CN105039375B - 一种利用蛋白ihf构建克隆载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，通过对待连接的DNA片段设计引物，并引入DNA同源同组序列，在分别进行扩增，扩增产物和IHF混合，利用传统的转化方法在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA质粒。本发明方法不依赖于任何重组酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，用同源重组的方法和IHF蛋白一起完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体同源重组连接，常温反应时间短至10分钟，阳性率高达95％以上。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，尤其涉及一种利用含有和DNA双链结合的蛋白IHF取代重组酶，在大肠杆菌中连接DNA片段和克隆载体构建的新方法。
背景技术
DNA克隆是分子生物学的重要内容。传统DNA克隆方法利用T4DNA连接酶(T4DNALigase)的方法将待克隆的目的基因与载体连接，将该重组子转化到受体菌中，筛选鉴定正确的克隆。但是该方法涉及的步骤多，并且繁琐费时，而且特定基因的克隆常因两端缺乏合适限制酶切点而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。同源重组是指发生在同一染色体等染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecF等，以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等，同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Hol的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday结构的拆分)。同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性。
近年来PCR同源重组克隆法被愈来愈受重视，该方法不受载体和目的片段的酶切位点限制，通过重组酶直接运用同源重组的方法完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短和传统方法相比，具有快速，效率高的特点，但是重组酶纯化的过程比较复杂，在运送和保存方法要求也比较高。
IHF是与双链DNA结合的类似组蛋白的耐热的小分子蛋白质，IHF由α亚基(himA编码，11.35kD)和β亚基(hip编码，10.65kD)构成，λ噬菌体的位置特异性重组需要宿主编码的整合宿主因子IHF。同源重组克隆法是利用重组酶来进行连接DNA和克隆的，迄今为止国内国外，没有任何有关利用同DNA(单链，双链，或者是非特异性)结合的蛋白代替克隆所需要的酶在大肠杆菌中进行定向克隆载体构建的报道。这种利用和DNA双链结合蛋白来克隆的方法属于首创。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，具体为利用双链结合功能的整合宿主因子IHF来连接DNA片段和克隆载体构建的方法，该方法是通过引物设计DNA片段之间的同源同组序列，用PCR技术把DNA片段扩增后，利用与DNA双链结合功能的整合宿主因子IHF取代重组酶的功能，并在大肠杆菌里DNA连接的过程。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，具体通过以下步骤完成：
1)对至少两个待连接的DNA片段设计引物；
2)根据酶切或者PCR反应得到待连接的线性化载体；
3)对至少两个待连接的DNA片段之间引入DNA同源同组序列；
4)利用IHF蛋白进行同源重组转化；
5)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA质粒。
进一步，步骤(1)所述的待连接的DNA片段包含用于克隆的线性化质粒片段。
进一步，步骤(3)的具体步骤为根据限制性酶切或PCR反应得到待连接的线性化载体的两端序列，通过PCR反应得到与线性化载体的5’和3’末端具有15到50同源碱基的目的DNA片段。
进一步，步骤(4)中反应条件是将待连的DNA片段、Shift buffer、IHF蛋白混合成10ul体系，混匀后离心，常温反应10分钟；Shift buffer的配方：25mM Tris PH8.0和10mMMgCl2。
进一步，步骤(5)使用DH5α或top10或DH10B感受态细胞进行转化。
本发明的有益效果为：本技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体同源重组连接，常温反应时间短至10分钟，阳性率高达95％以上。
附图说明
图1是IHF SDS-PAGE电泳检测图；
图2是IHF-β蛋白条带迁移活性检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1
1)IHF蛋白的制备
将来源于大肠杆菌的IHFα或IHFβ亚基或者是IHFα和IHFβ的二聚体分别插入pET22表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET22-IHFα或者pET22-IHFβ或者是IHFα和IHFβ的二聚体；
将构建好的重组载体pET22-IHFα或者pET22-IHFβ或者是IHFα和IHFβ的二聚体转化大肠杆菌BL21，取含重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6～0.8；加入IPTG，将菌液放入37℃摇床中诱导表达3小时；
取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况如图1所示。
2)HF-β蛋白条带迁移活性检测
将不同浓度的IHF-β蛋白加入到相同量的pET-22b质粒中，室温放置10min后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，pET-22b质粒的条带发生了明显的移动。
实施例2
本Shift实验是用来测定IHF与DNA结合活性。将质粒pET-22b(5439bp，97ng/ul)加入IHF进行shift实验具体过程如下：
琼脂糖凝胶阻滞实验(shift实验)，如表1所示确定好梯度，将质粒pET-22b与shift buffer、IHF 102ng/ul蛋白混合成10ul体系。混匀后离心，室温放置10分钟。
表1 pET-22b与shift buffer、IHF 102ng/ul混合体系
| Shift buffer(ul) | 9.7 | 9.2 | 8.2 | 6.7 | 5.2 | 3.7 | 2.2 | 1.2 | 0 |
| pET-22b质粒(ul) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| IHF蛋白(ul) | 0 | 0.5 | 1.5 | 3 | 4.5 | 6 | 7.5 | 8.5 | 9.7 |
反应完成后，加入2ul DNA6×loading buffer混匀，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，上样量为5ul。实验结果表明IHF蛋白具有和DNA结。
实施例3
本实施例是在待连接的DNA片段中加入不同浓度(IHF-β)蛋白后，在大肠杆菌中转化和克隆的结果(菌落生长情况)，以及市场上购买的同源重组试剂盒的菌落生长情况。克隆的效率用传统的克隆PCR法来验证。转化和克隆具体过程：
克隆载体构建过程(以线性载体pUC19和DNA片段A重组质粒为例)；pUC19线性载体的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，DNA片段A的序列如SEQ ID NO.2所示。
1.线性载体准备
1.1.对PUC19质粒进行PCR扩增
1.1.1PCR体系(100ul体系)为：PUC19(2ng\ul)3ul，引物1(puc19-正引物)0.5u，引物2(puc19-反引物)0.5ul，2×Master Mix 50ul，ddh2046ul。
引物1(puc19-正引物)的DNA序列：ctctagagtcgacct；此序列是pUC19序列位置422到436的15个碱基。
引物2(puc19-反引物)的DNA序列：taccgagctcgaatt；此序列是pUC19序列位置411到397的15个碱基。
1.1.2PCR程序如下：95℃1min；95℃30s，58℃30s，72℃1min30s，34次循环；72℃5min；4℃∞。使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.1.3使用胶回收试剂盒对pUC19进行回收纯化，
2.DNA目的片段准备(片段A目的片段制备过程)
2.1.1PCR体系(100ul体系)如下：Pet-22-片段A(2ng\ul)3ul，引物3-片段A正引物0.5u，引物4-片段A反引物0.5u，2×Master Mix50ul，ddh2046ul。
引物3(片段A正引物的DNA序列)：aggtcgactctagagatgaccaagtcagaattgat。其中：aggtcgactctagag是pUC19序列位置436到422的15个碱基。atgaccaagtcagaattgat是片段A序列位置1到20的20个碱基。
引物4(片段A反引物的DNA序列)aattcgagctcggtattaaccgtaaatattggcg。其中：aattcgagctcggta是pUC19序列位置397到411的15个碱基。ttaaccgtaaatattggcg是片段A序列位置285到266的20个碱基。
2.1.2PCR程序如下：95℃1min；95℃30s，58℃30s，72℃1min30s，34个循环；72℃5min；4℃∞。使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
2.1.3使用胶回收试剂盒对片段A进行回收纯化，
3.使用市场销售的剂盒进行同源重组的转化和克隆
如表2所示构建同源重组反应体系。
表2
| 线性PUC19(ul)(7～8ng\ul) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| DNA fragment A(20～25ng\ul) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| Buffer(ul)市场销售 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Enzyme(ul)市场销售 | 0.5 | 0 | 0 | 0 |
| 稀释3倍的IHF蛋白(ul) | 0 | 1 | 2.5 | 4 |
每个反应的体积用水调节到10ul，混匀离心后，除了第一个加Enzyme(0.5ul)的反应需要在22℃，30min充分反应，65℃，10分钟将酶灭活以外，其余的三个只加IHF蛋白的反应条件是静置在常温10分钟即可。
4.使用DH5α感受态细胞进行转化。
4.1-1取5ul市场销售反应液于100ul DH5α惑受态细胞(1.5ml离心管)，冰上静置30min。
4.1-2取5ul上述的DNA片段和IHF的混和反应液于100ul DH5α感受态细胞(1.5ml离心管)，冰上静置30min。
4.2使用金属浴，42℃下热激70s。
4.3冰上静置5min。
4.4超净工作台中向离心管中加入300ul SOC培养基，在37℃条件下，以转速225rpm\min摇菌1h。
4.5取200ul菌液进行涂平板(含100mg\ml Amp的LB固体培养基)，37℃培养箱中倒置过夜培养。最后获得克隆。
4.6取10ul连接反应液于100ul top10感受态细胞(1.5ml离心管)，冰上静置30min.
4.7使用金属浴，42℃下热激70s。
4.8冰上静置5min。
4.9超净工作台中向离心管中加入300ul SOC培养基，在37℃条件下，以转速225rpm\min摇菌1h。
4.10取200ul菌液进行涂平板(含100mg\ml Amp的LB固体培养基)，37℃培养箱中倒置过夜培养。最后获得克隆。
4.11用克隆PCR的方法检量转化和克隆的效率＞96％。
实施例4
在待连接的DNA片段中同时加入市场上购买的同源重组试剂和不同浓度IHF蛋白后，在大肠杆菌中转化和克隆的结果(菌落生长情况)，以及市场上购买的同源重组试剂的菌落生长情况。克隆的效率用传统的克隆PCR法来验证。
转化和克隆具体过程：
1)克隆载体构建过程(以线性载体pUC19和DNA片段A重组质粒为例)；
1.线性载体准备：与实施例3相同。
2.目的片段准备：与实施例3相同
3.使用市场销售的试剂加上进行同源重组的转化和克隆
表3 构建同源重组反应体系
混匀离心后，22℃，30min充分反应，65℃，10min将酶灭活。
4.使用DH5α感受态细胞进行转化和克隆：
4.1-1取5ul市场销售反应液于100ul DH5α感受态细胞(1.5ml离心管)，冰上静置30分钟。
4.1-2取5ul上述的DNA片段和IHF以及市场销售反应液混和反应液于100ul DH5α感受态细胞(1.5ml离心管)，冰上静置30分钟。
剩余的步骤与实施例3相同。
5.用克隆PCR的方法检量转化和克隆的效率大于96％。
Claims (5)
1.一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)设计引物：对至少两个待连接的DNA片段设计引物；
2)根据酶切或者PCR反应得到待连接的线性化载体；
3)对至少两个待连接的DNA片段之间引入DNA同源重组序列；
4)利用IHF蛋白进行同源重组转化；
5)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA质粒。
2.根据权利要求1所述的一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，其特征在于：步骤(1)所述的待连接的DNA片段包含用于克隆的线性化质粒片段。
3.根据权利要求1所述的一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为根据限制性酶切或PCR反应得到待连接的线性化载体的两端序列，通过PCR反应得到与线性化载体的5′和3′末端具有15到50同源碱基的目的DNA片段。
4.根据权利要求1所述的一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，其特征在于：步骤(4)中反应条件是将待连的DNA片段、Shift buffer、IHF蛋白混合成10μ L 体系，混匀后离心，常温反应10分钟；Shift buffer的配方：25mM Tris PH8.0和10mM Mg Cl2。
5.根据权利要求1所述的一种利用蛋白IHF构建克隆载体的方法，其特征在于：步骤(5)使用DH5α或top10或DH10B感受态细胞进行转化。
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| 同源重组介导的克隆策略研究进展;戴倩等;《农产品加工·学刊》;20110630(第6期);第7-13页 |
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