CN100460515C

CN100460515C - 一种改进的重叠延伸pcr方法及其所获得的突变基因

Info

Publication number: CN100460515C
Application number: CNB2005100464149A
Authority: CN
Inventors: 吴文芳; 安迎锋; 吕安国
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2005-05-13
Publication date: 2009-02-11
Anticipated expiration: 2025-05-13
Also published as: CN1861799A

Abstract

本发明涉及基因定点突变的方法，具体的说是一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因，本方法分为如下步骤：片段合成；双混合；预延伸；全长DNA合成；后延伸。以来自于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1为起始基因验证了该方法的有效性，并获得了经稀有密码子改造的突变基因，该基因编码的SAM合成酶能在酿酒酵母中高效表达，并且能提高胞内SAM的积累量。本发明在原有重叠延伸PCR的基础上，进行了一系列重要的改进，使得在一个反应过程中实现多点定位突变。

Description

一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因

技术领域

本发明涉及基因定点突变的方法，具体的说是一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因，是一种能在一个反应过程中实现多点定位突变的基因改造方法。

背景技术

定点突变(site-directed mutagenesis，SDM)就是指在基因的特定位点引入突变，即在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列。该方法已经被广泛的应用于基因表达调控、基因结构与功能及蛋白质性质等方面的研究。

产生SDM的方法最常见是采用Overlap extension PCR(OE-PCR)介导定点突变，又称重叠延伸PCR。该技术是将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸的方法进行体外基因拼接的简单、快速的基因重组技术(Russell，Higuchi.protocols：A guide to methods and applications[A].Recombinant PCR[M].Academic Press，1990.177-183.)。该方法要求两条侧翼的通用引物和两个反向部分重叠的突变引物。首先引物两两配对分别进行PCR反应，产生两个部分重叠的PCR片段，两者的重叠区都通过引物的错配引入相同的突变。序列的重叠允许两个片段在混合、变性、复性后在DNA聚合酶作用下延伸产生全长的DNA片段；该片段可作为第二次延伸的模板，以两个侧翼引物进行全长DNA扩增。1987年，该技术问世一年后，Mullis KB等人便首先运用引物的错配引导(mis-priming)，通过对基因进行体外定点突变，成功地将突变序列引入产物末端(Mullis KB，Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.Methods Enzymol.1987；155：335-50.)；1988年，Higuchi R等在此基础上，运用重叠延伸方法将突变序列引入产物中的中间部位(Higuchi R，Krummel B，Saiki RK.A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis ofDNA fragments：study of protein and DNA interactions.Nucleic Acids Res.1988Aug 11；16(15)：7351-67.)；此后Ho和Horton尝试用重叠延伸方法进行基因重组和嵌合基因的构建并获成功(Ho SN，Hunt HD，Horton RM，Pullen JK，Pease LR.Site-directed mutagenesis by overlap extension using thepolymerase chain reaction.Gene.1989 Apr15；77(1)：51-9.；Horton RM，HuntHD，Ho SN，Pullen JK，Pease LR.Engineering hybrid genes without the use ofrestriction enzymes：gene splicing by overlap extension.Gene.1989 Apr15；77(1)：61-8.)。利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化性质、底物特异性和热稳定性等进行改造已经有很多成功的例子(Ma YF，Evans DE，Logue SJ，Langridge P.Mutations of barley beta-amylase that improve substrate-bindingaffinity and thermostability.Mol Genet Genomics.2001 Nov；266(3)：345-52.；Huang CY，Chang AK，Nixon PF，Duggleby RG.Site-directed mutagenesis ofthe ionizable groups in the active site of Zymomonas mobilis pyruvatedecarboxylase：effect on activity and pH dependence.Eur J Biochem.2001Jun；268(12)：3558-65.；Wang SX，Dunphy WG.Activation of Xenopus Chklby mutagenesis of threonine-377.FEBS Lett.2000 Dec 29；487(2)：277-81.)。

尽管OE-PCR作为一种常见的方法已经被广泛应用，但是一般情况下，每次只能引入一处突变，而当多个位点需要突变时，将需要烦琐的试验步骤和很大工作量，同时也增加了引入一些不必要点突变的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速高效的实现基因多点突变的—改进的重叠延伸PCR方法(modified overlap extension by PCR，MOE-PCR)；本发明是一种快速、简单、无错的多点突变方法，应用本发明既可以实现在一轮反应过程中对多个位点进行定点突变，又没有引入其它突变位点，从而为DNA进行多点突变提供了新的选择；应用本发明，仅经过一轮反应就成功的实现了同时对sam1 8个稀有密码子进行定点突变。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种改进的重叠延伸PCR方法，反应过程分为以下几个步骤：

(1)片段合成：以所需突变的全长基因为模板，根据突变位点的个数设计一系列平行引物，引物中包含待突变的碱基，每相邻一对引物的末端设计一个重叠区段，长度为20-30bp；采用上述每相邻的一对引物分别进行平行的PCR，实现各个DNA小片段的扩增；

(2)双混合：分别纯化上述片段，分成不同组分，将等量相邻的每个组分的DNA片段分别两两混合，片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成长片段，反应为无引物PCR过程；

(3)预延伸：将上述多组反应后产物混合在一起，新形成的长片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成全长新模板，该步骤也是无引物PCR过程；

(4)全长DNA合成：在上述反应体系中加入全长基因的一对外侧引物，以上一步产生的重组全长DNA为模板，进行PCR，扩增全长基因；

(5)后延伸：将上述反应体系再经过10个循环的94℃变性30s，72℃退火和延伸1min；

(6)将突变基因连入载体并转入宿主菌株，进行序列分析。

以酿酒酵母总DNA为模板，扩增带有EcoRI和NotI的sam1基因，该基因具有序列表SEQ ID No：1中的核苷酸序列。将该基因作为起始基因，进行如下步骤的反应(如图1)：

(1)片段合成：以酿酒酵母SAM合成酶基因sam1(如图2)作为模板，设计6对平行引物，引物中包含待突变的碱基，每相邻一对引物的末端设计一个重叠区段，长度为20-30bp；采用上述每相邻的一对引物分别进行平行的PCR，实现6个DNA小片段的扩增；

(2)双混合：纯化后的上述片段被分成5个组分，在每个组分中，等量的相邻的DNA片段两两混合(每一个片段约10ng)。片段1和2混合后命名为组分1，以下依次命名为组分2-5，片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成长片段，反应为无引物PCR过程；

(3)预延伸：随后，将5个组分混合在一起，新形成的长片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成全长新模板，该步骤也是无引物PCR过程；

(4)全长DNA合成：在反应体系中加入全长基因的一对外侧引物，以上一步产生的重组全长DNA为模板，进行PCR扩增全长基因；

(5)后延伸：经过10个循环的94℃变性30s，72℃退火和延伸1min；

(6)将突变基因连入表达载体并转入酿酒酵母，进行序列分析；并且进行诱导表达，检测蛋白质表达量和SAM的胞内积累量。所获得的突变基因具有序列表SEQ ID No：3中的核苷酸序列；该核酸序列来源于初始基因，与初始基因相比具有8个点突变：G126T，G138T，G462T，G483T，G603T，G621T，G936T和G975T。

本发明具有以下优点：

1.本发明通过独特的反应过程提供了一个新的基因定点突变方法，该方法通过简单的实验步骤，实现在一轮循环中对多个位点同时突变；并且整个反应过程具有良好的保真性，不引入其它点突变。

2.在本发明中，申请人运用该方法对来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因sam1为起始基因进行了8个稀有密码子的改造，验证了该方法的有效性，并获得了一种突变基因，核酸序列与原有基因序列相比具有8点突变：G126T，G138T，G462T，G483T，G603T，G621T，G936T和G975T，将原有的稀有密码子变换成常见密码子；该基因编码的SAM合成酶可以在酿酒酵母中高效表达，并且能提高胞内SAM的积累量；引用本发明，可进一步提供直接用于生产高表达SAM合成酶的工程菌株。

总之，本发明首次将DNA shuffling技术的原理与定点突变相结合，提出并实践了一种新的定点突变方法。

附图说明

图1用MOE-PCR对sam1进行多点突变的示意图，反应步骤包括：(1)片段合成：用高保真的Pfu DNA聚合酶合成6条DNA片段，每相邻两条片段之间具有一个重叠区，长度为20-30bp，引物中包含有待突变的碱基，6条片段通过重叠连接在一起可以组成全长的DNA，白色空格位置代表待突变的位点；(2)双混合：将相邻的DNA片段两两混合，组成5个平行的组分，分别进行无引物的重叠延伸PCR(OE-PCR)；(3)预延伸：将上述5个平行的组分混合在一个反应体系中，再通过无引物的重叠延伸PCR获得全长的重聚DNA模板；(4)全长DNA合成：在反应体系中加入一对相对于全长DNA末端的引物，以上一步反应产生的DNA为模板扩增出全长的经过突变的目的基因；(5)后延伸：经过10个循环的94℃变性，72℃退火和延伸。

图2为SAM合成酶基因sam1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，其中，LaneM：DNA Marker DL2000；Lane1：PCR目的条带；

图3用MOE-PCR方法对sam1的8个稀有密码子进行定点突变的琼脂糖凝胶电泳图(胶浓度1％)，其中，Lane M：DNA sizemarker DL2000；Lane1-6：用PCR方法合成的片段1-6；Lane7：MOE-PCR的最终结果。

图4重组质粒pYES-sam1”酶切和PCR验证图谱，其中，LaneM1：Marker DL2000；Lane1：PCR验证结果；Lane2：空白质粒pYES2经BamHI和EcoRI双酶切；Lane3：重组质粒pYES-sam1”经BamHI和EcoRI双酶切；LaneM2：Marker λDNA\HindIII。

图5表达产物的SDS-PAGE电泳分析，其中，M为中分子量蛋白质Marker；Lane1-3分别代表包含有不同质粒的酿酒酵母的诱导表达蛋白：Lane1包含有pYES2；Lane2包含有pYES-sam1；Lane3包含有pYES-sam1”。

图6HPLC检测腺苷蛋氨酸的胞内积累量，其中，a，b，c分别代表包含有不同质粒的酿酒酵母经诱导表达和抽提后的产物：a包含有pYES2，b包含有pYES2+sam1，c包含有pYES2+sam1”；d为腺苷蛋氨酸标准样。

具体实施方式

实施例1

一种来源于酿酒酵母INVScI菌株的编码SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1，具有序列表SEQ ID No：1中的碱基序列。

SEQ ID No：1：

ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGA

TAAGATCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGG

ACCCTCACTCCAAAGTTGCGTGTGAAACCGCGGCAAAGACTGGTATGATTATG

GTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAG

AGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGTTTCGACTATA

AGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGATATCGCCCAA

GGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCGGTGACCAAGGTAT

CATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTGACTATTC

TTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCGAGAAGAGATGGCTCT

TTAGCGTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGA

TGACCACGGTAGATGGGTTCCACAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTC

AACATGCTGACGAAATCACGACCGAGGACTTAAGAGCGCAACTAAAGTCCGAG

ATCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTT

TATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTT

TGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGT

GGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTA

TGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAG

TTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCGGAACCATTGTCCTTGCAC

GTTGACACCTATGGTACTGCGACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTAT

CAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTAG

CTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAA

TACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA

(1)SEQ ID No：1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1149碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：酿酒酵母INVScI菌株的编码SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1

(2)来源于酿酒酵母INVScI菌株的编码SAM合成酶(2.5.1.6)的基因sam1的制备：

上游引物1：5-ATTGGATCCCAACGATGGCACTAGACATA-3；

下游引物2：5-GCAGAATTCGAGGTTGAAGGCAGAAAA-3；

下划线序列分别为BamHI和EcoRI酶切位点。

扩增条件：以酿酒酵母INVScI菌株总DNA为模板，用pfu DNA聚合酶进行扩增。反应体系为：2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmolL^-1dNTP、1mmol L^-1各引物、100ng的DNA模板，总反应体积100μl；反应条件：94℃变性2min；30个循环的94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 3min；72℃延伸10min。PCR产物回收：按上海华舜试剂盒使用说明书。目的产物见琼脂糖凝胶电泳(如图2)。将目的基因经BamHI和EcoRI酶切后克隆入pYES2载体的相应酶切位点，构建pYES2-sam1重组质粒。

实施例2

采用新的综合的基因改组方法对sam1进行改组，获得编码酶活性提高的重组酶的基因sam1，具有序列表SEQ ID No：3的碱基序列。

ATGGCCGGTACATTTTTATTCACTTCTGAATCCGTTGGTGAAGGTCACCCAGA

TAAGCTCTGTGACCAAGTTTCCGACGCCATCTTGGACGCTTGTTTAGCCGAGG

ACCCTCACTCCAAAGTTGCTTGTGAAACCGCTGCAAAGACTGGTATGATTATG

GTCTTTGGTGAAATTACTACCAAGGCACAGTTGGATTACCAAAAAATCGTCAG

AGACACCATCAAGAAGATTGGTTACGATGATTCCGCCAAGGGATTCGACTATA

AGACCTGTAACGTCCTTGTCGCCATTGAGCAACAATCTCCAGACATCGCCCAA

GGTGTCCACGAGGAGAAGGATTTGGAAGACATCGGTGCCAGTGACCAAGGTAT

CATGTTTGGTTACGCCACAGATGAAACTCCAGAGGGTTTGCCTTTAACTATTC

TTTTGGCTCATAAACTAAACATGGCCATGGCTGACGCTAGAAGAGATGGCTCT

TTAGCTTGGTTGAGACCAGACACCAAGACTCAAGTCACCGTCGAATACAAGGA

TGACCACGGTAGATGGGTTCCGCAAAGAATCGACACCGTCGTCGTCTCCGCTC

AACATGCTGACGAAATCACTACCGAGGACTTAAGAGCTCAACTAAAGTCCGAG

TTCATTGAAAAAGTCATCCCAAGAGACATGTTGGACGAAAACACCAAATACTT

TATCCAACCTTCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTT

TGACCGGTAGAAAGATCATCGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGT

GGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTACTCTAAGGTTGATCGTTCTGCCGCTTA

TGCCGCTAGATGGGTTGCCAAGTCCCTAGTTGCCGCTGGTTTATGTAAGAGAG

TTCAAGTTCAATTTTCTTATGCCATCGGTATTGCTGAACCATTGTCCTTGCAC

GTTGACACCTATGGTACTGCTACCAAGTCTGACGAAGAAATTATCGACATTAT

CAGCAAGAACTTTGACTTGAGACCTGGTGTATTGGTCAAGGAGTTGGACTTAT

CTAGACCAATCTACTTGCCAACCGCTTCTTATGGCCATTTCACAAACCAAGAA

TACCCATGGGAAAAGCCTAAGACTTTGAAGTTCTAA

(1)SEQ ID No：3的信息(参见序列表)

(A)序列特征

*长度：1149碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(2)采用MOE-PCR对sam1进行多点突变。

(1)片段合成：采用6个平行的PCR反应实现对6条相邻DNA片段的扩增(如图3)，每相邻两个PCR之间具有一个重叠区，长度一般20-30bp。DNA反应体系如下：dNTP 0.2mM，10×pfu buffer(with MgCl₂)10μl，pfuDNA聚合酶5U，模板(总DNA)100ng，引物(见表1)各1mM，加ddH₂O至反应总体积为100μl。对于片段1进行扩增，其反应程序为：94℃变性2min；30个循环的94℃30s，59.6℃30s，72℃55s；72℃延伸10min。

表1：用MOE-PCR进行sam1稀有密码子改造所用的各突变引物

已经突变的碱基用阴影标示；方框内所示为BamHI和EcoRI限制性识别序列

其它各片段的反应条件与片段1相似，除了退火温度和延伸时间不同。片段2-6的退火温度分别为62.5℃，58.8℃，59.5℃，55.1℃和53.3℃；而片段2-6的延伸时间分别为1min 25s，55s，1min 20s，50s和55s。扩增后的产物分别进行1％的琼脂糖凝胶电泳，然后以胶回收试剂盒进行回收纯化。

(2)双混合：纯化后的上述片段被分成5个组分，在每个组分中，等量的相邻的DNA片段两两混合(每一个片段约10ng)。片段1和2混合后命名为组分1，以下依次命名为组分2-5，片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成长片段，反应为无引物PCR过程。每组中反应体系如下：dNTP 0.2mM，10×pfu buffer(with MgCl₂)2μl，pfuDNA聚合酶1U，相邻两条片段各10ng，加ddH₂O至反应总体积为20μl。对于组分1(即片段1&2混合)进行无引物PCR，其反应程序如下：94℃变性2min；30个循环的94℃ 20s，59.6℃ 30s，72℃ 1min 25s；72℃延伸10min。其它组分的反应条件与组分1相似，除了退火温度和延伸时间不同。组分2-5的退火温度分别为58.8℃、58.8℃、55.1℃和53.3℃；组分2-5的延伸时间分别为1min 25s、1min 20s、1min 20s、55s；

(3)预延伸：随后，将5个组分混合在一起，新形成的长片段之间(新形成的长片段之间互为模板)经过20个循环的94℃ 20s变性和72℃ 30s退火、延伸，形成部分全长新模板，该步骤也是无引物PCR过程；

(4)全长DNA合成：在反应体系中加入40pmol的两种外测引物F₀和R₀，以上一步产生的重组全长DNA为模板，进行PCR扩增全长基因。PCR反应程序如下：94℃变性20s；30个循环的94℃ 20s，53.3℃ 30s，72℃ 2min；72℃延伸10min；

(5)后延伸：经过10个循环的94℃变性30s，72℃退火和延伸1min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的大小的条带，用胶回收试剂盒进行纯化；

(6)将突变基因经BamHI和EcoRI酶切后克隆入同样经双酶切的pYES2载体上，构建pYES2+sam1”重组质粒(如图4)，并转化酿酒酵母INVScI菌株。挑取基因工程菌单菌落接种到15ml修改的SC-U培养基(6.7g酵母氮源；5g蛋氨酸；0.1g的腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，络氨酸，苏氨酸；0.05g的天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，色氨酸和缬氨酸；终体积1L)，包括2％棉籽糖。30℃培养至OD₆₀₀＝0.4，然后4℃下1500×g离心5min，然后将细胞重悬于2ml诱导培养基(修改的SC-U培养基，包含2％的半乳糖)，再接种到50ml的诱导培养基内，30℃条件下150rmin^-1摇床内培养6h。然后4℃下1500×g离心5min，倒掉上清，将沉淀重悬于500μl的纯净水。4℃下1500×g离心5min，倒掉上清，细胞用于检测SAM积累。每1g菌体中加入5ml 1.5molL^-1的高氯酸以120r min^-1摇动1h进行抽提，生成的SAM水平用BioCAD700E型HPLC(Perseptive Biosystem，Inc.U.S.A.)进行检测。本试验选用弱阳离子交换柱Poros20CM(4.6mm×100mm)，流动相为0.5mol L^-1的HCOONH₄，pH调整为4.0，流速为5ml min^-1，在260nm波长下检测产物，室温22℃。作为对照，含有pYES2质粒和pYES2+sam1质粒的酿酒酵母也被用于检测SAM的胞内积累量。10μmol/L的标准品SAM被用于标定SAM的保留时间。

取1ml发酵液离心，菌体沉淀用1ml蒸馏水洗涤，离心后重悬于1倍的上样缓冲液中，沸水浴煮10min，12000×g离心2min。取10μl进行SDS-PAGE电泳，0.1％考马斯亮蓝染色，然后检测蛋白的表达。

结果：

1.测序结果表明，突变基因序列，即8个点突变与预测结果相符，没有其它突变位点引入；

2.运用本发明所述的基因定点突变方法，经过一轮反应即获得目的大小的突变DNA(如图3)；

3.在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带，诱导蛋白如图5所示。分子量约为4.2K dalton；

4.通过HPLC检测，得到一株腺苷蛋氨酸胞内积累量提高的酿酒酵母菌株，胞内SAM积累量较对照提高了25.6％(如图6)。

重叠延伸

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院沈阳应用生态研究所

<120>一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1149

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1149)

<223>

<400>1

<210>2

<211>382

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>2

<210>3

<211>1149

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1149)

<223>

<400>3

<210>4

<211>382

<212>PRT

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>4

Claims

1.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于：

反应过程分为以下几个步骤：

(2)双混合：分别纯化上述片段，分成不同组分，将等量相邻的DNA片段分别两两混合，片段之间互为模板，以重叠延伸PCR方式扩增成长片段，反应为无引物PCR过程；

(4)全长DNA合成：在上述反应体系中加入全长基因的一对外侧引物，以上一步产生的重组全长DNA为模板，PCR扩增出全长基因；

(5)后延伸：将上述反应体系再经过10个循环的94℃变性30s，72℃退火和延伸1min。

2.按权利要求1所述方法所获得的突变基因，其特征在于：具有序列表SEQ ID No：3中的核苷酸序列。