CN105907746A - 一种基于ihf蛋白进行基因突变方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种基于IHF蛋白进行基因突变方法，通过设计突变引物在引物重叠区域引入突变，同时应用IHF蛋白代替同源重组酶进行重组克隆。利用分段PCR扩增和全长基因PCR扩增方法获得全长的突变基因，应用IHF介导的同源重组反应在室温下可以进行，并且同源重组效果与市场上存在的试剂盒活性差距不大，重组效率可达到95％以上。突变基因重组克隆测序证明突变成功，说明本发明的基因突变方法的可行性，并且本发明的方法具有操作简单、经济、和保存运输要求条件低等优点，具有种非常大的市场应用潜力。

Description

一种基于IHF蛋白进行基因突变方法

技术领域

本申请属于基因工程领域，具体地说，涉及一种基于IHF蛋白进行基因突变方法。

背景技术

基因突变是指个别dNMP(脱氧单磷酸核苷)残基以至片段DNA在结构、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤。体外定点突变技术是当代生物、医学等领域中基因研究一种重要方法，可应用于改造和优化目的基因，基因功能研究，探索启动子的调节位点的有功能关系，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。

基因突变也是生物变异的根本来源，为生物的进化提供了原材料。基因重组和基因突变可以产生多种多样的基因组合的子代，其中一些子代会含有适应某种环境变化的基因组合，所以说基因突变是生物变异的来源之一，是形成生物多样性的重要原因。因此，我们对基因突变的研究具有重大意义。

近年来随着PCR法同源重组克隆法被愈来愈受重视，由于该方法不受载体和目的片段的酶切位点限制，通过重组酶直接介导目的片段与载体相连接实现基因基因克隆。同时同源重组克隆操作简单，PCR产物可一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短和传统方法相比，具有快速，效率高的特点。利用同源重组法介导的基因突变是目前基因突变的一种重要手段。同源重组不仅可以发生在高等的生物体在原核的工程菌种也可以发生同源重组，仅需要目的基因与载体具有同源区域就可以发生同源重组实现基因克隆载体构建。基于这一原理，人为的导入同源突变基因可以成功的实现基因突变，对下游基因研究具有重要意义。

目前的基因重组反应一般需要重组酶和多种辅助因子参与下发生。通常 这些重组酶组分制备工艺比较复杂，并且不耐高温，存在运送和保存方法要求也比较高等问题。

发明内容

有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是提供了一种基于IHF蛋白进行基因突变方法，首先利用已经设计好的两对引物扩增目的基因引入突变和同源重组区域。在引物设计的过程中在重叠区域插入缺失的基因或者替换需要突变的基因；在目的基因DNA的两端引入与克隆载体同源的15-50bp序列。接着用具有重组活性的IHF蛋白把引入突变的DNA片段重组到克隆载体，最后提取重组质粒并测序实现基因突变的目的。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种基于IHF蛋白进行基因突变方法，包括以下步骤：

1)对目的基因进行处理：针对目的基因的某些位点进行突变，并将突变后的目的基因进行处理，得到两段具有重叠区域的DNA片段，该重叠区域包括突变位点；重叠区域的DNA片段的长度为15-25bp；

2)设计引物：针对目的基因，设计一对基因全长扩增引物和至少一对突变引入引物；

3)突变基因扩增：首先用突变引入引物对两段具有重叠区域的DNA片段进行分段PCR扩增，得到两管PCR产物，然后用全长引物进行PCR扩增得到的全长DNA片段；

4)IHF基因重组转化：使用IHF蛋白介导具有突变位点的目的基因与克隆载体发生同源重组转化，其中，具有突变位点的目的基因为步骤3)得到的全长DNA片段；

5)转化：在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA载体，并通过测序验证突变结果。

进一步地，步骤3)中的全长引物进行PCR扩增中的PCR反应体系是：25μl的2×Phusion Master Mix，一对体积均为0.5μl的基因全长扩增引物，两管体积均为0.5μl的PCR产物，佘量为蒸馏水，该PCR反应体系的总量为 50μl。

进一步地，步骤3)中的全长引物进行PCR扩增中的PCR反应程序是：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃5min。

进一步地，步骤4)中，重组过程添加IHF蛋白，反应条件是室温直接放置10-15min，然后直接进行转化实验；转化用于DH5α、TOP10、DH10B感受态宿主菌。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

1)载体线性化：载体线性化可以减少转化过程中产生的假阳性克隆。本发明中采用PCR法线性化载体，并且使用割胶回收线性化载体进一步的减少PCR扩增模板带来的不必要干扰。

2)突变引物：突变扩增引物需要设计包基因全长扩增引物一对和至少一对突变扩增引物。

3)PCR扩增：首先利用分段PCR将突变引入DNA片段中，然后用全长扩增引物扩增出具有同源重组区域DNA全长。

4)IHF蛋白同源重组：使用具有DNA非特异结合活性的蛋白IHF代替重组酶克隆突变基因，转化、克隆、提取质粒并测序达到基因突变目的。

本发明将用DNA非特异性结合蛋白IHF在基因重组过程中代替重组酶。IHF是与双链DNA结合的类似组蛋白的耐热的小分子蛋白质。IHF由α亚基(himA编码，11.35kD)和β亚基(hip编码，10.65kD)构成，例如λ噬菌体的位置特异性重组就需要宿主编码的整合宿主因子IHF。同源重组克隆法是指利用重组酶将目的DNA和克隆载体连接实现的克隆技术，基于之前我们用IHF蛋白重代替重组酶进行重组克隆得到成功，专利设计使用IHF蛋白作为突变基因重组克隆，该IHF蛋白介导重组并实现基因突变方法在国内外也是首创。

当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本申请IHF-β活性检测电泳图，其中，M：DNA分子量marker；1：空白对照；2-8：分别是pET-22b质粒加入0.5、1、2、4、8、9μl的IHF蛋白电泳结果；

图2是本申请分段PCR电泳检测结果图；其中，M：100bp Marker；1：以primer 1和Primer 2为引物的扩增产物电泳结果；2：以Primer 3和Primer4为引物的扩增产物电泳结果；

图3是本申请整段PCR电泳检测结果图，其中，M，100bp Marker；1：以实施例3中1和2为模板，primer1和primer2位引物的PCR电泳结果图；

图4是本申请菌落生长情况，其中，4-1市售试剂盒转化菌落生长情况；4-2用本发明的方法用1μl IHF蛋白的菌落生长情况；4-3本发明的方法用2.5μl IHF蛋白的菌落生长情况。4-4：本发明的方法用4μl IHF蛋白的菌落生长情况；

图5是本申请cp1-3基因序列比对结果；

图6是本申请cp1-9基因序列比对结果；

图7是本申请cp1-10基因序列比对结果；

图8是本申请IHF蛋白SDS-PAGE凝胶电泳。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1 IHF蛋白的制备

1)IHF(NC_000913.3)来源于大肠杆菌，是DNA结合蛋白DNABII家 族的一个成员。它是可与双链DNA结合的类似组蛋白的耐热的小分子蛋白质，IHF由α亚基(himA编码，11.35kD)和β亚基(hip编码，10.65kD)构成。

将来源于大肠杆菌的IHFα或IHFβ亚基基因片段分别重组插入PET-22b表达载体中，重组载体通过转化后克隆，并用采用菌落PCR、酶切法和测序法进一步验证重组载体正确无误，重组表达载体命名为PET22-IHFα或者pET22-IHFβ；

2)将构建好的重组载体pET22-IHFα或者pET22-IHFβ转化到蛋白表达工程菌BL21感受态细胞中，氨苄平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种到加入氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，225rpm过夜培养，按体积比1∶100的量接种到50ml的LB培养基中扩大培养，37℃培养至其OD值为0.6-0.8；添加IPTG诱导蛋白表达，将菌液放入37℃，160rpm摇床中诱导表达3小时；

3)离心菌液收集菌体沉淀，通过反复冻融法使菌体裂解，蛋白从菌体中释放。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。结果如图8所示。

4)IHF的纯化

菌液(3000×g)离心15min，收集大肠杆菌菌体，-70℃冷冻放置过夜。

裂解缓冲液(组分为：0.1M，0.02M EDTA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶)(pH7.5)，重新悬浮菌体，室温放置30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离心(120000×g)90min收集上清。上清液过阴离子交换柱Prep Q。以25mM Tris/HCl，1mM EDTA(pH7.5)洗脱，再以NaCl溶液进行梯度洗脱。之后，再过肝素亲和柱进一步纯化，以NaCl溶液梯度洗脱，可得到纯度为95％左右的IHF蛋白原液。经测定IHF蛋白原液的浓度为102ng/μl。

5)IHF的活性检测

按照表1配置10μl的反应体系

表1 IHF活性检测反应体系表

如表1所示，在反应液中，加入不同体积的IHF蛋白，室温下静置10min。取5μl反应液跑琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。在加入IHF蛋白后，IHF与双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移，这表明纯化出的蛋白IHF具有与DNA结合的活性，并且与环状的双链DNA相互作用。

实施例2引物设计

1)我们使用大肠杆菌基因组的一段基因序列，并送金斯瑞公司进行基因片段合成，其基因片段序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGAATAAATCTCAATTGATCGACAAGATTGCTGCAGGGGCTGATATCTCTAAAGCTGCGGCTGGCCGTGCGTTAGATCTATTATTGCTCCGTAACTGAATCTCTGAAAGAAGGGGATGATGTAGCACTGGTAGGTTTTGGTACTTTTGCCGTTAAAGAGCGTGCTGCCCGTACTGGCCGCAACCCGCAGACCGGTAAAGAGATCACCATCGCTGCTGCTAAAGTACCGAGCTTCCGTGCAGGTAAAGCACTGAAAGACGCGGTAAACTAA；

突变位点：第79位G-C，第90位T-A，我们将对原序列的第79位和第90位进行突变。并将该基因分成两段具有重叠区域的DNA片段，该重叠区域包括突变位点；重叠区域的DNA片段的长度为15-25bp；

2)引物设计：使用的软件：GenSearch设计一对基因全长扩增引物和至少一对突变引入引物，本发明设计一对突变引入引物和一对基因全长同源重组引物，GenSearch输出的结果如下：

Primer 1：5′-CGTTAGATCCTATTATTGCATCCGTAACTGAATC-3′，如SEQ ID NO.2所示；

Primer2：5′-GTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGAATTCTTAGTTTACCGCGTCTT-3′，如SEQ IDNO.3所示；

Primer3：5′-TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATATGAATAAATCTCAATTGATCG-3′，如SEQID NO.4所示；

Primer 4：5′-CAGTTACGGATGCAATAATAGGATCTAACGCACG-3′， 如SEQ ID NO.5所示；其中，Primer1和Primer2是目的基因中的其中的一段基因的突变引入引物；Primer3和Primer4是目的基因中的其中的另一段基因的突变引入引物；

实施例3分段PCR

1)分段PCR扩增目的基因，在重叠区域引入突变，两管PCR如表格2所示，每管体系均为50μl：

第一管：各种试剂添加如表2所示

表2 第一段PCR反应体系

试剂	使用量(μl)	终浓度
			2×Phusion Master Mix	25	1×
Primer 1	0.5	25pmol
			Primer 2	0.5	25pmol
原基因片段	1
			灭菌蒸馏水	23
总体积	50

第二管：各试剂的添加如表格3所示：

表3 第二段PCR反应体系

试剂	使用量(μl)	终浓度
			2×Phusion Master Mix	25	1×
Primer 3	0.5	25pmol
			Primer 4	0.5	25pmol
原基因片段	1
			灭菌蒸馏水	23
总体积	50

2)均按以下条件进行PCR反应：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃5min。

3)PCR扩增产物检测：每管取3μl PCR产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和95V电压下电泳30min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，结果见图2，分段PCR的产物是目的产物，大小符合分段的两段基因片段的大小。

实施例4整段PCR

1)整段PCR扩增出整条基因片段，同时在基因的两端引入与克隆载体15-50bp的同源区域。整段PCR反应体系如表4所示，反应体系为50μl：

表4 整段PCR反应体系

试剂	使用量(μl)	终浓度
			2×Phusion Master Mix	25	1×
Primer 2	0.5	25pmol
			Primer 3	0.5	25pmol
实施例3中的第一管PCR产物	0.5
			实施例3中的第二管PCR产物	0.5
灭菌蒸馏水	23
			总体积	50

2)均按以下条件进行PCR反应：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃5min。

3)PCR扩增产物检测：取3μl PCR产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和95V电压下电泳30min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体电泳结果见图3，整段PCR的产物是目的产物，大小符合目的基因片段的大小。

实施例5.克隆转化与测序

将实施例4制备得到的具有突变位点的目的基因(该基因的核苷酸序列 与SEQ IDNO.1相比，在第79位和第90位不同，本核苷酸序列的79位为C，第90位为A)使用同源重组的方法重组到克隆载体中，本发明中使用实施例1中制备的IHF蛋白介导同源重组反应。详细步骤如下：

1)IHF同源重组反应：配制IHF介导同源重组反应体系，按照下表4配置反应体系：

表4 IHF同源重组反应体系

每个反应的体积用水调节到10ul，混匀离心后，除了第一个加Enzyme(0.5ul)的反应需要在22℃，30min充分反应，65℃，10分钟将酶灭活以外，其余的三个只加IHF蛋白的反应条件是静置在常温下10分钟即可进行转化实验。

2)转化实验：用热激发进行转化，具体步骤如下：将反应液分别加入100ul Top 10感受态细胞进行转化(1.5ml离心管)，冰上静置30min，使用金属浴，42℃下热激70s，再冰上静置5min。再在超净工作台中向离心管中加入300ul SOC培养基，在37℃条件下，以转速225rpm摇菌1h。之后取200ul菌液进行涂平板(含100mg/ml Amp的LB固体培养基)，37℃培养箱中倒置过夜培养，最后获得克隆。实验结果如图4，由图4可以看出加入不同量的IHF蛋白进行同源重组再转化之后获得的克隆数与使用市售同源重组试 剂盒菌落生长情况差别不大，说明IHF蛋白可以达到与重组酶几乎相同的重组效果。

3)阳性克隆筛选：挑取3个图4所示的平板中的单个菌落于离心管中，分别命名为cp1-3，cp1-9和cp1-10，并加入5ml LB培养基和体积分数千分之一的100mg/ml的氨苄，在37℃条件下，以转速180rpm培养过夜，各取1ml菌液送金斯瑞公司进行测序，结果如图5-图7。结果表明突变位点均突变成功。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种基于IHF蛋白进行基因突变方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对目的基因进行处理：针对目的基因的某些位点进行突变，并将突变后的目的基因进行处理，得到两段具有重叠区域的DNA片段，该重叠区域包括突变位点；重叠区域的DNA片段的长度为15-25bp；

2)设计引物：针对目的基因，设计一对基因全长扩增引物和至少一对突变引入引物；

3)突变基因扩增：首先用突变引入引物对两段具有重叠区域的DNA片段进行分段PCR扩增，得到两管PCR产物，然后用全长引物进行PCR扩增得到的全长DNA片段；

4)IHF基因重组转化：使用IHF蛋白介导具有突变位点的目的基因与克隆载体发生同源重组转化，其中，具有突变位点的目的基因为步骤3)得到的全长DNA片段；

5)转化：在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA载体，并通过测序验证突变结果。

2.根据权利要求1所述的基于IHF蛋白进行基因突变方法，其特征在于，所述步骤3)中的全长引物进行PCR扩增中的PCR反应体系是：25μl的2×Phusion Master Mix，一对体积均为0.5μl的基因全长扩增引物，两管体积均为0.5μl的PCR产物，余量为蒸馏水，该PCR反应体系的总量为50μl。

3.根据权利要求1所述的基于IHF蛋白进行基因突变方法，其特征在于，所述步骤3)中的全长引物进行PCR扩增中的PCR反应程序是：95℃1min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃5min。

4.根据权利要求1所述的基于IHF蛋白进行基因突变方法，其特征在于，所述步骤4)中，重组过程添加IHF蛋白，反应条件是室温直接放置10-15min，然后直接进行转化实验；转化用于DH5α、TOP10、DH10B感受态宿主菌。