CN1863552B - 酪氨酸酶突变体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了新的酪氨酸酶蛋白质及其使用方法。具体地，本发明提供酪氨酸酶衍生的肽和多核苷酸，及其引发免疫应答和治疗黑色素瘤的能力。

Description

酪氨酸酶突变体及其使用方法

发明背景 

1.发明领域 

本发明涉及可溶的蛋白质突变体及利用可溶的蛋白质突变体来治疗疾病或紊乱的方法。特别地，本发明描述了可溶的酪氨酸酶及其在黑色素瘤治疗中的应用。 

2.发明背景 

在北美，恶性黑色素瘤的发病率比任何其它类型的人类癌症增加更为迅速(Armstrong等人(1994)Cancer Surv.19-20：219-240)。虽然黑色素瘤是可医治的癌症，但必须在疾病发展的早期，即在其波及远离部位前除去原发肿瘤。微小转移的存在可能并且经常导致最后的有症状的转移(symptomatic metastases)。因此，需要设计用于治疗黑色素瘤的治疗学方法。 

因此，本发明人研究了在存在和缺少酪氨酸酶跨膜结构域时，酪氨酸酶球状结构域的折叠途径。酪氨酸酶(单酚，3，4-二羟基苯丙氨酸：氧氧化还原酶，EC1.14.18.1)是在存在ER质量控制时其成熟已被很好证明的I型膜糖蛋白(Petrescu等，2000；Halaban等，1997；Toyofuku等，2001；Branza-Nichita等，2000)。酪氨酸酶一般为产生色素的细胞(黑色素细胞)所专有并且是黑色素瘤中的分化抗原。令人惊讶地，本发明人已经发现缺乏其跨膜结构域的可溶酪氨酸酶突变体保留在ER中。这种突变体被蛋白酶体降解并且通过MHC I类分子呈递到细胞表面上。 

当新生多肽链通过转位孔移位进入ER内腔时开始了真核细胞中可溶的和膜-结合糖蛋白的折叠(Hardesty等人，1999)。在存在ER-驻留陪伴分子时，通过重复的折叠和再折叠步骤，该过程翻译后继续，并且产生能够脱离ER的产物(Trombetta和Helenius，1998，Chen和Helenius，2000)。错误折叠和不正确组装的蛋白质通常移位回到细胞质而受到蛋白酶体的降解(Brodsky，1997)。 

无锚定(可溶的)和膜-结合的蛋白质的折叠途径可能由于跨膜结构域(TM)插入脂双分子层的相关事件而显著不同。已知转位子提供 保护性和限制性的环境，其本身在移位期间起作为蛋白质链陪伴分子作用(Chen和Helenius，2000)。最近，已经表明TM不能直接整合进入ER脂双分子层(Mothes等人，1997)。代替的，TM结构域在俣成后释放到含水通道中，并通过侧向扩散插入脂双分子层。扩散过程发生的效率和速度取决于TM结构域的疏水性(Heinrich等人，2000)。例如，当TM区域疏水性更低时，新生链可更长时段地保留在转位子中。因此，新生链在转位子内部或其附近所花费的时间可能取决于TM区域的氨基酸组成。 

根据这些发现，本发明人推论TM结构域可起移位期间发生折叠的相关事件的驱动因子作用。通过基于由凝集素陪伴分子钙连接蛋白(CNX)和钙网蛋白(CRT)识别单葡萄糖基化的N-聚糖的质量控制紧密调节ER内腔中新生链的折叠(Helenius和Aebi，2001；Schrag等人，2001)。虽然研究表明质量控制也监控TM结构域组装进入脂双分子层(Cannon和Creswell，2001)，然而对于膜蛋白折叠过程中TM结构域的作用知之甚少。 

为了进一步研究TM结构域的作用，本发明人构建了其运输停止在ER水平的人酪氨酸酶突变体。换言之，突变体酪氨酸酶被错误折叠并且通过质量控制系统保留在ER中。因此，突变体酪氨酸酶向后移位(retro-translocate)至用于降解作用的蛋白酶体，降解之后，所得到的肽通过MHC I类分子呈递于细胞表面上。因而，本发明的突变酪氨酸酶可作为设计增加针对黑色素瘤细胞的CTLs免疫应答的疫苗药物来用于黑色素瘤免疫疗法。 

特别地因为其涉及疫苗效力，免疫应答的重要方面是加工抗原以便其被免疫系统的特化细胞识别的方式。使用不同的抗原加工和呈递途径，因此特定抗原被MHC II类或I类分子分别细胞表面呈递至辅助T淋巴细胞或细胞毒性T淋巴细胞取决于抗原加工途径。 

一个途径是加工细胞内部表达的内原性抗原的胞质途径。在细胞的细胞质中抗原被专门的蛋白酶复合物降解，并且将所得到的抗原肽转运进入内质网。这导致抗原结合MHC I类分子。通过交叉呈递，可在专门的抗原-呈递细胞的细胞质中加工外源性抗原并且结合MHC I类分子。 

备选途径是绕过细胞质的内质网途径。在内质网中，抗原肽结合 MHC I类分子，其然后被转运至细胞表面来呈递至免疫系统的细胞毒性T淋巴细胞。几个研究指出了细胞毒性T细胞在经免疫系统的癌症产生和消除中的重要作用(Byrne等人，J.Immunol.51：682(1984)；McMichael等人，N.Engl.J.Med.309：13(1983))。 

第三个途径是加工存在于细胞外部抗原的发生在专门的抗原-呈递细胞中的内吞途径，其导致抗原结合MHC II类分子。通过使得抗原进入内涵体然后带至溶酶体的胞吞将这种抗原带入细胞。随后，抗原经蛋白酶降解成为结合MHC II类分子的抗原肽，然后转运至细胞表面用于呈递至免疫系统的辅助T淋巴细胞。 

发明概述 

本发明中预期包括可溶的酪氨酸酶突变体的多肽，其中该酪氨酸酶突变体能够积聚在内质网中。优选地，该酪氨酸酶突变体对钙连接蛋白(calnexin)具有降低的亲合力。也优选的，该酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域或至少一个糖基化位点。最优选地，由SEQ ID No.1的多核苷酸或其变体，优选保守取代的变体或缺失片段编码该酪氨酸酶突变体。 

在相关方面，也描述编码黑色素瘤抗原的多核苷酸，其中该黑色素瘤抗原是能够积聚在内质网中的可溶酪氨酸酶突变体。优选地，编码黑色素瘤抗原的多核苷酸缺乏跨膜结构域或至少一个糖基化位点。也优选，该酪氨酸酶突变体对钙连接蛋白具有降低的亲合力。最优选地，本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO.1中所示的序列。 

本发明中还公开的是在此所描述的、包括能够积聚在内质网中的可溶酪氨酸酶突变体的免疫原性组合物。优选地，该可溶的酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域并且由SEQ ID No.1的多核苷酸或其变体编码。同样，也描述了包括编码可溶的酪氨酸酶突变体的多核苷酸和药物学上可接受的载体的疫苗。 

在另一个实施方案中，预期包括编码可溶的酪氨酸酶突变体的多核苷酸的宿主细胞。优选地，该多核苷酸包括SEQ ID No.1中描述的序列，或其变体。 

也描述了用于治疗黑色素瘤的方法，包括将多肽或编码可溶的酪氨酸酶突变体的多核苷酸施用于抗原-呈递细胞并引发细胞毒性淋巴细胞免疫应答，以及用于制备可溶的酪氨酸酶突变体的方法，包括构建 缺乏跨膜结构域的截短形式的人酪氨酸酶。 

附图简述 

图1.脉冲追踪试验表明可溶的酪氨酸酶保留在ER中并且在蛋白酶体中降解 

用[³⁵S]脉冲STcDNA转染的CHO细胞20min并且在缺乏(泳道1-8)或存在(泳道9-16)20μM乳胱素(lactacystine)时追踪标明的时段。用T311单克隆抗体免疫沉淀细胞裂解物并且将免疫沉淀样品一分为二，并用(+)或不用(-)EndoH消化。使样品在还原的10％SDS-PAGE凝胶上电泳并通过放射自显影显现。分子量标记物显示在该附图的右侧。 

图2.脉冲追踪实验表明从ER输出野生型(WT)酪氨酸酶 

用[³⁵S]脉冲WT转染细胞20min并且在缺乏(泳道1-4)或存在(泳道9-12)20μM乳胱素时追踪指明的时段。用EndoH消化来自泳道5-8的样品。用T311抗血清免疫沉淀细胞裂解物。使样品在10％SDS-PAGE凝胶上电泳并通过放射自显影显现。 

图3.脉冲追踪实验显示钙连接蛋白和钙网蛋白与WT和ST酪氨酸酶的缔合 

在用[³⁵S]脉冲20min前，使用ST(泳道1-10)或WT(泳道11-20)转染的CHO细胞在饥饿缓冲液中培养1h。然后追踪细胞标明的时段并且用抗-钙连接蛋白抗体(CNX)或抗-钙网蛋白抗体(CRT)，然后是抗-酪氨酸酶抗体(T311抗体)免疫沉淀细胞裂解物。使免疫沉淀在非还原的10％ SDS-PAGE凝胶上电泳并通过放射自显影显现。 

图4.脉冲追踪实验证明可溶的和野生型酪氨酸酶的折叠途径 

在用[³⁵S]脉冲20min前，使用ST(泳道1-6)或WT(泳道7-11)酪氨酸酶转染的CHO细胞在饥饿缓冲液中培养1h。然后追踪细胞标明的时段，并且用抗-酪氨酸酶抗体(T311抗体)免疫沉淀细胞裂解物。使免疫沉淀在非还原的或还原的10％ SDS-PAGE凝胶上电泳并通过放射自显影显现。 

图5.可溶的酪氨酸酶的核酸序列(SEQ ID NO.1) 

图6.脉冲追踪实验表明Tyrmut1保留在ER中。 

用[35S]脉冲Tyrmut1转染的细胞20分钟并且追踪2小时。用T311抗血清免疫沉淀细胞裂解物。将免疫沉淀一分为二并且用(+)或不用 (-)EndoH消化。使样品在10％ SDS-PAGE凝胶上电泳并通过放射自显影显现。 

图7.Western印迹实验显示Tyr_E2嵌合体保留在ER中。 

用Tyr_E2构建体转染细胞并且将细胞裂解物一分为二并用(+)或不用(-)EndoH消化。使样品在10％ SDS-PAGE凝胶上电泳，通过T311抗血清经ECL化学发光印迹和显现。 

优选实施方案的详细描述 

引言 

人酪氨酸酶是I型膜糖蛋白并且具有529个氨基酸，7个占据的N-糖基化位点，17个半胱氨酸残基集中在2个半胱氨酸-富集域，2个铜结合结构域和一个C-末端TM结构域(Ujvari等人，2001)。本发明人已经构建了缺乏跨膜(TM)结构域的截短形式的人酪氨酸酶。当缺少TM结构域时，ER内腔链不能折叠成为天然的构象。然而，当翻译速率减慢时，显示发生产生活性蛋白质的截短链的生产性折叠。在降低的温度也产生酶促活性的可溶酪氨酸酶，并且在两种情况下产生性的折叠在早期与CNX相互作用相关。这个证据支持TM结构域在折叠中和在转位子环境中保持链的作用，由此促进其与CNX相互作用。 

酪氨酸酶在形成肿瘤抗原的黑色素瘤细胞中组成性表达。野生型酪氨酸酶通过分泌途径运输并靶向黑素体。本发明人构建了在内质网(ER)终止运输的人酪氨酸酶突变体。然后错误折叠的蛋白质通过质量控制系统保留在ER中并且向后移位而在蛋白酶体中被降解。细胞质的降解作用后，所得到的肽经MHC I类分子被呈递至细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。因而，本发明的突变酪氨酸酶可作为设计增加针对黑色素瘤细胞的CTLs免疫应答的疫苗药物来用于黑色素瘤免疫疗法。 

虽然酪氨酸酶在正常的黑色素细胞、黑色素瘤细胞、和视网膜色素上皮细胞(RPE)中表达，递送编码本发明突变酪氨酸酶的核酸的疫苗仍然适于治疗黑色素瘤。因此，虽然疫苗药物可能靶向正常和异常的黑色素细胞，没有黑色素细胞人类仍可生存(Marks等人，Immunologic Research，27，409-425(2003))。例如，疫苗接种可能导致被称为白斑病的病症，一种不形成严重的健康问题的皮肤色素沉着紊乱。 

如在此所描述的黑色素瘤抗原或免疫原意味着能够在例如人类或 其它哺乳动物的患者中导致细胞毒性T细胞免疫应答的可溶酪氨酸酶突变体或其片段。优选地，该可溶的酪氨酸酶突变体保留在ER中并且缺乏跨膜结构域。 

术语黑色素瘤包括但不限于，黑色素瘤、转移性的黑色素瘤、来源于黑色素细胞或黑色素细胞相关痣细胞的黑色素瘤、恶性黑色素瘤、黑素上皮癌、黑肉瘤、原位黑色素瘤、表浅蔓延型黑色素瘤、结节状黑色素瘤、恶性着色斑型黑色素瘤、肢端色斑样黑色素瘤、侵袭性黑色素瘤或家族性的非典型痣和黑色素瘤综合症。 

组合物 

本发明中预期的是包括编码适于引发CTL免疫应答的可溶酪氨酸酶突变体的多核苷酸以及任选地药物学上合适赋形剂的免疫原性组合物。免疫原性组合物被递送至靶细胞后，本发明的表达的酪氨酸酶保留在内质网中、被降解、然后经用于抗原呈递的MHC I类被呈递到细胞表面上。优选地，该可溶的酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域。最优选地，该可溶的酪氨酸酶突变体包括SEQ ID NO.1所描述的核酸序列或其变体。 

本发明中也描述了缺乏一个或多个糖基化位点的酪氨酸酶突变体。预期这种突变体保留在ER中并且通过内质网相关的降解作用(ERAD)降解，因为它们不能与钙连接蛋白(其结合聚糖)相互作用并且产生错误折叠的多肽。这些糖基化突变体可能或可能不包括跨膜的结构域。可通过缺失或插入酪氨酸酶cDNA序列来获得其它的合适酪氨酸酶突变体，只要它们能够诱导ERAD。 

例如，在第81位缺乏一个聚糖(glycan)的酪氨酸酶突变体(Tyrmutl)保留在ER中。实际上，酪氨酸酶依赖于钙连接蛋白与聚糖的相互作用来正确折叠，因此防止聚糖附着在特异的残基可导致错误折叠和ER滞留。 

同样，认为白化病是酪氨酸酶错误折叠的疾病，因此由患有这种疾病的个体表达的酪氨酸酶保留在ER中。因为黑色素瘤的发病率在白化体中很低，这表明呈递于HLA复合物环境中的酪氨酸酶突变体破坏了针对由黑色素瘤细胞呈递的酪氨酸酶抗原的耐受性。 

其它的酪氨酸酶突变体可被包含ER滞留信号的另一个蛋白质的跨膜结构域锚定。这种嵌合的酪氨酸酶突变体产生具有ER滞留分布型 (profile)的蛋白质。另外这些突变体也可能缺乏至少一个糖基化位点。 

本发明也描述了编码由T细胞识别的新黑色素瘤抗原的核酸序列。在此公开的黑色素瘤抗原是优选保留在ER中并缺乏跨膜结构域的可溶的突变体酪氨酸酶或其片段。优选地，该核酸序列包括SEQ IDNo.1中描述的序列。 

在此也公开了包括编码本发明的酪氨酸酶突变体的核酸序列或其片段的黑色素瘤疫苗，或包括本发明的可溶酪氨酸酶突变体或来源于所述酪氨酸酶突变体的免疫原性肽的疫苗来用于治疗黑色素瘤。本发明的疫苗也可在药学上可接受的载体中给药。药学上可接受的载体一般包括本领域技术人员已知的载体，包括药物佐剂。一般地，这些药学上可接受的载体可包括水、盐水、缓冲液、和在例如，MERCK INDEX，Merck & Co.，Rahway，N.J.中描述的其他化合物。也参见BioreversibleCarriers in Drug Design，Theory and Application，Roche(ed.)，Pergamon Press，(1987)。在例如Gilman等人(eds)(1990)Goodman andGilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th Ed.，Pergamon Press；Novel Drug Delivery Systems，2nd Ed.，Norris(ed.)Marcel Dekker Inc.(1989)，and Remington′s Pharmaceutical Sciences中描述了各种因素，其中所完全公开的内容在此引入作为参考。 

可在人类之前，首先在动物模型中或非人类的灵长类中评估在此所描述的疫苗制剂。可使用常规方法评估患者的免疫应答以确定疫苗的效力。 

本发明也预期在本发明中所描述的多核苷酸和多肽的变体。在一个实施方案中，预期SEQ ID NO.1中公开的多核苷酸变体用于本发明。如在此所使用的″变体″被理解为是指改变自特定基因或蛋白质的标准的、或给定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语″同工型，″″同种型，″和″类似物″也指核苷酸或氨基酸序列的″变体″形式。可认为通过加入、除去或取代一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列，或核苷酸序列的变化是″变体″序列。变体可具有其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性的″保守的″变化，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。变体可具有″非保守的″变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的较小变化也可包括氨基酸缺失或插入，或两者皆有。可利用本领 域公知的计算机程序，例如Vector NTI Suite(InforMax，MD)软件发现确定哪些氨基酸残基可被取代、插入、或缺失的指导。 

根据本发明的保守变体一般保持酪氨酸酶突变体的整个分子结构。给出包括所公开的酪氨酸酶突变体的个别氨基酸的特性，一些合理的取代是明显的。可例如根据涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲特性中的相似性来产生氨基酸取代，即″保守取代″。 

例如：(a)非极性的(疏水性的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；(b)极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天门冬酰胺、和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；以及(d)带负电的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。一般可在组(a)-(d)内产生取代。此外，甘氨酸和脯氨酸可根据其使α-螺旋破坏的能力而相互取代。类似地，更通常在α-螺旋中发现某些氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，而更通常在β-折叠片层中发现缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸。通常在转角中发现甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺和脯氨酸。可在下列组中产生一些优选的取代：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。给出已知的遗传密码、和重组以及合成DNA的技术，技术熟练的科学工作者可容易地构建编码保守氨基酸变体的DNAs。 

″变体″也可指例如在Maxygen-转让的专利中描述的″改组的基因″(shuffled gene)。例如，本发明的变体可包括根据在U.S.6,132,970中公开的方法和原理所改变的序列和所需要的多核苷酸的变体，其在此全部引入作为参考。 

同样，本发明中公开的多核苷酸和多肽变体包括分别与编码可溶酪氨酸酶突变体或其片段的核酸、或可溶的酪氨酸酶突变体多肽或其片段具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性，或在低、中或高严谨条件下与编码可溶酪氨酸酶突变体或其片段的核酸杂交的多核苷酸和多肽。杂交方法是本领域技术人员公知的。(参见，例如，Ausubel等人(1997)Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York N.Y.，Units 2.8-2.11，3.18-3.19 and 4-6-4.9。)可选择其中完全互补的探针和靶可杂交，即各个碱基对必须与其互补碱基对相互作用的杂交条件。备选地，可选择其中探针和靶具有最多大约10％错配但仍能杂交的条件。可例如通过改变预杂交、杂交、和洗液中盐的浓度或通过改变杂交和洗涤温度来选择合适的条件。对于一些底物，可通过向预杂交和杂交溶液加入甲酰胺来降低温度。可在低严谨条件下用缓冲液，例如5×SSC，1％十二烷基磺酸钠(SDS)，于60℃进行杂交，其容许在包含一些错配的探针和靶序列之间进行杂交以形成探针/靶复合物。随后在更高严谨性下用缓冲液，例如0.2×SSC，0.1％ SDS，在45℃(中等严谨)或68℃(高严谨)进行洗涤，以只保持那些包含完全互补序列的探针/靶复合物的杂交。可通过利用例如SDS、十二烷基肌氨酸钠、或Triton X-100的去污剂，或例如鲑鱼精DNA的封闭剂减少背景信号。 

可任选地利用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制根据本发明所使用的疫苗和免疫原性组合物。因此，可配制其用于吸入或吹入给药(通过口腔或鼻)、或口服、颊、肠胃外或直肠给药。在优选的实施方案中，制备该药物组合物用于肠胃外给药。 

对于口服给药，本发明的组合物可采取通过传统方法制备的例如片剂或胶囊剂的形式，其中使用药学上可接受的赋形剂，例如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。可通过本领域公知的方法包被片剂。用于口服给药的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可作为干燥制品提供，用于在使用前用水或其它合适的载体进行配制(constitution)。可通过传统方法制备这种液体制剂，其中使用药物学上可接受的添加剂，例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如，杏仁油、油脂、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，甲基或丙基-p-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。该制剂也可酌情包含缓冲盐、调味剂、染料和甜味剂。 

可适当地配制用于口服给药的制剂以产生控释的活性化合物。对 于颊给药，该组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。 

为了通过吸入给药，借助于合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷射呈递的形式便利地递送本发明所述的酪氨酸酶突变体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门确定剂量单位以递送计量的数量。可配制用于吸入器或吹入器的例如白明胶的胶囊剂和药筒，其包含该化合物和例如乳糖或淀粉的合适粉末基体的粉末混合物。 

如上所述，优选配制本发明的可溶酪氨酸酶突变体用于通过注射，例如通过弹丸注射或连续输液进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如存在于加入防腐剂的安瓿中或多剂量容器中。该组合物可采取例如悬浮液、溶液或在油脂或含水载体中的乳化液形式，并且可包含例如悬浮、稳定和/或分散剂的配方试剂。备选地，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适载体，例如无菌无热原水进行配制。 

也可配制该化合物为直肠组合物，例如栓剂或滞留灌肠剂，例如包含常规的栓塞基质，例如可可脂或其它的甘油酯。 

除先前描述的制剂外，本发明的酪氨酸酶突变体也可配制为储存制剂(depot preparation)。可通过植入(例如皮下地或肌内地)或通过肌肉注射来施用这种长效制剂。因此例如可用合适的聚合或疏水性的物质(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂、或微溶的衍生物，例如微溶的盐来配制该化合物。 

如果需要该组合物可以在包装或分散装置中存在，其可包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。该包装可例如包括金属或塑料箔片，例如发泡包装。该包装或分散装置可伴随有用于给药的指导说明。 

本发明中也描述了包括本发明的可溶酪氨酸酶突变体蛋白质的核苷酸序列的DNA构建体。在优选的实施方案中，该酪氨酸酶核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸序列或其变体。 

重组蛋白质的生产是本领域公知的并且如下简要概述。 

通过将合适的翻译起始和终止信号与编码所需要蛋白质的结构DNA序列一起插入具有功能性启动子的可操作阅读框(phase)来构建用于细菌的有用表达载体。该载体可包括一个或多个表型可选择的标 记物和复制原点以保证载体的维持，并且如果需要，在宿主内提供扩增。用于转化的合适原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各种物种，不过其它属也可用作所选择的材料。在优选的实施方案中，原核宿主是大肠杆菌。 

细菌载体可以是以例如细菌噬菌体-、质粒-或粘粒-为基础的。这些载体可包括来源于商业购买的、一般包含公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)元件的质粒的可选择标记物和细菌复制起点。这种商品化的载体包括，例如GEM 1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)、pBs，phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNHl8a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540、和pRIT5(Pharmacia)。本发明所述的优选载体是pTriex(Novagen)。 

这些″骨架″部分与合适的启动子和待表达的结构序列组合。细菌启动子包括lac、T3、T7、λP_R或P_L、trp和ara。T7是优选的细菌启动子。 

转化合适的宿主菌株和使该宿主菌株生长至合适的细胞密度后，通过适当手段(例如温度变化或化学诱导)去抑制/诱导所选择的启动子，并且培养细胞另外的时段。一般通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破裂细胞，保留所得到的粗提物用于进一步纯化。 

也可使用各种哺乳动物细胞培养系统表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括选择的小鼠L细胞，例如胸苷激酶-阴性(TK)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶-阴性(APRT)的细胞。其它的实例包括由Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的猴肾脏成纤维细胞的COS-7系，和能够表达相容载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包括复制起点、合适的启动子和增强子、以及任何必须的核糖体结合位点、多聚腺苷酸位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列、和5′侧翼非转录序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40原点、早期启动子、增强子、拼接、和多聚腺苷酸位点可用来提供所需要的非转录遗传元件。 

哺乳动物启动子包括CMV即时早期、HSV胸苷激酶、早期和晚 期SV40、来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。例证性的哺乳动物载体包括pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXTl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL(Pharmacia)。在优选的实施方案中，哺乳动物表达载体是pTriex。 

在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多以病毒为基础的表达系统。如果使用腺病毒作为表达载体，可将所感兴趣的编码序列连接至腺病毒转录/翻译调控复合物，例如晚期启动子和三重前导序列。然后可通过体外或体内重组将这个嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必要区域(例如，E1或E3区)将产生可存活并且能够在感染的宿主中表达靶蛋白质的重组病毒。(例如，参见Logan等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。 

本发明的核酸序列也适于用作检测正常和疾病组织中酪氨酸酶表达的探针。因此，本发明的另一个方面涉及检测生物样品中编码酪氨酸酶的mRNA的生物测定，其包括在容许核酸和样品mRNA之间杂交的条件下使样品与核酸序列接触，然后检测该复合物。 

也可通过多种技术进行生物测定中复合物的检测。可通过一些常规的标记技术来实现通过信号放大检测复合物，包括放射性标记和酶(Sambrook等，(1989)in″Molecular Cloning，A Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.；Ausubel等人，(1987)in″Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NewYork N.Y.)。也可商业购买放射性标记试剂盒。用作生物测定中的探针的突变酪氨酸酶核酸序列可以是RNA或DNA。优选的方法是用Klenow酶或多核苷酸激酶用³²P标记DNA序列。优选的方法是利用RNA聚合酶用³²P或³⁵S标记RNA或核糖探针(riboprobe)序列。此外，存在用于信号放大的已知的非放射性技术，包括使化学部分附着于嘧啶和嘌呤环的方法(Dale，R.N.K.等人(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.，70：2238-2242；Heck，R.F.(1968)S.Am.Chem.Soc.，90：5518-5523)、容许通过化学发光检测的方法(Barton，S.K.等(1992)J.Am.Chem.Soc.，114：8736-8740)以及利用生物素酰化的核酸探针的方法(Johnson，T，.K.等人(1983)Anal.Biochem.，133：125-131；Erickson，P.F.等人(1982)J.of Immunology Methods，51：241-249；Matthaei，F.S.等(1986)Anal.Biochem.，157：123-128)和容许利用可商业购买的制品荧光检测的方 法。也可商业购买非放射性的标记试剂盒。 

可用于这种生物测定的生物样品实例包括但不限于原代哺乳动物培养物、连续的哺乳动物细胞系，例如黑色素细胞系，哺乳动物器官，例如皮肤或视网膜，组织、活检标本、肿瘤、病理学样本、以及尸体解剖样本。 

在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸、多肽及其变体可用于制备针对可溶酪氨酸酶抗原的单克隆抗体。例如可在借助于免疫组织染色的酪氨酸酶检测中使用这些抗体。因此，本发明的抗体可用作诊断试剂。 

单克隆抗体(MAbs)是针对特定抗原的抗体的同质群体并且该抗体只包括一个类型的抗原结合位点且只结合抗原决定簇上的一个表位。可通过本领域技术人员已知的方法获得特异抗原的啮齿类单克隆抗体。参见例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和Coligan等人(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，VOL.1，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)。 

治疗的方法 

本发明也公开了用于治疗黑色素瘤的方法，包括施用改进的酪氨酸酶cDNA。在此所描述的改进的酪氨酸酶是保留在转染/转导的抗原呈递细胞(APC)的ER中的可溶酪氨酸酶突变体。然后加工这种蛋白质并且由此衍生而来的抗原性肽与APCs上的HLA分子形成复合物。然后由靶向异常细胞用于进行裂解的细胞毒性T细胞识别这些复合物。 

在优选的实施方案中，将可溶酪氨酸酶的DNA递送至表达可溶酪氨酸酶并且在HLA复合物环境中呈递酪氨酸酶抗原性肽的专门的抗原-呈递细胞(例如，树突状细胞)。这可加强破坏针对由黑色素瘤细胞呈递的酪氨酸酶抗原的耐受性的特异CTL克隆的激发(priming)。 

正如上文所讨论的，在此描述用于治疗黑色素瘤的疫苗。可通过常规方法进行疫苗接种。例如，可将免疫原用于例如盐水或水的合适稀释剂，或完全的或不完全佐剂中。进一步地，该免疫原可能或可能不结合载体以使得蛋白质变得免疫原性。这种载体分子的实例包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素等。免疫原也可与脂蛋白结合或以脂质体形式或与佐剂一起给药。 可通过任何适于抗体产生的途径，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下等施用该免疫原。可一次或以周期性的间隔施用该免疫原直到产生显著滴度的抗-酪氨酸酶免疫细胞或抗-酪氨酸酶抗体。可通过在免疫之前和之后经CTL前体分析测定(Coulie，P.等人，(1992)InternationalJournal Of Cancer 50：289-297)测量针对酪氨酸酶抗原的前体CTL(细胞毒的T淋巴细胞)的频率来评估抗-酪氨酸酶免疫细胞的存在。 

本发明的疫苗或免疫原的给药可用于治疗性的目的。在发病时(或在发病后不久)或在出现该疾病的任何症状时提供免疫原。免疫原的治疗性给药是用来削弱该疾病。 

举例来说，可使用利用重组的可溶酪氨酸酶蛋白质或肽的表达载体制备的疫苗。为了给个体提供疫苗，如上所述将编码可溶酪氨酸酶突变体核酸序列的全部或部分的基因序列插入表达载体，并且导入待免疫的哺乳动物。可用于上述疫苗的载体实例包括但不限于、缺陷型反转录病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、禽痘病毒载体、或其它的病毒载体(Mulligan，R.C.，(1993)Science 260：926-932)。可在黑色素瘤的任何迹象前或在为黑色素瘤所苦的哺乳动物中介导疾病退化前，将携带全部或部分的可溶酪氨酸酶突变核酸序列的病毒载体导入哺乳动物。将该病毒载体施用进入哺乳动物的方法的实例包括但不限于，使细胞暴露于离体病毒，或将逆转录病毒或病毒的生产细胞系注射进入感染的组织或静脉内施用该病毒。备选地可通过直接注射进入黑色素瘤病变或在药学上可接受的载体中局部应用来局部施用携带全部或部分的可溶酪氨酸酶核酸序列的病毒载体。优选地，在SEQ IDNO.1及其变体中提供适合用于本发明的可溶的酪氨酸酶核酸。有待给药的携带全部或部分突变酪氨酸酶核酸序列的病毒载体的数量是以病毒颗粒的滴定度为基础的。举例来说，有待施用的免疫原的范围是每个哺乳动物，优选人10⁵-10¹³个病毒颗粒。 

免疫后，可通过识别该抗原的抗体或免疫细胞的产生来评估疫苗的效力，例如通过特异的溶解活性、特异的细胞因子产生或肿瘤退化来进行评估。本领域的技术人员已知评估上述参数的常规方法。如果有待免疫的哺乳动物已经为黑色素瘤所苦，可结合其它的治疗施用该疫苗。其它治疗方案的实例包括过继T细胞免疫疗法和共施用细胞因子或针对黑色素瘤的其它治疗药物。 

制备方法 

在此所描述的是用于制备可溶酪氨酸酶突变体的方法，包括构建截短形式的人酪氨酸酶。在优选的实施方案中，该酪氨酸酶突变体对钙连接蛋白具有降低的亲合力。也优选该酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域和/或缺失至少一个糖基化位点。更优选该酪氨酸酶突变体是由SEQ ID No.1的多核苷酸或其变体编码的。 

进一步参考仅提供用作例证说明的下列实施例描述本发明。本发明不限于该实施例而是包括明显来自在此提供的教导的所有变化。 

实施例 

实施例1.材料和方法 

将CHO细胞(欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collectionof Animal Cell Cultures)，Porton Down，英国(UK))和K42细胞(来自Dr.T.Elliott，University of Southampton和Dr.M.Michalak，Universlty Alberta的惠赠)培养在含有10％胎牛血清(FCS，Sigma，Poole，Dorset，UK)，50单位/ml青霉素，和50mg/ml链霉素(LifeTechnologies，Inc.)的RPMI 1640培养基中(Life Technologies，Inc.，Paisley，苏格兰)，并维持在37℃和5％CO₂条件下。小鼠单克隆抗-酪氨酸酶抗体(T311抗体)来自于NeoMarkers(Fremont，美国)。兔多克隆抗-钙连接蛋白抗体由Dr.J.Bergeron(McGill University)惠赠。兔抗-钙网蛋白抗体(钙网蛋白(calregulin)C-17抗体)购自SantaCruz Biotechnology。NB-DNJ是来自Searle/Monsanto(St.Louis，MO)的赠品。放射性标记的[³⁵S]甲硫氨酸/半胱氨酸来自于I.C.N.Flow，(Thame，Oxfordshire，UK)。CHAPS(3-[3-胆酰胺基丙基]-二甲氨基-1-丙磺酸盐)来自Pierce Chemicals Co。乳胱素(lactacystine)来自Calbiochem。所有的其它化学制品来自Sigma Chemicals Co.(St.Louis，MO)。 

实施例2.酪氨酸酶突变体的构建 

在pcTyr克隆载体中编码人酪氨酸酶的全长cDNA是来自Dr.V.J.Hearing(NCI，National Institute of Health，Bethesda，MD)的赠品。利用pcTyr作为模板和下列引物通过PCR扩增WT酪氨酸酶cDNA和WT内腔结构域(456aa)cDNA(ST)： 

正向引物5′-GCTATACCATGGCCCTCCTGGCTGTTTTG-3 

WT反向引物：5’-GGCGCGCCTCGAGTAAATGGCTCTGATA-3’ 

ST反向引物：5’-GTATTCTCGAGCCGACTCGCTTGTTC-3’ 

用NcoI和XhoI消化PCR产物并且伴随6个His Tag克隆到pTriexl(Novagen)的读框中用于哺乳动物表达。通过自动的DNA测序证实序列。 

CHO细胞的转染和新陈代谢标记 

在6-孔板中培养对数生长期的CHO细胞用于转染并利用脂质转染胺Lipofectamine Plus(Invitrogen)瞬时表达酪氨酸酶cDNA。转染后24小时收获细胞，刮下并沉淀细胞。对于新陈代谢标记，使转染的CHO细胞(10⁷个细胞/ml)在无半胱氨酸-/甲硫氨酸-的培养基中饥饿1小时，用100-150μCi[³⁵S]半胱氨酸/甲硫氨酸脉冲标记20分钟，并且追踪特定的时间。追踪后立即在冷的PBS中收获细胞并且在20mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)中培养30分钟以烷基化游离的巯基。然后用CHAPS裂解缓冲液(50mM HEPES缓冲液pH 7.5，其含有2％CHAPS，200mM NaCl和包含亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、乙二胺四乙酸钠、苯丁抑制素、AEBSF和E-64的0.5％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))裂解细胞。 

免疫沉淀和SDS-PAGE 

离心[³⁵S]标记的细胞裂解物，使上清液与T311抗体(1∶50)，或与抗-钙连接蛋白抗体(1∶100)在4℃孵育过夜。然后加入20μl蛋白A琼脂糖，并且在4℃孵育细胞裂解物1小时。用HEPES缓冲液中的0.5％ CHAPS洗涤匀浆3次。通过在具有(还原条件)或没有5％2-巯基乙醇(非还原条件)的SDS样品缓冲液中煮沸匀浆5分钟来洗提酪氨酸酶。对于共-免疫沉淀研究，用抗-钙连接蛋白抗体(1∶100)来免疫沉淀裂解物，并且用1％ SDS洗提洗涤的匀浆，用裂解缓冲液稀释10倍，并用T311再沉淀。在天然或还原条件洗提结合的蛋白质并在10％的SDS-PAGE凝胶上分析。然后通过放射自显影显示凝胶。 

DOPA氧化酶测定 

DOPA氧化酶测定测量酪氨酸酶的第二催化活性，即借助于DOPA 奎宁使L-DOPA转化为DOPAchrom。利用L-DOPA作为酶底物在凝胶中进行测定(Negroiu等人，2000)。使转染后24h收获的粗制裂解物或转染细胞的细胞培养物培养基在天然条件下通过SDS-PAGE电泳并且在2.5mg/ml L-DOPA中孵育以显现酪氨酸酶活性。 

免疫印迹 

如所描述的(Branza-Nichita等人，1999)使来自用不同cDNA′s转染的裂解CHO细胞的蛋白质在10％丙烯酰胺凝胶中电泳分离并且转移至immobilon膜(Amersham International，Amersham，UK)。 

为了分离分泌的酪氨酸酶，用镍-次氮基三乙酸-超流珠(Ni-NTA)(Qiagen，Chatsworth，CA)在4℃孵育培养基过夜。沉淀珠子，用20mM咪唑洗涤3次并且用还原的SDS样品缓冲液洗提。如上通过SDS-PAGE分离所得到的样品。用5％牛奶，0.1％ Tween中的1∶250稀释度的抗-酪氨酸酶抗体(T311)在37℃孵育印迹2小时。根据制造商的方法通过增强的化学发光Western印迹(ECL，Amersham Corp.)检测免疫活性。 

实施例3.可溶的酪氨酸酶突变体缺乏酶活性，在ER中积聚并且在蛋白酶体中降解 

通过脉冲追踪分析体内监测可溶酪氨酸酶突变体的成熟，并且用单克隆抗-酪氨酸酶抗体(T311)免疫沉淀。将样品一分为二，取各样品的一半用Endo H限制性内切酶消化，并且在还原的SDS-PAGE凝胶中紧邻于未消化的对照进行电泳(图1)。因为Endo H只消化高-甘露糖和杂种N-聚糖，使用Endo H的灵敏性监测聚糖从高-甘露糖到复合物结构的成熟。用Endo H消化将该集合物减少至在55kD电泳的多肽。在追踪的5h期间，前体具有相同的电泳迁移率并且保持完全Endo H敏感，表明其N-聚糖没有在高尔基体中被加工成复合物结构(图1，泳道1、3、5、7)。观察到合成1h后免疫沉淀蛋白质的数量趋向于逐步减少(图1)。 

为了确定这是否与内质网中的链滞留和随后的降解作用一致，我们在存在蛋白酶体抑制剂时进行相同的实验。对于全部的追踪时段在存在乳胱素时相对于未处理的样品观察到免疫沉淀物质数量的增加(图1)。乳胱素处理的样品的Endo H消化模式与未处理的相似(图1，泳道9、11、13、15)，表明ST保留在ER中并且最终被靶向在蛋 白酶体中进行降解。 

为了比较ST与野生型蛋白质的成熟，我们在相同条件中表达被克隆到相同载体中的膜酪氨酸酶(WT)(图2)。如通过Endo-H消化实验所示，在大约1h的追踪中合成的WT为得到复合型聚糖的75kD蛋白质。复合物对高-甘露糖聚糖的减少比率反映了酪氨酸酶在这个系统中的过表达并且先前已有报道(Berson等人，2000)。如先前所显示的(Halaban等，1997；Toyofuku等人，2001)，用乳胱素处理导致在追踪的第一个3h中未降解蛋白质的积聚，表明至少在成熟初期，膜酪氨酸酶在蛋白酶体中降解。 

与WT酪氨酸酶相反，缺乏对由可溶形式显示的复合物聚糖的加工表明糖蛋白的不完全成熟。这可能与其不能获得天然的构象相关。为了阐明这个问题，我们通过DOPA氧化酶测定确定ST突变体的酶活性。ST突变体在细胞裂解物或培养基中是完全失活的。这与能够使酶底物DOPA转化为DOPA chrome的WT酪氨酸酶相反。因此，ST链发展成为缺乏生物活性的非天然构象。 

实施例4.可溶的和野生型的酪氨酸酶显示不同的陪伴分子相互作用模式和折叠途径 

为了检验钙连接蛋白和钙网蛋白在ST折叠中的作用，我们用代谢标记的转染细胞裂解物的抗-CNX/抗-CRT和抗-酪氨酸酶抗体进行连续的免疫沉淀实验。在追踪的最初30min，存在ST与CNX(图3，泳道1、2)和CRT(图3，泳道6、7)的非常弱的相互作用。从1h-追踪起，该相互作用变得可见并且3h后与CNX(图3，泳道3-5)和CRT(图3，泳道8-9)的相互作用增加到最大水平。 

对与来自折叠极早阶段的CNX相互作用的WT酪氨酸酶观察到不同的模式，并且在1h-追踪显示显著的降低(图3，泳道11-13)。在脉冲周期结束时，CRT与WT新生链的弱相互作用是明显的(图3，泳道6)。 

为了表征WT和突变酪氨酸酶的折叠途径，我们在转染的脉冲追踪的CHO细胞中进行免疫沉淀实验，并通过非还原的SDS-PAGE凝胶分析样品。这些条件容许我们追踪二硫键的形成，其与导致在凝胶中加速链迁移率的更紧密构象是同步的(Branza-Nichita等人，1999，Hebert等人，1995)。 

如从0到5h的追踪中迁移率变换的递增所示，在非生产性的折叠途径中ST通过至少3个氧化中间产物折叠(图4，泳道1-6)。与还原样品相比第一个中间产物出现在脉冲后(0min-追踪)，而在3h-追踪观察到最后的中间产物，其与截短的酪氨酸酶的加速降解加工有关。 

通过分析WT蛋白质折叠，我们可区分2种氧化中间产物。如其与还原样品相似的迁移速度所示，第一个没有被完全氧化(图4，泳道7、12)。在30min时段期间，链被氧化为未被进一步氧化的第二中间产物(图4，泳道8)。第二中间产物的出现与聚糖复合物结构的出现和在1h CNX相互作用的剧烈减少有关，表明该链已经获得有能力输出的构象并且到达高尔基体间隔。因为还原的ST(图1，泳道2、4、6、8)和WT脉冲追踪样品(图2，泳道1-4)在追踪时段期间显示均一的迁移率，非还原凝胶中的漂移完全是由于不同的氧化中间产物。在非还原的条件中，对于ST和WT都可在折叠早期看到聚集物和二硫化物二聚体(图4)。这些形式在最后的追踪点和还原条件中是不存在的，表明在折叠期间形成混合的二硫化物中间产物。该数据表明ST折叠为非天然构象比WT长5倍，并且在降解前形成晚期氧化的中间产物。 

实施例5.TM结构域是为链的产生性折叠所需要的 

为了研究折叠如何受跨膜结构域存在的影响，我们已经使用I型膜糖蛋白-酪氨酸酶-作为模型，并与其中缺失了TM结构域的构建体比较其折叠途径。酪氨酸酶是调节哺乳动物中色素合成的黑素生成酶(Petrescu等人，1997)。我们先前已经证明其折叠依赖于糖基化(Branza-Nichita等人，1999，2000)。 

从代谢标记的转染CHO细胞的非还原SDS-PAGE结果，我们表明可溶的构建体成熟为保留在ER中并最终在蛋白酶体中降解的非天然构象。与用WT转染的细胞相对比，这与用ST转染的细胞中缺乏酶活性有关。有趣地，可溶的形式与WT相比采用增加数目的氧化中间产物。 

两种形式的酪氨酸酶的折叠途径也在其与CNX和CRT的缔合模式方面有差异。从早期开始直到折叠加工完成，膜-锚定链受到CNX的帮助。我们先前已经报道对于小鼠膜酪氨酸酶相似的钙连接蛋白依 赖的折叠伴随有2种氧化中间产物的发生(Branza-Nichita等人，1999；Branza-Nichita等人，2000)。相反，对于CNX和CRT的截短酪氨酸酶的亲合力开始极低，在降解作用前，向着加工结束而增加。在缺乏CNX/CRT相互作用(可能伴随有其它ER折叠因子的协助)时，出现ST的总共3种折叠中间产物中的至少2种。这些中间产物不能达到天然的折叠，意味着它们已经获得异常的二硫桥键。两种硫还原酶显示在ER中在二硫桥键形成期间与新生链相互作用，-PDI和Erp57(Farmery等人，2000；Mezghrani等人，2001)。当这与CNX相缔合时，Erp57与链相互作用(Frickel等人，2002)。有可能硫还原酶也催化在膜酪氨酸酶中形成S-S键。相反地当缺少CNX和Erp57时，开始生产可溶形式的氧化中间产物，并且不能通过其稍后与陪伴分子的相互作用挽救该链为天然的构象，即使钙连接蛋白和钙网蛋白在这个阶段都显示与其缔合在一起。在具有区分正确折叠和错误折叠链的质量控制循环的这个阶段，在折叠和降解之间存在脆弱的平衡。错误折叠多肽被GT再葡糖基化并且被CNX/CRT驱动进入循环(Sousa和Parodi，1995)。许多可溶的或膜-结合的蛋白质已经显示在被靶向降解前与CNX或CRT缔合在一起(Ellgaard和Helenius，2001)。 

这些数据表明在折叠的后期阶段错误折叠的ST的再葡糖基化增加，因此存在与CNX和CRT缔合的增加-这与该链刚好在降解前崩塌为具有异常二硫化物的构型相符。实际上它不是被氧化为最后中间产物的全部的酪氨酸酶汇集库；更确切地，一些链被靶向更早期的降解。对于最后的2个追踪点，截短链的异常折叠和降解几乎同时发生。这表明钙连接蛋白循环中不正确折叠的链被直接送至向后移位结构。总而言之这些资料表明TM结构域是酪氨酸酶产生性折叠的关键。 

看来TM结构域似乎在这个加工中通过增加转位子区域中所花费的时间，通过插入相关事件并且通过阻止蛋白质从该区域迅速扩散而发挥关键的作用。也值得注意就所有情况而论，产生性的(productive)折叠途径通常比非产生性的途径包括较少的中间产物，而与加工的长度无关。基本上，当在早期形成非天然二硫化物时，该链可比天然的途径中采用更多的构象，而产生一些可能最终被靶向降解的氧化中间产物。因此折叠期间中间产物数目的增加可能是导致非天然折叠途径的指示。在这种情况下，与钙连接蛋白相互作用可被更确切地描述为 早期的降解作用而不是晚期的折叠。 

实施例6.膜结合的酪氨酸酶糖基化突变体 

在第86位构建缺乏共有序列Asn-Arg-Thr的酪氨酸酶突变体。这通过突变Asn 86为Gln，由此改变sequon为Gln-Arg-Thr而实现。突变体Tyrmutl的ER滞留通过其EndoH消化模式显示在图6中。 

实施例7.通过包含ER滞留信号的跨膜结构域锚定的膜结合酪氨酸酶 

利用丙型肝炎病毒包膜蛋白质(HCV E2)的跨膜结构域和酪氨酸酶胞外结构域构建酪氨酸酶嵌合蛋白质(TyrE2)。如图7所示，表达TyrE2嵌合体的细胞裂解物的EndoH消化产生具有ER滞留分布型的蛋白质。 

举例说明的实施方案 

附加的实施方案是在本发明的范围之内。例如，进一步通过下列编号的实施方案说明本发明： 

1.包括可溶的酪氨酸酶突变体的多肽，其中所述的酪氨酸酶突变体能够积聚在内质网中。 

2.实施方案1的酪氨酸酶突变体，其中该可溶的酪氨酸酶突变体对钙连接蛋白具有降低的亲合力。 

3.实施方案2的酪氨酸酶突变体，其中该可溶的酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域。 

4.实施方案2的酪氨酸酶突变体，其中通过SEQ ID No.1的多核苷酸或其变体编码该可溶的酪氨酸酶突变体。 

5.实施方案2的酪氨酸酶突变体，其中该可溶的酪氨酸酶突变体缺乏至少一个糖基化位点。 

6.包括能够在内质网中积聚的可溶的酪氨酸酶突变体的免疫原性组合物。 

7.实施方案6的免疫原性组合物，其中通过SEQ ID No.1的多核苷酸或其变体编码该可溶的酪氨酸酶突变体。 

8.编码黑色素瘤抗原的多核苷酸，其中黑色素瘤抗原是能够积聚在内质网中的可溶的酪氨酸酶突变体。 

9.实施方案8的多核苷酸，其中该可溶的酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域。 

10.实施方案9的多核苷酸，其中通过SEQ ID NO.1中所示的序列或其变体编码该可溶的酪氨酸酶突变体。 

11.包括编码可溶的酪氨酸酶突变体的多核苷酸和药学上可接受的载体的疫苗。 

12.实施方案11的疫苗，其中该多核苷酸包括SEQ ID No.1中所示的序列或其变体。 

13.包括编码可溶的酪氨酸酶突变体的多核苷酸的宿主细胞。 

14.实施方案13的宿主细胞，其中该多核苷酸包括SEQ ID NO.1所示的序列或其变体。 

15.用于治疗黑色素瘤的方法，包括将编码可溶的酪氨酸酶突变体的多核苷酸施用于抗原-呈递细胞并且引发细胞毒的淋巴细胞免疫应答。 

16.实施方案15的方法，其中该可溶的酪氨酸酶突变体积聚在细胞的内质网中。 

17.实施方案16的方法，其中该可溶的酪氨酸酶突变体缺乏跨膜结构域。 

18.用于制备可溶的酪氨酸酶突变体的方法，包括构建截短形式的人酪氨酸酶，其中该酪氨酸酶缺乏跨膜结构域。 

在本说明书中引用的所有出版物和专利申请以及专利在此全部并入作为参考。 

序列表

<110>UNITED THERAPEUTICS CORPORATION

<120>酪氨酸酶突变体及其使用方法

<130>080618-0356

<140>PCT/US2004/033048

<141>2004-10-07

<150>60/508,879

<151>2003-10-07

<160>5

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>1425

<212>DNA

<213>智人

<400>1

atgctcctgg ctgttttgta ctgcctgctg tggagtttcc agacctccgc tggccatttc   60

cctagagcct gtgtctcctc taagaacctg atggagaagg aatgctgtcc accgtggagc  120

ggggacagga gtccctgtgg ccagctttca ggcagaggtt cctgtcagaa tatccttctg  180

tccaatgcac cacttgggcc tcaatttccc ttcacagggg tggatgaccg ggagtcgtgg  240

ccttccgtct tttataatag gacctgccag tgctctggca acttcatggg attcaactgt  300

ggaaactgca agtttggctt ttggggacca aactgcacag agagacgact cttggtgaga  360

agaaacatct tcgatttgag tgccccagag aaggacaaat tttttgccta cctcacttta  420

gcaaagcata ccatcagctc agactatgtc atccccatag ggacctatgg ccaaatgaaa  480

aatggatcaa cacccatgtt taacgacatc aatatttatg acctctttgt ctggatgcat  540

tattatgtgt caatggatgc actgcttggg ggatctgaaa tctggagaga cattgatttt  600

gcccatgaag caccagcttt tctgccttgg catagactct tcttgttgcg gtgggaacaa  660

gaaatccaga agctgacagg agatgaaaac ttcactattc catattggga ctggcgggat  720

gcagaaaagt gtgacatttg cacagatgag tacatgggag gtcagcaccc cacaaatcct  780

aacttactca gcccagcatc attcttctcc tcttggcaga ttgtctgtag ccgattggag  840

gagtacaaca gccatcagtc tttatgcaat ggaacgcccg agggaccttt acggcgtaat  900

cctggaaacc atgacaaatc cagaacccca aggctcccct cttcagctga tgtagaattt  960

tgcctgagtt tgacccaata tgaatctggt tccatggata aagctgccaa tttcagcttt 1020

agaaatacac tggaaggatt tgctagtcca cttactggga tagcggatgc ctctcaaagc 1080

agcatgcaca atgccttgca catctatatg aatggaacaa tgtcccaggt acagggatct 1140

gccaacgatc ctatcttcct tcttcaccat gcatttgttg acagtatttt tgagcagtgg 1200

ctccgaaggc accgtcctct tcaagaagtt tatccagaag ccaatgcacc cattggacat 1260

aaccgggaat cctacatggt tccttttata ccactgtaca gaaatggtga tttctttatt 1320

tcatccaaag atctgggcta tgactatagc tatctacaag attcagaccc agactctttt 1380

caagactaca ttaagtccta tttggaacaa gcgagtcgga tctaa                 1425

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>2

gctataccat ggccctcctg gctgttttg                                     29

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>3

ggcgcgcctc gagtaaatgg ctctgata                                      28

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>4

gtattctcga gccgactcgc ttgttc                                        26

<210>5

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：合成的6-His tag

<400>5

His His His His His His

  1               5

Claims (7)

1.包括酪氨酸酶突变体的多肽，其中所述的酪氨酸酶突变体能够积聚在内质网中，具有对钙连接蛋白的降低的亲合力，并且缺乏跨膜结构域，其中通过SEQ ID No.1的多核苷酸编码所述的酪氨酸酶突变体。

2.一种免疫原性组合物，其包括能够在内质网中积聚，具有对钙连接蛋白的降低的亲合力，并且缺乏跨膜结构域的酪氨酸酶突变体，其中通过SEQ ID No.1的多核苷酸编码所述的酪氨酸酶突变体。

3.编码黑色素瘤抗原的多核苷酸，其中黑色素瘤抗原是能够积聚在内质网中，具有对钙连接蛋白的降低的亲合力、缺乏跨膜结构域的酪氨酸酶突变体，其中通过SEQ ID No.1所示的序列编码所述的酪氨酸酶突变体。

4.一种疫苗，其包括(i)编码酪氨酸酶突变体的多核苷酸和(ii)药学上可接受的载体，所述酪氨酸酶突变体能够在内质网中积聚，具有对钙连接蛋白的降低的亲合力，并且缺乏跨膜结构域，其中所述的多核苷酸由SEQ ID No.1所示的序列组成。

5.一种宿主细胞，其包括编码酪氨酸酶突变体的多核苷酸，所述酪氨酸酶突变体能够在内质网中积聚，具有对钙连接蛋白的降低的亲合力，并且缺乏跨膜结构域，其中所述的多核苷酸由SEQ ID No.1所示的序列组成。

6.权利要求3的多核苷酸在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

7.用于制备酪氨酸酶突变体的方法，包括构建截短形式的人酪氨酸酶，其中该酪氨酸酶突变体具有对钙连接蛋白的降低的亲合力，并且缺乏跨膜结构域，其中通过SEQ ID No.1所示的序列编码所述的酪氨酸酶突变体。

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