CN102899345A - 一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法 - Google Patents

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周哲敏
刘义
崔文璟
周丽
周月涵
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Jiangnan University
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Abstract

本发明公开了一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法，是采用是把两个突变点分别设计在两个特异性引物片段上，通过一步PCR获得含两点突变的重组质粒的方法，属于基因克隆技术领域。本发明方法操作简单，具有非常高的效率和成功率。

Description

一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法
技术领域
一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法，本发明涉及一种快速高效构建点突变重组质粒的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。
通过巧妙设计单点突变，将质粒定点突变技术变得简单有效。设计一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。之后用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎(DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次)，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法。
本发明的具体步骤如下：
1)把两个突变位点分别设计在两条延伸方向相向的引物上；
2)PCR扩增步骤与普通PCR一致，但是延伸温度的时间设定与该重组质粒的长度有关，一般含7000b碱基数的重组质粒延伸时间约为5-8min；
3)PCR扩增步骤与普通PCR一致，但是PCR扩增循环数一般约为15-20次；
4)PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞；
5)选择阳性克隆测序。
本发明所述PCR扩增步骤与普通PCR一致，只是延伸温度的时间设定要根据重组质粒的长度而定，PCR扩增循环数也要尽量少一些，一般15-20次为宜，尽量减少因PCR扩增循环数过多而引起的其它突变。
本发明的详细的步骤为：
1)把两个突变位点分别设计在两条延伸方向相向的引物上
突变位点设计的时候要注意，突变引物5‘端离突变位点的碱基数比3‘端离突变位点的碱基数要多一些，一般5‘端离突变位点的碱基数为15-30bp，而3‘端离突变位点的碱基数为6-15bp。
2)设定PCR扩增程序
PCR反应条件：
Figure BSA00000778843700021
“变性-退火-延伸”这个过程进行15-20个循环。
3)PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞
PCR扩增完成后，跑DNA凝胶电泳检验一下有弱的条带就可以了。再用DpnI酶消化模板质粒3h，之后可直接转化克隆宿主菌或表达宿主菌。
4)选择阳性克隆测序
本发明的有益效果：本发明提供了一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法。
附图说明
图1.快速高效构建两点突变重组质粒的原理
具体实施方式
材料和检测方法
腈水合酶基因B(GenBank U89363.1)来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668(“Astereoselective cobalt-containing nitrile hydratase”发表在1997的Biochemistry)。模板质粒pET24a(+)-B。
实施例1
1)根据腈水合酶基因序列B(GenBank U89363.1)设计引物
2)把两个突变位点分别设计在两条延伸方向相向的引物上
突变位点设计的时候要注意，突变引物5‘端离突变位点的碱基数比3‘端离突变位点的碱基数要多一些，一般5‘端离突变位点的碱基数为15-30bp，而3‘端离突变位点的碱基数为6-15bp。本实例希望突变腈水合酶第10位的丙氨酸为半胱氨酸和第172位的丙氨酸为半胱氨酸，根据上述引物设计原则，设计：
上游突变引物5‘-tggcattcacgatactggcggatgccatggttat-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
下游突变引物5‘-gggctgctcgccctttccgtgtgcgcaggtgtcc-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
下划线的核苷酸为突变位点。
3)设定PCR扩增程序
PCR反应条件：
Figure BSA00000778843700022
“变性-退火-延伸”这个过程进行15-20个循环。
4)PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞
PCR扩增完成后，跑DNA凝胶电泳检验一下有弱的条带就可以了。然后再用DpnI酶消化模板质粒3h，之后直接转化E.coli BL21(DE3)表达宿主菌。
5)选择阳性克隆测序
选择阳性克隆送生工生物工程上海股份有限公司测序，测序结果(如SEQ ID NO.3所示)显示成功突变了第10位和第172位两个位点。
Figure ISA00000778843900011
Figure ISA00000778843900021

Claims (8)

1.一种快速高效构建两点突变重组质粒的方法，是采用把两个突变点分别设计在两个特异性引物片段上，通过一步PCR获得含两点突变的重组质粒的方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一步PCR扩增得到含两点突变的重组质粒，不需要酶切、连接等传统的质粒构建方法。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增的模板是已经构建好的重组质粒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，两个突变点分别设计在两个特异性引物上。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，两个引物扩增的方向相向。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法与普通PCR方法一致，但PCR延伸时间为延伸整个重组质粒长度的时间，一般含7000bp碱基数的重组质粒延伸时间约为5-8min。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法与普通PCR方法一致，但PCR扩增循环数一般约为15-20次。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增完成后经DpnI酶消化模板质粒3h后直接转化感受态细胞。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
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