ES2329904T3 - Mutante de tirosinasa y procedimientos de utilizacion del mismo. - Google Patents
Mutante de tirosinasa y procedimientos de utilizacion del mismo. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2329904T3 ES2329904T3 ES04794411T ES04794411T ES2329904T3 ES 2329904 T3 ES2329904 T3 ES 2329904T3 ES 04794411 T ES04794411 T ES 04794411T ES 04794411 T ES04794411 T ES 04794411T ES 2329904 T3 ES2329904 T3 ES 2329904T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tyrosinase
- mutant
- domain
- transmembrane
- lacks
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Polipéptido que comprende un mutante de tirosinasa, en el que el mutante de tirosinasa es capaz de acumularse en el retículo endoplasmático y (a) el mutante de tirosinasa es enzimáticamente activo y carece de un dominio transmembranal, o (b) el mutante de tirosinasa carece de un dominio transmembranal de tirosinasa aunque contiene un dominio transmembranal de una proteína que no es la tirosinasa.
Description
Mutante de tirosinasa y procedimientos de
utilización del mismo.
La presente invención se refiere a mutantes de
tirosinasa según las reivindicaciones 1 y 25. En particular, la
presente invención describe mutantes de tirosinasa y la utilización
de los mismos para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento del melanoma.
La incidencia del melanoma maligno está
creciendo más rápidamente que cualquier otro tipo de cáncer humano
en Norteamérica (Armstrong et al., Cancer Surv.
19-20:219-240, (1994)). Aunque el
melanoma es un cáncer curable, el tumor primario debe extirparse en
un estadio muy temprano de la progresión de la enfermedad, es
decir, antes de que se haya extendido a sitios distantes. La
presencia de micrometástasis puede conducir, y con frecuencia
conduce, a metástasis sintomáticas eventuales. De esta manera,
existe la necesidad de diseñar un procedimiento terapéutico para el
tratamiento del melanoma.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los
inventores investigaron la ruta de plegamiento del dominio globular
de la tirosinasa en presencia y en ausencia del dominio
transmembranal de la tirosinasa. La tirosinasa (monofenol,
3,4-dihidroxifenilalanina: oxígeno oxidorreductasa,
EC 1.14.18.1) es una glucoproteína membranal de tipo I cuya
maduración en presencia del control de calidad del ER ha sido bien
documentada (Petrescu et al. 2000; Halaban et al.
1997, Toyofuku et al. 2001, Branza-Nichita
et al. 2000). La tirosinasa es generalmente exclusiva de las
células productoras de pigmento (melanocitos) y es un antígeno de
diferenciación en el melanoma. La presente invención se refiere a
mutantes de tirosinasa retenidos en el ER. Estos mutantes resultan
degradados por proteasomas y presentados sobre la superficie
celular por moléculas del MHC de clase I.
El mutante de tirosinasa descrito por Simonova
et al. (Cancer Research 60:23, 6656-6662,
2000) no resulta retenido dentro del ER sino que, por el contrario,
resulta secretado. Debido a que dicho mutante es activo, puede
producir radicales libres tóxicos y puede utilizarse como profármaco
que se autoactiva y elimina células. Lo anterior contrasta con el
mutante de la presente invención, que resulta retenido en la ruta
secretoria temprana y es inactivo; es incapaz de producir melanina
ni radicales libres de efectos tóxicos. El mutante de tirosinasa de
la presente invención activa el sistema inmunológico y las células
del sistema inmunológico que, a su vez, eliminan células de
melanoma, evitando simultáneamente cualquier toxicidad que
produciría un profármaco.
Halaban et al. (PNAS 97:11,
5889-5894, 2000) describen tres mutantes de
tirosinasa que resultan retenidos en el ER; dicho documento no
describe un mutante de tirosinasa que carece de su dominio
transmembranal y que no interacciona con calnexina.
Halaban et al. (J. Investigative
Dermatology 119:2, 481-488, 2002) describen mutantes
de tirosinasa por deleción de glucosilación de sitio único. Dicho
documento no describe un mutante por glucosilación preparado
mediante la mutación de Asn en la posición 86. Además, no se dan a
conocer mutantes que no presentan el dominio transmembranal y que
no interaccionan con calnexina.
Dichos documentos no se refieren a la
presentación de antígenos de tirosinasa para el tratamiento del
melanoma.
Woelfel et al. (International J. Of
Cancer 88:3, 432-438, 2000) describen la
presentación independiente de transportador y de proteasoma del
péptido 1-9 de la tirosinasa por parte del
HLA-A2.1. El péptido 1-9 derivado
de la secuencia de señal se considera un candidato para
inmunoterapia específica.
La presente invención proporciona mutantes de
tirosinasa que presentan la capacidad de inducir una respuesta
inmunológica mejorada para el tratamiento del melanoma.
El plegamiento de las glucoproteínas solubles y
unidas a membrana en las células eucarióticas se inicia durante la
traslocación de la cadena polipeptídica naciente hacia el interior
de la luz del ER a través del poro del traslocón (Hardesty et
al. 1999). El proceso continúa después de la traducción en
etapas repetidas de plegamiento y replegamiento en presencia de
chaperones residentes del ER, y resulta en un producto capaz de
salir del ER (Trombetta y Helenius 1998, Chen y Helenius 2000). Las
proteínas mal plegadas e incorrectamente ensambladas habitualmente
se retrotraslocan al citoplasma, donde son degradadas por
proteasomas (Brodsky 1997).
La ruta de plegamiento de las proteínas libres
de anclaje (solubles) y de las unidas a membrana puede ser
sustancialmente diferente debido a sucesos relacionados con la
inserción del dominio transmembranal (TM) en la bicapa lipídica. Es
conocido que el traslocón ofrece un ambiente protector y restrictivo
que actúa como chaperón para la cadena proteica durante la
traslocación (Chen y Helenius 2000). Recientemente se ha demostrado
que el TM es incapaz de integrarse directamente en la bicapa
lipídica del ER (Mothes et al. 1997). Por el contrario, el
dominio del TM resulta liberado al canal acuoso tras la síntesis y
se inserta en la bicapa lipídica mediante difusión lateral. La
eficiencia y velocidad con las que se produce el proceso de difusión
depende de la hidrofobicidad del dominio TM (Heinrich et al.
2000). Por ejemplo, una cadena naciente puede resultar retenida en
el traslocón durante periodos de tiempo más largos en el caso de que
las regiones TM sean menos hidrofóbicas. De esta manera, el tiempo
durante el que la cadena naciente permanece en el interior o en
proximidad al traslocón puede depender de la composición de
aminoácidos de la región TM.
Basándose en dichos resultados, los inventores
plantearon la teoría de que el dominio TM podría actuar como factor
controlador de sucesos relacionados con el plegamiento durante la
traslocación. El plegamiento de la cadena naciente en el lumen del
ER se encuentra estrechamente regulado por un control de calidad
basado en el reconocimiento de los N-glicanos
monoglucosilados por parte de las lectinas chaperones denominadas
calnexina (CNX) y calreticulina (CRT) (Helenius y Aebi 2001, Schrag
et al. 2001). Aunque algunos estudios demuestran que el
control de calidad también realiza un seguimiento del ensamblaje de
los dominios TM en la bicapa lipídica (Cannon y Creswell 2001), se
conoce poco el papel del dominio TM en el proceso de plegamiento de
las proteínas membranales.
Con el fin de investigar adicionalmente el papel
de un dominio TM, los presentes inventores construyeron un mutante
de tirosina humana cuyo tráfico se detuvo al nivel del ER. En otras
palabras, se plegó incorrectamente el mutante de tirosinasa y se
retuvo en el ER mediante un sistema de control de calidad. De esta
manera, el mutante de tirosinasa se retro-traslocó
a proteasomas para la degradación, y tras ella, los péptidos
resultantes fueron presentados sobre la superficie celular por
moléculas del MHC de clase I. De este modo, el mutante de
tirosinasa de la presente invención puede utilizarse en la
inmunoterapia del melanoma a modo de vacuna diseñada para
incrementar la respuesta inmunológica de CTL contra las células del
melanoma.
Un aspecto importante de la respuesta
inmunológica, en particular en lo referido a la eficacia de la
vacuna, es la manera en la que se procesan los antígenos de manera
que puedan ser reconocidos por las células especializadas del
sistema inmunológico. Se utilizan rutas de procesamiento y
presentación de antígeno diferentes y, por lo tanto, la
presentación en la superficie celular de un antígeno particular por
parte de una molécula del MHC de clase II o de clase I a un
linfocito T ayudante o a un linfocito T citotóxico, respectivamente,
depende de la ruta de procesamiento de los antígenos.
Una ruta es una ruta citosólica que procesa los
antígenos endógenos expresados en el interior de una célula. El
antígeno resulta degradado por un complejo proteasa especializado en
el citosol de la célula, y los péptidos antígenos resultantes son
transportados hacia el interior del retículo endoplasmático. Lo
anterior resulta en la unión de antígenos a moléculas del MHC de
clase I. Mediante la presentación cruzada, los antígenos exógenos
pueden ser procesados en el citoplasma de las células presentadoras
de antígeno profesionales y unirse a moléculas del MHC de clase
I.
Una ruta alternativa es una ruta del retículo
endoplasmático que evita el citosol. En el retículo endoplasmático,
los péptidos antígenos se unen a las moléculas del MHC de clase I,
que después son transportadas a la superficie celular para la
presentación a los linfocitos T citotóxicos del sistema
inmunológico. Varios estudios apuntan al papel crucial de las
células T citotóxicas tanto en la producción como en la erradicación
del cáncer por parte del sistema inmunológico (Byrne et al.,
J. Immunol. 51:682, 1984; McMichael et al., N. Engl. J. Med.
309:13, (1983)).
Una tercera ruta es una ruta endocítica que se
encuentra en las células presentadoras de antígeno profesionales,
que procesa antígenos existentes en el exterior de la célula,
resultando en la unión del antígeno a moléculas del MHC de clase
II. Dichos antígenos se introducen en la célula mediante
endocitosis, que transporta los antígenos al interior de endosomas
y seguidamente a lisosomas. Posteriormente, el antígeno resulta
degradado por proteasas, formando péptidos antigénicos que se unen
a moléculas del MHC de clase II, que después se transportan a la
superficie celular para la presentación a linfocitos T ayudante del
sistema inmunológico.
Se encuentra contemplado en la presente
invención un polipéptido que comprende un mutante de tirosinasa, en
el que el mutante de tirosinasa es capaz de acumularse en el
retículo endoplasmático y:
- a)
- el mutante de tirosinasa es enzimáticamente inactivo y no presenta un dominio transmembranal, o
- b)
- el mutante de tirosinasa no presenta un dominio transmembranal de la tirosinasa pero contiene un dominio transmembranal de una proteína que no es tirosinasa, o
- c)
- el residuo Asn en la posición 86 se sustituye por un residuo Gln en el mutante de tirosinasa.
Figura 1. Experimento de
pulso-caza que muestra que la tirosinasa soluble
está retenida en el ER y degradada en proteasomas.
Las células CHO transfectadas con ADNc de ST se
pulsaron durante 20 minutos con [^{35}S] y se realizó un
seguimiento de las mismas en ausencia (carriles 1 a 8) o en
presencia (carriles 9 a 16) de lactacistina 20 \muM durante el
periodo de tiempo indicado. Los lisados celulares se
inmunoprecipitaron con anticuerpos monoclonales T311 y las muestras
de inmunoprecipitado se dividieron por la mitad y se digirieron con
(+) o sin (-) EndoH. Las muestras se corrieron en un gel
SDS-PAGE al 10% reductor y se visualizaron mediante
autorradiografía. El marcador de masa molecular se muestra en el
margen derecho de la figura.
Figura 2. Experimento de
pulso-caza que indica que la tirosinasa de tipo
salvaje (WT) es exportada del ER.
Se pulsaron células WT transfectadas durante 20
minutos con [^{35}S] y se realizó un seguimiento de las mismas en
ausencia (carriles 1 a 4) o en presencia (carriles 9 a 12) de
lactacistina 20 \muM durante el periodo de tiempo indicado. Las
muestras procedentes de los carriles 5 a 8 se digirieron con EndoH.
Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con antisuero T311. Las
muestras se corrieron en un gel de SDS-PAGE al 10%
y se visualizaron mediante autorradiografía.
Figura 3. Experimento de
pulso-caza que muestra la asociación de la calnexina
y la calreticulina con la tirosinasa WT y ST.
Se incubaron células CHO transfectadas con ST
(carriles 1 a 10) o WT (carriles 11 a 20) en tampón de ayuno
durante 1 hora antes de realizar un pulso de 20 minutos de
[^{35}S]. A continuación, se realizó un seguimiento de las
células durante el periodo de tiempo indicado y los lisados
celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo
anti-calnexina (CNX) o un anticuerpo
anti-calreticulina (CRT), seguido de un anticuerpo
anti-tirosinasa (anticuerpo T311). Los
inmunoprecipitados se corrieron en un gel SDS-PAGE
al 10% no reductor y se visualizaron mediante autorradio-
grafía.
grafía.
Figura 4. Experimento de
pulso-caza que demuestra la ruta de plegamiento de
la tirosinasa soluble y de tipo salvaje.
Se incubaron células CHO transfectadas con
tirosinasa ST (carriles 1 a 6) y WT (carriles 7 a 11) en tampón de
ayuno durante 1 hora antes de realizar un pulso de 20 minutos de
[^{35}S]. A continuación, se realizó un seguimiento de las mismas
durante el periodo de tiempo indicado, y los lisados celulares se
inmunoprecipitaron con un anticuerpo
anti-tirosinasa (anticuerpo T311). Los
inmunoprecipitados se corrieron en un gel SDS-PAGE
al 10% no reductor o reductor y se visualizaron mediante
autorradiografía.
Figura 5. Secuencia de ácidos nucleicos de
tirosinasa soluble (SEC ID nº 1).
Figura 6. Experimentos de
pulso-caza que muestran que Tyrmut1 está retenido en
el ER.
Se pulsaron células transfectadas por Tyrmut1
durante 20 minutos con [^{35}S] y se realizó un seguimiento
durante 2 horas. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con
antisuero T311. Los inmunoprecipitados se dividieron en dos y se
digirieron con (+) o sin (-) EndoH. Las muestras se corrieron en un
gel SDS-PAGE al 10% y se visualizaron mediante
autorradiografía.
Figura 7. Experimento de transferencia
western que muestra que la quimera Tyr_E2 resulta retenida en el
ER.
Se transfectaron células con el constructo
Tyr_E2 y los lisados celulares se dividieron en dos y se digirieron
con (+) o sin (-) EndoH. Las muestras se corrieron en un gel
SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a membranas y se
visualizaron con antisuero T311 mediante quimioluminiscencia
ECL.
La tirosinasa humana es una glucoproteína
membranal de tipo I y presenta 529 aminoácidos, siete ocupados por
sitios de N-glucosilación, 17 residuos de cisteína
agrupados en dos dominios ricos en cisteína, dos dominios de unión
de cobre y un dominio TM C-terminal (Ujvari et
al. 2001). Los inventores han construido una forma truncada de
tirosinasa humana que no presenta un dominio transmembranal (TM). En
ausencia del dominio TM, la cadena de la luz del ER no fue capaz de
plegarse en una conformación nativa. Sin embargo, se demostró que
el plegamiento productivo de la cadena truncada, que rinde una
proteína activa, se produce al reducirse la velocidad de
traducción. La tirosina soluble enzimáticamente activa también se
produjo a temperaturas reducidas y el plegamiento productivo se
asoció en ambos casos a la interacción con CNX en los estadios
tempranos. Estos datos sugieren un papel para el dominio TM en el
plegamiento y en el mantenimiento de la cadena en el ambiente del
traslocón, facilitando de esta manera su interacción con la CNX.
La tirosinasa se expresa constitutivamente en
las células de melanoma, generando antígenos tumorales. La
tirosinasa de tipo salvaje sigue la ruta secretoria y presenta como
diana los melanosomas. Los inventores construyeron un mutante de
tirosinasa humano el tráfico del cual se detiene en el retículo
endoplasmático (ER). La proteína mal plegada seguidamente resulta
retenida en el ER por un sistema de control de calidad y resulta
retro-traslocado, degradándose en los proteasomas.
Tras la degradación citoplasmática, los péptidos resultantes son
presentados a linfocitos T citotóxicos (CTL) por las moléculas del
MHC de clase I. En esta forma, el mutante de tirosinasa de la
presente invención puede utilizarse para la preparación de un
medicamento para la inmunoterapia del melanoma en forma de vacuna
diseñada para incrementar la respuesta inmunológica de CTL contra
las células del melanoma.
Aunque la tirosinasa se expresa en melanocitos
normales, células de melanoma y células epiteliales pigmentadas
retinales (RPE), una vacuna que administra un ácido nucleico
codificante del mutante de tirosinasa de la presente invención
todavía resulta adecuada para el tratamiento del melanoma. Por lo
tanto, aunque la vacuna puede presentar como diana melanocitos
tanto normales como anormales, el ser humano puede sobrevivir sin
melanocitos (Marks et al., Immunologic Research
27:409-425, 2003). Por ejemplo, la vacunación puede
resultar en una condición conocida como vitíligo, un trastorno de
la pigmentación de la piel que no plantea un problema sanitario
grave.
Un antígeno o inmunógeno del melanoma tal como
se describe en la presente memoria se refiere a un mutante de
tirosinasa soluble o a un fragmento del mismo que es capaz de causar
la respuesta inmunológica de células T citotóxicas en un paciente,
tal como un ser humano u otro mamífero. Preferentemente el mutante
de tirosinasa soluble resulta retenido en el ER y no presenta un
dominio transmembranal.
El término melanoma incluye, aunque sin
limitación, melanomas, melanomas metastásicos, melanomas derivados
de melanocitos o de células nevus relacionadas con melanocitos,
melanocarcinomas, melanoepiteliomas, melanosarcomas, melanoma in
situ, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular,
melanoma léntigo maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma
invasivo o síndrome de melanoma mola familiar atípico.
Se encuentra contemplada en la presente
invención una composición inmunogénica que comprende un
polinucleótido codificante de un mutante de tirosinasa soluble que
resulta adecuado para la inducción de una respuesta inmunológica de
CTL y opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente adecuado. Tras
la administración de la composición inmunogénica en una célula
diana, la tirosinasa expresada de la presente invención resulta
retenida en el retículo endoplasmático, resulta degradada y después
presentada sobre la superficie celular por el MHC de clase I para
la presentación de antígenos. Preferentemente, el mutante de
tirosinasa soluble no presenta un dominio transmembranal. Más
preferentemente, el mutante de tirosinasa soluble comprende una
secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEC ID nº 1 o variantes
de la misma.
También se encuentra descrito en la presente
invención un mutante de tirosinasa que carece de uno o más sitios
de glucosilación. Este tipo de mutantes previsiblemente queda
retenido en el ER y degradado mediante degradación asociada al
retículo endoplasmático (ERAD) debido a que no serán capaces de
interaccionar con la calnexina (que se une a glicanos), produciendo
polipéptidos incorrectamente plegados. Dichos mutantes de
glucosilación pueden incluir o no un dominio transmembranal. Pueden
obtenerse otros mutantes de tirosinasa adecuados mediante
deleciones o inserciones en la secuencia del ADNc de la tirosinasa,
con la condición de que sean capaces de inducir la ERAD.
Por ejemplo, un mutante de tirosinasa que no
presente un glicano en la posición 86 (Tyrmut1) resultará retenido
en el ER. En efecto, la tirosinasa depende de la interacción de la
calnexina con los glicanos para el plegamiento correcto y, por lo
tanto, el bloqueo de la unión de glicanos a residuos específicos
puede provocar el plegamiento incorrecto y la retención en el
ER.
De manera similar, el albinismo se considera una
enfermedad provocada por el plegamiento incorrecto de la tirosinasa
y, por lo tanto, la tirosinasa expresada por una persona que
presente dicha enfermedad resultará retenida en el ER. La baja
incidencia de melanoma en albinos sugiere que los mutantes de
tirosinasa presentados en el contexto del complejo HLA rompen la
tolerancia frente a los antígenos de tirosinasa presentados por las
células del melanoma.
Otros mutantes de tirosinasa pueden anclarse
mediante un dominio transmembranal de otra proteína que contiene
una señal de retención en el ER. Dicho mutante quimérico de
tirosinasa resulta en una proteína con un perfil de retención en el
ER. Estos mutantes también pueden carecer adicionalmente de por lo
menos un sitio de glucosilación.
La presente invención también describe una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica un nuevo antígeno de
melanoma reconocido por las células T. El antígeno de melanoma dado
a conocer en la presente memoria es una tirosinasa mutante soluble
o un fragmento de la misma que preferentemente resulta retenida en
el ER y que no presenta un dominio transmembranal. Preferentemente,
la secuencia de ácidos nucleicos comprende la secuencia indicada en
SEC ID nº 1.
También se da a conocer en la presente memoria
una vacuna para el melanoma, que comprende una secuencia de ácidos
nucleicos codificante del mutante de tirosinasa de la presente
invención, o un fragmento del mismo, o una vacuna que comprende un
mutante de tirosinasa soluble de la presente invención o un péptido
inmunogénico derivado del mutante de tirosinasa, para la
utilización en el tratamiento del melanoma. Además, la vacuna de la
presente invención puede administrarse en un portador
farmacéuticamente aceptable. Entre los portadores farmacéuticamente
aceptables típicamente se incluyen portadores conocidos por el
experto en la materia, incluyendo adyuvantes farmacéuticos.
Generalmente, entre dichos portadores farmacéuticamente aceptables
se incluyen agua, solución salina, tampones y otros compuestos
indicados, por ejemplo, en el MERCK INDEX, Merck & Co., Rahway
N.J. Ver también "Bioreversible Carriers in Drug Design, Theory
and Application", Roche (editor), Pergamon Press, (1987). Se
proporcionan diversas consideraciones en, por ejemplo, Gilman et
al. (editores), "Goodman and Gilman's: The Pharmacological
Bases of Therapeutics", 8ª edición, Pergamon Press; "Novel Drug
Delivery Systems", 2ª edición, Norris (editor), Marcel Dekker
Inc., (1989), y Remington's Pharmaceutical Sciences, las
exposiciones completas de las cuales se incorporan como referencia
en la presente memoria.
Las formulaciones de vacuna indicadas en la
presente memoria, en primer lugar, pueden evaluarse en modelos
animales o en primates no humanos antes que en seres humanos. Se
utilizarían procedimientos convencionales para evaluar la respuesta
inmunológica del paciente para determinar la eficacia de la
vacuna.
La presente invención también contempla
variantes de los polinucleótidos y polipéptidos indicados en la
presente invención. En una forma de realización, las variantes del
polinucleótido dado a conocer en SEC ID nº 1 se encuentran
contempladas para la utilización en la presente invención. Una
"variante", tal como se utiliza en la presente memoria, se
entiende que se refiere a una secuencia de nucleótidos o de
aminoácidos que se aparta de la secuencia de nucleótidos o
aminoácidos estándar o dada de un gen o proteína particular. Las
expresiones "isoforma", "isotipo" y "análogo"
también se refieren a formas "variantes" de una secuencia de
nucleótidos o de aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos que se
altera mediante la adición, eliminación o sustitución de uno o más
aminoácidos, o una modificación de la secuencia de nucleótidos,
puede considerarse una secuencia "variante". La variante puede
presentar modificaciones "conservadoras", en las que un
aminoácido sustituido presenta propiedades estructurales o químicas
similares, por ejemplo la sustitución de leucina por isoleucina.
Una variante puede presentar modificaciones "no conservadoras",
por ejemplo la sustitución de una glicina por un triptófano. Entre
las variaciones menores análogas también pueden incluirse deleciones
o inserciones de aminoácidos, o ambas. Pueden encontrarse guías
para determinar qué residuos aminoácidos pueden sustituirse,
insertarse o delecionarse utilizando programas informáticos bien
conocidos de la técnica, tales como software de Vector NTI Suite
(InforMax, MD).
Las variantes conservadoras según la invención
generalmente conservan la estructura molecular global del mutante
de tirosinasa. Dadas las propiedades de los aminoácidos individuales
que comprende el mutante de tirosinasa dado a conocer, resultarán
evidentes algunas sustituciones racionales. Pueden realizarse
sustituciones de aminoácidos, es decir "sustituciones
conservadoras", por ejemplo basándose en la similitud de
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o
la naturaleza anfipática de los residuos implicados.
Por ejemplo: (a) entre los aminoácidos no
polares (hidrofóbicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina,
valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina, (b) entre los
aminoácidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina y glutamina, (c) entre los
aminoácidos cargados positivamente (básicos) se incluyen arginina,
lisina e histidina, y (d) entre los aminoácidos cargados
negativamente (ácidos) se incluyen ácido aspártico y ácido
glutámico. Las sustituciones típicamente pueden realizarse dentro
de los grupos (a) a (d). Además, la glicina y la prolina pueden
sustituirse entre sí basándose en su capacidad de romper las
hélices \alpha. De manera similar, determinados aminoácidos, tales
como alanina, cisteína, leucina, metionina, ácido glutámico,
glutamina, histidina y lisina, se encuentran más comúnmente en las
hélices \alpha, mientras que valina, isoleucina, fenilalanina,
tirosina, triptófano y treonina se encuentran más comúnmente en las
láminas \beta-plegadas. Los aminoácidos glicina,
serina, ácido aspártico, asparagina y prolina se encuentran
comúnmente en los giros. Pueden realizarse algunas sustituciones
preferentes entre los grupos siguientes: (i) S y T, (ii) P y G, e
(iii) A, V, L e I. Dado el código genético conocido, y las técnicas
de ADN recombinantes y sintéticas, el experto en la materia puede
construir fácilmente ADN codificantes de las variantes de
aminoácidos conservadoras.
El término "variante" también puede
referirse a un "gen aleatorizado", tales como aquellos
indicados en las patentes asignadas a Maxygen. Por ejemplo, una
variante de la presente invención puede incluir variantes de
secuencias y polinucleótidos deseados que son modificados según los
procedimientos y argumentación dada a conocer en la patente US nº
6.132.970, que se incorpora a la presente memoria como referencia en
su totalidad.
De manera similar, entre las variantes de
polinucleótidos y de polipéptidos dadas a conocer en la presente
invención se incluyen polinucleótidos y polipéptidos que presentan
una identidad de secuencia de por lo menos 65%, de por lo menos
70%, de por lo menos 75%, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%,
de por lo menos 90%, de por lo menos 95% o de por lo menos 99% con
un ácido nucleico codificante de un mutante de tirosinasa soluble o
un fragmento del mismo, o un polipéptido de mutante de tirosinasa
soluble o fragmento del mismo, respectivamente, o hibridarse bajo
condiciones de astringencia baja, moderada o alta con un ácido
nucleico codificante de un mutante de tirosina soluble o fragmento
del mismo. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos por
los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel et
al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, New York N.Y., unidades 2.8-2.11,
3.18-3.19 y 4.6-4.9, (1997)). Pueden
seleccionarse las condiciones de hibridación en la que sonda y
diana completamente complementarias puedan hibridarse, es decir,
cada par de bases debe interaccionar con su par de bases
complementario. Alternativamente, pueden seleccionarse condiciones
en las que sonda y diana presenten no correspondencias de hasta
aproximadamente 10%, pero que todavía sean capaces de hibridarse.
Las condiciones adecuadas pueden seleccionarse, por ejemplo,
mediante la modificación de las concentraciones salines en las
soluciones de prehibridación, de hibridación y de lavado o mediante
la modificación de las temperaturas de hibridación y de lavado. En
el caso de algunos sustratos, la temperatura puede reducirse
mediante la adición de formamida a las soluciones de hibridación y
de hibridación. La hibridación puede llevarse a cabo a baja
astringencia utilizando tampones, tales como 5xSSC con
dodecilsulfato sódico (SDS) al 1% a 60ºC, lo que permite la
hibridación entre secuencias de sonda y diana que contienen algunas
no correspondencias, formando complejos de sonda/diana. Los lavados
posteriores se llevan a cabo a astringencia más alta, con tampones
tales como 0,2xSSC con SDS al 0,1% a 45% (astringencia intermedia) o
a 68ºC (astringencia elevada), con el fin de mantener la
hibridación de únicamente aquellos complejos de sonda/diana que
contengan secuencias completamente complementarias. Pueden
reducirse las señales de fondo mediante la utilización de
detergentes, tales como SDS, sarcosilo o Triton
X-100, o un agente de bloqueo, tal como ADN de
esperma de salmón.
Las vacunas y composiciones inmunogénicas para
la utilización de acuerdo con la presente invención opcionalmente
pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más
portadores o excipientes fisiológicamente aceptables. De esta
manera, pueden formularse para la administración mediante inhalación
o insuflado (a través de la boca o de la nariz) o mediante
administración oral, bucal, parenteral o rectal. En una forma de
realización preferida, la composición farmacéutica se prepara para
la administración parenteral.
Para la administración oral, las composiciones
de la presente invención pueden adoptar la forma de, por ejemplo,
tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con
excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes
ligantes (por ejemplo almidón de maíz pregelatinizado,
polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa), rellenos (por
ejemplo lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de
calcio), lubricantes (por ejemplo estearato de magnesio, talco o
sílice), desintegrantes (por ejemplo almidón de patata o glicolato
de almidón sódico) o agentes humectantes (por ejemplo laurilsulfato
sódico). Las tabletas pueden recubrirse mediante procedimientos
bien conocidos de la técnica. Las preparaciones líquidas para la
administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo,
soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse en forma de
producto seco para la constitución con agua u otro vehículo
adecuado antes de la utilización. Dichas preparaciones líquidas
pueden prepararse por medios convencionales con aditivos
farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por
ejemplo jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas
comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (por ejemplo
lecitina o acacia), vehículos no acuosos (por ejemplo aceite de
almendra, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales
fraccionados) y conservantes (por ejemplo metil o
propil-p-hidroxibenzoatos o ácido
sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales
tamponadoras, agentes saborizantes, colorantes o edulcorantes,
según resulte apropiado.
Las preparaciones para la administración oral
pueden formularse convenientemente para proporcionar la liberación
controlada del compuesto activo. Para la administración bucal la
composición puede presentar la forma de tabletas o pastillas
formuladas de manera convencional.
Para la administración mediante inhalación, los
mutantes de tirosinasa según la presente invención se administran
convenientemente en la forma de una presentación de pulverización de
aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con la
utilización de un propelente adecuado, por ejemplo
diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede
determinarse proporcionando una válvula para administrar una
cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina
para la utilización en un inhalador o insuflador pueden formularse
conteniendo una mezcla de polvos del compuesto y una base de polvos
adecuada, tal como lactosa o almidón.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
mutantes de tirosinasa solubles de la presente invención
preferentemente se formulan para la administración parenteral
mediante inyección, por ejemplo mediante inyección de bolo o la
infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden
presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo en
ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido.
Las composiciones pueden presentar formas tales como suspensiones,
soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden
contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión,
estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente
activo puede encontrarse en forma de polvos para la reconstitución
con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de
pirógenos, antes de la utilización.
Los compuestos también pueden formularse en
composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de
retención, por ejemplo que contengan bases para supositorio
convencionales, tales como manteca de cacao u otro glicéridos.
Además de las formulaciones anteriormente
indicadas, los mutantes de tirosinasa de la presente invención
también pueden formularse en forma de preparación de depósito. Este
tipo de formulaciones de acción prolongada pueden administrarse
mediante implantación (por ejemplo subcutáneamente o
intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De esta
manera, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales
poliméricos o hidrofóbicos (por ejemplo en forma de una emulsión en
un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o en forma de
derivados poco solubles, por ejemplo en forma de sal poco
soluble.
La composición, si se desea, puede presentarse
en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o
más formas de dosificación unitaria que contengan el ingrediente
activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, lámina metálica o
plástica, tal como un paquete blíster. El paquete o dispositivo
dispensador puede acompañarse de instrucciones para la
administración.
También se describe en la presente invención un
constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de una
proteína mutante soluble de tirosinasa de la presente invención. En
una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos de
la tirosinasa es la secuencia de ácidos nucleicos proporcionada en
SEC ID nº 1 o una variante de la misma.
La producción de proteínas recombinantes es bien
conocida en la técnica y se describe de manera general brevemente a
continuación.
Se construyen vectores de expresión útiles para
la utilización en bacterias mediante la inserción de una secuencia
de ADN estructural codificante de una proteína deseada conjuntamente
con señales adecuadas de inicio y terminación de traducción en fase
de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprende
uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de
replicación para garantizar el mantenimiento del vector y, si se
desea, para proporcionar la amplificación dentro del huésped. Entre
los huéspedes procarióticos adecuados para la transformación se
incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella
typhimurium y diversas especies en los géneros
Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus,
aunque pueden utilizarse a elección otros. En una forma de
realización preferida, el huésped procariótico es E.
coli.
Los vectores bacterianos pueden basarse, por
ejemplo, en bacteriófagos, plásmidos o cósmidos. Dichos vectores
pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de
replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles
comercialmente que típicamente contienen elementos del vector de
clonación bien conocido pBR322 (ATCC nº 37017). Entre dichos
vectores comerciales se incluyen, por ejemplo, GEM 1 (Promega
Biotec, Madison, WI, USA), pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript
SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene), pTrc99A,
pKK223-3, pKK233-3,
pKK232-8, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia). Un vector
preferido según la invención es pTriex (Novagen).
Dichas secciones "esqueléticas" se combinan
con un promotor apropiado y la secuencia estructural que debe
expresarse. Entre los promotores bacterianos se incluyen lac, T3,
T7, lambda P_{R} o P_{L}, trp y ara. T7 es el promotor
bacteriano preferente.
Tras la transformación de una cepa huésped
adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad
celular apropiada, el promotor seleccionada se desreprime/induce por
medios apropiados (por ejemplo un cambio de temperatura o la
inducción química) y las células se cultivan durante un periodo
adicional. Las células típicamente se recolectan mediante
centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el
extracto crudo resultante se retiene para la purificación
adicional.
También pueden utilizarse diversos sistemas de
cultivo de células de mamífero para expresar la proteína
recombinante. Entre los ejemplos de sistemas de expresión de
mamífero se incluyen células L de ratón seleccionadas, tales como
células timidina quinasa-negativas (TK) y células
adenina fosforibosiltransferasa-negativas (APRT).
Entre otros ejemplos, se incluyen las líneas COS-7
de los fibroblastos renales de mono, descritos por Gluzman, Cell
23:175, (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un
vector compatible, por ejemplo las líneas celulares C127, 3T3, CHO,
HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenden un
origen de replicación, un promotor y un intensificador adecuados, y
también cualquier sitio de unión ribosómica necesario, un sitio de
poliadenilación, sitios donadores y aceptores de procesamiento,
secuencias de terminación de transcripción y secuencias 5'
flanqueantes no transcritas. Las secuencias de ADN derivadas del
genoma del virus SV40, por ejemplo los sitios de origen, de
promotor temprano, de intensificador, de procesamiento y de
poliadenilación de SV40, pueden utilizarse para proporcionar los
elementos genéticos no transcritos requeridos.
Entre los promotores de mamífero se incluyen CMV
inmediato temprano, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y
tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína I de ratón. Entre los
vectores de mamífero ejemplares se incluyen pWLneo, pSV2cat, pOG44,
pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). En una
forma de realización preferida, el vector de expresión de mamífero
es pTriex.
En las células huésped de mamífero, puede
utilizarse varios sistemas de expresión de base vírica. En los casos
en los que se utilice un adenovirus como vector de expresión, la
secuencia codificante de interés puede ligarse a un complejo de
control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo el
promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico
seguidamente puede insertarse en el genoma de adenovirus mediante
recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una
región no esencial del genoma vírico (por ejemplo la región E1 o
E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de
expresar una proteína diana en huéspedes infectados (ver, por
ejemplo, Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:3655-3659, 1984).
Las secuencias de ácidos nucleicos de la
presente invención también resultan adecuadas para la utilización
como sondas para detectar la expresión de la tirosinasa en tejido
normal y enfermo. Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención se refiere a un bioensayo para detectar ARNm codificante
de tirosinasa en una muestra biológica, que comprende poner en
contacto la muestra con la secuencia de ácidos nucleicos bajo
condiciones que permitan la hibridación entre el ácido nucleico y
el ARNm de la muestra, y después detectar los complejos.
La detección de complejos en el bioensayo
también puede llevarse a cabo mediante una diversidad de técnicas.
La detección de complejos mediante amplificación de señales puede
conseguir mediante varias técnicas de marcaje convencionales,
incluyendo marcajes radioactivos y enzimas (Sambrook et al.,
en: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989; Ausubel et al., en:
"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons,
New York N.Y., 1987). Los kits de marcaje radioactivo también se
encuentran disponibles comercialmente. La secuencia de ácidos
nucleicos del mutante de tirosina utilizada como sonda en el
bioensayo puede ser ARN o ADN. Los procedimientos preferidos de
marcaje de las secuencias de ADN son con ^{32}P utilizando enzima
Klenow o polinucleótido quinasa. Los procedimientos preferidos de
marcaje de ARN o secuencias de ribosoma son con ^{32}P o ^{35}S
utilizando ARN polimerasas. Además, existen técnicas no
radioactivas conocidas para la amplificación de señales, incluyendo
procedimientos para unir grupos químicos a anillos de piridimina y
de purina (Dale R.N.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
70:2238-2242, 1973; Heck R.F., S. Am. Chem. Soc.
90:5518-5523, 1968), procedimientos que permiten la
detección mediante quimioluminiscencia (Barton S.K. et al.,
J. Am. Chem. Soc. 114:8736-8740, 1992) y
procedimientos que utilizan sondas de ácidos nucleicos biotinilados
(Johnson T.K. et al., Anal. Biochem.
133:125-131, 1983; Erickson P.F. et al., J.
of Immunology Methods 51:241-249, 1982; Matthaei
F.S. et al., Anal. Biochem. 157:123-128,
1986) y procedimientos que permiten la detección mediante
fluorescencia utilizando productos disponibles comercialmente. Los
kits de marcaje no radioactivo también se encuentran disponibles
comercialmente.
Entre los ejemplos de muestras biológicas que
pueden utilizarse en dicho bioensayo se incluyen, aunque sin
limitación, cultivos primarios de mamífero, líneas celulares de
mamífero continuas, tales como líneas celulares de melanocitos,
órganos de mamífero, tales como piel o retina, tejidos, especímenes
de biopsia, neoplasmas, especímenes patológicos y especímenes de
necropsia.
En otra forma de realización, los
polinucleótidos, polipéptidos y variantes de los mismos de la
presente invención pueden utilizarse para preparar anticuerpos
monoclonales contra el antígeno de tirosinasa soluble. Estos
anticuerpos pueden utilizarse, por ejemplo, en la detección de la
tirosinasa mediante inmunohistotinción. Por lo tanto, los
anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse como un
reactivo diagnóstico.
Los anticuerpos monoclonales (MAb) son una
población homogénea de anticuerpos contra un antígeno particular y
el anticuerpo comprende únicamente un tipo de sitio de unión a
antígeno y se une únicamente a un epítopo sobre un determinante
antigénico. Los anticuerpos monoclonales de roedor contra antígenos
específicos pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos por
los expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Kohler y Milstein,
Nature 256:495, (1975), y Coligan et al. (editores),
Current Protocols in Immunology, vol., páginas
1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons, 1991).
Asimismo, la presente invención da a conocer la
utilización de un ADNc de tirosinasa modificado para la preparación
de un medicamento para el tratamiento del melanoma. La tirosinasa
modificada indicada en la presente memoria es un mutante de
tirosinasa soluble que resulta retenido en el ER de una célula
presentadora de antígeno (APC) transfectada/transducida. A
continuación, se procesa esta proteína y los péptidos antigénicos
derivados de la misma forman un complejo con moléculas de HLA sobre
las APC. Seguidamente, estos complejos resultan reconocidos por las
células T citotóxicas, que reconocen una célula anormal para la
lisis.
En una forma de realización preferida, el ADN de
la tirosinasa soluble se administra a células presentadoras de
antígeno profesionales (por ejemplo células dendríticas) que
expresarán la tirosinasa soluble y presentarán los péptidos
antigénicos de la tirosinasa en el contexto del complejo HLA. Lo
expresado anteriormente incrementará el cebado de los clones de CTL
específicos, rompiendo la tolerancia contra los antígenos de la
tirosinasa que son presentados por las células de melanoma.
Tal como se ha comentado anteriormente, se
describe en la presente memoria una vacuna para el tratamiento del
melanoma. La vacunación puede llevarse a cabo mediante
procedimientos convencionales. Por ejemplo, el inmunógeno puede
utilizarse en un diluyente adecuado, tal como solución salina o
agua, o en adyuvante completo o incompleto. Además, el inmunógeno
puede unirse o no a un portador para convertir la proteína en
inmunogénica. Entre los ejemplos de este tipo de moléculas de
portador se incluyen, aunque sin limitación, la albúmina de suero
bovino (BSA), la hemocianina de lapa americana (KLH), el toxoide
tetánico, y similares. El inmunógeno también puede acoplarse con
lipoproteínas o administrarse en forma liposómica o con adyuvantes.
El inmunógeno también puede administrarse mediante cualquier vía
apropiada para la producción de anticuerpos, tal como la
intravenosa, la intraperitoneal, la intramuscular, la subcutánea y
similares. El inmunógeno puede administrarse una vez o a intervalos
periódicos hasta producir un título significativo de células
inmunológicas anti-tirosinasa o de anticuerpo
anti-tirosinasa. La presencia de células
inmunológicas anti-tirosinasa puede evaluarse
midiendo la frecuencia de CTL precursoras (linfocitos T
citotóxicos) contra un antígeno de tirosinasa antes y después de la
inmunización mediante un ensayo de análisis de precursores de CTL
(Coulie P. et al., International Journal Of Cancer
50:289-297, (1992)).
La administración de la vacuna o inmunógeno de
la presente invención puede presentar un fin terapéutico. El
inmunógeno se proporciona al aparecer la enfermedad o poco después,
o al aparecer cualquier síntoma de la enfermedad. La administración
terapéutica del inmunógeno sirve para atenuar la enfermedad.
A título de ejemplo, puede utilizarse una vacuna
preparada utilizando proteína tirosinasa soluble recombinante o
vectores de expresión de péptidos. Para proporcionar una vacuna a un
individuo, se inserta una secuencia genética que codifica la
totalidad o parte de la secuencia de ácidos nucleicos mutante de
tirosinasa soluble en un vector de expresión, tal como se ha
indicado anteriormente, y se introduce en un mamífero que debe
inmunizarse. Entre los ejemplos de vectores que pueden utilizarse
en las vacunas anteriormente indicadas se incluyen, aunque sin
limitación, vectores retrovíricos defectivos, vectores adenovíricos,
vectores de virus Vaccinia, vectores de virus de la viruela aviar u
otros vectores víricos (Mulligan R.C., Science
260:926-932, (1993)). Los vectores víricos que
transportan la totalidad o parte de la secuencia de ácidos nucleicos
de mutante de tirosinasa soluble pueden introducirse en un mamífero
antes de haberse observado evidencia de melanoma o para mediar en
la regresión de la enfermedad en un mamífero que presenta melanoma.
Entre los ejemplos de procedimientos de administración del vector
vírico en los mamíferos se incluyen, aunque sin limitación, la
exposición de las células al virus ex vivo, o la inyección
del retrovirus o de una línea celular productora del virus en el
tejido afectado o la administración intravenosa del virus.
Alternativamente, el vector vírico que transporta la totalidad o
parte de la secuencia de ácidos nucleicos de la tirosinasa soluble
puede administrarse localmente mediante inyección directa en una
lesión de melanoma o mediante la aplicación típica en un portador
farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, los ácidos nucleicos
de tirosinasa soluble para la utilización en la presente invención
se proporcionan en SEC ID nº 1, y variantes de la misma. La cantidad
de vector vírico que transporta la totalidad o parte de la
secuencia de ácidos nucleicos del mutante de tirosinasa que debe
administrarse se basa en el título de partículas víricas. A título
de ejemplo, un intervalo del inmunógeno que debe administrarse es
de entre 10^{5} y 10^{13} partículas víricas por mamífero,
preferentemente un ser humano.
Tras la inmunización, la eficacia de la vacuna
puede evaluarse mediante la producción de anticuerpos o células
inmunológicas que reconocen el antígeno, según se evalúa mediante la
actividad lítica específica, la producción de citoquinas
específicas o la regresión del tumor. Un experto en la materia
conocerá los procedimientos convencionales para evaluar las
variables anteriormente indicadas. Si el mamífero que debe
inmunizarse ya presenta melanoma, la vacuna puede administrarse
conjuntamente con otros tratamientos terapéuticos. Entre los
ejemplos de otros regímenes terapéuticos se incluyen la
inmunoterapia de células T adoptivas y la coadministración de
citoquinas o de otros fármacos terapéuticos para el melanoma.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente memoria se describe un
procedimiento para preparar un mutante de tirosinasa soluble, que
comprende construir una forma truncada de una tirosinasa humana. En
una forma de realización preferida, el mutante de tirosinasa
presenta una afinidad reducida para la calnexina. También resulta
preferente que el mutante de tirosinasa no presente un dominio
transmembranal y/o falte por lo menos un sitio de glucosilación.
También se prefiere que el mutante de tirosinasa se encuentre
codificado por el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 1 o por una
variante de la misma.
La invención se describe adicionalmente haciendo
referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan
únicamente a título ilustrativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se cultivaron células CHO (European Collection
of Animal Cell Cultures, Porton Down, Reino Unido (UK)) y células
K42 (cortésmente proporcionadas por el Dr. T. Elliott, Universidad
de Southampton y por el Dr. M. Michalak, Universidad de Alberta) en
medio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Paisley, Escocia) que
contenía suero de feto bovino al 10% (FCS, Sigma, Poole, Dorset,
UK), 50 unidades/ml de penicilina y 50 mg/ml de estreptomicina
(Life Technologies, Inc.) y se mantuvieron a 37ºC con 5% de
CO_{2}. Los anticuerpos monoclonales de ratón
anti-tirosinasa (anticuerpos T311) se obtuvieron de
NeoMarkers (Fremont, USA). Los anticuerpos policlonales de conejo
anti-calnexina fueron un obsequio del Dr. J.
Bergeron (McGill University). Los anticuerpos de conejo
anti-calreticulina (anticuerpos C-17
de la calregulina) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology.
NB-DNJ fue un obsequio de Searle/Monsanto (St.
Louis, MO). La metionina/cisteína marcada radioactivamente con
[^{35}S] se obtuvo de I.C.N. Flow (Thame, Oxfordshire, UK). El
CHAPS
(3-[3-cloramidopropil]-dimetilamonio-1-propanosulfato)
se obtuvo de Pierce Chemicals Co. La lactacistina se obtuvo de
Calbiochem. Los demás compuestos químicos se obtuvieron de Sigma
Chemicals Co. (St. Louis, MO).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El ADNc de longitud completa codificante de
tirosinasa humana en un vector de clonación pcTyr fue un obsequio
del Dr. V.J. Hearing (NCI, National Institute of Health, Bethesda,
MD). Se amplificó el ADNc de tirosinasa WT y el ADNc del dominio
luminal WT (456 aminoácidos) (ST) mediante PCR utilizando pcTyr como
molde y los cebadores siguientes:
- \quad
- Cebador directo: 5'-GCTATACCATGGCCCTCCTGGCTGTTTTG-3'
- \quad
- Cebador inverso WT: 5'-GGCGCGCCTCGAGTAAATGGCTCTGATA-3'
- \quad
- Cebador inverso ST: 5'-GTATTCTCGAGCCGACTCGCTTGTTC-3'
Los productos de la PCR se digirieron con NcoI y
XhoI y se clonaron en el mismo marco de lectura con una etiqueta de
6 His en pTriex1 (Novagen) para la expresión en un mamífero. Las
secuencias se confirmaron mediante secuenciación automática del
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células CHO en etapa de
crecimiento logarítmico en placas de 6 pocillos para la transfección
y se utilizaron para expresar transitoriamente el ADNc de la
tirosinasa utilizando Lipofectamina Plus (Invitrogen). Las células
se recolectaron 24 horas después de la transfección y se rasparon y
se peletizaron. Para el marcaje metabólico, las células CHO
transfectadas (10^{7} células/ml) se sometieron a ayuno en un
medio libre de cisteína/metionina durante 1 hora, se marcaron con
un pulso de 100 a 150 \muCi [^{35}S] durante 20 minutos y se
realizó un seguimiento en los tiempos especificados. Inmediatamente
después del seguimiento, se recolectaron las células en PBS frío y
se incubaron en N-etilmaleimida (NEM) 20 mM durante
30 minutos para alquilar los grupos sulfhidrilo libres. A
continuación, las células se lisaron con tampón de lisis CHAPS
(tampón HEPES 50 mM, pH 7,5, que contenía CHAPS al 2%, NaCl 200 mM
y cóctel inhibidor de proteasa al 0,5% (Sigma) que contenía
leupeptina, aprotinina, EDTA sódico, bestatina, AEBSF y
E-64).
\vskip1.000000\baselineskip
Se centrifugaron unos lisados celulares marcados
con [^{35}S] y los sobrenadantes se incubaron con anticuerpos
T311 (1:50) o con anticuerpos anti-calnexina (1:100)
durante la noche a 4ºC. A continuación, se añadieron 20 \mul de
proteína A-sefarosa y los lisados celulares se
incubaron durante 1 hora a 4ºC. La suspensión se lavó 3 veces con
CHAPS al 0,5% en tampón HEPES. Se eluyó la tirosinasa mediante
ebullición de la suspensión durante 5 minutos en tampón de muestras
SDS con (condiciones reductoras) o sin
2-mercaptoetanol al 5% (condiciones no reductoras).
Para los estudios de coinmunoprecipitación, los lisados se
inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-calnexina
(1:100) y la suspensión lavada se eluyó con SDS al 1%, se diluyó
diez veces con tampón de lisis y se reprecipitó con T311. Las
proteínas unidas se eluyeron en condiciones nativas o reductoras y
se resolvieron en un gel de SDS-PAGE al 10%.
Seguidamente los geles se visualizaron mediante
autorradiografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ensayo de DOPA oxidasa mide la segunda
actividad catalítica de la tirosinasa, es decir, la conversión de
L-DOPA a DOPAcromo por parte de la DOPA quinina. El
ensayo se llevó a cabo en gel utilizando L-DOPA como
sustrato (Negroiu et al. 2000). Los lisados crudos o el
medio de cultivo celular de células transfectadas recolectadas 24
horas después de la transfección se corrieron en condiciones nativas
mediante SDS-PAGE y se incubaron en
L-DOPA 2,5 mg/ml para visualizar la actividad de
tirosinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas procedentes de las células CHO
lisadas con diferentes ADNc se separaron electroforéticamente en
geles de acrilamida al 10% tal como ha sido descrito
(Branza-Nichita et al. 1999) y se
transfirieron a una membrana immobilon (Amersham International,
Amersham, UK).
Para aislar la tirosinasa secretada, el medio de
cultivo se incubó con níquel-ácido
nitrilotriacético-perlas Superflow
(Ni-NTA) (Qiagen, Chatsworth, CA) durante la noche a
4ºC. Las perlas se peletizaron, se lavaron tres veces con imidazol
20 mM y se eluyeron con tampón para muestras SDS reductor. Las
muestras resultantes se separaron mediante
SDS-PAGE, tal como anteriormente. A continuación,
los filtros se incubaron con dilución 1:250 de anticuerpos
anti-tirosinasa (T311) en 5% de leche, Tween al 0,1%
durante 2 horas a 37ºC. La inmunoreactividad se detectó mediante
transferencia western quimioluminiscente potenciada (ECL, Amersham
Corp.) siguiendo el protocolo del
fabricante.
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se realizó un seguimiento in vivo de la
maduración de un mutante de tirosinasa soluble mediante análisis de
pulso-caza, y se inmunoprecipitó con anticuerpos
monoclonales anti-tirosinasa (T311). Las muestras se
dividieron en dos, y la mitad de cada muestra se digirió con un
enzima de restricción EndoH y se corrió en paralelo a un control no
digerido en un gel SDS-PAGE reductor (figura 1).
Debido a que EndoH únicamente digiere los N-glicanos
ricos en manosa e híbridos, se utilizó la sensibilidad de EndoH
para realizar un seguimiento de la maduración de los glicanos de
estructuras ricas en manosa a estructuras complejas. La digestión
con EndoH redujo el pool a un polipéptido que corría a 55 kD.
Durante 5 horas de seguimiento, el precursor presentó la misma
movilidad electroforética y siguió siendo totalmente sensible a
EndoH, indicando que los N-glicanos del mismo no
estaban siendo procesados para formar estructuras complejas en el
Golgi (figura 1, carriles 1, 3, 5 y 7). Se observó una tendencia
hacia una reducción gradual de la cantidad de proteína
inmunoprecipitada tras 1 hora de síntesis (figura 1).
\newpage
Para determinar si lo anterior concordaba con la
retención de cadenas en el ER y la posterior degradación, los
presentes inventores llevaron a cabo el mismo experimento en
presencia de inhibidores de proteasoma. Se observó un incremento de
la cantidad de material inmunoprecipitado en presencia de
lactacistina respecto a la muestra no tratada (figura 1) durante el
periodo de seguimiento completo. El patrón de digestión de EndoH de
las muestras tratadas con lactacistina fue similar al de las no
tratadas (figura 1, carriles 9, 11, 13 y 15), sugiriendo que ST
resultaba retenido en el ER y finalmente reconocido para la
degradación en proteasomas.
Para comparar la maduración de ST con la
proteína de tipo salvaje, los presentes inventores expresaron
tirosinasa membranal (WT) clonada en el mismo vector bajo
condiciones idénticas (figura 2). Tal como muestran los experimentos
de digestión con EndoH, WT se sintetiza en forma de una proteína de
75 kD que adquiere glicanos de tipo complejo en aproximadamente 1
hora de seguimiento. La proporción reducida de glicanos complejos
frente a ricos en manosa refleja una sobreexpresión de las
tirosinasas en este sistema y ello ha sido informado anteriormente
(Berson et al. 2000). Tal como se ha demostrado
anteriormente (Halaban et al. 1997, Toyofuku et al.
2001), el tratamiento con lactacistina resulta en una acumulación
de proteína no degradada en las primeras 3 horas del seguimiento,
sugiriendo que, por lo menos en las etapas iniciales de la
maduración, la tirosinasa membranal resulta degradada en
proteasomas.
La falta de procesamiento para formar glicanos
complejos mostrada por la forma soluble, en contraste con la
tirosinasa WT, sugiere una maduración incompleta de la
glucoproteína. Lo expresado anteriormente podría relacionarse con
su incapacidad para adquirir una conformación nativa. Para
investigar esta cuestión, los presentes inventores determinaron la
actividad enzimática del mutante ST mediante un ensayo de
DOPA-oxidasa. El mutante de ST se encuentra
completamente inactivo en el lisado celular o en el medio de
cultivo. Lo anterior contrasta con la tirosinasa WT, que es capaz
de convertir el sustrato DOPA en DOPAcromo. De esta manera, la
cadena ST se desarrolla en una conformación no nativa sin actividad
biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para examinar el papel de la calnexina y de la
calreticulina en el plegamiento de ST, los presentes inventores
llevaron a cabo experimentos de inmunoprecipitación secuencial con
anticuerpos anti-CNX/anti-CRT y
anti-tirosinasa de lisados celulares transfectados
marcados metabólicamente. Durante los 30 primeros minutos, se
produjo una interacción muy débil entre ST y tanto CNX (figura 3,
carriles 1 y 2) como CRT (figura 3, carriles 6 y 7). Tras 1 hora de
seguimiento, la interacción resultó visible y se incrementó hasta el
nivel máximo tras 3 horas tanto con CNX (figura 3, carriles 3 a 5)
como CRT (figura 3, carriles 8 y 9).
Se observó un patrón diferente para la
tirosinasa WT, que interaccionó con CNX desde las etapas más
tempranas de plegamiento y mostró una reducción significativa tras
1 hora de seguimiento (figura 3, carriles 11 a 13). Resultó
evidente una interacción débil de CRT con la cadena naciente de WT
al final del periodo del pulso (figura 3, carril 6).
Para caracterizar las rutas de plegamiento de
las tirosinasas WT y mutantes, los presentes inventores llevaron a
cabo experimentos de inmunoprecipitación en células CHO
transfectadas sometidas a pulso-caza y se analizaron
las muestras en un gel SDS-PAGE no reductor. Estas
condiciones permitieron seguir la formación de los enlaces
disulfuro, que es simultánea a la conformación más compacta que
resulta y por lo tanto se observa una movilidad acelerada de las
cadenas en el gel (Branza-Nichita et al.
1999, Hebert et al. 1995).
La proteína ST se pliega pasando por, como
mínimo, tres intermediarios de oxidación en una ruta de plegamiento
no productiva, tal como demuestra el progresivo incremento del
desplazamiento de movilidad de 0 a 5 horas de seguimiento (figura
4, carriles 1 a 6). El primer intermediario apareció tras el pulso
(0 minutos), en contraste con la muestra reducida, mientras que el
último intermediario se observó tras 3 horas de seguimiento,
correlacionándose con un proceso acelerado de degradación de la
tirosinasa truncada.
Mediante el análisis del plegamiento de la
proteína WT, los presentes inventores pudieron discriminar entre
dos intermediarios de oxidación. El primer no se encuentra
completamente oxidado, tal como muestra su velocidad de migración
similar a la de la muestra reducida (figura 4, carriles 7 y 12).
Durante un periodo de 30 minutos la cadena se oxidó formando el
segundo intermediario (figura 4, carril 8) que no se oxidó
adicionalmente. La aparición del segundo intermediario se
correlaciona con la aparición de estructuras complejas de glicano y
una reducción drástica de la interacción de CNX tras 1 hora,
indicando que la cadena había adquirido una conformación competente
para la exportación y había alcanzado el compartimiento de Golgi.
Debido a que las muestras de ST reducido (figura 1, carriles 2, 4,
6 y 8) y WT de pulso-caza (figura 2, carriles 1 a 4)
mostraban movilidades uniformes durante el periodo de seguimiento,
los desplazamientos en los geles no reductores se deben únicamente
a diferentes intermediarios oxidados. Bajo condiciones no
reductoras, se pudieron observar agregados y dímeros disulfuro en
las etapas tempranas de plegamiento tanto para ST como para WT
(figura 4). Estas formas se encontraban ausentes en los últimos
puntos del seguimiento y bajo condiciones reductoras, indicando la
formación de una mezcla de intermediarios disulfuro durante el
plegamiento. Los datos muestran que el plegamiento de ST hasta
producir una conformación no nativa tarda seis veces más que para WT
y que los intermediarios oxidados tardíos se forman previamente a
la degradación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para investigar cómo influye en el plegamiento
la presencia de un dominio transmembranal, los presentes inventores
utilizaron como modelo una glucoproteína de tipo
I-tirosinasa y compararon la ruta de plegamiento de
la misma con la de un constructo en el que se había delecionado su
dominio TM. La tirosinasa es un enzima melanogénico que regula la
síntesis de pigmento en los mamíferos (Petrescu et al. 1997).
Los presentes inventores han documentado anteriormente su
plegamiento dependiente de la glucosilación
(Branza-Nichita et al. 1999, 2000).
A partir del resultado de un
SDS-PAGE no reductor de células CHO transfectadas
marcadas metabólicamente, los presentes inventores demostraron que
el constructo soluble madura en una conformación no nativa que
resulta retenida en el ER y que finalmente se degrada en
proteasomas. Lo anterior se correlaciona con la ausencia de
actividad enzimática en células transfectadas con ST, en contrate
con las células transfectadas con WT. Resulta interesante que la
forma soluble adopta un número incrementado de intermediarios
oxidados en comparación con la forma
WT.
WT.
La ruta de plegamiento de las dos formas de
tirosinasa también difiere en su patrón de asociación con CNX y
CRT. La cadena anclada a membrana resulta asistida por CNX partiendo
de las etapas tempranas hasta el completado del proceso de
plegamiento. Los presentes inventores han informado anteriormente de
un plegamiento dependiente de calnexina similar para la tirosinasa
membranal de ratón, produciéndose dos intermediarios oxidantes
(Branza-Nichita et al. 1999,
Branza-Nichita et al. 2000). En contraste, la
afinidad de la tirosinasa truncada para CNX y CRT inicialmente es
muy reducida y se incrementa hacia el final del proceso, previamente
a la degradación. Por lo menos dos de un total de tres
intermediarios de plegamiento de ST aparece en ausencia de la
interacción CNX/CRT (posiblemente con la asistencia de otros
factores de plegamiento del ER). Dichos intermediarios son
incapaces de alcanzar el plegamiento nativo, implicando que han
adquirido puentes disulfuro aberrantes. Se demostró que dos
tioreductasas interaccionaban con las cadenas nacientes durante la
formación de puentes disulfuro en el RE-PDI y Erp57
(Farmery et al. 2000, Mezghrani et al. 2001). Erp57
interacciona con la cadena en el caso de que ésta se encuentre
asociada con CNX (Frickel et al. 2002). Resulta posible que
la tiorreductasa también catalice la formación de los enlaces
S-S en la tirosinasa membranal. A la inversa, los
intermediarios oxidados de la forma soluble se producen
inicialmente en ausencia de CNX y de Erp57 y la cadena no puede
rescatarse a una conformación nativa a partir de sus interacciones
tardías con chaperones, aunque se demuestra que tanto calnexina
como calreticulina se asocien con ella en esta etapa. Existe un
equilibrio frágil entre el plegamiento y la degradación en esta
etapa, discriminando el ciclo de control de calidad entre las
cadenas correcta e incorrectamente plegadas. Los polipéptidos
incorrectamente plegados son nuevamente glucosilados por GT y
dirigidos por CNX/CRT al ciclo (Sousa y Parodi 1995). Se ha
demostrado la asociación de muchas proteínas solubles o unidas a
membrana, con CNX o CRT antes de ser dirigidas a la etapa de
degradación (Ellgaard y Helenius 2001).
Dichos datos indican que la nueva glucosilación
de la ST incorrectamente plegada se incrementa en las etapas
tardías del plegamiento y, por lo tanto, existe una asociación
incrementada tanto con CNX como con CRT, coincidiendo con el
colapso de la cadena a configuraciones con disulfuros aberrantes que
se produce inmediatamente antes de la degradación. De hecho, no se
oxida el pool entero de tirosinasa para formar el último
intermediario; por el contrario, algunas de las cadenas se envían a
ser degradadas en etapas más tempranas. El plegamiento aberrante y
la degradación de la cadena truncada se produce prácticamente de
manera simultánea en los dos últimos puntos de seguimiento. Lo
anterior sugiere que las cadenas incorrectamente plegadas en el
ciclo de la calnexina se envían directamente a la maquinaria de
retro-traslocación. Conjuntamente estos datos
demuestran que el dominio TM resulta crucial para el plegamiento
productivo de la tirosinasa.
El dominio TM aparentemente desempeña un papel
clave en dicho proceso, al incrementar el tiempo transcurrido en la
región traslocón mediante sucesos asociados a inserciones y al
impedir que la proteína se aleje por difusión rápida. Resulta
importante indicar que en todos los casos las rutas de plegamiento
productivo normalmente incluirían menos intermediarios que las
rutas no productivas, con independencia de la duración del proceso.
Básicamente, en el caso de que se formen disulfuros no nativos en
las etapas tempranas, la cadena adopta más conformaciones que en la
ruta nativa, resultando en varios intermediarios oxidados que
finalmente se dirigirán a la etapa de degradación. Por lo tanto, un
incremento del número de intermediarios durante el plegamiento
podría ser una indicación de una ruta que conduce a un plegamiento
no nativo. En este caso, la interacción con la calnexina podría
describirse más exactamente como una etapa temprana de degradación y
no como una etapa tardía de plegamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se construyó en la posición 86 un mutante de
tirosinasa humana sin la secuencia de consenso
Asn-Arg-Thr. Lo anterior se
consiguió mutando Asn86 a Gln, modificando de esta manera la
secuencia a Gln-Arg-Thr. La
retención en el ER del mutante Tyrmut1 se muestra en la figura 6 a
partir de su patrón de digestión con EndoH.
\newpage
Ejemplo
7
Se construyó una proteína tirosinasa quimérica
(TyrE2) utilizando el dominio transmembranal de la proteína de
cubierta del virus de la hepatitis C (HCV E2) y un ectodominio de
tirosinasa. Tal como se observa en la figura 7, la digestión con
EndoH del lisado celular que expresa la quimera TyrE2 resultó en una
proteína con un perfil de retención en el ER.
Claims (24)
1. Polipéptido que comprende un mutante de
tirosinasa, en el que el mutante de tirosinasa es capaz de
acumularse en el retículo endoplasmático y
- (a)
- el mutante de tirosinasa es enzimáticamente activo y carece de un dominio transmembranal, o
- (b)
- el mutante de tirosinasa carece de un dominio transmembranal de tirosinasa aunque contiene un dominio transmembranal de una proteína que no es la tirosinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que el mutante de tirosinasa presenta una afinidad reducida para la
calnexina.
3. Polipéptido según la reivindicación 2, en el
que el mutante de tirosinasa no presenta ningún dominio
transmembranal.
4. Polipéptido según la reivindicación 2, en el
que el mutante de tirosinasa está codificado por el polinucleótido
de secuencia SEC ID nº 1 o una variante del mismo.
5. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que el mutante de tirosinasa es una tirosinasa quimérica.
6. Polipéptido según la reivindicación 5, en el
que la tirosinasa quimérica se encuentra unida a membrana mediante
un dominio transmembranal de otra proteína, y en el que el dominio
transmembranal contiene señales de retención en el ER.
7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el
que la tirosina quimérica está retenida en el ER a través de
señales de retención en el dominio transmembranal de la proteína 2
de la cubierta del virus de la hepatitis C.
8. Composición inmunogénica que comprende un
mutante de tirosinasa que es capaz de acumularse en el retículo
endoplasmático y en el que:
- (a)
- el mutante de tirosinasa es enzimáticamente inactivo y carece de un dominio transmembranal, o
- (b)
- el mutante de tirosinasa carece de un dominio transmembranal de tirosinasa aunque contiene un dominio transmembranal procedente de una proteína que no es la tirosinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Composición inmunogénica según la
reivindicación 8, en la que el mutante de tirosinasa está codificado
por el polinucleótido de secuencia SEC ID nº 1 o una variante del
mismo.
10. Polinucleótido codificante de un mutante de
tirosinasa, en el que dicho mutante de tirosinasa es capaz de
acumularse en el retículo endoplasmático, y en el que:
- (a)
- el mutante de tirosinasa es enzimáticamente inactivo y carece de un dominio transmembranal, o
- (b)
- el mutante de tirosinasa carece de un dominio transmembranal aunque contiene un dominio transmembranal procedente de una proteína que no es la tirosinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Polinucleótido según la reivindicación 10,
en el que el mutante de tirosinasa carece de un dominio
transmembranal.
12. Polinucleótido según la reivindicación 11,
en el que el mutante de tirosinasa está codificado por la secuencia
identificada en SEC ID nº 1 o por una variante de la misma.
13. Vacuna que comprende un polinucleótido según
la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Vacuna según la reivindicación 13, en la que
el polinucleótido comprende la secuencia identificada en SEC ID nº
1 o una variante de la misma.
15. Célula huésped que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 10.
16. Célula huésped según la reivindicación 15,
en la que el polinucleótido comprende la secuencia indicada en SEC
ID nº 1, o una variante de la misma.
\newpage
17. Utilización de un polinucleótido codificante
de un mutante de tirosinasa para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de un melanoma, y en la que:
- (a)
- el mutante de tirosinasa es enzimáticamente inactivo y carece de un dominio transmembranal, o
- (b)
- el mutante de tirosinasa carece de un dominio transmembranal de tirosinasa aunque contiene un dominio transmembranal procedente de una proteína que no es la tirosinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Utilización según la reivindicación 17, en
la que dicho medicamento se administra en células presentadoras de
antígeno.
19. Utilización según la reivindicación 17, en
la que dicho medicamento induce una respuesta inmunológico de
linfocitos citotóxicos.
20. Utilización según la reivindicación 17, en
la que el mutante de tirosinasa se acumula en el retículo
endoplasmático de una célula.
21. Utilización según la reivindicación 20, en
la que el mutante de tirosinasa carece de un dominio
transmembranal.
22. Procedimiento para la preparación de un
mutante de tirosinasa, que comprende construir una forma truncada
de una tirosinasa humana, en el que la tirosinasa no presenta ningún
dominio transmembranal y es capaz de acumularse en el retículo
endoplasmático, y en el que:
- (a)
- el mutante de tirosinasa es enzimáticamente inactivo y carece de un dominio transmembranal, o
- (b)
- el mutante de tirosinasa carece de un dominio transmembranal de tirosinasa aunque contiene un dominio transmembranal procedente de una proteína que no es la tirosinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Polipéptido que comprende un mutante de
tirosinasa humano, en el que dicho mutante de tirosinasa es capaz
de acumularse en el retículo endoplasmático, y en el que dicho
mutante de tirosinasa humano también carece de la secuencia de
consenso Asn-Arg-Thr debido a la
mutación de Asn en la posición 86.
24. Polipéptido según la reivindicación 23, en
el que el residuo Asn en la posición 86 se modifica por un residuo
Gln.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50887903P | 2003-10-07 | 2003-10-07 | |
| US508879P | 2003-10-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2329904T3 true ES2329904T3 (es) | 2009-12-02 |
Family
ID=34434936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04794411T Active ES2329904T3 (es) | 2003-10-07 | 2004-10-07 | Mutante de tirosinasa y procedimientos de utilizacion del mismo. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050142143A1 (es) |
| EP (1) | EP1689430B1 (es) |
| JP (1) | JP4734251B2 (es) |
| KR (1) | KR20060114326A (es) |
| CN (1) | CN1863552B (es) |
| AT (1) | ATE437650T1 (es) |
| CA (1) | CA2541833A1 (es) |
| DE (1) | DE602004022323D1 (es) |
| ES (1) | ES2329904T3 (es) |
| WO (1) | WO2005035723A2 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102016109524A1 (de) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Dewertokin Gmbh | Schlaf-oder Ruhemöbel und elektromotorischer Möbelantrieb für ein solches Möbel sowie Verfahren zum Bereitstellen eines Informations und/oder Warnsignals durch einen elektromotorischen Möbelantrieb |
| WO2018024110A1 (zh) | 2016-08-01 | 2018-02-08 | 北京大学 | Mg53突变体及其制备方法和用途 |
| WO2018124623A1 (ko) * | 2016-12-29 | 2018-07-05 | 충남대학교 산학협력단 | 신규 재조합 티로시나아제 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5605793A (en) * | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| US6472375B1 (en) * | 1998-04-16 | 2002-10-29 | John Wayne Cancer Institute | DNA vaccine and methods for its use |
-
2004
- 2004-10-07 JP JP2006534327A patent/JP4734251B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-07 CN CN2004800291849A patent/CN1863552B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-10-07 US US10/959,600 patent/US20050142143A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-07 EP EP04794411A patent/EP1689430B1/en not_active Not-in-force
- 2004-10-07 CA CA002541833A patent/CA2541833A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-07 WO PCT/US2004/033048 patent/WO2005035723A2/en active Application Filing
- 2004-10-07 AT AT04794411T patent/ATE437650T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-10-07 ES ES04794411T patent/ES2329904T3/es active Active
- 2004-10-07 KR KR1020067008790A patent/KR20060114326A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-10-07 DE DE602004022323T patent/DE602004022323D1/de active Active
-
2011
- 2011-07-22 US US13/137,153 patent/US20120034675A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007507240A (ja) | 2007-03-29 |
| CA2541833A1 (en) | 2005-04-21 |
| EP1689430A2 (en) | 2006-08-16 |
| KR20060114326A (ko) | 2006-11-06 |
| ATE437650T1 (de) | 2009-08-15 |
| EP1689430B1 (en) | 2009-07-29 |
| DE602004022323D1 (de) | 2009-09-10 |
| WO2005035723A2 (en) | 2005-04-21 |
| CN1863552A (zh) | 2006-11-15 |
| WO2005035723A3 (en) | 2006-01-19 |
| EP1689430A4 (en) | 2007-08-29 |
| US20050142143A1 (en) | 2005-06-30 |
| US20120034675A1 (en) | 2012-02-09 |
| JP4734251B2 (ja) | 2011-07-27 |
| CN1863552B (zh) | 2012-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6087110A (en) | Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein | |
| US5994523A (en) | Melanoma antigens and their use in diagnostic and therapeutic methods | |
| ES2311027T3 (es) | Composiciones y metodos para la inmunoterapia especifica de wt1. | |
| ES2576130T3 (es) | Antagonistas de activina para el diagnóstico y la terapia de enfermedades asociadas a fibrosis | |
| ES2224113T3 (es) | Antigeno asociado al melanoma, epitopos de este antigeno y vacunas contra el melanoma. | |
| US7084249B1 (en) | Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines | |
| KR100336452B1 (ko) | 앤지오스타틴및맥관형성억제를위한이의사용방법 | |
| EP1021535B1 (en) | Human cancer antigen ny eso-1/cag-3 and gene encoding same | |
| ES2329904T3 (es) | Mutante de tirosinasa y procedimientos de utilizacion del mismo. | |
| US7084239B1 (en) | Cancer peptides of NY-ESO-1/CAG-3 | |
| AU782853B2 (en) | Methods for preventing or attenuating pathoangiogenic conditions | |
| JP2001502529A (ja) | ＳｐｓＡポリヌクレオチドおよびポリペプチド | |
| WO2002018536A2 (fr) | Proteine bard1 tronquee, et ses applications diagnostiques et therapeutiques | |
| US7015312B1 (en) | Antibodies to the protein product encoded by ORF3 of the TRP-1 gene and compositions and kits thereof | |
| US7001600B1 (en) | Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes | |
| AU2001275490A1 (en) | MHC peptides over-expressed on prostate cancer cells and methods of use | |
| EP1806403A2 (en) | Human cancer antigen NY ESO 1/CAG-3 and gene encoding same | |
| CA2506684A1 (en) | Immunogenic epitopes for fibroblast growth factor 5 (fgf-5) presented by hla-a3 and hla-a2 | |
| US20110217316A1 (en) | GBS Toxin Receptor Compositions and Methods of Use | |
| US20080096833A1 (en) | Polytpeptide Specific To Liver Cancer, Polynucleotide Coding For The Polypeptide, And Rna Molecule Inhibiting Expression Of The Polypeptide |