CN1861789B - 一种综合的基因改组方法及所获得的重组基因和编码蛋白 - Google Patents

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CN1861789B CN2005100464134A CN200510046413A CN1861789B CN 1861789 B CN1861789 B CN 1861789B CN 2005100464134 A CN2005100464134 A CN 2005100464134A CN 200510046413 A CN200510046413 A CN 200510046413A CN 1861789 B CN1861789 B CN 1861789B
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安迎锋
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Abstract

本发明涉及基因的指导进化，是一种综合的基因改组方法，首先选取待突变/改组的线性双链基因，采用易错PCR方法扩增15个循环，所得到的产物用80％酒精沉淀，清洗去除反应体系中的可溶性组分；然后在上述沉淀物中加入DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和超纯水，组成StEP反应体系，并扩增得到改组基因，通过琼脂糖凝胶电泳，并对目的大小的DNA片段进行特异性扩增，然后进行表达与筛选，获得具有目的特征的改组基因。本发明可以有效的实现在一个反应过程中同时实现基因的随机突变和改组，并用合成酶基因sam1为起始基因验证了本发明的有效性，获得了能促进胞内SAM积累量提高的重组酶。

Description

一种综合的基因改组方法及所获得的重组基因和编码蛋白
技术领域
本发明涉及基因的指导进化，具体的说是一种综合的基因改组方法及所获得的重组基因和编码蛋白，是一种能将易错PCR和StEP巧妙的整合在一个反应过程中的基因改组方法。
背景技术
指导进化就是在实验室中人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制(如突变、重组)，从而在不需要了解蛋白质的空间结构和功能的前提下，定向选择出所需性质的蛋白分子。目前这一机制已经被广泛的应用于蛋白质药物，农业，化学工业，生物工程等领域(Patten，P.A.，Howard，R.J.&Stemmer，W.P.C.Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals andvaccines.Curr Opin Biotechnol.1997，8：724-733)，特别是被应用于提高酶的活性(Crameri，A.，Raillard，S-A.，Bermudez，E.& Stemmer，W.P.C.DNAshuffling of a family of genes from diverse species accelerates directedevolution.Nature.1998，391，288-291.)、稳定性(Oh，K.H.，Nam，S.H.& Kim，H.S.Improvement of Oxidative and Thermostability of N-Carbamyl-D-AminoAcid Amidohydrolase by Directed Evolution.Protein Eng.2002，15，689-695.)和表达水平(Bulter，T.et.al.Functional expression of a fungal laccase inSaccharomyces cerevisiae by directed evolution.Appl.Environ.Microbiol.2003，69，987-995.)。
随着各种新型突变技术和新型的检测系统的出现，对于指导进化的研究不断向纵深发展。指导进化相关的方法有很多，其中简单和为人们所熟知的就是采用易错PCR(error-prone PCR)产生随机突变。该方法采用低保真性的扩增步骤，在每一轮循环中都随机的引入点突变。该方法具有很多成功的例子，但是不能够满足进化在统计学上的复杂性，主要是由于缺乏重组机制。运用该方法，人们往往无法得到核苷酸序列分布的多样性，因为多个点突变不容易重新组合，因此无法获得对功能序列空间的有意义的探索。而另一种PCR相关的基因改组方法-交错延伸过程(StEP)则可以通过序列延伸过程中模板间的切换，介导产生不同母链DNA间的序列交换，从而有效的实现基因间的重新组合。
在以往的研究中，StEP和error-prone PCR经常被结合使用，但是需要经历相对独立的两个反应过程(Zhao，H.，Giver，L.，Shao，Z.& Arnold，F.H.Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitrorecombination.Nat.Biotechnol.1998，16，258-261.；Zhao H，Arnold F H.Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent ofthermitase[J].Protein Eng，1999，12：47～53.)，而这些过程往往工作量很大，非常费时，而且在这些烦琐的步骤中，一些有意义的突变位点可能会丢失。以对SAM合成酶基因进行改组为例，其具体反应流程是(如图1-b)：首先进行易错PCR——进行产物纯化——产物经酶切后克隆进载体——重组质粒转化大肠杆菌——转化产物涂布在含有乙硫氨酸和氨苄的LB培养基进行抗性筛选——从存活菌株中提取质粒并转化酿酒酵母——SAM抽提——用HPLC进行SAM含量测定——抽提能促进胞内SAM积累量提高的重组质粒——以上述重组质粒为模板，建立StEP反应体系，进行基因改组。因此能否将两者有机的结合起来，尽可能的减少工作量，提高工作效率，是亟待解决的一个问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种综合的基因改组方法，该方法通过简单的实验步骤将以往两种独立的基因改造技术(易错PCR和StEP)巧妙的结合在一个反应体系中，并通过一轮反应即实现了基因的突变与改组；并运用该方法产生了改组基因和活性提高的改组蛋白。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种综合的基因改组方法，步骤如下：
1)易错PCR：选取待突变/改组的线性双链基因，采用易错PCR方法扩增15个循环，所得到的产物用80％酒精沉淀，清洗去除反应体系中的可溶性组分；
2)StEP反应：在上述沉淀物中加入DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和超纯水，组成StEP反应体系，并扩增得到改组基因，通过琼脂糖凝胶电泳，并对目的大小的DNA片段进行特异性扩增，然后进行表达与筛选，获得具有目的特征的改组基因。
下面以酿酒酵母总DNA为模板，扩增带有EcoRI和NotI的sam1基因，该基因具有序列表SEQ ID No：1中的核苷酸序列。将该基因克隆到pYES2载体相应的酶切位点，获得重组质粒，然后进行如下步骤：
1)以上述重组质粒为模板，采用易错PCR方法扩增15个循环，所得到的产物用80％酒精沉淀，并反复清洗，去除反应体系中的可溶性组分；
2)在沉淀物中加入相关物质，组成StEP反应体系，并扩增得到改组基因；
3)通过琼脂糖凝胶电泳，对目的大小的DNA片段进行纯化和特异性扩增；
4)将重组基因连入表达载体并转入酿酒酵母，通过筛选，得到抗乙硫氨酸的工程菌株，通过腺苷蛋氨酸含量的测定，分离得到含量提高的菌株及其所包含的重组基因；
所获得的重组基因具有序列表SEQ ID No：3中的核苷酸序列；该核酸序列来源于初始基因，与初始基因相比具有8个点突变：A58C，T255A，T309C，G358A，G417A，A552G，A637T和G1060T。所获得的重组基因编码的蛋白，具有序列表SEQ ID No：4中的氨基酸序列，其能在酿酒酵母中高效表达，并能促进SAM在胞内的积累量；该蛋白氨基酸序列分别来源于初始酶，并且具有4个氨基酸突变：I20L，G120S，I213L和A354S。
同样以对SAM合成酶基因进行改组为例，采用本试验方法，，在本研究中，我们运用该方法对来自酿酒酵母的SAM合成酶基因sam1进行了改组。
本发明具有以下优点：
1.过程非常简单。本方法首先采用易错PCR扩增15个循环，反应物经80％酒精沉淀和反复清洗后，所得的产物作为引物与模板，通过交错延伸过程(staggered extension process，StEP)，也就是在DNA扩增过程中通过缩短退火和延伸时间而实现扩增片段在模板间的切换，从而实现基因间改组(反应步骤如下：易错PCR(error-prone PCR)反应15个循环——产物用80％乙醇沉淀和洗涤——将上述沉淀溶解，并加入其它组分，建立StEP反应体系，进行基因改组)。本发明通过独特的反应过程提供了一个新的基因改组方法，该方法通过简单的实验步骤将以往两种独立的基因改造技术(易错PCR和StEP)巧妙的结合在一个反应体系中，并在一个试验反应过程中同时实现基因的随机突变与改组；使用本发明所述方法进行基因改组，仅通过一轮反应即可获得改组基因；
2.安全、效果稳定。使用本发明所述方法可以避免传统方法中由于复杂的步骤可能造成的有益点突变的缺失。
3.应用效果好。使用本发明方法用来自于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1为起始基因验证了该方法的有效性，获得了一种重组基因，其核酸序列与原有基因序列相比具有8点突变：A58C，T255A，T309C，G358A，G417A，A552G，A637T，G1060T，该基因可以在大肠杆菌中高效表达；其编码的重组酶来源于初始酶，并且具有4个氨基酸突变：I20L，G120S，I213L和A354S，其具有SAM合成酶活性，能促进SAM在胞内的积累量提高；引用本发明，可进一步提供直接用于生产重组酶的工程菌株。
附图说明
图1为采用综合性方法对sam1进行突变和改组；其中，A显示该方法的试验步骤，经15个循环的易错PCR后，产物经80％乙醇沉淀和洗涤并直接用作模板和引物进行StEP改组过程；B显示在采用以往方法对SAM进行改组时，为达到同样的目的所需要的更多的试验步骤；
图2为SAM合成酶基因sam1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析；其中，LaneM：DNA Marker DL2000；Lane1：PCR目的条带；
图3为采用综合性方法对sam1进行突变和改组过程的琼脂糖凝胶电泳图；其中，Lane M：DNA marker DL2000；Lane1：采用综合的基因改组方法，经一轮反应后所得到的产物；Lane2：目的大小DNA片段的特异性扩增(大约1.15kb)；
图4为采用综合性方法指导进化的sam1表达量的SDS-PAGE图；其中，Lane M：中分子量蛋白质Marker；Lane 1-3分别代表包含有不同质粒的酿酒酵母的表达情况：Lane1包含pYES2；Lane2包含pYES2+sam1；Lane3包含pYES2+sam1’；
图5为含有重组质粒的酿酒酵母经诱导表达后胞内SAM积累量的HPLC图；其中，(a)到(c)分别代表包含有不同质粒的酿酒酵母在诱导表达后SAM的胞内积累量：(a)含有pYES2，(b)含有pYES2+sam1，(c)含有pYES2+sam1’；(d)SAM标准品。
具体实施方式
易错PCR和StEP分别是介导点突变和DNA序列交换的常用方法，两种方法都是基于传统PCR建立起来的。两者的不同之处在于PCR反应体系的组分和反应的程序。具体的说，在反应体系的组分上，两种方法的主要区别在于引物与模板的比率不同。对于易错PCR，其比率与标准的PCR程序相似，约为106∶1，这一比率明显高于StEP。在本发明中，首先要进行易错PCR，在反应初始阶段，特别是前十几个循环中，产物将以近似指数形式递增，相应的，引物也将以同样的方式递减；15个循环过后，以60％-100％之间的扩增效率计算，引物与模板之间的比率将从106∶1降低到61-866∶1，而这一比率与所报道的StEP反应体系要求的比率范围基本吻合；产物经80％的乙醇沉淀和洗涤后，反应体系中可溶性成分(包括taq DNA聚合酶，1×taq buffer，dNTP等)将会被除去，而沉淀下来的PCR产物和引物经超纯水溶解后，可以作为下一个步骤中StEP反应体系的模板与引物。这样的处理方法，可以节省在以往方法中易错PCR结束后所需要的大量的反应步骤(如图1-b)。
实施例1
一种来源于酿酒酵母INVScI菌株的编码SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1，具有序列表SEQ ID No：1中的碱基序列。
SEQ ID No：1：
ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGA
TAAGATCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGG
ACCCTCACTCCAAAGTTGCGTGTGAAACCGCGGCAAAGACTGGTATGATTATG
GTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAG
AGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGTTTCGACTATA
AGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGATATCGCCCAA
GGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCGGTGACCAAGGTAT
CATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTGACTATTC
TTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCGAGAAGAGATGGCTCT
TTAGCGTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGA
TGACCACGGTAGATGGGTTCCACAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTC
AACATGCTGACGAAATCACGACCGAGGACTTAAGAGCGCAACTAAAGTCCGAG
ATCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTT
TATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTT
TGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGT
GGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTA
TGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAG
TTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCGGAACCATTGTCCTTGCAC
GTTGACACCTATGGTACTGCGACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTAT
CAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTAG
CTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAA
TACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA
(1)SEQ ID No：1的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：1149碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：酿酒酵母INVScI菌株的编码SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1
(2)来源于酿酒酵母INVScI菌株的编码SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1的制备：
上游引物1：5-GTCGAATTCATGGCCGGTACATTTTTATTCAC-3；
下游引物2：5-GCAGCGGCCGCTTAGAACTTCAAAGTCTTAGGC-3；
下划线序列分别为EcoRI和NotI酶切位点。
扩增条件：以酿酒酵母INVScI菌株总DNA为模板，以pfu DNA聚合酶进行扩增。反应体系为：2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmolL-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，总反应体积100μl；反应条件：94℃变性2min；30个循环的94℃30s，55℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR产物回收：按上海华舜试剂盒使用说明书。目的产物见琼脂糖凝胶电泳(如图2)。将目的基因经EcoRI和NotI酶切后克隆入pSE380载体的相应酶切位点，构建pSE380-sam1重组质粒。
实施例2
采用新的综合的基因改组方法对sam1进行改组，获得编码酶活性提高的重组酶的基因sam1，具有序列表SEQ ID No：3的碱基序列。
SEQ ID No3：
ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGA
TAAGCTCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGG
ACCCTCACTCCAAAGTTGCGTGTGAAACCGCGGCAAAGACTGGTATGATTATG
GTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAG
AGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGATTCGACTATA
AGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGACATCGCCCAA
GGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCAGTGACCAAGGTAT
CATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTAACTATTC
TTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCGAGAAGAGATGGCTCT
TTAGCGTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGA
TGACCACGGTAGATGGGTTCCGCAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTC
AACATGCTGACGAAATCACGACCGAGGACTTAAGAGCGCAACTAAAGTCCGAG
TTCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTT
TATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTT
TGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGT
GGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTA
TGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAG
TTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCGGAACCATTGTCCTTGCAC
GTTGACACCTATGGTACTGCGACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTAT
CAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTAT
CTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAA
TACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA
(1)SEQ ID No：3的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度：1149碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(2)采用综合的基因改组方法对sam1进行改组。
采用易错PCR方法引入随机突变。5’和3’引物分别为：
P1(5-GTCGAATTCATGGCCGGTACATTTTTATTCAC-3)；
P2(5-GCAGCGGCCGCTTAGAACTTCAAAGTCTTAGGC-3)
P1和P2中下划线序列分别为EcoRI和NotI限制性内切酶的识别序列，该序列的存在将允许PCR产物经过相应的酶切后克隆入经同样酶切的pYES2载体中。
易错PCR反应体系如下：dATP 0.2mM，dGTP 0.2mM，dCTP 1mM，dTTP 1mM，MnCl2 1mM，MgCl2 8mM，引物各1μM，模板(质粒pYES2-sam1)0.3ng，10×Taq buffer 10μl，Taq DNA聚合酶5U，加ddH2O至反应总体积为100μl。PCR反应程序如下：94℃变性2min，随后15个循环的94℃30s，45℃1min，72℃2min.PCR反应产物用80％乙醇沉淀并洗涤3次，干燥后溶解于20μl无菌水中。
该产物被用作下一步骤的模板和引物，其反应体系如下：dNTP 0.2mM，MgCl2 1.5mM，10×Taq buffer 10μl，Taq DNA聚合酶5U，引物与模板(上述反应产物)，加ddH2O至反应总体积为100μl。反应程序如下：94℃变性2min，随后80个循环的94℃30s，50℃5s.
反应产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，其正确大小的条带(约1.15kb)用胶回收试剂盒纯化。纯化产物用于模板特异性的扩增目的基因。反应体系为：dNTP 0.2mM，MgCl2 1.0mM，10×Taq buffer 10μl，Taq DNA聚合酶5U，模板2ng，引物0.5μM，加ddH2O至反应总体积为100μl。
PCR反应程序如下：94℃变性2min，随后30个循环的94℃30s，52.5℃30s，72℃2min；然后72℃10min。产物用PCR纯化试剂盒进行纯化，然后用EcoRI和Not I进行限制性酶切消化，反应物总体积为20μl。反应产物经灭活内切酶后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，目的大小的条带(约1.15kb)被切下并用胶回收试剂盒进行纯化。用T4 DNA连接酶将纯化产物连接到经同样酶切的pSE380载体上。
将连接后的重组质粒转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布在含有100μg/ml Amp和10mmol/L乙硫氨酸的LB平板上进行筛选，以获得含有突变目的基因的重组菌株。平板在37℃下培养12h。从存活的菌株中抽提重组质粒，然后再用EcoRI和NotI酶切，酶切产物经灭活内切酶后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，目的大小的条带(约1.15kb)被切下并用胶回收试剂盒进行纯化，再用T4 DNA连接酶将纯化产物亚克隆到经同样酶切的pYES2载体上，构建pYES2+sam1’重组质粒，并转化酿酒酵母INVScI菌株。挑取基因工程菌单菌落接种到15ml修改的SC-U培养基(6.7g酵母氮源；5g蛋氨酸；0.1g的腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，络氨酸，苏氨酸；0.05g的天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，色氨酸和缬氨酸；终体积1L)，包括2％棉籽糖。30℃培养至OD600＝0.4，然后4℃下1500×g离心5min，然后将细胞重悬于2ml诱导培养基(修改的SC-U培养基，包含2％的半乳糖)，再接种到50ml的诱导培养基内，30℃条件下150r min-1摇床内培养6h。然后4℃下1500×g离心5min，倒掉上清，将沉淀重悬于500μl的纯净水。4℃下1500×g离心5min，倒掉上清，细胞用于检测SAM积累。每1g菌体中加入5ml 1.5mol L-1的高氯酸以120r min-1摇动1h.进行抽提，生成的SAM水平用BioCAD 700E型HPLC(Perseptive Biosystem，Inc.U.S.A.)进行检测。本试验选用弱阳离子交换柱Poros20CM(4.6mm×100mm)，流动相为0.5mol L-1的HCOONH4，pH调整为4.0，流速为5ml min-1，在260nm波长下检测产物，室温22℃。作为对照，含有pYES2质粒和pYES2+sam1质粒的酿酒酵母也被用于检测SAM的胞内积累量。10μmol/L的标准品SAM被用于标定SAM的保留时间。
取1ml发酵液离心，菌体沉淀用1ml蒸馏水洗涤，离心后重悬于1倍的上样缓冲液中，沸水浴煮10min，12000×g离心2min。取10μl进行SDS-PAGE电泳，0.1％考马斯亮蓝染色，然后检测蛋白的表达。
结果：
1.运用本发明所述的基因改组方法，经过一轮反应即获得目的大小的重组DNA(如图3)；
2.在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带，诱导蛋白如图4所示。分子量约为4.2K dalton；
3.通过HPLC检测，得到一株腺苷蛋氨酸胞内积累量提高的酿酒酵母菌株，胞内SAM积累量较对照提高了26％(如图5)；
4.对其所含质粒pYES2+sam1’进行序列分析，确定其含有改组基因，并且具有8个位点突变，引起4个氨基酸替换。
基因改组
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院沈阳应用生态研究所
<120>一种综合的基因改组方法及所获得的重组基因和编码蛋白
<130>
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1149
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1149)
<223>
<400>1
atg gcc ggt aca ttt tta ttc act tct gaa tcc gtt ggt gaa ggt cac     48
Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His
1               5                   10                  15
cca gat aag atc tgt gac caa gtt tcc gac gcc atc ttg gac gct tgt     96
Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys
            20                  25                  30
tta gcc gag gac cct cac tcc aaa gtt gcg tgt gaa acc gcg gca aag    144
Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys
        35                  40                  45
act ggt atg att atg gtc ttt ggt gaa att act acc aag gca cag ttg    192
Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu
    50                  55                  60
gat tac caa aaa atc gtc aga gac acc atc aag aag att ggt tac gat    240
Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp
65                  70                  75                  80
gat tcc gcc aag ggt ttc gac tat aag acc tgt aac gtc ctt gtc gcc    288
Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala
                85                  90                  95
att gag caa caa tct cca gat atc gcc caa ggt gtc cac gag gag aag    336
Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys
            100                 105                 110
gat ttg gaa gac atc ggt gcc ggt gac caa ggt atc atg ttt ggt tac    384
Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr
        115                 120                 125
gcc aca gat gaa act cca gag ggt ttg cct ttg act att ctt ttg gct    432
基因改组
Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala
    130                 135                 140
cat aaa cta aac atg gcc atg gct gac gcg aga aga gat ggc tct tta    480
His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu
145                 150                 155                 160
gcg tgg ttg aga cca gac acc aag act caa gtc acc gtc gaa tac aag    528
Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys
                165                 170                 175
gat gac cac ggt aga tgg gtt cca caa aga atc gac acc gtc gtc gtc    576
Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val
            180                 185                 190
tcc gct caa cat gct gac gaa atc acg acc gag gac tta aga gcg caa    624
Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln
        195                 200                 205
cta aag tcc gag atc att gaa aaa gtc atc cca aga gac atg ttg gac    672
Leu Lys Ser Glu Ile Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp
    210                 215                 220
gaa aac acc aaa tac ttt atc caa cct tcc ggt aga ttc gtc atc ggt    720
Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly
225                 230                 235                 240
ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag atc atc gtc gac    768
Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp
                245                 250                 255
gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc ggt aag    816
Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys
            260                 265                 270
gac tac tct aag gtt gat cgt tct gcc gct tat gcc gct aga tgg gtt    864
Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val
        275                 280                 285
gcc aag tcc cta gtt gcc gct ggt tta tgt aag aga gtt caa gtt caa    912
Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln
    290                 295                 300
ttt tct tat gcc atc ggt att gcg gaa cca ttg tcc ttg cac gtt gac    960
Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp
305                 310                 315                 320
acc tat ggt act gcg acc aag tct gac gaa gaa att atc gac att atc   1008
Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile
                325                 330                 335
agc aag aac ttt gac ttg aga cct ggt gta ttg gtc aag gag ttg gac   1056
Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp
            340                 345                 350
tta gct aga cca atc tac ttg cca acc gct tct tat ggc cat ttc aca   1104
Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr
        355                 360                 365
aac caa gaa tac cca tgg gaa aag cct aag act ttg aag ttc taa       1149
Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe
    370                 375                 380
<210>2
<211>382
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>2
Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His
1               5                   10                  15
基因改组
Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys
            20                  25                  30
Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys
        35                  40                  45
Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu
    50                  55                  60
Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala
                85                  90                  95
Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys
            100                 105                 110
Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr
        115                 120                 125
Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala
    130                 135                 140
His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu
145                 150                 155                 160
Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys
                165                 170                 175
Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val
            180                 185                 190
Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln
        195                 200                 205
Leu Lys Ser Glu Ile Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp
    210                 215                 220
Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp
                245                 250                 255
Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys
            260                 265                 270
Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val
        275                 280                 285
Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln
    290                 295                 300
Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp
305                 310                 315                 320
基因改组
Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp
            340                 345                 350
Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr
        355                 360                 365
Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe
    370                 375                 380
<210>3
<211>1149
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1149)
<223>
<400>3
atg gcc ggt aca ttt tta ttc act tct gaa tcc gtt ggt gaa ggt cac     48
Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His
1               5                   10                  15
cca gat aag ctc tgt gac caa gtt tcc gac gcc atc ttg gac gct tgt     96
Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys
            20                  25                  30
tta gcc gag gac cct cac tcc aaa gtt gcg tgt gaa acc gcg gca aag    144
Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys
        35                  40                  45
act ggt atg att atg gtc ttt ggt gaa att act acc aag gca cag ttg    192
Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu
    50                  55                  60
gat tac caa aaa atc gtc aga gac acc atc aag aag att ggt tac gat    240
Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp
65                  70                  75                  80
gat tcc gcc aag gga ttc gac tat aag acc tgt aac gtc ctt gtc gcc    288
Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala
                85                  90                  95
att gag caa caa tct cca gac atc gcc caa ggt gtc cac gag gag aag    336
Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys
            100                 105                 110
gat ttg gaa gac atc ggt gcc agt gac caa ggt atc atg ttt ggt tac    384
Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Ser Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr
        115                 120                 125
gcc aca gat gaa act cca gag ggt ttg cct tta act att ctt ttg gct    432
Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala
    130                 135                 140
cat aaa cta aac atg gcc atg gct gac gcg aga aga gat ggc tct tta    480
His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu
145                 150                 155                 160
gcg tgg ttg aga cca gac acc aag act caa gtc acc gtc gaa tac aag    528
基因改组
Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys
                165                 170                 175
gat gac cac ggt aga tgg gtt ccg caa aga atc gac acc gtc gtc gtc    576
Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val
            180                 185                 190
tcc gct caa cat gct gac gaa atc acg acc gag gac tta aga gcg caa    624
Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln
        195                 200                 205
cta aag tcc gag ttc att gaa aaa gtc atc cca aga gac atg ttg gac    672
Leu Lys Ser Glu Phe Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp
    210                 215                 220
gaa aac acc aaa tac ttt atc caa cct tcc ggt aga ttc gtc atc ggt    720
Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly
225                 230                 235                 240
ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag atc atc gtc gac    768
Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp
                245                 250                 255
gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc ggt aag    816
Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys
            260                 265                 270
gac tac tct aag gtt gat cgt tct gcc gct tat gcc gct aga tgg gtt    864
Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val
        275                 280                 285
gcc aag tcc cta gtt gcc gct ggt tta tgt aag aga gtt caa gtt caa    912
Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln
    290                 295                 300
ttt tct tat gcc atc ggt att gcg gaa cca ttg tcc ttg cac gtt gac    960
Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp
305                 310                 315                 320
acc tat ggt act gcg acc aag tct gac gaa gaa att atc gac att atc   1008
Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile
                325                 330                 335
agc aag aac ttt gac ttg aga cct ggt gta ttg gtc aag gag ttg gac   1056
Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp
            340                 345                 350
tta tct aga cca atc tac ttg cca acc gct tct tat ggc cat ttc aca   1104
Leu Ser Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr
        355                 360                 365
aac caa gaa tac cca tgg gaa aag cct aag act ttg aag ttc taa       1149
Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe
    370                 375                 380
<210>4
<211>382
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>4
Met Ala Gly Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu Gly His
1               5                   10                  15
Pro Asp Lys Leu Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp Ala Cys
            20                  25                  30
Leu Ala Glu Asp Pro His Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala Ala Lys
        35                  40                  45
基因改组
Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala Gln Leu
    50                  55                  60
Asp Tyr Gln Lys Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu Val Ala
                85                  90                  95
Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Val His Glu Glu Lys
            100                 105                 110
Asp Leu Glu Asp Ile Gly Ala Ser Asp Gln Gly Ile Met Phe Gly Tyr
        115                 120                 125
Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ala
    130                 135                 140
His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly Ser Leu
145                 150                 155                 160
Ala Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu Tyr Lys
                165                 170                 175
Asp Asp His Gly Arg Trp Val Pro Gln Arg Ile Asp Thr Val Val Val
            180                 185                 190
Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Thr Thr Glu Asp Leu Arg Ala Gln
        195                 200                 205
Leu Lys Ser Glu Phe Ile Glu Lys Val Ile Pro Arg Asp Met Leu Asp
    210                 215                 220
Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val Ile Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp
                245                 250                 255
Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys
            260                 265                 270
Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Val
        275                 280                 285
Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln Val Gln
    290                 295                 300
Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His Val Asp
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Glu Glu Ile Ile Asp Ile Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu Leu Asp
            340                 345                 350
基因改组
Leu Ser Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His Phe Thr
        355                 360                 365
Asn Gln Glu Tyr Pro Trp Glu Lys Pro Lys Thr Leu Lys Phe
    370                 375                 380

Claims (3)

1.一种综合的基因改组方法，其特征在于：
1)易错PCR：选取待突变和改组的线性双链基因，采用易错PCR方法扩增15个循环，所得到的产物用80％酒精沉淀，清洗去除反应体系中的可溶性组分；
2)StEP反应：在上述沉淀物中加入DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和超纯水，组成StEP反应体系，并扩增得到改组基因，通过琼脂糖凝胶电泳，并对目的大小的DNA片段进行特异性扩增，然后进行表达与筛选，获得具有目的特征的改组基因。
2.一种权利要求1所述基因改组方法所获得的重组基因，其特征在于：由序列表中SEQ ID No：3所述的核苷酸序列组成。
3.一种权利要求2所述重组基因编码的蛋白，其特征在于：由序列表中SEQ ID No：4所述的氨基酸序列组成。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6132970A (en) * 1994-02-17 2000-10-17 Maxygen, Inc. Methods of shuffling polynucleotides
EP1258494A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-20 Cellzome Ag Multiprotein complexes from eukaryotes
WO2003072602A2 (en) * 2001-12-20 2003-09-04 Cellzome Ag Protein complexes and methods for their use
CN1584024A (zh) * 2004-05-24 2005-02-23 清华大学 一种腈水合酶及其编码基因与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6132970A (en) * 1994-02-17 2000-10-17 Maxygen, Inc. Methods of shuffling polynucleotides
EP1258494A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-20 Cellzome Ag Multiprotein complexes from eukaryotes
WO2003072602A2 (en) * 2001-12-20 2003-09-04 Cellzome Ag Protein complexes and methods for their use
CN1584024A (zh) * 2004-05-24 2005-02-23 清华大学 一种腈水合酶及其编码基因与应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Huimin Zhao and Frances H.Arnold..Directed evolution converts subtililsin E into afunctional equivalent of thermitase..Protein Engineering.12 1.1999,12(1),47-53.
Huimin Zhao and Frances H.Arnold..Directed evolution converts subtililsin E into afunctional equivalent of thermitase..Protein Engineering.12 1.1999,12(1),47-53. *

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