JP2003174881A - ランダムフラグメント化および再組立によるｄｎａ変異誘発 - Google Patents

ランダムフラグメント化および再組立によるｄｎａ変異誘発

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 変異タンパク質を生成する方法、および容易
にサーチされる変異核酸配列の大規模ライブラリーの開
発方法の提供。 【解決手段】 ランダムフラグメント化後のＤＮＡ再組
立のための方法、およびインビトロまたはインビボにお
ける組換えによる核酸配列の変異誘発のためのその適用
を開示する。詳細には、変異タンパク質をコードする核
酸フラグメントまたはポリヌクレオチドの生成のための
方法を開示する。本発明はまた、タンパク質のインビト
ロまたはインビボにおける直接的な分子進化を可能にす
る変異誘発、再編成および選択の反復サイクルの方法に
関する。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、所望の表現型を与
えるポリヌクレオチドおよび／または選択可能な有利な
予め決定された特質を有するタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドの生成のための方法に関する。１つの局
面において、本方法は変異タンパク質をコードする核酸
フラグメントを生成および選択するために使用される。 【０００２】 【従来の技術】生体高分子（例えば、タンパク質、ＤＮ
Ａなど）の活性配列の複雑さは、その情報内容（ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）（「ＩＣ」；５−
９）と呼ばれている。タンパク質の情報内容はアミノ酸
配列変異に対する活性タンパク質の抵抗性として定義さ
れ、同様の機能を有する関連配列のファミリーを記載す
るために必要な最少数の不変アミノ酸（ビット）から算
定される（９、１０）。ランダムな変異誘発に感受性で
あるタンパク質は、高い情報内容を有する。１９７４年
に、この定義が作製された際、タンパク質の多様性は、
分類上の多様性としてしか存在していなかった。 【０００３】分子ライブラリーのような分子生物学の発
達は、かなり多数の変異しやすい塩基の同定、およびラ
ンダムなライブラリーからの機能配列の選択さえ可能に
してきた。大部分の残基が、典型的に全てが同時にでは
ないにしても、変異され得、配列の前後関係（ｃｏｎｔ
ｅｘｔ）の変化を補うことに依存している。従って、１
００アミノ酸のタンパク質は、２，０００個の異なる変
異しかを含まないが、２０100通りの可能な変異の組み
合わせを包含する。 【０００４】情報密度は、配列の単位長当たりの情報内
容である。酵素の活性部位は高い情報密度を有する傾向
がある。対照的に、酵素における可変リンカー（ｆｌｅ
ｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）は低い情報密度を有する
（８）。 【０００５】実験室形式で変異タンパク質を作製するた
めに現在広く用いられている方法は、誤りがち（ｅｒｒ
ｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（１１、１
２、１９）およびカセット変異誘発（８、２０、２１、
２２、４０、４１、４２）であり、これらの方法では最
適化しようとする特定の領域が、合成上で変異誘発され
るオリゴヌクレオチドで置換される。どちらの場合も、
「変異体曇り（ｍｕｔａｎｔ ｃｌｏｕｄ）」（４）
は、元の配列における特定の部位の周囲で生成される。 【０００６】誤りがちなＰＣＲは、長い配列にわたって
ランダムに低レベルの点変異を誘導するために、低適合
性の重合条件を使用する。誤りがちなＰＣＲは、未知の
配列のフラグメントの混合物を変異誘発するために使用
され得る。しかし、コンピューターによるシュミレーシ
ョンは、点変異単独では、しばしばあまりにも緩やか
で、連続した配列進化に必要とされるブロック変化が可
能でない場合もあることを示唆した。公表されている誤
りがちなＰＣＲプロトコルは、０．５ｋｂ〜１．０ｋｂ
より大きいのＤＮＡフラグメントの増幅が不可能で、そ
れらの実際的な適用は限られている。さらに、誤りがち
なＰＣＲの反復サイクルは、中立変異の蓄積を導き、こ
れは例えば、タンパク質を免疫原性にし得る。 【０００７】オリゴヌクレオチド直接変異誘発では、短
い配列が合成上で変異誘発されるオリゴヌクレオチドで
置換される。このアプローチは遠位変異の組み合わせを
生成せず、従って組み合わせではない。莫大な配列長に
関する制限されたライブラリーサイズは、タンパク質の
最適化のために多数回の選択が避けられないことを意味
する。合成オリゴヌクレオチドを用いる変異誘発には、
各回の選択の後に、個々のクローンの配列決定をし、次
いでファミリーに分類して、単一のファミリーを任意に
選択し、そしてファミリーをコンセンサスモチーフに縮
小する必要がある。このコンセンサスモチーフは再合成
され、そして単一の遺伝子中へ再挿入さた後にさらなる
選択を行う。このプロセスは統計的なボトルネック（ｓ
ｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ）を構成
し、多数回の変異誘発のためにはこのプロセスは労働力
を必要とし、そして実際的でない。 【０００８】従って、誤りがちなＰＣＲおよびオリゴヌ
クレオチド直接変異誘発は、単一サイクルの配列微調整
には有用であるが、多数サイクルに適用する場合、直ち
に制限されるようになる。 【０００９】誤りがちなＰＣＲは未知の配列のフラグメ
ントの混合物を変異誘発するために使用され得る（１
１、１２）。しかし、公表されている誤りがちなＰＣＲ
プロトコル（１１、１２）は、ポリメラーゼの低いプロ
セシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を受ける。
従って、このプロトコルは平均的なサイズの遺伝子のラ
ンダムな変異誘発を生じ得ない。このように能力がない
ことによって、誤りがちなＰＣＲの実際的な適用が制限
される。 【００１０】誤りがちなＰＣＲのもう１つの重大な制限
は、配列の情報内容に伴って下流変異の速度が増すこと
である。ある情報内容、ライブラリーのサイズ、および
変異誘発速度、下流変異の上流変異に対するバランス
は、統計的に、さらなる改良の選択を阻害する（統計的
最高限度）。 【００１１】最後に、誤りがちなＰＣＲの反復サイクル
はまた、中立変異の蓄積を導き、例えば、免疫原性に影
響し得るが、結合アフィニティーには影響しない。 【００１２】従って、誤りがちなＰＣＲは、あまりにも
緩やかで連続した配列進化に必要とされるブロック変化
が可能でないことが見出された（１、２）。 【００１３】カッセット変異誘発において、単一の鋳型
の配列ブロックは、代表的に、（部分的に）ランダム化
された配列により置換される。従って、得られる最大情
報内容は、ランダムな配列の数（すなわち、ライブラリ
ーのサイズ）により統計学的に制限される。このことは
統計的なボトルネックを構成し、現在のところ最適では
ないが、より長期間のポテンシャルを有し得る他の配列
ファミリーを排除する。 【００１４】さらに、合成オリゴヌクレオチドでの変異
誘発は、各回の選択の後に個々のクローンの配列決定を
必要とする（２０）。従って、このアプローチは時間が
かかり、そして多数回の変異誘発には実際的でない。 【００１５】従って、誤りがちなＰＣＲおよびカセット
変異が最も適しており、そして比較的低い情報内容の範
囲を微調整するために広く使用されてきた。１つの明白
な例外は、誤りがちなＰＣＲによる多数回の増幅および
選択を用いる、ランダムライブラリーからのＲＮＡリガ
ーゼリボザイムの選択である（１３）。 【００１６】直鎖状の生物学的組換え配列（例えば、タ
ンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡ）の設計のための手段
は、天然に発達してきた手段ほど強力ではないことが、
ますます明らかになっている。より良い変異体を見出す
ことは、より広いライブラリー内でより多くの配列をサ
ーチすることに依存しており、変異誘発性の増幅および
選択のサイクルの数を増加することが必要である。しか
し、上記のように、広く用いられている現在の変異誘発
方法には、反復サイクルのために使用される場合、明ら
かに制限がある。 【００１７】大部分の生物の進化は自然淘汰および有性
生殖により生じる。有性生殖は選択された個体の子孫の
遺伝子を混合および結合することを確実にする。減数分
裂の間、親由来の相同染色体を互いに並べ、そしてそれ
らの長さに沿って交差することによって、遺伝子物質を
交換する。このようなＤＮＡの交換（ｓｗａｐｐｉｎ
ｇ）または再編成（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）は、生物体が
より迅速に進化することを可能にする（１、２）。有性
生殖において、挿入される配列は同種環境内で有用性が
証明された配列なので、一旦配列が新しい配列中へ挿入
されても、実質的な情報内容を有する傾向がある。 【００１８】Ｍａｒｔｏｎら（２７）は、直線的な反復
配列を有するプラスミドにおける組換えをモニターする
ための、インビトロにおけるＰＣＲの使用について記載
している。Ｍａｒｔｏｎらは、ＤＮＡの切断またはニッ
キング（ｎｉｃｋｉｎｇ）の結果として、ＰＣＲ中に組
換えが生じることを開示している。これにより組換え分
子が生じる。Ｍｅｙｅｒｈａｎｓら（２３）もまた、イ
ンビトロにおけるＰＣＲ中にＤＮＡ組換えが存在するこ
とを開示している。 【００１９】用語、適用された分子進化（「ＡＭＥ」）
は、進化上の設計アルゴリズムの特定の有用な目的に対
する適用を意味する。ＡＭＥのための多くの異なるライ
ブラリー形式が、ポリヌクレオチド（３、１１−１
４）、ペプチドおよびタンパク質（ファージ（１５−１
７）、ｌａｃＩ（１８）およびポリソームについて報告
されてきたが、これらの形式においは、いずれも、組み
合わせライブラリーを故意に作製するためのランダムな
交差による組換えを使用していない。 【００２０】理論的には、１００アミノ酸のタンパク質
には２，０００通りの異なる個々の変異体が存在する。
１００個アミノ酸からなるタンパク質は、２０100通り
の可能な変異の組み合わせを有するが、数が多すぎるの
で、従来の方法では徹底的に調査し得ない。これらの可
能な結合変異（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉ
ｏｎ）の全てを生成およびスクリーニングすること可能
にするようなシステムを開発することは有益である。 【００２１】Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らは（４
３，４４）は、ファージシステムでの発現のために、イ
ンビボ部位特異的組換えシステムを利用してＬ鎖抗体の
遺伝子とＨ鎖抗体の遺伝子とを結合した。しかし、彼ら
のシステムは組換えの特異的部位に依存しており、それ
ゆえ制限される。Ｈａｙａｓｈｉら（４８）は、重複伸
長およびＰＣＲによる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）における抗
体ＣＤＲ領域の同時変異誘発を報告している。 【００２２】Ｃａｒｅｎら（４５）はランダムなインビ
ボ組換えを使用する大規模集団の多重変異体を生成する
方法を記載している。しかし、彼らの方法は、プラスミ
ドの２つの異なるライブラリーの組み換えを必要として
おり、各ライブラリーは異なる選択マーカーを有してい
る。従って、方法は存在する選択マーカーの数に等しい
限られた数の組換えに制限され、そして選択された配列
（１つまたは複数）に連結するマーカー遺伝子の数を同
時に直線的に増加する。 【００２３】Ｃａｌｏｇｅｒｏら（４６）およびＧａｌ
ｉｚｚｉら（４７）は、相同であるがプラスミド上で端
を切り取った２つの昆虫トキシン遺伝子でのインビボ組
換えによりハイブリッド遺伝子を生成し得ることを報告
している。Ｒａｄｍａｎら（４９）は、欠損型ミスマッ
チ修復酵素を有する宿主細胞において、実質的にミスマ
ッチなＤＮＡ配列のインビボ組換えによりハイブリッド
分子が形成されることを報告している。 【００２４】 【発明が解決しようとする課題】変異タンパク質を生成
する方法を開発することは有益であり、その方法は容易
にサーチされる変異核酸配列の大規模ライブラリーの開
発を可能にするであろう。 【００２５】本発明のさらなる利点については、添付の
図面を参考にして、本発明の以下の記載から明らかにな
ろう。 【００２６】 【課題を解決するための手段】本発明は、選択されるポ
リヌクレオチド配列または選択されるポリヌクレオチド
配列の集団を、代表的には増幅されたポリヌクレオチド
および／またはクローニングされたポリヌクレオチドの
形態において生成する方法に関し、それによって選択さ
れたポリヌクレオチド配列（１つまたは複数）は、選択
され得る所望の表現型の特徴（例えば、ポリペプチドを
コードする、連結されたポリヌクレオチドの転写を促進
する、タンパク質に結合するなどの特徴）を有する。所
望の構造または機能的特性（例えば、予め決定された生
体高分子（例えば、レセプター）への結合）を有するポ
リペプチドを同定する１つの方法は、ポリペプチドの大
規模ライブラリーを、ポリペプチドのアミノ酸配列によ
り与えられる所望の構造または機能的特性を有する個々
のライブラリーメンバーについてスクリーニングするこ
とを包含する。 【００２７】本発明は、アフィニティー相互作用スクリ
ーニングまたは表現型スクリーニングに適切なディスプ
レイされたポリペプチドまたはディスプレイされた抗体
のライブラリーを生成する方法を提供する。本方法は、
（１）ディスプレイされたポリペプチドまたはディスプ
レイされた抗体、および上記のディスプレイされたポリ
ペプチドまたはディスプレイされた抗体をコードする関
連性ポリヌクレオチドを含む第１の複数の選択されたラ
イブラリーメンバーを得、そして上記の関連性ポリヌク
レオチドまたはそのコピーを得る工程であって、ここで
上記の関連性ポリヌクレオチドが実質的に同一の配列の
領域を包含し、必要に応じて上記のポリヌクレオチドま
たはコピーに変異を導入する工程、および（２）代表的
にはランダムに上記の関連性ポリヌクレオチドまたはコ
ピーをプールし、そしてフラグメント化してＰＣＲ増幅
に適する条件下でそのフラグメントを形成し、ＰＣＲ増
幅および必要に応じて変異誘発を実施し、それにより上
記フラグメントを相同的に組換えて、組換えポリヌクレ
オチドの再編成プールを形成し、それによって上記再編
成プールの組換えポリヌクレオチドの実質的画分（例え
ば、１０％を超える）が、第１の複数の選択されたライ
ブラリーメンバー中に存在せず、上記再編成プールは、
アフィニティー相互作用スクリーニングに適切であるデ
ィスプレイされたポリペプチドまたはディスプレイされ
た抗体のライブラリーを構成する工程を包含する。必要
に応じて、本方法は再編成プールのライブラリーメンバ
ーをスクリーニングするさらなる工程を包含し、予め決
定された高分子（例えば、タンパク質性レセプター、ペ
プチド、オリゴ糖、ビリオン、または他の予め決定され
た化合物または構造）と結合または相互作用する能力を
有する個々の再編成ライブラリーメンバー（例えば、触
媒性抗体）を同定する。このようなライブラリーから同
定されるディスプレイされたポリペプチド、抗体、ペプ
チド類似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）抗体、お
よび可変領域配列は、治療、診断、研究、および関連す
る目的（例えば、触媒、水性溶液の浸透性を増加するた
めの溶質など）のために使用され得、および／または再
編成選択および／またはアフィニティー選択の１回以上
のさらなるサイクルを受け得る。方法は、選択の工程
が、予め決定された分子に対する結合アフィニティー以
外の表現型の特徴（例えば、触媒活性、安定性、酸化抵
抗性、薬物耐性、または宿主細胞上で与えられる検出可
能な表現型）を対象とするように改変され得る。 【００２８】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーは、フラグメント化さ
れ、そしてインビトロにおいてＰＣＲにより相同的に組
換えられる。 【００２９】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーは、インビトロにおい
てフラグメント化され、得られるフラグメントを宿主細
胞または生物体へ移し、そして相同組換えされ、インビ
ボにおける再編成ライブラリーのメンバーを形成する。 【００３０】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーは、エピソーム的に複
製可能なベクター上でクローニングまたは増殖され、上
記多様なベクターは細胞へ移され、そして相同組換えさ
れ、インビボにおける再編成ライブラリーのメンバーを
形成する。 【００３１】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーはフラグメント化され
ないが、直線的な反復としてエピソーム的に複製可能な
ベクター上でクローニングまたは増殖され、各反復は、
選択されたライブラリーのメンバー配列の異なる種を包
含しており、上記ベクターは細胞内へ移され、そしてベ
クター内の組換えにより相同組換えされ、インビボにお
ける再編成ライブラリーのメンバーを形成する。 【００３２】ある実施態様において、インビトロにおけ
る再編成およびインビボにおける再編成の組み合わせ
が、組み合わせの多様性を増強するために提供される。 【００３３】本発明はアフィニティー相互作用スクリー
ニングに適するディスプレイされた抗体のライブラリー
を生成する方法を提供する。本方法は、（１）ディスプ
レイされた抗体、および上記のディスプレイされた抗体
をコードする関連性ポリヌクレオチドを含む第１の複数
の選択されるライブラリーメンバーを得、そして上記の
関連性ポリヌクレオチドまたはそのコピーを得る工程で
あって、ここで上記の関連性ポリヌクレオチドが実質的
に同一な可変領域のフレームワーク（ｆｒａｍｅ ｗｏ
ｒｋ）配列の領域を包含する工程、および（２）上記の
関連性ポリヌクレオチドまたはコピーをプールし、そし
てフラグメント化してＰＣＲの増幅に適する条件下でそ
のフラグメントを形成し、それにより上記フラグメント
を相同組換して、ＣＤＲの新規な組み合わせを包含する
組換えポリヌクレオチドの再編成プールを形成し、それ
によってＣＤＲの組み合わせを包含する上記再編成プー
ルの組換えポリヌクレオチドの実質的画分（例えば、１
０％を超える）が、第１の複数の選択されるライブラリ
ーメンバー中に存在せず、上記再編成プールは、ＣＤＲ
の並べ替えを含み、そしてアフィニティー相互作用スク
リーニングに適切であるディスプレイされた抗体のライ
ブラリーを構成する工程を包含する。必要に応じて、再
編成プールは予め決定されたエピトープ（抗原）に結合
する再編成ライブラリーメンバーを選択するために、ア
フィニティースクリーニングを受け、それゆえ複数の選
択される再編成ライブラリーのメンバーを選択する。必
要に応じて、複数の選択される再編成ライブラリーのメ
ンバーは、１〜約１０００サイクルまたは所望の結合ア
フィニティーを有するライブラリーメンバーが得られる
まで、所望により、繰り返し再編成およびスクリーニン
グされ得る。 【００３４】従って、本発明の１つの局面では、１つ以
上の変異を鋳型２本鎖ポリヌクレオチド中へ導入する方
法が提供される（ここで鋳型２本鎖ポリヌクレオチドは
所望のサイズのランダムフラグメントに切断される）。
本方法は、１つ以上の１本鎖または２本鎖オリゴヌクレ
オチドを、得られる２本鎖フラグメントの集団に添加す
る工程であって、ここで上記オリゴヌクレオチドは鋳型
ポリヌクレオチドに同一な範囲および非相同な範囲含
む、工程；２本鎖のランダムフラグメントおよびオリゴ
ヌクレオチドの得られる混合物を１本鎖フラグメントに
変性する工程；上記１本鎖フラグメント間の同一の領域
で上記１本鎖フラグメントがアニールし、そして変異誘
発された２本鎖ポリヌクレオチドを形成する条件下で、
得られる１本鎖フラグメントの集団をポリメラーゼとと
もにインキュベートする工程；および所望により上記の
工程を反復する工程によってなされる。 【００３５】別の局面において、本発明は、野生型タン
パク質をコードする２本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含有
するサンプルを、上記鋳型ポリヌクレオチドを所望のサ
イズのランダムな２本鎖フラグメントに切断することを
提供する条件下で処理する工程；１つ以上の１本鎖また
は２本鎖オリゴヌクレオチドを、得られるランダムフラ
グメントの集団に添加する工程であって、ここで上記オ
リゴヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドに同一な範囲
または非相同範囲を包含する、工程；２本鎖のフラグメ
ントおよびオリゴヌクレオチドの得られる混合物を１本
鎖フラグメントに変性する、工程；同一な範囲で上記１
本鎖フラグメントがアニールし、そして変異誘発された
２本鎖ポリヌクレオチドを形成する条件下で、得られる
１本鎖フラグメントの集団をポリメラーゼとともにイン
キュベートする工程；所望により上記の工程を反復する
工程；次いで、変異誘発された２本鎖ポリヌクレオチド
配列から組換えタンパク質を発現する工程により、生物
学的活性を有する組換えタンパク質を生成する方法に関
する。 【００３６】本発明の第３の局面は、異なる２本鎖鋳型
ポリヌクレオチドをを含有するサンプルを処理する工程
であって、ここで上記の異なる鋳型ポリヌクレオチドが
上記鋳型ポリヌクレオチドを所望のサイズのランダムな
２本鎖フラグメントに切断ことを提供する条件下で、同
一な範囲および非相同な範囲を包含する、工程；処理サ
ンプル中に含有の得られるランダムな２本鎖フラグメン
トを１本鎖フラグメントに変性する工程；同一な範囲で
該１本鎖フラグメントがアニールし、そして鋳型ポリヌ
クレオチド配列を含有するキメラな２本鎖ポリヌクレオ
チド配列を形成する条件下で、得られる１本鎖フラグメ
ントの集団をポリメラーゼとともにインキュベートする
工程に；および所望により上記の工程を反復する工程に
より、キメラなポリヌクレオチドを得る方法に関する。 【００３７】本発明の第４の局面は、インビトロにおい
て、１本鎖鋳型ポリヌクレオチドと、鋳型ポリヌクレオ
チドを切断および変性することにより得られるランダム
な１本鎖小フラグメントとを結合することにより、鋳型
ポリヌクレオチドを複製し、そして２本鎖鋳型ポリヌク
レオチドの集団が形成されるような条件下、核酸ポリメ
ラーゼの存在下で上記核酸フラグメントの混合物をイン
キュベートする方法に関する。 【００３８】本発明はまた、ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドおよび／または転写調節配列を含有す
るポリヌクレオチドを再編成するために、インビトロお
よび／またはインビボにおけるポリヌクレオチド再編成
の使用を提供する。 【００３９】本発明はまた、ウイルス遺伝子（例えば、
キャプシドタンパク質、スパイク糖タンパク質、ポリメ
ラーゼ、プロテアーゼなど）またはウイルスゲノム（例
えは、パラミキソウイルス（例えば、ｐａｒａｍｙｘｏ
ｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミキソウイルス（ｏｒｔｈｏ
ｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス、レトロ
ウイルス、レオウイルス、ライノウイルスなど）の集団
を再編成するために、ポリヌクレオチド再編成の使用を
提供する。ある実施態様において、本発明は免疫原ウイ
ルスタンパク質の全てまたは一部をコードする配列を再
編成して、新規の組み合わせのエピトープおよび組換え
により作製される新規のエピトープを生成する方法を提
供し、このような再編成されたウイルスタンパク質は、
ウイルス進化の結果として天然の環境において生じがち
なエピトープまたはエピトープの組み合わせを包含し得
る（例えば、インフルエンザウイルス株の組換えな
ど）。 【００４０】本発明はまた、遺伝子治療ベクター、およ
びヒト遺伝子治療のために使用され得る複製能欠損の遺
伝子治療構築物（ＤＮＡに基づくワクチン注射のための
ワクチン注射ベクター、および抗新生物遺伝子治療なら
びに他の遺伝子治療形式を含むが、これらに限定されな
い）を生成するためのポリヌクレオチド配列の再編成に
適した方法を提供する。 【００４１】 【発明の実施の形態】本発明は、ＤＮＡ配列の変異誘発
のためのランダムフラグメント化およびその適用後に、
核酸分子を再組立する方法に関する。増強される生物学
的活性を有する変異タンパク質をコードする核酸フラグ
メントを生成する方法もまた記載される。特に、本発明
はまた、増強された生物学的活性を有する変異タンパク
質の作製を可能にする変異誘発、核酸の再編成および選
択の反復サイクルの方法に関する。 【００４２】本発明はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク
質変異体の非常に大規模なライブラリーを生成する方法
に関する。この方法は、所望の核酸フラグメント（１つ
または複数）が選択され得る関連のあるＤＮＡフラグメ
ントの生成において特定の利点を有する。特に本発明は
また、増強された生物学的活性を有する変異タンパク質
作製を可能にする変異誘発、相同組換えおよび選択の反
復サイクルの方法に関する。 【００４３】しかし、本発明をさらに詳細に考察する前
に、まず以下の用語について定義する。 【００４４】（定義）本明細書で使用される以下の用語
は、以下の意味を有する：用語「ＤＮＡ再組立」は、同
一の配列の間で組換えが生じる場合に使用される。 【００４５】対照的に、用語「ＤＮＡ再編成」は、実質
的に相同であるが同一ではない配列の間の組換えを示す
ために本明細書で使用され、いくつかの実施態様におい
て、ＤＮＡ再編成は非相同な組換え（例えば、ｃｒｅ／
ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔシステムなど）を
介する交差を含み得る。 【００４６】用語「増幅」は、核酸フラグメントのコピ
ー数が増加されることを意味する。 【００４７】用語「同一な」または「同一」は、２つの
核酸配列が同じ配列または相補的な配列を有することを
意味する。従って、「同一の範囲」は、核酸フラグメン
トまたはポリヌクレオチドの領域または範囲が別のポリ
ヌクレオチドまたは核酸フラグメントに同一または相補
的であることを意味する。 【００４８】用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配
列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分に相
同である（すなわち同一であり、厳密には進化的に関連
しない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプ
チド配列に同一であることを意味するために本明細書に
おいて使用される。対照的に、用語「相補する」は、相
補的な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一
部分に相同であることを意味するために本明細書で使用
される。例えば、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列
「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴ
Ａ」に相補的である。 【００４９】以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチ
ド間での配列の関係を記載するために使用される：「参
照配列」、「比較領域（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎ
ｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセン
テージ」、および「実質的同一性」。「参照配列」は、
配列比較のための基本として使用される規定の配列であ
る；参照配列は、より大きな配列のサブセット（例え
ば、配列表に示される全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の
セグメント（例えば、図１または図２（ｂ）のポリヌク
レオチド配列））であり得、または参照配列は完全なｃ
ＤＮＡまたは遺伝子配列を含有し得る。一般的に、参照
配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、頻繁
には少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、そして
しばしば少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２
つのポリヌクレオチドが、それぞれ（１）２つのポリヌ
クレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌク
レオチド配列の一部分）を含有し得、そして（２）２つ
のポリヌクレオチド間で互いに一致しない配列をさらに
含有し得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレ
オチド間の配列比較は、代表的には、「比較領域」にわ
たる２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによ
り実施され、配列が類似する局所領域を同定および比較
する。 【００５０】本明細書で使用される「比較領域」は、少
なくとも２０の隣接するヌクレオチドの位置の概念のセ
グメントをいい、ここでポリヌクレオチド配列が少なく
とも２０の隣接するヌクレオチドの参照配列と比較され
得、そしてここでは比較領域におけるポリヌクレオチド
配列の部分が、２つの配列の最適アラインメントのため
に、参照配列（付加または欠失を含まない）に比べて２
０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み
得る。比較領域を並べるための、配列の最適なアライン
メントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ （１９
８１） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局
所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎおよ
びＷｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム
により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ （１９８
８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．
Ｓ．Ａ．） ８５：２４４４の類似度方法に関するサー
チにより、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇ
ｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧＡＰ、
ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）の
コンピュータ実行により、または検査により行われ得、
そして種々の方法により生成される最も良いアラインメ
ント（すなわち、比較領域にわたる最も高い相同性パー
センテージを与える）が、選択される。 【００５１】用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレ
オチド配列が比較領域にわたって同一である（すなわ
ち、１ヌクレオチドずつに基づいて）ことを意味する。
用語「配列同一性のパーセンテージ」は、最適に並べら
れた２つの配列を比較領域にわたって比較し、同一の核
酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両
方の配列において生じる位置の数を測定し、一致した位
置の数を得、一致した位置の数を比較の領域における位
置の全体数（すなわち、比較サイズ）で割り、そして結
果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得
ることにより、算定される。本明細書で使用される用語
「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示
し、ここではポリヌクレオチドは、少なくとも２０の隣
接するヌクレオチド位置の比較領域にわたり、頻繁には
少なくとも２５〜５０ヌクレオチドの領域にわたり参照
配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ま
しくは少なくとも８５％の同一性、そしてしばしば９０
％〜９５％パーセントの配列同一性、最も通常には少な
くとも９９％の配列同一性を有する配列を包含し、ここ
では配列同一性のパーセンテージは、ポリヌクレオチド
配列を参照配列と比べることにより算定され、このヌク
レオチド配列は、比較領域にわたり、全体で参照配列の
２０％以下の欠失または付加を含み得る。 【００５２】保存的アミノ酸置換は、類似側鎖を有する
残基の互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミ
ノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル
側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオ
ニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグルー
プはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖
を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チ
ロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有
するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、および
ヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミ
ノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。
好ましい保存的アミノ酸の置換グループは：バリン−ロ
イシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、
リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパ
ラギン−グルタミンである。 【００５３】用語「相同」または「同種（ｈｏｍｅｏｌ
ｏｇｏｕｓ）」は、ある１本鎖核酸配列が相補的な１本
鎖核酸配列にハイブリダイズし得ることを意味する。ハ
イブリダイゼーションの程度は配列間の同一性の量およ
びハイブリダイゼーション条件（例えば、後述するよう
な温度および塩濃度）を包含する多数の要素に依存し得
る。好ましくは同一な領域は約５ｂｐより多くであり、
より好ましくは同一な領域は１０ｂｐより多くである。 【００５４】用語「非相同」は、ある１本鎖核酸配列が
別の１本鎖核酸配列またはその相補鎖にハイブリダイズ
し得ないことをいう。従って非相同な範囲は、核酸フラ
グメントまたはポリヌクレオチドが、別の核酸またはポ
リヌクレオチドにハイブリダイズし得ない範囲または領
域を配列中に有することを意味する。このような領域ま
たは範囲は、例えば、変異の範囲である。 【００５５】本明細書で使用される用語「同族」は、種
間で進化的におよび機能的に関連付けられる遺伝子配列
をいう。これに限定されないが例えば、ヒトゲノムにお
いては、ヒトＣＤ４遺伝子は、マウスＣＤ４遺伝子の同
族遺伝子である。なぜならこれらの２つの遺伝子の配列
および構造が、それらが高度に相同であることを示し、
そして両方の遺伝子がＭＨＣクラスＩＩ−制限抗原認識
を介してＴ細胞活性化をシグナルすることに機能するタ
ンパク質をコードしているからである。 【００５６】用語「野生型」は、核酸フラグメントがい
かなる変異も含まないことを意味する。「野生型」タン
パク質は、タンパク質が天然において見られる活性のレ
ベルで活性であり、そして天然において見られるアミノ
酸配列を含有することを意味する。 【００５７】用語「関連ポリヌクレオチド」は、ポリヌ
クレオチドの領域または範囲が同一であり、かつポリヌ
クレオチドの領域または範囲が非相同であることを意味
する。 【００５８】用語「キメラなポリヌクレオチド」は、ポ
リヌクレオチドが野生型である領域および変異を受けた
領域を含むことを意味する。ポリヌクレオチドが、ある
ポリヌクレオチドに由来する野生型領域および別の関連
ポリヌクレオチドに由来する野生型領域を含むこともま
た意味する。 【００５９】用語「切断」は、ポリヌクレオチドを酵素
で消化することまたはポリヌクレオチドを切断すること
を意味する。 【００６０】本明細書で使用される用語「集団」は、ポ
リヌクレオチド、核酸フラグメント、またはタンパク質
のような成分の集合を意味する。「混合集団」は、核酸
またはタンパク質の同じファミリーに属する（すなわち
関連する）が、それらの配列が異なり（すなわち同一で
はない）、それゆえそれらの生物学的活性においても異
なる成分の集合を意味する。 【００６１】用語「特定核酸フラグメント」は、特定の
終点を有し、そして特定核酸配列を有する核酸フラグメ
ントを意味する。２つの核酸フラグメント（ここでは１
つの核酸フラグメントが第２の核酸フラグメントの一部
分と同一の配列を有するが、異なる末端を有する）は、
２つの異なる特定核酸フラグメントを包含する。 【００６２】用語「変異」は、野生型核酸配列の配列に
おける変化、またはペプチドの配列における変化を意味
する。このような変異は、塩基転位または塩基転換のよ
うな点変異であり得る。変異は欠失、挿入、または重複
であり得る。 【００６３】本明細書で使用されるポリペプチド表記
は、標準的な慣習および慣用に従い、左側方向がアミノ
末端方向であり、右側方向がカルボキシ末端方向であ
る。同様に、他で特定しないかぎり、１本鎖ポリヌクレ
オチド配列の左側の末端は５’末端であり；２本鎖ポリ
ヌクレオチド配列の左側方向は５’方向という。新生Ｒ
ＮＡ転写産物の５’から３’付加の方向を、転写方向と
いい；ＲＮＡと同じ配列を有し、およびＲＮＡ転写産物
の５’末端の５’側にであるＤＮＡ鎖上の配列領域を
「上流配列」といい；ＲＮＡと同じ配列を有し、および
コードＲＮＡの転写産物の３’末端の３’側にあるＤＮ
Ａ鎖上の配列領域を「下流配列」という。 【００６４】本明細書で使用される用語「天然に存在す
る」は、ある物体に適用されるように、ある物体が天然
において見出され得る事実をいう。例えば、供給源から
天然に単離され得、研究室においてヒトにより故意に改
変されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在す
る配列である。一般的に、用語天然に存在するは、種に
代表的であるような非病的（非疾患）個体に存在する物
体をいう。 【００６５】本明細書で使用される用語「薬剤」は、化
合物、化合物の混合物、場所的に局在する化合物の配列
（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチド配列、ポリヌクレオチ
ド配列、および／または結合小分子配列）、生体高分
子、バクテリオファージのペプチドディスプレイライブ
ラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）
ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディス
プレイライブラリー、または細菌、植物、真菌、または
動物（特に哺乳動物）細胞または組織のような生体物質
から作製される抽出物を示す。薬剤は、本明細書の以下
に記載されるスクリーニングアッセイに含めることによ
り、抗新生物剤、抗炎症剤、またはアポトーシスモジュ
レーターとしての潜在的活性について評価される。薬剤
は、本明細書の以下に記載されるスクリーニングアッセ
イに含めることにより、特定のタンパク質相互作用のイ
ンヒビター（すなわち、２つの予め決定されたポリペプ
チド間の結合相互作用を選択的に阻害するが、細胞の生
存性を実質的に阻害しない薬剤）としての潜在的活性に
ついて評価される。 【００６６】本明細書で使用されるように、「実質的に
純粋な」は、対象種が存在する優勢種であること（すな
わち、モル濃度に基づき、組成において他の任意の個々
の高分子種よりも豊富であること）を意味し、そして好
ましくは実質的に精製された画分は、対象種が、存在す
る全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルに基づ
き）を含む組成である。一般的には、実質的に純粋な組
成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０％〜９
０％より多くを含有する。最も好ましくは、対象種は本
質的に均質にまで精製され（汚染種が従来の検出方法に
より組成物中に検出され得ない）、ここでは組成物は本
質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（＜５
００ダルトン）、および元素イオン種は高分子種とは見
なさない。 【００６７】本明細書で使用される用語「生理学的条
件」は、温度、ｐＨ、イオン強度、粘性率、および同様
の生物学的パラメーターであって、これらは生存可能な
生物に適合する、および／または生存可能な酵母培養細
胞または哺乳動物培養細胞において細胞内に代表的に存
在する。例えば、代表的な実験培養条件下で増殖される
酵母細胞における細胞内条件は、生理学的条件である。
インビトロ転写反応混液に適切なインビトロ反応条件
は、一般的に生理学的条件である。一般に、インビトロ
生理学的条件は５０〜２００ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣ
ｌ、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃、および０．０
０１〜１０ｍＭ ２価イオン（例えば、Ｍｇ ++、Ｃ
ａ++）；好ましくは約１５０ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣ
ｌ、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭ 二価カチオンを含有
し、そしてしばしば０．０１〜１．０％の非特異的タン
パク質（例えば、ＢＳＡ）を含有する。非イオン性界面
活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００）が、通常約０．００１％〜２％、代表的には
０．０５％〜０．２％（ｖ／ｖ）でしばしば存在し得
る。特定の水性条件は従来の方法に従って当業者により
選択され得る。一般的な手引きのために、以下の緩衝化
水性条件が適用可能であり得る：１０〜２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ５−
８、二価カチオン（１種類または複数）および／または
金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤お
よび／または膜画分および／または消泡剤および／また
は発光剤（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の最適な添加を有
する。 【００６８】本明細書において、特異的ハイブリダイゼ
ーションは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌク
レオチド（例えば、第１のポリヌクレオチドと区別され
るが実質的には同一の配列を有するポリヌクレオチド）
との間のハイブリッドの形成として定義され、ここで
は、実質的に関連のないポリヌクレオチド配列が混合物
中でハイブリッドを形成しないストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で、第１のポリヌクレオチド
は優先して第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズする。 【００６９】本明細書で使用される用語「単鎖抗体」
は、ポリペプチド結合においてＶHドメインおよびＶLド
メインを含むポリペプチドをいい、一般的にスペーサー
ペプチド（例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ］X）を介して連接され、アミノ末端および／
またはカルボキシ末端で付加的なアミノ酸配列を含み得
る。例えば、単鎖抗体はコード化ポリヌクレオチドに結
合するために、つなぎ（ｔｅｔｈｅｒ）セグメントを含
み得る。一例として、ｓｃＦｖは、単鎖抗体である。単
鎖抗体は一般に、免疫グロブリンスーパーファミリーの
遺伝子により実質的にコードされる、少なくとも１０個
の隣接するアミノ酸の１つ以上のポリペプチドセグメン
トからなるタンパク質である（例えば、Ｔｈｅ Ｉｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍ
ｉｌｙ， Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂ
ａｒｃｌａｙ， Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅ
ｎｅｓ， Ｔ．Ｈｏｎｊｏ， Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，および
Ｔ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ編 （１９８９） Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ，
３６１−３８７頁（本明細書中に参考として援用され
る）を参照のこと）。最も頻繁には単鎖抗体は、齧歯
類、ヒト以外の霊長類、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤ
ギ、またはヒトのＨ鎖遺伝子配列またはＬ鎖遺伝子配列
によりコードされる。一般に機能的な単鎖抗体は、免疫
グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部分
を含有しており、特定標的分子（代表的にはレセプター
または抗原（エピトープ））に対する結合特性を保有す
る。 【００７０】本明細書で使用されるように、用語「相補
性決定領域」および「ＣＤＲ」は、ＫａｂａｔおよびＣ
ｈｏｔｈｉａにより例証される技術認識用語である。一
般に、ＣＤＲの定義は、高頻度可変領域または高頻度可
変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ （１９８
７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏ
ｔｈｉａら （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８
７７；Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅｓ ｏｆＨｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，
ＭＤ） （１９８７）；およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏ
ら （１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１
７５）としてもまた知られる。可変領域のドメインは、
代表的に、天然に存在する免疫グロブリン鎖のアミノ末
端の約１０５〜１１５アミノ酸（例えば、アミノ酸１〜
１１０）を含むが、いくらか短いまたは長い可変ドメイ
ンはもまた、単鎖抗体の形成に適している。 【００７１】免疫グロブリンのＬ鎖可変領域またはＨ鎖
可変領域は、ＣＤＲとも呼ばれる３つの高頻度可変領域
により中断される「フレームワーク」領域からなる。フ
レームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義され
ている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｓ
ｅｔ」 Ｅ．Ｋａｂａｔら， 第４版， Ｕ．Ｓ．Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕ
ｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍ
Ｄ （１９８７）を参照のこと）。異なるＬ鎖またはＨ
鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存され
ている。本明細書で使用される「ヒトフレームワーク領
域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレーム
ワーク領域に実質的に同一（約８５％以上、通常は９０
％〜９５％以上）であるフレームワーク領域である。抗
体のフレームワーク領域（すなわち、構成要素のＬ鎖お
よびＨ鎖の結合フレームワーク領域）は、ＣＤＲの配置
および配列に作用する。ＣＤＲが主に、抗原のエピトー
プへの結合を担う。 【００７２】本明細書で使用される用語「可変セグメン
ト」は、ランダムな配列、偽似ランダムな配列、または
規定の核配列を含む新生ペプチドの一部分をいう。可変
セグメントは、可変領域位置および不変領域位置の両方
を含み得、可変領域位置での残基の変化の程度は制限さ
れ得る；両方の選択とも実施者の判断で選択される。代
表的に、可変セグメントは約５〜２０アミノ酸残基の長
さ（例えば、８〜１０アミノ酸）であるが、可変セグメ
ントはより長くあり得、そして抗体位置またはレセプタ
ー位置（例えば、抗体フラグメント、核酸結合タンパク
質、レセプタータンパク質など）を含み得る。 【００７３】本明細書で使用される「ランダムペプチド
配列」は、２つ以上のアミノ酸モノマーからなり、確率
過程またはランダム過程により構築されるアミノ酸配列
をいう。ランダムなペプチドはフレームワークモチーフ
または骨組みモチーフを含み得、不変配列を含み得る。 【００７４】本明細書で使用される「ランダムペプチド
ライブラリー」は、一セットのランダムペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列のセットをいい、そしてこ
れらのポリヌクレオチド配列によりコードされるランダ
ムペプチドのセット、ならびにこれらのランダムペプチ
ドを含む融合タンパク質をいう。 【００７５】本明細書で使用される用語「疑似ランダ
ム」は、限定された可変性を有する配列のセットをい
い、これにより、例えば、ある位置の残基の可変性の程
度が別の位置の残基の可変性の程度と異なる。しかし任
意の疑似ランダム位置は、ある程度の残基の変化を可能
にするが、制限される。 【００７６】本明細書で使用される用語「規定の配列フ
レームワーク」は、一般的に実験データまたは構造デー
タを基礎として、非ランダムに選択される規定の配列の
セットをいい；例えば、規定の配列フレームワークは、
βシート構造を形成すると予想されるアミノ酸配列のセ
ットを含み得、または他の変化の間にロイシンジッパー
の７個の反復モチーフ、亜鉛フィンガードメインを含み
得る。「規定の配列核」は、可変性の制限範囲を含む配
列のセットである。（１）２０個の従来のアミノ酸の完
全にランダムな１０マーの配列は、（２０）10個の配列
のいずれでもあり得、そして（２）２０個の従来のアミ
ノ酸の疑似ランダムな１０マーの配列は（２０）10個の
配列のいずれでもあり得るが、特定の位置および／また
は全体で特定の残基に偏りが表れるのに対し、一方
（３）規定の配列核は、それぞれの残基位置が可能であ
る２０個の従来のアミノ酸（および／または可能な比従
来型のアミノ酸／イミノ酸）のいずれでもあることが可
能とされた場合、可能な配列の最大数よりも少なくなる
配列のサブセットである。一般に、規定の配列核は、個
々の選択されたライブラリーメンバー配列のセグメント
または全長のいずれかに、可変残基位置および不変残基
位置を含んだり、そして／またはアミノ酸残基の規定の
サブセットから選択される残基を含み得る可変残基位置
を包んだりなどする。規定の配列核は、アミノ酸配列ま
たはポリヌクレオチド配列のいずれかをいい得る。これ
らに限定されないが例えば、配列（ＮＮＫ）10および
（ＮＮＨ）10は、配列核であると定義される（ここでＮ
はＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣを表し；Ｋは、ＧまたはＴを表
し；およびＭはＡまたはＣを表す）。 【００７７】本明細書で使用される「エピトープ」は、
抗体の可変領域結合ポケットと相互作用して結合相互作
用を形成し得る抗原または他の高分子の一部分をいう。
代表的に、このような結合相互作用はＣＤＲの１つ以上
のアミノ酸残基の分子間接触として示される。 【００７８】本明細書で使用される「レセプター」は、
所定のリガンドにアフィニティーを有する分子をいう。
レセプターは天然に存在する分子または合成分子であり
得る。レセプターは不変状態においてまたは他の種とと
もに集合体として使用され得る。レセプターは、共有結
合的または非共有結合的に、直接または特異的な結合物
質を介してのいずれかで、結合メンバーに付着され得
る。レセプターの例は、抗体（特定の抗原決定基（例え
ば、ウイルス、細胞、または他の物質）と反応するモノ
クロール抗体および抗血清を包含する）、細胞膜レセプ
ター、炭水化物および糖タンパク質の複合体、酵素、お
よびホルモンレセプターを包含するがこれらに限定され
ない。 【００７９】本明細書で使用される「リガンド」は、ラ
ンダムペプチド配列または可変セグメント配列のよう
な、特定のレセプターで認識される分子をいう。当業者
の認識するところによれば、分子（または高分子複合
体）は、レセプターおよびリガンドの両方であり得る。
一般的に、小分子量を有する結合対をリガンドといい、
そして大きな分子量を有する結合対をレセプターとい
う。 【００８０】本明細書で使用される「リンカー」または
「スペーサー」は、２つの分子（例えば、ＤＮＡ結合タ
ンパク質およびランダムペプチド）を結合させる分子ま
たは分子のグループをいい、そして好ましい配置にその
２つの分子を置くように供せられる。これにより、例え
ば、ランダムペプチドは、ＤＮＡ結合タンパク質から最
少の立体障害でレセプターに結合し得る。 【００８１】本明細書で使用される用語「作動可能に連
結される」は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要
素の連結をいう。核酸が、別の核酸配列と機能的関係に
置かれる場合、核酸は「作動可能に連結される」。例え
ば、プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列の
転写に影響する場合、これはコード配列に作動可能に連
結される。作動可能に連結されるとは、代表的に、連結
されるＤＮＡ配列が隣接されることを意味し、２つのタ
ンパク質コード領域を接続することが必要である場合、
隣接されかつリーディングフレーム内にある。 【００８２】（方法論）核酸再編成は、インビトロまた
はインビボにおいて核酸フラグメントまたはポリヌクレ
オチドのプールを相同組換えする方法である。関連核酸
配列またはポリヌクレオチドの混合物をランダムにフラ
グメント化し、そして再組立して、組換え核酸分子また
はポリヌクレオチドのライブラリーまたは混合集団を生
じる。 【００８３】カセット変異誘発とは対照に、再編成およ
び誤りがちなＰＣＲのみが、（プライマー以外の配列情
報を用いずに）盲目的に配列のプールを変異させる。 【００８４】反復選択について誤りがちなＰＣＲのみよ
りも優れる本発明の変異性再編成の利点は、抗体工学か
らの例を用いて最も良く説明され得る。図１に、本明細
書で記載されるＤＮＡ再編成の概略図が示される。開始
ライブラリーは多様な起源の関連配列（すなわち、天然
ｍＲＮＡ由来の抗体）からなり得、または単一抗体遺伝
子の任意の型の変異誘発（再編成を包含する）により得
られ得る。選択される相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の
集合は、一回目のアフィニティー選択後に得られる（図
１）。図において、太いＣＤＲは、抗体分子に抗原への
増加したアフィニティーを与える。再編成は、全てのＣ
ＤＲ１と全てのＣＤＲ２および全てのＣＤＲ３などとの
自由な組み合わせの結合を可能にする（図１）。 【００８５】この方法は、逆鎖反応である点でＰＣＲと
は異なる。ＰＣＲでは、ポリメラーゼの開始部位の数お
よび分子の数は指数関数的に増加する。しかし、ポリメ
ラーゼ開始部位の配列および分子の配列は本質的に同じ
である。反対に、ランダムフラグメントの核酸再組立ま
たは再編成では、開始部位の数およびランダムフラグメ
ントの数（サイズではない）は、時間がたつと減少す
る。全プラスミドに由来するフラグメントについて、理
論上の終点は、単一の大きな鎖状分子である。 【００８６】相同な領域で交差が生じるので、組換えは
主に同じ配列ファミリーのメンバー間で生じる。このこ
とは、ひどく不適合性である （例えば、同じ抗原の異
なるエピトープに対する）ＣＤＲの組み合わせを防止す
る。配列の多数のファミリーが同じ反応において再編成
され得ることが意図される。さらに、再編成は相対的順
位を保存するので、例えば、ＣＤＲ１は、ＣＤＲ２の位
置では見出されない。 【００８７】優れた再編成体は多数の最も良い（例え
ば、最も高いアフィニティーの）ＣＤＲを含み、そして
これらの優れた再編成体はそれらの優れたアフィニティ
ーに基づいて選択され得る（図１）。 【００８８】１００個の異なる選択される抗体配列のプ
ールに由来するＣＤＲは、１００6通りまで順序変えさ
れ得る。この多数の順序変えはＤＮＡ配列の単一ライブ
ラリーでは表し得ない。従って、ＤＮＡ再編成および選
択の多数のサイクルは、配列の長さおよび所望の配列の
多様性に依存して要求され得ることが意図される。 【００８９】反対に、誤りがちなＰＣＲは全ての選択さ
れるＣＤＲを同じ関連配列中に保ち（図１）、よりずっ
と小さな変異曇りを生成する。 【００９０】本発明の方法において使用され得る鋳型ポ
リヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。それ
は、組換えまたは再組立される遺伝子またはＤＮＡフラ
グメントの大きさに依存して種々の長さであり得る。好
ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは５０ｂｐ〜５０ｋｂ
である。目的のタンパク質をコードする核酸を含有する
完全なベクターが、本発明の方法において使用され得る
ことが意図され、そして実際に首尾良く使用されてい
る。 【００９１】鋳型ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応（米
国特許第４，６８３，２０２号および第４，６８３，１
９５号）または他の増幅方法またはクローニング方法を
使用する増幅により得られ得る。しかし、フラグメント
化する前にＰＣＲ産物から遊離プライマーを除去する
と、より効率的な結果が提供される。プライマーの十分
な除去を損なうと、低頻度の交差クローンを導き得る。 【００９２】鋳型ポリヌクレオチドはしばしば、２本鎖
であるべきである。２本鎖核酸分子は、得られる１本鎖
核酸フラグメントの領域が互いに相補的で、従って、ハ
イブリダイズして２本鎖分子を形成し得ることを確実に
することが要求される。 【００９３】鋳型ポリヌクレオチドに同一な領域および
鋳型ポリヌクレオチドに非相同な領域を有する１本鎖ま
たは２本鎖核酸フラグメントが、この工程で、鋳型ポリ
ヌクレオチドに添加され得ることが意図される。２つの
異なるが関連したポリヌクレオチド鋳型がこの工程で混
合され得ることもまた意図される。 【００９４】２本鎖ポリヌクレオチド鋳型および任意の
添加される２本鎖フラグメントまたは１本鎖フラグメン
トは、約５ｂｐ〜５ｋｂ以上のフラグメントにランダム
に消化される。好ましくは、ランダムフラグメントの大
きさは１０ｂｐ〜１０００ｂｐであり、より好ましくは
ＤＮＡフラグメントの大きさは約２０ｂｐ〜５００ｂｐ
である。 【００９５】あるいは、多数のニックを有する２本鎖核
酸は、本発明の方法において使用され得る。ニックは２
本鎖核酸の１本鎖における切れ目である。このようなニ
ック間の距離は好ましくは５ｂｐ〜５ｋｂであり、より
好ましくは１０ｂｐ〜１０００ｂｐの間である。 【００９６】核酸フラグメントは多数の異なる方法によ
り消化され得る。核酸フラグメントはヌクレアーゼ（例
えば、ＤＮＡｓｅＩまたはＲＮＡｓｅ）を用いて消化さ
れ得る。核酸は、超音波処理方法によりまたは小穴を有
するチューブの通過によりランダムに剪断され得る。 【００９７】核酸が１つ以上の制限酵素を用いて部分的
に消化され得、これにより特定の交差点が統計的に保持
され得ることもまた意図される。 【００９８】任意の１つの特定核酸フラグメントの濃度
は、全核酸の１重量％より大きいことはなく、より好ま
しくは、任意の１つの特定核酸フラグメントの濃度は、
全核酸の０．１重量％より大きいことはない。 【００９９】混合物における異なる特定核酸フラグメン
トの数は少なくとも約１００個であり、好ましくは少な
くとも５００個であり、そしてより好ましくは少なくと
も約１０００個である。 【０１００】この工程で、１本鎖核酸フラグメントまた
は２本鎖核酸フラグメントは、合成または天然のいずれ
かで、核酸フラグメントの混合物の不均一性を増加する
ために、ランダムな２本鎖核酸フラグメントに添加され
得る。 【０１０１】２本鎖のランダムに切断された核酸フラグ
メントの集団が、この工程で混合され得、または組み合
わされ得ることもまた意図される。 【０１０２】鋳型ポリヌクレオチドへの変異の挿入が所
望される場合、鋳型ポリヌクレオチドに同一な領域およ
び鋳型ポリヌクレオチドに非相同な領域を有する１本鎖
核酸フラグメントまたは２本鎖核酸ラグメントは、全核
酸に比べて２０重量倍過剰に、より好ましくは１本鎖核
酸フラグメントが全核酸に比べて１０重量倍過剰に添加
され得る。 【０１０３】異なるが関連した鋳型ポリヌクレオチドの
混合物が所望される場合、鋳型のそれぞれに由来する核
酸フラグメントの集団が約１：１００より少ない比率で
組み合わされ得、より好ましくは、比率は約１：４０よ
り小さい。例えば、野生型ポリヌクレオチドと変異ポリ
ヌクレオチドの集団との戻し交雑が、中立変異（例え
ば、選択される表現型の特性において実質のない変化を
生じる変異）を除去するために所望され得る。このよう
な例では、ランダム消化変異ポリヌクレオチドフラグメ
ントに添加され得るランダム消化野生型ポリヌクレオチ
ドフラグメントの比率は約１：１から約１００：１であ
り、そしてより好ましくは１：１から４０：１である。 【０１０４】ランダム核酸フラグメントの混合集団は、
変性されて１本鎖核酸フラグメントを形成し、次いで再
びアニールされる。他の１本鎖核酸フラグメントに相同
な領域を有するこれらの１本鎖核酸フラグメントのみ
が、再びアニールされる。 【０１０５】ランダム核酸フラグメントは熱を加えるこ
とにより変性される。当業者は完全に２本鎖核酸を変性
するために必要な条件を決定し得る。好ましくは、温度
は８０℃〜１００℃であり、より好ましくは温度は９０
℃〜９６℃である。核酸フラグメントを変性するために
使用され得る他の方法は、圧力（３６）およびｐＨを包
含する。 【０１０６】核酸フラグメントは冷却することにより再
びアニールされ得る。好ましくは、温度は２０℃〜７５
℃であり、より好ましくは温度は４０℃〜６５℃であ
る。高頻度の交差が、平均して単に４つの連続した相同
な塩基に基づいて必要される場合、組換えは低いアニー
ル温度を使用することにより増強され得るが、プロセス
はより困難になる。生じる再生の程度は、１本鎖核酸フ
ラグメントの集団間の相同性の程度に依存する。 【０１０７】再生はポリエチレングリコール（「ＰＥ
Ｇ」）または塩の添加により加速され得る。塩濃度は好
ましくは０ｍＭ〜２００ｍＭであり、より好ましくは塩
濃度は１０ｍＭ〜１００ｍＭである。塩はＫＣｌまたは
ＮａＣｌであり得る。ＰＥＧの濃度は好ましくは０％〜
２０％であり得、より好ましくは５％〜１０％であり得
る。 【０１０８】次に、アニールされた核酸フラグメント
は、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下
でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、Ｋｌｅ
ｎｏｗフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、または当該
分野において知られる任意の他のＤＮＡポリメラーゼで
あり得る。 【０１０９】再組立に使用されるアプローチは、それで
もなお交差が生じるような最少の程度の相同性に依存す
る。同一である範囲が広い場合、Ｔａｑポリメラーゼが
４５℃〜６５℃の間のアニール温度を用いて使用され得
る。同一である範囲が小さな場合、Ｋｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼが、２０℃〜３０℃の間のアニール温度を用いて
使用され得る。当業者は達成される交差の数を増加する
ためにアニールの温度を変化させ得る。 【０１１０】ポリメラーゼはアニーリングの前、アニー
リングと同時に、またはアニーリングの後にランダム核
酸フラグメントに添加され得る。 【０１１１】ポリメラーゼの存在下での変性、再生、お
よびインキュベーションのサイクルは、本明細書では、
核酸の再編成または再組立という。このサイクルは所望
の回数反復される。好ましくは、サイクルは２回〜５０
回反復され、より好ましくは１０回〜４０回反復され
る。 【０１１２】得られる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋ
ｂのより大きな２本鎖ポリヌクレオチドであり、好まし
くはより大きなポリヌクレオチドは５００ｂｐ〜５０ｋ
ｂである。 【０１１３】このより大きなポリヌクレオチドフラグメ
ントは、鋳型ポリヌクレオチドと同じ大きさを有する核
酸フラグメントの多くのコピーを直列して含有し得る。
次いで、この鎖状フラグメントは鋳型ポリヌクレオチド
の単一コピーに消化される。結果は鋳型ポリヌクレオチ
ドとほぼ同じ大きさの核酸フラグメントの集団である。
同一な範囲および非相同な範囲を有する１本鎖核酸フラ
グメントまたは２本鎖核酸フラグメントが、再編成の前
に鋳型ポリヌクレオチドに添加される場合、集団は混合
集団である。 【０１１４】次いで、これらのフラグメントは適切なベ
クターにクローン化され、そして細菌を形質転換するた
めにライゲーション混合液が使用される。 【０１１５】単一の核酸フラグメントは、鎖状フラグメ
ントを消化するのではなく、種々の方法（ＰＣＲ（米国
特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２
号）を包含する）によりクローン化される前に単一の核
酸フラグメントを増幅することにより、より大きな鎖状
核酸フラグメントから得られ得ることが意図される。 【０１１６】クローン化に使用されるベクターは、ベク
ターが所望の大きさのＤＮＡフラグメントを受容するの
であれば決定的なものではない。ＤＮＡフラグメントの
発現が所望される場合、クローン化媒体は、宿主細胞に
おけるＤＮＡフラグメントの発現を可能にするように、
ＤＮＡフラグメントの挿入部位の隣に転写シグナルおよ
び翻訳シグナルをさらに含有する。好ましいベクター
は、プラスミドのｐＵＣ系列およびｐＢＲ系列を包含す
る。 【０１１７】得られる細菌集団は、ランダムな変異を有
する多くの組換えＤＮＡフラグメントを含む。この混合
集団は、所望の組換え核酸フラグメントを同定するため
に試験され得る。選択の方法は所望のＤＮＡフラグメン
トに依存する。 【０１１８】例えば、リガンドへの結合効率が増加され
たタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントが所望さ
れる場合、集団またはライブラリーにおいてそれぞれの
ＤＮＡフラグメントにより発現されるタンパク質は、当
該分野において公知の方法（すなわち、パンニング、ア
フィニティークロマトグラフィー）により、リガンドに
結合するそれらの能力について試験され得る。増加した
薬物耐性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグ
メントが所望される場合、集団またはライブラリーにお
いてそれぞれのＤＮＡフラグメントにより発現されるタ
ンパク質は、宿主生物に薬物耐性を与えるそれらの能力
について試験され得る。所望されるタンパク質の知識を
与えられた当業者であれば、タンパク質に所望の特性を
与えるＤＮＡフラグメントを同定するために、集団を容
易に試験し得る。 【０１１９】当業者が、タンパク質のフラグメントがフ
ァージ表面上で融合タンパク質として発現されるような
ファージディスプレイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）を使用し得ることが意図
される。組換えＤＮＡ分子は、融合タンパク質（その一
部分は組換えＤＮＡ分子によりコードされる）の転写を
生じるような部位で、ファージＤＮＡへクローン化され
る。組換え核酸分子を含有するファージは、細胞内で複
製および転写を行う。融合タンパク質のリーダー配列
は、融合タンパク質の輸送をファージ粒子の先端部へと
導く。従って、組換えＤＮＡ分子により部分的にコード
される融合タンパク質は、上記の方法による検出および
選択のために、ファージ粒子上にディスプレイされる。 【０１２０】核酸再編成の多くのサイクルが、第１の集
団のサブ集団からの核酸フラグメントを用いて実施され
得ることがさらに意図され、サブ集団は所望の組換えタ
ンパク質をコードするＤＮＡを含む。このようにして、
さらに高い結合アフィニティーまたは酵素活性を有する
タンパク質が達成され得る。 【０１２１】核酸再編成の多くのサイクルが、サブ集団
から任意のサイレント変異を取り除くために、野生型核
酸フラグメントおよび一回目のまたはそれに続く核酸再
編成に由来する核酸のサブ集団の混合物を用いて実施さ
れ得る。 【０１２２】核酸の任意の供給源が、精製された形態で
出発核酸として利用される。従って、プロセスはＤＮＡ
またはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）を使用し
得、ＤＮＡまたはＲＮＡは、１本鎖または２本鎖であり
得る。さらに、それぞれの片鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡの
ハイブリッドが使用され得る。核酸配列は、変異される
核酸配列の大きさに依存して種々の長さであり得る。好
ましくは、特定核酸配列は５０〜５００００塩基対であ
る。目的のタンパク質をコードする核酸を含有する完全
なベクターが本発明の方法において使用され得ることが
意図される。 【０１２３】核酸は任意の供給源から得られ得、例え
ば、ｐＢＲ３２２のようなプラスミドから、クローン化
されたＤＮＡまたはＲＮＡから、または任意の供給源
（細菌、酵母、ウイルスおよび植物または動物のような
高等生物を含む）に由来する天然のＤＮＡまたはＲＮＡ
から得られ得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、血液または組
織物質から抽出され得る。鋳型ポリヌクレオチドはポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，
２０２号および４，６８３，１９５号）を使用する増幅
により得られ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは細胞
に存在するベクターに存在し得、そして十分な核酸が、
細胞を培養し、そして細胞から当該分野で公知の方法に
より核酸を抽出することにより得られ得る。 【０１２４】任意の特定核酸配列が、本プロセスにより
変異の集団を生成するために使用され得る。特定核酸配
列の変異配列の小さな集団が存在することまたは本プロ
セスの前に作製されることのみが必要とされる。 【０１２５】変異を有する特定核酸配列の初めの小さな
集団が、多くの異なる方法により作製され得る。変異は
誤りがちなＰＣＲにより作製され得る。誤りがちなＰＣ
Ｒは、長い配列にわたり、ランダムに低レベルで点変異
を誘導するために、低忠実度の重合条件を使用する。あ
るいは、オリゴヌクレオチドに特異的に変異を誘発する
ことにより、変異は鋳型ポリヌクレオチドに導入され得
る。オリゴヌクレオチドに特異的に変異を誘発するにお
いて、ポリヌクレオチドの短い配列が、制限酵素消化を
使用してポリヌクレオチドから除去され、そして種々の
塩基が元の配列から変化された合成オリゴヌクレオチド
で置き換えられる。ポリヌクレオチド配列はまた、化学
変異誘発により変化させられ得る。化学変異誘発物質
は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシ
ルアミン、ヒドラジン、またはギ酸を包含する。ヌクレ
オチド前駆体のアナログである他の薬剤は、ニトロソグ
アニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、ま
たはアクリジンを包含する。一般的に、これらの薬剤は
ヌクレオチド前駆体の代わりにＰＣＲ反応に添加され、
それゆえ配列を変異させる。プロフラビン、アクリフラ
ビン、キナクリンなどのような挿入剤もまた使用され得
る。ポリヌクレオチド配列のランダム変異誘発は、Ｘ線
または紫外線光を用いる照射によっても達成され得る。
一般に、そのように変異が誘発されたプラスミドＤＮＡ
フラグメントまたはＤＮＡフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉへ導入され、そして変異のプラスミドのプールまたは
ライブラリーとして増殖される。 【０１２６】あるいは、特定核酸の小さな混合集団は、
天然において見出され得うる。なぜならそれらが同じ遺
伝子の異なる対立遺伝子、または異なる関連種に由来す
る同じ遺伝子（すなわち、同族遺伝子）からなり得るか
らである。あるいは、特定核酸配列の小さな混合集団
は、１つの種（例えば、免疫グロブリン遺伝子）内に見
出される関連ＤＮＡ配列であり得る。 【０１２７】一旦、特定核酸配列の混合集団が生成され
たら、ポリヌクレオチドは、当業者に周知の技術を使用
して直接使用され得るか、または適切なクローニングベ
クターに挿入され得る。 【０１２８】ベクターの選択はポリヌクレオチド配列の
大きさ、および本発明の方法において使用される宿主細
胞に依存する。本発明の鋳型はプラスミド、ファージ、
コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウ
イルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペスウイル
ス、レオウイルス、パラミキソウイルスなど）、または
その選択部分（例えば、コートタンパク質、スパイク糖
タンパク質、キャプシドタンパク質）であり得る。例え
ば、変異特定核酸配列がより大きい場合、コスミドおよ
びファージミドが好ましい。なぜならこれらのベクター
は大きな核酸フラグメントを安定に増殖し得るからであ
る。 【０１２９】特定核酸配列の混合集団がベクターにクロ
ーン化される場合、それぞれのベクターを宿主細胞に挿
入し、そして宿主細胞にベクターを増殖させることによ
り、特定核酸配列の混合集団はクローン的に（ｃｌｏｎ
ａｌｌｙ）増幅され得る。このことはクローン増幅（ｃ
ｌｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ばれ
る。なぜなら核酸配列の絶対数は増加されるが、変異体
の数は増加しないからである。 【０１３０】（有用性）本発明のＤＮＡ再編成方法は、
未知の配列のプール上で盲目的に実施され得る。再組立
の混合オリゴヌクレオチド（再組立される配列に相同で
ある末端を有する）を添加することにより、任意の配列
混合物が任意の特定位置で別の配列混合物中に取り込ま
れ得る。従って、合成オリゴヌクレオチド、ＰＣＲフラ
グメント、または全遺伝子の混合物が、規定の位置で別
の配列ライブラリーへ混合され得る。１つの配列（混合
物）の挿入は、鋳型の別の部分における配列の挿入から
独立する。従って、組換えの程度、要求される相同性の
程度、およびライブラリーの多様性の程度は、再組立さ
れるＤＮＡの長さに従って独立してまたは同時に変化さ
れ得る。 【０１３１】２つの遺伝子を混合するこのアプローチ
は、マウスハイブリドーマ由来の抗体をヒト化するため
に有用であり得る。２つの遺伝子を混合するアプローチ
または変異配列を遺伝子へ挿入するアプローチは、任意
の治療学的に使用されるタンパク質（例えば、インター
ロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、成長ホルモンなど）のため
に有用であり得る。このアプローチは、任意の核酸（例
えば、プロモーター、またはイントロン、または遺伝子
の３’非翻訳領域または５’非翻訳領域）において、発
現を増加するためにまたはタンパク質の発現特異性を変
えるためにもまた有用であり得る。このアプローチはま
た、リボザイムまたはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を
変異するためにもまた使用され得る。 【０１３２】再編成は、多様な領域を分離する相同な領
域の存在を要求する。スカホールド様タンパク質構造
は、特に再編成に適し得る。保存されるスカホールド
は、自己会合により全体の折り畳みを決定するが、特異
的結合を媒介する相対的に制限されないループをディス
プレイする。このようなスカホールドの例は、免疫グロ
ブリンβバレル、および４へリックス束である（２
４）。この再編成は、結合について変異配列の種々の組
み合わせを有するスカホールド様タンパク質を作製する
ために、使用され得る。 【０１３３】（インビトロにおける再編成）同等のいく
つかの標準的な遺伝子交配もまた、インビトロにおける
再編成により実施され得る。例えば、「分子戻し交雑」
は、目的の変異について選択しながら、変異体の核酸と
野生型核酸との混合を反復することにより実施され得
る。従来の育種におけるように、このアプローチは異な
る供給源に由来する表現型を選択されたバックグランド
に組み合わせるために使用され得る。これは、例えば、
選択されない特徴（すなわち、免疫原性）に影響する中
立変異を除去するために有用である。従って、このアプ
ローチは、タンパク質におけるどの変異が増強される生
物学的活性に関連するか関連しないかを決定するために
有用であり得、誤りがちな変異誘発方法またはカセット
変異誘発方法により達成され得ない利点を決定するため
に有用であり得る。 【０１３４】大きな機能的遺伝子は、小さなランダムフ
ラグメントの混合物から正確に組立され得る。この反応
は、化石の高度にフラグメント化されたＤＮＡから遺伝
子を再組立するために有用であり得る（２５）。さら
に、化石に由来するランダムな核酸フラグメントは、関
連種に由来する類似遺伝子からの核酸フラグメントとと
もに組み合わせられ得る。 【０１３５】本発明の方法は、種々の研究および診断的
適用に必要とされるように、単一の細胞から全ゲノム
を、インビトロにおいて増幅するために使用され得る。
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、実際、約４０ｋｂの長さに
制限される。ＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ（５，０００ｋ
ｂ）のような全ゲノムを増幅することは、１２５個の４
０ｋｂのフラグメントを生じる約２５０のプライマーを
必要とする。このアプローチは、十分な配列データが利
用できないために実用的ではない。反対に、ＤＮＡｓｅ
Ｉを用いるゲノムのランダムな消化、それに続く小フラ
グメントのゲル精製は、多数の可能なプライマーを提供
する。ＰＣＲ反応においてこのランダム小フラグメント
の混合物をプライマーとして単独でまたは鋳型としての
全ゲノムと共に使用すると、理論上、ゲノムの多くのコ
ピーを含む単一の鎖状体を終点とする逆鎖反応が生じ
る。 【０１３６】ランダムフラグメントのみが使用される場
合、コピー数において１００倍の増幅および５０ｋｂよ
り大きい平均フラグメントサイズが得られ得る（実施例
２を参照のこと）。より大きな鎖状体が、多くの小フラ
グメントの重複により生成されると考えられる。合成プ
ライマーを使用して得られる特定ＰＣＲ産物の質は、増
幅されないＤＮＡから得られる産物と区別されない。こ
のアプローチはゲノムのマッピングに有用であると期待
される。 【０１３７】再編成されるポリヌクレオチドは、実施者
の判断で、ランダムにまたは非ランダムにフラグメント
化され得る。 【０１３８】（インビボにおける再編成）インビボにお
ける再編成の１つの実施態様において、特定核酸配列の
混合集団は、各宿主細胞において、少なくとも２つの異
なる核酸配列が存在する条件下で、細菌細胞または真核
細胞へ導入される。フラグメントは種々の異なる方法に
より、宿主細胞へ導入され得る。宿主細胞は、当業者に
公知の方法（例えば、塩化カルシウムを用いる処理）を
使用してフラグメントで形質転換され得る。フラグメン
トがファージゲノムに挿入される場合、宿主細胞は特定
核酸配列を有する組換えファージゲノムを用いてトラン
スフェクトされ得る。あるいは、核酸配列は、エレクト
ロポレーション、トランスフェクション、リポフェクシ
ョン、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、接
合などを用いて宿主細胞へ導入され得る。 【０１３９】一般的に、この実施態様において、特定核
酸配列は、宿主細胞において配列を安定に複製し得るベ
クター中に存在する。さらに、ベクターを有する宿主細
胞が選択され得るように、ベクターがマーカー遺伝子を
コードすることが意図される。このことは、変異特定核
酸配列が、宿主細胞へ導入された後に回収され得ること
を確実にする。しかし、特定核酸配列の完全な混合集団
がベクター配列上に存在する必要がないことが意図され
る。むしろ、宿主細胞にフラグメントを導入した後に、
各宿主細胞が、少なくとも１つのそこに存在する特定核
酸配列を有する１つのベクターを含有することを確実に
するために、十分な数だけの配列がベクターにクローン
化される必要がある。特定核酸配列の集団のサブセット
をベクターへクローン化させるよりも、このサブセット
は宿主細胞に、すでに安定に組み込まれ得ることもま
た、意図される。 【０１４０】同一の領域を有する２つのフラグメント
が、宿主細胞へ挿入される場合、２つのフラグメント間
に相同組換えが生じることが見出された。２つの変異特
定核酸配列間のこのような組換えで、いくつかの状況に
おいて二重変異体または三重変異体を生じる。 【０１４１】いくつかの変異特定核酸配列が、直鎖上の
核酸分子上に存在する場合、組換えの頻度が増加される
こともまた見出された。従って、好ましい実施態様で
は、いくつかの特定核酸配列が直鎖状核酸フラグメント
上に存在する。 【０１４２】形質転換の後に、宿主細胞形質転換体は、
所望の特質を有する変異特定核酸配列を含有するこれら
の宿主細胞形質転換体を同定するために選択下におかれ
る。例えば、特定の薬物に対して増加される耐性が所望
される場合、形質転換された宿主細胞は、特定の増加し
た薬物濃度を受け得、そして増加する薬物耐性を与え得
る変異タンパク質を産生する形質転換体が、選択され得
る。特定タンパク質がレセプターに結合する能力の増強
が所望される場合、タンパク質の発現は形質転換体から
誘導され得、そして得られるタンパク質は当業者に公知
の方法によるリガンド結合アッセイにおいてアッセイさ
れ、リガンドに対して増強される結合を示す変異集団の
サブセットを同定する。あるいは、タンパク質は、適切
なプロセシングを確実にするように、別のシステムにお
いて発現され得る。 【０１４３】一旦、所望される特徴を有する第１の組換
え特定核酸配列（娘配列）のサブセットが同定される
と、次いで、それらは２回目の組換えを受ける。 【０１４４】組換えの２回目のサイクルにおいて、組換
え特定核酸配列は、元の変異特定核酸配列（親配列）と
ともに混合され得、そして上記のようにサイクルが反復
され得る。この方法では、増強される特性を有するかま
たは増強される特性を有するタンパク質をコードする第
２の組換え特定核酸配列のセットが同定され得る。この
サイクルは所望される多数回反復され得る。 【０１４５】第２のまたはそれに続く組換えサイクルに
おいて、戻し交雑が実施され得ることもまた意図され
る。分子の戻し交雑は、所望の特定核酸配列を多数の野
生型配列と混合することにより実施され得、それにより
少なくとも１つの野生型核酸配列および変異核酸配列
が、形質転換後に、同じ宿主細胞中に存在する。野生型
特定核酸配列を用いる組換えは、免疫原性のような選択
されない特徴に影響し得るが、選択される特徴には影響
し得ないそれらの中立変異を除去する。 【０１４６】本発明の別の実施態様において、一回目の
間、宿主細胞へ導入する前に、特定核酸配列のサブセッ
トがフラグメント化され得ることが意図される。フラグ
メントの大きさは、他の配列と相同組換えできるよう
に、他の配列に同一ないくつかの領域を含むのに十分な
大きさでなくてはならない。フラグメントの大きさは
０．０３ｋｂ〜１００ｋｂの範囲であり、より好ましく
は０．２ｋｂ〜１０ｋｂの範囲である。それに続くラウ
ンドにおいて、以前のラウンドから選択される配列以外
の全ての特定核酸配列は、宿主細胞へ導入する前に切断
されてフラグメント化され得る。 【０１４７】配列のフラグメント化は、当該分野におい
て公知の種々の方法により達成され得る。配列は、核酸
配列中、ランダムにフラグメント化され得るか、または
特定部位でフラグメント化され得る。ランダムフラグメ
ントは核酸の切断により、または核酸を過酷な物理的処
理（例えば、剪断または放射線照射）または過酷な化学
剤（例えば、遊離ラジカル；金属イオン；脱プリン；お
よび切断するための酸処理による）に核酸を曝露するこ
とにより得られ得る。ＤＮＡの場合、ＤＮＡｓｅまたは
同様のヌクレアーゼを使用することによってもまた、ラ
ンダムフラグメントが得られ得る。配列は、制限酵素の
使用により、特定部位で切断され得る。フラグメント化
配列は、１本鎖または２本鎖であり得る。配列が、本来
１本鎖である場合、宿主細胞に挿入する前に、それらは
熱、化学物質、または酵素で変性され得る。核酸の鎖を
分離するために適切な反応条件は、当該分野において周
知である。 【０１４８】このプロセスの工程は、限界なく反復され
得、達成され得る可能な変異体の数によってのみ、制限
される。一定の数のサイクル後、全ての可能な変異体が
達成され、そしてさらなるサイクルは余分になる。 【０１４９】ある実施態様において、同じ変異鋳型核酸
が繰り返し組換えされて、そして得られる組換え体が所
望の特徴について選択される。 【０１５０】それゆえ、変異鋳型核酸の初めのプールま
たは集団は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌において複製可
能なベクターへクローン化される。Ｅ．ｃｏｌｉにおい
て自律複製し得るかぎり、特定のベクターは必須ではな
い。好ましい実施態様において、ベクターは、ベクター
に連結される変異特定核酸によりコードされる任意のタ
ンパク質の発現および生成を可能にするように設計され
る。ベクターが選択可能なマーカーをコードする遺伝子
を含有することもまた、好ましい。 【０１５１】変異核酸配列のプールを含有するベクター
の集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞へ導入される。ベクタ
ーの核酸配列は形質転換、トランスフェクションまたは
ファージの場合は感染により導入され得る。細菌に形質
転換するために使用されるベクターの濃度は、多くのベ
クターが各細胞へ導入され得る程度である。一旦、細胞
中に存在すると、相同組換えの効率は、相同組換えが種
々のベクター間で生じる程度である。このことにより、
元の親変異配列と異なる変異の組み合わせを有する変異
体（娘）を生成する。 【０１５２】次いで、宿主細胞はクローン的に複製さ
れ、ベクター上に存在するマーカー遺伝子について選択
される。プラスミドを有するこれらの細胞のみが、選択
下で増殖する。 【０１５３】次いで、ベクターを含む宿主細胞は、好ま
しい変異の存在について試験される。このような試験
は、例えば、選択される遺伝子が改良される薬物耐性遺
伝子である場合、細胞を選択圧下におくことからなり得
る。ベクターが変異核酸配列によりコードされるタンパ
ク質の発現を可能にする場合、このような選択はコード
されるタンパク質の発現を可能にし、タンパク質を単離
し、そして、例えば、増加された効率で目的のリガンド
に結合するかどうかを決定するためにタンパク質を試験
することを包含し得る。 【０１５４】一旦、所望の特徴を与える特定の娘変異核
酸配列が同定されると、核酸は、すでにベクターに連結
されているかまたはベクターから分離されているかのい
ずれかで単離される。次いで、この核酸は核酸の第一集
団または親集団と混合され、そしてサイクルが反復され
る。 【０１５５】本方法により増強された所望の特性を有す
る核酸配列が選択され得ることが示される。 【０１５６】別の実施態様において、変異体の第一世代
は細胞内に保持され、親変異配列が再び細胞に添加され
る。従って、実施態様Ｉの第一サイクルは上記のように
実施される。しかし、娘核酸配列が同定された後、これ
らの配列を含む宿主細胞が保持される。 【０１５７】親の変異特定核酸集団は、フラグメントと
してまたは同じベクターへクローン化されるかのいずれ
かで、既に娘核酸を含む宿主細胞へ導入される。組換え
を細胞において生じさせ、次世代の組換え体、または子
孫が上記の方法により選択される。 【０１５８】このサイクルは、所望の特徴を有する核酸
またはペプチドが得られるまで、多数回反復され得る。
続くサイクルにおいて、好ましい変異体に添加される変
異配列の集団が、親変異体または任意の次の世代から生
じ得る。 【０１５９】別の実施態様において、本発明は、任意の
中立変異を除去するために、得られる組換え特定核酸の
「分子」戻し交雑を実施する方法を提供する。中立変異
は、核酸またはペプチドに所望の特性を与えない変異で
ある。しかし、このような変異は核酸またはペプチドに
所望でない特徴を与え得る。従って、このような中立変
異を除去することが望ましい。本発明の方法は、そのよ
うに行う手段を提供する。 【０１６０】この実施態様において、所望の特徴を有す
る変異体核酸が実施態様の方法により得られた後、核
酸、核酸を有するベクター、またはベクターおよび核酸
を含有する宿主細胞が単離される。 【０１６１】次いで、核酸またはベクターはかなり過剰
な野生型核酸とともに宿主細胞へ導入される。変異体の
核酸および野生型配列の核酸を、組換えに供する。得ら
れる組換え体は、変異体核酸と同じ選択下に置かれる。
所望の特徴を有するこれらの組換え体のみが選択され
る。所望の特徴を与えない任意のサイレント変異は野生
型ＤＮＡとの組換えを介して失われる。このサイクル
は、全てのサイレント変異が除去されるまで、多数回反
復され得る。 【０１６２】従って、本発明の方法は、分子戻し交雑に
おいて、不必要な変異またはサイレント変異を除去する
ために使用され得る。 【０１６３】（有用性）本発明のインビボにおける組換
え方法は、未知の変異体のプールまたは特定核酸フラグ
メントまたは配列の対立遺伝子上で盲目的に実施され得
る。しかし、特定核酸フラグメントの実際のＤＮＡまた
はＲＮＡ配列を知る必要はない。 【０１６４】遺伝子の混合集団内で組換えを使用するア
プローチは、任意の有用なタンパク質（例えば、インタ
ーロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、成長ホルモンなど）を生
成するために有用であり得る。本アプローチは、変化さ
れた特異性または活性を有するタンパク質を生成するた
めに使用され得る。本アプローチは変異体核酸配列（例
えば、プロモーター領域、イントロン、エキソン、エン
ハンサー配列、遺伝子の３’非翻訳領域または５’非翻
訳領域）を生成するために有用であり得る。従って、本
アプローチは増加された発現率を有する遺伝子を生成す
るために使用され得る。本アプローチは、反復性ＤＮＡ
配列の研究においてもまた有用であり得る。最後に本ア
プローチは、リボザイムまたはアプタマーを変異させる
のに有用であり得る。 【０１６５】タンパク質における多様性の領域を分離す
るスカホールド様領域は、本発明の方法に特に適切であ
り得る。保存されたスカホールドは、自己結合により全
体の折り畳みを決定するが、特異的結合を媒介する比較
的制限されていないループをディスプレイする。このよ
うなスカホールドの例は、免疫グロブリンβバレル、お
よび４へリックス束である。本発明の方法は、結合につ
いて変異配列の種々の組み合わせを有するスカホールド
様タンパク質を作製するために使用され得る。 【０１６６】いくつかの標準的な遺伝交配の等価物がま
た、本発明の方法により実施され得る。例えば、「分
子」戻し交雑は、目的の変異を選択しながら、変異体の
核酸を野生型の核酸と繰り返し混合することにより実施
され得る。従来の育種におけるように、本アプローチは
異なる供給源に由来する表現型を選択されるバックグラ
ンドへ組み合わせるために使用され得る。本アプローチ
では、例えば、選択されない特徴（例えば、免疫原性）
に影響する中立変異を除去するために有用である。従っ
て、本アプローチは、タンパク質のどの変異が増強され
た生物学的活性に関連するか、そしてどの変異が関連し
ないかを決定するために有用であり得る。 【０１６７】（ペプチドディスプレイ法）本方法は、開
示された方法のいずれかによるインビトロおよび／また
はインビボにおける組換えにより、および任意の組み合
わせで、ペプチドディスプレイ法により選択されるポリ
ヌクレオチド配列を再編成するために使用され得、ここ
では会合されたポリヌクレオチドは、表現型（例えば、
予め決定されたレセプター（リガンド）に対するアフィ
ニティーについて）についてスクリーニングされるディ
スプレイされたペプチドをコードする。 【０１６８】生物薬剤の開発および分子生物学の増々重
要な局面は、生体高分子と相互作用するペプチドまたは
ペプチド疑似体のペプチド構造（アミノ酸一次配列を包
含する）の同定である。所望の構造または所望の機能的
特性（例えば、予め決定された生体高分子（例えば、レ
セプター）に対する結合）を有するペプチドを同定する
１つの方法は、ペプチドのアミノ酸配列により与えられ
る所望の構造または所望の機能的特性を有する個々のラ
イブラリーメンバーについて、大規模なライブラリーま
たはペプチドをスクリーニングすることを包含する。 【０１６９】ペプチドライブラリーを生成する直接化学
合成方法に加えて、いくつかのＤＮＡ組換え方法もまた
報告されている。１つの型は、バクテリオファージ粒子
または細胞表面上のペプチド配列、抗体、または他のタ
ンパク質のディスプレイを包含する。一般に、これらの
方法において、それぞれのバクテリオファージ粒子また
は細胞は、天然のバクテリオファージまたは細胞のタン
パク質配列に加えて、ディスプレイされたペプチドの単
一種をディスプレイする個々のライブラリーメンバーと
して供せられる。各バクテリオファージまたは細胞は、
特定のディスプレイされたペプチドの配列をコードする
核酸配列情報を含有し；従って、ディスプレイされたペ
プチド配列は、単離されたライブラリーメンバーのヌク
レオチド配列決定により確かめられ得る。 【０１７０】周知のペプチドディスプレイ方法は、繊維
状バクテリオファージの表面上のペプチド配列（代表的
には、バクテリオファージコートタンパク質との融合物
として）の提示を包含する。バクテリオファージライブ
ラリーは固定化した予め決定された高分子または小分子
（例えば、レセプター）とともにインキュベートされ
得、それにより固定化高分子に結合するペプチド配列を
提示するバクテリオファージ粒子が、予め決定された高
分子に結合するペプチド配列を提示しないバクテリオフ
ァージ粒子と差別的に区分され得る。次いで、固定化高
分子に結合するバクテリオファージ粒子（すなわち、ラ
イブラリーメンバー）は回収され、そして次のアフィニ
ティー増強およびファージ複製ラウンドのため、複製さ
れて、選択されるバクテリオファージサブ集団を増幅す
る。数ラウンドのアフィニティー増強およびファージ複
製の後、このように選択されたバクテリオファージライ
ブラリーメンバーは単離され、そしてディスプレイされ
たペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が決定さ
れ、これにより予め決定された高分子（例えば、レセプ
ター）に結合するペプチドの配列（１つまたは複数）を
同定する。このような方法はＰＣＴ特許公開第９１／１
７２７１号、同９１／１８９８０号、および同９１／１
９８１８号ならびに９３／０８２７８号においてさらに
記載されている。 【０１７１】後者のＰＣＴ公開は、ペプチドリガンドの
ディスプレイのための組換えＤＮＡ方法が、第１のポリ
ペプチド部分（代表的には可変配列を含み、予め決定さ
れた高分子への潜在的な結合に利用可能である）、およ
び第２のポリペプチド部分（個々の融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡベクターのようなＤＮＡに結合する）で
構成される融合タンパク質をそれぞれ有する融合タンパ
ク質のライブラリーの生成を包含することを記載してい
る。形質転換された宿主細胞が融合タンパク質の発現を
可能にする条件下で培養される場合、融合タンパク質は
それをコードするＤＮＡベクターに結合する。宿主細胞
の溶解の際に、融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体
は、バクテリオファージ粒子がファージに基づくディス
プレイシステムにおいてスクリーニングされるのとほぼ
同様にして、予め決定された高分子に対してスクリーニ
ングされ得、選択された融合タンパク質／ベクターＤＮ
Ａ複合体におけるＤＮＡベクターの複製および配列決定
が、選択されるライブラリーペプチド配列（１つまたは
複数）の同定のための基礎として供せられる。 【０１７２】ペプチドおよび同様のポリマーのライブラ
リーを生成する他のシステムは、組換え方法およびイン
ビトロにおける化学合成方法の両方の局面を有する。こ
れらのハイブリッド方法において、無細胞酵素機構がラ
イブラリーメンバー（すなわち、ペプチドまたはポリヌ
クレオチド）のインビトロにおける合成を達成するため
に使用される。１つの型の方法において、予め決定され
たタンパク質または予め決定された色素分子を結合する
能力を有するＲＮＡ分子が、選択およびＰＣＲ増幅を交
互に行うことにより選択された（ＴｕｅｒｋおよびＧｏ
ｌｄ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０
５；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ （１９
９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８）。同様の技術
が、予め決定されたヒト転写因子を結合するＤＮＡ配列
を同定するために使用された（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢ
ａｃｈ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１８：３２０３；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙ
ｃｅ （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７；６３
５；ＰＣＴ特許公開第９２／０５２５８号および第９２
／１４８４３号）。同様の様式において、インビトロに
おける翻訳の技術が目的のタンパク質を合成するために
使用され、そしてペプチドの大規模なライブラリーを生
成する方法として提案されてきた。一般に安定化された
ポリソーム複合体を含有するインビトロにおける翻訳に
依存するこれらの方法は、ＰＣＴ特許出願第８８／０８
４５３号、第９０／０５７８５号、第９０／０７００３
号、第９１／０２０７６号、９１／０５０５８号、およ
び９２／０２５３６号にさらに記載されている。出願人
らは、ライブラリーメンバーが、ＤＮＡ結合活性を有す
る第１のポリペプチド部分、およびライブラリーメンバ
ーの独特のペプチド配列を有する第２のポリペプチド部
分を有する融合タンパク質を含む方法を記載し；このよ
うな方法は、無細胞インビトロ選択形式における使用
に、特に適切である。 【０１７３】ディスプレイされたペプチド配列は、代表
的には３〜５０００アミノ酸以上、頻繁には５〜１００
アミノ酸、そしてしばしば約８〜１５アミノ酸の種々の
長さであり得る。ライブラリーは、ディスプレイされた
ペプチド配列の種々の長さを有するライブラリーメンバ
ーを含有し得るか、またはディスプレイされたペプチド
配列の固定した長さを有するライブラリーメンバーを含
有し得る。ディスプレイされたペプチド配列（１つまた
は複数）の１部分または全ては、ランダムな配列、疑似
ランダムな配列、規定の核セットの配列、固定した配列
などであり得る。本ディスプレイ方法は、ポリソーム上
の新生ｓｃＦｖまたはファージ上に表示されたｓｃＦｖ
のような単鎖抗体のインビトロおよびインビボにおける
ディスプレイの方法を包含し、広い多様性の可変領域配
列および結合特異性を有するｓｃＦｖライブラリーを、
大規模なスケールでスクリーニングし得る。 【０１７４】本発明はまた、ランダムな配列、疑似ラン
ダムな配列、および規定の配列のフレームワークペプチ
ドライブラリーを提供し、および目的のレセプター分子
またはエピトープ、またはペプチドを改変する遺伝子産
物、またはＲＮＡに所望の様式で結合する有用な化合物
（例えば、ペプチド、単鎖抗体を含む）を同定するため
に、それらのライブラリーを生成し、スクリーニングす
る方法を提供する。ランダムな配列、疑似ランダムな配
列、および規定の配列のフレームワークペプチドは、デ
ィスプレイされたペプチド、またはディスプレイされた
ペプチドが合成されたポリヌクレオチドの鋳型に付着す
るディスプレイされた単鎖抗体を含むペプチドライブラ
リーメンバーのライブラリーから生成される。付着の様
式は、選択された本発明の特定の実施態様に従って変化
し得、そしてファージ粒子におけるキャプシドの包みこ
み、または細胞における取り込みを包含し得る。 【０１７５】アフィニティー増強方法は、ペプチドおよ
び単鎖抗体のかなり大規模なライブラリーがスクリーニ
ングされ、そして所望のペプチド（１つまたは複数）ま
たは単鎖抗体をコードするポリヌクレオチド配列が選択
されることを可能にする。次いで、ポリヌクレオチドは
単離および再編成され得、選択されるペプチド（１つま
たは複数）の（またはその予め決定された部分）または
単鎖抗体（または、ちょうどそのＶH、ＶL、またはＣＤ
Ｒ部分）のアミノ酸配列を組み合わせて組換えする。こ
れらの方法を使用して、ペプチドまたは単鎖抗体を分子
について所望の結合アフィニティーを有するとして同定
し得、そして所望の高アフィニティーペプチドまたはｓ
ｃＦｖに迅速に集めるために再編成のプロセスを活用し
得る。次いで、ペプチドまたは抗体は、任意の適切な使
用（例えば、治療剤または診断剤として）のために、従
来の手段により大量に合成され得る。 【０１７６】本発明の著しい利点は、予想されるリガン
ド構造に関する以前の情報が目的のペプチドリガンドま
たは抗体を単離するために全く要求されないことであ
る。同定されたペプチドは、生物学的活性を有し得、こ
のことは選択されるレセプター分子に対する特異的な結
合アフィニティーを少なくとも含むことが意味され、そ
して、いくつかの例において、他の化合物の結合をブロ
ックし、代謝経路を刺激または阻害し、シグナルまたは
メッセンジャーとして作用し、細胞活性を刺激または阻
害するなどの能力をさらに包含する。 【０１７７】本発明はまた、予め決定されたレセプター
（例えば、哺乳動物タンパク質性レセプター（例えば、
ペプチド性ホルモンレセプター、細胞表面レセプター、
他のタンパク質（１つまたは複数）に結合してヘテロダ
イマーのような細胞内タンパク質複合体を形成する細胞
内タンパク質など）、またはエピトープ（例えば、固定
化タンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖など）に結合す
るライブラリーメンバーについて、新生ペプチド（単鎖
抗体を包含する）をディスプレイするポリソームのライ
ブラリーをアフィニティースクリーニングすることによ
り選択されるポリヌクレオチド配列のプールを再編成す
る方法もまた提供する。 【０１７８】これらの方法のいずれかにより、第１の選
択ラウンド（代表的には、レセプター（例えば、リガン
ド）に対する結合についてのアフィニティー選択によ
る）において選択されるポリヌクレオチド配列は、プー
ルされ、そしてプール（単数または複数）はインビトロ
および／またはインビボにおける組換えにより再編成さ
れ、組換えられた選択ポリヌクレオチド配列の集団を含
む再編成プールを生成する。組換えられた選択ポリヌク
レオチド配列は、少なくとも１回の続く選択ラウンドに
かけられる。続く選択ラウンド（１回または複数回）に
おいて選択されたポリヌクレオチド配列は、直接用いら
れ得、配列決定され得、そして／または、１回以上のさ
らなるラウンドの再編成およびそれに続く選択にかけら
れ得る。選択された配列は、中立配列（すなわち、結合
において非実質的な機能的効果を有する）をコードする
ポリヌクレオチド配列と戻し交雑され（例えば、選択さ
れる配列に実質的に同一な野生型または天然に存在する
配列と戻し交雑することによる）、免疫原性の低い天然
様の機能的ペプチドを生成し得る。一般に、戻し交配の
間、続く選択は、予め決定されたレセプター（リガン
ド）への結合の特性を保有するように適用される。 【０１７９】選択配列の再編成の前または同時に、配列
が変異誘発され得る。１つの実施態様において、選択さ
れるライブラリーメンバーは、原核生物ベクター（例え
ば、プラスミド、ファージミド、またはバクテリオファ
ージ）中にクローン化され、ここでは、別個のライブラ
リーメンバーを提示する個々のコロニー（またはプラー
ク）の集合が生成される。次いで、選択される個々のラ
イブラリーメンバーは操作され（例えば、部位特異的変
異誘発、カセット変異誘発、化学変異誘発、ＰＣＲ変異
誘発など）、選択されるライブラリーメンバーの配列に
基づいて配列の多様性のカーネル（ｋｅｒｎａｌ）を提
示するライブラリーメンバーの集合を生成し得る。選択
される個々のライブラリーメンバーまたはプールの配列
は操作され、ランダム変異、疑似ランダムな変異、規定
のカーネル変異（すなわち、可変残基位置および不変残
基位置を含み、そして／またはアミノ酸残基の規定のサ
ブセットから選択される残基を含み得る可変残基位置を
含む）、コドンに基づく変異などを、選択される個々の
ライブラリーメンバー配列にセグメント的にまたは全長
にわたってのいずれかで、組み込み得る。変異誘発され
た選択ライブラリーメンバーは、次いで、本明細書で記
載されるインビトロおよび／またはインビボにおける組
換え再編成により、再編成される。 【０１８０】本発明はまた、本発明の複数の個々のライ
ブラリーメンバーを含むペプチドライブラリーを提供
し、ここでは（１）上記複数のうち各個々のライブラリ
ーメンバーが、選択される配列のプールの再編成により
生成される配列を含有し、そして（２）各個々のライブ
ラリーメンバーは、可変ペプチドセグメント配列または
単鎖抗体セグメント配列（これは、上記複数における他
の個々のライブラリーメンバーの可変ペプチドセグメン
ト配列または単鎖抗体配列から区別される）を含有する
（しかし、いくつかのライブラリーメンバーは、不均一
な増幅、推計学的確率などのために、ライブラリー当た
り１コピー以上で存在し得る）。 【０１８１】本発明はまた、その方法によって作られる
もの（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂｙ−ｐｒｏｓｅｓｓ）を提供
する。ここでは、予め決定された結合特異性を有する
（または予め決定された結合特異性を有するペプチドを
コードする）選択されたポリヌクレオチド配列が、以下
の工程により形成される：（１）ディスプレイペプチド
またはディスプレイ単鎖抗体のライブラリーを予め決定
されたレセプター（例えば、リガンド）またはエピトー
プ（例えば、抗原高分子）に対してスクリーニングし、
そして予め決定されたレセプターまたはエピトープに結
合するライブラリーメンバーを同定および／または濃縮
し、選択されたライブラリーメンバーのプールを生成す
る工程、（２）予め決定されたエピトープを結合して、
そしてそれによりライブラリーから単離および／または
濃縮されて再編成ライブラリーを生成する選択されたラ
イブラリーメンバー（または増幅またはクローン化され
たそのコピー）を、組換えにより再編成する工程、およ
び（３）再編成ライブラリーを予め決定されたレセプタ
ー（例えば、リガンド）またはエピトープ（例えば、抗
原高分子）に対してスクリーニングし、そして予め決定
されたレセプターまたはエピトープに結合する再編成ラ
イブラリーメンバーを同定および／または濃縮し、選択
された再編成ライブラリーメンバーのプールを生成する
工程。 【０１８２】（抗体ディスプレイおよびスクリーニング
法）本発明の方法は、開示された方法のいずれかによる
インビトロおよび／またはインビボ組換えおよび任意の
組み合わせにより、抗体ディスプレイ法により選択され
たポリヌクレオチド配列を再編成するために用いられ得
る。ここで会合されたポリヌクレオチドは、表現型（例
えば、予め決定された抗原（リガンド）への結合につい
てのアフィニティー）についてスクリーニングされたデ
ィスプレイされた抗体をコードする。 【０１８３】種々の分子遺伝学的アプローチが、免疫グ
ロブリン鎖中に存在し得る非常に多数の異なる可変領域
により表される広大な免疫学的レパートリーを捕獲する
ために考案されている。天然に存在する生殖系列免疫グ
ロブリンＨ鎖座位は、多様性（Ｄ）セグメント遺伝子の
直列の配列の上流に位置する可変性（Ｖ）セグメント遺
伝子の分離した直列の配列からなる。このＤセグメント
自身は、結合（Ｊ）領域遺伝子の直列の配列の上流に位
置し、Ｊ領域は、定常（ＣH）領域遺伝子の上流に位置
する。Ｂリンパ球の発達の間、Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列が生
じ、ここでＨ鎖可変領域遺伝子（ＶH）は、融合したＤ
−Ｊセグメントを形成するための再配列、それに続くＶ
−Ｄ−Ｊ結合産物遺伝子を形成するためのＶセグメント
との再配列により形成され、生産的に再配列される場
合、このＶ−Ｄ−Ｊ結合産物遺伝子は、機能的なＨ鎖の
可変領域（ＶH）をコードする。同様に、Ｌ鎖座位は、
いくつかのＪセグメントの１つといくつかのＶセグメン
トの１つを再配列し、Ｌ鎖の可変領域（ＶL）をコード
する遺伝子を形成する。 【０１８４】免疫グロブリン中にあり得る可変領域の広
範なレパートリーは、Ｂ細胞発達における再配列の間の
ＶセグメントとＪセグメント（とＤセグメント（Ｈ鎖座
位である場合））との結合の多数の組み合わせの可能性
に部分的に由来する。Ｈ鎖可変領域における付加的な配
列多様性は、Ｖ−Ｄ−Ｊ結合の間のＤセグメントの不均
一な再配列、およびＮ領域付加から生じる。さらに、特
定のＢ細胞クローンの抗原選択は、Ｈ鎖とＬ鎖の可変領
域のいずれか１つまたは両方に非生殖系列変異を有する
変異体をより高いアフィニティーに関して選択する；こ
の現象は、「アフィニティー成熟」または「アフィニテ
ィー鋭敏化（ｓｈａｒｐｅｎｉｎｇ）」と呼ばれる。代
表的には、これらの「アフィニティー鋭敏化」変異は、
可変領域の特定の範囲に、最も一般的には相補性決定領
域（ＣＤＲ）中にクラスター形成する。 【０１８５】抗原刺激化Ｂ細胞の発達（すなわち、免疫
化）を通して高アフィニティー免疫グロブリンを産生お
よび同定することにおける多くの制限を克服するため
に、特異的な抗原に対する高アフィニティー抗体につい
てスクリーニングされ得る組み合わせの抗体ライブラリ
ーを作製するように操作され得る種々の原核生物の発現
システムが開発されている。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉおよびバクテリオファージシステムにおける抗
体の発現における最近の利点（以下の「別のペプチドデ
ィスプレイ法」を参照のこと）は、実際に任意の特異性
が、特徴づけられたハイブリドーマから抗体遺伝子をク
ローニングするか、または抗体遺伝子ライブラリー（例
えば、Ｉｇ ｃＤＮＡから）を用いる新規選択のいずれ
かにより得られ得るという可能性を増加している。 【０１８６】抗体の組み合わせのライブラリーは、バク
テリオファージプラークまたは溶原菌のコロニーとして
スクリーニングされ得るバクテリオファージλ発現シス
テムにおいて生成されている（Ｈｕｓｅら、（１９８
９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５； Ｃａｔ
ｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ （１９９０） Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
８７： ６４５０； Ｍｕｌｌｉｎａｘら、（１９９
０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．
Ｓ．Ａ．） ８７： ８０９５； Ｐｅｒｓｓｏｎら、
（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：２４３２）。バクテリオ
ファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファー
ジ発現ライブラリーの種々の実施様態が、記載されてい
る（Ｋａｎｇら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８： ４３６
３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ
３５２： ６２４；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９
９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８： ５５２；Ｂｕｒｔｏ
ｎら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８： １０１３４；Ｈｏｏ
ｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９： ４１３３；Ｃｈａｎｇら、
（１９９１） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７： ３６１
０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、（１９９１）Ｇｅｎｅ １
０４： １４７；Ｍａｒｋｓら、（１９９１） Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２： ５８１；Ｂａｒｂａｓら、
（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８９： ４４５７；Ｈａｗｋｉ
ｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ （１９９２） Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．２２： ８６７；Ｍａｒｋｓら、（１９９２）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ７７９；Ｍａ
ｒｋｓら、（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６７： １６００７； Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０： １０８３２；Ｌ
ｅｒｎｅｒら、（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
８： １３１３は、参考として本明細書中に援用され
る）。代表的には、バクテリオファージ抗体ディスプレ
イライブラリーは、固定化（例えば、アフィニティーク
ロマトグラフィーにより反応性ファージについて富化す
るためのクロマトグラフィー樹脂への共有結合による）
および／または標識（例えば、プラークまたはコロニー
リフトをスクリーニングするために）されているレセプ
ター（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク
質、核酸）でスクリーニングされる。 【０１８７】１つの特に有利なアプローチは、いわゆる
単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）ライブラリーの使用
である（Ｍａｒｋｓら、（１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ １０： ７７９； Ｗｉｎｔｅｒ Ｇお
よびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ
３４９： ２９３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９
１） 前出；Ｍａｒｋｓら、（１９９１） Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ
ら、（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ） ８７： １０６６；Ｃｈｉｓｗｅｌ
ｌら、（１９９２） ＴＩＢＴＥＣＨ １０： ８０；
ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）前出；およびＨ
ｕｓｔｏｎら、（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８５： ５８７９）。バ
クテリオファージコートタンパク質においてディスプレ
イされるｓｃＦｖライブラリーの種々の実施様態が記載
されている。 【０１８８】１９８８年のはじめ、Ｆｖフラグメントの
単鎖アナログおよびそれらの融合タンパク質が、抗体工
学法により確実に生成されている。第１の工程は、一般
に、所望の結合特性を有するＶHおよびＶLドメインをコ
ードする遺伝子を得ることを包含する；これらのＶ遺伝
子は、特定のハイブリドーマ細胞株から単離され得る
か、組み合わせのＶ遺伝子ライブラリーから選択され得
るか、またはＶ遺伝子合成により作製され得る。単鎖Ｆ
ｖは、成分Ｖ遺伝子と適切に設計されたリンカーペプチ
ド（例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ）3または等価のリンカーペプチド（１つまたは複
数））をコードするオリゴヌクレオチドとを結合するこ
とにより形成される。リンカーは、ＶH−リンカー−ＶL
またはＶL−リンカー−ＶHのいずれかの順序で第１のＶ
領域のＣ−末端、および第２のＶ領域のＮ−末端に橋を
架ける。原則として、ｓｃＦｖ結合部位は、その親の抗
体結合部位のアフィニティーおよび特異性の両方を正確
に複製し得る。 【０１８９】従って、ｓｃＦｖフラグメントは、柔軟な
リンカーペプチドにより単一のポリペプチド鎖に連結さ
れたＶHおよびＶLドメインからなる。ｓｃＦｖ遺伝子が
組立てられた後、それらは、ファージミド中にクローン
化され、そしてバクテリオファージｐＩＩＩ（遺伝子
３）コートタンパク質との融合タンパク質としてＭ１３
ファージ（または類似の繊維状バクテリオファージ）の
先端部で発現される。目的の抗体を発現するファージの
富化は、予め決定されたエピトープ（例えば、標的抗
原、レセプター）への結合についてｓｃＦｖ集団をディ
スプレイする組換えファージをパンニングすることによ
り達成される。 【０１９０】ライブラリーメンバーの連結ポリヌクレオ
チドは、スクリーニング手順または選択手順後のライブ
ラリーメンバーの複製に関する基礎を提供し、そしてヌ
クレオチド配列決定による、ディスプレイされたペプチ
ド配列またはＶHおよびＶLアミノ酸配列の正体の決定の
ための基礎をも提供する。ディスプレイされたペプチド
（１つまたは複数）または単鎖抗体（例えば、ｓｃＦ
ｖ）および／またはそのＶHおよびＶLドメインあるいは
それらのＣＤＲは、適切な発現システムにクローン化さ
れ得、そして発現され得る。しばしば、単離されたＶH
およびＶLドメインをコードするポリヌクレオチドは、
定常領域（ＣHおよびＣL）をコードするポリヌクレオチ
ドに連結され、完全な抗体（例えば、キメラ、または完
全なヒトの抗体）、抗体フラグメントなどをコードする
ポリヌクレオチドを形成する。しばしば、単離されたＣ
ＤＲをコードするポリヌクレオチドは、適切な可変領域
フレームワーク（および随意に定常領域）をコードする
ポリヌクレオチドに融合され、完全な抗体（例えば、ヒ
ト化または完全なヒト抗体）、抗体フラグメントなどを
コードするポリヌクレオチドを形成する。抗体は、免疫
アフィニティークロマトグラフィーにより、調製量の抗
原を単離するために用いられ得る。このような抗体の種
々の他の使用は、疾患（例えば、腫瘍形成）を診断／ま
たは段階づけすること、および治療応用のために、疾患
（例えば：腫瘍形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管
性疾患、感染症など）を処置することである。 【０１９１】種々の方法が、ｓｃＦｖライブラリーの組
み合わせの多様性の増加が、結合種のレパートリー（イ
ディオタイプスペクトル）を広げることについて報告さ
れている。ＰＣＲの使用は、可変領域を、特定のハイブ
リドーマ供給源からか、または非免疫化細胞から遺伝子
ライブラリーとして、迅速にクローン化することを可能
にし、これは組み合わされ得るＶHおよびＶLカセットの
分類における組み合わせの多様性を供給する。さらに、
ＶHおよびＶLカセットは、例えば、ランダムな変異誘
発、疑似ランダムな変異誘発、または定方向変異誘発
（ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、
それ自身多様化させられ得る。代表的には、ＶHおよび
ＶLカセットは、相補性決定領域（ＣＤＲ）（しばしば
第３のＣＤＲ、ＣＤＲ３）内またはその近くにおいて多
様化される。酵素的インバースＰＣＲ変異誘発は、誤り
がちなＰＣＲおよび化学的変異誘発がそうであるように
（Ｄｅｎｇら、（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６９：９５３３）、ｓｃＦｖ部位特異的変異体の
比較的大きなライブラリーを構築することに関して単純
かつ信頼し得る方法であることが示されている（Ｓｔｅ
ｍｍｅｒら、（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１４： ２５６）。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９９
３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２： ８８４８
は、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲおよび引き続いて結
果として生じるｓｃＦｖ変異体のファージディスプレイ
による部位特異的ランダム化を用いる抗体ｓｃＦｖフラ
グメントの半合理的な設計を示した。Ｂａｒｂａｓら、
（１９９２） 前出は、ヒト破傷風トキソイド結合Ｆａ
ｂの合成ＣＤＲ領域における配列をランダム化すること
により、偏った可変領域配列を用いることに起因する制
限されたレパートリーサイズの問題を回避することを試
みた。 【０１９２】ＣＤＲランダム化は、Ｈ鎖ＣＤＲ３のみに
ついて約１×１０20 ＣＤＲ、そしておおよそ類似した
数のＨ鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の変異体、ならびにＬ
鎖ＣＤＲ１−３変異体を作製する潜在力を有する。個々
にまたは一緒に考慮すると、Ｈ鎖および／またはＬ鎖の
ＣＤＲランダム化の組み合わせは、全ての可能な組み合
わせを提示するクローンライブラリーを作製するため
に、膨大な数のバクテリオファージクローン（それらの
ほとんどは、非結合性である）の生成を必要とする。こ
のような多数の初期形質転換体の生成は、現在の形質転
換技術およびバクテリオファージディスプレイシステム
では、容易ではない。例えば、Ｂａｒｂａｓら、（１９
９２） 前出は、５×１０7の形質転換体のみを生成
し、これは、完全にランダム化されたＣＤＲのライブラ
リーのごく小さな割合の潜在的多様性のみを提示する。 【０１９３】これらの実質的な制限にも関わらず、ｓｃ
Ｆｖのバクテリオファージディスプレイはすでに、種々
の有用な抗体および抗体融合タンパク質を産生してい
る。二特異性の単鎖抗体は、効率的な腫瘍細胞溶解を仲
介することが示されている（Ｇｒｕｂｅｒら、（１９９
４） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２： ５３６８）。抗
Ｒｅｖ ｓｃＦｖの細胞内発現は、インビトロでのＨＩ
Ｖ−１ウイルス複製を阻害することが示されており（Ｄ
ｕａｎら、（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９１： ５０７５）、そして
抗ｐ２１ras ｓｃＦｖの細胞内発現は、Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ卵母細胞の減数分裂の成熟を阻害することが示されて
いる（Ｂｉｏｃｃａら、（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７：
４２２）。ＨＩＶ感染を診断するために用いら得る組換
えｓｃＦｖもまた、報告されており、ｓｃＦｖの診断上
の利用性が示されている（Ｌｉｌｌｅｙら、（１９９
４） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７１：２１
１）。ｓｃＦｖが第２のポリペプチド（例えば、毒素ま
たは線維素溶解性活性化タンパク質）に連結している融
合タンパク質もまた報告されている（Ｈｏｌｖｏｓｔ
ら、（１９９２） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１
０： ９４５； Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、（１９９３）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８： ５３０２）。 【０１９４】広範な抗体多様性を有し、そして潜在的な
配列組み合わせの非常に小さい割合のみをカバーし得る
多くの従来のＣＤＲ変異誘発およびランダム化法の制限
の多くを克服するｓｃＦｖライブラリーを生成し得るな
らば、ｓｃＦｖ抗体の数および質を治療上および診断上
の使用に適切に大幅に改善してもよい。これに取り組む
ために、本発明のインビトロおよびインビボ再編成法
が、選択されたディスプレイされた抗体から得られた核
酸から（代表的にＰＣＲ増幅またはクローン化により）
得られたＣＤＲを組み換えるために用いられる。このよ
うなディスプレイされた抗体は、細胞、バクテリオファ
ージ粒子、ポリソーム、または任意の適切な抗体ディス
プレイシステムにおいて、ディスプレイされ得る。ここ
で抗体が、それをコードする核酸（１つまたは複数）と
会合されている。ある改変例においては、ＣＤＲは最初
に、抗体産生細胞（例えば、第ＷＯ９２／０３９１８
号、第ＷＯ９３／１２２２７号、および第ＷＯ９４／２
５５８５号に記載のように、免疫化した野生型マウス、
ヒト、またはヒト抗体を作製し得るトランスジェニック
マウス由来の形質細胞／脾細胞）（これはそれに由来す
るハイブリドーマを包含する）由来のｍＲＮＡ（または
ｃＤＮＡ）から得られる。 【０１９５】これらの方法のいずれかにより第１の選択
ラウンドにおいて選択された（代表的には、ディスプレ
イされた抗体が抗原（例えば、リガンド）に結合するこ
とに関するアフィニティー選択による）ポリヌクレオチ
ド配列は、プールされ、そしてこのプール（１つまたは
複数）は、インビトロおよび／またはインビボ組換え、
特にＣＤＲの再編成により再編成され（代表的には、Ｈ
鎖ＣＤＲが他のＨ鎖ＣＤＲで再編成され、そしてＬ鎖Ｃ
ＤＲが他のＬ鎖ＣＤＲで再編成される）、組み換えられ
た選択ポリヌクレオチド配列の集団を含有する再編成さ
れたプールを作製する。組み換えられた選択ポリヌクレ
オチド配列は、ディスプレイされた抗体のような選択様
式において発現され、そして少なくとも１回の引き続く
選択ラウンドにかけられる。引き続く選択ラウンド（１
回または複数回）において選択されたポリヌクレオチド
配列は、直接使用され得、配列決定され得、そして／ま
たは所望の結合アフィニティーを有する抗体が得られる
まで１回またはそれ以上の更なる再編成および引き続く
選択のラウンドにかけられ得る。選択された配列はま
た、中立の抗体フレームワーク配列をコードするポリヌ
クレオチド配列（すなわち、抗原結合において非実質的
な機能的効果を有する）と戻し交雑され（例えば、ヒト
可変領域フレームワークとの戻し交雑による）、ヒト様
配列抗体を作製し得る。一般に、戻し交雑の間、引き続
く選択は、予め決定された抗原への結合の特性を保有す
るように適用される。 【０１９６】あるいは、または公知の改変例との組み合
わせにおいて、標的エピトープの結合価は、選択された
ｓｃＦｖライブラリーメンバーの平均結合アフィニティ
ーを調節するように、改変され得る。標的エピトープ
は、例えば、競合エピトープを含有すること、希釈、ま
たは当業者に公知の他の方法により、種々の密度で表面
または基質に結合され得る。予め決定されたエピトープ
の高密度（結合価）は、比較的低いアフィニティーを有
するｓｃＦｖライブラリーメンバーについて富化するた
めに用いられ得る。一方、低密度（結合価）は、より高
いアフィニティーについてｓｃＦｖライブラリーメンバ
ーを優先的に富化し得る。 【０１９７】多種多様な可変セグメントを生成するため
に、ペプチド配列のランダム、疑似ランダム、または規
定の配列のカーネルセットをコードする合成オリゴヌク
レオチドの集合は、予め決定された部位（例えば、ＣＤ
Ｒ）への連結により挿入され得る。同様に、単鎖抗体カ
セット（１つまたは複数）の１つまたはそれ以上のＣＤ
Ｒの配列多様性は、部位特異的変異誘発、ＣＤＲ置換な
どを用いてＣＤＲ（１つまたは複数）を変異させること
により拡大され得る。生じるＤＮＡ分子は、再編成の前
のクローン化および増幅のために宿主において増殖され
得るか、または直接使用され得（すなわち、宿主細胞に
おける増殖の際に生じ得る多様性の損失を回避し得
る）、そして選択されたライブラリーメンバーは、引き
続いて再編成される。 【０１９８】目的の可変セグメントペプチド配列または
目的の単鎖抗体をコードするディスプレイされたペプチ
ド／ポリヌクレオチド複合体（ライブラリーメンバー）
は、アフィニティー富化技術により、ライブラリーから
選択される。これは、目的のペプチド配列に特異的な固
定化された高分子またはエピトープ（例えば、レセプタ
ー、他の高分子、または他のエピトープ種）により達成
される。アフィニティー選択手順を繰り返すことによ
り、所望の配列をコードするライブラリーメンバーの富
化物が提供され、次いでこの富化物は、プールおよび再
編成、配列決定、および／または更なる増殖およびアフ
ィニティー富化のために単離され得る。 【０１９９】所望の特異性を有しないライブラリーメン
バーは、洗浄により除去される。要求される洗浄の度合
およびストリンジェンシーは、目的のそれぞれのペプチ
ド配列または単鎖抗体、および固定化された予め決定さ
れた高分子またはエピトープに関して決定される。調節
の所定の度合は、結合のインキュベーションおよび引き
続く洗浄の条件を調整することにより、回収された新生
のペプチド／ＤＮＡ複合体の結合特性に影響を及ぼし得
る。温度、ｐＨ、イオン強度、二価陽イオン濃度、およ
び洗浄の容量および持続時間は、固定化高分子に対する
アフィニティーの特別な範囲内で、新生のペプチド／Ｄ
ＮＡ複合体について選択される。通常、高アフィニティ
ーの指標となる緩徐な解離速度に基づく選択は、しばし
ば最も実践的な経路である。これは、飽和量の遊離した
予め決定された高分子の存在下における継続的なインキ
ュベーション、または洗浄の容量、回数、および長さを
増加させることのいずれかにより実施され得る。それぞ
れの場合において、解離した新生ペプチド／ＤＮＡまた
はペプチド／ＲＮＡ複合体の再結合は防止され、そして
時間の増加とともに、徐々にアフィニティーが高くなる
新生のペプチド／ＤＮＡまたはペプチド／ＲＮＡ複合体
が回収される。 【０２００】結合および洗浄の手順のさらなる改変は、
特別な特徴を有するペプチドを見い出すために適用され
得る。いくつかのペプチドのアフィニティーは、イオン
強度または陽イオン濃度に依存する。これは、ペプチド
からこのタンパク質を除去するのに穏やかな条件が要求
される場合の種々のタンパク質のアフィニティー精製に
おいて用いられるペプチドについて有用な特徴である。 【０２０１】１つの改変例は、ｓｃＦｖライブラリー
が、異なる結合特異性を有するｓｃＦｖの多重性につい
て同時にスクリーニングされ得るような、多重結合標的
（多重エピトープ種、多重レセプター種）の使用を包含
する。ｓｃＦｖライブラリーのサイズが、しばしば潜在
的なｓｃＦｖ配列の多様性を制限すると仮定すると、一
般に、可能な限りの大きなサイズのｓｃＦｖライブラリ
ーが本発明者らにとって望ましい。多数の非常に大きな
ポリソームｓｃＦｖ−ディスプレイライブラリーを生成
することの時間性および経済性の考慮は、障害になり得
る。この実質的な問題を回避するために、多重性を有す
る予め決められたエピトープ種（レセプター種）が、単
一のライブラリーにおいて同時にスクリーニングされ得
るか、または多数のエピトープ種に対する逐次スクリー
ニングが用いられ得る。１つの改変例において、それぞ
れ別個のビーズ（またはビーズのサブセット）にコード
される多重標的エピトープ種は、適切な結合条件下でポ
リソームディスプレイｓｃＦｖライブラリーと混合およ
びインキュベートされ得る。次いで多重エピトープ種を
含有するビーズの集合は、アフィニティー選択により、
ｓｃＦｖライブラリーメンバーを単離するために用いら
れ得る。一般に、引き続くアフィニティースクリーニン
グラウンドは、ビーズの同一の混合物、それのサブセッ
ト、または１つのみまたは２つの個々のエピトープ種を
含有するビーズを包含し得る。このアプローチは、効率
的なスクリーニングを提供し、そして研究自動化法、バ
ッチプロセシング法、および高処理能力スクリーニング
法と適合する。 【０２０２】種々の技術は、予め決定された高分子また
はエピトープに対する十分な結合活性を有するように、
ペプチドライブラリーまたは単鎖抗体ライブラリーを多
様化するために、あるいは再編成の前または同時に、周
囲の可変セグメントペプチドまたはＶH、ＶL、あるいは
パンニングの初期のラウンドにおいて見い出されるＣＤ
Ｒを多様化するために本発明において用いられ得る。１
つのアプローチにおいて、ポジティブに選択されたペプ
チド／ポリヌクレオチド複合体（アフィニティー富化の
初期のラウンドにおいて同定される複合体）は、活性ペ
プチドの正体を決定するために配列決定される。次いで
オリゴヌクレオチドは、これらの活性ペプチド配列に基
づいて合成され、これはそれぞれの工程で取り込まれる
全ての塩基を低レベルで使用し、一次オリゴヌクレオチ
ド配列の僅かな改変例を生じる。次いでこの（僅かに）
縮重したオリゴヌクレオチドの混合物は、適切な位置で
可変セグメント配列中にクローン化される。この方法
は、開始ペプチド配列の規則正しい調節された改変例を
生じ、次いでこれらは再編成され得る。しかしこの方法
は、個々のポジティブ新生ペプチド／ポリヌクレオチド
複合体が、変異誘発の前に配列決定されることを要求
し、従って少数の回収された複合体の多様性を拡大し、
そしてより高い結合アフィニティーおよび／またはより
高い結合特異性を有する変異体を選択するために有用で
ある。変種の、ポジティブに選択された（特に可変領域
配列の）ペプチド／ポリヌクレオチド複合体の変異性Ｐ
ＣＲ増幅において、その増幅産物は、インビトロおよび
／またはインビボで再編成され、そして１回以上のさら
なるスクリーニングのラウンドが、配列決定の前に実施
される。同一の一般的なアプローチは、多様性を拡大
し、そして結合アフィニティー／特異性を増強するため
に、代表的には、再編成の前または同時にＣＤＲまたは
隣接のフレームワーク領域を多様化することにより、単
鎖抗体とともに用いられ得る。所望であれば、再編成反
応は、選択されたライブラリーメンバーとインビトロ組
換えし得る変異原性オリゴヌクレオチドでスパイクされ
得る。従って、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲフ
ラグメント（誤りがちな方法または高度に忠実な方法に
より合成された）の混合物がインビトロ再編成混合物に
添加され、そして結果として生じる再編成されたライブ
ラリーメンバー（再編成体）中に取り込まれ得る。 【０２０３】本発明の再編成は、ＣＤＲ変異体単鎖抗体
の広大なライブラリーの生成を可能にする。このような
抗体を生成する１つの方法は、再編成の前または再編成
と同時に、単鎖抗体および／またはＣＤＲのランダム化
中に合成ＣＤＲを挿入することである。合成ＣＤＲカセ
ットの配列は、ヒトＣＤＲの公知の配列データを参照す
ることにより選択され、そして以下のガイドラインに従
って実施者の判断により選択される：合成ＣＤＲは、公
知のＣＤＲ配列に対して少なくとも４０％の位置的な配
列同一性を有し、そして好ましくは、公知のＣＤＲ配列
に対して少なくとも５０〜７０パーセントの位置的な配
列同一性を有する。例えば、合成ＣＤＲ配列の集合は、
Ｋａｂａｔら、（１９９１） 前出に列挙された天然に
存在するヒトＣＤＲ配列に基づいてオリゴヌクレオチド
配列の集合を合成することにより生成され得る；合成Ｃ
ＤＲ配列のプール（１つまたは複数）は、少なくとも一
つの公知の天然に存在するヒトＣＤＲ配列に対して少な
くとも４０％の配列同一性を有するＣＤＲペプチド配列
をコードするように計算される。あるいは、天然に存在
するＣＤＲ配列の集合が比較され得、ある残基位置に頻
繁に（すなわち、公知のＣＤＲ配列の少なくとも５％に
おいて）用いられるアミノ酸が、相当する位置（１つま
たは複数）で合成ＣＤＲ中に取り込まれるように、コン
センサス配列を生成し得る。代表的には、いくつか（例
えば、３〜約５０）の公知のＣＤＲ配列が比較され、そ
して公知のＣＤＲの間の観測された天然配列の改変例が
一覧表にされ、そして観測された天然配列の改変例の全
てまたはほとんどの順列を包含するＣＤＲペプチド配列
をコードするオリゴヌクレオチドの集合が合成される。
限定されないが、例えば、ヒトＶH ＣＤＲ配列の集合
が、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、またはＡｓｐのいずれか
であるカルボキシ末端アミノ酸を有する場合、合成ＣＤ
Ｒオリゴヌクレオチド配列のプール（１つまたは複数）
は、カルボキシ末端のＣＤＲ残基がこれらのアミノ酸の
いずれかであるように設計される。いくつかの実施様態
では、ＣＤＲ配列の集合においてある残基位置に天然に
存在する残基以外の残基が取り込まれる：保存的なアミ
ノ酸置換は、頻繁に取り込まれ、そして公知の天然に存
在するＣＤＲ配列と比較して５残基位置までが、非保存
的なアミノ酸置換が取り込まれるように変動し得る。こ
のようなＣＤＲ配列は、（第１ラウンドのスクリーニン
グの前の）最初のライブラリーメンバーにおいて用いら
れ、そして／または選択されたライブラリーメンバー配
列のインビトロの再編成反応をスパイクするために用い
られ得る。規定の配列および／または縮重配列のこのよ
うなプールの構築は、当業者により容易に達成される。 【０２０４】合成ＣＤＲ配列の集合は、天然に存在する
ＣＤＲ配列であるとして知られていない、少なくとも１
つのメンバーを含む。Ｈ鎖ＣＤＲにおけるＮ領域付加に
相当するランダムまたは疑似ランダムな配列の一部を含
有するかまたは含有しないかは、実施者の判断内にあ
る；Ｎ領域配列は、Ｖ−ＤおよびＤ−Ｊ結合部に存在す
る１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドの範囲である。合
成Ｈ鎖ＣＤＲ配列の集合は、少なくとも約１００のユニ
ークなＣＤＲ配列を含み、代表的には少なくとも約１，
０００のユニークＣＤＲ配列を含み、好ましくは、少な
くとも約１０，０００のユニークなＣＤＲ配列を含み、
しばしば５０，０００より多いユニークなＣＤＲ配列を
含む；しかし、特に、保存的なアミノ酸置換が、保存的
なアミノ酸置換基が天然に存在するヒトＣＤＲにおける
その位置に存在しないか、またはまれに存在する（すな
わち、０．１％未満）位置において許容される場合、と
きには１×１０7〜１×１０8のユニークなＣＤＲ配列が
存在することもあるが、通常、せいぜい約１×１０6の
ユニークなＣＤＲ配列が集合中に含まれる。一般に、ラ
イブラリーに含まれるユニークなＣＤＲ配列の数は、ラ
イブラリー中の最初の形質転換体の予測される数を１０
倍（ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ １０）を超えて超過する
べきでない。このような単鎖抗体は、一般に、少なくと
も約１×１０7Ｍ-1のアフィニティーで、好ましくは少
なくとも約５×１０7 Ｍ-1のアフィニティーで、より
好ましくは少なくとも１×１０8 Ｍ-1〜１×１０9 Ｍ
-1またはそれ以上のアフィニティーで、ときには１×１
０10 Ｍ-1またはそれ以上のアフィニティーで、予め決
定された抗原（例えば、免疫原）に結合する。頻繁に
は、予め決定された抗原は、例えばヒト細胞表面抗原
（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２レセプター、ＥＧ
Ｆレセプター、ＰＤＧＦレセプター）のようなヒトタン
パク質、他のヒト生体高分子（例えば、トロンボモジュ
リン、プロテインＣ、糖質抗原、シアリルＬｅｗｉｓ抗
原、Ｌ−セレクチン）、または非ヒト疾患関連高分子
（例えば、細菌ＬＰＳ、ビリオンカプシドタンパク質、
またはエンベロープ糖タンパク質）などである。 【０２０５】所望の特異性を有する高アフィニティー単
鎖抗体は、種々のシステムにおいて改変および発現され
る。例えば、ｓｃＦｖは、植物中で産生されており（Ｆ
ｉｒｅｋら、（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２３： ８６１）、そして原核生物系において容
易に生成され得る（Ｏｗｅｎｓ ＲＪおよびＹｏｕｎｇ
ＲＪ （１９９４） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．１６８： １４９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＳおよびＢｉ
ｒｄ ＲＥ （１９９１） ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍ
ｏｌ．２０３： ８８）。さらに、単鎖抗体は、抗体全
体またはその種々のフラグメントを構築する基礎として
用いられ得る（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（１９
９４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４： ９５
２）。可変領域をコードする配列は、単離され得（例え
ば、ＰＣＲ増幅またはサブクローン化により）、そして
免疫原性が好適に最小化されるヒトの治療的使用により
適切なヒト配列抗体をコードするように、所望のヒト定
常領域をコードする配列にスプライシングされ得る。結
果として生じる完全なヒトコード配列（１つまたは複
数）を有するポリヌクレオチド（１つまたは複数）は、
宿主細胞において発現され（例えば、哺乳動物細胞にお
いて発現ベクターから）、そして製薬製造のために精製
され得る。 【０２０６】ＤＮＡ発現構築物は、代表的には、コード
配列に作動可能に連結された発現調節ＤＮＡ配列を含有
し、この配列は、天然に会合したプロモーター領域、ま
たは異種のプロモーター領域を含む。好ましくは、発現
調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトラン
スフェクトし得るベクターの真核生物プロモーターシス
テムである。一旦ベクターが適切な宿主中に取り込まれ
ると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現、な
らびに変異「改変」抗体の収集および精製に適切な条件
下で維持される。 【０２０７】上述のように、ＤＮＡ配列は、配列が発現
調節配列に作動可能に連結された（すなわち、構造遺伝
子の転写および翻訳を確実にするように位置された）後
に、宿主中で発現される。これらの発現ベクターは、代
表的には、エピソームまたは宿主の染色体ＤＮＡの必須
部分として、この宿主生物において複製可能である。一
般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換さ
れたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択マー
カー（例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシン）
を含有する（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号
を参照のこと。これは、参考として本明細書中に援用さ
れる）。 【０２０８】真核の微生物（例えば、酵母）に加えて、
哺乳動物の組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチ
ドを生成するために用いられ得る（Ｗｉｎｎａｃｋｅ
ｒ、「Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，」
ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｎ．
Ｙ．（１９８７）を参照のこと。これは参考として本明
細書中に援用される）。真核細胞は、実際に好ましい。
なぜなら、無傷の免疫グロブリンを分泌し得る多数の適
切な宿主細胞株が当該分野で開発されており、そしてこ
れは、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細
胞、ミエローマ細胞株などを含むが、形質転換されたＢ
細胞またはハイブリドーマが好ましい。これらの細胞の
ための発現ベクターは、発現調節配列（例えば、複製起
点、プロモーター、エンハンサー）（Ｑｕｅｅｎら、
（１９８６） Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９： ４
９）、および必要とされるプロセシング情報部位（例え
ば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、
ポリアデニル化部位、および転写終結配列）を含有す
る。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリン遺伝子、
サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウ
シパピローマウイルスなどに由来するプロモーターであ
る。 【０２０９】真核生物のＤＮＡ転写は、ベクター中にエ
ンハンサー配列を挿入することにより増加され得る。エ
ンハンサーは、プロモーターによる転写を増加する１０
ｂｐと３００ｂｐとの間のシス作用性配列である。エン
ハンサーは、転写単位に対して５’または３’のいずれ
かにある場合、転写を効率的に増加し得る。それらはま
た、イントロン内、またはコード配列自身の内部に位置
される場合にも効果的である。代表的には、ウイルスの
エンハンサーが使用され、これは、ＳＶ４０エンハンサ
ー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエ
ンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれ
る。マウス免疫グロブリンＨ鎖エンハンサーのような、
哺乳動物系由来のエンハンサー配列もまた、一般に使用
される。 【０２１０】哺乳動物の発現ベクターシステムはまた、
代表的に選択マーカー遺伝子を含有する。適切なマーカ
ーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦ
Ｒ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐
性を与える原核生物遺伝子を包含する。最初の２つのマ
ーカー遺伝子は、生育培地へのチミジンの添加をともな
わずに生育する能力を欠如する変異体細胞株の使用を好
む。次いで、形質転換された細胞は、非補充培地におけ
る生育能により同定され得る。マーカーとして有用な原
核生物の薬物耐性遺伝子の例は、Ｇ４１８、ミコフェノ
ール酸、およびヒグロマイシンへの耐性を与える遺伝子
を包含する。 【０２１１】目的のＤＮＡセグメントを含有するベクタ
ーは、細胞の宿主タイプに依存して周知の方法により宿
主細胞中に導入され得る。例えば、塩化カルシウムトラ
ンスフェクションが、原核細胞に一般に利用されるが、
リン酸カルシウム処理、リポフェクション、またはエレ
クトロポレーションは、他の細胞の宿主に用いられ得
る。哺乳動物を形質転換するために用いられる他の方法
は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エ
レクトロポレーション、およびマイクロインジェクショ
ンの使用を含む（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を
参照のこと）。 【０２１２】一旦発現されると、抗体、個々の変異免疫
グロブリン鎖、変異抗体フラグメント、および本発明の
他の免疫グロブリンポリペプチドは、当該分野の標準的
な手順に従って精製され得る。この手順は、硫酸アンモ
ニウム沈澱、フラクションカラムクロマトグラフィー、
ゲル電気泳動などを包含する（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，
Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．
（１９８２）を参照のこと）。一旦部分的にまたは所望
の均一性まで精製されると、次いでポリペプチドは、治
療的に、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発
および実施において用いられ得る（一般に、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＩおよびＩＩ巻、
ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．
（１９７９および１９８１）を参照のこと）。 【０２１３】本発明の方法により生成される抗体は、診
断および治療に用いられ得る。限定のためではなく、説
明のために、それらは、ガン、自己免疫疾患、またはウ
イルス感染症を処置するために用いられ得る。ガンの処
置について、抗体は、代表的に癌細胞において優先的に
発現される抗原（例えば、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＣＤ
３３、および当業者に周知の多数の他の抗原および結合
メンバー）に結合する。 【０２１４】（酵母ツーハイブリッドスクリーニングア
ッセイ）再編成はまたは、予め決定されたポリペプチド
配列に結合するライブラリーメンバーを同定するための
ツーハイブリッドスクリーニングシステムをスクリーニ
ングすることにより得られた選択されたライブラリーメ
ンバーのプールを組換え的に多様化するために用いられ
得る。選択されたライブラリーメンバーは、プールさ
れ、そしてインビトロおよび／またはインビボ組換えに
より再編成される。次いで再編成されたプールは、前記
の予め決定されたポリペプチド配列（例えば、ＳＨ２ド
メイン）に結合するライブラリーメンバー、または別の
予め決定されたポリペプチド配列（例えば、他のタンパ
ク質の種由来のＳＨ２ドメイン）を選択するために、酵
母ツーハイブリッドシステムにおいてスクリーニングさ
れ得る。 【０２１５】予め決定されたポリペプチド配列に結合す
るポリペプチド配列を同定するための１つのアプローチ
は、予め決定されたポリペプチド配列が融合タンパク質
中に存在するいわゆる「ツーハイブリッド」システムを
用いている（Ｃｈｉｅｎら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８８：９５
７８）。このアプローチは、転写のアクティベーター
（Ｆｉｅｌｄｓ ＳおよびＳｏｎｇ Ｏ （１９８９）
Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５）、酵母Ｇａ１４転写
タンパク質の再構成を通して、インビボでのタンパク質
−タンパク質の相互作用を同定する。代表的には、この
方法は、酵母Ｇａｌ４タンパク質の特性に基づく。この
タンパク質は、ＤＮＡ結合および転写の活性化に機能す
る分離可能なドメインからなる。２つのハイブリッドタ
ンパク質（一方は、公知のタンパク質のポリペプチド配
列に融合された酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインから
なり、他方は、第２のタンパク質のポリペプチド配列に
融合されたＧａｌ４活性化ドメインからなる）をコード
するポリヌクレオチドが構築され、酵母宿主細胞に導入
される。２つの融合タンパク質間の分子間の結合は、Ｇ
ａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインとＧａｌ４活性化ドメイン
とを再構成し、これはＧａｌ４結合部位に作動可能に連
結されたレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ＨＩＳ
３）の転写の活性化を導く。代表的に、ツーハイブリッ
ド法は、公知のタンパク質に相互作用する新規のポリペ
プチド配列を同定するために用いられる（Ｓｉｌｖｅｒ
ＳＣおよびＨｕｎｔ ＳＷ （１９９３） Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７： １５５； Ｄｕｒｆｅｅ
ら、（１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．７； ５
５５； Ｙａｎｇら、（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５７： ６８０； Ｌｕｂａｎら、（１９９３） Ｃ
ｅｌｌ ７３：１０６７； Ｈａｒｄｙら、（１９９
２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．６； ８０１； Ｂａ
ｒｔｅｌら、（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ １４： ９２０； およびＶｏｊｔｅｋら、（１９
９３） Ｃｅｌｌ ７４： ２０５）。しかし、ツーハ
イブリッド法の変法が、第２の公知のタンパク質への結
合に影響する公知のタンパク質の変異を同定するために
用いられている（Ｌｉ ＢおよびＦｉｅｌｄｓ Ｓ
（１９９３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．７： ９５７； Ｌａｌ
ｏら、（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９０： ５５２４； Ｊａｃｋｓ
ｏｎら、（１９９３） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１３； ２８９９；およびＭａｄｕｒａら、（１９９
３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８： １２０４
６）。ツーハイブリッドシステムはまた、２つの公知の
タンパク質の相互作用する構造ドメインを同定するため
（Ｂａｒｄｗｅｌｌら、（１９９３） Ｍｅｄ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．８： １１７７； Ｃｈａｋｒａｂｏｒ
ｔｙら、（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
７： １７４９８； Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら、（１９
９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８： ４６０
８； およびＭｉｌｎｅ ＧＴおよびＷｅａｖｅｒ Ｄ
Ｔ （１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．７； １
７５５）、または単一のタンパク質のオリゴマー形成に
機能するドメインを同定するためにも用いられている
（Ｉｗａｂｕｃｈｉら、（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ ８； １６９３； Ｂｏｇｅｒｄら、（１９９３）
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７： ５０３０）。ツーハイブリ
ッドシステムの変法は、タンパク質分解酵素のインビボ
での活性を研究するために用いられている（Ｄａｓｍａ
ｈａｐａｔｒａら、（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８９： ４１５
９）。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ／ＢＣＣＰ 相互作用的
スクリーニングシステム（Ｇｅｒｍｉｎｏら、（１９９
３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．
Ｓ．Ａ．） ９０： ９３３； Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ
（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ９０： １６３９）は、相互作
用するタンパク質配列（すなわち、ヘテロ二量体化する
か、またはより高次のヘテロ多量体を形成するタンパク
質配列）を同定するために用いられ得る。ツーハイブリ
ッドシステムにより選択された配列は、プールおよび再
編成され、そして予め決定された結合配列を含有するハ
イブリッドに結合するポリペプチド配列を同定するため
のスクリーニングの１つ以上の引き続くラウンドのため
に、ツーハイブリッドシステムに導入され得る。このよ
うにして同定された配列は、コンセンサス配列およびコ
ンセンサス配列カーネルを同定するために比較され得
る。 【０２１６】上述の開示から理解され得るように、本発
明は、広範な応用を有する。従って、以下の実施例は、
説明のために提供され、制限のためではない。 【０２１７】以下の実施例において、以下の略語は以下
の意味を有する。以下に定義されない場合、その略語は
当該分野で理解される意味を有する。 【０２１８】ｍｌ ＝ ミリリットル μｌ ＝ マイクロリットル μＭ ＝ マイクロモル濃度 ｎＭ ＝ ナノモル濃度 ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝生理食塩水 ｎｇ ＝ ナノグラム μｇ ＝ マイクログラム ＩＰＴＧ ＝ イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクト
シド ｂｐ ＝ 塩基対 ｋｂ ＝ キロ塩基対 ｄＮＴＰ ＝ デオキシヌクレオシド３リン酸 ＰＣＲ ＝ ポリメラーゼ連鎖反応 Ｘ−ｇａｌ ＝ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド ＤＮＡｓｅＩ＝ デオキシリボヌクレアーゼ ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝生理食塩水 ＣＤＲ ＝ 相補性決定領域 ＭＩＣ ＝ 最小阻止濃度 ｓｃＦｖ ＝ 抗体の単鎖Ｆｖフラグメント 一般に、組換えＤＮＡ工学の標準的な技術は、種々の出
版物（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９， Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ａｕｓｕｂｅｌ
ら、１９８７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻お
よび２巻ならびに増補、ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫ
ｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １５２， Ｇｕｉｄｅ ｔｏＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ （１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ、それぞれ参
考として全体が本明細書中に援用される）に記載されて
いる。制限酵素およびポリヌクレオチド修飾酵素を、製
造業者の推奨に従って用いた。オリゴヌクレオチドをＡ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍｏｄ
ｅｌ３９４ ＤＮＡ合成機で、ＡＢＩの化学製品を用い
て合成した。所望であれば、予め決定されたＤＮＡ配列
を増幅するためのＰＣＲアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅ
ｒ）は、従事者の判断で選択され得る。 【０２１９】 【実施例】（実施例１．ＬａｃＺα遺伝子の再組立） （１）基質の調製）再組立反応のための基質は、ｐＵＣ
１８由来の野生型ＬａｃＺα遺伝子のｄｓＤＮＡポリメ
ラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）産物であった（図２）
（２８； Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ第ＸＯ２５１４号）。プ
ライマー配列は、５’ＡＡＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴ
ＧＴＧＡＴ３’（配列番号１）および５’ＡＴＧＧＧＧ
ＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴ３’（配列番号２）であ
った。遊離したプライマーを、製造業者の指示に従い、
Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によりＰＣＲ産物から除去した。
遊離したプライマーの除去は、重要であることが見い出
された。 【０２２０】（２）ＤＮＡｓｅＩ消化）約５μｇのＤＮ
Ａ基質を、１０〜２０分間室温にて、１００μｌの［５
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４， １ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2］中で、０．１５単位のＤＮＡｓｅＩ（Ｓｉｇ
ｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で消化した。消化さ
れたＤＮＡを、２％低融点アガロースゲルで泳動した。
１０〜７０塩基対（ｂｐ）のフラグメントを、ＤＥ８１
イオン交換紙（Ｗｈａｔｍａｎ， Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ
ｕｇｈ ＯＲ）上への電気泳動により２％低融点アガロ
ースゲルから精製した。ＤＮＡフラグメントを、１Ｍ
ＮａＣｌを用いてこの紙から溶出してエタノール沈澱し
た。 【０２２１】（３）ＤＮＡ再組立）精製されたフラグメ
ントを、ＰＣＲ Ｍｉｘ（０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、
２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、０．３μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、５０μｌの総容量）中に１０〜３０ｎｇ／μｌ
の濃度で再懸濁させた。この時点では、プライマーを添
加しなかった。９４℃６０秒間、［９４℃３０秒間、５
０〜５５℃３０秒間、７２℃３０秒間］の３０〜４５サ
イクル、および７２℃５分間の再組立プログラムを、Ｍ
Ｊ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）Ｐ
ＴＣ−１５０サーマルサイクラーにおいて用いた。より
大きな配列への小さなフラグメントのＰＣＲ再組立に続
いて、再組立の２５、３０、３５、４０、および４５サ
イクル後の反応のサンプルを採取した（図２）。 【０２２２】１００〜２００ｂｐのフラグメントの再組
立は、正確なサイズの単一のＰＣＲ産物を産生し得る
が、１０〜５０塩基のフラグメントは、代表的に正確な
サイズのいくらかの産物および不均一な分子量の産物を
産生する。制限酵素消化後、正確なサイズの単一のバン
ドが得られるので、このサイズ不均一性のほとんどは、
産物の末端での１本鎖配列に起因すると思われる。 【０２２３】（４）プライマーを用いたＰＣＲ）それぞ
れ０．８μＭの上記のプライマー（配列番号１および
２）を有するＰＣＲ Ｍｉｘへの再組立産物の希釈、お
よび約１５サイクルのＰＣＲ（それぞれのサイクルは、
［９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃３０
秒間］からなる）の後、正確なサイズの単一の産物が得
られた（図２）。 【０２２４】（５）クローニングおよび分析）上記の工
程４由来のＰＣＲ産物を、末端の制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＥｃｏ０１０９で消化し、そして上記の工程２に記
載のようにゲル精製した。再組立されたフラグメント
を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ０１０９で消化したｐＵＣ
１８に連結した。Ｅ．ｃｏｌｉを、製造業者（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）により推
奨されるような標準的な条件下で、この連結混合物を用
いて形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリ
ン、０．００４％ Ｘ−ｇａｌおよび２ｍＭ ＩＰＴＧ
を有するアガープレートに播いた。＋＋組換え体と判定
されるＨｉｎＤＩＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントを有する
得られたコロニーを、それが青く見えることにより同定
した。 【０２２５】この実施例は、ＬａｃＺα遺伝子を保有す
る１．０ｋｂの配列が、１０〜７０ｂｐのフラグメント
に消化され得ること、およびこれらのゲル精製された１
０〜７０ｂｐのフラグメントが、正確なサイズの単一の
産物に再組立され得ることを説明する。ここで、得られ
たコロニーの８４％（Ｎ＝３７７）がＬａｃＺ+である
（再編成なしの場合の９４％に対して；図２）。 【０２２６】得られたＬａｃＺ-コロニー由来のＬａｃ
Ｚ遺伝子をコードするＤＮＡを、製造業者の指示に従
い、配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ
ＯＨ）で配列決定し、そしてこの遺伝子が、再組立プ
ロセスに起因する点変異を有することを見い出した（表
１）。１１／１２の型の置換が見い出され、そしてフレ
ームシフトは見い出されなかった。 【０２２７】 【表１】 再編成されたｌａｃＺ ＤＮＡの全体の４，４３７塩基
を配列決定した。 【０２２８】１０〜７０ｂｐの切片からのＤＮＡ再組立
の間の点変異誘発率は、ＤＮＡ配列決定から０．７％
（Ｎ＝４，４７３）であると決定された。これは誤りが
ちなＰＣＲと類似している。いかなる理論にも制限され
ることなく、より大きなフラグメントが再組立に用いら
れる場合、または校正ポリメラーゼが添加される場合、
点変異誘発率は、より低くあり得ると考えられている。 【０２２９】１４のこれらの点変異されたＬａｃＺ-コ
ロニーのプラスミドＤＮＡを、組合わせ、そして再び上
述の方法により再組立／再編成した場合、得られたコロ
ニーの３４％（Ｎ＝２９１）がＬａｃＺ+であり、そし
てこれらのコロニーは、おそらく異なるコロニー由来の
ＤＮＡの組換えにより生じたのであろう。 【０２３０】誤りがちなＰＣＲによる単一の点変異の予
測される回復率は、変異誘発率が０．７％（１０）であ
ると仮定すると、＜１％であると予想される。 【０２３１】このようにして、大きなＤＮＡ配列は、驚
くほど効率的および単純な反応により、小さなフラグメ
ントのランダムな混合物から再組立され得る。この技術
の１つの応用は、相同性に基づいた関連した配列の組換
えまたは再編成である。 【０２３２】（実施例２．ＬａｃＺ遺伝子およびプラス
ミドＤＮＡ全体の再編成） （１）ＬａｃＺ遺伝子再編成）２つのＬａｃＺ遺伝子構
築物を用いて、７５塩基離れた２つのマーカー間のクロ
スオーバーを計測した。終止コドンを、ＬａｃＺα遺伝
子の２つの離れた範囲に挿入し、ネガティブマーカーと
して用いた。それぞれのマーカーは、４つの終止コドン
を有する２５ｂｐの非相同配列であり、終止コドンのう
ち２つは、ＬａｃＺ遺伝子のリーディングフレーム内に
ある。２５ｂｐの非相同配列を、大きな四角により図３
に示す。終止コドンは、四角で囲むか、または下線を付
すかした。＋−および−＋型のＬａｃＺα遺伝子（図
３）を含有する２つの１．０ｋｂのＬａｃＺテンプレー
トの１：１混合物を、ＤＮＡｓｅＩで消化し、そして１
００〜２００ｂｐのフラグメントを実施例１に記載のよ
うに精製した。再編成プログラムを、０．５μｌのポリ
メラーゼを添加し、そして全容量が１００μｌであった
以外は、実施例１における再組立について記載された条
件と同様の条件下で実施した。 【０２３３】クローニング後、得られた青色のコロニー
の数は、２４％；（Ｎ＝３８６）であった。これは青色
のコロニーの理論的な最大数（すなわち２５％）に近接
しており、２つのマーカー間の組換えが完全であったこ
とを示した。１０の青色のコロニーの全ては、予測され
るＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ制限フラグメントを含有し
た。 【０２３４】（２）プラスミドＤＮＡ全体の再編成）
２．７ｋｂプラスミド全体（ｐＵＣ１８−＋およびｐＵ
Ｃ１８＋−）もまた、試験した。＋−および−＋型のＬ
ａｃＺα遺伝子（図３）を含有する２つの２．９ｋｂの
プラスミドの１：１混合物を、ＤＮＡｓｅＩで消化し、
そして１００〜２００ｂｐのフラグメントを実施例１に
記載のように精製した。プログラムが［９４℃３０秒
間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間］の６０サイクル
であった以外は、上記の工程（１）における再組立につ
いて記載された条件と同様の条件下で再編成プログラム
を実施した。ゲル分析は，再編成プログラム後、産物の
ほとんどが２０ｋｂよりも大きいことを示した。このよ
うにして、２．７ｋｂのプラスミド全体（ｐＵＣ１８−
＋およびｐＵＣ１８＋−）を、プライマーの添加なしに
ランダムな１００〜２００ｂｐのフラグメントから効率
的に再組立した。 【０２３５】プラスミド上に唯一の部位を有する制限酵
素（ＥｃｏＯ１０９）での消化後、産物のほとんどは、
予測されるサイズの単一のバンドからなっていた。この
バンドをゲル精製し、再連結し、そしてこのＤＮＡを
Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に用いた。実施例１に記載のよ
うに、形質転換体を０．００４％ Ｘ−ｇａｌプレート
上に播いた。得られたプラスミドの１１％（Ｎ＝３２
８）は、青色すなわち＋＋組換え体であった。 【０２３６】（３）スパイクしたＤＮＡ再編成）再編成
混合物中に混合されるオリゴヌクレオチドは、テンプレ
ートＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドのフランキング
配列の相同性に基づき最終産物中に取り込まれ得る（図
４）。上述のＬａｃＺ-終止コドン変異体（ｐＵＣ１８
−＋）をＤＮＡｓｅＩ消化テンプレートとして用いた。
両末端に野生型ＬａｃＺ遺伝子に対する１８塩基の相同
性を含有する６６マーのオリゴヌクレオチドを、４倍モ
ル濃度過剰量で反応物中に添加し、本来の遺伝子中に存
在する終止コドン変異を補正した。再編成反応を、上記
の工程２における条件と同様の条件下で実施した。得ら
れた産物を消化し、連結し、そして上述のようにＥ．ｃ
ｏｌｉに挿入した。 【０２３７】 【表２】 ｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡよりも効率的であるようであ
り、おそらくこれは競合的なハイブリダイゼーションに
起因すると思われる。取り込みの度合は、モル濃度過剰
量、アニーリング温度、または相同性の長さを調整する
ことにより、広範な範囲に亘って変化し得る。 【０２３８】（実施例３．プライマーの完全な非存在下
におけるＤＮＡ再組立）プラスミドｐＵＣ１８を制限酵
素ＥｃｏＲＩ、Ｅｃｏ０１０９、ＸｍｎＩ、およびＡｌ
ｗＮＩで消化し、約３７０、４６０、７７０、および１
０８０ｂｐのフラグメントを産生した。これらのフラグ
メントを電気泳動し、そして２％低融点アガロースゲル
から別々に精製した（３７０塩基対のバンドと４６０塩
基対のバンドは、分離され得なかった）。これにより、
３つの別個のチューブに、大きなフラグメント、中程度
のフラグメント、および２つの小さなフラグメントの混
合物を得た。 【０２３９】それぞれのフラグメントを実施例１に記載
のようにＤＮＡｓｅＩで消化し、そして５０〜１３０ｂ
ｐのフラグメントを、それぞれの本来のフラグメントに
ついて２％低融点アガロースゲルから精製した。 【０２４０】ＰＣＲ混合物（上述の実施例１に記載のよ
うな）を精製した消化フラグメントに添加して、フラグ
メントの最終濃度を１０ｎｇ／μｌとした。プライマー
を添加しなかった。再組立反応を、３つの消化したＤＮ
Ａフラグメント混合物それぞれについて別々に［９４℃
３０秒間、６０℃３０秒間］を７５サイクル実施し、そ
して産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。 【０２４１】この結果は、１０８０ｂｐ、７７０ｂｐ、
ならびに３７０ｂｐおよび４６０ｂｐのバンドが、精製
されたフラグメントから効率的に再形成されたことを明
確に示した。これは、再編成がいかなるプライマーの使
用をも全く必要としないことを示す。 【０２４２】（実施例４．ＩＬ−１β遺伝子再編成）こ
の実施例は、１５塩基よりも少ない相同性に基づいてク
ロスオーバーが得られ得ることを説明する。例として、
ヒトおよびマウスのＩＬ−１β遺伝子を再編成した。 【０２４３】マウスのＩＬ−１β遺伝子（ＢＢＧ４９）
およびＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度を有するヒトＩＬ
−１β遺伝子（ＢＢＧ２； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）を再編成
反応のテンプレートとして用いた。ヒトＩＬ−１β配列
とマウスＩＬ−１β配列との間の完全に相同な範囲は、
平均してわずか４．１塩基の長さである（図５、非相同
の領域を四角で囲った）。 【０２４４】それぞれの遺伝子のｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産
物の調製、プライマーの除去、１０〜５０ｂｐフラグメ
ントのＤＮＡｓｅＩ消化および精製は、実施例１におい
て上述されたものと同様であった。ＰＣＲ反応に用いら
れるプライマーの配列は、５’ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣ
ＡＧＧＣＴＴＴ３’（配列番号３）および５’ＡＴＧＴ
ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ３’（配列番号４）であ
った。 【０２４５】再編成反応の最初の１５のサイクルは、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用い
て、それぞれのサイクル毎に１単位の新たな酵素を添加
しながら、実施した。ＤＮＡをポリメラーゼを含まない
実施例１のＰＣＲ混合物に添加した。手動のプログラム
は、９４℃１分間、および次いで［９５℃１分間、ドラ
イアイス／エタノール上に１０秒間（凍結するまで）、
２５℃にて約２０秒間インキュベート、１ＵのＫｌｅｎ
ｏｗフラグメントの添加、および２５℃にて２分間イン
キュベート］の１５サイクルであった。変性工程後のそ
れぞれのサイクルにおいて、チューブをドライアイス／
エタノール中で迅速に冷却し、そしてアニール温度まで
再加熱した。次いで、熱不安定性ポリメラーゼを添加し
た。この酵素は、全てのサイクルごとの添加を必要とす
る。このアプローチを用いることにより、わずか数塩基
の連続した相同性に基づいて、高レベルのクロスオーバ
ーが得られた（図５、クロスオーバーの位置を「 ＿｜
￣ 」で示す）。 【０２４６】これらの１５回の手動のサイクルの後、Ｔ
ａｑポリメラーゼを添加し、そしてさらなる２２サイク
ルの再編成反応［９４℃３０秒間、３５℃３０秒間］を
プライマーなしで実施した。 【０２４７】次いで反応物を２０倍に希釈した。以下の
プライマーを、０．８μＭの最終濃度で添加した：５’
ＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴ
ＴＡＴＴ３’（配列番号５）および５’ＡＡＡＧＣＣＣ
ＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴ３’
（配列番号６）。そしてＰＣＲ反応を実施例１における
上述のように実施した。第２のプライマーペアは、制限
部位の変化が必要であると考えられるためだけで第１の
ペアと異なった。 【０２４８】ＸｂａＩおよびＳｐｈＩでのＰＣＲ産物の
消化の後、このフラグメントをＸｂａＩ−ＳｐｈＩ消化
ｐＵＣ１８に連結した。いくつかのコロニー由来の挿入
物の配列を、製造業者の指示に従い、ジデオキシＤＮＡ
配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＣｌｅｖｅｌａｎｄＯ
Ｈ）により決定した。 【０２４９】全部で１７のクロスオーバーが、９つのコ
ロニーのＤＮＡ配列決定により見い出された。いくつか
のクロスオーバーは、わずか１〜２塩基の連続した相同
性に基づいていた。 【０２５０】短い相同性に基づく効率的なクロスオーバ
ーを強いるために、非常に低い効率的なアニーリング温
度が要求されることが見い出された。任意の熱安定性ポ
リメラーゼを用いて、ＰＣＲ機械の冷却時間（１〜２℃
／秒の９４℃から２５℃への）は、効果的なアニーリン
グ温度を設定されたアニール温度よりも高くする。従っ
て、Ｔａｑポリメラーゼに基づくプロトコルのいずれも
が、ＩＬ−１β遺伝子の一方の１０倍過剰量を用いても
クロスオーバーを産生しなかった。対照的に、熱不安定
性ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌ
ｅｎｏｗフラグメント）は、低いアニーリング温度を正
確に得るために用いられ得る。 【０２５１】（実施例５．ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺
伝子のＤＮＡ再編成）直接分子進化のための変異誘発Ｄ
ＮＡ再編成の利用性を、βラクタマーゼモデルシステム
において試験した。ＴＥＭ−１βラクタマーゼは、非常
に効率的な酵素であり、主に拡散によりその反応速度は
限定される。この実施例は、その反応特異性を変化する
こと、および通常加水分解しない薬物セフォタキシムに
対して耐性を得ることが可能であるかを決定する。 【０２５２】プラスミドを含まない細菌性細胞における
セフォタキシムの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）の一夜細菌培養物の１０
-2希釈の１０μｌ（約１０００ｃｆｕ）を、異なるレベ
ルのセフォタキシム（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ）を有するプレートに播き、続いて３７℃で２４
時間インキュベートすることにより決定した。 【０２５３】セフォタキシム上での生育は、細胞の密度
に対して敏感であり、それ故類似の数の細胞がそれぞれ
のプレートに播かれる必要がある（添加物非含有ＬＢプ
レートに播くことにより得られる）。１０００個の細胞
のプレートが一貫して行われた。 【０２５４】（１）最初のプラスミド構築）細菌のＴＥ
Ｍ−１βラクタマーゼ遺伝子を保有するｐＵＣ１８誘導
体を用いた（２８）。ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子
は、細菌に約０．０２μｇ／ｍｌのセフォタキシムに対
する耐性を与える。２つのプライマー：プライマーＡ
（配列番号７）： 【０２５５】 【化１】 および、プライマーＢ（配列番号８）： 【０２５６】 【化２】 を用いるベクター配列のＰＣＲおよび２つの他のプライ
マー：プライマーＣ（配列番号９）： 【０２５７】 【化３】 および、プライマーＤ（配列番号１０）： 【０２５８】 【化４】 を用いるβラクタマーゼ配列のＰＣＲにより、プロモー
ターの５’および遺伝子の末端の３’にＳｆｉ１制限部
位を付加した。 【０２５９】２つの反応産物をＳｆｉＩで消化し、混合
し、連結し、そして細菌を形質転換するために用いた。 【０２６０】得られたプラスミドは、ｐＵＣ１８２Ｓｆ
ｉであった。このプラスミドは、ＴＥＭ−１遺伝子およ
びＰ−３プロモーターを保有するＳｆｉ１フラグメント
を含有する。 【０２６１】このプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ
ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に関するセフォタキシムの最小阻止
濃度は、３７℃で２４時間後で０．０２μｇ／ｍｌであ
った。 【０２６２】再編成なしに、セフォタキシムに対するβ
ラクタマーゼ遺伝子の耐性を改変する能力は、２倍に増
加した薬物レベルへの細胞（約１０7ｃｆｕ）の希釈し
たプールの段階的な再プレートにより決定した。１．２
８μｇ／ｍｌまでへの耐性が再編成なしに得られ得た。
これは、耐性の６４倍の増加を表す。 【０２６３】（２）ＤＮＡｓｅＩ消化）第１の再編成反
応のための基質は、プライマーＣおよびＤ（両方ともＳ
ｆｉＩ部位を含有する）を用いるｐＵＣ１８２Ｓｆｉの
ＰＣＲにより得られた０．９ｋｂのｄｓＤＮＡであっ
た。 【０２６４】各サイクルごとにＰＣＲ産物から遊離プラ
イマーをＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）により除去した。 【０２６５】約５μｇのＤＮＡ基質を、１０分間室温
で、１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ2中で０．１５単位のＤＮＡ
ｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で消
化した。１００〜３００ｂｐのフラグメントを、ＤＥ８
１イオン交換紙（Ｗｈａｔｍａｎ， Ｈｉｌｌｓｂｏｒ
ｏｕｇｈ ＯＲ）への電気泳動、１Ｍ ＮａＣｌでの溶
出、およびエタノール沈澱により、実施例１に記載の方
法によって２％低融点アガロースゲルから精製した。 【０２６６】（３）遺伝子再編成）精製したフラグメン
トを、１０〜３０ｎｇ／μｌの濃度でＰＣＲ混合物
（０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に再懸
濁した。この時点でプライマーを添加しなかった。９４
℃６０秒間、次いで［９４℃３０秒間、５０〜５５℃３
０秒間、７２℃３０秒間］の４０サイクル、そして次い
で７２℃５分間の再組立プログラムを、ＭＪ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）ＰＴＣ−１５０
サーマルサイクラーにおいて使用した。 【０２６７】（４）プライマーを用いる再組立産物の増
幅）０．８μＭのそれぞれのプライマー（ＣおよびＤ）
を有するＰＣＲ混合物への再組立産物の希釈、および２
０のＰＣＲサイクル［９４℃３０秒間、５０℃３０秒
間、７２℃３０秒間］の後、９００ｂｐのサイズの単一
の産物を得た。 【０２６８】（５）クローニングおよび分析）末端の制
限酵素ＳｆｉＩでの９００ｂｐ産物の消化、およびアガ
ロースゲル精製の後、９００ｂｐ産物を、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ（ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ Ｍ
Ｄ）を用いて唯一のＳｆｉＩ部位でベクターｐＵＣ１８
２Ｓｆｉに連結した。混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１
−ｂｌｕｅ細胞にエレクトロポレートし、そして０．３
２〜０．６４μｇ／ｍｌのセフォタキシム（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を有するＬＢプレートに
播いた。細胞を、３７℃で２４時間まで増殖させ、得ら
れたコロニーをプールとしてプレートから掻き取り、そ
して次のラウンドの再編成のためのＰＣＲテンプレート
として用いた。 【０２６９】（６）引き続く再組立ラウンド）３ラウン
ドの再編成のそれぞれの後に得られた形質転換体を、漸
増するレベルのセフォタキシムに播いた。最も高いレベ
ルのセフォタキシムを有するプレート由来のコロニー
（＞１００、多様性を維持するために）をプールし、次
のラウンドのＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用
いた。 【０２７０】上記の工程（５）において０．３２〜０．
６４μｇ／ｍｌで得られたセフォタキシム耐性コロニー
の混合物を次のラウンドの再編成のためのテンプレート
して用いた。ＬＢブロス中の１０μｌの細胞を、上述の
ように、９９℃１０分間、次いで［９４℃３０秒間、５
２℃３０秒間、７２℃３０秒間］の３５サイクル、およ
び次いで７２℃５分の再組立プログラムにおいてテンプ
レートとして用いた。 【０２７１】再組立産物を消化し、そして上記の工程
（５）に記載のようにｐＵＣ１８２Ｓｆｉに連結した。
混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞にエレク
トロポレートし、そして５〜１０μｇ／ｍｌのセフォタ
キシムを有するＬＢプレートに播いた。 【０２７２】５〜１０μｇ／ｍｌで得られたコロニー
を、細胞を８０〜１６０μｇ／ｍｌのセフォタキシムを
含有するＬＢプレートに播いた以外は第１および第２の
ラウンドと同様である第３のラウンドに用いた。第３の
ラウンドの後、コロニーを、８０〜１６０μｇ／ｍｌで
得、そして漸増する濃度のセフォタキシムに再プレート
した後、コロニーは、３７℃で２４時間後、３２０μｇ
／ｍｌまでで得られた（ＭＩＣ＝３２０μｇ／ｍｌ）。 【０２７３】セフォタキシムにおける増殖は、細胞密度
に依存し、全てのＭＩＣが規格化されることを要求する
（本発明者らの場合、プレートあたり約１，０００細胞
まで）。より高い細胞密度で、１２８０μｇ／ｍｌまで
での増殖が得られた。１，２８０μｇ／ｍｌで増殖され
た５つの最も大きいコロニーを、単一コロニーのために
２回プレートし、そしてＳｆｉ１挿入物を、コロニーＰ
ＣＲ産物の制限マッピングにより分析した。 【０２７４】セフォタキシムに対する耐性が１６，００
０倍に増加した（ＭＩＣ＝０．０２μｇ／ｍｌからＭＩ
Ｃ＝３２０μｇ／ｍｌ）１つの変異体が得られた。 【０２７５】選択後、選択されたクローンのプラスミド
を野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に戻
し、測定された薬剤耐性の全てが、染色体の変異に起因
しないことを確認した。 【０２７６】再編成および選択の３つのサイクルは、Ｔ
ＥＭ−１βラクタマーゼに関する伸展した幅広いスペク
トラムの抗生物質であるセフォタキシムの最小阻止濃度
における１．６×１０4倍の増加を生じた。対照的に、
再編成なしの繰り返しのプレーティングは、耐性のわず
か１６倍の増加のみを生じた（誤りがちなＰＣＲまたは
カセット変異誘発）。 【０２７７】（７）配列分析）１，２８０μｇ／ｍｌで
生育した５つの最も大きいコロニーの全ては、野生型Ｔ
ＥＭ−１酵素と同一な制限地図を有した。これらのコロ
ニーの内の１つから得られたプラスミドのＳｆｉＩ挿入
物を、製造業者の指示に従い、ジデオキシＤＮＡ配列決
定法（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）により
配列決定した。全ての塩基番号は、改訂されたｐＢＲ３
２２配列（２９）に対応し、そしてアミノ酸番号は、Ａ
ＢＬ標準番号付けスキーム（３０）に対応する。アミノ
酸は３文字表記で示され、そしてヌクレオチドは１文字
表記で示される。用語Ｇ４２０５Ａは、ヌクレトチド４
２０５が、グアニジンからアデニンに変化したことを意
味する。 【０２７８】９つの１塩基置換が見い出された。Ｇ４２
０５Ａは、βラクタマーゼＰ３プロモーター（３１）の
−３５と−１０部位との間に位置される。Ｃｈｅｎおよ
びＣｌｏｗｅｓ（３１）により観察されたプロモーター
上方変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）は、本発明で用いら
れたＳｆｉ１フラグメントの外側に位置され、従って検
出され得なかった。４つの変異は、サイレント変異であ
り（Ａ３６８９Ｇ、Ｇ３７１３Ａ、Ｇ３９３４Ａ、およ
びＴ３９５９Ａ）、そして４つがアミノ酸変化を生じた
（Ｇｌｙ２３８Ｓｅｒを生じるＣ３４４８Ｔ、Ｍｅｔ１
８２Ｔｈｒを生じるＡ３６１５Ｇ、Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ
を生じるＣ３８５０Ｔ、およびＡｌａ１８Ｖａｌを生じ
るＧ４１０７Ａ）。 【０２７９】（８）分子戻し交雑）次いで非必須変異を
除去するために、過剰量の野生型ＤＮＡを用いた分子戻
し交雑を用いた。 【０２８０】分子戻し交雑は、ＤＮＡｓｅＩ消化および
再編成反応を４０倍の過剰量の野生型ＴＥＭ−１遺伝子
フラグメントの存在下で実施した以外は、上述したよう
な通常の再編成と同一な方法によりＤＮＡ再編成の第３
のラウンドから選択されたプラスミドに対して実施し
た。戻し交雑をより効率的にするために、非常に小さな
ＤＮＡフラグメント（３０〜１００ｂｐ）を再編成反応
に用いた。戻し交雑変異体を、８０〜１６０μｇ／ｍｌ
のセフォタキシム（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ）を有するＬＢプレートで再び選択した。 【０２８１】この戻し交雑再編成を、４０倍の過剰量の
野生型ＴＥＭ−１ ＤＮＡの存在下での第１の戻し交雑
ラウンドからのコロニー由来のＤＮＡを用いて繰り返し
た。戻し交雑の効率を増加させるために、小さなＤＮＡ
フラグメント（３０〜１００ｂｐ）を用いた。第２のラ
ウンドの戻し交雑変異体を、８０〜１６０μｇ／ｍｌの
セフォタキシムを有するＬＢプレートで再び選択した。 【０２８２】得られた形質転換体を１６０μｇ／ｍｌの
セフォタキシムに播き、そしてコロニーのプールを、
１，２８０μｇ／ｍｌまでの漸増するレベルのセフォタ
キシムに再プレートした。１，２８０μｇ／ｍｌで得ら
れた最も大きなコロニーを、単一コロニーのために再プ
レートした。 【０２８３】この戻し交雑変異体は、野生型よりも３
２，０００倍高い耐性を示した（ＭＩＣ＝６４０μｇ／
ｍｌ）。変異体株は、以前に報告された臨床的ＴＥＭ−
１由来株または加工されたＴＥＭ−１由来株よりもセフ
ォタキシムに対して６４倍高い耐性である。従って、Ｄ
ＮＡ再編成は、少なくともいくつかのサイクルの定方向
性分子進化のための迅速で強力な手段であるようであ
る。 【０２８４】戻し交雑された変異体のＳｆｉＩ挿入物の
ＤＮＡ配列を、製造業者の指示に従いジデオキシＤＮＡ
配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｏ
Ｈ）を用いて決定した（表３）。変異体は、９つの１塩
基対変異を有した。予測されるように、以前に同定した
４つのサイレント変異の全てが消失し、野生型遺伝子の
配列に戻っていた。プロモーター変異（Ｇ４２０５Ａ）
および４つのアミノ酸変異の内の３つ（Ｇｌｕ１０４Ｌ
ｙｓ、Ｍｅｔ１８２Ｔｈｒ、およびＧｌｙ２３８Ｓｅ
ｒ）は、戻し交雑されたクローンに残っていた。このこ
とは、それらが高レベルのセフォタキシム耐性のために
必須であることを示唆する。しかし、２つの新規のサイ
レント変異（Ｔ３８４２ＣおよびＡ３７６７Ｇ）ならび
にアミノ酸変化を生じる３つの新規の変異（Ａｒｇ２４
１Ｈｉｓを生じるＣ３４４１Ｔ、Ｇｌｙ９２Ｓｅｒを生
じるＣ３８８６Ｔ、およびＡｌａ４２Ｇｌｙを生じるＧ
４０３５Ｃ）が見い出された。これらの２つのサイレン
ト変異は、タンパク質の１次配列に影響しないが、タン
パク質の発現レベル（例えばｍＲＮＡの構造により）、
およびおそらくタンパク質の折り畳みにさえに影響し得
る（コドン使用頻度を変化すること、およびそれゆえタ
ンパク質の折り畳みに関係する休止部位を変化すること
による）。 【０２８５】 【表３】 戻し交雑変異体および非戻し交雑変異体は両方とも１つ
のプロモーター変異（これは、単独または組み合わせに
より発現レベルにおいて２〜３倍の増加を生じる）およ
び３つの共通したアミノ酸変化（Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ、
Ｍｅｔ１８２Ｔｈｒ、およびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ）を有
する。Ｇｌｕ１０４ＬｙｓおよびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ
は、いくつかのセフォタキシム耐性ＴＥＭ−１誘導体ま
たは他のＴＥＭ−１誘導体（表４）において存在する変
異である。 【０２８６】（９）発現レベル比較）野生型プラスミ
ド、非戻し交雑変異体、および戻し交雑変異体における
βラクタマーゼ遺伝子の発現レベルを、Ｗｉｔｈｏｌ
ｔ， Ｂ．（３２）の方法に従い浸透圧ショックにより
調製された周辺質の抽出物のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（４〜２０％；Ｎｏｖｅｘ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）により比較した。 【０２８７】精製されたＴＥＭ−１βラクタマーゼ（Ｓ
ｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を、分子量基準
として用い、そしてプラスミドを含まないＥ．ｃｏｌｉ
ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をネガティブコントロールとし
て用いた。 【０２８８】変異体および戻し交雑された変異体は、野
生型遺伝子と比較して２〜３倍高いレベルのβラクタマ
ーゼタンパク質を産生するようであった。プロモーター
変異は、βラクタマーゼの２〜３倍の増加を生じるよう
であった。 【０２８９】（実施例６．ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺
伝子の変異体組み合わせ体の構築）変異の異なる組み合
わせの耐性を決定するため、そして発表された変異体と
新規の変異体とを比較するために、いくつかの変異体
を、同一のプラスミドバックグラウンド中に構築した。
２つの変異（Ｇｌｕ１０４ＬｙｓおよびＧｌｙ２３８Ｓ
ｅｒ）は、セフォタキシム変異体として知られている。
構築した全ての変異体の組み合わせは、プロモーター変
異を有しており、これは選択された変異体の比較を可能
にした。結果を図４に示す。 【０２９０】変異の特定の組み合わせは、１変異当たり
２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより野生
型ｐＵＣ１８２Ｓｆｉ中に導入された。 【０２９１】以下の変異を得るためのオリゴヌクレオチ
ドは以下のようであった： 【０２９２】 【化５】 これらの個々のＰＣＲフラグメントを、合成オリゴヌク
レオチドからゲル精製した。１０ｎｇのそれぞれのフラ
グメントを組み合わせ、そして再組立反応を、９４℃１
分間、および次いで２５サイクル；［９４℃３０秒間、
５０℃３０秒間、および７２℃４５秒間］で実施した。
ＰＣＲを、ＳｆｉＩ含有外側プライマー（実施例５のプ
ライマーＣおよびプライマーＤ）の存在下で２５サイク
ルにわたって再組立産物に対して実施した。ＤＮＡをＳ
ｆｉＩで消化し、そして野生型ｐＵＣ１８２Ｓｆｉベク
ターに挿入した。以下の変異体組み合わせが得られた
（表４）。 【０２９３】 【表４】★ これらの変異体の全ては、Ｇ４２０５Ａプロモータ
ー変異を付加的に含有する。 【０２９４】保存された変異が、ＭＩＣにおける１５の
倍加（ｄｏｕｂｌｉｎｇ）の内の９つの原因であると結
論づけられた。 【０２９５】Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ単独は、０．０８μｇ
／ｍｌへのＭＩＣの倍加のみを生じることが示され、そ
してＧｌｙ２３８Ｓｅｒ（いくつかの状況において１つ
のさらなるアミノ酸変化を有する）は、０．１６μｇ／
ｍｌのＭＩＣのみを生じた（２６）。２重変異体Ｇｌｕ
１０４Ｌｙｓ／Ｇｌｙ２３８Ｓｅｒは、１０μｇ／ｍｌ
のＭＩＣを有する。この変異体は、ＴＥＭ−１５に相当
する。 【０２９６】これらの同一のＧｌｕ１０４Ｌｙｓ変異お
よびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ変異は、Ｇｌｎ３９Ｌｙｓ（Ｔ
ＥＭ−３）またはＴｈｒ２６３Ｍｅｔ（ＴＥＭ−４）と
組み合わせて、高レベルの耐性（ＴＥＭ−３について２
〜３２μｇ／ｍｌおよびＴＥＭ−４について８〜３２μ
ｇ／ｍｌ（３４、３５））を生じる。 【０２９７】戻し交雑後に保存された３つのアミノ酸変
化（Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ／Ｍｅｔ１８２Ｔｈｒ／Ｇｌｙ
２３８Ｓｅｒ）を含有する変異体もまた、１０μｇ／ｍ
ｌのＭＩＣを有した。これは、新規の選択された変異体
のそれぞれが、３つの公知の変異に加えてさらに有する
変異が、セフォタキシムに対する遺伝子の耐性のさらな
る３２〜６４倍の増加の原因であることを意味した。 【０２９８】天然に存在する、臨床的ＴＥＭ−１由来酵
素（ＴＥＭ−１〜１９）のそれぞれは、５〜７つのみの
同一の変異の異なる組み合わせを含有する（総説）。こ
れらの変異は、遺伝子において十分に分離した位置に存
在するので、高度なセフォタキシム耐性を有する変異体
は、単一の範囲のカセット変異誘発によっては得られ得
ない。これは、標準的なカセット変異誘発アプローチに
より得られる最大ＭＩＣが、わずか０．６４μｇ／ｍｌ
である理由を説明し得る（２６）。例えば、Ｇｌｕ１０
４Ｌｙｓ変異およびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ変異は両方とも
０．１６μｇ／ｍｌ未満のＭＩＣを有することが本研究
において個々に見い出された。ＤＮＡ再編成の使用は、
組み合わせを可能にし、それ故１０μｇ／ｍｌのＭＩＣ
を有するＧｌｕ１０４Ｌｙｓ／Ｇｌｙ２３８Ｓｅｒの組
み合わせが見い出された。 【０２９９】この実施例の重要な制限は、開始点として
の単一の遺伝子の使用である。多数の関連した天然に存
在する遺伝子が再編成される場合、より良好な組み合わ
せが見い出され得ることが意図される。このような混合
物に存在する多様性は、変異誘発再編成により産生され
るランダムな変異よりも有意義である。例えば、単一の
種由来の関連した遺伝子のレパートリー（例えば、免疫
系の既存の多様性）、または多くの異なる種から得られ
る関連した遺伝子を使用し得ることが意図される。 【０３００】（実施例７．６つの変異体ＣＤＲ全てのラ
イブラリーのＤＮＡ再編成による抗体Ａ１０Ｂの改善）
Ａ１０Ｂ ｓｃＦｖ抗体、マウス抗ウサギＩｇＧは、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）から寄
贈された。ｐＣＡＮＴＡＢ５ファージディスプレイベク
ターを使用する市販のＰｈａｒｍａｃｉａファージディ
スプレイシステムを使用した。 【０３０１】本来のＡ１０Ｂ抗体は、低いアビディティ
のみを再現性よく有した。というのは、（ファージＥＬ
ＩＳＡ （Ｐｈａｒｍａｃｉａアッセイキット）または
ファージタイターにより測定したところ）固定化抗原
（ウサギＩｇＧ）に弱く結合するクローンのみが得られ
たからである。競合アッセイにおいてＡ１０Ｂ抗体結合
の５０％阻害を生じたウサギＩｇＧの濃度は、１３ピコ
モル濃度であった。観察された低いアビディティはま
た、Ａ１０Ｂクローンの不安定さに起因し得る。 【０３０２】Ａ１０Ｂ ｓｃＦｖ ＤＮＡを製造業者の
指示に従い配列決定した（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄＯＨ）。Ｋａｂａｔ（３３）との比較に基づくと、
この配列は、既存の抗体と同様であった。 【０３０３】（１）ファージＤＮＡの調製）Ａ１０Ｂ野
生型抗体遺伝子を有するファージＤＮＡ（１０μｌ）
を、９９℃にて１０分間インキュベートし、次いで７２
℃にて２分間インキュベートした。ＰＣＲ混合物（５０
ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００
μＭ 各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭＭｇＣｌ）、０．６μｍ
のそれぞれのプライマー、および０．５μｌ ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ
ＷＩ）をファージＤＮＡに添加した。ＰＣＲプログラ
ムを［９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃４５秒
間］の３５サイクルにわたって実施した。用いたプライ
マーは：５' ＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴ
３'（配列番号２６）および５' ＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴ
ＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴ ３'（配列番号２７）であっ
た。 【０３０４】次いで８５０ｂｐのＰＣＲ産物を電気泳動
し、そして２％低融点アガロースゲルから精製した。 【０３０５】（２）フラグメント化）３００ｎｇのゲル
精製した８５０ｂｐのバンドを、２０分間室温にて、５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ中で０．１８単位のＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍ
ａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で消化した。消化した
ＤＮＡを、２％低融点アガロースゲルにおいて分離し、
そして５０〜２００ｂｐ間のバンドをゲルから精製し
た。 【０３０６】（３）試験ライブラリーの構築）本実験の
目的は、ＣＤＲの挿入が効果的であるか否かを試験する
ことである。 【０３０７】内部に制限酵素部位を有する以下のＣＤＲ
配列を合成した。「ＣＤＲ Ｈ」は、抗体のＨ鎖におけ
るＣＤＲを意味し、「ＣＤＲ Ｌ」は、抗体のＬ鎖にお
けるＣＤＲを意味する。 【０３０８】制限部位を有するＣＤＲオリゴ： 【０３０９】 【化６】 上記工程（２）からの５０〜２００ｂｐの精製Ａ１０Ｂ
抗体ＤＮＡフラグメントにＣＤＲオリゴを過剰な１０倍
のモル量で添加した。ＰＣＲ混合物（５０ｍＭＫＣｌ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．９ｍＭ ＭｇＣｌ、２０
０μｍの各ｄＮＴＰ、０．３μｌＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、総
容積５０μｌ）を添加し、そして９４℃で１分間、７２
℃で１分間、次いで３５サイクル：９４℃で３０秒間、
５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の再編成プログラ
ムを行った。 【０３１０】１μｌの再編成混合液を１００μｌのＰＣ
Ｒ混合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、２００μｍの各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭ ＭｇＣｌ、
それぞれ０．６μＭの２つの外側プライマー（配列番号
２６および２７、下記参照のこと）、０．５μｌ Ｔａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に添加し、そしてＰＣＲプロ
グラムを３０サイクル［９４℃で３０秒間、４５℃で３
０秒間、７２℃で４５秒間］行った。得られる８５０塩
基対サイズのＤＮＡフラグメントの混合液をフェノール
／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させた。 【０３１１】外側プライマーは： 外側プライマー１：配列番号２７ ５’ ＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴ
３’ 外側プライマー２：配列番号２６ ５’ ＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴ ３’ ８５０ｂｐのＰＣＲ生成物を制限酵素ＳｆｉＩおよびＮ
ｏｔＩで消化し、低融点アガロースゲルから精製し、そ
してＰｈａｒｍａｃｉａ、ＭｉｌｗａｕｋｅｅＷＩから
得たｐＣＡＮＴＡＢ５発現ベクターに連結した。Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）により
記載される方法に従って、 連結したベクターをＴＧ１
細胞（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ Ｗ
Ｉ）にエレクトロポレートし、そして単一のコロニーに
ついてプレートした。 【０３１２】得られるコロニー由来のＤＮＡを１００μ
ｌのＰＣＲ混合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、２００μｍの各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ、０．６μＭの外側プライマー１（配列番号２
７、下記参照のこと）および６つの内側プライマー（配
列番号４０〜４５；下記参照のこと）、および０．５μ
ｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に添加し、そして３
５サイクル［９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７
２℃で４５秒間］でＰＣＲプログラムを行った。ＰＣＲ
生成物のサイズを、アガロースゲル電気泳動により測定
し、そして制限部位を有するどのＣＤＲが挿入されたの
かを決定するために用いた。 【０３１３】ＣＤＲ内側プライマー： 【０３１４】 【化７】 ６つの合成ＣＤＲは、野生型Ａ１０Ｂ抗体ＤＮＡの予想
された位置に挿入された（図７）。これらの研究は、特
定のクローン中の６つのＣＤＲはそれぞれ制限部位を有
するＣＤＲになるわずかな可能性を有するが、ほとんど
のクローンは少なくとも１つの制限部位を有するＣＤＲ
を保有し、そして制限部位を有するＣＤＲの可能な任意
の組み合わせが生成されたことを示した。 【０３１５】（４）変異相補性決定領域（「ＣＤＲ」）
の構築）本発明者らの配列データに基づき、６つのＣＤ
Ｒに対応する６オリゴヌクレオチドを作製した。ＣＤＲ
（Ｋａｂａｔ定義）を７０（個の存在塩基）：１０：１
０：１０の比率で合成的に変異を誘発し、そして約２０
塩基のフランキング配列により５’末端および３’末端
側に側面を接しさせた。このフランキング配列は、変異
を誘発しない抗体遺伝子フラグメントの混合物に過剰な
モル量で混合する場合、ＣＤＲの取り込みに対して相同
性を提供する。得られる変異配列を以下に示す。 【０３１６】ＣＤＲライブラリーのオリゴ 【０３１７】 【化８】太字体かつ下線を付した配列は、７０：１０：１０：１
０のヌクレオチド（ここで７０％は野生型ヌクレオチ
ド）の混合物を用いて合成した変異配列であった。 【０３１８】過剰な１０倍のモル量のＣＤＲ変異オリゴ
を、上記工程（２）からの長さ５０〜２００ｂｐの精製
Ａ１０Ｂ抗体ＤＮＡフラグメントに添加した。ＰＣＲ混
合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
１．９ｍＭ ＭｇＣｌ、２００μｍの各ｄＮＴＰ、０．
３μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、総容積５０μｌ）を添加
し、そして９４℃で１分間、７２℃で１分間、次いで３
５サイクル：［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２
℃で３０秒］の再編成プログラムを行った。 【０３１９】１μｌの再編成した混合物を１００μｌの
ＰＣＲ混合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、２００μｍの各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭ ＭｇＣ
ｌ、それぞれ０．６μＭの２つの外側プライマー（配列
番号２６および２７、下記参照のこと）、０．５μｌの
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に添加し、そして３０サ
イクル［９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃
で４５秒間］でＰＣＲプログラムを行った。得られる８
５０塩基対サイズのＤＮＡフラグメントの混合物をフェ
ノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿さ
せた。 【０３２０】外側プライマーは： 【０３２１】 【化９】 （５） ｓｃＦＶ抗体ＤＮＡのｐＣＡＮＴＡＢ５へのク
ローニング）８５０ｂｐのＰＣＲ生成物を制限酵素Ｓｆ
ｉＩおよびＮｏｔＩで消化し、低融点アガロースゲルか
ら精製し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋ
ｅｅＷＩから得たｐＣＡＮＴＡＢ５発現ベクターに連結
した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
ＣＡ）により記載される方法に従って連結したベクター
をＴＧ１細胞（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｉｌｗａｕｋｅ
ｅ ＷＩ）にエレクトロポレートし、そして製造業者に
より推薦されるガイドラインに従ってヘルパーファージ
を用いてファージライブラリーを増殖させた。 【０３２２】この様式で生成したライブラリーを、６サ
イクルの選択を使用して、改善された抗体の存在につい
てスクリーニングした。 【０３２３】（６） 高親和性クローンの選択）９６ウ
ェルのマイクロタイタープレートの１５ウェルを、ウサ
ギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒ
ｃｈ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）で１０μｇ／ウェ
ル、３７℃で１時間コートし、次いでＰＢＳ中の２％の
ノンファットドライミルクで３７℃で１時間ブロックし
た。 【０３２４】１００μｌのファージライブラリー（１×
１０10ｃｆｕ）を１００μｌの２％のミルクで室温で３
０分間ブロックし、次いで１５ウェルのそれぞれに添加
し、３７℃で１時間インキュベートした。 【０３２５】次いで、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含
有するＰＢＳを用い、３７℃で１回の洗浄あたり１０分
間でウェルを３回洗浄した。結合したファージを１００
μｌの溶出緩衝液（Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ２．
２）で溶出し、続いて２ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４で迅
速に中和し、そしてファージ生産のためにトランスフェ
クションした。この選択サイクルを６回反復した。 【０３２６】６サイクルの後、個々のファージクローン
を拾い、そしてファージＥＬＩＳＡにより相対的な親和
性を比較し、そしてウサギＩｇＧに対する特異性をＰｈ
ａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）製のキッ
トを用いて製造業者により推薦される方法に従ってアッ
セイした。 【０３２７】ウエスタンアッセイにより試験した場合、
最良のクローンは、野生型Ａ１０Ｂと比較して約１００
倍の改善された発現レベルを有した。最良のクローンを
用いる競合アッセイにおいて５０％の阻害を生じたウサ
ギＩｇＧの濃度は１ピコモル濃度であった。最良のクロ
ーンはウサギ抗原に対する特異性に再現性が認められ
た。ファージによりディスプレイされる抗体のコピー数
は増加するようである。 【０３２８】（実施例８．部分的遺伝子のダイレクトリ
ピートによるインビボでの組換え）プラスミドを２つの
部分で構築した。この２つの部分は、これらの２つのダ
イレクトリピートの共通範囲間の組換えが完全長の活性
組換え遺伝子をもたらすことを示す同一遺伝子（β−ラ
クタマーゼ）の不活性コピーである。 【０３２９】細菌ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子を保
有するｐＵＣ１８誘導体を使用した（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐ
ｅｒｒｏｎら、１９８５、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１
１９）。ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子（「Ｂｌ
ａ」）は、約０．０２μｇ／ｍｌのセフォタキシムに対
する耐性を細菌に与える。２つのプライマーを用いるベ
クター配列のＰＣＲにより、Ｓｆｉ１制限部を、５’側
のプロモーターとβラクタマーゼ遺伝子の３’末端とに
加えた。２つのプライマーの配列： 【０３３０】 【化１０】 ２つの反応生成物をＳｆｉｌで消化し、混合し、連結
し、そしてこれを用いて以下に記載される手順によりコ
ンピテントなＥ．ｃｏｌｉ菌を形質転換した。得られた
プラスミドをｐＵＣ１８２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉとし
た。このプラスミドはＢＬＡ遺伝子およびＰ−３プロモ
ーターを保有するＳｆｉｌフラグメントを含む。 【０３３１】ｐＵＣ１８２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを保
有するＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に対するセフォタ
キシムの最小阻害濃度は、３７℃、２４時間後で０．０
２μｇ／ｍｌであった。 【０３３２】ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン遺伝子を
相同性範囲を用いてｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉ
にクローニングし、ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｂｌａ
−Ｓｆｉを得た。次いでＳｓｐＩおよびＦｓｐＩを用い
るｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉの制限消
化および平滑末端連結によりＴＥＭ−１遺伝子を欠失さ
せ、ｐＵＣ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉを得た。 【０３３３】ＴＥＭ−１遺伝子の重複領域を標準的なＰ
ＣＲ技術および以下のプライマーを用いて増幅した： 【０３３４】 【化１１】 ２つの得られるＤＮＡフラグメントをＳｆｉ１およびＢ
ｓｔＸ１で消化し、ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉ
のＳｆｉ部位に連結した。得られるプラスミドをｐＢＲ
３２２Ｓｆｉ−ＢＬ−ＬＡ−Ｓｆｉとした。プラスミド
の地図ならびに機能的β−ラクタマーゼのプラスミド内
組換えおよび再形成のスキームを図９に示す。 【０３３５】このプラスミドをＴＧ−１細胞またはＪＣ
８６７９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のいずれかにエレクトロポ
レートした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９はＲｅｃＢＣ
ｓｂｃＡ （Ｏｌｉｎｅｒら、１９９３、ＮＡＲ ２
１：５１９２）である。この細胞をテトラサイクリンを
含有する固体寒天プレート上にプレートした。次いで、
増殖したこれらのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピ
リシンを含有する個体寒天プレート上にプレートし、そ
して生存するコロニーの数をカウントした。アンピリシ
ン耐性を示したこれらの形質転換体中のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子挿入物を、 【０３３６】 【化１２】 とを用いて標準的なＰＣＲ技術により増幅し、そして挿
入物の長さを測定した。１ｋｂの挿入物の存在は、図９
および表５に示されるように遺伝子がうまく組換えられ
たことを示す。 【０３３７】 【表５】 （実施例９．完全長遺伝子のダイレクトリピートによる
インビボ組換え）β−ラクタマーゼ遺伝子の異なる対立
遺伝子の２つの完全長コピーを有するプラスミドを構築
した。２つの遺伝子の相同組換えによりこの遺伝子の１
つの組換え完全長コピーを得た。 【０３３８】ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉおよび
ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉの構築につ
いては上で述べた。 【０３３９】β−ラクタマーゼ遺伝子の２つの対立遺伝
子を以下のように構築した。２つのＰＣＲ反応をｐＵＣ
１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉをテンプレートとして用い
て行った。１つの反応は以下のプライマーを用いて行っ
た。 【０３４０】 【化１３】 これにより２つのＢｌａ遺伝子（一方のＢｌａ遺伝子は
５’末端Ｓｆｉ１部位および３’末端ＢｓｔＸ１部位を
有し、他方のＢｌａ遺伝子は５’末端ＢｓｔＸ１部位お
よび３’末端Ｓｆｉ１部位を有する）を得た。 【０３４１】これらの２つの遺伝子をＢｓｔＸ１および
Ｓｆｉ１で消化し、そしてＳｆｉ１消化プラスミドｐＢ
Ｒ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉに連結した後、Ｂｌａ遺
伝子のタンデムリピートを有するプラスミド（ｐＢＲ３
２２−Ｓｆｉ−２ＢＬＡ−Ｓｆｉ）を得た。（図１０を
参照のこと）このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞内にエ
レクトロポレートした。この細胞を１５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含有する固体寒天プレート上にプレー
トした。次いで増殖したこれらのコロニーを１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含有する固体寒天プレート上に
プレートし、そして生存するコロニーの数をカウントし
た。アンピシンリン耐性を示すこれらの形質転換体中の
Ｂｌａ挿入物を、実施例８に記載される方法およびプラ
イマーを使用する標準的なＰＣＲ技術により増幅した。
１ｋｂの挿入物の存在は、表６に示されるように重複遺
伝子（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｇｅｎｅ）が組換えられた
ことを示す。 【０３４２】 【表６】 （実施例１０．多数サイクルのプラスミド内のダイレク
トリピート組換え）さらに迅速に耐性細胞を生産するた
めに多数サイクルの組換えを用い得るか否かを決定する
ために、実施例９に記載される多数サイクルの方法を行
った。 【０３４３】マイナスの組換えコントロールは、β−ラ
クタマーゼ遺伝子の１つのコピーからなり、一方プラス
の組換え実験は、ダイレクトリピートとしてのβ−ラク
タマーゼの２つのコピーを挿入する工程からなった。テ
トラサイクリンマーカーを用いて、各ラウンドにおいて
セフォタキシム耐性について選択されたコロニーの数を
等しくして連結効率に対して補正をした。 【０３４４】第１ラウンドにおいて、ｐＢＲ３２２Ｔｅ
ｔＳｆｉ−Ｂｌａ−ＳｆｉをＥｃｒＩで消化し、誤りが
ちなＰＣＲのための正常なＰＣＲ混合物とＣａｄｗｅｌ
ｌＰＣＲ混合物（ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（１
９９２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２８−３３）との１：１の混合
物（１ｍｌ）を用いてＰＣＲにかけた。ＰＣＲプログラ
ムは、最初に７０℃で２分間、次いで９４℃で３０秒
間、５２℃で３０秒間、および７２℃で３分間＋６秒／
１サイクルの３０サイクルであり、続いて７２℃で１０
分間であった。 【０３４５】１つのＢｌａ遺伝子コントロールプラスミ
ドを作製するためのＰＣＲ反応で使用されるプライマー
は、プライマー２６５０（配列番号５０）およびプライ
マー２７１９（配列番号５５）５’ ＴＴＡＡＧＧＧＡ
ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴ ３’であった。こ
れはフラグメント＃５９としてひとまとめに消化され、
増幅されたＤＮＡフラグメントの混合された集団を生じ
た。これらのフラグメントは多くの異なる変異を有し
た。 【０３４６】２つのＢｌａ遺伝子プラスミドを作製する
ために２つの異なるＰＣＲ反応で使用されるプライマー
は、第１の遺伝子についてはプライマー２６５０（配列
番号５０）およびプライマー２６４９（配列番号５１）
であり、そして第２の遺伝子についてはプライマー２６
４８（配列番号５４）およびプライマー２７１９（配列
番号５５）であった。これは、２つの増幅したＤＮＡフ
ラグメント：フラグメント＃８９（プライマー２６４８
および２７１９で増幅した）およびフラグメント＃９０
（プライマー２６５０および２６４９で増幅した）それ
ぞれの混合された集団を生じた。それぞれの場合、多く
の異なる変異体がそれぞれのフラグメントの混合された
集団に導入された。 【０３４７】誤りがちなＰＣＲの後、増幅されたＤＮＡ
フラグメント＃５９の集団をＳｆｉ１で消化し、次いで
ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉ内にクローニングし
てプラスミドｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉ1の
混合された集団を作製した。 【０３４８】誤りがちなＰＣＲの後、増幅されたＤＮＡ
フラグメント＃９０および＃８９の集団をＳｆｉＩおよ
びＢｓｔＸＩで５０℃で消化し、そしてｐＢＲ３２２Ｔ
ｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉに連結してプラスミドｐＢＲ３２２
ＴｅｔＳｆｉ−２Ｂｌａ−Ｓｆｉ1の混合された集団を
作製した（図１０）。 【０３４９】プラスミドｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−
Ｓｆｉ1およびｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−２Ｂｌａ−Ｓｆｉ1
をＥ．ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９内にエレクトロポレート
し、そして異なる濃度のセフォタキシムを有する寒天プ
レートに置いて耐性株について選択し、そしてテトラサ
イクリンプレートに置いて力価を測定した。 【０３５０】等しい数のコロニーを（テトラサイクリン
上で増殖するコロニーの数に基づいて）拾い、ＬＢ−ｔ
ｅｔ中で増殖させ、そしてコロニーからＤＮＡを抽出し
た。これは組換えの１ラウンドである。このＤＮＡをＥ
ｃｒＩで消化し、そして上記のように第２ラウンドの誤
りがちなＰＣＲに用いた。 【０３５１】５ラウンド後、１つのフラグメントプラス
ミドに対するセフォタキシムのＭＩＣ（最小阻害濃度）
は０．３２であったが、２つのフラグメントプラスミド
についてのＭＩＣは１．２８であった。結果は、５サイ
クル後の組換えにより得られる耐性は、インビボ組換え
の存在下では４倍高かったことを示す。 【０３５２】（実施例１１．フラグメントのエレクトロ
ポレーションによるインビボ組換え）ｐＵＣ１８Ｓｆｉ
−Ｂｌａ−Ｓｆｉを含む適切なＥ．ｃｏｌｉ細胞を記載
のように調製した。プラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｂｌ
ａ−Ｓｆｉは、前出に記載のような標準的なＴＥＭ−１
β−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。 【０３５３】ｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃｅｆ−Ｓｆｉ（クロ
ーンＳＴ２）（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ （１９９４）
Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１、本明細書中で
参考として援用される）由来のＴＥＭ−１由来セフォタ
キシム耐性遺伝子を得た。このプラスミドは、このプラ
スミドを有するＥ．ｃｏｌｉにセフォタキシムについて
の６４０μｇ／ｍｌのＭＩＣを与える。１つの実験にお
いて、完全なプラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃｅｆ−Ｓ
ｆｉ ＤＮＡを、プラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ
−Ｓｆｉを有するＥ．ｃｏｌｉ細胞内にエレクトロポレ
ートした。 【０３５４】別の実験において、ｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃ
ｅｆ−Ｓｆｉ由来のセフォタキシム遺伝子を有するＤＮ
Ａフラグメントを、プライマー２６５０（配列番号５
０）および２７１９（配列番号５５）を用いるＰＣＲに
より増幅した。得られる１ｋｂのＰＣＲ生成物をＤＮＡ
ｓｅにより１００ｂｐ未満のＤＮＡフラグメントに消化
し、そしてこれらのフラグメントをすでにｐＵＣ１８Ｓ
ｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを有するコンピテントなＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞内にエレクトロポレートした。 【０３５５】次いで、両方の実験からの形質転換された
細胞を、セフォタキシムの種々の濃度を有する寒天プレ
ート上に形質転換された細胞をプレートすることにより
そのセフォタキシムに対する耐性についてアッセイし
た。結果を表７に示す。 【０３５６】 【表７】 結果から、エレクトロポレーション後、ＳＴ−２ Ｃｅ
ｆ遺伝子全体が細菌ゲノムまたはプラスミドのいずれか
に挿入されたように思われる。たいていの挿入物は相同
的であるため、この遺伝子がプラスミドに挿入され、野
生型遺伝子を置換したことが予想される。ＳＴ−２由来
のＣｅｆ遺伝子のフラグメントはまた、効率的にプラス
ミド中の野生型遺伝子内に挿入された。野生型遺伝子
（全体またはフラグメントで）の導入を伴い、そして非
ＤＮＡの導入を伴う場合は、セフォタキシム耐性の急激
な増加は観察されなかった。それゆえ、ＳＴ−２フラグ
メントが野生型フラグメントよりも極めて高いセフォタ
キシム耐性を生じることが示された。耐性を増加させる
遺伝子プールから調製されたフラグメントの反復された
挿入物が、耐性の増加をもたらすことが意図される。 【０３５７】従って、ＳＴ−２遺伝子フラグメントによ
りセフォタキシム耐性の増加を生じるこれらのコロニー
を単離し、そしてプラスミドＤＮＡを抽出した。このＤ
ＮＡを上記の方法によるＰＣＲを用いて増幅した。増幅
したＤＮＡをＤＮＡｓｅで消化してフラグメント（＜１
００ｂｐ）にし、そして２〜４μｇのフラグメントを上
記のようにすでにｐＵＣ３２２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉ
を含有するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞内にエレク
トロポレートした。形質転換された細胞を種々の濃度の
セフォタキシムを含有する寒天上にプレートした。 【０３５８】コントロールとしてｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｋ
ａｎ−Ｓｆｉを有するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉも使
用した。ｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃｅｆ−ＳｆｉのＰＣＲ生
成物の消化物からのＤＮＡフラグメントをこれらの細胞
内にエレクトロポレートした。カナマイシン遺伝子とβ
−ラクタマーゼ遺伝子との間には相同性は存在せず、従
って組換えは起こらない。 【０３５９】この実験を２ラウンド反復した。結果を表
８に示す。 【０３６０】 【表８】（実施例１２．組換え形式の決定）本実験は、どの組換
え形式が１サイクルあたり最大の組換え体を生成するか
を決定するために設計された。 【０３６１】第１のアプローチにおいて、ベクターｐＵ
Ｃ１８５Ｓｆｉ−Ｂｌａ−ＳｆｉをＰＣＲプライマーで
増幅して、大フラグメントおよび小フラグメントを生成
した。大フラグメントはプラスミドおよびＢｌａ遺伝子
部分を有する末端を有し、そして小フラグメントはＢｌ
ａ遺伝子の中間部分をコードした。完全なＢｌａ遺伝子
を有する第３のフラグメントを実施例８の方法によりＰ
ＣＲを使用して作製した。より大きなプラスミドフラグ
メントおよび完全なＢｌａ遺伝子を有するフラグメント
を上記の方法により同時にＥ．ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９
細胞内にエレクトロポレートし、そして形質転換体を異
なる濃度のセフォタキシム上にプレートした。 【０３６２】第２のアプローチにおいて、ベクターｐＵ
Ｃ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを増幅して、上記第１の
アプローチにおけるように単離された大プラスミドフラ
グメントを生成した。２つのフラグメントはそれぞれ完
全なＢｌａ遺伝子の一部を有し、その結果２つのフラグ
メントが共になって完全なＢｌａ遺伝子にまたがる２つ
のフラグメントもまたＰＣＲにより得た。大プラスミド
フラグメントおよび２つのＢｌａ遺伝子フラグメントを
すべてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９細胞
内にエレクトロポレートし、そして形質転換体を種々の
濃度のセフォタキシム上にプレートした。 【０３６３】第３のアプローチにおいて、ベクターとプ
ラスミドとの両方をＥ．ｃｏｌｉＪＣ８６７９細胞内に
エレクトロポレートし、そして形質転換体を種々の濃度
のセフォタキシム上にプレートした。 【０３６４】第４のアプローチにおいて、完全なＢｌａ
遺伝子を、すでにベクターｐＵＣＳｆｉ−Ｓｆｉを含む
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９細胞内にエレクトロポレー
トし、そして形質転換体を種々の濃度のセフォタキシム
上にプレートした。コントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＣ８６７９細胞を完全なＢｌａ遺伝子またはベクター
単独のいずれかでエレクトロポレートした。 【０３６５】結果を図１１に表す。ベクターへの２つの
フラグメントの挿入の効率は、完全なＢｌａ遺伝子を有
する１つのフラグメントが使用される場合より１００倍
低い。第３のアプローチは、挿入の効率は遊離ＤＮＡ末
端の存在に依存することを示した。なぜなら、このアプ
ローチでは組換え体が得られなかったからである。しか
し、第３のアプローチの結果もまた、ベクターのエレク
トロポレーションの低効率によるものであった。発現ベ
クターがすでにコンピテントな細胞内にある場合、ベク
ターのエレクトロポレーションの効率はもはや要因では
なく、効率的な相同組換えは非切断のベクターを用いて
さえ達成され得る。 【０３６６】（実施例１２．ベクターの性能を最適化す
るカセット再編成のためのキット）最適化された表現型
（例えば、クローン化遺伝子のようなベクターがコード
される配列の最大の発現）を与え得るベクターを提供す
るために、再編成され得る種々のカセットを含むキット
が提供され、そして最適化された再編成体が選択され得
る。図１２は、それぞれの遺伝子座が複数のカセットを
有する１つの実施態様を概略的に示す。例えば、細菌の
発現システムにおいて、図１３はそれぞれの遺伝子座で
使用される例示のカセットを示す。与えられた遺伝子座
のそれぞれのカセット（例えば、本実施例のすべてのプ
ロモーター）は、隣接する遺伝子座のカセットのフラン
キング配列に重複し得、そしてまた、好ましくは相同組
換えまたは非相同性組換えに関与し得る（例えば、ｌｏ
ｘ／ｃｒｅまたはｆｌｐ／ｆｒｔ系）実質的に同一な配
列と隣接し、遺伝子座内であるが実質的に遺伝子座間で
はないカセットの再編成を提供するようにする。 【０３６７】カセットはＰＣＲフラグメントとしてキッ
トに供給されるが、それぞれのタイプのカセットまたは
個々のカセットの種は個別のチューブにパッケージされ
る。ベクターライブラリーは、それぞれの遺伝子座のカ
セットの重複フランキング配列と隣接する遺伝子座のカ
セットとのハイブリダイゼーションによって、プラスミ
ド全体またはその実質的な部分を組立てるチューブの内
容物を組み合わせることにより作製される。組立てられ
たベクターは目的の未定の遺伝子へ連結されてベクター
ライブラリーを形成する。ここで、それぞれのライブラ
リーのメンバーは目的の未決定の遺伝子およびカセット
の結合により決定されるカセットの組み合わせを含む。
ベクターは適切な宿主細胞内に移され、そしてこの細胞
は発現に適切な条件下で培養され、そして所望の表現型
が選択される。 【０３６８】本発明は、好適な実施例と考えられるもの
に関して記載されているが、本発明が開示された実施例
に制限されないことが理解されるべきである。反対に、
本発明は添付された請求の範囲の趣旨および範囲内に包
含される種々の改変および同等の組立てを包含すること
が意図されている。 【０３６９】（参考文献）以下の文献は、本出願の関連
する部分で本出願において引用される。 【０３７０】 【表９】 すべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個
々の刊行物、特許、または特許出願が特別にかつ個々に
その全体が参考として援用されると示される場合と同じ
程度に、本明細書中においてそれらの全体が参考として
援用される。 【０３７１】 【発明の効果】本明細書に記載の発明は、点変異誘発、
核酸再編成および選択の反復サイクルを使用することに
関し、タンパク質のような高度に複雑な直線配列のイン
ビトロにおける直接的な分子進化を、ランダム組換えに
よって可能にする。 【０３７２】従って、変異ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパ
ク質の大規模ライブラリーの生成を可能にする方法およ
び所望の目的のために特定の変異体を選択することを可
能にする方法を開発することは有益である。本明細書中
に記載の発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のよ
うな高度に複雑な直線配列のインビボにおける直接分子
進化を、組換えによって可能にする変異誘発、インビボ
組換えおよび選択の反復サイクルの使用に関する。
【図面の簡単な説明】 【図１】図１は、変異誘発性の再編成と誤りがちなＰＣ
Ｒとを比較する概略図である；（ａ）初発ライブラリ
ー；（ｂ）１回目のアフィニティー選択において選択さ
れた配列のプール；（ｄ）選択された配列のインビトロ
における組換え（「再編成」）；（ｆ）再編成後の２回
目のアフィニティー選択において選択された配列のプー
ル；（ｃ）誤りがちなＰＣＲ；（ｅ）誤りがちなＰＣＲ
後の２回目のアフィニティー選択において選択された配
列のプール。 【図２】図２は、１０ｂｐ〜５０ｂｐのランダムフラグ
メントからの１．０ｋｂ ＬａｃＺα遺伝子フラグメン
トの再組立（ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）を示す。（ａ）Ｌ
ａｃＺα遺伝子を有するＰＣＲ増幅したゲルＤＮＡフラ
グメントの写真。（ｂ）ＤＮＡｓｅＩ消化後のＤＮＡフ
ラグメントのゲルの写真。（ｃ）消化されたＬａｃＺα
遺伝子ＤＮＡフラグメントから精製した１０ｂｐ〜５０
ｂｐのＤＮＡフラグメントのゲルの写真；（ｄ）指示さ
れた数のサイクルのＤＮＡ再組立後の１０ｂｐ〜５０ｂ
ｐのＤＮＡフラグメントのゲルの写真；（ｅ）プライマ
ーを用いたＰＣＲによる増幅後の組換え混合物のゲルの
写真。 【図３ａ】図３は、ＬａｃＺα遺伝子の終止コドン変異
体およびそれらのＤＮＡ配列の概略図である。四角枠の
領域は非相同範囲であり、マーカーとして働く。終止コ
ドンは小さな四角枠内に位置するかまたは下線を付して
いる。「＋」は、野生型遺伝子を示し、そして「−」は
遺伝子における変異範囲を示す。 【図３ｂ】図３は、ＬａｃＺα遺伝子の終止コドン変異
体およびそれらのＤＮＡ配列の概略図である。四角枠の
領域は非相同範囲であり、マーカーとして働く。終止コ
ドンは小さな四角枠内に位置するかまたは下線を付して
いる。「＋」は、野生型遺伝子を示し、そして「−」は
遺伝子における変異範囲を示す。 【図４】図４は、合成オリゴヌクレオチドをＬａｃＺα
遺伝子の再組立プロセスへの導入またはスパイク（ｓｐ
ｉｋｉｎｇ）の概略図である。 【図５ａ】図５は、 Ｅ．ｃｏｌｉの使用コドン（ｃｏ
ｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を用いて、マウスＩＬ１−Ｂ遺伝
子（Ｍ）とヒトＩＬ１−Ｂ遺伝子（Ｈ）との間の相同な
領域を示す。非相同領域には四角枠を付す。「＿｜￣」
は、２つの遺伝子の再編成時に得られた交差を示す。 【図５ｂ】図５は、 Ｅ．ｃｏｌｉの使用コドン（ｃｏ
ｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を用いて、マウスＩＬ１−Ｂ遺伝
子（Ｍ）とヒトＩＬ１−Ｂ遺伝子（Ｈ）との間の相同な
領域を示す。非相同領域には四角枠を付す。「＿｜￣」
は、２つの遺伝子の再編成時に得られた交差を示す。 【図６】図６は、抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａ１０Ｂ）のｓ
ｃＦｖを使用した抗体ＣＤＲ再編成モデルシステムの概
略図である。 【図７】図７は、抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａ１０Ｂ）のｓ
ｃＦｖの再編成ＤＮＡにおいて、観察されたＣＤＲの特
定の組み合わせが生じる頻度を示す。 【図８】図８は、ＤＮＡ再編成および各サイクルの選択
後のｓｃＦｖ抗ウサギＩｇＧ抗体の改良された結合活性
を示す。 【図９】図９は、ｐＢＲ３２２−Ｓｆｉ−ＢＬ−ＬＡ−
Ｓｆｉおよびダイレクトリピートを介するインビボにお
けるプラスミド内の組換え、および機能的なβラクタマ
ーゼ遺伝子を再構築するプラスミド内の組換えによるア
ンピシリン耐性コロニーの発生率を概略する。 【図１０】図１０は、ｐＢＲ３２２−Ｓｆｉ−２Ｂｌａ
−Ｓｆｉおよびダイレクトリピートを介するインビボに
おけるプラスミド内の組換え、および機能的なβラクタ
マーゼ遺伝子を再構築するインビボにおけるプラスミド
内の組換えによるアンピシリン耐性コロニーの発生率を
概略する。 【図１１】図１１は、組換えタンパク質を生成するため
に、ポリヌクレオチドフラグメントを細胞に導入した
後、多数回の相同組換えの効率を試験する方法を示す。 【図１２】図１２は、以下の座位でのカセットを再編成
することによるベクターのライブラリーの生成を概略す
る：プロモーター、リーダーペプチド、ターミネータ
ー、選択薬物耐性遺伝子、および複製開始点。各遺伝子
座での複数の平行な線はそのカセットについてのカセッ
トの多様性を表す。 【図１３】図１３は、再編成により真核生物のベクター
ライブラリーを構築するために、種々の遺伝子座におけ
る適切なカセットのいくつかの例を概略的に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレアス クラメリ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040, マウンテン ビュー， ドルシラ ドラ イブ 531 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 DA06 GA14 HA08 HA11 HA20

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 キメラなポリヌクレオチドを得る方法で
    あって、以下の工程： ａ）同一な範囲および非相同な範囲を含む異なる２本鎖
    鋳型ポリヌクレオチドを、該鋳型ポリヌクレオチドの所
    望な大きさを有する２本鎖のランダムフラグメントへの
    切断を提供するような条件下で処理する工程； ｂ）工程（ａ）で生成される、得られる２本鎖のランダ
    ムフラグメントを、１本鎖フラグメントに変性する工
    程； ｃ）該同一な範囲での標的１本鎖フラグメントのアニー
    リング、および工程（ｂ）で生成される１本鎖フラグメ
    ントを含有するキメラな２本鎖ポリヌクレオチド配列の
    形成を提供する条件下で、得られる該１本鎖フラグメン
    トをポリメラーゼとともにインキュベートする工程； ｄ）少なくとも２回、（ｂ）および（ｃ）の工程を反復
    する工程；および ｅ）キメラ２本鎖ポリヌクレオチドまたはその発現産物
    を、スクリーニングまたは選択して、所望の機能的性質
    を有するキメラ２本鎖ポリヌクレオチドを同定する工
    程；を、包含する、方法。
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