CN110894499A - 一种基因定点突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基因定点突变的方法，所述基因定点突变的方法包括以下步骤：以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。本发明通过先对目标基因片段进行重叠延伸PCR扩增，以对目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体，即可获得重组质粒，作为重叠延伸PCR法的扩展，避免了以重叠延伸PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时，难以获得含有突变位点的扩增产物的问题，提供了一种适用于长基因定点突变的有效方法。

Description

一种基因定点突变的方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及基因定点突变技术领域，具体涉及一种基因定点突变的方法。
背景技术
基因定点突变是常用的分子生物学技术，是蛋白质结构与功能研究的基础手段。目前基因定点突变主要采用基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的突变引入办法。最早开发出来的重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)是基因突变的主要方法，近年来还发展出大引物法与滚环扩增法等定点突变方法。这些方法各有优劣，不同实验室在选择基因定点突变方法时有所偏好。
OE-PCR包括两轮扩增，第一轮PCR分别扩增基因上、下游片段，第二轮PCR通过上、下游片段的末端重叠延伸产物作为模板扩增全长基因。很多科研工作者都有类似的经验，即上、下游片段较小时，第二轮PCR容易成功；随着上、下游基因片段长度增加，第二轮PCR成功率逐渐降低；当某一片段超过2kb时，第二轮PCR不易获得目标产物。一般认为是较长的基因片段干扰了上、下游片段的末端互补所致。另一方面，PCR体外扩增DNA时总是存在随机突变的可能，而且随着目标产物长度增加，随机突变的概率也逐渐增加。由于以上两点，OE-PCR在制作长基因定点突变时往往并不顺利。因此，在遇到相应问题时，有科研工作者会转向滚环扩增法。滚环扩增法也是目前市场上大多数突变试剂盒所采用的基本原理，如NEBQ5,Stratagene QuikChange及碧云天QuickMutation基因定点突变试剂盒等。然而，滚环扩增法也存在固有缺陷：其一，PCR扩增7-12kb质粒依赖于高保真、快速且稳定的DNA聚合酶，否则无法得到目标产物或容易引入随机突变；其二，若DpnI酶未能对模板质粒做彻底消化，则会严重干扰目标突变质粒的筛选。尽管所有试剂盒厂商都声称其所含上述两酶都满足要求，但随着试剂盒使用和存储时间增加，不可避免的酶活性降低就会极大地影响基因突变的效率。其三，体外扩增的DNA须经测序确认后才会用于后续研究。这一缺陷于滚环扩增法尤为明显，因为该法需对质粒全长作扩增，而长质粒测序既耗时又会增加额外费用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种基因定点突变的方法，旨在提供一种适用于长基因定点突变的有效方法。
为实现上述目的，本发明提出一种基因定点突变的方法，包括以下步骤：
以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；
将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。
可选地，所述质粒载体来源于获得所述目标基因片段的原始质粒。
可选地，所述目标基因片段两端分别具有第一酶切位点和第二酶切位点，且所述第一酶切位点在所述原始质粒上不单一，所述原始质粒还包括通过所述第一酶切位点与所述目标基因片段连接的第二基因片段，所述第二基因片段的另一端具有第三酶切位点；
对应地，将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒的步骤，包括：先将所述含有突变位点的基因片段通过所述第一酶切位点与所述第二基因片段连接，再通过所述第二酶切位点和第三酶切位点与质粒载体连接，获得重组质粒。
可选地，所述目标基因片段来源于视网膜母细胞瘤基因。
可选地，所述目标基因片段为所述视网膜母细胞瘤基因编码区1968-2787位的基因片段。
可选地，以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段的步骤，包括：
以重叠延伸PCR法，将所述视网膜母细胞瘤基因编码区2338-2339位的TC定点突变为GA。
可选地，所述重叠延伸PCR法中，采用的上游引物包括引物S2和引物780E_A，所述下游引物包括引物780E_S和引物pEGFP_C3’，其中：
所述引物S2的序列为GCCATTGAAATCTACCTCTCT；
所述引物780E_A的序列为ATTGGTTCCAAGGTAGGGGG；
所述引物780E_S的序列为ACCTTGGAACCAATACCTCA；
所述引物pEGFP_C3’的序列为TATGGCTGATTATGATCAGT。
本发明提供的技术方案中，通过先对目标基因片段进行重叠延伸PCR扩增，以对目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体，即可获得重组质粒，本基因定点突变的方法作为重叠延伸PCR法的扩展，避免了以重叠延伸PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时，难以获得含有突变位点的扩增产物的问题，提供了一种适用于长基因定点突变的有效方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的基因定点突变的方法的一实施例中的双片段连接示意图；
图2为本发明提供的基因定点突变的方法的一实施例中基因片段与载体的酶切结果图；
图3至图7为实施例中制得的重组质粒的PCR检测结果图；
图8为实施例中制得的重组质粒的序列测试结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
重叠延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)是基因突变的主要方法，OE-PCR包括两轮扩增，第一轮PCR分别扩增基因上、下游片段，第二轮PCR通过上、下游片段的末端重叠延伸产物作为模板扩增全长基因。很多科研工作者都有类似的经验，即上、下游片段较小时，第二轮PCR容易成功；随着上、下游基因片段长度增加，第二轮PCR成功率逐渐降低；当某一片段超过2kb时，第二轮PCR不易获得目标产物。一般认为是较长的基因片段干扰了上、下游片段的末端互补所致。另一方面，PCR体外扩增DNA时总是存在随机突变的可能，而且随着目标产物长度增加，随机突变的概率也逐渐增加。由于以上两点，OE-PCR在制作长基因定点突变时往往并不顺利。
鉴于此，本发明提出一种基因定点突变的方法，以OE-PCR为基础，对含有目标突变位点的目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该基因片段连接入合适的载体中，获得重组质粒，即完成基因的定点突变。在本发明提供的基因定点突变的方法的一实施例中，所述基因定点突变的方法包括以下步骤：
步骤S10、以OE-PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；
步骤S20、将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。
本发明提供的技术方案中，通过先对目标基因片段进行OE-PCR扩增，以对目标基因片段进行定点突变，得到含有突变位点的基因片段，然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体，即可获得重组质粒，本基因定点突变的方法作为OE-PCR法的扩展，避免了以OE-PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时，难以稳定获得含有突变位点的扩增产物的问题，提供了一种适用于长基因定点突变的有效方法。
在将含有突变位点的基因片段连接入载体时，可选用本领域常规的质粒载体，而考虑到所所述含有突变位点的基因片段的有效表达，优选所述质粒载体来源于获得所述目标基因片段的原始质粒，也即，可以将所述原始质粒切除所述目标基因片段所剩余的基因片段作为所述质粒载体，有利于最大限度的保留所述原始质粒的基因片段，以实现仅将所述原始质粒需要突变的位点进行定点突变，而其余基因片段保持不变，使得获得的重组质粒不仅具有基因定点突变后所带来的功能，还具有所述原始质粒自身的功能。
对于突变位点两侧具有合适酶切位点的基因突变，采用上述实施例提供的方法，通过OE-PCR法扩增两侧酶切位点之间的部分序列，获得含有突变位点的基因片段，再将其连入适当的质粒载体中，即可获得重组质粒。而当突变位点两侧的酶切位点在原始质粒序列上并不单一时，则扩增后含有突变位点的基因片段难以顺利连接至来源于原始质粒的质粒载体上。由此，在本发明提供的一优选实施例中，采用双片段连接法，将含有突变位点的基因片段与同样来源于原始质粒的另一片段先连接，利用恰当的基因片段组合形成组合片段，再将该组合片段作为一个整体连接入来源于所述原始质粒的质粒载体(此时，所述质粒载体为切除所述目标基因片段以及与之组合的基因片段后，所剩余的基因片段)。
具体地，在此优选实施例中，所述目标基因片段两端分别具有第一酶切位点和第二酶切位点，且所述第一酶切位点在所述原始质粒上不单一，所述原始质粒还包括通过所述第一酶切位点与所述目标基因片段连接的第二基因片段，所述第二基因片段的另一端具有第三酶切位点；对应地，步骤S20包括：先将所述含有突变位点的基因片段通过所述第一酶切位点与所述第二基因片段连接，再通过所述第二酶切位点和第三酶切位点与质粒载体连接，获得重组质粒。
通过部分扩增法(也即，以OE-PCR扩增目标基因片段，对应获得含有突变位点的基因片段)以及双片段连接法(也即，将含有突变位点的基因片段先与恰当的基因片段连接，再连接入质粒载体，对应获得完整的重组质粒)相结合的方式，有效实现了长基因的定点突变，同时也解决了突变位点两端酶切位点在质粒序列上不一致而导致难以连接至来源于原始质粒的质粒载体的问题，提供了一种长基因定点突变的有效可行的新方案。
上述提供的基因定点突变的方法，可适用于长基因的定点突变，具有普适性，具体操作流程及条件可以根据实际需要进行对应调整，以下以对视网膜母细胞瘤基因(Retinoblastoma gene 1,rb1)进行定点突变为例，也即，所述目标基因片段来源于rb1基因，详细说明本发明提供的基因定点突变方法。
rb1基因是典型的抑癌基因，rb1基因缺失与突变是众多肿瘤发生的重要诱因。rb1基因转录终产物约4.7kb，其开放阅读框全长2787bp，编码928个氨基酸。在细胞周期的G1期，Rb1蛋白相继被cyclin D1/CDK4与cyclin E/CDK2磷酸化，释放与之结合的E2F，从而启动G1/S转换。Rb1蛋白C端有数个CDK潜在磷酸化位点，其中大多受cyclin E/CDK2修饰，唯有780Ser是较为可信的CDK4磷酸化位点，将Rb1蛋白780Ser(S)突变为780Glu(E)可模拟其磷酸化修饰效果，进而研究其调节机制。由于rb1基因编码区较长，常规OE-PCR制作rb1S780E突变体时遇到困难。通过本发明将部分扩增与双片段连接法相结合的方案，以所述rb1基因编码区1968-2787位的基因片段作为所述目标基因片段，可以成功克隆rb1S780E突变体并将其连入质粒载体，为进一步研究该基因的调节机制做下基础准备，同时也提供了一种有效的长基因定点突变解决方案。
想要获得rb1S780E定点突变，需要将rb1基因编码区2338-2339位的TC定点突变为GA，对应地，步骤S10包括：以OE-PCR法，将所述rb1基因编码区2338-2339位的TC定点突变为GA。
通过OE-PCR法进行定点突变通常需要设计特定的引物，在对所述rb1基因进行如上所述的定点突变时，采用的上游引物包括引物S2和引物780E-A，所述下游引物包括引物780E-S和引物pEGFP-C3’，其中：所述引物S2的序列为GCCATTGAAATCTACCTCTCT；所述引物780E_A的序列为ATTGGTTCCAAGGTAGGGGG；所述引物780E_S的序列为ACCTTGGAACCAATACCTCA；所述引物pEGFP_C3’的序列为TATGGCTGATTATGATCAGT。
具体地，从rb1基因的原始质粒上切下基因编码区1968-2787位的基因片段作为所述目标基因片段，然后以所述引物S2搭配所述引物780E_A扩增上游片段，以所述780E_S搭配引物pEGFP_C3’扩增下游片段，得到含有预设定点突变的目标产物片段，即成功获得rb1S780E定点突变，且条带清晰。然后选用同样来源于rb1基因原始质粒的质粒载体与上述OE-PCR扩增产物连接，获得完整的重组质粒即可。
理论上，将上述OE-PCR扩增产物以NheI/SalI双酶切即可获得含有突变位点的基因片段，再连接入切除对应片段的质粒载体即可得到完整的突变体质粒。然而，通过限制性酶切分析发现rb1基因的原始质粒多克隆位点上游还有另一个NheI位点，因此，所述含有突变位点的基因片段无法直接与切除对应片段的载体连接而获得目标质粒。因此，优选为通过双片段连接法解决上述问题，即，参阅图1所示，以NheI/EcoRI双酶切原始质粒(命名为pEGFP_C3-rb1)，得到1068bp、1662bp和4773bp的三个基因片段，如图2所示，其中最小的基因片段为所需要的第二基因片段(rb1基因编码区900-1968位的基因片段，在图1中命名为基因片段F2)，其与1622bp片段相距较远，易于分离回收(图2中b道所示)；以NheI/SalI双酶切OE-PCR扩增产物获得含有突变位点的基因片段(在图2中命名为基因片段rb1-F3)；以EcoRI/SalI双酶切原始质粒，得到1888bp和5615bp两个基因片段，其中大片段为所需要的质粒载体部分(在图1中命名为基因片段F1，图3中c道所示)；然后将基因片段F2和基因片段rb1-F3一起，与基因片段F1连接，从而获得完整的目标质粒(命名为pEGFP_C3-rb1S780E)。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
采用高保真Pyrobest DNAPolymerase对目标基因片段进行定点突变，原始质粒为pEGFP_C3-rb1质粒，由北京大学生命科学学院张传茂教授馈赠，引物采用Primer Premier5.0软件设计，由北京天润奥生物科技有限公司合成，经PAGE纯化，引物序列如表1所示。
表1引物序列
Figure BDA0002295187060000071
Figure BDA0002295187060000081
(1)基因定点突变：总体积20μL，含14.3μL ddH2O，2μL 10×buffer，3μL dNTP，0.2μL primer 1/0.2μl primer 2，0.2μL酶，0.1μL(10ng)pEGFP_C3-rb1质粒；运行程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃3min，30循环；72℃10min.第二轮PCR方案：总体积2μL，含13.4μL ddH2O，2μL 10×buffer，3μL dNTP，0.2μL primer 1/0.2μL primer 2，0.2μL酶，0.5μL上游片段/0.5μL下游片段；运行程序：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃3min，30循环；72℃10min.PCR产物经电泳检测后回收至20μl ddH2O中。
(2)双片段连接：取PCR回收物17μL，加2μL 10×buffer，0.5μL酶1/0.5μL酶2；另取pEGFP_C3-rb1质粒1μg稀释到17μL ddH2O中，加2μL 10×buffer，0.5μL酶1/0.5μL酶2，37℃2h。电泳检测后将目标片段回收至20μL ddH2O中，用DNALigation Kit Ver.2.1连接：载体0.5μL，两个片段各3.5μL，solution I 7.5μL混合，16℃30min。连接产物即为含有突变体的重组质粒。
对获得的重组质粒进行菌落检测和序列分析，方法如下：
(1)菌落检测：将连接产物直接转化感受态大肠杆菌，然后涂布在含卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜。在过夜培养的平板上随机挑取数个成型菌落，置于4mL含卡那霉素的LB培养基中继续培养6h，以菌液为模板进行PCR检测。方案：5μL 2×SuperMix，0.1μL primer 1/0.1μL primer 2，0.8μl菌液，补水至10μL；扩增条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃1min，30循环。另对部分克隆取3mL菌液小量提取质粒进行酶切检测，方案为：12.5μL ddH2O，2μL 10×buffer，0.5μL内切酶，5μL小提质粒；37℃2h。PCR产物及酶切产物皆经1％琼脂糖凝胶电泳分析。取2个经验证的阳性质粒进行序列测定，质粒测序由北京天润奥科生物科技有限公司完成。
在进行PCR检测时，以两种不同的引物组合进行PCR检测，方案一选用S2/780E_A引物组合；阳性结果表示质粒含有rb1基因后半部分，如图3所示。检测得到#1、#4、#5三个阳性克隆，其产物大小约500bp，与预期(514bp)相符，如图4所示。方案二选用780E_S/pEGFP_C3’引物组合；阳性结果表示质粒为pEGFP_C3载体，且含有rb1后半部分。该方案检测结果与方案一一致，其产物大小约400bp，与预期(421bp)相符，如图5所示。为进一步确认检测结果的可靠性，对#1-5号克隆提取质粒作酶切检测。分别以MluI与NheI作单酶切检测，结果显示#1、#4、#5三个质粒能切出预期片段，而#2、#3号质粒无预期片段，如图6和图7所示。酶切检测结果与PCR检测结果一致。
(2)为鉴定目标质粒序列准确性，对上述菌落检测中的#1、#4阳性质粒进行序列测定。
由于经PCR扩增的F3片段位于基因下游，且目标突变位点S780E距下游SalI位点仅490bp，故选择pEGFP_C3’引物对该质粒反义链进行序列测定。结果显示两者目标位点为TC碱基，且F3部分序列内未引入其它非预期突变点，如图8所示。表明其正义链对应位置为GA碱基，符合预期的rb1S780E突变体序列特征。由于目标质粒其它部分未经PCR扩增，故未作序列测定。
综合分析，#1、#4克隆皆是符合要求的pEGFP_C3-rb1S780E目标突变体。说明本发明实施例提供的基因定点突变的方法，可以有效可行的对长基因rb1进行预期的基因定点突变，获得复合预期的重组质粒。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种基因定点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段；
将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒。
2.如权利要求1所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述质粒载体来源于获得所述目标基因片段的原始质粒。
3.如权利要求2所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述目标基因片段两端分别具有第一酶切位点和第二酶切位点，且所述第一酶切位点在所述原始质粒上不单一，所述原始质粒还包括通过所述第一酶切位点与所述目标基因片段连接的第二基因片段，所述第二基因片段的另一端具有第三酶切位点；
对应地，将所述含有突变位点的基因片段与质粒载体连接，获得重组质粒的步骤，包括：先将所述含有突变位点的基因片段通过所述第一酶切位点与所述第二基因片段连接，再通过所述第二酶切位点和第三酶切位点与质粒载体连接，获得重组质粒。
4.如权利要求1所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述目标基因片段来源于视网膜母细胞瘤基因。
5.如权利要求4所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述目标基因片段为所述视网膜母细胞瘤基因编码区1968-2787位的基因片段。
6.如权利要求5所述的基因定点突变的方法，其特征在于，以重叠延伸PCR法对目标基因片段进行定点突变，获得含有突变位点的基因片段的步骤，包括：
以重叠延伸PCR法，将所述视网膜母细胞瘤基因编码区2338-2339位的TC定点突变为GA。
7.如权利要求6所述的基因定点突变的方法，其特征在于，所述重叠延伸PCR法中，采用的上游引物包括引物S2和引物780E_A，所述下游引物包括引物780E_S和引物pEGFP_C3’，其中：
所述引物S2的序列为GCCATTGAAATCTACCTCTCT；
所述引物780E_A的序列为ATTGGTTCCAAGGTAGGGGG；
所述引物780E_S的序列为ACCTTGGAACCAATACCTCA；
所述引物pEGFP_C3’的序列为TATGGCTGATTATGATCAGT。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1861799A (zh) * 2005-05-13 2006-11-15 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种改进的重叠延伸pcr方法及其所获得的突变基因
CN101899434A (zh) * 2010-06-18 2010-12-01 南方医科大学 一种可连接多片段的重叠延伸pcr方法
CN104232607A (zh) * 2014-09-01 2014-12-24 湖北大学 一种苏云金芽孢杆菌几丁质酶的突变酶制备及其应用
CN105907735A (zh) * 2016-05-03 2016-08-31 江南大学 一种催化效率与热稳定性提高的n-乙酰谷氨酸激酶突变体

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Title
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