filamento, existen de manera estable con un plásmido en las células y también extruden progenie phage de la célula. Otros virus tales como lambda que tienen un genoma cósmido, se establecen de manera estable en una célula como plásmidos sin producir viriones progenie. Otros virus, como T-phage y lytic lambda, sufren recombinación con el plásmido pero finalmente matan la célula huésped y destruyen el ADN plásmido. Para virus que infectan células sin matar los huéspedes, las células que contienen plásmidos recombinantes y los virus pueden analizarse/seleccionarse usando la misma técnica que en la recombinación plásmido-plásmido. También se pueden recoger virus progenie extrudido por células supervivientes a la selección/análisis y se pueden usar como sustratos en vueltas posteriores de recombinación. Para virus que matan a sus células huéspedes, los genes recombinantes que resultan de la recombinación sólo reside en los virus progenie. Si la prueba de análisis o selección requiere expresión de genes recombinantes en una célula, los genes recombinantes deberían transfectarse de los virus progenie a otro vector, por ejemplo un vector plásmido, y retransfectarse a células antes de que se lleve a cabo la selección/análisis.

Para phage de filamento, los productos de recombinación están presentes en células supervivientes a la recombinación y en phage extrudido de estas células. La fuente dual de productos recombinantes proporciona algunas opciones adicionales relativas a la recombinación plásmido-plásmido. Por ejemplo, el ADN puede aislarse de las partículas phage para usarse en una vuelta de recombinación in vitro. De modo alternativo, el phage progenie puede usarse para transfectar o infectar células supervivientes a una vuelta previa de análisis/selección, o células supervivientes a una vuelta previa de selección/análisis, o células nuevas transfectadas con sustratos nuevos de recombinación.

(c) Recombinación Virus-Virus

Los principios descritos para recombinación plásmido-plásmido y plásmido-viral puede aplicarse a la recombinación virus-virus con un pocas modificaciones. Los sustratos iniciales para la recombinación son clonados en un vector viral. Normalmente, se emplea el mismo vector para todos los sustratos. Preferentemente, el virus es uno que, de manera natural o como resultado de una mutación, no mata a las células. Después de la inserción, algunos genomas virales pueden empaquetarse in vitro. Los virus empaquetados pueden usarse para infectar células a multiplicidad elevada de modo que exista una alta probabilidad de que una célula reciba múltiples virus que portan sustratos diferentes.

Después de la vuelta inicial de infección, los pasos posteriores dependen de la naturaleza de la infección como se ha descrito en la sección anterior. Por ejemplo, si los virus tienen genomas phagemid como cósmidos lambda o M13, F1 o phagemid FD, los phagemid se comportan como plásmidos dentro de la célula y sufren recombinación simplemente mediante la propagación de las células. La recombinación puede aumentar por electroporación de células. Tras las selección/análisis, los cósmidos que contienen genes recombinantes pueden recuperarse de las células supervivientes (p. ej., por inducción de calor de una célula huésped coslisogénica), preempaquetada in vitro, y utilizada para infectar células nuevas a elevada multiplicidad para una vuelta posterior de recombinación.

Si los virus son phage de filamento, la recombinación de ADN de forma replicante se da por la propagación de cultivo de células infectadas. La selección/análisis identifica colonias de células que contienen vectores virales con genes recombinantes de propiedades mejoradas, junto con phage extrudido de tales células. Opciones posteriores son básicamente las mismas que para recombinación plásmido-viral.

(d) Recombinación Cromosoma-Plásmido

Este formato puede emplearse para desarrollar tanto los sustratos de cromosomas como sustratos portados por plásmido. El formato es particularmente en situaciones en las que muchos genes de cromosoma contribuyen a un fenotipo o cuando no se sabe la posición exacta de los genes de cromosoma que se pretende desarrollar. Los sustratos iniciales para la recombinación se clonan en un vector plásmido. Si se conocen los genes de cromosomas que van a evolucionar, los sustratos constituyen una familia de secuencias que muestra un alto grado de identidad de secuencia pero alguna divergencia del gen de cromosoma. Si los genes de cromosoma a evolucionar no han sido localizados, los sustratos iniciales normalmente constituyen una biblioteca de segmentos ADN de los cuales sólo unos pocos muestran identidad de secuencia con el gen o genes a ser desarrollados. La divergencia entre sustrato portado por plásmido y el gen de cromosoma puede estar inducido por mutagénesis o mediante la obtención de sustratos portados por plásmido de especies diferentes a las de las células que portan el cromosoma.

Los plásmidos que portan los sustratos para recombinación son transfectados a células que tienen genes de cromosomas que se pretende evolucionar. La evolución puede darse simplemente propagando el cultivo, o puede acelerarse transfiriendo plásmidos entre células por conjugación o electroporación. La evolución puede además acelerarse por el uso de células huésped mutantes o por la siembra de un cultivo de células huésped no mutantes que están siendo desarrolladas con células huésped mutantes y que inducen transferencia intracelular de plásmidos por electroporación o conjugación. Preferentemente, las células huésped mutantes usadas para el cultivo contienen un marcador de selección negativo para facilitar el aislamiento de un cultivo puro de la célula no mutantes que están siendo desarrolladas. La selección/análisis identifica las células que portan cromosomas y/o plásmidos que han evolucionado hacia la adquisición de una función deseada.

Las vueltas posteriores de recombinación y selección/análisis proceden de modo similar a las descritas para recombinación plásmido-plásmido. Por ejemplo, una recombinación adicional puede efectuarse mediante la propagación de células supervivientes a la recombinación en combinación con electroporación o transferencia conjugativa de plásmidos. De modo alternativo, los plásmidos que portan sustratos adicionales para la recombinación pueden introducirse en las células supervivientes. Preferentemente, tales plásmidos sean de un grupo de incompatibilidad diferente y suportan un marcador de selección diferente al del los plásmidos originales para permitir la selección de células que contiene al menos dos plásmidos diferentes. Como otra alternativa, ADN de plásmido y/o cromosoma puede aislarse de una subpoblación de células supervivientes y tranfectarse a una segunda subpoblación. ADN de cromosoma puede clonarse en un vector plásmido antes de la transfección.

(e) Recombinación Virus-Cromosoma

Como en otros métodos descritos anteriormente, el virus es normalmente uno que no mata las células, y a menudo es un phage o phagemid. El proceso es básicamente el mismo que para recombinación plásmido-cromosoma. Los sustratos para recombinación son clonados en el vector. Los vectores que incluyen los sustratos pueden después ser transfectados a células o empaquetarse in vitro e introducirse en células mediante genomas de infección viral que se recombinan con cromosomas huésped meramente por propagación de un cultivo. La evolución puede acelerarse permitiendo transferencia intercelular de genomas virales por electroporación, o reinfección de células por viriones progenie. El análisis/selección identifica células que tienen cromosomas y/o genomas virales que han evolucionado hacia la adquisición de una función deseada.

Existen varias opciones para vueltas posteriores de recombinación. Por ejemplo, genomas virales pueden transferirse entre células supervivientes a selección/recombinación pro electroporación. De modo alternativo, los virus extrudidos de células supervivientes a selección/análisis pueden acumularse y usarse para superinfectar las células a elevada multiplicidad. De modo alternativo, los sustratos nuevos para recombinación pueden introducirse en las células, bien en vectores de plásmido o virales.

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Ejemplos

Los ejemplos que no se relacionan específicamente con la invención reivindicada se incluyen únicamente como ilustración.

1. RecA Hiper-Recombiogénico de Evolución

La proteína RecA está implicada en la mayoría de rutas de recombinación homóloga de E. coli. La mayor parte de las mutaciones en recA inhiben la recombinación, pero algunas han demostrado haber aumentado la recombinación (kowalczykowski et al., Microbiol. Rev., 58, 401-465 81994). El siguiente ejemplo describe la evolución de RecA para adquirir actividad hiper-recobiogénica útil en formatos de mezcla in vivo.

RecA hiper-recombiogénica fue seleccionada mediante una modificación de un sistema desarrollado por Shen et al., Genetics 112, 441-457 (1986); Shen et al., Mol. Gen. Genet. 218, 358-360 (1989)) para medir el efecto de la longitud de formato y homología sobre frecuencia de recombinación. El sistema de Shen & Huang empleó plásmidos y bacteriophages con pequeñas (31-430 bp) regiones de homología en las cuales los dos podían recombinar. En un huésped restrictivo, sólo phage que habían incorporado la secuencia de plásmido fueron capaces de forma placas.

Para la mezcla de recA, se borraron recA endógeno y mutS de la variedad huésped MC1061. En esta variedad, no se observó recombinación entre plásmido y phage. RecA de E. coli fue después clonada en dos de los vectores de recombinación (Bp221 y \Pimt631 c18). Los plásmidos que contienen RecA clonado fueron capaces de recombinarse con phage homólogo: \lambdaV3 (430 bp identidad con Bp221) y \lambdalink H (31 bp identidad con \Pimt631 c18, excepto por un desequilibrio en la posición 18).

RecA clonado fue después mezclada in vitro mediante el tratamiento estándar de ADNasa seguido de reensamblaje basado en PCR. Los plásmidos mezclados fueron transformados en variedad de huésped no recombinante. Estas células crecieron durante la noche, infectadas con phage \lambdaVc, \lambdaV13 o \lambdalink H, y se pusieron en placas NZCYM en presencia de un exceso multiplicado por 10 de MC1061 carente de plásmido. Cuanto más eficientes sea un allele RecA para potenciar la recombinación, el allele estará más altamente representado en el bacteriophage ADN. De modo consecuente, el cultivo de todos los phage de las placas y la recuperación de los genes RecA selecciona los alleles RecA más reconsbiogénicos.

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Las frecuencias de recombinación para tipo salvaje y un poco de RecA hiper-recombiogénico después de 3 vueltas de mezcla fueron como se expone a continuación:

Cruzado	Tipo Salvaje	Hiper Recom
BP221 x V3	6.5 x 10^{-4}	3-3 x 10^{-2}
BP221 x V13	2.2 x 10^{-5}	1.0 x 10^{-3}
^{#}MT631c18 x link H	8.7 x 10^{-6}	4.7 x 10^{-6}

Estos resultados indican un aumento de 50 veces en la recombinación para el sustrato de 430 bp, y un aumento de 5 veces para el sustrato de 31 bp.

La frecuencia de recombinación entre BP221 y V3 para cinco clones aislados individuales se muestra a continuación y las secuencias de ADN y proteína y alineaciones de los mismos están incluídos en Figs. 2 y 3.

Tipo Salvaje: 1.6 x 10^{-4}

Clon 2: 9.8 x 10^{-3} (61 x aumento)

Clon 4: 9.9 x 10^{-3} (62 x aumento)

Clon 5: 6.2 x 10^{-3} (39 x aumento)

Clon 6: 8.5 x 10^{-3} (53 x aumento)

Clon 13: 0.019 (116 x aumento)

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Los clones 2, 4, 5, 6 y 13 pueden usarse como los sustratos en sustratos en vueltas posteriores de mezcla, si se desean más mejoras en recA. No todas las variaciones de la secuencia de recA de tipo salvaje necesariamente contribuyen al fenotipo hiper-recombinogénico. Variaciones silenciosas pueden ser eliminadas mediante cruzados de vuelta. De modo alternativo, variantes de recA que incorporan puntos individuales de variación de tipo salvaje de condones 5, 18, 156, 190, 236, 268, 271, 283, 304, 312, 317, 345 y 353 pueden ser testadas para actividad.

2. Evolución del Organismo Completo para Hiper-Recombinación

La posibilidad de selección para una variedad E. coli con un nivel aumentado de recombinación se indicó a partir de fenotipos de variedades de tipo salvaje, \DeltarecA, mutS y ArecA mutS seguidos de exposición a mitomicina C- un agente de unión cruzada de intertrenzado de ADN.

La exposición de E. coli a mitomicina C causa unión cruzada de Intertrenzado de ADN bloqueando de este modo la réplica de ADN. La reparación de las uniones cruzadas de intertrenzado ADN en E. coli se da a través de la ruta de reparación recombinacional dependiente de RecA (Friedberg et al., en DNA Repair and Mutagenesis (1995) pp. 191-232). El procesamiento de uniones cruzadas durante la reparación da como resultando ocasionales roturas de ADN de doble trenzado, que también son reparadas por la ruta recombinacional dependiente de RecA. De este modo, las variedades de RecA son notablemente más sensibles que las variedades de tipo salvaje a la exposición de mitomincina C. De hecho, mitomicina C se emplea en simples ensayos de sensibilidad al disco para diferenciar entre variedades RecA^{+} y RecA^{-}.

Además de sus propiedades recombinogénicas, mitomicina C es un mutagen. La exposición a agentes que dañan el ADN, como mitomicina C, normalmente resulta en la introducción del regulón SOS de E. coli que incluye productos involucrados en la reparación de decúbito prono de error del daño ADN (Friedberg et al., 1995, supra, en pp. 465-522).

Tras transducción phage generalizada mediada por P-1 del \Delta (recA-sr1): transductantes de Tn10 allele (un allele no funcional) en tipo salvaje y muts E. coli, resistentes a tetraciclina se analizaron para un fenotipo recA usando el ensayo de sensibilidad de mitomicina C. Se observó que las capas con un disco de ¼ de pulgada saturado con 10 \mug de mitomicina C seguido de 48 horas a 37°C, crecimiento de las variedades de tipo salvaje y muts se inhibió dentro de una región con un radio de aproximadamente 10 mm desde el centro del disco. La unión cruzada de ADN a altos niveles de mitomicina C satura la reparación recombinaciónal resultando en bloqueo letal de réplica de ADN. Ambas variedades otorgaron un ascenso a la colonia ocasional formando unidades dentro de la zona de inhibición, a pesar de que la frecuencia de colonias fue 10-20 veces más alta en la variedad mutS. Esto presumiblemente se debe a la tasa aumentada de mutación espontánea de fondos mutS. Una comparación que se realizó uno al lado del otro demostró que las variedades ARecA y ARecA mutS eran considerablemente más sensibles a mitomicina C con crecimiento inhibido en una región que se extiende sobres sus mm a partir del centro del disco. Sin embargo, a diferencia de las variedades recA^{+}, no se observaron individuos Mitr dentro de la región de inhibición de crecimiento- ni siquiera en el fondo mutS. La aparición de individuos Mit^{r} en fondos recA^{+}, pero no en fondos \DeltarecA indica que Mi^{r} es dependiente de una proteína Rec^{A} funcional y sugiere que Mit^{r} podría resultar de una capacidad aumentada para reparación recombinacional de daño provocado por mitomicina C.

Las mutaciones que llevan a la capacidad aumentada para reparación recombinacional mediado por RecA puede ser diverso, inesperado, desenlazado, y potencialmente sinergético. Un protocolo recursivo que alterna la selección de Mit^{r} y la mezcla de cromosomas desarrolla las células individuales con una capacidad dramáticamente mayor para la recombinación.

El protocolo recursivo es como se describe a continuación. Tras ala exposición de una variedad mutS a mitomicina C, individuos Mit^{r} son acumulados y cruzados (p. ej., mediante la mezcla de cromosomas mediada por Hfr o transducción generalizada de corte-acumulación). Alleles que resultan en Mit^{r} y que presumiblemente resultan en una capacidad aumentada para reparación recombinacional se mezclan entre la población ante la ausencia de reparación de desequilibrio. Además, la reparación por error decúbito prono seguido de la exposición a mitomicina C puede introducir nuevas mutaciones para la siguiente vuelta de mezcla. El proceso se repite utilizando de manera ascendente exposiciones más rigurosas a mitomicina C. Una serie de selecciones paralelas en la primera vuelta sirve como medio para generar una variedad de alleles. De modo opcional, la recombinogenicidad de aislados puede ser controlada por hiper-recombinación usando un ensayo plásmido x plásmido o un ensayo cromosoma x cromosoma. (p. ej., de Honrad, J. Bacteriol. 130, 167-172 (1977)).

3. Mezcla del Genoma Completo de Streptomyces coelicolor

Para demostrar que la mutación recursiva y la recombinación de un genoma completo puede usarse para mejorar un fenotipo particular, S. coelicolor estás siendo mezclada de manera recursiva a solas y en compañía del pariente cercano S. lividans para mejorar la producción total de pigmento azul \gamma-actinorhodina. Esta estrategia de mejora de variedad está siendo comparada con un programa de mejora similar de variedad que no incluye recombinación.

Las suspensiones de esporas de S. coelicolor y S. lividans están suspendidas en agua estéril y se someten a mutagénesis UV (600 unidades de "energía") empleando un Stratalinker (Stratagen), y los mutantes resultantes "crecen" en esporulación agar. Se recogen las esporas y se colocan en un medio sólido RG-2 (Bystrykh et al., J. Bact. 178, 2238-2244 (1996)). Las colonias que producen halos más grandes y oscuros de pigmento azul son seleccionadas y crecen en el medio líquido RG-2, y la cantidad de \gamma-actinorhodina producida se determina de manera espectrofotometrical midiendo la absorción de 650 nm de sobrenadantes de cultivo de alcalina usando un formato microtitreplaca. La concentración del pigmento y la estructura son además confirmadas por LC/MS, MS/MS y/o NMR. Las células que producen \gamma-actinorhodina a niveles superiores que las de tipo salvaje van avanzando hacia el programa de mejora de variedad. Las esporas aisladas de cada uno de los mutantes son 1) de nuevo mutagenizadas y analizadas como se ha explicado anteriormente o 2) crecen, se preparan como protoplastos, y se fusionan. Procedimientos para la preparación y fusión de protoplastos Streptomyces se describen en Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual (Hopwood, D. A et al.). Los protoplatos regenerados fusionados se analizan como se ha descrito anteriormente para clones que han sufrido recombinación que producen \gamma-actinorhodina a niveles más elevados que las células que se han fusionado. Los clones seleccionados son sometidos de nuevo a mutagénesis UV y el análisis y recombinación se repiten de manera recursiva hasta que se alcanza el nivel deseado de producción de \gamma-actinorhodina.

Claims (15)

1. Un método in vitro para desarrollar una célula bacterial o archaebacterial para adquirir una propiedad deseada, que comprende:

(1)

formar protoplastos de una población de células bacteriales o archaebacteriales diferentes;

(2)

fusionar los protoplastos para forma protoplastos híbridos, en los cuales los genomas de los protoplastos se recombinan para formar genomas híbridos;

(3)

incubar los protoplastos híbridos bajo condiciones que potencien la recombinación de células;

(4)

seleccionar o analizar con el fin de aislar células regeneradas que hayan evolucionado hacia la adquisición de la propiedad deseada;

(5)

pasos recurrentes (1)-(4) con las células regeneradas del paso (4) usadas para formar el protoplasto en el paso (1) hasta que las células regeneradas hayan adquirido la propiedad deseada.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende el paso de seleccionar o analizar los protoplastos fusionados libres de los protoplastos no fusionados con genomas parentales.

3. El método de la reivindicación 1, que además comprende la selección y análisis para aislar células regeneradas con genomas híbridos libres de células con genomas parentales.

4. El método de la reivindicación 1, donde una primera subpoblación de células contienen un primer marcador y la segunda subpoblación de células contiene un segundo marcador, y el método además comprende la selección y análisis para identificar células regeneradas que expresan tanto el primer marcador como el segundo.

5. El método de la reivindicación 4, donde el primer marcador es un marcador de membrana y el segundo marcador es un marcador genético.

6. El método de la reivindicación 4, donde el primer marcador es una primera subunidad de una enzima heteromérica y el segundo marcador es una segunda subunidad de la enzima heteromética.

7. El método de la reivindicación 1, que además comprende la transformación de protoplastos con una biblioteca de fragmentos de ADN en al menos un ciclo.

8. El método de la reivindicación 7, donde los fragmentos de ADN están acompañados por una enzima de restricción.

9. El método de la reivindicación 1, que además comprende la exposición de los protoplastos a radiación ultravioleta durante al menos un ciclo.

10. El método de la reivindicación 1, donde la propiedad deseada es la expresión de una proteína o metabolito secundario, o la secreción de una proteína o metabolito secundario.

11. El método de la reivindicación 10, donde el metabolito secundario es taxol.

12. El método de la reivindicación 1, que además comprende la exposición de los protoplastos a un agente mutagénico durante al menos un ciclo.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la subpoblación de diferentes células son células bacteriales.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde las diferentes células son células de Streptomyces sp.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, donde las células de un Streptomyces sp. son Streptomyces coelicolor o Streptomyces lividans.

16 Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la subpoblación de diferentes células son células archaebacteriales.